JP5583908B2 - 増強されたａｄｃｃ活性を伴う抗体に基づく治療薬 - Google Patents

Description

本出願は、２００５年１０月２１日に出願された米国特許出願第６０／７２８，９４７号（本明細書において参考として援用される）に対して優先権を主張する。

本発明の技術分野は、一般的には、タンパク質糖鎖生物学、より詳細には、抗体エンジニアリングおよび産生ならびに、例えば、モノクローナル抗体およびＩｇ融合タンパク質のような多様な抗体に基づく治療薬におけるグリコシル化の臨床上の意義に関する。

抗体に基づく治療薬、即ち、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびＦｃ融合タンパク質は、現在、治療薬として「成熟」している。少なくとも１８種のｍＡｂおよび２種の融合分子が市場に存在し、１５０を超えるものが、現在、臨床治験中である（例えば、非特許文献１および非特許文献２を参照のこと）。これらの治療薬の適応症は様々であり、例えば、臓器移植（ＯＫＴ３（登録商標）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）、Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、腫瘍学（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、ＨｕＭａｘ−ＣＤ４（登録商標））、感染性疾患（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、炎症および自己免疫疾患（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、ならびにアレルギー喘息（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））が挙げられる。かかる薬物の治療活性は、例えば、標的細胞におけるシグナル伝達事象を阻害することによる、アポトーシスの直接的誘導による、ならびにＦｃ受容体への結合を介する抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）およびＣ１ｑへの結合を介する補体依存性細胞障害のような間接的免疫学的機構（両方の機構はまとめて「エフェクター機能」と呼ばれる）による、異なる作用機序により介在され得る。

マウスｍＡｂは、１９７５年にケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）ら（非特許文献３）によって最初に作製された。臨床用途に承認された最初のｍＡｂは、マウス抗体（ＯＫＴ３（登録商標））である。しかし、マウス抗体のエフェクター機能、免疫原性、および薬物動態学的特性（それらのほとんどはＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ、場合によって、ＩｇＧ２ｂである）は、一般的にヒトの治療用途には十分ではない。例えば、マウス抗体をヒト由来の細胞で試験する場合、ＡＤＣＣのレベルは実質的にマウス細胞でのレベルより低い。さらなる研究により、抗体Ｆｃ領域がエフェクター機能の要因であり、ＡＤＣＣの減少は、ヒト抗体と比較して、ヒトＦｃγ受容体に対するマウスＩｇＧ Ｆｃ領域の結合親和性が低いためであることが解明された。

ヒトにおける減少した免疫原性および最適化されたエフェクター機能を伴う抗体に基づく治療薬を生成するために、多くの努力がなされてきた。結果として、キメラ、ヒト化および完全なヒトモノクローナル抗体ならびに抗体に基づく融合タンパク質が開発された。このサブクラスは所定のタイプの免疫介入にとって望ましい特徴（ＦｃγＲ結合、血清中半減期）および機能的特性（ＡＤＣＣ、食作用、エンドサイトーシス、補体活性化）を示すため、ほとんどのキメラおよびヒト化抗体ならびに抗体に基づく融合分子はヒトＩｇＧ１から誘導されるＦｃ領域を含有する。

いくつかの抗体に基づく治療薬は、抗体エフェクター機構を利用することなく機能し得るが、他のものは免疫系を補充することにより標的細胞を死滅させることが必要であり得る。免疫系の補充が特定の治療薬に対して望まれる場合、ＩｇＧ Ｆｃ部分を操作することによりエフェクター機能（例えば、ＩｇＧ受容体および／または補体に対する改善された結合）が改善されることが、効果のある増強であり得る。

抗体の一方の腕がＦｃγ受容体に結合する二重特異性抗体（例えば、非特許文献４を参照のこと）；サイトカイン−ＩｇＧ融合分子（例えば、ＩＬ−１０−Ｆｃ、ＩＬ−１５−Ｆｃ）；およびＦｃγＲへの結合の原因であるアミノ酸残基の変異（例えば、非特許文献５を参照のこと）を含む免疫系の補充を増強するためのいくつかの手法が模索されている。

免疫グロブリンのグリコシル化は、エフェクター機能の必須な決定要素であり得る。したがって、特定のＩｇＧのエフェクター機能を改変するための別のアプローチは、Ｆｃ領域のグリコシル化パターンを操作することである。

ＩｇＧ分子は、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ドメインのそれぞれの保存されたＡｓｎ２９７に共有結合したＮ−結合オリゴ糖を含有する。血清ＩｇＧのＦｃ領域で見出されるオリゴ糖は、主として複合型のバイセクティンググリカンである。ＩｇＧグリコシル化パターンの種類として、末端シアル酸の結合、３番目のＧｌｃＮＡｃ腕（分岐ＧｌｃＮＡｃ）、末端ガラクトシル化、およびα−１，６−結合コアフコシル化が挙げられる。オリゴ糖は、０個（Ｇ０）、１個（Ｇ１）、または２個（Ｇ２）のガラクトースを含有することができる（図１Ａを参照のこと）。グリコシル化の正確なパターンは、ＩｇＧサブコンポーネント、特に、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの構造特性に依存する（非特許文献６）。組み換えＩｇＧ ｍＡｂまたは融合分子を産生するために使用される細胞系統（多くはマウスおよびハムスター細胞系統に由来する）はまた、オリゴ糖鎖の合成にも影響を及ぼし得る。

糖タンパク質のオリゴ糖部分は、最初に脂質結合オリゴ糖から生合成されてＧｌｃ_３Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２−ピロホスホリル−ドリコールが形成され、次いで、小胞体（ＥＲ）中のタンパク質に移行される（図１Ｂを参照のこと）。次いで、オリゴ糖部分は以下の順序で加工される。第一に、３個のすべてのグルコース（Ｇｌｃ）残基がグルコシダーゼＩおよびＩＩにより取り除かれてＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２−タンパク質が産出される。Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２構造は、多くのマンノース（Ｍａｎ）残基の除去によりさらに加工され得る。最初に、４個のα１，２−結合マンノースが除去されてＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２−タンパク質となり、次いで、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の付加により伸長される。この新たな構造、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２−タンパク質は、α１，３−およびα１，６−結合マンノースを取り除くマンノシダーゼＩＩの基質である。その後、他の糖、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、およびシアル酸が順に付加され、糖タンパク質で頻繁に見出される複合型の構造となる。

いくらかの研究により、ＩｇＧグリコフォームとＦｃγＲＩＩＩ依存性ＡＤＣＣとの間の関係が調べられている。

ガラクトース−−ヒト化ｍＡｂ ＩｇＧ１（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））からのほとんどのガラクトース残基の除去は、補体溶血活性の減少を生じたが、ＡＤＣＣに対しては影響を及ぼさなかった（非特許文献７）。しかしながら、ヒト抗ＲｈＤモノクローナルＩｇＧの高度にガラクトシル化された形態は、アガラクトシル形態よりもＡＤＣＣのアッセイにおいて活性である（非特許文献８）。それゆえ、ＡＤＣＣにおけるＩｇＧオリゴ糖のガラクトシル化の影響については議論の余地がある。

シアル酸−−末端シアル酸はＡＤＣＣに対して影響を及ぼさないように思われる（非特許文献７）。

Ｎ−アセチルグルコサミン−−いくつかの研究は、ＦｃγＲＩＩＩおよびＡＤＣＣに結合する時のバイセクティングＧｌｃＮＡｃの役割に着目している。キメラＩｇＧ１抗神経芽腫抗体のグリコシル化パターンが、β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をトランスフェクトされたＣＨＯ細胞において操作されている（非特許文献９；また、特許文献１についても参照のこと）。この酵素は、Ｎ−結合オリゴ糖へのバイセクティングＧｌｃＮＡｃ残基の付加を触媒する。α１，６−フコシルトランスフェラーゼは、基質としてのバイセクティングＮ−グリカンを効率的に用いることができないため、バイセクティングＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−グリカンのα−１，６−結合コアフコシル化を阻害する（非特許文献１０）。この細胞系統において産生されるＩｇＧはＡＤＣＣ活性の増加を示した。しかし、コアフコースと比較して、エフェクター機能に対するバイセクティングＧｌｃＮＡｃの寄与は依然として議論の余地がある（非特許文献１１）。

フコース−−分泌されるｍＡｂは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）産生ＩｇＧ１より低い程度のフコシル化されたオリゴ糖を有するため、ヒト化およびキメラＩｇＧ１ ｍＡｂは、より低いレベルのα−１，６−フコシルトランスフェラーゼを発現するラットハイブリドーマ細胞系統において産生されている（非特許文献１１；また、特許文献２についても参照のこと）。これらの研究では、フコシル化されていないオリゴ糖は、ＡＤＣＣを増強する時に、バイセクティングＧｌｃＮＡｃオリゴ糖より極めて重要な役割を果たすことが示されている。この報告は、ＩｇＧ１のフコース欠損がＣ１ｑ結合に影響を及ぼさないが、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡへの増加した結合を惹起し、より高いＡＤＣＣ活性を可能にした先の報告（非特許文献１２）と一致する。

Ｆｃ領域において明確なパターンのグリコシル化を伴う組み換えＩｇＧを産生する細胞系統を操作する試みが行われている。例えば、高いレベルのヒトβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）および／またはα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）を発現するＣＨＯ細胞系統が作製されている。これらの細胞で産生されるＩｇＧオリゴ糖の構造は、コントロールの細胞系統と比較してより高い同種性を示す。ＧＴの過剰発現が末端ＧｌｃＮＡｃの量を減少させる一方、ＳＴの過剰発現はオリゴ糖のシアリル化を増加させる（非特許文献１３）。

抗体に基づく治療薬を最適化し、特に、増強されたＡＤＣＣ活性を伴う抗体に基づく治療薬を製造するための方法を開発する必要性が継続して存在する。
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（発明の要約）
本発明は、増強されたＡＤＣＣ活性を伴う治療用抗体およびＦｃ融合タンパク質を作製する方法ならびにかかる治療薬を使用する方法を提供する。本発明は、完全なヒトであるか、またはそうでなければ、ヒト抗体、例えば、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体のＦｃドメインおよびヒトＦｃドメインもしくはその機能的誘導体を伴うＦｃ融合分子を含有する抗体に基づく治療薬に関する。好ましい具体例では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、より好ましくはＩｇＧ１由来である。

本発明の方法により作製される抗体およびＦｃ融合タンパク質は、オリゴマンノース型Ｎ−グリカンを含み、さらに（複合型Ｎ−グリカンを含有する同じ抗体またはＦｃ融合タンパク質と比較して）１つまたはそれ以上の以下の特性：
（ａ）より高いＡＤＣＣ活性；
（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩＡ（および他の所定のＦｃγ受容体）に対するより高い結合親和性；
（ｃ）標的に対する類似のまたはより高い結合特異性；
（ｄ）標的に対する類似のまたはより高い結合親和性；ならびに
（ｅ）マンノース受容体に対する類似のまたはより低い結合親和性
により特徴付けられる。

