KR20140041796A - Adp-리보실 시클라제 2에 대한 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ADP-리보실 시클라제 2에 결합하는 항체를 제공한다. 항체를 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체를 발현시키는 방법이 또한 제공된다. 항체는 급성 골수성 백혈병 (AML), B-세포 만성 림프구성 백혈병, 유방암, 결장직장암, 신장암, 두경부암, 폐암, 난소암 및 췌장암을 포함하는 인간 암 및 천식, 통풍, 크론병, 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선, 당뇨병 및 아테롬성동맥경화증을 비롯한 인간 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있다.

Description

ADP-리보실 시클라제 2에 대한 항체 {ANTIBODIES TO ADP-RIBOSYL CYCLASE 2}
본 개시내용은 일반적으로 면역학 및 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, ADP-리보실 시클라제 2에 대해 지시된 항체 및 다른 치료 단백질, 이러한 항체 및 치료 단백질을 코딩하는 핵산, 모노클로날 항체 및 다른 치료 단백질을 제조하는 방법, 및 질환, 예컨대 ADP-리보실 시클라제2 발현/활성에 의해 매개되고/거나 이에 따른 리간드의 비정상적 발현/활성과 연관된 암의 치료 방법이 본원에 제공된다.
ADP-리보실 시클라제2 (또한 골수 기질 항원 1 (BST1) 또는 CD157로 공지됨)는 리보뉴클레오티드 고리화 및 가수분해를 촉매하는 지질-앵커링 비-기능성 체외효소이다. 이는 칼슘 방출 및 단백질 인산화를 활성화할 수 있는 뉴클레오티드 2차 메신저 시클릭 ADP-리보스 및 ADP-리보스를 생성한다 (문헌 [FEBS Lett. 1994, 356(2-3):244-8]). 이는 아마도 NAD+ 대사물의 생성을 통해 전구-B 세포의 성장을 주변분비 방식으로 지지할 수 있을 것이다 (문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91:5325-5329; J Biol Chem. 2005, 280:5343-5349]).
ADP-리보실 시클라제2 및 그의 상동체, CD38은 수용체로서 작용하여, 리아노딘 수용체를 통해 세포내 Ca2+ 방출을 유도하는 2차 메신저 대사물을 생성하는 것으로 보인다 (문헌 [Biochem Biophys Res Commun. 1996, 228(3):838-45]). 이는 또한 CD11b 인테그린을 통해 작용하여 PI-3 키나제 경로를 통한 Ca2+ 방출에 영향을 줄 수 있다 (문헌 [J Biol Regul Homeost Agents. 2007;21(1-2):5-11]). BST1은 급성 골수성 백혈병 (AML), 유방암, 결장직장암, 신장 암, 폐암 또는 췌장암 세포 막으로부터 기원하는 것으로 이전에 보고된 적이 없으며, 새로운 치료 및 진단적 가치를 갖는 단백질로 제시된다. BST1은 또한 둘 다 천식, 통풍, 크론병, 루푸스 및 당뇨병과 같은 질환과 연관되고 이러한 질환에서 활성화될 수 있는 단핵구 및 과립구 상에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 단핵구는 또한 아테롬성동맥경화판의 발생과 관련된다.
본 개시내용은 BST1에 대해 지시된 항체, 이러한 항체 및 치료 단백질을 코딩하는 핵산, 항-BST1 항체 및 다른 치료 단백질의 제조 방법, 및 질환, 예컨대 BST1 매개 장애, 예를 들어 인간 암, 예컨대 급성 골수성 백혈병 (AML), B-세포 만성 림프구성 백혈병, 유방암, 결장직장암, 신장암, 두경부암, 폐암, 난소암, 췌장암, 및 인간 염증성 질환, 예컨대 천식, 통풍, 크론병, 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선, 당뇨병 및 아테롬성동맥경화증 (이하, '본 발명의 질환'으로 지칭됨)의 치료 방법을 제공한다.
따라서, 본 개시내용은 BST1에 결합하며 하나 이상의 원하는 기능적 특성을 나타내는 단리된 항체, 특히 뮤린, 키메라, 인간화 및 완전-인간 모노클로날 항체를 제공한다. 이러한 특성은 예를 들어 BST1에 대한 고친화도 특이적 결합을 포함한다. 또한 본 발명의 항체, 단백질 및 조성물을 사용하여 다양한 BST1-매개 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 단리된 항-BST1 항체는
a) i) 서열 10에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제1 CDR;
ii) 서열 12 또는 서열 51에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제2 CDR;
iii) 서열 14에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제3 CDR
을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
b) i) 서열 16에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제1 CDR;
ii) 서열 18에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제2 CDR;
iii) 서열 20에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제3 CDR
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
추가 실시양태에서, 단리된 항-BST1 항체는
a) i) 서열 9에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제1 CDR;
ii) 서열 11에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제2 CDR;
iii) 서열 13에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제3 CDR
을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
b) i) 서열 15에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제1 CDR;
ii) 서열 17에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제2 CDR;
iii) 서열 19에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제3 CDR
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
추가 실시양태에서, 단리된 항-BST1 항체는
a) i) 서열 56에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제1 CDR;
ii) 서열 57에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제2 CDR;
iii) 서열 58에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제3 CDR
을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
b) i) 서열 59에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제1 CDR;
ii) 서열 60에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제2 CDR;
iii) 서열 61에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 제3 CDR
을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 항체에 의해 인식되는 에피토프(들)는 서열 44의 폴리펩티드 서열 내에서 발견된다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 부모 항체와 비교하여 가변 CDR을 포함한다. 따라서, 본 발명은 부모 항체의 변이체 가변 영역을 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 부모 항체는 서열 10을 포함하는 제1 vhCDR, 서열 12 및 서열 51로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 vhCDR, 서열 14를 포함하는 제3 vhCDR, 서열 16을 포함하는 제1 vlCDR, 서열 18을 포함하는 제2 vlCDR; 및 서열 20을 포함하는 제3 vlCDR을 포함하고, 변이체 항체는 제1 vhCDR, 제2 vhCDR, 제3 vhCDR, 제1 vlCDR, 제2 vlCDR 및 제3 vlCDR의 세트에 총괄적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환을 특정한 용도의 1 내지 4개의 치환과 함께 갖고, 항체는 BST1에 대한 특이적 결합을 보유한다. 유사하게, 부모 항체는 서열 9를 포함하는 제1 vhCDR, 서열 11을 포함하는 제2 vhCDR, 서열 13을 포함하는 제3 vhCDR; 서열 15를 포함하는 제1 vlCDR, 서열 17을 포함하는 제2 vlCDR 및 서열 19를 포함하는 제3 vlCDR을 포함할 수 있다. 추가로, 부모 항체는 서열 56을 포함하는 제1 vhCDR, 서열 57을 포함하는 제2 vhCDR, 서열 58을 포함하는 제3 vhCDR, 서열 59를 포함하는 제1 vlCDR, 서열 60을 포함하는 제2 vlCDR 및 서열 61을 포함하는 제3 vlCDR을 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 단리된 항-BST1 항체는 서열 2로 나타낸 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 4로 나타낸 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 단리된 항-BST1 항체는 서열 45로 나타낸 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 49로 나타낸 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 단리된 항-BST1 항체는 서열 1로 나타낸 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 3으로 나타낸 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
추가 실시양태에서, 단리된 항-BST1 항체는 서열 52로 나타낸 중쇄 가변 영역 서열 및 서열 53으로 나타낸 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 임의의 상기 항체는 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 인간이다. 다른 실시양태에서, Fc 도메인은 변이체 인간 Fc 도메인이다.
또 다른 실시양태에서, 임의의 상기 기재된 항체는 모노클로날 항체이다.
한 실시양태에서, 임의의 상기 기재된 항체는 접합된 작용제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합된 작용제는 세포독성제이다. 다른 실시양태에서, 접합된 작용제는 중합체이다. 또 다른 실시양태에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 또 다른 실시양태에서, PEG는 PEG 유도체이다.
한 실시양태에서, 단리된 항체는 BST1에 대한 결합에 대해 임의의 상기 항체와 경쟁하는 항체이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 수득하고, 숙주 세포 배양물에서 숙주 세포를 성장시키고, 상기 하나 이상의 핵산 분자가 발현되는 숙주 세포 배양 조건을 제공하고, 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양물로부터 항체를 회수하여 임의의 상기 항체를 제조하는 방법이 기재된다.
한 실시양태에서, 임의의 기재된 항-BST1 항체는 제약 조성물로 제공된다.
또 다른 실시양태에서, BST1과 연관된 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 임의의 상기 항체를 투여하여 상기 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 제공된다.
본 발명은 2, 1 및 52로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 4, 3, 54 및 55로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는 인간 BST1 상의 에피토프에 결합하는 단리된 모노클로날 항체, 또는 그의 항원-결합 부분, 항체 단편 또는 항체 모방체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 전장 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 전체 항체, 항체 단편, 인간화 항체, 단일 쇄 항체, 면역접합체, 탈푸코실화 항체 및 이중특이적 항체. 항체 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 유니바디, 도메인 항체 및 나노바디. 일부 실시양태에서, 본 발명의 면역접합체는 치료제를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 치료제는 세포독소 또는 방사성 동위원소이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 아피바디, DARPin, 안티칼린, 아비머, 베르사바디 및 듀오칼린.
대안적 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 단리된 항체 또는 항원-결합 부분 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명의 항체는 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 부분 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 BST1 상의 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 항원-결합 부분의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 본 발명의 다른 측면은 이러한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를 수득하는 단계; 숙주 세포를 숙주 세포 배양물에서 성장시키는 단계; 하나 이상의 핵산 분자가 발현되는 숙주 세포 배양 조건을 제공하는 단계; 및 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-BST1 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 BST1을 발현하는 표적 세포와 연관된 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 양의 항-BST1 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 의해 치료되거나 예방되는 질환은 인간 암이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체에 의해 치료되거나 예방되는 질환은 본 발명의 질환을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 BST1을 발현하는 표적 세포와 연관된 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 양의 항-BST1 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 의해 치료되거나 예방되는 질환은 인간 암이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체에 의해 치료되거나 예방되는 질환은 본 발명의 질환이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 BST1을 발현하는 표적 세포와 연관된 질환을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 항-BST1 항체, 또는 그의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 의해 치료되거나 예방되는 질환은 인간 암이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체에 의해 치료되거나 예방되는 질환은 본 발명의 질환이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 BST1을 발현하는 표적 세포와 연관된 질환을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서 항-BST1 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 용도에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명의 의약에 의해 치료되거나 예방되는 질환은 인간 암이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 의약에 의해 치료되거나 예방되는 질환은 본 발명의 질환이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 2에 기재된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 4에 기재된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 서열 1에 기재된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 3에 기재된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 서열 52에 기재된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 53에 기재된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는 인간 BST1 상의 에피토프에 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 항체 단편 또는 항체 모방체이다. 추가 측면에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 전체 항체, 항체 단편, 인간화 항체, 단일 쇄 항체, 면역접합체, 탈푸코실화 항체 및 이중특이적 항체. 본 발명의 추가 측면에서, 항체 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 유니바디, 도메인 항체 및 나노바디. 일부 실시양태에서, 항체 모방체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 아피바디, DARPin, 안티칼린, 아비머, 베르사바디 및 듀오칼린. 추가 실시양태에서, 조성물은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 단리된 핵산 분자이며, 추가 측면에서 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명의 항체 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 발현하는 하이브리도마이다.
본 발명의 다른 측면은
동물을 BST1 펩티드로 면역화시키는 단계;
상기 동물의 B 세포로부터 mRNA를 회수하는 단계;
상기 mRNA를 cDNA로 전환시키는 단계;
파지 내에서 상기 cDNA를 발현시켜 상기 cDNA에 의해 코딩되는 항-BST1 항체가 상기 파지의 표면 상에 제시되도록 하는 단계;
항-BST1 항체를 제시한 파지를 선택하는 단계;
상기 선택된 파지로부터 상기 항-BST1 이뮤노글로불린을 코딩하는 핵산 분자를 회수하는 단계;
상기 회수된 핵산 분자를 숙주 세포에서 발현시키는 단계; 및
상기 숙주 세포로부터 BST1에 결합하는 항체를 회수하는 단계
를 포함하는, 본 발명의 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다..
본 발명의 일부 측면에서, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 2, 1 또는 52로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 4, 3 또는 53으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인식되는 서열 44의 아미노산 서열을 갖는 BST1 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 제한적 의미로서 해석되지 않아야 하는 하기 상세한 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이다. 본원 전반에 걸쳐 인용되는 모든 참고문헌, 진뱅크(Genbank) 등록물, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
도 1a는 A1의 중쇄 CDR1 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 21)과 마우스 배선 VH 1-80 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 138392-138424 (서열 33)의 정렬; A2의 중쇄 CDR1 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 22)과 마우스 배선 VH 1-39 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 153362-153394 (서열 35)와 정렬을 보여준다.
도 1b는 A1의 중쇄 CDR2 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 23)과 마우스 배선 VH 1-80 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 138461-138511 (서열 34)의 정렬; A2의 중쇄 CDR2 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 24)과 마우스 배선 VH 1-39 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 153431-153481 (서열 36)의 정렬을 보여준다.
도 2a는 A1의 경쇄 CDR1 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 27)과 마우스 배선 VK 4-74 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 496-531 (서열 37)의 정렬; A2의 경쇄 CDR1 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 28)과 마우스 배선 VK 4-55 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 523-552 (서열 40)의 정렬을 보여준다.
도 2b는 A1의 경쇄 CDR2 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 29)과 마우스 배선 VK 4-74 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 577-597 (서열 38)의 정렬; A2의 경쇄 CDR2 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 30)과 마우스 배선 VK 4-55 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 598-618 (서열 41)의 정렬을 보여준다.
도 2c는 A1의 경쇄 CDR3 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 31)과 마우스 배선 VK 4-74 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 691-718 (서열 39)의 정렬; A2의 경쇄 CDR3 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 32)과 마우스 배선 VK 4-55 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 715-739 (서열 42)의 정렬을 보여준다.
도 3a 및 3b는 A549 및 H226 세포 상에서의 BST1의 유동 세포측정 분석의 결과를 보여준다.
도 4a 및 4b는 MabZAP 검정을 이용하여 A549 및 H226 세포에 의한 항-BST1 모노클로날 항체의 내재화를 보여준다.
도 5는 서열 2의 잔기 21-137 (서열 45), 인간 배선 BF238102 VH의 상응하는 위치로 전달된 서열 2의 CDR 영역 (볼드체로 강조함)을 갖는 인간화 VH 쇄 (서열 46)와 인간 배선 BF238102 VH (서열 47)의 정렬을 보여준다. CDR 영역과 유의한 접촉을 보여주는 잔기를 상응하는 인간 잔기로 치환하였다. 이러한 치환 (밑줄 표시됨)은 위치 30, 48, 67, 71 및 100에서 수행되었다.
도 6은 서열 4의 잔기 22-128 (서열 48), 인간 배선 X72441 VL의 상응하는 위치로 전달된 서열 4의 CDR 영역 (볼드체로 강조함)을 갖는 인간화 VL 쇄 (서열 49)와 인간 배선 X72441 VL (서열 50)의 정렬을 보여준다. CDR 영역과 유의한 접촉을 보여주는 잔기를 상응하는 인간 잔기로 치환하였다. 하나의 치환 (밑줄 표시됨)을 위치 71에서 수행하였다.
도 7은 A2 중쇄의 CDR2 영역 (서열 12)과 항원-결합 친화도의 손실 없이 가능한 아미노산 치환 (서열 51)의 정렬을 보여준다.
도 8은 이펙터 세포의 존재 하에 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 반응을 도출하는 BST1_A2 및 BST1_A2_NF를 보여준다.
본 개시내용은 예를 들어 본원에 개략된 바와 같이 고친화도로 BST1에 특이적으로 결합하는, 모노클로날 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 단리된 항체에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 제공된 항체는 특정한 구조적 특징, 예컨대 특정한 아미노산 서열을 갖는 CDR 영역을 포함한다. 본 개시내용은 단리된 항체 (하기 개략된 바와 같이, 매우 다양한 널리 공지된 구조, 유도체, 모방체 및 접합체 포함), 상기 분자의 제조 방법 및 상기 분자 및 제약 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 예컨대 BST1의 검출 뿐만 아니라 본 발명의 질환을 비롯하여 BST1, 예컨대 종양 및 염증성 질환에서 발현된 BST1의 발현과 연관된 질환의 치료를 위한 분자의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명을 보다 용이하게 이해하기 위해 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가의 정의는 발명의 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재되어 있다.
본 개시내용의 인간화 및 뮤린 항체는, 특정 경우에 인간 이외의 종으로부터의 BST1과 교차-반응할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 인간 BST1에 대해 완전하게 특이적일 수 있으며, 종 또는 다른 유형의 비-인간 교차-반응성을 나타내지 않을 수 있다.
용어 "면역 반응"은 병원체가 침입한 인간 신체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적인 손상, 파괴 또는 감소를 일으키는, 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산되는 가용성 거대분자 (항체, 시토카인, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
"신호 전달 경로"는 신호를 세포의 한 부분에서 세포의 또 다른 부분으로 전달하는데 소정의 역할을 수행하는 다양한 신호 전달 분자 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 본원에 사용된 어구 "세포 표면 수용체"는 예를 들어 신호를 수용하고 이 신호를 세포의 원형질 막을 통과하여 전달할 수 있는 분자 및 이러한 분자의 복합체를 포함한다. "세포 표면 수용체"의 예는 BST1이다.
본원에 지칭된 용어 "항체"는 적어도 이뮤노글로불린의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분")을 포함한다.
"항체"의 정의는 각각 전장 항체, 항체 단편, 단일 쇄 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (본원에서 때때로 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 융합체 (때때로 "항체 접합체"로 지칭됨), 및 각각의 단편 및/또는 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 전장 항체 (본원에서 때때로 "전체 항체"로 지칭됨)는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함할 수 있는 당단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (이하, VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (이하, VL 또는 VK로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL / VK 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 지칭되는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 지칭되는 초가변 영역으로 보다 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL / VK는 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 다양한 세포 (예를 들어 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다. 특정 항체 단편은 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (iv) 단일 가변 도메인으로 이루어진 dAb 단편, (v) 단리된 CDR 영역, (vi) F(ab')2 단편 (2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편), (vii) 단일 쇄 Fv 분자 (scFv) (여기서, VH 도메인 및 VL 도메인은 2개의 도메인을 연합시켜 항원 결합 부위가 형성되도록 하는 펩티드 링커에 의해 연결됨), (viii) 이중특이적 단일 쇄 Fv 이량체, 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구축된 다가 또는 다중특이적 단편 "디아바디" 또는 "트리아바디"를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항체 단편은 변형될 수 있다. 예를 들어, 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디술피드 가교의 혼입에 의해 안정화될 수 있다. 항체 포맷 및 구조의 예는 문헌 [Holliger & Hudson (2006) Nature Biotechnology 23(9):1126-1136, 및 Carter (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357] 및 여기에 인용된 참고문헌 (이들은 모두 명백하게 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
본 개시내용은 항체 유사체를 제공한다. 이러한 유사체는 각각 전장 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (본원에서 때때로 "항체 모방체"로 지칭됨), 항체 융합체, 항체 접합체 및 각각의 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 구조체를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 이뮤노글로불린은 항체 단편을 포함한다. 특정 항체 단편은 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (iv) 단일 가변 도메인으로 이루어진 dAb 단편, (v) 단리된 CDR 영역, (vi) F(ab')2 단편 (2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편), (vii) 단일 쇄 Fv 분자 (scFv) (여기서, VH 도메인 및 VL 도메인은 2개의 도메인을 회합시켜 항원 결합 부위가 형성되도록 하는 펩티드 링커에 의해 연결됨), (viii) 이중특이적 단일 쇄 Fv 이량체, 및 (ix) "디아바디" 또는 "트리아바디", 유전자 융합에 의해 구축된 다가 또는 다중특이적 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항체 단편은 변형될 수 있다. 예를 들어, 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디술피드 가교의 혼입에 의해 안정화될 수 있다. 항체 포맷 및 구조의 예는 문헌 [Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136, 및 Carter 2006, Nature Reviews Immunology 6:343-357] 및 여기에 인용된 참고문헌 (이들은 모두 명백하게 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
예를 들어 인간에서, 인지된 이뮤노글로불린 유전자는 다수의 가변 영역 유전자를 함께 포함하는 카파 (κ), 람다 (λ) 및 중쇄 유전자좌, 및 각각 IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), IgE 및 IgA (IgA1 및 IgA2) 이소형을 코딩하는 불변 영역 유전자 뮤 (υ), 델타 (δ), 감마 (γ), 시그마 (σ) 및 알파 (α)를 포함한다. 본원에서 항체는 전장 항체 및 항체 단편을 포함하는 것으로 의도되고, 임의의 유기체로부터의 천연 항체, 조작된 항체, 또는 실험적, 치료적, 또는 다른 목적을 위해 재조합적으로 생성된 항체를 지칭할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는 다중특이적 항체, 특히 이중특이적 항체 (또한 때때로 "디아바디"로 지칭됨)일 수 있다. 이들은 2개 (또는 그 초과)의 상이한 항원에 결합하는 항체이다. 디아바디는 당업계에 공지된 다양한 방식으로 제조될 수 있고, 예를 들어 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 미니바디이다. 미니바디는 CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 최소화된 항체-유사 단백질이다. 일부 경우에, scFv는 Fc 영역과 연결될 수 있고, 일부 또는 모든 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다중특이적 항체의 설명에 대해 문헌 [Holliger and Hudson (2006) Nature Biotechnology 23(9):1126-1136] 및 여기에 인용된 참고문헌 (이들은 모두 명백하게 참고로 포함됨)을 참조한다.
본원에 사용된 "CDR"은 항체 가변 도메인의 "상보성 결정 영역"을 의미한다. CDR에 포함된 잔기의 체계적인 확인은 카바트(Kabat) (문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda]) 및 대안적으로 코티아(Chothia) (문헌 [Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883; Al-Lazikani et al. (1997) J. Mol. Biol. 273: 927-948])에 의해 개발되었다. 본 발명의 목적을 위해, CDR은 코티아에 의해 정의된 CDR보다 약간 더 작은 세트의 잔기로 정의된다. VL CDR은 본원에서 위치 27-32 (CDR1), 50-56 (CDR2), 및 91-97 (CDR3) (여기서, 넘버링은 코티아에 따름)의 잔기를 포함하는 것으로 정의된다. 코티아 및 카바트에 의해 정의된 VL CDR이 동일하기 때문에, 이들 VL CDR 위치의 넘버링은 또한 카바트에 따른다. VH CDR은 본원에서 위치 27-33 (CDR1), 52-56 (CDR2) 및 95-102 (CDR3)의 잔기를 포함하는 것으로 정의되고, 여기서 넘버링은 코티아에 따른다. 이들 VH CDR 위치는 카바트 위치 27-35 (CDR1), 52-56 (CDR2) 및 95-102 (CDR3)에 상응한다.
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 본원에 기재된 CDR은 또한 예를 들어 본원에 개시된 CDR을 다양한 프레임워크 영역으로 복귀돌연변이시키는 경우에 변이체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 개별 변이체 CDR 사이의 아미노산 동일성은 본원에 도시된 서열에 대해 적어도 80%이고, 보다 전형적으로 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 거의 100%로 동일성이 증가한다. 유사한 방식으로, 본원에서 확인된 결합 단백질의 핵산 서열에 대한 "핵산 서열 동일성 퍼센트 (%)"는 항원 결합 단백질의 코딩 서열 내의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드 잔기의 백분율로 정의된다. 특정 방법은 중첩 스팬 및 중첩 분율이 각각 1 및 0.125로 설정된, 디폴트 파라미터로 설정된 WU-BLAST-2의 BLASTN 모듈을 사용하고, 필터는 선택되지 않는다.
일반적으로, 개별 변이체 CDR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 본원에 도시된 뉴클레오티드 서열 사이의 핵산 서열 동일성은 적어도 80%이고, 보다 전형적으로 바람직하게는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 및 거의 100%로 동일성이 증가한다.
따라서, "변이체 CDR"은 본 발명의 부모 CDR에 대해 지정된 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는 것이고, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 부모 CDR의 특이성 및/또는 활성을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생물학적 기능을 공유한다.
아미노산 서열 변화를 도입하기 위한 부위 또는 영역은 미리 결정되지만, 돌연변이는 그 자체로 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이 수행을 최적화하기 위해, 무작위적인 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행할 수 있고, 발현된 항원 결합 단백질 CDR 변이체를 바람직한 활성의 최적의 조합에 대해 스크리닝할 수 있다. 공지된 서열을 갖는 DNA 내의 미리 결정된 부위에서 치환 돌연변이를 만들기 위한 기술, 예를 들어 M13 프라이머 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발이 널리 공지되어 있다. 돌연변이체의 스크리닝은 본원에 기재된 항원 결합 단백질 활성의 검정을 이용하여 수행한다.
아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기의 치환이고; 상당히 더 큰 삽입이 허용될 수 있으나, 삽입은 통상적으로 대략 약 1 내지 약 20개의 아미노산 잔기일 것이다. 일부 경우에 결실은 보다 더 클 수 있으나, 결실 범위는 약 1 내지 약 20개의 아미노산 잔기이다.
치환, 결실, 삽입 또는 그의 임의의 조합은 최종 유도체 또는 변이체에 도달하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 이들 변화는 분자의 변경, 특히 항원 결합 단백질의 면역원성 및 특이성의 변경을 최소화하도록 몇몇 아미노산에 대해 이루어진다. 그러나, 특정 상황에서는 보다 큰 변화가 허용될 수 있다.
본원에 사용된 "Fab" 또는 "Fab 영역"은 VH, CH1, VL 및 CL 이뮤노글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. Fab는 단리된 상기 영역 또는 전장 항체, 항체 단편 또는 Fab 융합 단백질, 또는 본원에 개략된 임의의 다른 항체 실시양태와 관련된 상기 영역을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 "Fv" 또는 "Fv 단편" 또는 "Fv 영역"은 단일 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 "프레임워크"는 CDR로 정의된 영역을 제외한 항체 가변 도메인의 영역을 의미한다. 각각의 항체 가변 도메인 프레임워크는 CDR에 의해 분리된 근접 영역으로 추가로 세분될 수 있다 (FR1, FR2, FR3 및 FR4).
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 간단히 "항체 부분")은 항원 (예를 들어, BST1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL / VK, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) 본질적으로 힌지 영역의 부분을 갖는 Fab인 Fab' 단편 (문헌 [FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993] 참조) (iv) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (vi) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (문헌 [Ward et al. (1989) Nature 341:544-546]); (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (viii) 나노바디, 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 추가로, Fv 단편, VL / VK 및 VH의 2개의 도메인은 분리된 유전자에 의해 코딩되어 있지만, 이들은 재조합 방법에 의해 이들을 단일 단백질 쇄로 만들 수 있는 합성 링커에 의해 연결될 수 있고, 여기서 VL / VK 및 VH 영역은 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성한다 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). 이러한 단일 쇄 항체 역시 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수득되며, 이 단편들은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는 항체를 지칭하도록 의도된다 (예를 들어, BST1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 BST1 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 존재하지 않음). 그러나 BST1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 BST1에 교차-반응성을 가질 수는 있다. 추가로 및/또는 대안적으로, 단리된 항체에는 자연에서 통상적으로 발견되지 않는 형태의 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 재조합 단백질, 단리된 단백질 또는 실질적으로 순수한 단백질이다. "단리된" 단백질은 그의 천연 상태에서 통상적으로 회합하는 물질 중 적어도 일부에 의해 수반되지 않고, 예를 들어 주어진 샘플에서 총 단백질의 적어도 약 5 중량%, 또는 적어도 약 50 중량%를 구성한다. 단리된 단백질은 상황에 따라 총 단백질 함량의 5 내지 99.9 중량%를 구성할 수 있을 것으로 이해된다. 예를 들어, 단백질은 단백질이 증가한 농도 수준에서 만들어지도록 유도성 프로모터 또는 고발현 프로모터를 사용함으로써 유의하게 더 높은 농도에서 만들어질 수 있다. 재조합 단백질의 경우에, 정의는 자연적으로 생산되지 않는, 당업계에 공지된 매우 다양한 유기체 및/또는 숙주 세포에서의 항체의 생산을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물인 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 본원에 사용된 "폴리클로날 항체"는 전체 동물에서의 경우에서와 같이 B-림프구의 여러 클론에 의해 생산된 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 교환가능하게 사용된다.
