CN117500832A - 抗her3抗体、含有该抗体的抗体药物缀合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了抗HER3抗体、含有该抗HER3抗体的抗体药物缀合物(ADC)。还提供了该抗体或ADC在治疗表达HER3的癌症中的用途。

Description

抗HER3抗体、含有该抗体的抗体药物缀合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年6月15日提交的PCT国际申请PCT/CN2021/099998的优先权，该申请通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本公开涉及抗HER3抗体。本公开还涉及含有该抗HER3抗体的抗体药物缀合物以及它们在治疗表达HER3的癌症中的用途。
背景技术
HER3是ERBB家族的成员，在细胞增殖、肿瘤转移和药物抗性中起关键作用。虽然靶向EGFR和HER2的药物在缓解多种癌症方面表现出巨大的临床益处，但先前在开发用于癌症治疗的抗HER3抗体方面的尝试却屡次失败，这表明仅仅针对HER3及其涉及的通路可能不足以抑制肿瘤生长。与该假设一致，U3-1402，一种靶向HER3的ADC，在乳腺癌和NSCLC的早期临床试验中显示出有前景的结果。此外，操控HER3和HER2两者的双特异性抗体在一些富集的人群中显著减少了疾病生物标志物。最新的临床进展表明，如果具备额外的附加机制，HER3仍然是一个有前景的肿瘤学靶点。
发明内容
在一个方面，本公开提供了抗HER3抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含：包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，所述VH包含由SEQ ID NO：15组成的CDR-H1、由SEQ ID NO：17组成的CDR-H2和由SEQ ID NO：19组成的CDR-H3。
在一些实施方案中，所述抗HER3抗体或其抗原结合片段进一步包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含：包含SEQ ID No：5的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，所述VL包含由SEQ ID NO：5组成的CDR-L1、由SEQ ID NO：7组成的CDR-L2和由SEQ ID NO：9组成的CDR-L3。
在一些实施方案中，所述VH包含带有或不带有SEQ ID NO：13的前导序列的SEQ IDNO：12的氨基酸序列，或与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述VL包含带有或不带有SEQ ID NO：3的前导序列的SEQ IDNO：2的氨基酸序列，或与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗HER3抗体是小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
在一些实施方案中，所述抗HER3抗体的重链是IgG1类型。
在一些实施方案中，所述抗HER3抗体是人源化抗体，且重链包含SEQ ID NO：21、25或27的氨基酸序列，或与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗HER3抗体是人源化抗体，且轻链包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，或与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述HER3是人或猴HER3。
在一些实施方案中，所述抗HER3抗体阻断NRG1诱导的HER3磷酸化。
在一些实施方案中，所述抗HER3抗体与人或猴HER3结合的EC50低于1nM。
在一些实施方案中，所述抗HER3抗体在与HER3结合后具有内化活性。
在另一方面，本公开提供了分离的核酸，其包含编码上述VH和/或上述VL的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的核酸选自SEQ ID NO：1、11、22、24、26和28。
在另一方面，本公开提供了包含所述分离的核酸的载体(vector)。
在另一方面，本公开提供了包含所述分离的核酸或所述载体的宿主细胞。
在另一方面，本公开提供了表达抗HER3抗体或其抗原结合片段的宿主细胞。
在另一方面，本公开提供了抗体缀合物，其包含与化学部分缀合的抗HER3抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗HER3抗体或其抗原结合片段通过接头与所述化学部分缀合。
在一些实施方案中，所述接头是酶可切割的。
在一些实施方案中，所述接头包含Val-Cit部分。
在一些实施方案中，所述抗体缀合物是抗体药物缀合物(ADC)。
在一些实施方案中，所述化学部分是放射性同位素、化疗剂或细胞毒性剂。
在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是毒素。
在一些实施方案中，所述毒素选自澳瑞他汀E(auristatin E)、澳瑞他汀F(auristatin F)、MMAE和MMAF。
在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含所述抗HER3抗体或其抗原结合片段或所述抗体缀合物，以及药学上可接受的载体(carrier)。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含一种或更多种其他抗癌剂。
在另一方面，本公开提供了所述抗HER3抗体或其抗原结合片段或所述抗体缀合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述癌症表达HER3。
在一些实施方案中，所述癌症是胃癌或结肠直肠癌。
在另一方面，本公开提供了治疗受试者的癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的所述抗HER3抗体或其抗原结合片段、所述抗体缀合物或所述药物组合物。
在一些实施方案中，所述癌症表达HER3。
在一些实施方案中，所述癌症是胃癌或结肠直肠癌。
附图说明
图1显示鼠3F8特异性结合SP2/0-HER3细胞。
图2显示通过ELISA确定的鼠3F8与人HER3、HER2和EGFR的结合亲和力。
图3显示通过ELISA确定的鼠3F8以相似的效力识别人和猴HER3。
图4显示鼠3F8阻断NRG1诱导的磷酸化的HER3。
图5显示鼠3F8被具有不同表面HER3水平的细胞迅速摄取。
图6显示抗HER3抗体有效抑制BT474皮下异种移植物模型中的肿瘤生长。
图7显示胃PDX模型GAS078的[89Zr]Zr-ch3F8成像。
图8分别显示6个PDX模型中的代表性[89Zr]Zr-ch3F8成像。
图9显示ch3F8-MMAE保持与ch3F8相似的结合亲和力。
图10显示ch3F8-MMAE在多种细胞系中的细胞毒性。
图11显示ch3F8-MMAE抑制胃模型GAS078中的肿瘤生长。
图12A-12C显示hu3F8在热、酸和反复冻融(free-thaw)的应激测试后仍保持结合亲和力。图12A，hu3F8的三种克隆在pH3.5孵育0、2、4和6小时，然后进行ELISA测定以测量结合亲和力。图12B，hu3F8的三种克隆在40℃孵育不同天数，然后进行ELISA测定以测量结合亲和力。图12C，hu3F8的三种克隆冷冻并解冻3或5个循环，然后进行ELISA测定以测量结合亲和力。
图13A-13B显示hu3F8-MMAE剂量依赖性地抑制肿瘤生长(图13A)，并且对体重几乎没有影响(图13B)。
图14显示hu3F8-MMAE单次注射(single shot)10mg/kg抑制胃PDX模型GAS078中的肿瘤生长。
图15显示6mg/kg的hu3F8-MMAE抑制胃PDX模型GAS078中的肿瘤生长。
图16显示hu3F8-MMAE抑制结肠直肠PDX模型CS226中的肿瘤生长。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。任何与本文所述方法、装置和材料相似或等效的方法、装置和材料都可用于本发明的实践。提供以下定义是为了便于理解本文使用的某些术语，并不意味着限制本公开的范围。
冠词“a”和“an”在本文用来指一个或多于一个(即，至少一个)的该冠词的语法对象。举例来说，“an element”是指一个元素或多于一个的元素。
本文使用的术语“和/或”应被视为具体公开了两个指定的特征或组分中的每一个，其单独存在或者与另一个同时存在。因此，在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”意在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。
“人表皮生长因子受体3(HER3)”，也称为受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3(ERBB3)，是EGFR/ERBB家族的成员。与其他ERBB家族成员HER2和EGFR不同，HER3本身没有激酶活性。因此，HER3必须与其激酶活性成员EGFR或HER2结合为异二聚体来触发其下游活性。在与其天然配体NRG1结合后，HER3经过构象改变、异二聚化和磷酸化，然后进行信号转导激活MAPK、PI3K/Akt和PLCγ。同时，在高水平HER2存在下，HER3也通过不依赖配体的方式发挥其生物活性。HER3在细胞生长和增殖、胚胎发育和肿瘤发生中起关键作用。HER3敲除小鼠严重发育不良，在胚胎第13.5天致死。HER3也导致针对不同蛋白质和适应症的药物的耐药性。