本発明の抗体およびＦｃ融合分子上のオリゴマンノース型Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ_５−９（ＧｌｃＮＡｃ）_２を含んでなる。かかるＮ−グリカンは、末端シアル酸、ガラクトース、またはＧｌｃＮＡｃを含有しない。好ましい具体例では、そのようなＮ−グリカンは、コアフコースを含有しない。好ましい具体例では、本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質組成物は、主としてオリゴマンノース型オリゴ糖Ｍａｎ_８（ＧｌｃＮＡｃ）_２、Ｍａｎ_７（ＧｌｃＮＡｃ）_２、Ｍａｎ_６（ＧｌｃＮＡｃ）_２、およびＭａｎ_５（ＧｌｃＮＡｃ）_２の量の減少を伴うＭａｎ_９（ＧｌｃＮＡｃ）_２を含む一方、少量もしくは検出不能な量の複合体型および／またはハイブリッド型Ｎ−グリカンを含有する。

本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質を作製する１つの方法は、
（ａ）抗体またはＦｃ融合タンパク質を発現するように操作された細胞を提供し；
（ｂ）オリゴマンノース型Ｎ−グリカンを含んでなる抗体またはＦｃ融合タンパク質の分泌を生じる条件下で細胞を培養し；次いで
（ｃ）分泌される抗体またはＦｃ融合タンパク質を回収すること
を含んでなる。

本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質を作製する別の方法は、
（ａ）抗体またはＦｃ融合タンパク質を発現するように操作された細胞を提供し；
（ｂ）オリゴマンノース型Ｎ−グリカンを含んでなる抗体またはＦｃ融合タンパク質の発現を生じる条件下で細胞を培養し；次いで
（ｃ）発現される抗体またはＦｃ融合タンパク質を回収すること
を含んでなる。

好ましい具体例では、操作される細胞は、哺乳動物の細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、またはマウスハイブリドーマ細胞である。操作される細胞は、Ｎ−グリカンの初期段階のプロセシングに必要な１つもしくはそれ以上のグリコシダーゼを欠損していてもよく、および／または培養条件は、これらのグリコシダーゼの１つもしくはそれ以上の活性が阻害されるようなものであってもよい。例えば、細胞は、α−グルコシダーゼＩ、α−グルコシダーゼＩＩ、およびα−マンノシダーゼＩからなる群から選択される１つもしくはそれ以上のグリコシダーゼを欠損していてもよい。さらに、または代替的に、操作される細胞を、α−グルコシダーゼＩ、α−グルコシダーゼＩＩ、およびα−マンノシダーゼＩからなる群から選択される１つもしくはそれ以上のグリコシダーゼのインヒビターと接触させてもよい。好ましい具体例では、インヒビターは、α−マンノシダーゼＩのインヒビター、例えば、α−マンノシダーゼＩ特異的インヒビター、キフネンシンである。

本発明は、本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質を含んでなる薬学的組成物を哺乳動物に投与し、それによって、抗体がＡＤＣＣを介して標的細胞の死滅を介在することにより哺乳動物における標的細胞を死滅させる方法をさらに提供する。標的細胞を死滅させる方法は、標的細胞の抗体指向性死滅が望ましい疾患、例えば、多様なタイプの癌、感染性疾患、ならびに炎症および自己免疫疾患を処置する方法を含む。

（図面の簡単な説明）
図１Ａは、ＩｇＧの多様なグリコフォームの略図を示す。Ａｓｎ２９７に結合したＩｇＧ炭水化物の糖残基として、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、マンノース、ガラクトース、フコース、およびシアル酸（ＮｅｕＡｃ）が挙げられる。ＩｇＧグリコフォームのバリエーションは、ガラクトース、ＮｅｕＡｃ残基およびバイセクティングＧｌｃＮＡｃのコアＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃへの結合に依存する。Ｎ−グリカンは、０個（Ｇ０）、１個（Ｇ１）または２個（Ｇ２）のガラクトース残基、ならびに還元末端上の第１のＧｌｃＮＡｃに結合した１個のフコースを含有してもよい（それぞれＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆと表される）。しかし、ほとんどの哺乳動物細胞系統から発現される組換え抗体において見出される主要なＮ−グリカンはＧ０ＦおよびＧ１Ｆである。

図１Ｂは、多様なインヒビターを用いるＮ−結合型グリコシル化経路の阻害を例示する。抗体におけるＮ−グリカンのプロセシングは、ＥＲまたはＧｏｌｇｉの内腔内のグリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼに特異的なインヒビターによって阻害され得る。ＯＴはオリゴ糖トランスフェラーゼを表し；ＧｌｃａｓｅＩおよびＩＩはα−グルコシダーゼＩおよびＩＩを表し；ＭａｎａｓｅＩおよびＩＩはα−マンノシダーゼＩおよびＩＩを表し；ＧｎＴ ＩおよびＩＩはＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩおよびＩＩを表し；ＦＴはα−１，６フコシルトランスフェラーゼを表し；ＧＴはβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを表す。

図１Ｃは、ヒトＩｇＧＦｃドメインの生来の配列のアラインメントを表し、多様なＩｇＧアイソタイプ由来の配列間の差異を星印で標記する。

図２は、精製されたＴＥＭ ｍＡｂ ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、レクチンおよび抗体ブロッティングの結果を示す。還元サンプル緩衝液中５μｇのＴＥＭ ｍＡｂ Ａサンプルの一定量を４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各ウェルにアプライし、ゲルをクーマシーブルーで染色した（図２Ａ）。レーン１はインヒビターを伴わずに処置した細胞由来のＩｇＧ１を表し；レーン２はマンノスタチンＡで処置された細胞由来のＩｇＧ１を表し；レーン３はキフネンシンで処置された細胞由来のＩｇＧ１を表し；レーン４はＮＢ−ＤＮＪで処置された細胞由来のＩｇＧ１を表す。図２Ｂは多様な抗体のレクチンブロッティングの結果を示す。タンパク質（１サンプルあたり０．５μｇ）を、図２Ａについて記載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に移行させた。膜をビオチン化レンチルレクチンとブロットさせ、ストレプトアビジン−ＨＲＰで展開した。図２Ｃは、図２Ｂと同じ膜であって、ストリッピングし、ＨＲＰと抱合させた抗ヒトＦａｂ抗体を用いて再ブロットしたものを示す。

図３は、ＴＥＭ抗体由来の炭水化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の結果を示す。インヒビターなし（Ａ）、マンノスタチンＡ（Ｂ）、キフネンシン（Ｃ）およびＮＢ−ＤＮＪ（Ｄ）で処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ａ上の炭水化物、ならびにインヒビターなし（Ｅ）およびキフネンシン（Ｆ）で処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ上の炭水化物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を用いて分析した。

図４は、キフネンシンを伴ってまたはキフネンシンを伴わずに処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ上の２−アミノ安息香酸で標識されたＮ−グリカンのＨＰＬＣプロファイリングの結果を示す。多様なＮ−グリカン標準と比較した、キフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ上の２−アミノ安息香酸で標識されたＮ−グリカンのＨＰＬＣプロファイル（Ａ）。ＥｎｄｏＨ処置の前後にキフネンシンで処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ上の２−アミノ安息香酸で標識されたＮ−グリカンのＨＰＬＣプロファイル（Ｂ）。

図５は、インヒビターで処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂのＡＤＣＣ活性を示す。（Ａ）インヒビターなし（コントロール）またはマンノスタチンＡ（インヒビター番号１）、キフネンシン（インヒビター番号２）、ＮＢ−ＤＮＪ（インヒビター番号３）で処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ ＡのＡＤＣＣ活性。（Ｂ）多様な抗体濃度でキフネンシンを伴わずに（コントロール）または伴って処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ ＡのＡＤＣＣ活性。（Ｃ）キフネンシンを伴わずに（コントロール）またはキフネンシンを伴って処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ ＢのＡＤＣＣ活性。抗ＤＮＰをネガティブコントロールとしてアッセイに含めた。

図６Ａは、フローサイトメトリー分析による標的細胞へのＴＥＭ ｍＡｂ Ａ結合を示す。インヒビターを伴わずに処置した細胞由来の抗体はコントロールとして標識される一方、マンノスタチンＡ（インヒビター番号１）、キフネンシン（インヒビター番号２）、およびＮＢ−ＤＮＪ（インヒビター番号３）で処置した細胞由来の抗体はそれら自体として標識される。図６Ｂは、フローサイトメトリー分析による標的細胞へのＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ結合を示す。ＴＥＭ抗体は、キフネンシンを伴わずに（コントロール）または伴って処置した細胞由来であり、一方でまた、抗ＤＮＰをネガティブコントロールとして含めた。

図７は、可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖａｌ１５８）とキフネンシンで処置した細胞および非処置細胞から産生される抗体との間の相互作用の表面プラズモン共鳴分析の結果を示す。目的の領域を拡大してＦｃγＲＩＩＩＡのフローを示した。

図８は、マンノース受容体の炭水化物−結合ドメインとキフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置した細胞由来の抗体との相互作用を示す。キフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置したＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂのマンノース受容体の炭水化物−結合ドメインへの結合を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）を用いて測定した。マンノース末端糖タンパク質（「Ｍａｎ３糖タンパク質」）をポジティブコントロールとして使用した。

図９は、キフネンシンを伴ってまたは伴わずにＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂの薬物動態解析の結果を示す。キフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置したＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂをマウスに注入し、多様な時間ポイントで回収した血清中の抗体の量を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。

図１０Ａは、０〜２μｇ／ｍｌキフネンシン（１もしくは３回の処置）を伴う培地中振盪フラスコにおいて増殖させたＴＥＭ ｍＡｂ Ｂを発現するＣＨＯ細胞の生存率を示す。図１０Ｂは、０〜２μｇ／ｍｌキフネンシン（１もしくは３回の処置）を伴うまたは伴わない培地において増殖させたＴＥＭ ｍＡｂ Ｂを発現するＣＨＯ細胞の細胞密度を示す。３×処置を、図１０Ａおよび１０Ｂにおいて「ｓｕｐ．」として示す。

図１１は、１１日間、多様な量のキフネンシンによって処置したＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ抗体由来の炭水化物のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析の結果を示す。キフネンシンを伴わずに（図１１Ａ）または次のようなキフネンシンの添加を伴って処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ上の炭水化物：（図１１Ｂ）０．５μｇ／ｍｌを１回、（図１１Ｃ）１μｇ／ｍｌを１回、（図１１Ｄ）１．５μｇ／ｍｌを１回、（図１１Ｅ）２μｇ／ｍｌを１回、（図１１Ｆ）０．５μｇ／ｍｌを３回、（図１１Ｇ）１μｇ／ｍｌを３回、（図１１Ｈ）１．５μｇ／ｍｌを３回、および（図１１Ｉ）２μｇ／ｍｌを３回（図１０を参照のこと）。１１日間、インヒビター（図１１Ｊ）または２μｇ／ｍｌキフネンシン（図１１Ｋ）を伴わずに処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ａ上の炭水化物（図１２もまた参照のこと）。

図１２Ａは、１１日間、２μｇ／ｍｌキフネンシン（１Ｌスピナー培養における単回処置）を伴うまたは伴わない培地において増殖させたＴＥＭ ｍＡｂ Ａを発現するＣＨＯ細胞の生存率を示す。図１２Ｂは、２μｇ／ｍｌキフネンシン（１回添加）を伴うまたは伴わない培地において増殖させたＴＥＭ ｍＡｂ Ａを発現するＣＨＯ細胞の細胞密度を示す。

図１３は、キフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置したＨＥＫ２９３細胞により発現される抗体ＣのＡＤＣＣ活性を示す。５０：１（図１３Ａ）および１００：１（図１３Ｂ）のエフェクター細胞対標的細胞比において、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、抗体Ｃにより認識される抗原を発現する細胞を標的細胞として使用した。ＩｇＧを非特異的抗体コントロールとして使用した。

