ES2640960T3 - Anticuerpos para ADP-ribosil ciclasa 2 - Google Patents

Anticuerpos para ADP-ribosil ciclasa 2 Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo o porción del mismo de unión al antígeno que se une específicamente a BST-1 que comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una primera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 10; ii) una segunda vhCDR que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 51; iii) una tercera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 14; y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una primera vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 16; ii) una segunda vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 18; y iii) una tercera vlCDR que comprende una SEQ ID NO: 20.

Description

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génica. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser modificados. Por ejemplo, las moléculas pueden estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL. Ejemplos de formatos de anticuerpos y arquitecturas se describen en Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23 (9): 1126-1136, y Carter 2006, Nature Reviews Immunology 6: 343-357 y las referencias citadas allí.
Los genes de inmunoglobulina reconocidos, por ejemplo, en seres humanos, incluyen los loci genéticos kappa (), lambda (λ) y cadena pesada, que juntos comprenden la miríada de genes de región variable y los genes de región constante mu (), delta (δ), gamma (γ), sigma (σ) y alfa (α) que codifican los isotipos IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgE e IgA (IgA1 e IgA2) respectivamente. Se entiende que el anticuerpo en la presente invención incluye anticuerpos de longitud completa y fragmentos de anticuerpos y puede referirse a un anticuerpo natural de cualquier organismo, un anticuerpo modificado por ingeniería genética o un anticuerpo generado de forma recombinante para fines experimentales, terapéuticos u otros.
En una realización, un anticuerpo divulgado en la presente memoria puede ser un anticuerpo multiespecífico, y notablemente un anticuerpo biespecífico, también denominado a veces "diacuerpos". Estos son anticuerpos que se unen a dos (o más) antígenos diferentes. Los diacuerpos pueden fabricarse en una variedad de formas conocidas en la técnica, por ejemplo, preparados químicamente o a partir de hibridomas híbridos. En un ejemplo, el anticuerpo es un minicuerpo. Los minicuerpos son proteínas de tipo anticuerpo minimizadas que comprenden un scFv unido a un dominio CH3. En algunos casos, el scFv puede unirse a la región Fc, y puede incluir algunas o todas las regiones de bisagra. Para una descripción de anticuerpos multiespecíficos, véase Holliger y Hudson (2006) Nature Biotechnology 23 (9): 1126-1136 y las referencias citadas allí.
Por "CDR" tal como se usa en la presente memoria se entiende una "región determinante de complementariedad" de un dominio variable de anticuerpo. La identificación sistemática de los residuos incluidos en los CDR ha sido desarrollada por Kabat (Kabat et al., (1991)) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Bethesda) y alternativamente por Chothia [Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342: 877-883; Al-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273: 927-948]. Para los fines de la presente invención, las CDR se definen como un conjunto ligeramente más pequeño de residuos que las CDR definidas por Chothia. Las CDR VL se definen aquí para incluir residuos en las posiciones 27-32 (CDR1), 50-56 (CDR2) y 91-97 (CDR3), en donde la numeración está de acuerdo con Chothia. Debido a que las CDR VL como las define Chothia y Kabat son idénticas, la numeración de estas posiciones CDR VL también es de acuerdo con Kabat. Las CDR VH se definen aquí para incluir residuos en las posiciones 27-33 (CDR1), 52-56 (CDR2) y 95-102 (CDR3), en donde la numeración está de acuerdo con Chothia. Estas posiciones de CDR VH corresponden a las posiciones de Kabat 27-35 (CDR1), 52-56 (CDR2) y 95-102 (CDR3).
Como se apreciará por los expertos en la técnica, las CDR divulgadas en la presente memoria también pueden incluir variantes, por ejemplo, cuando se retromutan las CDR divulgadas en la presente memoria descriptiva en diferentes regiones marco. Generalmente, la identidad de ácidos nucleicos entre variantes individuales de CDR son al menos el 80% con las secuencias representadas en este documento, y más típicamente con identidades preferiblemente crecientes de al menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% %, 96%, 97%, 98%, 99% y casi 100%. De manera similar, el "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a la secuencia de ácido nucleico de las proteínas de unión identificadas en la presente memoria se define como el porcentaje de residuos de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de nucleótidos en la secuencia codificación de la proteína de unión al antígeno. Un método específico utiliza el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 ajustado a los parámetros por defecto, con intervalo de superposición y fracción de superposición establecidos en 1 y 0,125, respectivamente y sin filtros seleccionados.
Generalmente, la identidad de secuencia de ácido nucleico entre las secuencias de nucleótidos que codifican variantes individuales de CDR y las secuencias de nucleótidos representadas en la presente memoria son al menos 80%, y más típicamente con identidades preferiblemente crecientes de al menos 80%, 81%, 82%, 83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% y casi 100%.
Por lo tanto, una "variante de CDR" es una con la homología, similitud o identidad especificada con la CDR original de la invención, y comparte la función biológica, incluyendo, pero sin limitarse a, al menos 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la especificidad y/o actividad de la CDR original.
Aunque el sitio o región para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la mutación en sí no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, con el fin de optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, la mutagénesis aleatoria puede llevarse a cabo en el codón o región objetivo y las variantes expresadas de CDR de proteína de unión al antígeno seleccionadas para la combinación óptima de la actividad deseada. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en ADN que tienen una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, mutagénesis del cebador M13 y mutagénesis por PCR. La selección de los mutantes se realiza usando ensayos de actividades de proteína de unión al antígeno como se describe aquí.
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Como se usa en la presente memoria, un "anticuerpo policlonal" se refiere a anticuerpos producidos por varios clones de linfocitos B como sería el caso en un animal completo.
Como se usa en la presente memoria, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificada por los genes de la región constante de cadena pesada.
Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan de forma intercambiable en la presente memoria con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".