术语“抗体”通常指由四条多肽链、两条重(H)链和两条轻(L)链组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子或是保留了Ig分子的必要表位结合特征的其任何功能片段(抗原结合片段)。在全长抗体中，每条重链由重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区通常由三个结构域组成，CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL的区域可以进一步细分为超变区，称为互补决定区(CDR)，其分散地分布在比较保守的区域之间，这些比较保守的区域称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。因此，重链的CDR从重链的氨基末端一侧起分别称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，而轻链的CDR从轻链的氨基末端一侧起分别称为CDR-L1、CDR-L2和CDRL3。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、lgG2、IgG 3、lgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在广义上，术语“抗体”还指scFv或sdAb，其不是来源于具有四条多肽链的免疫球蛋白分子。术语“抗体”还指任何含有抗HER3抗体或其抗原结合片段的多特异性抗体(尤其是双特异性抗体)。
抗体或抗体的功能片段可以具有一个或更多个修饰的氨基酸残基。例如，抗体的重链或轻链经历了一种或更多种修饰，其选自由N-连接糖基化、O-连接糖基化、N-末端加工、C-末端加工、脱酰胺、天冬氨酸异构化、甲硫氨酸氧化、N-末端添加甲硫氨酸残基、脯氨酸残基酰胺化、N-末端谷氨酰胺或N-末端谷氨酸转化为焦谷氨酸，以及羧基末端缺失一个或两个氨基酸组成的组。
“抗原结合片段”是抗体的部分，例如F(ab’)2、Fab、Fv、scFv、sdAb等等。全长抗体的抗原结合片段保留了全长抗体的靶向特异性。因此，重组功能性抗体片段，如scFv(单链可变链片段)，已被用于开发治疗药物，作为基于mAb的治疗药物的替代。scFv片段(～25kDa)由两个可变结构域VH和VL组成。天然状态下，VH和VL结构域通过疏水相互作用非共价结合，并且倾向于解离。然而，稳定的片段可以通过用亲水性柔性接头连接结构域来进行工程化，从而产生scFv。
本文使用的术语“单域抗体”(sdAb)在本领域中具有其一般含义，是指抗体的单个重链可变结构域，该抗体类型可以在骆驼科哺乳动物中发现，其天然缺乏轻链。这种单域抗体也被称为VHH或“纳米抗体”。单域抗体的氨基酸序列和结构可以被认为由四个框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)组成。因此，单域抗体可以定义为具有以下一般结构的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其类似于可变结构域VH或VL。与使用常规抗体或其他抗体片段(例如scFv)相比，使用sdAb作为单一抗原结合蛋白或作为较大蛋白质或多肽中的抗原结合结构域，具有许多显著优势。sdAb的优势包括：只需要单个结构域就能以高亲和力和高选择性结合抗原；sdAb对变性剂或条件(包括热、pH和蛋白酶)高度稳定；并且sdAb可以接近常规抗体无法接近的靶标和表位。通常，sdAb在骆驼科动物如美洲驼(llama)中产生，但也可以使用本领域公知的技术合成产生。
术语“嵌合抗体”是指包含来自小鼠的可变区(即结合区)和至少部分的来自不同来源或物种(例如人)的恒定区的抗体，通常通过重组DNA技术制备。包含小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是特别优选的。这种小鼠/人嵌合抗体通常是表达的免疫球蛋白基因的产物，所述免疫球蛋白基因包含编码小鼠免疫球蛋白可变区的DNA片段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA片段。生产嵌合抗体的方法涉及本领域目前公知的常规重组DNA和基因转染技术。
术语“人源化抗体”是指其中框架或“互补决定区”(CDR)已被修饰以包含与母体免疫球蛋白相比具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR的抗体。在优选的实施方案中，VH和VL的CDR被嫁接到人抗体的框架区域中以制备“人源化抗体”。重链和轻链可变框架区可以来源于相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然存在的人抗体的序列。可选地，框架区可以通过进一步的突变来修饰。特别优选的CDR对应于识别上述嵌合抗体的抗原的那些代表性序列。优选地，这种人源化版本与人恒定区嵌合。本文使用的术语“人源化抗体”还包含在恒定区被修饰以产生如本发明所述的特性的此类抗体，特别是关于C1q结合和/或FcR结合，例如通过“类别转换”，即Fc部分的改变或突变(例如从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。
本文使用的术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区、恒定区的抗体。人抗体也可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，该转基因动物在免疫后，在缺乏内源性免疫球蛋白产生的情况下，能够产生全部的人抗体或选择性的部分人抗体。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移进入这种种系突变体小鼠，将会在抗原攻击时产生人抗体。人抗体也可以在噬菌体展示文库中产生。
本文使用的术语“抗HER3抗体”是指特异性结合人HER3抗原的抗体。“特异性结合”感兴趣的抗原(即HER3)的抗体是能够以足够的亲和力结合该抗原的抗体，从而该抗体可用于靶向表达该抗原的细胞。结合亲和力可以用标准结合测定法测得，例如表面等离子共振技术(GE-Healthcare Uppsala，瑞典)。
对于肽或抗体序列，术语“序列同一性”被定义为，候选序列中与参考肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大百分比的序列同一性之后得到，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
当用于本发明的抗体在癌细胞表面与HER3抗原的结合时，术语“内化”是指通过受体介导的内吞作用、微胞饮作用、吞噬作用或其他类似的细胞摄取和/或运送通路从外部环境快速摄取抗体-抗原复合物。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体的“内化”涉及其通过涉及质膜折叠和囊泡形成的机制从外部环境中被摄取。当本发明的抗体与化学部分如放射性同位素、荧光团或细胞毒素缀合时，该化学部分可以与本发明的抗体一起内化到表达HER3的细胞中。抗体是否具有内化活性可以通过本领域技术人员公知的方法来确认，并且可以通过，例如，将结合有标记材料的抗HER3抗体与表达HER3的细胞接触并确认标记材料(例如放射性同位素、荧光团或荧光蛋白)是否并入细胞的方法来确认，或者将细胞毒性物质缀合的抗HER3抗体与表达HER3的细胞接触并确认是否诱导表达HER3的细胞死亡的方法来确认。更具体地说，抗HER抗体的内化活性可以通过例如实施例中描述的方法来测定。具有内化活性的抗HER3抗体可以与例如细胞毒性物质缀合，并用作药物组合物，例如后文描述的抗癌剂。
本文使用的术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生感兴趣的蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞系统。宿主细胞包括但不限于培养的细胞，例如来源于啮齿动物(大鼠、小鼠、豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，如CHO、BHK、NSO、SP2/0、YB2/0；或人组织或杂交瘤细胞、酵母细胞和昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养组织中的细胞。该术语不仅包括特定的受试细胞，还包括这种细胞的子代。由于突变或环境影响，某些修饰可能发生在后代中，因此这样的子代可能与亲代细胞不同，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。
本文使用的术语“核酸”是指由通过磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、相关的天然存在的结构变体以及合成的非天然存在的其类似物)、相关的天然存在的结构变体以及合成的非天然存在的其类似物组成的聚合物。因此，该术语包括核苷酸聚合物，其中核苷酸和它们之间的连接包括非天然存在的合成的类似物，例如但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。这种多核苷酸可以通过，例如使用自动DNA合成器，来合成。应当理解，当核苷酸序列由DNA序列表示时(即，A，T，G，C)，这也包括RNA序列(即，A，U，G，C)其中由“U”代替“T”。
本文使用的术语“分离的核酸”是指纯化状态，在这种语境下是指核酸基本上不含其他生物分子，如蛋白质、脂质、碳水化合物或其他物质，如细胞碎片和生长介质。
术语“EC50”，也称为半最大效应浓度，是指抗体或其抗原结合部分产生半最大反应的浓度，例如在通过FACS或ELISA进行的测试中。
本文使用的术语“抗体缀合物”是指抗体或其抗原结合片段与其它化学部分缀合，例如放射性同位素、化疗剂和毒素。在一些实施方案中，化学部分是同位素或荧光团，因此缀合的抗体可用于(通过体内成像)显示表达HER3的细胞、组织或器官(包括肿瘤)。在一些实施方案中，所述抗体缀合物是抗体药物缀合物(ADC)。
