JP6949343B1 - 抗体薬物コンジュゲート及び抗体の薬物送達のための使用 - Google Patents

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Abstract

新生血管を標的とした新たな薬物送達手段の提供を目的とする。透過性が亢進した血管を標的とした新たな薬物送達手段の提供を目的とする。さらに、悪性の腫瘍をはじめとする各種疾患の処置又は診断のための方法及び検出試薬を提供することを目的とする。抗ＨＭＧＢ１抗体又はその抗原結合性断片と薬物とのコンジュゲートを投与して、血管新生又は透過性が亢進している血管の血管内皮細胞に取り込ませ、当該薬物を細胞内に送達する。また、前記コンジュゲートを用いて、悪性の腫瘍をはじめとする各種疾患の処置又は診断のための方法及び検出試薬を提供する。

Description

本発明は、抗ＨＭＧＢ１抗体を用いた抗体薬物コンジュゲート並びに抗ＨＭＧＢ１抗体及びその抗原結合性断片の薬物送達のための使用に関する。
近年、癌やその他の疾患の処置のために、病変細胞の特定の分子を標的とする抗体や抗体薬物コンジュゲートなどの分子標的薬が開発されている。しかし、例えば癌においては、癌細胞の変異によって、抗体に対する耐性や抵抗性が生じることが知られている。また、癌の種類によって提示される抗原の種類が異なるため、特定の抗体が適用可能な癌の種類は限られる。
そこで、例えば固形癌においては、腫瘍細胞そのものではなく、腫瘍組織内で新生される血管を標的とする抗体（ＶＥＧＦ抗体など）が開発されている。また、腫瘍に対する自然免疫応答の抑制を解除する免疫チェックポイント阻害剤（抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体など）が、幅広く各種腫瘍に適用可能な薬剤として開発されている。しかし、新生血管を標的とする抗体は腫瘍血管のみならず正常な血管の新生を阻害することがある。また免疫チェックポイント阻害剤も実際には一部の癌にしか奏功しないことが知られている。
そこで、新たなメカニズムによって腫瘍を処置するための抗腫瘍薬が待ち望まれていた。
他方で、癌と同様に血管のダイナミックな変化が起こる現象として、血液脳関門（ＢＢＢ）の破綻が注目されている。脳梗塞、脳卒中や脳外傷、あるいは脳内炎症によって、内因性のダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）であるＨＭＧＢ１（High Mobility Group Box 1、非特許文献１）が神経細胞などの細胞核から細胞外に放出される。そして、ＨＭＧＢ１が引き金となって、脳内で起炎性のサイトカインが増加するとともに、血液脳関門における脳血管の透過性を上げる。その結果、ＢＢＢ破綻が起こる。ＢＢＢ破綻と炎症によって脳浮腫や低酸素症が惹起され、また炎症がＨＭＧＢ１のさらなる放出を促進するために、症状の悪化に正のフィードバックをもたらす。さらに、てんかんにも、ＨＭＧＢ１やＢＢＢ破綻が関与していることが示唆されている（非特許文献２、３）。
例えば特許文献１では、各種炎症性疾患の治療又は予防のために、抗ＨＭＧＢ１抗体又はその抗原結合性断片を中和抗体として用いることが記載されている。しかしながら、斯る技術は、抗ＨＭＧＢ１抗体又はその抗原結合性断片自体を用いて、各種炎症性疾患を治療又は予防するものである。
ＷＯ２０１４／１１５４３０号公報
Annual Review of Immunology, 2011, Vol.29, pp.139-162 日本薬理学雑誌、2018年、第151巻、4-8頁 Journal of Pharmacological Science, 2019, Vol.140, pp.94-101
本発明は、上記の状況に鑑み、新生血管を標的とした新たな薬物送達手段の提供を目的とする。
また、本発明は、上記の状況に鑑み、透過性が亢進した血管を標的とした新たな薬物送達手段の提供を目的とする。
さらに、本発明は、悪性の腫瘍をはじめとする各種疾患の処置又は診断のための方法及び検出試薬を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討した結果、抗ＨＭＧＢ１抗体又はその抗原結合性断片と薬物のコンジュゲートが、血管新生が亢進している血管内皮細胞に取り込まれ、当該薬物を細胞内に送達できることを見出した。
さらに、本発明者らは、抗ＨＭＧＢ１抗体又はその抗原結合性断片と薬物のコンジュゲートが、てんかんにおける脳血管などの透過性が亢進した血管の内皮細胞に取り込まれることを見出した。
また、本発明者らは、抗ＨＭＧＢ１抗体又はその抗原結合性断片と薬物のコンジュゲートは、正常な血管へは実質的に取り込まれないことを見出した。
本発明者らは、以上の知見をもとに、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、以下の抗体薬物コンジュゲートを提供する。
［１］
ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片部分と、前記抗体又はその抗原結合性断片部分に連結された薬物部分とを含む、抗体薬物コンジュゲート。
［２］
前記薬物部分と前記抗体又はその抗原結合性断片部分とが、１以上のリンカーで連結されている、［１］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［３］
前記薬物部分が、細胞傷害剤、細胞保護剤、プローブ、血管新生阻害剤、免疫抑制剤、降圧剤、昇圧剤、疼痛緩和剤、サイトカイン、抗生物質、及び免疫チェックポイント阻害剤からなる群より選ばれる１種又は２種以上を含む、［１］又は［２］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［４］
下記式（Ｉ）で表される、［１］〜［３］のいずれか１に記載の抗体薬物コンジュゲート：
Ａ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ （Ｉ）
（式中、ＡはＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片であり；
Ｌはリンカーであり；
Ｄは薬物部分であり；
ｍは１〜８の整数であり；
ｎは１〜２０の整数である）。
［５］
前記抗体又は抗原結合性断片が、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合し、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はそれらの断片である、［１］〜［４］のいずれか１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［６］
前記抗体が、モノクローナル抗体である、［１］〜［５］のいずれか１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［７］
前記抗体又は抗原結合性断片が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトＨＭＧＢ１のエピトープに特異的に結合する、［１］〜［６］のいずれか１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［８］
前記リンカーが、切断性リンカー、非切断性リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカー及びジカルボン酸に基づくリンカーからなる群より選ばれる、［２］〜［７］のいずれか１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
また、本発明は、以下の医薬組成物を提供する。
［９］
［１］〜［８］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート、及び薬学的に許容可能な担体を含有する、医薬組成物。
［１０］
血管新生亢進関連疾患又は血管透過性亢進関連疾患の処置に使用される、［９］に記載の医薬組成物。
［１１］
（ａ）良性若しくは悪性の腫瘍、滲出型加齢黄斑変性、黄斑浮腫、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、血管新生緑内障、関節リウマチ、若しくは乾癬；又は
（ｂ）てんかん、脳卒中、脳梗塞、脳血管攣縮、脳外傷、慢性炎症、神経変性疾患、急性炎症若しくは敗血症；
の処置に使用される、［９］又は［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］
さらに別の抗体、別の抗体薬物コンジュゲート、細胞傷害剤、細胞保護剤、プローブ、血管新生阻害剤、免疫抑制剤、降圧剤、昇圧剤、疼痛緩和剤、サイトカイン、抗生物質、及び免疫チェックポイント阻害剤からなる群より選ばれる１種又は２種以上と併用される、［９］〜［１１］のいずれか１に記載の医薬組成物。
加えて、本発明は、以下の検出試薬を提供する。
［１３］
［１］〜［８］のいずれか１に記載の抗体薬物コンジュゲートを含む、検出試薬。
［１４］
前記薬物部分が、少なくともプローブを含む、［１３］に記載の検出試薬。
加えて、本発明は、以下の使用を提供する。
［１５］
細胞への薬物送達のための、ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片の使用。
［１６］
前記細胞が、血管内皮細胞である、［１５］に記載の使用。
［１７］
［１］〜［８］のいずれか１に記載の抗体薬物コンジュゲートで処置することを含む、［１５］又は［１６］に記載の使用。
さらに、本発明は、以下の処置又は診断のための方法を提供する。
［１８］
［１］〜［８］のいずれか１に記載の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することを含む、血管新生亢進関連疾患又は血管透過性亢進関連疾患の処置又は診断のための方法。
［１９］
［１］〜［８］のいずれか１に記載の抗体薬物コンジュゲートを含有する医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、
（ａ）良性若しくは悪性の腫瘍、滲出型加齢黄斑変性、黄斑浮腫、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、血管新生緑内障、関節リウマチ、若しくは乾癬；又は
（ｂ）てんかん、脳卒中、脳梗塞、脳血管攣縮、脳外傷、慢性炎症、神経変性疾患、急性炎症若しくは敗血症；
の処置又は診断のための方法。
［２０］
別の抗体、別の抗体薬物コンジュゲート、細胞傷害剤、細胞保護剤、プローブ、血管新生阻害剤、免疫抑制剤、降圧剤、昇圧剤、疼痛緩和剤、サイトカイン、抗生物質、及び免疫チェックポイント阻害剤からなる群より選ばれる１種又は２種以上を前記対象に投与することをさらに含む、［１８］又は［１９］に記載の方法。
［２１］
前記対象への陽子線、重粒子線、ガンマ線、Ｘ線又は光を照射することをさらに含む、［１８］〜［２０］のいずれか１に記載の方法。
