JP2011526480A - α５−β１抗体及びそれらの使用 - Google Patents

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Abstract

本開示は、高親和性を有するインテグリンα５β１に特異的に結合する、分離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。本開示の抗体をコード化する核酸分子、発現ベクター、宿主細胞及び本開示の抗体を発現させる方法も提供される。イムノコンジュゲート、二重特異性分子及び抗体又はその抗原結合部分を含む医薬組成物も提供される。本開示は、本明細書に記載の抗α５β１抗体又はその抗原結合部分を使用して種々のがんを処置する方法をも提供する。
【選択図】

Description

本願は、２００８年２月５日に出願された米国仮出願第６１／０２６０２７号、及び２００８年９月９日に出願された米国仮出願第６１／０９５４２９号の優先権を主張するものであり、両出願の全文は参照することにより本明細書に組み入れられている。
本開示は、α５β１に結合する抗体及びその抗原結合部分に関する。本開示は、また、当該抗体及び抗原結合部分をコード化する核酸分子、α５β１抗体及び抗原結合部分を作製する方法、これらの抗体及び抗原結合部分を含む組成物、並びに抗体、抗原結合部分、及び組成物を使用する方法に関する。
インテグリンα５β１は、フィブロネクチンを結合するヘテロ二量体細胞表面タンパク質であり、そして細胞付着及び血管新生に関与する。このヘテロ二量体はα５サブユニット及びβ１サブユニットで構成されている。インテグリンα５β１は、マトリックス接着、移動、増殖、分化、及び生存において重要な役割を果たす「古典的フィブロネクチン受容体」と呼ばれている。幾つかのインテグリンはフィブロネクチン（ＦＮ）に結合するが、α５β１は、それがリガンド認識及び最適相互作用のために、ＦＮの９番目(ＰＨＳＲＮ)及び１０番目（ＲＧＤＳ）のＩＩＩ型反復上の両ペプチド配列を必要とすることから、ＦＮに対して選択的である（非特許文献１、２、３）。ＦＮに対するインテグリン媒介細胞接着はカルシウム流出を誘発し、チロシン及びセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ並びにイノシトール脂質代謝を活性化し、そしてアクチン細胞骨格及び細胞周期進行を制御する低分子ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーの活性を調節することができる。
α５β１の発現は大部分の胚組織で認められるが、そのレベルは出生後に最終細胞分化と整合した形で低下する(非特許文献４)。野生型成体マウスでは、発現は主として血管系及び結合組織であるが、低レベルの受容体が広く分布している。α５β１及びＦＮの両発現は、ヒト腫瘍の血管でそして成長因子及びサイトカイン刺激組織において顕著にそして協調的に高進している。ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＴＧＦ−β、及びＴＮＦ−αなどの血管新生サイトカインは、インビトロ及びインビボで内皮細胞のα５β１発現をアップレギュレーションするが、これらの分子は正常なヒト血管及び組織では低発現する（非特許文献５、６、７）。
腫瘍細胞でも多くのタイプのがんにおいてα５β１を発現することが高い頻度で観察されることから、高レベルのα５β１の発現は血管系に限定されない。腫瘍低酸素は腫瘍α５β１発現増加に関連している（非特許文献８）。インテグリンは、新生毛細管への腫瘍血管内異物侵入及び遠位部位への血管外漏出に重要と考えられ、そして腫瘍拡大及び転移性疾患をもたらす。全体として、α５β１の発現パターンは、間質及び腫瘍細胞活性の両方を媒介することによりがんの促進における多面的役割と整合している。種々の臨床研究は、腫瘍細胞でのα５β１アップレギュレーションを、ヒト黒色腫、口腔扁平上皮がん、及びＢ細胞白血病の進行と関連付けている（非特許文献９、１０、１１）。
Danen et al. J. Biol. C hem. 270(37):21612-21618 (1995) Redick et al. J. Cell Biol. 149(2):521-527 (2000) Takagi et al. EMBO J. 22:4607-4615 (2003)) Muschler & Horwitz Development 1 13(l):327-337 (1991) Kim et al. Am. J. Path. 156(4): 1345-62 (2000) Enaida et al. Fukushima J. Med. ScI 44(l):43-52 (1998) Klein et al. MoL Biol. Cell 4(10):973-982 (1993) Mousa et al. J. Cell. Biochem. 74:135-143 (1999) Jin & Varner, Br. J. Cancer 90:561-565 (2004) Danen et al. Histo pathology 24(3):249-256 (1994) Shinohara et al., Am. J. Clin. Pathol l l l(l):75-88 (1999)
本開示は、分離されたモノクローナル抗体、特にヒトインテグリンα５β１に結合して高親和性を示すヒトモノクローナル抗体を提供する。本開示に記載されている抗体は通常ヒト抗体であるが、別の例では、抗体はマウス抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体であってよい。
１つの態様では、本開示は、分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分であって、抗体が：（ａ）１×１０-7Ｍ以下のＫDでヒトインテグリンα５β１に結合し；そして（ｂ）抗体依存性細胞傷害を誘導することができる分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分に関する。例えば、１つの例では、抗体はＩｇＧ１又はＩｇＧ３などのＡＤＣＣを誘導することができるサブクラスに属する。別の例では、ＡＤＣＣ活性は、変化した糖鎖付加パターンなど糖質修飾を、天然の糖質パターンに比べてＦｃ領域へ導入した結果である。
特定の例では、抗体は、５×１０-8Ｍ以下、２×１０-8Ｍ以下、１×１０-8Ｍ以下、５×１０-9Ｍ以下、４×１０-9Ｍ以下、３×１０-9Ｍ以下、又は２．７×１０-9Ｍ以下のＫDでヒトインテグリンα５β１に結合する。
更なる態様では、本開示は、分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分であって、抗体が：（ａ）１×１０-7Ｍ以下のＫDでヒトインテグリンα５β１に結合し；そして（ｂ）比較できる抗体に比べてＡＤＣＣ活性増強を示す分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。例えば、１つの例では、ＡＤＣＣ活性増強を示す抗体は野生型Ｆｃ領域に比べてＦｃ領域に少なくとも１つの突然変異を含み、そしてＡＤＣＣ活性増強は同じ抗体と相対的であるが、野生型Ｆｃ領域を含んでいる。特定の例では、抗体は、５×１０-8Ｍ以下、２×１０-8Ｍ以下、１×１０-8Ｍ以下、５×１０-9Ｍ以下、４×１０-9Ｍ以下、３×１０-9Ｍ以下、又は２．７×１０-9Ｍ以下のＫDで、ヒトインテグリンα５β１に結合する。更なる例では、抗体は、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも５００倍、又は少なくとも１０００倍である比較できる抗体に比べてＡＤＣＣ活性を増強し、比較できる抗体が同じ抗体であるが野生型Ｆｃ領域を有する、ＡＤＣＣ活性増強を示すものである。
更なる態様では、本開示は、分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分であって、抗体が：（ａ）１×１０-7Ｍ以下のＫDでヒトインテグリンα５β１に結合し；そして（ｂ）野生型Ｆｃ領域に比べてＦｃ領域中に少なくとも１つの突然変異を含む、分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。例えば、１つの例では、抗体のサブクラスはＩｇＧ１であり、そしてＩｇＧ１サブクラスのＦｃ領域中の少なくとも１つのアミノ酸は突然変異している。更なる例では、少なくとも１つの突然変異は、ＩｇＧ１サブクラスのＦｃ領域のセリン２４７、アラニン３３８、又はイソロイシン３４０の位置に起こる。更なる例では、少なくとも１つの突然変異はＳ２４７Ｄ、Ａ３３８Ｌ、及びＩ３４０Ｅから成る群から選択される。尚更なる例では、抗体は突然変異Ｓ２４７Ｄ、Ａ３３８Ｌ、及びＩ３４０Ｅを含む。
本開示の更なる態様は、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、抗体が：（ａ）配列番号７、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び（ｂ）配列番号８、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体とヒトインテグリンα５β１に結合するために交差競合又は競合する、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分である。
本開示の更なる態様は、抗体がヒトインテグリンα５β１を特異的に結合する、ヒトＶH４〜３９遺伝子の又はそれからの産物である重鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分である。
本開示の更なる態様は、抗体がヒトインテグリンα５β１を特異的に結合する、ヒトＶKＬ６遺伝子の又はそれからの産物である軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分である。
別の態様では、本開示は、配列番号１、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号２、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号３、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号４、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号５、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号６、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、
（ａ）配列番号１、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び
（ｆ）配列番号６、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３：
を含む分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号７、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。例えば、本開示は、配列番号７に記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である重鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合部分を提供する。更なる態様では、本開示は、配列番号８、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。例えば、本開示は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合部分を提供する。更なる態様では、本開示は、配列番号７、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域及び配列番号８、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。例えば、本開示は、配列番号７に記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である重鎖可変領域、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
別の態様では、本開示は、配列番号１３、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号１４、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号１５、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号１６、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号１７、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号１８、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、
（ａ）配列番号１３、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１４、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１５、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１６、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１７、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び
（ｆ）配列番号１８、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３：
を含む分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号１９、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。更なる態様では、本開示は、配列番号２０、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。更なる態様では、本開示は、配列番号１９、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２０、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
別の態様では、本開示は、配列番号２３、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号２４、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号２５、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号２６、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号２７、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号２８、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、
（ａ）配列番号２３、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２４、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２５、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２６、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２７、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び
（ｆ）配列番号２８、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３：
を含む分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号２９、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。更なる態様では、本開示は、配列番号３０、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。更なる態様では、本開示は、配列番号２９、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３０、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
別の態様では、本開示は、配列番号３３、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号３４、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号３５、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号３６、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号３７、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号３８、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、（ａ）配列番号３３、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３４、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３５、又はその保存修飾を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号３６、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号３７、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号３８、又はその保存修飾を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３：を含む分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
更なる態様では、本開示は、配列番号３９、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。更なる態様では、本開示は、配列番号４０、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。更なる態様では、本開示は、配列番号３９、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４０、又はその保存修飾のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
更なる態様では、本明細書に開示される抗体のいずれかのようにヒトインテグリンα５β１の同じエピトープに結合し、及び／又はヒトインテグリンα５β１に結合するために当該抗体と競合する、分離抗体又はその抗原結合部分が提供される。
１つの実施態様では、本開示は、寄託番号ＰＴＡ−９３７７としてＡＴＣＣに寄託された物質を提供する。別の実施態様では、本開示は、寄託番号ＰＴＡ−９３７８としてＡＴＣＣに寄託された物質を提供する。別の実施態様では、開示は、寄託番号ＰＴＡ−９３７７としてＡＴＣＣに寄託された重鎖可変領域を含む分離抗体を提供する。別の実施態様では、本開示は、寄託番号ＰＴＡ−９３７８としてＡＴＣＣに寄託された軽鎖可変領域を含む分離抗体を提供する。別の実施態様では、本開示は、寄託番号ＰＴＡ−９３７７としてＡＴＣＣに寄託された重鎖可変領域を含む分離抗体を提供するが、ここで、生殖細胞系突然変異Ｉ３０Ｓ及びＮ３３Ｓは、ＶH領域において作製されている。更なる実施態様では、本開示はそれぞれ寄託番号ＰＴＡ−９３７７及びＰＴＡ−９３７８としてＡＴＣＣに寄託された重鎖及び軽鎖可変領域を含む分離抗体、又は生殖細胞系突然変異Ｉ３０Ｓ及びＮ３３ＳがＶH領域において作製されている該抗体を提供する。更なる実施態様では、本開示は、寄託番号ＰＴＡ−９３７７としてＡＴＣＣに寄託された重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域を含み、又は該重鎖可変領域が生殖細胞系突然変異Ｉ３０Ｓ及びＮ３３Ｓを含む場合に該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む分離抗体を提供する。更なる実施態様では、本開示は、寄託番号ＰＴＡ−９３７８としてＡＴＣＣに寄託された軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域を含む分離抗体を提供する。更なる実施態様では、本開示は、それぞれ寄託番号ＰＴＡ−９３７７及びＰＴＡ−９３７８としてＡＴＣＣに寄託された重鎖及び軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域及び重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域を含み、又は該重鎖可変領域が生殖細胞系突然変異Ｉ３０Ｓ及びＮ３３Ｓを含む場合に、該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域を含む分離抗体を提供する。
本開示の抗体は、例えば、完全長抗体、例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスであってよい。代わりに、抗体は、Ｆａｂ又はＦａｂ′２フラグメントなどの抗体フラグメント、又は一本鎖抗体であってよい。１つの例では、本開示は、サブクラスＩｇＧ１のヒト完全長抗体である上記のいずれかの抗体であって、ＩｇＧ１サブクラスのＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸が突然変異している抗体を提供する。更なる例では、少なくとも１つの突然変異は、セリン２４７、アラニン３３８、又はイソロイシン３４０の位置に起こる。更なる例では、少なくとも１つの突然変異は、Ｓ２４７Ｄ、Ａ３３８Ｌ、及びＩ３４０Ｅから成る群から選択される。尚更なる例では、抗体は突然変異Ｓ２４７Ｄ、Ａ３３８Ｌ、及びＩ３４０Ｅを含む。
更なる態様では、本開示は、配列番号９、又はその保存修飾に示される重鎖を含む分離されたモノクローナル抗体を提供する。例えば、抗体は、配列番号９に記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である重鎖を含む。更なる態様では、本開示は、配列番号１０、又はその保存修飾に示される軽鎖を含む分離されたモノクローナル抗体を提供する。例えば、抗体は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である軽鎖を含む。更なる態様では、本開示は、配列番号９、又はその保存修飾に示される重鎖、及び配列番号１０、又はその保存修飾に示される軽鎖を含む、分離されたモノクローナル抗体を提供する。例えば、抗体は、配列番号９に記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である重鎖、及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である軽鎖を含む。
幾つかの実施態様では、記載された本開示の抗α５β１抗体のいずれかの重鎖Ｃ末端リジンは切断され、そしてそれ故に存在しない。例えば、幾つかの実施態様では、本開示の抗体は配列番号４３に示されるようにＩｇＧ１定常重鎖領域を含むが、しかしそこにはＣ末端リジンは存在しない。種々の例では、抗α５β１抗体の重鎖及び軽鎖は、場合によりシグナル配列を含んでもよい。
更なる態様では、本開示は、本明細書に記載のいずれかの抗体、又はその抗原結合部分、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
更なる態様では、本開示は、本明細書に記載の、治療薬に結合されたいずれかの抗体、又はその抗原結合部分を含むイムノコンジュゲートを提供する。１つの例では、治療薬は細胞毒素又は放射性同位体である。更なる態様では、本開示は、本明細書に記載のいずれかのイムノコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。本開示は、また、該抗体、又はその抗原結合部位と異なる結合特異性を有する第２の機能性部分に結合される、抗体又はその抗原結合部位を含む二重特異性分子を提供する。
本開示の抗体若しくはその抗原結合部位、又はイムノコンジュゲート若しくは二重特異性分子、及び薬学的に許容される担体を含む組成物も提供される。
抗体、又はその抗原結合部位をコード化する核酸分子も、当該核酸を含む発現ベクター及び当該発現ベクターを含む宿主細胞と同様に、本開示によって包含される。１つの態様は、例えば、配列番号１１若しくはその保存修飾に示される配列を含む分離された核酸分子、又は発現ベクターである。更なる態様は、配列番号１２、若しくはその保存修飾に示される配列を含む分離された核酸分子、又は発現ベクターである。更なる態様は、配列番号２１、２２、３１、３２、４１及び４２若しくはその保存修飾から成る群から選択される配列を含む分離された核酸分子、又は発現ベクターである。本開示は、ヒト免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスであって、マウスが本開示の抗体並びに当該マウスから調製されるハイブリドーマを発現し、かつ、そのハイブリドーマが本開示の抗体を生産する、トランスジェニックマウスを提供することである。
本開示は、更に本明細書に記載の発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。
更なる態様では、本開示は、本明細書に記載のいずれかの宿主細胞に抗体を発現し、そして宿主細胞から抗体を分離することを含む、抗インテグリンα５β１抗体を製造する方法を提供する。
別の実施態様では、本開示は、１×１０-7ＭのＫD以下のヒトインテグリンα５β１に結合し、そして抗体依存性細胞傷害を誘導することができる抗体又はその抗原結合部分を、細胞と接触させることを含む、インテグリンα５β１を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。１つの例では、抗体は完全ヒト抗体である。更なる例では、抗体又はその抗原結合部分は、抗体依存性細胞傷害を誘導するその能力を強化するために改変される。尚更なる例では、強化はＦｃ領域の少なくとも１つのアミノ酸残基の突然変異によって達成される。
更なる態様では、本開示は、本明細書に記載のように、腫瘍細胞の増殖を阻害する有効量の抗体又はその抗原結合部分のいずれかを、細胞と接触させることを含む、インテグリンα５β１を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、異常細胞増殖を処置するための薬剤を製造するための、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分のいずれかの使用を提供する。なお更なる態様では、本開示は、異常細胞増殖の処置及び／又は診断に使用するための、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分のいずれかの使用を提供する。本方法の１つの実施態様では、異常細胞増殖は、中皮腫、肝胆（肝及び胆管）、原発性又は二次性ＣＮＳ腫瘍、原発性又は二次性脳腫瘍、肺がん（ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣ）、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚又は眼内黒色腫、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、胃腸（胃、結腸直腸、及び十二指腸）、乳がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頚がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、精巣がん、慢性又は急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓又は尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質がん、胆嚢がん、多発性骨髄腫、胆管がん、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、又は上記のがんの１つ又はそれ以上の併発を含むがんであるが、それらに限定されない。
本開示は、また、本明細書で与えられる抗α５β１抗体の配列に基づいて、「第二世代の」抗α５β１抗体を作製する方法を提供する。例えば、本開示は、（ａ）：（ｉ）配列番号１、１３、２３、又は３３に示されるＣＤＲ１配列、配列番号２、１４、２４、又は３４に示されるＣＤＲ２配列及び／又は配列番号３、１５、２５、又は３５に示されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；及び／又は（ｉｉ）配列番号４、１６、２６、又は３６に示されるＣＤＲ１配列、配列番号５、１７、２７、又は３７に示されるＣＤＲ２配列及び／又は配列番号６、１８、２８、又は３８に示されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を与えること；（ｂ）少なくとも１つの変化抗体配列を作製するために、重鎖可変領域抗体配列及び／又は軽鎖可変領域抗体配列内で少なくとも１つのアミノ酸残基を変えること；（ｃ）タンパク質として変化抗体配列を発現させること：を含む抗α５β１抗体を製造する方法を提供する。
本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び実施例から明白であると思われるが、実施例は限定するものと解釈してはならない。全ての参考文献の内容、ジーンバンク登録、本明細書のすべてにわたり引用された特許及び公開特許出願は、参照することにより本明細書に明確に組み込まれている。