図１４は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖａｌ１５８）とキフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置したＨＥＫ２９３細胞由来の抗体Ｃとの間の相互作用の表面プラズモン共鳴分析の結果を示す。可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩＡをセンサーチップ上で捕捉し、抗体Ｃの固定化されたＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を測定した。

図１５は、キフネンシンで処置しなかったＣＨＯ細胞（図１５Ａ）由来または４ｎｇ／ｍｌ（図１５Ｂ）、２０ｎｇ／ｍｌ（図１５Ｃ）、１００ｎｇ／ｍｌ（図１５Ｄ）、５００ｎｇ／ｍｌ（図１５Ｅ）、および２５００ｎｇ／ｍｌ（図１５Ｆ）のキフネンシンで処置したＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ａの炭水化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の結果を示す。

図１６は、多様な量：２０ｎｇ／ｍｌ（図１６Ａ）、４０ｎｇ／ｍｌ（図１６Ｂ）、６０ｎｇ／ｍｌ（図１６Ｃ）、８０ｎｇ／ｍｌ（図１６Ｄ）、および１００ｎｇ／ｍｌ（図１６Ｅ）のキフネンシンで処置したＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ａ由来の炭水化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の結果を示す。

図１７は、多様な量のキフネンシンで処置したＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ ＡのＡＤＣＣ活性を示す。図１７Ａは、キフネンシン（ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｓｎｅ）の非存在下または２５００ｎｇ／ｍｌキフネンシンの存在下で発現される抗体のＡＤＣＣ活性を示す。抗ＤＮＰ抗体をネガティブコントロールとして含めた。図１７Ｂは、２０、４０、６０、８０および１００ｎｇ／ｍｌキフネンシンで処置した細胞由来の同じ抗体のＡＤＣＣ活性を示す。

図１８は、３種の抗体濃度（０．００６、０．０６および０．５５μｇ／ｍｌ）における非フコシル化グリカンの百分率と特異的細胞障害性との間の関係を示す。非フコシル化グリカンの百分率を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルにおけるそれぞれ個々のグリカンピークの面積を算出することによって見積もった。

図１９は、キフネンシンで処置した細胞由来または非処置細胞由来の抗体Ｄへの多様なＦｃγＲの結合を評価するために用いられたＥＬＩＳＡ型アッセイからの結果を示す。図１９Ａは、抗体のＦｃγＲＩＡへの結合を示す。図１９Ｂは、抗体ＤのＦｃγＲＩＩＡへの結合を示す。図１９Ｃは、抗体ＤのＦｃγＲＩＩＢへの結合を示す。

（配列の簡単な説明）
配列番号１、２、３、および４は、それぞれヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４由来のＦｃドメインのアミノ酸配列である。

（発明の詳細な説明）
実施例に記載の実験では、抗体を発現するように操作されたＣＨＯおよびハイブリドーマ細胞を、α−マンノシダーゼＩインヒビター、キフネンシンの存在下で培養した。キフネンシンによる細胞の処置は、オリゴマンノース型Ｎ−グリカンを担持する抗体の産生を生じる一方、複合型Ｎ−グリカンの形成が阻止された。オリゴマンノース型グリカンを担持する抗体は、キフネンシン処置を伴わずに産生される同じ抗体と比較して、増強されたＡＤＣＣ活性を示した。それゆえ、オリゴマンノース型Ｎ−グリカンを担持する抗体およびＦｃ融合タンパク質は、標的細胞のＦｃ指向性死滅が望まれる多様な治療に有用である。

したがって、本発明は、増強されたＡＤＣＣ活性を伴う治療用抗体およびＦｃ融合タンパク質を作製する方法、ならびにかかる治療薬を使用する方法を提供する。

本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質を作製する１つの方法は、
（ａ）抗体またはＦｃ融合タンパク質を発現するように操作された細胞を提供し；
（ｂ）オリゴマンノース型Ｎ−グリカンを含んでなる抗体またはＦｃ融合タンパク質の分泌を生じる条件下で細胞を培養し；次いで
（ｃ）分泌される抗体またはＦｃ融合タンパク質を回収すること
を含む。

本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質を作製する別の方法は、
（ａ）抗体またはＦｃ融合タンパク質を発現するように操作された細胞を提供し；
（ｂ）オリゴマンノース型Ｎ−グリカンを含んでなる抗体またはＦｃ融合タンパク質の発現を生じる条件下で細胞を培養し；次いで
（ｃ）発現される抗体またはＦｃ融合タンパク質を回収すること
を含んでなる。

代替的には、オリゴマンノース型Ｎ−グリカンを含んでなる抗体は、非グリコシル化抗体またはＦｃ融合タンパク質および個別に合成されたオリゴ糖部分の化学的連結によって産生され得る。

抗体およびＦｃ融合タンパク質
抗体は、免疫グロブリンとして公知のタンパク質のクラスに属する。無傷（ｉｎｔａｃｔ）な抗体は、典型的に、それぞれ約２５ｋＤａの２本の軽鎖およびそれぞれ約５０ｋＤａの２本の重鎖からなる四量体のグリコシル化タンパク質である。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、抗体は、主要な５つのクラス：Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭに割り当てることができ、これらのいくらかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ヒトでは：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２などに分けられ得る。重および軽鎖は各々、特定のアイソタイプのすべての抗体に共通のＣ末端定常領域、および抗体に特異的な結合を付与するＮ末端可変領域を含有する。本明細書で用いられる用語「抗体」は、それらの供給源または産生の方法にかかわらずモノクローナル抗体を意味し、例えば、単特異性、多重特異性（例えば、二重特異性）、ヒト化、ヒト、キメラ、組み換え、ハイブリッド、変異型、およびＣＤＲグラフト化抗体を含む。例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、およびＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）はキメラ抗体であり；Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｚａｎａｐａｘ（登録商標）、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、およびＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）はヒト化抗体であり；Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）およびＨｕｍａｘ−ＣＤ４（登録商標）は完全なヒト抗体である。それはまた、かかる分子が免疫グロブリンのＦｃ領域に連結される限り、ｓｃＦｖの部分のような抗体分子の部分も含む。本明細書で用いられる用語「ポリクローナル抗体」は、組み換え的に産生されるポリクローナル抗体を意味する。ポリクローナル（Ｐｏｌｙｃｏｌｏｎａｌ）抗体が、本明細書に記載されるごとき他の抗体に類似の本発明の方法および組成物において用いられてもよい。

これらの多様なタイプの抗体を作製する一般的な方法は周知であり、例えば、Antibody Engineering by Borrebaeck (editor), Oxford University Press, 2nd ed., 1995; Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) by Lo (ed.), Humana Press, 2003; および Antibody Engineering (Springer Lab Manuals) by Kontermann et al. (eds.), Springer; 1st ed., 2001 に記載されている。

用語「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」、および「Ｆｃ領域」は、ヒト抗体重鎖のＣ末端フラグメント、例えば、γ鎖の約アミノ酸（ａａ）２３０〜約ａａ４４７または他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体のα、δ、εおよびμ）におけるその対応配列、あるいはその天然に存在するアロタイプを指す。他で特定しない限り、免疫グロブリンに対して一般的に受け入れられているＫａｂａｔのアミノ酸番号付けを、本開示を通して使用する（Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD を参照のこと）。用語「非ヒトＦｃドメイン」、「非ヒトＦｃ部分」、および「非ヒトＦｃ領域」は、（例えば、マウス、ラット、ヤギ、またはウサギ由来の）非ヒト抗体重鎖の対応するＣ末端フラグメントを指す。非ヒトＦｃドメインは、本明細書に記載のヒトＦｃドメインに類似の本発明の方法および組成物において用いられ得る。

図１Ｃは、ＩｇＧ１（配列番号１）、ＩｇＧ２（配列番号２）、ＩｇＧ３（配列番号３）、およびＩｇＧ４（配列番号４）由来のヒトＦｃドメインの配列を表す。配列は、これらのＦｃドメインの間で約９１〜９４％の同一性を示す。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、およびＩｇＧ３由来のヒトＦｃドメインとマウスＦｃドメインとの比較は、約６１〜６８％の同一性を示す。

免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）は、ＩｇＧ抗体の細胞エフェクター機能を介在する。Ｆｃ領域におけるアミノ酸残基のサブセットは、ＦｃγＲへの結合に関与する。ＦｃγＲＩＩＩへの結合の増加を示すアミノ酸配列の変異型はまた、増強されたＡＤＣＣ活性を有することが実証されている（Shields et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:6591-6604）。ヒトＦｃγＲＩＩＩＡでは、このサブセットは、例えば、次のものを含む：（１）Ｌｙｓ２７４−Ａｒｇ３０１およびＴｙｒ４０７−Ａｒｇ４１６（Sarmay et al. (1984) Mol. Immunol., 21:43-51 および Gergely et al. (1984) Biochem. Soc. Trans., 12:739-743）；（２）Ｌｅｕ２３４−Ｓｅｒ２３９、Ａｓｐ２６５−Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７−Ｔｈｒ２９９、およびＡｌａ３２７−Ｉｌｅ３３２（Sondermann et al. (2000) Nature, 406:267-273、ならびに（３）Ｔ２５６、Ｋ２９０、Ｓ２９８、Ｅ３３３、Ｋ３３４、Ａ３３９（Shields et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:6591-6604; また、U.S. Patent Application No. 2004/0228856 において開示された変異型についても参照のこと）。例えば、Ｆｃ変異型Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔは、生来の配列と比較して、増強されたＡＤＣＣ活性を有するものとして記載されている（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ、上掲を参照のこと）。さらに、多くのアミノ酸がＡＤＣＣ機能を喪失することなく変異されうる。

したがって、操作されたＦｃドメインは、例えば、上記で特定するような天然に存在するＦｃドメインの部分的または変異型アミノ酸配列のみを含有してもよい。それゆえ、本開示内容の目的のために、用語「Ｆｃドメイン」およびその同系物は、天然に存在する形態だけではなく、操作されたＦｃドメインも指す。例えば、Ｆｃドメインは、配列番号ｎ（ここで、ｎ＝１、２、３、もしくは４）の全長にわたって配列番号ｎに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である配列を含んでもよい。

本発明の方法では、抗体に基づく治療薬は、完全なヒトであるか、またはそうでなければ、ヒト抗体、例えば、ヒト化もしくはキメラ抗体のＦｃドメインおよびヒトＦｃドメインもしくはその機能的誘導体（例えば、１つもしくはそれ以上のＦｃ受容体、例えばＦｃγＲＩＩＩＡに結合する誘導体）を伴うＦｃ融合分子を含有する。誘導体は、例えば、保存的置換が行われた、および／または非必須アミノ酸が欠失された生来の配列を含む。

好ましい具体例では、抗体またはＦｃ部分は、ＩｇＧ１に由来する。しかし、本発明はまた、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭを含む他のクラスの抗体、ならびに例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２のようなアイソタイプによって実施することもできる。例えば、ＩｇＧ４は、エフェクター機能を活性化する能力を制限する一方、ＩｇＡは、ＡＤＣＣの強力なアクチベーターである。いずれの場合においても、抗体またはＦｃ融合分子のＡＤＣＣ活性は、本発明の方法を用いて増強することができる。

