ES2677003T3 - Humanización de anticuerpos de conejo utilizando un marco universal de anticuerpos - Google Patents

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Abstract

Un marco aceptor para injertar CDR de lagomorfo que comprende un marco de cadena pesada variable humana que tiene al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO. 4 y que comprende treonina (T) en la posición 24, alanina (A) o glicina (G) en la posición 56, treonina (T) en la posición 84, valina (V) en la posición 89 y arginina (R) en la posición 108 (numeración de AHo).

Description

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DESCRIPCION
Humanizacion de anticuerpos de conejo utilizando un marco universal de anticuerpos Antecedentes de la invencion
Los anticuerpos monoclonales, sus conjugados y derivados son enormemente importantes comercialmente como agentes terapeuticos y de diagnostico. Los anticuerpos no humanos provocan una respuesta inmune fuerte en los pacientes, generalmente despues de una unica inyeccion de dosis baja (Schroff, 1985 Cancer Res 45: 879-85, Shawler. J Immunol 1985 135: 1530-5; Dillman, Cancer Biother 1994 9: 17-28). De acuerdo con esto, se desarrollaron varios metodos para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos murinos y de otros roedores, asi como tambien tecnologias para producir anticuerpos completamente humanos usando, por ejemplo, ratones transgenicos o presentacion en fagos. Se disenaron anticuerpos quimericos, que combinan regiones variables de roedores con regiones constantes humanas (por ejemplo, Boulianne Nature 1984 312: 643-6) reduciendo considerablemente los problemas de inmunogenicidad (por ejemplo, LoBuglio, Proc Natl Acad Sci 1989 86: 4220-4; Clark, Immunol Today 2000 21: 397-402). Tambien se disenaron anticuerpos humanizados, en los que la secuencia de roedores de la region variable en si misma esta disenada para estar lo mas cerca posible de una secuencia humana conservando al menos las CDR originales, o donde se injertaron las CDR del anticuerpo de roedor en el marco de un anticuerpo humano (por ejemplo, Riechmann, Nature 1988 332: 323-7; patente de Estados Unidos No. 5.693.761). Los anticuerpos policlonales de conejo se usan ampliamente para ensayos biologicos tales como ELISA o transferencias Western. Los anticuerpos policlonales de conejo a menudo son preferidos respecto a los anticuerpos policlonales de roedores debido a su afinidad generalmente mucho mas alta. Ademas, los conejos a menudo son capaces de provocar buenas respuestas de anticuerpos a los antigenos que son poco inmunogenicos en ratones y/o que no dan lugar a buenos aglutinantes cuando se usan en la presentacion en fagos. Debido a estas ventajas bien conocidas de los anticuerpos de conejo, serian ideales para ser utilizados en el descubrimiento y desarrollo de anticuerpos terapeuticos. La razon por la que esto no se hace comunmente se debe principalmente a los desafios tecnicos en la generacion de anticuerpos monoclonales de conejo. Dado que los tumores de tipo mieloma no son conocidos en conejos, la tecnologia de hibridoma convencional para generar anticuerpos monoclonales no es aplicable a anticuerpos de conejo. El trabajo pionero en la provision de companeros de linea celular de fusion para celulas que expresan anticuerpos de conejo ha sido realizado por Knight y colegas (Spieker-Polet et al., PNAS 1995, 92: 934852) y Pytela et al., en 2005 (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 7.429.487) han descrito una linea celular companera de fusion mejorada. Sin embargo, esta tecnologia no se distribuye ampliamente, ya que los conocimientos tecnicos correspondientes estan basicamente controlados por un solo grupo de investigacion. En la literatura se describen metodos alternativos para la generacion de anticuerpos monoclonales que implican la clonacion de anticuerpos a partir de celulas que expresan anticuerpos seleccionados mediante RT-PCR, pero nunca se han notificado con exito para anticuerpos de conejo.
Se espera que los anticuerpos de conejo, como los anticuerpos de raton, provoquen respuestas inmunitarias fuertes si se usan para terapia humana, por lo tanto, los anticuerpos de conejo necesitan ser humanizados antes de que puedan usarse clinicamente. Sin embargo, los metodos que se usan para fabricar anticuerpos de roedores humanizados no se pueden extrapolar facilmente para anticuerpos de conejo debido a diferencias estructurales entre el conejo y el raton y, respectivamente, entre anticuerpos de conejo y de humano. Por ejemplo, la cadena ligera CDR3 (CDRL3) a menudo es mucho mas larga que las CDRL3 previamente conocidas a partir de anticuerpos humanos o de raton.
Hay pocos enfoques de humanizacion de anticuerpos de conejo descritos en la tecnica anterior que, sin embargo, no son un enfoque de injerto clasico en el que las CDR de un donante no humano se trasplantan en un anticuerpo aceptor humano. El documento WO 04/016740 describe una estrategia denominada de "remodelacion de la superficie". El objetivo de una estrategia de "remodelacion de la superficie" es remodelar los residuos accesibles a los disolventes del marco no humano de manera que se vuelvan mas parecidos a los humanos. Tecnicas de humanizacion similares para anticuerpos de conejo como se describe en el documento WO 04/016740 son conocidas en la tecnica. Tanto el documento WO08/144757 como el documento WO05/016950 divulgan metodos para humanizar un anticuerpo monoclonal de conejo que implican la comparacion de secuencias de aminoacidos de un anticuerpo parental de conejo con las secuencias de aminoacidos de un anticuerpo humano similar. Posteriormente, la secuencia de aminoacidos del anticuerpo parental de conejo se altera de modo que sus regiones marco son mas similares en secuencia a las regiones marco equivalentes del anticuerpo humano similar. Para obtener buenas capacidades de union, es necesario realizar laboriosos esfuerzos de desarrollo para cada inmunoenlazante individualmente.
Un problema potencial de los enfoques descritos anteriormente es que no se usa un marco humano, sino que el marco de conejo se modifica de manera que se parezca mas al de un ser humano. Tal enfoque conlleva el riesgo de que los tramos de aminoacidos que estan enterrados en el nucleo de la proteina aun puedan comprender epitopos de celulas T inmunogenicas.
Hasta la fecha, los solicitantes no han identificado un anticuerpo de conejo, que se haya humanizado mediante la aplicacion de enfoques de injerto de ultima generacion. Esto podria explicarse por el hecho de que las CDR de conejo pueden ser bastante diferentes de las CDR humanas o de roedor. Como se conoce en la tecnica, muchas
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cadenas Vh de conejo tienen cisteinas emparejadas adicionales en relacion con las contrapartes murinas y humanas. Ademas del puente disulfuro conservado formado entre cys22 y cys92, tambien hay un puente cys21- cys79, asi como un puente S-S dentro de la CDR formado entre el ultimo residuo de CDRH1 y el primer residuo de CDRH2 en algunas cadenas de conejo. Ademas, a menudo se encuentran pares de residuos de cisteina en la CDR- L3. Ademas, muchas CDR de anticuerpos de conejo no pertenecen a ninguna estructura canonica previamente conocida. En particular, la CDR-L3 es a menudo mucho mas larga que la CDR-L3 de una contraparte humana o murina. El documento WO 2008/004834 A1 se refiere a un anticuerpo humanizado para el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) compuesto por CDR originadas a partir de un conejo inmunizado y una region marco de Ig humana.
Por lo tanto, el injerto de anticuerpos de CDR no humanas en un marco humano es una tarea importante de ingenieria de proteinas. La transferencia de los bucles de union del antigeno desde un marco evolucionado naturalmente a un marco humano diferente seleccionado artificialmente se debe realizar de manera que las conformaciones del bucle nativo se retengan para la union del antigeno. A menudo, la afinidad de union al antigeno se reduce o se anula en gran medida despues del injerto del bucle. El uso de marcos humanos cuidadosamente seleccionados en el injerto de los bucles de union al antigeno maximiza la probabilidad de retener la afinidad de union en la molecula humanizada (Roguzka et al. 1996). Aunque los muchos experimentos de injerto disponibles en la literatura proporcionan una guia aproximada para el injerto de CDR, no es posible generalizar un patron. Los problemas tipicos consisten en perder la especificidad, estabilidad o producibilidad despues de injertar los bucles CDR.
De acuerdo con esto, existe una necesidad urgente de metodos mejorados para humanizar de manera confiable y rapida anticuerpos de conejo para uso como agentes terapeuticos y de diagnostico. Ademas, existe una necesidad de estructuras aceptoras humanas para humanizar de forma confiable anticuerpos de conejo, proporcionando anticuerpos funcionales y/o fragmentos de anticuerpos con propiedades biofisicas similares a los farmacos.
Sumario de la invencion
Sorprendentemente, se ha descubierto que un marco de anticuerpo humano altamente soluble y estable identificado mediante un ensayo de control de calidad (QC) (como se divulga en el documento WO 0148017 y en Auf der Maur et al., (2001), FEBS Lett 508, paginas 407-412) es particularmente adecuado para acomodar CDR de otras especies de animales no humanos, por ejemplo, CDR de conejo. La presente invencion esta definida por las reivindicaciones. En particular, la presente invencion proporciona un marco aceptor para injertar CDR de lagomorfos que comprende un marco de cadena pesada variable humana que tiene al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO. 4 y que comprende treonina (T) en la posicion 24, alanina (A) o glicina (G) en la posicion 56, treonina (T) en la posicion 84, valina (V) en la posicion 89 y arginina (R) en la posicion 108 (numeracion de AHo). Por consiguiente, en un primer aspecto, la invencion proporciona las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano particular (el denominado anticuerpo "FW 1.4") que es especialmente adecuado como aceptor universal para CDR de una variedad de anticuerpos, en particular de anticuerpos de conejo, de diferentes especificidades de union, independientemente de si un puente disulfuro esta presente en una CDR o no. Ademas, la presente invencion proporciona dos secuencias mutantes de dicho marco de anticuerpo humano particular, concretamente rFW1.4 y rFW1.4(V2), siendo ambos marcos particularmente adecuados como marcos de aceptores universales para el injerto de CDR de conejo. En otro aspecto, la invencion proporciona un motivo de residuos marco que convierte un marco humano adecuado para acomodar CDR de otras especies de animales no humanos, en particular CDR de conejo.
Los inmunoenlazantes humanizados generados por el injerto de CDR de conejo en estos marcos de cadena ligera y pesada variables altamente compatibles retienen de forma consistente y confiable la orientacion espacial de los anticuerpos de conejo de los que se derivan las CDR del donante. Por lo tanto, no es necesario introducir posiciones estructuralmente relevantes del inmunoenlazante del donante en el marco aceptor. Debido a estas ventajas, se puede lograr la humanizacion de alto rendimiento de los anticuerpos de conejo con poca o ninguna optimizacion de las capacidades de union.
Por consiguiente, en otro aspecto, la invencion proporciona metodos para injertar CDR de conejo y otras no humanas, en las secuencias marco de anticuerpo humano de cadena ligera y/o cadena pesada solubles y estables divulgadas aqui, generando asi anticuerpos humanizados con propiedades biofisicas superiores. En particular, los inmunoenlazantes generados por los metodos de la invencion exhiben propiedades funcionales superiores tales como solubilidad y estabilidad.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 representa la definicion de CDR H1 usada en este documento para injertar sitios de union a antigeno a partir de anticuerpos monoclonales de conejo en los marcos de anticuerpos humanos altamente solubles y estables.
La Figura 2 muestra esquematicamente una celula B 1 marcada con un anticuerpo fluorescente 2 que interacciona con una celula 3 que expresa el objetivo tenido con un colorante 4 intracelular. Objetivo de eleccion: 5; BCR: 6.
Figura 3: el proceso de seleccion por FACS de celulas B de conejo que se unen al blanco soluble ESBA903. Fig. 3A: los linfocitos se seleccionan de acuerdo con la dispersion frontal y lateral. Fig. 3B: entre ellos, se seleccionan las
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celulas IgG+ IgM- (probablemente celulas B de memoria) (cuadrante rojo). Fig. 3C: se espera que las celulas doblemente tenidas con ESBA903-PE y ESBA903-PerCP (cuadrante verde) codifiquen IgG de alta afinidad contra ESBA903. Las celulas que muestran la fluorescencia mas brillante (cuadrante rosa) se clasificaron en placas de 96 pozos.
Figura 4. Las perlas recubiertas con anticuerpos anti-TNFalfa (marcados con PE) se unen a las celulas CHO transfectadas con TNFalfa (panel superior). Las perlas de control recubiertas con anticuerpos anti-CD19 (marcados con APC) no se unen a las celulas CHO transfectadas con TNFalfa (panel central). Las perlas recubiertas con anticuerpos anti-TNFalfa (marcados con PE) no se unen a celulas CHO de tipo silvestre (ts) (panel inferior). Los graficos de puntos a la izquierda muestran dispersiones hacia adelante y hacia los lados, que indican respectivamente el tamano y la granularidad de los eventos. La poblacion de perlas individuales (~3 pm) se seleccionan en P2. Las celulas CHO finalmente unidas a perlas (~30 pm) se seleccionan en P1. Los graficos de puntos en el medio muestran los eventos P1 (celulas CHO) con respecto a su tincion con PE o APC. Por lo tanto, si las celulas interactuan con perlas anti-TNFalfa, se mostraran en el cuadrante P3, y si interactuan con las perlas anti- CD19, apareceran en el cuadrante P4. A la derecha, se detallan las estadisticas de cada muestra.
Figura 5. Las perlas recubiertas con anti-TNFalfa-PE y las perlas recubiertas con anti-CD19-APC se mezclaron junto con celulas CHO transfectadas con TNFalfa. Las celulas CHO se seleccionan (P1) y entre ellas se muestran las celulas que se unen a perlas recubiertas con anti-TNFalfa-PE o perlas recubiertas con anti-CD19-APC en los cuadrantes P3 y P4, respectivamente. Las perlas sin unir son visibles en el cuadrante P2.
Figura 6. Un analisis de las secuencias de anticuerpos de conejo extraidas de la base de datos de Kabat confirma que la CDR3 de la cadena pesada variable tipicamente es tres aminoacidos mas larga que su contraparte murina.
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones
Para que la presente invencion pueda entenderse mas facilmente, ciertos terminos se definiran de la siguiente manera. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripcion detallada.
El termino "anticuerpo" se refiere a anticuerpos completos y a cualquier fragmento de union a antigeno. El termino "polipeptido de union a antigeno" e "inmunoenlazante" se usan simultaneamente en este documento. Un "anticuerpo" se refiere a una proteina, opcionalmente glicosilada, que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porcion de union a antigeno del mismo. Cada cadena pesada esta compuesta por una region variable de cadena pesada (abreviada en este documento como Vh) y una region constante de cadena pesada. La region constante de la cadena pesada esta compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta compuesta por una region variable de cadena ligera (abreviada en este documento como Vl) y una region constante de cadena ligera. La region constante de la cadena ligera esta compuesta por un dominio, CL. Las regiones Vh y Vl se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada Vh y Vl se compone de tres CDR y cuatro Fr, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de union que interactua con un antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la union de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huesped, que incluyen diversas celulas del sistema inmune (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clasico.
El termino "porcion de union a antigeno" de un anticuerpo (o simplemente "porcion de anticuerpo") se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse especificamente a un antigeno (por ejemplo, TNF). Se ha demostrado que la funcion de union a antigeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de union abarcados dentro del termino "porcion de union a antigeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un solo dominio o fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio Vh; y (vi) una region determinante de complementariedad (CDR) aislada o (vii) una combinacion de dos o mas CDR aisladas que pueden unirse opcionalmente mediante un enlazador sintetico. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando metodos recombinantes, mediante un enlazador sintetico que les permite formarse como una sola cadena de proteina en la que el par de regiones Vl y Vh forman moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); vease, por ejemplo, Bird et al., (1988) Science 242: 423 - 426, y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 - 5883). Dichos anticuerpos de cadena sencilla tambien pretenden incluirse dentro del termino "porcion de union a antigeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y los fragmentos se seleccionan para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Las porciones de union a antigeno se pueden producir por tecnicas de ADN recombinante, o por escision enzimatica o
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quimica de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden ser de diferente isotipo, por ejemplo, un anticuerpo IgG (por ejemplo, un subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM.
El termino "inmunoenlazante" se refiere a una molecula que contiene todo o parte del sitio de union a antigeno de un anticuerpo, por ejemplo, todo o parte del dominio variable de la cadena pesada y/o ligera, de modo que el inmunoenlazante reconoce especificamente un antigeno objetivo. Los ejemplos no limitantes del inmunoenlazantes incluyen moleculas de inmunoglobulina de longitud completa y scFv, asi como fragmentos de anticuerpos, que incluyen, pero sin limitacion, (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, CL y Ch1 ; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la region bisagra (vease, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3ra ed. 1993), (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1 ; (v) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un unico brazo de un anticuerpo, (vi) un anticuerpo de dominio unico tal como un fragmento Dab (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio Vh o Vl, un anticuerpo de Camelido (vease Hamers-Casterman, et al., Nature 363: 446-448 (1993), y Dumoulin, et al., Protein Science 11: 500-515 (2002)) o un anticuerpo de tiburon (por ejemplo, Nanobodies® de Ig- NAR de tiburon y (vii) un nanocuerpo, una region variable de cadena pesada que contiene un unico dominio variable y dos dominios constantes.
El termino "anticuerpo de cadena sencilla", "Fv de cadena sencilla" o "scFv" se refiere a una molecula que comprende un dominio variable de cadena pesada del anticuerpo (o region; Vh) y un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo (o region; Vl)) conectado por un enlazador. Dichas moleculas de scFv pueden tener las estructuras generales: NH2-VL-enlazador-VH-COOH o NH2-VH-enlazador-VL-COOH. Un enlazador adecuado del estado de la tecnica consiste en secuencias de aminoacidos repetidas de GGGGS o variantes de las mismas. En una realizacion preferida de la presente invencion se usa un enlazador (GGGGS)4 de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 8, pero tambien son posibles variantes de 1-3 repeticiones (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 - 6448). Otros enlazadores que pueden usarse para la presente invencion son descritos por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725 - 731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al., (1996), Cancer Res. 56: 3055 - 3061, Kipriyanov et al., (1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56 y Roovers et al., (2001), Cancer Immunol.
Como se usa en el presente documento, el termino "propiedad funcional" es una propiedad de un polipeptido (por ejemplo, un inmunoenlazante) para el que una mejora (por ejemplo, con respecto a un polipeptido convencional) es deseable y/o ventajosa para un experto en la tecnica, por ejemplo, para mejorar las propiedades de fabricacion o la eficacia terapeutica del polipeptido. En una realizacion, la propiedad funcional es estabilidad (por ejemplo, estabilidad termica). En otra realizacion, la propiedad funcional es la solubilidad (por ejemplo, bajo condiciones celulares). En otra realizacion mas, la propiedad funcional es el comportamiento de agregacion. En otra realizacion mas, la propiedad funcional es la expresion de proteinas (por ejemplo, en una celula procariota). En otra realizacion mas, la propiedad funcional es el comportamiento de replegamiento despues de la solubilizacion del cuerpo de inclusion en un proceso de fabricacion. En ciertas realizaciones, la propiedad funcional no es una mejora en la afinidad de union al antigeno. En otra realizacion preferida, la mejora de una o mas propiedades funcionales no tiene un efecto sustancial sobre la afinidad de union del inmunoenlazante.
El termino "CDR" se refiere a una de las seis regiones hipervariables dentro de los dominios variables de un anticuerpo que contribuyen principalmente a la union al antigeno. Una de las definiciones mas comunmente utilizadas para los seis CDR fue proporcionada por Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. Publicacion de los NIH 91-3242). Como se usa en el presente documento, la definicion de CDR de Kabat solo se aplica a CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena ligera (CDR L1, CDR L2, CDR L3 o L1, L2, L3), asi como para CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena pesada (CDR H2, CDR H3 o H2, H3). Sin embargo, la CDR del dominio variable de cadena pesada (CDR H1 o H1), como se usa en este documento, esta definida por las posiciones de los residuos (numeracion de Kabat) comenzando en la posicion 26 y terminando antes de la posicion 36. Esta definicion es basicamente una fusion de CDR H1 como se definio de manera diferente por Kabat y Chothia (vease tambien la Figura 1 para ilustracion).
El termino "marco de anticuerpo" como se usa en el presente documento se refiere a la parte del dominio variable, Vl o Vh, que sirve como andamio para los bucles de union a antigeno (CDR) de este dominio variable. En esencia, es el dominio variable sin las CDR.
El termino "epitopo" o "determinante antigenico" se refiere a un sitio en un antigeno al que se une especificamente una inmunoglobulina o anticuerpo (por ejemplo, un sitio especifico en la molecula de TNF). Un epitopo tipicamente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoacidos consecutivos o no consecutivos en una conformacion espacial unica. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
Los terminos "union especifica", "union selectiva", "se une selectivamente" y "se une especificamente" se refieren a la union del anticuerpo a un epitopo en un antigeno predeterminado. Tipicamente, el anticuerpo se une con una afinidad (Kd) de aproximadamente menos de 10-7 M, tal como aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso menos.
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El termino "Kd" o "Kd" se refiere a la constante de equilibrio de disociacion de una interaccion particular anticuerpo- antigeno. Tipicamente, los anticuerpos de la invencion se unen a TNF con una constante de equilibrio de disociacion (Kd) de menos de aproximadamente 10-7 M, tal como menos de aproximadamente 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso mas bajo, por ejemplo, como se determina usando la tecnologia de resonancia de plasmon superficial (SPR) en un instrumento BIACORE.