Ａは、２２Ｂ５重鎖可変領域のＤＮＡ配列（配列番号１１）を示す；Ｂは、２２Ｂ５重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（配列番号１７）−ＣＤＲ領域には下線が引かれている；Ｃは、２２Ｂ５軽鎖可変領域のＤＮＡ配列（配列番号１２）を示す；Ｄは、２２Ｂ５軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（配列番号８）−ＣＤＲ領域には下線が引かれている。 Ｅは、２４Ｃ７重鎖可変領域のＤＮＡ配列（配列番号２１）を示す；Ｆは、２４Ｃ７重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（配列番号１９）−ＣＤＲ領域には下線が引かれている；Ｇは、２４Ｃ７軽鎖可変領域のＤＮＡ配列（配列番号２２）を示す；Ｈは、２４Ｃ７軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（配列番号２０）−ＣＤＲ領域には下線が引かれている。 Ｉは、１Ｄ９重鎖可変領域のＤＮＡ配列（配列番号３１）を示す；Ｊは、１Ｄ９重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（配列番号２９）−ＣＤＲ領域には下線が引かれている；Ｋは、１Ｄ９軽鎖可変領域のＤＮＡ配列（配列番号３２）を示す；Ｌは、１Ｄ９軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（配列番号３０）−ＣＤＲ領域には下線が引かれている。 Ｍは、２Ｄ２重鎖可変領域のＤＮＡ配列（配列番号４１）を示す；Ｎは、２Ｄ２重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（配列番号３９）−ＣＤＲ領域には下線が引かれている；Ｏは、２Ｄ２軽鎖可変領域のＤＮＡ配列（配列番号４２）を示す；Ｐは、２Ｄ２軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（配列番号４０）−ＣＤＲ領域には下線が引かれている。 Ｑは、下線が引かれた突然変異Ｓ２４７Ｄ、Ａ３３８Ｌ、及びＩ３４０Ｅを有するＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列を示し；Ｒは、ＩｇＧ１軽鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。 対応する生殖細胞系配列を有する２２Ｂ５重鎖可変ドメイン（ＶH）のアラインメントを示す。対応する生殖細胞系配列を有する２２Ｂ５軽鎖可変ドメイン（Ｖκ）のアラインメントも示される。ＣＤＲ領域には下線が引かれ、同一残基は欠失を示す長音記号及び点線によって表わされる。 固定化２２Ｂ５／ＤＬＥにわたって種々の濃度のα５β１組み換え細胞外ドメインを注射することによって得られる、センサーグラムのオーバーレイを示す。このデータは、４.０ｍＭのＣａＣｌ2の存在下に収集された。注射の順序は低濃度から高濃度へであった。 ＦＡＣＳによる２２Ｂ５／ＤＬＥのＨＵＶＥＣへの用量依存性結合を示す。 ヒト及びマウスＦｃγ受容体を比較する平衡解離定数を示す。「ｗｔ」は２２Ｂ５野生型ＩｇＧ１を指し；「ＤＬＥ」は２２Ｂ５／ＤＬＥを指す。 ＨＵＶＥＣ細胞接着遮断分析の結果を示す。結果は、２２Ｂ５及び種々のサブクラス変異体、並びに陰性対照（ＢＨＡ２ＩｇＧ１）に対するフィブロネクチンへのＨＵＶＥＣ接着阻害のレベルを示す。ＩＣ50計算値も示される。 ウェスタンブロット法によって測定したＨＵＶＥＣ及び２０の腫瘍細胞系からの、ヒトα５発現を示す。 ２２Ｂ５ｗｔＩｇＧ１と比べた２２Ｂ５／ＤＬＥによって誘導されたインビトロＡＤＣＣを示す。２２Ｂ５／ＤＬＥ及び２２Ｂ５ｗｔＩｇＧ１によるヒトＰＢＭＣの存在下でＵ８７ＭＧ細胞のＡＤＣＣを測定した、ＬＤＨに基づく検出分析を示す。 ２２Ｂ５ｗｔＩｇＧ１と比べた２２Ｂ５／ＤＬＥによって誘導されたインビトロＡＤＣＣを示す。２２Ｂ５／ＤＬＥ及び２２Ｂ５ｗｔＩｇＧ１によるヒトＰＢＭＣの存在下でＨＵＶＥＣのＡＤＣＣを測定したToxiLightに基づく検出分析を示す。 抗原発現レベルの広範囲にわたりｗｔ２２Ｂ５ＩｇＧ１を超えて２２Ｂ５／ＤＬＥからの実質的なＡＤＣＣ増強を示す、ＬＤＨに基づく検出分析を示す。 Ａ５４９−Ｌｕｃ実験転移モデルにおける２２Ｂ５／ＤＬＥの阻害活性を示す。Ａ：８週でＢＬＩによって測定した肺転移容積（対照群はｎ＝１１、２２Ｂ５ＩｇＧ２群はｎ＝１４及び２２Ｂ５／ＤＬＥ群はｎ＝１２）。 Ａ５４９−Ｌｕｃ実験転移モデルにおける２２Ｂ５／ＤＬＥの阻害活性を示す。Ｂ：投薬後、２２Ｂ５ＩｇＧ２処置群における肺腫瘍の再増殖は停止した。比較すれば、２２Ｂ５／ＤＬＥ処置群は殆ど再増殖を示さなかった。 Ａ５４９−Ｌｕｃ実験転移モデルにおける２２Ｂ５／ＤＬＥの阻害活性を示す。Ｃ：各処置群の動物生存率のKaplan-Meierプロット（エンドポイント＝ＢＬＩ１×１０8光子／秒）、他のすべての群と比べて対照賦形剤群でｐ＜０．０００１、及び２２Ｂ５／ＤＬＥ及び２２Ｂ５ＩｇＧ２群間の比較でｐ＜０．０５。 ＦＡＣＳによれば、ＨＵＶＥＣへの１Ｄ９、１Ｄ９／ＤＬＥ、２４Ｃ７／ＤＬＥ、２Ｄ２／ＤＬＥ、２２Ｂ５、及び２２Ｂ５／ＤＬＥの用量依存性結合を示す。 ＦＡＣＳによれば、ＨＵＶＥＣへの１Ｄ９、１Ｄ９／ＤＬＥ、２４Ｃ７／ＤＬＥ、２Ｄ２／ＤＬＥ、２２Ｂ５、及び２２Ｂ５／ＤＬＥの用量依存性結合を示す。 １Ｄ９、１Ｄ９／ＤＬＥ、２Ｄ２／ＤＬＥ、２２Ｂ５／ＤＬＥ、及び２４Ｃ７／ＤＬＥによって誘導されるインビトロＡＤＣＣを示す。 転移性黒色腫の同系モデルにおける１Ｄ９／ＤＬＥのＡＤＣＣ依存性抗腫瘍効果を示す。Ａ：全群から切除した肺の肉眼的形態。 転移性黒色腫の同系モデルにおける１Ｄ９／ＤＬＥのＡＤＣＣ依存性抗腫瘍効果を示す。Ｂ：肺質量の定量化（*ｐ＜０.０５、１Ｄ９ＩｇＧ１ＤＬＥｖｓ１Ｄ９ＩｇＧ２）。 転移性黒色腫の同系モデルにおける１Ｄ９／ＤＬＥのＡＤＣＣ依存性抗腫瘍効果を示す。Ｃ：肺表面に見える転移コロニー数の定量化。ＡＮＯＶＡ及びBonferroni多重比較検定による統計解析（*ｐ＜０.０５、１Ｄ９ＩｇＧ１ＤＬＥｖｓ１Ｄ９ＩｇＧ２；*ｐ＜０.０５、１Ｄ９ＩｇＧ１ＤＬＥｖｓ抗ＫＬＨＩｇＧ２）。
本開示は、分離されたモノクローナル抗体、特に高親和性のα５β１に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体に関する。特定の例では、本開示の抗体は特定の重鎖及び軽鎖生殖細胞系配列から生じ、及び／又は特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域など特定の構造的特徴を含む。本開示は、分離抗体、当該抗体を作製する方法、当該抗体を含むイムノコンジュゲート及び二重特異性抗体、及び抗体を含む医薬組成物、本開示のイムノコンジュゲート及び二重特異性抗体を提供する。本開示は、α５β１を検出するため、並びに異常細胞増殖（例えばがん）などのα５β１の発現に関連する疾患を処置するためなど、抗体を使用する方法にも関する。従って、本開示は、がんなど種々のタイプの異常細胞増殖を処置するための、抗α５β１抗体又はその抗原結合部分を使用する方法も提供する。
本開示を更に容易に理解するために、特定の用語を先ず定義する。更なる定義は本項全体を通して記載される。
本明細書において特に明記がない限り、本開示に関連して使用される科学及び技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈上必要がない限り、単数用語は複数形を含み、そして複数用語は単数形を含む。一般的に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーション、及びそれらの技術に関連して使用される専門用語は、当業者に周知のかつ当技術分野において一般的に使用されるものである。
本開示の方法と技術は、当技術分野において周知の、そして特に指示がない限り、本明細書を通して例示されそして論じられる種々の一般的な及びより特定の参考文献に記載の方法により、一般的に実施される。当該参考文献には、例えば、Sambrook and Russell, 「分子クローニング、実験室的アプローチ」（Molecular Cloning, A Laboratory Approach）、Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001), Ausubel et al., 「分子生物学における現在のプロトコール」（Current Protocols in Molecular Biology）, John Wiley & Sons, NY (2002), and Harlow and Lane 「抗体：実験室マニュアル」（Antibodies：A Laboratory Manual）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990)が含まれる。酵素反応及び精製技術は、当技術分野で一般的に得られ又は本明細書に記載のメーカーの仕様書によって実施される。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、及び医薬品及び製薬化学に関連して、そしてその実験操作と技術に使用される専門用語は、当技術分野で周知でありそして一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬品、製剤及び送達、並びに患者の処置には、標準的な方法が使用される。
本明細書で使用される以下の各用語は、本項においてそれと関連する意味を有する。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的対象の１つ又はそれ以上（即ち、少なくとも１つ）に言及するために本明細書で使用される。１例として、「（an）エレメント」は１つのエレメント、又は１つより多いエレメントを意味する。
本明細書で使用される２０の既存アミノ酸及びそれらの略号は、慣用的用法に従う。「免疫学−合成」（Immunology−A Synthesis） (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)）を参照されたい。
用語「α５β１」及び「インテグリンα５β１」は互換性を持って使用され、そしてヒトα５β１の変異体、アイソフォーム及び種ホモログを含む。天然のヒトα５β１は、例えば、α５サブユニット（前駆配列から生じ、続いてジスルフィド結合によって結合する２つの鎖に切断される）（Genbank Accession No.P08648）及びβ１サブユニット（前駆配列から生じ、続いて成熟型にプロセシングされる）（Genbank Accession No.P05556-1）から構成されている。β１サブユニットは、選択的スプライシングにより産生する幾つかのアイソフォーム（例えば、Genbank Accession Nos.P05556-2、P05556-3、P05556-4、及びP05556-5を参照）として存在することが知られている。本開示のヒトα５β１抗体は、特定の場合に、ヒト以外の種からのα５β１と交差反応する。他の場合には、抗体はヒトα５β１抗体に対して完全に特異的であると考えられ、種の又は他のタイプの交差反応性を示さないと考えられる。
熟練した技術者では当然のことながら、「免疫応答」は、ヘルパーＴ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞応答のいずれかの検出可能な抗原特異的又は同種活性化、抗体の産生、同種反応のＴ細胞媒介活性化などを含むが、それらに限定されない。この用語は、病原体、病源体に感染した細胞若しくは組織、がん細胞の侵入した、又は自己免疫若しくは病的炎症、正常ヒト細胞若しくは組織の場合に、人体に対する選択的損傷、その破壊、又はそこからの除去をもたらす、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、及び上記細胞又は肝臓で生産される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用を包含する。
「シグナル伝達経路」は、細胞の１つの部分から細胞の別の部分へのシグナル伝送の役割を果たす、多様なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。本明細書で使用される語句「細胞表面受容体」は、例えば、細胞の細胞膜の全体にわたりシグナル及び当該シグナルの伝送を受け取ることができる、分子及び分子複合体を含む。本開示の「細胞表面受容体」の例は、α５β１インテグリンである。
本明細書に記載の用語「抗体」は、全抗体及びいずれもの抗原結合フラグメント（即ち、「抗原結合部分」）又はその単一鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合により相互結合した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、又はその抗原結合部分を含む糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶHと略称する）及び重鎖定常領域から成る。重鎖定常領域は３ドメイン、ＣH１、ＣH２及びＣH３から成る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶLと略称する）及び軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣLから成る。ＶH及びＶL領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が、散在的に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分し得る。各ＶH及びＶLは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順位：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列する、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから成る。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ） を含む、宿主の組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。軽鎖及び重鎖内では、可変及び定常領域は、約１２又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合し、また重鎖では約１０又はそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般的には、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989))を参照されたい。
本明細書に記載の抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）は、抗原(例えば、α５β１)に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又はそれ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによってなし得ることが示されている。抗体の用語「抗原結合部分」に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶL、ＶH、ＣL及びＣH1から成る一価フラグメントのＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋で結合した２つのＦａｂフラグメントを含む、二価フラグメントのＦ（ａｂ′）2フラグメント；（ｉｉｉ）ＶH及びＣH1ドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶL及びＶHドメインから成るＦｖフラグメント、（ｖ）ＶHドメインから成るｄＡｂフラグメント(Ward el al, (1989) Nature 341:544-546)；及び（ｖｉ）分離相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。更に、Ｆｖフラグメントの２ドメイン、ＶL及びＶHは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは組み換え法を用いて、ＶL及びＶH領域がペアとなって一価分子を形成する、単一タンパク質鎖としてそれらを作製することが可能な合成リンカーにより結合することができる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 及びd Huston el al. (1988) Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:5879-5883を参照）。当該一本鎖抗体も、用語、抗体の「抗原結合部分」に包含されることを意図している。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来技術を含むいずれの適切な技術を用いて得てもよく、そしてフラグメントは完全抗体と同じ様に有用性のスクリーニングをすることができる。
本明細書で使用される「分離抗体」は、異なる抗原特異性を有する、他の抗体が実質的に含まれていない抗体を指すことを意図している（例えば、α５β１を特異的に結合する分離抗体は、α５β１以外の抗原を特異的に結合する抗体が実質的に含まれていない）。α５β１を特異的に結合する分離抗体は、しかしながら、他種由来のα５β１分子など他の抗原に交差反応性を有すると考えられる。その上、分離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学品を実質的に含まないと考えられる。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、単一分子組成物の抗体分子の製品を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和性を示す。
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」、又は「完全ヒト抗体」は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から生じる可変領域を有する抗体を含むことを意図している。更に、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から生じる。本開示のヒト抗体又はその抗原結合部分は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコード化されないアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、インビトロでランダム又は部位特異的突然変異誘発、又はインビボで体細胞突然変異によって導入される突然変異）。しかしながら、本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、マウスなど別の哺乳動物種の生殖細胞系から生じるＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むことを意図するものではない。
用語「ヒトモノクローナル抗体」又は「完全ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から生じる可変領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を指す。１つの実施態様では、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、Ｂ細胞が不死化細胞に融合されるヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
本明細書で使用される用語「組み換えヒト抗体」は、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニック又は染色体導入動物（例えば、マウス）から分離した抗体、又はそれから調製したハイブリドーマ（更に下記に記載）、（ｂ）ヒト抗体を発現するために形質転換された宿主細胞から、例えば、トランフェクトーマから分離される抗体、（ｃ）組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから分離される抗体、及び（ｄ）他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングに関わるその他の手段により調製され、発現され、作製され又は分離される抗体など、組み換え手段により調製され、発現され、作製され又は分離されるすべてのヒト抗体を含む。当該組み換えヒト抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域が、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から生じる可変領域を有する。特定の実施態様では、しかしながら、当該組み換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニック動物が使用される場合は、インビボ体細胞突然変異誘発）を受けることができ、それ故組み換え抗体のＶH及びＶL領域のアミノ酸配列は、一方でヒト生殖細胞系のＶH及びＶL配列から生じそしてそれに関連するが、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー内に自然には存在しない配列である。
本明細書で使用される「イソタイプ」又は「クラス」は、重鎖定常領域遺伝子によってコード化される抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ）を指す。抗体の定常ドメインは抗原への結合に関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸の配列に応じて、所定のヒト抗体又は免疫グロブリンは、主要５クラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの１つに帰属することができる。異なるクラスの免疫グロブリンの構造及び３次元立体配置は周知である。種々のヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びＩｇＭだけが補体を活性化することが知られている。ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３はヒトのＡＤＣＣを媒介することが知られている。
本明細書で使用される「サブクラス」は、ＩｇＧイソタイプのうちの、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラスなどの、重鎖定常領域遺伝子イソタイプのうちの更なる詳細クラスを指す。
本明細書で使用される用語「化合物」又は「医薬品」は、抗体、その抗原結合部分、イムノコンジュゲート、及び二重特異性分子を含む。
語句「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」は、本明細書では用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換性を持って使用される。
用語「抗体依存性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、非特異的細胞傷害性細胞（例えばＮＫ細胞、好中球、マクロファージなど）が標的細胞に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介反応を指す。一般的にＡＤＣＣを媒介する当該細胞傷害性細胞は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞（ＮＫ細胞）はＦｃγＲＩＩＩを発現するが、一方で単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及び／又はＦｃγＲＩＶを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)に要約されている。分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５５００３６２号又は第５８２１３３７号に記載のようなインビトロＡＤＣＣ分析を実施してもよい。当該分析に有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代わりに又は更に、関係する分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998)に記載されているような動物モデルにおいて、インビボで評価してもよい。
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、Ｆｃ領域が重鎖のヒンジ領域並びにＣH２及びＣH３ドメインを含む、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために使用される。例えば、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲであってよい。ＦｃＲはＩｇＧ抗体（γ受容体）を結合する１つであってよく、そしてこれらの受容体の対立遺伝子多型及び選択的スプライシング型を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃγＲＩＶサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制性受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)を参照）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457- 92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); 及び de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995）に概説されている。今後同定されるものも含めて他のＦｃＲは、本明細書で用語「ＦｃＲ」によって包含される。この用語は、母体ＩｇＧの胎児への移行に関与する新生児受容体、ＦｃＲｎをも含む（Guyer et al., Immunol, 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol, 24:249 (1994))。免疫グロブリンＦｃフラグメントへの主要ＦｃＲ結合部位は、ＣH１とＣH２ドメイン間のヒンジ領域に存在する。このヒンジ領域は種々の白血球でＦｃＲ１〜３と相互作用し、これらの細胞の標的攻撃を誘引する（Wines et al., J. Immunol, 164:5313-5318 (2000))。ヒンジ領域は米国特許第６１６５４７６号に記載の配列を包含するが、これに限定されない。
用語「抗体依存性細胞傷害を誘導することができる」とは、当業者に公知の分析法により測定して、抗体などの薬剤がＡＤＣＣを示す能力を指す。当該活性は、一般的に種々のＦｃＲを有するＦｃ領域の結合によって特徴付けられる。いかなる特定のメカニズムによっても限定されることなく、当業者は、抗体がＡＤＣＣを示す能力は、例えば、そのサブクラス（ＩｇＧ１又はＩｇＧ３など）により、Ｆｃ領域に導入される突然変異により、又は抗体のＦｃ領域における糖質パターンへの修飾によって決まり得ることを認識しているはずである。当該修飾は、例えば、米国特許出願第２００７−００９２５２１号に記載されている。
用語「ヒト抗体誘導体」は、ヒト抗体のいずれかの修飾型、例えば、その抗体及び別の薬剤又は抗体のコンジュゲートを指す。
用語「ヒト化抗体」は、マウスなど別の哺乳動物種の生殖細胞系から生じるＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を指すことを意図すしている。更なるフレームワーク領域修飾は、ヒトフレームワーク配列内で行なわれてもよい。
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種から生じ、そして定常領域配列が別の種から生じる抗体、即ち、可変領域配列がマウス抗体から生じ、そして定常領域配列がヒト抗体から生じるような抗体を指すことを意図している。
本明細書で使用される語句「特異的に結合する」では、特異的分子を認識して結合するが、試料中の他の分子を実質的の認識又は結合しない１つの化合物、例えば、タンパク質、核酸、抗体などを意味する。例として、試料中のコグネートリガンド（例えば、そのコグネート抗原、α５β１と結合する抗α５β１抗体）を認識して結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識又は結合しない抗体又はペプチド阻害剤を意味する。従って、指定された分析条件下に、特異的結合部分（例えば、抗体及びその抗原結合部分）は、特定の標識分子、例えば、α５β１に選択的に結合し、そして試験試料中に存在する他の成分には顕著な量では結合しない。関係する分子を特異的に結合する抗体を選択するために、様々な分析フォーマットが選択される。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫測定分析、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＦＡＣＳ、及びウェスタンブロット解析は、α５β１と特異的に反応する抗体を同定するために使用してもよい。一般的に、特異的又は選択的反応は、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍、そしてより一般的にはバックグラウンドの１０倍より大きくなるはずであり、更により具体的には、平衡解離定数（ＫD）が≦１μＭ、例えば≦１００ｎＭ、及び更に、例えば、≦１０ｎＭの場合に、抗体は抗原を「特異的に結合する」といわれる。
本明細書で使用される、「ヒトインテグリンα５β１に特異的に結合する」抗体は、１×１０-7Ｍ以下、５×１０-8Ｍ以下、３×１０-8Ｍ以下、１×１０-8Ｍ以下、又は５×１０-9Ｍ以下、のＫDで、ヒトインテグリンα５β１に結合する抗体を指すことを意図している。
本明細書で使用される用語「ｋon」は、オンレート、又は特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指し、一方で本明細書にて使用される用語「ｋoff」は、オフレート、又は特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。本明細書で使用される用語「ＫD」は、ｋoff対ｋonの比率（即ち、ｋoff／ｋon）から得られ、そしてモル濃度（Ｍ）で表わされる解離定数を指すことを意図している。抗体に対するＫD値は、当技術分野で周知の方法を用いて測定することができる。抗体のＫD値を測定する１つの方法は、表面プラスモン共鳴を用い、一般的にBiacore(登録商標)システムなどのバイオセンサーシステムを用いる方法である。
本明細書で使用される用語のＩｇＧ抗体に対する「高親和性」とは、標的抗原に対して１×１０-7Ｍ以下、５×１０-8Ｍ以下、又は５×１０-9Ｍ以下のＫDを有する抗体を指す。しかしながら、「高親和性」結合は他の抗体イソタイプに対して変動することができる。例えば、ＩｇＭイソタイプに結合するための「高親和性」結合は、１０-6Ｍ以下、１０-7Ｍ以下、又は１０-8Ｍ以下のＫDを有する抗体を指す。
抗体に関して本明細書で使用される用語「競合する」は、一次抗体又はその抗原結合部分が、二次抗体又はその抗原結合部分との結合を競合する場合を指し、そこではコグネートエピトープと一次抗体の結合は、二次抗体の不存在における一次抗体の結合と比べて、二次抗体の存在下では検出可能に低下する。二次抗体のそのエピトープへの結合も一次抗体の存在下に検出可能に低下する二者択一があり得るが、必ずというわけではない。即ち、一次抗体は、一次抗体のその各エピトープへの結合を阻害するその二次抗体なしに、二次抗体のそのエピトープへの結合を阻害することができる。しかしながら、各々の抗体がそのコグネートエピトープ又はリガンドと他の抗体の結合を、同じに、より大きく、又はより小さくのいずれでも、検出可能に阻害する場合、抗体はそれらの各々の１つ又は複数のエピトープの結合に対して相互に「交差競合する」といわれている。例えば、交差競合する抗体は、本明細書に開示の抗体が結合する、エピトープ又はエピトープの部分に結合することができる。両方の競合及び交差競合する抗体の使用は本開示により包含される。当該競合又は交差競合が起こるメカニズム（例えば、立体障害、立体配座変化、又は共通エピトープへの結合、又はその部分など）に関係なく、熟練技術者には当然のことながら、本明細書にて与えられる教示に基づいて、当該競合及び／又は交差競合抗体は包含され、そして本明細書に開示の方法にとって有用となり得る。
用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができる、いずれのタンパク質決定因子をも含む。エピトープ決定因子は、通常アミノ酸又は糖鎖など分子の化学的活性表面グループ分けから成り、そして通常特異的３次元構造特性、並びに特異的電荷特性を有する。立体配座又は非立体配座エピトープは、後者への結合ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下に失われるという点で区別される。
「糖型」は、種々の糖単位の結合を含む複合オリゴ糖構造を指す。当該構造は、例えば、「糖生物学の要点」（Essentials of Glycobiology ）Varki et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1999)に記載されており、そしてまた標準糖生物学命名法の概要を提供している。当該糖型はＧ２、Ｇ１、Ｇ０、Ｇ−１、及びＧ−２（例えば、国際公開第９９／２２７６４号を参照）を含むがこれらに限定されない。
「糖鎖付加パターン」は、タンパク質（例えば、糖型）、並びに１つ又は複数の糖型がタンパク質のペプチド骨格、より具体的には免疫グロブリンタンパク質に共有結合する１つ又は複数の部位に共有結合する、糖質単位のパターンと定義される。
