ES2843974T3 - Anticuerpos anti-TNF alfa y fragmentos funcionales de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo capaz de unirse al factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) humano, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional comprende (i) un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24 y (ii) un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 21.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-TNF alfa y fragmentos funcionales de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpos y fragmentos funcionales de las mismas, capaces de unirse al factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), a los procedimientos para su producción y a sus usos terapéuticos. Antecedentes

El TNFa es una citocina proinflamatoria homotrimérica que es liberada e interactúa con las células del sistema inmunológico. También se ha demostrado que el TNFa está regulado por aumento en varias enfermedades humanas, incluyendo enfermedades crónicas, tales como artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y esclerosis múltiple.

Se han propuesto anticuerpos contra TNFa para la profilaxis y el tratamiento del choque endotóxico (Beutler y col., Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer y col., (Critical Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) y Wherry y col., (Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993) discuten el potencial terapéutico de los anticuerpos anti-TNFa en el tratamiento del choque séptico. El uso de anticuerpos anti-TNFa en el tratamiento del choque séptico también se trata en Kirschenbaum y col., (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998). La artritis inducida por colágeno se puede tratar eficazmente utilizando un anticuerpo monoclonal anti-TNFa (Williams y col. (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).

El uso de anticuerpos anti-TNFa en el tratamiento de la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn se analiza en Feldman y col. (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini y col. (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) y en Feldman y col. (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Los anticuerpos contra TNFa utilizados previamente en tales tratamientos son generalmente anticuerpos quiméricos, tales como los descritos en la patente de Estados Unidos N.° 5.919.452.

Se han descrito en la técnica anterior anticuerpos monoclonales contra TNFa. Meager y col. (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) describen anticuerpos monoclonales murinos contra TNFa recombinante. Fendly y col. (Hybridoma, 6, 359­ 370, 1987) describen el uso de anticuerpos monoclonales murinos contra TNFa recombinante en la definición de epítopos neutralizantes en TNF. Adicionalmente, en la Solicitud de Patente Internacional WO 92/11383, se desvelan anticuerpos recombinantes, incluyendo anticuerpos injertados con CDR, específicos para TNFa. Rankin y col. (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) describen el uso de tales anticuerpos injertados con CDR en el tratamiento de la artritis reumatoide. La patente de Estados Unidos N.° 5.919.452 desvela anticuerpos quiméricos anti-TNFa y su uso en el tratamiento de patologías asociadas con la presencia de TNFa. Se desvelan otros anticuerpos anti-TNFa en Stephens y col. (Immunology, 85, 668-674, 1995), documentos GB-A-2246 570, GB-A-2 297 145, US 8.673.310, US 2014/0193400, EP 2390267 B1, US 8.293.235, US 8.697.074, WO 2009/155723 A2 y WO 2006/131013 A2.

Las moléculas de anticuerpo anti-TNFa recombinantes de la técnica anterior generalmente tienen una afinidad reducida por el TNFa en comparación con los anticuerpos de los que derivan las regiones hipervariables o CDR. Todos los inhibidores de TNFa comercializados actualmente se administran por vía intravenosa o subcutánea en intervalos semanales o más largos como inyecciones en bolo, que dan como resultado altas concentraciones iniciales que están disminuyendo constantemente hasta la próxima inyección.

Los productos bioterapéuticos anti-TNFa actualmente aprobados incluyen (i) infliximab, un anticuerpo monoclonal antihumano IgG quimérico (Remicade®); (ii) etanercept, una proteína de fusión dimérica TNFR2, con un Fc IgG1 (Enbrel®); (iii) adalimumab, un anticuerpo monoclonal (mAb) completamente humano (Humira®) y (iv) certolizumab, un fragmento Fab PEGilado (Cimzia®). Sin embargo, se están desarrollando varios biosimilares y ya se ha aprobado en Europa un imitador del infliximab conocido como Remsima.

Infliximab tiene una afinidad relativamente baja por TNFa (K^d > 0,2 nM; Weir y col., 2006, Therapy 3:535) y una potencia de neutralización limitada en un ensayo L929. Además, infliximab no muestra sustancialmente reactividad cruzada con TNFa de monos Cynomolgus o Rhesus. Para anticuerpos anti-TNFa, sin embargo, la reactividad cruzada con TNFa de monos es muy deseable, ya que esto permite pruebas en animales con primates, que reflejan la situación en seres humanos en muchos aspectos.

Etanercept, aunque es una molécula bivalente, se une al TNFa en una proporción de un trímero por una molécula de etanercept, impidiendo la formación de grandes complejos antígeno-bioterapéuticos (Wallis, 2008, Lancet Infect Dis 8: 601). No inhibe la secreción de citocinas inducida por LPS en monocitos (Kirchner y col., 2004, Cytokine 28: 67). La potencia del adalimumab es similar a la del infliximab. Otra desventaja del adalimumab es su escasa estabilidad, por ejemplo, según se determina en una prueba de desplegamiento térmico. Se determinó que la temperatura de fusión (T^m) del adalimumab en tal prueba era de 67,5 °C. Cuanto menor sea el valor de T^m de un anticuerpo, sin embargo, menor es su estabilidad general. Una T^m más baja hace que los anticuerpos sean menos adecuados para uso farmacéutico, por ejemplo para administración oral.

La potencia del certolizumab es ligeramente mayor que la del infliximab, pero aún no satisfactoria. Certolizumab no inhibe la proliferación de linfocitos T en un MLR (Vos y col., 2011, Gastroenterology 140: 221).

El documento EP 2623515 A1 desvela anticuerpos anti-TNFa y fragmentos de unión a antígeno (Fab) de los mismos, en los que la potencia de los fragmentos Fab humanizados resultantes es comparable o solo ligeramente mejor que la del infliximab en un ensayo de neutralización de L929 y la reactividad cruzada del anticuerpo se une débilmente al TNFa de Rhesus.

El documento WO 2012/007880 A2 desvela una molécula de unión a antígeno de dominio único modificada (SDAB) en forma de proteínas de fusión que comprenden uno o más dominios de unión a antígeno únicos que se unen a una o más dianas (por ejemplo, TNFa, un enlazador y una o más moléculas de polímero).

El documento WO 2015/144852 A1 investiga las propiedades de un scFv anti-TNFa denominado "scFv1". Este scFv mostró una capacidad de neutralización de TNFa en un ensayo de células PK-15 que era comparable a la del infliximab.

El documento WO 2015/065987 A1 describe anticuerpos anti-TNFa, anticuerpos anti-IL-6 y anticuerpos biespecíficos que se unen a ambos antígenos. Ciertos anticuerpos anti-TNFa mostraron cierta reactividad cruzada con TNFa de Cynomolgus.

En "Infliximab (Remicade)", Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH, Weinheim, páginas 885-904, M. Wiekowski y col. resumen las características de infliximab, también conocido como Remicade.

En "Adalimumab (Humira)", Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH, Weinheim, páginas 697-732, H. Kupper y col. resumen la información sobre el anticuerpo aprobado adalimumab.

Melmed Gil Y. y col. describen en "Certolizumab pegol", Nature Reviews. Drug Discovery, Nature Publishing Group, Reino Unido, vol. 7, n.° 8, 2008, páginas 641-642, el fragmento de anticuerpo pegilado certolizumab pegol.

M. Sohini y col. resumen en "Golimumab", MABS, Landes Bioscience, EE.UU., vo. 1, n.° 5, 2009, páginas 422-431, datos sobre el anticuerpo golimumab. Golimumab es un anticuerpo de alta afinidad, caracterizado por una KD de aproximadamente 17 pM.

La publicación científica "CDP571: anti-TNF monoclonal antibody, BAY 103356, BAY W 3356, Humicade2, Drugs in R & D, ADIS International, Auckland, Nueva Zelanda, vol. 4, n.° 3, 2003, páginas 174-178 se refieren al anticuerpo humanizado "Humicade" (CDP 571; BAY 103356), un anticuerpo monoclonal anti-TNFa con alta afinidad.

Existe la necesidad de moléculas de anticuerpos mejoradas para tratar enfermedades inflamatorias crónicas tales como trastornos inflamatorios del intestino. Las moléculas de anticuerpo deben tener al menos (i) una alta afinidad por el TNFa humano (es decir, una Kd < 100 pM), (ii) una alta potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa en células L929, (iii) afinidad sustancial por el TNFa de Cynomolgus y Rhesus (por ejemplo, una K^d < 1 nM) y (iv) una temperatura de fusión alta del dominio variable determinada en un experimento de desplegamiento térmico (por ejemplo, una Tm > 70 °C).

Sumario de la invención

Los inventores de la presente solicitud encontraron que ciertos anticuerpos anti-TNFa y fragmentos funcionales de los mismos exhiben una combinación de propiedades favorables, incluyendo alta afinidad por el TNFa humano (Kd < 100 pM), una potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa en células L929 mayor que la de infliximab y una afinidad sustancial (K^d < 1 nM) por TNFa de animales tales como el mono Cynomolgus (Macaca fascicularis) y/o macacos Rhesus (Macaca mulatta). Además, los anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos eran específicos para TNFa en el sentido de que no se unían significativamente a TNFp y exhibían una estabilidad significativa, según se determina en un ensayo de desplegamiento térmico del dominio variable.

La invención proporciona moléculas de anticuerpos y fragmentos funcionales de las mismas.

Por lo tanto, la presente invención se refiere al objeto definido en los siguientes puntos (1) a (41):

(1) Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo capaz de unirse al factor de necrosis tumoral alfa humano (TNFa), en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende (i) un dominio Vl que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 22 y SEQ ID NO: 24 y (ii) un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 21.

(2) El anticuerpo o fragmento funcional del punto (1), en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo se une específicamente al TNFa humano.

(3) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo no se une significativamente a TNFp.

(4) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional

(i) se une al TNFa humano con una constante de disociación (Kd) de menos de 100 pM;

(ii) tiene reactividad cruzada con TNFa de Macaca mulatta y con TNFa de Macaca fascicularis;

(iii) tiene una mayor potencia que infliximab, según se determina mediante un ensayo L929; y/o

(iv) es capaz de unirse al TNFajrímero humano en una estequiometría (anticuerpo: TNFajrímero) de al menos 2. (5) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, que se une al TNFa humano con una K^d de menos de 75 pM.

(6) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, que se une al TNFa de Macaca mulatta con una Kd de menos de 1 nM.

(7) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, que se une al TNFa de Macaca fascicularis con una KD de menos de 1 nM.

(8) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que la potencia del anticuerpo o fragmento funcional para inhibir la apoptosis inducida por TNFa en relación con la de infliximab (potencia relativa), determinada en un ensayo L929, es mayor que 5, y en el que dicha potencia relativa es la relación entre el valor de CI⁵⁰ en ng/ml de infliximab en el ensayo L929 y el valor de CI⁵⁰ en ng/ml del anticuerpo en formato scFv en el ensayo L929.

(9) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que la temperatura de fusión del dominio variable del anticuerpo en formato scFv, determinada por fluorimetría diferencial de barrido, es de al menos 65 °C.

(10) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que la temperatura de fusión del dominio variable del anticuerpo en formato scFv, determinada por fluorimetría diferencial de barrido, es de al menos 70 °C.

(11) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que la temperatura de fusión, determinada por fluorimetría diferencial de barrido, es de al menos 75 °C.

(12) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que la pérdida en el contenido de monómero, después de cinco ciclos consecutivos de congelación-descongelación, es de menos del 0,2 %.

(13) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que la pérdida en el contenido de monómero, después del almacenamiento durante cuatro semanas a 4 °C, es de menos del 1 %. (14) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que la potencia del anticuerpo o fragmento funcional para bloquear la interacción entre el TNFa humano y el receptor I de TNF (TNFRI), relativa a la del infliximab (potencia relativa), según se determina en un ELISA de inhibición, es al menos 1,3, en el que dicha potencia relativa es la relación entre el valor de CI⁵⁰ en ng/ml de infliximab y el valor de CI⁵⁰ en ng/ml del anticuerpo en formato scFv.

(15) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, en el que la potencia del anticuerpo o fragmento funcional para bloquear la interacción entre el TNFa humano y el receptor II del TNF (TNFRII), relativa a la del infliximab (potencia relativa), según se determina en un ELISA de inhibición, es al menos 1,3, en el que dicha potencia relativa es la relación entre el valor de CI⁵⁰ en ng/ml de infliximab y el valor de CI⁵⁰ en ng/ml del anticuerpo en formato scFv.

(16) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, que es capaz de inhibir la proliferación celular de células mononucleares de sangre periférica en una reacción mixta de linfocitos.

(17) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, que es capaz de inhibir la secreción de interleucina-1p inducida por LPS a partir de monocitos CD14+.

(18) El anticuerpo o fragmento funcional del punto (17), en el que el valor de CI⁵⁰ para inhibir la secreción de interleucina-1p inducida por LPS es inferior a 1 nM.

(19) El anticuerpo o fragmento funcional del punto (18), en el que dicho valor de CI⁵⁰ para inhibir la secreción de interleucina-1p inducida por LPS, sobre una base molar, es menor que el de adilumumab.

(20) El anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores, que es capaz de inhibir la secreción de TNFa inducida por LPS a partir de monocitos CD14+.

(21) El anticuerpo o fragmento funcional del punto (20), en el que el valor de CI⁵⁰ para inhibir la secreción de TNFa inducida por LPS es inferior a 1 nM.

(22) El anticuerpo o fragmento funcional del punto (21), en el que dicho valor de CI⁵⁰ para inhibir la secreción de TNFa inducida por LPS, sobre una base molar, es menor que el de adalimumab.

(23) El anticuerpo de uno cualquiera de los puntos anteriores, que es una inmunoglobulina G (IgG).

(24) El fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos (1) a (22), que es un fragmento variable monocatenario (scFv).

(25) El fragmento funcional del punto (24), en el que dicho scFv comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 27.

(26) El fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos (1) a (22), que es un diacuerpo.

(27) Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos anteriores.

(28) Un vector o plásmido que comprende el ácido nucleico del punto (27).

(29) Una célula que comprende el ácido nucleico del punto (27) o el vector o plásmido del punto (28).

(30) Un procedimiento para preparar el anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos (1) a (26), que comprende cultivar la célula del punto (29) en un medio en condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento funcional y recuperar el anticuerpo o fragmento funcional de las células o del medio.

(31) Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento funcional de uno cualquiera de los puntos (1) a (26) y, opcionalmente, un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

(32) El anticuerpo o fragmento funcional como se define en uno cualquiera de los puntos (1) a (26) para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno inflamatorio o un trastorno relacionado con TNFa.

(33) El anticuerpo o fragmento funcional para su uso según el punto (32), en el que dicho trastorno inflamatorio o trastorno relacionado con TNFa se selecciona de la lista de trastornos y enfermedades enumerados en la sección "Trastornos a tratar" a continuación.

(34) El anticuerpo o fragmento funcional para su uso según el punto (32), en el que dicho trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal.

(35) El anticuerpo o fragmento funcional para su uso según el punto (34), en el que dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal.

(36) El anticuerpo o fragmento funcional para su uso según el punto (34) o (35), en el que dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es la enfermedad de Crohn.

(37) El anticuerpo o fragmento funcional para su uso según el punto (36), en el que dicha enfermedad de Crohn se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Crohn ileal, colónica, ileocolónica y/o aislada superior (gástrica, duodenal y/o yeyunal) e incluyendo comportamiento de enfermedad sin estrechamiento/no penetrante, con estrechamiento, penetrante y perianal, permitiendo cualquier combinación de localización y comportamiento de enfermedad de cualquiera de los mencionados anteriormente.

(38) El anticuerpo o fragmento funcional para su uso según el punto (34) o (35), en el que dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es colitis ulcerosa.

(39) El anticuerpo o fragmento funcional para su uso según el punto (38), en el que dicha colitis ulcerosa se selecciona del grupo que consiste en proctitis ulcerosa, proctosigmoiditis, colitis del lado izquierdo, colitis panulcerosa y reservoritis.

(40) El anticuerpo o fragmento funcional para su uso según el punto (34) o (35), en el que dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es colitis microscópica.

(41) El anticuerpo o fragmento funcional para su uso según cualquiera de los puntos (32) a (40), en el que dicho procedimiento comprende la administración oral del anticuerpo o fragmento funcional a un sujeto.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Representación esquemática del procedimiento de humanización.

Figura 2: Cromatogramas SE-HPLC de preparaciones de scFv humanizado purificado de scFv. El monómero scFv eluye en tiempos de retención entre 8,4 y 9,5 minutos, mientras que los componentes del tampón eluyen a > 10min. Todos los picos desde el volumen muerto de la columna hasta el monómero scFv respectivo se integraron como agregados/oligómeros y se usaron para el cálculo del área relativa del pico.

Figura 3: Curvas de desplegamiento térmico de las mediciones de DSF de tres construcciones de scFv. Para cada construcción se muestran medidas duplicadas. Los valores de Tm resultantes se han determinado ajustando los datos a una ecuación de Boltzmann para obtener el punto medio de la transición.

Figura 4: Transcurso del tiempo del contenido de monómero de las tres construcciones de scFv durante el almacenamiento. El contenido de monómero determinado por SE-HPLC se ha representado para las temperaturas de almacenamiento 4, -20 y <-65 °C durante 4 semanas.

Figura 5: Superposición de cromatogramas SE-HPLC para tres moléculas scFv. Para cada scFv, se muestra la muestra (10 mg/ml) al d0 y después del almacenamiento durante 4 semanas a 4 °C. Además, se muestra el cromatograma de la muestra después de 5 ciclos de congelación y descongelación. El panel insertado muestra una ampliación de aproximadamente 15 veces del eje y de cada molécula para visualizar también cambios minúsculos en el contenido de oligómeros.

Figura 6: Evolución temporal del contenido de monómeros de los scFv humanizados durante el almacenamiento. El contenido de monómero determinado por SE-HPLC se ha representado gráficamente para las muestras de 10 mg/ml a una temperatura de almacenamiento de 37 °C durante 4 semanas.

Figura 7: Potencia para neutralizar el TNFa humano en el ensayo L929 de tres scFv. Se muestran las curvas de dosis-respuesta para los scFv y el anticuerpo de referencia infliximab para cada experimento. Las concentraciones más altas de scFv e infliximab, así como los controles negativos, se establecieron en 100 % y 0 % de crecimiento.

Figura 8: Potencia de dos scFv para neutralizar el TNFa de primates no humanos y humano en el ensayo L929. Se muestran las curvas de dosis-respuesta para la neutralización de TNFa humano, del mono Cynomolgus y del mono Rhesus. La concentración más alta de scFv y los controles negativos se establecieron en 100 % y 0 % de crecimiento.

Figura 9: Potencia de dos scFv para bloquear la interacción TNFa-TNFRI. Se muestran las curvas dosisrespuesta. La concentración más alta de scFv y los controles negativos se establecieron en 0% y 100% de unión de TNFa a TNFRI.

Figura 10: Potencia de dos scFv para bloquear la interacción TNFa-TNFRII. Se muestran las curvas dosisrespuesta. La concentración más alta de scFv y los controles negativos se establecieron en 0% y 100% de unión de TNFa a TNFRII.