さらに、本発明は、以下の抗体薬物コンジュゲートを含む。
［２２］
血管新生亢進関連疾患又は血管透過性亢進関連疾患の処置又は診断に使用するための、［１］〜［８］のいずれか１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２３］
（ａ）良性若しくは悪性の腫瘍、滲出型加齢黄斑変性、黄斑浮腫、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、血管新生緑内障、関節リウマチ、若しくは乾癬；又は
（ｂ）てんかん、脳卒中、脳梗塞、脳血管攣縮、脳外傷、慢性炎症、神経変性疾患、急性炎症若しくは敗血症；
の処置又は診断に使用するための、［１］〜［８］のいずれか１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
さらに、本発明は、以下の製造のための使用を含む。
［２４］
血管新生亢進関連疾患又は血管透過性亢進関連疾患の処置又は診断のための医薬組成物の製造のための［１］〜［８］のいずれか１に記載の抗体薬物コンジュゲートの使用。
［２５］
（ａ）良性若しくは悪性の腫瘍、滲出型加齢黄斑変性、黄斑浮腫、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、血管新生緑内障、関節リウマチ、若しくは乾癬；又は
（ｂ）てんかん、脳卒中、脳梗塞、脳血管攣縮、脳外傷、慢性炎症、神経変性疾患、急性炎症若しくは敗血症；
の処置又は診断のための医薬組成物の製造のための［１］〜［８］のいずれか１に記載の抗体薬物コンジュゲートの使用。
本発明の構成により、抗体又はその抗原結合性断片に連結された薬物が、血管新生又は血管透過性が亢進された血管の内皮細胞に特異的に送達される。そして、送達された薬物が血管内皮細胞に作用して、血管新生亢進関連疾患又は血管透過性亢進関連疾患を効果的に予防、改善、又は治療することができる。また、本発明によれば、悪性の腫瘍をはじめとする各種疾患の処置又は診断のための方法及び検出試薬を提供することができる。
実施例に用いられたドキソルビシン連結抗体におけるドキソルビシンとそのリンカー部分を表す化学構造式である。網掛け部が抗体のリジン側鎖のアミノ基部分に相当する。 実施例に用いられたエムタンシン連結抗体におけるエムタンシン部分を表す化学構造式である。網掛け部が抗体のリジン側鎖のアミノ基部分に相当する。 試験例１において、蛍光標識した抗ＨＭＧＢ１抗体（#10-22）又は抗ＫＬＨ抗体と種々の時間でインキュベートした培養血管内皮細胞における抗体の局在を表す写真である。左から、抗体添加から１、２、４時間後を表す。蛍光標識抗体（Alexa Fluor 488）は緑色、細胞核（ＤＡＰＩ）は青色、Ｆ−アクチンは赤色で示す。 試験例１において、蛍光標識した抗ＨＭＧＢ１抗体（#10-22、#11-19）又は蛍光標識した抗ＫＬＨ抗体と４時間インキュベートした培養血管内皮細胞における抗体の局在を表す写真である。図２Ｂは二次元局在、図２Ｃは三次元局在を表す。蛍光標識抗体（Alexa Fluor 488）は緑色、細胞核（ＤＡＰＩ）は青色で示す。 試験例２において、ドキソルビシン連結抗ＨＭＧＢ１抗体（#10-22）又はドキソルビシン連結抗ＫＬＨ抗体と４時間インキュベートした培養血管内皮細胞における抗体の局在を表す写真である。 試験例３において、メラノーマ担癌マウスに投与されたAlexa Fluor 488標識抗ＨＭＧＢ１抗体の分布を表す写真である。図４Ａはメラノーマ組織血管、図４Ｂは肝臓、図４Ｃは肺、図４Ｄは脳における分布を表す。 試験例４の試験計画の概要を表す図である。 試験例４において、薬剤投与開始から１１日後までの各処置群（ｎ＝４）のマウスの腫瘍体積の変化を表すグラフである。各群間の検定は対応のないｔ検定を用いた。α-HMGB1Ab-Dox群と、PBS群、α-KLHAb-Dox群、及びDoxorubicin群との間の両側ｐ値は、それぞれ０．０４７、０．０４７、及び０．０２１であった。 試験例４において、薬剤投与開始から１１日後までの各処置群（ｎ＝４）のマウスの体重の変化を表すグラフである。各群間の検定はStudent t-testを用いた。α-HMGB1Ab-Dox群と、PBS群、α-KLHAb-Dox群、及びDoxorubicin群との間の両側ｐ値は、いずれも０．０５より大きかった。 試験例４において、薬剤投与１１日後の各群のマウスから得られたメラノーマ組織切片のＫｉ６７染色像である。 試験例４において、薬剤投与１１日後の各群のマウスから得られたメラノーマ組織切片のＫｉ６７染色像のＫｉ６７陽性細胞数を比較したグラフである。ｐ値はそれぞれ、++：p=0.000029、##：p=0.00428、*：p=0.015であった。なお検定はStudent t-testを用いた。 試験例４において、薬剤投与１１日後の各群のマウスから得られたメラノーマ組織切片のアポトーシスを起こした細胞の染色像である。アポトーシスを起こした細胞（Ｔｕｎｅｌ染色）は緑色、細胞核（ＤＡＰＩ）は青色で示す。低倍率観察像の＊は、血管内腔を表す。 試験例４において、Ｔｕｎｅｌ染色像から得られた各群のメラノーマ組織切片のアポトーシスを起こした細胞の割合を比較したグラフである。グラフ上のp値はいずれもStudent t-testによって得られた値である。 試験例５において、ピロカルピン誘発重積痙攣（ＰＩＬＯ−ＳＥ）モデルマウスにおいて投与した蛍光標識抗ＨＭＧＢ１抗体が脳血管部に集積することを示す写真である。蛍光標識抗体（Alexa Fluor 488）は緑色、細胞核（ＤＡＰＩ）は青色で示す。 試験例６の試験計画の概要を表す図である。
［用語の説明］
本明細書において、本発明に関連して用いられる科学用語及び専門用語は、当業者により一般に理解される意味で用いられる。さらに、文脈により、特に必要とされない限り、単数用語は複数を含み、複数用語は単数を含む。一般に、本明細書に記載されている細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質化学、核酸化学ならびにハイブリダイゼーションの技術に関連して用いられる命名法は、当該分野で周知であり、かつ一般に使用されているものである。
本明細書において、ＨＭＧＢ１は、上記のHigh Mobility Group Box 1（非特許文献１を参照）を表す。ＨＭＧＢ１は、ほとんど全ての真核細胞に存在する非ヒストン性染色体タンパク質であり、内因性のダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）の一つである。例えば、ヒトＨＭＧＢ１の遺伝子は、ＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）において、NCBI Gene ID: 3146の遺伝子である。本明細書において、ＨＭＧＢ１タンパク質は、斯るＨＭＧＢ１の特徴を有する限りにおいて、そのアイソフォームは特に限定されない。
ＨＭＧＢ１タンパク質は、リジン残基に富む２１５のアミノ酸からなる２５ｋＤａのタンパク質であり、哺乳動物間では非常に高度に保存されたアミノ酸配列を有する。その構造は、Ａ−ｂｏｘ（又はｂｏｘ−Ａ）及びＢ−ｂｏｘ（又はｂｏｘ−Ｂ）と呼ばれる２つのＤＮＡ結合ドメイン、並びにアスパラギン酸及びグルタミン酸のみで構成されているＣ末端領域（Ｃ末端ドメイン又は酸性尾部とも呼ばれる。）の３つのドメインで構成されている。Ａ−ｂｏｘ及びＢ−ｂｏｘは、それぞれ高度に保存された約８０個のアミノ酸残基で構成されており、強く正に帯電している。Ｂ−ｂｏｘにはＴＬＲ４（toll-like receptor 4）結合ドメイン、及びＲＡＧＥ（receptor for advanced glycation end products）結合ドメインが存在する。Ｃ末端領域のアミノ酸配列は、哺乳動物間で２〜３箇所の差異があるのみで、高度に保存されていることが知られている。
ＨＭＧＢ１タンパク質は、細胞の核内に局在しているのみならず、マクロファージや各種免疫系細胞の活性化に伴って核から細胞質へ移行し細胞外へ分泌される（能動的分泌）。また、上記のように虚血や傷害による細胞の壊死又はアポトーシスに伴って核に局在していたＨＭＧＢ１が速やかに放出されること（受動的放出）が明らかにされている。そして、放出されたＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ４やＲＡＧＥなどを介して強力な炎症メディエーターとして作用し、炎症性免疫応答を引き起こす。
本明細書において、「抗体」とは、抗原に対して非共有結合的そして特異的に抗原に結合することができる免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指す。
天然の免疫グロブリン分子のうち、ＩｇＧは４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の重鎖及び２本の軽鎖であってジスルフィド結合によって相互結合されたものからなる。各重鎖は重鎖可変領域（「ＶＨ」と称す場合がある）と重鎖定常領域（重鎖定常領域は３つのドメインからなり、それぞれ「ＣＨ１」、「ＣＨ２」、「ＣＨ３」と称す）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＶＬ」と称す場合がある）と軽鎖定常領域（「ＣＬ」と称す場合がある）からなる。
一方、ＶＨ及びＶＬは、抗体の結合特異性に関与する点で重要である。抗体はＶＨ及びＶＬのアミノ酸残基を主に通じて標的抗原と相互作用するので、可変領域内のアミノ酸配列は可変領域の外にある配列よりも個々の抗体間の違いが大きい。さらに、ＶＨ及びＶＬにおいても、各種抗体間でより一定に保たれたフレームワーク領域（ＦＲ：framework region）と呼ばれる領域と相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。ＶＨ及びＶＬは、それぞれ３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、これらはＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列している。
本明細書において、「抗ＨＭＧＢ１抗体」とは、ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体を表す。
本明細書において、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とは、抗原特異性に関与する、ＶＬ及びＶＨの超可変性の領域である。本明細書において、重鎖可変領域のＣＤＲである重鎖ＣＤＲ１〜３を、ＣＤＲＨ１〜３と表すことがある。また、本明細書において軽鎖可変領域のＣＤＲである軽鎖ＣＤＲ１〜３を、ＣＤＲＬ１〜３と表すことがある。
本明細書において、ＣＤＲとフレームワーク領域の位置は、Ｋａｂａｔの定義による。即ち、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242、に基づいて規定される。