용어 "항체 유도체"는 항체의 임의의 변형된 형태, 예를 들어 항체 및 또 다른 작용제 또는 항체의 접합체 (일반적으로 화학적 연결)를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 하기 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 중합체 (예를 들어 PEG), 독소, 표지 등를 포함하나 이에 제한되지는 않는 작용제에 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 비인간, 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 키메라 및 인간화 항체의 개념의 설명에 대해 문헌 [Clark et al. (2000)] 및 여기서 인용된 참고문헌 (문헌 [Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402])을 참조한다. 키메라 항체는 인간 항체의 불변 영역에 작동가능하게 연결된, 비인간 항체의 가변 영역, 예를 들어 마우스 또는 래트 기원의 VH 및 VL 도메인을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간화된다. 본원에 사용된 "인간화" 항체는 인간 프레임워크 영역 (FR) 및 비-인간 (통상적으로 마우스 또는 래트) 항체로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 항체를 의미한다. CDR을 제공하는 비-인간 항체는 "공여자"로 불리고, 프레임워크를 제공하는 인간 이뮤노글로불린은 "수용자"로 불린다. 인간화는 주로 공여자 CDR의 수용자 (인간) VL 및 VH 프레임워크로의 그라프팅에 의존한다 (미국 특허 번호 5,225,539). 이러한 전략은 "CDR 그라프팅"으로 지칭된다. 선택된 수용자 프레임워크 잔기의 상응하는 공여자 잔기로의 "복귀돌연변이"는 종종 처음 그라프팅된 구축물에서 손실된 친화도를 회복할 필요가 있다 (US 5,530,101; US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 6,180,370; US 5,859,205; US 5,821,337; US 6,054,297; US 6,407,213). 인간화 항체는 최적으로 또한 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이며, 따라서 전형적으로 인간 Fc 영역을 포함할 것이다. 비-인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료의 방법 (문헌 [Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; Verhoeyen et al. (1988) Science, 239:1534-1536])에 따라 수행될 수 있다. 인간화 뮤린 모노클로날 항체의 추가의 예가 또한 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 항체 결합 인간 단백질 C (문헌 [O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8), 인터류킨 2 수용체 (문헌 [Queen et al. (1989) Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33]) 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (문헌 [Carter et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9])가 있다. 대안적 실시양태에서, 본 발명의 항체는 완전 인간 항체일 수 있으며, 즉 항체의 서열은 완전하게 또는 실질적으로 인간 서열이다. 트랜스제닉 마우스 (문헌 [Bruggemann et al. (1997) Curr Opin Biotechnol 8:455-458]) 또는 선택 방법과 커플링된 인간 항체 라이브러리 (문헌 [Griffiths et al. (1998) Curr Opin Biotechnol 9:102-108)의 사용을 비롯하여 완전 인간 항체를 제조하기 위한 다수의 방법이 당업계에 공지되어 있다.
용어 "인간화 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그라프팅된 항체를 포함하도록 의도된다. 추가의 프레임워크 영역 변형은 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인 아미노산 변형과 같이 인간 프레임워크 서열 내에서 이루어질 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종에서 유래되고 불변 영역 서열은 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "특이적으로 결합한다" (또는 "면역특이적으로 결합한다")는 다수의 실시양태에서는 사실일지라도, 즉 항체가 그의 표적에 "특이적으로 결합하며" 샘플, 세포 또는 환자의 다른 성분에 검출하가능하게 또는 실질적으로 결합하지 않더라도, 항체가 그의 의도된 표적에 독점적으로 결합하는 것을 나타내도록 의도되지는 않는다. 그러나, 일부 실시양태에서, 항체는 그의 의도된 표적에 대한 그의 친화도가 비-표적 분자에 대한 그의 친화도와 비교시에 약 5배를 초과한다면 "특이적으로 결합한다". 적합하게는 원치않는 물질, 특히 건강한 사람 또는 동물의 자연 발생 단백질 또는 조직과의 유의한 교차-반응 또는 교차-결합이 존재하지 않는다. 표적 분자에 대한 항체의 친화도는 비-표적 분자에 대한 그의 친화도보다 예를 들어 적어도 약 5배, 예컨대 10배, 예컨대 25배, 특히 50배, 및 특별히 100배 또는 그 초과일 것이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 다른 결합제와 항원 사이의 특이적 결합은 적어도 106 M-1의 결합 친화도를 의미한다. 항체는 예를 들어 적어도 약 107 M-1, 예컨대 약 108 M-1 내지 약 109 M-1, 약 109 M-1 내지 약 1010 M-1, 또는 약 1010 M-1 내지 약 1011 M-1의 친화도로 결합할 수 있다. 항체는 예를 들어 50 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하, 또는 보다 바람직하게는 10 pM 이하의 EC50으로 결합할 수 있다.
본원에 사용된, 용어 단백질 또는 세포"에 실질적으로 결합하지 않는"은 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나, 고친화도로 결합하지 않는다는 것, 즉 단백질 또는 세포에 1 x 10-6 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-5 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-4 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-3 M 이상, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-2 M 이상의 KD로 결합한다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "EC50"은 50% 최대 반응/효과를 일으키는 농도를 정량화함으로써, 화합물의 효력을 지칭하도록 의도된다. EC50은 스캐차드 또는 FACS에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭하는 것인 반면, 본원에 사용된 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하도록 의도된다. 본원에 사용된 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비 (즉, Kd/Ka)로부터 수득하고 몰 농도 (M)로서 표현되는 친화도 상수를 지칭하도록 의도된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 항체의 KD를 결정하기 위한 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명, 바람직하게는 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(Biacore)® 시스템을 이용하는 방법에 의한 것이다.
본원에 사용된 IgG 항체에 대한 용어 "고친화도"는 표적 항원에 대해 1 x 10-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5 x 10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 1x10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 5 x 10-9 M 이하, 및 보다 더 바람직하게는 1 x 10-9 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "고친화도" 결합은 다른 항체 이소형에 대해 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 항체의 KD 값이 10-6 M 이하, 보다 바람직하게는 10-7 M 이하, 보다 더 바람직하게는 10-8 M 이하인 경우를 지칭한다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 이뮤노글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬된 불연속 아미노산 또는 인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로, 변성 용매에 대한 노출시에 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로, 변성 용매로의 처리시에 손실된다. 에피토프에는 전형적으로, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산이 특유한 공간 입체형태로 포함된다. 에피토프의 공간 입체형태를 결정하는 방법은 당업계에 공지되고 본원에 기재된 기술, 예를 들어 x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)] 참조).
따라서, 또한 본 발명에는 본원에 기재된 바와 같은 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 (즉, 인식하는) 항체 (즉, BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3)가 포괄된다. 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 표적 항원에 대한 참조 항체와 통계적으로 유의한 방식으로 교차-경쟁 (즉, 결합을 경쟁적으로 억제)하는 능력에 의해 확인될 수 있다. 경쟁적 억제는, 예를 들어 항체가 동일하거나 구조적으로 유사한 에피토프에 결합하는 경우 (예를 들어, 에피토프 중첩), 또는 결합시에 항체 사이에 입체 장애를 일으키는 공간적으로 근접한 에피토프에 결합하는 경우에 일어날 수 있다.
경쟁적 억제는 통상적인 검정을 이용하여 결정할 수 있으며, 여기서 시험 하의 이뮤노글로불린은 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제한다. 다수의 유형의 경쟁적 결합 검정이 공지되어 있고, 예를 들어 고체 상 직접적 또는 간접적 방사능 면역 분석 (RIA), 고체 상 직접적 또는 간접적 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahl et al. (1983) Methods in Enzymology 9:242] 참조); 고체 상 직접적 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al. (1986) J. Immunol. 137:3614] 참조); 고체 상 직접적 표지된 검정, 고체 상 직접적 표지된 샌드위치 검정 (문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 사용한 고체 상 직접적 표지 RIA (문헌 [Morel et al. (1988) Mol. Immunol. 25(1):7)] 참조); 고체 상 직접적 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Cheung et al. (1990) Virology 176:546]); 및 직접적 표지된 RIA (문헌 [Moldenhauer et al. (1990) Scand. J. Immunol. 32:77])가 있다. 전형적으로, 이러한 검정은 비표지 시험 이뮤노글로불린 및 표지된 참조 이뮤노글로불린 중 어느 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 이뮤노글로불린의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정하여 측정한다. 통상적으로, 시험 이뮤노글로불린은 과량으로 존재한다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우에, 이는 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 그 초과로 억제할 것이다.
다른 기술은, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법, 예컨대 항원:항체 복합체 결정의 x-분석을 포함하며, 이는 에피토프의 원자 해상도를 제공한다. 다른 방법은 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이체에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 것으로, 항원 서열 내의 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 손실은 종종 에피토프 성분을 나타내는 것으로 간주된다. 또한, 에피토프 맵핑에 대한 전산 조합 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 조합 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 특이적인 짧은 펩티드를 친화도 단리하는 관심 항체의 능력에 의존한다. 이어서, 펩티드는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된 항체에 상응하는 에피토프를 정의하기 위한 본보기로서 간주된다. 에피토프 맵핑을 위해 전산 알고리즘이 또한 개발되어 있고, 이는 형태적으로 불연속적인 에피토프를 맵핑하는 것으로 밝혀졌다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본 개시내용의 다양한 측면이 하기의 하위섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.
항- BST1 항체
본 발명의 항체는 항체의 특정한 기능적 특징 또는 특성에 의해 특성화된다. 예를 들어, 항체는 인간 BST1에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 BST1에 고친화도, 예를 들어 8 x 10-7 M 이하, 보다 더 전형적으로는 1 x 10-8 M 이하의 KD로 결합한다. 본 발명의 항-BST1 항체는 바람직하게는 하기 특성 중 하나 이상을 나타내며, 항체는 특정한 용도 둘 다의 발견을 나타낸다:
50 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하, 또는 보다 바람직하게는 10 pM 이하의 EC50으로 인간 BST1에 결합하는 것;
BST1을 발현하는 인간 세포에 결합하는 것.
한 실시양태에서, 항체는 바람직하게는 BST1 내에 존재하는 항원성 에피토프에 결합하며, 이 에피토프는 다른 단백질에는 존재하지 않는다. 바람직하게는, 항체는 관련 단백질에 결합하지 않고, 예를 들어 항체는 다른 세포 부착 분자에 실질적으로 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, 항체는 BST1을 발현하는 세포에 내재화될 수 있다. 예를 들어 MabZap 또는 HumZap 내재화 검정을 포함하여, 항체 내재화를 평가하기 위한 표준 검정이 당업계에 공지되어 있다.
예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯, RIA, 비아코어® 검정 및 유동 세포측정법 분석을 비롯하여 BST1에 대한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정은 단백질 또는 세포 수준 상에서 수행될 수 있으며 당업계에 공지되어 있다. 적합한 검정은 실시예에 상세하게 기재된다. 또한, 항체의 결합 동역학 (예를 들어, 결합 친화도)을 당업계에 공지된 표준 검정, 예컨대 비아코어® 시스템 분석으로 평가할 수 있다. 라지(Raji) 또는 다우디(Daudi) B 세포 종양 세포에 대한 결합을 평가하기 위해, 라지 (ATCC 기탁 번호 CCL-86) 또는 다우디 (ATCC 기탁 번호 CCL-213) 세포를 공개적으로 이용가능한 공급원, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에서 입수할 수 있고, 표준 검정, 예컨대 유동 세포측정 분석에 사용할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체
본 발명의 바람직한 항체는 실시예 1-4에 기재된 바와 같이 단리되고 구조적으로 특성화된 모노클로날 항체 BST1_A2 및 BST1_A1이다. VH 아미노산 서열 BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3은 각각 서열 2, 1 및 52로 나타낸다. VK 아미노산 서열 BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3은 각각 서열 4, 3 및 53으로 나타낸다.
이들 각각의 항체가 BST1에 결합할 수 있음을 고려할 때, VH 및 VK 서열을 "혼합 및 매치"시켜 본 발명의 다른 항-BST1 결합 분자를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매치"된 항체의 BST1 결합을 상기 및 실시예에 기재된 결합 검정 (예를 들어, ELISA)을 이용하여 시험할 수 있다. 바람직하게는, VH 및 VK 쇄를 혼합 및 매치시킬 경우에, 특정한 VH/VK 쌍으로부터의 VH 서열을 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체한다. 유사하게, 바람직하게는 특정한 VH/VK 쌍으로부터의 VK 서열을 구조적으로 유사한 VK 서열로 대체한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 2, 1 및 52로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 4, 3 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공하며; 여기서 항체는 BST1, 바람직하게는 인간 BST1에 특이적으로 결합한다.
바람직한 중쇄 및 경쇄 조합은 하기를 포함한다:
서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 측면에서, 본 발명은 BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 그의 조합을 포함하는 항체를 제공한다. BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3의 VH CDR1의 아미노산 서열은 각각 서열 10, 9 및 56으로 나타낸다. BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3의 VH CDR2의 아미노산 서열은 각각 서열 12 또는 51, 11 및 57로 나타낸다. BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3의 VH CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 14, 13 및 58로 나타낸다. BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3의 VK CDR1의 아미노산 서열은 각각 서열 16, 15 및 59로 나타낸다. BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3의 VK CDR2의 아미노산 서열은 각각 서열 18, 17 및 60으로 나타낸다. BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3의 VK CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열 20, 19 및 61로 나타낸다. CDR 영역은 카바트 시스템을 이용하여 설명된다 (문헌 [Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]).
각각의 이들 항체가 BST1에 결합할 수 있고, 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에 의해 제공된다는 점을 고려할 때, VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 VK CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 본 발명의 다른 항-BST1 결합 분자를 생성하기 위해 "혼합 및 매치"될 수 있다 (즉, 각각의 항체가 일반적으로 VH CDR1, CDR2 및 CDR3 및 VK CDR1, CDR2 및 CDR3을 함유하지만, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매치될 수 있음). 따라서, 본 발명은 특히 중쇄 및 경쇄의 CDR의 모든 가능한 조합을 포함한다.
이러한 "혼합 및 매치된" 항체의 BST1 결합은 상기 및 실시예에 기재된 결합 검정 (예를 들어, ELISA, 비아코어® 분석)을 이용하여 시험할 수 있다. 바람직하게는, VH CDR 서열이 혼합 및 매치되는 경우에, 특정한 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 유사하게, VK CDR 서열이 혼합 및 매치되는 경우에, 특정한 VK 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 바람직하게는 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 신규한 VH 및 VK 서열은 하나 이상의 VH 및/또는 VL / VK CDR 영역 서열을 모노클로날 항체 BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3에 대한 본원에 개시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환시켜 생성할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은
서열 10, 9 및 56으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 12 또는 51, 11 및 57로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 14, 13 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
서열 16, 15 및 59로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 18, 17 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
서열 20, 19 및 61로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
(가능한 경우에 모든 가능한 조합 포함)을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공하며, 여기서 항체는 BST1, 바람직하게는 인간 BST1에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체는
서열 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 12 또는 서열 51을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 및
서열 16을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 18을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
서열 20을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체는
서열 9를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 및
서열 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 17을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
서열 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체는
서열 56을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
서열 57을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
서열 58을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 및
서열 59를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
서열 60을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
서열 61을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
을 포함한다.
CDR1 및/또는 CDR2 도메인(들)과는 독립적으로, CDR3 도메인은 단독으로 동족 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있고, 공통 CDR3 서열에 기초하여 동일한 결합 특이성을 갖는 여러 항체들을 예측가능하게 생성할 수 있다는 것이 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Klimka et al. (2000) British J. of Cancer 83(2):252-260] (뮤린 항-CD30 항체 Ki-4의 중쇄 가변 도메인 CDR3 만을 사용한 인간화 항-CD30 항체의 생산을 기재함); [Beiboer et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:833-849] (모 뮤린 MOC-31 항-EGP-2 항체의 중쇄 CDR3 서열만을 사용한 재조합 상피 당단백질-2 (EGP-2) 항체를 기재함); [Rader et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:8910-8915] (뮤린 항-인테그린 αvβ3 항체 LM609의 중쇄 및 경쇄 가변 CDR3 도메인을 사용한 인간화 항-인테그린 αvβ3 항체의 패널을 기재함, 여기서 각 구성원 항체는 CDR3 도메인 외부에 특유의 서열을 포함하고 부모 뮤린 항체만큼 높거나 더 높은 친화도로 부모 뮤린 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있음); [Barbas et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162] (CDR3 도메인이 항원 결합에 가장 중요한 기여를 제공한다는 것을 개시함); [Barbas et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:2529-2533] (인간 태반 DNA에 대한 3종의 Fab (SI-1, SI-40 및 SI-32)의 중쇄 CDR3 서열의 항파상풍 톡소이드 Fab의 중쇄로의 그라프팅과 이에 따른 기존 중쇄 CDR3의 대체를 기재하고, CDR3 도메인이 단독으로 결합 특이성을 부여한다는 것을 증명함); 및 [Ditzel et al. (1996) J. Immunol. 157:739-749] (모 다중특이적 Fab LNA3의 중쇄 CDR3 단독의 단일특이적 IgG 파상풍 톡소이드-결합 Fab p313 항체의 중쇄로의 이전이 상기 부모 Fab의 결합 특이성을 유지하는데 충분한다는 것을 증명하는 그라프팅 연구를 기재함)을 참조한다. 이들 참고문헌은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
따라서, 본 발명은 인간 또는 비-인간 동물로부터 유래된 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서 상기 모노클로날 항체는 BST1에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명은 비-인간 항체, 예컨대 마우스 또는 래트 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하고, BST1에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 비-인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 이러한 본 발명의 항체는 상응하는 부모 비-인간 항체와 (a) 결합에 대해 경쟁할 수 있고/거나; (b) 그의 기능적 특성을 보유하고/거나; (c) 그와 동일한 에피토프에 결합하고/거나; (d) 그와 유사한 결합 친화도를 갖는다.
다른 측면에서, 본 발명은 BST1에 특이적으로 결합할 수 있는 인간 항체, 예컨대 비-인간 동물로부터 수득한 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 모노클로날 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명에서는 제1 인간 항체, 예컨대 비-인간 동물로부터 수득된 인간 항체로부터 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서 상기 제1 인간 항체는 BST1에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 제1 인간 항체로부터 CDR3 도메인은 BST1에 대한 결합 특이성이 부재하는 인간 항체에서 CDR3 도메인을 대체하여 BST1에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 인간 항체를 생성한다. 일부 실시양태에서, 제1 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 본 발명의 항체는 상응하는 부모 제1 인간 항체와 (a) 결합에 대해 경쟁할 수 있고/거나; (b) 그의 기능적 특성을 보유하고/거나; (c) 그와 동일한 에피토프에 결합하고/거나; (d) 그와 유사한 결합 친화도를 갖는다.
특정한 배선 서열을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 특정한 배선 중쇄 이뮤노글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정한 배선 경쇄 이뮤노글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 뮤린 VH 1-39 유전자, 뮤린 VH 1-80 유전자 또는 뮤린 VH 69-1 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공하며, 여기서 항체는 BST1에 특이적으로 결합한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 뮤린 VK 4-55 유전자, 뮤린 VK 4-74 유전자 또는 뮤린 VK 44-1 유전자의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공하며, 여기서 항체는 BST1에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공하며, 여기서 항체는
뮤린 VH 1-39 유전자 (이 유전자는 서열 35 및 36에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함함)의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고; 뮤린 VK 4-55 유전자 (이 유전자는 서열 40, 41 및 42에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함함)의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고; BST1, 바람직하게는 인간 BST1에 특이적으로 결합한다. 상기 기재된 서열을 갖는, VH 1-39 및 VK 4-55 유전자를 갖는 항체의 예는 BST1_A2이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공하며, 여기서 항체는
뮤린 VH 1-80 유전자 (이 유전자는 서열 33 및 34에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함함)의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고;
뮤린 VK 4-74 유전자 (이 유전자는 서열 37, 38 및 39에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함함)의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고; BST1, 바람직하게는 인간 BST1에 특이적으로 결합한다. 상기 기재된 서열을 갖는, VH 1-80 및 VK 4-74 유전자를 갖는 항체의 예는 BST1_A1이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제공하며, 여기서 항체는
뮤린 VH 69-1 유전자 (이 유전자는 서열 68 및 69에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함함)의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고;
뮤린 VK 44-1 유전자 (이 유전자는 서열 70, 71 및 72에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함함)의 산물이거나 또는 이로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고; BST1, 바람직하게는 인간 BST1에 특이적으로 결합한다. 상기 기재된 서열을 갖는, VH 및 VK 유전자를 갖는 항체의 예는 BST1_A3이다.
본원에 사용된 항체는 이러한 항체의 가변 영역이 뮤린 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 수득되는 경우에, 특정한 배선 서열의 "산물"이거나 또는 "이로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 시스템은 관심 항원을 갖는 파지 상에 디스플레이된 뮤린 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 뮤린 배선 이뮤노글로불린 서열의 "산물"이거나 또는 "이로부터 유래된" 항체는 예컨대 항체의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 뮤린 배선 이뮤노글로불린의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하고, 항체의 서열과 가장 가까운 서열을 갖는 (즉, 최대 동일성 %) 뮤린 배선 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인될 수 있다. 특정한 뮤린 배선 이뮤노글로불린 서열의 "산물"이거나 또는 "이로부터 유래된" 항체는, 예를 들어 자연 발생 체세포 돌연변이, 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적 도입으로 인해, 배선 서열과 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선택된 항체는 전형적으로, 뮤린 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%이고, 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 인간 배선 서열)과 비교하는 경우에 뮤린인 항체를 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. 전형적으로, 특정한 뮤린 배선 서열로부터 유래된 항체는 뮤린 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과는 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 경우에, 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어는 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
상동 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 바람직한 항체의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 항체는 본 발명의 항-BST1 항체의 원하는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열 2, 1 및 52로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 4, 3 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 항체는 인간 BST1에 결합한다. 이러한 항체는 50 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하, 또는 보다 바람직하게는 10 pM 이하의 EC50으로 인간 BST1에 결합할 수 있다.
항체는 또한 인간 BST1로 형질감염된 CHO 세포에 결합할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
다른 실시양태에서, VH 및/또는 VK 아미노산 서열은 상기 기재된 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성일 수 있다. 상기 기재된 서열의 VH 및 VK 영역과 높은 (즉, 80% 이상의) 동일성을 갖는 VH 및 VK 영역을 갖는 항체는 서열 6, 5, 8, 7, 54 및 55를 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어 본원에 기재된 기능적 검정을 이용하는 코딩된 변경된 항체의 보유하는 기능에 대한 시험에 의해 수득할 수 있다.
2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트는 서열이 공유하는 동일한 위치의 수에 관한 함수 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100)로서, 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 퍼센트의 결정은 하기 비제한적 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다.
2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 PAM120 가중 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 이용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 혼입된 이. 마이어스(E. Meyers) 및 더블유. 밀러(W. Miller)의 알고리즘 (문헌 [Comput. Appl. Biosci. (1988) 4:11-17])을 이용하여 결정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 블로섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함)에 혼입된 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch) (문헌 [J. Mol. Biol. (1970) 48:444-453]) 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은 예를 들어 관련 서열들을 확인하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램 (스코어 = 50, 단어 길이 = 3)을 통해 수행되고, 이에 의해 본 발명의 항체 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교를 위한 갭 형성 정렬을 얻기 위해서는, 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재되어 있는 바와 같이, Gapped BLAST를 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 이용할 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
보존적 변형을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 이러한 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에서 기재한 바람직한 항체 (예를 들어, BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3)에 기초하여 규정된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 포함하고, 상기 항체는 본 발명의 항-BST1 항체의 원하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 14, 13 및 58의 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 20, 19 및 61의 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 항체는 50 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 100 pM 이하 또는 보다 바람직하게는 10 pM 이하의 EC50으로 인간 BST1에 결합한다.
항체는 또한 인간 BST1로 형질감염된 CHO 세포에 결합할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 12 또는 51, 11 및 57의 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 18, 17 및 60의 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열 10, 9 및 56의 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열 16, 15 및 59의 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 14, 13 및 58의 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 20, 19 및 61의 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 12 또는 51, 11 및 57의 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 18, 17 및 60의 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열 10, 9 및 56의 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열 16, 15 및 59의 아미노산 서열 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의한 영향을 미치지 않거나, 유의하게 이를 변경시키지 않는 아미노산의 변형을 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당업계에 규정되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 항체는 본원에 기재된 기능적 검정을 이용하여 보유 기능에 대해 시험될 수 있다.
서열 10, 9 및 56의 중쇄 CDR1 서열은 하나 이상의 보존적 서열 변형, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있고/거나; 서열 16, 15 및 59의 경쇄 CDR1 서열은 하나 이상의 보존적 서열 변형, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있고/거나; 서열 12 또는 51, 11 및 57로 나타낸 중쇄 CDR2 서열은 하나 이상의 보존적 서열 변형, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있고/거나; 서열 18, 17 및 60으로 나타낸 경쇄 CDR2 서열은 하나 이상의 보존적 서열 변형, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있고/거나; 서열 14, 13 및 58로 나타낸 중쇄 CDR3 서열은 하나 이상의 보존적 서열 변형, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있고/거나; 서열 20, 19 및 61로 나타낸 경쇄 CDR3 서열은 하나 이상의 보존적 서열 변형, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다.
본 발명의 항- BST1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 BST1 모노클로날 항체와 동일한 인간 BST1 상의 에피토프에 결합하는 항체 (즉, 본 발명의 임의의 모노클로날 항체와 BST1에 대한 결합에 대해 교차-경쟁하는 능력을 갖는 항체)를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 교차-경쟁 연구를 위한 참조 항체는 모노클로날 항체 BST1_A2 (각각 서열 2 및 4로 나타낸 VH 및 VK 서열을 가짐), 모노클로날 항체 BST1_A1 (각각 서열 1 및 3로 나타낸 VH 및 VK 서열을 가짐), 모노클로날 항체 BST1_A3 (각각 서열 52 및 53으로 나타낸 VH 및 VK 서열을 가짐)일 수 있다.
이러한 교차-경쟁 항체는 표준 BST1 결합 검정에서 BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3과 교차-경쟁하는 그의 능력에 기초하여 수 있다. 예를 들어, 비아코어 분석, ELISA 검정 또는 유동 세포측정법을 이용하여 본 발명의 항체와의 교차-경쟁을 입증할 수 있다. 시험 항체가 인간 BST1에 대한 예를 들어 BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3의 결합을 억제하는 능력은 시험 항체가 인간 BST1에 대한 결합에 대해 BST1_A2, BST1_A1 또는 BST1_A3과 경쟁할 수 있으며, 이에 따라 인간 BST1_A2, BST1_A1 또는 BST1_A3 상의 동일한 에피토프에 결합한다는 것을 입증한다.
조작 및 변형된 항체
본 발명의 항체는 또한 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있는 본원에 개시된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조되고, 상기 변형된 항체는 출발 항체와 비교하여 변경된 특성을 갖는다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL), 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 존재하는 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항체는 불변 영역(들) 내의 잔기들을 변형시켜 조작되어, 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체의 가변 영역을 조작하기 위해 CDR 그라프팅이 이용될 수 있다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상으로 그라프팅된 특이적 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특이적 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. USA. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 각각 서열 10, 9 및 56; 12 또는 51, 11 및 57; 및 14, 13 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열 16, 15 및 59; 18, 17 및 60; 및 20, 19 및 61로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 모노클로날 항체 BST1_A2, BST1_A1 및 BST1_A3의 VH 및 VK CDR 서열을 함유하지만, 이러한 항체로부터의 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.
이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 간행된 참고문헌으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 IMGT (인터내셔널 이뮤노제네틱스(international ImMunoGeneTics)) 뮤린 배선 서열 데이터베이스 (hypertext transfer protocol//www.imgt.cines.fr/?에서 이용가능함) 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] (그의 각각의 내용이 명백하게 본원에 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다. 또 다른 예에서, 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 진뱅크 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다.
항체 단백질 서열은 당업자에게 널리 공지되어 있는 Gapped BLAST (문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402])라 지칭되는 서열 유사성 검색 방법 중의 하나를 이용하여 컴파일링된 단백질 서열 데이터베이스에 대해 비교된다. BLAST는 항체 서열과 데이터베이스 서열 사이의 통계적으로 유의한 정렬이 정렬된 워드의 높은-스코어링 절편 쌍 (HSP)을 함유하는 것으로 예상된다는 점에서 발견적 알고리즘이다. 스코어가 연장 또는 말단절단에 의해 개선될 수 없는 절편 쌍이 히트(hit)로 지칭된다. 간략하게, 데이터베이스의 뉴클레오티드 서열을 번역하고, FR1 내지 FR3 프레임워크 영역을 포함하는 이들 사이의 영역을 유지시킨다. 데이터베이스 서열은 평균 길이가 98개의 잔기이다. 단백질 전체 길이에 걸쳐 정확히 매치되는 중복 서열을 제거한다. BLAST는 디폴트, 작동 중지되는 저 복잡성 필터를 제외한 표준 파라미터, 및 BLOSUM62의 치환 매트릭스, 서열 매치를 산출시키는 상위 5개의 히트에 대한 필터를 수반한 프로그램 blastp를 이용하여 단백질을 검색한다. 뉴클레오티드 서열을 6개의 프레임 모두에서 번역하고, 데이터베이스 서열의 매치 절편 내의 정지 코돈을 전혀 수반하지 않은 프레임을 잠재적 히트로 간주한다. 이는 다시 BLAST 프로그램 tblastx를 이용하여 확인하는데, 이 프로그램은 항체 서열을 6개의 모든 프레임에서 번역하고, 이러한 번역물을, 6개의 모든 프레임에서 극적으로 번역된 데이터베이스의 뉴클레오티드 서열과 비교한다.
동일성은 서열 전체 길이에 걸쳐 항체 서열과 단백질 데이터베이스 사이의 정확한 아미노산 매치이다. 양성 (동일성 + 치환 매치)은 동일한 것은 아니지만 BLOSUM62 치환 매트릭스에 의해 유도된 아미노산 치환이다. 항체 서열이 동일한 동일성으로 데이터베이스 서열 중의 2개와 매치되는 경우에, 가장 양성인 히트가 매치 서열 히트로 결정될 것이다.