Figura 11: Especificidad diana de un scFv. El potencial para inhibir la interacción de TNFa biotinilado con scFv por TNFa y TNFp se analizó mediante ELISA de competición. Se muestran los efectos dependientes de la dosis de TNFa y TNFp.

La figura 12 representa la formación de complejos 17-22-B03-scFv:TNFa determinados mediante SE-HPLC (Ejemplo 4).

Descripción detallada

La presente invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo capaz de unirse al TNFa humano, como se define en las reivindicaciones.

En el contexto de la presente solicitud, el término "anticuerpo" se utiliza como sinónimo de "inmunoglobulina" (Ig), que se define como una proteína perteneciente a la clase IgG, IgM, IgE, IgA o IgD (o cualquier subclase de las mismas) e incluye todos los anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos conocidos convencionalmente. En el contexto de la presente invención, un "fragmento funcional" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define como un fragmento de unión a antígeno u otro derivado de un anticuerpo parental que esencialmente mantiene una o más de las propiedades de dicho anticuerpo parental mencionado en los puntos (1) a (26) del presente documento anteriormente. Un "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define como un fragmento (por ejemplo, una región variable de una IgG) que retiene la región de unión a antígeno. Una "región de unión a antígeno" de un anticuerpo se encuentra típicamente en una o más regiones hipervariables de un anticuerpo, es decir, las regiones CDR-1, 2 y/o 3. Los "fragmentos de unión a antígeno" de la invención incluyen el dominio de un fragmento F(ab')² y un fragmento Fab. Los "fragmentos funcionales" de la invención incluyen, scFv, dsFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y proteínas de fusión Fc. El F(ab')² o Fab puede someterse a ingeniería para minimizar o eliminar completamente las interacciones disulfuro intermoleculares que se producen entre los dominios CH1 y CL. Los anticuerpos o fragmentos funcionales de la presente invención pueden ser parte de construcciones bi o multifuncionales.

Los fragmentos funcionales preferidos en la presente invención son scFv y diacuerpos.

Un scFv es un fragmento Fv de cadena sencilla en el que los dominios variable ligero ("Vl") y variable pesado ("Vh") están unidos por un puente peptídico.

Un diacuerpo es un dímero que consiste en dos fragmentos, teniendo cada uno regiones variables unidas entre sí mediante un enlazador o similar (en lo sucesivo denominados fragmentos formadores de diacuerpos) y normalmente contienen dos Vl y dos Vh. Los fragmentos que forman diacuerpos incluyen los que consisten en Vl y Vh, Vl y Vl, Vh y Vh, etc., preferentemente Vh y Vl. En fragmentos formadores de diacuerpos, el enlazador que une regiones variables no está específicamente limitado, pero preferentemente lo suficientemente corto para evitar enlaces no covalentes entre regiones variables en el mismo fragmento. Los expertos en la técnica pueden determinar la longitud de dicho enlazador según sea apropiado, pero típicamente 2-14 aminoácidos, preferentemente 3-9 aminoácidos, especialmente 4-6 aminoácidos. En este caso, los Vl y Vh codificados en el mismo fragmento se unen a través de un enlazador lo suficientemente corto para evitar enlaces no covalentes entre los Vl y Vh en la misma cadena y para evitar la formación de fragmentos de región variable de cadena sencilla para que se puedan formar dímeros con otro fragmento. Los dímeros pueden formarse mediante enlaces covalentes o no covalentes o ambos entre fragmentos formadores de diacuerpos.

Además, los fragmentos formadores de diacuerpos se pueden unir mediante un enlazador o similar para formar diacuerpos de cadena sencilla (sc(Fv)²). Al unir fragmentos que forman diacuerpos usando un enlazador largo de aproximadamente 15-20 aminoácidos, pueden formarse enlaces no covalentes entre fragmentos formadores de diacuerpos que existen en la misma cadena para formar dímeros. Basado en el mismo principio que para la preparación de diacuerpos, también se pueden preparar anticuerpos polimerizados, tales como trímeros o tetrámeros, uniendo tres o más fragmentos formadores de diacuerpos.

Preferentemente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se une específicamente a TNFa. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo "reconoce específicamente", o "se une específicamente al" TNFa humano, cuando el anticuerpo o fragmento funcional es capaz de discriminar entre TNFa humano y una o más moléculas de referencia. Preferentemente, el valor de CI⁵⁰ para unirse a cada una de las moléculas de referencia es al menos 1.000 veces mayor que el valor de CI⁵⁰ para unirse a TNFa, particularmente como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.1.4. En su forma más general (y cuando no se menciona ninguna referencia definida), "unión específica" se refiere a la capacidad del anticuerpo o fragmento funcional para discriminar entre el TNFa humano y una biomolécula no relacionada, tal como se determina, por ejemplo, de acuerdo con procedimientos de ensayo de especificidad conocidos en la técnica. Dichos procedimientos comprenden pruebas de transferencia de Western y ELISA. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo ELISA estándar. Normalmente, la determinación de la especificidad de unión se realiza sin utilizar una sola biomolécula de referencia, sino un conjunto de aproximadamente tres a cinco biomoléculas no relacionadas, tales como leche en polvo, BSA, transferrina o similares. En una realización, unión específica refiere a la capacidad del anticuerpo o fragmento para discriminar entre TNFa humano y TNFp humano.

El anticuerpo de la invención o el fragmento funcional de la invención comprende un dominio V^l que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO 22 y SEQ ID NO: 24, y un dominio V^h que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 21. El dominio V^l comprende una región CDR1 (CDRL1), una región CDR2 (CDRL2), una región CDR3 (CDRL3) y regiones marco. El dominio V^h comprende una región CDR1 (CDRH1), una región CDR2 (CDRH2), una región CDR3 (CDRH3) y regiones marco. El término "CDR" se refiere a una de las seis regiones hipervariables dentro de los dominios variables de un anticuerpo que contribuyen principalmente a la unión del antígeno. Una de las definiciones más comúnmente utilizadas para las seis CDR fue proporcionada por Kabat E. A. y col., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. Publicación del NIH 91-3242). Como se usa en el presente documento, la definición de CDR de Kabat solo se aplica a CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena ligera (CDR L1, CDR L2, CDR L3 o L1, L2, L3), así como para CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena pesada (C^d R H2, CDR H3 o H2, H3). CDR1 del dominio variable de cadena pesada (CDR H1 o H1), sin embargo, como se usa en el presente documento, se define por los siguientes restos (numeración de Kabat): Comienza en la posición 26 y termina antes de la posición 36.

La región CDR1 del dominio V^l consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 7. La región CDR2 del dominio Vl consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 8. La región CDR3 del dominio V^l consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 9.

La región CDR1 del dominio Vh consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 10. La región CDR2 del dominio V^h consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 11. La región CDR3 del dominio V^H consiste en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 6.

El anticuerpo de la invención o el fragmento funcional de la invención comprende un dominio V^h que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:21. Adicionalmente, el anticuerpo o fragmento funcional comprende un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24. En una realización aún más preferida, el anticuerpo o fragmento funcional comprende un dominio V^l que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 22.

En una realización particularmente preferida, el fragmento funcional es un anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende un dominio V^h que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 21 y un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24. El dominio Vh y el dominio Vl se unen, preferentemente, mediante un enlazador peptídico. El enlazador peptídico (en lo sucesivo denominado "enlazador A") típicamente tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 aminoácidos, más preferentemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 aminoácidos. El enlazador A típicamente comprende los restos Gly y Ser, pero también son posibles otros aminoácidos. En realizaciones preferidas, el enlazador comprende múltiples repeticiones de la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 30), por ejemplo de 2 a 6 o de 3 a 5, o 4 repeticiones consecutivas de la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 30. Mucho más preferentemente, el enlazador A consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 29. El scFv puede tener la siguiente estructura (con el extremo N-terminal a la izquierda y el C-terminal a la derecha):

VL-Enlazador A-V^h; o

VH-Enlazador A-V^l.

Mucho más preferentemente, el fragmento funcional es un anticuerpo monocatenario (scFv) que consta de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 27.

En otra realización particularmente preferida, el fragmento funcional es un diacuerpo que comprende un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 21 y un dominio V^l que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24. El dominio Vh y el dominio Vl están unidos por un enlazador peptídico. El enlazador peptídico (en lo sucesivo denominado "enlazador B") tiene, preferentemente, una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 aminoácidos, más preferentemente de aproximadamente 5 aminoácidos. El enlazador B típicamente comprende restos Gly y Ser, pero también son posibles otros aminoácidos. Mucho más preferentemente, el enlazador B consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 30.

El diacuerpo es, preferentemente, un diacuerpo monoespecífico, es decir, está dirigido solo a un epítopo. El diacuerpo es, preferentemente, un homodímero. El diacuerpo puede ser un dímero de dos cadenas polipeptídicas que están unidas entre sí de forma no covalente. Cada monómero puede ser una cadena polipeptídica que tiene la estructura:

VL-Enlazador B-V^h; o

VH-Enlazador B-VL.

Además, los fragmentos formadores de diacuerpos se pueden unir mediante un enlazador A o similar para formar diacuerpos de cadena sencilla (sc(Fv)²). Al unir fragmentos que forman diacuerpos usando un enlazador largo de aproximadamente 15-20 aminoácidos, pueden formarse enlaces no covalentes entre fragmentos formadores de diacuerpos que existen en la misma cadena para formar dímeros. Ejemplos de disposiciones de diacuerpos monocatenarios incluyen los siguientes.

V^h - enlazador B - V^l - enlazador A - V^h - enlazador B - V^l

V^l - enlazador B - V^h - enlazador A - V^l - enlazador B - V^h

Preferentemente, el diacuerpo de la invención tiene la siguiente estructura:

Vl - enlazador B - Vh - enlazador A - Vl - enlazador B - Vh

Basado en el mismo principio que para la preparación de diacuerpos, también se pueden preparar anticuerpos polimerizados, tales como trímeros o tetrámeros, uniendo tres o más fragmentos formadores de diacuerpos.

En otra realización particular, el anticuerpo de la invención es una inmunoglobulina, preferentemente una inmunoglobulina G (IgG). La subclase de IgG de la invención no está limitada e incluye IgG-i, IgG², IgG³ e IgG⁴. Preferentemente, la IgG de la invención es de subclase 1, es decir, es una molécula de IgG-i.

Afinidad

El anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene una alta afinidad por el TNFa humano. El término "Kd", se refiere a la constante de disociación en el equilibrio de una interacción particular anticuerpo-antígeno. Normalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se une al TNFa humano con una constante de disociación en el equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 2x10'10 M, preferentemente de menos de 1,5x10'10 M, preferentemente de menos de 1x10'10 M, lo más preferentemente menos de 7x10'11 M, o incluso menor, por ejemplo, según se determina utilizando la tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento BIACORE. En particular, la determinación de la K^d se lleva a cabo como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.1.1.

Reactividad cruzada con TNFa de monos Cynomolgus o de macacos Rhesus

En realizaciones particulares, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene una afinidad sustancial por TNFa de animales, tales como monos Cynomolgus (Macaca fascicularis) y/o macacos Rhesus (Macaca mulatta). Esto es ventajoso, dado que los ensayos preclínicos de anticuerpos anti-TNFa humano, tales como estudios de toxicidad se realizan preferentemente con dichos animales. Por consiguiente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene, preferentemente, reactividad cruzada con TNFa de animales tales como monos Cynomolgus y/o macacos Rhesus. Las mediciones de afinidad se llevan a cabo como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.1.1. En una realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene reactividad cruzada con TNFa de Macaca fascicularis. El anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene, preferentemente, una afinidad por el TNFa de Macaca fascicularis que es menos de 10 veces, particularmente menos de 5 veces, incluso más particularmente menos de 2 veces o incluso menos de 1,5 veces diferente de su afinidad por el TNFa humano. Normalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se une al TNFa de Macaca fascicularis con una constante de disociación en el equilibrio (KD), en el que la relación RM.fascicularis de (i) la K^d para la unión a TNFa de Macaca fascicularis a (ii) la Kd para la unión a TNFa humano es menor que 10.

¡-i _ KD(M .fa sc icu laris)

R ^{M.fascicularis} . ^{--------------- “ --------------------- "} _K ^-- _{D(hum ano)}

RM.fascicularis es, preferentemente, menor que 5, particularmente menor que 2, incluso más particularmente menor que 1,5.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene reactividad cruzada con TNFa de Macaca mulatta. El anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene preferentemente una afinidad por TNFa de Macaca mulatta que es menos de 20 veces, más particularmente menos de 10 veces diferente, incluso más particularmente menos de 5 veces diferente a su afinidad por el TNFa humano. Normalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se une al TNFa de Macaca mulatta con una constante de disociación en el equilibrio (Kd), en el que la relación RM.mulatta de (i) la Kd para la unión a TNFa de Macaca mulatta a (ii) la Kd para la unión a TNFa humano es menor que 20.

Kd (M. m u la tta )

R ^{M .mulatta} KD(hum ano)

Rm mulatta es, preferentemente, menor que 20, particularmente menor que 10, incluso más particularmente menor que 5.

En otra realización más, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención presenta reactividad cruzada con TNFa de Macaca fascicularis y con TNFa de Macaca mulatta. El anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene, preferentemente, una afinidad por el TNFa de Macaca fascicularis que es menos de 10 veces, particularmente menos de 5 veces, incluso más particularmente menos de 2 veces o incluso menos de 1,5 veces diferente a su afinidad por el TNFa humano, y preferentemente tiene una afinidad por TNFa de Macaca mulatta que es menos de 20 veces, más particularmente menos de 10 veces, incluso más particularmente menos de 5 veces diferente a su afinidad por el TNFa humano. La relación R^{M.fascicularis} del anticuerpo o fragmento funcional es, preferentemente, menor que 10, particularmente menor que 5, incluso más particularmente menor que 2 o incluso menor que 1,5, y la relación R^M.mulatta del anticuerpo o fragmento funcional es, preferentemente, menor que 20, particularmente menor que 10, incluso más particularmente menor que 5.

Potencia para inhibir la apoptosis de células L929 inducida por TNFa

El anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene una alta potencia para inhibir la apoptosis de células L929 inducida por TNFa. En una realización particular, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención tiene una potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa de células L929 mayor que la del anticuerpo conocido infliximab.

La potencia relativa al infliximab se puede determinar en un ensayo L929 como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.1.2 de la presente solicitud. La potencia relativa del anticuerpo o fragmento funcional de la invención es mayor que 1,5, preferentemente mayor que 2, más preferentemente mayor que 3, más preferentemente mayor que 5, más preferentemente mayor que 7,5, o incluso mayor que 10, en el que la potencia relativa es la relación de (i) el valor de CI ⁵⁰ de infliximab en un ensayo L929 sobre (ii) el valor de CI⁵⁰ del anticuerpo o fragmento funcional de la invención en el ensayo L929, y en el que CI⁵⁰ indica la concentración en ng/ml de la molécula respectiva necesaria para lograr el 50 % de la inhibición máxima de la apoptosis de células L929 inducida por TNF.

En otra realización, la potencia relativa del anticuerpo o fragmento funcional de la invención es mayor que 1,5, preferentemente mayor que 2, más preferentemente mayor que 3, más preferentemente mayor que 5, más preferentemente mayor que 7,5, o incluso mayor que 10, en el que la potencia relativa es la relación de (i) el valor CI ⁹⁰ de infliximab en un ensayo L929 sobre (ii) el valor CI⁹⁰ del anticuerpo o fragmento funcional de la invención en el ensayo L929, y en el que el valor CI⁹⁰ indica la concentración en ng/ml de la molécula respectiva necesaria para lograr el 90 % de la inhibición máxima de la apoptosis de células L929 inducida por TNF.

Inhibición de la secreción de citocinas inducida por LPS

El anticuerpo o fragmento funcional de la invención puede ser capaz de inhibir la secreción de citocinas inducida por LPS a partir de monocitos. La secreción de citocinas inducida por LPS a partir de monocitos se puede determinar como se describe en el Ejemplo 7.

En una realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la secreción de interleucina-1p inducida por LPS a partir de monocitos CD14⁺ . El valor de CI⁵⁰ para inhibir la secreción de interleucina-1p inducida por LPS puede ser menor que 1 nM y/o menor que 100 pg/ml. El valor de CI⁵⁰ para inhibir la secreción de interleucina-1p inducida por LPS, sobre una base molar y/o sobre una base de peso por volumen, puede ser menor que el de adalimumab.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la secreción inducida por LPS de TNFa a partir de monocitos CD14⁺. El valor de CI⁵⁰ para inhibir la secreción de TNFa inducida por LPS puede ser menor que 1 nM y/o menor que 150 pg/ml. El valor de CI⁵⁰ para inhibir la secreción de TNFa inducida por LPS, sobre una base molar y/o sobre una base de peso por volumen, puede ser menor que el de adalimumab. Inhibición de la proliferación celular

El anticuerpo o fragmento funcional de la invención puede ser capaz de inhibir la proliferación celular de células mononucleares de sangre periférica en una reacción mixta de linfocitos. La inhibición de la proliferación celular se puede determinar como se describe en el Ejemplo 6. El índice de estimulación del anticuerpo o fragmento funcional, por ejemplo del scFv o diacuerpo de la invención, determinado según el ejemplo 6, puede ser menor que 5 o menor que 4,5. En realizaciones particulares, el índice de estimulación del anticuerpo, por ejemplo de la IgG de la invención, es menor que 4 o incluso menor que 3.

Inhibición de la interacción entre TNFa y el receptor de TNF

Normalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la interacción entre el TNFa humano y el receptor I de TNF (TNFRI). La inhibición de la interacción entre el TNFa humano y el TNFRI se puede determinar en un ELISA de inhibición como se describe a continuación en el Ejemplo 2, sección 2.1.3.

La potencia del anticuerpo o fragmento funcional de la invención para inhibir la interacción entre el TNFa humano y el TNFRI, relativa a la del infliximab (potencia relativa), según se determina en un ELISA de inhibición, es, preferentemente de al menos 1,3, en la que dicha potencia relativa es la relación entre el valor de CI⁵⁰ en ng/ml de infliximab y el valor de CI⁵⁰ en ng/ml del anticuerpo o fragmento funcional del mismo.

Normalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de inhibir la interacción entre el TNFa humano y el receptor II de TNF (TNFRII). La inhibición de la interacción entre el TNFa humano y el TNFRII se puede determinar en un ELISA de inhibición como se describe a continuación en el Ejemplo 2, sección 2.1.3.

La potencia del anticuerpo o fragmento funcional de la invención para inhibir la interacción entre el TNFa humano y el TNFRII, relativa a la del infliximab (potencia relativa), según se determina en un ELISA de inhibición, es, preferentemente de al menos 1,3, en la que dicha potencia relativa es la relación entre el valor de CI⁵⁰ en ng/ml de infliximab y el valor de CI⁵⁰ en ng/ml del anticuerpo o fragmento funcional del mismo.