抗体のその抗原に対する特異性またはＦｃ融合タンパク質の非Ｆｃ部分のその標的に対する特異性は、特定の適用要件によって変動するであろう。例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）は、ＴＮＦ受容体（ｐ７５）の受容体−結合ドメインを含有し、Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標）は、ＬＦＡ−３のＣＤ２−結合ドメインを含む、それぞれ、ヒトＦｃドメインに融合されている。例えば、Ｆｃドメインは、酵素、毒素、増殖因子、ケモカイン、またはサイトカインに連結されてもよい。さらに、Ｆｃ融合タンパク質は、抗体ヒンジ領域および／またはリンカーを含んでもよい。

細胞および培養条件
本発明のいくつかの方法では、抗体またはＦｃ融合体を発現するように操作された細胞が提供される。好ましい具体例では、操作された細胞は、（例えば、生きている動物の部分であること（「インビボ」）の対照として）細胞培養において増殖される。例えば、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞またはヒト細胞またはマウスハイブリドーマ細胞であってもよい。抗体およびＦｃ融合タンパク質の発現に用いられ得る他のタイプの細胞の例として、マウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０）、ヒト胚性腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）、サル腎細胞（例えば、ＣＯＳ）、ヒト上皮癌細胞（例えば、ＨｅＬａ）、ヒト線維肉腫細胞（例えば、ＨＴ−１０８０）、ベビーハムスター腎臓細胞、酵母細胞、昆虫細胞などが挙げられる（例えば、Fernandez et al. (eds.) Gene Expression Systems, Academic Press, 1999 を参照のこと）。本発明および適切な培養条件に適合するいずれの細胞を使用してもよい。

操作される細胞は、Ｎ−グリカンの初期段階のプロセシングに必要な１つもしくはそれ以上のグリコシダーゼを欠損していてもよく、および／または培養条件は、これらのグリコシダーゼの１つもしくはそれ以上の活性が阻害されるようなものであってもよい。これらの条件の１つまたは両者の結果として、オリゴ糖合成がオリゴマンノース型の種に切り換えられる。

例えば、細胞は、α−グルコシダーゼＩ、α−グルコシダーゼＩＩ、およびα−マンノシダーゼＩからなる群から選択される１つもしくはそれ以上のグリコシダーゼを欠損していてもよい。目的のグリコシダーゼを欠損する細胞は、例えば、Tymms et al. (eds.) Gene Knockout Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 1st ed., 2001; および Joyner (ed.) Gene Targeting: A Practical Approach, Oxford University Press, 2nd ed., 2000 に記載の方法を用いて操作されうる。例えば、グリコシダーゼ欠損細胞は、Stanley et al. (1975) Biochemistry, 72(9):3323-3327 に記載されるように、レクチン選択を用いて操作され得る。

加えて、または、代替的に、操作される細胞は、α−グルコシダーゼＩ、α−グルコシダーゼＩＩ、およびα−マンノシダーゼＩからなる群から選択される１つもしくはそれ以上のグリコシダーゼのインヒビターと接触されていてもよい。これらの酵素のインヒビターは、例えば、小分子または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であってもよい。

ｓｉＲＮＡは、転写後の遺伝子サイレンシングを介して目的のグリコシダーゼを阻害する短い（２０〜２５ｎｔ）二本鎖ＲＮＡである。グリコシダーゼ特異的ｓｉＲＮＡは、U.S. Patent No. 6,506,559 に記載のように、および／または他の適切な方法（例えば、Appasani (ed.) RNA Interference Technology: From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, 1st ed., 2005; および Uei-Ti et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32(3):936-948 を参照のこと）を用いて調製され、使用されてもよい。

小分子α−グルコシダーゼＩインヒビターの例として、カスタノスペルミン（Pan et al. (1983) Biochemistry, 22:3975-3984）、デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ; Hettkamp et al. (1984) Eur. J. Biochem., 142:85-90）ならびにそのＮ−アルキルおよびＮ−アルケニル誘導体（例えば、Ｎ−ブチル−ＤＮＪ）；２，５−ジヒドロメチル（ｄｉｈｙｄｒｏｍｅｔｈｉｌ）−３，４−ジヒドロキシピロリジン（ＤＭＤＰ; Elbein et al. (1984) J. Biol. Chem., 259:12409-12413）；ならびにオーストラリン（Molyneux et al. (1988) J. Nat. Prod., 51:1198-1206）が挙げられる。

小分子α−グルコシダーゼＩＩインヒビターの例として、ＤＮＪならびにそのＮ−アルキルおよびＮ−アルケニル誘導体；ならびにＭＤＬ２５６３７が挙げられる（Hettkamp et al. (1984) Eur. J. Biochem., 142:85-90; Kaushal et al. (1988) J. Biol. Chem., 263:17278-17283）。

小分子α−マンノシダーゼＩインヒビターの例として、デオキシマンノジリマイシン（ＤＭＪ; Legler et al. (1984) Carbohydr. Res., 128:61-72）およびその誘導体（例えば、Bosch et al. (1985) Virology, 143:342-346 に記載のＮ−メチル誘導体）、１，４−ジデオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−マンニトール（ＤＩＭ; Fleet et al. (1984) J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1240-1241 およびPalmarzyk et al. (1985) Arch. Biochem. Biophys., 243:35-45）、ならびにキフネンシン（Elbein (1990) J. Biol. Chem., 265:15599-15605）が挙げられる。

好ましい具体例では、操作される細胞は、α−マンノシダーゼＩインヒビター、キフネンシンの存在下で培養される。特定の具体例では、キフネンシンは、０．０１〜１００μｇ／ｍｌ、０．０１〜７５μｇ／ｍｌ、０．０１〜５０μｇ／ｍｌ０．０１〜４０μｇ／ｍｌ、０．０１〜３０μｇ／ｍｌ、０．０１〜２０μｇ／ｍｌ、０．１〜１０μｇ／ｍｌ、０．１〜２．０μｇ／ｍｌ、または１〜０．５μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも１２、２４、４８、７２時間、または４、７、１０、２０日間もしくはそれ以上の期間、あるいは継続的に使用され得る。非制限的例示的具体例では、ＣＨＯまたはハイブリドーマ細胞は、１０日間を超えて約０．５〜１０μｇ／ｍｌキフネンシンと共にインキュベートされる。

産生される抗体の特徴
本発明の方法によって作製される抗体およびＦｃ融合タンパク質はオリゴマンノース型Ｎ−グリカンを含んでなり、（複合型Ｎ−グリカン（「野生型」）を伴う同じ抗体またはＦｃ融合タンパク質と比較して）１つもしくはそれ以上の以下の特性によってさらに特徴付けられる：
（ａ）より高いＡＤＣＣ活性；
（ｂ）ＦｃγＲＩＩＩＡ（および一定の他のＦｃγ受容体）に対するより高い結合親和性；
（ｃ）標的に対する実質的に同じかまたはより良好な結合特異性；
（ｄ）標的に対する実質的に同じかまたはより高い結合親和性；ならびに
（ｅ）マンノース受容体に対する実質的に同じかまたはより低い結合親和性。

「ＡＤＣＣ活性」は、ＡＤＣＣ反応を誘導する抗体またはＦｃ融合タンパク質の能力を意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃＲを発現する抗原非特異的細胞障害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞の表面に結合した抗体を認識し、続いて、標的細胞の溶解を引き起こす（即ち、「死滅させる」）細胞介在性反応である。主要なメディエーター細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、ＦｃγＲＩＩＩＡは活性化受容体であり、ＦｃγＲＩＩＩＢは阻害受容体であり；単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する（Ravetch et al. (1991) Annu. Rev. Immunol., 9:457-92）。ＡＤＣＣ活性は、インビトロアッセイ、例えば、実施例ならびに Shields et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:6591-6604 に記載のような末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および／またはＮＫエフェクター細胞を用いる^５１Ｃｒ遊離アッセイ、あるいは別の適切な方法を用いて直接評価することができる。ＡＤＣＣ活性は、標的細胞の溶解が最大の半分である抗体またはＦｃ融合タンパク質の濃度として表されてもよい。したがって、いくつかの具体例では、溶解レベルが野生型コントロールによる最大の半分のレベルと同じである本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質の濃度は、野生型コントロール自体の濃度より少なくとも２、３、５、１０、２０、５０、１００倍低い。さらに、例えば、ＴＥＭ ｍＡｂ Ａのようないくつかの具体例では、本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質は、野生型コントロールと比較して、より高い最大標的細胞溶解を示してもよい。例えば、本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質の最大標的細胞溶解は、野生型コントロールより１０％、１５％、２０％、２５％もしくはそれ以上高くてもよい。

抗体またはＦｃ融合タンパク質のその標的ならびにＦｃ受容体およびマンノース受容体への結合親和性は、実施例に記載のような表面プラズモン共鳴および／または Shields et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:6591-6604 に記載のようなＥＬＩＳＡまたは他の適切な方法を用いて測定されてもよい。いくつかの具体例では、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する抗体またはＦｃ融合タンパク質の結合定数Ｋ_ｄは、野生型コントロールのそれより少なくとも２、５、１０、５０倍もしくはそれ以上大きくてもよい。本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質のその標的（例えば、抗原）に対する結合定数Ｋ_ｄは、野生型コントロールと実質的に同じ（すなわち、±５０％）かまたはそれより大きくてもよい。いくつかの具体例では、本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質のマンノース受容体に対する結合定数Ｋ_ｄは、野生型コントロールと実質的に同じ（すなわち、±５０％）かまたはそれ未満の可能性がある。

いくつかの具体例では、本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質の一定の薬物動態学的パラメータが野生型コントロールのそれらと同じかもしくはより良好である。例えば、いくつかの具体例では、消失半減期（ｔ_１／２）および／または濃度曲線下面積（ＡＵＣ）は、野生型コントロールと実質的に同じ（すなわち、±５０％）またはそれより大きくてもよい。薬物動態学的パラメータは、ヒトにおいて、または（例えば、実施例に記載のような）適切な動物モデルまたは他の方法（例えば、Shargel et al. (1995) Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics, 4th ed., McGraw-Hill/Appleton を参照のこと）を用いて測定することができる。

抗体またはＦｃ融合タンパク質の結合特異性は、例えば、実施例に記載のようなフローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、または別の適切な方法により調べられ得る。いくつかの具体例では、本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質は、標的細胞の表面上で発現されるヒト標的タンパク質（抗体の場合、ヒト抗原）に対して指向される。いくつかの具体例では、それは、可溶性抗原に対して指向されてもよい。他のいくつかの具体例では、本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質は、病原性の標的（例えば、ウイルスまたは細菌タンパク質）に対して指向される。抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ヒト標的に対して特異的であるか、または他の種由来の対応する標的と交差反応するかのいずれかであってもよい。

本発明の抗体およびＦｃ融合分子上のオリゴマンノース型Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ_９（ＧｌｃＮＡｃ）_２、Ｍａｎ_８（ＧｌｃＮＡｃ）_２、Ｍａｎ_７（ＧｌｃＮＡｃ）_２、Ｍａｎ_６（ＧｌｃＮＡｃ）_２、およびＭａｎ_５（ＧｌｃＮＡｃ）_２からなる群から選択される１つもしくはそれ以上のオリゴマンノース型オリゴ糖を含んでなる。