本明細書において、「抗原結合性断片」とは、抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持し、元の抗体の抗原特異的な相互作用の機能を有する抗体断片を指す。
抗体断片としては、特に限定されないが、例えばＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片、特異的に結合するのに十分なフレームワークを有する単離された相補性決定領域、二重特異性抗体、多特異性抗体などが挙げられる。これらの抗体断片の概要については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134及びPlueckthun, A., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315、Nature Vol.341, pp.544-546, 1989などに記載されている。
本明細書において、「エピトープ」とは、抗体又は抗原結合性断片が特異的に結合する、抗原上の部位を指す。
本明細書において、「ヒト抗体」とは、ＦＲとＣＤＲの両方がヒト免疫グロブリン由来である可変領域及び定常領域を有する抗体を指す。
本明細書において、「キメラ抗体」とは、例えば、非ヒト動物抗体由来の可変領域とヒト抗体の定常領域とを組み合わせてなる抗体などを表す。
本明細書において、「ヒト化抗体」とは、例えば、非ヒト動物抗体由来の可変領域中のＣＤＲを、ヒト抗体に移植したもの、非ヒト動物抗体由来のＣＤＲとＦＲの一部をヒト抗体に移植したものなどを表す。
ヒト抗体又はヒト化抗体のＦＲは、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで導入されるランダム変異、部位特異的突然変異などによってヒトの免疫グロブリン遺伝子にコードされていないアミノ酸残基を含んでいても良い。
本明細書において、「抗体薬物コンジュゲート」又は「コンジュゲート」とは、抗体又はその抗原結合性断片と、これらとは別の細胞傷害剤、細胞保護剤、プローブなどである薬物とが連結されたものを指す。
本明細書において、「連結（conjugation）」は、共有結合、非共有結合（特に限定されないが、例えば、配位結合、疎水結合、水素結合、静電結合など）又はそれらの両方を含み得る。
また、「連結された（conjugated）」とは、抗体又はその抗原結合性断片と別の薬物とが元々分離している状態から連結状態をとる場合に限られない。即ち、「抗体薬物コンジュゲート」には、例えば、リンカー及び薬物部分の全部又は一部がポリペプチドであって、抗体又は抗原結合性断片部分の少なくとも１つのポリペプチドと、リンカー及び薬物部分のうちのポリペプチド部分とが、１つのポリペプチドとして融合されて製造される場合も含まれる。
本明細書において、「細胞傷害剤」とは、細胞の成長及び増殖にとって有害であり、細胞を減少させる、増殖阻害する、又は破壊するように作用する薬物を指す。
本明細書において、「細胞保護剤」とは、細胞の成長及び増殖にとって有益であり、細胞を増加させる、細胞死を阻害する、細胞構造を修復する、又は細胞の機能を改善するように作用する薬物を指す。
本明細書において、「プローブ」とは、器官、組織、若しくは細胞、又はその一部の形態又は状態を可視化する物質を指す。プローブは、細胞傷害剤としての機能を実質的に持たないことが好ましく、細胞傷害剤及び細胞保護剤の機能を実質的に持たないことがより好ましい。
本明細書において、「リンカー」は、薬物部分などの別の部分に、抗体又は抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を連結することができる任意の化学部分である。
本明細書において、「対象」とは、個体（ヒト、非ヒト動物など）、器官、組織、又は細胞を表す。個体がヒトである場合は、注記しない限り、「患者」は「対象」と互換的に用いられる。
本明細書において、「処置（treatment）」又は「処置する（treat）」とは、「治療（medical treatment）」、「予防(prevention)」のほか、器官、組織、又は細胞などの非個体に対しての薬物の曝露を包含する。「治療」は疾患、症状、若しくは健康状態を治癒、好転若しくは緩和させること、又は、疾患、症状、若しくは健康状態の悪化を軽減、防止若しくは遅延させること、あるいは、疾患若しくは症状の進行を逆転、軽減、防止若しくは遅延させることを表す。
本明細書において、「予防」とは、疾患若しくは症状の発症の防止、又は疾患若しくは症状の発症のリスクを低下させることを表す。
［抗ＨＭＧＢ１抗体又はその抗原結合性断片の薬物送達のための使用］
本発明の使用は、細胞への薬物送達のための、ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体（抗ＨＭＧＢ１抗体）又はその抗原結合性断片の使用に関する。ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片は、後述の［抗体薬物コンジュゲート］の項に記載したものと同じものを使用することができる。
一態様では、本発明の使用の対象である細胞は、生体内若しくは生体から分離された器官、組織などに含まれる細胞、又は単離、培養、又は分化誘導された細胞を意味する。
一態様では、本発明の使用においては、薬物は血管内皮細胞に送達され、好ましくは血管新生又は血管透過性が亢進された血管の内皮細胞に特異的に送達される。
一態様では、上記の薬物は、抗ＨＭＧＢ１抗体又はその抗原結合性断片に連結されて、抗体薬物コンジュゲートの状態で上記細胞に取り込まれる。当該抗体薬物コンジュゲートには後述の［抗体薬物コンジュゲート］の項に記載したものを用いることができる。
メカニズムは不明であるが、薬物を連結した抗ＨＭＧＢ１抗体又はその抗原結合性断片は、血管新生又は血管透過性が亢進された血管の内皮細胞に特異的に集積して細胞内に取り込まれるが、正常な血管の内皮細胞へは実質的に集積されない。このような特性から、本発明によれば、例えば、以下の効果又は用途がもたらされる。
（１）血管新生又は血管透過性が亢進された血管を含む組織（例えば、腫瘍など）に高効率で薬物を送達でき、薬物による全身の副作用が排除又は軽減される。
（２）一態様では、血管新生又は血管透過性の亢進が予想される疾患に適用することができる。
（３）さらに一態様では、薬物に細胞傷害剤を用いることで、例えば腫瘍などのように生体に好ましくない病変部の血管を傷害し、病変部への栄養及び酸素の供給を抑制することができる。
（４）また、さらに一態様では、薬物に細胞保護剤を用いることで、例えば血管透過性が異常亢進した血液脳関門において、当該状態を改善し、血管透過性に関連する疾患の処置を行うことができる。
（５）一態様では、個体、器官、組織、又は細胞の形態又は状態の情報を得るために用いることができる。例えば、薬物としてプローブを用いることにより、血管新生又は血管透過性が亢進された血管や、その細胞の形態や状態の情報を得ることが可能となる。
［抗体薬物コンジュゲート］
本発明の抗体薬物コンジュゲートは、ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体（抗ＨＭＧＢ１抗体）又はその抗原結合性断片と、及び前記抗体又はその抗原結合性断片部分に連結された１又は複数の薬物部分とを含む。
本発明の抗体薬物コンジュゲートに複数の薬物が連結される場合は、それぞれの薬物が抗体と直接連結されていてもよい。あるいは、本発明の抗体薬物コンジュゲートには１つ以上の薬物が、別の薬物を介して間接的に抗体又はその抗原結合性断片に連結されてもよい。
一態様では、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、１以上のリンカーを含み、共有結合及び／又は非共有結合によって抗体又はその抗原結合性断片部分と薬物部分とが連結される。
一態様では、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、下記式（Ｉ）で表される。
Ａ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ （Ｉ）
（式中、ＡはＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片であり；
Ｌはリンカーであり；Ｄは薬物部分であり；ｍは、例えば１〜８の整数であり；ｎは１〜２０の整数である）
より好適には、上記式（Ｉ）の抗体薬物コンジュゲートにおいて、ｍは、例えば１以上の整数、好ましくは１、２、３又は４の整数であり；ｎは、例えば１以上の整数、好ましくは１〜１０、２〜８、又は２〜５の整数である。
本発明の抗体薬物コンジュゲートの抗体１分子当たりの平均薬物分子数を表す薬物／抗体比（ＤＡＲ）は、特に限定されず、使用する薬物の種類、適用対象等によって適宜選択され得る。本発明の抗体薬物コンジュゲートのＤＡＲは、抗腫瘍活性を高める観点から、例えば１以上、或いは２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、更に好ましくは５以上、更により好ましくは６以上である。また、本発明の抗体薬物コンジュゲートの抗体１分子当たりのＤＡＲは、副作用を抑える観点から、例えば１５以下、１２以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下にすることができる。
（抗ＨＭＧＢ１抗体又はその抗原結合性断片部分）
抗ＨＭＧＢ１抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれでもよいが、医薬の品質均一性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体としては、非ヒト動物由来の抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体などが挙げられるが、好ましくはヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体であり、より好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体である。
抗ＨＭＧＢ１抗体は、その抗原であるＨＭＧＢ１への結合活性を有する限り、別の抗ＨＭＧＢ１抗体又はＨＭＧＢ１以外の抗原と結合する別の抗体との間で、抗体の重鎖及び／又は軽鎖の全長又は一部、定常領域部分の全部又は一部、ＣＤＲの全部又は一部を交換したものであってもよい。
抗ＨＭＧＢ１抗体が認識する抗原であるＨＭＧＢ１は、例えばヒト由来又はヒト以外の哺乳動物由来のＨＭＧＢ１であり得るが、抗体薬物コンジュゲートの対象と同じ生物由来のものであることが好ましい。
モノクローナル抗体のアイソタイプは、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４など）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２など）、ＩｇＤ、ＩｇＥ当が挙げられるが、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭであり、より好ましくはＩｇＧ２である。