El término "derivados de anticuerpo" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo, por ejemplo, un conjugado (generalmente un enlace químico) del anticuerpo y otro agente o anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden conjugarse con agentes, incluyendo, pero sin limitarse a, polímeros (por ejemplo, PEG), toxinas, marcadores, etc., tal como se describe más completamente a continuación. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser no humanos, quiméricos, humanizados o totalmente humanos. Para una divulgación de los conceptos de anticuerpos quiméricos y humanizados, véase Clark et al., (2000) y las referencias citadas en él (Clark, 2000, Immunol Today 21: 397-402). Los anticuerpos quiméricos comprenden la región variable de un anticuerpo no humano, por ejemplo, los dominios VH y VL originarios de ratón o rata, unidos operativamente a la región constante de un anticuerpo humano (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567). En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención son humanizados. Por anticuerpo "humanizado", como se usa en la presente memoria, se entiende un anticuerpo que comprende una región marco humana (FR) y una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo no humano (usualmente de ratón
o rata). El anticuerpo no humano que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina "aceptor". La humanización se basa principalmente en el injerto de CDR donante sobre marcos VL y VH aceptores (humanos) (Patente de Estados Unidos No. 5.225.539). Esta estrategia se conoce como "injerto de CDR". A menudo se requiere "retromutación" de residuos de marco aceptor seleccionados para los correspondientes residuos donantes para recuperar la afinidad que se pierde en el constructo injertado inicial (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762, 6.180.370, 5.859.205, 5.821.337, 6.407.213). El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana, y por lo tanto comprenderá típicamente una región Fc humana. Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica y pueden realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones et al., (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al., (1988) Nature 332: 323-329; Verhoeyen et al., (1988) Science, 239: 15341536]. También se conocen en la técnica ejemplos adicionales de anticuerpos monoclonales murinos humanizados, por ejemplo, anticuerpos que unen la proteína C humana (O'Connor et al., 1998, Protein Eng. 11: 321-8), el receptor de interleuquina 2 [Queen et al., (1989) Proc Natl Acad Sci, USA 86: 10029 -33], y el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 [Carter et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 4285-9]. En una realización alternativa, los anticuerpos de la presente invención pueden ser totalmente humanos, es decir, las secuencias de los anticuerpos son completamente o sustancialmente humanas. Se conocen una serie de métodos en la técnica para generar anticuerpos completamente humanos, incluyendo el uso de ratones transgénicos [Bruggemann et al., (1997) Curr Opin Biotechnol 8: 455-458] o bibliotecas de anticuerpos humanos acopladas con métodos de selección [Griffiths et al., (1998) Curr Opin Biotechnol 9: 102-108].
El término "anticuerpo humanizado" pretende incluir anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias marco humanas. Pueden hacerse modificaciones adicionales de la región marco dentro de las secuencias marco humana, tales como las modificaciones de aminoácidos del dominio Fc, como se describe en la presente memoria.
El término "anticuerpo quimérico" pretende referirse a anticuerpos en los que las secuencias de la región variable se derivan de una especie y las secuencias de región constante se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el que las secuencias de región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de región constante se derivan de un anticuerpo humano.
El término "se une específicamente" (o "se une inmunoespecíficamente") no pretende indicar que un anticuerpo se une exclusivamente a su objetivo deseado, aunque en muchas realizaciones esto será cierto; es decir, un anticuerpo "se une específicamente" a su objetivo y no se une de forma detectable o sustancialmente a otros componentes en la muestra, célula o paciente. Sin embargo, en algunas realizaciones, un anticuerpo "se une específicamente" si su afinidad por su objetivo pretendido es aproximadamente 5 veces mayor cuando se compara con su afinidad por una molécula no objetivo. Adecuadamente, no hay reacción cruzada significativa o unión cruzada con sustancias no deseadas, especialmente proteínas o tejidos naturales de una persona o animal sanos. La afinidad del anticuerpo será, por ejemplo, al menos aproximadamente 5 veces, tal como 10 veces, tal como 25 veces, especialmente 50 veces, y particularmente 100 veces o más, mayor para una molécula objetivo que su afinidad por una molécula no objetivo. En algunas realizaciones, la unión específica entre un anticuerpo u otro agente de unión y un antígeno significa una afinidad de unión de al menos 106 M-1. Los anticuerpos pueden, por ejemplo, unirse con afinidades de al menos aproximadamente 107 M-1, tal como entre aproximadamente 108 8M-1 hasta aproximadamente 109
M-1M-1 M-1
hasta aproximadamente 1010 , o aproximadamente 1010 a aproximadamente 1011 . Los anticuerpos pueden, por ejemplo, unirse con una EC50 de 50 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, 100 pM o menos, o
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El término "no se une sustancialmente" a una proteína o células, como se usa en la presente memoria, significa que no se une o no se une con una alta afinidad a la proteína o células, es decir, se une a la proteína o células con un KD de 1 x 10-6 M o más, más preferiblemente 1 x 10-5 M o más, más preferiblemente 1 x 10-4 M o más, más preferiblemente 1x10-3 M o más, incluso más preferiblemente 1 x 10-2 M o más.
El término "EC50", tal como se usa en la presente memoria, pretende referirse a la potencia de un compuesto cuantificando la concentración que conduce al 50% de respuesta/efecto máximo. EC50 puede determinarse mediante Scratchard o FACS.
El término "Kasociación" o "Ka", tal como se usa en la presente memoria, pretende referirse a la velocidad de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "Kdisociación" o "Kd" como se utiliza en la presente memoria pretende referirse a la velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. El término "KD", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende referirse a la constante de afinidad, que se obtiene a partir de la relación de Kd con respecto a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de KD para anticuerpos se pueden determinar usando métodos bien establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar la KD de un anticuerpo es utilizando resonancia de plasmón superficial, preferiblemente utilizando un sistema biosensor tal como un sistema Biacore®.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 1 x 10-7 M o menos, más preferiblemente 5 x 10-8 M o menos, incluso más preferiblemente 1x108 M o menos, incluso más preferiblemente 5 x 10-9 M o menos e incluso más preferiblemente 1 x 10-9 M o menos para un antígeno objetivo. Sin embargo, la unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, la unión de "alta afinidad" para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene un KD de 10-6 M o menos, más preferiblemente 10-7 M o menos, incluso más preferiblemente 10-8 M o menos.
El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio sobre un antígeno al que se une específicamente una inmunoglobulina o anticuerpo. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se retienen típicamente por exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario se pierden típicamente en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye típicamente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen técnicas en el arte y aquéllas descritas en la presente memoria, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional [véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)].