したがって、好ましい具体例では、本発明の抗体およびＦｃ融合タンパク質の組成物は、主に、減少したもしくは検出不能な量のオリゴマンノース型Ｎ−グリカンＭａｎ_８（ＧｌｃＮＡｃ）_２、Ｍａｎ_７（ＧｌｃＮＡｃ）_２、Ｍａｎ_６（ＧｌｃＮＡｃ）_２、およびＭａｎ_５（ＧｌｃＮＡｃ）_２を伴うＭａｎ_９（ＧｌｃＮＡｃ）_２を含有する一方、少量（例えば、すべてのＮ−グリカンに対して１０％未満）もしくは検出不能な量の（例えば、Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、およびＧ０Ｆ−Ｇｎのような）複合型Ｎ−グリカンを含有する。

いくつかの具体例では、本発明の方法により生成される組成物は、（すべてのＮ−グリカンに対してモル比で）少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％もしくはそれ以上のオリゴマンノース型グリカンＭａｎ_５−９（ＧｌｃＮＡｃ）_２を含有する。いくつかの具体例では、本発明の組成物におけるＭａｎ_５−９（ＧｌｃＮＡｃ）_２は実質的にフコシル化されていない、すなわち、それらは（すべてのＮ−グリカンに対してモル比で）３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％未満またはそれ以下のフコースを含有する。いくつかの具体例では、該組成物は、（すべてのＮ−グリカンに対してモル比で）３０％、２０％、１０％、５％、１％未満もしくはそれ以下のＭａｎ_５（ＧｌｃＮＡｃ）_２および／またはＭａｎ_６（ＧｌｃＮＡｃ）_２グリカンを含有する。いくつかの具体例では、該組成物は、少量（すなわち、すべてのＮ−グリカンに対してモル比で１０％未満）または検出不能な量のＭａｎ_４（ＧｌｃＮＡｃ）_２を含有する。いくつかの具体例では、該組成物は、（すべてのＮ−グリカンに対してモル比で）８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％未満またはそれ以下の複合型グリカンを含有する。

グリカン組成物は、例えば、実施例に記載のようなレクチンブロッティング、ＨＰＬＣおよび／または質量分析ならびに／あるいは例えば、Townsend et al. (1997) Techniques in Glybiology, CRC Press に記載のごとき他の方法を用いて測定することができる。

使用
本発明は、本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質を哺乳動物に投与し、それにより抗体がＡＤＣＣを介して標的細胞の死滅を介在することを含んでなる、哺乳動物における標的細胞を死滅させる方法をさらに提供する。本発明の方法における標的細胞は、癌細胞、感染細胞、免疫系の細胞（例えば、Ｂ細胞もしくはＴ細胞）、または細胞の死滅が所望される他の任意の細胞であってもよい。抗体またはＦｃ融合タンパク質が投与される哺乳動物は、ヒト、または、別の種、例えばげっ歯類であってもよい。

標的細胞を死滅させる方法として、本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質を含んでなる薬学的組成物を哺乳動物に投与することによる、標的細胞の抗体指向性死滅が望まれる疾患を処置する方法が挙げられる。抗体またはＦｃ融合タンパク質に加えて、薬学的組成物は薬学上許容される賦形剤を含んでなる。薬学的組成物の製剤化は、意図される投与経路、有効成分の生物学的活性および他のパラメータに依存して変動する（例えば、Rowe et al. (2003) Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th ed., APhA Publications を参照のこと）。

本発明の抗体に基づく治療薬は、標的細胞の抗体指向性死滅が望まれるいずれかの疾患または病態に広範に適用可能である。本発明の組成物によって処置すべき疾患および病態として、多様なタイプの癌、感染性疾患、炎症性および免疫介在性疾患（自己免疫疾患を含む）、腎疾患、移植（例えば、幹細胞または臓器移植）などが挙げられる。

本発明の組成物による処置に影響を受け得る癌の例として、白血病、リンパ腫、骨髄腫および造血系由来の他の癌、黒色腫および皮膚の他の癌、ならびに腎臓、胸部、肺、骨、結腸、直腸、子宮、頚部、卵巣、膵臓、前立腺、精巣、膀胱、胃、脳、および甲状腺の癌が挙げられるが、これらだけに限定されない。さらなる癌としては、U.S. Patent No. 6,359,193 の表１に列挙されたものが挙げられる。

本発明の組成物による処置に影響を受け得る感染性疾患の例として、ウイルス感染（例えば、ＲＳＶ、ＨＣＶ、およびウエストナイルウイルス）が挙げられる。

本発明の組成物による処置に影響を受け得る炎症性および免疫介在性疾患の例として、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびループス腎炎、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ；Ｉ型糖尿病）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、セリアック病、自己免疫性甲状腺疾患、シェーグレン症候群、自己免疫性胃炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性皮膚病、自己免疫性拡張型心筋症、心筋炎、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、血管炎（例えば、高安動脈炎およびウェゲナー肉芽腫症）、筋肉の自己免疫疾患、精巣の自己免疫疾患、自己免疫性卵巣疾患、ならびに自己免疫性ぶどう膜炎が挙げられる。

本発明の組成物による処置に影響を受け得るさらなる障害として、線維症（例えば、腎線維症）、アジソン病、シドナム舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）、大腸炎、多発性筋肉痛、悪性貧血、および悪性貧血が挙げられる。

「投与」は、特定の送達システムに何ら限定されず、非経口（皮下、静脈内、骨髄内、関節内、筋肉内、または腹腔内注入を含む）、局所、経皮、および経口を含んでもよい。投与は、単回投薬または反復投与で行ってもよい。抗体およびＦｃ融合タンパク質は、他の治療用薬剤との組み合わせで投与してもよい。例えば、癌を処置する時に、抗体およびＦｃ融合タンパク質が、化学療法剤（例えば、PCT Application Pub. No. WO 2005/050200 を参照のこと）、放射線および他の処置（例えば、Schwartz et al. (ed.) Combination Cancer Therapy: Modulators and Potentiators, Humana Press, 2005 を参照のこと）と組み合わされてもよい。

最も一般的には、抗体およびＦｃ融合タンパク質は、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、１〜１０μｇ／ｋｇでの１週間に１回の投与、緩徐な静脈内（ＩＶ）輸注による投薬によって、外来施設において投与される。適切な治療有効用量、投与経路および投薬計画は、問題の特定の抗体の生物学的活性に基づいて医師により決定され；市販の抗体についての例示的用量は、2005 Physicians’Desk Reference (PDR) Thomson Healthcare, 59th ed., 2004; および Remington: The Science and Practice of Pharmacy, eds. Gennado et al., 20th ed, Lippincott, Williams & Wilkins, 2000 において見出すことができる。

以下の実施例は、本発明の例示的な具体例を提供する。実施例は、いかなる方法においても本発明を制限するものではない。

実施例
実施例１：細胞の処置および抗体の精製
ＴＥＭ ｍＡｂ Ａ、腫瘍血管関連抗原に対する抗体を発現するハイブリドーマ細胞を、低ＩｇＧを含む１％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、５μｇ／ｍｌウシインスリン、５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、０．０１ｍＭエタノールアミンおよび２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを含有する培地で増殖させた。細胞を、次のインヒビター：２０μｇ／ｍｌマンノスタチンＡ、および０．５ｍＭ ＮＢ−ＤＮＪで４日間、１回処置し；０および２日目に２μｇ／ｍｌキフネンシンで２回処置するか；またはインヒビターなし（「コントロール」）で培養した。

ＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ、腫瘍血管関連抗原に対する異なる抗体を発現するＣＨＯ細胞を、４ｍＭグルタミンを含むＣＤ−ＣＨＯ培地において増殖させた。細胞を３日間培養する一方、０および２日目に２μｇ／ｍｌキフネンシンで処置するかまたはキフネンシンを伴わずに（「コントロール」）培養した。培地中の抗体を、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムを用いて精製した。カラムに充填した後、カラムを１５カラム容積のＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．１、またはＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８．０で広範に洗浄し、抗体を、５０ｍＭコハク酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．０もしくはｐＨ３．７５で溶離した。溶離液を、チューブ内に、画分あたり１ｍｌにおいて、１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０で回収した。精製した抗体を、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．２に緩衝液交換し、Ａ２８０を用いてタンパク質濃度を調べた。抗体の精製度を４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で評価し、クーマシーブルーで染色した。ＴＥＭ ｍＡｂ Ａでは、９０％を超える精製度が観察された（図２Ａ）。ＴＥＭ ｍＡｂ Ｂでは、同様の結果が得られた。

実施例２：レクチンブロッティング
実施例１に記載のように精製した抗体サンプルを４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。膜を、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１％ＢＳＡおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４中のビオチン化レンチルレクチン（α−１，６結合フコースに特異的なレクチン）と共に１時間インキュベートさせた。その後、膜を洗浄し、同じ緩衝液中のストレプトアビジン−ＨＲＰと共にインキュベートさせ、次いで、化学発光（ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）試薬を用いて展開した。

ＴＥＭ ｍＡｂ Ａについての結果を図２Ｂに示す。結果は、キフネンシンで処置した細胞由来の抗体が、α−１，６−結合フコシル化構造を伴うＮ−グリカンの含有がかなり少なかったことを示す。（ＴＥＭ ｍＡｂ Ｂサンプルでも、同様の結果が観察された。）

同一の膜を、ストリッピング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてストリッピングし、抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰ抗体と共にインキュベートし、化学発光（ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）試薬を使用して展開した。結果（図２Ｃ）により、抗体サンプルの等価な充填（ｌｏａｄｉｎｇ）が確認された。

実施例３：オリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析
実施例１に記載されるごとく精製された抗体由来のＮ−結合グリカンを、ＰＮＧａｓｅ Ｆで遊離させた。１０ｋＤａフィルターを介するろ過後、ろ液を、ＤｏｗｅｘＡＧ−５０（Ｈ^＋）、ＡＧ５０１、およびＣ１８ｚｉｐｔｉｐで連続的に処置した。サンプルの一定量を標的、続いてｓＤＨＢマトリックスに適用した。Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＰＲＯ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州、米国）を陽イオンおよび反射モードで使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを得た。

実施例１に記載されるように、ＴＥＭ ｍＡｂ Ａの分析の結果を、図３および表１に示す。

（表１）

^ａｍ／ｚ値は［Ｍ＋Ｎａ］^＋イオンに対するものである。

データは、キフネンシンで処置した細胞由来のＴＥＭ抗体が、主に、主要なＮ−グリカンとしてフコースを伴わないＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２（Ｍａｎ９）、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２（Ｍａｎ８）およびＭａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２（Ｍａｎ７）を含有した（図３Ｃおよび３Ｆ）一方、コントロール細胞由来の同じ抗体における主要なＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｆｕｃ_１（Ｇ０Ｆ）およびＧａｌ_１ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｆｕｃ_１（Ｇ１Ｆ）を含む０または１個のガラクトースを伴うフコシル化二分岐種であった（図３Ａおよび３Ｅ）ことを示す。マンノスタチンＡで処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ａにおける炭水化物は、コントロール抗体において見出されるそれらに類似した（図３Ｂ）。しかし、ＮＢ−ＤＮＪで処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ａでは、有意な量のＧｌｃ_１Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２（Ｍａｎ９Ｇｌｃ）が存在した（図３Ｄ）。データは、キフネンシンが複合型構造に対するグリコシル化を阻止する時に、ＮＢ−ＤＮＪよりも有効であることを示す。マンノスタチンＡで処置した細胞において発現される抗体では、グリコシル化の変化は生じなかった。