본 발명의 항체에 사용하기에 바람직한 프레임워크 서열은 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 서열, 예를 들어 본 발명의 바람직한 모노클로날 항체에 의해 사용되는 VH 1-80 프레임워크 서열, VH 1-39 프레임워크 서열, VK 4-74 프레임워크 서열 및/또는 VK 4-55 프레임워크 서열과 유사한 서열이다. VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 VK CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 그로부터 프레임워크 서열이 유도되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있거나, CDR 서열은 배선 서열에 비하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VK CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선하기 위한 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발을 수행하여 돌연변이(들)를 도입할 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 관심의 대상이 되는 다른 기능적 특성을 본원에 기재된 바와 같고 실시예에서 제공되는 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정으로 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, (상기 논의되어 있는 바와 같은) 보존적 변형이 도입된다. 대안적으로, 비-보존적 변형이 만들어 질 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 또한, 다른 구역 (예를 들어, 프레임워크 영역)에서의 변이체가 더 많을 수 있다는 것을 당업자가 인지할 것이지만, 전형적으로는 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기를 변경시킨다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열 10, 9 및 56으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 10, 9 및 56과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; (b) 서열 12 또는 51, 11 및 57로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 12 또는 51, 11 및 57과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; (c) 서열 14, 13 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 14, 13 및 58과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; (d) 서열 16, 15 및 59로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 16, 15 및 59와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VK CDR1 영역; (e) 서열 18, 17 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 18, 17 및 60과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VK CDR2 영역; 및 (f) 서열 20, 19 및 61로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 20, 19 및 61과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VK CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-BST1 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공한다.
본 개시내용의 조작된 항체는 VH 및/또는 VK 내의 프레임워크 잔기를 변형시켜, 예를 들어 항체의 특성을 개선하는 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한가지 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로는, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 이러한 항체가 유래된 배선 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로 지칭되며, 이는 미국 특허 공개 번호 2003/0153043에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 추가하여 또는 이러한 변형에 대안적으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포 세포독성을 변경시키는 변형을 Fc 영역 내에 포함하도록 조작될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체를 화학적으로 변형시킬 수 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티를 항체에 부착시킬 수 있음), 그의 글리코실화를 변경시켜 항체의 하나 이상의 기능적 특성이 다시 변경되도록 변형시킬 수 있다. 각각의 이러한 실시양태는 하기에서 추가로 상세하게 기재된다. Fc 영역 내 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 넘버링이다.
한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 추가로 미국 특허 번호 5,677,425에 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이될 수 있다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입하여 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코쿠스 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 한다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기가 증가되도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375에 기재된 바와 같이, 하기 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해서, 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022에 기재된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 유도된 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 항체를 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 WO2007/059782에 기재된 바와 같은 유니바디로서 생산된다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대한 친화도는 변경되지만 부모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 제거된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 하기 위치에서 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 또한, FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 맵핑되어 있으며, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다 (문헌 [Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특이적 돌연변이가 FcγRIII에 대한 결합을 개선하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 하기 조합 돌연변이체는 FcγRIII 결합을 개선하는 것으로 밝혀졌다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A. 추가의 ADCC 변이체는 예를 들어 WO2006/019447에 기재되어 있다.
또 다른 예에서, Fc 영역은 예를 들어 PCT/US2008/088053, US 7,371,826, US 7,670,600 및 WO 97/34631에 기재된 바와 같이, 일반적으로 FcRn 수용체에 대한 결합을 증가시킴으로써 항체의 반감기가 증가하도록 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기가 증가되도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재된 바와 같은, 하기 돌연변이 중의 하나 이상을 도입할 수 있다: T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해서, 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022에 기재된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 유도된 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 항체를 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비-글리코실화 항체를 제조할 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 결핍됨). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도가 증가하도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경시켜 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 이 부위에서 글리코실화가 일어나지 않도록 하는 하나 이상의 아미노산 치환을 만들 수 있다. 이러한 비-글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 보다 상세하게 기재되어 있고, 위치 297에서 아스파라긴을 제거함으로써 달성될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 푸코실 잔기 수가 감소된 저푸코실화 항체 또는 이분화 GlcNac 구조가 증가된 항체가 생성될 수 있다. 이는 때때로 당업계에서 "조작된 당형태"로 지칭된다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴이 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은 일반적으로 2가지 방식으로 달성될 수 있고, 예를 들어 일부 실시양태에서, 항체는 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 발현된다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 포텔리젠트(POTELLIGENT)® 기술을 참조한다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8 (알파 (1,6)푸코실트랜스퍼라제)이 결핍되어 있어서, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체의 탄수화물에 푸코스가 존재하지 않는다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포 내에서 FUT8 유전자의 표적화된 파괴에 의해 생성되었다 (미국 특허 공개 번호 2004/0110704, 미국 특허 번호 7,517,670 및 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614-22] 참조). 또 다른 예로서, EP 1,176,195 (Hanai et al.)은 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이와 같이 이러한 세포주에서 발현된 항체는 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거함으로써 저푸코실화를 나타낸다. 하나이(Hanai) 등은 또한, 항체의 Fc 영역과 결합하거나 또는 효소 활성을 갖지 않는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하기 위한 낮은 효소 활성을 갖는 세포주, 예를 들어 래트 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)를 기재하였다. 대안적으로, 조작된 당형태, 특히 비-푸코실화는 글리코실화 경로 효소의 소분자 억제제를 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Rothman et al. (1989) Mol. Immunol. 26(12):113-1123; Elbein (1991) FASEB J. 5:3055]; PCT/US2009/042610 및 미국 특허 번호 7,700,321 참조). PCT 공개 WO 03/035835는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되고, 또한 이에 의해 해당 숙주 세포에서 발현된 항체가 저푸코실화된 것인 변이체 CHO 세포주, Lec13 세포를 기재한다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO99/54342는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 이와 같이 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이분화 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성이 증가시킨다 (또한, 문헌 [Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).
대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단할 수 있다. 예를 들어, 푸코시다제 알파-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다 (문헌 [Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23]).
본 발명에 의해 고려되는 본원의 항체의 또 다른 변형은 PEG화이다. 예를 들어, 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해, 항체가 PEG화될 수 있다. 항체를 PEG화시키기 위해서는, 이러한 항체 또는 그의 단편을 전형적으로 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 바람직하게는, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행한다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용되는 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 비-글리코실화 항체이다. 단백질의 PEG화 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들어, EP 0154316 및 EP 0401384를 참조한다.
추가 실시양태에서, 예를 들어 진단 또는 검출 목적을 위한 본 발명의 항체의 용도에서, 항체는 표지를 포함할 수 있다. 본원에서 "표지된"은 화합물이 화합물의 검출이 가능하도록 부착된 하나 이상의 성분, 동위원소 또는 화학적 화합물을 갖는다는 것을 의미한다. 일반적으로, 표지는 3가지 부류: a) 방사성 또는 중동위원소일 수 있는 동위원소 표지; b) 자기성, 전기적, 열적; 및 c) 착색 또는 발광 염료로 분류되나, 표지는 또한 효소 및 입자, 예컨대 자기 입자를 포함한다. 바람직한 표지는 형광 란타나이드 복합체 (유로퓸 및 테르븀의 것 포함), 및 형광 표지 (양자 점, 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, 캐스케이드 블루, 텍사스 레드, 알렉사 염료, Cy 염료를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 및 문헌 [Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland]의 제6판 (명백하게 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 다른 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
링커
본 발명은 항체가 화학적 링커를 통해 파트너에 연결된 항체-파트너 접합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티딜 링커이고, 다른 링커는 히드라진 및 디술피드 링커를 포함한다. 파트너에 부착될 링커 뿐만 아니라, 본 개시내용은 또한 본질적으로 임의의 분자 종에 대한 부착에 적절한 절단가능한 링커 아암을 제공한다. 본 발명의 링커 아암 측면은 치료 모이어티에 대한 그의 부착을 언급함으로써 본원에 예시된다. 그러나, 링커가 진단제, 분석 작용제, 생체분자, 표적화제, 검출가능한 표지 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 종에 부착될 수 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다.
항체-파트너 접합체에서의 펩티딜 및 다른 링커의 사용이 미국 특허 가출원 일련 번호 60/295,196; 60/295,259; 60/295342; 60/304,908; 60/572,667; 60/661,174; 60/669,871; 60/720,499; 60/730,804; 및 60/735,657 및 미국 특허 출원 일련 번호 10/160,972; 10/161,234; 11/134,685; 11/134,826; 및 11/398,854 및 미국 특허 번호 6,989,452 및 PCT 특허 출원 번호 PCT/US2006/37793 (이들은 모두 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 추가의 링커는 미국 특허 번호 6,214,345, 미국 특허 출원 2003/0096743 및 미국 특허 출원 2003/0130189, 문헌 [de Groot et al., J. Med. Chem. 42, 5277 (1999); de Groot et al. J. Org. Chem. 43, 3093 (2000); de Groot et al., J. Med. Chem. 66, 8815, (2001)]; WO 02/083180; [Carl et al., J. Med. Chem. Lett. 24, 479, (1981); Dubowchik et al., Bioorg & Med. Chem. Lett. 8, 3347 (1998)]; 및 미국 특허 가출원 일련 번호 60/891,028에 기재되어 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 치료제 및 마커에 표적화 기를 부착시키는데 유용한 링커에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 화합물에 안정성을 부여하거나, 이들의 생체내 독성을 감소시키거나, 또는 다르게는 그의 약동학, 생체이용률 및/또는 약역학에 유리한 영향을 미치는 링커를 제공한다. 일반적으로, 이러한 실시양태에서 약물이 그의 작용 부위로 전달되면, 링커가 절단되어 활성 약물을 방출시키는 것이 바람직하다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 링커는 흔적이 없어, 일단 치료제 또는 마커로부터 (예컨대 활성화 동안) 제거되면 링커 존재의 흔적이 남아있지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 치료 작용 또는 마커 활성 부위와 같은 표적 세포 내의 부위 또는 근처에서 절단될 수 있는 능력을 특징으로 한다. 이러한 절단은 사실상 효소적일 수 있다. 이러한 특징은 치료제 또는 마커의 전신 활성화를 감소시켜, 독성 및 전신 부작용을 감소시키는데 도움을 제공한다. 효소적 절단을 위한 바람직한 절단가능한 기는 펩티드 결합, 에스테르 연결 및 디술피드 연결을 포함한다. 다른 실시양태에서, 링커는 pH에 대해 민감하고, pH 상의 변화를 통해 절단된다.
본 개시내용의 측면은 링커가 절단되는 속도를 제어하는 능력이다. 종종, 신속하게 절단되는 링커가 요망된다. 하지만, 일부 실시양태에서는 보다 서서히 절단되는 링커가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 지속 방출 제제 또는 빠른 방출 성분 및 느린 방출 성분을 둘 다 갖는 제제에서, 보다 서서히 절단되는 링커를 제공하는 것이 유용할 수 있다. WO 02/096910은 히드라진 링커를 갖는 여러 특정한 리간드-약물 복합체를 제공한다. 그러나, 요구되는 고리화의 속도에 따라 링커 조성물을 "조정하는" 방법이 존재하지 않고, 기재된 특정한 화합물은 다수의 약물-링커 접합체에서 바람직한 보다 느린 속도로 리간드를 약물로부터 절단한다. 대조적으로, 본 발명의 히드라진 링커는 매우 빠른 것부터 매우 느린 것까지 소정 범위의 고리화 속도를 제공하고, 이에 의해 고리화의 바람직한 속도에 기초한 특정한 히드라진 링커의 선택이 허용된다.
예를 들어, 매우 빠른 고리화는 절단시에 단일 5-원 고리를 생산하는 히드라진 링커로 달성될 수 있다. 세포독성제의 세포로의 표적화된 전달에 바람직한 고리화 속도는 절단시에 같은자리 위치에 2개의 메틸을 갖는 링커로부터 생성된 2개의 5-원 고리 또는 단일 6-원 고리를 생산하는 히드라진 링커를 사용하여 달성된다. 같은자리-디메틸 효과는 같은자리 위치에서 2개의 메틸 없이 단일 6-원 고리와 비교하여 고리화 반응의 속도를 가속시키는 것으로 밝혀졌다. 이는 고리에서 방출되는 균주로부터 유래한다. 그러나, 때때로 치환기는 반응을 보다 빠르게 하는 것 대신에 반응을 느리게 할 수 있다. 종종 지연에 대한 원인은 입체 장애로 추정될 있다. 예를 들어, 같은자리 디메틸 치환은 같은자리 탄소가 CH2인 경우와 비교하여 보다 더 빠른 고리화 반응이 일어나도록 한다.
그러나, 일부 실시양태에서는 보다 서서히 절단되는 링커가 바람직할 수 있다는 것에 주목하는 것이 중요하다. 예를 들어, 지속 방출 제제 또는 빠른 방출 성분 및 느린 방출되는 성분을 둘 다 갖는 제제에서는, 보다 서서히 절단되는 링커를 제공하는 것이 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 고리화의 느린 속도는 절단시에 같은자리-디메틸 치환 없이 단일 6-원 고리를 생산하거나 또는 단일 7-원 고리를 생산하는 히드라진 링커를 사용하여 달성된다. 링커는 또한 순환 동안 분해에 대해 치료제 또는 마커를 안정시키는 작용을 한다. 이러한 특징은 이러한 안정화가 부착된 치료제 또는 마커의 순환 반감기를 연장시키기 때문에 유의한 이익을 제공한다. 링커는 또한 부착된 치료제 또는 마커의 활성을 감쇠시키는 작용을 하여 접합체가 순환 동안 비교적 유리하고, 원하는 작용 부위에서의 활성화 후에 원하는 효과, 예를 들어 독성을 갖게 된다. 치료제 접합체의 경우, 이러한 링커의 특성은 치료제의 치료 지수를 개선하는 작용을 한다.
안정화 기는 바람직하게는 혈액 또는 비-표적 조직에 존재할 수 있는 효소에 의한 치료제 또는 마커의 제거 및 대사를 제한하기 위해 선택되고, 세포 내로의 치료제 또는 마커의 수송을 제한하기 위해 추가로 선택된다. 안정화 기는 치료제 또는 마커의 분해를 차단하는 작용을 하고, 또한 치료제 또는 마커의 다른 물리적 특성을 제공하는데 작용할 수 있다. 안정화 기는 또한 제제화된 또는 비-제제화된형태로 저장 동안 치료제 또는 마커의 안정성을 개선할 수 있다.
이상적으로, 안정화 기가 2시간 동안 37℃에서 인간 혈액에서 작용제 또는 마커의 저장에 의해 시험될 때 치료제 또는 마커를 분해로부터 보호하는 작용을 한다면 치료제 또는 마커를 안정화시키는데 유용하고, 주어진 검정 조건 하에 인간 혈액에 존재하는 효소에 의해 치료제 또는 마커의 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만 및 보다 더 바람직하게는 2% 미만의 절단을 일으킨다. 본 발명은 또한 이러한 링커를 함유하는 접합체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 질환의 치료, 특히 암 화학요법을 위해 사용될 수 있는 전구약물의 사용에 관한 것이다. 구체적으로, 본원에 기재된 링커의 사용은 유사한 구조의 전구약물에 비해 혈액에서 작용의 높은 특이성, 감소된 독성 및 개선된 안정성을 나타내는 전구약물을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 링커는 파트너 분자 내의 다양한 위치에 존재할 수 있다.
따라서, 예를 들어 혈액계에서 링커의 쇄의 일부로서의 임의의 다양한 기가 결핍된 구축물에 비해 증진된 속도로 생체내에서 절단될 상기 기를 함유할 수 있는 링커가 제공된다. 링커 아암의 치료제 및 진단제와의 접합체가 또한 제공된다. 링커는 치료제의 전구약물 유사체의 형성 및 치료제 또는 진단제의 표적화제, 검출가능한 표지 또는 고체 지지체로의 가역성 연결에 유용하다. 링커는 세포독소를 포함하는 복합체에 혼입될 수 있다.
항체에 대한 전구약물의 부착은 세포독성 약물의 종래의 항체 접합체에 대해 추가의 안전성 이점을 제공할 수 있다. 전구약물의 활성화는 혈장을 비롯하여, 종양 세포 및 여러 정상 조직 둘 다 내에서 에스테라제에 의해 달성될 수 있다. 인간의 적절한 에스테라제 활성의 수준은 마우스에서 관찰되는 것보다는 낮더라도, 래트 및 비-인간 영장류에서 관찰된 것과 매우 유사한 것으로 밝혀졌다. 전구약물의 활성화는 또한 글루쿠로니다제에 의한 절단에 의해 달성될 수 있다. 절단가능한 펩티드, 히드라진, 또는 디술피드 기 뿐만 아니라, 하나 이상의 자기-희생적 링커 기는 임의로 세포독소와 표적화제 사이에 도입된다. 이러한 링커 기는 스페이서 기로서 기재될 수 있고, 2개 이상의 반응성 관능기를 함유할 수도 있다. 전형적으로, 스페이서 기의 한 화학적 관능기는 치료제, 예를 들어 세포독소의 화학적 관능기에 결합하는 반면, 스페이서 기의 다른 화학적 관능기는 표적화제 또는 절단가능한 링커의 화학적 관능기에 결합하는데 사용된다. 스페이서 기의 화학적 관능기의 예는 히드록시, 메르캅토, 카르보닐, 카르복시, 아미노, 케톤 및 메르캅토 기를 포함한다.
자기-희생적 링커는 일반적으로 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 아릴, 치환되거나 치환되지 않은 헤테로아릴, 또는 치환되거나 치환되지 않은 헤테로알킬 기이다. 한 실시양태에서, 알킬 또는 아릴 기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 이들은 또한 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함할 수 있다.
예시적인 스페이서 기는 예를 들어 6-아미노헥산올, 6-메르캅토헥산올, 10-히드록시데칸산, 글리신 및 다른 아미노산, 1,6-헥산디올, β-알라닌, 2-아미노에탄올, 시스테아민 (2-아미노에탄티올), 5-아미노펜탄산, 6-아미노헥산산, 3-말레이미도벤조산, 프탈리드, α-치환된 프탈리드, 카르보닐 기, 아미날 에스테르, 핵산, 펩티드 등을 포함한다.
스페이서는 추가의 분자 질량 및 화학적 관능기를 세포독소-표적화제 복합체내로 도입시키는 작용을 할 수 있다. 일반적으로, 추가의 질량 및 관능성은 혈청 반감기 및 다른 복합체 특성에 영향을 미칠 것이다. 따라서, 스페이서 기를 조심스럽게 선택함으로써, 소정 범위의 혈청 반감기를 갖는 복합체가 생성될 수 있다.
다중 스페이서가 존재하는 경우에, 또한 동일하거나 상이한 스페이서가 사용될 수 있다.
바람직하게는 모이어티를 함유하는 링커를 사용하여 접합체에 증가된 가용성 또는 감소된 응집 특성을 부여하거나 또는 접합체의 가수분해 비율을 변형시키는 추가의 링커 모이어티가 사용될 수 있고, 이러한 링커는 자기 희생적일 필요는 없다. 한 실시양태에서, 링커 모이어티는 치환된 알킬, 치환되지 않은 알킬, 치환된 아릴, 치환되지 않은 아릴, 치환된 헤테로알킬, 또는 치환되지 않은 헤테로알킬 (이들 모두는 직쇄형, 분지형 또는 시클릭일 수 있음)이다. 치환기는 예를 들어 저급 (C1-C6) 알킬, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노 또는 디알킬아미노일 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 비-시클릭 모이어티를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 임의의 양전하 또는 음전하로 하전된 아미노산 중합체, 예컨대 폴리리신 또는 폴리아르기닌을 포함한다. 링커는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티와 같은 중합체를 포함할 수 있다. 추가로 링커는 예를 들어 중합체 성분 및 소형 화학적 모이어티를 둘 다 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 링커는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티를 포함한다.
PEG 부분은 길이가 1 내지 50개의 단위일 수 있다. 바람직하게, PEG는 1-12개의 반복 단위, 보다 바람직하게는 3-12개의 반복 단위, 보다 바람직하게는 2-6개의 반복 단위, 보다 더 바람직하게는 3-5개의 반복 단위, 가장 바람직하게는 4개의 반복 단위를 가질 것이다. 링커는 PEG 모이어티로만 이루어질 수 있거나, 또는 추가의 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 헤테로알킬을 함유할 수도 있다. 복합체의 수 용해도를 증진시키기 위해 모이어티의 일부로서 PEG와 합하는 것이 유용하다. 추가로, PEG 모이어티은 약물을 항체와 접합시키는 동안 일어날 수도 있는 응집 정도를 감소시킨다.
세포독소의 유형, 링커 및 항체에 치료제를 접합시키는 방법의 추가의 논의에 대해, 또한 PCT 공개 WO 2007/059404 (Gangwar et al., 표제 "Cytotoxic Compounds And Conjugates"), 문헌 [Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, CJ. (2001) Adv. Drag Deliv. Rev. 53:247-264] (이들은 각각 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)을 참조한다.
파트너 분자
본 발명은 파트너 분자, 예컨대 세포독소, 약물 (예를 들어, 면역억제제) 또는 방사성독소에 접합된 항체를 포함한다. 이러한 접합체는 또한 본원에서 "면역접합체"로 지칭된다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에게 해로운 (예를 들어, 사멸시키는) 임의의 작용제를 포함한다.
본 개시내용의 파트너 분자의 예는 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브로민화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 그의 유사체 또는 상동체를 포함한다. 파트너 분자의 예는 또한 예를 들어 항대사물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신 (AMC)), 및 항유사분열 작용제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체에 접합될 수 있는 파트너 분자의 다른 바람직한 예는 두오카르마이신, 칼리케아미신, 메이탄신 및 아우리스타틴, 및 그의 유도체를 포함한다. 칼리케아미신 항체 접합체의 예는 상업적으로 입수가능하다 (밀로타르그(Mylotarg)®; 아메리칸 홈 프로덕츠(American Home Products)).
파트너 분자의 바람직한 예는 CC-1065 및 두오카르마이신이다. CC-1065는 업존 캄파니(Upjohn Company)에 의해 1981년에 스트렙토미세스 젤렌시스(Streptomyces zelensis)로부터 최초로 단리되었고 (문헌 [Hanka et al., J. Antibiot. 31: 1211 (1978); Martin et al., J. Antibiot. 33: 902 (1980); Martin et al., J. Antibiot. 34: 1119 (1981)]), 시험관내 및 실험 동물에서 둘 다 강력한 항종양 및 항미생물 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Li et al., Cancer Res. 42: 999 (1982)]). CC-1065는 5'-d(A/GNTTA)-3' 및 5'-d(AAAAA)-3'의 서열 선호도로 소수 그루브 내의 이중-가닥 B-DNA에 결합하고 (문헌 [Swenson et al., Cancer Res. 42: 2821 (1982)]), 분자에 존재하는 그의 CPI 좌측 유닛에 의해 3'-아데닌의 N3 위치를 알킬화시킨다 (문헌 [Hurley et al., Science 226: 843 (1984)]).
그의 강력하고 광범위한 항종양 활성에도 불구하고, CC-1065는 실험 동물에서 지연된 사망을 일으키기 때문에 인간에 사용될 수 없다. CC-1065 및 두오카르마이신의 많은 유사체 및 유도체는 당업계에 공지되어 있다. 이들 많은 화합물의 구조, 합성 및 특성에 관한 조사가 검토되었다. 예를 들어, 문헌 [Boger et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1438 (1996); 및 Boger et al., Chem. Rev. 97: 787 (1997)]을 참조한다. 교와 핫코 고교 캄파니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogya Co., Ltd.)에서의 그룹이 다수의 CC-1065 유도체를 제조하였다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,101,038; 5,641,780; 5,187,186; 5,070,092; 5,703,080; 5,070,092; 5,641,780; 5,101,038; 및 5,084,468; 및 공개된 PCT 출원, WO 96/10405 및 공개된 유럽 출원 0 537 575 A1을 참조한다. 업존 캄파니 (파마시아 업존(Pharmacia Upjohn))는 또한 CC-1065의 유도체를 제조하는 활동을 하고 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,739,350; 4,978,757, 5,332,837 및 4,912,227을 참조한다.
항체 물리적 특성
본 발명의 항체는 항-BST1 항체의 다양한 물리적 특성에 의해 추가로 특성화될 수 있다. 다양한 검정을 이용하여 이들 물리적 특성에 기초한 상이한 부류의 항체를 검출 및/또는 구별할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에서 1개 이상의 글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 가변 영역 내에서 1개 이상의 글리코실화 부위의 존재는 변경된 항원 결합으로 인하여, 항체의 증가된 면역원성 또는 항체의 pK의 변경을 일으킬 수 있다 (문헌 [Marshall et al. (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al. (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al. (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706]). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 함유하는 모티프에서 발생하는 것으로 공지되어 있다. 항체를 절단시켜 Fab를 생성시킨 다음, 퍼아이오데이트 산화와 쉬프(Schiff) 염기 형성을 측정하는 검정을 이용하여 글리코실화에 관하여 시험하는 글리코블롯(glycoblot) 검정을 이용하여 가변 영역 글리코실화를 시험할 수 있다. 대안적으로, Fab로부터 사카라이드를 절단시켜 모노사카라이드를 수득하고, 개별 사카라이드 함량을 분석하는 디오넥스(Dionex) 광 크로마토그래피 (디오넥스-LC)를 이용하여 가변 영역 글리코실화를 시험할 수 있다. 일부 경우에, 가변 영역 글리코실화를 함유하지 않는 항-BST1 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 가변 영역 내에서 글리코실화 모티프를 함유하지 않는 항체를 선택함으로써, 또는 당업계에 널리 공지된 표준 기술을 이용하여 글리코실화 모티프 내에서 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아스파라긴 이성질현상 부위를 함유하지 않는다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트산 효과는 각각, N-G 또는 D-G 서열 상에서 나타날 수 있다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트산 효과는 주쇄 보다는 측쇄 카르복시 말단 외부에 꼬임 구조를 만들어 항체의 안정성을 감소시키는 이소아스파르트산의 발생을 일으킨다. 이소아스파르트산의 생성은 이소-정량적 검정을 이용하여 측정될 수 있는데, 이는 역상 HPLC를 이용하여 이소아스파르트산을 시험한다.
각각의 항체는 고유의 등전점 (pI)을 가질 것이나, 일반적으로 항체는 6 내지 9.5의 pH 범위에 해당한다. IgG1 항체에 대한 pI는 전형적으로 7-9.5의 pH 범위에 해당하고, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로 6-8의 pH 범위에 해당한다. 항체는 이러한 범위를 벗어나는 pI를 가질 수 있다. 이들 효과가 전반적으로 공지되어 있지는 않지만, 정상 범위를 벗어나는 pI를 갖는 항체는 생체내 조건 하에 상당한 언폴딩 및 불안정성을 가질 것으로 추측된다. 등전점은 pH 구배를 발생시키는 모세관 등전점 포커싱 검정을 이용하여 시험될 수 있으며, 증가된 정확도를 위해 레이저 포커싱을 이용할 수 있다 (문헌 [Janini et al. (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al. (1998) J Chromatogr A 800:355-67]). 일부 경우에, 정상 범위에 들어가는 pI 값을 함유하는 항-BST1 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 정상 범위의 pI를 갖는 항체를 선택함으로써, 또는 당업계에 널리 공지된 표준 기술을 이용하여 하전 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
각각의 항체는 열 안정성을 나타내는 용융 온도를 가질 것이다 (문헌 [Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71]). 보다 높은 열 안정성은 생체내에서 보다 큰 전체 항체 안정성을 나타낸다. 항체의 융점은 시차 주사 열량측정법과 같은 기술을 이용하여 측정할 수 있다 (문헌 [Chen et al. (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al. (1999) Immunol Lett 68:47-52]). TM1은 항체의 초기 언폴딩 온도를 나타낸다. TM2는 항체의 완전한 언폴딩 온도를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명의 항체의 TM1이 60℃ 초과, 바람직하게는 65℃ 초과, 보다 더 바람직하게는 70℃를 초과하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 항체의 열 안정성은 원편광 이색성을 이용하여 측정할 수 있다 (문헌 [Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9]).
바람직한 실시양태에서, 신속하게 분해되지 않는 항체가 선택된다. 항-BST1 항체의 단편화는 당업계에서 널리 이해되는 바와 같이 모세관 전기영동 (CE) 및 MALDI-MS를 이용하여 측정할 수 있다 (문헌 [Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal. Chem. 67:3626-32]).
또 다른 바람직한 실시양태에서, 최소 응집 효과를 갖는 항체가 선택된다. 응집은 원치 않는 면역 반응 및/또는 변경되거나 바람직하지 않은 약동학적 특성의 촉발로 이어질 수 있다. 일반적으로, 응집이 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 보다 더 바람직하게는 15% 이하, 보다 더 바람직하게는 10% 이하, 보다 더 바람직하게는 5% 이하인 항체가 허용된다. 응집은 크기-배제 칼럼 (SEC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 및 단량체, 이량체, 삼량체 또는 다량체를 확인하기 위한 광 산란을 비롯한, 당업계에 널리 공지된 여러 기술에 의해 측정될 수 있다.
항체의 조작 방법
상기 논의된 바와 같이, 본원에 개시된 VH 및 VK 서열을 갖는 항-BST1 항체는 VH 및/또는 VK 서열, 또는 이들에 부착된 불변 영역(들)을 변형함으로써 신규한 항-BST1 항체를 제작하는데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 항-BST1 항체, 예를 들어 BST1_A2, BST1_A1 또는 BST1_A3의 구조적 특징은 본 발명의 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 인간 BST1에 대한 결합을 보유하는 구조적으로 관련된 항-BST1 항체를 생성하는데 사용된다. 예를 들어, BST1_A2, BST1_A1 또는 BST1_A3의 하나 이상의 CDR 영역 또는 그의 돌연변이는 공지의 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어, 상기 논의된 바와 같이 추가의 재조합적으로-조작된 본 발명의 항-BST1 항체를 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 이전 섹션에 기재된 것들을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에 제공된 VH 및/또는 VK 서열 중의 하나 이상, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에서 제공되는 하나 이상의 VH 및/또는 VK 서열 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할 (즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 오히려, 이들 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 본래의 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 제작한 다음, 이러한 "제2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) 서열 10, 9 및 56으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 12 또는 51, 11 및 57로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열 14, 13 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열 16, 15 및 59로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 18, 17 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열 및/또는 서열 20, 19 및 61로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하는 것, 상기 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 상기 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경하여 하나 이상의 변경된 항체 서열을 생성하는 것; 및 변경된 항체 서열을 단백질로 발현시키는 것을 포함하는, 항-BST1 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다.