異なる細胞系により又はトランスジェニック動物に発現する抗体は、相互に比較して異なる糖型及び／又は糖鎖付加パターンを有するものと考えられる。しかしながら、本明細書で提供される核酸分子によってコード化され、又は本明細書で提供されるアミノ酸配列を含むすべての抗体は、当該抗体の糖鎖付加に関係なく本開示の一部である。
本明細書で使用される用語「対象」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれをも含む。用語「非ヒト動物」はすべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生動物、爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物を含む。
本明細書で使用される「処置する」とは、疾患の症状（即ち、腫瘍増殖及び／又は転移、又は免疫細胞の数及び／又は活性によって媒介される他の影響など）が患者により経験される頻度を低減させることを意味する。この用語には、症状、合併症、又は疾患の生化学的指標の発生を抑制又は遅延させるための本開示の化合物又は薬剤の投与、そして症状を軽減する、又は疾患、病態、又は障害の更なる進展を停止若しくは抑制することが含まれる。処置は、予防的（疾患の発症を防止又は遅延させること、又はその臨床症状又は不顕性症状の発症を防止すること）又は疾患発症後の症状の治療的抑制又は軽減であってもよい。
本開示の種々の態様は、以下の小項目において更に詳細に記載されている。
抗α５β１抗体
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特徴又は特性によって特徴付けられる。例えば、抗体はヒトα５β１に特異的に結合する。好ましくは、本開示の抗体は、例えば、１×１０-7Ｍ以下のＫDを有する高親和性でα５β１に特異的に結合する。
好ましくは、抗体は、５×１０-8Ｍ以下、２×１０-8Ｍ以下、５×１０-9Ｍ以下、又は４×１０-9Ｍ以下、３×１０-9Ｍ以下、又は２.７×１０-9Ｍ以下のＫDを有するヒトα５β１に結合する。α５β１に対する抗体の結合能を評価する分析法は当技術分野において公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、ＲＩＡ、及びフローサイトメトリー解析が含まれる。好適な分析法は、実施例に詳細に記載されている。抗体の結合動力学（例えば、結合親和性）も、Biacore 解析によるなど当技術分野で公知の分析によって評価することができる。
本開示の抗α５β１抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することもできる。当該機能性は、例えば、抗体のＡＤＣＣ活性レベルを更に増強することができるＦｃドメインに対する突然変異体を含み、特異的サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３）の使用によって達成することができる。当該変異及びＡＤＣＣを測定する方法は、実施例に更に記載されている。
モノクローナル抗体２２Ｂ５
本開示の１つの例示的な抗体は、実施例１及び２に記載のヒトモノクローナル抗体２２Ｂ５である。２２Ｂ５のＶHアミノ酸配列は図１Ｂに示され、配列番号7に記載されている。２２Ｂ５のＶLアミノ酸配列は図１Ｄに示され、配列番号８に記載されている。図１Ｂ及び図２に示されるように、２２Ｂ５の重鎖可変領域はヒト生殖細胞系遺伝子配列に戻る２つの突然変異を含む。即ち、２２Ｂ５は、アミノ酸残基番号３０（Ｉ３０Ｓ）でイソロイシンからセリンまでの１つの突然変異及びアミノ酸残基番号３３（Ｎ３３Ｓ）でアスパラギンからセリンまでの１つの突然変異を含む。本明細書で使用される用語「２２Ｂ５」は、該Ｉ３０Ｓ及びＮ３３Ｓ重鎖可変領域生殖細胞系突然変異が作製される抗体を指す。
２２Ｂ５はα５β１に結合できることから、ＶH及びＶL配列は、本開示の更なる抗α５β１結合分子を作製するために他の抗α５β１抗体と「混合及び対応」することができる。当該「混合又は対応」抗体のα５β１結合は、上記及び実施例（例えば、ＥＬＩＳＡ)に記載の結合分析を用いて試験することができる。１つの例では、ＶH及びＶL鎖が混合又は対応される場合、特定のＶH／ＶL対合からのＶH配列は、構造的に類似のＶH配列で置換される。同様に、別の例では、特定のＶH／ＶL対合からのＶL配列は、構造的に類似のＶL配列で置換される。
別に態様では、本開示は、２２Ｂ５の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体を提供する。２２Ｂ５のＶHＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号1に示される。２２Ｂ５のＶHＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２に示される。２２Ｂ５のＶHＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３に示される。２２Ｂ５のＶLＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４に示される。２２Ｂ５のＶLＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５に示される。２２Ｂ５のＶLＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号６に示される。ＣＤＲ領域は、Kabat システム (Kabat, E. A., et al. (1991) 「免疫関係のタンパク質の配列」（Sequences of Proteins of Immunological Interest), Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）を用いて描出される。
２２Ｂ５はα５β１に結合し、そして抗原結合特異性は主としてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域によって与えられることから、ＶHＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列、並びにＶLＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、本開示の更なる抗α５β１結合分子を作製するために「混合及び対応」することができる（即ち、異なるα５β１抗体からのＣＤＲは混合及び対応することができるが、各抗体は一般的にＶHＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びにＶLＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有すると考えられる）。当該「混合又は対応」抗体のα５β１結合は、上記及び実施例（例えば、ＥＬＩＳＡ、Biacore解析）に記載の結合分析を用いて試験することができる。１つの例では、ＶHＣＤＲ配列が混合又は対応される場合、特定のＶH配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は、構造的に類似の１つ又は複数のＣＤＲ配列で置換される。同様に、ＶLＣＤＲ配列が混合又は対応される場合、特定のＶL配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は、一般的に構造的に類似の１つ又は複数のＣＤＲ配列で置換される。通常の熟練技術者には当然のことながら、新しいＶH及び／又はＶL配列は、１つ又はそれ以上のＶH及び／又はＶLＣＤＲ領域配列を、本明細書に開示のＣＤＲ配列から構造的に類似の配列で置換することにより作製することができる。
従って、別の態様では、本開示は：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び／又は（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；を含む分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分であって、抗体がα５β１を、好ましくはヒトα５β１を特異的に結合する分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供することである。
モノクローナル抗体２Ｄ２、２４Ｃ７及び１Ｄ９
本開示の別の具体的抗体は、実施例１及び８に記載のヒトモノクローナル抗体２Ｄ２である。２Ｄ２のＶHアミノ酸配列は配列番号３９に示される。２Ｄ２のＶLアミノ酸配列は配列番号４０に示される。
本開示の別の具体的抗体は、実施例１及び８に記載のヒトモノクローナル抗体２４Ｃ７である。２４Ｃ７のＶHアミノ酸配列は配列番号１９に示される。２４Ｃ７のＶLアミノ酸配列は配列番号２０に示される。
本開示の別の具体的抗体は、実施例１及び８に記載のヒトモノクローナル抗体１Ｄ９である。１Ｄ９のＶHアミノ酸配列は配列番号２９に示される。１Ｄ９のＶLアミノ酸配列は配列番号３０に示される。
２Ｄ２、２４Ｃ７及び１Ｄ９はα５β１に結合できることから、これらの抗体のＶH及びＶL配列は、本開示の更なる抗α５β１結合分子を作製するために他の抗α５β１抗体と「混合及び対応」することができる。当該「混合及び対応」抗体のα５β１結合は、上記及び実施例（例えば、ＥＬＩＳＡ）に記載の結合分析を用いて試験することができる。１つの例では、ＶH及びＶL鎖が混合又は対応される場合、特定のＶH／ＶL対合からのＶH配列は、構造的に類似のＶH配列で置換される。同様に、別の例では、特定のＶH／ＶL対合からのＶL配列は、構造的に類似のＶL配列で置換される。
別に態様では、本開示は、２Ｄ２、２４Ｃ７、及び１Ｄ９の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体を提供する。これらＣＤＲの対応するのアミノ酸配列は以下に示される。
Figure 2011526480
ＣＤＲ領域は、Kabat システム (Kabat, E. A., et al. (1991) 「免疫関係のタンパク質の配列」（Sequences of Proteins of Immunological Interest）, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）を用いて描出される。
２Ｄ２、２４Ｃ７及び１Ｄ９はα５β１に結合し、そして抗原結合特異性は、主としてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域によって与えられることから、ＶHＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びにＶLＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、本開示の更なる抗α５β１結合分子を作製するために「混合及び対応」することができる（即ち、異なるα５β１抗体からのＣＤＲは混合及び対応することができるが、各抗体は一般的にＶHＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにＶLＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有する）と考えられる。当該「混合及び対応」抗体のα５β１結合は、上記及び実施例（例えば、ＥＬＩＳＡ、Biacore解析)に記載の結合分析を用いて試験することができる。１つの例では、ＶHＣＤＲ配列が混合及び対応される場合、特定のＶH配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は、構造的に類似の１つ又は複数のＣＤＲ配列で置換される。同様に、ＶLＣＤＲ配列が混合又は対応される場合、特定のＶL配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は、一般的に構造的に類似の１つ又は複数のＣＤＲ配列で置換される。通常の熟練技術者には当然のことながら、新しいＶH及び／又はＶL配列は、１つ又はそれ以上のＶH及び／又はＶLＣＤＲ領域配列を、本明細書に開示のＣＤＲ配列から構造的に類似の配列で置換することにより作製することができる。
従って、別の態様では、本開示は：（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び／又は（ｆ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；を含む分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分であって、抗体がα５β１を、好ましくはヒトα５β１を特異的に結合する、分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。
別の態様では、本開示は：（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び／又は（ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；を含む分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分であって、抗体がα５β１を、好ましくはヒトα５β１を特異的に結合する、分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。
別の態様では、本開示は：（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び／又は（ｆ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；を含む分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分であって、抗体がα５β１を、好ましくはヒトα５β１を特異的に結合する、分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。
特定の態様では、本開示の抗体は、特定の生殖細胞系重鎖免疫グロブリン遺伝子からの重鎖可変領域、及び／又は特定の生殖細胞系軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。
例えば、１つの態様では、本開示は、抗体がα５β１を特異的に結合する、ヒトＶH４〜３９遺伝子の産物又はそれから生じる重鎖可変領域を含む分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。別の態様では、本開示は、抗体がα５β１を特異的に結合する、ヒトＶH３〜３０．３遺伝子の産物又はそれから生じる重鎖可変領域を含む分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。尚別の態様では、本開示は、抗体がα５β１を特異的に結合する、ヒトＶKＬ６遺伝子の産物又はそれから生じる軽鎖可変領域を含む分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。尚別の例示的な態様では、本開示は、分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分であって、抗体が：
（ａ）ヒトＶH４〜３９遺伝子（その遺伝子が配列番号７に記載のアミノ酸配列をコード化する）又はヒトＶH３〜３０．３遺伝子（その遺伝子が配列番号１９、２９、又は３９に記載のアミノ酸配列をコード化する）の産物又はそれから生じる重鎖可変領域を含み；
（ｂ）ヒトＶKＬ６遺伝子（その遺伝子が配列番号８、２０、３０、又は４０に記載のアミノ酸配列をコード化する）の産物又はそれから生じる軽鎖可変領域を含み；そして
（ｃ）α５β１を、好ましくはヒトα５β１を特異的に結合する；
分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。
それぞれＶH４〜３９及びＶKＬ６のＶH及びＶLを有する抗体の例は、２２Ｂ５である。それぞれＶH３〜３０．３及びＶKＬ６のＶH及びＶLを有する抗体の例は、２４Ｃ７、２Ｄ２、及び１Ｄ９である。
本明細書で使用されるヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、特定の生殖細胞系配列の「産物」、又はそれ「から生じる」重鎖又は軽鎖を含む。当該系は、関係する抗原を有するヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫処置すること、又は関係する抗原を有するファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の「産物」、又はそれ「から生じる」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較すること、及びヒト抗体の配列に最も近い配列（即ち、最大同一性％）であるヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することによって、それ自体は同定することができる。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の「産物」、又はそれ「から生じる」ヒト抗体は、例えば、天然の体細胞突然変異又は部位特異的突然変異の意図的導入に因り、生殖細胞系配列と比べてアミノ酸差を含んでもよい。しかしながら、選択ヒト抗体は、一般的にヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコード化されるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、そして他の種（例えば、マウス生殖細胞系配列）の生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較した場合、ヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含む。特定の例では、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコード化されるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９５％、又はさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であってよい。特定の例では、ヒト抗体は、生殖細胞系Ｉｇ遺伝子によってコード化されるアミノ酸配列とアミノ酸配列において同一である。一般的に、特定のヒト生殖細胞系配列から生じるヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコード化されるアミノ酸配列とせいぜい１０アミノ酸差を示すと考えられる。特定の例では、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコード化されるアミノ酸配列とせいぜい５、又はせいぜい４、３、２若しくは１アミノ酸差を示すと考えられる。
同種抗体
尚別の態様では、本開示の抗体は、本明細書に記載の例示的抗体のアミノ酸配列と相同の重鎖及び軽鎖可変領域であって、抗体が本開示の抗α５β１抗体の所望の機能特性を保持している重鎖及び軽鎖可変領域を含む。
例えば、本開示は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって：
（ａ）重鎖可変領域が、配列番号７、１９、２９、及び３９から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）軽鎖可変領域が、配列番号８、２０、３０、及び４０から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同のアミノ酸配列を含み；
そして抗体は以下の特性：
（ｉ）抗体は１×１０-7Ｍ以下のＫDを有するヒトα５β１に結合する；
（ｉｉ）抗体は抗体依存性細胞傷害を誘導することができる；
の１つ又はそれ以上を示す、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
種々の例では、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であってよい。
他の例では、ＶH及び／又はＶLアミノ酸配列は、上記の配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同であってよい。上記の配列のＶH及びＶL領域に対して高い（即ち、８０％より大きい）相同を有するＶH及びＶL領域を有する抗体は、配列番号７、１９、２９、３９、８、２０、３０及び／又は４０をコード化する核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的又はＰＣＲ介在突然変異誘発）によって得ることができ、続いて本明細書に記載の機能分析を用いてコード化変化抗体の保持機能（即ち、上記の（ｉ）及び／又は（ｉｉ）に記載の特性）を試験することができる。
本明細書に記載の２アミノ酸配列間の相同性パーセントは、２配列間の同一性パーセントと等価である。２配列間の同一性パーセントは、２配列の最適アラインメントで導入する必要のある、ギャップの数及びギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置数の関数である（即ち、相同性％＝同一位置の＃／位置×１００の総計＃）。２つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの測定は、下記の非限定的な実施例に記載されるように、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２.０）に組み込まれている、E.Meyers and W. Miller (Compul Appl. Biosci., 4: 1 1-17 (1988))のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み付き残差テーブル、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを用いて決定することができる。加えて、２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラム（http：//www.gcg.comで入手できる）に組み込まれている、Needleman and Wunsch (J. MoI. Biol. 48:444-453 (1970))アルゴリズムを使用して、Blossum６２マトリックスか又はＰＡＭ２５０マトリックス、及び１６、１４、１２、１０、８又は４のギャップ重み及び１、２、３、４、５又は６の長さ重みを用いて決定することができる。
加えて又は代わりに、本開示のタンパク質配列は、更に公開データベースの検索を行なうために、例えば、関連配列を特定するための「クエリー配列」として使用可能である。当該検索は、Altschul, et al. (1990) J. MoI. Biol. 215:403-10のＸＢＬＡＳＴプログラム(バージョン２.０)を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本開示の抗体分子に相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて実施することができる。比較目的としてギャップドアラインメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴを、Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のように利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。 http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
保存修飾を有する抗体
特定の例では、本開示の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域であって、１つ又はそれ以上のこれらのＣＤＲ配列が本明細書に記載の例示的抗体（例えば、２２Ｂ５、１Ｄ９、２４Ｃ７及び２Ｄ２）、又はその保存修飾に基づく特定アミノ酸配列を含み、そして抗体が本開示の抗α５β１抗体の１つ又はそれ以上の所望の機能特性を保持する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域である。従って、本開示は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分であって：
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号３、１５、２５、及び３５、並びその保存修飾から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｂ）軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号６、１８、２８、及び３８、並びにその保存修飾から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み；そして抗体は１つ又はそれ以上の以下の特性を示し：
（ｉ）抗体が１×１０-7Ｍ以下のＫDを有するヒトα５β１に結合し；
（ｉｉ）抗体が抗体依存性細胞傷害性を誘導することができる、分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。
他の例では、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号２、１４、２４及び３４、並びその保存修飾から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み；そして軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は配列番号５、１７、２７及び３７、並びにその保存修飾から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の例では、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号１、１３、２３及び３３、並びその保存修飾から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み；そして軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は配列番号４、１６、２６及び３６、並びにその保存修飾から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用される用語「保存修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に大きく影響を与えず、又は変化させないアミノ酸修飾を指す。当該保存修飾は、アミノ酸置換、付加及び欠失を含む。修飾は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ介在突然変異誘発などの、当技術分野で公知の標準技術により本開示の抗体へ導入することができる。所定の配列の保存修飾は、その配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるそれらの配列を含むことができる。保存アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるもである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分枝鎖アミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。このように、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、そして改変抗体は、本明細書に記載の機能分析を用いて保持機能（即ち、上記の（ｉ）から（ｉｉ）を通して記載される特性）を試験することができる。別のタイプのアミノ酸修飾は、１つ又は両方の残基を変えることにより潜在的な脱アミド化部位を形成する、アスパラギン−グリシン対を除去することである。別の例では、本開示のα５β１抗体重鎖のＣ末端リジンは切断されており、その結果存在しない。Ｃ末端リジン切断は、予め処理され、又は抗体を発現及び精製するために用いられる条件から生じる可能性がある。種々の例では、α５β１抗体の重鎖及び軽鎖は、場合によりシグナル配列を含む。
本開示の例示的抗α５β１抗体と同じエピトープを結合する抗体
別の態様では、本開示は、本開示のいずれかの例示的α５β１モノクローナル抗体として、ヒトα５β１で同じエピトープに結合する抗体を提供する（即ち、本開示のいずれのモノクローナル抗体ともα５β１に結合するための交差競合する能力を有する抗体）。例えば、交差競合研究での参照抗体は、モノクローナル抗体２２Ｂ５（それぞれ、配列番号７及び８に示されるＶH及びＶL配列を有する）、又はモノクローナル抗体２４Ｃ７（それぞれ、配列番号１９及び２０に示されるＶH及びＶL配列を有する）、又はモノクローナル抗体１Ｄ９（それぞれ、配列番号２９及び３０に示されるＶH及びＶL配列を有する）、又はモノクローナル抗体２Ｄ２（それぞれ、配列番号３９及び４０に示されるＶH及びＶL配列を有する）であってよい。当該交差競合抗体は、標準α５β１結合分析において２２Ｂ５、２４Ｃ７、１Ｄ９、又は２Ｄ２と交差競合するそれらの能力に基づいて特定し得る。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ解析、ＥＬＩＳＡ分析又はフローサイトメトリーは、本開示の例示的抗体との交差競合を証明するのに使用してもよい。試験抗体が、例えば、２２Ｂ５、２４Ｃ７、１Ｄ９又は２Ｄ２のヒトα５β１への結合を阻害する能力は、試験抗体がヒトα５β１へ結合するために２２Ｂ５、２４Ｃ７、１Ｄ９又は２Ｄ２と競合することができ、その結果２２Ｂ５、２４Ｃ７、１Ｄ９又は２Ｄ２と同じヒトα５β１のエピトープと結合することを示す。１つの例では、２２Ｂ５、２４Ｃ７、１Ｄ９又は２Ｄ２２と同じヒトα５β１のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。当該ヒトモノクローナル抗体は、例えば、実施例に記載のように調製及び分離することができる。
改変及び修飾抗体
本開示の抗体又はその抗原結合部分は、修飾抗体を改変するための出発物質として、本明細書に記載の１つ又はそれ以上のＶH及び／又はＶL配列を有する抗体を用いて更に調製することができ、その修飾抗体は出発抗体からその性質を変えている。抗体は、１つ又は両方の可変領域（即ち、ＶH及び／又はＶL）内、例えば、１つ又はそれ以上のＣＤＲ領域内及び／又は１つ又はそれ以上の骨格領域内の１つ又はそれ以上の残基を修飾することにより改変することができる。その上又はあるいは、抗体は、例えば、その抗体の１つ又は複数のエフェクター機能を変えるために、１つ又は複数の定常領域内の残基を修飾することにより改変することができる。
実施し得る１つのタイプの可変領域改変は、ＣＤＲ移植である。抗体は、６種の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置する主としてアミノ酸残基を通して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外の配列よりも個々の抗体間でより多様性である。ＣＤＲ配列は大部分の抗体−抗原相互作用に関与することから、種々の特性を有する異なる抗体の骨格配列へ移植した特異的自然抗体から、ＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的自然抗体の特性を模倣する組み換え抗体を発現することが可能である (例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 312:323-327; Jones, P. el al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 86: 10029-10033；Winterによる 米国特許第５２２５５３９号、及びQueen et al.による 米国特許第５５３０１０１号；米国特許第５５８５０８９号； 米国特許第５６９３７６２号及び米国特許第６１８０３７０号を参照)。