実施例４：２−アミノ安息香酸で標識されたＮ−グリカンのＨＰＬＣ分析
分析を、若干の変更を伴って、Anumula et al. (1998) Glycobiology, 8:685-694 に記載のように行った。２００μｇの抗体から遊離させたＮ−グリカンを、Ｂｉｏｄｉａｌｙｚｅｒにより一晩精製した。物質の半分を２−アミノ安息香酸で標識し、ＧｌｙｃｏＣｌｅａｎ Ｓカートリッジ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）で浄化した。いくつかのＮ−グリカン標準もまた、２−アミノ安息香酸で標識した。２−アミノ安息香酸で標識されたグリカンを、蛍光検出器（励起波長２３０ｎｍおよび蛍光波長４２５ｎｍ）を具備するＨＰ１１００システムを用いてＡｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｄカラム（４．６×２５０ｍｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で分離した。カラムを、７０％溶媒Ａ（アセトニトリル中２％酢酸および１％阻害型テトラヒドロフラン）において平衡化した。２−アミノ安息香酸で標識されたグリカンを、３０〜５０％溶媒Ｂ（水中５％酢酸、３％トリエチルアミン、および１％阻害型テトラヒドロフラン）の直線勾配を、６０分間にわたって、１ｍｌ／分の流速で使用して、５０℃で溶出させた。９５％溶媒Ｂおよび３０％溶媒Ｂを用いる以後の洗浄によりカラムを浄化し、再平衡化した。最終注入量を、２０μｇの抗体から遊離されるグリカンのプールと等量にした。

蛍光で標識されたＮ−グリカンのＨＰＬＣ分析の結果により、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の結果（実施例３）が確認された。コントロールＴＥＭ ｍＡｂ Ｂについて、ＨＰＬＣの第１のピークはＧ０Ｆ標準と整合した（図４Ａ）。他の２つの残りのピークは、Ｇ１ＦおよびＧ２Ｆと推定される。キフネンシンで処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂのスペクトルにおいて、最後および主要なＭＡＬＤＩピークがＭａｎ９標準と整合した。しかし、抗体由来の推定されたＭａｎ７およびＭａｎ８ピークは、Ｍａｎ７およびＭａｎ８標準と整合しなかった。Ｍａｎ７およびＭａｎ８標準とサンプルピークとの間の溶出時間の差異は、構造の異なる異性体の組成に起因するであろう。キフネンシンで処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ由来の蛍光で標識されたＮ−グリカンのＥｎｄｏＨ消化は、Ｍａｎ９、Ｍａｎ８およびＭａｎ７ピークの消失を生じ、それらのオリゴマンノース構造の同一性が確認された（図４Ｂ）。

実施例５：ＡＤＣＣアッセイ
異なるインヒビターで処置した細胞由来の抗体サンプルを、ＡＤＣＣについて、次のとおりに分析した。標的細胞、ＴＥＭ抗原を伴うＳＫＯＶ３またはＭＤＡ２３１を含む乳癌細胞系統を、増殖培地で再懸濁し、５％ＣＯ_２の３７℃インキュベーター中において、１〜２時間、Ｎａ_２ ^５１ＣｒＯ_４で標識した。次いで、細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ培地で再懸濁し、１００：１または２００：１のエフェクター：標的比で、多様な濃度の抗体およびエフェクター細胞を混合した。エフェクター細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離を用いて調製した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であった。細胞および抗体を、４〜１８時間、３７℃で、５％ＣＯ_２である加湿インキュベーターにおいてインキュベートした。インキュベーション後、無傷（ｉｎｔａｃｔ）な細胞を、遠心分離によって取り出すかまたは界面活性剤を用いて溶解させた。実験的放出（Ｅ）、自然放出（Ｓ、エフェクター細胞および抗体を伴わない標的からの放出）、ならびに全溶解物（Ｔ、界面活性剤で処置した標的細胞からの放出）由来の上清における放射能を、放射カウンターを用いて調べた。特異的溶解パーセントを、次のとおりに算出した：［（Ｅ−Ｓ）／（Ｔ−Ｓ）］＊１００。

多様なインヒビターの存在下で発現されるハイブリドーマ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ａ抗体のＡＤＣＣアッセイの結果を図５Ａに示す。データは、キフネンシン（インヒビター番号２）で処置したハイブリドーマ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ａが、抗体サンプルの間で最も高いＡＤＣＣ活性を有したことを示す。ＮＢ−ＤＮＪ（インヒビター番号３）で処置した細胞由来の抗体は、キフネンシン処置細胞由来の同じ抗体より低いＡＤＣＣ活性を示したが、残りのすべてのサンプルと比較して、より高い活性を示した。マンノスタチンＡ（インヒビター番号１）で処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ ＡのＡＤＣＣ活性は、コントロールサンプルと同程度であった。結果は、ＡＤＣＣ活性が抗体のグリコシル化パターンと相関関係にあることを示した。

同様のＡＤＣＣアッセイを、キフネンシン（インヒビター番号２）処置細胞ならびに非処置コントロール細胞により産生されるＴＥＭ ｍＡｂ Ａにより行った。結果（図５Ｂ）は、インヒビターを伴わずに処置したハイブリドーマ細胞（コントロール）由来の抗体と比較して、キフネンシンで処置した細胞由来の抗体では、ＡＤＣＣ活性は１０〜１００倍の増加を示した。別の同様のＡＤＣＣアッセイを、キフネンシンで処置したＣＨＯ細胞および非処置コントロール由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂにおいて行った。結果（図５Ｃ）は、キフネンシン処置細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂが、コントロールより高いＡＤＣＣ活性を伴う抗体を産生したことを示した。

実施例６：フローサイトメトリー分析
ＦＡＣＳ（登録商標）アッセイを行うことにより、標的細胞上の抗原に対するＴＥＭ ｍＡｂ ＡおよびＴＥＭ ｍＡｂ Ｂの結合を調べた。実施例５に記載のように、２×１０５標的細胞を、多様なインヒビターで処置した細胞由来の抗体と共にインキュベートした。インキュベート溶液は、５％ウシ胎児血清および５％ヤギ血清を伴うＰＢＳ中に１〜１０μｇ／ｍｌ抗体を含有した。結合した抗体を、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＦｃによって検出し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。

ＦＡＣＳ（登録商標）分析の結果は、ＡＤＣＣ活性の差異（実施例５を参照のこと）にかかわらず、ＴＥＭ ｍＡｂ Ａ（図６Ａ）およびＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ（図６Ｂ）が、キフネンシンを伴ってまたは伴わずに産生されたかどうかに関係なく、細胞表面抗原に等しく良好に結合したことを示す。

実施例７：Ｆｃ受容体およびマンノース受容体結合
ＡＤＣＣ活性は、Ｆｃ受容体、特に、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する抗体または抗体−抗原複合体の結合と相関関係があるため、抗体とＦｃγＲＩＩＩＡとの相互作用を、表面プラズモン共鳴を用いて調べた。ＴＥＭ ｍＡｂ ＢをＴＥＭ抗原と一緒にＣＭ５チップ上に固定化した。次いで、可溶性の組み換えヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖａｌ１５８）を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００バイオセンサーユニットに注入して結合をモニターした。

結果（図７）は、インヒビターの非存在下で発現させた同じ抗体と比較して、キフネンシンの存在下で発現させたＴＥＭ ｍＡｂ Ｂへのより高いＦｃγＲＩＩＩＡの結合を示した。キフネンシン処置細胞由来の抗体のＦｃ受容体への結合の増大は、これらの抗体のＡＤＣＣ活性の増強と相関関係にあった。

マンノース受容体を介するインビボのクリアランスは、かなり迅速であることが公知である。したがって、マンノース受容体に対するＴＥＭ ｍＡｂ Ｂの結合を表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））を用いて調べた。炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）４−７およびＨＰＣタグを含有する可溶性マンノース受容体を、ＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅ表面（２００ＲＵ）に固定化した。抗体を、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２および０．００５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０を含有するＨＢＳ結合緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）において１００ｎＭに希釈し、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００バイオセンサーユニットに注入して結合をモニターした。マンノース末端グルコセレブロシダーゼ（１００ｎＭ）をポジティブコントロールとして含めた。

マンノース受容体結合実験の結果（図８）は、キフネンシン処置またはキフネンシン非処置細胞のいずれか由来の抗体の結合が、コントロール（Ｍａｎ_３（ＧｌｃＮＡｃ）_２のようなオリゴマンノース型Ｎ−グリカンを有するタンパク質（「Ｍａｎ３糖タンパク質」）よりかなり低かったことを示した。これらの結果は、インビボで投与される場合、オリゴマンノース型グリカンを担持する抗体がマンノース受容体により急速に浄化されないであろうことを示唆する。

実施例８：抗体親和性分析
以下の通りの表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））を用いて、キフネンシンの存在下で発現されるＴＥＭ ｍＡｂ Ｂの結合親和性を、インヒビターの非存在下で発現される抗体と比較した。固定化された抗原を担持するＣＭ５チップを用いて抗体の親和性を測定した。０．００５％ｓｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０ランニング緩衝液を含有するＨＢＳ−ＥＰまたはＰＢＳを用いて異なる濃度に希釈した抗体を、５分間２回または３回で注入し、続いて、５分の解離を行った。４０ｍＭ ＨＣｌを用いて表面を再生させた。次いで、１：１結合モデルを使用してデータを適合した。

結果（表２）は、１：１結合モデルを使用してデータを適合した場合、キフネンシンの存在または非存在下で発現されるＴＥＭ ｍＡｂ Ｂの同程度の親和性を示した。センサーグラムは、試験した各濃度の両方のサンプルについてほぼ同一の結合曲線を示した。これらの結果は、ＦＡＣＳを用いた標的細胞上の抗原への抗体結合に関するデータ（実施例６）に一致した。

（表２）

^aオン速度；^ｂオフ速度；^ｃ会合速度；^ｄ解離速度

実施例９：薬物動態解析
キフネンシンの存在または非存在下で発現されるＴＥＭ ｍＡｂ Ｂを注入したマウスを用いて薬物動態解析を行った。尾静脈を介して、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスにＴＥＭ ｍＡｂ Ｂを５ｍｇ／ｋｇで注入した。１グループあたりマウス１０匹とした。注入後１、６時間ならびに１、２、および７日に血液を採取し、凍結させた。血清中のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂの量を抗ヒト抗体によるＥＬＩＳＡを用いて測定した。

結果を図９に表す。キフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂサンプルの見かけ上の消失半減期における有意な差異はなかった。注入後７日目のマウスの血清において、両方の抗体の量にほとんど差異は観察されなかった。結果は、インビトロでのマンノース受容体結合データ（実施例７）および薬物動態学に基づいて、ＴＥＭ ｍＡｂ上のオリゴマンノース型グリカンが、マンノース受容体を介する有意なクリアランスに寄与しないことを示唆する。

実施例１０：バッチ培養における抗体の産生
多様な量のキフネンシンで処置したまたは非処置のバッチ培養由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂの産生を評価した。振盪フラスコ中のＣＨＯ細胞を、単回または３回の添加（４日間離して）で、０、０．５、１、１．５、または２μｇ／ｍｌで処置し、１１日間培養した。細胞生存率（トリパンブルーを使用する）および細胞の数を少なくとも１日おきに評価した。

０．５〜２μｇ／ｍｌ濃度における１回のキフネンシン処置を伴う培養における１１日間の抗体ＶＰＲ（体積産生速度）は、同じ量のインヒビターによる３回の処置におけるそれと同等であった。結果は、同程度の量の抗体が異なる条件下で産生されることを示した（表３）。細胞生存率は異なる条件で同等であった（図１０Ａ）一方、細胞密度は、キフネンシン処置細胞でより低かった。キフネンシンの３回添加による細胞の処置は、非処置コントロールまたは１回のキフネンシン処置のそれよりかなり低い細胞密度を生じた（図１０Ｂおよび表３）。