바람직하게는, 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩되는 항체는 본원에 기재된 항-BST1 항체의 하나, 일부 또는 모든 기능적 특성을 보유하는 것이며, 상기 기능적 특성은 (a) 1x10-7 M 이하의 KD로 인간 BST1에 결합하는 것; (b) BST1로 형질감염된 인간 CHO 세포에 결합하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
변경된 항체의 기능적 특성은 당업계에서 이용가능하고/거나 본원에 기재된 표준 검정, 예를 들어 실시예에 기재된 것 (예를 들어, 유동 세포측정법, 결합 검정)을 이용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 항체의 조작 방법의 특정 실시양태에서, 돌연변이는 항-BST1 항체 코딩 서열의 전체 또는 일부를 따라 무작위적으로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 항-BST1 항체는 결합 활성 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 02/092780은 포화 돌연변이유발, 합성 라이게이션 어셈블리, 또는 그의 조합을 이용하여 항체 돌연변이를 제작하고 스크리닝하는 방법을 기재한다. 대안적으로, PCT 공개 WO 03/074679는 항체의 생리화학적 특성을 최적화하는 전산 스크리닝 방법을 이용하는 방법을 기재한다.
본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전세포 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 표준 기술, 예를 들어 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계 공지의 기타 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포성 핵산 또는 단백질로부터 정제된 경우에 "단리"되거나 "실질적으로 순수한" 상태이다. 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, N. Y]을 참조한다. 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 포함하거나 그렇지 않을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 수득할 수 있다. 하이브리도마에 의해 발현되는 항체의 경우에, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득할 수 있다. 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득한 항체의 경우에 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 이용하는 경우), 이러한 항체를 코딩하는 핵산을 상기 라이브러리로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 BST1_A2, BST1_A1 또는 BST1_A3 모노클로날 항체의 VH 및 VK 서열을 코딩하는 것이다. BST1_A2, BST1_A1 또는 BST1_A3의 VH 서열을 코딩하는 DNA 서열은 각각 서열 6, 5 및 54로 나타낸다. BST1_A2, BST1_A1 또는 BST1_A3의 VK 서열을 코딩하는 DNA 서열은 각각 서열 8, 7 및 55로 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 핵산은 서열 6, 5, 8, 7, 54 및 55로 나타낸 서열 중 하나와 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산으로, 이들 핵산은 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩한다.
2개의 핵산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 이들 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되는 갭의 수와 각 갭의 길이를 고려하여, 서열 내에서 뉴클레오티드가 동일한 위치의 수이다. 서열의 비교와 2개의 서열 사이에 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘, 예컨대 마이어스 및 밀러의 알고리즘 또는 상기 기재된 알츠슐(Altschul)의 XBLAST 프로그램을 이용하여 달성될 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 바람직한 핵산은 서열 6, 5, 8, 7, 54 및 55로 나타낸 핵산 서열의 하나 이상의 CDR-코딩 부분을 포함한다. 이 실시양태에서, 핵산은 BST1_A2, BST1_A1 또는 BST1_A3의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열을 코딩할 수 있다.
서열 6, 5, 8, 7, 54 및 55의 이러한 CDR-코딩 부분 (VH 및 VK 서열)과 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 역시 본 발명의 바람직한 핵산이다. 이러한 핵산은 비-CDR 코딩 영역 및/또는 CDR-코딩 영역 내에서 서열 6, 5, 8, 7, 54 및 55의 상응하는 부분과 상이할 수 있다. 이러한 차이가 CDR-코딩 영역 내에 존재하는 경우에, 핵산에 의해 코딩된 핵산 CDR 영역은 전형적으로 BST1_A2, BST1_A1 또는 BST1_A3의 상응하는 CDR 서열과 비교하여 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 보존적 서열 변형을 포함한다.
일단 VH 및 VK 절편을 코딩하는 DNA 단편이 수득되면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이러한 조작에서, VK- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 또 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 이와 관련하여 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 인-프레임으로 유지되도록 이들 2개의 DNA 단편을 연결하는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 뮤린 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우에, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL / VK 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 뮤린 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL / VK-코딩 DNA 단편은 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결되어, VH 및 VL / VK 서열이 인접한 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 하고, 여기서 VL / VK 및 VH 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554] 참조).
모 노클로날 항체의 생산
본 발명에 따른 BST1 또는 그의 단편 또는 유도체는 이러한 면역원에 면역특이적으로 결합하는 항체를 생성하기 위해 면역원으로 사용될 수 있다. 이러한 면역원은 임의의 편리한 수단에 의해 단리될 수 있다. 당업자는 다수의 절차가 항체의 생성에 이용가능하다는 것을 인식할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Cold Spring Harbor, N.Y]에 기재됨). 당업자는 또한 항체를 모방하는 결합 단편 또는 Fab 단편이 다양한 절차에 의해 유전자 정보로부터 제조될 수 있다는 것을 인지할 것이다 (문헌 [Antibody Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C., ed.), 1995, Oxford University Press, Oxford; J. Immunol. 149, 3914-3920 (1992)]).
본 발명의 한 실시양태에서, BST1의 특정한 도메인에 대한 항체는 생산된다. 특정 실시양태에서, BST1의 친수성 단편이 항체 생산을 위한 면역원으로 사용된다.
항체의 생산에서, 바람직한 항체에 대한 스크리닝은 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 ELISA (효소-연결 면역흡착 검정)에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, BST1의 특정 도메인을 인식하는 항체를 선택하기 위해, 이러한 도메인을 함유하는 BST1 단편에 결합하는 생성물에 대해 생성된 하이브리도마를 검정할 수 있다. 제1 BST1 상동체에 특이적으로 결합하지만, 제2 BST1 상동체에 특이적으로 결합하지 않는 (또는 덜 단단하게 결합하는) 항체를 선택하기 위해, 제1 BST1 상동체에 대한 양성 결합 및 제2 BST1 상동체에 대한 결합의 결핍 (또는 감소된 결합)에 기초하여 선택할 수 있다. 유사하게, BST1에 특이적으로 결합하지만, 동일한 단백질의 상이한 이소형 (예컨대, BST1과 동일한 코어 펩티드를 갖는 상이한 당형태)에 특이적으로 결합하지 않는 (또는 덜 단단하게 결합하는) 항체를 선별하기 위해, BST1에 대한 양성 결합 및 상이한 이소형 (예를 들어, 상이한 당형태)에 대한 결합의 결핍 (또는 감소된 결합)에 기초하여 선별할 수 있다. 따라서, 본 발명은 BST1의 상이한 이소형 또는 이소형들 (예를 들어, 당형태)에 대해서보다 BST1에 대해 더 큰 친화도 (예를 들어, 적어도 2배, 예컨대 적어도 5배, 특히 적어도 10배 더 큰 친화도)로 결합하는 항체 (예컨대, 모노클로날 항체)를 제공한다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 폴리클로날 항체는 면역화된 동물의 혈청으로부터 유래된 항체 분자의 비균질 집단이다. 분획화되지 않은 면역 혈청이 또한 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 절차가 BST1, BST1의 단편, BST1-관련 폴리펩티드, 또는 BST1-관련 폴리펩티드의 단편에 대한 폴리클로날 항체의 생성에 사용될 수 있다. 예를 들어, 한가지 방식은 관심있는 폴리펩티드를 정제하는 것 또는 예를 들어 당업계에 널리 공지된 고체 상 펩티드 합성 방법을 이용하여 관심있는 폴리펩티드를 합성하는 것이다. 예를 들어, 문헌 [Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol. Vol 182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields ed., Meth. Enzymol. Vol 289 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 38: 1192-99, 1990; Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1: 255-60, 1995; Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 44: 1326-31, 1996]을 참조한다. 이어서, 선택된 폴리펩티드를 사용하여 다양한 숙주 동물 (토끼, 마우스, 래트 등을 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 주사에 의해 면역화시킴으로써 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생성할 수 있다. 완전 또는 불완전 프로인트 아주반트, 미네랄 겔, 예컨대 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 아주반트, 예컨대 BCG (바실 칼메트-게랑(bacille Calmette-Guerin)) 또는 코리네박테리움 파르붐(corynebacterium parvum)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 아주반트 (즉, 면역자극제)를 사용하여 숙주 종에 따라 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 추가의 아주반트가 또한 당업계에 널리 공지되어 있다.
BST1에 대해 지시된 모노클로날 항체 (mAb)의 제조를 위해, 배양물에서 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기술을 이용할 수 있다. 예를 들어, 쾰러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein) (문헌 [1975, Nature 256:495-497])에 의해 처음 개발된 하이브리도마 기술 뿐만 아니라 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (문헌 [Kozbor et al. (1983) Immunology Today 4:72]) 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술 (문헌 [Cole et al. (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96])이 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 그의 임의의 하위부류를 포함하는 임의의 이뮤노글로불린 부류일 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 시험관내에서 또는 생체내에서 배양할 수 있다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 모노클로날 항체는 공지된 기술을 이용하여 배-무함유 동물에서 생산될 수 있다 (PCT/US90/02545, 본원에 참고로 포함됨).
하이브리도마를 제조하는데 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 매우 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위해 면역화된 비장세포를 단리하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 공지되어 있다.
모노클로날 항체는 인간 모노클로날 항체 및 키메라 모노클로날 항체 (예를 들어, 인간-마우스 키메라)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 비-인간 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA를 관심 비-인간 하이브리도마로부터 수득하고 이를 조작하여 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하게 할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 창출하기 위해서는, 뮤린 가변 영역을 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.)).
완전 인간 항체는 내인성 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현시킬 수 없지만 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현시킬 수 있는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스를 사용하여 생산할 수 있다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예를 들어 BST1의 전부 또는 일부로 정상적 방식으로 면역화된다. 항원에 대해 지시되는 모노클로날 항체는 통상의 하이브리도마 기술을 이용하여 수득할 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 의해 정착된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진은 B 세포 분화 동안 재배열되고, 연속해서 부류 전환과 체세포 돌연변이를 진행한다. 따라서, 이러한 기술을 이용하여 치료상 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 HuMAb 마우스® (메다렉스®, 인크.(Medarex®, Inc.)) 및 KM 마우스® 계통의 마우스를 포함한다. HuMAb 마우스® 계통 (메다렉스®, 인크.)은 문헌 [Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)]에 기재되어 있다. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 상기 기술 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜의 상세한 논의에 대해, 예를 들어 미국 특허 5,625,126; 미국 특허 5,633,425; 미국 특허 5,569,825; 미국 특허 5,661,016; 및 미국 특허 5,545,806을 참조한다. KM 마우스® 주는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 마우스를 나타내고, PCT 공개 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 상세하게 기재되어 있다.
또한 추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스제닉 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 항-BST1 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스 (암젠, 인크.(Amgen, Inc.))로 지칭되는 대안적 트랜스제닉 시스템이 이용될 수 있고; 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체는 "가이드 선택"으로 지칭되는 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 접근법에서, 선택된 비-인간 모노클로날 항체, 예를 들어 마우스 항체를 사용하여 동일한 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체의 선택을 안내할 수 있다 (문헌 [Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899-903]).
또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스크로모소믹 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 항-BST1 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"라고 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜 둘 다를 보유하는 마우스를 사용할 수 있고, 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 추가로, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 소가 당업계 (문헌 [Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894]) 및 PCT 공개 번호 WO2002/092812에 기재되어 있고, 항-BST1 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 면역 세포를 재구축한 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수 있는데, 이에 의해 면역화시에 인간 항체 반응이 발생할 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,994 및 3,698,767에 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 선택된 표적에 대한 결합을 위한 폴리펩티드의 라이브러리를 생산 및 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 기술을 이용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-82, 1990; Devlin et al., Science 249, 404-6, 1990, Scott and Smith, Science 249, 386-88, 1990]; 및 미국 특허 번호 5,571,698 (Ladner et al.) 참조). 파지 디스플레이 방법의 기본 개념은 스크리닝될 폴리펩티드를 코딩하는 DNA와 폴리펩티드 사이의 물리적 회합의 확립이다. 이 물리적 회합은 파지 입자에 의해 제공하고, 이는 폴리펩티드를 코딩하는 파지 게놈을 둘러싸는 캡시드의 일부로서 폴리펩티드를 디스플레이한다. 폴리펩티드와 그의 유전자 물질 사이의 물리적 회합의 확립은 상이한 폴리펩티드를 보유하는 매우 많은 수의 파지의 동시 대규모 스크리닝을 허용한다. 표적에 대해 친화도를 갖는 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지는 표적에 결합하고, 이들 파지는 표적에 대한 친화도 스크리닝에 의해 풍부화된다. 이러한 파지로부터 디스플레이된 폴리펩티드의 동일성은 이들의 각각의 게놈으로부터 결정될 수 있다. 이어서, 이러한 방법을 이용하여 원하는 표적에 대해 결합 친화도를 갖는 것으로 확인된 폴리펩티드를 통상적인 수단에 의해 대량 합성할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,057,098 (모든 표, 도면 및 특허청구범위를 포함한 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)을 참조한다. 특히, 이러한 파지를 사용하여 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리 (예를 들어, 인간 또는 뮤린)로부터 발현된 항원 결합 도메인을 디스플레이할 수 있다. 관심 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지를 항원으로, 예를 들어 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합 또는 포획된 항원을 사용하여 선택 또는 확인할 수 있다. 이러한 방법에서 사용되는 파지는 전형적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된, Fab, Fv 또는 디술피드 안정화된 Fv 항체 도메인을 함유한 파지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 필라멘트형 파지이다. 본 발명의 항체의 제조에 이용될 수 있는 파지 디스플레이 방법은 문헌 [Brinkman et al. (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al. (1997) Gene 187 9-18; Burton et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280]; PCT 출원 번호 PCT/GB91/01134; PCT 공개 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 번호 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108 (각각 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 것을 포함한다
상기 참고문헌에 기재된 바와 같이, 파지 선택 후에, 파지로부터의 항체 코딩 영역을 단리하고, 이를 인간 항체를 비롯한 전체 항체 또는 임의의 다른 바람직한 항원 결합 단편을 생성하는데 사용하고, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 비롯한 임의의 바람직한 숙주에서 발현시킬 수 있다 (예를 들어, 하기 상세하게 기재되어 있음). 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생산하기 위한 기술은 또한 당업계에 공지된 방법, 예컨대 PCT 공개 WO 92/22324; 문헌 [Mullinax et al. (1992) BioTechniques 12(6):864-869; 및 Sawai et al. (1995) AJRI 34:26-34; 및 Better et al. (1988) Science 240:1041-1043] (상기 참고문헌은 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 방법을 이용하여 이용될 수 있다.
단일-쇄 Fv 및 항체를 생산하는데 이용될 수 있는 기술의 예는 미국 특허 4,946,778 및 5,258,498; 문헌 [Huston et al. (1991), Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al. (1993) PNAS 90:7995-7999; 및 Skerra et al. (1988) Science 240:1038-1040]에 기재된 것을 포함한다.
본 발명은 항-BST1 이뮤노글로불린 분자의 기능적 활성 단편, 유도체 또는 유사체를 제공한다. 기능적 활성은 단편, 유도체 또는 유사체가 단편, 유도체 또는 유사체가 유래되는 항체에 의해 인식되는 동일한 항원을 인식하는 항-항-이디오타입 항체 (즉, 3차 항체)를 유도할 수 있다는 것을 의미한다. 특히, 특정한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 분자의 이디오타입의 항원성은 항원을 프레임워크 및 특이적으로 인식하는 CDR 서열에 대해 C-말단인 CDR 서열의 결실에 의해 증진될 수 있다. 어느 CDR 서열이 항원에 결합하는지를 결정하기 위해, CDR 서열을 함유하는 합성 펩티드를 당업계에 공지된 임의의 결합 검정 방법에 의해 항원을 사용하는 결합 검정에 사용할 수 있다.
본 발명은 항체 단편, 예컨대 F(ab')2 단편 및 Fab 단편 (이에 제한되지는 않음)을 제공한다. 특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인으로 이루어지고, 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성된다. Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디술피드 가교를 환원시킴으로써 생성된다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄 이량체, 또는 임의의 그의 최소 단편, 예컨대 Fv 또는 단일 쇄 항체 (SCA) (예를 들어, 미국 특허 4,946,778; 문헌 [Bird, (1988) Science 242:423-42; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; 및 Ward et al. (1989) Nature 334:544-5]에 기재된 바와 같음), 또는 본 발명의 항체와 동일한 특이성을 갖는 임의의 다른 분자를 제공한다. 단일 쇄 항체는 아미노산 가교를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결하여 단일 쇄 폴리펩티드를 생성함으로써 형성된다. 이. 콜라이(E. coli)에서의 기능적 Fv 단편의 어셈블리를 위한 기술이 사용될 수 있다 (문헌 [Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041]).
다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 이뮤노글로불린의 융합 단백질 (또는 그의 기능적 활성 단편)을 제공하며, 여기서 예를 들어 이뮤노글로불린은 이뮤노글로불린이 아닌 또 다른 단백질의 아미노산 서열 (또는 그의 부분, 바람직하게는 단백질의 적어도 10, 20 또는 50개 아미노산 부분)에 N-말단 또는 C-말단에서 공유 결합 (예를 들어, 펩티드 결합)을 통해 융합된다. 바람직하게는, 이뮤노글로불린 또는 그의 단편은 불변 도메인의 N-말단에서 다른 단백질에 공유 결합에 의해 연결된다. 상기 언급된 바와 같이, 이러한 융합 단백질은 정제를 용이하게 하고, 생체내 반감기를 증가시키고, 상피 장벽을 통한 면역계로의 항원의 전달을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 이뮤노글로불린은 공유 부착이 면역특이적 결합을 손상시키지 않는 한, 즉 임의의 유형의 분자의 이러한 공유 부착에 의해 변형된 유사체 및 유도체를 포함한다. 예를 들어, 이뮤노글로불린의 유도체 및 유사체는 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해 추가로 변형된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 임의의 다수의 화학적 변형은 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 유사체 또는 유도체는 하나 이상의 비-고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
마우스의 면역화
마우스는 BST1 항원 및/또는 재조합 BST1의 정제된 또는 풍부화된 제제, 또는 BST1을 발현하는 세포로 면역화될 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 제1 주입시 6-16주령일 것이다. 예를 들어, BST1 항원의 정제된 또는 재조합 제제 (100 μg)를 사용하여 마우스를 복강내 면역화시킬 수 있다.
다양한 항원을 사용한 누적된 경험은 완전 프로인트 아주반트 중 항원으로 복강내 (IP) 면역화된 경우에 마우스가 반응한다는 것을 보여준다. 그러나, 프로인트 이외의 아주반트도 효과적인 것으로 밝혀졌다. 또한, 아주반트 부재 하의 전세포가 고도로 면역원성인 것으로 밝혀졌다. 면역 반응은 후안와동 채혈에 의해 수득될 혈장 샘플로 면역화 프로토콜 과정에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 혈장은 만족스러운 역가에 대해 시험하기 위해 ELISA (하기 기재된 바와 같음)에 의해 스크리닝될 수 있다. 마우스를 항원으로 3일 연속 정맥내 부스팅하고, 5일 후에 안락사시켜 비장을 분리할 수 있다. 한 실시양태에서, A/J 마우스 계통 (잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories), 메인주 바 하버)이 사용될 수 있다.
모 노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
본 발명의 항체는 예를 들어, 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]).
예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝 또는 PCR 증폭)에 의해 수득할 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이들의 의도된 기능을 수행하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션되는 것을 의미하도록 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용가능한 것을 선택한다.
숙주 세포를 본 발명의 2가지 발현 벡터로 공-형질감염시킬 수 있는데, 제1 벡터는 중쇄 유래된 폴리펩티드를 코딩하고 제2 벡터는 경쇄 유래된 폴리펩티드를 코딩한다. 이들 2가지 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 등가 발현시켜 줄 수 있는 동일한 선택성 마커를 함유할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다를 코딩하는 단일 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 상황 하에, 경쇄를 중쇄 앞에 위치시켜 과량의 독성 무함유 중쇄를 피해야 한다 (문헌 [Proudfoot (1986) Nature 322:52; Kohler (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197]). 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
항체 유전자를 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은, VH 절편이 벡터 내에서 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 VK 절편이 벡터 내에서 CL 절편에 작동가능하게 연결되도록 이들을 이미 원하는 이소형의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 제작하기 위해 사용될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 쇄 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자를 벡터 내로 클로닝하여 신호 펩티드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 인-프레임으로 연결되도록 할 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자 뿐만 아니라, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유하고 있다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다. 당업자는 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 설계가 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있음을 인지할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열은 포유동물 세포 내 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 성분, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비-바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 추가로, 조절 요소는 SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복부로부터의 서열을 함유하는 SRα 프로모터 시스템과 같은 상이한 공급원으로부터의 서열들로 구성된다 (문헌 [Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472]).
항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두 Axel et al.) 참조). 예를 들어, 전형적으로, 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택가능한 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위한 것) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위한 것)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는데 일반적으로 이용되는 광범위하게 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 의도된다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론상 가능하긴 하지만, 항체를 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 발현시키는 것이 가장 바람직한데, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비하는데 있어서 원핵 세포보다 더 적합하기 때문이다. 항체 유전자의 원핵세포 발현은 활성 항체의 고수율 생산을 위해 비효과적인 것으로 보고되었다 (문헌 [Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13]).
본 발명의 재조합 항체를 발현하기에 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) (벡터, 예컨대 인간 시토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 성분과 함께 사용됨 (문헌 [Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al. (1990) BioTechnology 8:2]), dhfr-CHO 세포 (문헌 [Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재됨, DHFR 선택가능한 마커와 함께 사용됨 (예를 들어, 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같음)), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포를 사용하는 경우에, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462 (Wilson), WO 89/01036 (Bebbington)) 및 EP 338,841 (Bebbington)에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다.
다양한 숙주 발현 벡터 시스템을 활용하여 본 발명의 항체 분자를 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열을 생산한 다음 후속 정제시킬 수 있는 비히클을 나타낼 뿐만 아니라 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염시킨 경우에, 계내에서 본 발명의 항체 분자를 발현시킬 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 미생물, 예컨대 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이, 비. 서브틸리스(B. subtilis)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus, CaMV); 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유동물 세포 시스템 (예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
박테리아 시스템에서, 발현될 항체 분자에 대해 의도된 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 많은 양의 이러한 단백질이 생산되어야 하는 경우에, 항체 분자를 포함하는 제약 조성물의 제조를 위해, 용이하게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 이. 콜라이 발현 벡터 pUR278 (문헌 [Ruther et al. (1983) EMBO J. 2:1791]) (여기서, 항체 코딩 서열은 융합 단백질이 생산되도록 lac Z 코딩 영역을 갖는 벡터로 인 프레임으로 개별적으로 라이게이션될 수 있음); pIN 벡터 (문헌 [Inouye & Inouye (1985) Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster (1989) J. Biol. Chem. 24:5503-5509])를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 유사한 pGEX 벡터가 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드에 대한 흡착 및 결합에 이어 유리 글루타티온의 존재 하의 용리에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.
곤충 시스템에서는, 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다면증 바이러스 (AcNPV)를 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용한다. 이 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열을 바이러스의 비-필수 영역 (예를 들어, 폴리헤드린 유전자) 내로 개별적으로 클로닝시키고, AcNPV 프로모터 (예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 놓아둘 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템 (예를 들어, 아데노바이러스 발현 시스템)을 활용할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 또는 유전자 산물을 원하는 특이적 방식으로 변형시키고 프로세싱하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 이러한 단백질 생성물의 변형 (예를 들어, 글리코실화) 및 프로세싱 (예를 들어, 절단)는 단백질의 기능에 중요할 수 있다.
재조합 항체의 장기간 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 관심 항체를 안정하게 발현하는 세포주는 항체의 뉴클레오티드 서열 및 선택가능한 것 (예를 들어, 네오마이신 또는 히그로마이신)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 세포를 형질감염시키고, 선택가능한 마커의 발현에 대해 선택함으로써 생산될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 특히 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에 유용할 수 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가시킬 수 있다 (검토를 위해, 문헌 [Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)] 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭가능한 경우에, 숙주 세포 배양물에 존재하는 억제제의 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자와 연관되기 때문에, 항체의 생산 또한 증가할 것이다 (문헌 [Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257]).
항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포 내로 도입할 때, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하기 위해, 또는 보다 바람직하게는 숙주 세포를 성장시키는 배양 배지 내로 항체의 분비를 허용하기 위해 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산한다. 본 발명의 항체 분자가 재조합적으로 발현되면, 이는 항체 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 예컨대 단백질 A 또는 특이적 항원에 대한 친화성 크로마토그래피, 및 크기결정 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 시차 용해도, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다.
대안적으로, 임의의 융합 단백질은 발현될 융합 단백질에 특이적인 항체를 사용함으로써 용이하게 정제될 수 있다. 예를 들어, 얀크네히트(Janknecht) 등에 의해 기재된 시스템은 인간 세포주에서 발현되는 비-변성 융합 단백질의 용이한 정제를 허용한다 (문헌 [Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897]). 이 시스템에서, 관심 유전자를 백시니아 재조합 플라스미드에 서브클로닝하여 유전자의 오픈 리딩 프레임이 6개의 히스티딘 잔기로 이루어진 아미노-말단 태그에 번역물로 융합되도록 한다. 태그는 융합 단백질에 대한 매트릭스 결합 도메인의 역할을 한다. 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 세포로부터의 추출물을 Ni2 + 니트릴로아세트산-아가로스 칼럼 상에 로딩하고, 히스티딘-태그 부착된 단백질을 이미다졸-함유 완충제로 선택적으로 용리한다.
항원에 대한 항체 결합의 특성화
이러한 방법에 의해 생성된 항체는 이어서 우선 관심있는 정제된 폴리펩티드로 친화도 및 특이성에 대해 스크리닝하고, 필요한 경우에 결합에서 제외되는 것이 바람직한 폴리펩티드를 사용한 항체의 친화도 및 특이성에 대한 결과를 비교함으로써 선택될 수 있다. 항체는 예를 들어 표준 ELISA에 의해 BST1에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 스크리닝 절차는 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰에서의 정제된 폴리펩티드의 고정화를 포함할 수 있다. 이어서, 잠재적 항체 또는 항체의 군을 함유하는 용액을 각각의 마이크로타이터 웰에 배치하고, 약 30분 내지 2시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 마이크로타이터 웰을 세척하고, 표지된 2차 항체 (예를 들어, 상승된 항체가 마우스 항체인 경우에 알칼리성 포스파타제에 접합된 항-마우스 항체)를 웰에 첨가하고, 약 30분 동안 인큐베이션한 후에 세척한다. 기질을 웰에 첨가하고, 색 반응은 고정된 폴리펩티드(들)에 대한 항체가 존재하는 경우에 나타날 것이다.
이와 같이 확인된 항체는 이어서 선택된 검정 설계에서 친화도 및 특이성에 대해 추가로 분석될 수 있다. 표적 단백질에 대한 면역검정의 개발에서, 정제된 표적 단백질은 선택된 항체를 사용하는 면역검정의 감수성 및 특이성을 판단하기 위한 표준으로서의 역할을 한다. 다양한 항체의 결합 친화도가 상이할 수 있기 때문에; 특정 항체 쌍 (예를 들어, 샌드위치 검정에서)은 서로 입체적으로 등으로 방해할 수 있고, 항체의 검정 성능은 항체의 절대 친화도 및 특이성보다 더 중요한 척도일 수 있다.
당업자는 다수의 접근법이 항체 또는 결합 단편을 생산하고, 다양한 폴리펩티드에 대한 친화도 및 특이성에 대해 스크리닝하고 선택하기 위해 취해질 수 있다는 것을 인지할 것이나, 이들 접근법은 본 발명의 범위를 변화시키지 않는다.
선택된 항-BST1 모노클로날 항체가 특유의 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 각각의 항체를 상업적으로 입수가능한 시약 (피어스(Pierce), 일리노이주 록포드)을 사용하여 비오티닐화할 수 있다. 비표지 모노클로날 항체 및 비오티닐화 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁 연구는 BST1 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다. 비오티닐화 mAb 결합은 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로 검출할 수 있다.
정제된 항체의 이소형을 결정하기 위해, 특정한 이소형의 항체에 특이적인 시약을 사용하여 이소형 ELISA를 수행할 수 있다.
항-BST1 항체는 웨스턴 블롯팅에 의해 BST1 항원과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간략하게, BST1을 제조하고, 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 처리할 수 있다. 전기영동 후에, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 10% 태아 소 혈청으로 차단하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙한다.
본 발명의 항체의 결합 특이성은 또한, 예를 들어 유동 세포측정법에 의해 BST1을 발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 모니터링함으로써 결정할 수 있다. 전형적으로, 세포주, 예컨대 CHO 세포주를 BST1을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 형질감염된 단백질은 태그에 대한 항체를 사용하여 검출하기 위해, 바람직하게는 N-말단에 태그, 예컨대 myc-태그를 포함할 수 있다. BST1에 대한 본 발명의 항체의 결합은 형질감염된 세포를 항체와 인큐베이션하고, 결합된 항체를 검출함으로써 결정될 수 있다. 형질감염된 단백질 상의 태그에 대한 항체의 결합을 양성 대조군으로서 사용할 수 있다.
BST1에 대한 본 발명의 항체의 특이성은 BST1에 대한 결합을 결정하는 동일한 방법을 이용하여 항체가 다른 단백질, 예컨대 Eph 부류의 다른 구성원에 결합하는지 여부를 결정함으로써 추가로 연구할 수 있다.