従って、本開示の別の態様は、それぞれ、配列番号１、１３、２３及び３３、配列番号２、１４、２４及び３４、及び配列番号３、１５、２５及び３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、並びにそれぞれ、配列番号４、１６、２６及び３６、配列番号５、１７、２７及び３７、及び配列番号６、１８、２８及び３８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分に関する。このように、当該抗体は、モノクローナル抗体２２Ｂ５、２４Ｃ７、１Ｄ９、及び２Ｄ２のＶH及びＶLＣＤＲ配列を含み、尚これらの抗体からの異なるフレームワーク配列を含んでもよい。
当該フレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベース又は公開参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子に対する生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系データベースに見出すことができる(www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbaseでインターネット上で入手可能)、並びに Kabat, E. A., el al (1991), 「免疫関係のタンパク質の配列」（Sequences of Proteins of Immunological Interest）, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992), J. Mol. Biol. 227:776-798; 及びCox, J. P. L et al. (1994), Eur. J. Immunol. 24:827-836；その各内容は参照することにより本明細書に明確に組み込まれている）。別の例として、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子に対する生殖細胞系ＤＮＡ配列は、Genbankデータベースに見出すことができる。例えば、ＨＣｏ７ＨｕＭＡｂマウスに見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、添付Genbank受入番号：１−６９（ＮＧＪ）０１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７及びＢＣ０７０３３３）、３−３３（ＮＧ＿００１０１０９及びＮＴ＿０２４６３７）及び３−７（ＮＧ＿００１０１０９及びＮＴ＿０２４６３７）で利用可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ＨｕＭＡｂマウスに見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、添付Genbank受入番号：１−６９（ＮＧ ００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７及びＢＣ０７０３３３）、５−５１（ＮＧＪＸＨ０１０９及びＮＴＪ）２４６３７）、４−３４（ＮＧＪ）０１０１０９及びＮＴ＿０２４６３７）、３−３０．３（Ｘ９２２８３）、及び３−２３ （ＡＪ４０６６７８）で利用可能である。
本開示の抗体に使用するためのフレームワーク配列は、本開示の選択抗体によって使用されるフレームワーク配列に構造的に類似の、例えば、本開示の例示的モノクローナル抗体によって使用されるＶH４〜３９及び／又はＶH３〜３０．３及び／又はＶKＬ６フレームワーク配列に類似のものであるが、これらに限定されない。例えば、ＶHＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列、並びにＶLＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が生じる生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子に見出されるのと同一の配列を有するフレームワーク領域へ移植することができ、又はＣＤＲ配列は生殖細胞系配列と比べて１つ又はそれ以上の突然変異を含むフレームワーク領域へ移植することができる。例えば、特定の例では、抗体の抗原結合能を維持又は強化するために、フレームワーク領域内の残基を突然変異することは有益であることが見出されている (例えば、Queen et alによる米国特許第５５３０１０１号；第５５８５０８９；第５６９３７６２及び第６１８０３７０号を参照)。
別のタイプの可変領域修飾は、ＶH及び／又はＶLＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を突然変異させて、それにより関係する抗体の１つ又はそれ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善することである。部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ介在突然変異誘発は、１つ又は複数の突然変異を導入するために実施することができ、そして抗体結合、又は関係する他の機能特性に対する作用は、本明細書に記載されそして実施例に与えられるインビトロ及びインビボ分析で評価することができる。一般的には、保存修飾（上記に示す）が導入される。突然変異はアミノ酸置換、付加又は欠失であってよい。更に、ＣＤＲ領域内のせいぜい１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの残基が変化するだけである。
従って、別の実施態様では、本開示は、（ａ）配列番号１、１３、２３及び３３から成る群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号１、１３、２３又は３３と比べて１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶHＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号２、１４、２４及び３４から成る群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号２、１４、２４又は３４と比べて１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶHＣＤＲ２領域；（ｃ）配列番号３、１５、２５及び３５から成る群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号３、１５、２５又は３５と比べて１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶHＣＤＲ３領域；（ｄ）配列番号４、１６、２６及び３６から成る群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号４、１６、２６又は３６と比べて１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶLＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号５、１７、２７及び３７から成る群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号５、１７、２７又は３７と比べて１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶLＣＤＲ２領域；（ｆ）配列番号６、１８、２８及び３８から成る群から選択されるアミノ酸配列、並びに配列番号６、１８、２８又は３８と比べて１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含むＶLＣＤＲ３領域：を含む重鎖可変領域を含む、分離抗α５β１モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。
本開示の改変抗体は、修飾がＶH及び／又はＶL内のフレームワーク残基に対して、例えば、抗体の特性を改善するためになされるものを含む。一般的に、当該フレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるためになされる。例えば、１つのアプローチは、１つ又はそれ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異させる」ことである。更に具体的には、体細胞突然変異を受けている抗体は、抗体が生じる生殖細胞系配列と異なるフレームワーク残基を含むと考えられる。当該残基は、抗体フレームワーク配列を抗体が生じる生殖細胞系配列と比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系立体配置に復帰させるために、体細胞突然変異は、例えば、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ介在突然変異誘発により、生殖細胞系配列に「復帰突然変異させる」ことができる。
別のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的免疫原性を低減するために、フレームワーク領域内、又は１つ又はそれ以上のＣＤＲ領域内でも、１つ又はそれ以上の残基を突然変異させることを含む。このアプローチは「脱感作」とも呼ばれ、そしてCarr et alによる米国特許出願第２００３０１５３０４３号に更に詳細に記載されている。
フレームワーク又はＣＤＲ領域内で行なわれる修飾に加えて、又はそれとは別に、本開示の抗体は、Ｆｃ領域内の修飾を含み、一般的には血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存性細胞傷害など、抗体の１つ又はそれ以上の機能特性を変えるために改変してもよい。更に、本開示の抗体は化学的に修飾され（例えば、１つ又はそれ以上の化学的部位が抗体に結合し得る）又はその糖鎖付加を改変し、再び抗体の１つ又はそれ以上の機能特性を変えるために修飾してもよい。各々のこれらの態様は更に下記に詳述される。Ｆｃ領域中の残基の付番はKabatのＥＵインデックスの付番である。
１つの例では、ＣH１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変わるように、例えば、増加又は減少するように修飾される。このアプローチは、Bodmer et al.による米国特許第５６７７４２５号に更に記載されている。ＣH１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖の会合を促進させ、又は抗体の安定性を増加若しくは減少させるように変わる。
別の例では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように突然変異される。更に具体的には、１つ又はそれ以上のアミノ酸変異が、抗体が天然のＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合に関連してブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を障害するように、ＦｃヒンジフラグメントのＣH２−ＣH３ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、Ward et al.による米国特許第６１６５７４５号に更に詳細に記載されている。
別の例では、抗体はその生物学的半減期を増加させるために修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、１つ又はそれ以上の以下の突然変異が導入され得る：Ward に対する米国特許第６１６５７４５号 に記載のＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。代わりに、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、Presta et al.により米国特許第５８６９０４６号及び第６１２１０２２号に記載のように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣH２ドメインの２ループから採取されるサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣH１又はＣＬ領域内で変化し得る。
尚他の例では、Ｆｃ領域は、抗体の１つ又は複数のエフェクター機能を変えるために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０及び３２２から選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する親和性を変えているが、親抗体の抗原結合能を保持するように、異なるアミノ酸残基で置換し得る。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体及びＣ１補体成分であってよい。このアプローチは、いずれもWinter el al.により米国特許第５６２４８２１号及び第５６４８２６０号に更に詳細に記載されている。
別の例では、アミノ酸残基３２９、３３１及び３２２から選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸は、抗体がＣ１ｑ結合を変えて、及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を低減又は停止するように、異なるアミノ酸残基で置換し得る。このアプローチは、Idusogie et al.による米国特許第６１９４５５１号に更に詳細に記載されている。
別の実例では、アミノ酸位置２３１及び２３９内の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が改変され、それにより補体を固定する抗体の能力が変えられる。このアプローチは、Bodmer et al.によるＰＣＴ国際公開第９４／２９３５１号に更に詳細に記載されている。
尚別の実例では、Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させ、及び／又は以下の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９において、１つ又はそれ以上のアミノ酸を修飾することによりＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させるように修飾される。このアプローチは、PrestaによるＰＣＴ国際公開第００／４２０７２号に更に詳細に記載されている。更に、ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲｌＩ、ＦｃγＲＩｌＩ及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧｌへの結合部位がマップ化され、そして結合改良変異体が記載されている（Shields, R. L. el al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604を参照)。２５６、２９０、２９８、３３３、３３４及び３３９位置での特異的突然変異は、ＦｃγＲＩＩＩへの結合を改良することが示された。加えて、組み合わせ突然変異体は、ＦｃγＲＩＩＩ結合：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ及びＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａを改良することが示された。例えば、本明細書に記載の２２Ｂ５／ＤＬＥ抗体は、ＩｇＧイソタイプのＩｇＧｌサブクラスをを使用するが、部位特異的変異誘発を通して（野生型ＩｇＧｌサブクラスと比較して）以下の変異：Ｓ２４７Ｄ；Ａ３３８Ｌ；及びＩ３４０Ｅを組み入れている。同様に、下記により詳細に記載されているように、当該Ｓ２４７Ｄ；Ａ３３８Ｌ；及びＩ３４０Ｅは、２４Ｃ７、１Ｄ９及び２Ｄ２モノクローナル抗体へ導入されている。更に実施例に記載されているように、当該突然変異は、Ｆｃγ受容体への抗体の親和性を増加させることができ、その結果そのエフェクター機能を増加させ得る。従って、本開示は、Ｆｃ領域に少なくとも１つの突然変異を含み、そして少なくとも１つの突然変異を含まない別の同一抗体よりも検出可能的に大きいＡＤＣＣ反応を有する抗体を提供する。
更に別の例では、抗体の糖鎖付加は修飾される。例えば、非糖鎖付加抗体を作製することができる（即ち、抗体は糖鎖付加を欠いている）。糖鎖付加は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変えることができる。糖質修飾は、例えば、抗体配列内の１つ又はそれ以上の糖鎖付加部位を変えることにより達成し得る。例えば、１つ又はそれ以上の可変領域フレームワーク糖鎖付加部位の除去をもたらし、それによりその部位の糖鎖付加を排除するように、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を行うことができる。当該非糖鎖付加は、抗原に対する抗体の親和性を増加させると考えられる。当該アプローチは、Co et al.により米国特許第５７１４３５０号及び第６３５０８６１号に更に詳細に記載されている。
加えて又は代わりに、フコシル残基の量を減少させた低フコシル化抗体、又は二等分ＧｌｃＮａｃ構造を増加させた抗体など、糖鎖付加の変化タイプを有する抗体を作製することができる。当該糖鎖付加パターンの変化は、抗体のＡＤＣＣ能を増加させることが示されている。当該糖質修飾は、例えば、糖鎖付加装置が変化した宿主細胞における抗体を発現させることにより達成し得る。糖鎖付加装置が変化した細胞は当技術分野で記載されており、そしてその開示の組み換え抗体を発現させるため、それにより変化した糖鎖付加を有する抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェララーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（α（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠如しているので、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９細胞に発現する抗体は、それの糖質にフコースを欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９ＦＵＴ８-/-細胞系は、２つの置換ベクターを用いてＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子の標的破壊によって作製された（Yamane et al.による米国特許出願第２００４０１１０７０４号及び Yamane et al. and Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22を参照)。別の例として、Hanai et al.による欧州特許第１１７６１９５号は、このような細胞系に発現する抗体が、α１，６結合関連酵素を低減又は除去することにより低フコシル化を顕わすように、フコシルトランスフェラーゼをコード化する機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系を記載している。Hanai et al.は、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加するのに、低酵素活性を有するか又は酵素活性を持たない細胞系、例えば、ラット骨髄腫細胞ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）も記載している。PrestaによるＰＣＴ国際公開第０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）−連結糖質に結合する能力が低下し、またその宿主細胞に発現する抗体の低フコシル化をもたらす、変異体ＣＨＯ細胞、Ｌｅｅ１３細胞について記載している (Shields, R.L. et al (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照)。Umana et al. によるＰＣＴ国際公開第９９／５４３４２号は、改変細胞系に発現する抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性増加をもたらす二等分ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ (例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）)を発現するために改変された細胞系を記載している（Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照)。代わりに、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断してもよい。例えば、フコシダーゼのα−Ｌ−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Tarentino, A. L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23)。
本開示で意図される本明細書における抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるためにペグ化してもよい。抗体をペグ化するために、抗体又はそのフラグメントは、１つ又はそれ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体フラグメントに結合するような条件下に、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応される。一般的には、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を経て実施される。本明細書で使用される用語「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−若しくはアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するのに用いられている、いずれの形態のＰＥＧをも包含することが意図されている。特定の例では、ペグ化される抗体は非糖鎖付加抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当技術分野で公知であり、本開示の抗体に応用できる。例えば、Nishimura el al. による欧州特許第０１５４３１６号及びIshikawa et al.による欧州特許第０４０１３を参照されたい。
抗体改変方法
上記のように、本明細書に開示のＶH及びＶLを有する抗α５β１抗体は、ＶH及び／又はＶL配列、又はそれに結合する１つ又は複数の定常領域を修飾すことにより新しい抗α５β１抗体を作製するために使用することができる。従って、本開示の別の態様では、本開示の抗α５β１抗体、例えば、２２Ｂ５、２４Ｃ７、１Ｄ９又は２Ｄ２の構造的特徴が、ヒトα５β１への結合など本開示の抗体の１つの機能特性を保持する、構造的に関連する抗α５β１抗体を作製するのに使用される。例えば、２２Ｂ５、２４Ｃ７、１Ｄ９若しくは２Ｄ２、又はその突然変異の１つ又はそれ以上のＣＤＲ領域は、上記のように本開示の更なる組み換え的に改変された抗α５β１抗体を作製するために、公知のフレームワーク領域及び／又は他のＣＤＲと組み換え的に結合することができる。他のタイプの修飾は前項に記載された修飾を含む。改変方法のための出発物質は、本明細書に提供される１つ又はそれ以上のＶH及び／又はＶL配列、又はその１つ又はそれ以上のＣＤＲ領域である。改変抗体を作出するために、本明細書に提供される１つ又はそれ以上のＶH及び／又はＶL配列、又はその１つ又はそれ以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製（即ち、タンパク質として発現）する必要はない。むしろ、１つ又は複数の配列に含まれる情報は、１つ又は複数の元の配列から生じる「第二世代」の１つ又は複数の配列を作製するために出発物質として使用してもよく、次いで「第二世代」の１つ又は複数の配列は、タンパク質として調製され発現される。
従って、別の実施態様では、本開示は、（ａ）：（ｉ）配列番号１、１３、２３及び３３から成る群から選択されるＣＤＲ１配列を含む重鎖可変領域抗体配列、配列番号２、１４、２４及び３４から成る群から選択されるＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号３、１５、２５及び３５から成る群から選択されるＣＤＲ３配列；及び／又は（ｉｉ）配列番号４、１６、２６及び３６から成る群から選択されるＣＤＲ１配列を含む軽鎖可変領域抗体配列、配列番号５、１７、２７及び３７から成る群から選択されるＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号６、１８、２８又は３８から成る群から選択されるＣＤＲ３配列を与えること；（ｂ）少なくとも１つの変化抗体配列を作製するために、重鎖可変領域抗体配列及び／又は軽鎖可変領域抗体配列内で少なくとも１つのアミノ酸残基を変えること；そして（ｃ）タンパク質として変化抗体配列を発現させること：を含む抗α５β１抗体を製造する方法を提供する。
標準的な分子生物学技術は、変化抗体配列を製造し発現させるのに使用することができる。
好ましくは、１つ又は複数の変化抗体配列によってコード化される抗体は、本明細書に記載の抗α５β１抗体の１つ、幾つか又はすべての機能特性を保持する抗体であって、その機能特性は、
（ｉ）１×１０-7Ｍ以下のＫDを有するヒトα５β１に結合する；
（ｉｉ）ＡＤＣＣを誘導することができる；
を含むが、これらに限定されない。
変化抗体の機能特性は、実施例に記載の分析法（例えば、フローサイトメトリー、結合分析）など、当技術分野で利用可能な及び／又は本明細書に記載の標準分析法を用いて評価することができる。
本開示の抗体を改変する方法の特定の態様では、突然変異はすべての又は一部の抗α５β１抗体コード配列に従って無作為又は選択的に導入することができ、そして結果として生じる修飾抗α５β１抗体は、本明細書に記載の結合活性及び／又は他の機能特性をスクリーニングすることができる。突然変異法は当技術分野において記載されている。例えば、ShortによるＰＣＴ国際公開第０２／０９２７８０号は、飽和突然変異誘発、合成的ライゲーション会合、又はその組み合わせを用いて抗体突然変異を作製しスクリーニングする方法を記載している。 代わりに、Lazar et al. によるＰＣＴ国際公開第０３／０７４６７９号は、抗体の物理化学的性質を最適化する、コンピュータによるスクリーニング法を用いる方法を記載している。
本開示の抗体をコード化する核酸分子
本開示の別の態様は、本開示の抗体をコード化する核酸分子に関する。核酸は、全細胞に、細胞溶解物中に、又は部分精製若しくは実質的に純粋形態で存在すると考えられる。核酸は、他の細胞成分又は他の不純物、例えば、他の細胞の核酸又はタンパク質から、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド法、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動などを含むいずれかの好適な技術によって精製する場合に、「分離され」又は「実質的に精製される」。 F. Ausubel, et al, ed. (1987)「分子生物学における最新のプロトコール」（Current Protocols in Molecular Biology）, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、そしてイントロン配列を含んでも又は含んでいなくてもよい。一般的に、核酸はｃＤＮＡ分子である。
本開示の核酸は、いずれの好適な分子生物学技術を用いても得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、更に下記のヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ）によって発現する抗体に対して、ハイブリドーマによって作製される抗体の重鎖及び軽鎖をコード化するｃＤＮＡは、ＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー（例えば、ファージディスプレイ法を用いて）から得られる抗体に対して、抗体をコード化する核酸はライブラリーから回収することができる。
本開示の核酸分子は、例えば、２２Ｂ５モノクローナル抗体のＶH及びＶL配列をコード化するものを含む。２２Ｂ５のＶH配列をコード化するＤＮＡ配列は、配列番号１１に示される。２２Ｂ５のＶL配列をコード化するＤＮＡ配列は、配列番号１２に示される。本明細書に開示の他の例示的な核酸分子は、２４Ｃ７、１Ｄ９又は２Ｄ２モノクローナル抗体のＶH及びＶL配列をコード化するものである。２４Ｃ７のＶH配列をコード化するＤＮＡ配列は、配列番号２１に示される。２４Ｃ７のＶL配列をコード化するＤＮＡ配列は、配列番号２２に示される。１Ｄ９のＶH配列をコード化するＤＮＡ配列は、配列番号３１に示される。１Ｄ９のＶL配列をコード化するＤＮＡ配列は、配列番号３２に示される。２Ｄ２のＶH配列をコード化するＤＮＡ配列は、配列番号４１に示される。２Ｄ２のＶL配列をコード化するＤＮＡ配列は、配列番号４２に示される。
ＶH及びＶLセグメントをコード化するＤＮＡフラグメントが得られると、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換させるために、好適な組み換えＤＮＡ技術によって更に操作することができる。これらの操作において、ＶL−又はＶH−コード化ＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域又はフレキシブルリンカーなどの別のタンパク質をコード化する別のＤＮＡフラグメントに操作可能に結合される。この文脈において使用される用語「操作可能に」は、２つのＤＮＡフラグメントによってコード化されるアミノ酸配列が骨格に残っているように、２つのＤＮＡフラグメントが結合していることを意味することが意図されている。
ＶH領域をコード化する分離ＤＮＡは、ＶH−コード化ＤＮＡを重鎖定常領域（ＣH１、ＣH２及びＣH３）にコード化する別のＤＮＡ分子に操作可能に結合することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり（例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) 「免疫関係のタンパク質の配列」（Sequences of Proteins of Immunological Interest）, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照）、そしてこれらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的ＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であってよいが、最も好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。ＩｇＧ１定常領域配列は、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、及びＧｍ（１７）など異なる個体内に生じることが知られている種々の対立遺伝子又はアロタイプのいずれであってもよい。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域において天然アミノ酸置換を呈する。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子に対して、ＶH−コード化ＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコード化する別のＤＮＡ分子に操作可能に結合することができる。
ＶL領域をコード化する分離ＤＮＡは、ＶL−コード化ＤＮＡを軽鎖定常領域、ＣＬにコード化する別のＤＮＡ分子に操作可能に結合することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり（例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) 「免疫関係のタンパク質の配列」（Sequences of Proteins of Immunological Interest）, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照）、そしてこれらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的ＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はκ又はλ定常領域であってよい。