本発明の抗体薬物コンジュゲートに用いられる抗ＨＭＧＢ１抗体のエピトープは、例えばＨＭＧＢ１のＣ末端領域又はＢ−Ｂｏｘ領域のポリペプチドであり得る。
例えば当該抗ヒトＨＭＧＢ１抗体のエピトープは、Ｃ末端領域のエピトープとしてＥＥＥＤＤＤＤＥ（配列番号１）、又はＢ−Ｂｏｘ領域のエピトープとしてＬＫＥＫＹＥＫＤＩＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
抗ＨＭＧＢ１抗体のＨＭＧＢ１エピトープに対する親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法を用いた測定によって得られる解離定数Ｋｄで評価される。Ｋｄは、好ましくは１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下である。
ヒトＨＭＧＢ１に特異的なモノクローナル抗体としては、例えば、WO2014/115430に開示される、配列番号１で表されるエピトープを認識する#10-22ヒト化抗体、又は、配列番号２のアミノ酸配列で表されるエピトープを認識する#11-19ヒト化抗体が挙げられる。
当該ヒトＨＭＧＢ１に特異的なモノクローナル抗体は、上記配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列で表されるエピトープを認識する抗体のＣＤＲ配列の組合せのみに限定されない。例えば、これら抗体のＣＤＲＨ１〜３及びＣＤＲＬ１〜３の合計６個のＣＤＲ配列のうち、例えば、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、又はこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列であってもよい。
また、当該ヒトＨＭＧＢ１に特異的なモノクローナル抗体は、上記配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列で表されるエピトープを認識するヒト化抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の組合せのみに限定されない。例えば、これらヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、例えば、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、又はこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列であってもよい。
あるいは、当該ヒトＨＭＧＢ１に特異的なモノクローナル抗体は、当該抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と、上記配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列で表されるエピトープを認識するヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域との間の相同性が、それぞれ９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上である。
あるいは、当該ヒトＨＭＧＢ１に特異的なモノクローナル抗体は、当該抗体のＦＲ全体と上記配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列で表されるエピトープを認識するヒト化抗体のＦＲ全体との間の相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上である。
本明細書において、アミノ酸配列の相同性は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴのｂｌａｓｔｐ ｓｕｉｔｅのデフォルトの設定でアラインメントを行って得られるidentityの数値で表される。
本発明の抗体薬物コンジュゲートに用いられる抗ＨＭＧＢ１抗体は、例えば、ＨＭＧＢ１全体又はエピトープを含むポリペプチドを動物に免疫して得られるＢリンパ球細胞由来のハイブリドーマから産生させることができる。具体的な方法としては、例えばWO2007/049468、US2009/0252739、WO2014/115430、FASEB J. 2007, Vol.21, pp.3904-3916などに記載された方法を用いることができる。
免疫に用いられる動物は、特に限定されず、例えば温血動物、好適にはウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、モルモット、サル、イヌ、ネコ、ハムスター、ニワトリなどが挙げられる。
また、抗ＨＭＧＢ１抗体又はその抗原結合性断片は、抗体の可変領域の全部又は一部をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを、例えば、動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト肝細胞ガン細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）など）、非動物真核細胞（昆虫細胞など）、細菌（大腸菌など）、酵母、昆虫、植物、トランスジェニック動物（ウシ、ニワトリなど）又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系（真核生物由来、大腸菌由来無細胞翻訳系など）に導入し、抗体を発現させる方法によっても産生することができる。ウサギ由来抗体、マウスキメラ抗体、ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体又はこれらの抗原結合性断片の製造においては、このようなポリヌクレオチド導入によって抗体を製造することが好ましい。
（薬物部分）
本発明の抗体薬物コンジュゲートの薬物部分に用いられる薬物は、特に限定されず、対象の疾患等に応じて適宜選択し得る。また当該薬物は１種類であっても、複数種であってもよい。例えば、当該薬物としては、細胞傷害剤、細胞保護剤（スタチン、アポトーシス阻害剤、神経保護剤、スルフォラファンなど）、プローブ、血管新生阻害剤、免疫抑制剤、降圧剤、昇圧剤、疼痛緩和剤、サイトカイン、抗生物質、及び免疫チェックポイント阻害剤からなる群より選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。
当該薬物の化学種は、例えば、天然有機化合物、合成有機化合物、タンパク質（抗体、抗体断片、酵素など）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸類縁体（ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルフォリノ核酸、Ｓ化オリゴなど）、ペプチド、ナノ粒子、量子ドット、原子（放射性核種など）、ベシクル（ＰＬＧＡナノ粒子など）、サッカリド、ポリサッカリドなどを用いることができる。
細胞傷害剤は、例えば、化学療法剤、放射性同位体、放射線増感剤、近赤外線吸収剤（ＩＲ７００（Nature Medicine, 2011, Vol.17, pp.1685-1691）など）、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤、ｍＴｏｒ阻害剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシン、メルタンシン、エムタンシン、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、トリコテセン、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（モデシン）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテスフォーディ（シナアブラギリ）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（ヨウシュヤマゴボウ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカチャランチア（ツルレイシ）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリス（sapaonaria oficinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン及びトリコテセン（tricothecene）ＣＣ１０６５、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、ＣＲＭ１核輸送阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、タンパク質合成阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＨＦＲ阻害剤、抗癌性抗生物質などが挙げられる。
化学療法剤は、例えば、アザリビン（azaribine）、アナストロゾール（anastrozole）、アザシチジン（azacytidine）、ブレオマイシン（bleomycin）、ボルテゾミブ（bortezomib）、ブリオスタチン−１（bryostatin-1）、ブスルファン（busulfan）、カンプトテシン（camptothecin）、１０−ヒドロキシカンプトテシン（10-hydroxycamptothecin）、カルムスチン（carmustine）、セレブレックス（celebrex）、クロラムブシル（chlorambucil）、シスプラチン（cisplatin）、イリノテカン（irinotecan）、カルボプラチン（carboplatin）、クラドリビン（cladribine）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、シタラビン（cytarabine）、ダカルバジン（dacarbazine）、ドセタキセル（docetaxel）、ダクチノマイシン（dactinomycin）、ダウノマイシングルクロニド（daunomycin glucuronide）、ダウノルビシン（daunorubicin）、デキサメタゾン（dexamethasone）、ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrol）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ドキソルビシンブルクロニド（doxorubicin glucuronide）、エピルビシン（epirubicin）、エチニルエストラジオール（ethinyl estradiol）、エストラムスチン（estramustine）、エトポシド（etoposide）、エトポシドグルクロニド（etoposide