术语“抗HER3抗体药物缀合物”和“抗HER3 ADC”在本文中可互换使用，是指抗体-药物缀合物，其包含特异性结合HER3并通过接头与细胞毒性剂(例如奥瑞他汀)缀合的抗体。通常，抗体(例如，抗HER3抗体)在修饰为ADC分子后能够保持其生物活性，例如与其靶向的抗原的结合亲和力。术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞表达活性、细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素、化疗剂和毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素)，包括其片段和/或变体。化疗剂是本领域公知的，包括但不限于蒽二酮类(蒽醌类)，如蒽环类(例如柔红霉素(道诺霉素；红比霉素)、多柔比星、表柔比星、伊达比星和戊柔比星)、米托蒽醌和匹杉琼；基于铂的试剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、赛特铂、吡铂、奈达铂、三铂(triplatin)和脂铂(lipoplatin))；它莫西芬及其代谢物如4-羟基他莫昔芬(阿非昔芬)和N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(恩多昔芬)；紫杉烷，如紫杉醇(paclitaxel、taxol)、多西他赛、卡巴他赛和10-脱乙酰巴卡亭；烷化剂(例如氮芥，如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine，HN2)、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-溶肉瘤素)和苯丁酸氮芥)；亚乙基亚胺和甲基三聚氰胺(例如六甲基三聚氰胺、噻替派、烷基磺酸盐如白消安、亚硝基脲如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNLJ)、塞莫司汀(甲基-CCN-U)和链脲霉素(链脲佐菌素)，以及三氮烯如达卡巴嗪(DTIC；二甲基三氮咪唑甲酰胺))；抗代谢药物(例如叶酸类似物如甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)、嘧啶类似物如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷；FUdR)和阿糖孢苷(阿糖胞苷)，以及嘌呤类似物和相关抑制剂如巯嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；6-TG)和喷司他丁(2’-脱氧肋间型霉素(2'-deoxycofonnycin)))；天然产物(例如，长春花生物碱如长春花碱(VLB)和长春新碱，表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷，以及抗生素如更生霉素(放线菌素D)、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素Q)；酶如L-天冬酰胺酶；生物反应调节剂如干扰素α)；取代脲如羟基脲；甲基肼衍生物，如丙卡巴肼(N-甲基肼；MIH)；肾上腺皮质抑制剂，如米托坦和氨鲁米特；其类似物、衍生物及其组合。细胞毒性剂的实例包括但不限于澳瑞他汀(例如澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、美登素、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、康普瑞汀、倍癌霉素、多拉司他汀(dolastatin)、多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、二羟基炭疽二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八迭球菌(alpha-sarcin)、白树毒素、米格来宁(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、伊诺霉素、curicin、巴豆素、卡利奇霉素、肥皂草抑制剂、糖皮质激素和其他化疗剂，以及放射性同位素。本文使用的术语“澳瑞他汀”是指抗有丝分裂剂家族。澳瑞他汀衍生物也包括在术语“澳瑞他汀”的定义中。澳瑞他汀的实例包括但不限澳瑞他汀E(AE)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)和多拉司他汀的合成类似物。在一个实施方案中，所述抗HER3抗体药物缀合物是抗HER3抗体-MMAE(例如，ch3F8-MMAE或hu3F8-MMAE)。在一些实施方案中，所述接头与抗体铰链区中的Cys残基缀合。
术语“药物组合物”是指其形式允许活性成分的生物活性有效的制剂，因此可以施用于受试者用于治疗用途。
术语“药学上可接受的载体(carrier)”是指制剂中适合用于递送活性成分(例如本发明的抗体或ADC)的任何非活性物质。载体可以是粘合剂、涂层、崩解剂、填充剂或稀释剂、防腐剂(例如抗氧化剂、抗菌剂或抗真菌剂)、甜味剂、吸收延迟剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。合适的药学上可接受的载体的实例包括水、乙醇、多元醇(polyol)(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)葡萄糖(dextrose)、植物油(例如橄榄油)、盐水、缓冲剂、缓冲盐水，和等渗剂，例如糖、聚醇(polyalcohol)、山梨醇和氯化钠。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生有益的或期望的结果的活性剂的量。治疗有效量可以根据以下一种或更多种而变化：被治疗的受试者和疾病病况、受试者的体重和年龄、疾病病况的严重程度、施用方式等等，其可以由本领域普通技术人员容易地确定。具体剂量可以根据以下一项或更多项而变化：所要遵循的给药方案、是否与其他治疗剂组合施用、施用时点、所要成像的组织以及携带它的物理递送系统。
本文使用的短语“其他抗癌剂”是指不同于本文公开的抗HER3抗体或抗HER3 ADC的抗癌剂。其他抗癌剂的非限制性实例包括化疗剂，例如5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、甲氨蝶呤、多柔比星、依托泊苷、卡铂、顺铂、环磷酰胺、美法仑、达卡巴嗪、紫杉酚(taxol)、喜树碱、FOLFIRI、FOLFOX、多西他赛、柔红霉素、紫杉醇(paclitaxel)、奥沙利铂及其组合；生物治疗剂，例如针对PD-L1、PD-1、CTLA-4、CCR4、OX40的抗体；电离辐射；细胞治疗剂，如嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞或NK细胞。
术语“癌”和“肿瘤”在本文中可互换地使用，是指例如，肺癌、非小细胞肺癌(NSCL)、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌症(cancer of the anal region)、胃癌(stomachcancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆道癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、施万细胞瘤(schwanoma)、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤、淋巴瘤、淋巴细胞白血病，包括任何上述癌症的难治型，或一种或更多种上述癌症的组合。优选地，这种癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌或胰腺癌，优选肺癌、头颈癌或胰腺癌。优选地，这种癌症还由HER3表达或过表达来表征，更优选地由HER3过表达来表征。
本文使用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指对受试者(例如哺乳动物(特别是人类))的疾病或医学病况的治疗，其包括：(a)防止疾病或医学病况的发生，例如对受试者进行预防性治疗；(b)改善疾病或医学病况，例如消除或使受试者的疾病或医学病况消退；(c)抑制疾病或医学病况，例如通过减缓或阻止受试者的疾病或医学病况的发展；或(d)减轻受试者的疾病或医学病况的症状。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非另有说明，术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方式，这些实施方式当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限制。
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间、精确至以下限为单位的十分之一的中间值，以及其他任何指定的或指定范围内的中间值，均包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，并且也包含在本发明中，但受到指定的范围中任何特定的排除的限制。在指定的范围包括一个或全部两个限值的情况下，排除这些所包括的限值中的一个或全部两个的范围也包括在本发明中。
材料和方法：
材料：以下试剂购自Southern Biotech，并以指定的稀释度使用：山羊抗小鼠IgG-HRP(1030-05，1:5000稀释度)、山羊抗人IgG-PE(2040-09，1:1000稀释度)、山羊抗人κIgG-HRP(2061-05，1:20000稀释度)、山羊抗兔IgG-HRP(4030-05，1:5000稀释度)、链霉亲和素-FITC(7100-02，1:500稀释度)、小鼠抗人κ-APC(9230-11，1:500稀释度)、小鼠IgG-APC(0107-11，0.1mg/ml)。NRG1来自Origene(TP723155)。细胞培养基Roswell Park MemorialInstitute(RPMI)1640、Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM)和胎牛血清来自Hyclone。重组Patritumab是自行制备的。HER3抗体3F8是自行生产的，其源自杂交瘤或重组体。m3F8表示鼠3F8，而ch3F8和hu3F8分别指嵌合和人源化3F8。
细胞培养：研究中使用的SP2/0、SP2/0-HER3、SP2/0-HER2、SP2/0-EGFR、NCI-N87、MDA-MB-468、MDA-MB-453、7901、HT29、MCF-7、SK-BR-3购自ATCC并保存在其推荐的适当培养基中。稳定表达人EGFR、HER2和HER3的SP2/0-EGFR、SP2/0-HER2、SP2/0-HER3是自行生产的。
抗HER3杂交瘤的产生：第1天，BALB/c小鼠(雌性，8-10周龄)腹腔注射1-2×106个表达人HER3的SP2/0-HER3细胞，以及弗氏完全佐剂。在第8天，用相同量的细胞与弗氏不完全佐剂的进行增强免疫。从第14天开始，每三天用上述量的细胞对小鼠进行免疫，重复三次。最后一次免疫后3天，从脾脏中分离B淋巴细胞，并与永生骨髓瘤细胞NS-1细胞融合以产生杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞在96孔板中连续稀释培养。收集上清液，用流式细胞术筛选识别SP2/0细胞表面上表达的HER3的任何抗体或用ELISA筛选识别重组HER3的任何抗体。