Por consiguiente, también se divulgan en la presente memoria anticuerpos que se unen (es decir, reconocen) al mismo epítopo que los anticuerpos descritos en la presente memoria (es decir, BST1_A2, BST1_A1 y BST1_A3). Los anticuerpos que se unen al mismo epítopo pueden identificarse mediante su capacidad para competir de forma cruzada con (es decir, inhibir competitivamente la unión de) un anticuerpo de referencia a un antígeno objetivo de una manera estadísticamente significativa. La inhibición competitiva puede ocurrir, por ejemplo, si los anticuerpos se unen a epítopos idénticos o estructuralmente similares (por ejemplo, epítopos de superposición), o epítopos espacialmente proximales que, cuando se unen, causan impedimento estérico entre los anticuerpos.
La inhibición competitiva puede determinarse usando ensayos de rutina en los que la inmunoglobulina sometida a ensayo inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto en fase sólida (RIA), inmunoensayo enzimático directo o indirecto en fase sólida (EIA), ensayo de competencia en sándwich [véase Stahl et al., (1983) Methods in Enzymology 9: 242]; EIA con biotina-avidina directa en fase sólida [véase Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137: 3614]; ensayo marcado directo en fase sólida, un ensayo en sándwich marcado directo en fase sólida [véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press]; RIA de marcación directa en fase sólida usando el marcador I-125 [véase Morel et al., (1988) Mol. Immunol. 25(1): 7]; EIA con biotina-avidina directa en fase sólida [Cheung et al., (1990) Virology 176: 546]; y RIA marcado directa. [Moldenhauer et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32: 77]. Típicamente, dicho ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que portan cualquiera de estas, una inmunoglobulina de prueba no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o células en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Por lo general, la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Normalmente, cuando un anticuerpo competidor está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos 50-55%, 5560%, 60-65%, 65-70% 70-75% o más.
Otras técnicas incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de epítopos, tales como análisis de rayos X de cristales de complejos de antígeno: anticuerpo que proporcionan la resolución atómica del epítopo. Otros métodos monitorean la unión del anticuerpo a fragmentos de antígeno o variaciones mutadas del antígeno donde la pérdida de unión debida a una modificación de un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de antígeno se considera a menudo una
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proteína. Una búsqueda por BLAST para proteínas utilizando el programa blastp con parámetros estándar predeterminados, excepto el filtro de baja complejidad, que está desactivado, y la matriz de sustitución de BLOSUM62, filtra los 5 primeros aciertos que producen coincidencias de secuencia. Las secuencias de nucleótidos se traducen en los seis marcos y el marco sin codones de parada en el segmento de correspondencia de la secuencia de base de datos se considera el acierto potencial. Esto se confirma a su vez utilizando el programa BLAST tblastx, que traduce la secuencia de anticuerpos en los seis marcos y compara esas traducciones con las secuencias de nucleótidos en la base de datos traducida dinámicamente en los seis marcos.
Las identidades son concordancias exactas de aminoácidos entre la secuencia del anticuerpo y la base de datos de la proteína en toda la longitud de la secuencia. Los positivos (identidades + coincidencia de sustitución) no son idénticos, sino sustituciones de aminoácidos guiados por la matriz de sustitución BLOSUM62. Si la secuencia del anticuerpo coincide con dos de las secuencias de la base de datos con la misma identidad, el acierto con la mayoría de los positivos se decidiría que sería el acierto de la secuencia coincidente.
Las secuencias marco preferidas para uso en los anticuerpos de la invención son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias marco utilizadas por los anticuerpos seleccionados de la invención, por ejemplo, similares a la secuencia marco 1-80 de VH, la secuencia marco 1-39 de VH, la secuencia marco 4-74 de VK y/o las secuencias marco 4-55 de VK utilizadas por los anticuerpos monoclonales preferidos de la invención. Las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de VK pueden injertarse en regiones marco que tienen la secuencia idéntica a la encontrada en el gen de la inmunoglobulina de línea germinal a partir de la cual se deriva la secuencia marco o las secuencias de CDR se pueden injertar en regiones marco que contienen una o más mutaciones en comparación con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que en ciertos casos es beneficioso mutar restos dentro de las regiones marco para mantener o mejorar la capacidad de unión del antígeno del anticuerpo (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.).
Otro tipo de modificación de región variable es mutar residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de VH y/o VK para mejorar de este modo una o más propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés. La mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis mediada por PCR pueden realizarse para introducir la mutación o mutaciones y el efecto sobre la unión al anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, puede evaluarse en ensayos in vitro e in vivo como se describe aquí y se proporciona en los Ejemplos. En algunos ejemplos, se introducen modificaciones conservadoras (como se ha discutido anteriormente). Alternativamente, se pueden hacer modificaciones no conservadoras. Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos, pero son preferiblemente sustituciones. Además, típicamente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR, aunque, tal como se apreciará por los expertos en la técnica, las variantes en otras áreas (regiones marco, por ejemplo) pueden ser mayores.
Por consiguiente, en otro ejemplo, la presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales anti-BST1 aislados, o sus porciones de unión al antígeno, que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 10, 9 y 56 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 10, 9 y 56; (b) una región CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 12 o 51, 11 y 57, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NOs: 12 o 51, 11 y 57; (c) una región CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 14, 13 y 58, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NOs: 14, 13 y 58; (d) una región CDR1 de VK que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 16, 15 y 59, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NOs: 16, 15 y 59; (e) una región CDR2 de VK que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 18, 17 y 60, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NOs: 18, 17 y 60; y (f) una región CDR3 de VK que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 20, 19 y 61, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NOs: 20, 19 y 61.
Los anticuerpos modificados genéticamente de la divulgación incluyen aquellos en los que se han hecho modificaciones a residuos en el marco dentro de VH y/o VK, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente, tales modificaciones del marco se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque es para "retromutar" uno o más residuos del marco a la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutación somática puede contener residuos del marco que difieren de la secuencia de la línea germinal a partir de la cual se deriva el anticuerpo. Dichos residuos se pueden identificar comparando las secuencias del marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de las que se deriva el anticuerpo.
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Estados Unidos Nos. 7.371.826, 7.670.600 y el documento WO 97/34631. En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Diversos enfoques son posibles. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de Estados Unidos No. 6.277.375 de Ward. Alternativamente, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la región CH1 o CL para contener un epítopo de unión al receptor de salvamento tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, tal como se describe en las patentes de Estados Unidos Nos. 5.869.046 y
6.121.022.