Estequiometría y reticulación

El anticuerpo o fragmento funcional de la invención es típicamente capaz de unirse a TNFa^Trímero humano en una estequiometría (anticuerpo: TNFa^Trímero) de al menos 2. La estequiometría (anticuerpo: TNFa^Trímero) es, preferentemente, mayor que 2 o de al menos 2,5, o al menos 3. En una realización, la estequiometría (anticuerpo: TNFa^Trímero) es de aproximadamente 3. La estequiometría (anticuerpo: TNFa^Trímero) se puede determinar como se describe en el Ejemplo 4 a continuación.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención es capaz de formar un complejo con TNFa humano, en el que dicho complejo comprende al menos dos moléculas de TNFa y al menos tres moléculas de anticuerpo o fragmento funcional. El fragmento funcional de acuerdo con esta realización comprende al menos dos sitios de unión separados para TNFa, tales como, por ejemplo diacuerpos. La formación de complejos se puede determinar como se describe en el Ejemplo 5 a continuación.

En una realización, el anticuerpo es una IgG y es capaz de formar un complejo de al menos 600 kDa con TNFa. En otra realización, el fragmento funcional es un diacuerpo y es capaz de formar un complejo de al menos 300 kDa con TNFa.

Selectividad de diana

En determinadas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento funcional de la invención tiene una alta selectividad de diana, es decir, puede discriminar entre TNFa y TNFp. Preferentemente, el valor de CI⁵⁰ de TNFp es al menos 1.000 veces mayor que el valor de CI⁵⁰ de TNFa, como se determina en un ELISA de competición como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.1.4. Más preferentemente, el valor de CI⁵⁰ del TNFp es al menos 5.000 veces, lo más preferentemente al menos 10.000 mayor que el valor CI⁵⁰ de TNFa, como se determina en un ELISA de competición como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.1.4.

Rendimiento de expresión y rendimiento de replegamiento

En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención, preferentemente el scFv o diacuerpo, se puede expresar de forma recombinante con alto rendimiento en microorganismos tales como bacterias o en otras células. Preferentemente, el rendimiento de expresión en E. coli, determinado como se describe en el Ejemplo 2, es de al menos 0,25 g/l. Esto se aplica particularmente a fragmentos funcionales, tales como scFv.

El rendimiento del replegamiento, determinado como se describe en el Ejemplo 2, es de al menos 5 mg/l, más preferentemente de al menos 10 mg/l, más preferentemente de al menos 15 mg/l y lo más preferentemente de al menos 20 mg/l. Esto se aplica particularmente a fragmentos funcionales, tales como scFv.

Estabilidad

Normalmente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención, preferentemente el scFv o diacuerpo, tiene una alta estabilidad. La estabilidad se puede evaluar mediante diferentes metodologías. La "temperatura de fusión" T^m del dominio variable del anticuerpo o fragmento funcional de la invención, determinado por fluorimetría diferencial de barrido (DSF) como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.2.4, es preferentemente de al menos 65 °C, más preferentemente al menos 68 °C, más preferentemente al menos 70 °C, lo más preferentemente al menos 74 °C. La "temperatura de fusión del dominio variable", como se usa en el presente documento, se refiere a la temperatura de fusión de un scFv que consiste en la secuencia V^l - Enlazador A - V^h, en el que la secuencia de aminoácidos de Enlazador A consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 29. Por ejemplo, la temperatura de fusión del dominio variable de una IgG se define como la temperatura de fusión de su scFv correspondiente como se ha definido anteriormente.

La pérdida de contenido de monómeros (a una concentración de 10 g/l; contenido inicial de monómero > 95%) después de almacenamiento durante cuatro semanas a 4 °C, determinado por cromatografía analítica de exclusión por tamaño como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.2.5, es, preferentemente, menos del 5%, más preferentemente menos del 3 %, más preferentemente menos del 1 %, lo más preferentemente menos del 0,5 %. La pérdida de contenido de monómeros (a una concentración de 10 g/l; contenido inicial de monómero > 95 %) después de almacenamiento durante cuatro semanas a -20 °C, determinado por cromatografía analítica de exclusión por tamaño como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.2.5, es, preferentemente, menos del 5 %, más preferentemente menos del 3 %, más preferentemente menos del 1 %, lo más preferentemente menos del 0,5 %. La pérdida de contenido de monómeros (a una concentración de 10 g/l; contenido inicial de monómero > 95 %) después de almacenamiento durante cuatro semanas a -65 °C, determinado por cromatografía analítica de exclusión por tamaño como se describe en el Ejemplo 2, sección 2.2.5, es, preferentemente, menos del 5 %, más preferentemente menos del 3 %, más preferentemente menos del 1 %, lo más preferentemente menos del 0,5 %.

La pérdida de monómero después de cinco ciclos consecutivos de congelación-descongelación, determinado como se describe en el Ejemplo 2, es menos del 5 %, más preferentemente menos del 1 %, más preferentemente menos del 0,5 %, lo más preferentemente menos del 0,2 %, por ejemplo 0,1 % o 0,0 %.

Anticuerpos y fragmentos funcionales

Realizaciones particulares de la invención se refieren a fragmentos funcionales de los anticuerpos descritos en el presente documento. Los fragmentos funcionales incluyen el fragmento F (ab')², un fragmento Fab, scFv, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos. Preferentemente, el fragmento funcional es un anticuerpo monocatenario (scFv) o un diacuerpo. Más preferentemente, las secuencias no CDR del scFv o del diacuerpo son secuencias humanas.

Preferentemente, con el fin de minimizar el potencial de inmunogenicidad en seres humanos, el armazón aceptor elegido está compuesto por regiones marco derivadas de secuencias consenso humanas o secuencias de la línea germinal humana. En particular, las regiones marco I a III del dominio ligero variable consisten en secuencias consenso de Vk1 humana de acuerdo con las SEQ ID NO: 31 a 33 y una región marco IV de una secuencia basada en la línea germinal A seleccionada de las SEQ ID NO: 34 a 37.

Dado que los restos que no son consenso humano o restos de la línea germinal humana pueden causar reacciones inmunes, el número de dichos restos en cada dominio variable (VH o VL) debe ser lo más bajo posible, preferentemente menor que 7, más preferentemente menor que 4, lo más preferentemente 0.

Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. La expresión "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento, no está limitada a los anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridoma. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que procede de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o fago, y no el procedimiento por el cual se produce. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la materia, incluido el uso de hibridomas, tecnologías de expresión de fagos y recombinantes, o una combinación de las mismas. (Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y.).

En otras realizaciones, incluyendo realizaciones relativas al uso in vivo de los anticuerpos anti-TNFa en seres humanos, pueden usarse anticuerpos quiméricos, primatizados, humanizados o humanos. En una realización preferente, el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, más preferentemente un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal humanizado.

La expresión anticuerpo "quimérico" como se utiliza en el presente documento se refiere a un anticuerpo que tiene secuencias variables procedentes de una inmunoglobulina no-humana, tales como un anticuerpo de rata o ratón, y regiones constantes de inmunoglobulinas humanas, típicamente elegido de un molde de inmunoglobulina humana. Los procedimientos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la materia. Véase, p. ej., Morrison, 1985, Science 229(4719): 1202-7; Oi y col., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies y col., 1985, J. Immunol. Methods 125: 191-202; las patentes de Estados Unidos n.° 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397.

Se encuentran disponibles diferentes metodologías recombinantes para un experto en la técnica para hacer que un anticuerpo no humano (por ejemplo, murino) sea más similar a uno humano mediante la generación de inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulina, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab^')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a la diana), que contienen secuencias mínimas derivadas de dicha inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo recombinante resultante comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en la que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana, particularmente una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos injertados con CDR son moléculas de anticuerpo que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) a partir de un anticuerpo generado originalmente en una especie no humana que se une al antígeno deseado y las regiones marco (FR) de una molécula de inmunoglobulina humana (documento EP239400; publicación PCT WO 91/09967; patentes de Estados Unidos N.° 5.225.539; 5.530.101 y 5.585.089). Con frecuencia, en un procedimiento llamado "humanización", los restos marco en las regiones marco humanas se sustituirán adicionalmente con el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferentemente mejorar, la unión del antígeno. Estas sustituciones de marco se identifican mediante procedimientos bien conocidos en la materia, p. ej., mediante el modelado de las interacciones de las CDR y los restos marco para identificar restos marco importantes para la unión de antígenos y la comparación de secuencias para identificar restos marco inusuales en posiciones particulares. Véase, p. ej., Riechmann y col., 1988, Nature 332: 323-7 y Queen y col., las patentes de Estados Unidos N.°: 5.530.101; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; y 6.180.370. Los anticuerpos se pueden hacer más humanos utilizando diversas técnicas adicionales conocidas en la materia que incluyen, por ejemplo, revestimiento o regeneración (documentos EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol, 28:489-498; Studnicka y col., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.

91:969-973, y barajado de cadenas (patente de Estados Unidos n.° 5.565.332). Un anticuerpo humanizado o injertado con CDR también puede comprender al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de un molde de inmunoglobulina humana elegido.

En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados se preparan como se describe en Queen y col., las patentes de Estados Unidos N.°: 5.530.101; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; y 6.180.370.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-TNFa son anticuerpos humanos. Anticuerpos anti-TNFa completamente "humanos" pueden ser deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Como se usa en el presente documento, "anticuerpos humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas. Los anticuerpos humanos se pueden producir mediante diversos procedimientos conocidos en la materia, que incluyen los procedimientos de expresión en fagos descritos anteriormente utilizando bibliotecas de anticuerpos procedentes de secuencias de inmunoglobulina humana. Véanse las Patentes de Estados Unidos n.° 4.444.887 y 4.716.111; y las publicaciones PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741. Los anticuerpos humanos también se pueden producir utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Véase, p. ej., las publicaciones PCT WO 98/24893; w O 92/01047; w O 96/34096; WO 96/33735; patentes de Estados Unidos N.° 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598. Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado se pueden generar utilizando una técnica denominada "selección guiada". En este enfoque, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, p. ej., un anticuerpo de ratón, se utiliza para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo (Jespers y col., 1988, Biotechnology 12:899-903).

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-TNFa son anticuerpos primatizados. La expresión "anticuerpo primatizado" se refiere a un anticuerpo que comprende regiones variables de mono y regiones constantes de humano. Los procedimientos para producir anticuerpos primatizados son conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, patentes de Estados Unidos N.° 5.658.570; 5.681.722; y 5.693.780.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-TNFa son anticuerpos derivatizados. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los anticuerpos derivatizados que se han modificado, p. ej., mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína (véase más adelante una discusión de conjugados de anticuerpos), etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, incluida la escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. De manera adicional, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

En otros aspectos más, un anticuerpo anti-TNFa tiene uno o más aminoácidos insertados en una o más de su región hipervariable, por ejemplo, como se describe en el documento US 2007/0280931.

Conjugados de anticuerpos

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-TNFa son conjugados de anticuerpos que se modifican, p. ej., mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo, de manera que la unión covalente no interfiera con la unión a TNFa. Las técnicas para conjugar restos efectores con anticuerpos son bien conocidas en la materia (véase, p. ej., Hellstrom y col., Controlled Drag Delivery, 2a ed., en págs. 623-53 (Robinson y col., eds., 1987)); Thorpe y col., 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58 y Dubowchik y col., 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123).

En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo se fusiona mediante un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptídico), en, opcionalmente, el N-terminal o el C-terminal, a una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o porción de la misma; preferentemente al menos una porción de 10, 20 o 50 aminoácidos de la proteína). Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento del mismo, está unido a la otra proteína en el N-terminal del dominio constante del anticuerpo. Se pueden utilizar procedimientos de ADN recombinante para crear tales fusiones, por ejemplo, como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP0392745. En otro ejemplo, la molécula efectora puede aumentar la semivida in vivo. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina, tales como los descritos en el documento WO 2005/117984.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-TNFa se pueden unir a restos de poli(etilenglicol) (PEG). Por ejemplo, si el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, los restos de PEG se pueden unir a través de cualquier grupo funcional de aminoácido terminal o de cadena lateral de aminoácido disponible ubicado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Dichos aminoácidos pueden aparecer de forma natural en el fragmento de anticuerpo o pueden modificarse por ingeniería genética en el fragmento utilizando procedimientos de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.219.996. Se pueden usar múltiples sitios para unir dos o más moléculas de PEG. Preferentemente, los restos de PEG se unen covalentemente a través de un grupo tiol de al menos un resto de cisteína ubicado en el fragmento de anticuerpo. Cuando se usa un grupo tiol como punto de unión, se pueden usar restos efectores apropiadamente activados, por ejemplo, derivados selectivos de tiol como maleimidas y derivados de cisteína.

En otro ejemplo, un conjugado de anticuerpo anti-TNFa es un fragmento Fab' modificado que está PEGilado, es decir, tiene PEG (poli(etilenglicol)) unido covalentemente al mismo, p. ej., de acuerdo con el procedimiento desvelado en el documento EP0948544. Véase también Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, Nueva York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris y S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D. C, 1997); y Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam y A. Dent, eds., Grove Publishers, Nueva York, 1998); y Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545.

Composiciones y tratamientos farmacéuticos

El tratamiento de una enfermedad abarca el tratamiento de pacientes ya diagnosticados con cualquier forma de la enfermedad en cualquier etapa clínica o manifestación; el retraso del inicio o evolución o agravamiento o deterioro de los síntomas o signos de la enfermedad; y/o la prevención y/o reducción de la gravedad de la enfermedad.

Un "sujeto" o "paciente" al que se administra un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional del mismo puede ser un mamífero, tal como un no primate (por ejemplo, vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata, etc.) o un primate (por ejemplo, mono o humano). En determinados aspectos, el ser humano es un paciente pediátrico. En otros aspectos, el ser humano es un paciente adulto.

Se describen en el presente documento composiciones que comprenden un anticuerpo anti-TNFa y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos adicionales, como los segundos agentes terapéuticos descritos a continuación. Las composiciones normalmente se suministran como parte de una composición farmacéutica estéril que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del procedimiento deseado de administración a un paciente).

Los anticuerpos anti-TNFa y los fragmentos funcionales pueden administrarse a un paciente por diversas vías, tales como por vía oral, transdérmica, subcutánea, intranasal, intravenosa, intramuscular, intratecal, tópica o localmente.

La vía de administración más adecuada en cualquier caso dado dependerá del anticuerpo en particular, el sujeto y la naturaleza y gravedad de la enfermedad y el estado físico del sujeto. Normalmente, un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional del mismo se administrará por vía intravenosa.

En una realización particularmente preferida, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se administra por vía oral. Si la administración es por vía oral, el fragmento funcional es, preferentemente, un anticuerpo monocatenario (scFv), diacuerpo o IgG.

En realizaciones típicas, un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional está presente en una composición farmacéutica a una concentración suficiente para permitir la administración intravenosa de 0,5 mg/kg de peso corporal a 20 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la concentración de anticuerpo o fragmento adecuado para su uso en las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento incluye 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, o una concentración que varía entre cualquiera de los valores anteriores, p. ej., de 1 mg/kg a 10 mg/kg, de 5 mg/kg a 15 mg/kg o de 10 mg/kg a 18 mg/kg.

La dosis eficaz de un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional puede variar de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 750 mg/kg por administración única (por ejemplo, en bolo), administraciones múltiples o administración continua, o para lograr una concentración sérica de 0,01-5000 pg/ml de concentración sérica por administración única (por ejemplo, bolo), múltiples administraciones o administración continua, o cualquier intervalo o valor efectivo en las mismas dependiendo de la afección que se esté tratando, la vía de administración y la edad, el peso y la afección del sujeto. En determinadas realizaciones, cada dosis puede variar de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal o de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 30 mg por kilogramo de peso corporal. El anticuerpo se puede formular como una solución acuosa.

Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un anticuerpo anti-TNFa o fragmento funcional por dosis. Tal unidad puede contener de 0,5 mg a 5 g, por ejemplo, 1 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg o cualquier intervalo entre dos cualesquiera de los valores anteriores, por ejemplo, de 10 mg a 1000 mg, de 20 mg a 50 mg o de 30 mg a 300 mg. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden tomar una amplia variedad de formas dependiendo, p. ej., de la afección a tratar o la vía de administración.

La determinación de la dosis efectiva, el número total de dosis y la duración del tratamiento, un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional del mismo está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, y puede determinarse usando un estudio estándar de aumento de dosis.

Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-TNFa y los fragmentos funcionales adecuadas en los procedimientos descritos en el presente documento pueden prepararse para almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales, excipientes o estabilizantes empleados típicamente en la técnica (todos los cuales se denominan en el presente documento "vehículos"), es decir, agentes tampón, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificantes, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos varios. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición (Osol, ed. 1980). Dichos aditivos no deben ser tóxicos para los receptores a las posologías y concentraciones empleadas.

Los agentes tampón ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden presentarse a concentraciones que varían de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. Los agentes tampón adecuados incluyen ácidos orgánicos e inorgánicos y sales de los mismos, tales como tampones de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico y citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico y citrato monosódico, etc.), tampones de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico y succinato monosódico, mezcla de ácido succínico e hidróxido sódico, mezcla de ácido succínico y succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico y tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico y tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico e hidróxido de sodio, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico y fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico y fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico y fumarato disódico, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico y gluconato de sodio, mezcla de ácido glucónico e hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico y gluconato de potasio, etc.), tampón de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico y oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico e hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico y oxalato de potasio, etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico y lactato de sodio, mezcla de ácido láctico e hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico y lactato de potasio, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético y acetato de sodio, mezcla de ácido acético e hidróxido de sodio, etc.). De manera adicional, se pueden usar tampones fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina, tales como Tris.

Se pueden añadir conservantes para retardar el crecimiento microbiano y se pueden añadir en cantidades que varían de 0,2 % - 1 % (p/v). Los conservantes adecuados incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), cloruro de hexametonio y alquilparabenos, tales como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol. Se pueden añadir isotonificantes conocidos como "estabilizantes" para asegurar la isotonicidad de las composiciones líquidas e incluir alcoholes de azúcar polihídricos, preferentemente alcoholes de azúcar trihídrico o superiores, tal como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizantes se refieren a una amplia categoría de excipientes que pueden variar en función de un agente de carga a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o la adherencia a la pared del recipiente. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes de azúcar polihídricos (enumerados anteriormente); aminoácidos, tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclitoles, tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, péptidos de 10 restos o menos); proteínas, tales como seroalbúmina humana, seroalbúmina bovina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como monosacáridos de polivinilpirrolidona, tal como xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacáridos, tales como lactosa, maltosa, sacarosa y trisacáridos tales como rafinosa; y polisacáridos tales como dextrano. Los estabilizantes pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 pesos por parte de proteína activa en peso.

Se pueden añadir tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por agitación, que también permite que la formulación se exponga a la superficie de cizallamiento estresada sin causar desnaturalización de la proteína. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles plurónicos, monoéteres de polioxietilensorbitán (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml o en un intervalo de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

Los excipientes varios adicionales incluyen agentes de carga (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E), inhibidores de proteasa y codisolventes.

La formulación del presente documento también puede contener un segundo agente terapéutico además de un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional del mismo. A continuación se proporcionan ejemplos de segundos agentes terapéuticos adecuados.