抗体可变区的DNA克隆与测序：简而言之，用Trizol(ThermoFisher)从杂交瘤中提取的总RNA被逆转录为第一cDNA链。如5’RACE试剂盒(Invitrogen，18374-058)的说明中所述，快速扩增5’互补DNA(5’RACE)，然后进行巢式PCR，以扩增编码可变区的DNA序列。将PCR产物克隆至pGM-T载体(vector)中。对阳性克隆进行DNA测序，由此推断出相应的蛋白序列。分析了可变区的氨基酸(在Kabat编码方案下)。
抗体表达：简而言之，将编码抗体重链和轻链的DNA克隆至表达载体pCDNA3.1(+)(Invitrogen)中，并在293T细胞中表达。抗体用蛋白A或G柱(GE)纯化。
人源化：人源化由GenScript进行。首先，用人IgG1恒定区序列替换鼠抗体重链恒定区，用人Igκ恒定区序列替换鼠抗体轻链恒定区，从而产生鼠-人嵌合抗体(ch3F8)。然后按照参考文献(Kuramochi等)中的程序，在嵌合抗体上进行人源化。用人种系框架替换小鼠框架以产生人源化抗体，同时保留了维持亲和力和特异性所必需的小鼠框架中的残基。
由GenScript合成编码人源化抗体的密码子优化的DNA序列。
抗体表达和纯化：用携带指定抗体的编码DNA序列的质粒转染的ExpiCHO-S细胞(Catl.#A29133，Gibco)在ExpiCHO培养基(Catl.#A2910001,Gibco)中培养并维持在32℃、5％CO2 12天。4000g旋转30min收集上清液，并通过0.22μm膜过滤。如制造商手册中详细描述的那样，与蛋白A(Catl.#17508001，GE)结合的抗体用20mM磷酸钠(pH7.0)洗涤，并用0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱。洗脱部分用0.1M Tris缓冲液(pH9.0)中和，然后通过超滤离心转移(switch)至PBS缓冲剂。用BCA测定蛋白质浓度。
表面等离子体共振(SPR)：用Biacore T200测定动力学和亲和力。简而言之，将重组人HER3抗体固定在蛋白A芯片(GE,Cat.#29-1275-55)上。浓度从50nM至0.78125nM的终浓度(通过2倍系列稀释产生)的抗原穿过芯片，以测定亲和力和动力学。
FACS：用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化培养的细胞，然后以1500rpm旋转5分钟。细胞沉淀物用含有5％PBS和0.2％ProClin300的PBS的FACS溶液再生(regenerate)为5×106个细胞/mL。将50μL细胞悬浮液与100μL浓度为1μg/ml的第一抗体在冰上孵育1小时。用FACS溶液清洗两次。沉淀物用100μL含有山羊抗小鼠IgG-PE(1:1000稀释度)的FACS溶液再生，并在黑暗中在冰上孵育1小时。然后将细胞洗涤两次，重悬于200μL FACS溶液中。
Western blot：将用SDS-PAGE分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上进行westernblot。第一抗体如下：抗HER2(Cell Signaling,Catl#:2165S)、抗HER3(Cell Signaling,Catl#:12708)、抗p-HER3(Cell Signaling,Catl#:4791)、抗β-肌动蛋白(Cell Signaling,Catl#:4967)。
ELISA：人HER2-ex-huFc、人HER3-huFc、人EGFR-his在96孔板中稀释至2μg/mL、50μl/孔，在4℃孵育过夜。用0.5×PBST洗涤，然后用100μL封闭缓冲剂(PBS+3％BSA)在37℃孵育2小时，并用0.5×PBST洗涤。3F8以1:3比例用封闭缓冲剂连续稀释后，以50μL/孔加入，37℃孵育40-50分钟，然后用0.5×PBST洗涤。山羊抗小鼠IgG-HRP(SouthernBiotech，1030-05)用封闭缓冲剂以1:20000稀释，50μL/孔，在黑暗中孵育30分钟，然后用0.5×PBST洗涤。在检测前，向每个孔中加入50μL以1:1混合的鲁米诺缓冲剂A+B。
NRG1诱导HER3磷酸化：细胞在6孔板中培养，当达到80％汇合度时用于实验。实验当天，细胞用PBS洗涤两次，在无血清培养基中孵育6小时，然后用10μg/mL抗体处理过夜以诱导HER3磷酸化，在收获细胞进行western blot前30分钟加入NRG1至100ng/mL的工作浓度。
细胞毒性：在实验前一天，以5000/孔将细胞接种在96孔板中。将3F8-MMAE加入细胞中，以1:3的稀释度，达到工作浓度从100nM降至1pM，每个浓度三个样品。72小时后，如制造商手册所述，用ATPLite试剂盒测量细胞毒性。
抗体应激测试：5mg/mL的纯化抗体按照惯例储存在4℃，在40℃时孵育7天和14天用于热稳定性评估，在pH3.5甘氨酸溶液中再生并保持2、4和6小时用于酸稳定性评估，或经历4或6次循环的反复冻融处理用于冻融稳定性评估。通过SEC-HPLC测量聚合度，通过ELISA测定结合亲和力。
[89Zr]Zr-抗体标记：DFO-NCS与抗体缀合并标记，如参考文献所示(Zeglis和Lewis，2015)。简而言之，DFO和抗体以5:1的摩尔比混合，并在37℃孵育一小时。用SEC-HPLC纯化DFO-缀合抗体。
0.8mCi的89Zr-草酸盐溶液与DFO-缀合抗体(0.2mg/ml)在HEPES/Na2CO2缓冲剂(pH7.0-7.5)中混合，并在室温下孵育30分钟。用TLC评估放射化学纯度。[89Zr]Zr-抗体的Rf是0-0.3，而游离的89Zr的Rf为0.6-1.0。
PET成像：大约100uCi[89Zr]Zr-抗体通过静脉内施用至每个动物。在注射后的指定时间，用小动物PET成像机收集和分析成像。
3F8-vc-MMAE和U3-1402的制备：ADC的制备由CRO进行。简而言之，抗体中的二硫键用TCEP(三-2-羧乙基膦)和DTPA(二乙烯三胺五乙酸)试剂在25℃还原1-3小时。MC-VC-MMAE或MC-GGFG-Dxd逐滴加入还原的抗体溶液中，并在25℃孵育1-4小时，其间轻轻搅拌(agitation)。3F8-vc-MMAE的DAR(药物抗体比)大约为3.8，而U3-1402(Patritumab-GGFG-Dxd)的DAR约为8.0。两种药物都缀合至抗体中的半胱氨酸残基。
最终产物通过超滤纯化。分别用SEC-HPLC和HIC-HPLC评估纯度和DAR。
体内疗效研究：动物根据IACUC的指南饲养和使用。BALC/b裸鼠和NPG小鼠分别购自Charles River和SPF Biotech，饲养在25℃、12小时的黑暗/光照周期中，可自由进食和饮水。通过皮下植入冷冻保存的组织碎片来产生来源自患者的异种移植物(PDX)模型。动物在肿瘤尺寸达到100-200mm3时开始接受药物治疗，并在尺寸达到1000mm3时进行安乐死。每天观察总体健康状况。每3天监测并记录肿瘤尺寸和体重。
软件：数据用Olinda、GraphPad Prism 6.0或EXCEL进行分析。
实施例1
鼠3F8与SP2/0野生型细胞或过表达HER3、HER2或EGFR的细胞一起孵育。在FACS机器中用PE-抗鼠第二抗体检测结合强度。
结果示于图1中。3F8特异性结合SP2/0-HER3细胞，但不结合其他细胞。
实施例2
通过ELISA测定鼠3F8与人HER3、HER2和EGFR的结合亲和力。
结果示于图2中。鼠3F8只识别HER3，而不识别HER2或EGFR。
实施例3
用GraphPad Prism 6.0分析鼠3F8结合人HER3、HER2和EGFR的EC50。结果示于表1中。3F8在次纳摩尔范围表现出有效的结合亲和力。
表1.鼠3F8与人HER3、HER2或EGFR结合的EC50
实施例4
用ELISA测定鼠3F8针对人、猴、大鼠和小鼠HER3的物种选择性。
结果示于图3中。3F8以相似效力识别人和猴HER3，但不识别小鼠HER3。
实施例5
用GraphPad Prism 6.0分析鼠3F8结合人、猴、大鼠和小鼠HER3的EC50。结果示于表2中。3F8在次纳摩尔范围表现出针对人和猴HER3的同等的结合亲和力。
表2.鼠3F8与人、猴、大鼠或小鼠HER3结合的EC50
实施例6
鼠3F8阻断NRG1诱导的磷酸化的HER3。用NRG1(HER3配体)处理NCI-N87、MDA-MB-468和MDA-MB-453，以诱导下游的HER3磷酸化。通过western blot确定鼠3F8抑制NRG1诱导的p-HER3的效果。3D4是先前证明的抗HER3抗体，其与NRG1竞争结合HER3，被用作阳性对照。
结果示于图4中。数据显示，3F8降低了磷酸化HER3蛋白水平，但对总HER3蛋白水平没有影响。HER2的western blot也显示3F8对HER2蛋白水平没有影响。
实施例7
鼠3F8被具有不同表面HER3水平的细胞迅速摄取。具有不同表面HER3水平的细胞与鼠3F8在冰上孵育作为对照，或在37℃孵育1小时或4小时。通过从冰上孵育对照中减去37℃孵育的细胞表面信号，来确定内化比例(fraction)。
结果示于图5中。数据显示，3F8迅速内化至细胞中。大部分在孵育1小时内被摄取，将孵育时间延长至4小时使得细胞内部分的量略有增加，表明3F8的内吞是快速和连续的过程。
实施例8
抗HER3抗体有效抑制BT474皮下异种移植物模型中的肿瘤生长。抗HER3抗体m3F8、m3D4或m3F8+m3D4组合以25mg/kg的静脉内施用，每周两次(biweekly)，持续三周。每3-4天监测肿瘤尺寸。
结果示于图6中。m3F8和m3D4均显著抑制肿瘤生长(单因素(one-way)ANOVA，p<0.05)，而3F8表现出更好的疗效。m3F8和m3D4的组合与单独的m3F8同等有效。3F8和3D4均为抗HER3抗体。m3F8表示鼠抗体。
实施例9
[89Zr]Zr-ch3F8用于胃PDX模型GAS078的成像。将[89Zr]Zr-ch3F8静脉注射至胃模型GAS078中。在注射后4、24、48、72、96和168小时收集图像。用Olinda分析每个器官的放射性摄取，并以％ID/g(注射剂量/克组织的百分比)表示。
图7是[89Zr]Zr-ch3F8在GAS078模型中的代表性的成像。ch3F8表示嵌合3F8抗体。数据显示，随着时间推移，[89Zr]Zr-ch3F8在肿瘤中的摄取逐渐增加。肿瘤摄取在注射后96小时保持平稳，随后在注射后168小时略有下降。