En aún otra realización, la glicosilación de un anticuerpo se modifica. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo que carece de glicosilación). La glicosilación puede alterarse, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, pueden hacerse una o más sustituciones de aminoácidos que resultan en la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de la región variable para eliminar de este modo la glicosilación en ese sitio. Dicha aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tal enfoque se describe con más detalle en las patentes de Estados Unidos Nos. 5.714.350 y 6.350.861 de Co et al., y puede llevarse a cabo eliminando la asparagina en la posición 297.
Adicional o alternativamente, se puede elaborar un anticuerpo que tiene un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene más estructuras de GlcNac bisectantes. Esto a veces se denomina en la técnica como una "glicoforma modificada genéticamente". Se ha demostrado que tales patrones de glicosilación alterados aumentan la capacidad de ADCC de anticuerpos. Tales modificaciones de hidratos de carbono pueden realizarse generalmente de dos maneras; por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo se expresa en una célula huésped con maquinaria de glicosilación alterada. Las células con maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en la técnica y pueden usarse como células huésped en las que expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir de este modo un anticuerpo con glicosilación alterada. Se hace referencia a la tecnología POTELLIGENT®. Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen del gen fucosiltransferasa, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferasa), de forma que los anticuerpos expresados en las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen de fucosa en sus carbohidratos. Las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 FUT8-/-se crearon por la ruptura dirigida del gen FUT8 en células CHO/DG44 usando dos vectores de reemplazo [véase la publicación de patente de Estados Unidos No. 2004/0110704, la patente de Estados Unidos No. 7.517.670 y Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87: 614-22]. Como otro ejemplo, el documento EP 1.176.195 de Hanai et al. describe una línea celular con un gen FUT8 perturbado funcionalmente, que codifica una fucosiltransferasa, de tal manera que los anticuerpos expresados en dicha línea celular presentan hipofucosilación reduciendo o eliminando la enzima relacionada con el enlace alfa 1,6. Hanai et al. describen también líneas celulares que tienen una baja actividad enzimática para añadir fucosa a la Nacetilglucosamina que se une a la región Fc del anticuerpo o que no tiene la actividad enzimática, por ejemplo la línea celular de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662). Alternativamente, las glicoformas modificadas por ingeniería genética, particularmente la afucosilación, se pueden hacer usando inhibidores de moléculas pequeñas de enzimas de la vía de glicosilación [véase, por ejemplo, Rothman et al. (1989) Mol. Immunol. 26 (12): 113-1123; Elbein (1991) FASEB J. 5: 3055; PCT/US2009/042610 y la patente de Estados Unidos No. 7.700.321]. La publicación PCT WO 03/035835 describe una variante de la línea celular CHO, las células Lec13, con capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos enlazados a Asn(297), dando también como resultado la hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula huésped [véase también Shields, RL et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-2667]. La publicación PCT WO 99/54342 describe líneas celulares manipuladas para expresar glicosil transferasas modificadoras de glucoproteínas (por ejemplo, beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas genéticamente exhiben estructuras de GlcNac más bisectantes dando como resultado el aumento de actividad de ADCC de los anticuerpos [véase también Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180].
Alternativamente, los residuos de fucosa del anticuerpo pueden escindirse usando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidasa elimina los residuos de fucosilo de los anticuerpos [Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14: 5516-23].
Otra modificación de los anticuerpos que se contemplan en la presente invención es la pegilación. Un anticuerpo puede ser pegilado, por ejemplo, para aumentar la semivida biológica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, típicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o derivado de aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para formar derivados de otras proteínas, tales como monoalcoxi (C1-C10) o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo a ser pegilado es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para las proteínas de pegilación son conocidos en la técnica y pueden aplicarse a los anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, los documentos EP 0154316 y EP 0401384.
En realizaciones adicionales, por ejemplo, en el uso de los anticuerpos de la divulgación con fines de diagnóstico o detección, los anticuerpos pueden comprender una etiqueta. Por "marcado" en la presente memoria se entiende que
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un compuesto tiene al menos un elemento, isótopo o compuesto químico unido para permitir la detección del compuesto. En general, las etiquetas se dividen en tres clases: a) etiquetas isotópicas, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados; b) magnéticas, eléctricas, térmicas; y c) tintes luminiscentes o coloreados; aunque las etiquetas incluyen también enzimas y partículas tales como partículas magnéticas. Las etiquetas preferidas incluyen, pero no se limitan a, complejos de lantánidos fluorescentes (incluyendo los de Europio y Terbio), y etiquetas fluorescentes incluyendo, pero no limitados a, puntos cuánticos, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde de malaquita, estilbeno, Amarillo Lucifer, Azul Cascada, Rojo Texas, los tintes Alexa, los tintes Cy, y otros descritos en la 6ª edición del Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland.
Enlazadores
La presente invención proporciona conjugados anticuerpo-compañero en los que el anticuerpo está unido al compañero a través de un enlazador químico. En algunos ejemplos, el enlazador es un enlazador peptidilo, otros enlazadores incluyen hidracina y enlazadores de disulfuro. Además de los enlazadores que están unidos al compañero, la presente divulgación también proporciona brazos enlazadores escindibles que son apropiados para la unión a esencialmente cualquier especie molecular. El brazo enlazador puede ejemplificarse en la presente memoria por referencia a su unión a una fracción terapéutica. Sin embargo, será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que los enlazadores pueden estar unidos a diversas especies incluyendo, pero sin limitarse a, agentes de diagnóstico, agentes analíticos, biomoléculas, agentes de direccionamiento, marcadores detectables y similares.
El uso de peptidilo y otros enlazadores en conjugados de anticuerpo-compañero se describe en las solicitudes de patentes provisionales de los Estados Unidos Nos. 60/295.196; 60/295.259; 60/295.342; 60/304.908; 60/572.667; 60/661.174; 60/669.871; 60/720.499; 60/730.804; y 60/735.657 y las solicitudes de patente de los Estados Unidos Nos. 10/160.972; 10/161.234; 11/134.685; 11/134.826; y 11/398.854 y la patente de Estados Unidos No. 6.989.452 y la solicitud de patente PCT No. PCT/US2006/37793. En la patente de Estados Unidos No. 6.214.345, en la solicitud de patente de Estados Unidos No. 2003/0096743 y en la solicitud de patente de Estados Unidos No. 2003/0130189, de Groot et al., J. Med. Chem. 42, 5277 (1999); de Groot et al. J. Org. Chem. 43, 3093 (2000); de Groot et al., J. Med. Chem. Chem. 66, 8815, (2001); WO 02/083180; Carl et al., J. Med. Chem. Chem. Lett. 24, 479, (1981); Dubowchik et al., Bioorg & Med. Chem. Lett. 8, 3347 (1998); y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos No. 60/891.028.