El termino "molecula de acido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a moleculas de ADN y moleculas de ARN. Una molecula de acido nucleico puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, pero preferiblemente es ADN de cadena doble. Un acido nucleico esta "operativamente unido" cuando se coloca en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador esta operativamente unido a una secuencia de codificacion si afecta a la transcripcion de la secuencia.
El termino "vector" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. En una realizacion, el vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de cadena doble en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. En otra realizacion, el vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Los vectores divulgados aqui pueden ser capaces de replicacion autonoma en una celula huesped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicacion y vectores episomales de mamifero) o pueden integrarse en el genoma de una celula huesped tras la introduccion en la celula huesped, y por lo tanto se replican junto con el genoma del huesped (por ejemplo, vectores de mamiferos no episomales).
El termino "celula huesped" se refiere a una celula en la que se ha introducido un vector de expresion. Las celulas huesped incluyen celulas bacterianas, microbianas, vegetales o animales, preferiblemente, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, CHO (lineas de ovario de hamster chino) o celulas NS0.
El termino "lagomorfo" se refiere a miembros del orden taxonomico Lagomorpha, que comprende las familias Leporidae (por ejemplo, liebres y conejos) y Ochotonidae (pikas). En una realizacion mas preferida, el lagomorfo es un conejo. El termino "conejo", como se usa en el presente documento, se refiere a un animal que pertenece a la familia de los leporidos.
Como se usa en el presente documento, "identidad" se refiere a la coincidencia de secuencias entre dos polipeptidos, moleculas o entre dos acidos nucleicos. Cuando una posicion en las dos secuencias comparadas esta ocupada por la misma subunidad monomerica de base o aminoacido (por ejemplo, si una posicion en cada uno de los dos polipeptidos esta ocupada por una lisina), entonces las moleculas respectivas son identicas en esa posicion. El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de espacios, y la longitud de cada espacio, que deben introducirse para una alineacion optima de las dos secuencias. Generalmente, se hace una comparacion cuando dos secuencias se alinean para dar la identidad maxima. Dicha alineacion puede proporcionarse usando, por ejemplo, el metodo del algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6.
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto habitual en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento pueden usarse en la practica o prueba de la presente invencion, los metodos y materiales adecuados se describen a continuacion. En caso de conflicto, la presente especificacion, incluidas las definiciones, primaran. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Varios aspectos de la invencion se describen con mas detalle en las siguientes subsecciones. Se entiende que las diversas realizaciones, preferencias e intervalos se pueden combinar a voluntad. Ademas, dependiendo de la realizacion especifica, las definiciones, realizaciones o intervalos seleccionados pueden no aplicarse.
Si no se indica lo contrario, las posiciones de aminoacidos se indican de acuerdo con el esquema de numeracion de AHo. El sistema de numeracion de AHo se describe adicionalmente en Honegger, A. y Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309: 657-670). Alternativamente, se puede usar el sistema de numeracion de Kabat como se describe mas adelante en Kabat et al. (Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Publicacion NIH No. 91-3242). Las tablas de conversion para los dos sistemas de numeracion diferentes usados para identificar las posiciones de residuos de aminoacidos en las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo se proporcionan en A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670.
En un primer aspecto, la presente divulgacion proporciona un marco aceptor universal para el injerto de CDR de otras especies animales, por ejemplo, de conejo. Se ha descrito previamente que los anticuerpos o derivados de anticuerpos que comprenden las estructuras humanas identificadas en la denominada seleccion de "control de calidad" (documento WO0148017) se caracterizan por una estabilidad y/o solubilidad generalmente alta. Aunque el marco FW1.4 de cadena sencilla humana (una combinacion de la SEQ ID NO: 1 (denominado a43 en el documento
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WO03/097697) y SEQ ID NO: 2 (denominado KI27 en el documento WO03/097697) claramente tuvo un rendimiento inferior en el ensayo de control de calidad, se encontro sorprendentemente que tiene una alta estabilidad termodinamica intrinseca y es bien producible, tambien en combinacion con una variedad de diferentes CDR. La estabilidad de esta molecula se puede atribuir principalmente a sus regiones marco. Se ha demostrado ademas que FW1.4 es, en esencia, altamente compatible con los sitios de union a antigeno de los anticuerpos de conejo. Por lo tanto, el FW 1.4 representa un andamiaje adecuado para construir fragmentos de anticuerpo scFv humanizados estables derivados del injerto de bucles de conejo. Por tanto, en un aspecto, la divulgacion proporciona un marco aceptor del inmunoenlazante, que comprende una secuencia VH que tiene al menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 1 y/o una secuencia VL que tiene al menos un 85% de identidad con la SEQ ID NO: 2, mas preferiblemente que comprende la secuencia de FW1.4 (SEQ ID NO: 3) para el injerto de CDR de conejo, o una secuencia que tiene al menos 60%, mas preferiblemente al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, de identidad con la SEQ ID NO: 3.
Ademas, se encontro que FW1.4 podria optimizarse sustituyendo varias posiciones de residuos en la cadena pesada de FW 1.4 y/o sustituyendo 1 posicion en la cadena ligera de FW1.4. De ese modo, se descubrio sorprendentemente que la conformacion en bucle de una gran variedad de CDR de conejo en la VH podia mantenerse completamente, en gran medida de manera independiente de la secuencia de la estructura del donante. Dichos residuos en la cadena pesada, asi como la posicion 1 en la cadena ligera de FW1.4 se conservan en anticuerpos de conejo. El residuo de consenso para las posiciones en la cadena pesada, asi como en una posicion en la cadena ligera se dedujo del repertorio de conejo y se introdujo en la secuencia del marco aceptor humano.
Como resultado, el marco modificado 1.4 (en lo sucesivo denominado rFW 1.4) es compatible con practicamente cualquier CDR de conejo. Ademas, el rFW 1.4 que contiene diferentes CDR de conejo esta bien expresado y se produce bien al contrario que las cadenas sencillas de tipo silvestre de conejo y aun retiene casi por completo la afinidad de los anticuerpos de conejo de donantes originales.
Por lo tanto, la presente divulgacion proporciona el marco de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 1, que comprende ademas uno o mas residuos de aminoacidos que generalmente soportan la conformacion de CDR derivadas de un inmunoenlazante de conejo. En particular, dichos residuos estan presentes en una o mas posiciones de aminoacidos seleccionadas del grupo que consiste en 24H, 25H, 56H, 82H, 84H, 89H y 108H (numeracion de AHo). Estas posiciones demuestran que afectan la conformacion de CDR y, por lo tanto, estan contempladas para la mutacion para acomodar CDR de donantes. Preferiblemente, dichos uno o mas residuos se seleccionan del grupo que consiste en: treonina (T) en la posicion 24, valina (V) en la posicion 25, glicina o alanina (G o A) en la posicion 56, lisina (K) en la posicion 82, treonina (T) en la posicion 84, valina (V) en la posicion 89 y arginina (R) en la posicion 108 (numeracion de AHo). Preferiblemente, estan presentes al menos tres, mas preferiblemente, cuatro, cinco, seis y lo mas preferiblemente todos los siete residuos. Sorprendentemente, se ha encontrado que la presencia de los residuos mencionados mejora la estabilidad del inmunoenlazante.
La presente divulgacion proporciona un marco aceptor del inmunoenlazante que comprende un VH que tiene al menos 50%, mas preferiblemente al menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% e incluso mas preferiblemente 100% de identidad con la SEQ ID NO: 4, con la condicion de que al menos uno, mas preferiblemente al menos tres, mas preferiblemente, cuatro, cinco, seis y lo mas preferiblemente siete residuos del grupo que consiste en treonina (T) en la posicion 24, valina (V) en la posicion 25, alanina (A) o glicina (G) en la posicion 56, treonina (T) en la posicion 84, lisina (K) en la posicion 82, valina (V) en la posicion 89 y arginina (R) en la posicion 108 (numeracion de AHo) esten presentes. En una realizacion preferida, el marco aceptor del inmunoenlazante es un marco aceptor del inmunoenlazante para CDR de conejo.
En una realizacion preferida, dicho marco de cadena pesada variable es o comprende la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 6. Ambas estructuras de cadena pesada variable pueden combinarse, por ejemplo, con cualquier marco de cadena ligera adecuado.
Por consiguiente, la presente divulgacion proporciona un marco aceptor del inmunoenlazante que comprende
(i) un marco de cadena pesada variable que tiene al menos 70% de identidad, preferiblemente al menos 75%, 80%, 85%, 90%, mas preferiblemente al menos 95% de identidad, con la SEQ ID NO: 4; y/o
(ii) un marco de cadena ligera variable que tiene al menos 70% de identidad, preferiblemente al menos 75%, 80%, 85%, 90%, mas preferiblemente al menos 95% de identidad, con la SEQ ID nO: 2.
En una realizacion muy preferida, el marco de cadena pesada variable comprende treonina (T) en la posicion 24, glicina (G) en la posicion 56, treonina (T) en la posicion 84, valina (V) en la posicion 89 y arginina (R) en la posicion 108 (numeracion de AHo).
En una realizacion preferida, la cadena ligera variable comprende treonina (T) en la posicion 87 (numeracion de AHo).
En una realizacion preferida, dicho marco aceptor del inmunoenlazante comprende
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(i) un marco de cadena pesada variable seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 6; y/o
(ii) un marco de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 9.
En una realizacion preferida, el marco de cadena pesada variable esta unido a un marco de cadena ligera variable a traves de un enlazador. El enlazador puede ser cualquier enlazador adecuado, por ejemplo, un enlazador que comprende de 1 a 4 repeticiones de la secuencia GGGGS, preferiblemente un peptido (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 8), o un enlazador como se describe en Alfthan et al., (1995) Protein Eng. 8: 725-731.
En otra realizacion preferida, el marco aceptor del inmunoenlazante es una secuencia que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% mas preferiblemente al menos 95% de identidad, con la SEQ ID NO: 5, mientras que la secuencia, preferiblemente, no es la SEQ ID NO: 3. Mas preferiblemente, el marco aceptor del inmunoenlazante comprende o es la SEQ ID NO: 5.
En otra realizacion preferida, el marco aceptor del inmunoenlazante es una secuencia que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, mas preferiblemente al menos 95% de identidad, con la SEQ ID NO: 7, mientras que la secuencia, preferiblemente, no es la SEQ ID NO: 3. Mas preferiblemente, el marco aceptor del inmunoenlazante comprende o es la SEQ ID NO: 7.
Ademas, se encontro sorprendentemente que la presencia del motivo de aminoacido descrito anteriormente vuelve a un marco, preferiblemente un marco humano, particularmente adecuado para la acomodacion de CDR de otras especies de animales no humanos, en particular CDR de conejo. Dicho motivo no tiene un impacto negativo en la estabilidad de un inmunoenlazante. Las CDR se presentan en una conformacion similar a su orientacion espacial nativa en el inmunoenlazante de conejo; por lo tanto, no es necesario injertar ninguna posicion estructuralmente relevante en el marco del aceptador. Por consiguiente, el marco aceptor del inmunoenlazante humano o humanizado comprende al menos tres aminoacidos, preferiblemente cuatro, cinco, seis y mas preferiblemente siete aminoacidos del grupo que consiste en treonina (T) en la posicion 24, valina (V) en la posicion 25, alanina (A) o glicina (G) en la posicion 56, lisina (K) en la posicion 82, treonina (T) en la posicion 84, valina (V) en la posicion 89 y arginina (R) en la posicion 108 (numeracion de AHo).
Los marcos de aceptores del inmunoenlazante como se describen en el presente documento pueden comprender una sustitucion potenciadora de la solubilidad en el marco de cadena pesada, preferiblemente en las posiciones 12, 103 y 144 (numeracion de AHo). Preferiblemente, un aminoacido hidrofobo esta sustituido por un aminoacido mas hidrofilico. Los aminoacidos hidrofilicos son, por ejemplo, arginina (R), asparagina (N), acido aspartico (D), glutamina (Q), glicina (G), histidina (H), lisina (K), serina (S) y treonina (T). Mas preferiblemente, el marco de cadena pesada comprende (a) Serina (S) en la posicion 12; (b) Serina (S) o treonina (T) en la posicion 103 y/o (c) serina (S) o treonina (T) en la posicion 144.
Ademas, los aminoacidos potenciadores de la estabilidad pueden estar presentes en una o mas posiciones 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91 y 103 del marco de cadena ligera variable (numeracion de AHo). Mas preferiblemente, el marco de cadena ligera variable comprende acido glutamico (E) en la posicion 1, valina (V) en la posicion 3, leucina (L) en la posicion 4, serina (S) en la posicion 10; arginina (R) en la posicion 47, serina (S) en la posicion 57, fenilalanina (F) en la posicion 91 y/o valina (V) en la posicion 103.
Como la glutamina (Q) es propensa a la desaminacion, en otra realizacion preferida, la VH comprende en la posicion 141 una glicina (G). Esta sustitucion puede mejorar el almacenamiento a largo plazo de la proteina.
Por ejemplo, los marcos del aceptor descritos en este documento pueden usarse para generar un anticuerpo humano o humanizado que retiene las propiedades de union del anticuerpo no humano del que se derivan las CDR no humanas. Por consiguiente, la divulgacion abarca un marco aceptor del inmunoenlazante como se divulga en la presente memoria, que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y/o CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de un inmunoenlazante del donante, preferiblemente de un inmunoenlazante de mamifero, mas preferiblemente de un inmunoenlazante de lagomorfo y lo mas preferiblemente de un conejo. Por lo tanto, la presente divulgacion proporciona un inmunoenlazante especifico para un antigeno deseado que comprende
(i) CDR de cadena ligera variable de un lagomorfo; y
(ii) un marco de cadena pesada variable humana que tiene al menos 50%, mas preferiblemente al menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% y lo mas preferiblemente 100% identidad con la SEQ ID NO. 4.
En una realizacion preferida, existe la condicion de que al menos un aminoacido del grupo que consiste en treonina (T) en la posicion 24, valina (V) en la posicion 25, alanina (A) o glicina (G) en la posicion 56, treonina (T) en la posicion 84, lisina (K) en la posicion 82, valina (V) en la posicion 89 y arginina (R) en la posicion 108 (numeracion de AHo) este presente en dicha secuencia del marco de cadena pesada variable humana.
Preferiblemente, el lagomorfo es un conejo. Mas preferiblemente, el inmunoenlazante comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera procedentes del inmunoenlazante del donante.
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Como se conoce en la tecnica, muchas cadenas de VH de conejo tienen cisteinas emparejadas adicionales con respecto a las contrapartes murinas y humanas. Ademas del puente disulfuro conservado formado entre cys22 y cys92, tambien hay un puente cys21-cys79, asi como un puente S-S interCDR formado entre el ultimo residuo de CDRH1 y el primer residuo de CDR H2 en algunas cadenas de conejo. Ademas, a menudo se encuentran pares de residuos de cisteina en la CDR-L3. Ademas, muchas CDR de anticuerpos de conejo no pertenecen a ninguna estructura canonica previamente conocida. En particular, la CDR-L3 es a menudo mucho mas larga que la CDR-L3 de una contraparte humana o murina.
Como se establecio anteriormente, el injerto de las CDR no humanas sobre los marcos divulgados en este documento produce una molecula en la que las CDR se muestran en una conformacion apropiada. Si es necesario, la afinidad del inmunoenlazante puede mejorarse mediante el injerto de residuos del marco que interactuan con el antigeno del inmunoenlazante del donante no humano. Estas posiciones pueden, por ejemplo, ser identificadas mediante
(i) la identificacion de la secuencia progenitora de la linea germinal respectiva o, alternativamente, mediante el uso de las secuencias de consenso en el caso de secuencias marco altamente homologas;
(ii) la generacion de un alineamiento de secuencia de las secuencias del dominio variable del donante con la secuencia progenitora de la linea germinal o la secuencia consenso de la etapa (i); y
(iii) la identificacion de diferentes residuos.
Los residuos diferentes en la superficie de la molecula se mutaron en muchos casos durante el proceso de generacion de afinidad in vivo, presumiblemente para generar afinidad por el antigeno.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un inmunoenlazante que comprende el marco aceptor del inmunoenlazante descrito en este documento. Dicho inmunoenlazante puede, por ejemplo, ser un anticuerpo scFv, una inmunoglobulina de longitud completa, un fragmento Fab, un Dab o un Nanocuerpo.
En una realizacion preferida, el inmunoenlazante esta unido a una o mas moleculas, por ejemplo, un agente terapeutico tal como un agente citotoxico, una citoquina, una quimioquina, un factor de crecimiento u otra molecula de senalizacion, un agente de formacion de imagenes o una segunda proteina tal como un activador transcripcional o un dominio de union a ADN.
El inmunoenlazante como se divulga en la presente memoria puede, por ejemplo, ser utilizado en aplicaciones de diagnostico, aplicacion terapeutica, validacion de objetivos o terapia genica.
La divulgacion proporciona adicionalmente un acido nucleico aislado que codifica el marco aceptor del inmunoenlazante descrito en la presente memoria o el inmunoenlazante o los inmunoenlazantes como se divulga en el presente documento.
Como se divulga en el presente documento, se proporciona un vector que comprende el acido nucleico divulgado en este documento.
El acido nucleico o el vector como se divulga en este documento puede, por ejemplo, ser utilizado en terapia genica.
La divulgacion abarca ademas una celula huesped que comprende el vector y/o el acido nucleico divulgados en este documento.
Ademas, se proporciona una composicion que comprende el marco aceptor del inmunoenlazante como se divulga en la presente memoria, el inmunoenlazante como se divulga en la presente memoria, el acido nucleico aislado como se divulga en la presente memoria o el vector como se divulga en la presente memoria.
Las secuencias divulgadas en este documento son las siguientes (los residuos X son sitios de insercion de CDR): SEQ ID NO.1: marco de cadena pesada variable de FW1.4 (a43)
E V QL VESGGGLV QPGGSLRLSC AAS(X)n=1 _50 W VRQ APGKGLEW V S (X)n=i-50 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(X)„=1.50 wgqgtl VTVSS
SEQ ID NO. 2: marco de cadena ligera variable de FW1.4 (KI27)
EIVMT QS PSTLS AS VGDR VIITC (X)n= i -50 W Y QQKPGKAPKLLIY (X)n=i .50 GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=i_5o FGQGTKLT VLG
SEQ ID NO. 3: marco de FW1.4
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ErVMTQSPSTLSASVGDRYHTC(X)n=i-50 WYQQKPGKAPKLLIY(X)„-i-5o GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=i.50FGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(X)n=i-5o WVRQAPGKGLEWVS(X)n=1.50 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA V Y Y C AK(X)n=1 -so W GQGTL VT V S S
SEQ ID NO. 4: marco de cadena pesada variable de rFW1.4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)n=i-5o
WVRQAPGKGLEWVG(X)n=i.50
RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAYYYCAR(X)n=i.5o WGQGTLV TVSS SEQ ID NO. 5: marco de rFW1.4
EIVMTQSPSTLSASVGDRVHTC(X)n=i-5oWYQQKPGKAPKLLIY(X)n=1.5o GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=i-5oFGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)n=1.5o W VRQ APGKGLEW V G(X)n=i _50 RFTISRDTS KNT V YLQMN S LRAEDTAVYYCAR(X)n=1.5oWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO. 6: marco de cadena pesada variable de rFW1.4 (V2)
E V QLYESGGGLV QPGGSLRLSCT V S (X)n=i -50 W VRQAPGKGLEWV G(X)n=i .50 RFTIS KDTS KNT V YLQMNSLR AEDT A Y Y Y C AR(X)n=i -50 W GQGTL VTV S S
SEQ ID NO. 7: marco de rFW1.4 (V2)
EIYMTQSPSTLSASVGDRVHTC(X)n=1.5oWYQQKPGKAPKLLIY(X)n=1-5o
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=1.50FGQGTKLTVLG
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)n=i.5o W VRQ APGKGLEW YG(X)n=1.50 RFTIS KDTS KNT V YLQMNSLR AEDTAVYYCAR(X)„=i.5o WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO. 8: enlazador GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO. 9: marco de cadena ligera variable sustituida de FW1.4
EIVMTQSPSTLS AS VGDRVnTCCX)0=i ,50 WYQQKPGKAPKLLIY(X)n=i.50
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=i-50FGQGTKLTVLG
En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos para la humanizacion de anticuerpos no humanos injertando CDR de anticuerpos de donantes no humanos sobre marcos de anticuerpos estables y solubles. En una realizacion particularmente preferida, las CDR provienen de anticuerpos de conejo y los marcos son los descritos anteriormente.
Un metodo general para injertar CDR en marcos de aceptores humanos ha sido divulgado por Winter en la patente de Estados Unidos No. 5.225.539 y por Queen et al. en el documento WO9007861A1. La estrategia general para injertar CDR a partir de anticuerpos monoclonales de conejo en marcos seleccionados se relaciona con aquella de Winter et al. y Queen et al., pero diverge en ciertos aspectos clave. En particular, los metodos de la invencion divergen de la metodologia tipica de Winter y Queen conocida en la tecnica en que las estructuras de anticuerpos humanos como se describen en la presente memoria son particularmente adecuadas como aceptores universales para anticuerpos de donantes humanos o no humanos. Por lo tanto, a diferencia del metodo general de Winter y Queen, la secuencia del marco utilizada para los metodos de humanizacion de la invencion no es necesariamente la secuencia del marco que exhibe la mayor similitud de secuencia con la secuencia del anticuerpo no humano (por ejemplo, conejo) del cual se derivan las CDR de donantes. Ademas, no se requiere injerto de residuos de marco de la secuencia del donante para soportar la conformacion de la CDR. A lo sumo, pueden introducirse los aminoacidos de union a antigeno localizados en el marco u otras mutaciones que se produjeron durante la hipermutacion somatica.
Los detalles particulares de los metodos de injerto para generar anticuerpos humanizados derivados de conejo con alta solubilidad y estabilidad se describen a continuacion.
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De acuerdo con esto, la descripcion proporciona un metodo para humanizar un inmunoenlazante del donante de CDR de conejo que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y/o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera. El metodo comprende las etapas de:
(i) injertar en la cadena pesada al menos una, preferiblemente dos, mas preferiblemente tres CDR del grupo que consiste en secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 en un marco aceptor de cadena pesada humana que tiene al menos 50%, preferiblemente al menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, mas preferiblemente al menos 95% de identidad con la SEQ ID NO: 1; y/o
(ii) injertar en la cadena ligera al menos una, preferiblemente dos, mas preferiblemente tres CDR del grupo que consiste en secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 en un marco aceptor de cadena ligera humana, teniendo el marco de cadena ligera humana al menos 50%, preferiblemente al menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, mas preferiblemente al menos 95% de identidad con la SEQ ID NO: 2.
En una realizacion preferida, el marco aceptor de cadena variable comprende (i) un marco de cadena pesada humana que comprende una secuencia de aminoacidos del marco seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 6 y (ii) un marco de cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoacidos del marco de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 9.
En una realizacion muy preferida, el metodo comprende la etapa de (i) injertar las secuencias de cadena pesada de CDR1, CDR2 y CDR3 en la cadena pesada e (ii) injertar las secuencias de cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 en la cadena ligera de un inmunoenlazante que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, mas preferiblemente al menos 95% de identidad con la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7. Mas preferiblemente, el inmunoenlazante es o comprende la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7.
En otra realizacion, para mejorar la union al antigeno, el metodo puede comprender ademas la etapa de sustituir los residuos del marco aceptor por residuos del donante que estan implicados en la union al antigeno.
En realizaciones ilustrativas de los metodos de la invencion, la secuencia de aminoacidos del anticuerpo donante de CDR se identifica primero y las secuencias se alinean usando herramientas convencionales de alineamiento de secuencias (por ejemplo, algoritmo de Needleman-Wunsch y matrices de Blossum). La introduccion de espacios y la nomenclatura de las posiciones de los residuos se puede hacer usando un sistema convencional de numeracion de anticuerpos. Por ejemplo, puede usarse el sistema de numeracion de AHo para dominios variables de inmunoglobulina. El esquema de numeracion de Kabat tambien se puede aplicar ya que es el estandar mas ampliamente adoptado para numerar los residuos en un anticuerpo. La numeracion de Kabat puede, por ejemplo, ser asignado usando el programa SUBIM. Este programa analiza regiones variables de una secuencia de anticuerpos y numera la secuencia de acuerdo con el sistema establecido por Kabat y colaboradores (Deret et al., 1995). La definicion de regiones marco y CDR generalmente se realiza siguiendo la definicion de Kabat, que se basa en la variabilidad de secuencia y es la mas comunmente utilizada. Sin embargo, para CDR-H1, la designacion es preferiblemente una combinacion de las definiciones de Kabat, datos medios de contacto generados por analisis de contactos entre anticuerpo y antigeno de un subconjunto de estructuras complejas tridimensionales (MacCallum et al., 1996) y de Chotia que se basa en la ubicacion de las regiones de bucle estructural (vease tambien la Fig. 1). Las tablas de conversion para los dos sistemas de numeracion diferentes usados para identificar las posiciones de residuos de aminoacidos en las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo se proporcionan en A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670. El sistema de numeracion de Kabat se describe adicionalmente en Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Publicacion NIH No. 91-3242). El sistema de numeracion de AHo se describe adicionalmente en Honegger, A. y Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309: 657-670).
Los dominios variables de los anticuerpos monoclonales de conejo pueden, por ejemplo, clasificarse en los subgrupos humanos correspondientes usando, por ejemplo, una implementacion en EXCEL de algoritmos de analisis de secuencia y metodos de clasificacion basados en el analisis del repertorio de anticuerpos humanos (Knappik et al., 2000, J Mol Biol. Feb 11; 296 (1): 57-86).
Las conformaciones de CDR se pueden asignar a las regiones de union al antigeno del donante, posteriormente se pueden identificar tambien las posiciones de los residuos requeridos para mantener las diferentes estructuras canonicas. Las estructuras canonicas de CDR para cinco de las seis regiones hipervariables de anticuerpos de conejo (L1, L2, L3, H1 y H2) se determinan usando la definicion de Chothia (1989).
En una realizacion preferida, las CDR se generan, identifican y aislan de acuerdo con el siguiente metodo: las celulas B, preferiblemente las celulas B de conejo, se incuban con (i) antigenos objetivo (preferiblemente purificados) o (ii) con celulas que expresan el antigeno objetivo en su superficie.
En el caso (ii), dichas celulas que expresan el antigeno objetivo pueden, por ejemplo, ser celulas de mamifero, preferiblemente celulas CHO o HEK293, celulas de levadura, preferiblemente esferoblastos de levadura, o celulas bacterianas que expresan naturalmente el objetivo de eleccion o se transforman para expresar la proteina objetivo en su superficie. Tras la expresion, el antigeno objetivo puede expresarse en la superficie celular integrado o unido a
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la membrana celular. Las celdas pueden, por ejemplo, cultivarse como cepas aisladas en cultivo celular o aislarse de su entorno natural, por ejemplo, un tejido, un organo o un organismo.
Proporcionar el antigeno objetivo expresado en la superficie de las celulas, es decir, el caso (ii), es especialmente preferido para proteinas transmembrana, incluso mas preferentemente para proteinas que abarcan multiples membranas, tales como GPCR (receptores acoplados a la proteina G) o canales ionicos o cualquier otra proteina cuya conformacion nativa es dificil de mantener tras la expresion y purificacion recombinantes. La inmunizacion tradicional con la proteina recombinante es en estos casos desaconsejable o imposible debido a la perdida de conformacion nativa de proteinas/complejos de membrana integrales durante el proceso de purificacion o debido a cantidades insuficientes de proteina pura. En una realizacion preferida de la invencion, un mamifero, mas preferiblemente un conejo, se inmuniza con ADN en lugar de proteina recombinante, por ejemplo, mediante un protocolo de vacunacion con ADN como se describe en el documento WO/2004/087216. La vacunacion con ADN induce una respuesta inmune rapida contra un antigeno nativo. Dado que no se necesita proteina recombinante, esta tecnologia es, por un lado, muy rentable, por otro lado, y mas importante, este metodo permite la expresion nativa de complejos de membrana integrales y/o proteinas de membrana que abarcan multiples membranas. Las celulas B pueden aislarse a partir de dicho mamifero inmunizado, preferiblemente de dicho conejo, o alternativamente pueden ser celulas B sin modificar.
En una etapa posterior de dicho metodo, las celulas B, preferiblemente las celulas B de memoria, se aislan de los organos linfaticos del animal inmunizado (tal como bazo o nodulos linfaticos), preferiblemente de conejos inmunizados. Las celulas B se incuban en una mezcla con celulas que expresan el antigeno en su superficie o con antigeno soluble marcado con fluorescencia. Se aislan las celulas B que expresan anticuerpos objetivo especificos en su superficie y, por consiguiente, se unen al antigeno objetivo o al antigeno objetivo expresado en la superficie celular. En una realizacion muy preferida, las celulas B y/o las celulas objetivo se tinen para permitir el aislamiento a traves de la clasificacion basada en citometria de flujo de complejos de celulas B/celulas objetivo o celulas B/antigeno. La citometria de flujo normalmente mide la fluorescencia emitida por celulas individuales cuando cruzan un rayo laser. Sin embargo, algunos investigadores ya han utilizado citometros para investigar las interacciones celula-celula, por ejemplo, adhesion mediada por cadherinas (Panorchan et al., 2006, J. Cell Science, 119, 66-74; Leong et Hibma, 2005, J. Immunol., 302, 116-124) o integrinas (Gawaz et al., 1991, J. Clin. Invest, 88, 1128-1134). Por lo tanto, en el caso (ii), las celulas que expresan el objetivo de eleccion se tinen con un colorante fluorescente intracelular (por ejemplo, calceina). Las celulas B se tinen con anticuerpos fluorescentes que se unen a marcadores especificos de la superficie celular. Por lo tanto, pueden seleccionarse "eventos" bicolor, que consisten en dos celulas que se adhieren entre si a traves de las interacciones objetivo con el receptor de celulas B (vease la Fig. 2).
Como las IgG generalmente tienen una afinidad mas alta que las IgM, se seleccionan preferiblemente las celulas B positivas que expresan IgG, pero no IgM en su superficie (que es caracteristica para las celulas B de memoria). Para dicho fin, se usa preferiblemente tincion multicolor, donde los anticuerpos especificos para IgG e IgM se marcan diferencialmente, por ejemplo, con APC y FITC, respectivamente.
En una realizacion particular, una lectura para la clasificacion de celulas B tambien puede seleccionar la capacidad de esta interaccion para bloquear/activar funcionalmente la senalizacion del receptor. Por ejemplo, las celulas B podrian incubarse con celulas que expresan funcionalmente un GPCR (receptor acoplado a proteina G). Se puede agregar un agonista que senala a traves de un GPCR a la mezcla para inducir la salida de Ca2+ mediada por GPCR del reticulo endoplasmico. En caso de que un anticuerpo presentado en una celula B bloqueara funcionalmente la senalizacion agonista, el flujo de Ca2+ tambien seria bloqueado por esta interaccion celula-celula. El eflujo de Ca2+ se puede medir cuantitativamente mediante citometria de flujo. Por lo tanto, solo se clasificaran los conglomerados de celulas B/celulas objetivo que muestren aumento o disminucion del eflujo de Ca2+.
La etapa de seleccion es seguida por el cultivo de las celulas B en condiciones adecuadas para que los anticuerpos se secreten en el medio de cultivo. Los anticuerpos producidos son anticuerpos monoclonales. El cultivo puede implicar el uso de una linea celular auxiliar, tal como una linea celular auxiliar de timoma (por ejemplo, EL4-B5, vease Zubler et al., 1985, J. Immunol., 134 (6): 3662-3668). Preferiblemente, se lleva a cabo una etapa de validacion probando los anticuerpos generados para union especifica al objetivo, por ejemplo, para excluir anticuerpos que estan dirigidos contra una proteina que se expresa en la superficie celular distinta de la proteina objetivo. Por ejemplo, CELISA, es decir, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) modificado, donde la etapa de recubrimiento se realiza con celulas enteras, es adecuado para dicho fin. Dicho metodo permite la evaluacion de la selectividad y la capacidad de los anticuerpos para competir con el ligando.
Los anticuerpos generados en la etapa anteriormente mencionada se analizan a continuacion para identificar las CDR de dichos anticuerpos. Esto puede implicar etapas tales como purificacion de los anticuerpos, elucidacion de su secuencia de aminoacidos y/o de la secuencia de acidos nucleicos.
Finalmente, las CDR pueden luego injertarse sobre marcos aceptores, por ejemplo, por sintesis genica con el metodo de extension del oligo, preferiblemente en los marcos de aceptores descritos anteriormente. En una realizacion, el proceso de injerto de CDR reconocido en la tecnica puede usarse para transferir CDR de donantes a marcos de aceptores. En la mayoria de los casos, las tres CDR de la cadena pesada se trasplantan desde el anticuerpo del donante a un unico marco aceptor y las tres CDR de la cadena ligera se trasplantan a un marco
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diferente del aceptor. Se espera que no siempre sea necesario trasplantar todas las CDR, ya que algunas CDR pueden no estar implicadas en la union al antigeno, y las CDR con diferentes secuencias (y la misma longitud) pueden tener el mismo plegamiento (y, por lo tanto, contactos del antigeno con los contactos de la cadena principal podrian conservarse a pesar de las diferentes secuencias). De hecho, dominios unicos (Ward et al., 1989, Nature 341, paginas 544-546) o incluso CDR individuales (R. Taub et al., 1989, J. Biol Chem 264, pp.259-265) pueden tener actividades de union al antigeno solamente. Sin embargo, si se trasplantan todas o solo algunas de las CDR, la intencion del injerto de CDR es trasplantar el mismo, o casi el mismo sitio de union a antigeno, de anticuerpos de animal a humanos (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5.225.539 (Winter)).
En otra realizacion, las CDR del anticuerpo del donante pueden alterarse antes o despues de su incorporacion al marco aceptor.
Alternativamente, la caracterizacion de los anticuerpos se realizara solo en su formato de inmunoenlazante final. Para este enfoque, las secuencias de CDR de anticuerpos expresados en celulas B clasificadas se recuperan por RT-PCR de las celulas B clasificadas cultivadas o de las celulas B individuales clasificadas directamente. Para dicho fin, la multiplicidad de celulas B y/o la etapa de validacion descrita anteriormente y/o la etapa de analisis como se describio anteriormente pueden no ser necesarias. La combinacion de dos conjuntos de oligonucleotidos parcialmente superpuestos en los que un conjunto de oligonucleotidos codifica las CDR y un segundo conjunto que codifica las regiones marco de un andamiaje de inmunoenlazante adecuado permitiria generar inmunoenlazantes humanizados en un procedimiento de PCR de una etapa. La secuenciacion, clonacion y produccion de alto rendimiento permitiria realizar una seleccion de clones basada en el rendimiento de los inmunoenlazantes humanizados purificados, en lugar de caracterizar la IgG secretada en el sobrenadante del cultivo celular. En una realizacion preferida de la misma, el inmunoenlazante es un scFv.
Sin embargo, el injerto de CDR puede dar como resultado una afinidad alterada del inmunoenlazante generado con el antigeno debido a residuos de marco que estan en contacto con el antigeno. Tales interacciones pueden ser el resultado de una hipermutacion somatica. Por lo tanto, todavia puede ser necesario injertar dichos aminoacidos del marco del donante en el marco del anticuerpo humanizado. Los residuos de aminoacidos del inmunoenlazante no humano implicados en la union al antigeno se pueden identificar mediante el examen de las secuencias y estructuras de la region variable del anticuerpo monoclonal de conejo. Cada residuo en el marco del donante de CDR que difiere de la linea germinal se puede considerar como relevante. Si no se puede establecer la linea germinal mas cercana, la secuencia se puede comparar con el consenso del subgrupo o el consenso de secuencias de conejo con un alto porcentaje de similitud. Los residuos raros del marco se consideran posibles resultados de la hipermutacion somatica y, por lo tanto, desempenan un papel en la union.
Los anticuerpos de la invencion se pueden optimizar adicionalmente para mostrar propiedades funcionales mejoradas, por ejemplo, solubilidad y/o estabilidad mejoradas. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invencion se optimizan de acuerdo con la metodologia de "consenso funcional" divulgada en la solicitud PCT serial No. PCT/EP2008/001958, titulada "Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies", presentada el 12 de marzo de 2008.
Por ejemplo, los inmunoenlazantes de la invencion se pueden comparar con una base de datos de scFv seleccionados funcionalmente para identificar posiciones de residuos de aminoacidos que son mas o menos tolerantes a la variabilidad que las posiciones correspondientes en inmunoenlazante, lo que indica que tales las posiciones identificadas de residuos pueden ser adecuadas para ingenieria genetica para mejorar la funcionalidad tal como la estabilidad y/o la solubilidad.
Los ejemplos de posiciones de residuos del marco para sustitucion y ejemplos de sustituciones en el arco se describen en la solicitud PCT No. PCT/CH2008/000285, titulada " Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodies with Improved Functional Properties", presentada el 25 de junio de 2008, y la solicitud PCT No. PCT/CH2008/000284, titulada "Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies", presentada el 25 de junio de 2008. Por ejemplo, se pueden introducir una o mas de las siguientes sustituciones en una posicion de aminoacido (se hace referencia a la numeracion de AHo para cada una de las posiciones de aminoacidos enumeradas a continuacion) en la region variable de la cadena pesada de un inmunoenlazante de la divulgacion:
(a) Q o E en la posicion del aminoacido 1;
(b) Q o E en la posicion del aminoacido 6;
(c) T, S o A en la posicion del aminoacido 7, mas preferiblemente T o A, incluso mas preferiblemente T;
(d) A, T, P, V o D, mas preferiblemente T, P, V o D, en la posicion del aminoacido 10,
(e) L o V, mas preferiblemente L, en la posicion del aminoacido 12,
(f) V, R, Q, M o K, mas preferiblemente V, R, Q o M en la posicion del aminoacido 13;
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(g) R, M, E, Q o K, mas preferiblemente R, M, E o Q, incluso mas preferiblemente R o E, en la posicion del aminoacido 14;
(h) L o V, mas preferiblemente L, en la posicion del aminoacido 19;
(i) R, T, K o N, mas preferiblemente R, T o N, incluso mas preferiblemente N, en la posicion del aminoacido 20;
(j) I, F, L o V, mas preferiblemente I, F o L, incluso mas preferiblemente I o L, en la posicion del aminoacido 21;
(k) R o K, mas preferiblemente K, en la posicion del aminoacido 45;
(l) T, P, V, A o R, mas preferiblemente T, P, V o R, incluso mas preferiblemente R, en la posicion del aminoacido 47;
(m) K, Q, H o E, mas preferiblemente K, H o E, incluso mas preferiblemente K, en la posicion del aminoacido 50;
(n) M o I, mas preferiblemente I, en la posicion del aminoacido 55;
(o) K o R, mas preferiblemente K, en la posicion del aminoacido 77;
(p) A, V, L o I, mas preferiblemente A, L o I, incluso mas preferiblemente A, en la posicion del aminoacido 78;
(q) E, R, T o A, mas preferiblemente E, T o A, incluso mas preferiblemente E, en la posicion del aminoacido 82;
(r) T, S, I o L, mas preferiblemente T, S o L, incluso mas preferiblemente T, en la posicion del aminoacido 86;
(s) D, S, N o G, mas preferiblemente D, N o G, incluso mas preferiblemente N, en la posicion del aminoacido 87;
(t) A, V, L o F, mas preferiblemente A, V o F, incluso mas preferiblemente V, en la posicion del aminoacido 89;
(u) F, S, H, D o Y, mas preferiblemente F, S, H o D, en la posicion del aminoacido 90;
(v) D, Q o E, mas preferiblemente D o Q, incluso mas preferiblemente D, en la posicion del aminoacido 92;
(w) G, N, T o S, mas preferiblemente G, N o T, incluso mas preferiblemente G, en la posicion del aminoacido 95;
(x) T, A, P, F o S, mas preferiblemente T, A, P o F, incluso mas preferiblemente F, en la posicion del aminoacido 98;
(y) R, Q, V, I, M, F o L, mas preferiblemente R, Q, I, M, F o L, incluso mas preferiblemente Y, incluso mas preferiblemente L, en la posicion del aminoacido 103; y
(z) N, S o A, mas preferiblemente N o S, incluso mas preferiblemente N, en la posicion del aminoacido 107.
De forma adicional o alternativa, se pueden introducir una o mas de las siguientes sustituciones en la region variable de la cadena ligera de un inmunoenlazante de la divulgacion:
(aa) Q, D, L, E, S o I, mas preferiblemente L, E, S o I, incluso mas preferiblemente L o E, en la posicion del aminoacido 1;
(bb) S, A, Y, I, P o T, mas preferiblemente A, Y, I, P o T, incluso mas preferiblemente P o T en la posicion del aminoacido 2;
(cc) Q, V, T o I, mas preferiblemente V, T o I, incluso mas preferiblemente V o T, en la posicion del aminoacido 3;
(dd) V, L, I o M, mas preferiblemente V o L, en la posicion del aminoacido 4;
(ee) S, E o P, mas preferiblemente S o E, incluso mas preferiblemente S, en la posicion del aminoacido 7;
(ff) T o I, mas preferiblemente I, en la posicion del aminoacido 10;
(gg) A o V, mas preferiblemente A, en la posicion del aminoacido 11;
(hh) S o Y, mas preferiblemente Y, en la posicion del aminoacido 12;
(ii) T, S o A, mas preferiblemente T o S, incluso mas preferiblemente T, en la posicion del aminoacido 14;
(jj) S o R, mas preferiblemente S, en la posicion del aminoacido 18;
(kk) T o R, mas preferiblemente R, en la posicion del aminoacido 20;
(ll) R o Q, mas preferiblemente Q, en la posicion del aminoacido 24;
(mm) H o Q, mas preferiblemente H, en la posicion del aminoacido 46;
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(nn) K, R o I, mas preferiblemente R o I, incluso mas preferiblemente R, en la posicion del aminoacido 47;
(oo) R, Q, K, E, T o M, mas preferiblemente Q, K, E, T o M, en la posicion del aminoacido 50;
(pp) K, T, S, N, Q o P, mas preferiblemente T, S, N, Q o P, en la posicion del aminoacido 53;
(qq) I o M, mas preferiblemente M, en la posicion del aminoacido 56;
(rr) H, S, F o Y, mas preferiblemente H, S o F, en la posicion del aminoacido 57;
(ss) I, V o T, mas preferiblemente V o T, R, incluso mas preferiblemente T, en la posicion del aminoacido 74;
(tt) R, Q o K, mas preferiblemente R o Q, incluso mas preferiblemente R, en la posicion del aminoacido 82;
(uu) L o F, mas preferiblemente F, en la posicion del aminoacido 91;
(vv) G, D, T o A, mas preferiblemente G, D o T, incluso mas preferiblemente T, en la posicion del aminoacido 92;
(xx) S o N, mas preferiblemente N, en la posicion del aminoacido 94;
(yy) F, Y o S, mas preferiblemente Y o S, incluso mas preferiblemente S, en la posicion del aminoacido 101; y
(zz) D, F, H, E, L, A, T, V, S, G o I, mas preferiblemente H, E, L, A, T, V, S, G o I, incluso mas preferiblemente A o V, en la posicion del aminoacido 103.
En otras realizaciones, los inmunoenlazantes de la invencion comprenden una o mas de las mutaciones potenciadoras de la estabilidad descritas en la solicitud provisional de Estados Unidos con serial No. 61/075.692, titulada " Solubility Optimization of Immunobinders", presentada el 25 de junio de 2008. En ciertas realizaciones preferidas, el inmunoenlazante comprende una mutacion potenciadora de la solubilidad en una posicion de aminoacido seleccionada del grupo de posiciones de aminoacidos de la cadena pesada que consiste en 12, 103 y 144 (convencion de numeracion de AHo). En una realizacion preferida, el inmunoenlazante comprende una o mas sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: (a) serina (S) en la posicion 12 del aminoacido de la cadena pesada; (b) serina (S) o treonina (T) en la posicion del aminoacido de la cadena pesada 103; y (c) serina (S) o treonina (T) en la posicion 144 del aminoacido de la cadena pesada. En otra realizacion, el inmunoenlazante comprende las siguientes sustituciones: (a) serina (S) en la posicion 12 del aminoacido de la cadena pesada; (b) serina (S) o treonina (T) en la posicion del aminoacido de la cadena pesada 103; y (c) serina (S) o treonina (T) en la posicion 144 del aminoacido de la cadena pesada.