数据还显示于表3中。肿瘤和心脏、肝、肾和脾等主要器官中对[89Zr]Zr-ch3F8的摄取以％ID/g(％注射剂量/克组织)为单位进行评估。
表3.肿瘤和主要器官的放射性摄取
实施例10
[89Zr]Zr-ch3F8用于多个PDX模型的成像。静脉注射[89Zr]Zr-ch3F8。在注射后72小时收集图像。图8示出了[89Zr]Zr-ch3F8在6个动物模型中成像的代表性图像。表4列出了通过ELISA测定的肿瘤组织中的HER3表达水平和注射后72小时主要器官和肿瘤组织中的放射性摄取。在所有6个测试的PDX模型中都有一定数量的肿瘤摄取。
表4.肿瘤组织中的HER3表达水平(ng/mg)及主要器官和肿瘤组织中的放射性摄取(％ID/g)
实施例11
ch3F8-MMAE保持与ch3F8相似的结合亲和力。用SP2/0-HER3通过FACS测量ch3F8-MMAE与HER3的结合亲和力。结果(图9)显示ch3F8-MMAE具有与ch3F8相同的对SP2/0-HER3的结合亲和力，而与HER3阴性SP2/0的结合很少。
实施例12
ch3F8-MMAE的细胞毒性。用ATPlite在多个细胞系中测量ch3F8-MMAE的细胞毒性。细胞用不同浓度的ch3F8-MMAE处理5天。用ATPlite测定ch3F8-MMAE的细胞毒性。数据(图10)显示，ch3F8-MMAE在杀伤HER3(+)细胞7901、HT-29、MCF-7、N87、MDA-MB-453、SK-BR-3、SP2/0-HER3方面具有很强的细胞毒性，但对HER3(-)细胞SP2/0-WT几乎没有影响。表5中列出了如图10所示的杀伤每种肿瘤细胞的细胞毒性IC50。数据用GraphPad Prism 6.0进行分析。
表5.ch3F8-MMAE对于多种细胞系的IC50。
7901 HT-29 MCF-7 N87 MDA-MB-453 SK-BR-3 SP2/0-HER3 SP2/0-WT
希尔斜率 -2.25 -1.191 -1.486 -0.6763 -0.4233 -0.4713 -1.261 NA
IC50(nM) 5.744 4.672 9.494 1.907 0.04009 0.1588 0.4864 NA
R2 0.9916 0.9851 0.984 0.9869 0.9897 0.9859 0.9943 NA
实施例13
ch3F8-MMAE抑制胃模型GAS078中的肿瘤生长。ch3F8-MMAE以3mg/kg静脉内施用，每周一次，持续三周，每3-4天测量肿瘤抑制效果，并在最后一次给药后持续10天测量。抗体3F8平行进行，使用盐水作为媒介物(vehicle)对照。结果显示于图11中。
实施例14
人源化3F8(hu3F8)和嵌合3F8的结合亲和力。用Biacore测定了人源化3F8的三种克隆和嵌合3F8的结合动力学。三种人源化的3F8克隆(克隆1、克隆2和克隆3)具有不同的重链，但共享同样的重链CDR和同样的轻链。下文列出了三种人源化3F8克隆的重链和轻链的氨基酸序列及其编码DNA序列。除非另有说明，克隆3在以下的实施例中用作hu3F8。
表6中列出的所有数据均使用Biacore T200评估软件3.1版本进行处理。
表6.人源化3F8(hu3F8)和嵌合3F8的结合亲和力
实施例15
hu3F8的三种克隆在pH3.5孵育0、2、4和6小时，然后进行ELISA测定以测量结合亲和力。结果(图12A)表明酸处理对结合亲和力几乎没有影响。
hu3F8的三种克隆在pH3.5孵育0、2、4和6小时后的EC50。EC50用ELISA测定。结果(表7)表明酸处理对结合亲和力几乎没有影响。
表7.hu3F8的三种克隆在pH3.5孵育0、2、4和6小时后的EC50
hu3F8的三种克隆在40℃孵育不同天数，然后进行ELISA测定以测量结合亲和力。平行测量嵌合抗体。结果显示于图12B中。
hu3F8的三种克隆在40℃孵育不同天数的EC50。人源化3F8抗体的3个克隆在生理盐水中于40℃孵育7天或14天，该热应激测试后的结合亲和力通过ELISA测定。平行测量嵌合3F8。结果(表8)表明酸处理对结合亲和力几乎没有影响。
表8.hu3F8的三种克隆在40℃孵育不同天数的EC50。
hu3F8的三种克隆冷冻并解冻3或5个循环，然后进行ELISA测定以测量结合亲和力。平行测量嵌合抗体。结果(图12C)表明反复冻融对结合亲和力几乎没有影响。
表9还显示了hu3F8的三种克隆经过多次冻融应激测试后的EC50。
表9.hu3F8的3个克隆经过多次冻融应激测试后的EC50
综上，这些数据表明，hu3F8在热、酸和反复自由解冻的应激测试后仍保持结合亲和力，从而表明hu3F8具有良好的可开发性(developability profile)。
实施例16
应激测试后的hu3F8的三种克隆及其对应物(在4℃下储存)的聚集性评估。用SEC-HPLC测量了三种hu3F8抗体在酸处理、反复冻融和40℃孵育后的聚集性，并与4℃储存的每种抗体进行了比较。结果示于表10中。所有克隆在应激测试后保持大于95％的单体，表明几乎没有聚集趋势。
表10.hu3F8的三种克隆在应激测试后的聚集性评估结果
实施例17
hu3F8的PTM(翻译后修饰)分析。P1：hu3F8无应激；P2：hu3F8在40℃应激2周。无应激或在40℃应激2周的hu3F8用胰蛋白酶消化，随后用质谱分析翻译后修饰。数据(表11)显示，在HC:372-393，脱酰胺作用略有增加。总的来说，应激前后PTM没有很大差异，表明可开发性良好。
表11.hu3F8的PTM分析结果
实施例18
hu3F8-MMAE剂量依赖性地抑制胃PDX模型GAS078中的肿瘤生长。hu3F8-MMAE以1、3mg/kg静脉内施用，每周一次，持续四周。U3-1402以10mg/kg平行进行。每3-4天监测肿瘤尺寸和体重。数据表明hu3F8-MMAE剂量依赖性地抑制肿瘤生长(图13A)，并且对体重几乎没有影响(图13B)。就肿瘤抑制而言，3mg/kg的hu3F8-MMAE与10mg/kg的U3-1402作用相当。
实施例19
hu3F8-MMAE单次注射10mg/kg时抑制胃PDX模型GAS078中的肿瘤生长。U3-1402，一种通过抗HER3抗体patritumab靶向HER3的ADC，平行进行。hu3F8-MMAE和U3-1402均以10mg/kg一次施用，每3-4天监测肿瘤抑制作用。数据(图14)显示，在GAS078模型中，10mg/kg的hu3F8-MMAE在抑制肿瘤生长方面比10mg/kg的U3-1402更有效。
实施例20
6mg/kg的hu3F8-MMAE抑制胃PDX模型GAS078中的肿瘤生长。U3-1402是通过抗HER3抗体patritumab靶向HER3的ADC。hu3F8-MMAE以6mg/kg静脉内施用，每周一次，持续三周。U3-1402的抗HER3抗体部分patritumab和U3-1402平行进行，10mg/kg，每周一次，持续三周。观察持续至37天，即最后一次给药后16天。每3-4天监测肿瘤尺寸和体重。数据(图15)表明，在药物施用期间，hu3F8-MMAE抑制肿瘤生长的效力与U3-1402相同，但具有更持久的功效。
实施例21
hu3F8-MMAE抑制结肠直肠PDX模型CS226中的肿瘤生长。三组动物分别用溶剂、10mg/kg的U3-1402和3mg/kg的hu3F8-MMAE治疗三周。每三天测量肿瘤抑制作用。与溶剂处理组相比，U3-1402和hu3F8-MMAE均显著抑制肿瘤生长。此外，3mg/kg的hu3F8并不劣于10mg/kg的U3-1402(图16)。
本文中，我们报告了新的抗HER3抗体或ADC分子，其在体外和体内均有效地抑制肿瘤细胞生长，具有合理的安全边际(safety margin)。HER3抗体，3F8，是从用过表达人HER3的SP2/0细胞免疫的小鼠杂交瘤中鉴别出来的。3F8以次纳摩尔的结合亲和力识别人和猴HER3，并对其他ERBB家族成员具有高选择性。此外，它被具有不同水平HER3的细胞快速有效地摄取，这被认为是理想的ADC药物所必需的特性。PET成像研究显示[89Zr]Zr-3F8在PDX模型的肿瘤中显著积累，表明3F8可能是携带细胞毒性进入肿瘤细胞的高效运载体(vehicle)。因此，生成了MMAE缀合的3F8，并测试了肿瘤抑制功效。在体外评估中，3F8-MMAE选择性杀伤表达HER3的肿瘤细胞，IC50大约为1nM(依赖于对MMAE的敏感性)，同时保持HER3阴性细胞不受影响。功效研究表明，3F8-MMAE剂量依赖性地抑制肿瘤生长，对体重没有严重影响，也没有可观察到的血液毒性。人源化版本的3F8，即hu3F8，以及hu3F8-MMAE在PDX模型中保持了上述结合亲和力、选择性和肿瘤抑制的特征，与U3-1402等价。hu3F8在反复冻融处理、酸培养和40℃储存的应激测试中，结合亲和力、聚集性和翻译后修饰几乎不改变，具有良好的可开发性。综上所述，3F8或其ADC hu3F8-MMAE是有前途的肿瘤治疗方式，并可为日益严峻的耐药性挑战以及未满足的医疗需求提供替代方案。
下面列出了一些氨基酸序列和核酸序列。抗体序列编号基于Kabat。
鼠3F8轻链可变区：
核苷酸序列：
氨基酸序列:
鼠3F8重链可变区：核苷酸序列：
氨基酸序列：
人源化3F8重链氨基酸序列：(克隆3)
/>
人源化3F8重链核苷酸序列：(克隆3)
人源化3F8轻链氨基酸序列：(克隆1-3)
人源化3F8轻链核苷酸序列：(克隆1-3)
/>
人源化3F8重链氨基酸序列：(克隆1)
人源化3F8重链核苷酸序列：(克隆1)
/>
人源化3F8重链氨基酸序列：(克隆2)
人源化3F8重链核苷酸序列：(克隆2)
参考文献：
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<210> 1
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8轻链可变区核苷酸序列
<400> 1
atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 180
gatggcactt ttaaactcct gatctactac acatcaatat tacactcagg agtcccatca 240
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 300
gaggatattg ccacttactt ttgccaacag ggtgatacgc ttcctcccac gttcggtgct 360
gggaccaagc tggagctgaa a 381
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8轻链可变区氨基酸序列
<400> 2