glucuronide）、フロキシウリジン（floxuridine）、フルダラビン（fludarabine）、フルタミド（flutamide）、フルオロウラシル（fluorouracil）、フルオキシメステロン（fluoxymesterone）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート（hydroxyprogesterone caproate）、ヒドロキシウレア（hydroxy urea）、イダルビシン（idarubicin）、イフォスファミド（ifosfamide）、ロイコボリン（leucovorin）、ロムスチン（lomustine）、マイタンシノイド（maytansinoid）、メクロレタミン（mechlorethamine）、メドロキシプロゲステロンアセテート（medroxyprogesterone acetate）、メゲストロールアセテート（megestrol acetate）、メルファラン（melphalan）、メルカプトプリン（mercaptopurine）、メトトレキセート（methotrexate）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、ミトラマイシン（mithramycin）、ミトマイシン（mitomycin）、ミトタン（mitotane）、フェニルブチレート（phenylbutyrate）、プレドニゾン（prednisone）、プロカルバジン（procarbazine）、パクリタキセル（paclitaxel）、ペントスタチン（pentostatin）、セムスチン（semustine）、スレプトゾシン（streptozocin）、タモキシフェン（tamoxifen）、タキサン類（taxanes）、タキソール（taxol）、テストステロンプロピオネート（testosterone propionate）、サリドマイド（thalidomide）、チオグアニン（thioguanine）、チオテパ（thiotepa）、テニポシド（teniposide）、トポテカン（topotecan）、ウラシルマスタード（uracil mustard）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビノレルビン（vinorelbine）、ビンクリスチン（vincristine）、トラスツズマブ（trastuzumab）などが挙げられる。
放射性同位体は、例えば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、及び１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、及び１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、６４Ｃｕ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎなどが挙げられる。
プローブとしては、特に限定されないが、例えば、蛍光物質、発光物質、放射性プローブ（３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法用スピン標識（１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１９Ｆ、Ｇｄ、Ｍｎ、Ｆｅなど）、ポジトロン放出物質、磁性粒子、微小粒子（金属ナノ粒子、プラスチックナノ粒子など）、造影剤、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェラーゼなど）、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジンなどが挙げられる。
蛍光物質は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）若しくはその誘導体、Alexa Fluor（登録商標）の各種蛍光体（Alexa Fluor 430など）、ローダミン系、クマリン系、オキサジン系、カルボピロニン系、シアニン系、ピロメセン系、ナフタレン系、ビフェニル系、アントラセン系、フェナントレン系、ピレン系、カルバゾール系、Ｃｙ系、ＥｖｏＢｌｕｅ系、フルオレセイン系、ピロロピリジン系、又はこれらの薬学的に許容される誘導体の各種蛍光体が挙げられる。
血管新生阻害剤は、例えば、アキシチニブ、サリドマイド、アンギオスタチン、エンドスタチン、メタスタチン、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦＲ−２インヒビター（例えば、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８）などが挙げられる。
（リンカー）
本発明で使用されるリンカーは、化合物又は抗体が活性を保持する条件下で、リソソームなどでの酸性条件で切断される酸誘導性切断（ヒドラゾン、アセタール、ｃｉｓ−アコニテート様アミドなど）、光誘導性切断、カテプシンその他リソソームのペプチド切断酵素により誘導されるペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、及びジスルフィド結合切断などの切断の影響を受けるものであってもよい（切断性リンカー）。あるいは、リンカーは、切断に対して実質的に耐性であってもよい（例えば、安定性リンカー又は非切断性リンカー）。あるいは、例えば、リンカーは、プロチャージリンカー（例えばUS2009/0274713参照）、親水性リンカー、又はジカルボン酸に基づくリンカーであってもよい。
一態様では、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、薬物部分及び抗体への連結を可能にする反応性官能性を有する架橋試薬を使用して調製することができる。例えば、システイン、チオール又はアミン、例えばＮ末端又はアミノ酸鎖側鎖（例えば、抗体又は抗原結合性断片上のリジン側鎖）は、架橋試薬の官能基と結合を形成することができる。そして、架橋試薬の全部又は一部、あるいは複数の架橋試薬によって、リンカー部分が構成される。
一態様では、リンカーは、抗体上に存在する遊離システインと反応して共有結合を形成することができる官能性を有する。非限定的且つ例示的なこのような反応性の官能性には、マレイミド、ハロアセトアミド、α−ハロアセチル、活性化エステル、例えばスクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸クロリド、スルホニルクロリド、イソシアネート、イソチオシアネートなどが挙げられる。
一態様では、リンカーは、抗体上に存在する求電子基と反応できる官能性を有する。このような求電子基には、例えば、アルデヒド基又はケトンカルボニル基が挙げられる。いくつかの実施態様では、リンカーの反応性官能性のヘテロ原子は、抗体上の求電子基と反応し、抗体単位への共有結合を形成することができる。このような反応性官能性には、例えば、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、アリールヒドラジンなどが挙げられる。
一態様では、リンカーは、ビス−マレイミド−トリオキシエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホン（ＨＢＶＳ）、スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロン酸）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、スクシンイミジル ３−（ブロムアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル ６−［（ベータ−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］（ＳＭＰＨ）、イミノチオラン（ＩＴ）、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びスクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）からなる群より選ばれる。
このようなリンカーを形成するための試薬には、ビス−マレイミド試薬：ジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４−ビスマレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４−ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビスマレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、ＢＭ（ＰＥＧ）２（以下に示す）、及びＢＭ（ＰＥＧ）３（以下に示す）；イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性化エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などが含まれる。
一態様では、リンカーは、ポリペプチドを含む。特に限定されないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びペンタペプチドが含まれる。ジペプチドには、限定されないが、例えばバリン−シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ）；フェニルアラニン−リジン（ｆｋ又はｐｈｅ−ｌｙｓ）；フェニルアラニン−ホモリジン（ｐｈｅ−ｈｏｍｏｌｙｓ）；及びＮ−メチル−バリン−シトルリン（Ｍｅ−ｖａｌ−ｃｉｔ）からなる群より選ばれる。トリペプチドには、限定されないが、例えばグリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）からなる群より選ばれる。
リンカーに含まれるポリペプチドのアミノ酸単位は、天然に存在するアミノ酸残基、及び／又はシトルリンのような非天然存在アミノ酸アナログ及び／又は他のアミノ酸を含んでいてもよい。アミノ酸単位は、特定の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ、又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断について設計及び最適化することができる。
これらのポリペプチドは、抗体若しくは抗原結合性断片、又は薬物部分を構成するポリペプチドと融合的に翻訳によって合成されてもよい。
リンカー部分の炭素原子の数は、例えば３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上又は１５以上とすることができ、例えば５０以下、４０以下、３０以下又は２０以下とすることができる。
［医薬組成物］
本発明の医薬組成物は、上記の［抗体薬物コンジュゲート］の項に記載した抗体薬物コンジュゲート及び薬学的に許容可能な担体を含有する。