La pauta posológica puede variar de una vez al mes a diario dependiendo de una serie de factores clínicos, incluyendo el tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la sensibilidad del paciente al anticuerpo anti-TNFa o al fragmento funcional. En realizaciones específicas, se administra diariamente un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional del mismo, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cada dos días, cada 5 días, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo entre dos cualesquiera de los valores anteriores, por ejemplo, de cada cuatro días a cada mes, de cada 10 días a cada dos semanas, o de dos a tres veces a la semana, etc.

La dosis de un anticuerpo anti-TNFa o fragmento funcional a administrar variará según el anticuerpo particular, el sujeto y la naturaleza y la gravedad de la enfermedad, el estado físico del sujeto, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se usa un segundo agente terapéutico) y la vía de administración seleccionada; la posología apropiada puede determinarla fácilmente un experto en la materia.

Un experto en la materia reconocerá que la cantidad óptima y el espaciamiento de las dosificaciones individuales de un anticuerpo anti-TNFa o fragmento funcional del mismo se determinarán mediante la naturaleza y la extensión de la afección que se está tratando, la forma, la vía y el lugar de administración, y la edad y el estado del sujeto en particular que se está tratando, y que un médico finalmente determinará las dosis apropiadas que se utilizarán. Esta posología puede repetirse tan a menudo como sea apropiado. Si se desarrollan efectos secundarios, la cantidad y/o frecuencia de la dosis puede alterarse o reducirse, de acuerdo con la práctica clínica habitual.

Trastornos a tratar

La invención se refiere a un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad relacionada con el TNFa humano en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo o fragmento funcional como se define en el presente documento. La expresión "trastorno relacionado con TNFa" o "enfermedad relacionada con TNF" se refiere a cualquier trastorno, la aparición, la progresión o la persistencia de los síntomas o estados patológicos de los cuales requiere la participación de TNFa. Los trastornos de ejemplo relacionados con el TNF incluyen estados de inflamación crónicos y/o autoinmunes en general, trastornos inflamatorios inmunomediados en general, enfermedad inflamatoria del SNC, enfermedades inflamatorias que afectan al ojo, articulaciones, piel, membranas mucosas, sistema nervioso central, tracto gastrointestinal, tracto urinario o pulmón, estados de uveítis en general, retinitis, uveítis HLA-B27+, enfermedad de Behget, queratoconjuntivitis seca, glaucoma, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus (incluida neuropatía diabética), resistencia a la insulina, estados de artritis en general, artritis reumatoide, artrosis, artritis reactiva y síndrome de Reiter, artritis juvenil, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrófica, sarcoidosis, glomerulonefritis, enfermedad renal crónica, cistitis, psoriasis (incluida artritis psoriásica), hidradenitis supurativa, paniculitis, piodermia gangrenosa, síndrome de SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), acné, síndrome de Sweet, pénfigo, enfermedad de Crohn (incluidas manifestaciones extraintestinales), colitis ulcerosa, asma bronquial, neumonitis por hipersensibilidad, alergias generales, rinitis alérgica, sinusitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar, granulomatosis de Wegener, síndrome de Kawasaki, arteritis gigantocelular, vasculitis de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, quemaduras, enfermedad de injerto contra hospedador, reacciones de injerto contra hospedador, episodios de rechazo después de un trasplante de órganos o de médula ósea, estados sistémicos y locales de vasculitis en general, lupus eritematoso sistémico y cutáneo, polimiositis y dermatomiositis, esclerodermia, preeclampsia, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis vírica, hepatitis alcohólica, inflamación posquirúrgica, tal como después de una cirugía ocular (por ejemplo, cataratas (reemplazo del cristalino) o cirugía de glaucoma), cirugía de articulaciones (incluida cirugía artroscópica), cirugía en estructuras relacionadas con las articulaciones (por ejemplo, ligamentos), cirugía bucal y/o dental, procedimientos cardiovasculares mínimamente invasivos (por ejemplo, ACTP, aterectomía, colocación de endoprótesis vascular), procedimientos intraabdominales y ginecológicos laparoscópicos y/o endoscópicos, procedimientos urológicos endoscópicos (por ejemplo, cirugía de próstata, ureteroscopia, cistoscopia, cistitis intersticial) o inflamación perioperatoria (prevención) en general, dermatitis bullosa, dermatitis neutrofílica, necrolisis epidérmica tóxica, dermatitis pustulosa, paludismo cerebral, síndrome urémico-hemolítico, rechazo de aloinjertos, otitis media, mordedura de serpiente, eritema nudoso, síndromes mielodisplásicos, colangitis esclerosante primaria, espondiloarteropatía seronegativa, anemia hemolítica autoinmunitaria, granulomatosis orofacial, piostomatitis vegetans, estomatitis aftosa, lengua geográfica, estomatitis migratoria, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, parálisis de Bell, enfermedad de Creutzfeld-Jakob y afecciones neurodegenerativas en general.

Osteólisis relacionada con cáncer, inflamación relacionada con cáncer, dolor relacionado con cáncer, caquexia relacionada con cáncer, metástasis ósea, formas agudas y crónicas de dolor, independientemente de si son causados por efectos centrales o periféricos del TNFa y si se clasifican como formas inflamatorias, nociceptivas o neuropáticas de dolor, ciática, dolor lumbar, síndrome del túnel carpiano, síndrome de dolor regional complejo (SDRC), gota, neuralgia postherpética, fibromialgia, estados de dolor local, síndromes de dolor crónico debido a un tumor metastásico, dismenorrea.

Los trastornos particulares a tratar incluyen estados de artritis en general, artritis reumatoide, artrosis, artritis reactiva, artritis juvenil; psoriasis, incluida artritis psoriásica; enfermedad inflamatoria intestinal, incluida la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa incluida proctitis, sigmoiditis, colitis del lado izquierdo, colitis extensa y pancolitis, colitis indeterminada, colitis microscópica, incluida colitis colágena y linfocítica, colitis en la enfermedad del tejido conectivo, colitis por derivación, colitis en la enfermedad diverticular, colitis eosinofílica y reservoritis.

Mucho más preferentemente, el anticuerpo o fragmento funcional de la invención se usa para tratar una enfermedad inflamatoria intestinal, en particular, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa o colitis microscópica. La enfermedad de Crohn puede ser enfermedad de Crohn ileal, colónica, ileocolónica o aislada superior (gástrica, duodenal y/o yeyunal) incluyendo comportamiento de enfermedad sin estrechamiento/no penetrante, con estrechamiento, penetrante y perianal, permitiendo cualquier combinación de localización y comportamiento de enfermedad de cualquiera de los mencionados anteriormente. La colitis ulcerosa puede ser proctitis ulcerosa, proctosigmoiditis, colitis del lado izquierdo, colitis panulcerosa y reservoritis.

Terapia combinada y otros aspectos

Preferentemente, el paciente que está siendo tratado con un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional del mismo también se trata con otro medicamento convencional. Por ejemplo, un paciente que sufre enfermedad inflamatoria intestinal, especialmente si sufre enfermedad de moderada a grave también se trata típicamente con mesalazina o derivados o profármacos de la misma, corticoesteroides, por ejemplo, budesonida o prednisolona (oral o i.v.), inmunosupresores, por ejemplo, azatioprina/6-mercaptopurina (6-MP) o metotrexato, ciclosporina o tacrolimus. Otros medicamentos que se pueden coadministrar al paciente incluyen productos biológicos, tales como infliximab, adalimumab, etanercept, certolizumab pegol u otros. Otros medicamentos que pueden coadministrarse al paciente incluyen inmunosupresores (por ejemplo, azatioprina/6-MP o metotrexato o ciclosporina oral) para mantener una remisión estable y más prolongada. Otro aspecto más de la invención es el uso de un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional como se ha definido en el presente documento anteriormente para reducir la inflamación.

Otro aspecto más de la invención es un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional como se ha definido anteriormente para su uso en la reducción de la inflamación en un paciente que padece una afección inflamatoria.

Un aspecto adicional como se describe en el presente documento es un procedimiento para tratar una afección inflamatoria, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TNFa o un fragmento funcional como se ha definido en el presente documento anteriormente. La afección inflamatoria es, preferentemente, una de las afecciones descritas anteriormente.

Tabla 1. Sumario de las secuencias de aminoácidos

(continuación)

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos de conejo dirigidos contra TNFa humano

1. Resultados

1.1 Inmunización

Se han inmunizado conejos con TNFa humano recombinante purificado (Peprotech, N.° cat. 300-01A). Durante el curso de la inmunización, la fuerza de la respuesta inmune humoral contra el antígeno se evaluó cualitativamente determinando la dilución máxima (título) para el suero de cada conejo que todavía producía una unión detectable de los anticuerpos policlonales séricos frente al antígeno. Se evaluaron los títulos de anticuerpos en suero contra el TNFa humano recombinante inmovilizado usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA, véase 2.2.1). Los tres conejos mostraron títulos muy altos con una dilución de 10 x 10⁶ veces del suero que aún da como resultado una señal positiva (al menos 3 veces más alta que la señal obtenida con suero de un animal no emparentado sin experiencia que se usó como control de fondo) en el ELISA. Además, se evaluó la capacidad de diferentes sueros de conejo para inhibir la actividad biológica de TNFa utilizando un ensayo basado en células L929 de ratón (véase 2.2.3). Los tres sueros inhibieron la apoptosis inducida por TNFa de fibroblastos de ratón L929. El conejo n.° 3 mostró la actividad neutralizante más fuerte con una inhibición del 50 % (CI⁵⁰) alcanzada a una dilución de suero de 1:155.000. Comparado con el conejo n.° 3, el conejo n.° 2 y el conejo n.° 1 mostraron aproximadamente 3 y 21 veces menos actividad, alcanzando un 50% de inhibición a una dilución de suero de 1:55.500 y 1:7.210, respectivamente. Se eligieron linfocitos aislados de bazos de los tres animales para los siguientes procedimientos de identificación de coincidencias. Los animales se priorizaron en función de la potencia para inhibir la actividad biológica de TNFa en el ensayo L929. Por lo tanto, el mayor número de coincidencias que se cultivaron se originó en el conejo n.° 3 y el menor número de coincidencias se obtuvo del conejo n.° 1.

1.2 Identificación de coincidencias

1.2.1 Clasificación de coincidencias

Antes del procedimiento de identificación de coincidencias, se desarrolló un procedimiento de clasificación basado en citometría de flujo que detecta específicamente y permite el aislamiento de linfocitos B que se unen a TNFa de alta afinidad (ver 2.1).

Un total de 33 x 10⁶ linfocitos (correspondientes al 1,5 % del total de linfocitos aislados) derivados de los tres conejos se caracterizaron en dos campañas de clasificación independientes. De las 33 x 10⁶ células analizadas en total, se aislaron 3452 linfocitos B que expresaban anticuerpos específicos de TNFa (IgG). El número de linfocitos clonados fue diferente para los tres conejos, ya que se aislaron más células de aquellos conejos cuyos sueros mostraron una fuerte inhibición de TNFa en el ensayo L929. De los linfocitos B aislados, se obtuvieron 792 clones de conejo n.° 1, 1144 clones de conejo n.° 2 y 1408 clones de conejo n.° 3. Para 108 clones se desconoce el origen de conejo respectivo, porque se derivan de una mezcla de linfocitos residuales de los 3 conejos para permitir la recuperación óptima de una pequeña cantidad de linfocitos de los viales.

1.2.2 Detección de coincidencias

Los resultados obtenidos durante la fase de detección se basan en ensayos realizados con anticuerpos no purificados de sobrenadantes de cultivos de células secretoras de anticuerpos (ASC), ya que la escala del cultivo de alto rendimiento no permite la purificación de los anticuerpos de conejo individuales. Dichos sobrenadantes se utilizaron para clasificar un gran número de anticuerpos entre sí, sin embargo, no proporcionan valores absolutos (por ejemplo, para la inhibición de la actividad biológica de TNFa), excepto por la afinidad de unión. Los sobrenadantes de ASC se cribaron en un ELISA de alto rendimiento para determinar la unión al TNFa humano recombinante. Los sobrenadantes que se unen al TNFa se caracterizaron adicionalmente por su unión al TNFa de mono Cynomolgus mediante ELISA, cinética de unión y por su potencial para neutralizar la actividad biológica del TNFa humano en el ensayo L929. Con la excepción de la cinética de unión, los valores de los informes de las pruebas de detección de alto rendimiento deben interpretarse como respuestas "sí" o "no", que se basan en mediciones de un solo punto (sin dosis-respuesta). Se analizó la afinidad con el TNFa de mono Cynomolgus y ratón para todos los 102 clones que se seleccionaron para la amplificación y secuenciación de los dominios variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo.

1.2.2.1 Unión al TNFa humano

El objetivo de la detección primaria es identificar clones de ASC que producen anticuerpos específicos para TNFa humano. Para este fin, los sobrenadantes de cultivos celulares de 3452 clones de ASC se analizaron para determinar la presencia de anticuerpos contra TNFa humano mediante ELISA (véase 2.2.1). El procedimiento ELISA utilizado evalúa la "cantidad" de anticuerpos del subtipo IgG unidos al TNFa humano recombinante, sin embargo, no proporciona información sobre la afinidad o la concentración de los anticuerpos. En este ensayo, los sobrenadantes de 894 clones de ASC produjeron una señal que estaba claramente por encima del fondo. La tasa de coincidencias en la detección fue similar para el conejo n.° 1 y el conejo n.° 2 con 153 coincidencias de 792 (19,3 %) identificados del conejo n.° 1 y 225 coincidencias de 1144 identificados del conejo n.° 2 (19,7 %). El conejo n.° 3 mostró una tasa de coincidencias significativamente mayor del 34,4 %, lo que resultó en la identificación de 484 coincidencias de 1408. Las 894 coincidencias identificadas en esta detección primaria, se sometieron a la medición de la cinética de unión mediante SPR (detección secundaria).

1.2.2.2 Cinética de unión al TNFa

El objetivo de la detección secundaria es obtener información cuantitativa sobre la calidad de la unión a la diana para cada coincidencia a partir de la detección primaria por resonancia de plasmón superficial (SPR, véase 2.2.2). A diferencia del ELISA utilizado durante la detección primaria, este procedimiento evalúa la cinética de la unión a la diana en función del tiempo. Esto permite la determinación de las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) del anticuerpo de su diana. La relación kd/ka proporciona la constante de disociación en el equilibrio (Kd), que refleja la afinidad de un anticuerpo por su diana. De las 894 coincidencias identificadas en la detección primaria, se pudieron determinar las afinidades de unión al TNFa humano para 839 anticuerpos monoclonales de conejo. Para los 55 anticuerpos restantes no se pudo medir la afinidad porque la concentración de anticuerpo en el sobrenadante de ASC estaba por debajo del límite de detección del instrumento SPR en la configuración respectiva. Los 839 anticuerpos anti-TNFa que se pudieron medir mostraron constantes de disociación (Kd) que variaban desde menos de 1,36 x 10-13 M hasta 1,14 x 10-8 M. El 69 % de todos los anticuerpos analizados tenían una Kd por debajo de 0,5 nM.

La mediana de KD de 2,21 x 10-10 M y 2,09 x 10-10 M para la detección de coincidencias identificadas de los conejos n.° 2 y n.° 3 fueron similares, mientras que el conejo n.° 1 mostró valores aproximadamente 2 veces más altos con una mediana de KD de 4,65 x 10-10 M. Al considerar solo las coincidencias de detección neutralizantes, las distribuciones de la afinidad fueron similares para los tres animales con valores más bajos para la mediana de Kd (mediana de Kd entre 1,4 x 10-10 M y 1,27 x 10-10 M). Las afinidades por debajo de 0,041 nM, 0,029 nM y 0,026 nM se midieron para el 5 % de las coincidencias de detección para los conejos n.° 1, n.° 2 y n.° 3, respectivamente. Para el 2 % de los sobrenadantes, las afinidades estaban incluso en el intervalo picomolar bajo (por debajo de 6,2 pM, 7,9 pM y 11 pM). El excelente rendimiento de anticuerpos de alta afinidad resultantes de la detección secundaria proporciona una base amplia para la selección de los anticuerpos más apropiados para la humanización y el reformateo.

1.2.2.3 Potencia

Para la evaluación de la potencia, se ha desarrollado un ensayo basado en células (ensayo L929) (véase 2.2.3). 506 de los 894 anticuerpos seleccionados (56,6 %), inhibieron la apoptosis inducida por TNFa en el ensayo L929 en más del 50 %. De acuerdo con los resultados obtenidos durante el análisis de títulos, el mayor porcentaje de coincidencias neutralizantes se obtuvo del conejo n.° 3 con una tasa de coincidencias del 62,8 %, seguido por el conejo n.° 2 con una tasa de coincidencias del 56,4 % y el conejo n.° 1 con la tasa de coincidencias más baja del 39,9 %. Las afinidades de estos anticuerpos neutralizantes oscilaron entre 1,36 x 10-13y 1,19 x 10-9 M.

1.2.2.4 Reactividad cruzada de especies (mono Cynomolgus)

Las 894 coincidencias identificadas en la detección primaria, se analizaron para determinar la reactividad cruzada de especies con TNFa de mono Cynomolgus mediante ELISA (véase 2.2.1). El objetivo de esta detección adicional era permitir la selección de clones de ASC que se sabe que reaccionan de forma cruzada con TNFa de mono Cynomolgus. El procedimiento ELISA utilizado evalúa la "cantidad" de anticuerpos del subtipo IgG unidos al TNFa recombinante de mono Cynomolgus, sin embargo, no proporciona información sobre la afinidad o la concentración de los anticuerpos. Los sobrenadantes de 414 (46 %) clones de ASC produjeron una señal clara (densidad óptica (DO) > 1). El porcentaje de coincidencias con reactividad cruzada con el TNFa de mono Cynomolgus fue similar para el conejo n.° 1 y el conejo n.° 3 con 81 coincidencias de 153 (52,9 %) identificadas del conejo n.° 1 y 236 coincidencias de 484 identificadas del conejo n.° 3 (48,8 %). Con un 37,8 %, el conejo n.° 2 mostró un porcentaje ligeramente menor de coincidencias con reactividad cruzada, lo que resultó en la identificación de 82 coincidencias de 225.

1.2.2.5 Selección de clones para RT-PCR

Como requisito previo para la confirmación de coincidencias, el análisis de la secuencia genética y posterior humanización de los anticuerpos de conejo, es necesario recuperar la información genética que codifica el dominio variable del anticuerpo de conejo. Esto se hizo mediante transcripción inversa (RT) del respectivo ARN mensajero en el ADN complementario (ADNc), seguido de la amplificación del ADN bicatenario mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La selección de clones de ASC sometidos a RT-PCR se basó principalmente en la afinidad y la actividad neutralizante. Como criterio adicional, se consideró la reactividad cruzada con TNFa de mono Cynomolgus. En total, se seleccionaron 102 clones de ASC para la clonación de genes mediante RT-PCR. En primer lugar, se seleccionaron los 93 ASC de mejor clasificación (en términos de afinidad) con una Kd por debajo de 80 pM, que inhibieron la actividad biológica de TNFa en el ensayo L929 en más del 50 % y que mostraron una unión significativa al TNFa de mono Cynomolgus. De manera adicional, también se eligieron los 9 clones de ASC de mejor clasificación con Kd por debajo de 20 pM que neutralizaban la actividad de TNFa en más del 50 % pero no se unían al TNFa de mono Cynomolgus. En total, 12, 13 y 66 clones de ASC se amplificaron y secuenciaron con éxito a partir de los conejos n.° 1, n.° 2 y n.° 3, respectivamente.