En ciertas realizaciones preferidas, el inmunoenlazante comprende mutaciones potenciadoras de la estabilidad en un residuo estructural del marco aceptor de la cadena ligera en al menos una de las posiciones 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91 y 103 de la region variable de la cadena ligera de acuerdo con el sistema de numeracion de AHo. En una realizacion preferida, el marco aceptor de la cadena ligera comprende una o mas sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en (a) acido glutamico (E) en la posicion 1, (b) valina (V) en la posicion 3, (c) leucina (L ) en la posicion 4; (d) serina (S) en la posicion 10; (e) arginina (R) en la posicion 47; (e) serina (S) en la posicion 57; (f) fenilalanina (F) en la posicion 91; y (g) valina (V) en la posicion 103.
Se puede usar cualquiera de una variedad de metodos disponibles para producir un anticuerpo humanizado que comprende una mutacion como se describio anteriormente.
De acuerdo con esto, la presente divulgacion proporciona un inmunoenlazador humanizado de acuerdo con el metodo descrito en este documento.
En ciertas realizaciones preferidas, el antigeno objetivo de dicho inmunoenlazador es VEGF o TNFa.
Los polipeptidos descritos en la presente divulgacion o generados por un metodo de la presente invencion pueden, por ejemplo, sintetizarse usando tecnicas conocidas en el arte. Alternativamente, las moleculas de acido nucleico que codifican las regiones variables deseadas se pueden sintetizar y los polipeptidos producidos por metodos recombinantes.
Por ejemplo, una vez que se ha decidido la secuencia de una region variable humanizada, esa region variable o un polipeptido que la comprende se pueden elaborar mediante tecnicas bien conocidas en el arte de la biologia molecular. Mas especificamente, las tecnicas de ADN recombinante pueden usarse para producir una amplia gama de polipeptidos transformando una celula huesped con una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica la region variable deseada (por ejemplo, una cadena pesada o ligera modificada; dominios variables de los mismos, u otros fragmentos de union a antigeno de los mismos)).
En una realizacion, se puede preparar un vector de expresion que incluye un promotor que esta operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica al menos Vh o Vl. Si es necesario, o se desea, se puede preparar un segundo vector de expresion que incluye un promotor que esta unido operablemente a una secuencia de ADN que
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codifica el dominio variable complementario (es decir, cuando el vector de expresion parental codifica Vh, el segundo vector de expresion codifica Vl y viceversa). Una lfnea celular (por ejemplo, una lfnea celular de mamffero inmortalizada) puede transformarse despues con uno o ambos vectores de expresion y cultivarse en condiciones que permitan la expresion del dominio quimerico variable o el anticuerpo quimerico (vease, por ejemplo, la solicitud internacional de patente No. PCT/GB85/00392 de Neuberger et al).
En una realizacion, pueden elaborarse regiones variables que comprenden CDR de donantes y secuencias de aminoacidos de FR del aceptor y a continuacion se introducen cambios en las moleculas de acido nucleico para efectuar la sustitucion de aminoacidos de CDR.
Los metodos reconocidos en la tecnica a modo de ejemplo para fabricar una molecula de acido nucleico que codifica una variante de secuencia de aminoacido de un polipeptido incluyen, pero no se limitan a, preparacion mediante mutagenesis dirigida al sitio (o mediada por oligonucleotido), mutagenesis por PCR y mutagenesis en casete de un ADN preparado previamente que codifica el polipeptido.
La mutagenesis dirigida al sitio es un metodo preferido para preparar variantes de sustitucion. Esta tecnica es bien conocida en el arte (vease, por ejemplo, Carter et al., Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) y Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987). Brevemente, al llevar a cabo la mutagenesis del ADN dirigida al sitio, el ADN parental se altera hibridando primero un oligonucleotido que codifica la mutacion deseada con una unica cadena de dicho ADN parental. Despues de la hibridacion, se usa una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena completa, usando el oligonucleotido hibridado como cebador, y usando la unica cadena del ADN parental como molde. Por lo tanto, el oligonucleotido que codifica la mutacion deseada se incorpora en el ADN de cadena doble resultante.
La mutagenesis por PCR tambien es adecuada para elaborar variantes de secuencia de aminoacidos de polipeptidos. Ver Higuchi, en PCR Protocols, paginas177-183 (Academic Press, 1990); y Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989). En resumen, cuando se usan pequenas cantidades de ADN molde como material de partida en una PCR, los cebadores que difieren ligeramente en secuencia de la region correspondiente en un ADN molde pueden usarse para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN especffico que difiere de la secuencia molde solo en las posiciones donde los cebadores difieren del molde.
Otro metodo para preparar variantes, mutagenesis en casete, se basa en la tecnica descrita por Wells et al., Gene 34: 315-323 (1985). El material de partida es el plasmido (u otro vector) que comprende el ADN a mutar. Se identifican el codon o los codones en el ADN original a mutar. Debe haber un sitio unico de endonucleasa de restriccion en cada lado del sitio o los sitios de mutacion identificados. Si no existen tales sitios de restriccion, se pueden generar usando el metodo de mutagenesis mediado por oligonucleotidos descrito anteriormente para introducirlos en ubicaciones apropiadas en el ADN que codifica el polipeptido. El ADN del plasmido se corta en estos sitios para linealizarlo. Un oligonucleotido de cadena doble que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restriccion pero que contiene la mutacion o mutaciones deseadas se sintetiza usando procedimientos estandar, donde las dos cadenas del oligonucleotido se sintetizan por separado y luego se hibridan juntas usando tecnicas estandar. Este oligonucleotido de cadena doble se denomina casete. Este casete esta disenado para tener extremos 5' y 3' que son compatibles con los extremos del plasmido linealizado, de manera que se puede ligar directamente al plasmido. Este plasmido ahora contiene la secuencia de ADN mutada.
Una region variable generada por los metodos de la invencion puede modelarse de nuevo y modificarse adicionalmente para aumentar adicionalmente la union al antfgeno. Por lo tanto, las etapas descritas anteriormente pueden estar precedidas o seguidas por etapas adicionales, que incluyen, por ejemplo, maduracion por afinidad. Ademas, los datos emprncos de union se pueden utilizar para una mayor optimizacion.
Un experto en la tecnica entendera que los polipeptidos de la invencion pueden modificarse adicionalmente de modo que varfen en la secuencia de aminoacidos, pero no en la actividad deseada. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones adicionales de nucleotidos que conducen a sustituciones de aminoacidos en residuos de aminoacidos "no esenciales". Por ejemplo, un residuo de aminoacido no esencial en un polipeptido de inmunoglobulina puede reemplazarse con otro residuo de aminoacido de la misma familia de cadena lateral. En otra realizacion, una cadena de aminoacidos puede reemplazarse con una cadena estructuralmente similar que difiere en el orden y/o composicion de los miembros de la familia de la cadena lateral, es decir, puede hacerse una sustitucion conservadora, en la que un residuo de aminoacido se reemplaza por un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral similar.
Se han definido en la tecnica las familias de residuos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistema), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
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Aparte de las sustituciones de aminoacidos, la presente invencion contempla otras modificaciones, por ejemplo, a secuencias de aminoacidos de la region Fc con el fin de generar una variante de region Fc con funcion efectora alterada. Uno puede, por ejemplo, eliminar uno o mas residuos de aminoacidos de la region Fc con el fin de reducir o mejorar la union a un FcR. En una realizacion, se pueden modificar uno o mas de los residuos de la region Fc para generar dicha variante de region Fc. Generalmente, no se eliminaran mas de uno a aproximadamente diez residuos de la region Fc de acuerdo con esta realizacion de la invencion. La region Fc en la presente memoria que comprende una o mas supresiones de aminoacidos conservara preferiblemente al menos aproximadamente 80%, y preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y lo mas preferiblemente al menos aproximadamente 95% de la region Fc de partida o de una region Fc humana de secuencia nativa.
Tambien se pueden hacer variantes de la region Fc de insercion de aminoacidos, cuyas variantes tienen una funcion efectora alterada. Por ejemplo, se puede introducir al menos un residuo de aminoacido (por ejemplo, uno o dos residuos de aminoacidos y generalmente no mas de diez residuos) adyacente a una o mas de las posiciones de la region Fc identificadas en la presente memoria porque afectan a la union de FcR. Por "adyacente" se entiende dentro de uno a dos residuos de aminoacidos de un residuo de la region Fc identificado en este documento. Dichas variantes de la region Fc pueden mostrar un enlace de FcRn mejorado o disminuido.
Dichas variantes de la region Fc generalmente comprenderan al menos una modificacion de aminoacido en la region Fc. En una realizacion, las modificaciones de aminoacidos se pueden combinar. Por ejemplo, la region Fc variante puede incluir dos, tres, cuatro, cinco, etc. sustituciones en la misma, por ejemplo, de las posiciones especificas de la region Fc identificadas aqui. En otra realizacion, un polipeptido puede tener una union alterada a FcRn y a otro receptor de Fc.
En una realizacion, los polipeptidos descritos en la presente divulgacion o generados mediante un metodo de la presente divulgacion, por ejemplo, regiones variables de Ig humanizadas y/o polipeptidos que comprenden regiones variables de Ig humanizadas pueden producirse por metodos recombinantes. Por ejemplo, una secuencia de polinucleotidos que codifica un polipeptido puede insertarse en un vector de expresion adecuado para expresion recombinante. Cuando el polipeptido es un anticuerpo, los polinucleotidos que codifican regiones variables adicionales de cadena ligera y pesada, opcionalmente unidos a regiones constantes, pueden insertarse en el mismo o diferente vector de expresion. Una secuencia de etiqueta de afinidad (por ejemplo, una etiqueta His(6)) se puede unir o incluir opcionalmente dentro de la secuencia polipeptidica para facilitar la purificacion mas adelante. Los segmentos de ADN que codifican cadenas de inmunoglobulina estan unidos operativamente a secuencias de control en el vector o vectores de expresion que aseguran la expresion de polipeptidos de inmunoglobulina. Las secuencias de control de expresion incluyen, pero sin limitacion, promotores (por ejemplo, promotores heterologos o asociados de forma natural), secuencias senal, elementos potenciadores y secuencias de terminacion de la transcripcion. Preferiblemente, las secuencias de control de la expresion son sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar celulas huespedes eucariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el huesped apropiado, el huesped se mantiene en condiciones adecuadas para la expresion de alto nivel de las secuencias de nucleotidos, y la recoleccion y purificacion del polipeptido.
Estos vectores de expresion son tipicamente replicables en los organismos huesped ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosomico del huesped. Comunmente, los vectores de expresion contienen marcadores de seleccion (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina o resistencia a neomicina) para permitir la deteccion de aquellas celulas transformadas con las secuencias de ADN deseadas (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 4.704.362).
E. coli es un huesped procariota particularmente util para clonar los polinucleotidos (por ejemplo, secuencias de ADN) de la presente descripcion. Otros huespedes microbianos adecuados para su uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias, tales como Salmonella, Serratia, y varias especies de Pseudomonas.
Otros microbios, tales como levadura, tambien son utiles para expresion. Saccharomyces y Picia son ejemplos de huespedes de levadura, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresion (por ejemplo, promotores), un origen de replicacion, secuencias de terminacion y similares segun se desee. Los promotores tipicos incluyen 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicoliticas. Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de la utilizacion de metanol, maltosa y galactosa.
Dentro del alcance de la presente descripcion, E. coli y S. cerevisiae son celulas huespedes preferidas.
Ademas de microorganismos, el cultivo de tejido de mamifero tambien puede usarse para expresar y producir los polipeptidos de la presente descripcion (por ejemplo, polinucleotidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de los mismos). Vease Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, NY (1987). Las celulas eucariotas son realmente preferidas porque en la tecnica se han desarrollado varias lineas celulares huespedes adecuadas capaces de secretar proteinas heterologas (por ejemplo, inmunoglobulinas intactas) e incluyen lineas celulares CHO, diversas lineas celulares Cos, celulas HeLa, celulas 293, lineas celulares de mieloma, celulas B transformadas e hibridomas. Los vectores de expresion para estas celulas pueden incluir secuencias de control de la expresion, tales como un origen de replicacion, un promotor y un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), y
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sitios de informacion de procesamiento necesarios, tales como sitios de union a ribosomas, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilacion y secuencias de terminacion transcripcional. Las secuencias preferidas de control de la expresion son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, citomegalovirus y similares. Vease Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992).
Los vectores que contienen las secuencias de polinucleotidos de interes (por ejemplo, las secuencias que codifican la cadena pesada y ligera y las secuencias de control de la expresion) pueden transferirse a la celula huesped mediante metodos bien conocidos, que varian dependiendo del tipo de huesped celular. Por ejemplo, la transfeccion con cloruro de calcio se utiliza comunmente para celulas procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio, electroporacion, lipofeccion, biolistica o transfeccion basada en virus se puede usar para otros huespedes celulares. (Vease, generalmente, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2a ed., 1989). Otros metodos utilizados para transformar celulas de mamiferos incluyen el uso de polibreno, fusion de protoplastos, liposomas, electroporacion y microinyeccion (vease en general, Sambrook et al., citado anteriormente). Para la produccion de animales transgenicos, los transgenes pueden microinyectarse en oocitos fertilizados, o pueden incorporarse en el genoma de celulas madre embrionarias, y los nucleos de tales celulas pueden transferirse a oocitos enucleados.
El polipeptido sujeto tambien se puede incorporar en transgenes para introduccion en el genoma de un animal transgenico y expresion posterior, por ejemplo, en la leche de un animal transgenico (vease, por ejemplo, Deboer et al., 5.741.957; Rosen 5.304.489; y Meade 5.849.992. Los transgenes adecuados incluyen secuencias codificantes para cadenas ligeras y/o pesadas en enlace operable con un promotor y potenciador de un gen especifico de glandula mamaria, tal como caseina o lactoglobulina beta.
Los polipeptidos se pueden expresar usando un solo vector o dos vectores. Por ejemplo, las cadenas ligera y pesada de anticuerpo se pueden clonar en vectores de expresion separados y cotransfectarse en celulas.
En una realizacion, las secuencias senal pueden usarse para facilitar la expresion de polipeptidos de la divulgacion.
Una vez expresados, los polipeptidos pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estandar de la tecnica, que incluyen precipitacion con sulfato de amonio, columnas de afinidad (por ejemplo, proteina A o proteina G), cromatografia en columna, purificacion por HPLC, electroforesis en gel y similares (vease en general Scopes, Proteins Purification (Springer-Verlag, NY, (1982)).
Ya sean las regiones variables de Ig humanizadas o los polipeptidos que las comprenden, pueden expresarse mediante celulas huesped o lineas celulares en cultivo. Tambien se pueden expresar en celulas in vivo. La linea celular que se transforma (por ejemplo, transfecta) para producir el anticuerpo alterado puede ser una linea celular de mamifero inmortalizada, como las de origen linfoide (por ejemplo, una linea celular de mieloma, hibridoma, trioma o cuadroma). La linea celular tambien puede incluir celulas linfoides normales, tales como celulas B, que se han inmortalizado por transformacion con un virus (por ejemplo, el virus de Epstein-Barr).
Aunque tipicamente la linea celular utilizada para producir el polipeptido es una linea celular de mamifero, tambien se pueden usar lineas celulares de otras fuentes (tales como bacterias y levaduras). En particular, las cepas bacterianas derivadas de E. coli se pueden usar, especialmente, por ejemplo, presentacion de fagos.
Algunas lineas celulares linfoides inmortalizadas, tales como lineas celulares de mieloma, en su estado normal, secretan cadenas ligeras o pesadas de Ig aisladas. Si dicha linea celular se transforma con un vector que expresa un anticuerpo alterado, preparado durante el proceso de la divulgacion, no sera necesario llevar a cabo las etapas restantes del proceso, siempre que la cadena secretada normalmente sea complementaria al dominio variable de la cadena de Ig codificada por el vector preparado anteriormente.
Si la linea celular inmortalizada no secreta o no secreta una cadena complementaria, sera necesario introducir en las celulas un vector que codifique la cadena complementaria apropiada o un fragmento de la misma.
En el caso en que la linea celular inmortalizada secreta una cadena ligera o pesada complementaria, la linea celular transformada puede producirse, por ejemplo, transformando una celula bacteriana adecuada con el vector y luego fusionando la celula bacteriana con la linea celular inmortalizada (por ejemplo, por fusion de esferoplastos). Alternativamente, el ADN puede introducirse directamente en la linea celular inmortalizada mediante electroporacion.
En una realizacion, una region variable de Ig humanizada como se describe en la presente divulgacion o generada por un metodo de la presente divulgacion puede estar presente en un fragmento de union a antigeno de cualquier anticuerpo. Los fragmentos pueden producirse en forma recombinante y manipularse por ingenieria genetica, sintetizarse o producirse por digestion de un anticuerpo con una enzima proteolitica. Por ejemplo, el fragmento puede ser un fragmento Fab; la digestion con papaina rompe el anticuerpo en la region, antes del enlace disulfuro entre cadenas (es decir, Vh-Vh), que une las dos cadenas pesadas. Esto da como resultado la formacion de dos fragmentos identicos que contienen la cadena ligera y los dominios Vh y Ch1 de la cadena pesada. Alternativamente, el fragmento puede ser un fragmento F(ab')2. Estos fragmentos pueden crearse digiriendo un anticuerpo con pepsina, que escinde la cadena pesada despues del enlace disulfuro entre cadenas, y da como resultado un fragmento que contiene ambos sitios de union a antigeno. Todavia otra alternativa es usar un anticuerpo de "cadena
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sencilla". Los fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) se pueden construir de varias formas. Por ejemplo, el C- terminal de Vh puede estar unido al N-terminal de Vl. Tfpicamente, un enlazador (por ejemplo, (GGGGS)4) se coloca entre Vh y Vl. Sin embargo, el orden en el que se pueden enlazar las cadenas se puede revertir, y se pueden incluir etiquetas que faciliten la deteccion o purificacion (por ejemplo, etiquetas Myc, His o FLAG) (etiquetas como estas pueden adjuntarse a cualquier anticuerpo). o fragmento de anticuerpo de la divulgacion; su uso no esta restringido a scFv). Por consiguiente, y como se indica a continuacion, los anticuerpos marcados estan dentro del alcance de la presente divulgacion. En realizaciones alternativas, los anticuerpos descritos en este documento, o generados por los metodos descritos en este documento, pueden ser dfmeros de cadena pesada o dfmeros de cadena ligera. Ademas, se puede usar una cadena ligera o pesada de anticuerpo, o partes de la misma, por ejemplo, un anticuerpo de dominio unico (DAb).
En otra realizacion, una region variable de Ig humanizada como se describe en la presente invencion o generada por un metodo de la presente divulgacion esta presente en un anticuerpo de cadena sencilla (ScFv) o un minicuerpo (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.837.821 o el documento WO 94/09817A1). Los minicuerpos son moleculas dimericas formadas por dos cadenas polipeptfdicas que comprenden cada una, una molecula de ScFv (un unico polipeptido que comprende uno o mas sitios de union a antfgeno, por ejemplo, un dominio Vl unido mediante un enlazador flexible a un dominio Vh fusionado a un dominio CH3 a traves de un peptido de conexion). Las moleculas de ScFv se pueden construir en una orientacion VH-enlazador-VL u orientacion VL-enlazador-VH. La bisagra flexible que une los dominios Vl y Vh que forman el sitio de union al antfgeno comprende preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 residuos de aminoacidos. Un peptido de conexion a modo de ejemplo para este fin es (Gly4Ser)3 (Huston et al., (1988). PNAS, 85: 5879). Otros peptidos de conexion son conocidos en la tecnica.
Los metodos para producir anticuerpos de cadena sencilla son bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, Ho et al., (1989), Gene, 77:51; Bird et al., (1988), Science 242: 423; Pantoliano et al., (1991), Biochemistry 30: 10117; Milenic et al., (1991), Cancer Research, 51: 6363; Takkinen et al., (1991), Protein Engineering 4: 837. Los minicuerpos pueden prepararse construyendo un componente de ScFv y conectando el componente peptido-CH3 usando metodos descritos en la tecnica (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.837.821 o el documento WO 94/09817 A1). Estos componentes se pueden aislar de plasmidos separados como fragmentos de restriccion y luego se ligan y vuelven a clonarse en un vector apropiado. El ensamblaje apropiado puede verificarse mediante digestion de restriccion y analisis de secuencia de ADN. En una realizacion, un minicuerpo de la divulgacion comprende un peptido de conexion. En una realizacion, el peptido de conexion comprende un enlazador Gly/Ser, por ejemplo, GGGSSGGGSGG.
En otra realizacion, se puede construir un minicuerpo tetravalente. Los minicuerpos tetravalentes se pueden construir de la misma manera que los minicuerpos, excepto que dos moleculas de ScFv se unen usando un enlazador flexible, por ejemplo, que tiene una secuencia de aminoacidos (G4S)4G3AS.
En otra realizacion, una region variable humanizada como se describe en la presente divulgacion o generada por un metodo de la presente divulgacion puede estar presente en un diacuerpo. Los diacuerpos son similares a las moleculas de scFv, pero habitualmente tienen un enlazador de residuo de aminoacido corto (menos de 10 y preferiblemente 1-5) que conecta ambos dominios variables, de modo que los dominios Vl y Vh en la misma cadena polipeptfdica no pueden interactuar. En cambio, el dominio Vl y Vh de una cadena polipeptfdica interactua con el dominio Vh y Vl (respectivamente) en una segunda cadena polipeptfdica (documento WO 02/02781).