本発明の医薬組成物は、例えば、溶液（例えば注射可能、経腸投与可能、又は輸液可能な溶液）、ミクロエマルジョン、分散液、懸濁液、錠剤、散剤、粒剤、カプセル、トローチ、ピル、リポソーム、坐剤、パップ剤、テープ剤など、液体、半固体、ペースト、固体又は粉末の剤型でありうる。好ましい形態は、意図される投与形態、投与量、投与頻度、投与期間、投与対象の症状・年齢・性別・体重、予防及び治療の適用目的により異なるが、注射可能、経腸投与可能又は輸液可能な溶液の形にあるものである。
本発明の医薬組成物の好ましい投与形態は、非経口的投与（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、消化管内など）である。一態様では、本発明の医薬組成物は、静脈輸液、経管輸液、又は静脈注射によって投与される。また一態様では、本発明の医薬組成物は筋肉内注射又は皮下注射によって投与される。
注射可能な製剤は、有効成分を液体に溶解したもの又は有効成分を凍結乾燥させたものを、フリント又はアンバーバイアル、アンプル、プラスチック容器、ガラス容器又はプレフィルドシリンジに封入して提供することができる。
本発明の医薬組成物は、一般に、製造及び貯蔵の条件下で無菌又は安定であることが好ましい。本発明の医薬組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、分散液、リポソームなどの既述の形態で、処方することができる。
例えば、無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量の有効成分（すなわち本発明の抗体薬物コンジュゲート）を、必要な場合には上記の成分の１つ又は組合せとともに適切な溶媒に混ぜ、その後、濾過滅菌などの滅菌処理を行うことによって調製することができる。
例えば、分散液は、有効成分を含有する粉末製剤を、基本的な分散媒及び上記列挙したものから必要とされるその他の成分を含有する無菌ビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）を用いて調製することができる。また粉末製剤は、例えば上記滅菌濾過溶液の凍結真空乾燥及び噴霧乾燥によって得られる。
薬学的に許容される担体としては、生理学的に適合可能な任意の又は全ての溶媒、分散媒、コーティング、等張剤、吸収促進剤及び吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容される担体の例には、水、塩類溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、単糖類、二糖類、オリゴ糖、多糖類（デキストリン、デキストラン、イソマルトデキストリン、セルロース、プルラン、キチン、キトサン、グアーガム、カラギーナンなど）などの糖質及びそれらの誘導体、グリセロール、エタノールなどのアルコール類などが含まれ、それらは単独又は適宜組み合わせて用いることができる。注射剤などとして使用される場合、ｐＨ調節剤や等張剤、例えば前記糖質や、マンニトール、ソルビトール、マルチトールなどの糖アルコール、又は塩化ナトリウムなどの１種又は複数を適宜組み合わせて用いることができる。
薬学的に許容される担体には、医薬組成物の形態に応じて、さらに、湿潤剤、乳化剤、防腐剤、緩衝剤、凍結保護剤、安定化剤、賦形剤、増量剤、ｐＨ調節剤など、抗体又はその抗原結合性断片部分の保存性又は有効性を維持又は増大させる適量の補助物質を含めることができる。
緩衝剤は、例えば、ｐＨ５．０〜７．０（最適な場合、ｐＨ約６）のＬ−ヒスチジン（１〜５０ｍＭ）、最適な場合は５〜１０ｍＭのＬ−ヒスチジンを用いることができる。その他の適切な緩衝剤は、例えばコハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、又はリン酸カリウムが挙げられる。
凍結保護剤又は賦形剤は、例えば、０〜１０％（最適な場合、０．５〜５％）のグルコース、フラクトース、スクロース、マルトースなどの糖質が用いられる。その他の適切な凍結保護剤又は賦形剤にはマンニトール、マルチトール、トレハロース、ラクトースなどの糖質が用いられる。
安定化剤は、例えば、１〜５０ｍＭ（最適な場合、５〜１０ｍＭ）のＬ−メチオニンなどのアミノ酸を使用することができる。その他の適切な安定化剤にはグリシン、アルギニン及びポリソルベート８０などが挙げられる。
増量剤は、特に限定されないが、既述の糖質又はそれらの誘導体、殊に、例えば、１〜１０％のトレハロース、マルチトール、マンニトール（最適な場合、２〜４％）が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、上記のように血管新生又は血管透過性が亢進された血管を含む生体組織に薬物を送達できることから、血管新生亢進関連疾患又は血管透過性亢進関連疾患に好適に使用できる。
本明細書で言う血管新生亢進関連疾患とは、血管新生の亢進を伴う疾患を指す。血管新生亢進関連疾患としては、例えば、良性若しくは悪性の腫瘍（特に固形腫瘍）、滲出型加齢黄斑変性、黄斑浮腫、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、水晶体後部線維増殖症、血管腫、眼内新生血管疾患、増殖性網膜症、血管新生緑内障、関節リウマチ、又は乾癬が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、中でも、血管新生の抑制又は新生血管の破壊によって周囲組織の栄養又は酸素供給阻害の効果が顕著に得られる点から、良性又は悪性の固形腫瘍に好適に適用できる。
本発明の医薬組成物をこれら血管新生亢進関連疾患に適用する場合、当該医薬組成物の抗体薬物コンジュゲートには、薬物として少なくとも細胞傷害剤又は血管新生阻害剤を含むことが好ましい。
悪性腫瘍は、例えば、悪性黒色腫（メラノーマ）、扁平上皮癌、基底細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌が挙げられる）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（gastric or stomach cancer）（胃腸癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（kidney or renal cancer）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、眼瞼腫瘍（脂腺癌や基底細胞癌を含む）、結膜腫瘍、眼窩腫瘍（涙腺腫瘍を含む）、眼内腫瘍（網膜芽細胞腫や脈絡膜悪性黒色腫を含む）、悪性リンパ腫、眼部転移性腫瘍が或いは種々のタイプの頭頚部癌（口腔癌、咽頭癌、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、喉頭癌、鼻・副鼻腔癌、唾液腺癌、甲状腺癌などを含む）が挙げられる。
本明細書で言う血管透過性亢進関連疾患とは、血管透過性の亢進を伴う疾患を指す。血管透過性は、慢性又は急性の強度又は全身性の炎症によっても亢進される。そのため、血管透過性亢進関連疾患としては、例えば、てんかん、脳卒中、脳梗塞、脳血管攣縮、脳外傷、慢性炎症、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、脊髄小脳変性症など）、急性炎症又は敗血症が挙げられる。
中でも、本発明の医薬組成物は、血液脳関門の破綻を伴う疾患に適用されることが好ましい。そのような疾患としては、例えば、てんかん、脳卒中、脳梗塞、脳血管攣縮、脳外傷、慢性炎症、神経変性疾患などが挙げられる。
本発明の医薬組成物をこれら血管透過性亢進関連疾患に適用する場合、当該医薬組成物の抗体薬物コンジュゲートには、薬物として少なくとも細胞保護剤を含むことが好ましい。
本発明の医薬組成物の対象は、ヒト又は非ヒト動物であり、好ましくはヒトである。
本発明の医薬組成物は、例えば、毎日１回、毎週１回、１週につき１〜７回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、５週ごとに１回、６週ごとに１回、７週ごとに１回、又は８週ごとに１回の間隔で投与され得る。
本発明の医薬組成物の投与量は、特に限定されず、またその構成、担体、使用目的、対象の年齢、体重、性別、適用する疾患などに応じて適宜変更し得る。本発明の医薬組成物の投与量は、当該医薬組成物が含有する抗体薬物コンジュゲートの質量に換算して、例えば０．０００１ｍｇ／ｋｇ（対象体重）以上、０．００１ｍｇ／ｋｇ（患者体重）以上、０．０１ｍｇ／ｋｇ（対象体重）以上であり、そして２００ｍｇ／ｋｇ（患者体重）以下、１００ｍｇ／ｋｇ（対象体重）以下、２０ｍｇ／ｋｇ（対象体重）以下、１０ｍｇ／ｋｇ（対象体重）以下、５ｍｇ／ｋｇ（対象体重）以下、２ｍｇ／ｋｇ（対象体重）以下、１ｍｇ／ｋｇ（対象体重）以下、０．５ｍｇ／ｋｇ（対象体重）以下、０．２ｍｇ／ｋｇ（対象体重）以下、０．１ｍｇ／ｋｇ（対象体重）以下であり得る。
本発明の医薬組成物は、さらに抗ＨＭＧＢ１抗体又は本発明の抗体薬物コンジュゲートとは別の抗体又は別の抗体薬物コンジュゲート、細胞傷害剤、細胞保護剤、プローブ、血管新生阻害剤、免疫抑制剤、降圧剤、昇圧剤、疼痛緩和剤、サイトカイン、抗生物質、及び免疫チェックポイント阻害剤からなる群より選ばれる１種又は２種以上と併用することができる。
本発明の医薬組成物の使用には、さらに対象への陽子線照射、重粒子線照射や、ガンマ線、Ｘ線、光（例えば、ＩＲ７００に吸収される近赤外線など）などを用いた光線力学療法（ＰＤＴ）などを組み合わせることもできる。
［検出試薬］
本発明の検出試薬は、上記の［抗体薬物コンジュゲート］の項に記載した抗体薬物コンジュゲートを含有する。
本発明の検出試薬には、治療、診断又は予防のための情報を得るのに用いられる医薬品、あるいは、研究などに用いられる試薬などの非医薬品が包含される。
一態様では、本発明の検出試薬に含まれる抗体薬物コンジュゲートの薬物部分には、少なくともプローブを含む。
本発明の検出試薬の対象は、ヒト又は非ヒト動物の個体、器官、組織又は細胞であり、好ましくはヒト個体である。ヒト個体に用いられる場合は、好ましくは静脈輸液、静脈注射、筋肉内注射又は皮下注射によって投与され、より好ましくは静脈輸液又は静脈注射によって投与される。
一態様では、本発明の検出試薬の使用においては、当該検出試薬が投与される対象に、さらに抗体薬物コンジュゲートとは別のプローブを投与してもよい。
一態様では、本発明の検出試薬の使用においては、当該検出試薬が投与される対象にＸ線、光（近赤外線などを含む）、磁場（例えば、ＭＲＩ）などを単独又は適宜組み合わせて照射してもよい。
本発明の検出試薬は、例えば血管新生若しくは血管透過性が亢進された血管又は血管内皮細胞の、画像又は状態の情報を得るために使用される。
