KR102474765B1 - 항-TNFα-항체 및 이의 기능성 단편 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)에 결합할 수 있는, 항체 분자 및 이의 기능성 단편, 그것의 생산 방법, 및 그것의 치료 용도에 관한 것이다.

Description

항-TNFα-항체 및 이의 기능성 단편
발명의 분야
본 발명은 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)에 결합할 수 있는, 항체 분자 및 이의 기능성 단편, 그것의 생산 방법, 및 그것의 치료 용도에 관한 것이다.
배경
TNFα는 면역계의 세포에 의해 방출되고 상기 세포와 상호작용하는 호모-삼량체 전-염증성 사이토카인이다. TNFα는 또한, 만성 질환 예컨대 류마티스성 관절염, 크론병, 궤양성 대장염 및 다발성 경화증을 포함하는, 수많은 인간 질환에서 상향조절되는 것이 밝혀졌다.
TNFα에 대한 항체는 내독소 충격의 예방 및 치료를 위하여 제안되어 왔다 (Beutler 등, Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer 등, (Critical Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) 및 Wherry 등, (Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993)은 패혈성 쇼크의 치료에서 항-TNFα 항체의 치료 잠재성을 논의한다. 패혈성 쇼크의 치료에서 항-TNFα 항체의 용도는 Kirschenbaum 등, (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998)에 의해 또한 논의된다. 콜라겐-유도된 관절염은 항-TNFα 단클론성 항체를 이용하여 효과적으로 치료될 수 있다 (Williams 등 (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).
류마티스성 관절염 및 크론병의 치료에서 항-TNFα 항체의 용도는 Feldman 등 (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini 등 (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) 및 Feldman 등 (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997)에서 논의된다. 그와 같은 치료에서 이전에 사용된 TNFα에 대한 항체는 일반적으로 키메라성 항체, 예컨대 미국 특허 번호 5,919,452에서 기재된 것이다.
TNFα에 대한 단클론성 항체는 선행기술에서 기재되어 있다. Meager 등 (Hybridoma, 6, 305-311, 1987)은 재조합 TNFα에 대한 쥣과 단클론성 항체를 기재한다. Fendly 등 (Hybridoma, 6, 359-370, 1987)은 TNF에서 에피토프 중화의 정의에서 재조합 TNF에 대한 쥣과 단클론성 항체의 용도를 기재한다. 더욱이, 국제 특허 출원 WO 92/11383에서, TNFα에 특이적인, CDR-그라프팅된 항체를 포함하는, 재조합 항체는 개시된다. Rankin 등 (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995)는 류마티스성 관절염의 치료에서 그와 같은 CDR-그라프팅된 항체의 용도를 기재한다. 미국 특허 번호 5,919,452는 TNFα의 존재와 관련된 치료 병리학에서 이의 용도 및 항-TNFα 키메라성 항체를 개시한다. 추가 항-TNFα 항체는 하기에서 개시된다: Stephens 등 (Immunology, 85, 668-674, 1995), GB-A-2　246　570, GB-A-2　297　145, US　8,673,310, US　2014/0193400, EP　2　390　267　B1, US　8,293,235, US　8,697,074, WO 2009/155723 A2 및 WO　2006/131013　A2.
선행기술 재조합 항-TNFα 항체 분자는 일반적으로 초가변 영역 또는 CDRs이 유래되는 항체에 비교된 TNFα에 대하여 감소된 친화성을 갖는다. TNFα의 모든 현재 시판되는 억제제는 볼러스 주사로서 매주 또는 더 긴 간격으로 정맥내로 또는 피하로 투여되어, 다음 주사까지 꾸준히 감소하는 높은 출발 농도를 초래한다.
현재 승인된 항-TNFα 생물학적 치료제는 하기를 포함한다: (i) 인플릭시맙, 키메라성 IgG 항-인간 단클론성 항체 (Remicade®; Wiekowski M 등: "인플릭시맙 (Remicade)", Handbook of Therapeutic Antibodies, WILEY-VCH; Weinheim, 2007-01-01, p.885-904); (ii) 에타네르셉트, IgG1 Fc (Enbrel®)과, TNFR2 이량체성 융합 단백질; (iii) 아달리무맙, 완전히 인간 단클론성 항체 (mAb) (Humira®; Kupper H 등: "아달리무맙 (Humira)", Handbook of Therapeutic Antibodies, WILEY-VCH; Weinheim, 2007-01-01, p.697-732), (iv) 세르톨리주맙, 페길화된 Fab 단편 (Cimzia®; Melmed G Y 등: "세르톨리주맙 페골", Nature Reviews. Drug Discovery, Nature Publishing Group, GB, Vol. 7, No. 8, 2008-08-01, p.641-642); (v) 골리무맙, 인간 IgGlK 단클론성 항체 (Simponi®; Mazumdar S 등: "골리무맙", mAbs, Landes Bioscience, US, Vol. 1, No. 5, 2009-09-01, p.422-431). 그러나, 다양한 바이오시밀러는 개발 중이고, Remsima로서 공지된 인플릭시맙의 모방체는 유럽에서 이미 승인되어 있다.
인플릭시맙은 L929 검정에서 제한된 중화 효력 및 TNFα에 대해 상대적으로 저친화도 (KD > 0.2 nM; Weir 등, 2006, Therapy 3: 535)를 갖는다. 또한, 인플릭시맙은 사이노몰구스 또는 레수스 원숭이로부터 TNFα와 교차-반응성을 실질적으로 보여주지 않는다. 항-TNFα 항체를 위하여, 하지만, 원숭이로부터 TNFα와 교차-반응성은, 이것이 많은 측면에서 인간내 상황을 반영하는, 영장류로 동물 시험을 허용함에 따라, 아주 바람직하다.
에타네르셉트는, 2가 분자이어도, 1 삼량체 / 1 에타네르셉트 분자의 비로 TNFα를 결합시켜, 큰 항원-생물학적 치료제 복합체의 형성 (Wallis, 2008, Lancet Infect Dis 8: 601)을 방해한다. 단핵구에서 LPS-유도된 사이토카인 분비를 억제시키지 않는다 (Kirchner 등, 2004, Cytokine 28: 67).
아달리무맙의 효력은 인플릭시맙의 것과 유사하다. 아달리무맙의 또 다른 약점은, 예를 들면 열적 언폴딩 시험에서 결정된 경우, 그것의 좋지 못한 안정성이다. 그와 같은 시험에서 아달리무맙의 용융 온도 (Tm)은 67.5 ℃이도록 결정되었다. 항체의 Tm 값이 더 낮을수록, 하지만, 그것의 일반적인 안정성은 더 낮다. 더 낮은 Tm은 항체를 약제학적 용도에, 예를 들면 경구 투여에 덜 적합하게 만든다.
세르톨리주맙의 효력은 인플릭시맙의 것보다 약간 더 크지만, 여전히 만족하지 못한다. 세르톨리주맙은 MLR에서 T-세포 증식을 억제시키지 못한다 (Vos 등, 2011, Gastroenterology 140: 221).
EP2623515 A1은 인간화된 항-TNFα 항체 및 이의 항원-결합 단편 (Fab)를 개시한다. 개시된 예로부터 명백해짐에 따라, 수득한 인간화된 Fab 단편의 효력은 L929 중화 검정에서 인플릭시맙의 것과 비교할만하다 (참조 표 2 및 5). 교차-반응성에 대하여 시험된 단독 항-TNFα IgG 항체는 레수스 TNF-α에 단지 약하게 결합한다 (참조 [0069]; 도 3). 사이노몰구스 TNFα와 교차-반응성은 시험되지 않았다. 또한, 인간 TNFβ에 약한 결합이 있다 (참조 도 3). 따라서, EP2623515 A1은, 레수스 TNFα 및 사이노몰구스 TNFα와 교차-반응성인 그리고 인플릭시맙의 것 초과 L929 세포에서 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시키는 효력을 갖는, 항-TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편을 개시하지 않는다.
WO 2012/007880 A2는 하나 이상의 표적 (예를 들면 TNFα), 링커 및 하나 이상의 폴리머 분자에 결합하는 하나 이상의 단일 항원 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질의 형태로 변형된 단일 도메인 항원 결합 분자 (SDAB)를 개시한다. 주어진 유일한 특이적 예는 SDAB-01로 일컬어지고, 가요성 링커, 및 부위 특이적 페길화를 지지하는 C-말단 시스테인과 연결된, TNFα에 결합하는, 2 항원 결합 도메인을 포함한다 (참조 도 3). WO 2012/007880 A2는 L929 세포-기반 중화 검정에서 인플릭시맙 같은 공지된 TNFα 항체에 SDAB-01의 효력을 비교하는데, 또는 TNFβ보다 TNFα 결합에 대하여 선택성 및 TNFα-TNFRI/II 상호작용을 차단하는 유효성 같은 다른 SDAB-01-특이적 파라미터를 평가하는데 실패한다. SDAB-01 및 인플릭시맙으로 치료가 인간 TNFα를 과발현시키는 다발관절염용 유전자도입 마우스 모델에서 비교되는 검정에서 (참조 페이지 54, 실시예 8), 2개는 관절염의 추가 발생 예방에서 유사하게 효과적인 것처럼 보인다 (예를 들면 도 17&18). 그러나, 이 실시예에서 주어진 투약량은 SDAB-01의 분자량이 인플릭시맙의 것의 절반 미만임에 따라 오도된다. 따라서, WO 2012/007880 A2는 인플릭시맙의 것 초과 L929 세포에서 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시키는 효력을 갖는 항-TNFα 항체를 개시하지 않는다.
WO　2015/144852　A1은 "scFv1"로 지정된 항-TNF-α scFv의 특성을 조사한다. 이러한 scFv는 인플릭시맙의 것과 비교할만하였던 PK-15 세포 검정에서 TNFα 중화 수용력을 보여주었다 (참조 [0236]). 또한, scFv는 히말라야 원숭이 및 사이노몰구스 원숭이로부터 TNF-α에 일부 교차-반응성을 갖는 것처럼 보인다 (참조 실시예 8). 친화성 데이터는 WO　2015/144852　A1에서 보고되지 않는다. 단지 중간 정도 친화성 (KD=157 pM; 참조 Urech 등. 2010 Ann Rheum Dis 69: 443)을 갖는 것으로 공지되는, (또한 ESBA　105로서 공지된) 단쇄 항체 단편 DLX105는, 하지만, scFv1보다 TNFα에 더 양호한 결합을 보여준다 (참조 WO　2015/144852　A1의 도 1). 따라서, WO　2015/144852　A1은 인간 TNFα에 대하여 고친화도 (KD < 100 pM)을 갖는 항-TNF-α 항체를 개시하지 않는다.
WO　2015/065987　A1은 항-TNF-α 항체, 항-IL-6 항체, 및 양쪽 항원에 결합하는 이중특이적 항체를 기재한다. 특정 항-TNFα 항체는 사이노몰구스로부터 TNFα와 일부 교차-반응성을 보여주었다 (도 17). 항-TNFα 항체는, 하지만, L929 중화 검정에서 인플릭시맙보다 상당히 더 낮은 효력을 나타냈다 ([0152]; 도 5). 따라서, WO　2015/065987　A1은 인플릭시맙의 것 초과 L929 세포에서 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시키는 효력을 갖는 항-TNF-α 항체를 개시하지 않는다.
Drugs in R&D, Vol. 4 No. 3, 2003, pages 174-178은 인간화된 항체 "휴미케이드(Humicade)" (CDP 571; BAY 103356), 고친화도를 가진 단클론성 항-TNF-α 항체를 기재한다. L929 세포에서 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시키는 휴미케이드의 효력은, 하지만, 제한되는 것처럼 보인다 (참조, 예를 들면, US 2003/0199679 A1 [0189]). 참조문헌은 따라서 인플릭시맙의 것 초과 L929 세포에서 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시키는 효력을 갖는 항-TNF-α 항체를 개시하지 않는다.
Saldanha J W 등: "Molecular Engineering I: Humanization", Handbook of Therapeutic Antibodies, Chapter 6, 2007-01-01, WILEY-VCH, Weinheim, p.119-144는 CDR 그라프팅, 재표면화/베니어링, SDR 전이 및 탈면역화 기술을 포함하는 단클론성 항체의 인간화를 위하여 상이한 전략을 개시한다.
만성 염증성 질환 예컨대 염증성 장 장애를 치료하기 위한 개선된 항체 분자가 필요하다. 항체 분자는 적어도 (i) 인간 TNFα에 대하여 고 친화성 (즉 KD < 100 pM), (ii) L929 세포에서 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시키는 높은 효력, (iii) 사이노몰구스 및 레수스로부터 TNFα에 대한 실질적인 친화성 (예를 들면 KD < 1 nM), 및 (iv) 열적 언폴딩 실험에서 결정된 경우 가변 도메인의 높은 용융 온도 (예를 들면 Tm > 70℃)를 가져야 한다.
발명의 요약
본원의 발명자들은 특정 항-TNFα 항체 및 이의 기능성 단편이, 인간 TNFα에 대하여 고친화도 (KD < 100 pM), 인플릭시맙의 것 초과 L929 세포에서 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시키는 효력, 및 동물 예컨대 사이노몰구스 원숭이 (마카카 파스시쿨라리스) 및/또는 히말라야 원숭이 (마카카 물라타)로부터 TNFα에 대한 실질적인 친화성 (KD < 1 nM)을 포함하는, 양호한 특성의 조합을 나타낸다는 것을 알아내었다. 또한, 항체 및 이의 기능성 단편은 이들이, 가변 도메인의 열적 언폴딩 검정에서 결정된 경우, 상당한 안정성을 나타내지 않았고, TNFβ에 상당히 결합하지 않았다는 점에서 TNFα에 특이적이었다.
본 발명은 항체 분자 및 이의 기능성 단편을 제공한다.
본 발명은 따라서 다음과 같은 항목 (1) 내지 (47)에서 한정된 요지에 관한 것이다:
(1) 인간 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 기능성 단편으로서, 상기 항체 또는 기능성 단편이 (i) 서열 식별 번호:1에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별 번호:2에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별 번호:3에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인, 및 (ii) 서열 식별 번호:4에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별 번호:5에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별 번호:6에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 기능성 단편.
(2) 항목 (1)에 있어서, 상기 항체 또는 기능성 단편이 (i) 서열 식별 번호:7에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별 번호:8에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별 번호:9에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인, 및 (ii) 서열 식별 번호:10에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별 번호:11에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별 번호:6에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 기능성 단편.
(3) 항목 (1) 내지 (2) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 기능성 단편이 서열 식별 번호:21에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 기능성 단편.
(4) 항목 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 기능성 단편이 서열 식별 번호:22, 서열 식별 번호:23 및 서열 식별 번호:24로 구성되는 군으로부터 선택된, 바람직하게는 서열 식별 번호:22 및 서열 식별 번호:23으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 기능성 단편.
(5) 항목 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편이 인간 TNFα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 기능성 단편.
(6) 항목 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편이 TNFβ에 상당히 결합하지 않는 항체 또는 기능성 단편.
(7) 항목 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 기능성 단편이 하기인 항체 또는 기능성 단편:
(i) 100 pM 미만의 해리 상수 (KD)로 인간 TNFα에 결합함;
(ii) 마카카 물라타 TNFα와 그리고 마카카 파스시쿨라리스 TNFα와 교차-반응성임;
(iii) L929 검정에 의해 결정된 경우, 인플릭시맙 초과 효력을 가짐;
(iv) 적어도 2의 화학양론 (항체 : TNFα삼량체)로 인간 TNFα삼량체에 결합할 수 있음.
(8) 항목 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 75 pM 미만의 KD를 가진 인간 TNFα에 결합하는 항체 또는 기능성 단편.
(9) 항목 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 1 nM 미만의 KD로 마카카 물라타로부터 TNFα에 결합하는 항체 또는 기능성 단편.
(10) 항목 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 1 nM 미만의 KD로 마카카 파스시쿨라리스로부터 TNFα에 결합하는 항체 또는 기능성 단편.
(11) 항목 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, L929 검정에서 결정된, 인플릭시맙의 것 (상대 효력)에 비해 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시키는 항체 또는 기능성 단편의 상기 효력이 5 초과이고, 상기 상대 효력이 L929 검정에서 인플릭시맙의 ng/mL로 IC50 값 대 L929 검정에서 scFv 포멧내 항체의 ng/mL로 IC50 값의 비인 항체 또는 기능성 단편.
(12) 항목 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 형광측정법에 의해 결정된, scFv 포멧내 항체의 가변 도메인의 상기 용융 온도가 적어도 65℃인 항체 또는 기능성 단편.
(13) 항목 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 형광측정법에 의해 결정된, scFv 포멧내 항체의 가변 도메인의 상기 용융 온도가 적어도 70℃인 항체 또는 기능성 단편.
(14) 항목 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 형광측정법에 의해 결정된, 상기 용융 온도가 적어도 75℃인 항체 또는 기능성 단편.
(15) 항목 (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 있어서, 5 연속 냉동-해동 사이클후, 단량체 함량에서 손실이 0.2% 미만인 항체 또는 기능성 단편.
(16) 항목 (1) 내지 (15) 중 어느 하나에 있어서, 4℃에서 4 주 저장후, 단량체 함량에서 손실이 1% 미만인 항체 또는 기능성 단편.
(17) 항목 (1) 내지 (16) 중 어느 하나에 있어서, 억제 ELISA에서 결정된 경우, 인플릭시맙의 것 (상대 효력)에 비해, 인간 TNFα와 TNF 수용체 I (TNFRI) 사이 상호작용을 차단하는 항체 또는 기능성 단편의 효력이 적어도 1.3이고, 상기 상대 효력이 인플릭시맙의 ng/mL로 IC50 값 대 scFv 포멧내 항체의 ng/mL로 IC50 값의 비인 항체 또는 기능성 단편.
(18) 항목 (1) 내지 (17) 중 어느 하나에 있어서, 억제 ELISA에서 결정된 경우, 인플릭시맙의 것 (상대 효력)에 비해, 인간 TNFα와 TNF 수용체 II (TNFRII) 사이 상호작용을 차단하는 항체 또는 기능성 단편의 효력이 적어도 1.3이고, 상기 상대 효력이 인플릭시맙의 ng/mL로 IC50 값 대 scFv 포멧내 항체의 ng/mL로 IC50 값의 비인 항체 또는 기능성 단편.
(19) 항목 (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 혼합된 림프구 반응에서 말초 혈액 단핵 세포의 세포 증식을 억제시킬 수 있는 항체 또는 기능성 단편.
(20) 항목 (1) 내지 (19) 중 어느 하나에 있어서, CD14+ 단핵구로부터 인터류킨-1β의 LPS-유도된 분비를 억제시킬 수 있는 항체 또는 기능성 단편.
(21) 항목 (20)에 있어서, 인터류킨-1β의 LPS-유도된 분비 억제용 IC50 값이 1 nM 미만인 항체 또는 기능성 단편.
(22) 항목 (21)에 있어서, 몰 기준으로, 인터류킨-1β의 LPS-유도된 분비 억제용 IC50 값이 아딜루무맙의 것보다 낮은 항체 또는 기능성 단편.
(23) 항목 (1) 내지 (22) 중 어느 하나에 있어서, CD14+ 단핵구로부터 TNFα의 LPS-유도된 분비를 억제시킬 수 있는 항체 또는 기능성 단편.
(24) 항목 (23)에 있어서, TNFα의 LPS-유도된 분비 억제용 IC50 값이 1 nM 미만인 항체 또는 기능성 단편.
(25) 항목 (24)에 있어서, 몰 기준으로, TNFα의 LPS-유도된 분비 억제용 상기 IC50 값이 아달리무맙의 것보다 낮은 항체 또는 기능성 단편.
(26) 항목 (1) 내지 (25) 중 어느 하나에 있어서, 면역글로불린 G (IgG)인 항체.
(27) 항목 (1) 내지 (25) 중 어느 하나에 있어서, 단쇄 가변 단편 (scFv)인 기능성 단편.
(28) 항목 (27)에 있어서, 상기 scFv가 서열 식별 번호:25, 서열 식별 번호:26 및 서열 식별 번호:27로 구성되는 군으로부터 선택된, 바람직하게는 서열 식별 번호:25 및 서열 식별 번호:26으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 상기로 구성되는 기능성 단편.
(29) 항목 (1) 내지 (25) 중 어느 하나에 있어서, 디아바디인 기능성 단편.
(30) 서열 식별 번호:21에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 식별 번호:22, 서열 식별 번호:23 및 서열 식별 번호:24로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체로서 인간 TNFα에서 동일한 에피토프에 본질적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능성 단편, 바람직하게는 서열 식별 번호:22 및 서열 식별 번호:23으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되는 VL 도메인을 포함하는 기능성 단편으로서, 특히 상기 항체 또는 기능성 단편이 상기 본 명세서에서 항목 1 내지 29에서 참조된 하나 이상의 피쳐를 나타내는 항체 또는 이의 기능성 단편.
(31) 항목 (1) 내지 (30) 중 어느 하나에 있어서, (i) 서열 식별 번호: 31 내지 33 (참조 표 10)을 가진 각각의 인간 Vκ1 공통 서열과 상이한 상기 항체 또는 기능성 단편의 가변 경 도메인의 프레임워크 영역 I 내지 III에서 아미노산의 수, 및 (ii) 서열 식별 번호: 34 내지 37 (참조 표 11)로부터 선택된 가장 유사한 인간 λ 생식계열-기반 서열과 상이한 상기 항체 또는 기능성 단편의 가변 경 도메인의 프레임워크 영역 IV에서 아미노산의 수의 합계가 7 미만, 바람직하게는 4 미만인 항체 또는 기능성 단편.
(32) 항목 (1) 내지 (31) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 기능성 단편의 가변 경 도메인의 프레임워크 영역 I 내지 III이 서열 식별 번호:31 내지 33, 각각을 가진 인간 Vκ1 공통 서열로 구성되고, 프레임워크 영역 IV가 서열 식별 번호:34 내지 37로부터 선택된 λ 생식계열-기반 서열로 구성되는 항체 또는 기능성 단편.
(33) 항목 (1) 내지 (32) 중 어느 하나에 따른 항체 또는 기능성 단편을 인코딩하는 핵산.
(34) 항목 (33)에 따른 핵산을 포함하는 벡터 또는 플라스미드.
(35) 항목 (34)에 따른 핵산 또는 항목 (33)에 따른 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 세포.
(36) 항체 또는 기능성 단편을 인코딩하는 핵산의 발현을 허용하는 조건하에 배지에서 항목 (35)의 세포를 배양하는 단계, 및 항체 또는 기능성 단편을 세포로부터 또는 배지로부터 회수하는 단계를 포함하는, 항목 (1) 내지 (32) 중 어느 하나에 따른 항체 또는 기능성 단편의 제조 방법.
(37) 항목 (1) 내지 (32) 중 어느 하나에 따른 항체 또는 기능성 단편, 및 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 캐리어 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
(38) 항목 (1) 내지 (32) 중 어느 하나에 있어서, 염증성 장애 또는 TNFα-관련된 장애의 치료 방법에서 사용하기 위한 항체 또는 기능성 단편.
(39) 항목 (38)에 있어서, 상기 염증성 장애 또는 TNFα-관련된 장애가 아래 "치료되는 장애" 섹션에서 열거된 장애 및 질환의 목록으로부터 선택되는 사용하기 위한 항체 또는 기능성 단편.
(40) 항목 (38)에 있어서, 상기 염증성 장애가 위장관의 염증성 장애인 사용하기 위한 항체 또는 기능성 단편.
(41) 항목 (40)에 있어서, 위장관의 상기 염증성 장애가 염증성 장 질환인 사용하기 위한 항체 또는 기능성 단편.
(42) 항목 (40) 또는 (41)에 있어서, 위장관의 상기 염증성 장애가 크론병인 사용하기 위한 항체 또는 기능성 단편.