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶL−及びＶH−をコード化するＤＮＡフラグメントは、ＶH及びＶL配列がフレキシブルリンカーによって結合されるＶL及びＶH領域により隣接単一鎖タンパク質として発現し得るように、フレキシブルリンカーをコード化する、例えば、アミノ酸配列（ＧＩｙ4−Ｓｅｒ）3をコード化する別のフラグメントに操作可能に結合される（例えば、Bird et al (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Set USA 85:5879-5883; McCafferty et al, (1990) Nature 348:552-554を参照）。
本開示のモノクローナル抗体の生産
本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、通常のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495の標準体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、種々の技術により生産することができる。モノクローナル抗体を生産する他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性又は発がん性形質転換も用いることができる。
ハイブリドーマを作製する好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの産生は既に完成された手順である。融合に対して免疫化脾細胞分離の免疫処置プロトコール及び技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手順も公知である。
本開示のキメラ又はヒト化抗体は、上記のように調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコード化するＤＮＡは、関係するマウスハイブリドーマから得られ、そして非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように、好適な分子生物学的技術を用いて改変することができる。例えば、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域は当技術分野で公知の方法（例えば、Cabilly et al.による米国特許第４８１６５６７号を参照）を用いてヒト定常領域に結合することができる。ヒト化抗体を作製するために、マウスＣＤＲ領域は当技術分野で公知の方法（例えば、Winterによる米国特許第５２２５５３９号、及びQueen et al.による米国特許第５５３０１０１号；第５５８５０８９号；第５６９３７６２号及び６１８０３７０号を参照）を用いて、ヒトフレームワークに挿入することができる。
幾つかの例では、本開示の抗体はヒトモノクローナル抗体である。α５β１に対する当該ヒトモノクローナル抗体は、マウスよりもむしろヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニック又はトランス染色体マウスを用いて生成することができる。これらのトランスジェニック又はトランス染色体マウスは、本明細書でそれぞれHuMAbマウス(登録商標)及びKM マウス(登録商標)と呼ばれるマウスを含み、そして本明細書で「ヒトＩｇマウス」と総称される。
HuMAbマウス（登録商標） (MedarexR, Inc.)は、内因性のμ及びκ鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異（例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859を参照）と合わせて、非配列ヒト重鎖（μ及びγ）及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコード化する、ヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む。従って、マウスはマウスＩｇＭ又はκの発現低下を示し、免疫処置に応じて、導入したヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子はクラススイッチング及び体細胞突然変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生成する（Lonberg, N, et al. (1994), 上記; Lonberg, N. (1994) 「実験薬理学便覧」（Handbook of Experimental Pharmacology）113：49-101に概説 ; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. JJ: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546）。HuMAbマウス(登録商標)の調製と使用、及び当該マウスによって行なわれるゲノム修飾については、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:1 17-123; Chen, J. et al (1993) EMBO J '. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al (1994) International Immunology 6: 579-591; 及び Fishwild, D. el al. (1996) Nature Biotechnology U: 845-851に更に記載されている。更に、すべてLonberg and Kayによる米国特許第５５４５８０６号； 第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５７８９６５０号；第５８７７３９７号；第５６６１０１６号；第５８１４３１８号；第５８７４２９９号；及び第５７７０４２９号；Surani et alによる米国特許第５５４５８０７号; すべてLonberg and KayによるＰＣＴ国際公開第９２／０３９１８号、国際公開第９３／１２２２７号、国際公開第９４／２５５８５号、国際公開第９７／１３８５２号、国際公開第９８／２４８８４号及び国際公開第９９／４５９６２号; 及びKorman et al.によるＰＣＴ国際公開第０１／１４４２４号を参照されたい。
別の例では、本開示のヒト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖トランス染色体を保有するマウスなどの、導入遺伝子及びトランス染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを用いて産生させることができる。本明細書において「KM マウス(登録商標)」と呼ばれるマウスは、Ishida et al.によるＰＣＴ国際公開第０２／４３４７８号に詳細に記載されている。
なお更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物系は当技術分野で入手可能であり、そして本開示の抗α５β１抗体を産生するために使用することができる。例えば、ゼノマウス（Abgenix, Inc.）と呼ばれる代替のトランスジェニック系が使用可能であり；当該マウスは、例えば、Kucherlapati et al.による米国特許第５９３９５９８号；第６０７５１８１号；第６１１４５９８号；第６１５０５８４号及び第６１６２９６３号に記載されている。
その上、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランス染色体動物系は当技術分野で入手可能であり、そして本開示の抗α５β１抗体を産生するために使用することができる。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖トランス染色体及びヒト軽鎖トランス染色体の両方を保有するマウスが使用可能であり；当該マウスは、Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. ScL USA 97:722-727に記載されている。更に、ヒト重鎖及び軽鎖トランス染色体を保有するウシは当技術分野において記載されており（Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894）、そして本開示の抗α５β１抗体を産生するために使用することができる。
本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためにファージディスプレイ法を用いても調製することができる。ヒト抗体を分離するための当該ファージディスプレイ法は当技術分野で確立されている。例えば：Ladner et alによる米国特許第５２２３４０９号；第５４０３４８４号；及び第５５７１６９８号; Dower et alによる米国特許第５４２７９０８及び第５５８０７１７号; McCafferty el alによる米国特許第５９６９１０８号及び第６１７２１９７号;及びGriffiths et alによる米国特許第５８８５７９３号 第６５２１４０４号；第６５４４７３１号；第６５５５３１３号；第６５８２９１５号及び６５９３０８１号を参照されたい。
本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫細胞が、ヒト抗体応答が免疫処置時に起きるように再構成されているＳＣＩＤマウスを用いても調製することができる。当該マウスは、例えば、Wilson et alによる米国特許第５４７６９９６号及び第５６９８７６７号に記載されている。
ヒトＩｇマウスの免疫処置
ヒトＩｇマウスを本開示のヒト抗体を産生させるのに使用する場合、当該マウスは、Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; 及びＰＣＴ国際公開第９８／２４８８４号及び国際公開第０１／１４４２４号によって記載されているように、α５β１抗原及び／又は組み換えα５β１、又はα５β１融合タンパク質の精製又は濃縮製剤によって免疫処置することができる。好ましくは、マウスは、第１注入時に６〜１６週齢であってよい。例えば、α５β１抗原の精製又は組み換え製剤（５〜５０μｇ）を腹腔投与でヒトＩｇマウスを感作するのに使用することができる。その上、関連タンパク質、例えば、α５及び／又はβ１のポリペプチドフラグメントをマウスに感作するのに使用してもよい。例えば、ポリペプチドフラグメントはそれらの免疫原性を増強する担体分子に結合してもよい。当該担体分子は当技術分野において周知であり、そしてとりわけ鍵穴吸着ヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、チログロブリン、ジフテリア毒素、及び破傷風トキソイドが含まれる。
α５β１に対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成する詳細な手順は、下記の実施例１に記載されている。種々の抗原での累積経験は、完全フロインドアジュバントで抗原により腹腔内（ＩＰ）初回免疫処置し、続いて不完全フロインドアジュバントで抗原により隔週ＩＰ免疫処置（総計６回まで）した場合、トランスジェニックマウスが反応することを示している。しかしながら、フロインド以外のアジュバントも有効であることが認められている。加えて、アジュバント不存在下で全細胞は高免疫原性であることが認められている。免疫反応は、後腹膜出血で得られている血漿試料を用いて、免疫処置プロトコールにわたってモニタリングすることができる。血漿はＥＬＩＳＡ（上記の）によってスクリーニングすることができ、そして十分なタイターの抗α５β１ヒト免疫グロブリンを有するマウスが融合に使用可能である。マウスは、犠牲及び脾臓の除去３日前に静脈内に抗原で追加免疫することができる。各免疫処置に対して２〜３回融合を実施する必要があると予測される。６〜２４匹間のマウスが、各抗原に対して一般的に免疫処置される。通常ＨＣｏ７及びＨＣｏ１２株の両株が使用される。加えて、ＨＣｏ７及びＨＣｏ１２の両導入遺伝子は、２つの異なるヒト重鎖導入遺伝子（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する単一マウスに合わせて育種することができる。代わりに又は加えて、KMマウス（登録商標）株が実施例１に記載のように使用可能である。
ヒトモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの生成
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するために、免疫マウスからの脾臓細胞及び／又はリンパ節細胞を分離し、マウス骨髄腫細胞系などの適切な不死化細胞系に融合することができる。結果として生じるハイブリドーマは、抗原特異的抗体の産生のためにスクリーニングすることができる。例えば、免疫マウスからの脾臓リンパ細胞の単細胞懸濁液は、５０％ＰＥＧにより１／６の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １５８０）に融合することができる。細胞を平底マイクロタイタープレートに、約２×１０5でプレートし、続いて２０％胎仔クローン血清、１８％「６５３」馴化培地、５％のOrigen（ＩＧＥＮ）、４ｍＭＬのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン及びＩＸＨＡＴ（Sigma;ＨＡＴは融合後２４時間添加する）を含む選択培地中で２週インキュベーションした。約２週後、細胞はＨＡＴがＨＴで置換された培地中で培養することができる。個々のウェルでは、次いで、ヒトモノクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。拡大ハイブリドーマ増殖が起こると、培地は通常１０〜１４日後に観察し得る。抗体分泌ハイブリドーマは再プレートし、再びスクリーニングし、そしてヒトＩｇＧに依然陽性ならば、モノクローナル抗体は限界希釈法により少なくとも２回サブクローニングできる。安定なサブクローンは、次いで、インビトロで培養して、特徴付けのために組織培養培地中に少量の抗体を生成し得る。
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択ハイブリドーマはモノクローナル抗体精製用の２リットル回転フラスコで増殖することができる。タンパク質Ａ−セファロース (Pharmacia, Piscataway, N.J.）による親和性クロマトグラフィー前に上清を濾過して濃縮してもよい。溶出ＩｇＧは、精製を確認するためにゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィーでチェックすることができる。緩衝液をＰＢＳに交換して、そして濃縮物は１．４３の減衰係数を用いてＯＤ280によって測定することができる。モノクローナル抗体は等分割して−８０℃に保存することができる。
モノクローナル抗体を生産するトランスフェクトーマの生成
本開示の抗体は、例えば、当技術分野で周知の組み換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを用いて（例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202）、宿主細胞トランスフェクトーマ中で生産することができる。
例えば、抗体又はその抗体フラグメントを発現させるために、部分又は完全軽鎖及び重鎖をコード化するＤＮＡは、標準的分子生物学技術（例えば、関係する抗体を発現するハイブリドーマ又はファージを用いる、ＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング）により得ることができ、そしてＤＮＡは、遺伝子が操作可能に転写及び翻訳制御配列へ操作可能に結合するように、発現ベクターに挿入することができる。これに関連して、用語「操作可能に結合した」は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するそれらの意図した機能に役立つように、抗体遺伝子がベクターに結合することを意味することを意図している。発現ベクター及び発現制御配列は、使用した発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができ、又はより一般的には、両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は好適な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメント及びベクター上の相補性制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）により、発現ベクターに挿入される。本明細書に記載の抗体の軽鎖及び重鎖可変領域は、いずれかの抗体イソタイプ及びサブクラスの完全長抗体遺伝子を作製するために、ＶHセグメントがベクター内の１つ又は複数のＣHセグメントに操作可能に結合され、そしてＶKセグメントがベクター内のＣLセグメントに操作可能に結合されるように、所望のイソタイプ及びサブクラスの重鎖定常及び軽鎖定常領域を前もってコード化する発現ベクターにそれらを挿入することにより使用することができる。加えて又は代わりに、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコード化することができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが骨格内で抗体鎖遺伝子のアミノ末端に結合するように、ベクターへクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であってよい。
抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組み換え発現ベクターは、一般的に宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。用語「調節配列」は、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び発現制御因子（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。当該調節配列は、例えば、Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)）に記載されている。当業者には当然のことながら、調節配列の選択を含む発現ベクターのデザインは、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの因子に依存すると考えられる。哺乳動物の宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマ由来のプロモーター及び／又はエンハンサーなどの哺乳動物細胞における、直接高レベルタンパク質発現に指向するウイルス要素を含む。代わりに、ユビキチンプロモーター又はβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス性調節配列を使用してもよい。尚更に、調節要素は、ＳＶ４０早期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復からの配列を含む、ＳＲプロモーター系などの異なる起源由来の配列から構成されている（Takebe, Y. et al. (1988) MoI. Cell. Biol 8:466-472）。
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組み換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）などの更なる配列及び選択可能なマーカー遺伝子を保有すると考えられる。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、Axel et al.による米国特許第 ４３９９２１６号、第４６３４６６５号及び第５１７９０１７号を参照)。例えば、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上にＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤耐性を賦与する。選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅でｇｈｆｒ−宿主細胞に使用するため）及び新遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。
軽鎖及び重鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコード化する１つ又は複数のベクターは、いずれもの好適な技術により宿主細胞へトランスフェクトされる。様々な形の用語「トランスフェクション」は、原核生物又は真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入によく使われる多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム−リン酸塩沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図している。原核生物か又は真核生物宿主細胞において本開示の抗体を発現することが可能であるが、真核細胞、及び一般的に哺乳動物の宿主細胞における抗体の発現が最も一般的である。
本開示の組み換え抗体を発現する哺乳動物宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) MoI. Biol. 759:601-621）に記載のようにＤＨＦＲ選択可能なマーカーで使用される、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. NatCharacterization of Antibody Binding to Antigenl. Acad. Sa. USA 77:4216-4220に記載のｇｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳｐ２細胞を含む。特に、ＮＳ０骨髄腫又はＣＨＯ細胞との使用では、別の発現系は、国際公開第８７／０４４６２号、国際公開第８９／０１０３６号及び欧州特許３３８８４１号に開示のＧＳ（グルタミンシンターゼ）遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコード化する組み換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞における抗体の発現、及び宿主細胞が増殖する培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間宿主細胞を培養することにより、抗体が生産される。抗体は、いずれかの好適なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収することができる。
抗原への抗体結合のキャラクタリゼーション
本開示の抗体又はその抗原結合部分は、例えば、標準的ＥＬＩＳＡによりα５β１への結合を試験することができる。簡潔には、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中０.２５μｇ／ｍｌで精製α５β１によりコーティングし、次いでＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンでブロックする。抗体の希釈液（例えば、α５β１免疫マウスの血漿の希釈液）を各ウェルに加えて、３７℃で１〜２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いでアルカリ性ホスファターゼに結合した二次試薬（例えば、ヒト抗体に対して、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的ポリクローナル試薬）により、３７℃で１時間インキュベートする。洗浄後、プレートをｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で展開し、４０５〜６５０のＯＤで分析する。好ましくは、最大タイターを呈するマウスが融合に使用し得る。
上記のＥＬＩＳＡ分析は、α５β１免疫原と陽性反応を示すハイブリドーマのスクリーニングに使用することもできる。α５β１に対して高親和力で結合するハイブリドーマは、サブクローニングされ更に特徴付けされる。親細胞の反応性（ＥＬＩＳＡによる）を保持する各ハイブリドーからの１つのクローンが、−１４０℃で保存した５〜１０バイアル細胞バンクを作製し、そして抗体精製のために選択することができる。
抗α５β１抗体を精製するために、選択ハイブリドーマはモノクローナル抗体精製用の２リットル回転フラスコで増殖することができる。タンパク質Ａ−セファロース (Pharmacia, Piscataway, N.J.)による親和性クロマトグラフィー前に、上清を濾過して濃縮することができる。溶出ＩｇＧは、精製を確認するためにゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィーでチェックすることができる。緩衝液をＰＢＳに交換し、そして濃縮物は１．４３の減衰係数を用いてＯＤ280によって測定することができる。モノクローナル抗体は等分割して−８０℃に保存することができる。
更に、抗体により結合したエピトープは、当技術分野で公知の標準法によって特徴付けすることができる。当該方法は、α５及び／又はβ１の一連の重複ペプチドフラグメントを生産し、そして種々のフラグメントへの抗体の結合を評価することを含む。代わりに、突然変異、例えば、各アミノ酸がアラニン残基により置換されるアラニンスキャニング変異誘発がα５及び／又はβ１ペプチドに導入され、そして変異ペプチドへの抗体の結合が野生型タンパク質への抗体の結合と比較され、それにより１つ又は複数の変異が結合に影響する部位を同定することができる。例えば、Cunningham et al, (1989) Science 244: 1081-1085. using commercially available reagents (Pierce, Rockford, IL)を参照されたい。
選択された抗α５β１抗体又はその抗原結合部分が特異エピトープに結合するかどうかを明らかにするために、各抗体は市販の試薬（Pierce, Rockford, IL）を用いてビオチニル化することができる。非標識モノクローナル抗体及びビオチン化抗体を用いた競合研究を、上記のα５β１コーティングＥＬＩＳＡプレートを用いて実施することができる。ビオチン化ｍＡｂ結合は、ストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼプローブを用いて検出することができる。
精製抗体のイソタイプを測定するために、イソタイプＥＬＩＳＡを特定のイソタイプの抗体に特異的な試薬を用いて実施することができる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のイソタイプを測定するために、マイクロタイタープレートのウェルを１μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンにより４℃で一夜コーティングすることができる。１％ＢＳＡでブロック後、プレートは１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体又は精製イソタイプ対照と常温で１〜２時間反応させる。ウェルは、次いで、ヒトＩｇＧ１か又はヒトＩｇＭ特異的アルカリ性ホスファターゼ結合プローブと反応することができる。プレートは上記のように展開し解析される。
抗α５β１ヒトＩｇＧは、更にウェスタンブロット法によりα５β１抗原との反応性を試験することができる。簡潔には、α５β１を調製して、ドデシル硫酸ナトリムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることができる。電気泳動後、分離抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％ウシ胎児血清によってブロックし、そして試験するモノクローナル抗体によりプローブすることができる。ヒトＩｇＧ結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリ性ホスファターゼを用いて検出し、そしてＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.）で展開することができる。
イムノコンジュゲート
別の態様では、本開示は、細胞毒素、薬剤（例えば、免疫抑制薬）又は放射性毒素などの治療部分に結合した抗α５β１抗体、又はその抗原結合部分を特徴付ける。当該コンジュゲートは、本明細書では「イムノコンジュゲート」と呼ばれる。細胞毒素又は細胞毒性薬は、細胞に有害（例えば、殺細胞）であるいずれの薬剤をも含む。実例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びプロマイシン及びそのアナログ又はホモログが挙げられる。治療薬としては、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有糸分裂薬（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も挙げられる。
本開示の抗体又はその抗原結合部位に結合することができる治療用細胞毒素の他の例は、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシン及びオーリスタチン、及びその誘導体を含む。カリケアマイシン抗体コンジュゲートの例は市販されている(Mylotarg（商標）; Wyeth-Ayerst）。
細胞毒素は、種々のリンカー技術を用いて、本開示の抗体又はその抗原結合部分に結合することができる。抗体に細胞毒素を結合させるために使用されているリンカータイプの例は、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド及びペプチド含有リンカーを含むが、それらに限定されない。例えば、リソソームコンパートメント内の低ｐＨによって切断し易い、又はカテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などの主要組織に主として発現するプロテアーゼによって切断し易いリンカーを選択することができる。
細胞毒素のタイプの更なる議論のために、抗体に治療薬を結合するリンカー及び方法については、例えば、Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opm. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, CJ. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264も参照されたい。
本開示の抗体又はその抗原結合部位は、細胞毒性放射性薬品を生成する放射性同位体にも結合することができ、放射性イムノコンジュゲートとも呼ばれる。診断及び治療に使用するために抗体に結合することができる放射性同位体の例は、ヨウ素131、インジウム111、イットリウム90及びルテチウム177を含むが、それらに限定されない。放射性イムノコンジュゲートを製造する方法は、当技術分野で確立されている。放射性イムノコンジュゲートの例は、ZevalinTM (IDEC Pharmaceuticals) 及び BexxarTM (Corixa Pharmaceuticals)を含み市販されており、そして類似の方法が、本開示の抗体を用いて放射性イムノコンジュゲートを製造するために使用可能である。