1.2.2.6 Identificación de clones relacionados con propiedades deseadas

Con el fin de caracterizar la diversidad genética del panel de clones de ASC aislados, se extrajeron las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y se sometieron a un alineamiento de secuencias múltiples, lo que permitió la agrupación de secuencias en un árbol filogenético.

Si bien este análisis, por un lado, permite que la selección de un conjunto diverso de secuencias clonales se lleve a cabo en experimentos de humanización y reformateo, también identifica grupos de homólogos de secuencias clonales que parecían compartir un clon de linfocitos B parentales común en el conejo. El sello distintivo de estos grupos de secuencias es una alta homología de secuencia en las CDR y un patrón consistente de propiedades farmacodinámicas. Ambas características se resumen para un grupo de ocho clones en las Tablas 2 y 3. A pesar de la conservación funcional de este grupo de secuencias, la secuencia consenso de la Tabla 3 revela que se tolera una cierta variabilidad de las CDR, sin dejar de dar como resultado el perfil farmacodinámico deseado.

Tabla 2: Propiedades farmacodinámicas de los anticuerpos monoclonales en sobrenadantes de linfocitos B.

SN de

_{linfocitos B} Afinidad por el TNFa humano Afinidad por el TNFa de Cynomolgus Neutralización de TNFa ID. del

_clon ka (M 'V ) Kd (s-1) K^d (M) ka (M -V ) Kd (s-1) K^d (M) % de inhibición 16-12-E09 2,37E+06 1,42E-04 5,99E-11 2,46E+06 1,29E-04 5,23E-11 80 16-13-E01 3,12E+06 1,37E-04 4,40E-11 3,26E+06 1,45E-04 4,44E-11 86 16-15-E11 4,16E+06 2,90E-04 6,97E-11 6,36E+06 3,39E-04 5,33E-11 72 16-17-C08 2,54E+06 1,03E-04 4,06E-11 5,01E+06 1,41E-04 2,81E-11 74 16-17-G01 2,20E+06 6,13E-05 2,79E-11 3,50E+06 9,42E-05 2,69E-11 94 17-18-D10 1,08E+06 6,72E-05 6,20E-11 2,37E+06 8,72E-05 3,69E-11 104 17-22-B01 1,48E+06 1,06E-04 7,15E-11 2,61E+06 1,25E-04 4,79E-11 104 17-22-B03 1,43E+06 1,03E-05 7,23E-12 2,40E+06 3,93E-05 1,64E-11 98

Tabla 3: Se obtuvieron los siguientes datos de secuencia con respecto a las CDR para los clones anteriores:

(continuación)

1.2.2.7 Reactividad cruzada con TNFa de mono Cynomolgus (por SPR)

Debido a la gran cantidad de coincidencias de alta afinidad que neutralizaban potencialmente al TNFa, se evaluó la reactividad cruzada de especies para todos los anticuerpos monoclonales de conejo que se sometieron a RT-PCR con el fin de facilitar la selección de clones de ASC para la confirmación de coincidencias. Las afinidades por el TNFa de mono Cynomolgus se determinaron mediante mediciones de SPR de manera similar a como se ha descrito anteriormente (véase también 2.2.2). Las afinidades de los 93 anticuerpos analizados para el TNFa de mono Cynomolgus oscilaron entre 9,6 x 10-12 y 2,1 x 10-9 M. 38 de los 93 anticuerpos de reacción cruzada se unieron al TNFa humano y de Cynomolgus con una afinidad similar (menos del doble de diferencia en la K^d). Además, la diferencia en la afinidad entre seres humanos y monos Cynomolgus fue menos de 20 veces para 79 de los 93 anticuerpos con reactividad cruzada y menos de 10 veces para 62 de ellos, lo que los hace aceptables para el desarrollo preclínico en el mono Cynomolgus.

2. Procedimientos

2.1 Ensayo de clasificación

El procedimiento de clasificación basado en citometría de flujo para el aislamiento de linfocitos B específicos de antígeno a partir de tejido linfático de conejo se realizó como lo describen Lalor y col. (Eur J Immunol. 1992; 22.3001-2011)

2.2 Ensayos de detección

2.2.1 Se usó ELISA de unión a TNFa (TNFa humano y de mono Cynomolgus) TNFa humano recombinante (Peprotech, Cat. N.° 300-01) para revestir una placa ELISA de microtitulación de 96 pocillos.

La unión de anticuerpos de conejo en los sobrenadantes de cultivo de ASC al TNFa inmovilizado se detectó mediante una IgG secundaria anti-conejo marcada con HRP (Jacksonlmmuno Research, n.° cat. 111-035-046). Se añadió sustrato TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, KPL, cat. N.° 53-00-00) y la reacción de color se detuvo mediante la adición de H²SO⁴. Las placas se leyeron usando un lector de placas de microvaloración (Infinity reader M200 Pro, Tecan) a una longitud de onda de 450 nm.

El rendimiento del ensayo durante las campañas de detección se controló mediante un anticuerpo policlonal de conejo anti-TNFa control positivo disponible comercialmente (AbD Serotec, n.° cat. 9295-0174). Con este fin, el anticuerpo de control positivo se probó a 100 y 250 ng/ml por duplicado en cada placa de detección. Se controló la robustez y la precisión de la respuesta del control positivo para cada placa. En las condiciones finales del ensayo, la relación señal-fondo fue de entre 30 y 40 para el control positivo a 250 ng/ml y el coeficiente de variación (CV) del control positivo estuvo por debajo del 10 %. Una señal con una densidad óptica de > 100 % en relación con el control positivo de 250 ng/ml se consideró como una coincidencia de detección primaria.

Para las determinaciones de títulos séricos, se utilizó la misma configuración de ELISA que se ha descrito anteriormente. Una dilución de suero se consideró positiva cuando la señal de unión del suero inmune era al menos 3 veces mayor en comparación con la señal de un animal no emparentado intacto.

La reactividad cruzada de especies con el mono Cynomolgus se determinó usando un ELISA similar al descrito anteriormente. Se usó TNFa recombinante de mono Cynomolgus (Sino Biological, n.° cat. 90018-CNAE) para revestir placas ELISA de microtitulación de 96 pocillos. La unión de anticuerpos de conejo en los sobrenadantes de cultivo de ASC al TNFa de mono Cynomolgus inmovilizado se detectó mediante el anticuerpo secundario marcado con HRP como se ha especificado anteriormente. Se usó suero inmune de conejo n.° 2 como control positivo a una dilución de 1:80.000 y 1:320.000. Se controló la robustez y la precisión de la respuesta del control positivo para cada placa. En las condiciones finales del ensayo, la relación señal-fondo fue de entre 20 y 30 para el control positivo a una dilución de 1: 80.000 y los CV del control positivo fueron inferiores al 10 %.

2.2.2 Cinética de unión a TNFa por SPR (humano y mono Cynomolgus)

Las afinidades de unión de los anticuerpos por el TNFa humano se midieron mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento MASS-1 SPR (Sierra Sensors). El rendimiento del instrumento se calificó mediante soluciones de referencia patrón, así como mediante el análisis de una interacción anticuerpo-antígeno de referencia, tal como la interacción infliximab-TNFa. Para la detección de afinidad, se inmovilizó un anticuerpo específico para la región Fc de las IgG de conejo (Bethyl Laboratories, n.° cat. A120-111A) en un chip sensor (sensor de afinidad SPR-2, High Capacity Amine, Sierra Sensors) utilizando un procedimiento estándar de acoplamiento de amina. Los anticuerpos monoclonales de conejo en los sobrenadantes de ASC fueron capturados por el anticuerpo IgG anti-conejo inmovilizado. Después de capturar los anticuerpos monoclonales, se inyectó TNFa humano (Peprotech, n.° cat 300-01) en las celdas de flujo durante 3 minutos a una concentración de 90 nM y se dejó que la disociación de la proteína de la IgG capturada en el chip sensor prosiguiera durante 5 minutos. Después de cada ciclo de inyección, las superficies se regeneraron con dos inyecciones de glicina-HCl 10 mM. Las constantes de velocidad de disociación aparente (kd) y asociación (ka) y la constante de disociación en el equilibrio aparente (K^d) se calcularon con el software de análisis MASS-1 (Analyzer, Sierra Sensors) utilizando el modelo de unión de Langmuir uno a uno y la calidad de los ajustes se controló en función de la Chi2 relativa (Chi2 normalizada a nivel de la unión máxima extrapolada del analito), que es una medida de la calidad del ajuste de la curva. Para la mayoría de las coincidencias, el valor relativo de Chi2 fue inferior al 15 %. Los resultados se consideraron válidos si las unidades de respuesta (UR) para la unión del ligando eran al menos el 2 % de las UR para la captura de anticuerpos. Se consideró que las muestras con UR para la unión del ligando con menos del 2 % de las UR para la captura de anticuerpos no mostraban unión específica de TNFa al anticuerpo capturado.

Se midió la reactividad cruzada de especies con TNFa de mono Cynomolgus (Sino Biological, n.° cat. 90018-CNAE) usando la misma configuración de ensayo y concentraciones de TNFa y aplicando las mismas medidas de calidad. La Chi2 relativa estaba por debajo del 15 % para la mayoría de los sobrenadantes de ASC analizados.

2.2.3 Apoptosis inducida por TNFa en fibroblastos L929

La capacidad de las IgG de conejo de los sobrenadantes de cultivos de ASC para neutralizar la actividad biológica del TNFa humano recombinante se evaluó utilizando fibroblastos L929 de ratón (patrones ATCC/LGC, n.° cat. CCL-1). Las células L929 se sensibilizaron a la apoptosis inducida por TNFa mediante la adición de 1 pg/ml de actinomicina D. Las células se cultivaron en placas de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos en presencia de sobrenadante de cultivo ASC al 50 % y TNFa humano 100 pM (5,2 ng/ml) (Peprotech, n.° cat. 300-01) durante 24 horas. En comparación con los anticuerpos purificados, deben usarse concentraciones más altas de TNFa en presencia de sobrenadantes de ASC para la detección de coincidencias. La supervivencia de las células se determinó mediante un ensayo colorimétrico utilizando el reactivo de proliferación celular WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica) (Sigma Aldrich, n.° cat. 96992). WST-8 se reduce mediante deshidrogenasas celulares a un producto formazán naranja. La cantidad de formazán producida es directamente proporcional al número de células vivas. Los datos se analizaron utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros utilizando el software de análisis de datos Softmax (Molecular Devices) y se calculó la concentración de infliximab necesaria para neutralizar la apoptosis inducida por TNFa en un 50 % (CI⁵⁰) a una concentración de 36,2 ng/ml. Por lo tanto, el límite inferior estimado de detección para este ensayo está entre 30 y 40 ng/ml. Este valor es solo una estimación aproximada del límite de detección, ya que el potencial para bloquear TNFa no solo depende de la concentración del anticuerpo monoclonal sino también de la afinidad del anticuerpo por la diana. Sin embargo, la sensibilidad del ensayo es suficiente para la detección de sobrenadantes de ASC ya que las concentraciones de IgG en la mayoría de los sobrenadantes de ASC están por encima de una concentración de 40 ng/ml. Los sobrenadantes que dieron como resultado una neutralización del 50 % de la apoptosis inducida por TNFa se consideraron positivos.

Para asegurar un rendimiento robusto del ensayo durante las campañas de detección, el anticuerpo de control positivo infliximab se probó a 115 ng/ml (0,8 nM) y a 58 ng/ml (0,4 nM) por duplicado en cada placa de detección. Se controló el porcentaje de inhibición y la precisión de la respuesta para el control positivo para cada placa de detección. Los criterios de aceptación para cada placa se establecieron de la siguiente manera: inhibición de al menos un 60% con el anticuerpo de control positivo a una concentración de 115 ng/ml con un coeficiente de variación (CV) inferior al 20 %.

Ejemplo 2: Humanización y generación de scFv

1. Resultados

1.1 Confirmación de coincidencias y selección de coincidencias para humanización

Se recuperaron 73 conjuntos únicos de dominios variables parentales de cadena ligera y pesada de conejo durante la detección de coincidencias y se analizaron mediante alineación de secuencia. Basado en los resultados del ensayo de detección y la homología de secuencia de los clones individuales de IgG de conejo, se seleccionaron 30 candidatos para la confirmación de coincidencias. Se fabricaron 29 anticuerpos monoclonales y se seleccionaron los clones de mejor rendimiento en términos de afinidad y potencia para la humanización y la generación de candidatos principales. Los criterios para la selección de clones fueron i) neutralización de TNFa humano en el ensayo L929, ii) alta afinidad por TNFa humano, iii) reactividad cruzada con TNFa de mono Cynomolgus y Rhesus, y iv) diversidad de secuencia. Se ha seleccionado un clon (17-22-B03) para humanización, una de las IgG de mejor clasificación en términos de potencia para neutralizar el TNFa humano en el ensayo L929. Con respecto a la fuerza de unión, se desea una alta afinidad ya que se necesita anticipar una cierta pérdida de afinidad como resultado de la humanización y el reformateo en el formato scFv.

Los datos del clon de IgG n.° 17-22-B03 se resumen en la Tabla 4.

1.2 Generación y selección de fragmentos de scFv humanizados

Las secuencias que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se transfirieron in silico mediante injerto de bucle de CDR en una secuencia de armazón de dominio variable humano como se describe en el documento WO 2014/206561. Además, se generó una segunda construcción por clon de conejo, que transfirió aminoácidos adicionales desde la secuencia donante en posiciones con relevancia estructural para los dominios de inmunoglobulina y posicionamiento de CDR. Se sintetizó un gen artificial (con un uso de codón optimizado para la expresión bacteriana) que codifica el respectivo Fv de anticuerpo monocatenario humanizado (scFv) (a partir de las correspondientes cadenas ligeras y pesadas variables). A continuación, se produjo el polipéptido y posteriormente se caracterizó utilizando ensayos similares a los descritos durante la confirmación de la coincidencia.

1.2.1 Humanización y fabricación de scFv humanizados (API)

La humanización del clon seleccionado comprendió la transferencia de las CDR de conejo a un marco aceptor de scFv del tipo Vk1/VH3 como se describe en el documento WO 2014/206561. En este procedimiento, que se muestra esquemáticamente en la figura 1, la secuencia de aminoácidos de las seis regiones CDR se identificó en la secuencia donante (mAb de conejo) y se injertó en la secuencia del armazón aceptor, dando como resultado las construcciones denominadas "injerto de CDR".

Además, se diseñó un segundo injerto, que incluyó modificaciones de aminoácidos adicionales del donante de conejo en la posición L15, L22, L48, L57, L74, L87, L88, L90, L92, L95, L97, L99 y H24, H25, H56, H82, H84, H89, H108 (numeración AHo), que se ha descrito que influyen potencialmente en la posición de las CDR y, por tanto, la unión al antígeno (Borras y col., 2010, JBC 285:9054-9066). Esta construcción humanizada se denomina "injerto estructural (STR)". En caso de que la comparación de los datos de caracterización para estas dos construcciones iniciales revelara una ventaja significativa de la construcción STR, se diseñaron variantes adicionales que combinaban la VL injertada con CDR con VH injertada con STR. Se ha demostrado que esta combinación a menudo es suficiente para retener la actividad del injerto STR (Borras y col., JBC. 2010; 285: 9054-9066) y, en general, se preferiría ya que menos alteraciones no humanas en el armazón del aceptor humano reducen el riesgo de alteración de la estabilidad y también el potencial de inmunogenicidad.

Una vez que se completó el diseño de la construcción in silico descrito en la sección anterior, se sintetizaron los genes correspondientes y se construyeron los vectores de expresión bacteriana. La secuencia de las construcciones de expresión se confirmó a nivel del ADN y las construcciones se fabricaron de acuerdo con protocolos genéricos de expresión y purificación.

La expresión heteróloga de las proteínas se realizó en E. coli como cuerpos de inclusión insolubles. El cultivo de expresión se inoculó con un cultivo inicial de crecimiento exponencial. El cultivo se realizó en matraces de agitación en un agitador orbital utilizando medios ricos disponibles comercialmente. Las células se cultivaron hasta una DO⁶⁰⁰ definida de 2 y se indujeron mediante expresión durante la noche con isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM. Al final de la fermentación, las células se recolectaron por centrifugación y se homogeneizaron mediante ultrasonidos. En este punto, se determinó el nivel de expresión de las diferentes construcciones mediante análisis SDS-PAGE del lisado celular. Los cuerpos de inclusión se aislaron del sedimento celular homogeneizado mediante un protocolo de centrifugación que incluyó varias etapas de lavado para eliminar los restos celulares y otras impurezas de la célula huésped. Los cuerpos de inclusión purificados se solubilizaron en un tampón desnaturalizante (Tris/HCl 100 mM pH 8,0, Gdn-HCl 6 M, EDTA 2 mM) y los scFv se volvieron a plegar mediante un protocolo de replegamiento escalable que generó cantidades de miligramos de scFv monomérico plegado de forma nativa. Se empleó un protocolo estandarizado para purificar los scFv, que incluye las siguientes etapas. El producto después del replegamiento se capturó mediante una cromatografía de afinidad empleando agarosa Capto L (GE Healthcare) para producir los scFv purificados. Los candidatos principales que cumplieron con los criterios de afinidad y potencia en las pruebas iniciales se purificaron aún más mediante una cromatografía de exclusión por tamaño de pulido utilizando una columna HiLoad Superdex75 (GE Healthcare). Posteriormente al protocolo de purificación, las proteínas se formularon en una solución salina tamponada y se caracterizaron por los diversos procedimientos biofísicos, de interacción de proteínas y biológicos, como se describe a continuación. Se comparó la capacidad de producción de las diferentes construcciones determinando el rendimiento final de proteína purificada para el lote y normalizando este valor a 1 l de volumen de replegamiento.

1.2.2 Caracterización biofísica de scFv humanizado

La caracterización biofísica del scFv con respecto a la estabilidad y la producibilidad se compiló en la Tabla 5. La producibilidad y la estabilidad de la construcción scFv se caracterizaron por los diferentes puntos de notificación, como se analiza en las secciones siguientes.

El scFv se investigó según ciertos criterios, como se explica a continuación.

El criterio de producibilidad garantizará que la entidad scFv seleccionada pueda expresarse, replegarse y purificarse en cantidades suficientes para apoyar el desarrollo posterior de la molécula principal. Los criterios definidos fueron el rendimiento de expresión de scFv por litro de caldo de fermentación, según lo evaluado mediante SDS-PAGE y el rendimiento de purificación logrado en el procedimiento genérico a escala de laboratorio, según lo evaluado midiendo la cantidad de proteína purificada por espectrometría UV, calculado de nuevo a 1 litro de solución de replegamiento.