(43) 항목 (42)에 있어서, 상기 크론병이, 임의의 상기 언급된 질환 행동 및 국재화의 임의의 조합을 허용하는, 회장, 결장, 회결장, 및/또는 단리된 상위 크론병 (위, 십이지장 및/또는 공장)으로 구성되는 그리고 비-협착/비-침윤, 협착, 침윤 및 항문주위 질환 행동을 포함하는 군으로부터 선택되는 사용하기 위한 항체 또는 기능성 단편.
(44) 항목 (40) 또는 (41)에 있어서, 위장관의 상기 염증성 장애가 궤양성 대장염인 사용하기 위한 항체 또는 기능성 단편.
(45) 항목 (44)에 있어서, 상기 궤양성 대장염이 궤양성 직장염증, 직장낭창염, 좌측 결장염, 팬-궤양성 대장염, 및 맹낭염으로 구성된 군으로부터 선택되는 사용하기 위한 항체 또는 기능성 단편.
(46) 항목 (40) 또는 (41)에 있어서, 위장관의 상기 염증성 장애가 현미경적 결장염인 사용하기 위한 항체 또는 기능성 단편.
(47) 항목 (38) 내지 (46) 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 항체 또는 기능성 단편을 대상체에 경구로 투여하는 것을 포함하는 사용하기 위한 항체 또는 기능성 단편.
도 1: 인간화 공정의 도식적 표현.
도 2: scFv의 정제된 인간화된 scFv 제제의 SE-HPLC 크로마토그램. scFv 단량체는 8.4와 9.5 분 사이 체류 시간을 용출시키고, 반면 완충액 성분은 >10 분에서 용출시킨다. 최대 각각의 scFv 단량체의 칼럼의 불용 용적으로부터 모든 피크는 응집물/올리고머로서 통합되었고 상대 피크 면적의 계산을 위하여 사용되었다.
도 3: 3개의 scFv 작제물의 DSF 측정으로부터 열적 언폴딩 곡선. 각각의 작제물에 대하여 2중 측정은 보여진다. 수득한 Tm 값은 전달의 중간점을 수득하기 위해 볼츠만 방정식에 데이터를 적합화시킴으로써 결정되었다.
도 4: 저장 동안 3개의 scFv 작제물의 단량체 함량의 시간경과. SE-HPLC에 의해 결정된 경우 단량체 함량은 4 주의 지속기간 동안 저장 온도 4, -20 및 <-65℃에 대하여 플롯팅되었다.
도 5: 3 scFv 분자에 대한 SE-HPLC 크로마토그램의 오버레이. 각각의 scFv에 대하여, 4℃에 4 주 동안 저장후 및 d0에서 샘플 (10 mg/mL)는 보여진다. 또한, 냉동 및 해동의 5 사이클후 샘플의 크로마토그램은 보여진다. 삽입된 패널은 올리고머 함량에서 극소 변화를 또한 시각화하기 위해 각각의 분자에 대하여 y-축의 대략 15-배 줌을 보여준다.
도 6: 저장 동안 인간화된 scFvs의 단량체 함량의 시간경과. SE-HPLC에 의해 결정된 경우 단량체 함량은 4 주의 지속기간 동안 37℃의 저장 온도에서 10 mg/mL 샘플에 대하여 플롯팅되었다.
도 7: 3개의 scFvs의 L929 검정에서 인간 TNFα를 중화시키는 효력. scFvs 및 참조 항체 인플릭시맙에 대하여 용량-반응 곡선은 각각의 실험에 대하여 보여진다. 최고 scFv 및 인플릭시맙 농도 뿐만 아니라 음성 대조군은 성장의 100% 및 0%로 셋팅되었다.
도 8: L929 검정에서 비-인간 영장류 및 인간 TNFα를 중화시키는 2 scFvs의 효력. 인간, 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 원숭이 TNFα의 중화용 용량-반응 곡선은 보여진다. 최고 scFv 농도 및 음성 대조군은 성장의 100% 및 0%로 셋팅되었다.
도 9: TNFα-TNFRI 상호작용을 차단하는 2 scFvs의 효력. 용량-반응 곡선은 보여진다. 최고 scFv 농도 및 음성 대조군은 TNFRI에 TNFα의 결합의 0% 및 100%로 셋팅되었다.
도 10: TNFα-TNFRII 상호작용을 차단하는 2 scFvs의 효력. 용량-반응 곡선은 보여진다. 최고 scFv 농도 및 음성 대조군은 TNFRII에 TNFα의 결합의 0% 및 100%로 셋팅되었다.
도 11: scFv의 표적 특이성. TNFα 및 TNFβ에 의해 scFv와 바이오티닐화된 TNFα의 상호작용을 억제시키는 잠재력은 경쟁 ELISA에 의해 분석되었다. TNFα 및 TNFβ의 용량-의존적 효과는 보여진다.
도 12는 SE-HPLC에 의해 결정된 17-22-B03-scFv:TNFα 복합체의 형성을 도시한다 (실시예 4).
상세한 설명
본 발명은 인간 TNFα에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다.
본원의 문맥에서, 용어 "항체"는 부류 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD (또는 이의 임의의 서브클래스)에 속하는 단백질로서 정의되는, 그리고 모든 종래에 공지된 항체 및 이의 기능성 단편을 포함하는, "면역글로불린" (Ig)에 대하여 동의어로서 사용된다. 본 발명의 문맥에서, 항체/면역글로불린의 "기능성 단편"은 상기 본 명세서에서 항목 (1) 내지 (30)에서 참조된 그와 같은 친계 항체의 하나 이상의 특성을 본질적으로 유지하는 친계 항체의 항원-결합 단편 또는 다른 유도체로서 정의된다. 항체/면역글로불린의 "항원-결합 단편"은 항원-결합 영역을 보유하는 단편 (예를 들면, IgG의 가변 영역)으로서 정의된다. 항체의 "항원-결합 영역"은 전형적으로 항체의 하나 이상의 초가변 영역(들), 즉, CDR-1, -2, 및/또는 -3 영역에서 발견된다. 본 발명의 "항원-결합 단편"은 F(ab')2 단편 및 Fab 단편의 도메인을 포함한다. 본 발명의 "기능성 단편"은 scFv, dsFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 Fc 융합 단백질을 포함한다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1과 CL 도메인 사이 발생하는 분자간 디설파이드 상호작용을 최소화 또는 완전히 제거하기 위해 조작될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 이- 또는 다작용성 작제물의 일부일 수 있다.
본 발명에서 바람직한 기능성 단편은 scFv 및 디아바디이다.
scFv는 가변 경 ("VL") 및 가변 중 ("VH") 도메인이 펩타이드 브릿지에 의해 연결되는 단쇄 Fv 단편이다.
디아바디는, 링커 또는 기타 동종 (이하에서 디아바디-형성 단편으로서 지칭됨)을 통해 함께 연결된 가변 영역을 각각 갖는, 2개의 단편으로 구성되는 이량체이고, 전형적으로 2개 VLs 및 2개 VHs를 함유한다. 디아바디-형성 단편은 VL 및 VH, VL 및 VL, VH 및 VH, 등, 바람직하게는 VH 및 VL로 구성되는 것을 포함한다. 디아바디-형성 단편에서, 가변 영역을 연결하는 링커는 구체적으로 제한되지 않지만, 바람직하게는 동일한 단편에서 가변 영역 사이 비공유결합을 피하기에 충분히 짧다. 그와 같은 링커의 길이는 당해 분야의 숙련가에 의해 적절한 경우 결정될 수 있지만, 전형적으로 2-14 아미노산, 바람직하게는 3-9 아미노산, 특히 4-6 아미노산일 수 있다. 이 경우에, 동일한 단편에서 인코딩된 VL 및 VH는 동일한 쇄에서 VL과 VH 사이 비공유결합을 피하기에 그리고 단쇄 가변 영역 단편의 형성을 피하기에 충분한 짧은 링커를 통해 연결되어 이로써 또 다른 단편을 가진 이량체가 형성될 수 있다. 이량체는 어느 한쪽 공유 또는 비공유결합 또는 양쪽 디아바디-형성 단편 사이를 통해 형성될 수 있다.
또한, 디아바디-형성 단편은 링커 또는 기타 동종을 통해 연결되어 단쇄 디아바디 (sc(Fv)2)를 형성할 수 있다. 약 15-20 아미노산의 긴 링커를 이용하여 디아바디-형성 단편을 연결함으로써, 비공유결합은 이량체를 형성하기 위해 동일한 쇄에서 현존하는 디아바디-형성 단편 사이 형성될 수 있다. 디아바디 제조에 관해 동일한 원리에 기반하여, 중합된 항체 예컨대 삼량체 또는 사량체는 또한 3 이상의 디아바디-형성 단편의 연결에 의해 제조될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 TNFα에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항체 또는 기능성 단편이 인간 TNFα와 하나 이상의 참조 분자(들) 사이 식별할 수 있는 경우, 항체 또는 이의 기능성 단편은 인간 TNFα를 "특이적으로 인식하거나", "상기에 특이적으로 결합한다". 바람직하게는, 각각의 참조 분자에 결합용 IC50 값은, 특히 실시예 2, 섹션 2.1.4에서 기재된 바와 같이, TNFα에 결합용 IC50 값보다 적어도 1,000 배 더 크다. 그것의 가장 일반적인 형태에서 (그리고 정의된 참조가 언급되지 않는 경우), "특이적 결합"은, 예를 들어, 당해 분야에서 공지된 특이성 검정 방법에 따라, 결정된 경우, 인간 TNFα와 관련없는 생체분자 사이 식별하는 항체 또는 기능성 단편의 능력을 지칭하고 있다. 그와 같은 방법은, 비제한적으로, 웨스턴 블랏 및 ELISA 시험을 포함한다. 예를 들어, 표준 ELISA 검정은, 수행될 수 있다. 전형적으로, 결합 특이성의 결정은 단일 참조 생체분자가 아닌, 일련의 약 3 내지 5 관련없는 생체분자, 예컨대 밀크 분말, BSA, 트랜스페린 또는 기타 동종 이용에 의해 수행된다. 하나의 구현예에서, 특이적 결합은 인간 TNFα와 인간 TNFβ 사이 식별하는 항체 또는 단편의 능력을 지칭한다.
본 발명의 항체 또는 본 발명의 기능성 단편은 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함한다. VL 도메인은 CDR1 영역 (CDRL1), CDR2 영역 (CDRL2), CDR3 영역 (CDRL3) 및 프레임워크 영역을 포함한다. VH 도메인은 CDR1 영역 (CDRH1), CDR2 영역 (CDRH2), CDR3 영역 (CDRH3) 및 프레임워크 영역을 포함한다.
용어 "CDR"은 항원 결합에 주로 기여하는 항체의 가변 도메인 이내 6개 초가변 영역 중 하나를 지칭한다. 6개 CDRs에 대하여 가장 통상적으로 사용된 정의 중 하나는 하기에 의해 제공되었다: 카밧 E. A. 등, (1991) Sequences of proteins of immunological interest. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, CDRs의 카밧의 정의는 단지 경쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CDR L1, CDR L2, CDR L3, 또는 L1, L2, L3), 뿐만 아니라 중쇄 가변 도메인의 CDR2 및 CDR3 (CDR H2, CDR H3, 또는 H2, H3)에 적용한다. 중쇄 가변 도메인의 CDR1 (CDR H1 또는 H1)은, 하지만, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 다음과 같은 잔기 (카밧 넘버링)에 의해 정의된다: 위치 26으로 시작하고 위치 36에 앞서 종료한다.
VL 도메인의 CDR1 영역은 서열 식별 번호:1에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열로 구성된다. 바람직하게는, VL 도메인의 CDR1 영역은 서열 식별 번호:7, 서열 식별 번호:16, 서열 식별 번호:17 및 서열 식별 번호:19로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된다. 가장 바람직하게는, VL 도메인의 CDR1 영역은 서열 식별 번호:7에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열로 구성된다.
VL 도메인의 CDR2 영역은 서열 식별 번호:2에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열로 구성된다. 바람직하게는, VL 도메인의 CDR2 영역은 서열 식별 번호:8, 서열 식별 번호:13 및 서열 식별 번호:20으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된다. 가장 바람직하게는, VL 도메인의 CDR2 영역은 서열 식별 번호:8에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열로 구성된다.
VL 도메인의 CDR3 영역은 서열 식별 번호:3에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열로 구성된다. 바람직하게는, VL 도메인의 CDR3 영역은 서열 식별 번호:28에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열로 구성된다. 특정한 구현예에서, VL 도메인의 CDR3 영역은 서열 식별 번호:9에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열로 구성된다.
VH 도메인의 CDR1 영역은 서열 식별 번호:4에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열로 구성된다. 바람직하게는, VH 도메인의 CDR1 영역은 서열 식별 번호:10 및 서열 식별 번호:18로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된다. 가장 바람직하게는, VH 도메인의 CDR1 영역은 서열 식별 번호:10에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열로 구성된다.
VH 도메인의 CDR2 영역은 서열 식별 번호:5에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열로 구성된다. 바람직하게는, VH 도메인의 CDR2 영역은 서열 식별 번호:11, 서열 식별 번호:12, 서열 식별 번호:14 및 서열 식별 번호:15로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된다. 가장 바람직하게는, VH 도메인의 CDR2 영역은 서열 식별 번호:11에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열로 구성된다.
VH 도메인의 CDR3 영역은 서열 식별 번호:6에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열로 구성된다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 기능성 단편은 (i) 서열 식별 번호:1에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별 번호:2에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별 번호:3에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인, 및 (ii) 서열 식별 번호:4에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별 번호:5에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별 번호:6에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열에 따라 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함한다
특정한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 기능성 단편은 (i) 서열 식별 번호:7에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별 번호:8에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별 번호:9에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인, 및 (ii) 서열 식별 번호:10에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별 번호:11에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별 번호:6에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함한다
더 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 기능성 단편은 서열 식별 번호:21에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함한다. 또 다른 더 바람직한 구현예에서 항체 또는 기능성 단편은 서열 식별 번호:22, 서열 식별 번호:23 및 서열 식별 번호:24로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 더욱 더 바람직한 구현예에서 항체 또는 기능성 단편은 서열 식별 번호:22 및 서열 식별 번호:23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 기능성 단편은 (i) 서열 식별 번호:21에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인, 및 (ii) 서열 식별 번호:22, 서열 식별 번호:23 또는 서열 식별 번호:24에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 기능성 단편은 서열 식별 번호:21에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 식별 번호:22, 서열 식별 번호:23 및 서열 식별 번호:24로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 단쇄 항체 (scFv)이다. VH 도메인 및 VL 도메인은 바람직하게는 펩타이드 링커에 의해 연결된다. 펩타이드 링커 (이하에서 "링커A"로서 지칭됨)는 전형적으로 약 10 내지 약 30 아미노산, 더 바람직하게는 약 15 내지 약 25 아미노산의 길이를 갖는다. 링커A는 전형적으로 Gly 및 Ser 잔기를 포함하지만, 다른 아미노산은 또한 가능하다. 바람직한 구현예에서 링커는 서열 GGGGS (서열 식별 번호:30)의 다중 반복부, 예를 들면 서열 식별 번호:30에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열의 2 내지 6, 또는 3 내지 5, 또는 4 연속 반복부를 포함한다. 가장 바람직하게는, 링커A는 서열 식별 번호:29에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열로 구성된다. scFv는 (N-말단이 좌측이고 C-말단이 우측인) 다음과 같은 구조를 가질 수 있다:
VL-링커A-VH; 또는
VH-링커A-VL.
가장 바람직하게는, 기능성 단편은 서열 식별 번호:25, 서열 식별 번호:26 및 서열 식별 번호:27로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되는 단쇄 항체 (scFv)이다.
또 다른 특히 바람직한 구현예에서, 기능성 단편은 서열 식별 번호:21에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 식별 번호:22, 서열 식별 번호:23 및 서열 식별 번호:24로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 디아바디이다. VH 도메인 및 VL 도메인은 펩타이드 링커에 의해 연결된다. 펩타이드 링커 (이하에서 "링커B"로서 지칭됨)는 바람직하게는 약 2 내지 약 10 아미노산, 더 바람직하게는 약 5 아미노산의 길이를 갖는다. 링커B는 전형적으로 Gly 및 Ser 잔기를 포함하지만, 다른 아미노산은 또한 가능하다. 가장 바람직하게는, 링커B는 서열 식별 번호:30에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열로 구성된다.
디아바디는 바람직하게는 단일특이적 디아바디이다, 즉 1개의 에피토프만에 관한 것이다. 디아바디는 바람직하게는 호모다이머이다. 디아바디는 서로에 대해서 비-공유결합되는 2개 폴리펩타이드 쇄의 이량체일 수 있다. 각각의 단량체는 하기 구조를 갖는 폴리펩타이드 쇄일 수 있다:
VL-링커B-VH; 또는
VH-링커B-VL.
또한, 디아바디-형성 단편은 단쇄 디아바디 (sc(Fv)2)를 형성하기 위해 링커A 또는 기타 동종을 통해 연결될 수 있다. 약 15-20 아미노산의 긴 링커를 이용하여 디아바디-형성 단편을 연결시킴으로써, 비공유결합은 이량체를 형성하기 위해 동일한 쇄에서 현존하는 디아바디-형성 단편 사이 형성될 수 있다. 단쇄 디아바디의 배열의 예는 하기를 포함할 수 있다:
VH - 링커B - VL - 링커A - VH - 링커B - VL
VL - 링커B - VH - 링커A - VL - 링커B - VH
바람직하게는 본 발명의 디아바디는 하기 구조를 갖는다:
VL - 링커B - VH - 링커A - VL - 링커B - VH
디아바디 제조에 관해 동일한 원리에 기반하여, 중합된 항체 예컨대 삼량체 또는 사량체는 3 이상의 디아바디-형성 단편 연결에 의해 제조될 수 있다.
또 다른 특정한 구현예에서 본 발명의 항체는 면역글로불린, 바람직하게는 면역글로불린 G (IgG)이다. 본 발명의 IgG의 서브클래스는 제한되지 않고 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 IgG는 서브클래스 1의 것이다, 즉 IgG1 분자이다.
친화성
본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 인간 TNFα에 고친화성을 갖는다. 용어 "KD"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은, BIACORE 기기에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술을 이용하여 결정된 경우, 예를 들어, 대략 2x10-10 M 미만, 바람직하게는 1.5x10-10 M 미만, 더 바람직하게는 1x10-10 M 미만, 가장 바람직하게는 7.5x10-11 M 미만 또는 심지어 더 낮은 해리 평형 상수 (KD)를 가진 인간 TNFα에 결합한다. 특히, KD의 결정은 실시예 2, 섹션 2.1.1에서 기재된 바와 같이 수행된다.
사이노몰구스 원숭이 또는 히말라야 원숭이로부터 TNFα에 대한 교차-반응성
특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 동물 예컨대 사이노몰구스 원숭이 (마카카 파스시쿨라리스) 및/또는 히말라야 원숭이 (마카카 물라타)로부터 TNFα에 실질적인 친화성을 갖는다. 항-인간 TNFα 항체의 전임상 시험 예컨대 독성 연구가 그와 같은 동물로 바람직하게는 수행됨에 따라, 이것은 유리하다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 바람직하게는 동물 예컨대 사이노몰구스 원숭이 및/또는 히말라야 원숭이로부터 TNFα와 교차-반응성이다. 친화성 측정은 실시예 2, 섹션 2.1.1에서 기재된 바와 같이 수행된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 마카카 파스시쿨라리스로부터 TNFα와 교차-반응성이다. 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 바람직하게는 인간 TNFα에 대한 이의 친화성으로 10-배 미만, 특히 5-배 미만, 더욱더 특히 2-배 미만, 또는 심지어 1.5-배 미만 상이한 마카카 파스시쿨라리스 TNFα에 친화성을 갖는다. 전형적으로, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 해리 평형 상수 (KD)로 마카카 파스시쿨라리스로부터 TNFα에 결합하고, 여기서 (i) 마카카 파스시쿨라리스로부터 TNFα에 결합용 KD 대 (ii) 인간 TNFα에 결합용 KD의 비 RM.파스시쿨라리스가 10 미만이다.
Figure 112018090719773-pct00001
RM.파스시쿨라리스는 바람직하게는 5 미만, 특히 2 미만, 더욱더 특히 1.5 미만이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 마카카 물라타로부터 TNFα와 교차-반응성이다. 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 인간 TNFα에 대한 이의 친화성으로 바람직하게는 20-배 미만, 더욱 특히 10-배 미만, 더욱 더 특히 5-배 미만 상이한 마카카 물라타 TNFα에 친화성을 갖는다. 전형적으로, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 해리 평형 상수 (KD)로 마카카 물라타로부터 TNFα에 결합하고, 여기서 (i) 마카카 물라타로부터 TNFα에 결합용 KD 대 (ii) 인간 TNFα에 결합용 KD의 비 RM.물라타는 20 미만이다.
Figure 112018090719773-pct00002
RM.물라타는 바람직하게는 20 미만, 특히 10 미만, 더욱더 특히 5 미만이다.
더욱 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 마카카 파스시쿨라리스로부터 TNFα와 그리고 마카카 물라타로부터 TNFα와 교차-반응성이다. 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 바람직하게는 인간 TNFα에 대한 이의 친화성으로 10-배 미만, 특히 5-배 미만, 더욱더 특히 2-배 미만, 또는 심지어 1.5-배 미만 상이한 마카카 파스시쿨라리스 TNFα에 친화성을 갖고, 바람직하게는 인간 TNFα에 대한 이의 친화성으로 20-배 미만, 더욱 특히 10-배 미만, 더욱더 특히 5-배 미만 상이한 마카카 물라타 TNFα에 친화성을 갖는다. 항체 또는 기능성 단편의 비 RM.파스시쿨라리스는 바람직하게는 10 미만, 특히 5 미만, 더욱더 특히 2 미만, 또는 심지어 1.5 미만이고, 항체 또는 기능성 단편의 비 RM.물라타는 바람직하게는 20 미만, 특히 10 미만, 더욱더 특히 5 미만이다.
L929 세포의 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시키는 효력
본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 L929 세포의 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시키는 높은 효력을 갖는다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 공지된 항체 인플릭시맙의 것 초과 L929 세포의 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시키는 효력을 갖는다.
인플릭시맙에 관한 효력은 본원의 실시예 2, 섹션 2.1.2에서 기재된 바와 같이 L929 검정에서 결정될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 상대 효력은 1.5 초과, 바람직하게는 2 초과, 더 바람직하게는 3 초과, 더 바람직하게는 5 초과, 더 바람직하게는 7.5 초과, 또는 더욱더 10 초과이고, 여기서 상대 효력은 (ii) L929 검정에서 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 IC50 값에 대해 (i) L929 검정에서 인플릭시맙의 IC50 값의 비이고, 여기서 IC50은 L929 세포의 TNF-유도된 세포자멸사의 최대 억제의 50%를 달성하는데 필요한 각각의 분자의 ng/mL로 농도를 표시한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 상대 효력은 1.5 초과, 바람직하게는 2 초과, 더 바람직하게는 3 초과, 더 바람직하게는 5 초과, 더 바람직하게는 7.5 초과, 또는 심지어 10 초과이고, 여기서 상대 효력은 (ii) L929 검정에서 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 IC90 값에 대해 (i) L929 검정에서 인플릭시맙의 IC90 값의 비이고, 여기서 IC90 값은 L929 세포의 TNF-유도된 세포자멸사의 최대 억제의 90%를 달성하는데 필요한 각각의 분자의 ng/mL로 농도를 표시한다.