En otra realizacion, una region variable humanizada de la invencion puede estar presente en un fragmento o porcion inmunorreactiva de un anticuerpo (por ejemplo, una molecula de scFv, un minicuerpo, un minicuerpo tetravalente o un diacuerpo) unido operativamente a una porcion de union a FcR. En un ejemplo de realizacion, la porcion de union a FcR es una region Fc completa.
Preferiblemente, los metodos de humanizacion descritos en la presente memoria dan como resultado regiones variables de Ig en las que la afinidad por el antfgeno no cambia sustancialmente en comparacion con el anticuerpo del donante.
En una realizacion, los polipeptidos que comprenden los dominios variables de la presente divulgacion se unen a antfgenos con una afinidad de union mayor que (o igual a) una constante de asociacion Ka de aproximadamente 105 M-1 , 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, o 1012 M-1, (incluyendo afinidades intermedias de estos
valores).
La afinidad, avidez y/o especificidad se pueden medir de varias formas. En general, e independientemente de la manera precisa en que se defina o mida la afinidad, los metodos de la divulgacion mejoran la afinidad del anticuerpo cuando generan un anticuerpo que es superior en cualquier aspecto de su aplicacion clfnica al anticuerpo (o anticuerpos) del cual era hecho (por ejemplo, los metodos de la invencion se consideran efectivos o exitosos cuando un anticuerpo modificado puede administrarse a una dosis mas baja o con menos frecuencia o por una vfa de administracion mas conveniente que un anticuerpo (o anticuerpos) del cual se formo).
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Mas especificamente, la afinidad entre un anticuerpo y un antigeno al que se une puede medirse mediante diversos ensayos, que incluyen, por ejemplo, un ensayo de ELISA, un ensayo BiaCore o el ensayo KinExAMR 3000 (disponible a traves de Sapidyne Instruments (Boise, ID)). Brevemente, las perlas de sefarosa estan recubiertas con antigeno (el antigeno usado en los metodos de la divulgacion puede ser cualquier antigeno de interes (por ejemplo, un antigeno cancerigeno, una proteina de superficie celular o proteina secretada, un antigeno de un patogeno (por ejemplo, un antigeno bacteriano o viral (por ejemplo, un antigeno del VIH, un antigeno de la gripe o un antigeno de la hepatitis)) o un alergeno) mediante union covalente. Se preparan diluciones del anticuerpo a probar y cada dilucion se agrega a los pozos designados en una placa. Luego se agrega anticuerpo de deteccion (por ejemplo, conjugado IgG-HRP antihumano de cabra) a cada pozo seguido por un sustrato cromogenico (por ejemplo, HRP). La placa se lee luego en un lector de placas de ELISA a 450 nm y se calculan los valores EC50 (se entiende, sin embargo, que los metodos descritos aqui son generalmente aplicables; no estan limitados a la produccion de anticuerpos que se unen a cualquier antigeno particular o clase de antigenos).
Los expertos en la tecnica reconoceran que determinar la afinidad no siempre es tan simple como mirar una sola figura. Dado que los anticuerpos tienen dos brazos, su afinidad aparente suele ser mucho mayor que la afinidad intrinseca entre la region variable y el antigeno (se cree que esto se debe a la avidez). La afinidad intrinseca se puede medir usando fragmentos scFv o Fab.
En otro aspecto, la presente divulgacion presenta moleculas biespecificas que comprenden un anticuerpo de conejo humanizado, o un fragmento del mismo, de la invencion. Un anticuerpo de la invencion, o porciones de union a antigeno del mismo, puede derivarse o unirse a otra molecula funcional, por ejemplo, otro peptido o proteina (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molecula biespecifica que se une al menos a dos sitios de union diferentes o moleculas objetivo. El anticuerpo de la invencion puede derivarse o unirse a mas de otra molecula funcional para generar moleculas multiespecificas que se unen a mas de dos sitios de union y/o moleculas objetivo diferentes; tales moleculas multiespecificas tambien se pretende que esten abarcadas por el termino "molecula biespecifica" como se usa en el presente documento. Para crear una molecula biespecifica de la invencion, un anticuerpo de la invencion puede estar funcionalmente unido (por ejemplo, mediante acoplamiento quimico, fusion genetica, asociacion no covalente o de otro modo) a una o mas moleculas de union diferentes, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, antigenos especificos de tumor o especificos de patogenos, peptidos o mimeticos de union, de modo que resulta una molecula biespecifica. Por consiguiente, la presente invencion incluye moleculas biespecificas que comprenden al menos una primera molecula de union que tiene especificidad por un primer objetivo y una segunda molecula de union que tiene especificidad por uno o mas epitopos objetivo adicionales.
En una realizacion, las moleculas biespecificas de la invencion comprenden como especificidad de union al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, que incluye, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o un Fv de cadena sencilla. El anticuerpo tambien puede ser un dimero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento minimo del mismo tal como un Fv o una construccion de cadena sencilla como se describe en Ladner et al., patente de Estados Unidos No. 4.946.778.
Aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que se pueden emplear en las moleculas biespecificas de la invencion son anticuerpos monoclonales murinos, quimericos y humanizados.
Las moleculas biespecificas de la presente invencion pueden prepararse conjugando las especificidades de union constituyentes usando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, cada especificidad de union de la molecula biespecifica puede generarse por separado y luego conjugarse entre si. Cuando las especificidades de union son proteinas o peptidos, se puede usar una variedad de agentes de acoplamiento o entrecruzamiento para la conjugacion covalente. Los ejemplos de agentes de entrecruzamiento incluyen proteina A, carbodiimida, N- succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(acido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N- succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y 4-(N-maleimidometil)ciclohaxano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (vease, por ejemplo, Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Otros metodos incluyen aquellos descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., (1985) Science 229: 81-83), y Glennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugacion preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles a traves de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Cuando las especificidades de union son anticuerpos, pueden conjugarse a traves de union por sulfhidrilo de las regiones de bisagra del C-terminal de las dos cadenas pesadas. En una realizacion particularmente preferida, la region de bisagra se modifica para que contenga un numero impar de residuos de sulfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conjugacion.
Alternativamente, ambas especificidades de union pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma celula huesped. Este metodo es particularmente util cuando la molecula biespecifica es una proteina de fusion mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molecula biespecifica de la invencion puede ser una molecula de cadena sencilla que comprende un anticuerpo de cadena sencilla y un determinante de union, o una molecula biespecifica de cadena sencilla que comprende dos determinantes de union. Las moleculas biespecificas pueden comprender al menos dos moleculas de cadena sencilla. Los metodos para
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preparar moleculas biespecificas se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos No. 5.260.203; la patente de Estados Unidos No. 5.455.030; la patente de Estados Unidos No. 4.881.175; la patente de Estados Unidos No. 5.132.405; la patente de Estados Unidos No. 5.091.513; la patente de Estados Unidos No. 5.476.786; la patente de Estados Unidos No. 5.013.653; la patente de Estados Unidos No. 5.258.498; y la patente de Estados Unidos No. 5.482.858.
La union de las moleculas biespecificas a sus objetivos especificos puede confirmarse, por ejemplo, mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), una clasificacion de celulas individuales basada en citometria de flujo (por ejemplo, analisis de FACS), bioensayo (por ejemplo, inhibicion del crecimiento), o ensayo de transferencia Western. Cada uno de estos ensayos generalmente detecta la presencia de complejos proteina-anticuerpo de interes particular empleando un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) especifico para el complejo de interes. Por ejemplo, los complejos de anticuerpos se pueden detectar usando, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo ligado a una enzima que reconoce y se une especificamente a los complejos anticuerpo-VEGF. Alternativamente, los complejos se pueden detectar usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse radiactivamente y usarse en un radioinmunoensayo (RIA) (vease, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Septimo curso de entrenamiento en tecnicas de ensayo con radioligandos, The Endocrine Society, marzo de 1986). El isotopo radioactivo se puede detectar por medios tales como el uso de un contador y o un contador de centelleo o por autorradiografia.
En otro aspecto, la presente invencion presenta un anticuerpo de conejo humanizado, o un fragmento del mismo, conjugado con un residuo terapeutico, tal como una citotoxina, un farmaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Tales conjugados se denominan aqui "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o mas citotoxinas se denominan "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, que mata) celulas. Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol y puromicina y analogos u homologos de los mismos. Los agentes terapeuticos tambien incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapeuticas que se pueden conjugar con un anticuerpo de la invencion incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas y auristatinas, y derivados de las mismas. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo de caliqueamicina esta disponible comercialmente (MylotargMR; Wyeth-Ayerst).
Las citotoxinas pueden conjugarse con los anticuerpos de la invencion usando la tecnologia de enlazador disponible en la tecnica. Los ejemplos de tipos de enlazadores que se han usado para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero sin limitacion, hidrazonas, tioeteres, esteres, disulfuros y enlazadores que contienen peptidos. Puede elegirse un enlazador que es, por ejemplo, susceptible de escision por pH bajo dentro del compartimento lisosomico o susceptible de escision por proteasas, tales como proteasas expresadas preferentemente en tejido tumoral tal como catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D).
Para una discusion adicional de tipos de citotoxinas, enlazadores y metodos para conjugar agentes terapeuticos a anticuerpos, vease tambien Saito, G. et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail, P.A. et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2: 750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; Senter, P.D. y Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.
Los anticuerpos de la presente invencion tambien pueden conjugarse con un isotopo radiactivo para generar productos radiofarmaceuticos citotoxicos, tambien denominados radioinmunoconjugados. Los ejemplos de isotopos radiactivos que pueden conjugarse con anticuerpos para uso diagnostico o terapeutico incluyen, pero no se limitan a, yodo131, indio 111, itrio90 y lutecio177. Los metodos para preparar radioinmunoconjugados se establecen en la tecnica. Los ejemplos de radioinmunoconjugados estan disponibles comercialmente, incluyendo ZevalinMR (IDEC Pharmaceuticals) y BexxarMR (Corixa Pharmaceuticals), y se pueden usar metodos similares para preparar radioinmunoconjugados usando los anticuerpos de la invencion.
Los conjugados de anticuerpo de la invencion pueden usarse para modificar una respuesta biologica dada, y el residuo de farmaco no debe interpretarse como limitado a agentes terapeuticos quimicos clasicos. Por ejemplo, el residuo de farmaco puede ser una proteina o polipeptido que posee una actividad biologica deseada. Tales proteinas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina de la difteria; una proteina tal como factor de necrosis tumoral o interferon-Y; o modificadores de la respuesta biologica, tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleucina-1
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("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), Factor estimulante de colonias de macrofagos y granulocitos ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento.
Las tecnicas para conjugar dichos residuos terapeutico a anticuerpos son bien conocidas, vease, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer
Therapy, Reisfeld et al., (eds.), paginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2da Ed.), Robinson et al., (eds.), paginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), paginas 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), paginas, 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
En un aspecto, la divulgacion proporciona formulaciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos de conejo humanizados para el tratamiento de la enfermedad. El termino "formulacion farmaceutica" se refiere a preparaciones que estan en tal forma que permiten que la actividad biologica del anticuerpo o derivado del anticuerpo sea inequivocamente efectiva, y que no contiene componentes adicionales que son toxicos para los sujetos a los que se administraria la formulacion. Los excipientes "farmaceuticamente aceptables" (vehiculos, aditivos) son aquellos que pueden administrarse razonablemente a un sujeto mamifero para proporcionar una dosis efectiva del ingrediente activo empleado.
Una formulacion "estable" es aquella en la que el anticuerpo o derivado de anticuerpo en el mismo retiene esencialmente su estabilidad fisica y/o estabilidad quimica y/o actividad biologica tras el almacenamiento. Diversas tecnicas analiticas para medir la estabilidad de proteinas estan disponibles en la tecnica y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por ejemplo. La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un periodo de tiempo seleccionado. Preferiblemente, la formulacion es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30°C) o a 40°C durante al menos 1 mes y/o estable a aproximadamente 2-8°C durante al menos 1 ano o durante al menos 2 anos. Ademas, la formulacion es preferiblemente estable despues de congelacion (a, por ejemplo, -70°C) y descongelacion de la formulacion.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su estabilidad fisica" en una formulacion farmaceutica si no muestra signos de agregacion, precipitacion y/o desnaturalizacion tras el examen visual de color y/o claridad, o segun se mide mediante dispersion de luz UV o mediante cromatografia de exclusion por tamano.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su estabilidad quimica" en una formulacion farmaceutica, si la estabilidad quimica en un momento dado es tal que se considera que la proteina aun conserva su actividad biologica como se define a continuacion. La estabilidad quimica se puede evaluar detectando y cuantificando las formas quimicamente alteradas de la proteina. La alteracion quimica puede implicar modificacion de tamano (por ejemplo, recorte) que puede evaluarse usando cromatografia de exclusion por tamano, SDS-PAGE y/o ionizacion por desorcion laser asistida por matriz/espectrometria de masas de tiempo de vuelo (MALDI/TOF MS), por ejemplo. Otros tipos de alteracion quimica incluyen la alteracion de la carga (por ejemplo, que se produce como resultado de la desamidacion) que puede evaluarse mediante cromatografia de intercambio ionico, por ejemplo.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su actividad biologica" en una formulacion farmaceutica, si la actividad biologica del anticuerpo en un momento dado esta dentro de aproximadamente 10% (dentro de los errores del ensayo) de la actividad biologica exhibida en el tiempo en que la formulacion farmaceutica se preparo como se determino en un ensayo de union a antigeno, por ejemplo. Otros ensayos de "actividad biologica" para anticuerpos se detallan a continuacion.
Por "isotonico" se entiende que la formulacion de interes tiene esencialmente la misma presion osmotica que la sangre humana. Las formulaciones isotonicas generalmente tendran una presion osmotica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. La isotonicidad se puede medir usando un osmometro de presion de vapor o un tipo de congelacion con hielo, por ejemplo.
Un "poliol" es una sustancia con multiples grupos hidroxilo, e incluye azucares (azucares reductores y no reductores), alcoholes de azucar y acidos de azucares. Los polioles preferidos en la presente invencion tienen un peso molecular que es inferior a aproximadamente 600 kD (por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 120 a aproximadamente 400 kD). Un "azucar reductor" es uno que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir iones metalicos o reaccionar covalentemente con lisina y otros grupos amino en proteinas y un "azucar no reductor" es aquel que no tiene estas propiedades de un azucar reductor. Los ejemplos de azucares reductores son fructosa, manosa, maltosa, lactosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y glucosa. Los azucares no reductores incluyen sacarosa, trehalosa, sorbosa, melecitosa y rafinosa. Manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol son ejemplos de alcoholes de azucar. En cuanto a los acidos de azucar, estos incluyen L-gluconato y sales metalicas de los mismos. Cuando se desea que la formulacion sea estable a la congelacion-descongelacion, el poliol es
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preferiblemente uno que no cristaliza a temperaturas de congelacion (por ejemplo, -202C) de manera que desestabilice el anticuerpo en la formulacion. Los azucares no reductores tales como sacarosa y trehalosa son los polioles preferidos en la presente invencion, prefiriendose la trehalosa sobre la sacarosa, debido a la estabilidad superior de la solucion de la trehalosa.
Como se usa en el presente documento, "regulador" se refiere a una solucion regulada que resiste los cambios en el pH por la accion de sus componentes conjugados acido-base. El regulador de esta invencion tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,0; preferiblemente de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,5; y lo mas preferiblemente tiene un pH de aproximadamente 5,0. Los ejemplos de reguladores que controlaran el pH en este intervalo incluyen acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros reguladores de acidos organicos. Cuando se desea una formulacion estable al congelamiento-descongelamiento, el regulador preferiblemente no es fosfato.
En un sentido farmacologico, en el contexto de la presente invencion, una "cantidad terapeuticamente eficaz" de un anticuerpo o derivado de anticuerpo se refiere a una cantidad eficaz en la prevencion o tratamiento de un trastorno para el tratamiento del cual el anticuerpo o anticuerpo derivado es efectivo. Una "enfermedad/trastorno" es cualquier condicion que se beneficiaria del tratamiento con el anticuerpo o derivado de anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades cronicas y agudas que incluyen aquellas afecciones patologicas que predisponen al mamifero al trastorno en cuestion.
Un "conservante" es un compuesto que se puede incluir en la formulacion para reducir esencialmente la accion bacteriana en el mismo, facilitando asi la produccion de una formulacion de uso multiple, por ejemplo. Ejemplos de posibles conservantes incluyen cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en la que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromaticos tales como fenol, butilo y alcohol bencilico, alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3- pentanol y m-cresol. El conservante mas preferido en este documento es alcohol bencilico.
La presente divulgacion tambien proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas anticuerpos o compuestos derivados de anticuerpos, junto con al menos un vehiculo o excipiente fisiologicamente aceptable. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender, por ejemplo, uno o mas entre agua, reguladores (por ejemplo, solucion salina regulada neutra o solucion salina regulada con fosfato), etanol, aceite mineral, aceite vegetal, dimetilsulfoxido, carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteinas, adyuvantes, polipeptidos o aminoacidos tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o glutation y/o conservantes. Como se indico anteriormente, otros ingredientes activos pueden (pero no necesitan) incluirse en las composiciones farmaceuticas proporcionadas en este documento.
Un vehiculo es una sustancia que puede estar asociada con un anticuerpo o derivado de anticuerpo antes de la administracion a un paciente, a menudo con el proposito de controlar la estabilidad o la biodisponibilidad del compuesto. Los vehiculos para uso dentro de tales formulaciones son generalmente biocompatibles y tambien pueden ser biodegradables. Los vehiculos incluyen, por ejemplo, moleculas monovalentes o multivalentes tales como albumina de suero (por ejemplo, humana o bovina), albumina de huevo, peptidos, polilisina y polisacaridos tales como aminodextrano y poliamidoaminas. Los vehiculos tambien incluyen materiales de soporte solidos tales como perlas y microparticulas que comprenden, por ejemplo, polilactato, poliglicolato, poli(lactido-co-glicolido), poliacrilato, latex, almidon, celulosa o dextrano. Un vehiculo puede soportar los compuestos en una variedad de formas, incluyendo enlaces covalentes (directamente o a traves de un grupo enlazador), interaccion o mezcla no covalente.
Las composiciones farmaceuticas se pueden formular para cualquier forma de administracion apropiada, incluyendo, por ejemplo, administracion topica, oral, nasal, rectal o parenteral. En ciertas realizaciones, se prefieren composiciones en una forma adecuada para uso oral. Tales formas incluyen, por ejemplo, pildoras, comprimidos, pastillas, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o granulos dispersables, emulsion, capsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. En aun otras realizaciones, las composiciones proporcionadas en la presente invencion pueden formularse como un liofilizado. El termino parenteral como se usa en la presente memoria incluye inyeccion subcutanea, intradermica, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, espinal, intracraneal, intratecal e intraperitoneal, asi como cualquier tecnica de inyeccion o infusion similar.
Las composiciones destinadas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier metodo conocido en la tecnica para la fabricacion de composiciones farmaceuticas y pueden contener uno o mas agentes, tales como agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes y conservantes para proporcionar preparaciones atractivas y comestibles. Los comprimidos contienen el ingrediente activo en mezcla con excipientes fisiologicamente aceptables que son adecuados para la fabricacion de comprimidos. Tales excipientes incluyen, por ejemplo, diluyentes inertes (por ejemplo, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio), agentes de granulacion y desintegracion (por ejemplo, almidon de maiz o acido alginico), agentes de union (por ejemplo, almidon, gelatina o acacia) y agentes lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, acido estearico o talco). Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden estar recubiertos por tecnicas conocidas para retrasar la desintegracion y la absorcion en el tracto gastrointestinal y proporcionar asi una accion sostenida durante un periodo