同様に、バッチ培養におけるＴＥＭ ｍＡｂ Ａの産生についてのキフネンシンの影響も試験した。細胞を、１Ｌスピナー中で２μｇ／ｍｌキフネンシン（単回添加）を伴うまたは伴わない培地中で１１日間培養した。（トリパンブルーを用いる）細胞生存率および細胞の数を少なくとも１日おきに評価した。

（表３）

^ａ体積産生速度；^ｂピーク細胞密度の１日における生存細胞；^ｃ特異的産生速度

結果は、同程度の細胞生存率および細胞数を示した（図１２）。キフネンシンでは、コントロールと比較して抗体力価の約６０％の増加が観察された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析の結果はまた、キフネンシンで処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ａにおける主要な種としてＭａｎ８およびＭａｎ９を含むＮ−グリカンの存在を示した（図１１Ｋ）。これらの培養から精製されるＴＥＭ ｍＡｂ Ｂの炭水化物は、用いられるキフネンシンの量にかかわらず同定度のＭａｎ９およびＭａｎ８を含むＮ−グリカンを含有した（図１１および表４）。０．５μｇ／ｍｌ濃度における１回のキフネンシン処置は、オリゴマンノース型構造の産生を生じるのに十分であった。

キフネンシン処置は、細胞生存率または抗体産生に影響を及ぼさなかった。細胞増殖は、特に、高用量および複数回のキフネンシン処置、振盪フラスコ中のＣＨＯ細胞において遅延されたが、スピナー培養ではそうではなかったことから、キフネンシン処置は、抗体発現および／または分泌効率の増加を生じうることが示唆される。

（表４）

^ａｍ／ｚ値は［Ｍ＋Ｎａ］^＋イオンに対するものである。

実施例１１：キフネンシンで処置された細胞において産生される抗体の増強されたＡＤＣＣ活性およびより高いＦｃγＲＩＩＩＡ結合のさらなる実施例
小細胞肺癌抗原（抗体Ｃ）に対する抗体を、キフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置した細胞において産生させた。抗体のｃＤＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞に一時的にトランスフェクトした。２日目に培地を取り除き、２μｇ／ｍｌキフネンシンを伴うまたはキフネンシンを伴わない新鮮な培地をＴ−１５０ 三層フラスコに添加した。３日間の細胞のキフネンシンによる処置後に培地を回収した。抗体を１５０〜２００ｍｌの培地から精製した。抗体の純度を４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した一方、グリコシル化をレクチンブロットを用いて調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果は、抗体サンプルの高い精製度を示した。キフネンシンの存在下で発現させた抗体に存在するα−１，６−結合フコースはかなり少なかった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析は、キフネンシンの存在下で発現される抗体Ｃにおけるフコースを伴わないＭａｎ９およびＭａｎ８へのグリカンの完全な修飾を示した。

２つのサンプルのＡＤＣＣ活性を、標的細胞として腫瘍抗原を内在的に発現する細胞を用いて測定した。エフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ）および標的細胞を５０：１または１００：１の比で５時間インキュベートすることによりアッセイを行った。図１３Ａおよび１３Ｂ各々に示す結果は、低抗体濃度におけるキフネンシンの存在下で発現される抗体ＣのＡＤＣＣ活性の有意な増強を示す。

キフネンシンで処置された抗体ＣのＦｃγＲＩＩＩＡ結合を、ＢＩＡｃｏｒｅを用いて測定した。ＨＰＣ４でタグ化された可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖａｌ１５８）を、１ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有するＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で３０μｇ／ｍｌに希釈し、１４，５００ＲＵ抗ＨＰＣ４チップに３分間、５μｌ／分で注入した。すべての抗体を、同じ緩衝液で１００ｎＭに希釈し、可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡの１分間の捕捉後、注入し、続いて、３０μｌ／分で３分間の解離に供した。表面を、２パルスのＨＢＳ−Ｐ緩衝液中５ｍＭ ＥＤＴＡで再生した。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析の結果は、コントロール抗体と比較して、キフネンシンの存在下で発現される抗体のより高いＦｃγＲＩＩＩＡ結合を示した（図１４）。結果は観察されたＡＤＣＣの増強と一致する。修飾された抗体はより緩徐なオフ速度を示す（図１４を参照のこと）。

実施例１２：キフネンシン濃度の滴定
抗体機能上の混合されたオリゴマンノースおよび複合型グリカンの影響を調べるために、ＴＥＭ ｍＡｂ Ａを発現する細胞を多様な量のキフネンシンで処置した。第１の実験では、ＴＥＭ ｍＡｂ Ａを発現するＣＨＯ細胞クローンを、０、４、２０、１００、５００および２５００ｎｇ／ｍｌのキフネンシンで１１日間処置した。培地を回収し、プロテインＡカラムを用いて抗体を精製した。タンパク質のピークを含む画分をプールし、ＰＢＳに対して透析した。

６つの抗体サンプルの精製度を、還元条件下で４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認し、続いて、クマシーブルーで染色した。確認された結果から、これらの抗体が純粋であることが確認された。

これらの６つのサンプルに対し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行った（図１５Ａ〜１５Ｆに示す）。結果は、２０ｎｇ／ｍｌキフネンシンで処置した細胞由来の抗体において少量のオリゴマンノース構造（Ｍａｎ５／Ｍａｎ６）のみを示した一方、１００ｎｇ／ｍｌキフネンシンは完全なオリゴマンノース構造を生じた。

二回目の滴定実験を、より狭い範囲のキフネンシン濃度、具体的には、２０〜１００ｎｇ／ｍｌで行った。１１日間の処置後、各処置条件に由来する５０ｍｌの培地を回収し、抗体を精製した。ピークを含有する画分をプールし、反復遠心分離を伴うＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）フィルターを用いてＰＢＳへの緩衝液交換を行った。ＴＥＭ ｍＡｂ Ａ抗体サンプルの一定量を４〜１２％ＮｕＰＡＧＥにアプライし、精製度を確認するためにクーマシーブルーで染色した。

これらのサンプルに対して行われたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果を図１６Ａ〜１６Ｅに示す。２０および１００ｎｇ／ｍｌのキフネンシンで処置した細胞由来の抗体のグリカン構造が第１の滴定実験で観察されたものと類似した一方で、４０および６０ｎｇ／ｍｌ濃度のキフネンシン処置は混合されたオリゴマンノースおよび複合型グリカンを有する抗体を生じた。

さらに、ＡＤＣＣアッセイを行った。結果は、第１の滴定実験において、いずれのインヒビターを伴わずに産生される抗体と比較して、２５００ｎｇ／ｍｌキフネンシンで処置した細胞由来の抗体ではより高いＡＤＣＣ活性を示した（図１７Ａ）。第２の滴定実験由来の５つのサンプルを比較した場合、６０、８０および１００ｎｇ／ｍｌキフネンシンの存在下で発現される抗体は、２０および４０ｎｇ／ｍｌキフネンシンで処置した細胞由来の抗体より高いＡＤＣＣ活性を示した。図１７Ｂを参照のこと。

第２の滴定実験におけるそれぞれのキフネンシン処置由来の抗体におけるフコシル化および非フコシル化グリカンの量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルにおけるそれぞれの個々のグリカンのピーク面積を算出することにより見積もった。非フコシル化グリカンパーセントを、特異的標的細胞溶解パーセントに対してプロットし、図１８に示す。結果は、８０％を超える非フコシル化グリカンを伴うＴＥＭ ｍＡｂ Ａが相対的に高いＡＤＣＣ活性を有することを示唆する。

要約すると、≧８０ｎｇ／ｍｌのキフネンシンで処置した細胞由来の抗体は、フコースを伴わないオリゴマンノース構造のみを示した。キフネンシン濃度を６０ｎｇ／ｍｌに、次いで、さらに２０ｎｇ／ｍｌに低下させると、抗体は、フコースを伴う複合型グリカンの量の増加を示した。より高いＡＤＣＣ活性が６０ｎｇ／ｍｌもしくはそれ以上のキフネンシン濃度で達成され、今度は、８０％を超える非フコシル化グリカンを産生した。

実施例１３：ヒトＦｃ受容体のキフネンシンで処置した細胞由来の抗体に対する結合
多様な組み換えヒトＦｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢ）に対するキフネンシン改変抗体Ｄ、別の抗腫瘍抗体の結合を、ＥＬＩＳＡ型結合アッセイを用いて分析した。９６ウェルマイクロタイタープレートを、以下の濃度：０．５μｇ／ｍｌのＦｃγＲＩ、２．５μｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＡ、および２μｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＢにおけるＲ＆Ｄシステム由来のＦｃγ受容体でコートした。ウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで室温において１時間ブロックした。０〜１００μｇ／ｍｌの範囲のキフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置した細胞由来の抗体Ｄを含む抗体をウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。抗体濃度を１００μｇ／ｍｌから開始し、１：２連続希釈を用いた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでプレートを３回洗浄した。結合した抗体を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳにおけるヤギ抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰ（１：１５００）との室温での１時間のインキュベーションを用いて検出した。次いで、プレートを洗浄し、ＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ ｌａｂ）により、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＢでは１５分間ならびにＦｃγＲＩＩＡでは３０分間展開した。反応を２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。キフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置した細胞由来の抗体Ｄは、低い親和性の受容体、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢと比較して、高い親和性のＦｃγＲＩに強く結合した。図１９Ａ〜１９Ｃに提示する結果は、キフネンシン処置がＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢに対する抗体結合を改善し得るが、ＦｃγＲＩに対する抗体結合は改善しないことを示唆した。

特許請求の範囲を含む本明細書で用いられる成分、細胞培養、処置条件などの数量を表現するすべての数字は、文脈の前後関係により他の表現を必要としない限り、用語「約」によって修飾されるものと理解すべきである。本明細書中の具体例は、本発明の具体例の例示を提供するものであって、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。本開示において引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、および生物学的配列は、それらの全体を出典明示により援用するものとする。