LPS-유도된 사이토카인 분비의 억제
본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 단핵구로부터 LPS-유도된 사이토카인 분비를 억제시킬 수 있다. 단핵구로부터 LPS-유도된 사이토카인 분비는 실시예 7에서 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 CD14+ 단핵구로부터 인터류킨-1β의 LPS-유도된 분비를 억제시킬 수 있다. 인터류킨-1β의 LPS-유도된 분비 억제용 IC50 값은 1 nM 미만 및/또는 100 pg/mL 미만일 수 있다. 몰 기준으로 및/또는 용적당 중량 기준으로, 인터류킨-1β의 LPS-유도된 분비 억제용 IC50 값은 아달리무맙의 것보다 낮을 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 CD14+ 단핵구로부터 TNFα의 LPS-유도된 분비를 억제시킬 수 있다. TNFα의 LPS-유도된 분비 억제용 IC50 값은 1 nM 미만 및/또는 150 pg/mL 미만일 수 있다. 몰 기준으로 및/또는 용적당 중량 기준으로, TNFα의 LPS-유도된 분비 억제용 IC50 값은 아달리무맙의 것보다 낮을 수 있다다.
세포 증식의 억제
본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 전형적으로 혼합된 림프구 반응에서 말초 혈액 단핵 세포의 세포 증식을 억제시킬 수 있다. 세포 증식의 억제는 실시예 6에서 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 실시예 6에 따라 결정된, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편, 예를 들면 scFv 또는 디아바디의 자극 지수는 5 미만, 또는 4.5 미만일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체, 예를 들면 IgG의 자극 지수는 4 미만 또는 심지어 3 미만이다.
TNFα와 TNF 수용체 사이 상호작용의 억제
전형적으로, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 인간 TNFα와 TNF 수용체 I (TNFRI) 사이 상호작용을 억제시킬 수 있다. 인간 TNFα와 TNFRI 사이 상호작용의 억제는 실시예 2, 섹션 2.1.3에서 아래에 기재된 바와 같이 억제 ELISA에서 결정될 수 있다.
억제 ELISA에서 결정된 경우, 인플릭시맙 (상대 효력)의 것에 비해, 인간 TNFα와 TNFRI 사이 상호작용을 억제시키는 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 효력은 바람직하게는 적어도 1.3이고, 여기서 상기 상대 효력은 인플릭시맙의 ng/mL로 IC50 값 대 항체 또는 이의 기능성 단편의 ng/mL로 IC50 값의 비이다.
전형적으로, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 인간 TNFα와 TNF 수용체 II (TNFRII) 사이 상호작용을 억제시킬 수 있다. 인간 TNFα와 TNFRII 사이 상호작용의 억제는 실시예 2, 섹션 2.1.3에서 아래에 기재된 바와 같이 억제 ELISA에서 결정될 수 있다.
억제 ELISA에서 결정된 경우, 인플릭시맙 (상대 효력)의 것에 비해, 인간 TNFα와 TNFRII 사이 상호작용을 억제시키는 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 효력은 바람직하게는 적어도 1.3이고, 여기서 상기 상대 효력은 인플릭시맙의 ng/mL로 IC50 값 대 항체 또는 이의 기능성 단편의 ng/mL로 IC50 값의 비이다.
화학양론 및 가교결합
본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 전형적으로 적어도 2의 화학양론 (항체　:　TNFα삼량체)로 인간 TNFα삼량체에 결합할 수 있다. 화학양론 (항체　:　TNFα삼량체)는 바람직하게는 2 초과, 또는 적어도 2.5, 또는 적어도 3이다. 하나의 구현예에서, 화학양론 (항체　:　TNFα삼량체)는 약 3이다. 화학양론 (항체　:　TNFα삼량체)는 아래 실시예 4에서 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 인간 TNFα와 복합체를 형성할 수 있고, 여기서 상기 복합체는 TNFα의 적어도 2 분자 및 항체 또는 기능성 단편의 적어도 3 분자를 포함한다. 이러한 구현예에 따라 기능성 단편 예컨대, 예를 들면 디아바디는 TNFα에 대하여 적어도 2개의 별개의 결합 부위를 포함한다. 복합체 형성은 아래 실시예 5에서 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 항체는 IgG이고, TNFα와 적어도 600 kDa의 복합체를 형성할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 기능성 단편은 디아바디이고, TNFα와 적어도 300 kDa의 복합체를 형성할 수 있다.
표적 선택성
특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 높은 표적 선택성을 갖는다, 즉 TNFα와 TNFβ 사이에서 식별할 수 있다. 바람직하게는, TNFβ의 IC50 값은, 실시예 2, 섹션 2.1.4에서 기재된 바와 같이 경쟁 ELISA에서 결정된 경우, TNFα의 IC50 값 적어도 1,000 배 초과이다. 더 바람직하게는, TNFβ의 IC50 값은, 실시예 2, 섹션 2.1.4에서 기재된 바와 같이 경쟁 ELISA에서 결정된 경우, TNFα의 IC50 값 적어도 5,000 배, 가장 바람직하게는 적어도 10,000 초과이다.
발현 수율 및 리폴딩 수율
다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편, 바람직하게는 scFv 또는 디아바디는 미생물 예컨대 박테리아에서 또는 다른 세포에서 고수율로 재조합으로 발현될 수 있다. 바람직하게는, 실시예 2에서 기재된 바와 같이 결정된, E. 콜리에서 발현 수율은 적어도 0.25 g/L이다. 이것은 특히 기능성 단편 예컨대 scFvs에 적용시킨다.
실시예 2에서 기재된 바와 같이 결정된, 리폴딩 수율은 적어도 5 mg/L, 더 바람직하게는 적어도 10 mg/L, 더 바람직하게는 적어도 15 mg/L, 및 가장 바람직하게는 적어도 20 mg/L이다. 이것은 특히 기능성 단편 예컨대 scFvs에 적용시킨다.
안정성
전형적으로, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편, 바람직하게는 scFv 또는 디아바디는 높은 안정성을 갖는다. 안정성은 상이한 방법론에 의해 평가될 수 있다. 실시예 2, 섹션 2.2.4에서 기재된 바와 같이 시차 주사 형광측정법 (DSF)에 의해 결정된, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 가변 도메인의 "용융 온도" Tm은 바람직하게는 적어도 65℃, 더 바람직하게는 적어도 68℃, 더 바람직하게는 적어도 70℃, 가장 바람직하게는 적어도 74℃이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "가변 도메인의 용융 온도"는 서열 VL - 링커A - VH로 구성되는 scFv의 용융 온도를 지칭하고, 여기서 링커A의 아미노산 서열은 서열 식별 번호:29에서 보여진 바와 같이 아미노산 서열로 구성된다. 예를 들어, IgG의 가변 도메인의 용융 온도는 상기에서 정의된 바와 같이 그것의 상응하는 scFv의 용융 온도로서 정의된다.
실시예 2, 섹션 2.2.5에서 기재된 바와 같이 분석적 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정된, 4℃에서 4 주 동안 저장후 (10 g/L의 농도에서; 초기 단량체 함량 > 95%) 단량체 함량에서 손실은 바람직하게는 5% 미만, 더 바람직하게는 3% 미만, 더 바람직하게는 1% 미만, 가장 바람직하게는 0.5% 미만이다. 실시예 2, 섹션 2.2.5에서 기재된 바와 같이 분석적 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정된, -20℃에서 4 주 동안 저장 후 (10 g/L의 농도에서; 초기 단량체 함량 > 95%) 단량체 함량에서 손실은 바람직하게는 5% 미만, 더 바람직하게는 3% 미만, 더 바람직하게는 1% 미만, 가장 바람직하게는 0.5% 미만이다. 실시예 2, 섹션 2.2.5에서 기재된 바와 같이 분석적 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정된, -65℃에서 4 주 동안 저장후 (10 g/L의 농도에서; 초기 단량체 함량 > 95%) 단량체 함량에서 손실은 바람직하게는 5% 미만, 더 바람직하게는 3% 미만, 더 바람직하게는 1% 미만, 가장 바람직하게는 0.5% 미만이다.
실시예 2에서 기재된 바와 같이 결정된, 5 연속 냉동-해동 사이클후 단량체 손실은 5% 미만, 더 바람직하게는 1% 미만, 더 바람직하게는 0.5% 미만, 가장 바람직하게는 0.2% 미만, 예를 들면 0.1% 또는 0.0%이다.
항체 및 기능성 단편
본 발명의 특정한 구현예는 본 명세서에서 기재된 항체의 기능성 단편에 관한 것이다. 기능성 단편은, 비제한적으로, F(ab')2 단편, Fab 단편, scFv, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디이다. 바람직하게는, 기능성 단편은 단쇄 항체 (scFv) 또는 디아바디이다. 더 바람직하게는, scFv의 또는 디아바디의 비-CDR 서열은 인간 서열이다.
바람직하게는 인간에서 면역원성에 대하여 잠재력을 최소화하기 위해 선택된 수용체 스캐폴드는 인간 공통 서열 또는 인간 생식계열 서열에서 유래된 프레임워크 영역으로 구성된다. 특히 가변 경 도메인의 프레임워크 영역 I 내지 III은 서열 식별 번호: 31 내지 33에 따라 인간 Vκ1 공통 서열로 구성되고 λ 생식계열-기반 서열의 프레임워크 영역 IV는 서열 식별 번호:34 내지 37로부터 선택된다. 인간 공통 또는 인간 생식계열 잔기가 아닌 잔기가 면역 반응을 야기시킬 수 있음에 따라 각각의 가변 도메인 (VH 또는 VL)에서 그와 같은 잔기의 수는 가능한 한 낮은, 바람직하게는 7 미만, 더 바람직하게는 4 미만, 가장 바람직하게는 0이어야 한다.
바람직하게는 항체는 단클론성 항체이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "단클론성 항체"는 비제한적으로 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체이다. 용어 "단클론성 항체"는, 생산되는 방법이 아닌, 임의의 진핵, 원핵, 또는 파아지 클론을 포함하는, 단일 클론에서 유래되는 항체를 지칭한다. 단클론성 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파아지 디스플레이 기술, 또는 이의 조합의 사용을 포함하는 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. (Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y.).
인간에서 항-TNFα 항체의 생체내 용도에 관한 구현예를 포함하는, 다른 구현예에서, 키메라성, 영장류화된, 인간화된, 또는 인간 항체는 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체, 더 바람직하게는 단클론성 인간 항체 또는 단클론성 인간화된 항체이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "키메라성" 항체는, 전형적으로 인간 면역글로불린 템플레이트로부터 선택된, 비-인간 면역글로불린, 예컨대 랫트 또는 마우스　항체, 및 인간 면역글로불린 불변 영역에서 유래된 가변 서열을 갖는 항체를 지칭한다. 키메라성 항체의 생산 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 참조, 예를 들면, Morrison, 1985, Science 229(4719): 1202-7; Oi 등, 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies 등, 1985, J. Immunol. Methods 125: 191-202; 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816397 (이는 그 전체가 본 명세서에서 참고로 편입됨).
상이한 재조합 방법론은, 그와 같은 비-인간 면역글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는, 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 표적-결합 하위서열) 생성에 의해 비-인간 (예를 들면, 쥣과) 항체를 더욱 인간-유사하게 만들기 위해 당해 분야의 숙련가에 이용가능하다. 일반적으로, 수득한 재조합 항체는 적어도 1, 및 전형적으로 2, 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기에서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열, 특히 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. CDR-그라프팅된 항체는 인간 면역글로불린 분자로부터 원하는 항원 및 프레임워크 (FR) 영역을 결합시키는 비-인간 종에서 본래 생성된 항체로부터 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDRs)를 갖는 항체 분자이다 (EP239400; PCT 공개 WO 91/09967; 미국 특허 번호 5,225,539; 5,530,101 및 5,585,089). 종종, "인간화"라고 불리는 공정에서, 인간 프레임워크 영역에서 프레임워크 잔기는 추가로 항원 결합을 변경, 바람직하게는 개선하기 위해 CDR 공여체 항체로부터 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은, 예를 들면, 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위해 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정한 위치에서 흔치않은 프레임워크 잔기를 확인하기 위해 서열 비교에 의해, 당해 분야에서 잘 알려진 방법에 의해 확인된다. 참조, 예를 들면, Riechmann 등, 1988, Nature 332:323-7 및 Queen 등, 미국 특허 번호: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 및 6,180,370 (이들 각각은 참고로 그 전문이 편입됨). 항체는, 예를 들어, 베니어링 또는 재표면화 (EP592106; EP519596; Padlan, 1991, MoI. Immunol, 28:489-498; Studnicka 등, 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska 등, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973, 및 쇄 셔플링 (미국 특허 번호 5,565,332) (이들 모두는 이로써 그 전체가 참고로 편입됨)를 포함하는 당해 분야에서 공지된 다양한 추가의 기술을 이용하여 더 많은 인간에 제공될 수 있다. CDR-그라프팅된 또는 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로 선택된 인간 면역글로불린 템플레이트의 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 인간화된 항체는 하기에서 기재된 바와 같이 제조된다: Queen 등, 미국 특허 번호: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 및 6,180,370 (이들 각각은 참고로 그 전문이 편입됨).
일부 구현예에서, 항-TNFα　항체는 인간 항체이다. 완전히 "인간" 항-TNFα 항체는 인간 환자의 치료적 처치에 바람직할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인간 항체"는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린용 동물 유전자도입으로부터 단리된 그리고 내인성 면역글로불린을 발현시키지 않는 항체를 포함한다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열에서 유래된 항체 라이브러리를 이용하여 상기 기재된 파아지 디스플레이 방법을 포함하는 당해 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 참조 미국 특허 번호 4,444,887 및 4,716,111; 및 PCT 공개 WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; 및 WO 91/10741 (이들 각각은 본 명세서에서 참고로 그 전문이 편입됨). 인간 항체는 또한 기능성 내인성 면역글로불린을 발현시킬 수 없는, 그러나 인간 면역글로불린 유전자를 발현시킬 수 있는 유전자도입 마우스를 이용하여 생산될 수 있다. 참조, 예를 들면, PCT 공개 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 번호 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; 및 5,939,598 (그 전체가 본 명세서에서 참고로 편입됨). 선택된 에피토프를 인식하는 완전히 인간 항체는 "가이드된 선택"으로서 지칭된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 접근법에서 선택된 비-인간 단클론성 항체, 예를 들면, 마우스　항체는 동일한 에피토프를 인식하는 완전히 인간 항체의 선택을 가이드하는데 사용된다 (Jespers 등, 1988, Biotechnology 12:899-903).
일부 구현예에서, 항-TNFα 항체는 영장류화된 항체이다. 용어 "영장류화된 항체"는 원숭이 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 영장류화된 항체의 생산 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 참조 예를 들면, 미국 특허 번호 5,658,570; 5,681,722; 및 5,693,780 (이는 그 전체가 본 명세서에서 참고로 편입됨).
일부 구현예에서, 항-TNFα 항체는 유도된 항체이다. 예를 들어, 제한으로써가 아닌, 예를 들면, 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 연결 (항체 콘주게이트의 논의에 대하여 아래 참조) 등에 의해 변형된 유도된 항체. 임의의 수많은 화학 변형은, 비제한적으로, 특이적 화학 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 대사성 합성 등을 포함하는, 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 유도체는 하나 이상의 비-고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
또 특정 다른 측면에서, 항-TNFα 항체는, 예를 들어 US 2007/0280931에서 기재된 바와 같이, 하나 이상의 그것의 초가변 영역에 삽입된 하나 이상의 아미노산을 갖는다.
항체 콘주게이트
일부 구현예에서, 항-TNFα 항체는, 예를 들면, 임의의 유형의 분자의 항체에의 공유결합에 의해 변형되는 항체 콘주게이트이어서, 이로써 공유결합은 TNFα에 결합을 방해하지 않는다. 항체에 효과기 모이어티의 콘주게이팅 기술은 당해 분야에서 잘 알려진다 (참조, 예를 들면, Hellstrom 등, Controlled Drag Delivery, 2nd Ed., at pp. 623-53 (Robinson 등, eds., 1987)); Thorpe 등, 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58 및 Dubowchik 등, 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123).
일 예에서, 항체 또는 이의 단편은, 또 다른 단백질의 아미노산 서열 (또는 이의 부분; 바람직하게는 단백질의 적어도 10, 20 또는 50 아미노산 부분)에, 선택적으로 N-말단 또는 C-말단에서, 공유결합 (예를 들면, 펩타이드 결합)을 통해 융합된다. 바람직하게는 항체, 또는 이의 단편은 항체의 불변 도메인의 N-말단에서 다른 단백질에 연결된다. 재조합 DNA 절차는, 예를 들어 WO 86/01533 및 EP0392745에서 기재된 바와 같이 그와 같은 융합을 창출하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예에서 효과기 분자는 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 효과기 분자의 예는 폴리머, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물 예컨대 WO 2005/117984에서 기재된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-TNFα 항체는 폴리(에틸렌글리콜) (PEG) 모이어티에 부착될 수 있다. 예를 들어, 항체가 항체 단편이면, PEG 모이어티는 항체 단편에서 위치한 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어 임의의 자유 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실 또는 카복실 기를 통해 부착될 수 있다. 그와 같은 아미노산은 항체 단편에서 자연적으로 발생할 수 있거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 단편 속으로 조작될 수 있다. 참조 예를 들어 미국 특허 번호 5,219,996. 다중 부위는 2 이상의 PEG 분자를 부착시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게는 PEG 모이어티는 항체 단편에서 위치한 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올 기를 통해 공유결합된다. 티올 기가 부착점으로서 사용되는 경우, 적절하게 활성화된 효과기 모이어티, 예를 들어 티올 선택적 유도체 예컨대 말레이미드 및 시스테인 유도체는 사용될 수 있다.
또 다른 예에서, 항-TNFα 항체 콘주게이트는 페길화되는 변형된 Fab' 단편이다, 즉, 예를 들면, EP0948544에서 개시된 방법을 따라, 거기에 공유결합된 PEG (폴리(에틸렌글리콜))을 갖는다. 또한 Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D. C, 1997); 및 Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998); 및 Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531- 545를 참조하시오.
약제학적 조성물 및 치료
질환의 치료는 임의의 임상 단계 또는 징후에서 질환의 임의의 형태; 질환의 증상 또는 징후의 개시 또는 진화 또는 심화 또는 악화의 지연; 및/또는 질환의 중증도의 예방 및/또는 감소를 갖는 것으로서 이미 진단된 환자의 치료를 포함한다.
항-TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편이 투여되는 "대상체" 또는 "환자"는 포유동물, 예컨대 비-영장류 (예를 들면, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 랫트, 등) 또는 영장류 (예를 들면, 원숭이 또는 인간)일 수 있다. 특정 측면에서, 인간은 소아 환자이다. 다른 측면에서, 인간은 성인 환자이다.
항-TNFα 항체 및, 선택적으로 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대 아래 기재된 제2 치료제를 포함하는 조성물은 본 명세서에서 기재된다. 조성물은 전형적으로 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 멸균된, 약제학적 조성물의 일부로서 공급된다. 이러한 조성물은 (환자에 원하는 투여 방법에 의존하여) 임의의 적합한 형태일 수 있다.
항-TNFα 항체 및 기능성 단편은 다양한 경로에 의해 예컨대 경구로, 경피로, 피하로, 비강내로, 정맥내로, 근육내로, 척추강내로, 국소적으로 또는 국부적으로 환자에 투여될 수 있다. 임의의 주어진 경우에서 투여에 가장 적합한 경로는 특정한　항체, 대상체, 및 질환의 성질 및 중증도 그리고 대상체의 신체 조건에 의존할 것이다. 전형적으로, 항-TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편은 정맥내로 투여될 것이다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 경구로 투여된다. 투여가 경구 경로를 통한다면 기능성 단편은 바람직하게는 단쇄 항체 (scFv), 디아바디 또는 IgG이다.
전형적인 구현예에서, 항-TNFα 항체 또는 기능성 단편은 0.5 mg/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중으로 정맥내 투여를 허용하는데 충분한 농도로 약제학적 조성물에서 존재한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 조성물 및 방법에서 사용에 적합한 항체 또는 단편의 농도는, 비제한적으로, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 또는 임의의 전술한 값 사이, 예를 들면, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 5 mg/kg 내지 15 mg/kg, 또는 10 mg/kg 내지 18 mg/kg 범위의 농도를 포함한다.
항-TNFα 항체 또는 기능성 단편의 효과적인 용량은 단일 (예를 들면, 볼러스) 투여, 다중 투여 또는 연속 투여당, 또는 단일 (예를 들면, 볼러스) 투여, 다중 투여 또는 연속 투여당 0.01-5000 μg의 혈청 농도/mL 혈청 농도를 달성하기 위해 약 0.001 내지 약 750 mg/kg 범위일 수 있거나, 대상체의 치료될 병태, 투여 경로 및 연령, 체중 및 상태에 의존하여 거기에 임의의 효과적인 범위 또는 값일 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 용량은 체중의 킬로그램당 약 0.5 mg 내지 약 50 mg 또는 체중 킬로그램당 약 3 mg 내지 약 30 mg 범위일 수 있다. 항체는 수용액으로서 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물은 용량당 항-TNFα 항체 또는 기능성 단편의 예정된 양을 함유하는 단위 용량 형태로 편리하게 나타날 수 있다. 그와 같은 단위는 0.5 mg 내지 5 g, 예를 들어, 그러나 제한 없이, 1 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg, 또는 전술한 값의 임의의 2개 사이 임의의 범위, 예를 들어 10 mg 내지 1000 mg, 20 mg 내지 50 mg, 또는 30 mg 내지 300 mg을 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 캐리어는, 예를 들면, 치료될 병태 또는 투여 경로에 의존하여 다양한 형태를 취할 수 있다.
효과적인 투약량, 총 용량의 수, 및 항-TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편 치료의 기간의 결정은 양호하게 당해 분야의 숙련가의 능력 이내이고, 표준 용량 단계적 확대 연구를 이용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에서 기재된 방법에서 적합한 항-TNFα 항체 및 기능성 단편의 치료 제형은 당해 분야에서 전형적으로 이용된 선택적인 약제학적으로-허용가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제 (이들 모두는 본 명세서에서 "캐리어"로서 지칭된다), 즉, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비-이온성 세제, 산화방지제, 및 다른 여러 종류 첨가제와 원하는 정도의 순도를 갖는 항체 혼합에 의해 동결건조된 제형 또는 수용액으로서 저장용으로 제조될 수 있다. 참조, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980). 그와 같은 첨가제는 이용된 투약량 및 농도에서 수령체에 비독성이어야 한다.