本開示の抗体コンジュゲートは、所定の生物学的反応を修飾するために使用することができ、薬剤部分は古典的化学療法薬に限定すると解釈されるものではない。例えば、薬剤部分は所望の生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってよい。当該タンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、又はジフテリア毒素などの酵素的活性毒素若しくはその活性フラグメント；腫瘍壊死因子又はインターフェロン−γなどのタンパク質；又は例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）などの生物学的反応修飾物質；又は他の成長因子が含まれる。
当該治療的部分を抗体に結合する技術は公知であり、例えば、Arnon et al, 「がん治療における薬剤の免疫ターゲッティングのためのモノクローナル抗体」“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al, 「ドラッグデリバリーのための抗体」“Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, 「がん治療における細胞毒性薬の抗体キャリア：概説」“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); 「がん治療における放射性標識抗体の治療的使用の解析、結果、及び将来展望」“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 及び Thorpe et al., 「抗体−毒素コンジュゲートの調製及び細胞毒性作用」“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”. Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)を参照されたい。
二重特異性分子
別の態様では、本開示は、本開示の抗α５β１抗体又はそのフラグメントを含む二重特異性分子を特徴付ける。本開示の抗体又はその抗原結合部分は、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、別の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、別の抗体又は受容体のリガンド）に誘導体化又は結合することができる。本開示の抗体は、３つ以上の異なる結合部位及び／又は標的分子に結合する多重特異性分子を生成するために、実際に２つ以上の他の機能性分子に誘導体化又は結合してもよい；当該多重特異性分子は、本明細書で使用される用語「二重特異性分子」によって包含することをも意図している。本開示の二重特異性分子を作製するために、本開示の抗体は、二重特異性分子が生じるように、別の抗体、抗体フラグメント、ペプチド又は結合模倣薬などの、１つ又はそれ以上の他の結合分子に機能的に結合することができる（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合などによって）。
従って、本開示は、α５β１に対する少なくとも１つの第１結合特異性、及び第２標的エピトープに対する第２結合特異性を含む二重特異性分子を含む。本開示の特定の態様では、第２標的エピトープはＦｃ受容体、例えば、ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）又はヒトＦｃγ受容体（ＣＤ８９）である。従って、本開示は、エフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージ又は多形核細胞（ＰＭＮ））を発現するＦｃγＲ又はＦｃγＲの両方に、そしてα５β１を発現する標的細胞に結合することができる二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子はα５β１発現細胞をエフェクター細胞に標的化し、そしてα５β１発現細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出、又はスーパーオキシドアニオンの生成などの、Ｆｃ受容体媒介エフェクター細胞活性を誘発する。
二重特異性分子が多重特異性である本開示の態様では、分子は、抗Ｆｃ結合特異性及び抗α５β１結合特異性に加えて、第３結合特異性を更に含むことができる。１つの例では、第３結合特異性は、抗増大因子（ＥＦ）部分、例えば、細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより標的細胞に対する免疫反応を増加させる分子である。「抗増大因子部分」は、所定の分子、例えば、抗原又は受容体に結合し、それによりＦｃ受容体又は標的細胞抗原に対する結合決定因子の効果の増強をもたらす、抗体、機能的抗体フラグメント又はリガンドであってよい。「抗増大因子部分」は、Ｆｃ受容体又は標的細胞抗原を結合することができる。代わりに、抗増大因子部分は、第１及び第２結合特異性が結合する実体と異なる実体に結合することができる。例えば、抗増大因子部分は、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−Ｉ又は標的細胞に対する免疫反応増強をもたらす他の免疫細胞を経て）を結合することができる。
１つの例では、本開示の二重特異性分子は、結合特異性として少なくとも１つの抗体、又は例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、又は単一鎖Ｆｖを含むその抗体フラグメントを含む。抗体は、軽鎖又は重鎖二量体、又はLadner, el alの米国特許第４９４６７７８号に記載のＦｖ又は単一鎖構築物などの、いずれかのその最小フラグメントであってもよい。
１つの例では、Ｆｃγ受容体に対する結合特異性はモノクローナル抗体によって与えられ、その結合はヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）によってブロックされない。本明細書で使用される用語「ＩｇＧ受容体」は、染色体１に位置する８つのγ鎖遺伝子のいずれかを指す。これらの遺伝子は、３つのＦｃγ受容体クラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）にグループ分けされる、総数で１２の膜貫通又は可溶性受容体イソフォームをコード化する。１つの例では、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。ヒトＦｃγＲＩは、単量体ＩｇＧに対して高親和性（１０8〜１０9Ｍ-1）を示す７２ｋＤａ分子である。
特定の抗Ｆｃγモノクローナル抗体の生産及び特徴付けは、Fanger et al. によりＰＣＴ国際公開第８８／０００５２号及び米国特許第４９５４６１７号に記載されている。これらの抗体は、受容体のＦｃγ結合部位と異なる部位でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩのエピトープに結合し、その結果それらの結合はＩｇＧの生理的レベルによって実質的にブロックされない。本開示において有用な特異的抗ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２及びｍＡｂ１９７である。ｍＡｂ３２を生産するハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＡＴＣＣ受入番号ＨＢ９４６９から入手可能である。他の例では、抗Ｆｃγ受容体抗体はヒト化型のモノクローナル抗体２２（Ｈ２２）である。Ｈ２２抗体の生産及び特徴付けは、Graziano, R.F. et al. (1995; J. Immunol 155 (10): 4996-5002 及びＰＣＴ国際公開第９４／１０３３２号に記載されている。Ｈ２２抗体産生細胞系は、ＨＡ０２２ＣＬ１指定下にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、そして受入番号はＣＲＬ１１１７７である。
尚他の例では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性は、ヒトＩｇＡ受容体、例えば、Ｆｃα受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））に結合する抗体によって与えられ、その結合は、一般的に、ヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）によってブロックされない。用語「ＩｇＡ受容体」は、染色体１９に位置する１つのα遺伝子の遺伝子産物（ＦｃαＲＩ）を含むことを意図する。この遺伝子は、５５〜１１０ｋＤａのいくつかの代わりにスプライスされた膜貫通イソフォームをコード化することが知られている。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸性及び好中性顆粒球に構成的に発現するが、非エフェクター細胞集団には発現しない。ＦｃαＲＩはＩｇＡ１及びＩｇＡ２の両方に対して中間の親和性（〜５×１０7Ｍ-1）を有し、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインに曝露時に増加する(Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440）。ＩｇＡリガンド結合ドメインの外側でＦｃαＲＩを結合する、Ａ３、Ａ５９、Ａ６２及びＡ７７と同定された４つのＦｃαＲＩ特異的モノクローナル抗体は、記載されている（Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148: 1764）。
ＦｃαＲＩ及びＦｃγＲＩは、本開示の二重特異性分子において使用するための例示的トリガー受容体であるが、その理由は、それらが、（１）主として免疫エフェクター細胞、例えば、単球、ＰＭＮ、マクロファージ及び樹状細胞で発現し；（２）高レベル（例えば、５，０００〜１００，０００／細胞）で発現し；（３）サイトカイン活性のメディエータ（例えば、ＡＤＣＣ、食作用）；（４）それらを標的とする自己抗原を含む抗原の抗原提示増強を媒介するためである。
ヒトモノクローナル抗体が選択される一方で、本開示の二重特異性分子に使用することができる他の抗体は、マウス、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体である。
本開示の二重特異性分子は、構成的結合特異性、例えば、いずれかの好適な方法を用いた抗ＦｃＲ及び抗α５β１結合特異性に結合することにより製造することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々に生成され、次いで互いに結合することができる。結合特異性がタンパク質又はペプチドの場合、種々の結合又は架橋剤を共有結合に使用することができる。架橋剤の例としては、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセタート（ＳＡＴＡ）、５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. ScL USA 82:8648を参照）。他の方法としては、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), 及び Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139:2367-2375)に記載のものが含まれる。好適な結合剤には、いずれもPierce Chemical Co. （Rockford, IL）で入手可能なＳＡＴＡ及びスルホ−ＳＭＣＣが含まれる。
結合特異性が抗体の場合、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を経由して結合することができる。１つの例では、ヒンジ領域は結合に先立って１つの残基など奇数のスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
代わりに、両結合特異性は同じベクターにコード化され、そして同じ宿主細胞中に発現し会合することができる。この方法は、特に二重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）2又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質の場合に有用である。本開示の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体及び結合決定因子を含む一本鎖分子、又は２つの結合決定因子を含む一本鎖二重特異性分子であってよい。二重特異性分子は少なくとも２つの一本鎖分子を含んでもよい。二重特異性分子を製造する方法は、例えば、米国特許第５２６０２０３号；米国特許第５４５５０３０号；米国特許第４８８１１７５号；米国特許第５１３２４０５号；米国特許第５０９１５１３号；米国特許第５４７６７８６号；米国特許第５０１３６５３号；米国特許第５２５８４９８号；及び米国特許第５４８２８５８号に記載されている。
それらの特異的標的への二重特異性分子の結合は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、又はウェスタンブロット分析によって確認することができる。これらの各分析は、一般的に格別関心のあるタンパク質−抗体複合体の存在を、関係する複合体に特異的な標識試薬（例えば、抗体）を用いることにより検出することができる。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、抗体−ＦｃＲ複合体を認識し特異的に結合する酵素結合抗体又は抗体フラグメントを用いて検出することができる。代わりに、複合体は、いずれかの種々の他の免疫測定法を用いて検出することができる。例えば、複合体は放射活性物質で標識することができ、そして放射免疫測定（ＲＩＡ）に使用することができる（例えば、Weintraub, B., 「放射免疫測定の原理、放射性リガンドアッセイ法の第７回訓練コース」（Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques）, The Endocrine Society, March, 1986を参照）。放射性同位体は、γカウンター若しくはシンチレーションカウンターの使用、又はオートラジオグラフィーなどの手段で検出することができる。
別の態様では、本開示は、薬学的に許容される担体と合わせて製剤化した、本開示のモノクローナル抗体の１つ又は組み合わせ、又は１つ又は複数のその抗原結合部分を含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。当該組成物は、本開示の（例えば、２つ又はそれ以上の異なる）抗体の１つ又は組み合わせ、又はイムノコンジュゲート若しくは二重特異性分子を含んでもよい。例えば、本開示の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合し、又は相補的活性を有する抗体（又はイムノコンジュゲート若しくは二重特異性分子）の組み合わせを含むことができる。
本開示の医薬組成物は、併用療法で、即ち、他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの他の抗炎症又は免疫抑制薬を組み合わせた、本開示の抗α５β１抗体を含むことができる。併用療法に使用することができる治療薬の例は、本開示の抗体の使用に関して下記の項で非常に詳細に記載されている。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合するいずれか及びすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌及び抗真菌薬、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。一般的に、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入）に好適である。投与経路に応じて、活性化合物、即ち、抗体、その抗原結合部分、イムノコンジュゲート、又は二重特異性分子は、化合物を不活性化する可能性のある酸の作用及び他の自然条件から化合物を保護するために、物質でコーティングしてもよい。
特定の実施態様では、本開示の抗体は中性型（両性イオンの形態を含む）で又は負荷電若しくは正荷電種として存在してもよい。幾つかの例では、抗体は対イオンと錯体形成して薬学的に許容される塩を形成してもよい。このように、本開示の医薬化合物は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される塩を含んでもよい。
「薬学的に許容される塩」は、親化合物（例えば、抗体）の所望の生物活性を保持して、望ましくない毒性作用を賦与しない（例えば、Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19を参照）塩を指す。例えば、用語「薬学的に許容される塩」は、１つ又はそれ以上の抗体、及び対イオンが薬学的に許容される無機及び有機酸並びに塩基から生じる、１つ又はそれ以上の対イオンを含む複合体を含む。
そのような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性の無機酸、並びに脂肪酸のモノ及びジカルボン酸、フェニル置換のアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などの非毒性の有機酸から誘導される塩を含む。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、並びにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性の有機アミンから誘導される塩が挙げられる。
更に、薬学的に許容される無機塩基としては、金属イオンが挙げられる。金属イオンは、適切なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、及びその他の生理学的に許容される金属イオンを含むが、それらに限定されない。無機塩基から誘導される塩としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、モリブデン、バナジウム、マンガン、クロム、セレン、スズ、銅、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ルビジウム、ナトリウム及び亜鉛の通常の原子価における塩が挙げられる。
本開示の抗体の薬学的に許容される酸付加塩は、以下の酸：ギ酸、酢酸、アセトアミド安息香酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、プロピオン酸、安息香酸、カンファー酸、炭酸、シクラミン酸、デヒドロコール酸、マロン酸、エデト酸、エチル硫酸、フェンジゾ酸、メタリン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、タンニン酸、クエン酸、硝酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、葉酸、フマル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リシン、イソクエン酸、トリフルオロ酢酸、パモ酸、プロピオン酸、アントラニル酸、メシル酸、オロチン酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、オレイン酸、ステアリン酸、サリチル酸、アミノサリチル酸、ケイ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボニン酸、スルホン酸、メタンスルホン酸、リン酸、ホスホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、アンモニウム、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、ナフタレンスルホン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、硫酸、硝酸、亜硝酸、硫酸モノメチルエステル、シクロヘキシルアミノスルホン酸、β−ヒドロキシ酪酸、グリシン、グリシルグリシン、グルタミン酸、カコジル酸、ジアミノヘキサン酸、カンファースルホン酸、グルコン酸、チオシアン酸、オキソグルタル酸、ピリドキサール５−リン酸、クロロフェノキシ酢酸、ウンデカン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸、ガラクタル酸及びガラクツロン酸から製造可能であるが、それらに限定されない。
薬学的に許容される有機塩基としては、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジベンジルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、プロカイン、環状アミン、第四級アンモニウムカチオン、アルギニン、ベタイン、カフェイン、クレミゾール、２−エチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタンジアミン、ブチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、エチルグルカミン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イミダゾール、イソプロピルアミン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピリジン、ピリドキシン、ネオジム、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、メチルアミン、タウリン、コール酸塩、６−アミノ−２−メチル−２−ヘプタノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、脂肪族モノ−及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸、ストロンチウム、トリシン、ヒドラジン、フェニルシクロヘキシルアミン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパン、４−モルホリノプロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）・二水和物、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、Ｎ−[トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、及びトロメタモールが挙げられる。
本開示の薬学的組成物は、また、薬学的に許容される抗酸化剤を含んでよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性の抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性の抗酸化剤；（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤が挙げられる。
本開示の薬学的組成物において採用される、好適な水溶性及び非水溶性の担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及び好適なそれらの混合物、オリーブ油などの野菜油及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆用物質を使用することにより、分散剤の場合、要求された粒径を維持することにより、そして界面活性剤を使用することにより、維持することができる。
これらの組成物には、また、保存剤などの助剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含有してもよい。微生物の存在の防止は、上記の殺菌方法及び種々の抗菌性及び抗カビ性剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含むことにより確実にすることができる。また、砂糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることは望ましい。更に、注射用の薬学的形態の長期に亘る吸収は、アルミニウムモノステアラート及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含有させることにより達成される。
薬学的に許容される担体は、殺菌性注射用溶液又は分散剤の即時調整用としての殺菌性水溶液又は分散剤及び殺菌粉末を含む。薬学的活性物質のために、当該媒体及び薬剤を使用することは、当業者に公知である。従来の媒体又は薬剤が活性化合物と相溶性がない場合を除いて、本開示の薬学的組成物におけるそれらの使用が意図される。補助活性化合物も、また、組成物に取り込むことができる。
治療組成物は、一般的に、製造及び貯蔵の条件下に無菌かつ安定にする必要がある。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬剤濃度に好適な他の秩序構造として処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングルコールなど）、及びその好適な混合物を含む溶媒又は分散媒であってよい。適度の流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合には所要粒径の維持により、そして界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、蔗糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は食塩を含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含ませることによりもたらすことができる。
無菌注射剤は、適切な溶媒中に所定量の活性化合物を上に列挙した成分の１つ又は組み合わせを組み入れ、必要に応じて続いて滅菌精密濾過することにより調製することができる。一般的に、分散系は、活性化合物を基本分散媒及び上に挙げた所定の他の成分を含む滅菌賦形剤に組み入れることにより調製することができる。無菌注射剤の製造のための滅菌粉末の場合には、製造方法は、有効成分＋その既滅菌濾過溶液からのいずれかの更なる所望の成分の粉末を得る、真空乾燥及び凍結乾燥を含むが、それに限定されない。
単一剤形を生産するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、処置する対象及び特定の投与方法によって変動してもよい。単一剤形を生産するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、一般的に、治療効果をもたらす組成物のその量であってよい。一般的に、１００％のうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせた有効成分の約０.０１％から約９９％まで、好ましくは約０.１％から約７０％まで、最も好ましくは約１％から約３０％までの範囲で変動してもよい。
投与計画は、最適所望反応（治療反応）を与えるように調整される。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、数分割用量が長期間投与されてもよく、又は用量は治療状況の緊急事態であれば均等に低減又は増加してもよい。投与の簡略化及び投薬量の均一性のために、投薬量単位形態で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書で使用される投薬量単位形態は、治療対象に対する単一投薬量として適する物理的に不連続な単位を指す；各単位は必要な薬剤担体と併せて所望の治療効果をもたらすように計算された活性化合物の所定量を含む。本開示の投薬量単位形態の規格は、（ａ）活性化合物のユニークな特性及び達成すべき特定の治療効果、及び（ｂ）個々人における感受性の処置のために当該活性化合物を調合する当技術分野に固有の制限により決定され、そして直接それに依存する。
抗体の投与では、投薬量は、宿主体重の約０.０００１から１００ｍｇ／ｋｇまで、そしてより通常は約０.０１から５ｍｇ／ｋｇまでの範囲に変動する。例えば、投薬量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重若しくは１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってよい。典型的治療計画は、週１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、月１回、３か月毎に１回又は３から６か月毎に１回の投与を必要とする。本開示の抗α５β１抗体又はその抗原結合部分の投与計画は、例えば、静脈内投与を経由する１ｍｇ／ｋｇ体重又は３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、抗体は以下の服薬スケジュールの１つを用いて与えられる：（ｉ）６投薬量で４週毎に、次いで３か月毎に；（ｉｉ）３週毎に；（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、続いて３週毎に１ｍｇ／ｋｇ体重。
幾つかの方法では、異なる結合特異性を有する２つ又はそれ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、その場合、投与される各抗体の投薬量は指示範囲に入る。抗体は、通常複数回で投与される。単回投薬量間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３か月毎又は毎年であってよい。間隔は、患者の標的抗原に対する抗体の血中濃度を測定することで示されるように不定期であってよい。幾つかの方法では、投薬量は約１〜１，０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調整され、そして幾つかの方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌに調整される。
代わりに、低頻度投与が必要な場合には、徐放性製剤として投与することができる。投薬量及び頻度は患者中の抗体の半減期により変動する。一般的に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、順次ヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体が続く。投薬量及び投与の頻度は、処置が予防的か又は治療的であるかによって変動してもよい。予防的適応では、比較的低い投薬量が長い期間にわたって比較的低い頻度間隔で投与される。特定の患者は、以降の人生にわたってずっと処置を継続する。治療的適応では、疾患の進行が減弱又は終息するまで、そして好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い投薬量が時に必要とされることがある。その後、患者には予防的処方を投与することができる。
本開示の医薬組成物における有効成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性でなく、特定患者に対し所望の治療反応を実現するのに有効な、有効成分量、組成物、及び投与方法を得るために変動してもよい。選択投薬量レベルは、使用される本開示の特定の組成物、又はそのエステル、塩又はアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる特定化合物の排泄速度、処置期間、他の薬剤、使用される特定組成物と組み合わせて使用される化合物及び／又は物質を含む種々の薬物動力学因子、処置する患者の年齢、性別、体重、病態、一般健康及び既往歴などの医術分野で周知の因子に依存するといえる。
本開示の抗α５β１抗体の「治療的有効投薬量」は、好ましくは病徴の重度の低減、無病徴期の頻度及び期間の増加、又は疾患の苦痛に因る機能障害又は身体障害の予防をもたらす。例えば、α５β１陽性腫瘍の処置に対して、「治療的有効投薬量」は、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、尚更に好ましくは少なくとも約６０％、及び更にいっそう好ましくは少なくとも約８０％、未処置対象と比べて細胞増殖又は腫瘍増殖を阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍における効果を予測する動物モデル系で評価することができる。代わりに、組成物のこの特性は、熟練医師に公知の分析により、そのようなインビトロ抑制を阻害する化合物の能力を調べることによって評価することができる。治療化合物の治療的有効量は、腫瘍サイズを減少させるか、さもなければ対象の症状を改善することができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重度、及び特定の組成物又は選択される投与経路などの因子を基準にして、当該量を決定することができると考えられる。