Los criterios de estabilidad estaban destinados a evaluar la propensión a la agregación durante el procedimiento de fabricación de las moléculas y su integridad estructural durante el almacenamiento y manipulación posterior. El contenido de monómeros determinado por SE-HPLC permite evaluar la estabilidad coloidal de las moléculas durante el procedimiento de purificación (2.2.3). En un estudio de estabilidad posterior, se probó el contenido de monómero durante 4 semanas a 1 y 10 mg/ml y almacenamiento a 4, -20 y <-65 °C. Adicionalmente, la estabilidad coloidal de las proteínas se probó después de 5 ciclos de congelación y descongelación. Como parámetro adicional indicador de estabilidad, el punto medio del desplegamiento térmico se determinó mediante fluorimetría de barrido diferencial (DSF) (2.2.4) para proporcionar una lectura de la estabilidad conformacional de los candidatos principales.

1.2.2.1 Evaluación de la producibilidad

Las moléculas scFv candidatas principales se expresaron mediante fermentación en matraz de agitación en modo discontinuo y se purificaron mediante un procedimiento genérico a escala de laboratorio para producir las muestras de proteínas para su posterior caracterización. Durante este procedimiento, se controlaron algunos parámetros clave de rendimiento para comparar las moléculas candidatas e identificar construcciones potencialmente difíciles de desarrollar. El título de expresión se determinó sobre el nivel del lisado de E. coli en bruto después de la recolección de las células mediante centrifugación. Durante la cosecha se prevé una pequeña pérdida de células, sin embargo, este factor se eligió para su omisión para el cálculo del rendimiento de expresión a favor de una estimación más conservadora de la productividad. Para la cuantificación del producto scFv en el lisado teñido con coomassie se eligió SDS-PAGE reductora (2.2.1) debido a la alta especificidad del procedimiento que permite discriminar el producto de las proteínas de la célula hospedadora en la muestra.

Un segundo criterio para evaluar la producibilidad es el rendimiento de purificación de scFv calculado por litro de solución de replegamiento. Este parámetro aborda el posible cuello de botella en el procedimiento de fabricación anticipado que incluye una etapa de replegamiento de proteínas. Dado que la eficacia del procedimiento de replegamiento ha demostrado ser limitante en procesos de fabricación comparables, se ha decidido comparar el rendimiento de las diferentes construcciones con respecto a la producibilidad normalizada a un volumen de replegamiento definido. Para el cálculo del rendimiento, la muestra de proteína final de cada lote se cuantificó mediante absorbancia UV (2.2.2) y se dividió por el volumen de replegamiento real de la purificación respectiva (Tabla 6).

Tabla 6: Sumario de los datos de producibilidad para tres scFv humanizados. El título de expresión se determinó mediante SDS-PAGE cuantitativa en lisados de células al final de la producción. El rendimiento del lote se determinó mediante la medición de la absorbancia UV del conjunto de purificación final. El rendimiento de la purificación se calcula como scFv purificado por litro de volumen de replegamiento.

ID de la Producibilidad

construcción

Título de expresión [g/l] Rendimiento Volumen de Rendimiento de del lote [mg] replegamiento [l] purificación [mg/ml] 17-22-B03-sc02 0,28 10,7 0,45 23,7

17-22-B03-sc08 0,47 21,7 0,49 44,3

17-22-B03-sc12 0,38 23,2 0,40 57,9

1.2.2.2 Evaluación de la estabilidad

La evaluación de la estabilidad conformacional, la monodispersidad y la integridad estructural de las construcciones de scFv es un componente integral para la clasificación de las diferentes moléculas con respecto a la capacidad de desarrollo. Un requisito previo para la comparación significativa de las diferentes construcciones es la preparación de moléculas purificadas de calidad similar. El criterio de "pureza del monómero" determinado por SE-HPLC tiene por objeto garantizar la calidad compatible de las diferentes sustancias de ensayo. Además del análisis SE-HPLC, se realizó SDS-PAGE para la determinación de la pureza e identidad de las proteínas para confirmar la calidad comparable de las preparaciones ensayadas.

Los resultados de SE-HPLC de los tres scFv revelan que todas las preparaciones pueden purificarse hasta un contenido de monómero de al menos 99 % (Figura 2).

El comportamiento de desplegamiento térmico de los candidatos principales se probó mediante fluorimetría de barrido diferencial (DSF) para permitir la clasificación de las moléculas con respecto a su estabilidad conformacional esperada. En la figura 3 se muestra un gráfico normalizado de los datos brutos de fluorescencia, que representa medidas duplicadas de cada muestra. Se observó un comportamiento de desplegamiento cooperativo. Las tres moléculas 17-22-B03-sc02, 17-22-B03-sc08 y 17-22-B03-sc12 mostraron una Tm de 77,5, 76,2 y 74,9 °C, respectivamente.

En un segundo brazo de la evaluación de la estabilidad, se controló la monodispersidad de las moléculas durante 4 semanas a diferentes temperaturas. Los resultados del estudio de estabilidad y el contenido de monómero resultante se muestran en la figura 4. Las tres moléculas (17-22-B03-sc02, 17-22-B03-sc08 y 17-22-B03-sc12) comienzan con un contenido de monómero que excede el mínimo del 95 % de monómero y pierden menos del 5 % de monómero con respecto al valor inicial respectivo a una concentración de 10 mg/ml. En estado congelado a -20 °C y <- 65 °C, las muestras solo mostraron diferencias mínimas a lo largo del tiempo. En las condiciones más estrictas (4 °C), la molécula 17-22-B03-sc08 perdió tan poco como un 0,5 % de monómero durante las 4 semanas. Además, se realizó un estudio de estabilidad frente al estrés a una temperatura de 37 °C y una concentración de scFv de 10 mg/ml durante un máximo de 4 semanas. En esta condición, se espera una discriminación más estricta de la propensión a la agregación de las diferentes construcciones. Los datos resultantes resumidos en la Figura 6 revelaron para 17-22-B03-sc02 y 17-22-B03-sc08 una pérdida de monómero del 28 % después de 28 días. Ambos scFv demostraron una buena estabilidad de los monómeros en condiciones de estrés. Los cromatogramas del estudio de estabilidad a 4 °C se proporcionan en la figura 5, donde se muestra la muestra el día 0 y después de 28 días a 4 °C. En esta superposición de cromatograma también se muestran los resultados de la estabilidad de congelación/descongelación. Para esta parte del estudio, las muestras se congelaron y descongelaron repetidamente durante un total de 5 ciclos. La cuantificación resultante del contenido de monómero por SE-HPLC analítica no reveló ningún cambio en las dos muestras (Tabla 5).

Se realizó un análisis SDS-PAGE para los dos scFv para generar datos de apoyo para la cuantificación por absorbancia UV, confirmando la pureza de la preparación de la muestra y confiriendo así especificidad para la cuantificación del contenido. En otro aspecto de este análisis, los resultados de SDS-PAGE revelaron la ausencia de degradación de proteínas durante el estudio de estabilidad (28 días a 4 °C y una concentración de 10 mg/ml en comparación con la muestra del día 0 almacenada a <-65 °C), que es una característica importante desde una perspectiva de desarrollo.

Es importante señalar que los diferentes estudios realizados dentro del ámbito de esta evaluación abordan distintos aspectos mecánicos de la estabilidad de las proteínas. La determinación de la temperatura de desplegamiento térmico de una proteína dará resultados complementarios a la medición de la monodispersidad por SE-HPLC tras el almacenamiento a temperatura elevada. Si bien ambos procedimientos están diseñados para dar una estimación de la vida útil y la estabilidad potenciales del producto, los mecanismos abordados son profundamente diferentes. El punto medio de transición (Tm) evaluado mediante desplegamiento térmico es una medida cualitativa de la estabilidad del dominio de la proteína (no permite la determinación termodinámica de AG). Es menos probable que los dominios de proteínas altamente estables (Tm alta) se desplieguen de forma espontánea a temperatura ambiente y, por lo tanto, son menos propensos a la agregación/precipitación irreversible impulsada por interacciones de dominios no plegados. La alta estabilidad del dominio indica un empaquetamiento denso de restos de aminoácidos, que también se correlaciona con la resistencia a la escisión por proteasa. La evaluación de SE-HPLC, por otro lado, determina cuantitativamente el contenido de la fracción monomérica, así como de oligómeros/agregados solubles. Dichos oligómeros solubles son a menudo asociaciones reversibles y relativamente sueltas impulsadas por interacciones electrostáticas o hidrofóbicas entre proteínas plegadas correctamente. Existe cierta correlación entre la Tm evaluada por el desplegamiento térmico y la propensión a la formación de oligómeros/agregados evaluada por SE-HPLC, en particular para proteínas con estabilidad en el "límite". Más allá de un cierto umbral Tm de aproximadamente 60 °C, los dominios variables del anticuerpo son generalmente suficientemente estables para ser resistentes a la agregación/precipitación y la degradación proteolítica debido al desplegamiento parcial del dominio a temperatura ambiente. La oligomerización impulsada por interacciones hidrófobas y/o electrostáticas de restos superficiales puede, sin embargo, seguir produciéndose. De manera importante, en un estudio de estabilidad acelerada (estrés) a temperatura elevada (por ejemplo, 37 °C), los diversos mecanismos de formación de oligómeros y precipitación pueden ocurrir simultáneamente.

1.2.3 Caracterización de la unión y actividad in vitro de scFv humanizados

A continuación, los scFv humanizados se caracterizaron in vitro por sus propiedades y potencias de unión a la diana. Se analizó la cinética de unión (ka, kd y KD) al TNFa humano y la potencia para neutralizar la apoptosis inducida por TNFa de los fibroblastos L929. De manera adicional, se determinó la potencia para inhibir la apoptosis inducida por TNFa de mono Cynomolgus (Macaca fascicularis) y mono Rhesus (Macaca mulatta), así como la potencia para inhibir la interacción entre TNFa humano y TNFRI/TNFRII mediante ELISA y la selectividad de la diana para la unión a TNFa sobre TNFp.

Para la comprensión de los resultados siguientes, es importante destacar que ambos, la transferencia de las CDR de conejo sobre un armazón de dominio variable humano y el cambio en el formato desde IgG de tamaño completo al fragmento scFv pueden afectar a las propiedades farmacológicas. Por ejemplo, una cierta pérdida de afinidad normalmente se asocia con humanización. Adicionalmente, debido al menor tamaño de los scFV en comparación con la IgG, la capacidad de un scFv para interferir con las parejas de interacción mediante impedimento estérico se reduce considerablemente. Por último, aunque no menos importante, cabe destacar que debido a su modo bivalente de unión al TNFa homotrimérico, la afinidad de la IgG parental puede haberse indicado como demasiado alta (artefacto SPR). En consecuencia, cuando se comparan afinidades entre la IgG de conejo bivalente parental y el scFv monovalente humanizado, la "pérdida en afinidad" notificada puede sobreestimarse.

1.2.3.1 Afinidad

La afinidad de los scFv humanizados por el TNFa humano se determinó mediante mediciones de SPR (véase también 2.1.1). La afinidad se determinó usando diluciones en serie por dos de los respectivos scFv. Los scFv procedieron de un anticuerpo monoclonal de conejo. Se generaron dos variantes de scFv, denominados "CDR" (CDR) e "injerto estructural" (STR). Para evaluar la contribución relativa de las sustituciones del marco en la cadena ligera y pesada y posiblemente reducir el número de restos de aminoácidos de conejo introducidos en el marco humano, se realizaron experimentos de barajado de dominios. Por lo tanto, se generaron construcciones de scFv que contenían una cadena ligera injertada con CDR y una cadena pesada injertada estructural (CDR/STR) para el clon 17-22-B03.

Los scFv de mayor rango 17-22-B03-sc02 (STR), 17-22-B03-sc08 (CDR/STR) y 17-22-B03-sc12 (CDR(C90S)/STR) se unieron con afinidades de 5,2 x 10^-11, 6,1 x 10^-11 y 4,8 x 10^-11 M, respectivamente. Casi no hubo variación en la afinidad entre las tres variantes de "injerto estructural" (véase Tabla 7).

1.2.3.2 Potencia

La capacidad de los scFv humanizados para neutralizar el TNFa humano se analizó usando el ensayo L929 (véase también 2.1.2). Se analizó la potencia (CI⁵⁰ y CI⁹⁰) para neutralizar la apoptosis inducida por TNFa para scFv derivados de 17-22-B03 y se comparó con la potencia del anticuerpo de referencia infliximab para permitir la comparación directa de los valores de CI⁵⁰ y CI⁹⁰ de diferentes placas de ensayo. Los valores relativos de CI⁵⁰ y CI⁹⁰ se calcularon en unidades de masa (ng/ml) de infliximab y scFv. El análisis de potencia se realizó varias veces en diferentes días con diferentes lotes de fragmentos de anticuerpos. La Figura 7 muestra curvas de dosis-respuesta representativas de un experimento para cada uno de los dos scFv. Los valores medios de las mediciones repetidas se muestran en la Tabla 7 (las desviaciones estándar se resumen en la leyenda de la tabla).

Los scFv humanizados inhibieron la apoptosis inducida por TNFa con valores de CI⁵⁰ y CI⁹⁰ más bajos que infliximab (véase la Tabla 7). De acuerdo con los resultados de SPR, la variante de dominio barajado 17-22-B03-sc08 (CDR/STR) exhibió la misma potencia en comparación con el injerto estructural 17-22-B03-scü2 (STR). Los scFv 17-22-B03-sc02, 17-22-B03-sc08 y 17-22-B03-sc12 mostraron excelentes actividades neutralizantes de TNFa, con valores de CI⁵⁰ de 23,7, 26,0 y 13,4 veces mejor que infliximab, respectivamente. El valor de CI⁹⁰ de 17-22-B03-sc02, 17-22-B03-sc08 y 17-22-B03-sc12 fueron 29,4, 26,6 y 11,7 veces mejor que para infliximab, respectivamente. Como se observó para los anticuerpos monoclonales de conejo parentales, no hubo una correlación clara entre la afinidad y la potencia de los anticuerpos (correlación no mostrada). De manera adicional, los resultados de los ensayos de neutralización sugieren que es necesario lograr un cierto umbral de afinidad para una inhibición eficaz de la señalización de TNFa. Por ejemplo, los scFv 16-14-D08-sc01 (CDR), 16-15-C09-sc01 (CDR), 16-24-H07-sc01 (CDR) y 17-20-G01-sc01 (CDR), todos unidos a TNFa con afinidades superiores a 1 nM, muestran poco potencial para neutralizar el TNFa (no mostrado).

1.2.3.3 Reactividad cruzada entre especies (TNFa de mono Cynomolgus y Rhesus)

La reactividad cruzada de especie para los scFv mejor clasificados se determinó mediante dos procedimientos: 1) potencia para neutralizar TNFa de mono Cynomolgus y mono Rhesus en el ensayo L929 y 2) afinidad por TNFa de mono Cynomolgus y mono Rhesus por SPR. La potencia para neutralizar el TNFa de las diferentes especies se determinó mediante el ensayo L929 de manera similar a como se ha descrito anteriormente para TNFa humano usando TNFa de mono Cynomolgus y mono Rhesus, respectivamente (véase también 2.1.2). El TNFa de ambas especies mostró una potencia muy similar para inducir la apoptosis de L929 (datos no mostrados). Por lo tanto, se utilizaron las mismas concentraciones de TNFa humano y de mono para las pruebas de reactividad cruzada de especie. De manera adicional, se determinó la cinética de unión (por SPR) al TNFa de mono Cynomolgus y mono Rhesus usando un ensayo similar a la del TNFa humano (véase también 2.1.1).

Todos los scFv derivados del clon 17-22-B03 mostraron reactividad cruzada con TNFa de mono Cynomolgus y mono Rhesus (véase la Tabla 7). Las afinidades eran similares, a saber, 5,0 x 10^{' 11} y 1,5 x 10^{' 10} M para el mono Cynomolgus y el mono Rhesus, respectivamente en el caso de 17-22-B03-sc02. La diferencia de afinidad entre el TNFa humano y de mono Rhesus fue de aproximadamente 3 veces, mientras que la afinidad por el TNFa del mono Cynomolgus era comparable al TNFa humano. (véase la Tabla 7 y la Figura 8). En resumen, los scFv derivados del clon 17-22-B03 mostraron reactividad cruzada de especies con TNFa de Cynomolgus y Rhesus.

1.2.3.4 Bloqueo de la interacción TNFa humano-TNFRI/II

Además del ensayo L929, la potencia de cada scFv humanizado para inhibir la interacción entre TNFa humano y TNFRI/II se evaluó mediante ELISA (véase 2.1.3). De manera similar al ensayo L929, los valores de CI⁵⁰ individuales en cada placa se calibraron frente a la CI⁵⁰ de la molécula de referencia infliximab que se tomó en cada placa y los valores relativos de CI⁵⁰ y CI⁹⁰ se calcularon en unidades de masa (ng/ml) de infliximab y los scFv.

Los ensayos de neutralización pueden distinguir las potencias de los anticuerpos bloqueantes de la diana solo si se unen a su diana con una constante de unión en el equilibrio (KD) que es mayor que la concentración de la diana utilizada en el ensayo de potencia (KD > concentración de la diana). Para el ensayo L929 se usó una concentración de TNFa de 5 pM mientras que en los ELISA de inhibición de TNFRI/II se usó una concentración de TNFa de 960 pM. Por lo tanto, teóricamente, el ensayo L929 puede diferenciar potencias entre scFv con KD > 5 pM, mientras que el ELISA de inhibición solo puede diferenciar potencias entre scFv con KD > 960 pM. Dado que todos los scFv analizados mostraron KD por debajo de 960 pM, las potencias entre scFv con diferentes afinidades (pero un mecanismo de acción similar) se pueden diferenciar sólo en el ensayo L929. 17-22-B03-sc02, 17-22-B03-sc08 y 17-22-B03-sc12 mostraron potencias para bloquear la interacción TNFa-TNFRI de 1,5, 2,3 y 1,5 veces mayor en comparación con infliximab, respectivamente, mientras que la potencia en comparación con infliximab en el ensayo L929 fue significativamente mayor (23,7, 26,0 y 13,4 veces). La inhibición de la interacción TNFa-TNFRII estuvo en un intervalo similar al del bloqueo de TNFa-TNFRI. Cuando se comparan los valores relativos de CI⁵⁰ para la IgG parental de conejo (véase la Tabla 4) con los valores relativos de CI^s0 para los scFv humanizados (Tabla 7), las potencias de los scFv son en general ligeramente superiores en comparación con las IgG parentales, aunque las afinidades en general están en mismo intervalo para la IgG parental de conejo. Dado que las potencias de los anticuerpos y scFv se compararon en unidades de masa, el número de valencias (sitios de unión de TNFa) en cada concentración es aproximadamente 2,9 veces mayor para los scFv monovalentes en comparación con la IgG más de cinco veces más pesada pero bivalente. Con scFv de unión de muy alta afinidad, esto da como resultado un bloqueo más potente de la interacción TNFa y TNFRI/II porque la falta de avidez ya no es crítica para la actividad. En contraste, con dominios monovalentes de baja afinidad se ha publicado lo contrario (Coppieters y col. Arthritis & Rheumatism 2006; 54: 1856-1866). Por las razones mencionadas anteriormente, los resultados del ELISA de inhibición no se utilizaron para clasificar las potencias entre los diferentes anticuerpos, sino principalmente para comparar el potencial de los anticuerpos para bloquear la interacción con TNFRI frente a TNFRII. Los scFv investigados bloquearon la interacción entre ambos receptores de TNFa con potencias comparables (Tabla 9, Figura 9 y Figura 10).