완충제는 생리적 병태를 근사하는 범위에서 pH 유지를 돕는다. 이들은 약 2 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 나타낼 수 있다. 적합한 완충제는 하기를 포함한다: 양쪽 유기 및 무기 산 및 이의 염 예컨대 시트레이트 완충제 (예를 들면, 모노나트륨 시트레이트-디나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-트리나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노나트륨 시트레이트 혼합물, 등), 석시네이트 완충제 (예를 들면, 석신산-모노나트륨 석시네이트 혼합물, 석신산-수산화나트륨 혼합물, 석신산-디나트륨 석시네이트 혼합물, 등), 타르트레이트 완충제 (예를 들면, 타르타르산-나트륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-칼륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물, 등), 푸마레이트 완충제 (예를 들면, 푸마르산-모노나트륨 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디나트륨 푸마레이트 혼합물, 모노나트륨 푸마레이트-디나트륨 푸마레이트 혼합물, 등), 글루코네이트 완충제 (예를 들면, 글루콘산-나트륨 글리코네이트 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-칼륨 글리우코네이트 혼합물, 등), 옥살레이트 완충제 (예를 들면, 옥살산-나트륨 옥살레이트 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-칼륨 옥살레이트 혼합물, 등), 락테이트 완충제 (예를 들면, 락트산-나트륨 락테이트 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-칼륨 락테이트 혼합물, 등) 및 아세테이트 완충제 (예를 들면, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물, 등). 추가로, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리메틸아민 염 예컨대 Tris는 사용될 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가될 수 있고, 0.2% - 1% (w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 적합한 보존제는 하기를 포함한다: 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알코늄 할라이드 (예를 들면, 클로라이드, 브로마이드, 및 아이오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 및 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 및 3-펜타놀. "안정화제"로서 때때로 공지된 등장화제는 액체 조성물의 등장성을 보장하기 위해 첨가될 수 있고 다가 당 알코올, 바람직하게는 3가 이상 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 안정화제는 치료제를 안정화시키는 또는 컨테이너 벽에 변성 또는 부착을 예방하는 증량제부터 첨가제까지 기능 형태로 범위할 수 있는 부형제의 넓은 카테고리를 지칭한다. 전형적인 안정화제는 하기일 수 있다: (상기 열거된) 다가 당 알코올; 아미노산 예컨대 아르기닌, 라이신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 등, 유기 당류 또는 당 알코올, 예컨대 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 및 기타 동종, 사이클리톨 예컨대 이노시톨 포함; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 폴리머; 황 함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온, 티옥트 산, 나트륨 티오글라이콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오 설페이트; 저분자량 폴리펩타이드 (예를 들면, 10 잔기 이하의 펩타이드); 단백질 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예컨대 폴리비닐피롤리돈 단당류, 예컨대 자일로스, 만노스, 푸룩토스, 글루코스; 이당류 예컨대 락토스, 말토스, 수크로스 및 삼당류 예컨대 라피노오스; 및 다당류 예컨대 덱스트란. 안정화제는 중량 활성 단백질의 일부당 0.1 내지 10,000 중량의 범위에서 존재할 수 있다.
("습윤제"로서 또한 공지된) 비-이온성 계면활성제 또는 세제는, 또한 단백질의 변성 유발 없이 스트레스 받은 표면을 전단하기 위해 제형을 노출되도록 하는, 치료제를 가용화하는데 뿐만 아니라 진탕-유도된 응집에 대해 치료 단백질을 보호하는데 돕기 위해 첨가될 수 있다. 적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 (20, 80, 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), 플루론산 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (TWEEN®-20, TWEEN®-80, 등)을 포함한다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL의 범위에서, 또는 약 0.07 mg/mL 내지 약 0.2 mg/mL의 범위에서 존재할 수 있다.
추가의 여러 종류 부형제는 증량제 (예를 들면, 전분), 킬레이트제 (예를 들면, EDTA), 산화방지제 (예를 들면, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 프로테아제 억제제 및 보조-용매를 포함한다.
본 명세서에서 제형은 또한 항-TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편에 더하여 제2 치료제를 함유할 수 있다. 적합한 제2 치료제의 예는 아래 제공된다.
투약 계획은, 질환의 유형, 질환의 중증도, 및 항-TNFα 항체 또는 기능성 단편에 대한 환자의 감수성을 포함하는, 수많은 임상 인자에 의존하여 1회 1월 내지 매일 다양할 수 있다. 특이적 구현예에서, 항-TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편은 매일, 2회 매주, 3회 1주, 격일, 매 5 일, 매 10 일, 격주, 매 3 주, 매 4 주 또는 1회 1개월, 또는 전술한 값의 임의의 2개 사이 임의의 범위, 예를 들어 매 4 일 내지 매달, 매 10 일 내지 격주, 또는 2 내지 3회 1주, 등으로 투여된다.
투여된 항-TNFα 항체 또는 기능성 단편의 투약량은 특정한 항체, 대상체, 및 질환의 성질 및 중증도, 대상체의 신체 조건, 치료 레지멘 (예를 들면, 제2 치료제가 사용되는지 여부), 그리고 선택된 투여 경로에 따라 다양할 것이고; 적절한 투약량은 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
항-TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편의 개별 투약량의 최적의 양 및 간격이 치료될 병태의 성질 및 정도, 형태, 경로 및 투여 부위, 그리고 특정한 치료될 대상체의 연령 및 상태에 의해 결정될 것이라는 것, 그리고 의사가 사용되는 적절한 투약량을 궁극적으로 결정할 것이라는 것은 당해 분야의 숙련가에 의해 인식될 것이다. 이러한 투약량은 적절한한 종종 반복될 수 있다. 부작용이 발생하면 투약량의 양 및/또는 빈도는, 정상 임상 실시에 따라, 변경 또는 감소될 수 있다.
치료되는 장애
본 발명은, 본 명세서에서 정의된 바와 같이 항체 또는 기능성 단편을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 인간 TNFα-관련된 질환의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 용어 "TNF-관련된 장애" 또는 "TNF-관련된 질환"은 임의의 장애를 지칭하고, 이의 증상 또는 질환 상태의 개시, 진행 또는 지속은 TNFα의 참여를 요구한다. 예시적인 TNF-관련된 장애는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 일반 염증의 만성 및/또는 자가면역 상태, 일반 면역 매개된 염증성 장애, 염증성 CNS 질환, 눈, 관절, 피부, 점막, 중추신경계, 위장관, 요로 또는 폐를 감염시키는 염증성 질환, 일반 포도막염의 상태, 망막염, HLA-B27+ 포도막염, 베체트병, 안구 건조 증후군, 녹내장, 쇼그렌 증후군, 진성 당뇨병 (당뇨병성 신경병증 포함), 인슐린 내성, 일반 관절염의 상태, 류마티스성 관절염, 골관절염, 반응성 관절염 및 라이터 증후군, 소아 관절염, 강직 척추염, 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 근위축 측삭 경화증, 유육종증, 사구체신염, 만성 신장 질환, 방광염, 건선 (건선성 관절염 포함), 화농성 한선염, 지방층염, 괴저성 농피증, SAPHO 증후군 (윤활막염, 여드름, 농포증, 골과다증 및 골염), 여드름, 스위트 증후군, 천포창, 크론병 (장외 증상 포함), 궤양성 대장염, 기관지 천식, 과민증 폐렴, 일반 알러지, 알러지성 비염, 알러지성 부비강염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 섬유증, 베게너 육아종증, 카와사키 증후군, 거대 세포 동맥염, 처그-스트라우스 혈관염, 결절성 다발동맥염, 화상, 이식편 대 숙주 질환, 숙주 대 이식편 반응, 장기 또는 골수 이식후 거부 에피소드, 일반 혈관염의 전신 및 국부 상태, 전신 및 피부 홍반성 낭창 낭창, 다발성근염 및 피부근염, 경피증, 전자간증, 급성 및 만성 췌장염, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 수술후 예컨대 눈 수술후 염증 (예를 들면 백내장 (눈 렌즈 대체) 또는 녹내장 수술), 관절 수술 (관절경 수술 포함), 관절-관련된 구조 (예를 들면 인대)에서 수술, 경구 및/또는 치과 수술, 최소로 침습성 심혈관 절차 (예를 들면 PTCA, 죽상반절제술, 스텐트 설치), 복강경검사 및/또는 내시경 복부내 및 부인과 절차, 내시경 비뇨기 절차 (예를 들면 전립선 수술, 요관내시경, 방광내시경, 사이질 방광염), 또는 일반 수술후 염증 (예방), 수포성 피부염, 중성구 피부염, 독성 표피 괴사성용해, 농포성 피부염, 뇌 말라리아, 용혈성 요독 증후군, 동종이식편 거부반응, 중이염, 독사교상, 결절 홍반, 골수이형성 증후군, 원발성 경화 담관염, 혈청검사음성 척추관절증, 자가면역 용혈성 빈혈, 구강안면 육아종, 증식농 구내염, 아프타 구내염, 지리상 설, 이동성 구내염, 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 헌팅턴병, 벨 마비, 크로이펠츠-야콥병 및 일반적으로 신경-퇴행성 병태.
암-관련된 골용해, 암-관련된 염증, 암-관련된 통증, 암-관련된 악액질, 뼈 전이, 이들이 TNFα의 중추 또는 주변 효과에 의해 야기되는지와 그리고 이들이 통증의 염증성, 통각성 또는 신경병성 형태로서 분류되는지와 무관하게, 통증의 급성 및 만성 형태, 엉덩뼈신경통, 하요부 통증, 손목골 증후군, 복합체 영역 통증 증후군 (CRPS), 통풍, 포진후 신경통, 섬유근육통, 국부 통증 상태, 전이성 종양으로 인한 만성 통증 증후군, 생리통.
치료되는 특정한 장애는 하기를 포함한다: 일반 관절염의 상태, 류마티스성 관절염, 골관절염, 반응성 관절염, 소아 관절염; 건선성 관절염 포함 건선; 크론병을 포함하는, 염증성 장 질환, 직장염증 포함 궤양성 대장염, S상결장염, 좌측 결장염, 광범위한 결장염 및 범결장염, 원인불명 결장염, 교원성 및 림프구성 결장염 포함 현미경적 결장염, 결합 조직 질환내 결장염, 전환 결장염, 게실 질환내 결장염, 호산구 결장염 및 맹낭염.
가장 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 염증성 장 질환, 특히 크론병, 궤양성 대장염 또는 현미경적 결장염을 치료하는데 사용된다. 크론병은, 임의의 상기 언급된 질환 행동 및 국재화의 임의의 조합을 허용하는, 비-협착/비-침윤, 협착, 침윤 및 항문주위 질환 행동을 포함하는 회장, 결장, 회결장, 및/또는 단리된 상위 크론병 (위, 십이지장 및/또는 공장)일 수 있다. 궤양성 대장염은 궤양성 직장염증, 직장낭창염, 좌측 결장염, 팬-궤양성 대장염 및 맹낭염일 수 있다.
병용 요법 및 다른 측면
바람직하게는, 항-TNFα 항체 또는 이의 기능성 단편으로 치료될 환자는 또한 또 다른 종래의 약제로 치료된다. 예를 들어, 염증성 장 질환을 앓고 있는 환자는, 특히 보통 내지 중증 질환을 가지면 전형적으로 또한 메살라진 또는 이의 유도체 또는 전구약물, 코르티코스테로이드, 예를 들면 부데소니드 또는 프레드니솔론 (경구 또는 i.v.), 면역억제제, 예를 들면 아자티오프린/6-메르캅토퓨린 (6-MP) 또는 메토트렉세이트, 사이클로스포린 또는 타크롤리무스로 치료중이다. 환자에 공-투여될 수 있는 다른 약제는 생물제제 예컨대 인플릭시맙, 아달리무맙, 에타네르셉트, 세르톨리주맙 페골 또는 기타를 포함한다. 환자에 공-투여될 수 있는 추가 약제는 안정적이고 더 오랜 차도를 유지시키기 위해 면역억제제 (예를 들면 아자티오프린/6-MP 또는 메토트렉세이트 또는 경구 사이클로스포린)을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면은 염증 감소를 위하여 상기에 정의된 바와 같이 항-TNFα 항체 또는 기능성 단편의 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 염증성 병태를 앓고 있는 환자에서 염증 감소에 사용하기 위한 상기에 정의된 바와 같이 항-TNFα 항체 또는 기능성 단편이다.
본 발명의 추가 측면은, 상기에 정의된 바와 같이 항-TNFα 항체 또는 기능성 단편의 유효량을 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하는, 염증성 병태의 치료 방법이다. 염증성 병태는 바람직하게는 상기에 기재된 병태 중 하나이다.
Figure 112018090719773-pct00003
Figure 112018090719773-pct00004
실시예
실시예 1: 인간 TNFα에 관한 토끼 항체의 생성
1. 결과
1.1 면역화
토끼는 정제된 재조합 인간 TNFα (Peprotech, Cat. No. 300-01A)로 면역화되었다. 면역화의 경과 동안, 항원에 대한 체액성 면역 반응의 강도는 항원에 다클론성 혈청 항체의 검출가능한 결합을 여전히 생산하였던 각각의 토끼의 혈청에 대하여 최대 희석 (역가) 결정에 의해 정성적으로 평가되었다. 고정된 재조합 인간 TNFα에 대한 혈청 항체 역가는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA, 참조 2.2.1)을 이용하여 평가되었다. 모두 3마리 토끼는 ELISA에서 (배경 대조군으로서 사용된 미접촉 관련없는 동물로부터 혈청으로 수득된 신호보다 적어도 3-배 더 높은) 양성 신호를 여전히 초래하는 혈청의 10 x 106-배 희석의 매우 높은 역가를 보여주었다. 또한, TNFα의 생물학적 활성을 억제시키는 상이한 토끼 혈청의 능력은 마우스 L929 세포-기반 검정 (참조 2.2.3)을 이용하여 평가되었다. 모두 3개 혈청은 마우스 L929 섬유아세포의 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시켰다. 토끼 #3은 1:155,000의 혈청 희석에서 도달된 50% 억제 (IC50)을 가진 가장 강력한 중화 활성을 보여주었다. 토끼 #3에 비교하여, 토끼 #2 및 토끼 #1은, 1:55,500 및 1:7,210, 각각의 혈청 희석에서 50% 억제에 도달하는, 대략 3 및 21-배 더 낮은 활성을 보여주었다.
모두 3마리 동물의 비장으로부터 단리된 림프구는 후속적인 히트 확인 절차를 위하여 선택되었다. 동물은 L929 검정에서 TNFα의 생물학적 활성을 억제시키는 효력에 기반하여 우선시되었다. 따라서, 배양된 히트의 가장 높은 수는 토끼 #3에서 기원하였고, 히트의 가장 낮은 수는 토끼 #1에서 유래되었다.
1.2 히트 확인
1.2.1 히트 분류
히트 확인 절차에 앞서, 고-친화성 TNFα 결합 B-세포 (참조 2.1)의 단리를 허용하고 구체적으로 검출하는 유동-세포측정-기반 분류 절차는 개발되었다.
모두 3마리 토끼에서 유래된 (단리된 총 림프구의 1.5%에 상응하는) 총 33 x 106 림프구는 2개 독립적 분류 캠페인에서 특성규명되었다. 총 3452 B-세포에서 분석된 33 x 106 세포 중에서 발현 TNFα-특이적 항체 (IgG)는 단리되었다. 혈청이 L929 검정에서 TNFα의 강한 억제를 보여주었던 그들 토끼로부터 더 많은 세포가 단리됨에 따라, 클로닝된 림프구의 수는 3마리 토끼에 대하여 상이하였다. 단리된 B-세포 중, 792 클론은 토끼 #1에서, 1144 클론은 토끼 #2에서 그리고 1408 클론은 토끼 #3에서 유래되었다. 108 클론에 대하여 각각의 토끼 기원이 공지되지 않는 것은, 이들이 바이알로부터 림프구의 소량의 최적의 회수를 허용하기 위해 모두 3마리 토끼로부터 잔여 림프구의 혼합물에서 유래되기 때문이다.
1.2.2 히트 선별
고-처리량 배양의 척도가 개별 토끼 항체의 정제를 허용하지 않음에 따라, 선별 단계 동안 수득된 결과는 항체 분비 세포 (ASC)의 배양 상청액으로부터 비-정제된 항체로 수행된 검정에 기반된다. 그와 같은 상청액은 서로에 대해 다수의 항체를 랭킹하는데, 하지만, 결합 친화성을 제외하고, (예를 들면 TNFα의 생물학적 활성의 억제에) 절대 값을 제공하지 않는데 사용되었다. ASC 상청액은 재조합 인간 TNFα에 결합용 고-처리량 ELISA에서 선별되었다. TNFα-결합 상청액은 ELISA에 의해 사이노몰구스 원숭이 TNFα에 결합, 결합 동력학 그리고 L929 검정에서 인간 TNFα의 생물학적 활성을 중화시키는 그것의 잠재력에 대하여 추가로 특성규명되었다. 결합 동력학을 예외로, 고-처리량 선별의 보고 값은, 단일점 측정 (무 용량-반응)에 기반하는, "유" 또는 "무" 응답으로서 해석되어야 한다. 사이노몰구스 원숭이 및 마우스 TNFα에 친화성은 항체 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 증폭 및 서열분석을 위하여 선택된 모든 102 클론에 대하여 분석되었다.
1.2.2.1 인간 TNFα에 결합
1차 선별의 목적은 인간 TNFα에 특이적인 항체를 생산하는 ASC 클론을 확인하는 것이다. 이러한 목적을 위해, 3452 ASC 클론의 세포 배양 상청액은 ELISA (참조 2.2.1)에 의해 인간 TNFα에 대한 항체의 존재에 대하여 분석되었다. 사용된 ELISA 방법은 재조합 인간 TNFα에 결합된 IgG 하위유형의 항체의 "양"을 평가하지만, 항체의 농도 또는 친화성에 대한 정보를 제공하지 않는다. 이 검정에서, 894 ASC 클론으로부터 상청액은 명확히 배경 위이었던 신호를 생산하였다. 선별에서 적중률은 토끼 #1로부터 확인된 792 중에서 153 히트 (19.3%) 및 토끼 #2로부터 확인된 1144 중에서 225 히트 (19.7%)로 토끼 #1 및 토끼 #2에 대하여 유사하였다. 토끼 #3은 1408 중에서 484 히트의 확인을 초래하는 34.4%의 상당히 더 높은 적중률을 보여주었다. 이러한 1차 선별에서 확인된 모든 894 히트는 SPR (2차 선별)에 의한 결합 동력학의 측정에 거치게 되었다.
1.2.2.2 TNFα 결합 동력학
2차 선별의 목적은 표면 플라즈몬 공명 (SPR, 참조 2.2.2)에 의해 1차 선별로부터 각각의 히트에 대하여 표적 결합의 품질에 관한 정량적 정보를 수득하는 것이다. 1차 선별 동안 사용된 ELISA와 대조적으로, 이러한 방법은 시간의 함수로서 표적 결합의 동력학을 평가한다. 이것은 그것의 표적으로부터 항체의 회합 (ka) 및 해리 (kd)용 속도 상수의 결정을 허용한다. 비 kd/ka는, 항체의 그것의 표적에의 친화성을 반영하는, 평형 해리 상수 (KD)를 제공한다. 1차 선별에서 확인된 894 히트 중, 인간 TNFα에 대한 결합 친화성은 839 단클론성 토끼 항체에 대하여 결정될 수 있다. 잔존 55 항체에 대하여 ASC 상청액에서 항체 농도가 각각의 셋업에서 SPR 기기의 검출 한계 미만이었기 때문에 친화성은 측정될 수 없다. 측정될 수 있는 839 항-TNFα 항체는 1.36 x 10-13 M 내지 1.14 x 10-8 M 미만 범위의 해리 상수 (KD)를 보여주었다. 분석된 모든 항체의 69%는 0.5 nM 미만의 KD를 가졌다.
토끼 #2 및 #3으로부터 확인된 히트 선별용 2.21 x 10-10 M 및 2.09 x 10-10 M의 중앙 KD는 유사하였던 반면 토끼 #1은 4.65 x 10-10 M의 중앙 KD로 약 2-배 더 높은 값을 보여주었다. 단지 중화 선별 히트를 고려하는 경우, 친화성 분포는 중앙 KD (1.4 x 10-10 M 내지 1.27 x 10-10 M의 중앙 KD)에 대하여 하한값으로 모두 3마리 동물에 대하여 유사하였다. 0.041 nM, 0.029 nM 및 0.026 nM 미만 친화성은 토끼 #1, #2 및 #3, 각각에 대하여 선별 히트의 5%로 측정되었다. 상청액의 2%로, 친화성은 심지어 낮은 피코몰 범위 (6.2 pM, 7.9 pM 및 11 pM 미만)이었다. 2차 선별로부터 비롯한 고-친화성 항체의 탁월한 수율은 인간화 및 리포멧팅에 가장 적절한 항체의 선택에 넓은 기준을 제공한다.
1.2.2.3 효력
효력의 평가를 위하여, 세포-기반 검정 (L929 검정)은 개발되었다 (참조 2.2.3). 894 선택된 항체 중에서 506 (56.6%)는 50% 초과만큼 L929 검정에서 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시켰다. 역가 분석 동안 수득된 결과에 따라, 중화 히트의 최고 백분율은 62.8%의 적중률로 토끼 #3에서, 이어서 56.4% 의 적중률로 토끼 #2 및 39.9%의 최저 적중률로 토끼 #1에서 유래되었다. 이들 중화 항체의 친화성은 1.36 x 10-13 내지 1.19 x 10-9 M 범위이었다.
1.2.2.4 종 교차-반응성 (사이노몰구스 원숭이)
1차 선별에서 확인된 모든 894 히트는 ELISA에 의해 사이노몰구스 원숭이 TNFα에 대한 종 교차-반응성에 대하여 분석되었다 (참조 2.2.1). 이러한 추가의 선별의 목적은 사이노몰구스 원숭이 TNFα와 교차-반응한다고 공지되는 ASC 클론의 선택을 허용하는 것이었다. 사용된 ELISA 방법은 재조합 사이노몰구스 원숭이 TNFα에 결합된 IgG 하위유형의 항체의 "양"을 평가하지만, 항체의 농도 또는 친화성에 대한 정보는 제공하지 않는다. 414 (46%) ASC 클론으로부터 상청액은 뚜렷한 신호 (광학 밀도 (OD) =　1)을 생산하였다. 사이노몰구스 원숭이 TNFα에 대한 히트 교차-반응성의 백분율은 토끼 #1로부터 확인된 153 중에서 81 히트 (52.9%) 및 토끼 #3으로부터 확인된 484 중에서 236 히트 (48.8%)로 토끼 #1 및 토끼 #3에 대하여 유사하였다. 37.8%로, 토끼 #2는 225 중에서 82 히트의 확인을 초래하는 교차-반응성 히트의 약간 더 낮은 백분율을 보여주었다.
1.2.2.5 RT-PCR용 클론의 선택
토끼 항체의 히트 확인, 유전자 서열 분석 및 후속 인간화용 필요 조건으로서, 토끼 항체 가변 도메인을 인코딩하는 유전적 정보는 회수되는 것이 필요하다. 이것은 상보적 DNA (cDNA) 속으로 각각의 메신저 RNA의 역전사 (RT), 이어서 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의한 이중가닥 DNA의 증폭에 의해 실시되었다. RT-PCR을 거친 ASC 클론의 선택은 주로 친화성 및 중화 활성에 기반되었다. 추가의 기준으로서 사이노몰구스 원숭이 TNFα에 대한 교차-반응성은 고려되었다. 전체로 102 ASC 클론은 RT-PCR에 의한 유전자 클로닝을 위하여 선택되었다. 먼저, 50% 초과만큼 L929 검정에서 TNFα의 생물학적 활성을 억제시켰던 그리고 사이노몰구스 원숭이 TNFα에 상당한 결합을 보여주었던, 80 pM 미만 KD로 (친화성의 면에서) 93 최상의 랭킹 ASC는 선택되었다. 추가로, 50% 초과만큼 중화된 TNFα 활성이 그러나 사이노몰구스 원숭이 TNFα에 결합하지 않았던 20 pM 미만 KD를 가진 모두 9 최상의 랭킹 ASC 클론은 그럼에도 불구하고 또한 선택되었다. 전체로, 12, 13 및 66 ASC 클론은 성공적으로 증폭되었고 토끼 #1, #2 및 #3, 각각으로부터 서열분석되었다.
1.2.2.6 원하는 특성을 가진 관련된 클론의 확인
단리된 ASC 클론의 패널의 유전적 다양성을 특성규명하기 위해 상보적 결정 영역 (CDRs)의 서열은 추출되었고 다중 서열 정렬을 거치게 되었고 따라서 계통발생 트리에서 서열 클러스터링을 허용하였다.