En un ejemplo, la presente divulgación se refiere a enlazadores que son útiles para unir grupos de direccionamiento a agentes terapéuticos y marcadores. En otro ejemplo, esta divulgación proporciona enlazadores que imparten estabilidad a compuestos, reducen su toxicidad in vivo, o bien afectan favorablemente su farmacocinética, biodisponibilidad y/o farmacodinámica. Se prefiere generalmente que, en tales ejemplos, se escinda el enlazador, liberando el fármaco activo, una vez que el fármaco se suministra a su sitio de acción. Por lo tanto, en una realización, los enlazadores de la presente divulgación no son trazables, de modo que una vez eliminados del agente terapéutico o marcador (tal como durante la activación), no queda ningún rastro de la presencia del enlazador. En otra realización, los enlazadores se caracterizan por su capacidad para ser escindidos en un sitio en o cerca de la célula objetivo, tal como en el sitio de acción terapéutica o actividad del marcador. Tal escisión puede ser de naturaleza enzimática. Esta característica ayuda a reducir la activación sistémica del agente o marcador terapéutico, reduciendo la toxicidad y los efectos secundarios sistémicos. Los grupos escindibles preferidos para la escisión enzimática incluyen enlaces peptídicos, enlaces éster y enlaces disulfuro. En otras realizaciones, los enlazadores son sensibles al pH y se escinden a través de cambios en el pH.
Un aspecto de la presente divulgación es la capacidad de controlar la velocidad con la que se escinden los enlazadores. Con frecuencia se desea un enlazador que se escinda rápidamente. En algunas realizaciones, sin embargo, se puede preferir un enlazador que se escinda más lentamente. Por ejemplo, en una formulación de liberación sostenida o en una formulación con un componente de liberación rápida y de liberación lenta, puede ser útil proporcionar un enlazador que se escinda más lentamente. El documento WO 02/096910 proporciona varios complejos ligando-fármaco específicos que tienen un enlazador de hidracina. Sin embargo, no hay manera de "concertar" la composición del enlazador dependiendo de la velocidad de ciclación requerida, y los compuestos particulares descritos escinden el ligando del fármaco a una velocidad más lenta que la que se prefiere para muchos conjugados fármaco-enlazador. Por el contrario, los enlazadores de hidracina de la presente divulgación proporcionan una gama de velocidades de ciclación, desde muy rápida a muy lenta, permitiendo de este modo la selección de un enlazador particular de hidracina con base en la velocidad de ciclación deseada.
Por ejemplo, se puede conseguir una ciclación muy rápida con los enlazadores de hidracina que producen un único anillo de 5 miembros tras la escisión. Las velocidades de ciclación preferidas para la administración dirigida de un agente citotóxico a las células se consiguen usando enlazadores de hidracina que producen, tras la escisión, dos anillos de 5 miembros o un único anillo de 6 miembros resultante de un enlazador que tiene dos metilos en la posición geminal. Se ha demostrado que el efecto dimetilo geminal acelera la velocidad de la reacción de ciclación en comparación con un anillo único de 6 miembros sin los dos metilos en la posición geminal. Este es el resultado de la tensión que se alivia en el anillo. A veces, sin embargo, los sustituyentes pueden ralentizar la reacción en lugar de hacerla más rápida. A menudo, las razones del retraso se pueden atribuir a impedimentos estéricos. Por ejemplo, la sustitución de dimetilo geminal permite que ocurra una reacción de ciclación mucho más rápida en comparación con
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cuando el carbono geminal es un CH2.
Es importante observar, sin embargo, que, en algunas realizaciones, se puede preferir un enlazador que se escinda más lentamente. Por ejemplo, en una formulación de liberación sostenida o en una formulación tanto con un componente de liberación rápida como de liberación lenta, puede ser útil proporcionar un enlazador que se escinda más lentamente. En ciertas realizaciones, se logra una velocidad lenta de ciclación usando un enlazador de hidracina que produce, tras la escisión, un sólo anillo de 6 miembros, sin la sustitución del dimetilo geminal o un sólo anillo de 7 miembros. Los enlazadores sirven también para estabilizar el agente terapéutico o marcador contra la degradación mientras está en circulación. Esta característica proporciona un beneficio significativo ya que dicha estabilización da como resultado prolongar la semivida de circulación del agente o marcador unido. El enlazador sirve también para atenuar la actividad del agente o marcador unido de modo que el conjugado es relativamente benigno mientras está en circulación y tiene el efecto deseado, por ejemplo, es tóxico, después de la activación en el sitio de acción deseado. Para los conjugados de agente terapéutico, esta característica del enlazador sirve para mejorar el índice terapéutico del agente.
Los grupos estabilizantes se seleccionan preferiblemente para limitar la eliminación y el metabolismo del agente o marcador terapéutico mediante enzimas que pueden estar presentes en la sangre o en el tejido no objetivo y se seleccionan además para limitar el transporte del agente o marcador en las células. Los grupos estabilizadores sirven para bloquear la degradación del agente o marcador y también pueden actuar proporcionando otras características físicas del agente o marcador. El grupo estabilizador también puede mejorar la estabilidad del agente
o marcador durante el almacenamiento ya sea de una manera formulada o no formulada.
Idealmente, el grupo estabilizante es útil para estabilizar un agente terapéutico o marcador si sirve para proteger el agente o marcador de la degradación cuando se prueba mediante almacenamiento del agente o marcador en sangre humana a 37ºC durante 2 horas y da como resultado menos del 20%, preferiblemente menos del 10%, más preferiblemente menos del 5% e incluso más preferiblemente menos del 2% de escisión del agente o marcador por las enzimas presentes en la sangre humana en las condiciones de ensayo dadas. La presente divulgación también se refiere a conjugados que contienen estos enlazadores. Más particularmente, la divulgación se refiere al uso de profármacos que pueden usarse para el tratamiento de enfermedades, especialmente para quimioterapia contra el cáncer. Específicamente, el uso de los enlazadores descritos en la presente memoria proporciona profármacos que muestran una alta especificidad de acción, una toxicidad reducida y una estabilidad mejorada en sangre con respecto a profármacos de estructura similar. Los enlazadores de la presente divulgación, tal como se describen aquí, pueden estar presentes en una variedad de posiciones dentro de la molécula asociada.