本発明の検出試薬は、例えば血管新生亢進関連疾患又は血管透過性亢進関連疾患の診断のために使用され、好ましくは腫瘍の診断のために使用される。特定の実施形態では、本発明の検出試薬は、メラノーマの診断のために使用される。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。本実施例において使用する分子生物学的手順は、特に言及しない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition)（Sambrookら、Cold Spring Harbour Laboratory Press，2001）で参照することができる。
［使用試薬］
（抗体等）
（１）抗ＨＭＧＢ１抗体
本実施例では、抗ＨＭＧＢ１抗体として、ラットＩｇＧを使用した。ＨＭＧＢ１のＣ末端領域に存在する、配列番号１のアミノ酸配列で表されるエピトープを認識する、#10-22ラットＩｇＧ抗体（WO2014/115430公報に記載）と、ＨＭＧＢ１のＢ−ｂｏｘ領域に存在する、配列番号２のアミノ酸配列のエピトープを認識する、#11-19ラットＩｇＧ抗体（FASEB J. 2007, Vol.21, pp.3904-3916に記載）を用いた。これらラット抗体のそれぞれ対応するエピトープに対する解離定数Ｋｄは、#10-22は１．５×１０−８Ｍ、#11-19は３．０×１０−７Ｍであった。なお、Ｋｄの測定は表面プラズモン共鳴法に基づく。
それぞれの抗体は、WO2007/049468、US2009/0252739、WO2014/115430の各公報、FASEB J. 2007, Vol.21, pp.3904-3916などに記載された方法により取得した抗体産生ハイブリドーマから得られる。以下にハイブリドーマの取得方法の概要を示す。
（ａ）ラットの免疫
市販のウシ胸腺由来ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２との混合物（和光純薬工業社製、コード番号：０８０−０７０７４１）をフロイント完全アジュバンドとともにラットの後肢足蹠に投与した。２週間後に抗体価の上昇を確認した。続いて、５週間後に腫大した腸骨リンパ節からリンパ節細胞を無菌的に取り出した。
（ｂ）細胞融合と抗ＨＭＧＢ１抗体産生細胞のクローニング
上記腸骨リンパ節細胞とマウス・ミエローマＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ２）細胞を、ポリエチレングリコールを用いて融合させ、得られた融合細胞を、９６穴マイクロプレートで培養し、ＥＬＩＳＡでの一次スクリーニング及びウェスタンブロットによる二次スクリーニングを経て抗ＨＭＧＢ１抗体産生細胞をクローニングした。
（２）対照抗体
本実施例では、抗ＫＬＨ抗体を適宜標識又は修飾して、対照抗体に用いた。抗ＫＬＨ抗体は、抗原としてキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（製品番号：H7017, SIGMA-ALDRICH社製）を用いた以外は、前記抗ＨＭＧＢ１抗体の作製方法に準じて作製した。
（３）Alexa Fluor 488標識抗体
上記（１）の抗ＨＭＧＢ１抗体及び（２）の抗ＫＬＨ抗体をAlexa Fluor 488標識したものを使用した。
（４）ドキソルビシン連結抗体
株式会社バイオロジカ（Biologica Co., Japan）に委託して上記（１）の抗ＨＭＧＢ１抗体及び（２）の抗ＫＬＨ抗体に、細胞傷害剤であるドキソルビシンを連結させた。具体的には、これらの抗体のリジン側鎖のアミノ基及びドキソルビシンのアミノ基と、クロスリンカーであるグルタル酸とがアミド結合で連結した、抗体薬物コンジュゲートを作製した（図１Ａ）。ドキソルビシン連結抗ＨＭＧＢ１抗体の薬物／抗体比（ＤＡＲ）は９．１、ドキソルビシン連結抗ＫＬＨ抗体のＤＡＲは８．２であった。
（５）エムタンシン連結抗体
（４）と同様の方法で、ドキソルビシン−リンカー部分の代わりにエムタンシンを抗ＨＭＧＢ１抗体及び抗ＫＬＨ抗体に結合させたもの（図１Ｂ）を作製した。各エムタンシン連結抗体のＤＡＲは０．９であった。
（イソレクチン）
血管内皮細胞を特異的に標識するために、レクチンの一つであるイソレクチンに赤色蛍光色素であるAlexa Fluor 594を標識したもの（製品番号：I21413, Invitrogen社製）を使用した。
［試験例１．抗ＨＭＧＢ１抗体の血管内皮細胞への取り込みの検証］
血管新生アッセイに用いられる、血管新生が亢進されている培養血管内皮細胞ＥＡ．ｈｙ９２６（CRL-2922, ATCC, Manassas, VA, USA）を使用した。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＤＭＥＭでＥＡ．ｈｙ９２６を５×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁して９６穴マイクロタイタープレートに播種した。細胞を３７℃で１６時間培養し、単層コンフルエントとなった状態でアッセイに供した。
コンフルエントなＥＡ．ｈｙ９２６培養血管内皮細胞に対して、Alexa Fluor 488標識抗ＨＭＧＢ１抗体（＃１０−２２若しくは＃１１−１９）又は対照としてAlexa Fluor 488標識抗ＫＬＨ抗体を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように上記培地に添加した。さらに細胞透過性を高める目的で、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を１００ｎｇ／ｍＬ加えた。核をＤＡＰＩ、細胞膜をＦ−アクチンで標識した。これら標識試薬の添加から１、２、及び４時間後の標識抗体の局在を観察した。観察には共焦点レーザー顕微鏡（LMS780、Carl Zeiss社製）を用いた。
結果を図２Ａ〜Ｃに示した。図２Ａに示すとおり、蛍光標識した抗ＨＭＧＢ１抗体と抗ＫＬＨ抗体（対照抗体）の局在が緑色の蛍光で示される。抗ＨＭＧＢ１抗体は１時間後には培養血管内皮細胞に取り込まれ、経時的に核の周囲に顆粒状に蓄積していることが判明した。一方、抗ＫＬＨ抗体は細胞内に緑色蛍光はほとんど観察されないことから、細胞内への取り込みは起こっていないと考えられる。
図２Ｂは、エピトープの異なるAlexa Fluor 488標識抗ＨＭＧＢ１抗体の細胞局在の比較を示す図である。エピトープが異なる抗ＨＭＧＢ１抗体がいずれも培養血管内皮細胞に取り込まれた。
図２Ｃは、図２Ｂの三次元再構成画像を示す。核の周囲に顆粒状の蛍光標識抗ＨＭＧＢ１抗体が存在していた。このことから、抗ＨＭＧＢ１抗体薬物コンジュゲートは、細胞質画分、とりわけ核周囲の小胞に取り込まれることが判明した。
以上の結果から、抗ＨＭＧＢ１抗体は、そのエピトープの違いにかかわらず、血管新生又は血管透過性が亢進した血管の血管内皮細胞に取り込まれると帰結された。
［試験例２．ドキソルビシン連結抗ＨＭＧＢ１抗体の血管内皮細胞への取り込みの検証］
試験例１と同じ方法によって得られたコンフルエントなＥＡ．ｈｙ９２６培養血管内皮細胞に対して、ドキソルビシン連結ラット抗ＨＭＧＢ１抗体（#10-22）又はドキソルビシン連結抗ＫＬＨ抗体（対照抗体）を、終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように培地に添加した。さらに刺激因子としてリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を１００ｎｇ／ｍＬ加えた。核をＤＡＰＩ、細胞膜をＦ−アクチンで標識して、添加後４時間後の標識抗体の局在を観察した。観察には共焦点レーザー顕微鏡（LMS780、Carl Zeiss社製）を用いた。ドキソルビシン連結抗体の検出には、ドキソルビシンの赤色の自家蛍光（exitation：485 nm、emission：590 nm）を用いた。
結果を図３Ａ及び図３Ｂに示した。ドキソルビシン連結抗ＨＭＧＢ１抗体は培養血管内皮細胞に取り込まれた。一方、対照の抗体である抗ＫＬＨ抗体は、ＬＰＳ刺激しても培養血管内皮細胞には取り込まれなかった。
以上の結果から、蛍光標識に代えてドキソルビシンを連結した抗ＨＭＧＢ１抗体もまた培養血管内皮細胞に取り込まれた。したがって、結合させる薬物の種類にかかわらず、抗ＨＭＧＢ１抗体薬物コンジュゲートは、血管新生又は血管透過性が亢進した血管内皮細胞内に取り込まれ、当該細胞内に薬物を送達できることが判明した。
［試験例３．抗ＨＭＧＢ１抗体の腫瘍血管内皮細胞特異的集積の検証］
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、7週齢、メス）背部皮下に、２．０×１０５個のＢ１６−ＢＬ６メラノーマ細胞を注射し、常法に従って飼育してメラノーマ担癌マウスを作製した。腫瘍が形成された移植後７日目のマウスに、Alexa Fluor 488標識抗ＨＭＧＢ１抗体（#10-22）又はAlexa Fluor 488標識抗ＫＬＨ抗体を１ｍｇ／ｋｇ（マウス体重）、蛍光標識イソレクチン２ｍｇ／ｋｇ（マウス体重）を尾静脈投与した。３０分後にマウスを脱血致死させ、生理食塩水を潅流した。潅流後に、メラノーマ腫瘍塊、肝臓、肺、脳を摘出して、常法により凍結切片を作製した。
得られた切片を、共焦点レーザー顕微鏡（LSM、Carl Zeiss社製）を用いて、倍率２００倍で観察した。
メラノーマ腫瘍塊、肝臓、肺、及び脳におけるＬＳＭ像を、それぞれ図４Ａ〜Ｄに示した。図４Ａに示すとおり、メラノーマ内の腫瘍血管内皮細胞に、蛍光標識抗ＨＭＧＢ１の著明な集積が認められた。一方、図４Ｂ〜Ｄに示すとおり、正常組織である肝臓、肺及び脳の血管には、蛍光標識抗ＨＭＧＢ１抗体の集積は認められなかった。
以上の結果から、生体に投与された抗ＨＭＧＢ１抗体は、腫瘍血管に特異的に局在することが判明した。そして、試験例１の結果と総合すれば、局在化した抗ＨＭＧＢ１抗体は、腫瘍血管内皮細胞に選択的に取り込まれたものと結論される。
［試験例４．ドキソルビシン連結抗ＨＭＧＢ１抗体の腫瘍縮小効果検証のためのｉｎ ｖｉｖｏ試験］
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、７週齢、メス）を背部皮下に、２．０×１０５個のＢ１６−ＢＬ６メラノーマ細胞を注射し、常法に従って飼育してメラノーマ担癌マウスを作製した。移植後６日目に、腫瘍が形成されたマウスを４匹ずつ４群に分けて、次の（ａ）〜（ｄ）の処置群（投与量はマウス体重当たりの量、括弧内は群名）とした。それぞれの薬剤はマウスに尾静脈投与した。なお、（ｄ）のドキソルビシン量は、（ｂ）及び（ｃ）のドキソルビシン部分の量と同量である。
（ａ）リン酸緩衝生理食塩水（PBS）
（ｂ）ドキソルビシン連結ラット抗ＫＬＨ抗体２．５ｍｇ／ｋｇ（α-KLHAb-Dox）
（ｃ）ドキソルビシン連結ラット抗ＨＭＧＢ１抗体（#10-22）２．５ｍｇ／ｋｇ（α-HMGB1Ab-Dox）
（ｄ）フリー体のドキソルビシン９８μｇ／ｋｇ（Doxorubicin）
投与後７日目に再度同じ薬剤を各群のマウスに投与した。そして、最初の投与から１１日後に蛍光標識イソレクチン２ｍｇ／ｋｇ（マウス体重）を尾静脈より投与した。１０分後にマウスを脱血致死させて、潅流固定後に組織切片作成を行った。以上の試験計画の概要を図５Ａに示した。