本開示の組成物は、当技術分野で公知の種々の方法の１つ又はそれ以上を用い、１つ又はそれ以上の投与経路を経由して投与することができる。熟練技術者には当然のことながら、投与経路及び／又は方法は所望の結果により変動してもよい。本開示の抗体又はその抗原結合部分の投与経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、又は他の非経口投与経路、例えば、注射又は注入を含む。本明細書で使用される語句「非経口投与」は、腸内投与及び局所投与以外の通常注射による投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入を含むが、これらに限定されない。
代わりに、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、局所、表皮又は粘膜投与経路、例えば、鼻内などの非経口経路を経由して、経口、経膣、経直腸、舌下又は局所で投与することができる。
インプラント、経皮パッチ剤、及びマイクロカプセルデリバリーシステムを含む放出制御製剤など、活性化合物は急速放出から化合物を保護する担体で調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。当該製剤の多くの製造方法は、特許化され又は当技術分野で一般的に公知である。例えば、「持続及び放出制御ドラッグデリバリーシステム」（Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems）, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
治療組成物は、当技術分野で公知の医療器具によって投与することができる。例えば、本開示の治療組成物は、米国特許第５３９９１６３号；第５３８３８５１号；第５３１２３３５号；第５０６４４１３号；第４９４１８８０号；第４７９０８２４号；又は第４５９６５５６号に開示の器具などのニードルレス皮下注射器具によって投与することができる。本開示において有用な周知のインプラント及びモジュールの例としては：制御速度での薬剤調剤のために埋め込み式ミクロ注入ポンプを開示する米国特許第４４８７６０３号；皮膚を通して薬剤を投与する治療器具を開示する米国特許第４４８６１９４号；正確な注入速度で薬剤を送達する薬剤注入ポンプを開示する米国特許第４４４７２３３号；連続的ドラッグデリバリーのための可変流量埋め込み式注入装置を開示する米国特許第４４４７２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧ドラッグデリバリーシステムを開示する米国特許第４４３９１９６号；及び浸透圧ドラッグデリバリーシステムを開示する米国特許第４４７５１９６号が含まれる。多くの他の当該インプラント、デリバリーシステム、及びモジュールは当業者に公知である。
特定の例では、本開示のヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、インビトロでの適切な分布を保証するように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本開示の化合物がＢＢＢ（必要に応じて）を越えることを保証するために、それらは、例えば、リポソームに製剤化することができる。リポソームを製造する方法として、例えば、米国特許第４５２２８１１号；第５３７４５４８号；及び第５３９９３３１号を参照されたい。リポソームは、特異的細胞又は臓器に選択的に輸送され、次いで標的ドラッグデリバリーを強化する１つ又はそれ以上の部分を含んでもよい（例えば、V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照)。典型的な標的部分は葉酸又はビオチン (例えば、Low et alによる米国特許第５４１６０１６号を参照); マンノシド(Umezawa et al, (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); 抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180);「サーファクタントタンパク質Ａ受容体」（surfactant protein A receptor） (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol 1233: 134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090);また K.Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; JJ. Killion; I.J. Fidler (1994);Immunomethods 4:273も参照されたい。
本開示の使用及び方法
本開示の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物及び方法は、α５β１媒介障害の診断及び処置に関わる多数のインビトロ及びインビボでの診断的及び治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、培養細胞に、インビトロ若しくは生体外で、又は被験者に、例えば、インビボで、種々の障害の処置、予防及び診断のために投与することができる。本明細書で使用される用語「対象」は、ヒト及び非ヒト動物を含むことを意図している。非ヒト動物は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生動物、及び爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物を含む。好ましい対象は、α５β１活性により媒介される障害を有するヒト患者を含む。本方法は、異常α５β１発現を伴う障害を有するヒト患者を処置するのに特に好適である。α５β１に対する抗体を別の薬剤と合わせて投与する場合、２つは順々に又は同時に投与することができる。
α５β１に対する本開示の抗体の特異的結合を考慮して、本開示の抗体は細胞表面のα５β１発現を特異的に検出するために使用することができ、その上免疫親和性精製を経てα５β１を精製するために使用することができる。
更に、種々の腫瘍細胞上でのα５β１の発現（例えば、実施例６、７を参照）、及びその血管新生への関与を考慮して、本開示のヒト抗体、抗体組成物及び方法は、例えば、中皮腫、肝胆（肝及び胆管）、原発性又は二次性ＣＮＳ腫瘍、原発性又は二次性脳腫瘍、肺癌（ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣ）、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚又は眼内黒色腫、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、胃腸（胃、結腸直腸、及び十二指腸）、乳がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頚がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、精巣がん、慢性又は急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓又は尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質がん、胆嚢がん、多発性骨髄腫、胆管がん、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、又は上記のがんの１つ又はそれ以上の併発を含む、異常細胞増殖、例えば、α５β１を発現する腫瘍細胞の存在により特徴付けられる、障害を有する対象を処置するのに使用することができる。
１つの例では、本開示の抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性及び二重特異性分子及び組成物）又はその抗原結合部分は、α５β１のレベル、又はそれらの膜表面にα５β１を含む細胞のレベルを検出するのに使用することができ、そのレベルはそれ故特定の疾患症状に関連し得る。代わりに、抗体は、特定の病徴の予防又は改善に順々に関与する可能性がある、α５β１機能を阻害又はブロックするために使用することができ、それによりα５β１は疾患のメディエータに関係があるとみなされる。これは、抗体とα５β１との間で複合体の形成を可能にする条件下に、抗α５β１抗体と試料及び対照試料を接触させることによって達成することができる。抗体とα５β１との間に形成されるいずれの複合体も、試料及び対照中に検出され比較される。
別の例では、本開示の抗体（例えば、ヒト抗体、多重特異性及び二重特異性分子、イムノコンジュゲート及び組成物）又はその抗原結合部分は、最初にインビトロでの治療的又は診断的使用に関連する結合活性を試験することができる。例えば、本開示の組成物は、下記の実施例に記載のフローサイトメトリー分析を用いて試験することができる。
本開示の抗体（例えば、ヒト抗体、多重特異性及び二重特異性分子、イムノコンジュゲート及び組成物）又はその抗原結合部分は、α５β１関連疾患の治療及び診断において更なる有用性を有する。例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性及び二重特異性分子及びイムノコンジュゲートは、１つ又はそれ以上の以下の生物活性：α５β１を発現する細胞の増殖を阻害し及び／又は殺細胞すること；ヒトエフェクター細胞の存在下α５β１を発現する細胞の食作用又はＡＤＣＣを媒介すること、又はα５β１に結合するα５β１リガンドをブロックすることを、インビトロ又はインビボで誘導するために使用することができる。
特定の例では、抗体（例えば、ヒト抗体、多重特異性及び二重特異性分子及び組成物）又はその抗原結合部分は、種々のα５β１関連疾患をインビボで処置、予防又は診断するために使用される。α５β１関連疾患の例としては、特にがんなどの異常細胞増殖が含まれる。１つの実施態様では、異常細胞増殖は、中皮腫、肝胆（肝及び胆管）、原発性又は二次性ＣＮＳ腫瘍、原発性又は二次性脳腫瘍、肺がん（ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣ）、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚又は眼内黒色腫、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、胃腸（胃、結腸直腸、及び十二指腸）、乳がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頚がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、精巣がん、慢性又は急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓又は尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質がん、胆嚢がん、多発性骨髄腫、胆管がん、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、又は上記のがんの１つ又はそれ以上の併発を含むがんであるが、それらに限定されない。
開示の抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性及び二重特異性分子及びイムノコンジュゲート）又はその抗原結合部分をインビボ及びインビトロで投与する好適な経路は、当技術分野で周知であり、通常の熟練者により選択することができる。例えば、抗体組成物は注射（例えば、静脈内又は皮下）によって投与することができる。使用される分子の好適な投薬量は、対象の年齢及び体重、並びに抗体組成物の濃度及び処方に依存すると考えられる。
上記のように、本開示のヒトα５β１抗体又はその抗原結合部分は、１つ又はそれ以上の他の治療薬、例えば、細胞毒性薬、放射性毒性薬又は免疫抑制薬と同時投与することができる。抗体は薬剤（免疫複合体として）に結合することができ、又は薬剤と別々に投与することができる。後者の例（別々投与）では、抗体は薬剤の前後に又はそれと同時に投与することができ、又は他の既知療法、例えば、抗がん療法、例えば、放射線療法と同時投与することができる。当該治療薬は、とりわけ、それ自体で患者に毒性又は亜毒性のレベルでのみ有効な、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、及びヒドロキシウレアなどの抗腫瘍薬を含む。シスプラチンは４週毎に１回、１００ｍｇ／用量で静脈内投与することができ、そしてアドリアマイシンは２１日毎に１回、６０〜７５ｍｇ／ｍｌ用量で静脈内投与される。化学療法薬と本開示のヒト抗α５β１抗体、又はその抗原結合部分の同時投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性作用をもたらす異なるメカニズムを経て作用する２つの抗がん薬を提供する。当該同時投与は、薬剤に対する耐性の発生、又はそれらを抗体に対して非反応性にする可能性のある腫瘍細胞の抗原性の変化に因る問題を解決することができる。
本開示の標的特異性エフェクター細胞、例えば、組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性及び二重特異性分子）に結合したエフェクター細胞も、治療薬として使用することができる。ターゲッティングのためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球又は単球などのヒト白血球であってよい。他の細胞としては、好酸球、ナチュラルキラー細胞及び他のＩｇＧ又はＩｇＡ受容体担持細胞が含まれる。必要に応じて、エフェクター細胞は処置すべき対象から得ることができる。標的特異性エフェクター細胞は生理的に許容される溶液中にて細胞懸濁液として投与することができる。投与される細胞数は１０8〜１０9のオーダーであってよいが、治療目的により変動してもよい。一般的に、その量は標的細胞、例えば、α５β１を発現する腫瘍細胞で局在性を得て、そして、例えば、食作用による殺細胞をもたらすのに十分なものとなる。投与経路も変動してもよい。
標的特異性エフェクター細胞による治療は、標的細胞の他の除去技術と併せて実施することができる。例えば、本開示の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性及び二重特異性分子）を用いる抗腫瘍治療及び／又はこれらの組成物を備えたエフェクター細胞は、化学療法と併せて使用することができる。加えて、併用免疫療法は、２つの直接細胞毒性エフェクター集団を腫瘍細胞拒絶へ向けるのに使用してもよい。例えば、抗Ｆｃ−γＲＩ又は抗ＣＤ３に結合した抗α５β１抗体は、ＩｇＧ又はＩｇＡ受容体特異的結合剤と併せて使用してもよい。
本開示の二重特異性及び多重特異性分子は、細胞表面の受容体のキャッピング又は除去によるなど、エフェクター細胞のＦｃγＲ又はＦｃγＲレベルを調節するために使用することもできる。抗Ｆｃ受容体の混合物も、この目的に使用することができる。
補体を結合するＩｇＧ１、−２若しくは−３又はＩｇＭからの部分などの補体結合部位を有する本開示の組成物（例えば、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体、多重特異性及び二重特異性分子及びイムノコンジュゲート）は、補体の存在下に使用することもできる。１つの例では、本開示の結合剤による標的細胞を含む細胞集団の生体外処置及び適切なエフェクター細胞は、補体又は補体を含む血清の添加により補充することができる。本開示の結合剤でコーティングした標的細胞の食作用は、補体タンパク質の結合により改善することができる。別の例では、本開示の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性及び二重特異性分子）でコーティングした標的細胞は、補体により溶解することもできる。尚別の例では、本開示の組成物は補体を活性化しない。
本開示の組成物（例えば、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体、多重特異性及び二重特異性分子及びイムノコンジュゲート）は、補体と合わせて投与することもできる。従って、ヒト抗体、多重特異性及び二重特異性分子及び血清又は補体を含む組成物は、本開示の範囲内である。これらの組成物は、ヒト抗体、多重特異性及び二重特異性分子に極めて近接して局在しているという点で有利である。代わりに、本開示のヒト抗体、多重特異性及び二重特異性分子及び補体又は血清は、別々に投与することができる。
本開示の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性又は多重特異性分子、又はイムノコンジュゲート）を含むキット及び使用説明書も、本開示の範囲内である。キットは、免疫抑制試薬、細胞毒性薬若しくは放射性毒性薬などの１つ又はそれ以上の追加試薬、又は本開示の更なるヒト抗体若しくはその抗原結合部分（例えば、一次ヒト抗体と異なるα５β１抗原のエピトープに結合する相補的活性を有するヒト抗体）を更に含むことができる。
従って、本開示の抗体組成物で処置した患者は、ヒト抗体の治療効果を強化又は増強させる細胞毒性薬又は放射性毒性薬など別の治療薬を、更に（本開示のヒト抗体の投与に先立って、同時に、又はその後に）投与することができる。
別の例では、対象は、例えば、サイトカインで対象を処置することにより、Ｆｃγ又はＦｃγ受容体の発現又は活性を調節、例えば、強化又は阻害する薬剤で更に処置することができる。多重特異性分子により処置時に投与するサイトカインとしては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。
本開示の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性及び二重特異性分子）は、ＦｃγＲ又はα５β１を発現する細胞を標的化、例えば、当該細胞を標識化するために使用することもできる。当該使用のために、結合剤は検出し得る分子に結合することができる。このように、本開示は、ＦｃγＲ、又はα５β１などのＦｃ受容体を発現する細胞を、生体外又はインビトロで局在化させる方法を提供する。検出可能な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素補助因子であってよい。
特定の例では、本開示は、試料中のα５β１抗原の存在を検出し、又はα５β１抗原の量を測定する方法であって、試料、及び対照試料を、抗体又はその部分及びα５β１間の複合体の形成可能な条件下でα５β１に特異的に結合する、ヒトモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分と接触させることを含む方法を提供する。次いで、複合体形成が検出され、その場合、対照試料と比べて試料間で異なる複合体形成が試料中のα５β１抗原の存在を示す。
他の例では、本開示は、対象におけるα５β１媒介障害、例えば、がんなどの異常細胞増殖を、上記のヒト抗体又はその抗原結合部分を対象に投与することによって処置する方法を提供する。当該抗体及びその誘導体は、特定の障害、例えば、血管新生、増殖、及び分化と関連するα５β１誘導活性を阻害するために使用される。抗体をα５β１と接触させることにより（例えば、対象に抗体を投与することにより）、α５β１が当該活性を誘導する能力が抑制され、その結果、関連傷害が処置される。抗体組成物は、単独で又はα５β１関連疾患を処置又は予防するために、抗体組成物と併せて又は相乗的に作用する細胞毒性薬又は放射性毒性薬などの別の治療薬と共に投与することができる。
尚別の例では、本開示のイムノコンジュゲートは、化合物（例えば、治療薬、標識、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制薬）を、当該化合物を抗体へ結合させることにより、α５β１細胞表面受容体を有する細胞に対して標的とするために使用することができる。このように、本開示は、α５β１を発現する細胞を生体外又はインビトロで局在化させる方法（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素補助因子などの検出可能な標識で）を提供する。代わりに、イムノコンジュゲートは、細胞毒素又は放射性毒素を、当該化合物をα５β１に標的化させることにより、α５β１細胞表面受容体を有する細胞を殺細胞するために使用することができる。
本開示を、以下の実施例により更に詳しく説明するが、これらの実施例は、更に限定するものと解釈すべきではない。本開示を通して引用されるすべての図及びすべての参考文献、特許及び公開特許出願の内容は、それらの全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる。
〔実施例１〕抗α５β１抗体を生産するハイブリドーマの作成
本開示に従う例証的な抗体は、以下のように調製され、選択され、そしてアッセイされた。
免疫処置及びハイブリドーマ作成：
以下の免疫原をハイブリドーマ作成に使用した：精製組み換えヒトインテグリン−α５タンパク質−Ｆｃ；インテグリン−α５−Ｈｉｓ（R&D Systems、特注); ヒトα５を発現させるためにトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞；ヒトインテグリンα５β１を自然発現するJurkat細胞系、Ｕ−９３７細胞系（ＡＴＣＣ Ｃａｔ Ｎｏ ＣＲＬ−１５９３）及びＫ−５６２細胞系（ＡＴＣＣ Ｃａｔ Ｎｏ ＣＣＬ−２４３）。
精製組み換えヒトインテグリン−α５タンパク質−Ｆｃは、ｐＳｅｃＴａｇ２ベクター中にクローニングされ、そして293-FreeStyleシステム（Invitrogen）を用いて発現したラットＦｃドメインに融合した、ヒトインテグリンα５（アミノ酸４２〜９９５）の細胞外ドメインのキメラ構築物である。ヒトα５を発現するようにトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、以下のように生産された。完全長ヒトインテグリンα５ｃＤＮＡ (Invitrogen, カタログ番号ＦＬ１００２、クローンＩＤ：３６２９６４７）を、完全長ヒトインテグリンα５ＭＧＣクローン（Invitrogen）からクローニングし、そしてレトロウイルス発現ベクター（ｐＢａｂｅ）中にサブクローニングした。ウイルス粒子を生成させ、使用してＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１６５８）に感染させた。ピューロマイシンを添加して陽性の安定細胞クローンを選択した。ヒトα５タンパク質発現のウェスタンブロット法及びＦＡＣＳ解析を行ない、高発現安定細胞クローンをピックアップした。
ヒトインテグリンα５β１抗体に対する完全長ヒトモノクローナル抗体を、ヒトＩｇトランスジェニックマウス株Ｈｃｏ７／Ｈｃｏｌ２及びヒトトランス染色体／トランスジェニック株、KM（Medarex, Inc.）を用いて調製した。これらの株は、すべてヒトから分離される抗体と区別できない完全ヒト抗体を発現する。これらのマウス株では、内因性マウスκ軽鎖遺伝子は、Chen et al. (1993) EMBO Jに記載のようにホモ接合的に破壊されており、そして内因性マウス重鎖遺伝子はＰＣＴ国際公開第０１／０９１８７号の実施例１に記載のようにホモ接合的に破壊されている。これらのマウス株の各々は、Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851に記載のように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子ＫＣｏ５を保有している。ＨＣｏ７株は、米国特許第５５４５８０６号、第５６２５８２５号、及び第５５４５８０７号に記載のように、ＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を保有している。ＨＣｏｌ２株は、ＰＣＴ国際公開第０１／０９１８７号の実施例２に記載のように、ＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を保有している。ＨＣｏ７／ＨＣｏｌ２株は、ＨＣｏ７及びＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子の両方を保有している。KM株はIshida et al., (2002),
Cloning and Stem Cells, 4: 91-102に記載のように、ヒトミニ染色体を保有している。
α５β１に対する完全ヒトモノクローナル抗体を作成するために、Ｈｃｏ７／Ｈｃｏｌ２及びKM株のHuMabマウスを、組み換えヒトインテグリン−α５タンパク質−Ｆｃ又はインテグリン−α５−Ｈｉｓ、ヒトα５を発現するようにトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞、及びヒトα５β１を自然発現するJurkat細胞系、Ｕ−９３７細胞系及びＫ−５６２細胞系で免疫した。HuMabマウスについての一般的な免疫処置スキームは、Lonberg, N, et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851及びＰＣＴ国際公開第９８／２４８８４号に記載されている。マウスは、抗原の初回注入時に６〜１６週齡であった。ヒトインテグリン−α５タンパク質−Ｆｃ又はインテグリン−α５−ｈｉｓ抗原の精製組み換え標品（１５〜２０μｇ）、トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞又はJurkat細胞、Ｕ−９３７細胞及びＫ−５６２細胞（１×１０7細胞）の標品を用いて、HuMabマウスを腹腔内（ＩＰ）及び皮下（Ｓｃ）で免疫した。
トランスジェニックマウスを、Ｒｉｂｉアジュバントの抗原により腹腔内及び皮下で１〜４週間隔にて免疫した（総計で最大１６の免疫処置）。免疫応答は後眼窩出血による採血でモニターした。血清はＦＡＣＳ（下記の）によりスクリーニングし、そして十分な力価の抗α５β１ヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合に使用した。マウスは、犠牲にして脾臓及び／又はリンパ節を除去する３及び２日前に、抗原で静脈内投与で追加免疫した。典型的には、各抗原について１０〜２０回の融合を行なった。合計で６０のＨｃｏ７／Ｈｃｏ１２及びKMマウスを免疫した。各抗原について数十のマウスを免疫した。
抗α５β１抗体を生産するHuMabマウスの選択：
α５β１を結合した抗体を生産するＨｕＭａｂマウスを選択するために、完全長ヒトα５β１を発現する細胞系に結合して、そしてα５β１を発現しない対照細胞系に結合しない免疫マウスの血清を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によりスクリーニングした。簡潔に言えば、α５発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞を１：２に希釈した免疫マウスの血清でインキュベートした。細胞を洗浄して、特異的抗体結合をＦｌＴＣ−標識抗ヒトＩｇＧＡｂで検出した。フローサイトメトリー解析をＦＡＣＳフローサイトメトリー装置（Becton Dickinson. San Jose, CA)で行なった。最大の力価の抗α５β１抗体を発現したマウスを融合に使用した。融合は下記のように行ない、そしてハイブリドーマ上清の抗α５β１活性をＦＡＣＳにより試験した。
α５β１に対するヒトモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの作成
HuMabマウスから分離したマウス脾臓細胞及び／又はリンパ節リンパ球を、電気融合（Ｅ−融合、Cyto Pulse1 M technology, Cyto Pulse1 M Sciences, Inc., Glen Burnie. MD）を用いて、マウス骨髄腫細胞系、Ｓｐ２／０（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５８１，Manassas, VA）に製造業者推奨プロトコールを用いて融合した。 簡潔に言えば、免疫マウスからの脾臓及び／又はリンパ節リンパ球の単細胞懸濁液を、Ｅ−融合を用いて同数のＳｐ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞に融合した。細胞を平底マイクロタイタープレートにおいて、約２×１０4脾臓細胞／ウェルでプレートし、そして１０％ウシ胎仔血清、１０％Ｐ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−ＴＩＢ−６３）ならし培地、ＤＭＥＭ (Mediatech, Herndon, VA, Cat.No, CRL 10013）中３〜５％（ＩＧＥＮ）、＋高グルコース、Ｌ−グルタミン及びピルビン酸ナトリウム）、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び１×ＨＡＴ（Sigma, Cat. No. CRL -P- 7185）を含む選択培地中で１０〜１４日間インキュベートした。１〜２週間後、ＨＡＴをＨＴで置換した培地中で細胞を培養した。細胞プレーティング後約１０〜１４日に、個々のウェルからの上清について、それらがヒトγ、κ抗体を含んでいるかどうかを最初にスクリーニングした。ヒトγ、κについてプラスにスコア化された場合、上清は続いてヒト抗α５β１についてＦＡＣＳ（上記の）によってスクリーニングした。
モノクローナルＩｇＧ抗体
ハイブリドーマを分泌する抗体を２４ウェルに移し、再びスクリーニングし、そしてヒト抗α５β１ＩｇＧモノクローナル抗体について陽性が確認された場合、限界希釈法により少なくとも２回サブクローニングした。安定なサブクローンは、次にインビトロで培養して、更なるキャラクタリゼーションのために組織培養液（tissue culture medium）中に少量の抗体を生成させた。上記の手順を用いて、本明細書に記載され「２２Ｂ５」、「２４Ｃ７」、「１Ｄ９」、及び「２Ｄ２」と命名した抗体を含む、幾つかの抗α５β１モノクローナル抗体を生産した。
〔実施例２〕ヒトモノクローナル抗体２２Ｂ５の構造的キャラクタリゼーション
２２Ｂ５のモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコード化するｃＤＮＡ配列は、標準的なＰＣＲ技術を用いて２２Ｂ５ハイブリドーマから得られ、そして標準的なＤＮＡ配列決定法を用いて配列決定した。
２２Ｂ５重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ、図１Ａ及び１Ｂに、そして配列番号１１及び７に示される。２２Ｂ５の軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ、図１Ｃ及び１Ｄに、そして配列番号１２及び８に示される。
元の２２Ｂ５分子のサブクラスはＩｇＧ４である。ＩｇＧサブクラスをＩｇＧ１にスイッチしてＡＤＣＣなどのＦｃγＲ結合及びエフェクター機能を与えた。３つの突然変異を、部位特異的突然変異誘発によってＩｇＧ１定常領域（Ｓ２４７Ｄ、Ａ３３８Ｌ、及びＩ３４０Ｅ）に導入して、ＦｃγＲへの結合及びエフェクター機能活性を更に増加させた。ＩｇＧ１サブクラスを有し、そしてこれらの３つの突然変異を含む２２Ｂ５を、「２２Ｂ５／ＤＬＥ」又は「２２Ｂ５ ＩｇＧ１ ＤＬＥ」という。重鎖可変ドメインの２つの突然変異は、免疫原性を最小化するために生殖細胞系列に戻した（Ｉ３０Ｓ及びＮ３３Ｓ）。軽鎖可変配列には突然変異は認められなかった。２２Ｂ５／ＤＬＥの重鎖は配列番号９として示されているが、一方２２Ｂ５／ＤＬＥの軽鎖は配列番号１０として示されている。
２２Ｂ５重鎖免疫グロブリン配列と既知の生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によって、２２Ｂ５重鎖が、ヒト生殖細胞系ＶH４〜３９からのＶHセグメント、ヒト生殖細胞系３〜１０からのＤセグメント、及びヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂからのＪＨセグメントを利用することが示された。生殖細胞系ＶH４〜３９配列への２２Ｂ５ＶH配列のアラインメントは図２に示される。ＣＤＲ領域決定のKabatシステムを用いる２２Ｂ５ＶH配列の更なる解析は、図１Ｂ、及びそれぞれ配列番号１、２及び３に示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３領域の明確化（delineation of）につながった。