De este modo, se proporciona un enlazador que puede contener cualquiera de una variedad de grupos como parte de su cadena que se disociará in vivo, por ejemplo, en el torrente sanguíneo, a una velocidad que aumenta con respecto a la de las construcciones que carecen de tales grupos. También se proporcionan conjugados de los brazos del enlazador con agentes terapéuticos y de diagnóstico. Los enlazadores son útiles para formar análogos de profármacos de agentes terapéuticos y para enlazar reversiblemente un agente terapéutico o de diagnóstico a un agente de direccionamiento, un marcador detectable o un soporte sólido. Los enlazadores pueden incorporarse en complejos que incluyen citotoxinas.
La unión de un profármaco a un anticuerpo puede proporcionar ventajas adicionales de seguridad frente a conjugados de anticuerpos convencionales de fármacos citotóxicos. La activación de un profármaco puede conseguirse mediante una esterasa, tanto dentro de células tumorales como en varios tejidos normales, incluyendo plasma. Se ha demostrado que el nivel de actividad esterasa relevante en seres humanos es muy similar al observado en ratas y primates no humanos, aunque menor que el observado en ratones. La activación de un profármaco también puede conseguirse por escisión con glucuronidasa. Además del grupo peptídico, hidracina o disulfuro escindibles, se pueden introducir opcionalmente uno o más grupos enlazadores de autoinmolación entre la citotoxina y el agente de direccionamiento. Estos grupos enlazadores pueden describirse también como grupos espaciadores y contienen al menos dos grupos funcionales reactivos. Típicamente, se une una funcionalidad química del grupo espaciador a una funcionalidad química del agente terapéutico, por ejemplo, citotoxina, mientras que la otra funcionalidad química del grupo espaciador se utiliza para unirse a una funcionalidad química del agente de direccionamiento o del enlazador escindible. Ejemplos de funcionalidades químicas de grupos espaciadores incluyen grupos hidroxi, mercapto, carbonilo, carboxi, amino, cetona y mercapto.
Los enlazadores de autoinmolación son generalmente un alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido o un grupo heteroalquilo sustituido o no sustituido. En una realización, los grupos alquilo o arilo pueden comprender entre 1 y 20 átomos de carbono. También pueden comprender una fracción polietilenglicol.
Ejemplos de grupos espaciadores incluyen, por ejemplo, 6-aminohexanol, 6-mercaptohexanol, ácido 10hidroxidecanoico, glicina y otros aminoácidos, 1,6-hexanodiol, β-alanina, 2-ammoetanol, cisteamina (2aminoetanotiol), ácido 5-aminopentanoico, ácido 6-aminohexanoico, ácido 3-maleimidobenzoico, ftalida, ftalidas sustituidas en α, el grupo carbonilo, ésteres animales, ácidos nucleicos, péptidos y similares.
El espaciador puede servir para introducir masa molecular y funcionalidad química adicionales en el complejo de
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agente direccionador-citotoxina. Generalmente, la masa y la funcionalidad adicionales afectarán a la semivida en suero y a otras propiedades del complejo. De este modo, mediante la selección cuidadosa de grupos espaciadores, se pueden producir complejos de citotoxinas con una gama de semividas en suero.
Cuando están presentes espaciadores múltiples, se pueden usar espaciadores idénticos o diferentes.
Se puede usar una fracción enlazadora adicional que imparte preferiblemente mayor solubilidad o propiedades de agregación disminuidas a conjugados que utilizan un enlazador que contiene la fracción o que modifica la velocidad de hidrólisis del conjugado, tales enlazadores no tienen que ser de autoinmolación. En una realización, la fracción de enlazamiento es alquilo sustituido, alquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroalquilo sustituido o heteroalquilo no sustituido, cualquiera de los cuales puede ser lineal, ramificado o cíclico. Las sustituciones pueden ser, por ejemplo, un alquilo (C1-C6) inferior, alcoxi, alquiltio, alquilamino o dialquilamino. En ciertas realizaciones, los enlazadores comprenden una fracción no cíclica. En otra realización, los enlazadores comprenden cualquier polímero de aminoácidos cargado positivamente o negativamente, tal como polilisina o poliarginina. Los enlazadores pueden comprender un polímero tal como una fracción de polietilenglicol. Adicionalmente, el enlazador puede comprender, por ejemplo, tanto un componente polimérico como una fracción química pequeña. En una realización preferida, dichos enlazadores comprenden una fracción de polietilenglicol (PEG).
La porción de PEG puede tener entre 1 y 50 unidades de longitud. Preferiblemente, el PEG tendrá 1-12 unidades repetidas, más preferiblemente 3-12 unidades repetidas, más preferiblemente 2-6 unidades repetidas, o aún más preferiblemente 3-5 unidades repetidas y lo más preferiblemente 4 unidades repetidas. Un enlazador puede consistir únicamente de la fracción PEG, o puede contener también un alquilo o heteroalquilo adicional sustituido o no sustituido. Es útil combinar PEG como parte de la fracción para aumentar la solubilidad en agua del complejo. Adicionalmente, la fracción de PEG reduce el grado de agregación que puede ocurrir durante la conjugación del fármaco al anticuerpo.
Para una discusión adicional de los tipos de citotoxinas, enlazadores y otros métodos para conjugar agentes terapéuticos con anticuerpos, véase también la publicación PCT WO 2007/059404 de Gangwar et al. y titulada "Cytotoxic Compounds and Conjugates", Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2: 750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; Senter, P.D. y Springer, CJ. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.
Moléculas compañeras
La presente invención incluye un anticuerpo conjugado a una molécula compañera, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Tales conjugados se denominan también aquí "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se denominan "inmunotoxinas". Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células (por ejemplo, matarlas).
Ejemplos de moléculas compañeras de la presente invención incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi-antracín-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos o homólogos de los mismos. Ejemplos de moléculas compañeras también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo dacarbacina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), y agentes antimitóticos (por ejemplo vincristina y vinblastina).
Otros ejemplos preferidos de moléculas compañeras que pueden conjugarse con un anticuerpo de la invención incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas y auristatinas, y derivados de las mismas. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo de calicheamicina se encuentra disponible comercialmente (Mylotarg®, American Home Products).