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mas largo. Por ejemplo, se puede emplear un material de retardo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
Las formulaciones para uso oral tambien pueden presentarse como capsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente solido inerte (por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolin), o como capsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso (por ejemplo, aceite de mani, parafina liquida o aceite de oliva). Las suspensiones acuosas contienen el anticuerpo o derivado de anticuerpo en mezcla con excipientes adecuados para la fabricacion de suspensiones acuosas. Tales excipientes incluyen agentes de suspension (por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidropropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arabiga); y agentes dispersantes o humectantes (por ejemplo, fosfatidos naturales tales como lecitina, productos de condensacion de un oxido de alquileno con acidos grasos tales como estearato de polioxietileno, productos de condensacion de oxido de etileno con alcoholes alifaticos de cadena larga tales como heptadecaetilenoxicetanol, productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilen sorbitol, o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y anhidridos de hexitol tales como monooleato de polietilen sorbitan). Las suspensiones acuosas tambien pueden comprender uno o mas conservantes, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o mas agentes colorantes, uno o mas agentes saborizantes y uno o mas agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina. Los jarabes y elixires se pueden formular con agentes edulcorantes, tales como glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones tambien pueden comprender uno o mas demulcentes, conservantes, agentes saborizantes y/o agentes colorantes.
Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo los ingredientes activos en un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sesamo o aceite de coco) o en un aceite mineral tal como parafina liquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante tal como cera de abejas, parafina dura o alcohol cetilico. Se pueden anadir agentes edulcorantes, tales como los expuestos anteriormente, y/o agentes saborizantes para proporcionar preparaciones orales apetecibles. Tales suspensiones se pueden conservar mediante la adicion de un antioxidante tal como acido ascorbico.
Los polvos y granulos dispersables adecuados para la preparacion de una suspension acuosa mediante la adicion de agua proporcionan el ingrediente activo en mezcla con un agente dispersante o humectante, agente de suspension y uno o mas conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspension adecuados se ejemplifican por los ya mencionados anteriormente. Tambien pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, edulcorantes, saborizantes y colorantes.
Las composiciones farmaceuticas tambien pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuete), un aceite mineral (por ejemplo, parafina liquida) o una mezcla de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas naturales (por ejemplo, goma arabiga o goma tragacanto), fosfatidos naturales (por ejemplo, de soja, lecitina y esteres o esteres parciales derivados de acidos grasos y hexitol), anhidridos (por ejemplo, monooleato de sorbitan), y productos de condensacion de esteres parciales derivados de acidos grasos y hexitol con oxido de etileno (por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitan). Una emulsion tambien puede comprender uno o mas agentes edulcorantes y/o saborizantes.
La composicion farmaceutica se puede preparar como una suspension acuosa u oleosa esteril inyectable en la que el modulador, dependiendo del vehiculo y la concentracion utilizada, se suspende o disuelve en el vehiculo. Dicha composicion se puede formular de acuerdo con la tecnica conocida usando agentes dispersantes, humectantes y/o de suspension adecuados, tales como los mencionados anteriormente. Entre los vehiculos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran agua, 1,3-butanodiol, solucion de Ringer y solucion isotonica de cloruro de sodio. Ademas, se pueden emplear aceites fijos esteriles como disolvente o medio de suspension. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo blando, incluidos mono o digliceridos sinteticos. Ademas, se pueden usar acidos grasos tales como acido oleico en la preparacion de composiciones inyectables, y se pueden disolver adyuvantes tales como anestesicos locales, conservantes y/o agentes reguladores en el vehiculo.
Las composiciones farmaceuticas se pueden formular como formulaciones de liberacion sostenida (es decir, una formulacion tal como una capsula que efectua una liberacion lenta del modulador despues de la administracion). Dichas formulaciones pueden prepararse generalmente usando tecnologia bien conocida y administrarse mediante, por ejemplo, implantacion oral, rectal o subcutanea, o mediante implantacion en el sitio objetivo deseado. Los portadores para uso dentro de tales formulaciones son biocompatibles y tambien pueden ser biodegradables; preferiblemente, la formulacion proporciona un nivel relativamente constante de liberacion del modulador. La cantidad de un anticuerpo o derivado de anticuerpo contenido en una formulacion de liberacion sostenida depende, por ejemplo, del sitio de implantacion, la velocidad y duracion esperada de la liberacion y la naturaleza de la enfermedad/trastorno a tratar o prevenir.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpos proporcionados en este documento se administran generalmente en una cantidad que alcanza una concentracion en un fluido corporal (por ejemplo, sangre, plasma, suero, CSF, fluido sinovial, linfa, fluido intersticial celular, lagrimas u orina) que es suficiente para unirse de manera detectable a un
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objetivo tal como, por ejemplo, VEGF y prevenir o inhibir tales enfermedades/trastornos mediados por el objetivo, por ejemplo, enfermedades/trastornos mediados por VEGF. Se considera que una dosis es efectiva si da como resultado un beneficio discernible para el paciente como se divulga en la presente memoria. Las dosis sistemicas preferidas varian de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 140 mg por kilogramo de peso corporal por dia (aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 7 g por paciente por dia), siendo generalmente las dosis orales aproximadamente 5-20 veces mayores que las dosis intravenosas. La cantidad de anticuerpo o derivado de anticuerpo que se puede combinar con los materiales de vehiculo para producir una unica forma de dosificacion variara dependiendo del huesped tratado y del modo particular de administracion. Las formas unitarias de dosificacion generalmente contendran entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 500 mg de un ingrediente activo.
Las composiciones farmaceuticas pueden envasarse para tratar afecciones que responden a un anticuerpo o derivado de anticuerpo dirigido, por ejemplo, a VEGF. Las composiciones farmaceuticas envasadas pueden incluir un recipiente que contiene una cantidad efectiva de al menos un anticuerpo o derivado de anticuerpo como se describe en el presente documento e instrucciones (por ejemplo, marcacion) que indican que la composicion contenida se va a usar para tratar una enfermedad/trastorno sensible a un anticuerpo o derivado de anticuerpo despues de la administracion en el paciente.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente invencion tambien pueden modificarse quimicamente. Los grupos modificadores preferidos son polimeros, por ejemplo, un polimero polialqueno, polialquileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido o un polisacarido ramificado o no ramificado. Tal grupo efector puede aumentar la vida media de los ejemplos de anticuerpo in vivo. Ejemplos particulares de polimeros sinteticos incluyen poli(etilenglicol) (PEG) cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido poli(propilenglicol), poli (alcohol vinilico) o derivados de los mismos. Los polimeros particulares de origen natural incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucogeno o derivados de los mismos. El tamano del polimero puede variarse segun se desee, pero generalmente estara en un intervalo de peso molecular promedio de 500 Da a 50.000 Da. Para la aplicacion local donde el anticuerpo esta disenado para penetrar en el tejido, un peso molecular preferido del polimero es de alrededor de 5.000 Da. La molecula de polimero se puede unir al anticuerpo, en particular al extremo C-terminal de la cadena pesada del fragmento Fab a traves de un peptido de bisagra unido covalentemente como se describe en el documento WO0194585. En cuanto a la union de residuos de PEG, se hace referencia a "Poly(ethylenglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Application", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York.
Despues de la preparacion del anticuerpo o derivado de anticuerpo de interes como se describio anteriormente, se prepara la formulacion farmaceutica que lo comprende. El anticuerpo a formular no se ha sometido a liofilizacion previa y la formulacion de interes en este documento es una formulacion acuosa. Preferiblemente, el anticuerpo o derivado de anticuerpo en la formulacion es un fragmento de anticuerpo, tal como un scFv. La cantidad terapeuticamente eficaz de anticuerpo presente en la formulacion se determina teniendo en cuenta los volumenes de dosis y el modo o modos de administracion deseados, por ejemplo. De aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 25 mg/mL y lo mas preferiblemente de aproximadamente 2 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL es un ejemplo de concentracion de anticuerpo en la formulacion.
Se prepara una formulacion acuosa que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo en una solucion regulada de pH. El regulador de esta invencion tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,0, preferiblemente de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,5, y lo mas preferiblemente tiene un pH de aproximadamente 5,0. Los ejemplos de reguladores que controlaran el pH dentro de este intervalo incluyen acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros reguladores de acidos organicos. La concentracion de regulador puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM, dependiendo, por ejemplo, del regulador y de la isotonicidad deseada de la formulacion. El regulador preferido es acetato de sodio (aproximadamente 10 mM), pH 5,0.
Se incluye en la formulacion un poliol que actua como un tonico y puede estabilizar el anticuerpo. En realizaciones preferidas, la formulacion no contiene una cantidad tonificante de una sal tal como cloruro de sodio, ya que esto puede provocar que el anticuerpo o derivado de anticuerpo precipite y/o puede dar como resultado la oxidacion a pH bajo. En realizaciones preferidas, el poliol es un azucar no reductor, tal como sacarosa o trehalosa. El poliol se agrega a la formulacion en una cantidad que puede variar con respecto a la isotonicidad deseada de la formulacion. Preferiblemente, la formulacion acuosa es isotonica, en cuyo caso concentraciones adecuadas del poliol en la formulacion estan en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 15% p/v, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 2% a aproximadamente 10% p/v. Sin embargo, las formulaciones hipertonicas o hipotonicas tambien pueden ser adecuadas. La cantidad de poliol anadida tambien puede alterar con respecto al peso molecular del poliol. Por ejemplo, puede anadirse una cantidad menor de un monosacarido (por ejemplo, manitol), en comparacion con un disacarido (tal como trehalosa).
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Tambien se agrega un tensioactivo al anticuerpo o formulacion de derivado de anticuerpo. Los ejemplos de tensioactivos incluyen tensioactivos no ionicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20, 80, etc.) o poloxameros (por ejemplo, poloxamero 188). La cantidad de tensioactivo anadida es tal que reduce la agregacion del anticuerpo/ derivado de anticuerpo formulado y/o minimiza la formacion de particulas en la formulacion y/o reduce la adsorcion. Por ejemplo, el tensioactivo puede estar presente en la formulacion en una cantidad de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,5%, preferiblemente de aproximadamente 0,005% a aproximadamente 0,2% y lo mas preferiblemente de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,1%.
En una realizacion, la formulacion contiene los agentes identificados anteriormente (es decir, anticuerpo o derivado de anticuerpo, regulador, poliol y tensioactivo) y esta esencialmente libre de uno o mas conservantes, tales como alcohol bencilico, fenol, m-cresol, clorobutanol y cloruro de bencetonio. En otra realizacion, se puede incluir un conservante en la formulacion, particularmente cuando la formulacion es una formulacion multidosis. La concentracion de conservante puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 2%, lo mas preferiblemente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%. Uno o mas vehiculos, excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences vigesima primera edicion, Osol, A. Ed. (2006) pueden incluirse en la formulacion siempre que no afecten adversamente a las caracteristicas deseadas de la formulacion. Los vehiculos, excipientes o estabilizadores aceptables no son toxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen; agentes reguladores adicionales; codisolventes; antioxidantes que incluyen acido ascorbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteina); polimeros biodegradables tales como poliesteres; y/o contraiones formadores de sal tales como sodio.
Las formulaciones a usar para la administracion in vivo deben ser esteriles. Esto se logra facilmente por filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles, antes o despues de la preparacion de la formulacion.
La formulacion se administra a un mamifero que necesita tratamiento con el anticuerpo, preferiblemente un ser humano, de acuerdo con metodos conocidos, tales como la administracion intravenosa en bolo o mediante infusion continua durante un periodo de tiempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutanea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, topica o por inhalacion. En realizaciones preferidas, la formulacion se administra al mamifero mediante administracion intravenosa. Para tales fines, la formulacion puede inyectarse usando una jeringa o a traves de una linea IV, por ejemplo.
La dosificacion apropiada ("cantidad terapeuticamente efectiva") del anticuerpo dependera, por ejemplo, de la afeccion que se va a tratar, la gravedad y el curso de la afeccion, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapeuticos, terapia previa, la historia clinica y la respuesta del paciente al anticuerpo, el tipo de anticuerpo utilizado y la discrecion del medico tratante. El anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos y se puede administrar al paciente en cualquier momento desde el diagnostico en adelante. El anticuerpo o derivado de anticuerpo puede administrarse como el unico tratamiento o junto con otros farmacos o terapias utiles en el tratamiento de la afeccion en cuestion.
Como una proposicion general, la cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo o derivado de anticuerpo administrado estara en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del paciente, ya sea mediante una o mas administraciones, usando el intervalo tipico de anticuerpo de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 20 mg/kg, mas preferiblemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 15 mg/kg, administrado diariamente, por ejemplo. Sin embargo, otros regimenes de dosificacion pueden ser utiles. El progreso de esta terapia se controla facilmente mediante tecnicas convencionales.
En otro aspecto, se proporciona un articulo de fabricacion que comprende un recipiente que contiene la formulacion farmaceutica de la presente invencion, preferiblemente una formulacion acuosa, y opcionalmente proporciona instrucciones para su uso. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales y jeringas. El contenedor puede estar formado por una variedad de materiales tales como vidrio o plastico. Un ejemplo de contenedor es un vial de vidrio de un solo uso de 3-20 cc. Alternativamente, para una formulacion multidosis, el recipiente puede ser un vial de vidrio de 3-100 cc. El contenedor contiene la formulacion y la etiqueta en, o asociada con, el contenedor puede indicar instrucciones de uso. El articulo de fabricacion puede incluir ademas otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluyen otros reguladores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos del envase con instrucciones de uso.
En ciertas realizaciones preferidas, el articulo de fabricacion comprende un inmunoenlazante liofilizado como se describe en la presente memoria o generado mediante los metodos descritos en este documento.
Ejemplos
La presente divulgacion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como una limitacion adicional.
Materiales y metodos
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En general, la practica de la presente invencion emplea, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de quimica, biologia molecular, tecnologia de ADN recombinante, inmunologia (especialmente, por ejemplo, tecnologia de anticuerpos) y tecnicas estandar de preparacion de polipeptidos. Vease, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992). Los metodos para injertar CDR de conejo y otros anticuerpos monoclonales no humanos en estructuras de anticuerpos humanos seleccionados se describieron en detalle anteriormente. Ejemplos de tales experimentos de injerto se exponen a continuacion.
Para mejor comprension, los injertos denominados "min" son aquellos en los que se injertaron CDR en el marco 1.4 o un dominio variable del mismo, mientras que los injertos llamados "max" son aquellos en los que se injertaron CDR en el marco 1.4 o un dominio variable del mismo y en el que el marco comprende ademas residuos de marco de donantes que interactuan con el antigeno.
Ejemplo 1: Diseno de rFW1.4
1.1. Analisis de secuencia primaria y busqueda en base de datos
1.1.1. Coleccion de secuencias de inmunoglobulina de conejo
Se recogieron secuencias de dominios variables de anticuerpos maduros y lineas germinales de conejo de diferentes bases de datos de codigo abierto (por ejemplo, la base de datos Kabat e IMGT) y se introdujeron en una base de datos personalizada como secuencias de aminoacidos de codigo de una letra. Para todo el analisis, se utilizo unicamente la porcion de aminoacidos correspondiente a la region V (variable). Las secuencias en la base de datos KDB con menos del 70% completas o que contienen multiples residuos indeterminados en las regiones marco se descartaron. Las secuencias con mas del 95% de identidad con cualquier otra secuencia dentro de la base de datos tambien se excluyeron para evitar el ruido aleatorio en el analisis.
1.1.2. Alineaciones y numeracion de secuencias de conejo
Las secuencias de anticuerpo de conejo se alinearon usando herramientas convencionales de alineamiento de secuencias basadas en el algoritmo de Needleman-Wunsch y matrices Blossum. La introduccion de espacios y la nomenclatura de posiciones de residuos se realizaron siguiendo el sistema de numeracion de AHo para dominios variables de inmunoglobulina (Honegger y Pluckthun, 2001). El esquema de numeracion de Kabat tambien se aplico en paralelo ya que es la norma mas ampliamente adoptada para numerar los residuos en un anticuerpo. La numeracion de Kabat se asigno utilizando el programa SUBIM. Este programa analiza regiones variables de una secuencia de anticuerpos y numera la secuencia de acuerdo con el sistema establecido por Kabat y colaboradores (Deret et al 1995).
La definicion de regiones marco y CDR se realizo siguiendo la definicion de Kabat, que se basa en la variabilidad de secuencia y es la mas comunmente utilizada. Sin embargo, la designacion de CDR-H1 fue un compromiso entre diferentes definiciones que incluyen, la media de los datos de contacto de AbM, de Kabat, generados por analisis de contactos entre anticuerpo y antigeno de un subconjunto de estructuras complejas tridimensionales (MacCallum et al., 1996) y de Chothia que se basa en la ubicacion de las regiones del bucle estructural (descritas anteriormente y mostradas en la Fig. 1).
1.1.3. Frecuencia y conservacion de posiciones de residuos
Se analizo la diversidad de secuencias de aminoacidos usando un conjunto de 423 secuencias de conejo de la base de datos de Kabat. La frecuencia de residuos, f(r), para cada posicion, i, en las secuencias maduras de conejo se calculo por el numero de veces que se observa ese residuo particular dentro del conjunto de datos dividido por el numero total de secuencias. El grado de conservacion para cada posicion, i, se calculo utilizando el indice de Simpson, que tiene en cuenta el numero de aminoacidos diferentes presentes, asi como la abundancia relativa de cada residuo.
SUnCri-1)
N(N - 1)
en el que: N es el numero total de aminoacidos, r es el numero de aminoacidos diferentes presentes en cada posicion y n es el numero de residuos de un tipo particular de aminoacidos.
1.1.4. Analisis de linaje de la region V de conejo
Se usaron herramientas de analisis de filogenia para estudiar el repertorio de conejos. Las secuencias de aminoacidos de la region V se agruparon utilizando tanto algoritmos de agrupaciones como topologicos. La matriz de distancia se calculo para todo el arreglo y se uso como indicacion del uso de la linea germinal. Se calculo la
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secuencia de consenso de cada grupo y se identified la contraparte de la secuencia de la linea germinal de conejo mas cercana. Tambien la secuencia consenso general se derivo para todo el conjunto de secuencias.
1.1.5. Asignacion del subgrupo humano
Para cada secuencia representativa de conejo de los diferentes grupos, se identifico el subgrupo humano mas homologo usando una implementacion en EXCEL de algoritmos de analisis de secuencia y metodos de clasificacion basados en el analisis del repertorio de anticuerpos humanos (Knappik et al., 2000).
1.2. Diseno del marco aceptor humano
Con el modelo del repertorio de conejos del analisis de secuencia descrito anteriormente, se identificaron residuos en el marco generalmente implicados en el posicionamiento de CDR de conejo. Entre los marcos que tienen una alta homologia con respecto al repertorio de conejos y los grupos respectivos, se selecciono uno que tiene buenas propiedades biofisicas de un conjunto de secuencias completamente humanas. El marco seleccionado para servir como marco aceptor pertenece al subgrupo de cadena ligera variable kappa 1 y al subgrupo III de cadena variable pesada con la ID KI 27, a43 de ESBATech correspondientemente. Este marco de anticuerpos estable y soluble se ha identificado mediante seleccion de una biblioteca de scFv de bazo humano usando un metodo de seleccion basado en levadura denominado sistema de "control de calidad" (Auf der Maur et al., 2004) y se designo "FW1.4". Aunque la secuencia estable y soluble del marco FW1.4 exhibe una alta homologia, no era la secuencia mas homologa disponible. Los residuos identificados se incorporaron en dicho marco aceptor para generar rFW1.4.