한편으로는 이러한 분석이 인간화 및 리-포멧팅 실험 속으로 이월되도록 클론 서열의 다양한 세트의 선택을 허용하는 동안 토끼에서 공통 친계 B-세포 클론을 전단하는 것처럼 보였던 클론 서열의 상동성 클러스터를 또한 확인한다. 이들 서열 클러스터의 특질은 CDRs에서 높은 서열 상동성 및 약동학적 특성의 일관된 패턴이다. 이들 피쳐의 모두가 표 2 및 3에서 8개 클론의 클러스터에 대하여 요약된다. 이러한 서열 클러스터의 기능성 보존에도 불구하고 표 3에서 공통 서열은, 원하는 약동학적 프로파일을 여전히 초래하면서, CDRs의 특정 가변성이 용인되는 것을 드러낸다.
표 2: B-세포 상청액내 단클론성 항체의 약동학적 특성
Figure 112018090719773-pct00005
표 3: CDRs에 관한 하기 서열 데이터는 상기 클론에 대하여 수득되었다
Figure 112018090719773-pct00006
Figure 112018090719773-pct00007
1.2.2.7 (SPR에 의한) 사이노몰구스 원숭이 TNFα에 대한 교차-반응성
TNFα를 강력하게 중화시켰던 고친화도 히트의 높은 수 때문에, 종 교차-반응성은 히트 확인용 ASC 클론의 선택을 용이하게 하기 위해 RT-PCR을 거치게 되었던 모든 단클론성 토끼 항체에 대하여 평가되었다. 사이노몰구스 원숭이 TNFα에 친화성은 상기에 기재된 바와 같이 유사하게 SPR 측정에 의해 결정되었다 (참조 또한 2.2.2). 사이노몰구스 원숭이 TNFα에 대하여 93 시험된 항체의 친화성은 9.6 x 10-12 내지 2.1 x 10-9 M 범위이었다. 93 교차-반응성 항체 중 38은 유사한 친화성 (KD로 2-배 미만 차이)로 인간 및 사이노몰구스 TNFα를 결합시켰다. 또한, 인간과 사이노몰구스 사이 친화성에서 차이는 93 교차-반응성 항체의 79에 대하여 20-배 미만이었고 이들의 62에 대하여 10-배 미만이었고, 이것은 사이노몰구스 원숭이에서 전임상 개발을 위하여 이들을 허용가능하게 한다.
2. 방법
2.1 분류 검정
토끼 림프 조직으로부터 항원-특이적 B-세포의 단리용 유동-세포측정 기반 분류 절차는 하기에 의해 설명된 바와 같이 수행되었다: Lalor 등 (Eur J Immunol.1992;22.3001-2011)
2.2 선별 검정
2.2.1 TNFα 결합 ELISA (인간 및 사이노몰구스 원숭이 TNFα)
재조합 인간 TNFα (Peprotech, Cat. No. 300-01)은 96 웰 미세적정 ELISA 플레이트상에 코팅되었다. ASC 배양 상청액에서 토끼 항체의 고정된 TNFα에의 결합은 2차 HRP-표지된 항-토끼 IgG (JacksonImmuno Research, Cat. No. 111-035-046)에 의해 검출되었다. TMB 기질 (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, KPL, Cat. No. 53-00-00)은 첨가되었고 색상 반응은 H2SO4의 첨가에 의해 중단되었다. 플레이트는 450 nm의 파장에서 미세적정 플레이트 리더 (무한대 판독기 M200 Pro, Tecan)을 이용하여 판독되었다.
선별 캠페인 동안 검정 성능은 상업적으로 입수가능한 양성 대조군 항-TNFα 토끼 다클론성 항체 (AbD Serotec, Cat. No. 9295-0174)로 모니터링되었다. 이러한 목적을 위해 양성 대조군 항체는 각각의 선별 플레이트에서 반복하여 100 및 250 ng/mL에서 시험되었다. 양성 대조군의 반응의 강건성 및 정확성은 각각의 플레이트에 대하여 모니터링되었다. 최종 검정 조건에서, 신호-대-바탕 비는 250 ng/mL에서 양성 대조군에 대하여 30 내지 40이었고 양성 대조군의 변동 계수 (CV)는 10% 미만이었다. 250 ng/mL 양성 대조군에 대해 ≥100%의 광학 밀도를 가진 신호는 1차 선별 히트로서 고려되었다.
혈청 역가 결정을 위하여, 동일한 ELISA 셋업은 상기에 기재된 바와 같이 사용되었다. 혈청 희석은 면역 혈청의 결합 신호가 미접촉 관련없는 동물의 신호와 비교하여 적어도 3-배 더 높았던 경우 양성으로 고려되었다.
사이노몰구스 원숭이에 대한 종 교차-반응성은 상기에 기재된 바와 같이 유사한 ELISA를 이용하여 결정되었다. 재조합 사이노몰구스 원숭이 TNFα (Sino Biological, Cat. No. 90018-CNAE)는 96 웰 미세적정 ELISA 플레이트 상에 코팅되었다. ASC 배양 상청액에서 토끼 항체의 고정된 사이노몰구스 원숭이 TNFα에의 결합은 상기 지정된 바와 같이 HRP-표지된 2차 항체에 의해 검출되었다. 토끼 #2로부터 면역 혈청은 1:80,000 및 1:320,000의 희석에서 양성 대조군으로서 사용되었다. 양성 대조군의 반응의 강건성 및 정확성은 각각의 플레이트에 대하여 모니터링되었다. 최종 검정 조건에서, 신호-대-바탕 비는 1:80,000의 희석에서 양성 대조군에 대하여 20 내지 30이었고 양성 대조군의 CVs는 10% 미만이었다.
2.2.2 SPR (인간 및 사이노몰구스 원숭이)에 의해 TNFα에 결합 동력학
인간 TNFα쪽으로 항체의 결합 친화성은 MASS-1 SPR 기기 (Sierra Sensors)를 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정되었다. 기기의 성능은 표준 참조 용액에 의해 뿐만 아니라 참조 항체-항원 상호작용 예컨대 인플릭시맙-TNFα 상호작용의 분석에 의해 적격화되었다.
친화성 선별을 위하여, 토끼 IgGs의 Fc 영역에 특이적 항체 (Bethyl Laboratories, Cat. No. A120-111A)는 표준 아민-커플링 절차를 이용하여 센서 칩 (SPR-2 Affinity Sensor, High Capacity Amine, Sierra Sensors)상에 고정되었다. ASC 상청액에서 토끼 단클론성 항체는 고정된 항-토끼 IgG 항체에 의해 포착되었다. 단클론성 항체의 포착후, 인간 TNFα (Peprotech, Cat. No. 300-01)은 90 nM의 농도에서 3 분 동안 유동 세포 속으로 주사되었고, 센서 칩상에 포착된 IgG로부터 단백질의 해리는 5 분 동안 진행하게 되었다. 각각의 주사 사이클후, 표면은 10 mM 글리신-HCl의 2개 주사로 재생되었다. 겉보기 해리 (kd) 및 회합 (ka) 속도 상수 및 겉보기 해리 평형 상수 (KD)는 1 대 1 랑뮤어 결합 모델을 이용하여 MASS-1 분석 소프트웨어 (Analyzer, Sierra Sensors)로 계산되었고 적합의 품질은 상대 Chi2 (피분석물의 외삽된 최대 결합 수준으로 정규화된 Chi2)에 기반하여 모니터링되었고, 이는 곡선 적합의 품질에 대한 평가이다. 대부분의 히트에 대하여 상대 Chi2 값은 15% 미만이었다. 리간드 결합용 반응 단위 (RU)가 항체 포착용 RUs의 적어도 2%이었다면 결과는 유효한 것으로 간주되었다. 항체 포착에 대하여 RUs의 2% 미만으로 리간드 결합에 대한 RUs를 가진 샘플은 포착된 항체에 TNFα의 특이적 결합을 보여주지 않는 것으로 간주되었다.
사이노몰구스 원숭이 TNFα (Sino Biological, Cat. No. 90018-CNAE)에 대한 종 교차-반응성은 동일한 검정 셋업 및 TNFα 농도를 이용하여 그리고 동일한 품질 측정을 적용하여 측정되었다. 상대 Chi2는 분석된 대부분의 ASC 상청액에 대하여 15% 미만이었다.
2.2.3 L929 섬유아세포에서 TNFα-유도된 세포자멸사
재조합 인간 TNFα의 생물학적 활성을 중화시키기 위한 ASC 배양 상청액으로부터 토끼 IgGs의 능력은 마우스 L929 섬유아세포 (ATCC/LGC Standards, Cat. No. CCL-1)을 이용하여 평가되었다. L929 세포는 1 μg/mL 악티노마이신 D의 첨가에 의해 TNFα-유도된 세포자멸사에 민감화되었다. 세포는 24시간 동안 50% ASC 배양 상청액 및 100 pM (5.2 ng/mL) 인간 TNFα (Peprotech, Cat. No. 300-01)의 존재하에 96-웰 편평 바닥 미세적정 플레이트에서 배양되었다. 정제된 항체에 비교하여, TNFα의 더 높은 농도는 히트 선별용 ASC 상청액의 존재하에 사용되어야 한다. 세포의 생존은 WST-8 (2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2H-테트라졸륨, 모노-나트륨 염) 세포 증식 시약 (Sigma Aldrich, Cat. No. 96992)를 이용하여 비색계 검정에 의해 결정되었다. WST-8은 세포 탈수소효소에 의해 오렌지 포르마잔 생성물로 환원된다. 생산된 포르마잔의 양은 살아있는 세포의 수에 직접적으로 비례한다. 데이터는 Softmax Data Analysis Software (Molecular Devices)를 이용하여 4-파라미터 로지스틱 곡선 적합을 이용하여 분석되었고, 50% (IC50)만큼 TNFα-유도된 세포자멸사를 중화시키기 위해 요구된 인플릭시맙의 농도는 36.2 ng/mL의 농도에서 계산되었다. 따라서, 이러한 검정용 검출의 추정된 하한은 30 내지 40 ng/mL이다. TNFα를 차단하기 위한 잠재력이 단클론성 항체의 농도 뿐만 아니라 항체의 표적에의 친화성에 의존적이기 때문에, 이러한 값은 검출 한계에 대하여 어림 추정치이다. 하지만, 대부분의 ASC 상청액에서 IgG 농도가 40 ng/mL의 농도 초과이기 때문에 검정의 감수성은 ASC 상청액의 선별에 충분하다. TNFα-유도된 세포자멸사의 50% 중화를 초래하는 상청액은 양성으로 고려되었다.
선별 캠페인 동안 강력한 검정 성능을 확신시키기 위해 양성 대조군 항체 인플릭시맙은 각각의 선별 플레이트상에 반복하여 115 ng/mL (0.8 nM)에서 그리고 58 ng/mL (0.4 nM)에서 시험되었다. 양성 대조군에 대하여 반응의 정확성 및 퍼센트 억제는 각각의 선별 플레이트에 대하여 모니터링되었다. 각각의 플레이트용 승인 범주는 아래와 같이 셋팅되었다: 20% 미만 변동 계수 (CV)와 115 ng/mL의 농도에서 양성 대조군 항체로 적어도 60% 억제.
실시예 2: scFv의 인간화 및 생성
1. 결과
1.1 히트 확인 & 인간화용 히트의 선택
친계 토끼 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 73 특유의 세트는 히트 선별 동안 회수되었고 서열 정렬에 의해 분석되었다. 개별 토끼 IgG 클론의 서열 상동성 및 선별 검정 결과에 기반하여, 30 후보는 히트 확인을 위하여 선택되었다. 29 단클론성 항체는 제조되었고 친화성 및 효력의 면에서 최상의 수행 클론은 인간화 및 선도 후보 생성을 위하여 선택되었다. 클론의 선택용 기준은 i) L929 검정에서 인간 TNFα의 중화, ii) 인간 TNFα에 대한 고친화도, iii) 사이노몰구스 및 레수스 원숭이 TNFα에 대한 교차-반응성, 및 iv) 서열 다양성이었다. 1 클론 (17-22-B03)은 인간화 - L929 검정에서 인간 TNFα를 중화시키는 효력의 면에서 최상의 랭킹 IgGs 중 하나에 대하여 선택되었다. 결합 강도에 대하여, 친화성의 특정 손실이 scFv 포멧으로 리포멧팅 및 인간화의 결과로서 기대될 필요가 있기 때문에 고 친화성은 원해진다.
IgG 클론 번호 17-22-B03용 데이터는 표 4에서 요약된다.
표 4: 정제된 단클론성 항체 (17-22-H05)의 생체외 결합 및 활성 특성
Figure 112018090719773-pct00008
1.2 인간화된 scFv 단편의 생성 및 선택
상보성 결정 영역 (CDRs)를 인코딩하는 서열은 WO 2014/206561에서 기재된 바와 같이 인간 가변 도메인 스캐폴드 서열상에 CDR-루프 그라프팅에 의해 인실리코 전달되었다. 또한 제2 작제물은, 면역글로불린 도메인 및 CDR 위치결정에 대하여 구조적 관련성을 가진 위치에 공여체 서열로부터 추가의 아미노산을 전달하였던, 토끼 클론에 따라 생성되었다. 각각의 인간화된 단쇄 항체 Fv (scFv)를 인코딩하는 (박테리아 발현용 최적화된 코돈 용법을 가진) 인공 유전자는 (상응하는 가변 경쇄 및 중쇄로부터) 합성되었다. 폴리펩타이드는 그 다음 생산되었고 히트 확인 동안 기재된 바와 같이 유사한 검정을 이용하여 후속적으로 특성규명되었다.
1.2.1 인간화 및 인간화된 scFv (APIs)의 제조
선택된 클론의 인간화는 WO 2014/206561에서 기재된 바와 같이 Vκ1/VH3 유형의 scFv 수용체 프레임워크상에 토끼 CDRs의 전달을 포함하였다. 개략적으로 도 1에서 보여지는, 이 공정에서, 6 CDR 영역의 아미노산 서열은 공여체 서열 (토끼 mAb)에서 확인되었고 수용체 스캐폴드 서열 속으로 그라프팅되어, 작제물 일명 "CDR 그라프트"를 초래하였다.
또한, CDR 위치결정 및 따라서 항원 결합에 잠재적으로 영향을 미칠 것으로 기대된, 위치 L15, L22, L48, L57, L74, L87, L88, L90, L92, L95, L97, L99 및 H24, H25, H56, H82, H84, H89, H108 (AHo 넘버링)에서 토끼 공여체로부터 추가의 아미노산 변형을 포함하였던, 제2 그라프트는 설계되었다 (Borras 등, 2010, JBC 285:9054-9066). 이들 인간화된 작제물은 "구조적 (STR) 그라프트"로 명명된다. STR 작제물의 상당한 이점을 드러내었던 이들 2개의 초기 작제물에 대하여 특성규명 데이터의 비교의 경우에서 STR 그라프팅된 VH와 CDR 그라프팅된 VL을 조합시켰던 추가의 변이체는 설계되었다. 이러한 조합은 STR 그라프트의 활성을 보유하는데 종종 충분함이 증명되었고 (Borras 등 JBC. 2010;285:9054-9066) 인간 수용체 스캐폴드에서 더 적은 비-인간 변경이 손상된 안정성에 대하여 위험 및 또한 면역원성에 대하여 잠재력을 감소시킴에 따라 일반적으로 바람직할 것이다.
일단 이전의 섹션에서 기재된 인-실리코 작제물 설계가 완료되었다면 상응하는 유전자는 합성되었고 박테리아 발현 벡터는 작제되었다. 발현 작제물의 서열은 DNA의 수준에서 확인되었고 작제물은 일반적인 발현 및 정제 프로토콜에 따라 제조되었다.
단백질의 이종성 발현은 불용성 봉입체로서 E.콜리에서 수행되었다. 발현 배양물은 기하급수적으로 성장하는 출발 배양물로 접종되었다. 배양화는 상업적으로 입수가능한 풍부 배지를 이용하여 회전식 진탕기내 진탕 플라스크에서 수행되었다. 세포는 2의 정의된 OD600으로 성장되었고 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)로 밤새 발현에 의해 유도되었다. 발효의 마지막에 세포는 원심분리에 의해 수확되었고 초음파처리에 의해 균질화되었다. 이 시점에서 상이한 작제물의 발현 수준은 세포 용해물의 SDS-PAGE 분석에 의해 결정되었다. 봉입체는 세포 잔해 및 다른 숙주 세포 불순물을 제거하기 위해 몇 개의 세정 단계를 포함하였던 원심분리 프로토콜에 의해 균질화된 세포 펠렛으로부터 단리되었다. 정제된 봉입체는 변성 완충액 (100 mM Tris/HCl pH 8.0, 6 M Gdn-HCl, 2 mM EDTA)에 용해되었고 scFvs는 천연적으로 접혀진, 단량체성 scFv의 밀리그램 양을 생성하였던 확장가능한 리폴딩 프로토콜에 의해 리폴딩되었다. 표준화된 프로토콜은, 다음과 같은 단계를 포함하였던, scFvs를 정제하는데 이용되었다. 리폴딩후 생성물은 Capto L 아가로스 (GE Healthcare)를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 포착되어 정제된 scFvs를 수득하였다. 초기 시험에서 친화성 및 효력 기준을 충족시켰던 선도 후보는 HiLoad Superdex75 칼럼 (GE Healthcare)를 이용하는 폴리싱 크기-배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제되었다. 정제 프로토콜에 이어서 단백질은 완충 식염수 용액에서 제형화되었고, 하기에서 기재된 바와 같이, 다양한 생체물리학적, 단백질 상호작용 및 생물학적 방법을 특징으로 하였다. 상이한 작제물의 생산가능성은 배치용 정제된 단백질의 최종 수율 결정 및 리폴딩 용적의 1 L로 이러한 값의 정상화에 의해 비교되었다.
1.2.2 인간화된 scFv의 생체물리학적 특성규명
안정성 및 생산가능성에 대해 scFv의 생체물리학적 특성규명은 표 5에서 컴파일링되었다. scFv 작제물의 생산가능성 및 안정성은 후속 섹션에서 논의된 바와 같이 상이한 보고 시점을 특징으로 하였다.
scFv는, 하기에서 설명된 바와 같이, 특정 기준에 관해 조사되었다.
생산가능성 기준은 선택된 scFv 독립체가 선도 분자의 후기 발생을 지지하기에 충분한 양으로 발현, 리폴딩 및 정제될 수 있다는 것을 보장할 수 있다. 정의된 기준은, SDS-PAGE에 의해 평가된 바와 같이, 발효 액체배지의 리터당 scFv의 발현 수율, 및, 리폴딩 용액의 1 리터로 역 계산된, UV 분광분석법에 의해 정제된 단백질의 양의 측정에 의해 평가된 바와 같이, 일반적 실험실-척도 과정에서 달성된 정제 수율이었다.
안정성용 기준은 분자의 제조 공정 동안 응집 경향 그리고 저장 및 추가 취급 동안 그것의 구조적 완전성을 평가하도록 의도되었다. SE-HPLC에 의해 결정된 단량체 함량은 정제 공정 (2.2.3) 동안 분자의 콜로이드성 안정성 평가를 허용한다. 후속 안정성 연구에서 단량체 함량은 1 및 10 mg/mL에서 4 주의 지속기간 및 4, -20 및 < -65℃에서 저장에 대해 시험되었다. 또한, 단백질의 콜로이드성 안정성은 5 냉동 및 해동 사이클후 시험되었다. 추가의 안정성 지시 파라미터로서, 열적 언폴딩의 중간점은 선도 후보의 형태적 안정성에 읽어내기를 제공하기 위해 시차 주사 형광측정법 (DSF) (2.2.4)에 의해 결정되었다.
표 5: 인간화된 scFvs에 대한 생체물리학적 특성규명의 요약
Figure 112018090719773-pct00009
1.2.2.1 생산가능성 평가
선도 후보 scFv 분자는 배치 식으로 진탕 플라스크 발효에 의해 발현되었고 일반 실험실-척도 과정에 의해 정제되어 추가 특성규명용 단백질 샘플을 수득하였다. 이러한 과정 동안 일부 핵심 성능 파라미터는 후보 분자를 비교하기 위해 그리고 작제물을 생성하기 잠재적으로 어려운 것을 확인하기 위해 모니터링되었다.
발현 역가는 원심분리에 의한 세포의 수확후 미정제 E.콜리 용해물의 수준에서 결정되었다. 수확 동안 세포의 작은 손실은 예상되지만, 이러한 인자는 생산성의 더욱 보수적 평가를 선호하여 발현 수율의 계산을 위하여 무시되도록 선택되었다. 용해물에서 scFv 생성물의 정량화를 위하여 쿠마씨 염색된 환원 SDS-PAGE (2.2.1)은 샘플에서 숙주 세포 단백질로부터 생성물 식별을 허용하는 방법의 높은 특이성으로 인해 선택되었다.
생산가능성을 평가하는 제2 기준은 리폴딩 용액의 리터당 계산된 scFv의 정제 수율이다. 이러한 파라미터는 단백질 리폴딩 단계를 포함하는 기대된 제조 공정에서 잠재적인 병목현상을 다룬다. 리폴딩 절차의 효율이 비교할만한 제조 공정에서 제한인 것으로 증명되기 때문에 정의된 리폴딩 용적으로 정규화된 생산가능성에 대해 상이한 작제물의 성능을 비교하는 것이 결정되었다. 수율의 계산을 위하여 각각의 배치로부터 최종 단백질 샘플은 UV 흡광도 (2.2.2)에 의해 정량화되었고 각각의 정제의 실제 리폴딩 용적에 의해 분할되었다 (표 6).
표 6: 3 인간화된 scFvs에 대한 생산가능성 데이터의 요약. 발현 역가는 생산종료 세포의 용해물에서 정량적 SDS-PAGE에 의해 결정되었다. 배치 수율은 최종 정제 풀의 UV 흡광도 측정에 의해 결정되었다. 정제 수율은 리폴딩 용적의 리터당 정제된 scFv로서 계산된다.
Figure 112018090719773-pct00010
1.2.2.2 안정성 평가
scFv 작제물의 형태적 안정성, 단분산도 및 구조적 완전성의 평가는 현상성에 대해 상이한 분자의 랭킹용 통합 구성요소이다. 상이한 작제물의 유의미한 비교용 필요 조건은 유사한 품질의 정제된 분자의 제제이다. SE-HPLC에 의해 결정된 기준 "단량체 순도"는 상이한 시험 서브스턴스의 양립가능한 품질을 보장하도록 의도된다. SE-HPLC 분석에 더하여, 단백질 순도 및 동일성의 결정용 SDS-PAGE는 시험된 제제의 비교할만한 품질을 확인하기 위해 수행되었다.
3개의 scFvs의 SE-HPLC 결과는 모든 제제가 적어도 99%의 단량체 함량으로 정제될 수 있다는 것을 드러낸다 (도 2).
선도 후보의 열적 언폴딩 행동은 그것의 기대된 형태적 안정성에 대해 분자의 랭킹을 허용하기 위해 시차 주사 형광측정법 (DSF)에 의해 시험되었다. 형광 미가공 데이터의 정규화된 플롯은, 각각의 샘플의 2중 측정을 도시하는, 도 3에서 보여진다. 헙력 언폴딩 행동은 관측되었다. 3 분자 17-22-B03-sc02, 17-22-B03-sc08 및 17-22-B03-sc12는 77.5, 76.2 및 74.9℃, 각각의 Tm을 보여주었다.