Los ejemplos preferidos de moléculas asociadas son CC-1065 y las duocarmicinas. CC-1065 se aisló por primera vez de Streptomyces zelensis en 1981 por la compañía Upjohn (Hanka et al, J. Antibiot, 31: 1211 (1978), Martin et al., J. Antibiot, 33: 902 (1980), Martin et al J. Antibiot 34: 1119 (1981)) y se encontró que tenía una potente actividad antitumoral y antimicrobiana tanto in vitro como en animales de experimentación (Li et al., Cancer Res. 42: 999 (1982)). CC-1065 se une al ADN B bicatenario dentro del surco menor (Swenson et al., Cancer Res. 42: 2821 (1982)) con la preferencia de secuencias de 5'-d(A/GNTTA)-3' y 5'-d(AAAAA)-3' y alquila la posición N3 de la 3'adenina mediante su unidad izquierda CPI presente en la molécula (Hurley et al., Science 226: 843 (1984)).
A pesar de su potente y amplia actividad antitumoral, CC-1065 no se puede usar en seres humanos porque provoca muerte retardada en animales de experimentación. Muchos análogos y derivados de CC-1065 y las duocarmicinas
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preferiblemente 20% o menos, aún más preferiblemente 15% o menos, incluso más preferiblemente 10% o menos e incluso más preferiblemente 5% o menos. La agregación puede medirse mediante varias técnicas bien conocidas en la técnica, incluyendo cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de columna de exclusión por tamaño (SEC) y dispersión de luz para identificar monómeros, dímeros, trímeros o multímeros.
Métodos de modificación de anticuerpos
Como se discutió anteriormente, los anticuerpos anti-BST1 que tienen secuencias de VH y VK descritas en la presente memoria pueden usarse para crear nuevos anticuerpos anti-BST1 modificando las secuencias de VH y/o VK, o la región o regiones constantes unidas a ellas. Por lo tanto, en otro ejemplo, las características estructurales de un anticuerpo anti-BST1 de la divulgación, por ejemplo, BST1_A2, BST1_A1 o BST1_A3, se usan para crear anticuerpos anti-BST1 estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como la unión al BST1 humano. Por ejemplo, una o más regiones CDR de BST1_A2, BST1_A1 o BST1_A3, o mutaciones de las mismas, se pueden combinar de forma recombinante con regiones marco conocidas y/u otras CDR para crear anticuerpos anti-BST1 adicionales, modificados de forma recombinante de la divulgación, como se discutió anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen las descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de modificación es una o más de las secuencias de VH y/o VK proporcionadas en este documento, o una o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo modificado por ingeniería genética, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias de VH y/o VK proporcionadas en este documento, o una o más regiones CDR de las mismas. Por el contrario, la información contenida en la secuencia o secuencias se utiliza como el material de partida para crear una secuencia o secuencias de "segunda generación" derivadas de la secuencia o secuencias originales y luego se prepara la secuencia o secuencias de "segunda generación" y se expresan como una proteína.
Por consiguiente, en otro ejemplo, la divulgación proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-BST1 que comprende: proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 10 , 9 y 56, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 12 o 51, 11 y 57, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 14, 13 y 58; y/o (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 16, 15 y 59, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 18, 17 y 60 y/o una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 20, 19 y 61, alterando al menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresando la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.
Se pueden usar técnicas de biología molecular estándar para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada.
Preferiblemente, el anticuerpo codificado por la secuencia o secuencias de anticuerpo alteradas es uno que retiene una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-BST1 descritos en la presente memoria, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a: (a) unión al BST1 humano con una KD de 1 x 10-7 M o menos; (b) unión a células CHO humanas transfectadas con el BST1.
Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar usando ensayos estándar disponibles en la técnica y/o descritos en la presente memoria, tales como los expuestos en los Ejemplos (por ejemplo, citometría de flujo, ensayos de unión).
En ciertos ejemplos de los métodos de modificación de anticuerpos de la divulgación, las mutaciones pueden ser introducidas al azar o selectivamente a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de anticuerpo anti-BST1 y los anticuerpos anti-BST1 modificados resultantes pueden ser seleccionados para determinar la actividad de unión y/u otras propiedades funcionales como se describe en la presente memoria. En la técnica se han descrito métodos mutacionales. Por ejemplo, la publicación PCT WO 02/092780 describe métodos para crear y seleccionar mutaciones de anticuerpos usando mutagénesis de saturación, montaje de ligación sintético, o una combinación de los mismos. Alternativamente, la publicación PCT WO 03/074679 describe métodos de utilización de métodos de cribado computacional para optimizar las propiedades fisicoquímicas de anticuerpos.
Moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos de la invención
Otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se "aisló" o "se hizo sustancialmente puro" cuando se purificó lejos de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, mediante técnicas estándar, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. Véase F. Ausubel, et al., Ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, N. Y. Un ácido nucleico de la invención puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede o no contener secuencias intrónicas. En una realización
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preferida, el ácido nucleico es una molécula de ADNc.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden obtenerse usando técnicas de biología molecular convencionales. Para anticuerpos expresados por hibridomas, los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo producido por el hibridoma pueden obtenerse mediante técnicas de amplificación por PCR estándar o de clonación de ADNc. Para los anticuerpos obtenidos de una biblioteca de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, usando técnicas de despliegue en fagos), los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo pueden recuperarse de la biblioteca.
Las moléculas preferidas de ácidos nucleicos de la divulgación son las que codifican las secuencias de VH y VK de los anticuerpos monoclonales BST1_A2, BST1_A1 o BST1_A3. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de VH de BST1_A2, BST1_A1 o BST1_A3 se muestran en las SEQ ID NO: 6, 5 y 54, respectivamente. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de VK de BST1_A2, BST1_A1 o BST1_A3 se muestran en las SEQ ID NOs: 8, 7 y 55, respectivamente.
Otros ácidos nucleicos preferidos de la divulgación son ácidos nucleicos que tienen al menos un 80% de identidad de secuencia, tal como al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia, con una de las secuencias mostradas en las SEQ ID NOs: 6, 5, 8, 7, 54 y 55, cuyos ácidos nucleicos codifican un anticuerpo de la invención, o una porción de unión al antígeno del mismo.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico es el número de posiciones en la secuencia en la que el nucleótido es idéntico, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que necesitan introducirse para una alineación óptima de dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático, tal como el algoritmo de Meyers y Miller o el programa XBLAST de Altschul descrito anteriormente.