Con la informacion para la diversidad de secuencia de aminoacidos, el uso de la linea germinal y las caracteristicas estructurales de los anticuerpos de conejo, se analizo el FW1.4 para la compatibilidad de las posiciones de residuos requeridas para preservar la conformacion de CDR en el nuevo marco humano. Se examinaron las regiones variables de FW1.4 para la compatibilidad de las siguientes caracteristicas:
i. Residuos que son parte de las secuencias canonicas para estructuras de bucle.
ii. Residuos de marco ubicados en la interfaz VL/VH.
iii. La plataforma de residuos directamente debajo de las CDR
iv. Residuos del nucleo superior e inferior
v. Residuos del marco que definen el subtipo
1.3. Injerto de CDR de conejo
Los injertos se generaron simplemente combinando las secuencias de CDR (de acuerdo con la definicion anterior) de un anticuerpo con la secuencia del marco de FW1.4 o el rFW 1.4. Se identificaron los residuos potencialmente implicados en la union. Para cada secuencia de dominio variable de conejo, se identifico la contraparte de linea germinal de conejo mas cercana. Si no se pudo establecer la linea germinal mas cercana, la secuencia se comparo con el consenso del subgrupo o el consenso de secuencias de conejo con un alto porcentaje de similitud. Los residuos raros del marco se consideraron posibles resultados de la hipermutacion somatica y, por lo tanto, desempenan un papel en la union. En consecuencia, tales residuos se injertaron en el marco aceptor.
1.4 Resultados
Analizando el repertorio de anticuerpos de conejo en terminos de estructura, la diversidad de secuencias de aminoacidos y el uso de la linea germinal, se encontraron 5 posiciones de residuos en la cadena ligera de FW 1.4 que se modificaron para mantener la conformacion de bucle de CDR de conejo. Estas posiciones estan altamente conservadas en anticuerpos de conejo. El residuo consenso para estas 5 posiciones se dedujo del repertorio de conejos y se introdujo en el marco 1.4 del aceptor humano. Con la modificacion de estas posiciones conservadas, dicho marco se volvio virtualmente compatible con las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cualquier CDR de conejo. El rFW1.4 maestro que contiene diferentes CDR de conejo esta bien expresado y se produce bien al contrario que las cadenas sencillas de tipo silvestre. Dieciseis miembros derivados de la combinacion de este marco y las CDR de conejo crearon una caracterizacion detallada que mostro la funcionalidad.
Ejemplo 2: Sistema de seleccion de celulas B
Se ha establecido un sistema de seleccion basado en FACS (clasificacion de celulas individuales basada en citometria de flujo) en ESBATech con el fin de seleccionar celulas B que se unen a un objetivo de interes a traves de sus receptores de celulas B (BCR). Un objetivo era, por ejemplo, una proteina soluble, a saber, un anticuerpo de cadena sencilla (ESBA903) marcado con un colorante fluorescente (PE y PerCP). La suspension de linfocitos se preparo a partir del bazo de conejos inmunizados con el objetivo recombinante. Despues, las celulas se incubaron con ESBA903 marcado con PE y PerCP, asi como con anticuerpos especificos para IgG (marcada con APC) o IgM (marcada con FITC). Las celulas B positivas para ESBA903 que expresan IgG, pero no IgM en su superficie se clasificaron en placas de 96 pozos (Figura 3, tabla 2). Por medio de una linea celular auxiliar de timoma (EL4-B5:
vease Zubler et al. 1985, J. Immunol, 134 (6): 3662-3668), proliferaron celulas B seleccionadas, diferenciadas en celulas plasmaticas y anticuerpos secretados. La afinidad de estas IgG por el objetivo se verifico mediante mediciones de ELISA y Biacore. Los parametros cineticos se representan en la tabla 1 para siete clones seleccionados. Estos clones, de un grupo de ~200 celulas clasificadas, muestran afinidades de union en el intervalo 5 nanomolar bajo a picomolar. Finalmente, se aislo ARNm de 6 clones de interes y se injertaron CDR en el marco FW1.4 de cadena sencilla.
Tabla 1: Valores cineticos para 7 sobrenadantes de cultivo de celulas B.
Clon de celulas B
ka [Ms-1] kd [s-1] Kd [M]
SG2
2,91 E+06 2,95E-04 1,01 E-10
SE11
3,63E+05 3,81 E-04 1,05E-09
2E-03
8,34E+05 3,53E-04 4,23E-10
9E-03
8,66E+05 6,47E-04 7,47E-10
7D-03
3,97E+05 3,04E-04 7,65E-10
12B-02
1,08E+06 1,10E-04 1,01 E-10
Tabla 2: Estadisticas de clasificacion.
Poblacion
# eventos % progenitor % total
Todos los eventos
100.000 #### 100,0
Linfocitos
86.585 86,6 86,6
Linfocitos individuales 1
86.013 99,3 86,0
Linfocitos individuales 2
85.523 99,4 85,5
^Celulas B de memoria?
5.450 6,4 5,4
Celulas clasificadas
16 0,3 0,0
Celulas de union 903
160 2,9 0,2
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Ejemplo 3: Deteccion de la interaccion entre perlas recubiertas con anticuerpo anti-TNFalfa y celulas CHO que expresan TNFalfa unido a la membrana.
Para evaluar si la alta presion en corriente de citometria de flujo rompe o no la union no covalente entre dos celulas, se realizo el siguiente experimento. Las celulas CHO establemente transfectadas con TNFalfa (celulas B-220) unidas 15 a la membrana se incubaron con perlas recubiertas con un anticuerpo anti-TNFalfa marcado con PE. En esta configuracion, las perlas imitan a las celulas B de memoria (tienen mas o menos el mismo tamano). Como controles negativos, se usaron celulas CHO no transfectadas, asi como perlas recubiertas con un anticuerpo no relacionado marcado con APC (anti-CD19). Despues de 2 horas de incubacion a 4°C con agitacion, la suspension de celulas- perlas se analizo mediante FACS (usando una boquilla de 130 pm). La Figura 4 muestra que una union especifica 20 entre perlas anti-TNFalfa y celulas CHO transfectadas con TNFalfa es claramente detectable con FACS. De hecho, en esta muestra (panel superior), alrededor de dos tercios de las perlas estan unidas a las celulas (585 unidas contra 267 no unidas). Por el contrario, en las muestras de control (paneles central e inferior), casi ninguna perla se une a las celulas CHO. Ademas, ambas poblaciones de perlas (anti-TNFalfa-PE y anti-CD19-APC) se mezclaron junto con celulas CHO transfectadas con TNFalfa. La Figura 5 y la Tabla 4 muestran que aproximadamente la mitad 25 de las perlas anti-TNFalfa se unen a las celulas CHO, mientras que la gran mayoria de las perlas anti-CD19 permanecen sin unirse. El porcentaje de perlas que se unen a la celula en cada muestra se detalla en la tabla 5. Por lo tanto, se demuestra que la seleccion especifica de celulas B individuales que se unen a una proteina objetivo de membrana integral a traves de su receptor de celulas B es posible usando citometria de flujo.
Tabla 3a: Estadisticas de clasificacion (vease tambien la Fig. 4a)
Poblacion
# Eventos % Original % Total
Todos los eventos
10.000 ### 100,0
P1
9.692 96,9 96,9
P3
585 6,0 5,9
P4
1 0,0 0,0
P2
267 2,7 2,7
Tabla 3b: Estadisticas de clasificacion (vease tambien la Fig. 4b)
Poblacion
# Eventos % Original % Total
Todos los eventos
10.000 ### 100,0
P1
9.399 94,0 94,0
P3
3 0,0 0,0
P4
6 0,1 0,1
P2
550 5,6 5,6
5 Tabla 3c: Estadisticas de clasificacion (vease tambien la Fig. 4c)
Poblacion
# Eventos % Original % Total
Todos los eventos
10.000 ### 100,0
P1
9.001 90,0 90,0
P3
13 0,1 0,1
P4
7 0,1 0,1
P2
811 8,1 8,1
Tabla 4: Estadisticas de clasificacion (vease tambien la Fig. 5)
Poblacion
# Eventos % Original % Total
Todos los eventos
10.000 ### 100,0
P1
9.096 91,0 91,0
P3
401 4,4 4,0
P4
2 0,0 0,0
P2
856 8,6 8,6
Tabla 5: Porcentaje de perlas unidas a celulas CHO en cada muestra
Celulas mAb sobre perlas % de perlas enlazadas
Muestra 1
CHO-TNFa (B220) anti-TNFa 68,0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Muestra 2
CHO-TNFa (B220) anti-CD19 0,9
Muestra 3
CHO de tipo silvestre anti-TNFa 1,5
Muestra 4
CHO-TNFa (B220) anti-TNFa 47,0
anti-CD19
0,4
Ejemplo 4: Injerto de CDR y humanizacion funcional de anticuerpos de donante de conejo anti-TNFa
Se seleccionaron cuatro anticuerpos de conejo anti-TNFa "Rabmabs" (EPI-1, EPI-15, EP-34, EP-35 y EP-42) para injerto de CDR. El esquema experimental general para el injerto de CDR, la humanizacion y la caracterizacion preliminar de anticuerpos humanizados de donantes de conejo se realizo como se describe en la descripcion. A diferencia de los metodos de humanizacion tradicionales que emplean el marco aceptor de anticuerpo humano que comparte la mayor homologia de secuencia con el anticuerpo de donante no humano, las CDR de conejo se injertaron en un marco humano (FW 1.4) que se preselecciono para propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad) utilizando un ensayo de control de calidad (WO0148017). Estas secuencias estables y solubles del marco exhibieron una alta homologia con los RabMabs.
Se generaron injertos de CDR para cada uno de los RabMabs usando la metodologia descrita en este documento. En injertos "Min", solo las CDR de conejo se trasplantaron de los dominios VL y VH del anticuerpo del donador de conejo al marco aceptor humano FW1.4. Los injertos "Max" se refieren al injerto de los CDR de conejo en rFW1.4.
Los scFv descritos y caracterizados en este documento se produjeron de la siguiente manera. Las secuencias de VL humanizadas se conectaron a secuencias de VH humanizadas a traves del enlazador de la SEQ ID NO: 8 para producir un scFv de la siguiente orientacion: NH2-VL-linker-VH-COOH. En muchos casos, las secuencias de ADN que codifican los diversos scFv se sintetizaron de nuevo en el proveedor de servicios Entelechon GmbH (
www.entelechon.com). Los insertos de ADN resultantes se clonaron en el vector de expresion bacteriana pGMP002 a traves de los sitios de restriccion NcoI y Hind 111 introducidos en los extremos 5' y 3' de la secuencia de ADN de scFv, respectivamente. Entre la secuencia de ADN del dominio VL y el dominio VH, se localiza un sitio de restriccion BamHI. En algunos casos, el ADN que codifica scFv no se sintetizo de nuevo, pero los constructos que expresan scFv se clonaron mediante transposicion del dominio. Por consiguiente, los dominios VL se cortaron y se introdujeron en los nuevos constructos a traves de los sitios de restriccion NcoI y BamHI, los dominios VH a traves de los sitios de restriccion BamHI y HindIII. En otros casos, se introdujeron mutaciones puntuales en el dominio VH y/o VL usando metodos de PCR de ensamblaje del estado de la tecnica. La clonacion de GMP002 se describe en el Ejemplo 1 de WO2008006235. La produccion de los scFv se hizo de forma analoga a la de ESBA105 como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2008006235.
La Tabla 3 presenta un resumen de los datos de caracterizacion detallados para los cuatro monoclonales de conejo (EP6, EP19, EP34, EP35 y EP43) y sus variantes injertadas con CDR. Aunque los injertos de CDR exhibieron una amplia gama de actividades en los ensayos de union de BIACore y L929, ensayos de citotoxicidad mediados por TNFa, 3 de los 4 injertos maximos ("max") exhibieron actividades terapeuticamente relevantes. EP43max exhibio la afinidad de union mas favorable (Kd de 0,25 nM) y una EC50 excelente en el ensayo de citotoxicidad. Estos datos muestran que FW1.4 (SEQ ID No: 1 y 2) es una region marco aceptor humano soluble y estable a modo de ejemplo para injertar CDR de conejo.
Prueba de potencia
La actividad neutralizante de los enlazantes anti-TNFa se evaluo en un ensayo de citotoxicidad mediada por TNFa de L929. La toxicidad de celulas de fibroblastos de raton L929 tratadas con actinomicina se indujo con TNF humano recombinante (hTNF). Se determino que el 90% de la citotoxicidad maxima inducida por hTNF estaba en una concentracion de TNF de 1.000 pg/mL. Todas las celulas L929 se cultivaron en RPMI 1640 con fenol, con medio de L-Glutamina suplementado con suero de ternera fetal (10% v/v). La actividad neutralizante de los aglutinantes anti- TNFa se evaluo en RPMI 1640 sin rojo de fenol y suero de ternera fetal al 5%. Se agregan diferentes concentraciones (0 - 374 ng/mL) de aglutinantes anti-TNF a las celulas L929 en presencia de 1.000 pg/mL de hTNF para determinar la concentracion a la que el efecto antagonista alcanza la inhibicion casi maxima (EC50%). La curva de respuesta a la dosis se ajusto con regresion sigmoidea no lineal con pendiente variable y se calculo la EC50.
Analisis de union con Biacore de scFv anti-TNF
Para las mediciones de afinidad de union, se emplearon mediciones de resonancia de plasmon superficial con BIAcoreMR-T 100 usando un chip sensor de NTA y TNF marcado con His (producido en ESBATech). La superficie del chip sensor de NTA consiste en una matriz de dextrano carboximetilada inmovilizada previamente con acido nitrilotriacetico (NTA) para la captura de moleculas marcadas con histidina a traves de la quelacion Ni2 + NTA. Trimeros TNFa N-his humanos (5 nM) son capturados por el niquel a traves de sus etiquetas his N-terminales y se inyecta ESBA105 (analito) a diversas concentraciones que van desde 30 nM a 0,014 nM en etapas de dilucion en
serie de 3 veces. En la etapa de regeneracion, el complejo formado por niquel, ligando y analito se elimina por lavado. Esto permite el uso de las mismas condiciones de regeneracion para diferentes muestras. La senal de respuesta se genera mediante la tecnologia de resonancia de plasmon superficial (SPR) y se mide en unidades de resonancia (RU). Todas las mediciones se realizan a 252C. Se generaron los sensogramas para cada muestra de 5 scFv anti-TNF despues de la correccion de la celda de referencia en linea seguida de la substraccion de la muestra del regulador. La constante de velocidad de disociacion aparente (kd), la constante de velocidad de asociacion aparente (ka) y la constante de equilibrio de disociacion aparente (KD) se calcularon usando el modelo de union de Langmuir uno a uno con el software de evaluacion BIAcore T100 version 1.1.
Tabla 3: segunda generacion de aglutinantes TNFalfa
Description
ID L929* kasociacion kdisociacion Kd FT-IR TM °C RF rendimiento**
EP1_min
1071 ND*** - - - - 2 '
EP6_min
673 ND*** 4,67E+04 4,94E-03 1,06E-07 50,2 35 '
EP15_min
1073 ND*** 1,57E+05 4,10E-02 2,62E-07 - 41,5 '
EP19_min
616 ND*** - - - - -
EP34_min
643 ND*** - - - - -
EP35 min
1075 ND*** - - - - 1 '
EP42_min
1076 ND*** 1,42E+05 8,35E-03 5,87E-08 - 3 '
EP43_min
705 ND*** 5,38E+03 2,98E-02 5,54E-06 70,2 30,0 '
EP1_max
1072 ND*** 1,11 E+04 6,30E-04 5,69E-08 - 44 '
EP6_max
674 1,1 2,84E+05 1,45E-04 5,12E-10 48,1 12 '
EP15_max
1074 0,39 1,53E+06 2,26E-03 1,48E-09 68,6 57,8 '
EP19_max
1007 0,6 2,25E+04 6,54E-05 2,91 E-09 53,5 52 '
EP34_max
791 10,5 5,86E+05 1,68E-05 2,86E-11 72,4 4,05 '
EP35_max
1089 5,20 7,72E+05 1,50E-04 1,94E-10 - 0,66 '
EP42_max
1077 ND*** 1,21 E+05 4,19E-04 3,46E-09 - 47,6 '
EP43_max
676 6,4 1,78E+05 4,48E-05 2,51 E-10 74,3 21,73 '
EP34min_C-His
790 0,2
EP19max C-His
789 1,9
*L929 [EC50-E105 / EC50-X], comparado en unidades de masa [ng/mL] en relacion con el rendimiento de ESBA105 (WO06/131013)
**(solucion de replegamiento en mg/L); *** No Determinado
10
Ejemplo 5: Injerto de CDR y humanizacion funcional de anticuerpos de donante de conejo anti-VEGF
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Ocho Rabmabs anti-VEGF (375, 435, 509, 511, 534, 567, 578 y 610) se seleccionaron para el injerto de CDR. A diferencia de los metodos de humanizacion tradicionales que emplean el marco aceptor de anticuerpo humano que comparte la mayor homologia de secuencia con el anticuerpo donante no humano, las CDR de conejo se injertaron en un marco aceptor humano FW1.4 (SEQ ID No: 1 y 2) que fue preseleccionado para propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad) usando un ensayo de control de calidad (WO0148017).
Se generaron varios injertos de CDR para cada uno de los RabMabs (anticuerpos de conejo) usando la metodologia descrita en este documento (vease el Ejemplo 4). Los injertos "Min" comprendieron un injerto minimo en el que solo las CDR de conejo se trasplantaron de los dominios VL y VH del anticuerpo donador de conejo al marco aceptor humano FW1.4 (SEQ ID NO: 1). Los injertos "Max" comprendieron no solo las CDR de conejo para VL y VH, sino tambien algunos residuos de marco adicionales del donante de conejo que se predijo que serian importantes para la union al antigeno. En el caso de 578max, la region marco de dominio variable de cadena pesada de FW1.4 tiene alteraciones de aminoacidos adicionales en las posiciones de Kabat 23H, 49H, 73H, 78H y 94H.
La Tabla 4 muestra un resumen de los datos de caracterizacion detallados para las variantes injertadas de CDR "Min" y "Max". Se describen su potencia como inhibidores de VEGF, que se mide usando ELISA de competicion de VEGFR y/o ensayo de HUVEC. Estos datos muestran que FW1.4 (SEQ ID No: 1 y 2) es un ejemplo de una region marco aceptor humano soluble y estable para injertar CDR de conejo.
Analisis de union con Biacore de scFv anti-VEGF
Se ensayo la capacidad de union a Biacore de scFv y se midio la afinidad de union usando el metodo de resonancia de plasmon de superficie a modo de ejemplo con BIAcoreMR-T100. Las proteinas VEGF, probadas para la union por estos candidatos scFv, en este ejemplo y ejemplos posteriores incluyen VEGF165 humano recombinante expresado en Escherichia coli purificado (PeproTech EC Ltd.), VEGF121 humano recombinante (PeproTech EC Ltd.), VEGF110 humano recombinante (ESBATech AG), VEGF164 murino recombinante (PeproTech EC Ltd.), VEGF164 de rata recombinante (Biovision), VEGF110 de conejo recombinante (ESBATech AG) y PLGF humano recombinante (PeproTech EC Ltd.). Para el experimento de resonancia de plasmon superficial, se activaron chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM4, GE Healthcare) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida y N- hidroxisuccinimida de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Cada una de las 6 formas diferentes de VEGF, como se ejemplifico anteriormente, se acoplaron a 1 de las 4 celdas de flujo diferentes en un chip sensor CM4 usando un procedimiento estandar de acoplamiento de amina. El intervalo de respuestas obtenidas con estas moleculas de VEGF inmovilizadas despues del acoplamiento y bloqueo fueron ~250-500 unidades de respuesta (RU) para hVEGF165, ~200 RU para hVEGFm, hVEGF121, VEGF164 murino, VEGF164 de rata y VEGF110 de conejo y ~400 RU para PLGF. La cuarta celda de flujo de cada chip se trato de manera similar, excepto que no se inmovilizaron proteinas antes del bloqueo, y la celda de flujo se uso como referencia en linea. Diversas concentraciones de scFv anti-VEGF (por ejemplo, 90 nM, 30 nM, 10 nM, 3,33 nM, 1,11 nM, 0,37 nM, 0,12 nM y 0,04 nM) en regulador HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M), EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005%) se inyectaron en las celulas de flujo a un caudal de 30 gl/min durante 5 minutos. La disociacion del scFv anti-VEGF del VEGF en el chip CM4 se dejo avanzar durante 10 min a 25°C. Se generaron los sensogramas para cada muestra de scFv anti-VEGF despues de la correccion de la celda de referencia en linea seguida de la substraccion de la muestra del regulador. La constante de velocidad de disociacion aparente (kd), la constante de velocidad de asociacion aparente (ka) y la constante de equilibrio de disociacion aparente (Kd) se calcularon usando el modelo de union Langmuir uno a uno con el software de evaluacion BIAcore T100 version 1.1.
Ensayo HUVEC de inhibicion de VEGF
El ensayo HUVEC es un metodo para medir la potencia de los candidatos de scFv anti-VEGF divulgados como inhibidores de VEGF.
Se usaron celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) (PromoCell), agrupadas de varios donantes, en el pase 2 al pase 14. Las celulas se sembraron a razon de 1.000 celulas/pozo en 50 gL de medio de crecimiento celular endotelial completo (ECGM) (PromoCell), que contenia 0,4% de ECGS/H, 2% de suero fetal bovino, 0,1 ng/mL de factor de crecimiento epidermico, 1 gg/mL de hidrocortisona, 1 ng/mL de factor fibroblastico basico y 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco). Siete a ocho horas mas tarde, se anadieron a las celulas 50 gL de medio de inanicion (ECGM sin suplementos que contenia 0,5% de FCS inactivado por calor y 1% de penicilina/estreptomicina) y las celulas fueron privadas de alimento durante 15 a 16 horas. Se prepararon diluciones en serie 3 veces de scFv anti-VEGF (0,023-150 nM) y uno de los siguientes VEGF165 humano recombinante (0,08 nM), VEGF164 de raton recombinante (0,08 nM), o VEGF164 de rata recombinante (0,3 nM) en medio de inanicion y se incubaron previamente durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. Las diferentes concentraciones de VEGF se usaron para compensar sus diferentes actividades biologicas relativas. Se usaron concentraciones que estimulan la proliferacion submaxima inducida por VEGF (EC90). Se anadieron 100 gL de las mezclas a las placas de cultivo de tejido de 96 pozos que contenian la suspension de HUVEC y se incubaron durante 4 dias en una incubadora humidificada con CO2 al 5%/37°C. La proliferacion de HUVEC se evaluo midiendo la absorbancia a 450 nm (620 nm utilizada como longitud de onda de referencia) despues de la adicion de 20 gL/pozo de reactivo de proliferacion celular WST-1 (Roche) usando un lector de microplacas Sunrise (Tecan). Los datos se analizaron usando un ajuste
de curva logistica de 4 parametros, y la concentracion de scFv anti-VEGF requerida para inhibir la proliferacion de HUVEC en un 50% (EC50) se derivo de las curvas de inhibicion.
Tabla 4
ID
Proteina No. Activdad relativa del comp. hVEGR2, ELISA (EC20Luc[nM]/EC50prueba[nM]) Activity relativa del comp. hVEGR1, ELISA (EC20Luc[nM]/EC50prueba[nM]) Mediciones por Biacore
hVEGF165
ka(1/Ms)
kd(1/s) Kd(M)
375 min
857 0,3 ND 9,27E+05 5,01 E-03 5,41 E-09
375- max
873 0,6 ND 2,44E+06 6,55E-03 2,68E-09
375- max C- His
877 0,4 ND 2,93E+05 8,75E-04 2,98E-09
509 min
854 1,0 2,9 6,23E+05 1,14E-03 1,82E-09
509- max
855 4,1 13 2,26E+06 2,72E-03 1,21 E-09
509- maxll
856 0,6 0,09 8,38E+05 2,82E-03 3,37E-09
511 - min
801 4,9 0,7 5,05E+05 1,28E-03 2,53E-09
511- max
802 8,7 8 6,59E+05 4,40E-05 6,67E-11
534min C- His
807 0,1 ND 2,71 E+05 9,21 E-03 3,41 E-08
534- max
793 1,1 ND 1,88E+06 1,73E-02 9,21 E-09
567 min
884 9,7 57 2,01 E+06 4,61 E-04 2,30E-10
567- max
874 4,1 15,7/54,5 1,20E+06 2,26E-04 1,88E-10
578 min
820 4,1 4,8 1,14E+06 1,03E-02 9,01 E-09
578- max
821 9,6 35,5/51,6 7,00E+05 3,07E-04 4,39E-10
5
10
15
20
25
ID
Proteina No. Activdad relativa del comp. hVEGR2, ELISA (EC20Luc[nM]/EC50prueba[nM]) Activity relativa del comp. hVEGR1, ELISA (EC20Luc[nM]/EC50prueba[nM]) Mediciones por Biacore
hVEGF165
ka(1/Ms)
kd(1/s) Kd(M)
610 min
882 0,1 ND 2,51 E+05 2,65E-03 1,06E-08
610- max
883 0,4 ND 5,09E+05 6,01 E-04 1,18E-09
435 min
944 ND ND ND ND ND
435- max
945 7,6 ND 1,67E+05 7,55E-04 4,53 E- 09
Equivalentes
Numerosas modificaciones y realizaciones alternativas de la presente invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica en vista de la descripcion anterior. En consecuencia, esta descripcion se debe considerar como ilustrativa solamente y tiene el proposito de ensenar a los expertos en la tecnica el mejor modo para llevar a cabo la presente invencion. Se pretende que la presente invencion se limite solo en la medida requerida por las reivindicaciones adjuntas y las normas de ley aplicables.
Listado de secuencias
<110> ESBATech AG
<120> Humanizacion de anticuerpos de conejo utilizando un marco de anticuerpos universal <130> Conversion de anticuerpos humanos en anticuerpos de conejo <160> 25
<170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 232 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> marco de cadena pesada variable de FW1.4 (a43)
<220>
<221 > CDR <222> (26)..(75)
<223> CDR1; al menos 3 y hasta 50 aminoacidos pueden estar presentes o ausentes; Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural
<220>
<221 > CDR
<222> (90)..(139)
10
<223> CDR2; al menos 3 y hasta 50 aminoacidos pueden estar presentes o ausentes; Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural
<220>
<221 > CDR
<222> (172)..(221)
<223> CDR3; al menos 3 y hasta 50 aminoacidos pueden estar presentes o ausentes; Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural
<400> 1