면역접합체
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 모이어티, 예컨대 세포독소, 약물 (예를 들어 면역억제제) 또는 방사성독소에 접합된 항-BST1항체, 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 상기 접합체는 본원에서 "면역접합체"로 지칭된다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에게 해로운 (예를 들어, 사멸시키는) 임의의 작용제를 포함한다. 예는 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브로민화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 그의 유사체 또는 상동체를 포함한다. 치료제는, 예를 들어 항대사물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 또한 포함한다.
본 발명의 항체에 접합될 수 있는 치료 세포독소의 다른 바람직한 예는 두오카르마이신, 칼리케아미신, 메이탄신 및 아우리스타틴, 및 그의 유도체를 포함한다. 칼리케아미신 항체 접합체의 예는 상업적으로 입수가능하다 (밀로타르그®; 아메리칸 홈 프로덕츠).
세포독소는 당업계에서 이용가능한 링커 기술을 이용하여 본 발명의 항체에 접합시킬 수 있다. 세포독소를 항체에 접합시키는데 사용되는 링커 유형의 예는 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드-함유 링커를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 리소솜 구획 내의 낮은 pH에 의한 절단에 감수성이거나 또는 프로테아제, 예컨대 종양 조직에서 우세하게 발현되는 프로테아제, 예컨대 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B, C, D)에 의한 절단에 감수성인 링커가 선택될 수 있다.
세포독소의 예는 예를 들어 미국 특허 번호 6,989,452, 7,087,600, 및 7,129,261, 및 PCT 출원 번호 PCT/US2002/17210, PCT/US2005/017804, PCT/US2006/37793, PCT/US2006/060050, PCT/US2006/060711, WO2006/110476, 및 미국 특허 출원 번호 60/891,028 (이들은 모두 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 세포독소의 유형, 링커 및 항체에 치료제를 접합시키는 방법의 추가의 논의에 대해, 또한 문헌 [Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. 및 Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264]을 참조한다.
본 발명의 항체는 또한 방사성면역접합체로도 지칭되는 세포독성 방사성제약을 생성하기 위해 방사성 동위원소에 접합될 수 있다. 진단 또는 치료 목적으로 이용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예는 아이오딘131, 인듐111, 이트륨90 및 루테튬177을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 방사성면역접합체를 제조하는 방법은 당업계에 확립되어 있다. 제발린(Zevalin)® (아이덱 파마슈티칼스(IDEC Pharmaceuticals)) 및 벡사르(Bexxar)® (코릭사 파마슈티칼스(Corixa Pharmaceuticals))를 비롯한 방사성면역접합체의 예가 상업적으로 입수가능하며, 본 발명의 항체를 사용하여 방사성면역접합체를 제조하는데 유사한 방법이 이용될 수 있다.
본 발명의 항체 접합체는 소정의 생물학적 반응을 변형시키는데 이용될 수 있고, 약물 모이어티는 고전적 화학 치료제에 제한되어 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어 림포카인, 인터류킨-1 ("IL-1"), 인터류킨-2 ("IL-2"), 인터류킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자를 포함할 수 있다.
이러한 치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)] 참조).
이중특이적 분자
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-BST1 항체, 또는 그의 단편을 포함하는 이중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 유도체화되거나 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)에 연결되어, 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로, 유도체화되거나 또는 1개를 초과하는 다른 기능적 분자에 연결되어, 2개를 초과하는 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고; 이러한 다중특이적 분자 역시 본원에서 용어 "이중특이적 분자"에 포괄되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체를 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 등에 의함)시켜 이중특이적 분자를 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 제1 표적 에피토프 (즉, BST1)에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 제2 표적 에피토프는 제1 결합 특이성에 의해 결합된 것과 동일한 표적 단백질 상에 제시될 수 있거나; 또는 제2 표적 에피토프는 제1 결합 특이성에 의해 결합된 것에 대해 제1 단백질에 의해 결합된 것과 상이한 표적 단백질로 제시될 수 있다. 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프 (즉, BST1)와 동일한 세포 상에 제시될 수 있거나; 또는 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프를 디스플레이하는 세포에 의해 디스플레이되지 않은 표적 상에 제시될 수 있다. 본원에 사용된 용어 '결합 특이성'은 하나 이상의 항체 가변 도메인을 포함하는 모이어티를 지칭한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRI (CD64) 또는 인간 Fcα 수용체(CD89)이다. 따라서, 본 발명은 FcγR 또는 FcαR 발현 이펙터 세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포 (PMN)) 및 BST1을 발현하는 표적 세포 둘 다에 결합할 수 있는 이중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 분자는 BST1 발현 세포를 이펙터 세포에 표적화하고, Fc 수용체-매개 이펙터 세포 활성, 예컨대 BST1 발현 세포의 식세포작용, 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 시토카인 방출, 또는 슈퍼옥시드 음이온 생성을 촉발한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 CD3 또는 CD5이다. 따라서, 본 발명은 CD3 또는 CD5 발현 이펙터 세포 (예를 들어, CD3 또는 CD5 발현 세포독성 T 세포) 둘 다, 및 BST1을 발현하는 표적 세포에 결합할 수 있는 이중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 분자는 BST1 발현 세포를 이펙터 세포에 대해 표적화하고, CD3 또는 CD5-매개 이펙터 세포 활성, 예컨대 T 세포 클론 증식 및 T 세포 세포독성을 촉발한다. 이 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 총 2 또는 3개의 항체 가변 도메인을 가질 수 있으며, 여기서 이중특이적 항체의 제1 부분은 인간 면역 이펙터 세포 상에 위치하는 이펩터 항원에 대한 특이적 결합에 의해 인간 면역 이펙터 세포의 활성을 동원할 수 있고, 이펙터 항원은 인간 CD3 또는 CD5 항원이고, 하나의 항체 가변 도메인으로 이루어진 상기 제1 부분, 및 이중특이적 항체의 제2 부분은 이펙터 항원, 예를 들어 BST1 이외의 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 표적 항원은 상기 인간 면역 이펙터 세포 이외의 표적 상에 존재하고, 상기 제2 부분은 1 또는 2개의 항체 가변 도메인을 포함한다.
이중특이적 분자가 다중특이적 분자인 본 발명의 한 실시양태에서, 분자는 항-Fc 결합 특이체 또는 항-CD3 또는 CD5 결합 특이체 및 항-BST1 결합 특이체 뿐만 아니라 제3 결합 특이체를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제3 결합 특이체는 항-증진 인자 (EF) 부분, 예를 들어 세포독성 활성에 관여한 표면 단백질과 결합함으로써 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자이다. "항-증진 인자 부분"은 주어진 분자, 예를 들어 항원 또는 수용체에 결합하여, Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정기의 효과를 증진시키는 항체, 기능적 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. "항-증진 인자 부분"은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 결합할 수 있다. 대안적으로, 항-증진 인자 부분은 제1 및 제2 결합 특이체 부분이 결합하는 엔티티와 상이한 엔티티에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-증진 인자 부분은 세포독성 T-세포와 결합할 수 있다 (예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1, 또는 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시켜 주는 다른 면역 세포를 통함).
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 하나 이상의 항체 또는 그의 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb 또는 단일 쇄 Fv를 포함한다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체 또는 그의 임의의 최소 단편, 예컨대 미국 특허 번호 4,946,778 (그의 내용이 명백하게 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있다.
한 실시양태에서, Fcγ 수용체에 대한 결합 특이성은 모노클로날 항체에 의해 제공되는데, 그의 결합은 인간 이뮤노글로불린 G (IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본원에 사용된 용어 "IgG 수용체"는 염색체 1 상에 위치하는 임의의 8개의 γ-쇄 유전자를 지칭한다. 이러한 유전자는 3종의 Fcγ 수용체 부류: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)으로 분류되는 총 12종의 막횡단 또는 가용성 수용체 이소형을 코딩한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, Fcγ 수용체는 인간 고친화도 FcγRI이다. 인간 FcγRI는 단량체 IgG에 대해 고친화도 (108-109 M-1)를 나타내는 72 kDa 분자이다.
특정의 바람직한 항-Fcγ 모노클로날 항체의 생산 및 특성화는 PCT 공개 WO 88/00052 및 미국 특허 번호 4,954,617에 기재되어 있으며, 그의 교시는 모두 본원에 참고로 포함된다. 이러한 항체는 수용체의 Fcγ 결합 부위와 구별되는 부위에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프와 결합하므로, 이들의 결합이 IgG의 생리학적 수준에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 구체적 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32를 생산하는 하이브리도마는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC 등록 번호 HB9469)으로부터 입수가능하다. 다른 실시양태에서, 항-Fcγ 수용체 항체는 모노클로날 항체 22의 인간화 형태 (H22)이다. H22 항체의 생산 및 특성화는 문헌 [Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002] 및 PCT 공개 WO 94/10332에 기재되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 명칭 HA022CL1 하에 기탁되었고, 등록 번호는 CRL 11177이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 인간 IgA 수용체, 예를 들어 Fc-알파 수용체 (FcαRI (CD89))와 결합하는 항체에 의해 제공되는데, 그의 결합은 바람직하게는 인간 이뮤노글로불린 A (IgA)에 의해 차단되지 않는다. 용어 "IgA 수용체"는 염색체 19 상에 위치하는 하나의 α-유전자 (FcαRI)의 유전자 산물을 포함하도록 의도된다. 이러한 유전자는 55 내지 110 kDa의 몇가지 다르게 스플라이싱된 막횡단 이소형을 코딩하는 것으로 공지되어 있다. FcαRI (CD89)는 단핵구/대식세포, 호산구성 및 호중구성 과립구 상에서 구성적으로 발현되지만, 비-이펙터 세포 집단 상에서는 그렇지 않다. FcαRI는 IgA1 및 IgA2 둘 다에 대한 중간 정도의 친화도 (
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5 x 107 M-1)를 갖고, 이는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 시토카인에 대한 노출시 증가된다 (문헌 [Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440]). IgA 리간드 결합 도메인 외부에서 FcαRI에 결합하는, A3, A59, A62 및 A77로 확인된 4종의 FcαRI-특이적 모노클로날 항체가 기재되어 있다 (문헌 [Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764]).
FcαRI 및 FcγRI는 본 발명의 이중특이적 분자에서 사용하기에 바람직한 촉발 수용체인데, 그 이유는 이들 수용체가 (1) 면역 이펙터 세포, 예를 들어 단핵구, PMN, 대식세포 및 수지상 세포에서 일차적으로 발현되고; (2) 높은 수준 (예를 들어, 세포당 5,000-100,000개)으로 발현되고; (3) 세포독성 활성 (예를 들어, ADCC, 식세포작용)의 매개자이고; (4) 그들을 표적화하는, 자기-항원을 비롯한 항원의 증진된 항원 제시를 매개하기 때문이다.
본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 항체는 뮤린, 인간, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여, 구성성분 결합 특이체, 예를 들어 항-FcR, 항-CD3, 항-CD5 및 항-BST1 결합 특이체를 접합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이체를 개별적으로 생성시킨 후에 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에, 공유 접합을 위해 다양한 커플링제 또는 가교제를 사용할 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, 및 Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것들을 포함한다. 바람직한 접합제는 SATA 및 술포-SMCC이며, 이들 둘 다 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.) (일리노이주 록포드)로부터 입수가능하다.
추가의 2가 작업은 이중 결합을 전장 항체-유사 포맷으로 설계함으로써 이중특이체에 대해 수행되었다 (문헌 [Wu et al., 2007, Nature Biotechnology 25[11]: 1290-1297; USSN12/477,711; Michaelson et al., 2009, mAbs 1[2]:128-141; PCT/US2008/074693; Zuo et al., 2000, Protein Engineering 13[5]:361-367; USSN09/865,198; Shen et al., 2006, J Biol Chem 281[16]: 10706-10714; Lu et al., 2005, J Biol Chem 280[20]: 19665-19672]; PCT/US2005/025472; 명백하게 본원에 참고로 포함됨).
결합 특이체가 항체인 경우에, 이들을 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 술프히드릴 결합을 통해 접합시킬 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수, 바람직하게는 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 2개의 결합 특이체 모두가 동일한 벡터에서 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; 및 5,482,858에 기재되어 있고, 이들은 모두 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
그의 특이적 표적에 대한 이중특이적 분자의 결합은, 예를 들어 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 확인할 수 있다. 이들 검정 각각은 일반적으로 특별히 관심있는 단백질-항체 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어 항체)을 사용함으로써 상기 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 예를 들어 항체-FcR 복합체를 인식하여 이와 특이적으로 결합하는 효소-연결된 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있다. 대안적으로, 복합체는 임의의 다양한 다른 면역검정을 이용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 항체를 방사성 표지시킬 수 있고, 방사성면역검정 (RIA)에 사용할 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986] 참조). γ 계수기 또는 섬광 계수기를 이용하는 것과 같은 수단에 의해, 또는 자가방사법에 의해 방사성 동위원소를 검출할 수 있다.
항체 단편 및 항체 모방체
본 발명은 종래의 항체로 제한되지 않고, 항체 단편 및 항체 모방체를 사용하는 것을 통해 실행될 수 있다. 하기 상세하게 설명된 바와 같이, 매우 다양한 항체 단편 및 항체 모방 기술이 현재 개발되어 있고, 당업계에 널리 공지되어 있다. 다수의 이러한 기술, 예컨대 도메인 항체, 나노바디, 및 유니바디가 종래의 항체 구조의 단편 또는 그에 대한 다른 변형을 사용하는 것이지만, 아피바디, DARPin, 안티칼린스, 아비머 및 베르사바디와 같은 대안적 기술도 또한 존재하며, 이는 종래의 항체 결합을 모방하는 것이기는 하지만, 특유의 메카니즘으로부터 생성되어 그를 통해 기능하는 결합 구조를 이용한다.
도메인 항체 (dAb)는 항체의 가장 작은 기능적 결합 단위로, 인간 항체의 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL) 중 어느 하나의 가변 영역에 상응한다. 도메인 항체는 대략 13 kDa의 분자량을 갖는다. 도만티스(Domantis)는 일련의 대형 및 매우 기능적인 완전 인간 VH 및 VL dAb 라이브러리 (각 라이브러리 내에는 100 억 초과의 상이한 서열)를 개발하였고, 이들 라이브러리는 치료 표적에 대해 특이적인 dAb를 선택하는데 사용된다. 많은 종래의 항체와 대조적으로, 도메인 항체는 박테리아, 효모, 및 포유동물 세포 시스템에서 잘 발현된다. 도메인 항체 및 그의 생산 방법에 대한 추가의 상세내용은 미국 특허 번호 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; 미국 일련 번호 2004/0110941; 유럽 특허 출원 번호 1433846 및 유럽 특허 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 및 WO03/002609를 참조하여 수득할 수 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
나노바디는 자연 발생 중쇄 항체의 독특한 구조적 및 기능적 특성을 갖는 항체-유래 치료 단백질이다. 이들 중쇄 항체는 단일 가변 도메인 (VHH) 및 2개의 불변 도메인 (CH2 및 CH3)을 함유한다. 중요하게는, 클로닝 및 단리된 VHH 도메인은 본래의 중쇄 항체의 완전한 항원-결합 능력을 보유하는 완벽하게 안정한 폴리펩티드이다. 나노바디는 인간 항체의 VH 도메인과 높은 상동성을 갖고, 어떤 활성 손실도 없이 추가로 인간화될 수 있다. 중요하게는, 나노바디는 낮은 면역원성 잠재력을 가지며, 이는 나노바디 유도 화합물을 사용한 영장류 연구에서 확인되었다.
나노바디는 종래의 항체의 이점과 소분자 약물의 중요한 특성을 조합한다. 종래의 항체와 마찬가지로, 나노바디는 높은 표적 특이성, 그의 표적에 대한 고친화도, 및 낮은 고유의 독성을 나타낸다. 그러나, 소분자 약물고 같이 이는 효소를 억제할 수 있고, 수용체 틈에 용이하게 접근할 수 있다. 추가로, 나노바디는 극히 안정하며, 주사 이외의 수단에 의해 투여될 수 있고 (예를 들어, 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 WO 04/041867 참조), 제조가 용이하다. 나노바디의 다른 이점은 그의 크기가 작기 때문에 흔하지 않거나 숨겨진 에피토프를 인식한다는 것, 단백질 표적의 캐비티 또는 활성 부위에 고친화도로 결합한다는 것, 그의 독특한 3-차원적, 약물 포맷 융통성으로 인한 선택성, 반감기 조정 및 약물 발견의 용이성 및 신속함을 포함한다.
나노바디는 단일 유전자에 의해 코딩되며, 거의 모든 원핵 및 진핵 숙주, 예를 들어 이. 콜라이 (예를 들어, 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 US 6,765,087 참조), 곰팡이 (예를 들어, 아스페르길루스(Aspergillus) 또는 트리코더마(Trichoderma)) 및 효모 (예를 들어, 사카로미세스, 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 한세눌라(Hansenula) 또는 피키아) (예를 들어, 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 US 6,838,254 참조)에서 효율적으로 생산된다. 생산 방법은 확장가능하며, 다중 킬로그램 양의 나노바디가 생산된다. 나노바디가 종래의 항체에 비해 우수한 안정성을 나타내기 때문에, 이는 긴 반감기의 즉시 사용가능한 용액으로서 제제화될 수 있다.
나노클론 방법 (예를 들어, 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 WO 06/079372 참조)은 B-세포의 자동화된 고-처리량 선택을 기초로 원하는 표적에 대한 나노바디를 생성하기 위한 독점적인 방법으로, 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
유니바디는 또 다른 항체 단편 기술이지만; 이는 IgG4 항체의 힌지 영역의 제거를 기초로 하는 것이다. 힌지 영역의 제거는 크기가 종래의 IgG4 항체 크기의 본질적으로 절반인 분자를 생성하고, IgG4 항체의 2가 결합 영역이 아닌 1가 결합 영역을 갖게 한다. 또한 IgG4 항체가 불활성이며, 따라서 면역계와 상호작용하지 않아 면역 반응이 바람직하지 않은 질환을 치료하는데 있어서 유익할 수 있으며, 이러한 이점은 유니바디에 해당한다는 사실이 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유니바디는 그것이 결합하는 세포를 억제하거나 침묵시키기만, 사멸시키지는 않도록 기능할 수 있다. 추가로, 암 세포에 결합하는 유니바디는 세포가 증식하도록 자극하지 않는다. 또한, 유니바디는 크기가 종래의 IgG4 항체의 약 절반이기 때문에, 이는 잠재적으로 유익한 효능으로 보다 큰 고형 종양 상에서 더 나은 분포를 나타낼 수 있다. 유니바디는 전체 IgG4 항체와 유사한 속도로 신체에서 소실되며, 전체 항체와 유사한 친화도로 항원에 결합할 수 있다. 유니바디에 대한 추가의 상세내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 특허 WO2007/059782를 참조하여 수득할 수 있다.
아피바디 분자는 스타필로코쿠스 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 하나로부터 유래된 58-아미노산 잔기 단백질 도메인에 기초한 친화도 단백질의 새로운 부류를 대표한다. 이의 3개의 헬릭스 다발 도메인은 조합 파지미드 라이브러리의 구축을 위한 스캐폴드로서 이용되며, 이로부터 파지 디스플레이 기술을 이용하여 원하는 분자를 표적화하는 아피바디 변이체를 선택할 수 있다 (문헌 [Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA (1997) 'Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain' Nat Biotechnol 15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA (2002) 'Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A' Eur J Biochem. 269:2647-55]). 아피바디 분자의 단순하고 견고한 구조는 그의 저분자량 (6 kDa)과 함께 이를 매우 다양한 적용분야에 적합하게 하며, 예를 들어 검출 시약 (문헌 [Ronmark J. et al. (2002) 'Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli' J Immunol Methods 261:199-211])으로서, 및 수용체 상호작용을 억제하는데 (문헌 [Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA (2003) 'Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering' Protein Eng 16:691-7]) 적합하다. 아피바디 및 그의 생산 방법에 대한 추가의 상세내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 번호 5831012를 참조하여 수득할 수 있다.
표지된 아피바디는 또한 이소형의 존재량을 결정하기 위한 영상화 용도에 유용할 수 있다.
DARPin (설계된 안키린 반복 단백질)은 비-항체 폴리펩티드의 결합 능력을 활용하기 위해 개발된 항체 모방체 DRP (설계된 반복 단백질) 기술의 한 예이다. 안키린 또는 류신 풍부 반복 단백질과 같은 반복 단백질은 항체와 달리 세포내 및 세포외적으로 존재하는 편재성 결합 분자이다. 이들의 특유한 모듈화 구조는 가변적 및 모듈화 표적-결합 표면을 디스플레이하는 신장된 반복 도메인을 형성하기 위해 겹겹이 쌓여 있는 반복 구조 단위 (반복부)를 특징으로 한다. 이러한 모듈성에 기초하여, 고도로 다양해진 결합 특이성을 갖는 폴리펩티드의 조합 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 이러한 전략은 반복 도메인 내로의 그의 무작위 어셈블리 및 가변 표면 잔기를 디스플레이하는 자가-상용성 반복체의 컨센서스 설계를 포함한다.
DARPin은 박테리아 발현 시스템에서 매우 높은 수율로 생산될 수 있으며, 공지된 가장 안정한 단백질에 속한다. 인간 수용체, 시토카인, 키나제, 인간 프로테아제, 바이러스 및 막 단백질을 비롯한 넓은 범위의 표적 단백질에 대한 매우 특이적인 고친화도 DARPin이 선택되었다. 한 자릿수의 나노몰 내지 피코몰 범위의 친화도를 갖는 DARPin을 수득할 수 있다.
DARPin은 ELISA, 샌드위치 ELISA, 유동 세포측정 분석 (FACS), 면역조직화학 (IHC), 칩 분야, 친화도 정제 또는 웨스턴 블롯팅을 비롯한 다양한 범위의 분야에서 사용되어 왔다. DARPin은 또한 세포내 구획에서, 예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된 세포내 마커 단백질로서 매우 활성이 있는 것으로 입증되었다. DARPin은 추가로 pM 범위의 IC50으로 바이러스 진입을 억제하는데에도 사용되었다. DARPin은 단백질-단백질 상호작용을 차단하는데 뿐만 아니라, 효소를 억제하는데에도 이상적이다. 가장 빈번하게는 알로스테릭 억제 모드로 프로테아제, 키나제 및 수송체가 성공적으로 억제되었다. 종양에서의 매우 신속하고 특이적인 풍부화 및 매우 바람직한 종양 대 혈액 비는 DARPin을 생체내 진단 또는 치료적 접근법에 매우 적합하게 만든다.
DARPin 및 다른 DRP 기술에 대한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0132028, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 02/20565에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 둘 다 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
안티칼린은 추가의 항체 모방체 기술이다. 이러한 경우, 결합 특이성은 자연적으로 인간 조직 및 체액에서 풍부하게 발현되는 저분자량 단백질 패밀리인 리포칼린으로부터 유래된다. 리포칼린은 화학적으로 감수성이거나 불용성인 화합물의 생리적 수송 및 저장과 연관된 일정 범위의 생체내 기능을 수행하도록 진화되어 왔다. 리포칼린은 해당 단백질의 1개의 말단에 4개의 루프를 지지시켜 주는 고도로 보존된 β-배럴을 포함하는 견고한 고유의 구조를 지니고 있다. 이들 루프는 결합 포켓에 대한 입구를 형성하고, 이러한 분자 일부에서의 입체형태적 차이는 개별 리포칼린 사이의 결합 특이성 상의 변동을 설명하고 있다.
보존된 β-시트 프레임워크에 의해 지지된 초가변 루프의 전반적 구조가 이뮤노글로불린을 연상시키긴 하지만, 리포칼린은 160-180개의 아미노산의 단일 폴리펩티드 쇄로 구성되어, 크기 측면에서 항체와 상당히 상이하며, 이는 단일 이뮤노글로불린 도메인보다 매우 조금 더 크다.
리포칼린은 클로닝되며, 그의 루프를 조작하여 안티칼린을 제작할 수 있다. 구조적으로 다양한 안티칼린의 라이브러리가 생성되었고, 안티칼린 디스플레이는 결합 기능의 선택 및 스크리닝에 이어 원핵 또는 진핵 시스템에서의 추가 분석을 위한 가용성 단백질의 발현 및 생산을 가능하게 한다. 연구 결과, 실질적으로 임의의 인간 표적 단백질에 특이적인 안티칼린을 개발 및 단리할 수 있고, 나노몰 이상의 범위의 결합 친화도를 수득할 수 있는 것으로 성공적으로 입증되었다.
안티칼린은 또한 이중 표적화 단백질, 소위 듀오칼린으로 포맷될 수 있다. 듀오칼린은 그의 2개의 결합 도메인의 구조적 배향에 관계없이 표적 특이성 및 친화도를 보유하면서 표준 제조 방법을 이용하여 용이하게 생산되는 단량체 단백질 내의 2개의 개별 치료 표적에 결합한다.
단일 분자를 통한 다중 표적의 조절은 단일 원인적 요인을 초과하여 관련된 것으로 공지된 질환에 있어서 특히 유익하다. 또한, 듀오칼린과 같은 2가 또는 다가 결합 포맷은 질환에서 세포 표면 분자를 표적화하거나, 신호 전달 경로에 대해 효능작용 효과를 매개하거나, 또는 세포 표면 수용체의 결합 및 클러스터링을 통한 증가된 내재화 효과를 유도하는데 있어서 상당한 잠재력을 갖는다. 또한, 듀오칼린의 높은 고유의 안정성은 단량체 안티칼린과 유사하여, 듀오칼린에 대해 융통성있는 제제화 및 전달 잠재력을 부여한다.
안티칼린에 관한 추가의 정보는 미국 특허 번호 7,250,297 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 99/16873에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 둘 다 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명과 관련하여 유용한 또 다른 항체 모방 기술은 아비머이다. 아비머는 시험관내 엑손 셔플링 및 파지 디스플레이에 의해 인간 세포외 수용체 도메인 거대 패밀리로부터 진화되는데, 이로써 결합 및 억제 특성을 갖는 멀티도메인 단백질이 생성된다. 다수의 독립적인 결합 도메인을 연결시키는 것이 결합력을 발생시키고, 통상적인 단일-에피토프 결합 단백질과 비교해서 친화도 및 특이성을 개선하는 것으로 밝혀졌다. 다른 잠재적 이점은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 내에서의 다중 표적-특이적 분자의 단순하고 효율적인 생산, 개선된 열안정성 및 프로테아제에 대한 내성을 포함한다. 다양한 표적에 대해 친화도가 나노몰 이하인 아비머가 수득되었다.
아비머에 관한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756 (모두 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.
베르사바디는 본 발명과 관련하여 이용될 수 있는 또 다른 항체 모방체 기술이다. 베르사바디는 전형적인 단백질이 갖고 있는 소수성 코어를 대체하는 높은 디술피드 밀도 스캐폴드를 형성하는, 시스테인 >15%인 3-5 kDa의 소형 단백질이다. 소수성 코어를 포함하는 다수의 소수성 아미노산을 소수의 디술피드로 대체하는 것에 의해, 보다 작고, 보다 친수성이며 (덜 응집되고, 비-특이적 결합임), 프로테아제 및 열에 대한 내성이 더 크고, 보다 낮은 밀도의 T-세포 에피토프를 갖는 단백질이 생성되는데, 이는 MHC 제시에 가장 기여하는 잔기가 소수성이기 때문이다. 모든 4가지의 이들 특성은 면역원성에 영향을 미치는 것으로 널리 공지되어 있고, 이들 특성은 함께 면역원성에 있어서 상당한 저하를 유발시킬 것으로 예상된다.
베르사바디에 대한 영감은 뜻밖의 낮은 면역원성을 나타내는 것으로 공지되어 있는 거머리, 뱀, 거미, 전갈, 달팽이, 및 아네모네에 의해 생산되는 천연 주사가능한 생물제약으로부터 유래되었다. 선택된 천연 단백질 패밀리로부터 시작하여, 설계하고 스크리닝하는 것에 의해, 크기, 소수성, 단백질분해 항원 처리, 및 에피토프 밀도를 천연 주사가능한 단백질의 평균보다 훨씬 낮은 수준으로 최소화시켰다.
베르사바디의 구조를 고려해볼 때, 이들 항체 모방체는 다가, 다중-특이성, 반감기 메카니즘의 다양성, 조직 표적화 모듈 및 항체 Fc 영역의 부재를 포함하는 다양한 포맷을 제공한다. 추가로, 베르사바디는 이. 콜라이에서 고수율로 제조되고, 친수성이고 크기가 작기 때문에, 베르사바디는 고도로 가용성이며, 고농도로 제제화될 수 있다. 베르사바디는 유난히 열 안정성이고 (비등이 가능함) 연장된 저장 수명을 제공한다.
베르사바디에 관한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0191272에서 찾아볼 수 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
상기 제공된 항체 단편 및 항체 모방체 기술의 상세한 설명은 본 명세서와 관련하여 이용될 수 있는 모든 기술을 종합한 목록인 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 및 또한 제한없이, 대안적 폴리펩티드-기반 기술, 예컨대 문헌 [Qui et al. (2007) Nature Biotechnology 25(8):921-929] (이는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 개략된 바와 같은 상보성 결정 영역의 융합, 뿐만 아니라 핵산-기반 기술, 예컨대 미국 특허 번호 5,789,157, 5,864,026, 5,712,375, 5,763,566, 6,013,443, 6,376,474, 6,613,526, 6,114,120, 6,261,774, 및 6,387,620 (이들은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 RNA 압타머 기술을 비롯한 다양한 추가의 기술을 본 발명과 관련하여 이용할 수 있다.