Aún más, los ácidos nucleicos preferidos de la divulgación comprenden una o más porciones que codifican CDR de las secuencias de ácido nucleico mostradas en las SEQ ID NOs: 6, 5, 8, 7, 54 y 55. En este ejemplo, el ácido nucleico puede codificar la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de cadena pesada y ligera de BST1_A2, BST1_A1
o BST1_A3.
Los ácidos nucleicos que tienen al menos el 80%, como al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia, con dicha porción codificante de CDR de las SEQ ID NOs: 6, 5, 8, 7, 54 y 55 (secuencias de VH y VH) son también ácidos nucleicos preferidos de la divulgación. Dichos ácidos nucleicos pueden diferir de la porción correspondiente de las SEQ ID NOs: 6, 5, 8, 7, 54 y 55 en una región codificante no de CDR y/o en una región codificadora de CDR. Cuando la diferencia está en una región codificadora de CDR, la región CDR de ácido nucleico codificada por el ácido nucleico comprende típicamente una o más modificaciones de secuencia conservadoras como se definen aquí en comparación con la secuencia de CDR correspondiente de BST1_A2, BST1_A1 o BST1_A3.
Una vez obtenidos los fragmentos de ADN que codifican los segmentos de VH y VK, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante técnicas estándar de ADN recombinante, por ejemplo, para convertir los genes de región variable en genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes del fragmento Fab, o en un scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VK o VH está operativamente unido a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El término "operativamente enlazado", tal como se utiliza en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN están unidos de tal manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el marco.
El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de los genes de la región constante de cadena pesada murina son conocidas en la técnica [véase, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, publicación NIH No. 91-3242] y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero lo más preferiblemente es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede estar operativamente unido a otra molécula de ADN que codifica solamente la región constante de CH1 de cadena pesada.
El ADN aislado que codifica la región VL/VK puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como un gen de cadena ligera de Fab) mediante la unión operativa del ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de la región constante de cadena ligera de murino son conocidas en la técnica [véase, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, publicación NIH No. 91-3242] y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación PCR estándar. En realizaciones preferidas, la región constante de cadena ligera puede ser una región constante
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kappa o lambda.
Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL/VK están operativamente unidos a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de manera que las secuencias de VH y VL/VK pueden expresarse como una proteína de cadena única contigua, con las regiones VL/VK y VH unidas por el enlazador flexible [véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-554].
Producción de anticuerpos monoclonales
De acuerdo con la invención, el BST1 o un fragmento o derivado del mismo puede usarse como un inmunógeno para generar anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a dicho inmunógeno. Dichos inmunógenos pueden aislarse por cualquier medio conveniente. Un experto en la técnica reconocerá que están disponibles muchos procedimientos para la producción de anticuerpos, por ejemplo, como se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Cold Spring Harbor, N.Y. Un experto en la técnica apreciará también que fragmentos de unión o fragmentos Fab que imitan anticuerpos también se pueden preparar a partir de información genética mediante diversos procedimientos [Antibody Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C., ed.), 1995, Oxford University Press, Oxford; J. Immunol. 149, 3914-3920 (1992)].
En un ejemplo, se producen anticuerpos para un dominio específico del BST1. En un ejemplo específico, se usan fragmentos hidrofílicos de BST1 como inmunógenos para la producción de anticuerpos.
En la producción de anticuerpos, el cribado para el anticuerpo deseado puede realizarse mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima). Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un dominio específico del BST1, se pueden ensayar hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de BST1 que contiene tal dominio. Para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a un primer homólogo de BST1, pero que no se une específicamente a (o se une menos ávidamente a) un segundo homólogo de BST1, se puede seleccionar con base en la unión positiva al primer homólogo de BST1 y la falta de unión a (o unión reducida a) el segundo homólogo de BST1. De manera similar, para la selección de un anticuerpo que se une específicamente al BST1 pero que no se une específicamente a (o se une menos ávidamente a) una isoforma diferente de la misma proteína (tal como una glicoforma diferente que tiene el mismo péptido central que el BST1), se puede seleccionar sobre la base de la unión positiva al BST1 y la falta de unión a (o unión reducida a) la isoforma diferente (por ejemplo, una glicoforma diferente). Por tanto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo (tal como un anticuerpo monoclonal) que se une con mayor afinidad (por ejemplo, al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, en particular al menos 10 veces mayor afinidad) al BST1 que a una isoforma o isoformas diferentes (por ejemplo, glicoformas) del BST1.
Los anticuerpos policlonales que pueden usarse en los métodos de la divulgación son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas del suero de animales inmunizados. También se puede usar suero inmune no fraccionado. Pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales con el BST1, un fragmento del BST1, un polipéptido relacionado con BST1, o un fragmento de un polipéptido relacionado con BST1. Por ejemplo, una forma es purificar polipéptidos de interés o sintetizar los polipéptidos de interés usando, por ejemplo, métodos de síntesis de péptidos en fase sólida bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol. Vol 182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields ed., Meth. Enzymol. Vol 289 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokio) 38: 1192-99, 1990; Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1: 255-60, 1995; Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokio) 44: 1326-31, 1996. Los polipéptidos seleccionados pueden utilizarse entonces para inmunizar mediante la inyección de diversos animales hospederos, incluyendo, pero sin limitarse a conejos, ratones, ratas, etc., para generar anticuerpos policlonales o monoclonales. Pueden usarse diversos adyuvantes (es decir, inmunoestimulantes) para mejorar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped, incluyendo, pero sin limitarse a, adyuvante de Freund completo o incompleto, un gel mineral tal como hidróxido de aluminio, sustancia tensoactiva tal como lisolecitina, poliol plurónico, un polianión, un péptido, una emulsión de aceite, hemocianina de lapa ojo de cerradura, dinitrofenol y un adyuvante tal como BCG (bacilo Calmette-Guerin) o corinebacterium parvum. Los adyuvantes adicionales son también bien conocidos en la técnica.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos hacia el BST1, puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256: 495-497), así como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas [Kozbor et al. (1983) Immunology Today 4:72], y la técnica del hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos [Cole et al. (1985) en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96]. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce los anticuerpos monoclonales puede cultivarse in vitro o in vivo. En una realización adicional de la invención, se pueden producir anticuerpos monoclonales en animales libres de gérmenes utilizando tecnología conocida (PCT/US90/02545).
El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridoma en el ratón
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