안정성 평가의 제2 아암에서 분자의 단분산도는 상이한 온도에서 4 주의 지속기간 동안 모니터링되었다. 안정성 연구 및 수득한 단량체 함량에 대한 결과는 도 4에서 보여진다. 모두 3 분자 (17-22-B03-sc02, 17-22-B03-sc08 및 17-22-B03-sc12)는 10 mg/mL의 농도에서 각각의 시작 값에 대해 단량체의 5% 미만 손실 및 최소의 95% 단량체를 초과하는 단량체 함량에서 시작한다. -20℃ 및 <-65℃에 냉동된 상태에서 샘플은 단지 최소 차이를 경시적으로 보여주었다. 가장 엄격한 조건 (4℃)에서 분자 17-22-B03-sc08은 4 주 동안 단량체의 0.5%만큼 적게 손실되었다. 또한 스트레스 안정성 연구는 최대 4 주 동안 37℃의 온도 및 10 mg/mL의 scFv 농도에서 수행되었다. 이러한 조건에서 상이한 작제물의 응집용 경향의 더욱 엄격한 식별력이 기대된다. 도 6에서 요약된 수득한 데이터는 17-22-B03-sc02 및 17-22-B03-sc08에 대하여 28 일후 28%의 단량체 손실을 드러냈다. 두 scFv는 스트레스 상태에서 양호한 단량체 안정성을 실증하였다. 4℃에 안정성 연구의 크로마토그램은 도 5에서 제공되고, 여기에서 0 일째 그리고 28 일후 4℃에 샘플은 보여진다. 이러한 크로마토그램 오버레이에서 또한 냉동/해동 안정성의 결과는 보여진다. 연구의 이러한 일부를 위하여 샘플은 총 5 사이클 동안 반복적으로 냉동 및 해동되었다. 분석적 SE-HPLC에 의한 단량체 함량의 수득한 정량화는 2 샘플에서 임의의 변화를 드러내지 않았다 (표 5).
SDS-PAGE 분석은 UV 흡광도에 의해 정량화용 지지적 데이터를 생성하기 위해 2 scFvs에 대하여 수행되어, 샘플 제제의 순도를 확인하였고 이로써 함량 정량화에 특이성을 부여하였다. 이러한 분석의 또 다른 측면에서 SDS-PAGE 결과는, 현상성 관점으로부터 중요한 특징인, 안정성 연구 (<-65℃에서 저장된 0 일째부터 샘플에 비교된 10 mg/mL의 농도 및 4℃에서 28 일) 동안 단백질 분해의 부재를 드러냈다.
이러한 평가의 범위 이내 수행된 상이한 연구가 단백질 안정성의 구별되는 기계론적인 측면을 다룬다는 것을 언급하는 것이 중요하다. 단백질의 열적 언폴딩 온도의 결정은 고온에서 저장시 SE-HPLC에 의한 단분산도의 측정에 상보적 결과를 제공할 것이다. 양쪽 방법이 잠재적인 생성물 보존 기간 및 안정성의 추정치를 제공하기 위해 설계되는 반면 다루어진 기전은 심오하게 상이하다. 열적 언폴딩에 의해 평가된 전달 (Tm)의 중간점은 (△G의 열역학적 결정을 허용하지 않는) 단백질 도메인 안정성에 대하여 정성적 측정이다. 고도로 안정적인 단백질 도메인 (높은 Tm)은 주위 온도에서 자발적으로 덜 언폴딩할 것 같고 따라서 언폴딩된 도메인 상호작용에 의해 유도된 비가역적 응집/침전하는 경향이 덜하다. 높은 도메인 안정성은 아미노산 잔기의 치밀한 패키징을 나타내고, 이는 또한 프로테아제 절단을 향한 저항과 상관한다. SE-HPLC 평가는 다른 한편으로 단량체성 분획의 뿐만 아니라 가용성 올리고머/응집물의 함량을 정량적으로 결정한다. 그와 같은 가용성 올리고머는 종종 정확하게 폴딩된 단백질 사이 정전 또는 소수성 상호작용에 의해 유도된 가역적 및 상대적으로 느슨한 회합이다. 열적 언폴딩에 의해 평가된 바와 같이 Tm과 SE-HPLC에 의해 평가된 바와 같이 올리고머/응집물 형성에 대한 특히 "경계 라인" 안정성을 가진 단백질에 대한 경향 사이 일부 상관관계가 있다. 대략 60℃의 특정 역치 Tm 넘어 항체 가변 도메인은 주위 온도에서 부분적인 도메인 언폴딩으로 인해 응집/침전 및 단백분해 열화에 대해 저항성이도록 일반적으로 충분히 안정적이다. 표면 잔기의 소수성 및/또는 정전 상호작용에 의해 유도된 올리고머화는, 하지만, 여전히 발생할 수 있다. 중요하게는, 고온 (예를 들면 37℃)에 가속화된 (스트레스) 안정성 연구에서 올리고머 형성 및 침전의 다양한 기전이 동시에 발생할 수 있다.
1.2.3 인간화된 scFvs의 시험관내 결합 및 활성의 특성규명
하기에서 인간화된 scFvs는 그것의 표적 결합 특성 및 효력에 대하여 시험관내 특성규명되었다. 인간 TNFα에 대한 결합 동력학 (ka, kd 및 KD) 및 L929 섬유아세포의 TNFα-유도된 세포자멸사를 중화시키는 효력은 분석되었다. 추가로, 사이노몰구스 원숭이 (마카카 파스시쿨라리스) 및 레수스 원숭이 (마카카 물라타) TNFα 유도된 세포자멸사를 억제시키는 효력 뿐만 아니라 TNFβ보다 TNFα에 결합용 표적 선택성 및 ELISA에 의해 인간 TNFα와 TNFRI/TNFRII 사이 상호작용을 억제시키는 효력은 결정되었다.
아래 결과의 이해를 위하여 인간 가변 도메인 스캐폴드상에 토끼 CDRs의 전달 뿐만 아니라 전체-크기 IgG 내지 scFv 단편 포멧에서 변화 양쪽이 약리적 특성에서 영향을 줄 수 있다는 것을 언급하는 것이 중요하다. 예를 들어, 친화성의 특정 손실은 인간화와 일반적으로 관련된다. 또한, IgG에 비교된 scFv의 더 작은 크기 때문에 입체 장애를 통해 상호작용 파트너를 방해하기 위한 scFv의 능력은 크게 감소된다. 마지막으로 강조하면 호모-삼량체 TNFα에 결합의 그것의 2가 방식으로 인해, 모 IgG의 친화성이 너무 높다고 (SPR 인공물) 보고될 수 있었던 것이 언급될 수 있다. 결과적으로, 친계 2가 토끼 IgG와 인간화된 1가 scFv 사이 친화성을 비교하는 경우, 보고된 "친화성에서 손실"은 과대평가될 수 있다.
1.2.3.1 친화성
인간 TNFα에 대한 인간화된 scFvs의 친화성은 SPR 측정에 의해 결정되었다 (참조 또한 2.1.1). 친화성은 각각의 scFvs의 2-배 연속 희석을 이용하여 결정되었다. scFvs는 토끼 단클론성 항체에서 유래되었다. "CDR" (CDR) 및 "구조적 그라프트" (STR)로 명명된, 2 scFv 변이체는 생성되었다. 경쇄 및 중쇄에서 프레임워크 치환의 상대 기여를 평가하기 위해 그리고 가능하게는 인간 프레임워크에서 도입된 토끼 아미노산 잔기의 수를 감소시키기 위해, 도메인 셔플링 실험은 수행되었다. 따라서, CDR 그라프팅된 경쇄 및 구조적 그라프팅된 중쇄 (CDR/STR)을 함유하는 scFv 작제물은 클론 17-22-B03에 대하여 생성되었다.
최상부 랭킹 scFvs 17-22-B03-sc02 (STR), 17-22-B03-sc08 (CDR/STR) 및 17-22-B03-sc12 (CDR(C90S)/STR)은 5.2 x 10-11 , 6.1 x 10-11 및 4.8 x 10-11 M, 각각의 친화성으로 결합하였다. 3 "구조적 그라프트" 변이체 사이 친화성에서 거의 변동이 없었다 (참조 표 7).
1.2.3.2 효력
인간 TNFα를 중화시키는 인간화된 scFvs의 능력은 L929 검정을 이용하여 분석되었다 (참조 또한 2.1.2). TNFα 유도된 세포자멸사를 중화시키는 효력 (IC50 및 IC90)은 17-22-B03 유래된 scFvs에 대하여 분석되었고 상이한 검정 플레이트로부터 IC50 및 IC90 값의 직접적인 비교를 허용하기 위해 참조 항체 인플릭시맙의 효력에 비교되었다. 상대 IC50 및 IC90 값은 인플릭시맙 및 scFvs의 질량 단위 (ng/mL)로 계산되었다. 효력 분석은 상이한 수많은 항체 단편으로 상이한 날에 몇 번 수행되었다. 도 7은 2 scFvs의 각각에 대하여 하나의 실험으로부터 대표적인 용량-반응 곡선을 보여준다. 반복되는 측정의 평균 값은 표 7에서 보여진다 (표준 편차는 표의 범례에서 요약된다).
인간화된 scFvs는 인플릭시맙보다 더 낮은 IC50 및 IC90 값으로 TNFα 유도된 세포자멸사를 억제시켰다 (참조 표 7). SPR 결과와 일치하는, 도메인 단행된 변이체 17-22-B03-sc08 (CDR/STR)은 구조적 그라프트 17-22-B03-sc02 (STR)에 비교된 경우 동일 효력을 나타냈다. scFvs 17-22-B03-sc02, 17-22-B03-sc08 및 17-22-B03-sc12는, 인플릭시맙보다 23.7-, 26.0- 및 13.4-배 더 양호한 IC50 값, 각각으로, 탁월한 TNFα-중화 활성을 보여주었다. 17-22-B03-sc02, 17-22-B03-sc08 및 17-22-B03-sc12의 IC90 값은 인플릭시맙에 대해서 보다, 각각, 29.4-, 26.6- 및 11.7-배 더 양호하였다. 친계 토끼 단클론성 항체에 대하여 관측된 바와 같이 항체의 효력과 친화성 사이 뚜렷한 상관관계는 없었다 (상관관계 도시되지 않음). 추가로, 중화 검정으로부터 결과는 특정 역치 친화성이 TNFα 신호전달의 효율적인 억제를 위하여 달성될 필요가 있다는 것을 시사한다. 예를 들어, 1 nM 초과 친화성으로 TNFα에 모두 결합하는, scFvs 16-14-D08-sc01 (CDR), 16-15-C09-sc01 (CDR), 16-24-H07-sc01 (CDR) 및 17-20-G01-sc01 (CDR)은 TNFα를 중화시키기 위한 좋지 못한 잠재력을 보여준다 (도시되지 않음).
1.2.3.3 종 교차-반응성 (사이노몰구스 및 레수스 원숭이 TNFα)
최상부 랭킹 scFvs에 대하여 종 교차-반응성은 2 방법에 의해 결정되었다: 1) L929 검정에서 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 원숭이 TNFα를 중화시키는 효력 및 2) SPR에 의한 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 원숭이 TNFα에 친화성. 상이한 종으로부터 TNFα를 중화시키는 효력은 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 원숭이 TNFα, 각각을 이용하여 인간 TNFα에 대하여 상기에 기재된 바와 같이 유사하게 L929 검정에 의해 결정되었다 (참조 또한 2.1.2). 양쪽 종으로부터 TNFα는 L929 세포자멸사를 유도하는 매우 유사한 효력을 보여주었다 (데이터 도시되지 않음). 따라서, 인간 및 원숭이 TNFα의 동일한 농도는 종 교차-반응성 시험에 사용되었다. 추가로, 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 원숭이 TNFα에 (SPR에 의한) 결합 동력학은 인간 TNFα에 대한 것과 같이 유사한 검정을 이용하여 결정되었다 (참조 또한 2.1.1).
클론 17-22-B03에서 유래된 모든 scFvs는 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 원숭이 TNFα에 교차-반응성을 보여주었다 (참조 표 7). 친화성은 유사하였다, 즉 사이노몰구스 원숭이 및 레수스 원숭이, 각각에 대하여 17-22-B03-sc02의 경우에서 5.0 x 10-11 및 1.5 x 10-10 M이었다. 인간과 레수스 원숭이 TNFα 사이 친화성에서 차이는 약 3-배이었고, 사이노몰구스 원숭이 TNFα에 친화성은 인간 TNFα에 비교된 경우 비교할만 하였다 (참조 표 7 및 도 8). 요약해서, 클론 17-22-B03에서 유래된 scFvs는 사이노몰구스 및 레수스 TNFα에 대한 종 교차-반응성을 보여주었다.
1.2.3.4 인간 TNFα-TNFRI/II 상호작용의 차단
L929 검정에 더하여, 인간 TNFα와 TNFRI/II 사이 상호작용을 억제시키는 각각의 인간화된 scFv의 효력은 ELISA에 의해 평가되었다 (참조 2.1.3). L929 검정과 유사하게, 각각의 플레이트상에서 개별 IC50 값은 각각의 플레이트상에서 함께 취득된 참조 분자 인플릭시맙의 IC50에 대해 보정되었고 상대 IC50 및 IC90 값은 인플릭시맙 및 scFvs의 질량 단위 (ng/mL)로 계산되었다.
이들이 효력 검정에서 사용된 상기 표적 농도보다 더 높은 평형 결합 상수 (KD) (KD > 표적 농도)로 그것의 표적을 결합시킬 때만 중화 검정은 표적 차단 항체의 효력을 식별할 수 있다. L929 검정을 위하여 5 pM의 TNFα 농도는 사용되었고 반면 TNFRI/II 억제 ELISAs에서 960 pM의 TNFα 농도는 사용되었다. 따라서, 이론적으로, L929 검정은 KD > 5 pM을 가진 scFvs 사이 효력을 분화시킬 수 있고, 반면 억제 ELISA는 KD > 960 pM을 가진 scFvs 사이 효력을 단지 분화시킬 수 있다. 분석된 모든 scFvs가 960 pM 미만 KDs를 보여주었기 때문에, 상이한 친화성을 가진 scFvs 사이 효력 (그러나 유사한 작용 기전)은 단지 L929 검정에서 분화될 수 있다.
17-22-B03-sc02, 17-22-B03-sc08 및 17-22-B03-sc12는 인플릭시맙에 비교하여 1.5-, 2.3- ALC 3.5-배, 각각 더 높은 TNFα-TNFRI 상호작용의 차단용 효력을 보여주었고, 반면 L929 검정에서 인플릭시맙에 비교된 효력은 상당히 더 높았다 (23.7-, 26.0- 및 13.4-배). TNFα-TNFRII 상호작용의 억제는 TNFα-TNFRI 차단에 관하여 유사한 범위이었다. 인간화된 scFvs (표 7)에 대하여 상대 IC50 값과 친계 토끼 IgG (참조 표 4)에 대하여 상대 IC50 값을 비교하는 경우 scFvs의 효력은 친화성이 일반적으로 친계 토끼 IgG에 대하여 동일한 범위에 있어도 친계 IgG에 비교하여 일반적으로 약간 더 높다. 항체 및 scFvs의 효력이 질량 단위로 비교되었기 때문에, 각각의 농도에서 원자가 (TNFα 결합 부위)의 수는 5-배 초과 더 무거운 그러나 2가 IgG에 비교된 1가 scFvs에 대하여 약 2.9-배 더 높다. 초고-친화성 결합 scFvs로, 결합능의 부족이 활성에 대하여 더 이상 핵심이 아니기 때문에 이것은 TNFα 및 TNFRI/II 상호작용의 더 강한 차단을 초래한다. 그에 반해서, 저-친화성 1가 도메인으로 반대편은 공개되었다 (Coppieters 등. Arthritis & Rheumatism, 2006;54:1856-1866). 상기 언급된 이유로, 억제 ELISA로부터 결과는 상이한 항체 사이 효력의 랭킹에 사용되지 않았고 TNFRI 대 TNFRII과 상호작용을 차단하기 위한 항체의 잠재력의 비교에 주로 사용되었다. 조사된 scFvs는 비교할만한 효력을 가진 양쪽 TNFα 수용체 사이 상호작용을 차단하였다 (표 9, 도 9 및 도 10).
1.2.3.5 표적 특이성 (TNFα 대 TNFβ에 대한 결합 선택성)
TNFβ보다 TNFα에 대하여 3 scFvs (17-22-B03-sc02, 17-22-B03-sc08 및 17-22-B03-sc12)의 특이성은 각각의 scFv에 TNFα 결합을 절반-최대로 억제시키기 위해 TNFα에 비교된 경우 TNFβ의 상대 잠재력의 평가에 의해 확인되었고 경쟁 ELISA에서 측정되었다 (참조 또한 2.1.4). 재조합 인간 TNFβ의 품질은 1) SDS-page 및 HPLC 분석에 의한 순도에 대하여, 그리고 2) 단백질의 제조자에 의해, 마우스 L929 세포독성 검정에서 생물학적 활성에 대하여 분석되었다. 도 11에서 보여진 바와 같이, 바이오티닐화된 TNFα를 가진 각각의 scFvs 사이 상호작용은 60 내지 260 ng/mL 범위의 IC50 값으로 비표지된 TNFα에 의해 차단되었고, 반면 TNFβ는 시험된 TNFβ의 최고 농도 (1250 μg/mL)에서조차 임의의 상당한 효과를 보여주지 못했다. 그러므로, 분석된 모든 scFvs는 그것의 가장 가까운 동족체, TNFβ가 아닌 TNFα에 특이적으로 결합한다. TNFβ는 시험된 농도에서 scFvs에 TNFα 결합의 임의의 상당한 억제를 보여주지 못했다. 따라서, TNFα 결합을 절반-최대로 억제시키기 위해 요구된 TNFβ 농도는 검정에서 사용된 TNFβ의 최고 농도 (1250 μg/mL)보다 상당히 더 높아야 한다. scFvs에 TNFα 결합을 절반-최대로 억제시키기 위해 요구된 TNFα 및 TNFβ의 농도를 비교하는 경우, TNFβ보다 TNFα에 대한 결합 선택성은 시험된 모든 단편에 대하여 대략 5,000 내지 20,000 배 보다 상당히 더 높다 (참조 또한 표 7). 따라서, 임의의 scFvs의 부정확한 결합은 고도로 가망이 없어 보인다.
상기에 기재된 실험의 결과는 표 7 내지 9에서 요약된다.
표 7. 인간화된 scFvs의 생체외 결합 및 활성 특성. CDR: "CDR 그라프트", STR: "구조적 그라프트". 효능 분석은 표준 편차를 가진 상이한 수많은 항체 단편으로 상이한 날에 몇 번 수행되었다: 17-22-B03-sc02 (n=4): rel. IC50=23.7±9.8 및 rel. IC90=29.4±9.5; 17-22-B03-sc08 (n=3): rel. IC50=26.0±13.6 및 rel. IC90=26.6±2.5
Figure 112018090719773-pct00011
표 8. 본 발명의 인간화된 scFvs의 사양
Figure 112018090719773-pct00012
표 9. TNFα-TNFRI 및 TNFα-TNFRII 상호작용을 차단하는 scFvs의 효능
Figure 112018090719773-pct00013
2. 방법
2.1 선도 특성규명 검정
2.1.1 SPR에 의한 종 교차-반응성 및 결합 동력학
인간 TNFα에 scFvs의 결합 친화성은 MASS-1 SPR 기기 (Sierra Sensors)를 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정되었다. SPR 검정의 성능은 참조 항체 항원 상호작용 예컨대 세르톨리주맙-TNFα 상호작용의 분석에 의해 적격화되었다. 페길화된 Fab-단편 세르톨리주맙은 scFvs의 것에 유사한 그것의 1가 결합 방식으로 인해 참조로서 선택되었다. scFvs의 친화성 측정에 대해서와 같이 동일한 검정 셋업을 이용하여, 9.94 x 10-11 M의 값은 TNFα에 대한 세르톨리주맙의 친화성에 대하여 결정되었다. 이러한 값은 9.02 ± 1.43 x 10-11 M의 공개된 KD 값과 양호하게 일치한다 (BLA 세르톨리주맙; BLA 수: 125160; 제출 일자: 2007년 4월 30일).
scFvs의 친화성 측정을 위하여 인간 TNFα (Peprotech, Cat. No. 300-01)은 50 내지 100 RUs의 고정화 수준에 도달하기 위해 아민-커플링에 의해 센서 칩 (SPR-2 Affinity Sensor, Amine, Sierra Sensors)상에 고정되었다 (SPR 분석 동안 달성된 고정화 수준은 40 내지 120 RUs이었다). 제1 단계에서, scFvs의 친화성 선별은 단 하나의 scFv 농도 (90 nM)을 이용하여 수행되었다. 제2 단계에서, 최상의 수행 scFvs를 위하여, 단일 주사 사이클 동력학 (SiCK)는 MASS-1 시스템에서 각각의 8 평행한 채널 속으로 상이한 농도에서 6 피분석물 샘플 동시 주사에 의해 단일 주사 사이클로부터 측정되었다. 친화성 선별을 위하여, 인간화된 scFvs는 3 분 동안 90 nM의 농도에서 유동 세포 속으로 주사되었고 해리는 12 분 동안 모니터링되었다. 후속 더욱 정확한 친화성 결정을 위하여, 45 내지 1.4 nM 범위의 scFv의 2-배 연속 희석은 3 분 동안 유동 세포 속으로 주사되었고 센서 칩상에 고정된 TNFα로부터 단백질의 해리는 12 분 동안 진행하게 되었다. 겉보기 해리 (kd) 및 회합 (ka) 속도 상수 및 겉보기 해리 평형 상수 (KD)는 1 대 1 랑뮤어 결합 모델을 이용하여 MASS-1 분석 소프트웨어 (Analyzer, Sierra Sensors)로 계산되었고 적합의 품질은 Chi2에 기반하여 모니터링되었고, 이는 곡선 적합의 품질에 대한 평가이다. Chi2에 대하여 값이 더 작을수록 1 대 1 랑뮤어 결합 모델에 대한 적합화는 더욱 정확하다. 친화성 선별을 위하여, Chi2가 분석된 농도에 대하여 10 미만이었다면 결과는 유효한 것으로 간주되었다. 몇 개의 scFv 농도가 분석되었던 사례에서, 시험된 모든 농도에 대해 평균 Chi2가 10 미만이었다면 결과는 유효한 것으로 간주되었다. 승인 범주는 시험된 모든 scFvs에 대하여 충족되었다.
사이노몰구스 원숭이 (Sino Biological, Cat. No. 90018-CNAE) 및 레수스 원숭이 (R&D Systems, Cat. No. 1070-RM-025/CF) TNFα (Peprotech, Cat. No. 315-01A)에 대한 종 교차-반응성은 동일한 검정 셋업을 이용하여 그리고 인간 TNFα에 대하여 상기에 기재된 바와 같이 동일한 품질 측정을 적용하여 측정되었다. 사이노몰구스 및 레수스 원숭이 TNFα에 대하여 50 내지 180 RUs 및 90 내지 250 RUs, 각각 범위의 고정화 수준은 달성되었다. scFvs는 45 내지 1.4 nM 범위의 농도로 2-배 연속 희석을 이용하여 분석되었다. 평균 Chi2 값은 시험된 모든 scFvs에 대하여 10 미만이었다.