제약 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본 발명의 모노클로날 항체, 또는 그의 항원-결합 부분(들) 중 하나 또는 이들의 조합물을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본 발명의 (예를 들어, 2개 이상의 상이한) 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 하나 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약 조성물은 표적 항원 상에서 상이한 에피토프에 결합하거나, 또는 상보적 활성을 갖는 항체 (또는 면역접합체 또는 이중특이체)의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조합 요법은 하나 이상의 다른 항종양제, 또는 항염증제 또는 면역억제제와 조합된 본 발명의 항- 항체를 포함할 수 있다. 조합 요법에 사용할 수 있는 치료제의 예는 본 발명의 항체의 용도에 대한 하기 섹션에서 보다 상세하게 설명한다.
본원에 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 면역접합체 또는 이중특이적 분자는 산의 작용으로부터 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하기 위해 물질에 코팅될 수 있다.
본 발명의 제약 화합물은 하나 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 부모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고 있고 바람직하지 않은 어떠한 독성학적 효과도 제공하지 않는 염을 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 아인산 등, 뿐만 아니라 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 다음을 포함한다: (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 상기 문헌의 멸균 절차, 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 도입 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 또한, 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사가능한 제약 형태의 흡수를 연장시킬 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약상 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서 이들을 사용하는 것이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에 멸균되고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다. 다수의 경우에서 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사가능한 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
멸균 주사액은 필요량의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 하나 또는 그의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 기재된 것 중의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조 (동결건조)인데, 이로써 앞서 멸균-여과시킨 그의 용액으로부터의 임의의 부가의 목적 성분이 활성 성분에 부가된 분말이 생성된다.
담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 대상체, 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로 100 퍼센트를 기준으로, 그 양은 제약상 허용되는 담체와 조합되어 약 0.01 퍼센트 내지 약 99 퍼센트 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 1 퍼센트 내지 약 30 퍼센트 활성 성분의 범위일 것이다.
투여 요법은 원하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 또는 용량이 치료 상황의 긴급성에 따라 정해지는 바에 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하고; 각 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 예정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 관한 상세사항은 (a) 활성 화합물의 특유한 특징 및 달성하고자 하는 특별한 치료 효과, 및 (b) 개체에서 감수성 치료를 위해 상기 활성 화합물을 배합하는 분야에 존재하는 제한 사항에 의해 지시되고 이에 직접적으로 좌우된다.
항체의 투여에 대해, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 통상적으로는 0.01 내지 5 mg/kg 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중일 수 있거나, 또는 1-10 mg/kg의 범위 이내일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 1주 당 1회 투여, 2주 당 1회 투여, 3주 당 1회 투여, 4주 당 1회 투여, 1개월 당 1회 투여, 3개월 당 1회 투여, 또는 3개월 내지 6개월 당 1회 투여를 포함한다. 본 발명의 항-BST1 항체에 대한 바람직한 투여 요법은 정맥내 투여를 통해 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중으로 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항체는 다음 투여 스케줄 중 하나를 이용하여 제공된다: (i) 6회 투여량에 대해 4주마다, 이어서 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3 mg/kg 체중으로 1회, 이어서 3주마다 1 mg/kg 체중.
일부 방법에서, 결합 특이성이 상이한 2가지 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되고, 이러한 경우에 투여되는 각각의 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 속한다. 항체는 일반적으로 여러 번 투여된다. 단일 투여량들 사이의 간격은, 예를 들어 매주, 매달, 3개월마다 또는 매년일 수 있다. 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 간격이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1-1000 μg/ml, 일부 방법에서는 약 25-300 μg/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다.
대안적으로, 덜 빈번한 투여가 요구되는 경우에, 항체를 지속 방출 제제로서 투여할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 그 다음으로 인간화 항체, 키메라 항체 및 비인간 항체 순이다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 치료적인지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방 용도에서, 비교적 낮은 투여량이 비교적 빈번하지 않은 간격으로 장기간의 시간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 나머지 일생 동안 계속 치료를 받는다. 치료 용도에서, 때때로 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 보일 때까지 상대적으로 짧은 간격의 상대적으로 높은 투여량이 요구된다. 그 후, 환자에게 예방 요법을 투여할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정한 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용되는 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료를 받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의학적 병력 및 의학 분야에 널리 공지된 유사 요인을 포함하는 다양한 약동학적 요인에 따라 달라될 것이다.
본 발명의 항-BST1 항체의 "치료 유효 투여량"은 바람직하게는 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 질환 증상이 없는 기간의 빈도와 지속 기간을 증가시키거나, 또는 질환 고통으로 인한 장애 또는 무능력을 방지한다. 예를 들어, BST1 매개 종양의 치료의 경우, "치료 유효 투여량"은 세포 성장 또는 종양 성장을 치료되지 않은 대상체에 비해 바람직하게는 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80% 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력을 인간 종양에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 세포 성장을 억제하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있고, 이러한 억제는 숙련된 진료의에게 공지된 검정에 의해 시험관내에서 측정될 수 있다. 치료 화합물의 치료 유효량은 대상체에게서 종양 크기를 감소시키거나 또는 증상을 달리 완화시킬 수 있다. 당업자는 대상체의 크기, 대상체의 증상의 중증도, 및 선택된 특정한 조성물 또는 투여 경로와 같은 요인에 기초하여 치료 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법 중에서 하나 이상을 이용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 항체에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입 경로를 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 대체로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
대안적으로, 본 발명의 항체는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
활성 화합물은 제어 방출 제제, 예컨대 이식물, 경피 패치, 및 미세캡슐화 전달 시스템과 같이 급속 방출에 대해 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허받거나 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (1978) J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y] 참조).
치료 조성물은 당업계에 공지된 의료 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 무바늘 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예는 미국 특허 번호 4,487,603에 개시된, 제어된 속도로 의약을 분배하기 위한 이식가능 마이크로-주입 펌프; 미국 특허 번호 4,486,194에 개시된, 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료 장치; 미국 특허 번호 4,447,233에 개시된, 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프; 미국 특허 번호 4,447,224에 개시된, 연속 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능 주입 기구; 미국 특허 번호 4,439,196에 개시된, 다중-챔버 구획을 보유하는 삼투성 약물 전달 시스템; 및 미국 특허 번호 4,475,196에 개시된, 삼투성 약물 전달 시스템을 포함한다. 이들 특허는 본원에 참고로 포함된다. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 생체내 적절한 분포가 보장되도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 (원하는 경우에) BBB를 확실히 횡단하도록 하기 위해서는, 이들을 예를 들어 리포솜 내에 제제화할 수 있다. 리포솜의 제조 방법에 대해서는 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포솜은 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있으며, 이는 특이적 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되어 표적화 약물 전달을 증강시킨다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어, 미국 특허 5,416,016 참조); 만노시드 (문헌 [Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]); 항체 (문헌 [P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 (문헌 [Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)]; p120 (문헌 [Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090])을 포함하며, 또한 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다.
용도 및 방법
본 발명의 항체, 항체 조성물 및 방법은 BST1 매개된 장애의 진단과 치료를 포함하는 다수의 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 유용성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 이들 분자를 배양 중인 세포에 시험관내 또는 생체외 투여하거나, 또는 인간 대상체에, 예를 들어 생체내 투여하여 다양한 장애를 치료, 예방 또는 진단할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 비인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 바람직한 대상체는 BST1 활성에 의해 매개되는 장애를 갖는 인간 환자를 포함한다. 방법은 비정상적인 BST1 발현과 연관된 장애를 갖는 인간 환자를 치료하는데 특히 적합하다. BST1에 대한 항체를 또 다른 작용제와 함께 투여하는 경우에, 이들 둘은 어떠한 순서로든 또는 동시에 투여될 수 있다.
BST1에 대한 본 발명의 항체의 특이적인 결합을 고려할 때, 본 발명의 항체는 세포의 표면 상에서 BST1 발현을 특이적으로 검출하는데 사용될 수 있고, 또한 면역친화성 정제를 통해 BST1을 정제하는데 사용될 수 있다.
또한, 종양 세포 상의 BST1의 발현을 고려하여, 본 발명의 항체, 항체 조성물 및 방법은 종양발생 장애, 예를 들어 BST1을 발현하는 종양 세포의 존재를 특징으로 하는 장애 (예를 들어 급성 골수성 백혈병 (AML), B-세포 만성 림프구성 백혈병, 유방암, 결장직장암, 신장 암, 두경부암, 폐암, 난소암 및 췌장암 포함)를 갖는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. BST1은 하기 실시예 5에 설명되는 바와 같이 항체 결합에 대해 내재화되는 것으로 입증되었으며, 따라서 본 발명의 항체는 임의의 페이로드 작용 메카니즘, 예를 들어 ADC 접근법, 방사성면역접합체 또는 ADEPT 접근법에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 조성물)는 BST1의 수준, 또는 막 표면 상에 BST1을 함유하는 세포의 수준을 검출하는데 사용될 수 있으며, 이들 수준은 이어서 특정 질환 증상과 연결될 수 있다. 대안적으로, 항체는 BST1 기능을 억제 또는 차단하는데 사용될 수 있고, 차례로 이는 특정 질환 증상의 방지 또는 완화에 연결될 수 있어, BST1이 질환의 매개자임을 확인시켜줄 수 있다. 이는, 샘플 및 대조군 샘플을 항-BST1 항체와, 항체 및 BST1 사이에 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에 접촉시킴으로써 달성할 수 있다. 항체 및 BST1 사이에 형성된 임의의 복합체를 검출하고, 샘플과 대조군을 비교한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)는 처음에 시험관내에서 치료 또는 진단 용도와 연관된 결합 활성에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 하기 실시예에 기재된 유동 세포측정 검정을 이용하여 시험할 수 있다.
본 발명의 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자, 면역접합체 및 조성물)는 BST1 관련 질환의 요법 및 진단에서 추가의 유용성을 갖는다. 예를 들어, 모노클로날 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 면역접합체는 생체내 또는 시험관내에서 하기 생물학적 활성들 중 하나 이상을 유도하는데 사용될 수 있다: BST1을 발현하는 세포의 성장을 억제하고/거나 이러한 세포를 사멸시키는 것; 인간 이펙터 세포의 존재 하에 BST1을 발현하는 세포의 식세포작용 또는 ADCC를 매개하는 것, 또는 BST1에 대한 BST1 리간드의 결합을 차단하는 것.
특정한 실시양태에서, 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)는 다양한 BST1-관련 질환을 치료, 또는 예방 또는 진단하기 위해 생체내에서 사용된다. BST1-관련 질환의 예는 특히 급성 골수성 백혈병 (AML), B-세포 만성 림프구성 백혈병, 유방암, 결장직장암, 신장암, 두경부암, 폐암, 난소암 및 췌장암을 나타내는 인간 암 조직을 포함한다.
본 발명의 항체 조성물 (예를 들어, 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)을 생체내 및 시험관내에서 투여하는 적합한 경로는 당업계에 널리 공지되어 있고, 당업자가 선택할 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 주사 (예를 들어, 정맥내 또는 피하)에 의해 투여될 수 있다. 사용된 분자의 적합한 투여량은 대상체의 연령 및 체중 및 항체 조성물의 농도 및/또는 제제에 따라 달라질 것이다.
이전에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항-BST1 항체는 하나 이상의 다른 치료제, 예를 들어 세포독성제, 방사성 독성제 또는 면역억제제와 공-투여될 수 있다. 항체는 작용제에 연결될 수 있거나 (면역복합체로서), 작용제와는 개별 투여될 수 있다. 후자의 경우에 (개별 투여), 항체는 작용제의 투여 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여될 수 있거나, 다른 공지된 요법, 예를 들어 항암 요법, 예를 들어 방사선 조사와 함께 공-투여될 수 있다. 이러한 치료제는 특히 그 자체로는 환자에게 독성 또는 준독성인 수준에서만 효과적인 항신생물제, 예컨대 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 및 시클로포스파미드 히드록시우레아를 포함한다. 시스플라틴은 100 mg/kg 용량을 4주마다 1회씩 정맥내로 투여하고, 아드리아마이신은 60-75 mg/ml 용량을 21일마다 1회씩 정맥내로 투여한다. 본 발명의 항체와의 공-투여에 적합한 다른 작용제는 암, 예를 들어 급성 골수성 백혈병 (AML), B-세포 만성 림프구성 백혈병, 유방암, 결장직장암, 신장암, 두경부암, 폐암, 난소암 또는 췌장암의 치료에 사용되는 다른 작용제, 예컨대 아바스틴(Avastin)®, 5FU 및 겜시타빈을 포함한다. 본 발명의 인간 항-BST1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 화학요법제와의 공-투여는 인간 종양 세포에 세포독성 효과를 나타내는 상이한 메카니즘을 통해 작용하는 2종의 항암제를 제공한다. 이러한 공-투여는 항체에 비반응성이 되도록 하는, 약물에 대한 내성의 발생 또는 종양 세포의 항원성의 변화로 인한 문제를 해결할 수 있다.
표적-특이적 이펙터 세포, 예를 들어 본 발명의 조성물 (예를 들어, 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)에 연결된 이펙터 세포가 또한 치료제로서 사용될 수 있다. 표적화를 위한 이펙터 세포는 인간 백혈구, 예를 들어 대식세포, 호중구 또는 단핵구일 수 있다. 다른 세포는 호산구, 자연 킬러 세포 및 다른 IgG- 또는 IgA-수용체 보유 세포를 포함한다. 원하는 경우에, 이펙터 세포는 치료하려는 대상체로부터 수득할 수 있다. 표적-특이적 이펙터 세포는 생리학상 허용되는 용액 중의 세포 현탁액으로서 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 수는 약 108-109개일 수 있지만, 치료 목적에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 표적 세포, 예를 들어 BST1을 발현하는 종양 세포에 국재화시키고, 예를 들어 식세포작용에 의한 세포 사멸에 영향을 미치는데 충분할 것이다. 투여 경로는 또한 달라질 수 있다.
표적-특이적 이펙터 세포를 사용하는 요법은 표적화 세포의 제거를 위한 다른 기술과 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및/또는 이들 조성물로 보강된 이펙터 세포를 사용하는 항종양 요법은 화학요법과 함께 사용될 수 있다. 추가로, 종양 세포 거부반응에 대해 2가지 개별 세포독성 이펙터 집단을 지시하기 위해 조합 면역요법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마 RI 또는 항-CD3에 연결된 항-BST1 항체는 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한 예를 들어, 세포 표면 상의 수용체를 캡핑하고 제거함으로써 이펙터 세포에 대한 FcγR 또는 FcγR 수준을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 항-Fc 수용체의 혼합물이 또한 상기 목적을 위해 사용될 수 있다.
보체 결합 부위, 예컨대 보체에 결합하는 IgG1, -2, 또는 -3 또는 IgM으로부터의 부분을 갖는 본 발명의 조성물 (예를 들어, 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)은 또한 보체의 존재 하에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 세포를 포함하는 세포 집단을 본 발명의 결합제 및 적절한 이펙터 세포를 사용하여 생체외 처리하는 것은 보체 또는 보체 함유 혈청을 부가함으로써 보충시킬 수 있다. 본 발명의 결합제로 코팅시킨 표적 세포의 식세포작용은 보체 단백질의 결합에 의해 개선될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포를 또한 보체에 의해 용해시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 보체를 활성화시키지 않는다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)은 또한, 보체와 함께 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 개시내용은 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 보체가 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자에 아주 근접하여 위치하는 경우에 유리할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 보체 또는 혈청을 개별적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 항체 조성물 (예를 들어, 모노클로날 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자, 또는 면역접합체) 및 사용 지침서를 포함하는 키트가 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 이러한 키트는 하나 이상의 추가 시약, 예컨대 면역억제 시약, 세포독성제 또는 방사성독성제, 또는 본 발명의 하나 이상의 추가 항체 (예를 들어, 제1 항체와 구별되는 BST1 항원 내의 에피토프에 결합하는 상보성 활성을 갖는 항체)를 추가로 함유할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체 조성물로 치료되는 환자는 항체의 치료 효과를 증진 또는 증강시키는 또 다른 치료제, 예컨대 세포독성제 또는 방사성독성제가 부가적으로 (본 발명의 항체의 투여 이전에, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에) 투여될 수 있다.
다른 실시양태에서, Fcγ 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조절하는, 예를 들어 증진시키거나 억제시키는 작용제를 사용하여, 예를 들어 대상체를 시토카인으로 치료함으로써 대상체를 추가로 치료할 수 있다. 다중특이적 분자를 사용하여 치료하는 동안에 투여하기 바람직한 시토카인은 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ), 및 종양 괴사 인자 (TNF)가 포함된다.
또한, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)은 FcγR 또는 BST1을 발현하는 세포를 표적화하기 위해, 예를 들어 이러한 세포를 표지하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같이 사용하기 위해서는, 검출될 수 있는 분자에 결합제를 연결시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 Fc 수용체, 예컨대 FcγR, 또는 BST1을 발현하는 세포를 생체외 또는 시험관내에 국재화하는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 샘플 내에서 BST1 항원의 존재를 검출하거나, 또는 BST1 항원의 양을 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항체 또는 그의 일부 및 BST1 사이에 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에, 샘플 및 대조군 샘플을 BST1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이어서, 복합체 형성이 검출되고, 여기서 대조 샘플에 비해 샘플 사이의 복합체 형성 차이는 샘플 내에 BST1 항원의 존재를 나타낸다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 BST1 매개 장애, 예를 들어 본 발명의 질환을 포함하여 인간 암 및 인간 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 면역접합체는 화합물 (예를 들어, 치료제, 표지, 세포독소, 방사성독소, 면역억제제 등)을 항체에 연결함으로써, BST1 세포 표면 수용체를 갖는 세포로 이들 화합물을 표적화시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-BST1 항체는 미국 특허 번호 6,281,354 및 6,548,530, 미국 특허 출원 번호 2003/0050331, 2003/0064984, 2003/0073852, 및 2004/0087497에 기재되거나, 또는 WO 03/022806에 공개된 임의의 독소 화합물에 접합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 BST1을 발현하는 세포를 (예를 들어, 검출가능한 표지, 예컨대 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조-인자와) 생체외 또는 생체내에서 국재화하는 방법을 제공한다. 대안적으로, 면역접합체는 BST1에 세포독소 또는 방사성독소를 표적화함으로써 BST1 세포 표면 수용체를 갖는 세포를 사멸시키는데 사용될 수 있다.
모든 논문, 공개, 특허, 특허 출원, 발표문, 문서, 보고문, 원고, 소책자, 책, 인터넷 게시물, 학술지 논문, 정기 간행물, 제품 정보지 등 (이에 제한되지는 않음)을 비롯한 본 명세서에 언급된 모든 참고문헌은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 것이다. 본원에서 참고문헌의 논의는 단지 그들 저자에 의한 주장을 요약하기 위한 것으로, 어떠한 참고문헌도 선행 기술을 구성하는 것으로 인정되지 않으며, 출원인은 언급된 참고문헌의 정확성 및 타당성에 이의를 제기할 권리를 갖는다.
상기 본 발명이 명확한 이해를 목적으로 설명 및 실시예에 의해 상세하게 기재되었으나, 본 발명의 교시에 비추어 하기하는 종속항의 취지 또는 범위를 벗어나지 않는 특정 변화 및 변형이 가해질 수 있음은 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 추가의 제한으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 파지-디스플레이 라이브러리의 구축
BST1의 아미노산 29-292 (서열 44)로 구성된 재조합 단백질을 표준 재조합 방법에 의해 진핵세포에서 합성하고, 면역화를 위한 항원으로 사용하였다.
면역화 및 mRNA 단리
BST1-결합 분자의 확인을 위한 파지 디스플레이 라이브러리를 하기와 같이 구축하였다. A/J 마우스 (잭슨 래보러토리즈, 메인주 바 하버)를 제0일에 프로인트 완전 아주반트 중 100 μg 단백질을 사용하여 재조합 BST1 항원 (세포외 도메인)으로 및 제28일에 100 μg 항원으로 복강내 면역화시켰다. 마우스의 시험 혈액을 후안와동 천자를 통해 수득하였다. 역가 시험에 의해, 이들이 뉴트라비딘 (리액티-바인드(Reacti-Bind)™) 뉴트라비딘(TM)-코팅된 폴리스티렌 플레이트, 피어스(Pierce), 일리노이주 록포드)을 통해 고정화된 비오티닐화 BST1 항원을 사용하는 ELISA에 의해 높은 것으로 간주되면, 마우스를 100 μg의 단백질로 제70일, 제71일 및 제72일에 부스팅하고, 이어서 제77일에 희생시켜 비장절제술을 수행하였다. 항체의 역가가 만족스러운 것으로 간주되지 않는다면, 마우스를 100 μg 항원으로 제56일에 부스팅하고, 시험 혈액을 제63일에 채취하였다. 만족스러운 역가가 얻어진다면, 동물을 100 μg의 항원으로 제98일, 제99일 및 제100일에 부스팅하고, 비장을 제105일에 수확하였다.
비장은 지방 및 결합 조직을 잘라내어 버리면서 층류 후드에서 수확하고 페트리 디쉬로 옮겼다. 비장을 1.0 ml의 용액 D (25.0 g 구아니딘 티오시아네이트 (베링거 만하임(Boehringer Mannheim), 인디애나주 인디애나폴리스), 29.3 ml 멸균수, 1.76 ml 0.75 M 시트르산나트륨 pH 7.0, 2.64 ml 10% 사르코실 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 펜실베니아주 피츠버그), 0.36 ml 2-메르캅토에탄올 (피셔 사이언티픽, 펜실베니아주 피츠버그))의 존재하에 멸균 5 cc 시린지로부터 플런저로 빠르게 불렸다. 이 비장 현탁액을 세포가 용해될 때까지 18 게이지 바늘을 통해 당기고, 점성 용액을 마이크로원심분리 튜브로 옮겼다. 페트리 디쉬를 100 μl의 용액 D로 세척하여 임의의 남아있는 비장을 회수하였다. 이어서, 이 현탁액을 22 게이지 바늘을 통해 추가로 5-10회 당겼다.
샘플을 2개의 마이크로원심분리 튜브 사이에 균등하게 나누고, 하기를 순서대로 첨가하며, 각각의 첨가 후에 뒤집어 혼합하였다: 50 μl 2 M 아세트산나트륨 pH 4.0, 0.5 ml 수-포화 페놀 (피셔 사이언티픽, 펜실베니아주 피츠버그), 100 μl 클로로포름/이소아밀 알콜 49:1 (피셔 사이언티픽, 펜실베니아주 피츠버그). 용액을 10초 동안 볼텍싱하고, 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 14 krpm에서 20분 동안 2-8℃에서 원심분리한 후에, 수성 상을 새로운 튜브로 옮겼다. 동등 부피의 수 포화 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜 (50:49:1)을 첨가하고, 튜브를 10초 동안 볼텍싱하였다. 얼음 상에서 15분 인큐베이션 후에, 샘플을 20분 동안 2-8℃에서 원심분리하고, 수성 상을 새로운 튜브로 옮기고, -20℃에서 최소 30분 동안 동등 부피의 이소프로판올로 침전시켰다. 14 krpm에서 20분 동안 4℃에서 원심분리한 후에, 상청액을 흡인 제거하고, 튜브를 잠시 회전시키고, 모든 미량의 액체를 RNA 펠릿으로부터 제거하였다.
RNA 펠릿을 각각 300 μl의 용액 D에 용해시키고, 합하고, -20℃에서 최소 30분 동안 동등 부피의 이소프로판올로 침전시켰다. 샘플을 14 krpm에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하고, 상청액을 상기와 같이 흡인하고, 샘플을 100 μl의 빙냉 70% 에탄올로 헹구었다. 샘플을 다시 14 krpm에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하고, 70% 에탄올 용액을 흡인하고, RNA 펠릿을 진공에서 건조시켰다. 펠릿을 100 μl의 멸균 디에틸 피로카르보네이트-처리된 물에 재현탁시켰다. 농도를 40 μg/ml의 농도에 대해 1.0의 흡광도를 사용하여 A260에 의해 결정하였다. RNA를 -80℃에 저장하였다.
상보적 DNA (cDNA)의 제조
상기 기재된 바와 같이 마우스 비장으로부터 정제된 전체 RNA를 cDNA 제조를 위한 주형으로 직접 사용하였다. RNA (50 μg)를 멸균수로 100 μL로 희석하고, 10 μL의 130 ng/μL 올리고 dT12 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 모델 392 DNA 합성기에서 합성)를 첨가하였다. 샘플을 10분 동안 70℃에서 가열한 후에, 얼음 상에서 냉각시켰다. 40 μL 5* 제1 가닥 완충제 (깁코(Gibco)/BRL, 메릴랜드주 게이더스버그)를, 20 μL 0.1 M 디티오트레이톨 (깁코/BRL, 메릴랜드주 게이더스버그), 10 μL 20 mM 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP, 베링거 만하임, 인디애나주 인디애나폴리스) 및 10 μL 얼음 상 물과 함께 첨가하였다. 이어서, 샘플을 37℃에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 10 μL 역전사효소 (슈퍼스크립트(Superscript)™ II, 깁코/BRL, 메릴랜드주 게이더스버그)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 계속 인큐베이션하였다. cDNA 생성물을 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 직접 사용하였다.
PCR에 의한 항체 유전자의 증폭
PCR을 이용하여 실질적으로 모든 H 및 L 쇄 유전자를 증폭시키기 위해, 실질적으로 모든 공개된 서열에 상응하는 프라이머를 선택하였다. H 및 L의 아미노 말단의 뉴클레오티드 서열이 상당한 다양성을 함유하기 때문에, 33개 올리고뉴클레오티드를 합성하여 H 쇄에 대한 5' 프라이머로 제공하고, 29개 올리고뉴클레오티드를 합성하여 카파 L 쇄에 대한 5' 프라이머로 제공하였다 (US 6,555,310에 기재된 바와 같음). 각각의 쇄에 대한 불변 영역 뉴클레오티드 서열은 H 쇄에 대해 오직 1개의 3' 프라이머 및 카파 L 쇄에 대해 1개의 3' 프라이머만을 필요로 한다.
각각의 프라이머 쌍에 대해 50 μmol의 5' 프라이머, 50 μmol의 3' 프라이머, 0.25 μL Taq DNA 폴리머라제 (5 유닛/μL, 베링거 만하임, 인디애나주 인디애나폴리스), 3 μL cDNA (기재된 바와 같이 제조함), 5 μL 2 mM dNTP, MgCl2을 함유하는 5 μL 10*Taq DNA 폴리머라제 완충제 (베링거 만하임, 인디애나주 인디애나폴리스), 및 H2O (50 μL까지)를 사용하여 50 μL 반응을 수행하였다. 진앰프(GeneAmp)(R) 9600 열 순환기 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 캘리포니아주 포스터 시티)를 이용하여 하기 열순환 프로그램으로 증폭을 수행하였다: 1분 동안 94℃; 30 주기의 20초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 및 30초 동안 72℃, 6분 동안 72℃; 4℃.
이어서, PCR 과정의 dsDNA 생성물에 대해 오직 3' 프라이머만을 사용하는 비대칭 PCR을 수행하여 실질적으로 오직 표적 유전자의 안티센스 가닥만을 생성하였다. 각각의 dsDNA 생성물에 대해 200 μmol의 3' 프라이머, 2 μL의 dsDNA 생성물, 0.5 μL Taq DNA 폴리머라제, 10 μL 2 mM dNTP, MgCl2를 함유하는 10 μL 10*Taq DNA 폴리머라제 완충제 (베링거 만하임, 미국 인디애나주 인디애나폴리스) 및 H2O (100 μL까지)를 사용하여 100 μL 반응을 수행하였다. 상기 기재된 바와 동일한 PCR 프로그램을 이용하여 단일-가닥 (ss)-DNA를 증폭시켰다.
고성능 액체 크로마토그래피에 의한 단일-가닥 DNA의 정제 및 단일-가닥 DNA의 키나제처리
H 쇄 ss-PCR 생성물 및 L 쇄 단일-가닥 PCR 생성물을, 2.5 부피 에탄올 및 0.2 부피 7.5M 아세트산암모늄을 첨가하고, -20℃에서 30분 이상 동안 인큐베이션함으로써 에탄올 침전시켰다. DNA를 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리로 14 krpm에서 10분 동안 2-8℃에서 원심분리하여 펠릿화하였다. 상청액을 주의깊게 흡인하고, 튜브를 2번째로 잠시 회전시켰다. 상청액의 마지막 방울을 피펫으로 제거하였다. DNA를 중간 열로 10분 동안 진공에서 건조시켰다. H 쇄 생성물을 210 μL 물에 모으고, L 쇄 생성물을 개별적으로 210 μL 물에 모았다. 단일-가닥 DNA를 휴렛 팩커드(Hewlett Packard) 1090 HPLC 및 Gen-Pak™ FAX 음이온 교환 칼럼 (밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.), 매사추세츠주 밀포드)을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제하였다. 단일-가닥 DNA를 정제하는데 사용된 구배를 표 1에 나타내었으며, 오븐 온도는 60℃였다. 흡광도를 260 nm에서 모니터링하였다. HPLC로부터 용리된 단일-가닥 DNA를 0.5분 분획으로 수집하였다. 단일-가닥 DNA를 함유하는 분획을 에탄올 침전시키고, 펠릿화시키고, 상기 기재된 바와 같이 건조시켰다. 건조된 DNA 펠릿을 200 μL 멸균수에 모았다.