最初の投与の開始時点から投与１１日後までのマウスの腫瘍体積を、経時測定した腫瘍径をもとに以下の近似式により算出した。
腫瘍体積Ｖ＝（Ｗ２×Ｌ）／２ （Ｗ：腫瘍短径、Ｌ：腫瘍長径）
上記の潅流固定したマウスのメラノーマ組織を、常法を用いてパラフィン切片化し、抗Ｋｉ６７抗体（製品番号：ab15580，abcam社製）を用いて増殖細胞を染色した。抗Ｋｉ６７抗体染色像中の１視野当たりの陽性細胞数を計数して、各群のＫｉ６７陽性細胞数の比較を行った。
さらに上記組織切片におけるアポトーシスを起こした細胞を、下記に示すＴｕｎｅｌ法で検出した。各群の４個体について、各個体の染色像中の４視野の細胞数及びＴｕｎｅｌ陽性細胞数を合計し、Ｔｕｎｅｌ陽性細胞の割合を求めた。
＜Ｔｕｎｅｌ法＞
市販のIn situ Apoptosis Detection Kit（タカラバイオ社製）を用いて下記手順によりアポトーシスを起こした細胞を検出した。
（１）各群（PBS群、α-KLHAb-Dox群、α-HMGB1Ab-Dox群、Doxorubicin群）から得られたメラノーマのパラフィン切片を作製した。
（２）脱パラフィン処理を行った。
（３）３％ Ｈ２Ｏ２水溶液で５分間、内因性ペルオキシダーゼをブロッキングした後、ＰＢＳで洗浄した。
（４）予め調製後氷冷しておいたラベリング反応液50μL（TdT Enzyme 5μL+labeling buffer 45μL）をスライド上にのせ、湿潤箱中、３７℃で６０分間反応させた後、ＰＢＳで洗浄し、５分間反応させる一連の工程を３回施行した。
（５）蛍光顕微鏡にて切片を観察した。
測定された腫瘍体積の変化を示すグラフを図５Ｂに、体重の変化を図５Ｃに示した。α-HMGB1Ab-Dox群では、他の群に比べて有意に腫瘍体積の増加が抑制された。一方、マウスの体重に群間の差が実質的になく、投与による重篤な副作用は観察されなかった。
メラノーマ組織の抗Ｋｉ６７抗体染色像を図５Ｄ、Ｋｉ６７陽性細胞数を比較したグラフを図５Ｅに示した。α-HMGB1Ab-Dox群は、Doxorubicin群などの他の群に比べて、有意に腫瘍の増殖が抑制されていた。
腫瘍組織中のアポトーシスを起こした細胞の染色像を図５Ｆに、Ｔｕｎｅｌ陽性細胞の割合を比較したグラフを図５Ｇに示した。α-HMGB1Ab-Dox群は、α-KLHAb-Dox群及びDoxorubicin群に比べて、顕著に高い割合で腫瘍細胞のアポトーシスを誘導した。α-HMGB1Ab-Dox群ではアポトーシスを起こした細胞が血管周辺に同心円状に広がっていた。
以上の結果から、ドキソルビシン連結抗ＨＭＧＢ１抗体が、腫瘍の血管内皮細胞に取り込まれてドキソルビシンによる細胞傷害が起こった結果、腫瘍の増殖が抑制されたものと結論される。
［試験例５．抗ＨＭＧＢ１抗体の病変脳血管内皮細胞への集積の検証］
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、体重１８〜２３ｇのメス５匹）に、メチルスコポラミン１ｍｇ／ｋｇ（マウス体重）を腹腔内注射、ピロカルピン３５０ｍｇ/ｋｇを静脈注射して投与した。これによって、ピロカルピン誘発重積痙攣（ＰＩＬＯ−ＳＥ）モデルマウスを作製した。
ピロカルピン投与による痙攣誘発直後にラット抗ＨＭＧＢ１抗体（#10-22）を１ｍｇ／ｋｇ静脈注射した。１２時間後に脳を４％パラホルムアルデヒドで潅流固定し、凍結切片を作製した。
切片について、核はＤＡＰＩ染色し、抗ＨＭＧＢ１はＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ抗体を用いて染色した。観察には共焦点レーザー顕微鏡（LMS780、Carl Zeiss社製）を用いた。
得られたＬＳＭ像を図６に示した。中央の空洞が血管を表す。抗ＨＭＧＢ１抗体（緑色）は、血管周囲に局在しており、血管内皮細胞に局在していることが示唆された。
てんかんや、脳卒中、脳腫瘍、あるいは神経変性疾患などの脳障害によって、脳血管の新生又は透過性の亢進が見られることが知られている。上記の結果から、このような脳障害に起因して血管新生又は透過性が亢進された血管に、抗ＨＭＧＢ１抗体薬物コンジュゲートが特異的に集積し、さらには血管内皮細胞内に取り込まれるものと判断される。
［試験例６．エムタンシン（Emtansine）連結抗ＨＭＧＢ１抗体の腫瘍縮小効果検証のためのｉｎ ｖｉｖｏ試験］
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、7週齢、メス）を背部皮下に、２．０×１０５個のＢ１６−ＢＬ６メラノーマ細胞を注射し、常法に従って飼育してメラノーマ担癌マウスを作製した。移植後９日目に、腫瘍が形成されたマウスを５匹ずつ５群に分けて、次の（ａ）〜（ｅ）の処置群（投与量はマウス体重当たりの量、括弧内は群名）とした。それぞれの薬剤はマウスに尾静脈投与した。なお、（ｅ）のエムタンシン量は、（ａ）及び（ｂ）のエムタンシン部分の量と同量である。
（ａ）エムタンシン連結ラット抗ＫＬＨ抗体２．５ｍｇ／ｋｇ（α−KLHAb-DM1）
（ｂ）エムタンシン連結ラット抗ＨＭＧＢ１抗体（#10-22）２．５ｍｇ／ｋｇ（α-HMGB1Ab-DM1）
（ｃ）ラット抗ＫＬＨ抗体２．５ｍｇ／ｋｇ（α−KLHAb）
（ｄ）ラット抗ＨＭＧＢ１抗体（#10-22）２．５ｍｇ／ｋｇ（α−HMGB1Ab）
（ｅ）フリー体のエムタンシン１８μｇ／ｋｇ（Emtansine）
投与後７日目に再度同じ薬剤を各群のマウスに投与した。そして、最初の投与から１０日後に蛍光標識イソレクチン２ｍｇ／ｋｇ（マウス体重）を尾静脈より投与した。１０分後にマウスを脱血致死させて、潅流固定後に組織切片作成を行った。以上の試験計画の概要を図７Ｂに示した。
試験例４と同様の方法で、最初の投与の開始時点から投与１０日後までのマウスの腫瘍体積を求めた。
試験の結果、１１日後の腫瘍体積がα-HMGB1Ab-DM1群で他の群よりも小さく、最も高い腫瘍の増殖抑制効果が認められた。また、α-HMGB1Ab-DM1群はマウス体重の減少は見られなかった。以上から、抗体に連結するエムタンシンの分子数をより増加させることにより、副作用を抑えつつ抗腫瘍効果をさらに高めることが可能であると結論される。
本発明の抗ＨＭＧＢ１抗体又はその抗原結合性断片と薬物のコンジュゲート（抗体薬物コンジュゲート）によれば、血管新生又は透過性が、亢進した血管の内皮細胞へ所望の薬剤を選択的に送達することができる。また、当該抗体薬物コンジュゲートは、正常な血管へは実質的に取り込まれないという特徴を有している。したがって、当該抗体薬物コンジュゲートは、薬剤の所期の薬理作用を効果的に発揮せることができるので、薬剤に起因する副作用を回避ないしは軽減できることとなり、患者への負担を軽減できる実益を有する。斯る本発明の産業上の有用性は計り知れない。

Claims (14)

  1. ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片部分と、前記抗体又はその抗原結合性断片部分に連結された薬物部分とを含む、抗体薬物コンジュゲート
    を含有する、血管内皮細胞に前記薬物部分を送達するための、医薬組成物。
  2. 前記薬物部分と前記抗体又はその抗原結合性断片部分とが、１以上のリンカーで連結されている、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記薬物部分が、細胞傷害剤、細胞保護剤、プローブ、血管新生阻害剤、免疫抑制剤、降圧剤、昇圧剤、疼痛緩和剤、サイトカイン、抗生物質、及び免疫チェックポイント阻害剤からなる群より選ばれる１種又は２種以上を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 前記抗体薬物コンジュゲートが下記式（Ｉ）で表される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物：
    Ａ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ （Ｉ）
    （式中、ＡはＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片であり；
    Ｌはリンカーであり；
    Ｄは薬物部分であり；
    ｍは１〜８の整数であり；
    ｎは１〜２０の整数である）。
  5. 前記抗体又は抗原結合性断片が、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合し、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はそれらの断片である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 前記抗体又は抗原結合性断片が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトＨＭＧＢ１のエピトープに特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 前記リンカーが、切断性リンカー、非切断性リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカー及びジカルボン酸に基づくリンカーからなる群より選ばれる、請求項２〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. 悪性腫瘍の処置に使用される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  10. さらに別の抗体、別の抗体薬物コンジュゲート、細胞傷害剤、細胞保護剤、プローブ、血管新生阻害剤、免疫抑制剤、降圧剤、昇圧剤、疼痛緩和剤、サイトカイン、抗生物質、及び免疫チェックポイント阻害剤からなる群より選ばれる１種若しくは２種以上、又は、陽子線、重粒子線、ガンマ線、Ｘ線若しくは光の照射と併用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  11. ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片部分と、前記抗体又はその抗原結合性断片部分に連結された薬物部分とを含む抗体薬物コンジュゲートを含有する、
    血管内皮細胞に前記薬物部分を送達することで血管内皮細胞を検出するための組成物。
  12. 前記薬物部分が、少なくともプローブを含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. 血管新生若しくは血管透過性が亢進された血管若しくは血管内皮細胞の、画像若しくは状態の情報を得るため、又は、
    血管新生亢進関連疾患又は血管透過性亢進関連疾患の診断のために使用される、請求項１１又は１２に記載の組成物。
  14. 血管内皮細胞への薬物送達用組成物の製造のための、ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片の使用。
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