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Phe
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp
100 105 110
Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8轻链可变区前导序列
<400> 3
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys
20
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8轻链可变区LFR1
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys
20
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8轻链可变区CDR-L1
<400> 5
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8轻链可变区LFR2
<400> 6
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Phe Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8轻链可变区CDR-L2
<400> 7
Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser
1 5
<210> 8
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8轻链可变区LFR3
<400> 8
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8轻链可变区CDR-L3
<400> 9
Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8轻链可变区LFR4
<400> 10
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
1 5 10
<210> 11
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8重链可变区核苷酸序列
<400> 11
atgaaagtgt tgagtctgtt gtacctgttg acagccattc ctggtatcct gtctgatgta 60
caacttcagg agtcaggacc tggcctcgtg aaaccttctc agtctctgtc tctcacctgc 120
tctgtcactg gctactccat caccagtgct tattactgga actggatccg gcagtttcca 180
ggagacaaac tggaatggat gggctacata agctacgacg gtcgcaataa tttcaaccca 240
tctctcaaaa atcgaatctc catcactcgt gacacatcta agaaccagtt tttcctgaag 300
ttgaattctg tgacttctgg ggacacagct acatattact gtgcaagaga tggggattac 360
gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 408
<210> 12
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8重链可变区氨基酸序列
<400> 12
Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile
1 5 10 15
Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
20 25 30
Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
35 40 45
Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asp Lys Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn Phe Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ser Gly Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 13
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8重链可变区前导序列
<400> 13
Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile
1 5 10 15
Leu Ser
<210> 14
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8重链可变区HFR1
<400> 14
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
20 25 30
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8重链可变区CDR-H1
<400> 15
Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn
1 5
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8重链可变区HFR2
<400> 16
Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asp Lys Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8重链可变区CDR-H2
<400> 17
Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn Phe Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 18
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8重链可变区HFR3
<400> 18
Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Ser Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8重链可变区CDR-H3
<400> 19
Asp Gly Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠3F8重链可变区HFR4
<400> 20
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化3F8克隆3重链氨基酸序列
<400> 21
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile
35 40 45
Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Phe Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn Phe Asn
65 70 75 80
Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 22
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化3F8克隆3重链核苷酸序列
<400> 22
atgggctggt catgcattat tctgtttctg gtcgcaactg ctacaggcgt gcatagtcaa 60
gtgcagctgc aggagagcgg acctggcctc gtgaagccaa gcgagacact gtctctgaca 120
tgtaccgtgt ccggctacag catcacctcc gcctactact ggaactggat ccggcagcct 180
tttggcaagg gcctggaatg gatgggctac atcagctacg acggcagaaa caacttcaac 240
cccagcctga aaaatagagt gtccatctct cgggacacca gcaagaacca gttcagcctg 300
aagctgagca gcgtgacagc cgctgatacc gccacatact actgcgccag agacggagat 360
tatgactact tcgactactg gggccagggc accaccgtca ccgtgtctag cgccagcacc 420
aagggccctt ccgtgtttcc actggccccc tcctctaaat ccacatctgg cggcaccgcc 480
gccctgggct gtctggtgaa ggactacttc ccagagcctg tgacagtgtc ctggaactct 540
ggcgccctga catccggcgt gcacacattt ccagccgtgc tgcagagctc cggcctgtac 600
agcctgtcta gcgtggtgac agtgccctcc tctagcctgg gcacacagac ctatatctgc 660
aacgtgaatc acaagccaag caataccaag gtggacaaga aggtggagcc caagtcctgt 720
gataagacac acacctgccc cccttgtcct gctcccgagc tgctgggcgg ccctagcgtg 780
ttcctgtttc cacccaagcc taaggacacc ctgatgatct cccggacacc cgaggtgacc 840
tgcgtggtgg tggacgtgtc tcacgaggat cctgaggtga agttcaactg gtatgtggat 900