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단일-가닥 DNA를 돌연변이유발의 제조에서 5'-인산화시켰다. 24 μL 10* 키나제 완충제 (유나이티드 스테이츠 바이오케미칼(United States Biochemical), 오하이오주 클리블랜드), 10.4 μL 10 mM 아데노신-5'-트리포스페이트 (베링거 만하임, 인디애나주 인디애나폴리스), 및 2 μL 폴리뉴클레오티드 키나제 (30 유닛/μL, 유나이티드 스테이츠 바이오케미칼, 오하이오주 클리블랜드)를 각각의 샘플에 첨가하고, 튜브를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 70℃에서 10분 동안 튜브를 인큐베이션하여 반응을 중지시켰다. 트리스 평형화 페놀 (pH>8.0, 유나이티드 스테이츠 바이오케미칼, 오하이오주 클리블랜드):클로로포름:이소아밀 알콜 (50:49:1)로 1회 추출하고, 클로로포름:이소아밀 알콜 (49:1)로 1회 추출하여 DNA를 정제하였다. 추출 후에, DNA를 에탄올 침전시키고, 상기 기재된 바와 같이 펠릿화시켰다. DNA 펠릿을 건조시킨 후에, 50 μL 멸균수에 용해시켰다. 1.0의 흡광도에 대해 33 μg/ml를 사용하여 260 nm에서 DNA 분취액의 흡광도를 측정함으로써 농도를 결정하였다. 샘플을 -20℃에 저장하였다.
비장 항체 파지 라이브러리의 생성에 사용되는 우라실 주형의 제조
1 ml의 이. 콜라이 CJ236 (바이오라드(BioRAD), 캘리포니아 허큘레스) 밤샘 배양물을 250 ml 배플 진탕 플라스크 중의 50 ml 2*YT에 첨가하였다. 배양물을 37℃에서 OD600=0.6으로 성장시키고, BS45 벡터 파지 원액의 10 μl의 1/100 희석액으로 접종하고 (US 6,555,310에 기재됨), 6시간 동안 계속 성장시켰다. 대략 40 ml의 배양물을 12 krpm에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액 (30 ml)을 새로운 원심분리 튜브로 옮기고, 15 μl의 10 mg/ml RNaseA (베링거 만하임, 인디애나주 인디애나폴리스)를 첨가한 후에 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 7.5 ml의 20% 폴리에틸렌 글리콜 8000 (피셔 사이언티픽, 펜실베니아주 피츠버그)/3.5M 아세트산암모늄 (시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.), 미주리주 세인트 루이스)을 첨가하여 파지를 침전시키고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 12 krpm에서 15분 동안 2-8℃에서 원심분리하였다. 상청액을 주의깊게 버리고, 튜브를 잠시 회전시켜 모든 미량의 상청액을 제거하였다. 펠릿을 400 μl의 고염도 완충제 (300 mM NaCl, 100 mM 트리스 pH 8.0, 1 mM EDTA)에 재현탁시키고, 1.5 ml 튜브로 옮겼다.
파지 원액을 어떠한 백색 인터페이스의 흔적도 보이지 않을 때까지 동등 부피의 평형화된 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜 (50:49:1)로 반복적으로 추출한 후에, 동등 부피의 클로로포름:이소아밀 알콜 (49:1)로 추출하였다. DNA를 2.5 부피의 에탄올 및 1/5 부피 7.5 M 아세트산암모늄으로 침전시키고, 30분 동안 -20℃에서 인큐베이션하였다. DNA를 14 krpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하고, 펠릿을 차가운 70% 에탄올로 1회 세척하고, 진공에서 건조시켰다. 우라실 주형 DNA를 30 μl 멸균수에 용해시키고, 농도를 40 μg/ml의 농도에 대해 1.0의 흡광도를 사용하여 A260에 의해 결정하였다. 주형을 멸균수로 250 ng/μL로 희석하고, 분취하고, -20℃에 저장하였다.
항체 파지 라이브러리의 생성을 위한 ss-DNA로의 우라실 주형의 돌연변이유발 및 이. 콜라이로의 전기천공
단일-가닥 중쇄 및 경쇄 유전자를 파지 디스플레이 벡터 우라실 주형 상으로 동시에 도입시킴으로써 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하였다. 전형적인 돌연변이유발을 2 μg 규모 상에서 하기를 0.2 ml PCR 반응 튜브에서 혼합함으로써 수행하였다: 8 μl (250 ng/μL)의 우라실 주형, 8 μL의 10* 어닐링 완충제 (200 mM 트리스 pH 7.0, 20 mM MgCl2, 500 mM NaCl), 3.33 μl의 키나제처리된 단일-가닥 중쇄 삽입물 (100 ng/μL), 3.1 μl의 키나제처리된 단일-가닥 경쇄 삽입물 (100 ng/μL), 및 멸균수 (80 μl까지). DNA를 진앰프(R) 9600 열 순환기에서 하기 열 프로파일을 이용하여 어닐링시켰다: 94℃에서 20초, 60초 동안 85℃, 30분에 걸친 85℃ → 55℃ 구배, 55℃에서 15분 동안 유지. 프로그램이 종료된 후에 DNA를 얼음으로 옮겼다. 신장/라이게이션을 8 μL의 10* 합성 완충제 (5 mM 각각의 dNTP, 10 mM ATP, 100 mM 트리스 pH 7.4, 50 mM MgCl2, 20 mM DTT), 8 μL T4 DNA 리가제 (1 U/μL, 베링거 만하임, 인디애나주 인디애나폴리스), 8 μL 희석된 T7 DNA 폴리머라제 (1 U/μL, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs), 매사추세츠주 비벌리)를 첨가함으로써 수행하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 300 μL의 돌연변이유발 정지 완충제 (10 mM 트리스 pH 8.0, 10 mM EDTA)로 반응을 중지시켰다. 돌연변이유발 DNA를 평형화된 페놀 (pH>8):클로로포름:이소아밀 알콜 (50:49:1)로 1회, 클로로포름:이소아밀 알콜 (49:1)로 1회 추출하고, DNA를 -20℃에서 30분 이상 동안 에탄올 침전시켰다. DNA를 펠릿화하고, 상청액을 상기 기재된 바와 같이 주의깊게 제거하였다. 샘플을 다시 잠시 회전시키고, 모든 미량의 에탄올을 피펫맨으로 제거하였다. 펠릿을 진공에서 건조시켰다. DNA를 4 μL의 멸균수에 재현탁시켰다.
1 μL의 돌연변이유발 DNA (500 ng)를 전기천공을 이용하여 40 μl 전기적격 이. 콜라이 DH12S (깁코/BRL, 메릴랜드주 게이더스버그)로 전달하였다. 형질전환된 세포를 대략 1.0 ml의 밤샘 XL-1 세포 (2*YT 브로쓰를 사용하여 60% 본래 부피로 희석됨)와 혼합하였다. 이어서, 이 혼합물을 15-ml 멸균 배양 튜브로 옮기고, 9 ml의 탑 한천을 플레이팅을 위해 150-mm LB 한천 플레이트 상에 첨가하였다. 플레이트를 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후에, 20℃로 밤새 옮겼다. 이들 플레이트에서 10 ml의 2*YT 중에서 파지를 용리하고, 용해물을 회전시키고, 상청액을 취함으로써 제1 라운드 항체 파지를 제조하였다. 이들 샘플이 BST1에 대한 항체를 선택하는데 사용된 항체 파지 디스플레이 라이브러리이다. LB 한천 플레이트 상에서 현탁된 세포의 10 μl의 10-4 희석액을 플레이팅한 후에 플레이트를 밤새 37℃에서 인큐베이션함으로써 전기천공의 효율을 측정하였다. 효율은 10-4 희석액 플레이트 상의 플라크의 수에 106을 곱하여 계산하였다. 라이브러리 전기천공 효율은 전형적으로 이러한 조건 하에 1*107개 파지 초과이다.
전기천공에 의한 이. 콜라이의 형질전환
전기적격 이. 콜라이 세포를 얼음 상에서 해동시켰다. 기포가 들어가지 않도록 주의하여 세포를 2-3회 상하로 완만하게 피펫팅함으로써 DNA를 40L의 이들 세포와 혼합하였다. 세포를 다시 전달시 기포가 들어가지 않도록 주의하여 얼음 상에서 냉각시킨 진 펄서(Gene Pulser) 큐벳 (0.2 cm 갭, 바이오라드, 캘리포니아주 허큘레스)으로 옮겼다. 큐벳을 이. 콜라이 펄서 (바이오라드, 캘리포니아 허큘레스)에 넣고, 제조업체의 제안에 따라 1.88 kV에서의 전압 설정에서 전기천공시켰다. 형질전환된 샘플을 즉시 2*YT 브로쓰 1 ml 또는 400 μl 2*YT/600 μl 밤샘 XL-1 세포의 혼합물 1 ml에 재현탁시키고, 지시된 절차에 따라 처리하였다.
항체 파지-디스플레이 벡터 돌연변이유발 반응으로 형질전환된 M13 파지 또는 세포의 플레이팅
파지 샘플을 100 mm LB 한천 플레이트 상에 플레이팅하는 경우에 200 μL의 이. 콜라이 XL1-블루의 밤샘 배양물에 또는 멸균 15 ml 배양 튜브 중에서 150 mm 플레이트 상에 플레이팅하는 경우에 600 μL의 밤샘 세포에 첨가하였다. LB 탑 한천 (100 mm 플레이트의 경우에 3 ml 또는 150 mm 플레이트의 경우에 9 ml, 55℃에 저장된 탑 한천 (문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌] 부록 A1 참조))을 첨가한 후에, 혼합물을 미리 가온시킨 (37℃-55℃) LB 한천 플레이트 상에 균등하게 분포시켜 한천 표면 상의 임의의 잉여 수분을 제거하였다. 플레이트를 탑 한천이 고형화될 때까지 실온에서 냉각시켰다. 플레이트를 뒤집고, 지시된 바와 같이 37℃에서 인큐베이션하였다.
비오티닐화 ADP-리보실 시클라제2 및 비오티닐화 항체의 제조
농축된 재조합 BST1 항원 (전장 세포외 도메인)을 광범위하게 BBS (20 mM 보레이트, 150 mM NaCl, 0.1% NaN3, pH 8.0)로 투석하였다. 투석 후에, 1 mg의 BST1 (BBS 중 1 mg/ml)을 15배 몰 과량의 비오틴-XX-NHS 에스테르 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 오레곤주 유진, 원액 용액, DMSO 중 40 mM)와 반응시켰다. 반응물을 실온에서 90분 동안 인큐베이션한 후에, 20 mM의 최종 농도에서 타우린 (시그마 케미칼 캄파니, 미주리주 세인트 루이스)으로 켄칭하였다. 이어서, 비오티닐화 반응 혼합물을 BBS에 대해 2-8℃에서 투석하였다. 투석 후에, 비오티닐화 BST1을 패닝 완충제 (40 mM 트리스, 150 mM NaCl, 20 mg/ml BSA, 0.1% 트윈 20, pH 7.5)에 희석하고, 분취하고, 필요할 때까지 -80℃에 저장하였다.
항체를 중쇄의 카르복시 말단에 위치한 유리 시스테인을 사용하여 3-(N-말레이미딜프로피오닐)비오시틴 (몰레큘라 프로브스, 오레곤주 유진)과 반응시켰다. DTT를 1 mM의 최종 농도로 30분 동안 실온에서 첨가함으로써 항체를 환원시켰다. 환원된 항체를 50 mM 인산칼륨, 10 mM 붕산, 150 mM NaCl, pH 7.0에서 평형화된 세파덱스(Sephadex) G50 탈염 칼럼을 통해 통과시켰다. 3-(N-말레이미딜프로피오닐)-비오시틴을 1 mM의 최종 농도로 첨가하고, 반응을 실온에서 60분 동안 진행시켰다. 이어서, 샘플을 BBS에 대해 충분히 투석하고, 2-8℃에 저장하였다.
아비딘 자기성 라텍스의 제조
자기성 라텍스 (에스타포르(Estapor), 10% 고체, 방스 래보러토리즈(Bangs Laboratories), 인디애나주 피셔스)를 완전하게 재현탁시키고, 2 ml를 15 ml 원추형 튜브로 분취하였다. 자기성 라텍스를 12 ml 증류수에 현탁시키고, 자석 (퍼셉티브 바이오시스템즈(PerSeptive Biosystems), 매사추세츠주 프라밍햄)을 사용하여 10분 동안 용액으로부터 분리하였다. 자석으로의 자기성 라텍스의 분리를 유지하면서, 10 ml 멸균 피펫을 사용하여 액체를 주의깊게 제거하였다. 이 세척 과정을 추가로 3회 반복하였다. 최종 세척 후에, 라텍스를 2 ml의 증류수에 재현탁시켰다. 개별 50 ml 원추형 튜브에서, 10 mg의 아비딘-HS (뉴트라비딘(NeutrAvidin), 피어스, 일리노이주 록포드)를 18 ml의 40 mM 트리스, 0.15 M 염화나트륨, pH 7.5 (TBS)에 용해시켰다. 볼텍싱하면서, 2 ml의 세척된 자기성 라텍스를 희석된 아비딘-HS에 첨가하고, 혼합물을 추가의 30초 동안 혼합하였다. 이 혼합물을 30분마다 진탕시키면서 45℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 아비딘 자기성 라텍스를 자석을 사용하여 용액으로부터 분리하고, 상기 기재된 바와 같이 20 ml BBS로 3회 세척하였다. 최종 세척 후에, 라텍스를 10 ml BBS에 재현탁시키고, 4℃에 저장하였다.
사용 직전에, 아비딘 자기성 라텍스를 패닝 완충제 (40 mM 트리스, 150 mM NaCl, 20 mg/ml BSA, 0.1% 트윈 20, pH 7.5)에서 평형화시켰다. 패닝 실험에 필요한 아비딘 자기성 라텍스 (200 μl/샘플)를 멸균 15 ml 원심분리 튜브에 첨가하고, 패닝 완충제로 10 ml로 만들었다. 튜브를 10분 동안 자석 위에 올려놓아 라텍스를 분리하였다. 용액을 상기 기재된 바와 같이 10 ml 멸균 피펫으로 주의깊게 제거하였다. 자기성 라텍스를 10 ml의 패닝 완충제에 재현탁시켜 제2 세척을 시작하였다. 자기성 라텍스를 패닝 완충제로 총 3회 세척하였다. 최종 세척 후에, 라텍스를 패닝 완충제에 출발 부피로 재현탁시켰다.
실시예 2: BST1 항원에 대한 재조합 폴리클로날 항체의 선택
BST1에 특이적으로 결합하는 결합 시약을 실시예 1에 기재된 바와 같이 과면역화된 마우스로부터 생성된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택하였다.
패닝
제1 라운드 항체 파지는 BS45 우라실 주형을 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 돌연변이유발 DNA의 전기천공을 수행하여 상이한 면역화된 마우스로부터 유래된 파지 샘플을 수득하였다. 재조합 폴리클로날 라이브러리에서 더 많은 다양성을 발생시키기 위해, 각각의 파지 샘플을 별도로 패닝시켰다.
비오티닐화 BST1 항원으로의 제1 라운드의 기능적 패닝 전에, 항체 파지 라이브러리를 그의 표면 상에 중쇄 및 경쇄 둘 다를 디스플레이하는 파지에 대해 7F11-자기성 라텍스 (US 6,555,310의 실시예 21 및 22에 기재된 바와 같음)로 패닝시킴으로써 선택하였다. 이들 풍부화된 라이브러리의 기능적 패닝은 원칙적으로 US 6,555,310의 실시예 16에 기재된 바와 같이 수행하였다. 구체적으로, 10 μL의 1*10-6 M 비오티닐화 BST1 항원을 파지 샘플 (대략 1*10-8 M BST1 최종 농도)에 첨가하고, 혼합물을 밤새 2-8℃에서 평형화시켰다.
평형에 도달한 후에, 샘플을 아비딘 자기성 라텍스로 패닝하여 BST1에 결합된 항체 파지를 포획하였다. 평형화된 아비딘 자기성 라텍스 (실시예 1) (샘플당 200 μL 라텍스)를 파지와 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 10분 후에, 대략 9 ml의 패닝 완충제를 각각의 파지 샘플에 첨가하고, 자기성 라텍스를 자석을 사용하여 용액으로부터 분리하였다. 10분 분리 후에, 결합되지 않은 파지를 10 ml 멸균 피펫을 사용하여 주의깊게 제거하였다. 이어서, 자기성 라텍스를 10 ml의 패닝 완충제에 재현탁시켜 제2 세척을 시작하였다. 라텍스를 상기 기재된 바와 같이 총 3회 세척하였다. 각각의 세척을 위해, 튜브를 10분 동안 자석과 접촉시켜 자기성 라텍스로부터 결합되지 않은 파지를 제거하였다. 제3 세척 후에, 자기성 라텍스를 1 ml의 패닝 완충제에 재현탁시키고, 1.5 mL 튜브로 옮겼다. 이어서, 각각의 샘플에 대해 자기성 라텍스의 전체 부피를 수집하고, 200 μL 2*YT에 재현탁시키고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 150 mm LB 플레이트 상에 플레이팅하여 결합된 파지를 증폭시켰다. 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후에, 밤새 20℃에서 인큐베이션하였다.
결합된 파지를 증폭시키는데 사용된 150 mm 플레이트를 사용하여 다음 라운드의 항체 파지를 생성하였다. 밤새 인큐베이션한 후에, 150 mm 플레이트로부터 10 mL의 2*YT 배지를 론으로 피펫팅함으로써 제2 라운드 항체 파지를 용리하고, 플레이트를 실온에서 20분 동안 완만하게 진탕시켰다. 이어서, 파지 샘플을 플러그 밀봉 캡이 있는 15 ml 일회용 멸균 원심분리 튜브로 옮기고, 튜브를 15분 동안 3500 rpm에서 원심분리함으로써 LB 플레이트로부터의 용해물을 펠릿화시켰다. 이어서, 제2 라운드 항체 파지를 함유하는 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다.
기능적 패닝의 제2 라운드는 100 μL의 각각의 파지 원액을 15 ml 일회용 멸균 원심분리 튜브에서 900 μL의 패닝 완충제로 희석시킴으로써 설정되었다. 이어서, 비오티닐화 BST1 항원을 패닝의 제1 라운드에 대해 기재된 바와 같이 각각의 샘플에 첨가하고, 파지 샘플을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 파지 샘플을 상기 기재된 바와 같이 아비딘 자기성 라텍스로 패닝하였다. 패닝의 진행을 이 지점에서 각각의 라텍스 샘플의 분취액을 100 mm LB 한천 플레이트 상에 플레이팅하여 카파 양성의 백분율을 결정함으로써 모니터링하였다. 각각의 패닝으로부터의 대다수의 라텍스 (99%)를 150 mm LB 한천 플레이트 상에 플레이팅하여 라텍스에 결합된 파지를 증폭시켰다. 100 mm LB 한천 플레이트를 37℃에서 6-7시간 동안 인큐베이션한 후에, 플레이트를 실온으로 옮기고, 니트로셀룰로스 필터 (공경 크기 0.45 mm, BA85 프로트란(Protran), 슐라이허 앤드 슈엘(Schleicher and Schuell), 뉴햄프셔주 킨)를 플라그 상에 중첩시켰다.
니트로셀룰로스 필터를 갖는 플레이트를 밤새 실온에서 인큐베이션한 후에, 염소 항-마우스 카파 알칼리성 포스파타제 접합체로 발색시켜 하기 기재된 바와 같이 카파 양성의 백분율을 결정하였다. 집단에서 카파 양성의 백분율이 보다 낮은 (<70%) 파지 샘플에 대해 7F11-자기성 라텍스로의 패닝의 라운드를 수행한 후에 대략 2*10-9 M에서 비오티닐화 BST1 항원을 사용하여 밤새 2-8℃에서 패닝의 제3 기능적 라운드를 수행하였다. 이 패닝의 라운드를 또한 카파 양성에 대해 모니터링하였다. 카파 양성 백분율이 80%를 초과하는 개별 파지 샘플을 모으고, 이에 대해 5*10-9 M에서 밤새 2-8℃에서 패닝의 최종 라운드를 수행하였다. 이 기능적 패닝의 제4 라운드로부터 용리된 파지 내에 함유된 BST1 항체 유전자를 발현 벡터, pBRncoH3에 서브클로닝하였다.
서브클로닝 과정은 일반적으로 US 6,555,310의 실시예 18에 기재된 바와 같이 수행하였다. 서브클로닝 후에, 발현 벡터를 DH10B 세포에 전기천공시키고, 혼합물을 밤새 1% 글리세롤 및 10 μg/ml 테트라시클린을 함유하는 2*YT에서 성장시켰다. 테트라시클린에서의 성장 및 선택의 제2 라운드 후에, 세포의 분취액을 BST1 폴리클로날 항체 생산을 위한 공급원으로서 -80℃에서 냉동시켰다. 이들 폴리클로날 혼합물로부터 혼합물의 샘플을 10 μg/ml 테트라시클린을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, BST1을 인식하는 항체에 대해 스크리닝함으로써 모노클로날 항체를 선택하였다.
ADP-리보실 시클라제 2에 대한 재조합 항체의 발현 및 정제
진탕 플라스크 접종물을 37℃, 300rpm에서 설정된 이노바(Innova) 4330 인큐베이터 진탕기 (뉴 브런즈윅 사이언티픽(New Brunswick Scientific), 뉴저지주 에디슨)에서 -70℃ 세포 은행으로부터 밤새 생성시켰다. 접종물을 사용하여 3 g/L L-류신, 3 g/L L-이소류신, 12 g/L 카세인 다이제스트(디프코(Difco), 미국 미시간주 디트로이트), 12.5 g/L 글리세롤 및 10 μg/ml 테트라시클린이 보충된 지정된 배양 배지 (문헌 [Pack et al. (1993) Bio/Technology 11: 1271-1277])를 함유하는 20 L 발효조 (애플리콘(Applikon), 미국 캘리포니아주 포스터 시티)에 시딩하였다. 발효조 내의 온도, pH 및 용존 산소는 각각 26℃, 6.0-6.8 및 25% 포화도에서 제어하였다. 폴리프로필렌 글리콜 (다우(Dow), 미시간주 미들랜드)을 첨가하여 발포를 제어하였다. 글리세롤을 공급-배치 방식으로 발효조에 첨가하였다. L(+)-아라비노스 (시그마, 미주리주 세인트 루이스)를 후기 지수 성장기 동안 2 g/L로 첨가하여 Fab 발현을 유도하였다. UV-1201분광광도계 (시마즈(Shimadzu), 메릴랜드주 칼럼비아)에서 600 nm에서의 광학 밀도에 의해 세포 밀도를 측정하였다. 진행 종결 및 6.0로의 pH의 조정 후에, 배양물을 17,000 psi에서 M-210B-EH 마이크로플루이다이저 (마이크로플루이딕스(Microfluidics), 매사추세츠주 뉴턴)를 통해 2회 통과시켰다. 세포의 고압 균질화는 Fab를 배양 상청액으로 방출하였다.
정제의 제1 단계는 확장층 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (EB-IMAC)였다. 스트림라인(Streamline)™ 킬레이팅 수지 (파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이)를 0.1 M NiCl2로 충전시킨 후에, 상향 방향의 50 mM 아세테이트, 200 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 0.01% NaN3, pH 6.0 완충제 흐름에서 확대시키고 평형화시켰다. 원액 용액을 사용하여 배양 균질물을 10 mM 이미다졸로 가져오고, 이후에 평형 완충제로 2배 이상 희석하여 습윤 고체 함량을 5 중량% 미만으로 감소시켰다. 이어서, 이를 300 cm/시의 공탑 속도에서 상향 방향의 유선형 칼럼 흐름 상에 로딩하였다. 세포 용해물은 방해받지 않고 통과하였으나, Fab는 Fab 중쇄 상에서 니켈과 헥사히스티딘 태그 사이의 고친화도 상호작용에 의해 포획되었다. 세척 후에, 확장층을 충전층으로 전환시키고, Fab를 하향 방향의 20 mM 보레이트, 150 mM NaCl, 200 mM 이미다졸, 0.01% NaN3, pH 8.0 완충제 흐름으로 용리하였다.
정제의 제2 단계는 이온-교환 크로마토그래피 (IEC)를 이용하였다. Q 세파로스 패스트플로우(Sepharose FastFlow) 수지 (파마시아, 뉴저지주 피스카타웨이)를 20 mM 보레이트, 37.5 mM NaCl, 0.01% NaN3, pH 8.0에서 평형화시켰다. EB-IMAC 단계로부터의 Fab 용리액 풀을 20 mM 보레이트, 0.01% NaN3, pH 8.0에서 4배 희석하고, IEC 칼럼 상에 로딩하였다. 세척 후에, Fab를 37.5-200 mM NaCl 염 구배로 용리하였다. 용리액 분획을 풀링 전에 엑스셀 II(Xcell II)™ SDS-PAGE 시스템 (노벡스(Novex), 캘리포니아주 샌디에고)을 이용하여 순도에 대해 평가하였다. 최종적으로, Fab 풀을 농축시키고, 저장을 위해 20 mM 보레이트, 150 mM NaCl, 0.01% NaN3, pH 8.0 완충제로 정용여과하였다. 이는 10,000 MWCO 카세트가 장착된 사르토콘 슬라이스(Sartocon Slice)™ 시스템 (사르토리우스(Sartorius), 뉴욕주 보헤미아)에서 달성되었다. 최종 정제 수율은 전형적으로 50%였다. 정제된 Fab의 농도는 280 nm에서 UV 흡광도에 의해 측정하였으며, 1 mg/ml 용액에 대해 1.6의 흡광도를 가정하였다.
실시예 3: 유동 세포측정법 분석에 의해 결정된 BST1에 대한 모노클로날 항체의 특이성
실시예 2에서 선택된 BST1에 대한 항체의 특이성을 유동 세포측정법에 의해 시험하였다. 세포 표면 BST1 단백질에 결합하는 항체의 능력을 시험하기 위해, 항체는 각각 인간 폐 선암종 및 인간 폐 편평세포 암종으로부터 BST1-발현 세포, A549 및 H226과 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제 (DPBS, 2% FBS)에서 세척하고, 원심분리하고, 100μl의 희석된 1차 BST1 항체 (또한 FACS 완충제에서 희석됨)에 재현탁시켰다. 항체-A549 복합체를 얼음 상에서 60분 동안 인큐베이션한 후에 상기 기재된 바와 같이 FACS 완충제로 2회 세척하였다. 세포-항체 펠릿을 100μl의 희석된 2차 항체 (또한 FACS 완충제에서 희석됨)에 재현탁시키고, 얼음 상에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 펠릿을 이전과 같이 세척하고, 200μl FACS 완충제에 재현탁시켰다. 샘플을 BD FACScanto II 유동 세포측정기에 로딩하고, 데이터를 BD FACSdiva 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
결과
유동 세포측정법 분석의 결과는 BST1_A1, BST1_A2 및 BST_A3으로 지칭되는 4개의 모노클로날 항체가 세포-표면 인간 BST1에 효과적으로 결합하였다는 것을 입증하였다. 도 3a는 각각 A549 및 H226 세포 상에서 BST1에 대한 BST1_A1 및 BST1_A2 둘 다의 결합 특이성을 보여준다. 도 3b는 A549 및 H226 세포 상에서 BST1에 대한 BST1_A3의 결합 특이성을 보여준다. 결과는 A549 및 H226 상에서 BST1에 대한 이러한 항체의 강한 결합을 나타낸다.
실시예 4: BST1에 대한 모노클로날 항체의 구조적 특성화
BST1_A2 및 BST1_A1 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA 서열을 표준 PCR 기술을 이용하여 수득하고, 표준 DNA 서열분석 기술을 이용하여 서열분석하였다.
항체 서열을 돌연변이유발시켜 하나 이상의 잔기에서 배선 잔기로 되돌릴 수 있다.
BST1_A2의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 10 및 2이다.
BST1_A2의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 14 및 6이다.
공지된 뮤린 배선 이뮤노글로불린 중쇄 서열에 대한 BST1_A2 중쇄 이뮤노글로불린 서열의 비교는 BST1_A2 중쇄가 뮤린 배선 VH 1-39로부터의 VH 절편을 사용한다는 것을 입증하였다. CDR 영역 결정의 카바트 시스템을 이용하는 BST1_A2 VH 서열의 추가의 분석은 각각 서열 38, 42 및 46에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 도시한다. 배선 VH 1-39 서열에 대한 BST1_A2 CDR1 및 CDR2 VH 서열의 정렬은 도 1a 및 1b에 나타낸다.
공지된 뮤린 배선 이뮤노글로불린 경쇄 서열에 대한 BST1_A2 경쇄 이뮤노글로불린 서열의 비교는 BST1_A2 경쇄가 뮤린 배선 VK 4-55로부터의 VK 절편을 사용한다는 것을 입증하였다. CDR 영역 결정의 카바트 시스템을 이용하는 BST1_A2 VK 서열의 추가의 분석은 각각 서열 49, 52 및 55에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 도시한다. 배선 VK 4-55 서열에 대한 BST1_A2 CDR1, CDR2 및 CDR3 VK 서열의 정렬은 도 2a, 2b 및 2c에 나타낸다.
BST1_A1의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 9 및 1이다.
BST1_A1의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 13 및 5이다.
공지된 뮤린 배선 이뮤노글로불린 중쇄 서열에 대한 BST1_A1 중쇄 이뮤노글로불린 서열의 비교는 BST1_A1 중쇄가 뮤린 배선 VH 1-80으로부터의 VH 절편을 사용한다는 것을 입증하였다. CDR 영역 결정의 서열 카바트 시스템을 이용하는 BST1_A1 VH 서열의 추가의 분석은 각각 서열 37, 41 및 45에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 도시한다. 배선 VH 1-80 서열에 대한 BST1_A1 CDR1 및 CDR2 VH 서열의 정렬은 도 1a 및 1b에 나타낸다.