Glu val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa xaa 20 25 30

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 35 40 45

xaa xaa Xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa 50 55 60

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Trp val Arg Gin Ala 65 70 75 80

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95

xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa xaa xaa Xaa xaa xaa 100 105 110
xaa
xaa
Xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa Xaa
xaa
xaa
xaa
115 120 125
xaa
xaa
Xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa Arg Phe Thr lie Ser
130 135 140
Arg Asp Asn
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg
145
150 155 160
Ala
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys Ala Lys xaa xaa xaa xaa Xaa
165 170 175
xaa
xaa
xaa
xaa
Xaa
xaa
xaa
xaa
xaa
xaa
xaa
xaa
xaa
xaa
xaa
xaa
180 185 190
xaa
xaa
xaa
xaa
xaa
xaa
xaa
xaa
Xaa xaa xaa xaa xaa Xaa
xaa
xaa
195 200 205
Xaa
xaa Xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa Xaa Trp Gly Gin
210 215 220

Gly Thr Leu val Thr val Ser ser 225 230
<210>2 <211> 231
<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> marco de cadena liviana variable de FW1.4(KI27)
5 <220>
<221 > CDR <222> (24)..(73)
<223> CDR1; al menos 3 y hasta 50 aminoacidos pueden estar presentes o ausentes; Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural
10 <220>
<221 > CDR
<222> (89)..(138)
<223> CDR2; al menos 3 y hasta 50 aminoacidos pueden estar presentes o ausentes; Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural
15 <220>
<221 > CDR
<222> (171)..(220)
<223> CDR3; al menos 3 y hasta 50 aminoacidos pueden estar presentes o ausentes; Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural
20 <400>2
Glu
lie val Met Thr Gin Ser Pro ser Thr Leu Ser Ala Ser val Gly
1
5 10 15
Q. <
Arg val lie lie Thr Cys xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa Xaa
20 25' - - 30

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 35 40 45

Xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa 50 55 60

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 65 70 75 80

Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 85 90 95

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 100 105 110

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 115 120 125

xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa xaa Gly val Pro Ser Arg Phe 130 135 140

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 145 150 155 160

Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys xaa xaa xaa xaa xaa xaa 165 170 175

xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 180 185 190

xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 195 200 205

Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa Xaa Xaa xaa xaa Phe Gly Gin Gly 210 215 220

Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230
<210>3 <211> 483 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> marco de FW1.4 <220>
<221 > CDR 10 <222> (24)..(73)
<223> LCDR1; al menos 3 y hasta 50 aminoacidos pueden estar presentes o ausentes; Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural
5
10
15
20
25
<221 > CDR <222> (89)..(138)
<223> LCDR2; al menos 3 y hasta 50 aminoacidos pueden estar presentes o ausentes; Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural
<220>
<221 > CDR
<222> (171)..(220)
<223> LCDR3; al menos 3 y hasta 50 aminoacidos pueden estar presentes o ausentes; Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural
<220>
<221 > CDR
<222> (277)..(326)
<223> HCDR1; al menos 3 y hasta 50 aminoacidos pueden estar presentes o ausentes; Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural
<220>
<221 > CDR
<222> (341)..(390)
<223> HCDR2; al menos 3 y hasta 50 aminoacidos pueden estar presentes o ausentes; Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural
<220>
<221 > CDR
<222> (423) .. (472)
<223> HCDR3; al menos 3 y hasta 50 aminoacidos pueden estar presentes o ausentes; Xaa puede ser cualquier aminoacido de origen natural
<400>3

Claims (47)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un marco aceptor para injertar CDR de lagomorfo que comprende un marco de cadena pesada variable humana que tiene al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO. 4 y que comprende treonina (T) en la posicion 24, alanina (A) o glicina (G) en la posicion 56, treonina (T) en la posicion 84, valina (V) en la posicion 89 y arginina (R) en la posicion 108 (numeracion de AHo).
  2. 2. El marco aceptor de la reivindicacion 1, en el que el marco de cadena pesada variable se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 6.
  3. 3. El marco aceptor de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas un marco de cadena ligera variable que tiene al menos un 85% de identidad con la SEQ ID NO. 2.
  4. 4. El marco aceptor de la reivindicacion 3, que comprende una treonina (T) en la posicion 87 del marco de cadena ligera variable (numeracion de AHo).
  5. 5. El marco aceptor de la reivindicacion 3, que comprende ademas CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de un polipeptido de union a antigeno de lagomorfo donador.
  6. 6. El marco aceptor de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el marco de cadena pesada variable y el marco de cadena ligera variable estan unidos a traves de un enlazador de la SEQ ID NO.8.
  7. 7. El marco aceptor de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un marco que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID NO.3, la SEQ ID NO.5 o la SEQ ID NO. 7.
  8. 8. Un marco aceptor de cadena pesada variable humano o humanizado para injertar CDR que comprende al menos cuatro aminoacidos del grupo que consiste en treonina (T) en la posicion 24, valina (V) en la posicion 25, alanina (A) o glicina (G) en la posicion 56, lisina (K) en la posicion 82, treonina (T) en la posicion 84, valina (V) en la posicion 89 y arginina (R) en la posicion 108 (numeracion de AHo), en el que el marco aceptor tiene al menos 95% de identidad con la SEQ ID NO. 4.
  9. 9. El marco aceptor de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el aminoacido en la posicion 12, 103 y/o 144 (numeracion de AHo) se sustituyo frente a un aminoacido hidrofilico.
  10. 10. El marco aceptor de la reivindicacion 9, que tiene
    (a) serina (S) en la posicion 12,
    (b) serina (S) o treonina (T) en la posicion 103 y/o
    (c) serina (S) o treonina (T) en la posicion 144 (numeracion de AHo) en el marco de cadena pesada variable.
  11. 11. El marco aceptor de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene acido glutamico (E) en la posicion 1, valina (V) en la posicion 3, leucina (L) en la posicion 4, serina (S) en la posicion 10; arginina (R) en la posicion 47, serina (S) en la posicion 57, fenilalanina (F) en la posicion 91 y/o valina (V) en la posicion 103 en el marco de la cadena ligera variable (numeracion de AHo).
  12. 12. El marco aceptor de la reivindicacion 11, que comprende ademas residuos del marco de donantes implicados en la union al antigeno.
  13. 13. El marco aceptor de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas glicina (G) en la posicion 141 de la cadena pesada variable (numeracion de AHo).
  14. 14. Uso del marco aceptor de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para el injerto de CDR de lagomorfos.
  15. 15. Un polipeptido de union a antigeno, que comprende el marco aceptor de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
  16. 16. El polipeptido de union a antigeno de la reivindicacion 15, que es un anticuerpo de scFv.
  17. 17. El polipeptido de union a antigeno de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16 que comprende ademas una o mas moleculas unidas, en particular un agente terapeutico tal como un agente citotoxico, una citoquina, una quimioquina, un factor de crecimiento u otra molecula de senalizacion, un agente de formacion de imagenes o una segunda proteina, en particular un activador transcripcional o un dominio de union a ADN.
  18. 18. El polipeptido de union a antigeno de cualquiera de las reivindicaciones 15-17 para uso en aplicaciones de diagnostico, aplicaciones terapeuticas, validacion de objetivo o terapia genica.
  19. 19. Un acido nucleico, en particular un acido nucleico aislado, que codifica el marco aceptor de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o el polipeptido de union a antigeno de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17.
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  20. 20. Un vector que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 19.
  21. 21. Una celula huesped que comprende el vector de la reivindicacion 20.
  22. 22. El acido nucleico de la reivindicacion 19 o el vector de la reivindicacion 20 para uso en terapia genica.
  23. 23. Una composicion que comprende el marco aceptor de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el polipeptido de union a antigeno de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, el acido nucleico de la reivindicacion 19 o el vector de la reivindicacion 20.
  24. 24. Un metodo para humanizar un polipeptido de union a antigeno de conejo, el polipeptido de union a antigeno de conejo que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y/o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, comprendiendo el metodo:
    (i) injertar al menos una CDR de cadena pesada del grupo que consiste en secuencias de CDR H1, CDR H2 y CDR H3 en un marco de cadena pesada variable humana que tiene al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO. 4, que comprende ademas al menos seis aminoacidos del grupo que consiste en treonina (T) en la posicion 24, valina (V) en la posicion 25, alanina (A) o glicina (G) en la posicion 56, lisina (K) en la posicion 82 , treonina (T) en la posicion 84, valina (V) en la posicion 89 y arginina (R) en la posicion 108 (numeracion de AHo), y
    (ii) injertar al menos una CDR de cadena ligera del grupo que consiste en secuencias de CDR L1, CDR L2 y CDR L3 en un marco aceptor de cadena ligera variable humana, teniendo la estructura de cadena ligera variable humana al menos un 85% de identidad con la SEQ ID NO: 2.
  25. 25. El metodo de la reivindicacion 24 en el que
    (i) el marco de la cadena pesada variable humana comprende la secuencia de aminoacidos del marco de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6; y
    (ii) el marco de cadena ligera variable humana comprende la secuencia de aminoacidos del marco de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 9.
  26. 26. El metodo de la reivindicacion 24 o 25, que comprende adicionalmente sustituir residuos del marco por residuos del marco del polipeptido de union al antigeno de conejo que esta implicado en la union al antigeno.
  27. 27. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, que comprende ademas la etapa de sustituir un residuo del marco del marco aceptor de cadena pesada variable con una sustitucion a en al menos una de las posiciones amino de la cadena pesada 12, 103 y 144 (numeracion de AHo), en particular sustituyendo contra un aminoacido hidrofilico, preferiblemente por una sustitucion seleccionada del grupo que consiste en: (a) serina (S) en la posicion 12; (b) treonina (T) en la posicion 103; y (c) treonina (T) en la posicion 144.
  28. 28. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 24-27, que comprende ademas sustituir un residuo del marco del marco aceptor de cadena ligera variable con una sustitucion potenciadora de la estabilidad en al menos una de las posiciones 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91 y 103 de la region variable de cadena ligera de acuerdo con el sistema de numeracion de AHo, en particular con una sustitucion seleccionada del grupo que consiste en (a) acido glutamico (E) en la posicion 1, (b) valina (V) en la posicion 3, ( c) leucina (L) en la posicion 4; (d) serina (S) en la posicion 10; (e) arginina (R) en la posicion 47; (e) serina (S) en la posicion 57; (f) fenilalanina (F) en la posicion 91; y (g) valina (V) en la posicion 103.
  29. 29. Un polipeptido de union a antigeno humanizado de acuerdo con el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 24-28.
  30. 30. El polipeptido de union a antigeno de la reivindicacion 29, en el que el antigeno objetivo es VEGF o TNFa.
  31. 31. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en el que el metodo comprende ademas la identificacion de las CDR del donador de un dominio variable de anticuerpo generado por las celulas B de acuerdo con las etapas de
    a) incubar celulas B de conejo con un antigeno objetivo;
    b) seleccionar aquellas celulas B que se unen al antigeno objetivo; y
    c) Identificar las CDR del dominio variable de anticuerpo generado por las celulas B.
  32. 32. El metodo de la reivindicacion 31, en el que dichas celulas B se aislan de un conejo que se inmuniza contra dicho antigeno objetivo, preferiblemente mediante vacunacion con ADN.
  33. 33. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 31 o 32, en el que las celulas B y el antigeno objetivo se tinen de forma diferente y la concurrencia de las dos tinciones se selecciona positivamente mediante citometria de flujo basada en la clasificacion de celulas individuales.
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  34. 34. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 31-33, en el que el antigeno objetivo es una proteina soluble.
  35. 35. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 31-33, en el que el antigeno objetivo se expresa en la superficie de una celula, en particular en el que el antigeno objetivo es una proteina transmembrana, en particular una proteina que abarca multiples membranas.
  36. 36. El metodo de la reivindicacion 35, en el que el antigeno objetivo se tine indirectamente mediante tincion de la celula que expresa el antigeno objetivo con un colorante fluorescente intracelular.
  37. 37. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 31-36, en el que las celulas B se tinen con uno o mas anticuerpos marcados que son especificos para marcadores de superficie de celulas B.
  38. 38. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 31-37, en el que las celulas B se tinen con anticuerpos anti-IgG marcados.
  39. 39. El metodo de la reivindicacion 38, en el que las celulas B se tinen con anticuerpos anti-IgG marcados y con anticuerpos anti-IgM marcados de manera diferente.
  40. 40. El metodo de la reivindicacion 39, en el que dichas celulas B que se tinen con anticuerpos anti-IgM marcados se seleccionan negativamente.
  41. 41. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 31-40, que comprende ademas la etapa de cultivar dichas celulas B seleccionadas en la etapa b) de la reivindicacion 31, de modo que los anticuerpos generados se secretan en el medio de cultivo, en particular en presencia de una linea celular auxiliar.
  42. 42. El metodo de cualquiera de la reivindicacion 41, que comprende ademas la etapa de analizar dichos anticuerpos secretados para union especifica al antigeno objetivo.
  43. 43. El metodo de la reivindicacion 42, en el que las CDR de dichos anticuerpos se amplifican, en particular por RT- PCR, y se injertan en un marco aceptor para producir un polipeptido de union a antigeno que se analiza posteriormente para la union especifica al antigeno objetivo.
  44. 44. Uso de un marco aceptor de cadena pesada variable humana que comprende una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO. 4, que comprende ademas al menos seis aminoacidos del grupo que consiste en treonina (T) en la posicion 24, valina (V) en la posicion 25, alanina (A) o glicina (G) en la posicion 56, lisina (K) en la posicion 82 , treonina (T) en la posicion 84, valina (V) en la posicion 89 y arginina (R) en la posicion 108 (numeracion de AHo), y un marco aceptor de cadena ligera variable humana que comprende una secuencia que tiene al menos un 85% de identidad con la SEQ ID NO. 2, para el injerto de CDR de conejo.
  45. 45. El uso de la reivindicacion 44, en el que el marco comprende la SEQ ID NO. 1 y la SEQ ID NO. 2, ambas conectadas mediante un enlazador que tiene la SEQ ID NO. 8.
  46. 46. Una composicion farmaceutica que comprende el polipeptido de union a antigeno de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, formulado para administracion topica, oral, nasal, intracerebro-espinal, rectal o parenteral.
  47. 47. Una formulacion que comprende un marco aceptor de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o el polipeptido de union a antigeno de la reivindicacion 29 o 30, para uso como medicamento, caracterizada porque la composicion se administra por via intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutanea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, topica o por inhalacion.
    Kabat Chothia
    Definicion de ESBATech
    f
    Chothia
    r
    ._____________________________A_
    imagen1
    Ka bat
    A
    25 26 27 28 29 30 31 * * * * 32 33 34 35 35a 35b 36
    25 26 27 28 29 30 31 31a 31b 32 33 34 35 * * * * 36
    V,______________________________________________________________>
    imagen2
    6
    imagen3
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    Figura 3A
    imagen5
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    anti-IgM-FITC FITC-A
    Figura 3B
    Figura 3C
    imagen6
    inntif r i i him]—r-mnnpr- 102 IQ3 10* 10s
    Celulas clasificadas
    ■
    Celulas de union a 903
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    ■0 3 a *S
    10 10 10 10
    903biot-PerCP PerCP-Cy5-5-A
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    JO 103 150 200 250
    FSC-A
    Especimen 001-CHO TNF +
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    FSC-A t DD°5
    Especimen 001-CHCitS + a
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    FSC-A
    Figura 6
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