2.1.2 L929 섬유아세포에서 TNF-유도된 세포자멸사 (scFvs에 의한 인간, 비-인간 영장류 및 TNFα의 중화)
재조합 인간 TNFα의 생물학적 활성을 중화시키는 scFvs의 능력은 마우스 L929 섬유아세포 (ATCC/LGC Standards, Cat. No. CCL-1)을 이용하여 평가되었다. L929 세포는 1 μg/mL 악티노마이신 D의 첨가에 의해 TNFα-유도된 세포자멸사로 민감화되었다. 항-TNFα 참조 항체 또는 scFvs (3000-0.05 ng/mL) 및 5 pM 재조합 인간 TNFα (Peprotech, Cat. No. 300-01)의 3-배 연속 희석은 실온에서 1시간 동안 사전-인큐베이션되었다. 사용된 TNFα 농도 (5 pM)은 준최대 L929 세포자멸사 (EC90)을 유도시킨다. 효능제/억제제 혼합물의 첨가후 세포는 24시간 동안 인큐베이션되었다. 세포의 생존은 WST-8 (2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2H-테트라졸륨, 모노-나트륨 염) 세포 증식 시약 (Sigma Aldrich, Cat. No. 96992)를 이용하여 비색계 검정에 의해 결정되었다. WST-8은 세포 탈수소효소에 의해 오렌지 포르마잔 생성물로 환원된다. 생산된 포르마잔의 양은 살아있는 세포의 수에 직접적으로 비례한다. 데이터는 Softmax Data Analysis Software (Molecular Devices)를 이용하여 4-파라미터 로지스틱 곡선 적합을 이용하여 분석되었고, 50% 및 90% (IC50 및 IC90)만큼 TNFα-유도된 세포자멸사를 중화시키기 위해 요구된 참조 항체 또는 scFvs의 농도는 계산되었다 (참조 또한 도 7). IC50 및 IC90 값을 상이한 날에 또는 상이한 검정 플레이트상에 수행되었던 실험 사이 직접적으로 비교할만하게 만들기 위해, IC50 및 IC90 값은 참조 항체 인플릭시맙에 대해 보정되었다. 반응의 정확성을 제어하기 위해, 용량-반응 곡선은 반복하여 분석되었다. 표준 편차 및 CVs는 각각의 측정 지점에 대하여 계산되었다 (CV < 20%)
사이노몰구스 원숭이 (Sino Biological, Cat. No. 90018-CNAE) 및 레수스 원숭이 (R&D Systems, Cat. No. 1070-RM-025/CF) TNFα에 대한 종 교차-반응성은 동일한 검정 셋업을 이용하여 그리고 인간 TNFα에 대하여 상기에 기재된 바와 같이 동일한 품질 측정을 적용하여 측정되었다. 인간 대응물에 유사하게, 준최대 L929 세포자멸사 (EC90)를 유도하는 TNFα 농도는 종 교차-반응성 시험에 사용되었다. 양쪽 종으로부터 TNFα는 L929 마우스 섬유아세포 세포자멸사를 유도하기 위해 인간 TNFα와 매우 유사한 효력을 보여주었다. 결과적으로 TNFα (5 pM)의 동일한 농도는 시험된 oth 종에 사용되었다. 종 교차-반응성 시험 동안 대부분의 2중 측정 지점의 CVs는 10% 미만이었다.
2.1.3 TNFα 억제 ELISA
리간드 결합에서 scFvs의 억제성 효과는, TNFα 및 TNFRI 및 TNFRII 사이 상호작용을 단독으로 재생산하는 생화학적 방법인, ELISA를 이용하여 평가되었다.
제1 억제 ELISA를 위하여, 인간 IgG의 Fc 영역에 융합된 TNFRI의 세포외 도메인 (R&D Systems, Cat. No. 372-RI)는 96-웰 Maxisorp ELISA에서 0.5 μg/mL의 농도로 코팅되었다. 제2 억제 ELISA를 위하여, 인간 IgG의 Fc 영역에 융합된 TNFRII의 세포외 도메인 (R&D Systems, Cat. No. 726-R2)는 2 μg/mL의 농도로 코팅되었다. 모든 후속 단계는 양쪽 검정에 대하여 동일하였다. TNFRI 및 TNFRII에 TNFα의 결합을 검출하기 위해, TNFα는 그것의 사용에 앞서 바이오티닐화되었다. 바이오티닐화된 인간 TNFα (960 pM, 50 ng/mL)는 3-배 연속으로 희석된 인간화된 항-TNFα scFvs 및 인플릭시맙 (10,000 ng/mL-0.2 ng/mL)로 1시간 동안 실온에서 제1 인큐베이션되었다. TNFα/항체 단편 혼합물은 TNF 수용체 고정된 플레이트에 전달되었고 고정된 TNFα 수용체에 미차단된 TNFα의 결합은 인큐베이션후 실온에서 20 분 동안 바이오틴-결합 스트렙타비딘-HRP (SDT Reagents, Cat. No. SP40C)로 검출되었다. 3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질의 첨가는 TNFRI 및 TNFRII에 TNFα의 결합에 비례하였던 비색 읽어내기를 수득하였다. 경쟁 ELISA에서 사용전, 바이오티닐화된 TNFα의 생물학적 활성은 L929 검정에서 확인되었다. 바이오티닐화된 TNFα의 EC50은 비표지된 TNFα의 EC50에 유사하였다 (데이터 도시되지 않음). 상기에 기재된 L929 검정과 유사한, 데이터는 Softmax Data Analysis Software (Molecular Devices)를 이용하여 4-파라미터 로지스틱 곡선 적합을 이용하여 분석되었고, 50% 및 90% (IC50 및 IC90)만큼 TNFα 및 TNFR의 상호작용을 억제시키기 위해 요구된 scFvs의 농도는 계산되었다. IC50 및 IC90 값을 상이한 날에 또는 상이한 검정 플레이트상에 수행되었던 실험 사이 직접적으로 비교할만하게 만들기 위해, IC50 및 IC90 값은 참조 항체 인플릭시맙에 대해 보정되었다.
반응의 정확성을 제어하기 위해, 용량-반응 곡선은 반복하여 분석되었다. 표준 편차 및 CVs는 각각의 측정 지점에 대하여 계산되었다 (CV <25%).
2.1.4 표적 특이성
항-TNFα scFvs의 특이성을 확인하기 위해, 가장 상동성 패밀리 일원 TNFβ에 결합은 평가되었다. 비표지된 TNFβ (Peprotech, Cat. No. 300-01B) 및 TNFα (Peprotech, Cat. No. 300-01)에 의해 scFvs와 바이오티닐화된 TNFα의 상호작용을 억제시키는 잠재력은 경쟁 ELISA에 의해 분석되었다. 이러한 목적을 위해, scFvs는 96-웰 Maxisorp ELISA 플레이트에서 1 μg/mL의 농도로 코팅되었다. 5-배 연속으로 희석된 비표지된 TNFα (50 μg/mL - 0.00013 μg/mL) 또는 TNFβ (1250 μg/mL - 0.00013 μg/mL)의 존재하에 코팅된 scFvs에 바이오티닐화된 TNFα (75 ng/mL)의 결합은 상기에 기재된 바와 같이 바이오틴-결합 스트렙타비딘-HRP (SDT Reagents, Cat. No. SP40C)를 이용하여 검출되었다. TNFα로 용량-반응 곡선에 대하여 데이터는 Softmax Data Analysis Software (Molecular Devices)를 이용하여 4-파라미터 로지스틱 곡선 적합을 이용하여 분석되었고, 50% (IC50)만큼 코팅된 scFv와 바이오티닐화된 TNFα의 상호작용을 차단하기 위해 요구된 비표지된 TNFα의 농도는 계산되었다. TNFβ는 바이오티닐화된 TNFα와 scFvs 사이 상호작용의 임의의 상당한 억제를 보여주지 못했다 (참조 또한 도 11). 각각의 scFv에 TNFα 결합을 억제시키기 위해 TNFα에 비교된 경우 TNFβ의 상대 잠재력을 정량화하기 위해 TNFα에 비해 TNFβ에 의한 상호작용은 계산되었다. TNFα의 IC50보다 대략 5,000 내지 20,000-배 더 높은 농도로 TNFβ를 이용하는 경우 상당한 억제가 관측되지 않았기 때문에, TNFβ보다 TNFα에 결합 선택성은 5,000 내지 20,000-배보다 상당히 더 높도록 결정되었다. 반응의 정확성을 제어하기 위해, 용량-반응 곡선은 반복하여 분석되었다. 표준 편차 및 CVs는 각각의 측정 지점에 대하여 계산되었다 (시험된 TNFα/β 농도 중 하나를 제외한 모두에 대하여 CV < 25%). 모든 scFv는 이러한 기준을 충족시켰다.
2.2 CMC 분석학
2.2.1 환원 SDS-PAGE
나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)은 정성적 특성규명을 위하여 그리고 단백질의 순도를 제어하기 위해 사용된 분석 기술이다. Unites States Pharmacopeia (USP) (USP Chapter 1056)에 따르면 분석적 겔 전기영동은 약물 서브스턴스에서 단백질의 균질성을 확인 및 평가하기 위한 적절한 및 일상적인 방법이다.
상기 방법은 발효후 발현 수율을 유도하기 위해 E.콜리 용해물로부터 scFv 생성물의 양을 정량화하는데 사용된다. 상기 방법의 또 다른 적용은 이론적 값에 대해 그것의 분자량에 기반하여 시험 서브스턴스의 동일성을 입증하는 것이다. 지지적 목적을 위하여 이러한 방법은 공정-관련된 불순물 (숙주 세포 단백질) 및 생성물 관련된 불순물 (열화 생성물 또는 부가물)에 대해 시험 샘플의 순도를 정량화하는데 사용된다.
SDS-PAGE 분석은 Bio-Rad Laboratories Inc.로부터 수득된 상업적으로 입수가능한 프리케스트 겔 시스템 "Mini Protean"으로 수행되었다. 인간화된 scFvs는 "임의의 kD" 분해 겔 (#456-9036)에서 분석되었다. 양쪽 사례에서 제조자에 의해 권고된 Tris/글리신 완충계는 사용되었다. 단백질 밴드의 검출을 위하여 어느 한쪽 SimplyBlueTM 염색 용액 (Life Technologies Corp., #LC6060)으로 쿠마씨 염색 또는 Pierce Silver Stain Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., #24612)로 은 염색은 이용되었다. 염색 절차에 대하여 각각의 공급자의 프로토콜은 뒤따랐다.
염색된 단백질 겔의 문서화 및 분석은 문서화 시스템 ChemiDoc XRS 시스템 (Bio-Rad Laboratories Inc., #170-8265) 및 소프트웨어 Image Lab, Version 4.0.1 (Bio-Rad Laboratories Inc., # 170-9690)으로 수행되었다.
용해물 샘플의 역가 결정
SDS-PAGE는 숙주 세포 단백질의 혼합물에서 관심 단백질의 특이적 검출을 허용한다. (미리 결정되었던) 방법의 선형 범위에서 참조 표준 희석 시리즈는 모든 겔에서 포함되었다. (밀도측정에 의해 측정된) 밴드 강도 대 참조 표준의 명목 농도의 선형 회귀는 표준 곡선을 계산하는데 사용되었고, 차례로, 샘플에서 scFv 함량을 외삽하는데 사용되었다.
미공지된 생성물 농도의 용해물 샘플은 상이한 희석 (희석 완충액내 적어도 1:10)으로 장입되어 상기 방법의 선형 범위에서 적어도 하나의 scFv 농도를 가졌다. 생성물 양은 scFv의 측정된 밴드 강도에 기반하여 계산되었고 농도는 샘플 제조의 희석 인자를 이용하여 결정되었다. 상기 값은 표준 곡선의 선형 범위 이내이었던 모든 샘플에 대하여 평균이었다.
용해물 샘플의 정량화를 위하여 방법의 적합성의 추가의 시험으로서 억제/향상 시험은 참조 표준의 공지된 양으로 용해물 샘플의 스파이킹에 의해 수행되었다. 희석 완충액내 1:10의 샘플 희석으로 스파이크 회수의 계산은 희석 완충액내 참조 표준으로서 관측된 바와 같이 정확성의 동일한 수준인 95.4%의 값을 초래하였다. 따라서, 세포 용해물에서 상당한 매트릭스 간섭은 관측되지 않았고 상기 방법은 세포 용해물에서 scFv 함량의 정량화에 적합한 것으로 간주되었다.
단백질 순도 및 함량
시험 샘플의 함량 및 이로써 또한 순도를 결정하는 방법의 적합성을 보여주기 위해, 참조 scFv용 검출의 하한 (LOD)는 0.02　μg의 명목 장입으로 (단백질 밴드 확인에 의해) 시각적으로 결정되었고, 각각의 레인의 강도 히스토그램의 평가는 대략 2의 이러한 장입으로 신호-대-잡음 비를 보여준다. 또한, 정량화용 선형 범위는 주요 밴드를 밀도계로 분석함으로써 결정되었다.
선형 회귀로 데이터의 적합은 0.9998의 결정 계수 (R2)를 초래하고, 따라서 적합의 양호한 품질을 나타낸다. 적합의 전반적인 품질에 더하여 각각의 개별 데이터 포인트의 상대 오차는 선택된 범위에서 방법의 적합성을 문서화하도록 결정되었다. 상대 오차는 이러한 방법의 양호한 정확도를 나타내는 모든 데이터 포인트에 대하여 10% 미만이다.
2.2.2 280　nm에서 UV 흡광도
280　nm에서 UV 흡광도 방법은 USP Chapter 1057에서 설명된 바와 같이 총 단백질 검정이다. 단백질 용액은 방향족 아미노산의 존재로 인해 280의　파장에서 UV 광을 흡수한다. UV 흡광도는 단백질에서 티로신 및 트립토판 잔기의　함량의　함수이고 단백질 농도에 비례한다. 미공지된 단백질 용액의　흡광도는 하기 적용에 의해 분광법에서 USP Chapter 851에 따라 결정될 수 있다: 베르 법칙: A= ε*l*c, 여기에서 흡광도 (A)는 몰 흡수성 (ε), 흡수 경로 길이 및 서브스턴스의 농도의 생성물과 동일하다. scFv에 대하여 몰 흡수성은 소프트웨어 Vector NTI® (Life Technologies Corporation)으로 계산되었다.
UV 흡광도의 측정은 Nanoquant 플레이트 (Tecan Group Ltd.)가 구비된 무한대 판독기 M200 Pro로 수행되었다. 단백질 샘플의 흡광도는 280　nm 및 310　nm에서 측정되었고, 여기에서 후자 파장은 280　nm 신호에서 공제된 참조 신호로서 작용하고 있었다. 샘플 매트릭스의 잠재적인 간섭을 설명하기 위해 블랭크 삭감은 각각의 측정에 대하여 수행되었다. 수득된 단백질 샘플의 최종 흡광도 신호는 람베르트-베르 법칙을 이용하여 단백질 농도를 계산하는데 사용되었다.
모든 측정은 0-4　OD의 측정 범위에서 기기 사양에 의해 주어진 범위 내에서 수행되었고, 여기에서 < 1%의 재현성 및 < 3%의 균일성은 제조자에 의해 특정된다.
2.2.3 SE-HPLC (크기 배제 고압 액체 크로마토그래피)
SE-HPLC는 USP chapter 621에 의해 설명된 바와 같이 고체 고정상 및 액체 이동상에 기반된 분리 기술이다. 이러한 방법은 소수성 고정상 및 수성 이동상을 이용하여 그것의 크기 및 형상에 기반된 분자를 분리시킨다. 분자의 분리는 특이적 칼럼의 공동 용적 (V0)와 총 침투 용적 (VT) 사이 발생하고 있다. SE-HPLC에 의한 측정은 280　nm의 검출 파장에 셋팅된 UV 검출기 및 자동화 샘플 주사가 구비된 Chromaster HPLC 시스템 (Hitachi High-Technologies Corporation)에서 수행되었다. 상기 설비는 수득한 크로마토그램의 분석을 또한 지지하는 소프트웨어 EZChrom Elite (Agilent Technologies, Version 3.3.2 SP2)에 의해 제어된다. 단백질 샘플은 원심분리에 의해 깨끗해졌고 주사에 앞서 자동시료주입기에서 6℃의 온도에 유지되었다. scFv 샘플의 분석을 위하여 칼럼 Shodex KW402.5-4F (Showa Denko Inc., #F6989201)은 0.35　mL/min의 권고된 유량에서 표준화된 완충 식염수 이동상 (50 mM 아세트산나트륨 pH 6.0, 250 mM 염화나트륨)으로 이용되었다. 주사당 상기 표적 샘플 장입은 5　μg이었다. 샘플은 280 nm의 파장에서 UV 검출기에 의해 검출되었고 데이터는 적합한 소프트웨어 제품군에 의해 기록되었다. 수득한 크로마토그램은 V0 내지 VT의 범위에서 분석되어 이로써 >10　분 용출 시간으로 매트릭스 관련된 피크를 배제시켰다.
방법의 중간 정확성을 확보하기 위해, 참조 표준은 각각의 HPLC 서열의 시작 및 끝에서 일상적으로 측정되었다. 이러한 시스템 적합성 시험에 사용된 참조 표준은 각각의 측정 시점에 대하여 사용되도록 분주되었고 배치로서 생산되었던 scFv이었다.
2.2.4 DSF (시차 주사 형광측정법)
DSF 방법은 온도-의존적 단백질 언폴딩을 측정하는 비-개괄적 방법이다. DSF에 의한 열적 언폴딩 온도의 측정은 MX Pro 소프트웨어 패키지 (Agilent Technologies)로 제어된 그리고 492/610　nm에서 셋팅된 여기/방출 필터가 구비된 MX3005P qPCR 기계 (Agilent Technologies)로 수행되었다. 반응은 Thermo 빠른 96 백색 PCR 플레이트 (Abgene; #AB-0600/W)에서 설정되었다. 단백질 언폴딩의 검출을 위하여 염료 SYPRO 오랜지의 상업적으로 입수가능한 모액 (Molecular Probes; # S6650)은 1:1,000의 최종 희석에서 사용되었다. 단백질 샘플은 표준화된 완충 식염수 용액에서 50　μg/mL의 최종 농도로 언폴딩 측정에 대하여 희석되었다. 열적 언폴딩은 30 초의 지속기간으로 1℃ 단계로 25℃에서 시작하고 최대 96℃ 상승하는 온도 프로그램에서 수행되었다. 온도 프로그램 동안 각각의 샘플의 형광 방출은 기록되었다. 기록된 미가공 데이터는 마이크로소프트 엑셀 템플레이트의 패키지 (Niesen, Nature Protocols 2007, Vol. 2 No.9)로 가공 및 평가되었고 형광 데이터는 전이의 중간점 (Tm)을 수득하기 위해 프로그램 GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)를 이용하여 볼츠만 방정식이 구비되었다.
언폴딩의 중간점의 신뢰할 수 있는 및 강력한 측정을 생산하기 위해 적어도 2중 측정은 수행되었다. 데이터 품질에 대하여 적합도 (R2) >0.9900 및 0.5% 미만의 Tm의 95% 신뢰 구간으로 측정만이 고려되었다.
중간 정확성의 평가를 위하여 참조 표준 (공지된 특성규명된 scFv)는 상이한 날에 검정 성능의 비교를 허용하기 위해 모든 측정과 포함되었다.
2.2.5 안정성 연구
이들 분자의 현상성용 읽어내기로서 상이한 scFv 작제물의 안정성을 평가하기 위해 단기 안정성 연구 프로토콜은 설계되었다. 단백질 작제물은 단순 완충 식염수 제형 (상기 참조)에서 1 및 10 mg/mL의 표적 농도로 농축되었다. 단량체 함량은 SE-HPLC에 의해 결정되어 순도가 > 95%의 성공 기준을 초과하고 있는 것을 확인하였다. 후속적으로 단백질 샘플은 4 주의 지속기간 동안 <-65, -20, 4 및 37℃에 저장되었고 분취액은 다양한 시점에서 분석되었다. 1차 읽어내기는, 가용성 고분자량 올리고머 및 응집물의 정량화를 허용하는, SE-HPLC에 의한 분석이다. 지지적 측정으로서 단백질 함량은 280　nm에서 UV 흡광도에 의해 결정되고, 이는 저장 기간 동안 단백질의 상당한 양이 침전에 의해 손실되었는지의 징후를 제공한다. 저장을 위하여 스크류 캡 튜브는 분취액당 30-1500 μg의 충전 양으로 사용되었다 (Sarstedt, Cat. No. 72.692.005). 추가로 순도는 열화 또는 공유 다량체화에 대해 작제물의 안정성을 나타내는 SDS-PAGE에 의해 결정된다.
실시예 3: 인간화된 디아바디 및 IgG의 생성
단쇄 디아바디 작제물은 VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA 배치형태에서 가변 도메인을 배열시킴으로써 설계된다. 이들 작제물에서 VLA 및 VHA 및 VLB 및 VHB 도메인은 TNFα용 결합 부위를 공동으로 형성한다. 가변 도메인을 연결하는 펩타이드 링커 L1-L3은 글리신/세린 반복부로 작제된다. 2개의 짧은 링커 L1 및 L3은 단일 G4S (서열번호: 30) 반복부로 구성되고, 반면에 긴 링커 L2는 서열 (G4S)4 (서열번호: 29)로 구성된다. 인간화된 가변 도메인 (실시예 2; 1.2.1.)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 드 노보 합성되고 pET26b(+) 골격 (Novagen)에 기반되는 E.콜리 발현을 위하여 적응된 벡터 속으로 클로닝된다. 발현 및 정제는 실시예 2; 1.2.1에서 scFvs에 대하여 기재된 바와 같이 수행된다.
인간화된 IgG는 리더 서열을 함유하는 일시적 이종성 발현을 위하여 가변 도메인 적합한 포유동물 발현 벡터 및 각각의 불변 도메인 예를 들면 pFUSE-rIgG 벡터 (Invivogen) 클로닝에 의해 작제되었다. 기능성 IgG의 일시적 발현은 CHO S 세포내 FreeStyle™ MAX 시스템으로 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 벡터의 공-형질감염에 의해 수행된다. 며칠 동안 배양후 항체 분비 세포의 상청액은 정제를 위하여 회수된다. 후속적으로 분비된 IgGs는 단백질 A 세파로스 (GE Healthcare)에 의해 친화성 정제된다. 용출 분획은 SDS-PAGE, 280 nm에서 UV 흡광도 및 SE-HPLC에 의해 분석된다.
항체 분자의 친화성은 2.1.1)하에 실시예 2에서 기재된 바와 같이 Biacore 기기를 이용하여 결정된다.
항체 분자의 효력은 L929 검정에서 결정된다 (방법은 2.1.2하에 실시예 2에서 기재된다).
실시예 4: TNFα 결합의 화학양론의 결정
TNFα에 대한 17-22-B03의 결합 화학양론은 SE-HPLC를 이용하여 결정되었다. 17-22-B03-scFv 및 TNFα는 2개의 상이한 몰비에서, 즉 1:1 및 4.5:1 몰비에서 인큐베이션되었다. TNFα가 용액내 삼량체로서 실재하기 때문에 지시된 몰비는 TNFα삼량체를 지칭한다. 따라서, 4.5:1 비에서 17-22-B03-scFv는 과잉이고 3 scFv와 1 TNFα삼량체의 복합체를 초래하는 모든 TNFα삼량체 결합 위치를 차지할 수 있다. 하지만, 등몰 조건하에 모든 3 이론적 TNFα 결합 부위를 포화시키기 위해 존재하는 scFv는 충분하지 않다. 따라서, 또한 결합된 3 scFv 미만을 가진 복합체 변이체는 기대된다. TNFα 및 17-22-B03-scFv는 복합체 형성을 허용하기 위해 RT에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. 샘플은 그 다음 4℃에서 10 분 동안 원심분리되었다. 10 μl의 각각의 샘플은 SE-HPLC에서 분석되었다. SE-HPLC 분석은 0.35 mL/min의 유량으로 용출물로서 50 mM 인산염 버퍼 pH 6.5, 300 mM NaCl로 수행되었다. 용출된 단백질 피크는 280 nm의 파장에서 검출되었다. 칼럼은 겉보기 분자량의 결정을 위하여 미리 GE Healthcare (LMW, HMW)로부터 겔 여과 보정 키트를 이용하여 보정되었다.