２２Ｂ５軽鎖免疫グロブリン配列と既知生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によって、２２Ｂ５軽鎖が、ヒト生殖細胞系ＶＫＬ６からのＶLセグメント及びヒト生殖細胞系ＪＫ４からのＪＫセグメントを利用することが示された。生殖細胞系ＶＫＬ６配列への２２Ｂ５ＶLのアラインメントは図２に示される。ＣＤＲ領域決定のKabatシステムを用いる２２Ｂ５ＶLの配列の更なる解析は、図１Ｄ、及びそれぞれ配列番号４、５及び６に示される軽鎖ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２及びＣＤ３領域の明確化につながった。
〔実施例３〕ヒトモノクローナル抗体２２Ｂ５の結合特異性及び結合動力学のキャラクタリゼーション
本実施例では、ＩｇＧｌＤＬＥ突然変異（２２Ｂ５／ＤＬＥ）を有する２２Ｂ５ヒト抗α５βｌ抗体の結合特異性及び結合動力学を、Biacore解析によって調べた。また、結合特異性はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって調べた。
結合特異性及び動力学
α５β１の細胞外ドメインに対する２２Ｂ５／ＤＬＥの結合動力学及び名目上のアビディティを、Biacore解析（Biacore AB, Uppsala, Sweden）を用いて測定した。BIAcore動力学解析を行なうために、２２Ｂ５／ＤＬＥをバイオセンサーチップ上に固定化し、そして種々の濃度のヒト組み換えα５β１細胞外ドメインを、その表面を２５℃で流した（図３を参照）。結合データは、ドリフトするベースラインを有する単純１対１結合モデルに全体的にフィットした。２２Ｂ５／ＤＬＥは可逆的にα５β１に結合した。ヒト組み換えα５β１細胞外ドメインに対する会合定数（ＫD）は、２.７〜４.１ｎＭの範囲であった。二価カチオンの不存在下で測定した場合、ＫDはインテグリンのカチオン依存性活性化と一致してより大きかった。動力学的結合パラメータは、オンレートでは３.４×１０-5から４.５×１０-5Ｍ-1ｓ-1、そしてオフレートでは１.２×１０-3から１.４×１０-3ｓ-1の範囲であった（図３及び表１を参照）。
名目上のアビディティ測定を得るために、ヒト組み換えα５β１細胞外ドメインをバイオセンサーチップ上に固定化し、そして種々の濃度の２２Ｂ５／ＤＬＥを、その表面を２５℃で流した。名目上のアビディティ値は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＰ２０＋４．０ｍＭのＭｇＣｌ2で０．０５ｐＭと推定された。
Figure 2011526480
ＦＡＣＳによるα５β１測定のための細胞親和性
２２Ｂ５／ＤＬＥ抗体について、細胞表面インテグリンα５に対するその結合親和性を、内因性ヒトインテグリンα５β１発現細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いるＦＡＣＳアッセイを使用して試験した。簡潔に言えば、細胞はトリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離し、冷ＰＢＳで洗浄した。９６ウェルプレート内に等分割した後、細胞を血清でブロックし、種々の濃度の特異的ｍＡｂと共に４℃にて１時間インキュベートした。続いて、細胞を洗浄し、Ｒ−ＰＥフルオロフォア（fluorophore）と結合した抗ヒトκ二次抗体と共にインキュベートし、そしてFACSCaliburフローサイトメーターを用いて解析した。各サンプルについていずれのゲーティングをも適用することなく１０，０００イベントを集めた。ＫD測定のために、各サンプルのヒストグラムの幾何平均を算出し、ｍＡｂ濃度の関数としてプロットした。２状態平衡モデルにフィッティングした後ＫDを算出した。２２Ｂ５／ＤＬＥは、ＨＵＶＥＣ中２．１５ｎＭ（ｎ＝４）のＫDで内因性のα５β１に結合した（図４を参照）。
〔実施例４〕BiacoreによるＦｃγ受容体の親和性
ＩｇＧ１ＤＬＥ三重突然変異（実施例２で既に論じた）を含む２２Ｂ５／ＤＬＥがＦｃγＲｓへの結合を増強する能力を、Biacore結合実験によって評価した。２２Ｂ５／ＤＬＥのＦｃγＲ結合親和性を、野生型（ｗｔ）ＩｇＧ１の結合親和性と比較した。試験したＦｃγＲの３クラスは：１）高親和性受容体ＦｃγＲＩ；２）低親和性受容体ＦｃγＲＩＩａ／１３１Ｈ及びＦｃγＲＩＩａ／１３１Ｒの２つの多型変異体；及び３）中間親和性受容体、ＦｃγＲＩＩＩａ／１５８Ｆ及びＦｃγＲＩＩＩａ／１５８Ｖの２つの多型変異体であった。結果（図５に示され、そして表２に要約される）は、高親和性受容体ＦｃγＲＩについて約６倍の増加を示した。中間親和性受容体ＦｃγＲＩＩＩ／１５８Ｆ及び１５８Ｖへの結合について、それぞれ１２２倍及び７０倍の増強が認められた。２２Ｂ５／ＤＬＥ及び野生型ＩｇＧｌの結合親和性比較についても、マウスＦｃγ受容体に対して評価した。最大の結合増強は、ｍＦｃγＲＩＶに対してであり、続いてｍＦｃγＲＩ、及びｍＦｃγＲＩＩＩの順であった（図５を参照）．
Figure 2011526480
〔実施例５〕２２Ｂ５／ＤＬＥの細胞機能活性
細胞接着阻止
２２Ｂ５／ＤＬＥがインテグリンα５β１仲介細胞接着を遮断する能力を試験した。細胞接着アッセイは、抗体（２２Ｂ５／ＤＬＥ、２２Ｂ５ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラス変異体、又は陰性対照ｍＡｂ（ＢＨＡ２ＩｇＧ１））と共にＨＵＶＥＣ細胞をプレ・インキュベートすることによって行ない、続いてフィブロネクチン（ＦＮ）又はコラーゲンをコーティングしたプレートで平板培養した。ＨＵＶＥＣ細胞（１５，０００）を接着緩衝液（グルコース及びウシ血清アルブミンを含むＨｅｐｅｓ緩衝化塩溶液）と室温で２０分間混合した。細胞をフィブロネクチン又はコラーゲンでコーティングした９６ウェルプレートに加え、そして３７℃／５％ＣＯ2で１時間プレートに接着させた。非接着細胞は、各ウェルを３回洗浄することにより除去した。各ウェルに残った接着細胞量を測定した。接着細胞は、ＣｙＱＵＡＮＴ ＧＲ色素を含む緩衝剤の添加により溶解させ、そして蛍光をプレートリーダーによりＥｘ／Ｅｍ：４８５／５３５ｎｍで測定した。図６に見られるように、機能遮断インテグリンα５β１ｍＡｂは、フィブロネクチンへのＨＵＶＥＣ接着を選択的に阻害したが、コラーゲン（陰性対照）への接着は阻害しなかった。図６に示されるように、２２Ｂ５／ＤＬＥ及びそのサブクラス変異体（野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ１ＤＬＥ、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４）についてのＩＣ50は、この１時間アッセイにおいて類似していた。これらのデータは、α５及び／又はα５β１と抗体の結合がフィブロネクチンとインテグリンの結合を阻害することを示した。これらのデータは、更にα５β１が細胞の表面に発現する場合に抗体がα５β１と結合することを示した。即ち、抗体によって認識されるエピトープは、α５及びβ１鎖が会合する場合に利用可能であり、そしてエピトープはインテグリンが細胞表面に発現する場合に結合に利用可能である。
〔実施例６〕インビトロＡＤＣＣエフェクター機能
エフェクター機能活性を、標準的な方法を用いて、α５βｌ陽性標的細胞に対してヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下のＡＤＣＣアッセイを通して評価した。さまざまな範囲の細胞系のインテグリンα５発現レベルは、以下のようにウェスタンブロット解析によって測定した。細胞は、プロテアーゼ（Roche）及びホスファターゼ阻害剤 (Calbiochem）を含むＲＩＰＡ溶解緩衝液（Upstate）に溶解した。溶解物(それぞれ、総タンパク質の３μｇ) をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動させ、そして抗インテグリンα５抗体でイムノブロッティングした。免疫反応性バンドを同定し、LI-COR BioscienceのOdyssey赤外線イメージングシステムで解析した。発現範囲の例を図７に示す。
ＡＤＣＣを測定するために、エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的な方法によりSan Diego Blood BankサンプルからFicoll勾配遠心分離を用いて分離した。１０，０００の標的細胞（ＨＵＶＥＣ又は腫瘍株）を増殖培地中抗体と共に室温で２０分間プレインキュベートし、次いで、１，０００，０００のヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝１００：１）を加え、そして混合物を３７℃／５％ＣＯ2で４時間インキュベートした。ＡＤＣＣ仲介細胞溶解は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遊離検出（Roche）又は ToxiLightバイオアッセイキット（Cambrex）を用いて標準的なプロトコールに従って測定した。
２２Ｂ５／ＤＬＥは腫瘍又は内皮発現インテグリンα５β１に結合し、そしてｗｔ２２Ｂ５ＩｇＧ１についての０．２３ｎＭと比べて０．０４ｎＭのＥＣ50でＡＤＣＣ（最大８０％の標的細胞溶解）を促進した。これらのデータは、ＤＬＥ突然変異が野生型ＩｇＧ１と比べて、ＡＤＣＣ活性を増強させることを示した。４時間アッセイでは、２２Ｂ５ＩｇＧ２か又は２２Ｂ５ＩｇＧ４のいずれでもＡＤＣＣは認められなかった。ＫＬＨＩｇＧ１を陰性対照ｍＡｂとして使用した。ＨＵＶＥＣのＡＤＣＣの例及び典型的な腫瘍株（Ｕ８７ＭＧ）を図８（両検出法の典型）に示す。
２２Ｂ５／ＤＬＥ及びｗｔ２２Ｂ５ＩｇＧ１によって誘導される細胞の細胞毒性は、図９において与えられるデータで示されるように、細胞系によるα５β１発現レベルと相関した。α５β１の最大発現レベルを有する細胞（パネルＡ、Ｕ８７ＭＧ）は最大レベルの細胞毒性を示したが、一方で、中間発現を有する細胞系（図９、Ｈｓ５７８Ｔ及び３Ｔ３、ａ５）は中等度の細胞毒性を示した。注目すべきは、２２Ｂ５／ＤＬＥが、低レベルのα５β１を発現したＭ２４ｍｅｔ細胞においてＡＤＣＣ効果を増強したことである（図９の低いパネルにおける例）。これらのデータは、ＡＤＣＣが、細胞により発現されるα５β１と抗体結合によって少なくとも部分的に仲介されることを示した。
〔実施例７〕インビボ抗転移効力
内皮及び腫瘍細胞における増殖促進性、移動促進性及び生存活性促進性に加えて、インテグリンα５β１は、腫瘍細胞の管外遊出及び遠位臓器への移動を促進することによって腫瘍転移にも関与している。以下の検討は前臨床モデルにおける２２Ｂ５／ＤＬＥの抗転移効力を実証することを目指した。
Ａ５４９−Ｌｕｃの実験的肺転移阻害
Ａ５４９−Ｌｕｃは、ルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトした非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞系である。静脈内で移植した場合、それは優先的に肺に局在化し、これは生物発光画像法（ＢＬＩ）によって測定することができる。本研究では、Ａ５４９−Ｌｕｃ細胞（３×１０6／動物）を、その注射の前の２日適切な抗体の前投薬を受けたＳＣＩＤＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈経由で静脈内注射した。移植後、動物に週１回８週まで投薬した。個々の動物の生物発光を週１回２０週まで測定した。
２２Ｂ５／ＤＬＥは、８週（投薬の最終週）で９７％のＴＧＩ（腫瘍増殖阻害）を有する優れた抗腫瘍転移効力を示し、これは対照群に比べて統計的に有意（ｐ＜０．０１）であった。本モデルにおいてＡＤＣＣを仲介することが期待されていない２２Ｂ５ＩｇＧ２の投与も、８週で８９％のＴＧＩを達成した（図１０Ａ）。５、６、７、及び８週での２２Ｂ５／ＤＬＥと２２Ｂ５ＩｇＧ２間で比較のｐ値は、それぞれ０．０７、０．０３、０．０８及び０．１７であった。８週後に全処置を停止し、一方動物のＢＬＩによる有害生理的徴候の毎日のモニタリング及び週１回測定は継続した。
２２Ｂ５／ＤＬＥ処置群の腫瘍は、投薬停止後１３週を通して抑制されたままであったが、２２Ｂ５ＩｇＧ２処置群の腫瘍はその約２週で急速に増殖を開始した（図１０Ｂ）。研究のエンドポイントは、腫瘍ＢＬＩが１×１０8光子／秒に達した場合に達成されたと考えられ、その時点でマウスを犠牲にした。Kaplan-Meierプロット（図１０Ｃ）は、２２Ｂ５／ＤＬＥが、２２Ｂ５ＩｇＧ２処置動物での１４週及び対照群での１０週に比べて、動物の生存期間中央値を２０週まで有意に延長することを示した。
これらのデータは、本モデルにおいて、２２Ｂ５の抗腫瘍効果がＡＤＣＣによって仲介されるとは限らないことを示す。即ち、ヒトＩｇＧ２が細胞毒性を含むエフェクター機能を仲介することは知られていないにもかかわらず、２２Ｂ５−ＩｇＧ２は腫瘍増殖／浸潤を阻害し、そして尚抗体は抗腫瘍効果を仲介した。更に、データは、２２Ｂ５−ＩｇＧ１−ＤＬＥの投与の停止後に、腫瘍増殖は抑制されたままであることを示した。これらのデータは、ＦＮとのα５β１結合の遮断が、ＡＤＣＣ（２２Ｂ５−ＩｇＧ１／ＤＬＥ）によって更に増強される抗腫瘍効果（２２Ｂ５−ＩｇＧ２）を仲介することを示す。
〔実施例８〕ヒトモノクローナル抗体２４Ｃ７、１Ｄ９、及び２Ｄ２の構造キャラクタリゼーション
２４Ｃ７、１Ｄ９及び２Ｄ２モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコード化するｃＤＮＡ配列は、標準的なＰＣＲ法を用いて（それぞれ）２４Ｃ７、１Ｄ９、及び２Ｄ２ハイブリドーマから得られ、そして標準的なＤＮＡ配列決定法を用いて配列決定された。
２４Ｃ７の重鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ図１Ｅ及び１Ｆ、並びに配列番号２１及び１９に示される。２４Ｃ７の軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ図１Ｇ及び１Ｈ、並びに配列番号２２及び２０に示される。
１Ｄ９の重鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ図１Ｉ及び１Ｊ、並びに配列番号３１及び２９に示される。１Ｄ９の軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ図１Ｋ及び１Ｌ、並びに配列番号３２及び３０に示される。
２Ｄ２の重鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ図１Ｍ及び１Ｎ、並びに配列番号４１及び３９に示される。１Ｄ９の軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ図１Ｏ及び１Ｐ、並びに配列番号４２及び４０に示される。
元の２４Ｃ７、１Ｄ９、及び２Ｄ２分子のサブクラスはＩｇＧ１であった。ＩｇＧ１サブクラスについては、部位特定的突然変異誘発によって３つの突然変異をＩｇＧ１定常領域（Ｓ２４７Ｄ、Ａ３３８Ｌ、及びＩ３４０Ｅ）中に導入して、ＦｃγＲへの結合及びエフェクター機能活性を更に増加させた。このように、ＩｇＧ１サブクラスを有し、そして３つの突然変異を含む２４Ｃ７を、「２４Ｃ７／ＤＬＥ」又は「２４Ｃ７ＩｇＧ１ＤＬＥ」という。同様に、これらの３つの突然変異を有する類似の抗体を、本明細書で「１Ｄ９／ＤＬＥ」又は「１Ｄ９ＩｇＧ１ＤＬＥ」、及び「２Ｄ２／ＤＬＥ」又は「２Ｄ２ＩｇＧ１ＤＬＥ」という。同様に、２つの突然変異Ｓ２４７Ｄ及びＩ３４０Ｅを有する抗体を、本明細書で「ＤＥ」突然変異体、例えば、「２４Ｃ７／ＤＥ」、又は「２４Ｃ７ＩｇＧ１ＤＥ」という。本明細書に記載の、そして上記の突然変異のいずれか１つ、２つ、又は３つを有するいずれかの抗体についての類似の名称は、同様にいう。例えば、「１Ｄ９／ＤＥ」は、Ｆｃ領域に以下の変異−Ｓ２４７Ｄ及び１３４０Ｅを有するＩｇＧ１サブクラスである、本明細書に記載の１Ｄ９抗体をいう。同様に、「２Ｄ２／Ｌ」は、ＩｇＧ１イソタイプであり、そしてＡ３３８Ｌ突然変異などを含む明細書に記載の２Ｄ２抗体をいう。
２４Ｃ７重鎖免疫グロブリン配列と既知ヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によって、２４Ｃ７重鎖がヒト生殖細胞系ＶH３〜３０．３からのＶHセグメント、ヒト生殖細胞系７〜２７からのＤセグメント、及びヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂからのＪＨセグメントを利用することが示された。ＣＤＲ領域測定のKabatシステムを用いる２４Ｃ７ＶH配列の解析は、図１Ｆ、及びそれぞれ配列番号１３、１４及び１５に示されるように、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３領域の明確化につながった。
２４Ｃ７軽鎖免疫グロブリン配列と既知生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によって、２４Ｃ７軽鎖がヒト生殖細胞系ＶＫＬ６からのＶLセグメント及びヒト生殖細胞系ＪＫ２からのＪＫセグメントを利用することが示された。ＣＤＲ領域決定のKabatシステムを用いる２４Ｃ７ＶLの配列の解析は、図１Ｈ、及びそれぞれ配列番号１６、１７及び１８に示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３領域の明確化につながった。
１Ｄ９重鎖免疫グロブリン配列と既知ヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によって、１Ｄ９重鎖がヒト生殖細胞系ＶH３〜３０．３からのＶHセグメント、及びヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂからのＪＨセグメントを利用することが示された。Ｄセグメントは、広範囲の突然変異のために生殖細胞系を割り当てることができなかった。ＣＤＲ領域測定のKabatシステムを用いる１Ｄ９ＶH配列の解析は、図１Ｊ、及びそれぞれ配列番号２３、２４及び２５に示されるように重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３領域の明確化につながった。
１Ｄ９軽鎖免疫グロブリン配列と既知生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によって、１Ｄ９軽鎖がヒト生殖細胞系ＶＫＬ６からのＶLセグメント及びヒト生殖細胞系ＪＫ１からのＪＫセグメントを利用することが示された。ＣＤＲ領域決定のKabatシステムを用いる１Ｄ９ＶLの配列の解析は、図１Ｌ、及びそれぞれ配列番号２６、２７及び２８に示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３領域の明確化につながった。
２Ｄ２重鎖免疫グロブリン配列と既知ヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によって、２Ｄ２重鎖がＶH３〜３０．３からのＶHセグメント、ヒト生殖細胞系７〜２７からのＤセグメント、及びヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂからのＪＨセグメントを利用することが示された。ＣＤＲ領域測定のKabatシステムを用いる２Ｄ２ＶH配列の解析は、図１Ｎ、及びそれぞれ配列番号１３、１４及び１５に示されるように重鎖ＣＤＲ３３、ＣＤＲ３４及びＣＤ３５領域の明確化につながった。
２Ｄ２軽鎖免疫グロブリン配列と既知生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によって、２Ｄ２軽鎖がヒト生殖細胞系ＶＫＬ６からのＶLセグメント及びヒト生殖細胞系ＪＫ３からのＪＫセグメントを利用することが示された。ＣＤＲ領域決定のKabatシステムを用いる２Ｄ２ＶLの配列の解析は、図１Ｐ、及びそれぞれ配列番号３６、３７及び３８に示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３領域の明確化につながった。抗体２２Ｂ５、２Ｄ２、２４Ｃ７、及び１Ｄ９モノクローナ抗体についての遺伝子利用を示す表は、表３として以下に示される。
Figure 2011526480
〔実施例９〕ヒトモノクローナ抗体２２Ｂ５、２４Ｃ７、１Ｄ９及び２Ｄ２の結合特異性及び結合動力学のキャラクタリゼーション
本実施例では、ＩｇＧ１ＤＬＥ突然変異（即ち、「２２Ｂ５Ｇ１ＤＬＥ」、「２２Ｂ５Ｇ１」、「１Ｄ９Ｇ１ＤＬＥ」、「１Ｄ９Ｇ１」など）の有り及び無しで−ＩｇＧ１サブクラスの２２Ｂ５、２４Ｃ７、１Ｄ９、及び２Ｄ２ヒト抗α５β１抗体の結合特異性を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いるフローサイトメトリーで調べた。
ＦＡＣＳによるα５β１測定のための細胞親和性
２２Ｂ５／ＤＬＥ、２４Ｃ７／ＤＬＥ、１Ｄ９／ＤＬＥ、及び２Ｄ２／ＤＬＥ抗体について、細胞表面インテグリンα５へのそれらの結合親和性を、内因性インテグリンα５β１発現細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いる、ＦＡＣＳを使用して試験した。簡潔に言えば、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離し、冷ＰＢＳで洗浄した。９６−ウェルプレート内に等分割後、細胞を血清でブロックし、そして種々の濃度の特異的ｍＡｂと共に４０℃で１時間インキュベートした。続いて、細胞を洗浄して、Ｒ−ＰＥフルオロフォアと結合した抗ヒトκ二次抗体とインキュベートし、そしてFACSCaliburサイトメーターを用いて解析した。各サンプルについていずれのゲーティングも適用することなしに、１０，０００イベントを集めた。ＫD測定のために、各サンプルのヒストグラムの幾何平均を算出し、ｍＡｂ濃度の関数としてプロットした。２状態平衡モデルにフィッティング後ＫDを算出した。結果を図１１Ａ及び１１Ｂに示す。
〔実施例１０〕ヒトモノクローナル抗体２２Ｂ５、２４Ｃ７、１Ｄ９、及び２Ｄ２のインビトロＡＤＣＣエフェクター機能
エフェクター機能活性を、実施例６に前述したように、抗体依存性細胞仲介細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを通して評価した。典型的な腫瘍細胞系（Ｕ８７ＭＧ）において、抗体１Ｄ９、１Ｄ９／ＤＬＥ、２Ｄ２／ＤＬＥ、２２Ｂ５／ＤＬＥ及び２４Ｃ７／ＤＬＥについて、ＡＤＣＣ（８０％標的細胞溶解まで）を促進するＥＣ50値を図１２に示す。
〔実施例１１〕転移性黒色腫の同系モデルにおけるインビボＡＤＣＣ依存性抗腫瘍効力
ＡＤＣＣ特異的応答を実証するために、ヒトモノクローナル抗体１Ｄ９／ＤＬＥ （ヒト及びマウスα５β１に結合するがα５β１を機能的に中和しない）を、インタクトな免疫エフェクター細胞を有する同系マウスの腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）モデルで試験した。特に、ＡＤＣＣ−仲介抗腫瘍活性を、マウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０細胞がα５β１を発現した同系マウスモデルで評価した。インテグリンα５発現マウス黒色腫系Ｂ１６Ｆ１０は高転移性で、静脈内１回注射で主として肺にコロニー形成する。腫瘍細胞を免疫コンピテントＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注射した。Ｂ１６Ｆ１０細胞（２×１０5／動物）に、その注射の前１日抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０／群）を前投薬した同系宿主Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、尾静脈経由で注射した。動物に抗体を週１回、全部で３週間皮下投与した。動物を犠牲にしてその肺を２１日目に切除した。
図１３の結果により示されるように、１Ｄ９／ＤＬＥ抗体が顕著なインビボ抗腫瘍効果をもたらしたことから、ＡＤＣＣ応答単独はＴＧＩ生産に十分であることを示した。モデルにおけるＡＤＣＣの特異的影響を描写するために、動物を１Ｄ９ＩｇＧ２（ＡＤＣＣを仲介することが知られていない）及び１Ｄ９ＩｇＧ１ＤＬＥ （ＤＬＥ突然変異によりＦｃ増強したＩｇＧ１イソタイプ）で処置した。より大きい抗腫瘍効力は、１Ｄ９ＩｇＧ２よりも１Ｄ９ＩｇＧ１ＤＬＥで認められた。イソタイプ対は抗原結合ドメインにおいて同一のアミノ酸配列及びインビトロ活性を有することから、データはＤＬＥ突然変異の結果としてのＡＤＣＣの増強が、１Ｄ９ＩｇＧ１ＤＬＥの優れた効力の原因であることを示した。
寄託情報
特許出願人は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）Manassas, VA 201 10-2209 U.S.A. により、本明細書において２２Ｂ５と命名した抗体の重鎖及び軽鎖領域を寄託している。２２Ｂ５ＶH領域は２００８年７月１６日に寄託され、ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．ＰＴＡ−９３７７と割り当てられた。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条約及びそれに基づく規則（ブダペスト条約）の規定に従って行なわれた。これらの寄託は、３０年、又は最新の請求後５年の期間、又は特許の有効期間のいずれか長い期間、ＡＴＣＣ寄託機関において制限なく維持され、そして寄託物がその期間中に生存しなくなった場合には差し替えられることになる。寄託された物質の利用可能性は、特許法に従っていずれの関係官庁の権限の下に付与された権利に違反して、本開示のいずれかの側面を実施するための実施許諾として解釈すべきではない。上記の書面による明細書は、当業者が本開示のすべての側面を実施することを可能にさせるのに十分であると考えられる。本開示は、寄託された実施態様が本開示の特定の側面の単一の例証を目的とするものであるから、寄託された物質によりその範囲が限定されるものではなく、そして機能的に同等のいずれの構築物も本開示の範囲内にある。本開示における物質の寄託は、本開示におけるベストモードを含む書面による説明が、本開示の任意の側面の実施を可能にするのに十分ではないという自白を構成するものではなく、そしてまた特許請求の範囲をそれが表わす格別な例証に限定するものと解釈すべきではない。実際に、本開示に示されそして記載されているものに加えて、本開示の種々の改変は、上記の説明から当業者には明らかとなり、そして添付の特許請求の範囲内に含まれるものである。
Figure 2011526480

Claims (20)

  1. （ａ）１×１０-7Ｍ以下のＫDでヒトインテグリンα５β１に結合し；そして
    （ｂ）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができる；
    分離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分。
  2. サブクラスＩｇＧ１の完全長ヒト抗体である、請求項１に記載の抗体。
  3. 抗体又は抗原結合部分が５×１０-8Ｍ以下のＫDでヒトインテグリンα５β１に結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  4. １×１０-7Ｍ以下のＫDでヒトインテグリンα５β１に結合し、そして配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変領域を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
  5. 配列番号８に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変領域を更に含む、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  6. （ａ）配列番号１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
    （ｂ）配列番号２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
    （ｃ）配列番号３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
    （ｄ）配列番号４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
    （ｅ）配列番号５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び
    （ｆ）配列番号６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
    を含む、分離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
  7. （ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
    （ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
    を含む、請求項６に記載の抗体又は抗原結合部分。
  8. 抗体がヒト完全長ＩｇＧ１抗体であり、そしてここで抗体のＦｃ領域の少なくとも１つのアミノ酸が突然変異し、そして更にここで該抗体は該少なくとも１つの該アミノ酸が突然変異していない同一抗体よりも大きいＡＤＣＣを示す請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
  9. 請求項８に記載の抗体であって、少なくとも１つの突然変異がセリン２４７、アラニン３３８、又はイソロイシン３４０のアミノ酸位置で起こる、上記抗体。
  10. 少なくとも１つの突然変異が、セリン２４７からアスパラギン酸（Ｓ２４７Ｄ）、アラニン３３８からロイシン（Ａ３３８Ｌ）、及びイソロイシン３４０からグルタミン酸（Ｉ３４０Ｅ）から成る群から選択される、請求項９に記載の抗体。
  11. 抗体が突然変異Ｓ２４７Ｄ、Ａ３３８Ｌ、及びＩ３４０Ｅを含む、請求項１０に記載の抗体。
  12. 抗体が配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖アミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体。
  13. 抗体が配列番号１０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体。
  14. 抗体が配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖アミノ酸配列、及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体。
  15. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合部分、及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
  16. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の、任意の抗体の重鎖及び／又は軽鎖、又はその抗原結合部分をコード化する分離された核酸分子。
  17. 請求項１６に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  18. 請求項１７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  19. 請求項１８に記載の宿主細胞において抗体又は抗原結合部分を発現させることを含む、抗α５β１抗体又はその抗原結合部分を調製する方法。
  20. 細胞を、腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量の請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分と接触させることを含む、インテグリンα５β１を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
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