1.2.3.5 Especificidad diana (selectividad por la unión a TNFa frente a TNFp)

La especificidad de los tres scFv (17-22-B03-sc02, 17-22-B03-sc08 y 17-22-B03-sc12) para TNFa sobre TNFp se confirmó mediante la evaluación del potencial relativo de TNFp en comparación con TNFa para inhibir de forma semimáxima la unión de TNFa a cada scFv y se midió en un ELISA de competición (véase también 2.1.4). Se ha analizado la calidad del TNFp humano recombinante 1) para determinar su pureza mediante análisis SDS-PAGE y HPLC, y 2) para determinar la actividad biológica en el ensayo de citotoxicidad de L929 de ratón, por el fabricante de la proteína. Como se muestra en la figura 11, la interacción entre cada uno de los scFv con TNFa biotinilado fue bloqueada por TNFa no marcado con valores de CI⁵⁰ que varían de 60 a 260 ng/ml, mientras que el TNFp no mostró ningún efecto significativo incluso a la concentración más alta de TNFp probada (1250 pg/ml). Por tanto, todos los scFv analizados se unen específicamente a TNFa pero no a su homólogo más cercano, TNFp. El TNFp no mostró ninguna inhibición significativa de la unión de TNFa a scFv a las concentraciones ensayadas. Por lo tanto, la concentración de TNFp requerida para inhibir de forma semimáxima la unión de TNFa tiene que ser significativamente más alta que la concentración más alta de TNFp usada en el ensayo (1250 pg/ml). Cuando se comparan las concentraciones de TNFa y TNFp necesarias para inhibir de forma semimáxima la unión de TNFa a los scFv, la selectividad para la unión a TNFa sobre TNFp es significativamente mayor que aproximadamente 5.000 a 20.000 veces para todos los fragmentos analizados (véase también la Tabla 7). Por lo tanto, la unión fuera de la diana de cualquiera de los scFv parece muy poco probable.

Los resultados de los experimentos descritos anteriormente se resumen en las tablas 7 a 9.

Tabla 8. Especificaciones de scFv humanizados de la presente invención.

Expresión Producibilidad Estabilidad

Rendimiento Rendimiento Pérdida de monómero de expresión de Despliegue Pérdida de monómero s de 5 ciclos de replegamiento térmico [°C] después de 4 s a 10 g/l despué ngelación/descongelación [g/l] 1 a 4 °C (-65, -20) [A %] co

[mg/l] _________ [A%]_________ 17-22-B03-sc02 0,28 23,7 77,5 0,3 (0,0, 0,0) ^{0 , 0}

17-22-B03-sc08 0,47 44,3 76,2 0,5 (0,0, 0,1) ^{0 , 0}

17-22-B03-sc12 0,38 57,9 74,9 3,7 (0,1, 0,1) ^{0 , 1}

Tabla 9. Potencia de los scFv para bloquear la interacción TNFa-TNFRI y TNFa-TNFRII.

Bloqueo de la interacción TNF-TNFRI Bloqueo de la interacción TNF-TNFRII

scFv CI⁵⁰ rel.* CI⁹⁰ rel.^& CI⁵⁰ [ng/ml] CI⁹⁰ [ng/ml] CI⁵⁰ rel.* CI⁹⁰ rel.^& CI⁵⁰ [ng/ml] CI⁹⁰ [ng/ml]

17-22-B03- 1,5 1,4 33,4 70,5 1,4 1,8 71,1 123,5 sc02

17-22-B03- 2,3 2,5 21,2 39,2 2,8 2,7 35,3 80,1 sc08

17-22-B03- 1,5 nd nd nd 2,1 nd nd nd sc12

*:Cl_{50,|nfliximab} (ng/ml)/ Cl^50,scFv (ng/ml)

_& : Cl_{90,|nfliximat}, (ng/ml)/ Cl^90,scFv (ng/ml)

2. Procedimientos

2.1 Ensayos de caracterización principales

2.1.1 Cinética de unión y reactividad cruzada de especies por SPR

Las afinidades de unión de los scFv por el TNFa humano se midieron mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento MASS-1 SPR (Sierra Sensors). El rendimiento del ensayo SPR se calificó mediante el análisis de una interacción de antígeno de anticuerpo de referencia, tal como la interacción certolizumab-TNFa. El certolizumab-fragmento Fab pegilado se seleccionó como referencia debido a su modo de unión monovalente similar al de los scFv. Usando la misma configuración de ensayo que para las mediciones de afinidad de los scFv, se determinó un valor de 9,94 x 10-11 M para la afinidad de certolizumab por TNFa. Este valor concuerda bien con los valores de K^d publicados de 9,02 ± 1,43 x 10-11 M (certolizumab BLA; número BLA: 125.160; día de presentación: lunes, 30 de abril de 2007).

Para las mediciones de afinidad de scFv se inmovilizó TNFa humano (Peprotech, n.° cat. 300-01) en un chip sensor (sensor de afinidad SPR-2, Amine, Sierra Sensors) mediante acoplamiento de amina para alcanzar un nivel de inmovilización de 50 a 100 UR (los niveles de inmovilización alcanzados durante el análisis de SPR estuvieron entre 40 y 120 UR). En una primera etapa, la detección de afinidad de scFv se realizó usando sólo una concentración de scFv (90 nM). En una segunda etapa, para los scFv de mejor rendimiento, la cinética del ciclo de inyección única (SiCK) se midió a partir de un ciclo de inyección único inyectando simultáneamente seis muestras de analito a diferentes concentraciones en cada uno de los ocho canales paralelos en el sistema MASS-1. Para las detecciones de afinidad, se inyectaron scFv humanizados en las celdas de flujo a una concentración de 90 nM durante tres minutos y se controló la disociación durante 12 minutos. Para las posteriores determinaciones de afinidad más precisas, se inyectaron diluciones en serie por dos de scFv en el intervalo de 45 a 1,4 nM en las celdas de flujo durante tres minutos y se dejó que la disociación de la proteína de TNFa inmovilizado en el chip sensor prosiguiera durante 12 minutos. Las constantes de la velocidad de disociación aparente (kd) y asociación (ka) y la constante de disociación en el equilibrio aparente (Kd) se calcularon con el software de análisis MASS-1 (Analyzer, Sierra Sensors) utilizando el modelo de unión de Langmuir uno a uno y la calidad de los ajustes se monitorizaron conforme a Chi2, que es una medida de la calidad del ajuste de la curva. Cuanto menor sea el valor de Chi2, más preciso será el ajuste al modelo de unión de Langmuir uno a uno. Para las detecciones de afinidad, los resultados se consideraron válidos si el Chi² era inferior a 10 para la concentración analizada. En los casos en que se analizaron varias concentraciones de scFv, los resultados se consideraron válidos si el Chi² promedio de todas las concentraciones analizadas era inferior a 10. Se cumplieron los criterios de aceptación para todos los scFv analizados.

Se midió la reactividad cruzada de especies con TNFa de mono Cynomolgus (Sino Biological, n.° cat. 90018-CNAE) y mono Rhesus (R&D Systems, n.° cat. 1070-RM-025/CF) (Peprotech, n.° cat. 315-01A) usando la misma configuración de ensayo y aplicando las mismas medidas de calidad descritas anteriormente para el TNFa humano. Para el TNFa de mono Cynomolgus y mono Rhesus se lograron niveles de inmovilización que oscilan entre 50 y 180 UR y entre 90 y 250 Ur , respectivamente. Los scFv se analizaron usando diluciones en serie por dos con concentraciones en el intervalo de 45 a 1,4 nM. Los valores promedio de Chi² fueron inferiores a 10 para todos los scFv analizados.

2.1.2 Apoptosis inducida por TNF en fibroblastos L929 (neutralización de humanos, primates no humanos y TNFa por scFv)

La capacidad de los scFv para neutralizar la actividad biológica del TNFa humano recombinante se evaluó utilizando fibroblastos L929 de ratón (patrones ATCC/LGC, n.° cat. CCL-1). Las células L929 se sensibilizaron a la apoptosis inducida por TNF mediante la adición de 1 pg/ml de actinomicina D. Diluciones seriadas triples de anticuerpo de referencia anti-TNFa o scFv (3000-0,05 ng/ml) y TNFa humano recombinante 5 pM (Peprotech, n.° cat. 300-01) se preincubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La concentración de TNFa usada (5 pM) induce apoptosis submáxima de L929 (CE⁹⁰). Después de la adición de las mezclas de agonista/inhibidor, las células se incubaron durante 24 horas. La supervivencia de las células se determinó mediante un ensayo colorimétrico utilizando el reactivo de proliferación celular WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica) (Sigma Aldrich, n.° cat. 96992). WST-8 se reduce mediante deshidrogenasas celulares a un producto formazán naranja. La cantidad de formazán producida es directamente proporcional al número de células vivas. Los datos se analizaron utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros utilizando el software de análisis de datos Softmax (Molecular Devices) y se calculó la concentración del anticuerpo de referencia o los scFv necesarios para neutralizar la apoptosis inducida por TNFa en un 50 % y un 90 % (CI⁵⁰ y CI⁹⁰) (véase también la Figura 7). Con el fin de hacer que los valores de CI⁵⁰ y CI⁹⁰ sean directamente comparables entre los experimentos que se realizaron en diferentes días o en diferentes placas de ensayo, los valores de CI⁵⁰ y CI⁹⁰ se calibraron frente al anticuerpo de referencia infliximab. Para controlar la precisión de la respuesta, las curvas dosis-respuesta se analizaron por duplicado. Se calcularon las desviaciones estándar y los CV para cada punto de medición (CV <20 %).

Se midió la reactividad cruzada de especies con TNFa de mono Cynomolgus (Sino Biological, n.° cat. 90018-CNAE) y mono Rhesus (R&D Systems, n.° cat. 1070-RM-025/CF) usando la misma configuración de ensayo y aplicando las mismas medidas de calidad descritas anteriormente para el TNFa humano. De manera similar al homólogo humano, las concentraciones de TNFa que inducen la apoptosis submáxima de L929 (CE⁹⁰) se utilizaron para las pruebas de reactividad cruzada de especies. El TNFa de ambas especies mostró una potencia muy similar al TNFa humano para inducir apoptosis de fibroblastos de ratón L929. En consecuencia, se utilizó la misma concentración de TNFa (5 pM) para otras especies analizadas. Durante las pruebas de reactividad cruzada de especies, los CV de la mayoría de los puntos de medición por duplicado estuvieron por debajo del 10 %.

2.1.3 ELISA de inhibición de TNFa

El efecto inhibidor de scFv sobre la unión del ligando se evaluó usando un ELISA, un procedimiento bioquímico que reproduce únicamente la interacción entre TNFa y TNFRI y TNFRII.

Para el primer ELISA de inhibición, el dominio extracelular de TNFRI fusionado a la región Fc de la IgG humana (R&D Systems, n.° cat. 372-RI) se usó para revestir un ELISA Maxisorp de 96 pocillos a una concentración de 0,5 pg/ml. Para el segundo ELISA de inhibición, el dominio extracelular de TNFRII fusionado a la región Fc de la IgG humana (R&D Systems, n.° cat. 726-R2) se revistió a una concentración de 2 pg/ml. Todas las etapas posteriores fueron idénticas para ambos ensayos. Para detectar la unión de TNFa a TNFRI y TNFRII, el TNFa se biotiniló antes de su uso. Primero se incubó TNFa humano biotinilado (960 pM, 50 ng/ml) con scFv anti-TNFa humanizado diluido en serie 3 veces e infliximab (10.000 ng/ml-0,2 ng/ml) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las mezclas de TNFa/fragmento de anticuerpo se transfirieron a las placas con el receptor de t Nf inmovilizado y se detectó la unión de TNFa no bloqueado al receptor de TNFa inmovilizado después de la incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos con estreptavidina HRP de unión a biotina (SDT Reagents, n.° cat. SP40C). La adición de sustrato de 3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) dio como resultado una lectura colorimétrica que era proporcional a la unión de TNFa a TNFRI y TNFRII. Antes de su uso en el ELISA de competición, la actividad biológica del TNFa biotinilado se confirmó en el ensayo L929. La CE⁵⁰ del TNFa biotinilado fue similar a la CE⁵⁰ del TNFa sin marcar (datos no mostrados). Similar al ensayo L929 descrito anteriormente, los datos se analizaron utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros utilizando el software de análisis de datos Softmax (Molecular Devices) y se calculó la concentración de scFv necesarios para inhibir la interacción de TNFa y TNFR en un 50 % y un 90 % (CI⁵⁰ y CI⁹⁰). Con el fin de hacer que los valores de CI⁵⁰ y CI⁹⁰ sean directamente comparables entre los experimentos que se realizaron en diferentes días o en diferentes placas de ensayo, los valores de CI⁵⁰ y CI⁹⁰ se calibraron frente al anticuerpo de referencia infliximab.

Para controlar la precisión de la respuesta, las curvas dosis-respuesta se analizaron por duplicado. Se calcularon las desviaciones estándar y los CV para cada punto de medición (CV <25 %).

2.1.4 Especificidad de la diana

Para confirmar la especificidad de los scFv anti-TNFa, se evaluó la unión al miembro de la familia más homólogo TNFp. El potencial para inhibir la interacción de TNFa biotinilado con scFv por TNFp no marcado (Peprotech, n.° cat.

300-01B) y TNFa (Peprotech, n.° cat. 300-01) se analizó mediante ELISA de competición. Para este fin, se revistió una placa ELISA Maxisorp de 96 pocillos con scFv a una concentración de 1 pg/ml. Se detectó la unión de TNFa biotinilado (75 ng/ml) a los scFv del revestimiento en presencia de TNFa no marcado diluido en serie 5 veces (50 pg/ml - 0,00013 pg/ml) o TNPp (1250 pg/ml - 0,00013 pg/ml) utilizando estreptavidina-HRP de unión a biotina SDT Reagents, n.° cat. SP40C) como se ha descrito anteriormente. Para la curva de dosis-respuesta con TNFa, los datos se analizaron usando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros utilizando el software de análisis de datos Softmax (Molecular Devices) y se calculó la concentración de TNFa sin marcar requerida para bloquear la interacción de TNFa biotinilado con el scFv de revestimiento en un 50 % (CI⁵⁰). El TNFp no mostró ninguna inhibición significativa de la interacción entre el TNFa biotinilado y los scFv (véase también la Figura 11). Para cuantificar el potencial relativo de TNFp en comparación con TNFa para inhibir la unión de TNFa a cada scFv se calculó la CI⁵⁰ para inhibir la interacción por TNFp con respecto a TNFa. Dado que no se observó una inhibición significativa cuando se usó TNFp a una concentración de aproximadamente 5.000 a 20.000 veces mayor que la CI⁵⁰ de TNFa, se determinó que la selectividad para la unión a TNFa sobre TNFp era significativamente mayor que 5.000 a 20.000 veces. Para controlar la precisión de la respuesta, las curvas dosis-respuesta se analizaron por duplicado. Se calcularon las desviaciones estándar y los CV para cada punto de medición (CV < 25 % para todas menos una de las concentraciones de TNFa/p analizadas). Todos los scFv cumplieron este criterio.

2.2 Análisis de CMC

2.2.1 Reducción de SDS-PAGE

La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) es una técnica de análisis utilizada para la caracterización cualitativa y para controlar la pureza de las proteínas. De acuerdo con la Farmacopea de Estados Unidos (USP) (USP, Capítulo 1056), la electroforesis analítica en gel es un procedimiento apropiado y de rutina para identificar y evaluar la homogeneidad de proteínas en sustancias farmacológicas.

El procedimiento se utiliza para cuantificar la cantidad de producto scFv de lisados de E. coli para obtener el rendimiento de expresión después de la fermentación. Otra aplicación del procedimiento es verificar la identidad de las sustancias de ensayo en función de su peso molecular con respecto a los valores teóricos. Con fines de apoyo, este procedimiento se utiliza para cuantificar la pureza de las muestras de prueba con respecto a las impurezas relacionadas con el proceso (proteínas de la célula huésped) y las impurezas relacionadas con el producto (productos de degradación o aductos).

Los análisis de SDS-PAGE se realizaron con un sistema de gel prefabricado comercialmente disponible "Mini Protean" obtenido de Bio-Rad Laboratories Inc. Se analizaron scFv humanizados en geles de resolución "Cualquier kD" (n.° 456-9036). En ambos casos se utilizó el sistema tampón Tris/Glicina recomendado por el fabricante. Para la detección de bandas de proteínas se empleó tinción de Coomassie con la solución de tinción SimplyBlueTM (Life Technologies Corp., N.° LC6060) o la tinción con plata con el kit Pierce Silver Stain (Thermo Fisher Scientific Inc., N.° 24612). Para los procedimientos de tinción se siguieron los protocolos del respectivo proveedor.

La documentación y análisis de los geles de proteínas teñidos se realizó con el sistema de documentación ChemiDoc XRS System (Bio-Rad Laboratories Inc., N.° 170-8265) y software Image Lab, Versión 4.0.1 (Bio-Rad Laboratories Inc., N.° 170-9690).

Determinación de títulos de muestras de lisados

La SDS-PAGE permite la detección específica de la proteína de interés en la mezcla de proteínas de la célula hospedadora. En cada gel se incluyó una serie de diluciones estándar de referencia en el intervalo lineal del procedimiento (que se determinó de antemano). Se utilizó una regresión lineal de las intensidades de banda (medidas por densitometría) frente a las concentraciones nominales del estándar de referencia para calcular una curva patrón, lo que, a su vez, se utilizó para extrapolar el contenido de scFv en la muestra. Las muestras de lisado de concentraciones de producto desconocidas se cargaron en diferentes diluciones (al menos 1:10 en tampón de dilución) para tener al menos una concentración de scFv en el intervalo lineal del procedimiento. La cantidad de producto se calculó conforme a las intensidades de banda medidas del scFv y la concentración se determinó usando los factores de dilución de la preparación de la muestra. Los valores se promediaron para todas las muestras que estaban dentro del intervalo lineal de la curva patrón. Como prueba adicional de la idoneidad del procedimiento para la cuantificación de la muestra de lisado, se realizó una prueba de inhibición/mejora añadiendo una muestra de lisado con una cantidad conocida de patrón de referencia. El cálculo de la recuperación de picos a una dilución de la muestra de 1:10 en tampón de dilución dio como resultado un valor del 95,4 % que tiene el mismo nivel de precisión que el observado con el patrón de referencia en tampón de dilución. Por lo tanto, no se observó una interferencia significativa de la matriz en los lisados celulares y el procedimiento se consideró adecuado para la cuantificación del contenido de scFv en los lisados celulares.