도 12의 최하부 패널은 TNFα삼량체 단독 및 scFv 단독의 프로파일과 오버레이되는 scFv 및 TNFα의 등몰 양으로 용출 프로파일을 보여준다. 용액내 TNFα의 삼량체화로 인해 각각의 삼량체에서 존재하는 scFv에 대하여 이론적으로 최대 3 동등 결합 부위가 있고 따라서 scFv 분자는 제한되고 있다. 이들 조건하에 모든 3 복합체 종 (3:1, 2:1, 1:1)은 확인되었다. 도 12의 최상부 패널은 scFv의 과잉량으로 복합체의 용출 프로파일을 보여준다. 미결합된 scFv의 여분은 기대된 체류 시간에서 용출하였다. TNFα 피크는 복합체 형성을 위하여 정량적으로 소비되었고 완전히 사라졌다. 이러한 복합체의 피크는 더 낮은 체류 시간쪽으로 이동하였고, 등몰 셋업의 최대 분자량으로 피크의 체류 시간과 양호하게 상관하였다. 이러한 이유로 TNFα에서 모든 이용가능한 결합 부위가 scFv에 의해 점유되었다는 것이 결론지어졌고 따라서, scFv가 과잉으로 이용가능하면 결합 화학양론은 3:1 (scFv:TNFα)이다.
이들 정성적 관찰에 추가로, 겉보기 결합 화학양론은 SE-HPLC에 의해 결정된 바와 같이 17-22-B03-scFv:TNFα 복합체의 겉보기 MW에 기반하여 또한 계산되었다. 체류 시간에 기반하여, 겉보기 MW는 149.2　kDa이도록 계산되었다. 아래 방정식 (1)에 따르면 겉보기 결합 화학양론은 3.6이도록 계산되었다. 이것은 3:1 결합 화학양론이 결정된 상기 관찰 및 TNFα삼량체에서 scFv에 대하여 이용가능한 3 동등 결합 부위의 이론적 수와 양호하게 상관한다.
Figure 112018090719773-pct00014
MW (복합체 근사치): 149.2 kDa
MW (TNFα 이론치): 52.2 kDa
MW (scFv 이론치): 26.5 kDa
실시예 5: TNFα:항체 복합체의 형성 (TNFα의 가교결합)
2 TNFα 분자에 동시에 결합하는 17-22-B03-디아바디의 능력은 Biacore T200 기기상에 10 mM HEPES, 150 mM NaCl 및 0.05% Tween을 함유하는 HEPES 완충액에서 시험되었다. 바이오티닐화된 TNFα (Acro Biosystems)는 제조자의 지침에 따라 바이오틴 CAPture 키트 (GE Healthcare)를 이용하는 바이오티닐화된 ssDNA 올리고를 통해 포착된다. 바이오티닐화된 TNFα의 0.25 μg/mL는 3 분 동안 10 μL/min의 유량으로 주사되어 대략 200 내지 300 RUs (공명 단위)의 포착 수준에 도달한다. 디아바디 및 17-22-B03-scFv는, 대조군으로서, 90 nM의 농도로 30 μL/min의 유량에서 2 분 동안 TNFα 고정된 표면에 걸쳐 주사된다. 항체 단편의 회합 이후, TNFα (Peprotech)는 90 nM에 30 μL/min의 유량으로 5분 동안 주사된다. 항체 및 TNFα 농도는 결합의 포화에 가깝게 선택된다. 측정은 25℃에서 수행된다. 2가 17-22-B03-디아바디는 2 TNFα 분자에 동시에 결합하는 것으로 기대되고 반면, 기대된 대로, 1가 17-22-B03-scFv는 1 TNFα 분자에만 결합한다.
또한, TNFα-항체 복합체의 형성은 SE-HPLC를 이용하여 TNFα 및 17-22-B03 항체 포맷의 상이한 비에서 평가되었다. 17-22-B03-IgG (150 kDa) 및 17-22-B03-scDb (~ 52 kDa)는 결합 부위에 대해 상이한 몰비 (1:3, 1:1, 3:1)에서 TNFα (52 kDa)로 인큐베이션된다. 따라서, IgG 및 scDb는 2 결합 부위를 갖고 TNFα는 3 결합 부위를 갖는다. 항체-TNFα 혼합물은 적어도 30 분 동안 37℃에서 인큐베이션되고, 10분 동안 RT에서 냉각되고 밤새 2 - 8℃에서 저장된다. 대략 1 mg/mL의 농도에서 5 내지 10 uL의 단백질 혼합물은 TOSHO TSKgel UP-SW3000 칼럼상에 주사된다. 분석은 0.3 mL/min의 유량으로 용출물로서 150 mM 인산염 버퍼 pH 6.8, 100 mM NaCl로 수행된다. 용출된 단백질 피크는 214 nm의 파장에서 검출된다. 칼럼은 복합체의 근사 분자량의 결정을 위하여 미리 BEH450 SEC 단백질 표준 믹스 (Waters)를 이용하여 보정된다. ≥ 600 kDa인 복합체는 ≥ 2 TNFα 및 ≥ 3 IgG 분자로 구성되는 복합체의 형성을 나타낸다. ≥ 300 kDa인 복합체는 ≥ 2 TNFα 및 ≥ 3 scDb 분자로 구성되는 복합체의 형성을 나타낸다.
실시예 6: 세포 증식의 억제
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 증식을 억제시키기 위한 17-22-B03 및 아달리무맙의 상이한 항체 포맷의 수용력은 혼합된 림프구 반응 (MLR)에서 시험된다. 2 건강한 공여체로부터 PBMC는 37℃/5 % CO2에 48시간 동안 96-웰 플레이트에서 1:1 비로 배양된다 (RPMI1640). 활성화 후, 세포는 37℃/5 % CO2에 또 다른 5 일 동안 6중으로 항-TNFα 항체 또는 IgG 대조군 항체로 (모두 10　μg/mL의 최종 농도로) 처리된다. 인큐베이션의 종료 24시간 전 BrdU (20 uL/웰)은 각 웰에 첨가되고 증식은 상업적으로 입수가능한 세포 증식 ELISA (Roche Diagnostics)를 이용하여 BrdU 흡수 측정에 의해 결정된다. 자극 지수는 항체 처리된 세포와 미토마이신 C (25 ng/mL) 처리된 세포 사이 BrdU 흡수의 비 계산에 의해 결정된다. 17-22-B03의 모든 시험된 항체 포맷은 아달리무맙에 비교할만한 T-세포 증식을 상당히 억제시키는 것으로 기대된다.
실시예 7: LPS-유도된 사이토카인 분비의 억제
RPMI1640내 CD14+ 단핵구는 96-웰 플레이트에서 씨딩되고 가습된 인큐베이터에서 37℃/5 % CO2에 16시간 동안 인큐베이션된다. 그 다음 세포는 2 내지 2000 ng/mL 범위의 최종 항체 농도를 이용하여 1시간 동안 반복하여 항-TNFα 항체 또는 IgG 대조군 항체로 처리된다. 단핵구는 세포 배양 배지로 3회 세정되고 후속적으로 LPS (100　ng/mL)로 4시간 동안 37℃/5% CO2에 인큐베이션된다. 세포 배양 상청액에서 IL-1β 및 TNFα 농도는 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트 (R&D Systems)를 이용하여 결정된다. IC50은 4-파라미터 로지스틱 곡선 적합을 이용하여 결정된다.
표 10. Vκ1 공통 서열 (재배열된)
Figure 112018090719773-pct00015
표 11: Vλ 생식계열-기반 프레임워크 IV 서열
Figure 112018090719773-pct00016
<110> TILLOTTS PHARMA AG <120> ANTI-TNFALPHA-ANTIBODIES AND FUNCTIONAL FRAGMENTS THEREOF <130> IPA180823-DE <150> EP16160918.5 <151> 2016-03-17 <160> 37 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic CDR L1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa is Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> Xaa is Ala or Ser <400> 1 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Xaa Xaa Tyr Leu Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic CDR L2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is Arg, Gln or Lys <400> 2 Xaa Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic CDR L3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 3 Gln Xaa Thr Tyr Tyr Glu Pro Ser Tyr Val Phe Arg Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic CDR H1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is Arg or Gly <400> 4 Xaa Ile Asp Phe Ser Ala Gly Tyr Asp Met Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic CDR H2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is Arg, Asn or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is Asn, Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa is Ser or Thr <400> 5 Cys Ile Asp Ser Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H3 of clones 17-22-B03, 16-12-E09, 16-13-E01, 16-15-E11, 16-17-C08, 16-17-G01, 17-18-D10 and 17-22-B01 <400> 6 Gly Gly Tyr Gly Gly Asp Gly Val Asp Gly Ala Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L1 of clones 17-22-B03, 16-12-E09, 16-13-E01, 16-15-E11 and 17-18-D10 <400> 7 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 of clones 17-22-B03, 16-12-E09, 16-15-E11, 16-17-C08, 16-17-G01 and 17-18-D10 <400> 8 Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L3 of clones 17-22-B03, 16-12-E09, 16-13-E01, 16-15-E11, 16-17-C08, 16-17-G01, 17-18-D10 and 17-22-B01 <400> 9 Gln Cys Thr Tyr Tyr Glu Pro Ser Tyr Val Phe Arg Ala 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H1 of clones 17-22-B03, 16-12-E09, 16-13-E01, 16-15-E11, 16-17-C08, 17-18-D10 and 17-22-B01 <400> 10 Gly Ile Asp Phe Ser Ala Gly Tyr Asp Met Cys 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 of clones 17-22-B03 and 16-17-C08 <400> 11 Cys Ile Asp Ser Arg Arg Glu Glu Ser Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 of clone 16-12-E09 <400> 12 Cys Ile Asp Ser Arg Ser Asp Asn Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 of clone 16-13-E01 <400> 13 Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 of clones 16-13-E01 and 17-18-D10 <400> 14 Cys Ile Asp Ser Arg Arg Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 of clones 16-15-E11, 16-17-G01 and 17-22-B01 <400> 15 Cys Ile Asp Ser Arg Asn Asp Asn Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L1 of clone 16-17-C08 <400> 16 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L1 of clone 16-17-G01 <400> 17 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H1 of clone 16-17-G01 <400> 18 Arg Ile Asp Phe Ser Ala Gly Tyr Asp Met Cys 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L1 of clone 17-22-B01 <400> 19 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 of clone 17-22-B01 <400> 20 Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 21 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of humanized scFv of clones 17-22-B03-sc02, 17-22-B03-sc08, 17-22-B03-sc12 <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Ala Cys Ile Asp Ser Arg Arg Glu Glu Ser Asp Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Asp Gly Val Asp Gly Ala Phe Asp 100 105 110 Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of humanized scFv of clone 17-22-B03-sc02 <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Pro 65 70 75 80 Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Tyr Glu Pro Ser 85 90 95 Tyr Val Phe Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 23 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of humanized scFv of clone 17-22-B03-sc08 <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Tyr Glu Pro Ser 85 90 95 Tyr Val Phe Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 24 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of humanized scFv of clone 17-22-B03-sc12 <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Tyr Tyr Glu Pro Ser 85 90 95 Tyr Val Phe Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 25 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized scFv of clone 17-22-B03-sc02 <400> 25 Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu 65 70 75 80 Pro Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Tyr Glu Pro 85 90 95 Ser Tyr Val Phe Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 130 135 140 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Ser Ala Gly Tyr Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Cys Ile Asp Ser Arg Arg Glu Glu Ser 180 185 190 Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser 195 200 205 Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Asp Gly Val 225 230 235 240 Asp Gly Ala Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 245 250 255 Ser <210> 26 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized scFv of clone 17-22-B03-sc08 <400> 26 Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Tyr Glu Pro 85 90 95 Ser Tyr Val Phe Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 130 135 140 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Ser Ala Gly Tyr Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Cys Ile Asp Ser Arg Arg Glu Glu Ser 180 185 190 Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser 195 200 205 Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Asp Gly Val 225 230 235 240 Asp Gly Ala Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 245 250 255 Ser <210> 27 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized scFv of clone 17-22-B03-sc12 <400> 27 Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Tyr Tyr Glu Pro 85 90 95 Ser Tyr Val Phe Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 130 135 140 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Ser Ala Gly Tyr Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Cys Ile Asp Ser Arg Arg Glu Glu Ser 180 185 190 Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser 195 200 205 Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Asp Gly Val 225 230 235 240 Asp Gly Ala Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 245 250 255 Ser <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic CDR L3 where Cys2 (Xaa) is limited to Arg, His, Pro, Phe, Gln, Gly or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is Arg, His, Pro, Phe, Gln, Gly or Tyr <400> 28 Gln Xaa Thr Tyr Tyr Glu Pro Ser Tyr Val Phe Arg Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence in scFv <400> 29 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence in diabody <400> 30 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 31 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Vk1 consensus sequence of framework I (Kabat positions 1-23) <400> 31 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Vk1 consensus sequence of framework II (Kabat positions 35-49) <400> 32 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 33 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Vk1 consensus sequence of framework III (Kabat positions 57-88) <400> 33 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V lamda germline-based sequence of framework IV <400> 34 Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V lamda germline-based sequence of framework IV <400> 35 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V lamda germline-based sequence of framework IV <400> 36 Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ile Ile Leu 1 5 10 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V lamda germline-based sequence of framework IV <400> 37 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 1 5 10

Claims (21)

  1. 인간 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음의 6개 CDR 영역 중 하나를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (i) 서열 식별 번호: 7의 서열을 포함하는 CDR L1, 서열 식별 번호: 8의 서열을 포함하는 CDR L2, 서열 식별 번호: 9의 서열을 포함하는 CDR L3, 서열 식별 번호: 10의 서열을 포함하는 CDR H1, 서열 식별 번호: 11의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 서열 식별 번호: 6의 서열을 포함하는 CDR H3;
    (ii) 서열 식별 번호: 7의 서열을 포함하는 CDR L1, 서열 식별 번호: 8의 서열을 포함하는 CDR L2, 서열 식별 번호: 9의 서열을 포함하는 CDR L3, 서열 식별 번호: 10의 서열을 포함하는 CDR H1, 서열 식별 번호: 12의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 서열 식별 번호: 6의 서열을 포함하는 CDR H3;
    (iii) 서열 식별 번호: 7의 서열을 포함하는 CDR L1, 서열 식별 번호: 13의 서열을 포함하는 CDR L2, 서열 식별 번호: 9의 서열을 포함하는 CDR L3, 서열 식별 번호: 10의 서열을 포함하는 CDR H1, 서열 식별 번호: 14의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 서열 식별 번호: 6의 서열을 포함하는 CDR H3;
    (iv) 서열 식별 번호: 7의 서열을 포함하는 CDR L1, 서열 식별 번호: 8의 서열을 포함하는 CDR L2, 서열 식별 번호: 9의 서열을 포함하는 CDR L3, 서열 식별 번호: 10의 서열을 포함하는 CDR H1, 서열 식별 번호: 15의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 서열 식별 번호: 6의 서열을 포함하는 CDR H3;
    (v) 서열 식별 번호: 16의 서열을 포함하는 CDR L1, 서열 식별 번호: 8의 서열을 포함하는 CDR L2, 서열 식별 번호: 9의 서열을 포함하는 CDR L3, 서열 식별 번호: 10의 서열을 포함하는 CDR H1, 서열 식별 번호: 11의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 서열 식별 번호: 6의 서열을 포함하는 CDR H3;
    (vi) 서열 식별 번호: 17의 서열을 포함하는 CDR L1, 서열 식별 번호: 8의 서열을 포함하는 CDR L2, 서열 식별 번호: 9의 서열을 포함하는 CDR L3, 서열 식별 번호: 18의 서열을 포함하는 CDR H1, 서열 식별 번호: 15의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 서열 식별 번호: 6의 서열을 포함하는 CDR H3;
    (vii) 서열 식별 번호: 7의 서열을 포함하는 CDR L1, 서열 식별 번호: 8의 서열을 포함하는 CDR L2, 서열 식별 번호: 9의 서열을 포함하는 CDR L3, 서열 식별 번호: 10의 서열을 포함하는 CDR H1, 서열 식별 번호: 14의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 서열 식별 번호: 6의 서열을 포함하는 CDR H3; 및
    (viii) 서열 식별 번호: 19의 서열을 포함하는 CDR L1, 서열 식별 번호: 20의 서열을 포함하는 CDR L2, 서열 식별 번호: 9의 서열을 포함하는 CDR L3, 서열 식별 번호: 10의 서열을 포함하는 CDR H1, 서열 식별 번호: 15의 서열을 포함하는 CDR H2, 및 서열 식별 번호: 6의 서열을 포함하는 CDR H3.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 (i) 서열 식별 번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별 번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별 번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인, 및 (ii) 서열 식별 번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별 번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별 번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 하기 특징 중 적어도 하나를 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (i) 100 pM 미만의 해리 상수 (KD)로 인간 TNFα에 결합함;
    (ii) 마카카 물라타 (레수스) TNFα 및 마카카 파스시쿨라리스 (사이노몰구스) TNFα와 교차-반응성임;
    (iii) L929 검정에 의해 결정된 경우, 인플릭시맙보다 TNFα-유도된 세포자멸사를 억제시키는 데 더 큰 효력을 가짐;
    (iv) 시차 주사 형광측정법에 의해 결정된, 적어도 70℃의 용융 온도를 갖는 가변 도메인을 포함함, 및
    (v) 적어도 2의 화학양론 (항체 : TNFα삼량체)으로 인간 TNFα삼량체에 결합할 수 있음.
  4. 제1항에 있어서, 70 pM 미만의 KD로 인간 TNFα에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열 식별 번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열 식별 번호: 22, 서열 식별 번호: 23 및 서열 식별 번호: 24로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 단쇄 가변 단편 (scFv)인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, 상기 scFv가 서열 식별 번호: 25, 서열 식별 번호: 26 및 서열 식별 번호: 27로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항에 있어서, 면역글로불린 G (IgG)인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열 식별 번호: 25, 서열 식별 번호: 26 및 서열 식별 번호: 27로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 scFv와 동일한 에피토프에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제1항에 있어서, (i) 서열 식별 번호: 31 내지 33을 가진 각각의 인간 Vκ1 공통 서열과 상이한 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 경쇄 도메인의 프레임워크 영역 I 내지 III에서 아미노산의 수, 및 (ii) 서열 식별 번호: 34 내지 37로부터 선택된 가장 유사한 인간 λ 생식계열-기반 서열과 상이한 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 경쇄 도메인의 프레임워크 영역 IV에서 아미노산의 수의 합계가 7 미만, 또는 4 미만인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 경쇄 도메인의 프레임워크 영역 I 내지 III이 서열 식별 번호: 31 내지 33을 가진 인간 Vκ1 공통 서열 각각으로 구성되고, 프레임워크 영역 IV가 서열 식별 번호: 34 내지 37로부터 선택된 λ 생식계열-기반 서열로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는, 핵산.
  14. 제13항에 따른 핵산을 포함하는, 벡터 또는 플라스미드.
  15. 제13항에 따른 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 또는 플라스미드를 포함하는, 단리된 세포.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산의 발현을 허용하는 조건하에 배지에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 세포 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 단리된 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포 또는 배지로부터 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어 및 부형제 중 적어도 하나를 포함하는, 염증성 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 제17항에 있어서, 상기 염증성 장애가 위장관의 염증성 장애인, 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 위장관의 염증성 장애가 염증성 장 질환인, 약제학적 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 위장관의 염증성 장애가 크론병 또는 궤양성 대장염인, 약제학적 조성물.
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KR1020187026446A KR102474765B1 (ko) 2016-03-17 2017-03-16 항-TNFα-항체 및 이의 기능성 단편

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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017158079A1 (en) 2016-03-17 2017-09-21 Numab Innovation Ag Anti-tnfalpha-antibodies and functional fragments thereof
SI3219726T1 (sl) 2016-03-17 2021-02-26 Tillotts Pharma Ag Anti-TNF alfa protitelesa in njihovi funkcionalni fragmenti
EP3430042B1 (en) 2016-03-17 2023-05-24 Numab Innovation AG Anti-tnfalpha-antibodies and functional fragments thereof
BR112019011689A2 (pt) 2016-12-14 2019-10-22 Progenity Inc tratamento de uma doença do trato gastrointestinal com um inibidor de tnf
EP3592384A1 (en) * 2017-03-09 2020-01-15 MAB Discovery GmbH Antibodies specifically binding to human il-1r7
WO2019246313A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a tnf inhibitor
US20220056124A1 (en) * 2018-09-05 2022-02-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Monoclonal antibodies against endotrophin and the use thereof
KR20210095165A (ko) 2018-11-19 2021-07-30 프로제너티, 인크. 바이오의약품으로 질환을 치료하기 위한 방법 및 디바이스
WO2020114616A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Tillotts Pharma Ag Topical treatment of immune checkpoint inhibitor induced diarrhoea, colitis or enterocolitis using antibodies and fragments thereof
CN115666704A (zh) 2019-12-13 2023-01-31 比奥拉治疗股份有限公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015144852A1 (en) * 2014-03-26 2015-10-01 Delenex Therapeutics Ag Binding members to tnf alpha

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9109645D0 (en) 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
NO309690B1 (no) 1995-01-23 2001-03-12 Western Atlas Int Inc Detonasjonsanordning av type eksploderende brotråd for bruk med et perforeringsverktöy i en brönn
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
KR20080059467A (ko) 1996-12-03 2008-06-27 아브게닉스, 인크. 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
WO1998046645A2 (en) 1997-04-14 1998-10-22 Micromet Gesellschaft Für Biomedizinische Forschung Mbh Method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
WO2000029584A1 (en) 1998-11-18 2000-05-25 Genentech, Inc. Antibody variants with higher binding affinity compared to parent antibodies
GB0412181D0 (en) 2004-06-01 2004-06-30 Celltech R&D Ltd Biological products
US7431927B2 (en) 2005-03-24 2008-10-07 Epitomics, Inc. TNFα-neutralizing antibodies
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
BRPI0611765B1 (pt) 2005-06-07 2022-09-27 Esbatech Ag Anticorpo ou fragmento de anticorpo estável e solúvel que se liga especificamente ao tnf-alfa seus usos e composição diagnóstica ou terapêutica
SI2307458T1 (en) 2008-06-25 2018-08-31 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Humanization of rabbit antibodies using a universal antibody framework
PL2307457T5 (pl) 2008-06-25 2022-12-27 Novartis Ag Stabilne i rozpuszczalne przeciwciała hamujące tnf
BRPI0915460A2 (pt) 2008-07-10 2015-11-10 Esbatech Alcon Biomed Res Unit métodos e composições para a liberação intensificada de macromoléculas
AU2011237679B2 (en) * 2010-04-07 2014-11-06 Abbvie Inc. TNF-alpha binding proteins
EP2593476A2 (en) * 2010-07-16 2013-05-22 Ablynx N.V. Modified single domain antigen binding molecules and uses thereof
US9096669B2 (en) * 2010-09-30 2015-08-04 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. Humanized anti-TNF-α antibody and antigen-binding fragment (Fab) thereof and use of the same
SI2636736T1 (sl) * 2010-10-29 2016-09-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Novo anti-dr5 protitelesce
AP2015008365A0 (en) * 2012-12-05 2015-04-30 Novartis Ag Compositions and methods for antibodies targeting epo
SG10201811017QA (en) 2013-06-26 2019-01-30 Numab Innovation Ag Novel antibody frameworks
CA2924520C (en) * 2013-11-01 2023-09-26 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antibodies that neutralize both tnf-alpha and il-6: novel therapeutic agent for autoimmune disease
US9737623B2 (en) * 2013-12-11 2017-08-22 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies that bind activatable antibodies and methods of use thereof
SI3219726T1 (sl) 2016-03-17 2021-02-26 Tillotts Pharma Ag Anti-TNF alfa protitelesa in njihovi funkcionalni fragmenti
WO2017158079A1 (en) 2016-03-17 2017-09-21 Numab Innovation Ag Anti-tnfalpha-antibodies and functional fragments thereof
EP3430042B1 (en) 2016-03-17 2023-05-24 Numab Innovation AG Anti-tnfalpha-antibodies and functional fragments thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015144852A1 (en) * 2014-03-26 2015-10-01 Delenex Therapeutics Ag Binding members to tnf alpha

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Publication number Publication date
EP3219727B1 (en) 2020-12-16
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TWI758280B (zh) 2022-03-21

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