ggcgtggagg tgcacaatgc caagaccaag cccagagagg agcagtacaa ctctacatat 960
agggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtataag 1020
tgcaaggtgt ccaataaggc cctgcccgcc cccatcgaga agacaatcag caaggccaag 1080
ggccagcctc gggagccaca ggtgtacacc ctgcctccat ccagagacga gctgacaaag 1140
aaccaggtgt ctctgacatg tctggtgaag ggcttctatc ctagcgatat cgccgtggag 1200
tgggagtcca atggccagcc agagaacaat tacaagacca caccccctgt gctggactcc 1260
gatggctcct tctttctgta ttccaagctg accgtggata agtctcggtg gcagcagggc 1320
aacgtgttca gctgttccgt gatgcacgaa gccctgcata atcactatac tcagaaatcc 1380
ctgtccctgt cacctggaaa gtgataa 1407
<210> 23
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化3F8克隆1-3轻链氨基酸序列
<400> 23
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile
35 40 45
Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Thr
100 105 110
Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 24
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化3F8克隆1-3轻链核苷酸序列
<400> 24
atgggctggt catgtattat tctgtttctg gtcgcaactg ctacaggggt ccatagtgat 60
attcagatga cccagagccc cagcagcctg agcgccagcg tgggcgatag agtgaccatc 120
acatgtcggg cctctcagga catcagcaac tacctgaact ggtatcagca aaagcccggc 180
aaagccccta agctgctgat ctactacacc agcatcctgc acagcggagt gccatctaga 240
ttcagcggct ctggcagcgg caccgactac acatttacca tctcctccct ccagcctgag 300
gacatcgcta catacttctg ccagcagggc gacaccctgc ctcctacctt cggcggcgga 360
acaaagctgg aaatcaagag gacagtggcc gccccaagcg tgttcatctt tcccccttcc 420
gacgagcagc tgaagtctgg caccgccagc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctaccct 480
cgggaggcca aggtccagtg gaaggtggat aacgccctgc agtctggcaa tagccaggag 540
tccgtgaccg agcaggactc taaggatagc acatattccc tgtctagcac cctgacactg 600
agcaaggccg attacgagaa gcacaaggtg tatgcctgtg aagtcaccca tcaggggctg 660
tcatcacccg tcactaagtc attcaatcgc ggagaatgct gataa 705
<210> 25
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化3F8克隆1重链氨基酸序列
<400> 25
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile
35 40 45
Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn Phe Asn
65 70 75 80
Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 26
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化3F8克隆1重链核苷酸序列
<400> 26
atgggctggt catgcattat tctgtttctg gtcgcaactg ctacaggcgt gcatagtcaa 60
gtgcagctgc aggagagcgg ccctggactg gtgaagccta gcgagacact gtctctcacc 120
tgtaccgtgt ctggctacag catcacctcc gcctactact ggaactggat ccggcagcct 180
ccaggcaagg gcctggaatg gatcggctac atcagctacg acggcagaaa caacttcaac 240
cccagcctga aaaatagagt gaccatctct gtggacacca gcaagaacca gtttagcctg 300
aagctgagca gcgtgacagc cgctgatacc gccgtgtact actgcgccag agacggagat 360
tatgactact tcgactactg gggccagggc accacagtca cagtgtccag cgccagcacc 420
aagggccctt ccgtgtttcc actggccccc tcctctaaat ccacatctgg cggcaccgcc 480
gccctgggct gtctggtgaa ggactacttc ccagagcctg tgacagtgtc ctggaactct 540
ggcgccctga catccggcgt gcacacattt ccagccgtgc tgcagagctc cggcctgtac 600
agcctgtcta gcgtggtgac agtgccctcc tctagcctgg gcacacagac ctatatctgc 660
aacgtgaatc acaagccaag caataccaag gtggacaaga aggtggagcc caagtcctgt 720
gataagacac acacctgccc cccttgtcct gctcccgagc tgctgggcgg ccctagcgtg 780
ttcctgtttc cacccaagcc taaggacacc ctgatgatct cccggacacc cgaggtgacc 840
tgcgtggtgg tggacgtgtc tcacgaggat cctgaggtga agttcaactg gtatgtggat 900
ggcgtggagg tgcacaatgc caagaccaag cccagagagg agcagtacaa ctctacatat 960
agggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtataag 1020
tgcaaggtgt ccaataaggc cctgcccgcc cccatcgaga agacaatcag caaggccaag 1080
ggccagcctc gggagccaca ggtgtacacc ctgcctccat ccagagacga gctgacaaag 1140
aaccaggtgt ctctgacatg tctggtgaag ggcttctatc ctagcgatat cgccgtggag 1200
tgggagtcca atggccagcc agagaacaat tacaagacca caccccctgt gctggactcc 1260
gatggctcct tctttctgta ttccaagctg accgtggata agtctcggtg gcagcagggc 1320
aacgtgttca gctgttccgt gatgcacgaa gccctgcata atcactatac tcagaaatcc 1380
ctgtccctgt cacctggaaa gtgataa 1407
<210> 27
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化3F8克隆2重链氨基酸序列
<400> 27
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile
35 40 45
Thr Ser Ala Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Phe Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Asn Phe Asn
65 70 75 80
Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 28
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化3F8克隆2重链核苷酸序列
<400> 28
atgggctggt catgcattat tctgtttctg gtcgcaactg ctacaggcgt gcatagtcaa 60
gtgcagctgc aggagagcgg ccccggcctg gtgaagccta gcgagacact gagcctcacc 120
tgtaccgtgt ccggctacag catcaccagc gcctactact ggaactggat ccggcagcct 180
tttggcaagg gcctggaatg gatgggctac atctcctacg acggcagaaa caacttcaac 240
ccatctctga aaaatagagt gaccatcagc cgggacacaa gcaagaacca gttcagcctg 300