図１Ａは、ＩｇＧの多様なグリコフォームの略図を示す。Ａｓｎ２９７に結合したＩｇＧ炭水化物の糖残基として、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、マンノース、ガラクトース、フコース、およびシアル酸（ＮｅｕＡｃ）が挙げられる。ＩｇＧグリコフォームのバリエーションは、ガラクトース、ＮｅｕＡｃ残基およびバイセクティングＧｌｃＮＡｃのコアＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃへの結合に依存する。Ｎ−グリカンは、０個（Ｇ０）、１個（Ｇ１）または２個（Ｇ２）のガラクトース残基、ならびに還元末端上の第１のＧｌｃＮＡｃに結合した１個のフコースを含有してもよい（それぞれＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆと表される）。しかし、ほとんどの哺乳動物細胞系統から発現される組換え抗体において見出される主要なＮ−グリカンはＧ０ＦおよびＧ１Ｆである。 図１Ｂは、多様なインヒビターを用いるＮ−結合型グリコシル化経路の阻害を例示する。抗体におけるＮ−グリカンのプロセシングは、ＥＲまたはＧｏｌｇｉの内腔内のグリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼに特異的なインヒビターによって阻害され得る。ＯＴはオリゴ糖トランスフェラーゼを表し；ＧｌｃａｓｅＩおよびＩＩはα−グルコシダーゼＩおよびＩＩを表し；ＭａｎａｓｅＩおよびＩＩはα−マンノシダーゼＩおよびＩＩを表し；ＧｎＴ ＩおよびＩＩはＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩおよびＩＩを表し；ＦＴはα−１，６フコシルトランスフェラーゼを表し；ＧＴはβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを表す。 図１Ｃは、ヒトＩｇＧＦｃドメインの生来の配列のアラインメントを表し、多様なＩｇＧアイソタイプ由来の配列間の差異を星印で標記する。 図２は、精製されたＴＥＭ ｍＡｂ ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、レクチンおよび抗体ブロッティングの結果を示す。還元サンプル緩衝液中５μｇのＴＥＭ ｍＡｂ Ａサンプルの一定量を４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各ウェルにアプライし、ゲルをクーマシーブルーで染色した（図２Ａ）。レーン１はインヒビターを伴わずに処置した細胞由来のＩｇＧ１を表し；レーン２はマンノスタチンＡで処置された細胞由来のＩｇＧ１を表し；レーン３はキフネンシンで処置された細胞由来のＩｇＧ１を表し；レーン４はＮＢ−ＤＮＪで処置された細胞由来のＩｇＧ１を表す。図２Ｂは多様な抗体のレクチンブロッティングの結果を示す。タンパク質（１サンプルあたり０．５μｇ）を、図２Ａについて記載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に移行させた。膜をビオチン化レンチルレクチンとブロットさせ、ストレプトアビジン−ＨＲＰで展開した。図２Ｃは、図２Ｂと同じ膜であって、ストリッピングし、ＨＲＰと抱合させた抗ヒトＦａｂ抗体を用いて再ブロットしたものを示す。 図３は、ＴＥＭ抗体由来の炭水化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の結果を示す。インヒビターなし（Ａ）、マンノスタチンＡ（Ｂ）、キフネンシン（Ｃ）およびＮＢ−ＤＮＪ（Ｄ）で処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ａ上の炭水化物、ならびにインヒビターなし（Ｅ）およびキフネンシン（Ｆ）で処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ上の炭水化物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を用いて分析した。 図４は、キフネンシンを伴ってまたはキフネンシンを伴わずに処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ上の２−アミノ安息香酸で標識されたＮ−グリカンのＨＰＬＣプロファイリングの結果を示す。多様なＮ−グリカン標準と比較した、キフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ上の２−アミノ安息香酸で標識されたＮ−グリカンのＨＰＬＣプロファイル（Ａ）。ＥｎｄｏＨ処置の前後にキフネンシンで処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ上の２−アミノ安息香酸で標識されたＮ−グリカンのＨＰＬＣプロファイル（Ｂ）。 図５は、インヒビターで処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂのＡＤＣＣ活性を示す。（Ａ）インヒビターなし（コントロール）またはマンノスタチンＡ（インヒビター番号１）、キフネンシン（インヒビター番号２）、ＮＢ−ＤＮＪ（インヒビター番号３）で処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ ＡのＡＤＣＣ活性。（Ｂ）多様な抗体濃度でキフネンシンを伴わずに（コントロール）または伴って処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ ＡのＡＤＣＣ活性。（Ｃ）キフネンシンを伴わずに（コントロール）またはキフネンシンを伴って処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ ＢのＡＤＣＣ活性。抗ＤＮＰをネガティブコントロールとしてアッセイに含めた。 図６Ａは、フローサイトメトリー分析による標的細胞へのＴＥＭ ｍＡｂ Ａ結合を示す。インヒビターを伴わずに処置した細胞由来の抗体はコントロールとして標識される一方、マンノスタチンＡ（インヒビター番号１）、キフネンシン（インヒビター番号２）、およびＮＢ−ＤＮＪ（インヒビター番号３）で処置した細胞由来の抗体はそれら自体として標識される。図６Ｂは、フローサイトメトリー分析による標的細胞へのＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ結合を示す。ＴＥＭ抗体は、キフネンシンを伴わずに（コントロール）または伴って処置した細胞由来であり、一方でまた、抗ＤＮＰをネガティブコントロールとして含めた。 図７は、可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖａｌ１５８）とキフネンシンで処置した細胞および非処置細胞から産生される抗体との間の相互作用の表面プラズモン共鳴分析の結果を示す。目的の領域を拡大してＦｃγＲＩＩＩＡのフローを示した。 図８は、マンノース受容体の炭水化物−結合ドメインとキフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置した細胞由来の抗体との相互作用を示す。キフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置したＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂのマンノース受容体の炭水化物−結合ドメインへの結合を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）を用いて測定した。マンノース末端糖タンパク質（「Ｍａｎ３糖タンパク質」）をポジティブコントロールとして使用した。 図９は、キフネンシンを伴ってまたは伴わずにＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂの薬物動態解析の結果を示す。キフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置したＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂをマウスに注入し、多様な時間ポイントで回収した血清中の抗体の量を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。 図１０Ａは、０〜２μｇ／ｍｌキフネンシン（１もしくは３回の処置）を伴う培地中振盪フラスコにおいて増殖させたＴＥＭ ｍＡｂ Ｂを発現するＣＨＯ細胞の生存率を示す。図１０Ｂは、０〜２μｇ／ｍｌキフネンシン（１もしくは３回の処置）を伴うまたは伴わない培地において増殖させたＴＥＭ ｍＡｂ Ｂを発現するＣＨＯ細胞の細胞密度を示す。３×処置を、図１０Ａおよび１０Ｂにおいて「ｓｕｐ．」として示す。 図１１は、１１日間、多様な量のキフネンシンによって処置したＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ抗体由来の炭水化物のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析の結果を示す。キフネンシンを伴わずに（図１１Ａ）または次のようなキフネンシンの添加を伴って処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ｂ上の炭水化物：（図１１Ｂ）０．５μｇ／ｍｌを１回、（図１１Ｃ）１μｇ／ｍｌを１回、（図１１Ｄ）１．５μｇ／ｍｌを１回、（図１１Ｅ）２μｇ／ｍｌを１回、（図１１Ｆ）０．５μｇ／ｍｌを３回、（図１１Ｇ）１μｇ／ｍｌを３回、（図１１Ｈ）１．５μｇ／ｍｌを３回、および（図１１Ｉ）２μｇ／ｍｌを３回（図１０を参照のこと）。１１日間、インヒビター（図１１Ｊ）または２μｇ／ｍｌキフネンシン（図１１Ｋ）を伴わずに処置した細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ａ上の炭水化物（図１２もまた参照のこと）。 図１２Ａは、１１日間、２μｇ／ｍｌキフネンシン（１Ｌスピナー培養における単回処置）を伴うまたは伴わない培地において増殖させたＴＥＭ ｍＡｂ Ａを発現するＣＨＯ細胞の生存率を示す。図１２Ｂは、２μｇ／ｍｌキフネンシン（１回添加）を伴うまたは伴わない培地において増殖させたＴＥＭ ｍＡｂ Ａを発現するＣＨＯ細胞の細胞密度を示す。 図１３は、キフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置したＨＥＫ２９３細胞により発現される抗体ＣのＡＤＣＣ活性を示す。５０：１（図１３Ａ）および１００：１（図１３Ｂ）のエフェクター細胞対標的細胞比において、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、抗体Ｃにより認識される抗原を発現する細胞を標的細胞として使用した。ＩｇＧを非特異的抗体コントロールとして使用した。 図１４は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖａｌ１５８）とキフネンシンを伴ってまたは伴わずに処置したＨＥＫ２９３細胞由来の抗体Ｃとの間の相互作用の表面プラズモン共鳴分析の結果を示す。可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩＡをセンサーチップ上で捕捉し、抗体Ｃの固定化されたＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を測定した。 図１５は、キフネンシンで処置しなかったＣＨＯ細胞（図１５Ａ）由来または４ｎｇ／ｍｌ（図１５Ｂ）、２０ｎｇ／ｍｌ（図１５Ｃ）、１００ｎｇ／ｍｌ（図１５Ｄ）、５００ｎｇ／ｍｌ（図１５Ｅ）、および２５００ｎｇ／ｍｌ（図１５Ｆ）のキフネンシンで処置したＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ａの炭水化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の結果を示す。 図１６は、多様な量：２０ｎｇ／ｍｌ（図１６Ａ）、４０ｎｇ／ｍｌ（図１６Ｂ）、６０ｎｇ／ｍｌ（図１６Ｃ）、８０ｎｇ／ｍｌ（図１６Ｄ）、および１００ｎｇ／ｍｌ（図１６Ｅ）のキフネンシンで処置したＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ Ａ由来の炭水化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の結果を示す。 図１７は、多様な量のキフネンシンで処置したＣＨＯ細胞由来のＴＥＭ ｍＡｂ ＡのＡＤＣＣ活性を示す。図１７Ａは、キフネンシン（ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｓｎｅ）の非存在下または２５００ｎｇ／ｍｌキフネンシンの存在下で発現される抗体のＡＤＣＣ活性を示す。抗ＤＮＰ抗体をネガティブコントロールとして含めた。図１７Ｂは、２０、４０、６０、８０および１００ｎｇ／ｍｌキフネンシンで処置した細胞由来の同じ抗体のＡＤＣＣ活性を示す。 図１８は、３種の抗体濃度（０．００６、０．０６および０．５５μｇ／ｍｌ）における非フコシル化グリカンの百分率と特異的細胞障害性との間の関係を示す。非フコシル化グリカンの百分率を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルにおけるそれぞれ個々のグリカンピークの面積を算出することによって見積もった。 図１９は、キフネンシンで処置した細胞由来または非処置細胞由来の抗体Ｄへの多様なＦｃγＲの結合を評価するために用いられたＥＬＩＳＡ型アッセイからの結果を示す。図１９Ａは、抗体のＦｃγＲＩＡへの結合を示す。図１９Ｂは、抗体ＤのＦｃγＲＩＩＡへの結合を示す。図１９Ｃは、抗体ＤのＦｃγＲＩＩＢへの結合を示す。

Claims (6)

1. （ａ）モノクローナル抗体またはＦｃ融合タンパク質を産生する細胞を提供し；
   （ｂ）少なくとも７０％のＭａｎ_５−９（ＧｌｃＮＡｃ）_２Ｎ−グリカンおよび１０％以下の複合型Ｎ−グリカンを有するモノクローナル抗体またはＦｃ融合タンパク質を産生するのに十分な量のキフネンシンの存在下で細胞を培養し、ここで、該抗体またはタンパク質の該Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ_９（ＧｌｃＮａｃ）_２を含み、そして、ここで、キフネンシンの量は、少なくとも６０ｎｇ／ｍｌである；次いで
   （ｃ）グリコシル化された抗体またはＦｃ融合タンパク質を回収すること
   を含んでなる、グリコシル化されたモノクローナル抗体またはＦｃ融合タンパク質を産生する方法。
2. キフネンシンの量が１０００ｎｇ／ｍｌ未満である、請求項１に記載の方法。
3. キフネンシンの量が５００ｎｇ／ｍｌ未満である、請求項１に記載の方法。
4. キフネンシンの量が１００ｎｇ／ｍｌ未満である、請求項１に記載の方法。
5. キフネンシンの量が８０ｎｇ／ｍｌ未満である、請求項１に記載の方法。
6. キフネンシンの量が６０〜２５００ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。

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