공지된 뮤린 배선 이뮤노글로불린 경쇄 서열에 대한 BST1_A1 경쇄 이뮤노글로불린 서열의 비교는 BST1_A1 경쇄가 뮤린 배선 VK 4-74로부터의 VK 절편을 사용한다는 것을 입증하였다. CDR 영역 결정의 카바트 시스템을 이용하는 BST1_A1 VK 서열의 추가의 분석은 각각 서열 48, 51 및 54에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 도시한다. 배선 VK 4-74 서열에 대한 BST1_A1 CDR1, CDR2 및 CDR3 VK 서열의 정렬은 도 2a, 2b 및 2c에 나타낸다.
BST1_A3의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 54 및 52이다.
BST1_A3의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 55 및 53이다.
공지된 뮤린 배선 이뮤노글로불린 중쇄 서열에 대한 BST1_A3 중쇄 이뮤노글로불린 서열의 비교는 BST1_A3 중쇄가 뮤린 VH 배선 69-1로부터의 VH 절편을 사용한다는 것을 입증하였다. CDR 영역 결정의 카바트 시스템을 이용하는 BST1_A3 VH 서열의 추가의 분석은 각각 서열 56, 57 및 58에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 도시한다. 뮤린 VH 배선 69-1 서열에 대한 BST1_A3 CDR1 및 CDR2 VH 서열의 정렬은 도 1a 및 1b에 나타낸다.
공지된 뮤린 배선 이뮤노글로불린 경쇄 서열에 대한 BST1_A3 경쇄 이뮤노글로불린 서열의 비교는 BST1_A3 경쇄가 뮤린 VK 배선 44-1로부터의 VK 절편을 사용한다는 것을 입증하였다. CDR 영역 결정의 카바트 시스템을 이용하는 BST1_A3 VK 서열의 추가의 분석은 각각 서열 59, 60 및 61로 나타낸 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 도시한다. 뮤린 VK 배선 44-1 서열에 대한 BST1_A3 CDR1, CDR2 및 CDR3 VK 서열의정렬은 도 2a, 2b 및 2c에 나타낸다.
실시예 5: A549 및 H226 세포에서 BST1_A1 및 BST1_A2의 내재화 및 MabZAP.
H226 및 A549에 의한 BST1_A1 및 BST1_A2의 내재화는 MabZap 검정을 이용하여 연구하였다. MabZAP 검정은 독소 사포린에 접합된 항-인간 IgG 2차 항체의 결합을 통한 항-BST1 모노클로날 항체의 내재화를 보여주었다. (어드밴스드 타겟팅 시스템(Advanced Targeting System), 캘리포니아주 샌디에고, IT-22-100). 우선, BST1 Fab를 세포의 표면에 결합시켰다. 이어서, MabZAP 항체를 1차 항체에 결합시켰다. 다음으로, MabZAP 복합체를 세포에 의해 내재화시켰다. 세포로 사포린을 진입시켜 단백질 합성을 억제하고, 궁극적으로는 세포를 사멸시켰다.
MabZAP 검정을 다음과 같이 수행하였다. 각각의 세포를 웰당 5x103개 세포의 밀도로 시딩하였다. 항-BST1 모노클로날 항체 또는 이소형 대조군 인간 IgG를 연속적으로 희석한 후에 세포에 첨가하고, 15분 동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, MabZAP를 첨가하고, 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트에서의 세포 생존율을 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광 세포 생존율 검정 키트 (프로메가(Promega), G7571)에 의해 검출하고, 플레이트를 판독하고, 프로메가 글로맥스(Glomax)를 이용하여 분석하였다. 세포 사멸은 항-BST1 모노클로날 항체의 농도에 비례하였다. 도 4a 및 4b는 항-BST1 모노클로날 항체, BST1_A1 및 BST1_A2가 항-인간 IgG 이소형 대조군 항체와 비교하여 H226 및 A549 세포에 의해 효율적으로 내재화되었다는 것을 보여준다.
실시예 6: BST1_A2의 인간화
BST1_A2 VH 및 VL의 인간화 서열을 설계하기 위해, CDR 구조의 형성에 중요한 프레임워크 아미노산을 3차원 모델을 이용하여 확인하였다. BST1_A2와 높은 상동성을 갖는 인간 VH 및 VL 서열을 또한 진뱅크 데이터베이스로부터 선택하였다. CDR 서열을 확인된 프레임워크 아미노산 잔기와 함께 BST1_A2로부터 인간 프레임워크 서열로 그라프팅시켰다 (도 5-7).
실시예 7: 항- BST1 mAb 에 의해 매개되는 항체-의존성 세포성 세포독성
우선 10nm/L 내지 0.1nm/L 농도 범위의 25μl의 부모 및 비-푸코실화 항-BST1 항체 (BST1_A2 및 BST1_A2_NF)를 v 바닥 96 웰 플레이트의 개별 웰에 50μl의 BST1-발현 A549 및 U937 세포와 함께 첨가하였다. 이어서, 25μl의 이펙터 세포를 웰에 첨가하여 10:1 및 25:1의 최종 이펙터: 표적 (E: T) 비를 수득하였다. 이어서, 플레이트를 1000rpm에서 2분 동안 완만하게 회전시키고, 그 후에 이를 4시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 3시간 후에, 10μl의 용해 용액을 최대 LDH 방출을 측정하기 위해 BST1-발현 세포를 단독으로 함유하는 각각의 웰에 첨가하고, 부피 보정 제어를 위해 배지를 단독으로 함유하는 1개의 세트의 웰에 첨가하였다.
인큐베이션 후에, 세포를 1000rpm에서 2분 동안 완만하게 회전시키고, 그 후에 50μl의 상청액을 편평 바닥 96 웰 플레이트로 옮겼다. 프로메가 (카탈로그 #: G1780)로부터 입수가능한 시토톡스 96(CytoTox 96)® 비-방사성 세포독성 검정을 이용하여, 키트 성분을 제조업체의 지시에 따라 재구성하고, 이어서 50 μl의 기질 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 덮고, 광을 차단하여 25℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이에 따라, 50 μl의 정지 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 흡광도를 배리오스칸(varioskan) 플레이트 판독기를 이용하여 490nm에서 판독하였다.
양성 대조군으로서의 ADCC 및 음성 대조군으로서의 인간 IgG1 이소형 대조군을 통해 세포-사멸을 자극하는 것으로 알려진 항체를 사용하여, 결과는 BST1_A2 및 BST1_A2_NF가 BST1-발현 A549 및 U937 세포 상에서 ADCC를 도출할 수 있다는 것을 보여준다. BST1-발현 A549 세포 상에서, BST1_A2_NF는 10nmol/L에서 대략 45% 사멸을 나타내었다 (도 8a). BST1-발현 U937 세포 상에서, BST1_A2는 1nmol/L에서 대략 20% 사멸을 나타내었고, BST1_A2_NF는 1nmol/L에서 대략 45% 사멸을 나타내었다 (도 8b).
실시예 8: AML 환자에서 유동 세포측정법 분석에 의해 결정된 BST1에 대한 모노클로날 항체의 특이성
AML을 앓고 있는 환자로부터의 림프모구에 결합하는 BST_A2의 능력을 유동 세포측정법 분석에 의해 시험하였다. 혈액을 20명의 AML 환자에서 채취하였다. 실시예 3에서 기재된 바와 같은 절차를 이용하여, BST_A2는 AML 환자의 대략 80%의 AML 아세포에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
서열 목록
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
SEQUENCE LISTING <110> Oxford Biotherapeutics Ltd. <120> Antibodies <130> 698015018WO01 <140> PCT/US2012/044703 <141> 2012-06-28 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 253 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 1 5 10 15 Pro Val Ala Lys Ala Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 20 25 30 Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ala Phe Ser Asn Ser Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Tyr Asp Thr Asn 65 70 75 80 Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Tyr Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Gly Asn Leu 115 120 125 Gly Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 145 150 155 160 Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 195 200 205 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val 210 215 220 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 225 230 235 240 Ile Val Pro Arg Asp Cys His His His His His His His 245 250 <210> 2 <211> 246 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 1 5 10 15 Pro Val Ala Lys Ala Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 20 25 30 Val Lys Ala Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ser Phe Ile Glu Tyr Thr Ile Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys 50 55 60 Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Met Phe Thr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser 85 90 95 Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Ser Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 130 135 140 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val 145 150 155 160 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro 210 215 220 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys His 225 230 235 240 His His His His His His 245 <210> 3 <211> 237 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Met Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Met Ser Thr Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser 35 40 45 Ser Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His 100 105 110 Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn 145 150 155 160 Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser 165 170 175 Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys 180 185 190 Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu 195 200 205 Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser 210 215 220 Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Ser 225 230 235 <210> 4 <211> 235 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ala Ile 20 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<213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (808)..(808) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 acgctttgta catggagaaa ataaagtgaa acaaagcact attgcactgg cactcttacc 60 gctcttattt acccctgtgg caaaagccca ggtgaagctt cagcagtccg gggctgagct 120 ggtgaggcct gggtcctcag tgaagatttc ctgcaaggct tctggctacg cattcagtaa 180 ctcctggata aactgggtga agcagaggcc tggacagggt cttgagtgga ttggacagat 240 ttatcctgga gattatgata ctaactacaa tggaaaattc aagggtaaag ccacactgac 300 tgcagactac tcctccagca cagcctacat gcagctcaac agcctaacat ctgaggactc 360 tgcggtctat ttctgtgcaa gggggggatc gatctactat ggtaacctcg ggttcttcga 420 tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctcagcc aaaacgacac ccccatctgt 480 ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc atggtgaccc tgggatgcct 540 ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg aactctggat ccctgtccag 600 cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc tacactctga gcagctcagt 660 gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc tgcaacgttg cccacccggc 720 cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat tgtcatcatc accatcacca 780 tcactaattg acagcttatc atcgatangc t 811 <210> 6 <211> 803 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 aaaaccctgg cgttacccac gctttgtaca tggagaaaat aaagtgaaac aaagcactat 60 tgcactggca ctcttaccgc tcttatttac ccctgtggca aaagcccagg cttatctaca 120 gcagtctgga cctgagctgg tgaaggctgg cgcttcagtg aagatgtcct gcaaggcttc 180 tggttactca ttcattgagt acaccataaa ctgggtgaaa cagagccatg gaaagagcct 240 tgagtggatt ggaaatattg atccttatta tggaaccact tattacaatc agatgttcac 300 gggcaaggcc acattgactg tagaccaatc ttccaacact gcctacatgc agctcaagag 360 cctgacatct gaggactctg cagtctattt ctgtgcaaga ggctccgcct ggtttcctta 420 ctggggccag gggactctag tcactgtctc tgcagccaaa acgacacccc catctgtcta 480 tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg gtgaccctgg gatgcctggt 540 caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac tctggatccc tgtccagcgg 600 tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac actctgagca gctcagtgac 660 tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc aacgttgccc acccggccag 720 cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt catcatcacc atcaccatca 780 ctaattgaca gcttatcatc gat 803 <210> 7 <211> 759 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 gtttttttgg atggagtgaa acgatgaaat acctattgcc tacggcagcc gctggattgt 60 tattactcgc tgcccaacca gccatggccg aaatggttct cacccagtct ccagcaatca 120 tgtctacatc tctaggggaa cgggtcacca tgacctgcac tgccagctca cgtgtaagtt 180 ccagttactt gcactggtac cagcagaagc caggatcctc ccccaaactc tggatttata 240 gtacatccaa cctggcttct ggagtcccag ctcgcttcag tggcagtggg tctgggacct 300 cttactctct cacaatcagc agcatggagg ctgaagatgc tgccacttat tactgccacc 360 agtatcatcg ttccccgtac acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgggctg 420 atgctgcacc aactgtatcc atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg 480 cctcagtcgt gtgcttcttg aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga 540 ttgatggcag tgaacgacaa aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag 600 acagcaccta cagcatgagc agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata 660 acagctatac ctgtgaggcc actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca 720 acaggaatga gtcttaagtg attagctaat tctagaacg 759 <210> 8 <211> 804 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 actctctact gtttctccat acccgttttt ttggatggag tgaaacgatg aaatacctat 60 tgcctacggc agccgctgga ttgttattac tcgctgccca accagccatg gccgacatcg 120 ttatgtctca gtctccagca atcatgtctg catctccagg ggagaaggtc accatgacct 180 gcagtgccag ctcaagtgta acttacatgt actggtacca gcagaagcca ggatcctccc 240 ccagactcct gatttatgac acatccaacc tggcttctgg agtccctgtt cgcttcagtg 300 gcagtgggtc tgggacctct tactctctca caatcagccg aatggaggct gaagatactg 360 ccacttatta ctgccagcag tggagtaatt acccactcac gttcggtgct gggaccaagc 420 tggagctgaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca tccagtgagc 480 agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac cccaaagaca 540 tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg aacagttgga 600 ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg ttgaccaagg 660 acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca tcaacttcac 720 ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt cttaagtgat tagctaattc tagaacgcgt 780 cacttggcac tggccgtcgt ttta 804 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Ser Trp Ile Asn Trp 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Gly Tyr Ser Phe Ile Glu Tyr Thr Ile Asn Trp 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Tyr Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 1 5 10 15 Lys <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Gln Met Phe 1 5 10 15 Thr <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Ala Arg Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Gly Asn Leu Gly Phe Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Ala Arg Gly Ser Ala Trp Phe Pro Tyr 1 5 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Thr Ala Ser Ser Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Gln Gln Trp Ser Asn Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 ggctacgcat tcagtaactc ctggataaac tgg 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 22 ggttactcat tcattgagta caccataaac tgg 33 <210> 23 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 23 ggacagattt atcctggaga ttatgatact aactacaatg gaaaattcaa g 51 <210> 24 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 24 ggaaatattg atccttatta tggaaccact tattacaatc agatgttcac g 51 <210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 25 gcaagggggg gatcgatcta ctatggtaac ctcgggttct tcgatgtc 48 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 26 gcaagaggct ccgcctggtt tccttac 27 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 27 actgccagct cacgtgtaag ttccagttac ttgcac 36 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 28 agtgccagct caagtgtaac ttacatgtac 30 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 29 agtacatcca acctggcttc t 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 30 gacacatcca acctggcttc t 21 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 31 caccagtatc atcgttcccc gtacacg 27 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 32 cagcagtgga gtaattaccc actcacg 27 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 33 ggctacgcat tcagtagcta ctggatgaac tgg 33 <210> 34 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 34 ggacagattt atcctggaga tggtgatact aactacaacg gaaagttcaa g 51 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 35 ggttactcat tcactgacta caacatgaac tgg 33 <210> 36 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 36 ggagtaatta atcctaacta tggtactact agctacaatc agaagttcaa g 51 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 37 actgccagct caagtgtaag ttccagttac ttgcac 36 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 38 agcacatcca acctggcttc t 21 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 39 caccagtatc atcgttcccc accca 25 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 40 agtgccagct caagtgtaag ttacatgtac 30 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 41 gacacatcca acctggcttc t 21 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 42 cagcagtgga gtagttaccc accca 25 <210> 43 <211> 318 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Ala Ala Gln Gly Cys Ala Ala Ser Arg Leu Leu Gln Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Gly Ala Arg Ala 20 25 30 Arg Trp Arg Gly Glu Gly Thr Ser Ala His Leu Arg Asp Ile Phe Leu 35 40 45 Gly Arg Cys Ala Glu Tyr Arg Ala Leu Leu Ser Pro Glu Gln Arg Asn 50 55 60 Lys Asn Cys Thr Ala Ile Trp Glu Ala Phe Lys Val Ala Leu Asp Lys 65 70 75 80 Asp Pro Cys Ser Val Leu Pro Ser Asp Tyr Asp Leu Phe Ile Asn Leu 85 90 95 Ser Arg His Ser Ile Pro Arg Asp Lys Ser Leu Phe Trp Glu Asn Ser 100 105 110 His Leu Leu Val Asn Ser Phe Ala Asp Asn Thr Arg Arg Phe Met Pro 115 120 125 Leu Ser Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Phe Leu Ser Trp Cys 130 135 140 Arg Gln Lys Asn Asp Ser Gly Leu Asp Tyr Gln Ser Cys Pro Thr Ser 145 150 155 160 Glu Asp Cys Glu Asn Asn Pro Val Asp Ser Phe Trp Lys Arg Ala Ser 165 170 175 Ile Gln Tyr Ser Lys Asp Ser Ser Gly Val Ile His Val Met Leu Asn 180 185 190 Gly Ser Glu Pro Thr Gly Ala Tyr Pro Ile Lys Gly Phe Phe Ala Asp 195 200 205 Tyr Glu Ile Pro Asn Leu Gln Lys Glu Lys Ile Thr Arg Ile Glu Ile 210 215 220 Trp Val Met His Glu Ile Gly Gly Pro Asn Val Glu Ser Cys Gly Glu 225 230 235 240 Gly Ser Met Lys Val Leu Glu Lys Arg Leu Lys Asp Met Gly Phe Gln 245 250 255 Tyr Ser Cys Ile Asn Asp Tyr Arg Pro Val Lys Leu Leu Gln Cys Val 260 265 270 Asp His Ser Thr His Pro Asp Cys Ala Leu Lys Ser Ala Ala Ala Ala 275 280 285 Thr Gln Arg Lys Ala Pro Ser Leu Tyr Thr Glu Gln Arg Ala Gly Leu 290 295 300 Ile Ile Pro Leu Phe Leu Val Leu Ala Ser Arg Thr Gln Leu 305 310 315 <210> 44 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Gly Ala Arg Ala Arg Trp Arg Gly Glu Gly Thr Ser Ala His Leu Arg 1 5 10 15 Asp Ile Phe Leu Gly Arg Cys Ala Glu Tyr Arg Ala Leu Leu Ser Pro 20 25 30 Glu Gln Arg Asn Lys Asn Cys Thr Ala Ile Trp Glu Ala Phe Lys Val 35 40 45 Ala Leu Asp Lys Asp Pro Cys Ser Val Leu Pro Ser Asp Tyr Asp Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Leu Ser Arg His Ser Ile Pro Arg Asp Lys Ser Leu Phe 65 70 75 80 Trp Glu Asn Ser His Leu Leu Val Asn Ser Phe Ala Asp Asn Thr Arg 85 90 95 Arg Phe Met Pro Leu Ser Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Phe 100 105 110 Leu Ser Trp Cys Arg Gln Lys Asn Asp Ser Gly Leu Asp Tyr Gln Ser 115 120 125 Cys Pro Thr Ser Glu Asp Cys Glu Asn Asn Pro Val Asp Ser Phe Trp 130 135 140 Lys Arg Ala Ser Ile Gln Tyr Ser Lys Asp Ser Ser Gly Val Ile His 145 150 155 160 Val Met Leu Asn Gly Ser Glu Pro Thr Gly Ala Tyr Pro Ile Lys Gly 165 170 175 Phe Phe Ala Asp Tyr Glu Ile Pro Asn Leu Gln Lys Glu Lys Ile Thr 180 185 190 Arg Ile Glu Ile Trp Val Met His Glu Ile Gly Gly Pro Asn Val Glu 195 200 205 Ser Cys Gly Glu Gly Ser Met Lys Val Leu Glu Lys Arg Leu Lys Asp 210 215 220 Met Gly Phe Gln Tyr Ser Cys Ile Asn Asp Tyr Arg Pro Val Lys Leu 225 230 235 240 Leu Gln Cys Val Asp His Ser Thr His Pro Asp Cys Ala Leu Lys Ser 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Thr Gln Arg Lys 260 <210> 45 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Ala Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Glu Tyr 20 25 30 Thr Ile Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Gln Met Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 46 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Glu Tyr 20 25 30 Thr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Gln Met Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Ala Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (31)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(66) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (99)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Pro Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 49 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asn Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 50 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (24)..(34) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(56) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (89)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 50 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Gln Met Phe Gln 1 5 10 15 <210> 52 <211> 245 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 1 5 10 15 Pro Val Ala Lys Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Arg Ala Glu Leu 20 25 30 Val Met Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Val His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Gly Ser Asp Thr Phe Asn Asp 65 70 75 80 Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Val Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Leu Gln Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 130 135 140 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 210 215 220 Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys His His 225 230 235 240 His His His His His 245 <210> 53 <211> 236 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys 50 55 60 Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Gly Glu Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys 85 90 95 Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His 100 105 110 His Tyr Gly Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser 130 135 140 Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu 165 170 175 Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr 195 200 205 Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr 210 215 220 Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Ser 225 230 235 <210> 54 <211> 738 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 54 gtgaaacaaa gcactattgc actggcactc ttaccgctct tatttacccc tgtggcaaaa 60 gcccaggtcc agctgcagca gtctagggct gaacttgtga tgcctggggc ttcagtgaag 120 atgtcctgca agacttctgg ctacacattc tctgactact gggtacactg ggtgaggcag 180 aggcctggac aaggccttga gtggatcgga gcgattgatg gttctgatac ttttaatgac 240 tacagtcaga agtttaaggg cagggccaca ttgactgtag acgaatcctc cagcacagtc 300 tacatgcaac tcagcagcct gacatctgag gactctgcgg tctattactg tgcaaggggg 360 ggccttcttc agtactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcagc caaaacgaca 420 cccccatctg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc 480 ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga 540 tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg 600 agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt 660 gcccacccgg ccagcagcac caaggtggac aagaaaattg tgcccaggga ttgtcatcat 720 caccatcacc atcactaa 738 <210> 55 <211> 711 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 55 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgctgc ccaaccagcc 60 atggccgaca ttcagctgac ccagtctcca gcctccctat ctgcatctgt gggagaaact 120 gtcaccatca catgtcgagc aagtgaaaac atttacagtt atttagcatg gtatcagcag 180 aaacagggaa aatctcctca gctcctggtc tataatacaa aaaccttagg agaaggtgtg 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatcgggc acacaatttt ctctgaagat caacagcctg 300 cagcctgaag attttgggag ttattactgt caacatcatt atggtactcc attcacgttc 360 ggctcgggga caaagttgga aataaaacgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 420 ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac 480 ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc 540 gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc 600 ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac 660 aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtctta a 711 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Val His Trp 1 5 10 <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Gly Ala Ile Asp Gly Ser Asp Thr Phe Asn Asp Tyr Ser Gln Lys Phe 1 5 10 15 Lys <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 58 Ala Arg Gly Gly Leu Leu Gln Tyr 1 5 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 60 Asn Thr Lys Thr Leu Gly Glu 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61 Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 62 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 62 ggctacacat tctctgacta ctgggtacac tgg 33 <210> 63 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 63 ggagcgattg atggttctga tacttttaat gactacagtc agaagtttaa g 51 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 64 gcaagggggg gccttcttca gtac 24 <210> 65 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 65 cgagcaagtg aaaacattta cagttattta gca 33 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 66 aatacaaaaa ccttaggaga a 21 <210> 67 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 67 caacatcatt atggtactcc attcacg 27 <210> 68 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 68 ggctacacct tcaccagcta ctggatgcac tgg 33 <210> 69 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 69 ggagagattg atccttctga tagttatact aactacaatc aaaagttcaa g 51 <210> 70 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 70 cgagcaagtg agaatattta cagttattta gca 33 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 71 aatgcaaaaa ccttagcaga a 21 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 72 caacatcatt atggtactcc tcc 23

Claims (31)

  1. a) i) 서열 10을 포함하는 제1 vhCDR;
    ii) 서열 12 및 서열 51로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 vhCDR; 및
    iii) 서열 14를 포함하는 제3 vhCDR
    을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    b) i) 서열 16을 포함하는 제1 vlCDR;
    ii) 서열 18을 포함하는 제2 vlCDR; 및
    iii) 서열 20을 포함하는 제3 vlCDR
    을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, BST1에 특이적으로 결합하는 항체.
  2. a) i) 서열 9를 포함하는 제1 vhCDR;
    ii) 서열 11을 포함하는 제2 vhCDR; 및
    iii) 서열 13을 포함하는 제3 vhCDR
    을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    b) i) 서열 15를 포함하는 제1 vlCDR;
    ii) 서열 17을 포함하는 제2 vlCDR; 및
    iii) 서열 19를 포함하는 제3 vlCDR
    을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, BST1에 특이적으로 결합하는 항체.
  3. a) i) 서열 56을 포함하는 제1 vhCDR;
    ii) 서열 57을 포함하는 제2 vhCDR; 및
    iii) 서열 58을 포함하는 제3 vhCDR
    을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    b) i) 서열 59를 포함하는 제1 vlCDR;
    ii) 서열 60을 포함하는 제2 vlCDR; 및
    iii) 서열 61을 포함하는 제3 vlCDR
    을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, BST1에 특이적으로 결합하는 항체.
  4. a) 서열 10을 포함하는 제1 vhCDR;
    b) 서열 12 및 서열 51로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 vhCDR;
    c) 서열 14를 포함하는 제3 vhCDR;
    d) 서열 16을 포함하는 제1 vlCDR;
    e) 서열 18을 포함하는 제2 vlCDR; 및
    f) 서열 20을 포함하는 제3 vlCDR
    을 포함하는 부모 항체의 변이체 가변 영역을 포함하며, 상기 제1 vhCDR, 상기 제2 vhCDR, 상기 제3 vhCDR, 상기 제1 vlCDR, 상기 제2 vlCDR 및 상기 제3 vlCDR에 총괄적으로 1 내지 4개의 아미노산 변화를 갖는 변이체 항-BST1 항체.
  5. a) 서열 9를 포함하는 제1 vhCDR;
    b) 서열 11을 포함하는 제2 vhCDR;
    c) 서열 13을 포함하는 제3 vhCDR;
    d) 서열 15를 포함하는 제1 vlCDR;
    e) 서열 17을 포함하는 제2 vlCDR; 및
    f) 서열 19를 포함하는 제3 vlCDR
    을 포함하는 부모 항체의 변이체 가변 영역을 포함하며, 상기 제1 vhCDR, 상기 제2 vhCDR, 상기 제3 vhCDR, 상기 제1 vlCDR, 상기 제2 vlCDR 및 상기 제3 vlCDR에 총괄적으로 1 내지 4개의 아미노산 변화를 갖는 변이체 항-BST1 항체.
  6. a) 서열 56을 포함하는 제1 vhCDR;
    b) 서열 57을 포함하는 제2 vhCDR;
    c) 서열 58을 포함하는 제3 vhCDR;
    d) 서열 59를 포함하는 제1 vlCDR;
    e) 서열 60을 포함하는 제2 vlCDR; 및
    f) 서열 61을 포함하는 제3 vlCDR
    을 포함하는 부모 항체의 변이체 가변 영역을 포함하며, 상기 제1 vhCDR, 상기 제2 vhCDR, 상기 제3 vhCDR, 상기 제1 vlCDR, 상기 제2 vlCDR 및 상기 제3 vlCDR에 총괄적으로 1 내지 4개의 아미노산 변화를 갖는 변이체 항-BST1 항체.
  7. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    서열 2와 적어도 95% 동일한 중쇄, 및
    서열 4와 적어도 95% 동일한 경쇄
    를 포함하는 항체.
  8. 제1항에 있어서,
    서열 2의 중쇄 가변 영역, 및
    서열 4의 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체.
  9. 제2항 또는 제5항에 있어서,
    서열 1과 적어도 95% 동일한 중쇄, 및
    서열 3과 적어도 95% 동일한 경쇄
    를 포함하는 항체.
  10. 제2항에 있어서,
    서열 1의 중쇄 가변 영역, 및
    서열 3의 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체.
  11. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    서열 46과 적어도 95% 동일한 중쇄, 및
    서열 49와 적어도 95% 동일한 경쇄
    를 포함하는 항체.
  12. 제11항에 있어서,
    서열 46의 중쇄 가변 영역, 및
    서열 49의 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체.
  13. 제3항 또는 제6항에 있어서,
    서열 52와 적어도 95% 동일한 중쇄, 및
    서열 53과 적어도 95% 동일한 경쇄
    를 포함하는 항체.
  14. 제13항에 있어서,
    서열 52의 중쇄 가변 영역, 및
    서열 53의 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체.
  15. 본래 서열의 BST1에 대한 결합의 적어도 80%를 유지하는 DNA 및 아미노산 변화를 포함하는 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 항체에 의해 인식되는 BST1 상의 에피토프에 결합하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 전장 항체인 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 부착된 모이어티를 추가로 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  18. 제17항에 있어서, 상기 모이어티가 약물인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  19. 제18항에 있어서, 상기 약물이 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, CC1065 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및/또는 T-세포 세포독성을 유도하는 단리된 항체.
  21. 제20항에 있어서, Fc 수용체에 대한 증가된 결합 및/또는 ADCC에 대해 증가된 효력을 갖는 조작된 항체 및/또는 이중특이적 항체인 단리된 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, BST1을 포함하는 제1 항원 및 CD3 항원 및 CD5 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체인 단리된 항체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산.
  25. 제23항 또는 제24항의 핵산을 함유하는 숙주 세포.
  26. 제25항의 숙주 세포를 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 발현되는 조건 하에 배양하는 것, 및 임의로 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 단리하는 것을 포함하는, 항체를 제조하는 방법.
  27. 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 BST1를 발현하는 세포에 의해 내재화되고, 상기 항체는 공유 부착된 약물 접합체를 포함하는 것인, 질환을 치료하는 방법.
  28. 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및/또는 T-세포 세포독성을 유발하는 것인, 질환을 치료하는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 질환이 급성 골수성 백혈병 (AML), B-세포 만성 림프구성 백혈병, 유방암, 결장직장암, 신장암, 두경부암, 폐암, 난소암 및 췌장암을 비롯한 암인 방법.
  30. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 질환이 천식, 통풍, 크론병, 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선, 당뇨병 및 아테롬성동맥경화증을 비롯한 염증성 질환인 방법.
  31. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 또는 의약으로 사용하기 위한 항체.
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