aagctgtcta gcgtgacagc cgctgatacc gccgtgtact actgcgccag agacggagat 360
tatgactact tcgactactg gggacagggc accaccgtga cagtcagctc tgccagcacc 420
aagggccctt ccgtgtttcc actggccccc tcctctaaat ccacatctgg cggcaccgcc 480
gccctgggct gtctggtgaa ggactacttc ccagagcctg tgacagtgtc ctggaactct 540
ggcgccctga catccggcgt gcacacattt ccagccgtgc tgcagagctc cggcctgtac 600
agcctgtcta gcgtggtgac agtgccctcc tctagcctgg gcacacagac ctatatctgc 660
aacgtgaatc acaagccaag caataccaag gtggacaaga aggtggagcc caagtcctgt 720
gataagacac acacctgccc cccttgtcct gctcccgagc tgctgggcgg ccctagcgtg 780
ttcctgtttc cacccaagcc taaggacacc ctgatgatct cccggacacc cgaggtgacc 840
tgcgtggtgg tggacgtgtc tcacgaggat cctgaggtga agttcaactg gtatgtggat 900
ggcgtggagg tgcacaatgc caagaccaag cccagagagg agcagtacaa ctctacatat 960
agggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtataag 1020
tgcaaggtgt ccaataaggc cctgcccgcc cccatcgaga agacaatcag caaggccaag 1080
ggccagcctc gggagccaca ggtgtacacc ctgcctccat ccagagacga gctgacaaag 1140
aaccaggtgt ctctgacatg tctggtgaag ggcttctatc ctagcgatat cgccgtggag 1200
tgggagtcca atggccagcc agagaacaat tacaagacca caccccctgt gctggactcc 1260
gatggctcct tctttctgta ttccaagctg accgtggata agtctcggtg gcagcagggc 1320
aacgtgttca gctgttccgt gatgcacgaa gccctgcata atcactatac tcagaaatcc 1380
ctgtccctgt cacctggaaa gtgataa 1407

Claims (38)

1.抗HER3抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含：
包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-H3。
2.根据权利要求1所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含由SEQ ID NO：15组成的CDR-H1、由SEQ ID NO：17组成的CDR-H2和由SEQ ID NO：19组成的CDR-H3。
3.根据权利要求1或2所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，其进一步包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含：
包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，其中所述VL包含由SEQ ID NO：5组成的CDR-L1、由SEQ ID NO：7组成的CDR-L2和由SEQ ID NO：9组成的CDR-L3。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含带有或不带有SEQ ID NO：13的前导序列的SEQ ID NO：12的氨基酸序列，或与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，其中所述VL包含带有或不带有SEQ ID NO：3的前导序列的SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，其中所述抗体的重链为IgG1类型。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是人源化抗体，且重链包含SEQ ID NO：21、25或27的氨基酸序列，或与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是人源化抗体，且轻链包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，或与其至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，其中所述HER3是人或猴HER3。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，其中所述抗HER3抗体阻断NRG1诱导的HER3的磷酸化。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，其中所述抗HER3抗体与人或猴HER3结合的EC50低于1nM。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，其中所述抗HER3抗体在与HER3结合后具有内化活性。
15.分离的核酸，其中所述分离的核酸包含编码权利要求1-14中任一项的抗HER3抗体或抗原结合片段的VH和/或权利要求1-14中任一项的抗HER3抗体或抗原结合片段的VL的多核苷酸序列。
16.根据权利要求15所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸选自SEQ ID NO：1、11、22、24、26和28。
17.载体，其中所述载体包含权利要求15或16所述的分离的核酸。
18.宿主细胞，其中所述宿主细胞包含权利要求15或16所述的分离的核酸或权利要求17所述的载体。
19.宿主细胞，其中所述宿主细胞表达权利要求1-14中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段。
20.抗体缀合物，其中所述抗体缀合物包含与化学部分缀合的权利要求1-14中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段。
21.根据权利要求20所述的抗体缀合物，所述抗HER3抗体或抗原结合片段通过接头与所述化学部分缀合。
22.根据权利要求20或21所述的抗体缀合物，其中所述接头是酶可切割的。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的抗体缀合物，其中所述接头包含Val-Cit部分。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物是抗体药物缀合物(ADC)。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的抗体缀合物，其中所述化学部分是放射性同位素、化疗剂或细胞毒性剂。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的抗体缀合物，其中所述细胞毒性剂是毒素。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的抗体缀合物，其中所述毒素选自澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、MMAE和MMAF。
28.药物组合物，其中所述药物组合物包含权利要求1-14中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段，或权利要求20-27中任一项所述的抗体缀合物，和药学上可接受的载体。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述抗体缀合物还包含一种或更多种其它抗癌剂。
30.权利要求1-14中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段或权利要求20-27中任一项所述的抗体缀合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述癌症表达HER3。
32.根据权利要求30或31所述的用途，其中所述癌症是胃癌或结肠直肠癌。
33.用于治疗癌症的权利要求1-14中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段或权利要求20-27中任一项所述的抗体缀合物。
34.根据权利要求33所述的用于治疗癌症的抗HER3抗体或抗原结合片段或抗体缀合物，其中所述癌症表达HER3。
35.根据权利要求33或34所述的用于治疗癌症的抗HER3抗体或抗原结合片段或抗体缀合物，其中所述癌症是胃癌或结肠直肠癌。
36.治疗受试者癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-14中任一项所述的抗HER3抗体或抗原结合片段、权利要求20-27中任一项所述的抗体缀合物或权利要求28或29所述的药物组合物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述癌症表达HER3。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述癌症是胃癌或结肠直肠癌。
CN202280043063.8A 2021-06-15 2022-06-15 抗her3抗体、含有该抗体的抗体药物缀合物及其用途 Pending CN117500832A (zh)

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