Pureza y contenido de proteínas

Para demostrar la idoneidad del procedimiento para determinar el contenido y, por lo tanto, también la pureza de las muestras de prueba, el límite inferior de detección (LOD) para un scFv de referencia se determinó visualmente (identificando la banda de proteína) a una carga nominal de 0,02 |jg, la evaluación del histograma de intensidad de la calle respectiva muestra una relación señal/ruido a esta carga de aproximadamente 2. Además, el intervalo lineal para la cuantificación se determinó analizando densitométricamente las bandas principales.

El ajuste de los datos con una regresión lineal, da como resultado un coeficiente de determinación (R2) de 0,9998, lo que indica una buena calidad del ajuste. Además de la calidad general del ajuste, se determinó el error relativo de cada punto de datos individual para documentar la idoneidad del procedimiento en el intervalo elegido. Los errores relativos están por debajo del 10% para todos los puntos de datos que indican una buena precisión de este procedimiento.

2.2.2 Absorbancia UV a 280 nm

El procedimiento de absorbancia UV a 280 nm es un ensayo de proteína total como se describe en el Capítulo 1057 de la USP. Las soluciones de proteínas absorben la luz ultravioleta a una longitud de onda de 280 nm debido a la presencia de aminoácidos aromáticos. La absorbancia UV es una función del contenido de restos de tirosina y triptófano en la proteína y es proporcional a la concentración de proteína. La absorbancia de una solución de proteína desconocida se puede determinar de acuerdo con el Capítulo 851 de la USP sobre espectroscopía aplicando la ley de Beer: A= £*l*c, donde la absorbancia (A) es igual al producto de la absortividad molar (e), la longitud de la ruta de absorción y la concentración de la sustancia. La absortividad molar del scFv se calculó con el software Vector NTI® (Life Technologies Corporation).

La medición de la absorbancia UV se realizó con el lector Infinity M200 Pro equipado con placa Nanoquant (Tecan Group Ltd.). La absorbancia de las muestras de proteína se midió a 280 nm y 310 nm, donde la última longitud de onda sirvió como una señal de referencia que se restó de la señal de 280 nm. Para tener en cuenta la posible interferencia de la matriz de la muestra, se realizó una resta en blanco para cada medición. La señal de absorbancia final de una muestra de proteína obtenida se usó para calcular la concentración de proteína usando la ley de Lambert-Beer. Todas las mediciones se realizaron dentro del intervalo dado por las especificaciones del instrumento en el intervalo de medición de DO 0-4, cuando el fabricante especifique una reproducibilidad <1 % y una uniformidad <3 %.

2.2.3 SE-HPLC (cromatografía líquida de alta presión con exclusión por tamaño)

SE-HPLC es una técnica de separación basada en una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida como se describe en el capítulo 621 de la USP. Este procedimiento separa las moléculas en función de su tamaño y forma utilizando una fase estacionaria hidrófoba y una fase móvil acuosa. La separación de moléculas se produce entre el volumen de vacío (V⁰) y el volumen de permeación total (Vt) de una columna específica. Las mediciones por SE-HPLC se realizaron en un sistema Chromaster HPLC (Hitachi High-Technologies Corporation) equipado con inyección de muestra automatizada y un detector de UV ajustado a la longitud de onda de detección de 280 nm. El equipo está controlado por el software EZChrom Elite (Agilent Technologies, Versión 3.3.2 SP2) que también admite el análisis de los cromatogramas resultantes. Las muestras de proteína se aclararon mediante centrifugación y se mantuvieron a una temperatura de 6 °C en el muestreador automático antes de la inyección. Para el análisis de muestras de scFv se empleó la columna Shodex KW402.5-4F (Showa Denko Inc., # F6989201) con una fase móvil de solución salina tamponada estandarizada (acetato de sodio 50 mM a pH 6,0, cloruro de sodio 250 mM) al caudal recomendado de 0,35 ml/min. La carga de la muestra diana por inyección fue de 5 jg. Las muestras se detectaron mediante un detector de UV a una longitud de onda de 280 nm y los datos se registraron mediante un paquete de software adecuado. Los cromatogramas resultantes se analizaron en el intervalo de V⁰ a V^t excluyendo así los picos asociados a la matriz con un tiempo de elución > 10 min.

Para asegurar una precisión intermedia del procedimiento, se midió de forma rutinaria un patrón de referencia al principio y al final de cada secuencia de HPLC. El patrón de referencia utilizado para esta prueba de idoneidad del sistema fue un scFv que se había producido como un lote y se dividió en alícuotas para usarse en cada punto de tiempo de medición.

2.2.4 DSF (Fluorimetría diferencial de barrido)

El procedimiento DSF es un procedimiento no compendial para medir el desplegamiento de proteínas dependiente de la temperatura. La medición de la temperatura de desplegamiento térmico por DSF se realizó con una máquina de qPCR MX3005P (Agilent Technologies) controlada con el paquete de software MX Pro (Agilent Technologies) y equipada con un filtro de excitación/emisión ajustado a 492/610 nm. Las reacciones se prepararon en placas de PCR blancas Thermo fast 96 (Abgene; N.° AB-0600/W). Para la detección del desplegamiento de las proteínas, una solución madre disponible comercialmente del colorante SYPRO orange (Molecular Probes; n.° S6650) se utilizó a una dilución final de 1:1.000. Las muestras de proteína se diluyeron para las medidas de desplegamiento hasta una concentración final de 50 jg/ml en una solución salina tamponada estandarizada. El desplegamiento térmico se realizó mediante un programa de temperatura a partir de 25 °C aumentando hasta 96 °C en etapas de 1 °C con una duración de 30 segundos. Durante el programa de temperatura se registró la emisión de fluorescencia de cada muestra. Los datos brutos registrados se procesaron y evaluaron con un paquete de plantillas de Microsoft Excel (Niesen, Nature Protocols 2007, vol. 2 N.° 9) y los datos de fluorescencia se ajustaron con una ecuación de Boltzmann utilizando el programa GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) para obtener el punto medio de transición (T^m).

Con el fin de producir medidas fiables y robustas del punto medio del desplegamiento, se realizaron al menos medidas duplicadas. Con respecto a la calidad de los datos, solo se consideraron las mediciones con una bondad de ajuste (R²) > 0,9900 y un intervalo de confianza del 95 % de la T^m menor del 0,5 %.

Para una evaluación de la precisión intermedia, se incluyó un patrón de referencia (scFv caracterizado conocido) con cada medición para permitir la comparación del rendimiento del ensayo en diferentes días.

2.2.5 Estudio de estabilidad

Para evaluar la estabilidad de diferentes construcciones scFv como lectura de la capacidad de desarrollo de estas moléculas, se diseñó un protocolo de estudio de estabilidad a corto plazo. Las construcciones de proteínas se concentraron en una formulación salina tamponada simple (véase anteriormente) a las concentraciones diana de 1 y 10mg/ml. El contenido de monómero se determinó mediante SE-HPLC para confirmar que la pureza supera los criterios de éxito de > 95 %. Posteriormente, las muestras de proteínas se almacenaron a <-65, -20, 4 y 37 C durante 4 semanas y se analizaron alícuotas en varios puntos de tiempo. La lectura principal es el análisis por SE-HPLC, lo que permite la cuantificación de oligómeros y agregados solubles de peso molecular superior. Como medidas de apoyo, el contenido de proteínas se determina mediante la absorbancia UV a 280 nm, lo que da una indicación de si durante el período de almacenamiento se perdieron cantidades sustanciales de proteína por precipitación. Para el almacenamiento se utilizaron tubos con tapón de rosca (Sarstedt, n.° cat. 72.692.005) con cantidades de llenado de 30-1500 |jg por alícuota. Además, la pureza se determina mediante SDS-PAGE que indica la estabilidad de la construcción con respecto a la degradación o multimerización covalente.

Ejemplo 3: Generación de diacuerpo e IgG humanizados

La construcción de diacuerpo monocatenario se diseña ordenando los dominios variables en una configuración VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA. En estas construcciones, los dominios VLA y VHA y VLB y VHB forman conjuntamente el sitio de unión para TNFa. Los enlazadores peptídicos L1-L3 que conectan los dominios variables se construyen a partir de repeticiones de glicina/serina. Los dos enlazadores cortos L1 y L3 están compuestos por una sola repetición G⁴S (SEQ ID NO: 30), mientras que el enlazador largo L2 está compuesto por la secuencia (G⁴S)⁴ (SEQ ID NO: 29). Las secuencias de nucleótidos que codifican los dominios variables humanizados (Ejemplo 2; 1.2.1.) se sintetizan de novo y se clonaron en un vector adaptado para la expresión en E. coli que se basa en un esqueleto pET26b(+) (Novagen). La expresión y purificación se realizan como se describe para los scFv en el Ejemplo 2; 1.2.1.

La IgG humanizada se construyó clonando los dominios variables en un vector de expresión de mamífero adecuado para la expresión heteróloga transitoria que contiene una secuencia líder y los respectivos dominios constantes, por ejemplo, los vectores pFUSE-rlgG (Invivogen). La expresión transitoria de la IgG funcional se realiza mediante cotransfección de vectores que codifican las cadenas pesada y ligera con el sistema Freestyle™ MAX en células CHO S. Después de cultivar durante varios días, se recupera el sobrenadante de las células secretoras de anticuerpos para su purificación. Posteriormente, las IgG secretadas se purifican por afinidad mediante Proteína A sefarosa (GE Healthcare). Las fracciones de elución se analizan mediante SDS-PAGE, absorbancia UV a 280 nm y SE-HPLC.

Las afinidades de las moléculas de anticuerpo se determinan usando un instrumento Biacore como se describe en el Ejemplo 2 en 2.1.1).

Las potencias de las moléculas de anticuerpo se determinan en un ensayo L929 (el procedimiento se describe en el Ejemplo 2 en 2.1.2).

Ejemplo 4: Determinación de la estequiometría de unión de TNFa

La estequiometría de unión de 17-22-B03 a TNFa se determinó usando SE-HPLC. Se incubaron 17-22-B03-scFv y TNFa en dos relaciones molares diferentes, a saber, en una relación molar de 1:1 y 4,5:1. Dado que el TNFa existe como un trímero en solución, las relaciones molares indicadas se refieren al TNFa^trímero. Por lo tanto, en la proporción de 4,5:1, el 17-22-B03-scFv está en exceso y debería ocupar todas las posiciones de unión a TNFa^trímero dando como resultado complejos de 1 TNFa^trímero con 3 scFv. Sin embargo, en condiciones equimolares, no hay suficiente scFv presente para saturar los 3 sitios de unión teóricos de TNFa. Por lo tanto, también se esperan variantes complejas con menos de 3 scFv unidos. Se incubaron TNFa y 17-22-B03-scFv durante 2 horas a TA para permitir la formación del complejo. A continuación, las muestras se centrifugaron a 4 °C durante 10 minutos. Se analizaron 10 j l de cada muestra en SE-HPLC. El análisis SE-HPLC se realizó con tampón fosfato 50 mM a pH 6,5, NaCl 300 mM como eluyente a un caudal de 0,35 ml/min. Los picos de proteína eluida se detectaron a una longitud de onda de 280 nm. La columna se calibró con el kit de calibración de filtración en gel de GE Healthcare (LMW, HMW) de antemano para la determinación de los pesos moleculares aparentes.

El panel inferior de la figura 12 muestra el perfil de elución con cantidades equimolares de scFv y TNFa que está superpuesto con los perfiles de TNFa^trímero solo y scFv solo. Debido a la trimerización del TNFa en solución, existen teóricamente hasta tres sitios de unión equivalentes para el scFv presente en cada trímero y, por lo tanto, las moléculas de scFv son limitantes. En estas condiciones, se identificaron las tres especies complejas (3:1, 2:1, 1:1). El panel superior de la figura 12 muestra el perfil de elución del complejo con cantidades en exceso de scFv. El excedente de scFv no unido se eluyó en el tiempo de retención esperado. El pico de TNFa se consumió cuantitativamente para la formación del complejo y desapareció por completo. El pico de este complejo se desplazó hacia tiempos de retención más bajos y se correlacionó bien con el tiempo de retención del pico con el mayor peso molecular de la configuración equimolar. Por esta razón, se concluyó que todos los sitios de unión disponibles en el TNFa estaban ocupados por scFv y, por lo tanto, la estequiometría de unión es 3:1 (scFv:TNFa) si el scFv está disponible en exceso. Además de estas observaciones cualitativas, la estequiometría de unión aparente también se calculó basándose en el PM aparente del complejo 17-22-B03-scFv:TNFa según lo determinado mediante SE-HPLC. Basado en el tiempo de retención, se calculó que el PM aparente era 149,2 kDa. Según la ecuación (1) a continuación, se calculó que la estequiometría de unión aparente era 3,6. Esto se correlaciona bien con el número teórico de tres sitios de unión equivalentes disponibles para scFv en el TNFatrímero y las observaciones anteriores en las que se determinó una estequiometría de unión de 3:1.

Ecuación ( '1)’: esteq ” uiometría de unión ' (scFv. TNFa') = — — --------P--M--f-cr -P---n--t-h-o-n-\----i----------- ¿

PM (aplicación

compleja): 149.2 kDa

PM (TNFa theo): 52.2 kDa

PM (scFv theo): 26,5 kDa

Ejemplo 5: Formación de complejos de TNFa:anticuerpo (reticulación de TNFa)

La capacidad del 17-22-B03-diacuerpo para unirse simultáneamente a dos moléculas de TNFa se prueba en un instrumento Biacore T200 en tampón HEPES que contiene HEPES 10 mM, NaCl 150 mM y Tween al 0,05 %. Se captura TNFa biotinilado (Acro Biosystems) a través de un oligo ADNss biotinilado utilizando el kit Biotin CAPture (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se inyectan 0,25 pg/ml de TNFa biotinilado con un caudal de 10 pl/min durante 3 minutos para alcanzar un nivel de captura de aproximadamente 200 a 300 UR (unidades de resonancia). El diacuerpo y un 17-22-B03-scFv, como control, se inyectan sobre la superficie inmovilizada con TNFa durante 2 min a un caudal de 30 pl/min a una concentración de 90 nM. Tras la asociación de los fragmentos de anticuerpos, se inyecta TNFa (Peprotech) durante 5 minutos con un caudal de 30 pl/min a 90 nM. Las concentraciones de anticuerpo y TNFa se seleccionan cerca de la saturación de la unión. La medición se realiza a 25 °C. Se espera que el 17-22-B03-diacuerpo bivalente se una a dos moléculas de TNFa simultáneamente mientras, tal como se esperaba, el 17-22-B03-scFv monovalente se une solo a una molécula de TNFa.

Adicionalmente, la formación de complejos TNFa-anticuerpo se puede evaluar en diferentes proporciones de TNFa y formatos de anticuerpo 17-22-B03 usando SE-HPLC. Se incuban 17-22-B03-IgG (150 kDa) y 17-22-B03-scDb (­ 52 kDa) con TNFa (52 kDa) a diferentes proporciones molares (1:3, 1:1, 3:1) con respecto a los sitios de unión. Por lo tanto, IgG y scDb tienen 2 y TNFa tiene 3 sitios de unión. Las mezclas de anticuerpo-TNFa se incuban durante al menos 30 min a 37 °C, se enfrían durante 10 minutos a TA y se almacenan durante la noche a 2-8 °C. Se inyectan de cinco a 10 ul de mezcla de proteínas a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml en una columna TOSHO TSKgel UP-SW3000. El análisis se realiza con tampón fosfato 150 mM a pH 6,8, NaCl 100 mM como eluyente a un caudal de 0,3 ml/min. Los picos de proteína eluida se detectan a una longitud de onda de 214 nm. La columna se calibra previamente utilizando la mezcla estándar de proteínas BEH450 SEC (Waters) para la determinación de los pesos moleculares aproximados de los complejos. Los complejos que son > 600 kDa indican la formación de complejos que consisten en > 2 TNFa y > 3 moléculas de IgG. Los complejos que son > 300 kDa indican la formación de complejos que consisten en > 2 TNFa y > 3 moléculas scDb.

Ejemplo 6: Inhibición de la proliferación celular

La capacidad de diferentes formatos de anticuerpos de 17-22-B03 y adalimumab para inhibir la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se prueba en una reacción mixta de linfocitos (MLR). Se cultivan PBMC de 2 donantes sanos (RPMI1640) en una proporción 1:1 en placas de 96 pocillos durante 48 horas a 37 °C/5 % de CO². Después de la activación, las células se tratan con anticuerpos anti-TNFa o anticuerpo de control IgG (todos a una concentración final de 10 pg/ml) por sextuplicado durante otros 5 días a 37 °C/5 % de CO². 24 horas antes del final de la incubación, se añade BrdU (20 ul/pocillo) a cada pocillo y se determina la proliferación midiendo la absorción de BrdU usando un ELISA de proliferación celular disponible comercialmente (Roche Diagnostics). El índice de estimulación se determina calculando la proporción de captación de BrdU entre las células tratadas con anticuerpo y las células tratadas con mitomicina C (25 ng/ml). Se espera que todos los formatos de anticuerpos probados de 17-22-B03 inhiban significativamente la proliferación de linfocitos T de manera comparable a adalimumab.

Ejemplo 7: Inhibición de la secreción de citocinas inducida por LPS

Se siembran monocitos CD14+ en RPMI1640 en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 16 horas a 37 °C/CO² al 5 % en una incubadora humidificada. Luego, las células se tratan con anticuerpos anti-TNFa o anticuerpo de control IgG por duplicado durante 1 hora usando concentraciones finales de anticuerpo que varían de 2 a 2.000 ng/ml. Los monocitos se lavan 3 veces con medio de cultivo celular y posteriormente se incuban con LPS (100 ng/ml) durante 4 horas a 37 °C/5 % de CO². Las concentraciones de IL-1p y TNFa en los sobrenadantes del cultivo celular se determinan usando kits de ELISA disponibles comercialmente (R&D Systems). La CI⁵⁰ se determina utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo capaz de unirse al factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) humano, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional comprende (i) un dominio V^l que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24 y (ii) un dominio V^h que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 21.

2. El fragmento funcional de la reivindicación 1, que es un fragmento variable de cadena única (scFv).

3. El fragmento funcional de la reivindicación 2, en el que dicho scFv tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 27.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es una inmunoglobulina G (IgG).

5. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o el fragmento funcional de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

6. Un vector o plásmido que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5 o el vector o plásmido de la reivindicación 6.

8. Un procedimiento de preparación del anticuerpo o fragmento funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende cultivar la célula de la reivindicación 7 en un medio en condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento funcional y recuperar el anticuerpo o fragmento funcional de las células o del medio.

9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y, opcionalmente, un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. El anticuerpo o fragmento funcional según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno inflamatorio.

11. El anticuerpo o fragmento funcional para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal.

12. El anticuerpo o fragmento funcional para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal.

13. El anticuerpo o fragmento funcional para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en el que dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa.