KR20100115360A - 알파 ５-베타 １ 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 높은 친화력으로 인테그린 α5β1에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 본 개시내용의 항체를 코딩하는 핵산 분자, 본 개시내용의 항체의 발현을 위한 발현 벡터, 숙주 세포 및 방법이 또한 제공된다. 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 면역접합체, 이중특이적 분자 및 제약 조성물이 또한 제공된다. 본 개시내용은 본원에 기술된 항-α5β1 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 사용하여 다양한 암을 치료하기 위한 방법을 또한 제공한다.

Description

알파 ５-베타 １ 항체 및 이의 용도{ALPHA 5 - BETA 1 ANTIBODIES AND THEIR USES}
본 출원은 미국 특허 가출원 번호 61/026,027 (2008년 2월 5일 출원), 및 미국 특허 가출원 번호 61/095,429 (2008년 9월 9일 출원)를 우선권으로 청구하고, 이들 양쪽 모두는 거명에 의해 전문이 본원에 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 α5β1에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 부분에 관한 것이다. 또한 본 개시내용은 이같은 항체 및 항원 결합 부분을 코딩하는 핵산 분자, α5β1 항체 및 항원 결합 부분의 제조 방법, 이러한 항체 및 항원 결합 부분을 포함하는 조성물, 및 이러한 항체, 항원 결합 부분 및 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
배경기술
인테그린 α5β1은 피브로넥틴에 결합하는 이종이량체성 세포 표면 단백질이고, 세포 부착 및 혈관형성에서 수반된다. 이러한 이종이량체는 α5 서브유닛 및 β1 서브유닛으로 구성된다. 인테그린 α5β1은 매트릭스 부착, 이동, 증식, 분화 및 생존에서 주요 역할을 하는 "고전적인 피브로넥틴 수용체"로 지칭된다. 여러 인테그린이 피브로넥틴 (FN)에 결합하지만, α5β1은 리간드 인식 및 최적의 상호작용을 위해 FN의 9번째 (PHSRN) 및 10번째 (RGDS) 제III형 반복부 상의 펩티드 서열 양쪽 모두를 필요로 하기 때문에 FN에 대해 선택적이다. ([Danen et al. J. Biol. Chem. 270(37):21612-21618 (1995)]; [Redick et al. J. Cell Biol. 149(2):521-527 (2000)]; [Takagi et al. EMBO J. 22:4607-4615 (2003)]). FN에 대한 인테그린-매개 세포 부착은 칼슘 유동을 유발할 수 있고, 타이로신 및 세린/트레오닌 단백질 카이네이스 및 이노시톨 지질 대사를 활성화시킬 수 있으며, 액틴 세포골격 및 세포 주기 진행을 제어하는 Rho 패밀리의 소형 GTPase의 활성을 조절할 수 있다.
α5β1의 발현이 대부분의 배아 조직에서 관찰되지만, 출생 이후에는 말단 세포 분화와 일관된 방식으로 수준이 감소된다 ([Muschler & Horwitz Development 113(1):327-337 (1991)]). 야생형 성체 마우스에서는, 낮은 수준의 수용체가 광범위하게 분포되지만, 혈관구조 및 결합 조직에서 주로 발현된다. α5β1 및 FN 양쪽 모두의 발현이 인간 종양의 혈관 상에서 및 성장 인자 및 사이토카인으로 자극된 조직 내에서 유의하게 및 대등하게 강화된다. 혈관형성성 사이토카인 예컨대 bFGF, VEGF, IL-8, TGF-베타, 및 TNF-α는 시험관 내에서 및 생체 내에서 내피 세포 상의 α5β1 발현을 상향조절하는 반면, 이러한 분자들은 정상적인 인간 혈관 및 조직 상에서 최소로 발현된다 ([Kim et al. Am. J. Path. 156(4):1345-62 (2000)]; [Enaida et al. Fukushima J. Med. Sci. 44(1):43-52 (1998)]; [Klein et al. Mol. Biol. Cell 4(10):973-982 (1993)]).
높은 수준의 α5β1 발현은 혈관구조에 한정되지 않는데, 많은 유형의 암에서 종양 세포가 α5β1를 발현하는 것으로 또한 빈번하게 관찰되었기 때문이다. 종양 저산소증이 증가된 종양 α5β1 발현과 관련되었다 ([Mousa et al. J. Cell. Biochem. 74:135-143 (1999)]). 인테그린은 종양 확산 및 전이성 질환에 이르는, 새롭게 형성된 모세혈관 내로의 종양 혈관내유입(intravasation) 및 원격 부위로의 혈관외유출(extravasation)에 중요한 것으로 생각된다. 전체적으로, 기질 세포 및 종양 세포 활성 양쪽 모두를 매개함으로써, α5β1의 발현 패턴이 암을 촉진하는 것에서의 다중 역할과 일관된다. 다양한 임상 연구에서, 종양 세포 상에서의 α5β1 상향조절이 인간 흑색종, 구강 편평 세포 암종 및 B-세포 백혈병의 진행과 관련되었다 ([Jin & Varner, Br. J. Cancer 90:561-565 (2004)]; [Danen et al. Histopathology 24(3):249-256 (1994)]; [Shinohara et al., Am. J. Clin. Pathol. 111(1):75-88 (1999)]).
개요
본 개시내용은 인간 인테그린 α5β1에 대한 높은 친화력의 결합을 나타내는 단리된 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체를 제공한다. 본 개시내용에 기술된 항체는 전형적으로 인간 항체이지만, 별법적인 사례에서, 이러한 항체는 뮤린(murine) 항체, 키메라(chimeric) 항체, 또는 인간화 항체일 수 있다.
한 양상에서, 본 개시내용은 (a) 인간 인테그린 α5β1에 1×10-7 M 이하의 KD로 결합하고; (b) 항체 의존적 세포성 세포독성을 유도할 수 있는, 단리된 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 부분에 관한 것이다. 예를 들어, 한 사례에서, 항체는 ADCC를 유도할 수 있는 서브클래스(subclass), 예컨대 IgG1 또는 IgG3에 속한다. 또다른 사례에서, ADCC 활성은 천연 탄수화물 패턴과 비교하여 탄수화물 변형, 예컨대 변경된 글리코실화 패턴을 Fc 영역 내로 도입한 결과이다.
특정 사례에서, 항체는 인간 인테그린 α5β1에 5×10-8 M 이하, 2×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 4×10-9 M 이하, 3×10-9 M 이하, 또는 2.7×10-9 M 이하의 KD로 결합한다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 (a) 인간 인테그린 α5β1에 1×10-7 M 이하의 KD로 결합하고; (b) 필적하는 항체에 비해 강화된 ADCC 활성을 나타내는, 단리된 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 예를 들어, 한 사례에서, ADCC 활성이 강화된 항체는 야생형 Fc 영역과 비교하여 Fc 영역 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 강화된 ADCC 활성은 야생형 Fc 영역을 포함하는 것을 제외하고는 동일한 항체에 대해 상대적인 것이다. 특정 예에서, 항체는 인간 인테그린 α5β1에 5×10-8 M 이하, 2×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 4×10-9 M 이하, 3×10-9 M 이하, 또는 2.7×10-9 M 이하의 KD로 결합한다. 추가적인 예에서, 항체는 필적하는 항체와 비교하여 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 500배 이상, 또는 1000배 이상인, 필적하는 항체에 비해 강화된 ADCC 활성을 나타내고, 이때 필적하는 항체는 야생형 Fc 영역이 있는 것을 제외하고는 동일한 항체이다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 (a) 인간 인테그린 α5β1에 1×10-7 M 이하의 KD로 결합하고; (b) 야생형 Fc 영역과 비교하여 Fc 영역 내에 1개 이상의 돌연변이를 포함하는, 단리된 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 예를 들어, 한 사례에서, 항체의 서브클래스는 IgG1이고, IgG1 서브클래스의 Fc 영역 내의 1개 이상의 아미노산이 돌연변이된다. 추가적인 예에서, 1개 이상의 돌연변이는 IgG1 서브클래스의 Fc 영역 내의 세린 247, 알라닌 338, 또는 이소류신 340의 위치에서 발생한다. 추가적인 예에서, 1개 이상의 돌연변이는 S247D, A338L, 및 I340E로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가적인 예에서, 항체는 돌연변이 S247D, A338L, 및 I340E를 포함한다.
본 개시내용의 추가적인 양상은 인간 인테그린 α5β1에 결합하는 것에 대해 (a) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 이의 보존성 변형물; 및 (b) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 항체와 교차-경쟁하거나 경쟁하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
본 개시내용의 추가적인 양상은 인간 VH 4-39 유전자의 생성물이거나 이로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고, 인간 인테그린 α5β1에 특이적으로 결합하는, 단리된 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 부분이다.
본 개시내용의 추가적인 양상은 인간 VK L6 유전자의 생성물이거나 이로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 인간 인테그린 α5β1에 특이적으로 결합하는, 단리된 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 부분이다.
또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 2를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 4를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 5를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 6을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은
(a) 서열 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물:
(b) 서열 2를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물;
(c) 서열 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물;
(d) 서열 4를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물;
(e) 서열 5를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물; 및
(f) 서열 6을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물
을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 서열 7에 기재된 아미노산 서열에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상 동일한 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 서열 8에 기재된 아미노산 서열에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 이의 보존성 변형물, 및 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 서열 7에 기재된 아미노산 서열에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상 동일한 중쇄 가변 영역, 및 서열 8에 기재된 아미노산 서열에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 16을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 17을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 18을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은
(a) 서열 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물:
(b) 서열 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물;
(c) 서열 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물;
(d) 서열 16을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물;
(e) 서열 17을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물; 및
(f) 서열 18을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물
을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 이의 보존성 변형물, 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 25를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 26을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 27을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 28을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은
(a) 서열 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물:
(b) 서열 24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물;
(c) 서열 25를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물;
(d) 서열 26을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물;
(e) 서열 27을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물; 및
(f) 서열 28을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물
을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 이의 보존성 변형물, 및 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 33을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 34를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 35를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 서열 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 (a) 서열 33을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물: (b) 서열 34를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물; (c) 서열 35를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물; (d) 서열 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 또는 이의 보존성 변형물; (e) 서열 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 또는 이의 보존성 변형물; 및 (f) 서열 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 이의 보존성 변형물, 및 서열 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
추가적인 양상에서, 임의의 본원에 개시된 항체와 동일한 인간 인테그린 α5β1 상의 에피토프에 결합하고/하거나 인간 인테그린 α5β1에 결합하는 것에 대해 이같은 항체와 경쟁하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 기탁 번호 PTA-9377로 ATCC에 기탁된 물질을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 개시내용은 기탁 번호 PTA-9378로 ATCC에 기탁된 물질을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 개시내용은 기탁 번호 PTA-9377로 ATCC에 기탁된 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 개시내용은 기탁 번호 PTA-9378로 ATCC에 기탁된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 개시내용은 기탁 번호 PTA-9377로 ATCC에 기탁된 중쇄 가변 영역을 포함하지만 배선 돌연변이 I30S 및 N33S가 VH 영역 내에서 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 추가적인 실시양태에서, 본 개시내용은 각각 기탁 번호 PTA-9377 및 PTA-9378로 ATCC에 기탁된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체, 또는 배선 돌연변이 I30S 및 N33S가 VH 영역 내에서 이루어진 상기 항체를 제공한다. 추가적인 실시양태에서, 본 개시내용은 기탁 번호 PTA-9377로 ATCC에 기탁된 중쇄 가변 영역의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하거나, 또는 상기 중쇄 가변 영역이 배선 돌연변이 I30S 및 N33S를 함유하는 경우의 상기 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 추가적인 실시양태에서, 본 개시내용은 기탁 번호 PTA-9378로 ATCC에 기탁된 경쇄 가변 영역의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 추가적인 실시양태에서, 본 개시내용은 각각 기탁 번호 PTA-9377 및 PTA-9378로 ATCC에 기탁된 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 및 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하거나, 또는 상기 중쇄 가변 영역이 배선 돌연변이 I30S 및 N33S를 함유하는 경우의 상기 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하는 단리된 항체를 제공한다.
본 개시내용의 항체는, 예를 들어, 전장 항체, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4 서브클래스의 전장 항체일 수 있다. 별법적으로, 항체는 항체 단편, 예컨대 Fab 또는 Fab'2 단편, 또는 단일쇄 항체일 수 있다. 한 사례에서, 본 개시내용은 IgG1 서브클래스의 Fc 영역 내의 1개 이상의 아미노산이 돌연변이된 서브클래스 IgG1의 인간 전장 항체인, 임의의 상기 기술된 항체를 제공한다. 추가적인 사례에서, 세린 247, 알라닌 338, 또는 이소류신 340의 위치에서 1개 이상의 돌연변이가 발생한다. 추가적인 사례에서, 1개 이상의 돌연변이는 S247D, A338L, 및 I340E로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가적인 사례에서, 항체는 돌연변이 S247D, A338L, 및 I340E를 포함한다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 9에 제시된 중쇄, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체를 제공한다. 예를 들어, 항체는 서열 9에 기재된 아미노산 서열에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상 동일한 중쇄를 포함한다. 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 10에 제시된 경쇄, 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체를 제공한다. 예를 들어, 항체는 서열 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상 동일한 경쇄를 포함한다. 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 서열 9에 제시된 중쇄 또는 이의 보존성 변형물, 및 서열 10에 제시된 경쇄 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체를 제공한다. 예를 들어, 항체는 서열 9에 기재된 아미노산 서열에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상 동일한 중쇄, 및 서열 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상 동일한 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기술된 바와 같은 임의의 본 개시내용의 항-α5β1 항체의 중쇄의 C-말단 라이신이 절단되고, 따라서 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 서열 43에 제시된 바와 같은 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하지만, 이때 C-말단 라이신이 존재하지 않는다. 다양한 사례에서, 항-α5β1 항체의 중쇄 및 경쇄는 신호 서열을 임의적으로 포함할 수 있다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 임의의 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 치료제에 연결된, 임의의 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역접합체를 제공한다. 한 사례에서, 치료제는 세포독소 또는 방사성 동위원소이다. 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 임의의 본원에 기술된 면역접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고, 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 이와 상이한 결합 특이성을 지니는 제2의 기능적 모이어티(moiety)에 연결되어 있는 이중특이적 분자를 또한 제공한다.
본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
이러한 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 코딩하는 핵산 분자, 뿐만 아니라 이같은 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 이같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 또한 본 개시내용에 포함된다. 예를 들어, 한 양상은 서열 11에 제시된 서열 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 핵산 분자 또는 발현 벡터이다. 추가적인 양상은 서열 12에 제시된 서열 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 핵산 분자 또는 발현 벡터이다. 추가적인 양상은 서열 21, 22, 31, 32, 41, 및 42로 구성된 군으로부터 선택된 서열 또는 이의 보존성 변형물을 포함하는 단리된 핵산 분자 또는 발현 벡터이다. 본 개시내용은 본 개시내용의 항체를 발현하는, 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진(transgene)을 포함하는 트랜스제닉(transgenic) 마우스, 뿐만 아니라 본 개시내용의 항체를 생산하는, 이같은 마우스로부터 제조된 하이브리도마를 또한 제공한다.
본 개시내용은 임의의 본원에 기술된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 임의의 본원에 기술된 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 단계 및 숙주 세포로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 항-인테그린 α5β1 항체의 제조 방법을 제공한다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 인테그린 α5β1을 발현하는 종양 세포를 1×10-7 M 이하의 KD로 인간 인테그린 α5β1에 결합하고 항체 의존적 세포성 세포독성을 유도할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함하는, 인테그린 α5β1을 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 한 사례에서, 항체는 전적으로 인간형인 항체이다. 추가적인 사례에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 항체 의존적 세포성 세포독성을 유도하는 이의 능력을 강화하도록 조작된다. 추가적인 사례에서, Fc 영역 내의 1개 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이에 의해 강화가 달성된다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 인테그린 α5β1을 발현하는 종양 세포를 종양 세포의 성장을 억제하는데 효과적인 양의 임의의 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 인테그린 α5β1을 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 비정상적인 세포 성장의 치료를 위한 의약의 제작을 위한, 임의의 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 용도를 제공한다. 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 비정상적인 세포 성장의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 임의의 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 이러한 방법의 한 실시양태에서, 비정상적인 세포 성장은 중피종, 간-담도 (간 및 담관), 원발성 또는 속발성 CNS 종양, 원발성 또는 속발성 뇌 종양, 폐암 (NSCLC 및 SCLC), 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 난소암, 결장암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 위장 (위, 결장직장 및 십이지장), 유방암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 음문 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연질 조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 고환암, 만성 또는 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 비-호지킨 림프종, 척추 종양, 뇌간교종, 뇌하수체 선종, 부신피질암, 담낭암, 다발성 골수종, 담관 암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 암이다.
본 개시내용은 본원에서 제공된 항-α5β1 항체의 서열을 기초로 "2세대" 항-α5β1 항체를 제조하는 방법을 또한 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 (a) (i) 서열 1, 13, 23, 또는 33에 제시된 CDR1 서열, 서열 2, 14, 24, 또는 34에 제시된 CDR2 서열 및/또는 서열 3, 15, 25, 또는 35에 제시된 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열 4, 16, 26, 또는 36에 제시된 CDR1 서열, 서열 5, 17, 27, 또는 37에 제시된 CDR2 서열 및/또는 서열 6, 18, 28, 또는 38에 제시된 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하는 단계; (b) 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜, 1개 이상의 변경된 항체 서열을 생성시키는 단계; 및 (c) 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 단계를 포함하는, 항-α5β1 항체의 제조 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또다른 특색 및 장점이 한정적인 것으로 해석되지 않아야 하는 하기의 상세한 설명 및 실시예로부터 명백할 것이다. 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 진뱅크(Genbank) 등록물, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다.
도면의 간단한 설명
도 1a는 22B5 중쇄 가변 영역의 DNA 서열 (서열 11)을 나타낸다; 도 1b는 22B5 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 7)을 나타내고, CDR 영역에 밑줄이 그어진다; 도 1c는 22B5 경쇄 가변 영역의 DNA 서열 (서열 12)을 나타낸다; 도 1d는 22B5 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 8)을 나타내고, CDR 영역에 밑줄이 그어진다; 도 1e는 24C7 중쇄 가변 영역의 DNA 서열 (서열 21)을 나타낸다; 도 1f는 24C7 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 19)을 나타내고, CDR 영역에 밑줄이 그어진다: 도 1g는 24C7 경쇄 가변 영역의 DNA 서열 (서열 22)을 나타낸다; 도 1h는 24C7 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 20)을 나타내고, CDR 영역에 밑줄이 그어진다; 도 1i는 1D9 중쇄 가변 영역의 DNA 서열 (서열 31)을 나타낸다; 도 1j는 1D9 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 29)을 나타내고, CDR 영역에 밑줄이 그어진다; 도 1k는 1D9 경쇄 가변 영역의 DNA 서열 (서열 32)을 나타낸다; 도 1l은 1D9 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 30)을 나타내고, CDR 영역에 밑줄이 그어진다; 도 1m은 2D2 중쇄 가변 영역의 DNA 서열 (서열 41)을 나타낸다; 도 1n은 2D2 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 39)을 나타내고, CDR 영역에 밑줄이 그어진다; 도 1o는 2D2 경쇄 가변 영역의 DNA 서열 (서열 42)을 나타낸다; 도 1p는 2D2 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 40)을 나타내고, CDR 영역에 밑줄이 그어진다; 도 1q는 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 나타내고, 돌연변이 S247D, A338L, 및 I340E에 밑줄이 그어진다; 도 1r은 IgG1 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 22B5 중쇄 가변 도메인 (VH)과 상응하는 배선 서열의 정렬을 나타낸다. 22B5 경쇄 가변 도메인 (Vκ)과 상응하는 배선 서열의 정렬이 또한 제시된다. CDR 영역에 밑줄이 그어지고, 동일한 잔기는 대시 (-)로 표시되며, 점 (.)은 결실을 가리킨다.
도 3은 다양한 농도의 α5β1 재조합 세포외 도메인을 고정된 22B5/DLE 상에 주사함으로써 수득된 센소그램의 오버레이를 나타낸다. 4.0 mM CaCl2의 존재 하에 이러한 데이터를 수집하였다. 주입 순서는 저농도 → 고농도였다.
도 4는 FACS에 의한 HUVEC에 대한 22B5/DLE의 용량-의존적 결합을 나타낸다.
도 5는 인간 및 마우스 Fcγ 수용체를 비교하는 평형 해리 상수를 나타낸다. "wt"는 22B5 야생형 IgG1을 지칭하고, "DLE"는 22B5/DLE를 지칭한다.
도 6은 HUVEC 세포 부착 차단 분석법의 결과를 나타낸다. 결과는 22B5 및 다양한 서브클래스 변이체, 뿐만 아니라 음성 대조군 (BHA2 IgG1)에 대한 피브로넥틴에 HUVEC가 부착하는 것을 억제하는 수준을 가리킨다. 계산된 IC50 값이 또한 제시된다.
도 7은 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)에 의해 측정된 HUVEC 및 20개의 종양 세포주로부터의 인간 α5 발현을 나타낸다.
도 8은 22B5 wt IgG1과 비교하여 22B5/DLE에 의해 유도된 시험관내 ADCC를 나타낸다. 도 8a는 22B5/DLE 및 22B5 wt IgG1에 의한 인간 PBMC의 존재 하에서의 U87MG 세포의 ADCC를 측정하는 LDH-기반 검출 분석법을 나타낸다. 도 8b는 22B5/DLE 및 22B5 wt IgG1에 의한 인간 PBMC의 존재 하에서의 HUVEC의 ADCC를 측정하는 톡시라이트(ToxiLight)-기반 검출 분석법을 나타낸다.
도 9는 광범위한 항원 발현 수준에 걸친 wt 22B5 IgG1에 비해 22B5/DLE로부터의 실질적인 ADCC 강화를 가리키는 LDH-기반 검출 분석법을 나타낸다.
도 10은 A549-Luc 실험적 전이 모델에서의 22B5/DLE의 억제 활성을 나타낸다. 도 10a: 제8주에 BLI에 의해 측정된 폐 전이 부피 (대조군은 n=11, 22B5 IgG2 군은 n=14, 22B5/DLE 군은 n=12). 도 10b: 투약이 중단된 후의 22B5 IgG2로 처치된 군에서의 폐 종양의 재성장. 이와 비교하여, 22B5/DLE로 처치된 군은 재성장을 거의 나타내지 않았다. 도 10c: 각각의 처치군 (종점 = BLI 1×108 광자/초)의 동물 생존율의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 플롯; 모든 다른 군과 비교하여 대조군 비히클에 대해 p<0.0001, 및 22B5/DLE와 22B5 IgG2 군 사이의 비교에 대해 p<0.05.
도 11은 FACS에 의한 HUVEC에 대한 1D9, 1D9/DLE, 24C7/DLE, 2D2/DLE, 22B5, 및 22B5/DLE의 용량-의존적 결합을 나타낸다.
도 12는 1D9, 1D9/DLE, 2D2/DLE, 22B5/DLE, 및 24C7/DLE에 의해 유도된 시험관내 ADCC를 나타낸다.
도 13은 전이성 흑색종의 동계 모델에서의 1D9/DLE의 ADCC-의존적 항-종양 효능을 나타낸다. 도 13a: 모든 군으로부터 절제된 폐의 총체적인 외양. 도 13b: 폐 중량의 정량 (* p<0.05, 1D9 IgG1 DLE 대 1D9 IgG2). 도 13c: 폐 표면 상의 가시적인 전이성 콜로니의 개수의 정량. ANOVA 및 본페로니(Bonferroni) 다중 비교 테스트에 의한 통계학적 분석 (* p<0.05, 1D9 IgG1 DLE 대 1D9 IgG2; * p<0.05, 1D9 IgG1 DLE 대 항-KLH IgG2).
상세한 설명
본 개시내용은 높은 친화력으로 α5β1에 특이적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체에 관한 것이다. 특정 사례에서, 본 개시내용의 항체는 특정 중쇄 및 경쇄 배선 서열로부터 유래되고/되거나, 특정 아미노산 서열을 포함하는 CDR 영역과 같은 특정한 구조적 특색을 포함한다. 본 개시내용은은 단리된 항체, 이같은 항체의 제조 방법, 이같은 항체를 포함하는 면역접합체 및 이중특이적 분자, 및 본 개시내용의 항체, 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 본 개시내용은, 예컨대 α5β1을 검출하기 위해, 뿐만 아니라 α5β1의 발현과 관련된 질환, 예컨대 비정상적인 세포 성장 (예를 들어, 암)을 치료하기 위해, 항체를 사용하는 방법에 또한 관련된다. 따라서, 본 개시내용은 다양한 유형의 비정상적인 세포 성장, 예컨대 암을 치료하기 위해 항-α5β1 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 사용하는 방법을 또한 제공한다.
본 개시내용이 더욱 쉽게 이해될 수 있기 위하여, 특정 용어들이 먼저 정의된다. 추가적인 정의가 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 지닐 것이다. 더욱이, 문맥적으로 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 이의 기술은 당업계에 주지되어 있고 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이다.
달리 지시되지 않는 한, 일반적으로 본 개시내용의 방법 및 기술은 당업계에 주지된 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 더욱 구체적인 참고문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 이같은 참고문헌에는, 예를 들어, [Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)], [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002)], 및 [Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990)]이 포함된다. 제조사의 설명서에 따라, 당업계에서 통상적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기술된 바와 같이, 효소 반응 및 정제 기술이 수행된다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련되어 사용된 명명법, 및 이의 실험 절차 및 기술은 당업계에 주지되어 있고 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 제약학적 제조, 제형, 및 전달, 및 환자의 치료를 위해 표준 기술이 사용된다.
본원에서 사용된, 하기의 용어들 각각은 본 섹션에서 이와 관련된 의미를 지닌다.
관사 ("a"' 및 "an")는 관사의 문법적 대상 1개 또는 1개 초과 (즉, 1개 이상)을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 예를 들어, "요소(an element)"는 1개의 요소 또는 1개를 초과하는 요소를 의미한다.
본원에서 사용된 20개의 통상적인 아미노산 및 이들의 약어는 통상적인 용법을 따른다. [Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))] 참조.
용어 "α5β1 " 및 "인테그린 α5β1"은 상호교환가능하게 사용되고, 인간 α5β1의 변이체, 이소형(isoform) 및 종 유사체를 포함한다. 예를 들어, 천연 인간 α5β1은 α5 서브유닛 (추후에 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 사슬로 절단되는 전구 서열로부터 유래됨) (진뱅크 접속 번호 P08648), 및 β1 서브유닛 (추후에 성숙형 형태로 프로세싱되는 전구 서열로부터 유래됨) (진뱅크 접속 번호 P05556-1)으로 구성된다. β1 서브유닛은 별법적인 스플라이싱(splicing)에 의해 생산된 여러 이소형으로 존재하는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 진뱅크 접속 번호 P05556-2, P05556-3, P05556-4, 및 P05556-5 참조). 본 개시내용의 인간 α5β1 항체는, 특정 사례에서, 인간 이외의 종으로부터의 α5β1과 교차-반응할 수 있다. 또다른 사례에서, 항체는 인간 α5β1에 대해 완전히 특이적일 수 있고, 종 또는 기타 유형의 교차-반응성을 나타내지 않을 수 있다.
"면역 응답"은, 당업자가 이해하는 바와 같이, 임의의 검출가능한, 헬퍼 T 세포 또는 세포독성 T 세포 응답의 항원-특이적 또는 동종 활성화, 항체 생산, 알러지 반응의 T 세포-매개 활성화 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이 용어는 침습성 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적인 감염의 경우의 정상적인 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적 손상, 이들의 파괴, 또는 인체로부터의 이들의 제거가 초래되는, 예를 들어, 림프구, 항원 제시 세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자 (항체, 사이토카인 및 보체 포함)의 작용을 포함한다.
"신호 전달 경로"는 세포의 한 부분으로부터 세포의 또다른 부분으로의 신호 전파에서 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자들 간의 생화학적 관계를 지칭한다. 본원에서 사용된 구절 "세포 표면 수용체"에는, 예를 들어, 신호를 받을 수 있고 이같은 신호를 세포의 형질막을 가로질러 전파할 수 있는 분자들 및 분자들의 복합체가 포함된다. 본 개시내용의 "세포 표면 수용체"의 예는 α5β1 인테그린이다.
본원에서 언급된 용어 "항체"는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원 결합 부분") 또는 단일쇄를 포함한다. "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 명명된 더욱 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명된 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전통적인 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 포함되는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 경쇄 및 중쇄에서, 가변 및 불변 영역은 아미노산 약 12개 이상의 "J" 영역에 의해 연결되고, 이때 중쇄는 아미노산 잔기 약 10개 이상의 "D" 영역을 또한 포함한다. 일반적으로, [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))] 참조.
본원에서 사용된, 항체의 "항원 결합 부분" (또는 간단히 "항체의 일부분")이라는 용어는 항원 (예를 들어, α5β1)에 특이적으로 결합하는 능력이 유지된 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지(hinge) 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 1개의 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 ([Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH이 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법을 사용하여, 이들이 VL 및 VH 영역이 쌍을 이뤄 1가 분자를 형성한 단일 단백질 사슬 (단일쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)로 만들어지도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 이들을 연결시킬 수 있다. 이같은 단일쇄 항체 또한 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함되도록 의도된다. 당업자에게 공지된 통상적인 기술이 포함되는 임의의 적절한 기술을 사용하여 이러한 항체 단편들을 수득할 수 있고, 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 단편들을 스크리닝할 수 있다.
본원에서 사용된 "단리된 항체"는 항원 특이성이 상이한 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하도록 의도된다 (예를 들어, α5β1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 α5β1 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, α5β1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 α5β1 분자에 대한 교차-반응성이 있을 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 분자 조성이 단일한 항체 분자들의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일한 결합 특이성 및 친화력을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체", 또는 "전적으로 인간형인 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 지니는 항체를 포함하도록 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역 또한 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 개시내용의 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인간 배선 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서의 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 또다른 포유류 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그래프트된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
용어 "인간 모노클로날 항체" 또는 "전적으로 인간형인 모노클로날 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 양쪽 모두가 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 지니는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 인간 중쇄 트랜스진(transgene) 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어, 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산되고, 이때 B 세포가 무한증식 세포에 융합된다.
본원에서 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소멀(transchromosomal)인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 이로부터 제조된 하이브리도마 (하기에 추가로 기술됨)로부터 단리된 항체, (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어, 이입세포(transfectoma)로부터 단리된 항체, (c) 조합형의 재조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 기타 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이같은 재조합 인간 항체의 가변 영역은 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이같은 재조합 인간 항체에 시험관내 돌연변이유발 (또는, 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)이 적용될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만 생체내에서 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에서 사용된 "이소타입" 또는 "클래스"는 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM 또는 IgG)를 지칭한다. 항체의 불변 도메인은 항원에의 결합에서 수반되지 않지만, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 소정의 인간 항체 또는 면역글로불린은 면역글로불린의 5가지 주요 클래스 중 하나로 지정될 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. 상이한 클래스의 면역글로불린들의 구조 및 3차원 형상이 주지되어 있다. 다양한 인간 면역글로불린 클래스 중에서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 IgM만이 보체를 활성화시키는 것으로 공지되어 있다. 인간 IgG1 및 IgG3은 인간에서 ADCC를 매개하는 것으로 공지되어 있다.
본원에서 사용된 "서브클래스"는 중쇄 불변 영역 유전자의 이소타입 내에서의 추가적인 상술, 예를 들어, IgG 이소타입 내의 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브클래스를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "화합물" 또는 "제약 화합물"은 항체, 이의 항원 결합 부분, 면역접합체, 및 이중특이적 분자를 포함한다.
"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"라는 구절은 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "항체 의존적 세포성 세포독성" 또는 "ADCC"는 비-특이적 세포독성 세포 (예를 들어, NK 세포, 호중구, 대식 세포 등)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 이어서 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 이같은 세포독성 세포는 일반적으로 Fc 수용체 (FcR)를 발현한다. ADCC를 매개하는 주요 세포 (NK 세포)는 FcγRIII을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII, 및/또는 FcγRIV를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현이 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]에 요약되어 있다. 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 분석법, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 것을 수행할 수 있다. 이같은 분석법에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어, [Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 힌지 영역 및 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하도록 사용된다. 예를 들어, FcR은 천연 서열 인간 FcR일 수 있다. FcR은 IgG 항체와 결합하는 것 (감마 수용체)일 수 있고, FcγRI, FcγRII, FcγRIII, 및 FcγRIV 서브클래스의 수용체 (이러한 수용체들의 대립유전자 변이체 및 별법적으로 스플라이싱된 형태 포함)를 포함한다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체")와 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함되고, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인 내에 면역수용체 타이로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인 내에 면역수용체 타이로신계 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 ([Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에 리뷰되어 있다. 추후에 확인될 것이 포함되는 기타 FcR이 본원에서의 용어 "FcR"에 포함된다. 이 용어는 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 또한 포함한다 ([Guyer et al., Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]). 면역글로불린 Fc 단편 상의 1차 FcR 결합 부위는 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 힌지 영역 내에 존재한다. 이러한 힌지 영역은 다양한 백혈구 상의 FcR1-3과 상호작용하고, 이러한 세포들이 표적을 공격하도록 촉발한다 ([Wines et al., J. Immunol, 164:5313-5318 (2000)]). 힌지 영역은 미국 특허 번호 6,165,476에 기술된 서열을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "항체 의존적 세포성 세포독성을 유도할 수 있는"은 당업자에게 공지된 분석법(들)에 의해 측정되는 ADCC를 나타내는 작용제, 예컨대 항체의 능력을 지칭한다. 이같은 활성은 Fc 영역과 다양한 FcR의 결합에 의해 전형적으로 특성화된다. 임의의 특정 메커니즘에 한정되지 않으면서, 당업자는 ADCC를 나타내는 항체의 능력이, 예를 들어, 이의 서브클래스 (예컨대 IgG1 또는 IgG3), Fc 영역 내로 도입된 돌연변이, 또는 항체의 Fc 영역 내의 탄수화물 패턴에 대한 변형에 의한 것일 수 있음을 인지할 것이다. 이같은 변형이 미국 특허 공개 번호 2007-0092521에 예를 들어 기술되어 있다.
용어 "인간 항체 유도체"는 임의의 변형된 형태의 인간 항체, 예를 들어, 항체와 또다른 작용제 또는 항체의 접합체를 지칭한다.
용어 "인간화 항체"는 또다른 포유류 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그래프트된 항체를 지칭하도록 의도된다. 추가적인 프레임워크 영역 변형이 인간 프레임워크 서열 내에서 이루어질 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 한 종으로부터 가변 영역 서열이 유래되고, 또다른 종으로부터 불변 영역 서열이 유래된 항체, 예컨대 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하도록 의도된다.
본원에서 사용된 "특이적으로 결합한다"라는 구절은 특정 분자를 인식하여 이에 결합하지만, 실질적으로 샘플 내의 또다른 분자는 인식하지 않거나 이에 결합하지 않는 화합물, 예를 들어, 단백질, 핵산, 항체 등을 의미한다. 예를 들어, 샘플 내의 동족 리간드를 인식하고 이에 결합하지만 (예를 들어, 자신의 동족 항원인 α5β1과 결합하는 항-α5β1 항체), 실질적으로 샘플 내의 또다른 분자는 인식하지 않거나 이에 결합하지 않는 항체 또는 펩티드 억제제가 있다. 따라서, 지정된 분석법 조건 하에, 특정된 결합 모이어티 (예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 부분)는 특정 표적 분자, 예를 들어, α5β1에 우선적으로 결합하지만, 테스트 샘플 내에 존재하는 다른 성분에는 유의한 양으로 결합하지 않는다. 다양한 분석법 포맷을 사용하여, 관심 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 선별할 수 있다. 예를 들어, 고체-상 ELISA 면역분석법, 면역침전, 비아코어(BIAcore), FACS, 및 웨스턴 블롯 분석이 α5β1과 특이적으로 반응하는 항체를 확인하는데 사용될 수 있는 다수의 방법들이다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 잡음의 2배 이상일 것이고, 더욱 전형적으로는 배경의 10배 초과이며, 더욱 더 명확하게는, 평형 해리 상수 (KD)가 ≤ 1 μM, 예를 들어 ≤ 100 nM, 추가로 예를 들어, ≤ 10 nM인 경우에 항체가 항원과 "특이적으로 결합"하는 것으로 언급된다.
본원에서 사용된, "인간 인테그린 α5β1에 특이적으로 결합하는" 항체는 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 3×10-8 M 이하, 1×10-8 M 이하, 또는 5×10-9 M 이하의 KD로 인간 인테그린 α5β1에 결합하는 항체를 지칭하도록 의도된다.
본원에서 사용된 용어 "kon"은 온(on)-속도, 또는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 지칭하도록 의도되는 한편, 본원에서 사용된 용어 "koff"는 오프(off)-속도, 또는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하도록 의도된다. 본원에서 사용된 용어 "KD"는 koff 대 kon의 비율 (즉. koff/kon)로부터 수득되고 몰 농도 (M)로 표현되는 해리 상수를 지칭하도록 의도된다. 당업계에 잘 확립되어 있는 방법들을 사용하여 항체에 대한 KD 값을 결정할 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 한 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것에 의한 방법이고, 전형적으로 비아코어(Biacore)® 시스템과 같은 바이오센서 시스템이 사용된다.
본원에서 사용된, IgG 항체에 대한 "높은 친화력"이라는 용어는 표적 항원에 대한 KD가 1×10-7 M 이하, 5×10-8 M 이하, 또는 5×10-9 M 이하인 항체를 지칭한다. 그러나, 또다른 항체 이소타입에 대해 "높은 친화력"의 결합이 다를 수 있다. 예를 들어, IgM 이소타입에 대한 "높은 친화력"의 결합은 KD가 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 또는 10-8 M 이하인 항체를 지칭한다.
항체와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "경쟁하다"는 제1 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 경쟁하는 경우를 지칭하고, 이때 제1 항체와 이의 동족 에피토프의 결합이 제2 항체의 부재 하에서의 제1 항체의 결합과 비교하여 제2 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소된다. 제2 항체가 이의 에피토프에 결합하는 것이 제1 항체의 존재 하에 또한 검출가능하게 감소되는 별법적인 경우가 가능하지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 즉, 제2 항체가 제1 항체가 이의 각자의 에피토프에 결합하는 것을 억제하지 않으면서 제1 항체가 제2 항체의 이의 에피토프에 대한 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 다른 항체와 이의 동족 에피토프 또는 리간드의 결합을 검출가능하게 억제하는 경우 (동일한 정도, 더 큰 정도, 또는 더 낮은 정도 여부와 상관없이), 이러한 항체들은 이들의 각자의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"하는 것으로 언급된다. 예를 들어, 교차-경쟁 항체들은 본원에 개시된 항체가 결합하는 에피토프 또는 에피토프의 일부분에 결합할 수 있다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체의 사용 양쪽 모두 본 개시내용에 포함된다. 이같은 경쟁 또는 교차-경쟁이 발생하는 메커니즘 (예를 들어, 입체 장애, 형상 변화, 또는 공통 에피토프 또는 이의 일부분에 대한 결합 등)과 관계없이, 본원에서 제공된 교시내용을 기초로, 당업자는 이같은 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 본원에 개시된 방법에 포함되고 이를 위해 유용할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프성 결정기는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 군(grouping)으로 구성되고, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특성, 뿐만 아니라 특정한 전하 특성이 있다. 입체형상적 및 비-입체형상적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 전자에 대한 결합은 상실되지만, 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
"당형태(glycoform)"는 다양한 탄수화물 단위의 연결을 포함하는 복합적인 올리고당류 구조를 지칭한다. 이같은 구조가, 예를 들어, [Essentials of Glycobiology Varki et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1999)]에 기술되어 있고, 이는 표준 당생물학(glycobiology) 명명법의 리뷰를 또한 제공한다. 이같은 당형태에는 G2, G1, G0, G-1, 및 G-2 (예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 99/22764 참조)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
"당화 패턴"은 단백질에 공유결합으로 부착된 탄수화물 단위들의 패턴 (예를 들어, 당형태), 뿐만 아니라 당형태(들)이 단백질, 더욱 구체적으로는 면역글로불린 단백질의 펩티드 골격에 공유결합으로 부착된 부위(들)로서 정의된다.
상이한 세포주에 의해 또는 트랜스제닉 동물에서 발현된 항체들은 서로 비교했을 때 상이한 당형태 및/또는 당화 패턴을 지닐 것이다. 그러나, 본원에서 제공된 핵산 분자에 의해 코딩되거나 본원에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 이같은 항체들의 당화와 관계없이 본 개시내용의 일부이다.
본원에서 사용된 용어 "대상"은 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본원에서 사용된 "치료하다"는 환자가 경험하는 질환 증상 (즉, 종양 성장 및/또는 전이, 또는 면역 세포의 개수 및/또는 활성에 의해 매개되는 기타 효과 등)의 빈도를 감소시키는 것을 의미한다. 이러한 용어는 질환의 증상, 합병증 또는 생화학적 징후의 개시를 방지하거나 지연시키기 위해, 증상을 완화시키기 위해, 또는 질환, 용태 또는 장애의 추가적인 발달을 중단시키거나 억제하기 위해, 본 개시내용의 화합물 또는 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 치료는 예방적 (질환 개시의 방지 또는 지연용, 또는 이의 임상 또는 준임상 증상 발현의 방지용)이거나, 또는 질환의 발현 후의 증상들의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다.
본 개시내용의 다양한 양상들이 하기의 하위 섹션에서 추가로 상세하게 기술된다.
항-α5β1 항체
본 개시내용의 항체는 항체의 특정한 기능적 특색 또는 성질에 의해 특성화된다. 예를 들어, 항체가 인간 α5β1에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 본 개시내용의 항체는 α5β1에 높은 친화력으로, 예를 들어 1×10-7 M 이하의 KD로 결합한다.
바람직하게는, 항체는 인간 α5β1에 5×10-8 M 이하, 2×10-8 M 이하, 5×10-9 M 이하, 4×10-9 M 이하, 3×10-9 M 이하, 또는 2.7×10-9 M 이하의 KD로 결합한다. α5β1에 대한 항체의 결합 능력을 평가하는 분석법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA, 및 유동 세포측정 분석이 포함된다. 적절한 분석법이 실시예에서 상세하게 기술된다. 당업계에 공지된 분석법에 의해, 예컨대 비아코어 분석에 의해 항체의 결합 동역학 (예를 들어, 결합 친화력)을 또한 평가할 수 있다.
본 개시내용의 항-α5β1 항체는 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 또한 유도할 수 있다. 항체의 ADCC 활성 수준을 추가로 강화시킬 수 있는 Fc 도메인에 대한 돌연변이를 포함하여, 특이적 서브클래스 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3)의 사용에 의해 이같은 기능성이 예를 들어 달성될 수 있다. 이같은 돌연변이 및 ADCC의 측정 방법이 실시예에 추가로 기술된다.
모노클로날 항체 22B5
한 예시적인 본 개시내용의 항체는 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같은 인간 모노클로날 항체 22B5이다. 22B5의 VH 아미노산 서열이 도 1b에 제시되고, 서열 7에서 기재된다. 22B5의 VL 아미노산 서열이 도 1d에 제시되고, 서열 8에 기재된다. 도 1b 및 도 2에 제시된 바와 같이, 22B5의 중쇄 가변 영역은 인간 배선 유전자 서열로 역행하는 2개의 돌연변이를 포함한다. 즉, 22B5는 아미노산 잔기 번호 30에서의 이소류신 → 세린 돌연변이 (I30S) 및 아미노산 잔기 번호 33에서의 아스파라긴 → 세린 돌연변이 (N33S)를 포함한다. 본원에서 사용된 "22B5"는 상기 I30S 및 N33S 중쇄 가변 영역 배선 돌연변이가 이루어진 항체를 지칭한다.
22B5가 α5β1에 결합할 수 있음을 고려하여, 추가적인 본 개시내용의 항-α5β1 결합 분자가 생성되도록 VH 및 VL 서열들이 다른 항-α5β1 항체와 "혼합 및 매칭(matching)"될 수 있다. 이같은 "혼합 및 매칭"된 항체의 α5β1 결합을 상기 및 실시예에 기술된 결합 분석법 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 테스트할 수 있다. 한 사례에서, VH 및 VL 사슬들이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열이 구조적으로 유사한 VH 서열로 교체된다. 유사하게, 또다른 사례에서, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열이 구조적으로 유사한 VL 서열로 교체된다.
또다른 양상에서, 본 개시내용은 22B5의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체를 제공한다. 22B5의 VH CDR1의 아미노산 서열이 서열 1에서 제시된다. 22B5의 VH CDR2의 아미노산 서열이 서열 2에서 제시된다. 22B5의 VH CDR3의 아미노산 서열이 서열 3에서 제시된다. 22B5의 VL CDR1의 아미노산 서열이 서열 4에서 제시된다. 22B5의 VL CDR2의 아미노산 서열이 서열 5에서 제시된다. 22B5의 VL CDR3의 아미노산 서열이 서열 6에서 제시된다. 캐벗(Kabat) 시스템을 사용하여 CDR 영역이 서술된다 ([Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]).
22B5가 α5β1에 결합하고, 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에 의해 제공됨을 고려하여, 추가적인 본 개시내용의 항-α5β1 결합 분자가 생성되도록 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열이 "혼합 및 매칭"될 수 있다 (즉, 비록 각각의 항체가 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3을 전형적으로 함유할 것이지만, 상이한 α5β1 항체들로부터의 CDR들이 혼합 및 매칭될 수 있다). 이같은 "혼합 및 매칭"된 항체의 α5β1 결합을 상기 및 실시예에 기술된 결합 분석법 (예를 들어, ELISA, 비아코어 분석)을 사용하여 테스트할 수 있다. 한 사례에서, VH CDR 서열들이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열이 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 교체된다. 유사하게, VL CDR 서열들이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열이 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 전형적으로 교체된다. 1개 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본원에 개시된 CDR 서열들로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 신규 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있다는 것이 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
따라서, 또다른 양상에서, 본 개시내용은 (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및/또는 (f) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하고, 이때 항체가 α5β1, 바람직하게는 인간 α5β1에 특이적으로 결합하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
모노클로날 항체 2 D2 , 24 C7 및 1 D9
또다른 예시적인 본 개시내용의 항체는 실시예 1 및 8에 기술된 인간 모노클로날 항체 2D2이다. 2D2의 VH 아미노산 서열이 서열 39에서 기재된다. 2D2의 VL 아미노산 서열이 서열 40에서 제시된다.
또다른 예시적인 본 개시내용의 항체는 실시예 1 및 8에 기술된 인간 모노클로날 항체 24C7이다. 24C7의 VH 아미노산 서열이 서열 19에서 기재된다. 24C7의 VL 아미노산 서열이 서열 20에서 제시된다.
또다른 예시적인 본 개시내용의 항체는 실시예 1 및 8에 기술된 인간 모노클로날 항체 1D9이다. 1D9의 VH 아미노산 서열이 서열 29에서 기재된다. 1D9의 VL 아미노산 서열이 서열 30에서 제시된다.
2D2, 24C7, 및 1D9가 α5β1에 결합할 수 있음을 고려하여, 추가적인 본 개시내용의 항-α5β1 결합 분자가 생성되도록 이러한 항체들의 VH 및 VL 서열들이 다른 항-α5β1 항체와 "혼합 및 매칭"될 수 있다. 이같은 "혼합 및 매칭"된 항체의 α5β1 결합을 상기 및 실시예에 기술된 결합 분석법 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 테스트할 수 있다. 한 사례에서, VH 및 VL 사슬들이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열이 구조적으로 유사한 VH 서열로 교체된다. 유사하게, 또다른 사례에서, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열이 구조적으로 유사한 VL 서열로 교체된다.
또다른 양상에서, 본 개시내용은 2D2, 24C7, 및 1D9의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체를 제공한다. 이러한 CDR들의 상응하는 아미노산 서열이 하기에 지시된다.
Figure pct00001
캐벗 시스템을 사용하여 CDR 영역이 서술된다 ([Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]).
2D2, 24C7 및 1D9가 α5β1에 결합하고, 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에 의해 제공됨을 고려하여, 추가적인 본 개시내용의 항-α5β1 결합 분자가 생성되도록 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열이 "혼합 및 매칭"될 수 있다 (즉, 비록 각각의 항체가 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3을 전형적으로 함유할 것이지만, 상이한 α5β1 항체들로부터의 CDR들이 혼합 및 매칭될 수 있다). 이같은 "혼합 및 매칭"된 항체의 α5β1 결합을 상기 및 실시예에 기술된 결합 분석법 (예를 들어, ELISA, 비아코어 분석)을 사용하여 테스트할 수 있다. 한 사례에서, VH CDR 서열들이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열이 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 교체된다. 유사하게, VL CDR 서열들이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열이 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 전형적으로 교체된다. 1개 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본원에 개시된 CDR 서열들로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 신규 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있다는 것이 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
따라서, 또다른 양상에서, 본 개시내용은 (a) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) 서열 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) 서열 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및/또는 (f) 서열 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하고, 이때 항체가 α5β1, 바람직하게는 인간 α5β1에 특이적으로 결합하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 개시내용은 (a) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및/또는 (f) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하고, 이때 항체가 α5β1, 바람직하게는 인간 α5β1에 특이적으로 결합하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 개시내용은 (a) 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및/또는 (f) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하고, 이때 항체가 α5β1, 바람직하게는 인간 α5β1에 특이적으로 결합하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
특정 배선 서열의 항체
특정 양상에서, 본 개시내용의 항체는 특정 배선 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정 배선 경쇄 면역글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
예를 들어, 한 양상에서, 본 개시내용은 인간 VH 4-39 유전자의 생성물이거나 이로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 항체가 α5β1에 특이적으로 결합하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 인간 VH 3-30.3 유전자의 생성물이거나 이로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 항체가 α5β1에 특이적으로 결합하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 양상에서, 본 개시내용은 인간 VK L6 유전자의 생성물이거나 이로부터 유래되는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 항체가 α5β1에 특이적으로 결합하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 또다른 예시적인 양상에서, 본 개시내용은
(a) 인간 VH 4-39 유전자 (서열 7에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자) 또는 인간 3-30.3 유전자 (서열 19, 29, 또는 39에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자)의 생성물이거나 이로부터 유래되는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
(b) 인간 VK L6 유전자 (서열 8, 20, 30, 또는 40에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자)의 생성물이거나 이로부터 유래되는 경쇄 가변 영역을 포함하며;
(c) α5β1, 바람직하게는 인간 α5β1에 특이적으로 결합하는,
단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
각각 VH 4-39 및 VK L6의 VH 및 VL을 지니는 항체의 예는 22B5이다. 각각 VH 3-30.3 및 VK L6의 VH 및 VL을 지니는 항체의 예는 24C7, 2D2, 및 1D9이다.
본원에서 사용되는 경우, 항체의 가변 영역이 인간 배선 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템에서 수득된다면 인간 항체는 특정 배선 서열의 "생성물"이거나 또는 이로부터 "유래"된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이같은 시스템은 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화시키는 단계 또는 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원으로 스크리닝하는 단계를 포함한다. 인간 배선 면역글로불린 서열의 "생성물"이거나 이로부터 "유래"된 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 서열 면에서 가장 근접한 (즉, ％ 동일성이 가장 큰) 인간 배선 면역글로불린 서열을 선별함으로써 그러한 것으로 확인될 수 있다. 특정 인간 배선 면역글로불린 서열의 "생성물"이거나 이로부터 "유래"된 인간 항체는, 예를 들어, 천연 발생 체세포 돌연변이 또는 의도적인 부위-지정 돌연변이의 도입으로 인해, 배선 서열과 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선별된 인간 항체는 전형적으로 인간 배선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열 면에서 90％ 이상 동일하고, 다른 종의 배선 면역글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 뮤린 배선 서열)과 비교했을 때 인간 항체가 인간형인 것으로 확인되도록 하는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 사례들에서, 인간 항체는 배선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열 면에서 적어도 95％, 또는 심지어 적어도 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 동일할 수 있다. 특정 사례에서, 인간 항체는 배선 Ig 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열 면에서 동일하다. 전형적으로, 특정 인간 배선 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 배선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 최대 10개의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 사례에서, 인간 항체는 배선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 최대 5개, 또는 심지어 최대 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
상동성 항체
또다른 양상에서, 본 개시내용의 항체는 본원에 기술된 예시적인 항체들의 아미노산 서열에 대해 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 항체는 본 개시내용의 항-α5β1 항체의 원하는 기능적 성질을 유지한다.
예를 들어, 본 개시내용은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때
(a) 중쇄 가변 영역이 서열 7, 19, 29, 및 39로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 80％ 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 경쇄 가변 영역이 서열 8, 20, 30, 및 40으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 80％ 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하며;
(i) 항체가 인간 α5β1에 1×10-7 M 이하의 KD로 결합하는 성질;
(ii) 항체가 항체 의존적 세포성 세포독성을 유도할 수 있는 성질
중 하나 이상을 항체가 나타내는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
다양한 예에서, 항체는, 예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
또다른 예에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 상기 기재된 서열들에 대해 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 상동성일 수 있다. 서열 7, 19, 29, 39, 8, 20, 30, 및/또는 40을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어서, 코딩된 변경된 항체를 본원에 기술된 기능성 분석법을 사용하여 기능 (즉, 상기 (i) 및/또는 (ii)에 기재된 성질) 유지에 대해 테스트함으로써 상기 기재된 서열들의 VH 및 VL 영역에 대한 상동성이 높은 (즉, 80％ 이상인) VH 및 VL 영역을 지니는 항체를 수득할 수 있다.
본원에서 사용된, 2개의 아미노산 서열 간의 백분율 상동성은 2개의 서열 간의 백분율 동일성과 등가이다. 2개의 서열 간의 백분율 동일성은 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭(gap)의 개수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 개수의 함수이다 (즉, ％ 상동성 = 동일한 위치의 # / 전체 위치의 # × 100). 서열들의 비교 및 2개의 서열 간의 백분율 동일성의 결정은 하기의 비-제한적인 예들에 기술된 바와 같은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
PAM120 웨이트(weight) 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여, ALIGN 프로그램 (버젼 2.0) 내로 혼입된 [E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)]의 알고리즘을 사용하여 2개의 아미노산 서열 간의 백분율 동일성을 결정할 수 있다. 또한, 블라섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 웨이트 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 웨이트 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 입수가능) 내의 GAP 프로그램 내로 혼입된 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)]의 알고리즘을 사용하여 2개의 아미노산 서열 간의 백분율 동일성을 결정할 수 있다.
추가적으로 또는 별법적으로, 본 개시내용의 단백질 서열은 공공 데이터베이스에 대한 검색 (예를 들어, 관련 서열을 확인하기 위해)을 수행하기 위한 "질의 서열"로 추가로 사용될 수 있다. [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 XBLAST 프로그램 (버젼 2.0)을 사용하여 이같은 검색을 수행할 수 있다. XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여, 본 개시내용의 항체 분자에 대해 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭(Gapped) BLAST가 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트(default) 파라메터를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조.
보존성 변형이 있는 항체
특정 사례에서, 본 개시내용의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 이러한 CDR 서열들 중 하나 이상은 본원에 기술된 예시적인 항체 (예를 들어, 22B5, 1D9, 24C7, 및 2D2)를 기초로 하는 특정 아미노산 서열 또는 이의 보존성 변형물을 포함하며, 항체는 본 개시내용의 항-α5β1 항체의 원하는 기능적 성질들 중 하나 이상을 유지한다. 따라서, 본 개시내용은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때
(a) 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 3, 15, 25 및 35, 및 이의 보존성 변형물로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열 6, 18, 28 및 38, 및 이의 보존성 변형물로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며;
(i) 항체가 인간 α5β1에 1×10-7 M 이하의 KD로 결합하는 성질;
(ii) 항체가 항체 의존적 세포성 세포독성을 유도할 수 있는 성질
중 하나 이상을 항체가 나타내는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
또다른 사례에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 2, 14, 24 및 34, 및 이의 보존성 변형물로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열 5, 17, 27 및 37, 및 이의 보존성 변형물로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 사례에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열 1, 13, 23 및 33, 및 이의 보존성 변형물로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열 4, 16, 26 및 36, 및 이의 보존성 변형물로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "보존성 변형"은 이러한 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치거나 이를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하도록 의도된다. 이같은 보존성 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 개시내용의 항체 내로 도입될 수 있다. 소정의 서열의 보존성 변형물은 이러한 서열에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 보존성 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄가 있는 아미노산 잔기로 교체된 것이다. 유사한 측쇄가 있는 아미노산 잔기들의 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄가 있는 아미노산 (예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 따라서, 본 개시내용의 항체의 CDR 영역 내의 1개 이상의 아미노산 잔기가 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있고, 변경된 항체를 본원에 기술된 기능 분석법을 사용하여 기능 (즉, 상기 (i) 및/또는 (ii)에 기재된 성질) 유지에 대해 테스트할 수 있다. 또다른 유형의 아미노산 변형은 잠재적인 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 이러한 잔기들 중 하나 또는 양쪽 모두를 변경시킴으로써 제거하는 것이다. 또다른 예에서, 본 개시내용의 α5β1 항체의 중쇄의 C-말단 라이신이 절단되었고, 따라서 존재하지 않는다. C-말단 라이신 절단은 미리 조작될 수 있거나, 또는 항체 발현 및 정제에 사용된 조건으로부터 초래될 수 있다. 다양한 사례에서, α5β1 항체의 중쇄 및 경쇄는 임의적으로 신호 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 본 개시내용의 항-α5β1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
또다른 양상에서, 본 개시내용은 예시적인 본 개시내용의 α5β1 모노클로날 항체들 중 임의의 것과 동일한 인간 α5β1 상의 에피토프에 결합하는 항체 (즉, α5β1에의 결합에 대해 임의의 본 개시내용의 모노클로날 항체와 교차-경쟁하는 능력이 있는 항체)를 제공한다. 예를 들어, 교차-경쟁 연구를 위한 기준 항체는 모노클로날 항체 22B5 (각각 서열 7 및 8에 제시된 바와 같은 VH 및 VL 서열을 지님), 또는 모노클로날 항체 24C7 (각각 서열 19 및 20에 제시된 바와 같은 VH 및 VL 서열을 지님), 또는 모노클로날 항체 1D9 (각각 서열 29 및 30에 제시된 바와 같은 VH 및 VL 서열을 지님), 또는 모노클로날 항체 2D2 (각각 서열 39 및 40에 제시된 바와 같은 VH 및 VL 서열을 지님)일 수 있다. 이같은 교차-경쟁 항체는 표준 α5β1 결합 분석법에서 22B5, 24C7, 1D9, 또는 2D2와 교차-경쟁하는 능력을 기초로 확인될 수 있다. 예를 들어, 비아코어 분석법, ELISA 분석법 또는 유동 세포측정법이 본 개시내용의 예시적인 항체와의 교차-경쟁을 실연하는데 사용될 수 있다. 인간 α5β1에 대한 예를 들어 22B5, 24C7, 1D9, 또는 2D2의 결합을 억제하는 테스트 항체의 능력은 테스트 항체가 인간 α5β1에의 결합에 대해 22B5, 24C7, 1D9, 또는 2D2와 경쟁할 수 있고, 따라서 22B5, 24C7, 1D9, 또는 2D2와 동일한 인간 α5β1 상의 에피토프에 결합한다는 것을 실연한다. 한 사례에서, 22B5, 24C7, 1D9, 또는 2D2와 동일한 인간 α5β1 상의 에피토프에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 실시예에 예를 들어 기술된 바와 같이 이같은 인간 모노클로날 항체가 제조 및 단리될 수 있다.
조작 및 변형된 항체
본원에 개시된 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상을 갖는 항체를 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로 사용하여 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 추가로 제조할 수 있고, 이러한 변형된 항체는 성질이 출발 항체로부터 변경될 수 있다. 가변 영역들 중 하나 또는 양쪽 모두 (즉, VH 및/또는 VL) 내, 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역 내 및/또는 1개 이상의 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 잔기를 변형시킴으로써 항체를 조작할 수 있다. 추가적으로 또는 별법적으로, 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해, 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 항체를 조작할 수 있다.
수행될 수 있는 한가지 유형의 가변 영역 조작은 CDR 그래프팅(grafting)이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, 개개의 항체들 간에 CDR 내의 아미노산 서열이 CDR 외부의 서열보다 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 성질을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그래프트된 특정 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 천연 발생 항체의 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다 (예를 들어, [Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327]; [Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525]; [Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (퀸(Queen) 등) 참조).
따라서, 본 개시내용의 또다른 양상은 각각 서열 1, 13, 23 및 33, 서열 2, 14, 24 및 34, 및 서열 3, 15, 25 및 35로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열 4, 16, 26 및 36, 서열 5, 17, 27 및 37, 및 서열 6, 18, 28 및 38로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 부분에 관한 것이다. 따라서, 이같은 항체는 모노클로날 항체 22B5, 24C7, 1D9, 및 2D2의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 이러한 항체들과 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.
이같은 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공개된 참고문헌 또는 공공 DNA 데이터베이스로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열을 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 인터넷 상에서 입수가능), 뿐만 아니라 [Kabat, E. A., et al (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]; [Tomlinson, I. M., et al. (1992), J. Mol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox, J. P. L. et al. (1994), Eur. J. Immunol. 24:827-836]에서 발견할 수 있고, 이들 각각의 내용은 거명에 의해 본원에 명백하게 포함된다. 또다른 예로서, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열을 진뱅크 데이터베이스에서 발견할 수 있다. 예를 들어, HCo7 HuMAb 마우스에서 발견된 하기의 중쇄 배선 서열이 괄호 안의 진뱅크 접속 번호에서 입수가능하다: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 3-33 (NG_0010109 및 NT_024637) 및 3-7 (NG_0010109 및 NT_024637). 또다른 예로서, HCo12 HuMAb 마우스에서 발견된 하기의 중쇄 배선 서열이 괄호 안의 진뱅크 접속 번호에서 입수가능하다: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 5-51 (NG_0010109 및 NT_024637), 4-34 (NG_0010109 및 NT_024637), 3-30.3 (X92283), 및 3-23 (AJ406678).
본 개시내용의 항체에서 사용하기 위한 프레임워크 서열에는 선별된 본 개시내용의 항체가 사용하는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것들, 예를 들어, 예시적인 본 개시내용의 모노클로날 항체가 사용하는 VH 4-39 및/또는 VH 3-30.3 프레임워크 서열 및/또는 VK L6 프레임워크 서열과 유사한 것들이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열이 프레임워크 서열이 유래된 배선 면역글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 그래프트될 수 있거나, 또는 CDR 서열이 배선 서열과 비교하여 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상에 그래프트될 수 있다. 예를 들어, 특정 예에서, 항체의 항원 결합 능력을 유지시키거나 강화시키기 위해 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시키는 것이 이롭다는 것이 발견되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (퀸(Queen) 등) 참조).
또다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 이에 의해 관심 항체의 1가지 이상의 결합 성질 (예를 들어, 친화력)을 개선시키는 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발을 수행하여 돌연변이(들)을 도입할 수 있고, 항체 결합 또는 또다른 흥미로운 기능적 성질에 대한 효과를 본원에 기술되고 실시예에서 제공된 시험관내 또는 생체내 분석법에서 평가할 수 있다. 전형적으로, 보존성 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 또한, 전형적으로 CDR 영역 내의 최대 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 잔기가 변경된다.
따라서, 또다른 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열 1, 13, 23 및 33, 및 서열 1, 13, 23 또는 33과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 있는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 서열 2, 14, 24 및 34, 및 서열 2, 14, 24 또는 34와 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 있는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; (c) 서열 3, 15, 25 및 35, 및 서열 3, 15, 25 또는 35와 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 있는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역; (d) 서열 4, 16, 26 및 36, 및 서열 4, 16, 26 또는 36과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 있는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; (e) 서열 5, 17, 27 및 37, 및 서열 5, 17, 27 또는 37과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 있는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및 (f) 서열 6, 18, 28 및 38, 및 서열 6, 18, 28 또는 38과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 있는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역을 포함하는, 단리된 항-α5β1 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
본 개시내용의 조작된 항체는 예를 들어 항체 성질을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형이 이루어진 것들을 포함한다. 전형적으로, 이같은 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한가지 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "역행 돌연변이"시키는 것이다. 더욱 구체적으로, 체세포 돌연변이가 진행된 항체는 항체가 유래된 배선 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이같은 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 이의 배선 구성으로 되돌리기 위해, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해, 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "역행 돌연변이"시킬 수 있다.
또다른 유형의 프레임워크 변형은 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해, 프레임워크 영역 내, 또는 심지어 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 "면역제거(deimmunization)"로 또한 지칭되고, 미국 특허 공보 번호 20030153043 (카(Carr) 등)에 추가로 상세하게 기술되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에 이루어진 변형에 더하여 또는 이에 대해 별법적으로, 전형적으로 항체의 1가지 이상의 기능적 성질, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원 의존적 세포성 세포독성을 변경시키기 위해, 본 개시내용의 항체는 Fc 영역 내의 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 개시내용의 항체는, 또다시 항체의 1가지 이상의 기능적 성질을 변경시키기 위해, 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 모이어티가 항체가 부착될 수 있음), 또는 이의 글리코실화가 변경되도록 변형될 수 있다. 각각의 이러한 양상들이 하기에 추가로 상세하게 기술된다. Fc 영역 내의 잔기의 번호매김은 캐벗의 EU 인덱스의 번호매김이다.
한 사례에서, 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어, 증가되거나 감소되도록 CH1의 힌지 영역이 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (보드머(Bodmer) 등)에 추가로 기술되어 있다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하기 위해 또는 항체의 안정성을 증가시키거나 감소시키기 위해, CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경된다.
또다른 실시양태에서, 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 항체의 Fc 힌지 영역이 돌연변이된다. 더욱 구체적으로, 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실(Staphylococcyl) 단백질 A (SpA) 결합에 비교하여 항체의 SpA 결합이 손상되도록 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 1개 이상의 아미노산 돌연변이가 도입된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (워드(Ward) 등)에 추가로 상세하게 기술되어 있다.
또다른 사례에서, 생물학적 반감기가 증가되도록 항체가 변형된다. 다양한 접근법들이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375 (워드(Ward))에 기술된 바와 같이, T252L, T254S, T256F 중 1개 이상의 돌변변이가 도입될 수 있다. 별법적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (프레스타(Presta) 등)에 기술된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 항체가 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.
또다른 사례에서, 항체의 이펙터 기능(들)이 변경되도록 1개 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 교체함으로써 Fc 영역이 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대한 친화력은 변경되지만 어버이 항체의 항원-결합 능력은 유지하도록 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 1개 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 이에 대한 친화력이 변경되는 이펙터 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (양쪽 모두 윈터(Winter) 등)에 추가로 상세하게 기술되어 있다.
또다른 사례에서, 항체의 C1q 결합이 변경되고/되거나 보체 의존적 세포독성 (CDC)이 감소 또는 폐지되도록 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 1개 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (이두소지(Idusogie) 등)에 추가로 상세하게 기술되어 있다
또다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 1개 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 이에 의해 보체를 고정하는 항체의 능력이 변경된다. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO 94/29351 (보드머(Bodmer) 등)에 추가로 상세하게 기술되어 있다.
또다른 예에서, 하기의 위치에서의 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/시키거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화력을 증가시키기기 위해 Fc 영역이 변형된다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO 00/42072 (프레스타(Presta))에 추가로 기술되어 있다. 또한, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 지도로 작성되었고, 결합이 개선된 변이체들이 기술되어 있다 ([Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특이적 돌연변이가 FcγRIII에의 결합을 개선시키는 것으로 나타났다. 추가적으로, 하기의 조합 돌연변이체가 FcγRIII 결합을 개선시키는 것으로 나타났다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A. 예를 들어, 본원에 기술된 22B5/DLE 항체는 IgG 이소타입의 IgG1 서브클래스를 사용하지만, (야생형 IgG1 서브클래스와 비교하여) 하기의 돌연변이들이 부위-지정 돌연변이유발을 통해 혼입되어 있다: S247D; A338L; 및 I340E. 유사하게, 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 이같은 S247D, A338L, 및 I340E 돌연변이가 24C7, 1D9 및 2D2 모노클로날 항체 내로 도입되었다. 실시예에서 추가로 기술된 바와 같이, 이같은 돌연변이들은 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화력을 증가시킬 수 있고, 따라서 이의 이펙터 기능을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 Fc 영역 내에 1개 이상의 돌연변이를 포함하고, 1개 이상의 돌연변이를 포함하지 않는, 다른 면에서는 동일한 항체보다 ADCC 응답이 검출가능하게 더 큰 항체를 제공한다.
또다른 예에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 탈글리코실화 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 없다). 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화력을 증가시키기 위해, 글리코실화가 변경될 수 있다. 이같은 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열 내의 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거가 초래되는 1개 이상의 아미노산 치환이 이루어져, 이에 의해 이러한 부위에서의 글리코실화가 제거될 수 있다. 이같은 탈글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화력을 증가시킬 수 있다. 이같은 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (코(Co) 등)에 추가로 상세하게 기술되어 있다.
추가적으로 또는 별법적으로, 글리코실화 유형이 변경된 항체, 예컨대 푸코실 잔기의 양이 감소된 저-푸코실화(hypofucosylated) 항체 또는 양분화(bisecting) GlcNac 구조가 증가된 항체가 제조될 수 있다. 이같은 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 증명되었다. 이같은 탄수화물 변형은, 예를 들어, 글리코실화 장치가 변경된 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 글리코실화 장치가 변경된 세포는 당업계에 기술되어 있고, 본 개시내용의 재조합 항체를 발현시켜 이에 의해 글리코실화가 변경된 항체를 생산하기 위한 숙주 세포로 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705, 및 Ms709에는 푸코실트랜스퍼레이스 유전자인 FUT8 (알파 (1,6) 푸코실 트랜스퍼레이스)가 없어서, Ms704, Ms705, 및 Ms709 세포에서 발현된 항체는 이의 탄수화물 상에 푸코스가 없다. 2개의 교체 벡터를 사용하는 CHO/DG44 세포에서의 FUT8 유전자의 표적화된 파괴에 의해 Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 세포주가 생성되었다 (미국 특허 공보 번호 20040110704 (야마네(Yamane) 등) 및 [Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22] 참조). 또다른 예로서, EP 1,176,195 (하나이(Hanai 등)에는 푸코실 트랜스퍼레이스를 코딩하는 FUT8 유전자가 기능적으로 파괴되어, 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거함으로써 이같은 세포주에서 발현된 항체가 저-푸코실화를 나타내는 세포주가 기술되어 있다. 하나이(Hanai) 등은 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하는 효소 활성이 낮거나 이러한 효소 활성이 없는 세포주, 예를 들어 래트 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)을 또한 기술하였다. PCT 공보 WO 03/035835 (프레스타(Presta)에는 푸코스를 Asn(297)-연결 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되어, 이러한 숙주 세포에서 발현된 항체의 저-푸코실화가 또한 초래되는 변이체 CHO 세포주인 Lec13 세포가 기술되어 있다 ([Shields, R.L. et al (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740]를 또한 참조). PCT 공보 WO 99/54342 (우마나(Umana) 등)에는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼레이스 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸클루코스아미닐트랜스퍼레이스 III (GnTIII))을 발현하도록 조작되어, 이러한 조작된 세포주에서 발현된 항체가 증가된 양분화 GlcNac 구조를 나타내고, 이는 항체의 증가된 ADCC 활성을 초래하는 세포주가 기술되어 있다 ([Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180]를 또한 참조). 별법적으로, 푸코시데이스 효소를 사용하여 항체의 푸코스 잔기를 절단할 수 있다. 예를 들어, 푸코시데이스 알파-L-푸코시데이스는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다 ([Tarentino, A. L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23]).
본 개시내용에 의해 구현되는 본원에서의 항체의 또다른 변형은 PEG화이다. 예를 들어, 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해, 항체가 PEG화될 수 있다. 항체를 PEG화시키기 위해, 전형적으로 항체 또는 이의 단편 단편을 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데하이드 유도체와 반응시킨다. 전형적으로, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에서 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화시키기 위해 사용된 임의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하도록 의도된다. 특정 사례에서, PEG화되는 항체는 탈글리코실화 항체이다. 단백질을 PEG화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 개시내용의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (니시무라(Nishimura) 등) 및 EP 0 401 384 (이시카와(Ishikawa) 등) 참조.
항체의 조작 방법
상기 논의된 바와 같이, 본원에 개시된 VH 및 VL 서열을 갖는 항-α5β1 항체를 VH 및/또는 VL 서열, 또는 이에 부착된 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 새로운 항-α5β1 항체를 생성시키는데 사용할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 또다른 양상에서, 본 개시내용의 항-α5β1 항체, 예를 들어 22B5, 24C7, 1D9, 또는 2D2의 구조적 특색을 사용하여, 본 개시내용의 항체의 1가지 이상의 기능적 성질, 예컨대 인간 α5β1에 결합하는 것을 유지하는 구조적으로 관련된 항-α5β1 항체가 생성된다. 예를 들어, 상기 논의된 바와 같이, 22B5, 24C7, 1D9, 또는 2D2의 1개 이상의 CDR 영역, 또는 이의 돌연변이가 재조합에 의해 공지된 프레임워크 영역 및/또는 또다른 CDR과 조합되어 추가적인, 재조합적으로 조작된 본 개시내용의 항-α5β1 항체가 생성될 수 있다. 또다른 유형의 변형에는 이전의 섹션에서 기술된 것들이 포함된다. 조작 방법에 대한 출발 물질은 본원에서 제공된 VH 및/또는 VL 서열들 중 1개 이상, 또는 1개 이상의 이의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성시키기 위해, 본원에서 제공된 VH 및/또는 VL 서열들 중 1개 이상, 또는 1개 이상의 이의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할 (즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 그보다는, 서열(들) 내에 함유된 정보가 원래의 서열(들)로부터 유래된 "제2세대" 서열(들)을 생성시키기 위한 출발 물질로 사용될 수 있고, 그후 "제2세대" 서열(들)이 제조되어 단백질로서 발현된다.
따라서, 또다른 양상에서, 본 개시내용은
(a) (i) 서열 1, 13, 23 및 33으로 구성된 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 2, 14, 24 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열 3, 15, 25 및 35로 구성된 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열 4, 16, 26 및 36으로 구성된 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 5, 17, 27 및 37로 구성된 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열 6, 18, 28 및 38로 구성된 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하는 단계;
(b) 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜, 1개 이상의 변경된 항체 서열을 생성시키는 단계; 및
(c) 이러한 항체 서열을 단백질로 발현시키는 단계
를 포함하는, 항-α5β1 항체의 제조 방법을 제공한다.
표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다.
바람직하게는, 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩되는 항체는
(i) 인간 α5β1에 1×10-7 M 이하의 KD로 결합하는 성질;
(ii) ADCC를 유도할 수 있는 성질
을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 본원에 기술된 항-α5β1 항체의 기능적 성질들 중 하나, 일부 또는 전체를 유지하는 항체이다.
변경된 항체의 기능적 성질을 당업계에서 입수가능하고/하거나 본원에 기술된 표준 분석법, 예컨대 실시예에 기재된 것들 (예를 들어, 유동 세포측정법, 결합 분석법)을 사용하여 평가할 수 있다.
본 개시내용의 항체를 조작하는 방법의 특정 양상에서, 돌연변이가 항-α5β1 항체 코딩 서열의 전체 또는 일부를 따라서 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성된 변형된 항-α5β1 항체를 결합 활성 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 기타 기능적 성질에 대해 스크리닝할 수 있다. 돌연변이 방법이 당업계에 기술되어 있다. 예를 들어, PCT 공보 WO 02/092780 (쇼트(Short))에는 포화 돌연변이유발, 합성 결찰 어셈블리, 또는 이의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성시키고 스크리닝하는 방법이 기술되어 있다. 별법적으로, PCT 공보 WO 03/074679 (라자르(Lazar) 등)에는 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용하여 항체의 생리화학적 성질을 최적화하는 방법이 기술되어 있다.
본 개시내용의 항체를 코딩하는 핵산 분자
본 개시내용의 또다른 양상은 본 개시내용의 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전체 세포 내에 또는 세포 용해물 내에 존재할 수 있거나, 또는 부분적으로 정제되었거나 실질적으로 정제된 형태의 핵산일 수 있다. 핵산은 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 젤 전기영동 및 기타 기술이 포함되는 임의의 적절한 기술에 의해 다른 세포성 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어, 다른 세포성 핵산 또는 단백질로부터 정제된 경우 "단리"되거나 "실질적으로 순수한 것으로 간주"된다. [F. Ausubel, et al, ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York] 참조. 본 개시내용의 핵산은, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 전형적으로, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 개시내용의 핵산을 임의의 적절한 분자 생물학 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 하기에 추가로 기술되는 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체에 대해, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA를 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득할 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득된 항체에 대해 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용), 항체를 코딩하는 핵산을 라이브러리로부터 회수할 수 있다.
본 개시내용의 핵산 분자는, 예를 들어, 22B5 모노클로날 항체의 VH 및 VL 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 22B5의 VH 서열을 코딩하는 DNA 서열이 서열 11에서 제시된다. 22B5의 VL 서열을 코딩하는 DNA 서열이 서열 12에서 제시된다. 또다른 예시적인 본원에 개시된 핵산 분자는 24C7, 1D9, 및 2D2 모노클로날 항체의 VH 및 VL 서열을 코딩하는 핵산 분자들이다. 24C7의 VH 서열을 코딩하는 DNA 서열이 서열 21에서 제시된다. 24C7의 VL 서열을 코딩하는 DNA 서열이 서열 22에서 제시된다. 1D9의 VH 서열을 코딩하는 DNA 서열이 서열 31에서 제시된다. 1D9의 VL 서열을 코딩하는 DNA 서열이 서열 32에서 제시된다. 2D2의 VH 서열을 코딩하는 DNA 서열이 서열 41에서 제시된다. 2D2의 VL 서열을 코딩하는 DNA 서열이 서열 42에서 제시된다.
일단 VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편들이 수득되면, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해, 이러한 DNA 단편들을 임의의 적절한 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작할 수 있다. 이러한 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편이 또다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 이러한 문맥에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결"은 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 인-프레임(in-frame)으로 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결되는 것을 의미하도록 의도된다.
VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA가 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편을 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. IgG1 불변 영역 서열은 상이한 개체들 간에 발생하는 것으로 공지된 다양한 대립유전자 또는 동종이형 중 임의의 것, 예컨대 Gm(1), Gm(2), Gm(3), 및 Gm(17)일 수 있다. 이러한 동종이형들은 IgG1 불변 영역에서의 천연 발생 아미노산 치환을 나타낸다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대해, VH-코딩 DNA가 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA가 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편을 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성시키기 위해, VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결되면서 VH 및 VL 서열이 연속성 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있도록, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편이 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 또다른 단편에 작동가능하게 연결된다 (예를 들어, [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554] 참조).
본 개시내용의 모노클로날 항체의 생산
통상적인 모노클로날 항체 방법, 예를 들어, [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]의 표준 체세포 혼성화 기술이 포함되는 다양한 기술에 의해 본 개시내용의 모노클로날 항체 (mAb)가 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 또다른 기술은, 예를 들어, B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환을 또한 이용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립되어 있는 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술이 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 공지되어 있다.
본 개시내용의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기술된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열을 기초로 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 DNA를 관심 대상인 뮤린 하이브리도마로부터 수득하여, 적절한 분자 생물학 기술을 사용하여 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 조작할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성시키기 위해, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (캐빌리(Cabilly) 등) 참조). 인간화 항체를 생성시키기 위해, 뮤린 CDR 영역을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,539 (윈터(Winter)) 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (퀸(Queen) 등) 참조).
일부 사례에서, 본 개시내용의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. α5β1에 대해 지시된 이같은 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹(transchromosomic) 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스® 및 KM 마우스®로 지칭되는 마우스를 포함하고, 본원에서 "인간 Ig 마우스"로 총괄적으로 지칭된다.
HuMAb 마우스® (Medarex, Inc.)는 내인성 μ 및 κ 사슬 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재정렬되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니유전자좌(minilocus)를 함유한다 (예를 들어, [Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 응답하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 진행되어 고친화력 인간 IgGκ 모노클로날이 생성된다 ([Lonberg, N, et al. (1994) 상기 문헌]; [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93], 및 [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 재검토됨). HuMAb 마우스®의 제조 및 사용, 및 이같은 마우스가 보유하는 게놈 변형이 [Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; [Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5:647-656]; [Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724]; [Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123]; [Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12:821-830]; [Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920]; [Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6:579-591]; 및 [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 추가로 기술되어 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429 (모두 론베르그(Lonberg) 및 케이(Kay)); 미국 특허 번호 5,545,807 (수라니(Surani) 등); PCT 공보 번호 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 론베르그(Lonberg) 및 케이(Kay)); 및 PCT 공보 번호 WO 01/14424 (코르만(Korman) 등) 참조.
또다른 사례에서, 트랜스진 또는 트랜스크로모솜 상에 인간 면역글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 마우스를 사용하여 본 개시내용의 인간 항체가 생성될 수 있다. PCT 공보 WO 02/43478 (이시다(Ishida) 등)에 본원에서 "KM 마우스™"로 지칭되는 이같은 마우스가 상세하게 기술되어 있다.
또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 별법적인 트랜스제닉 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 개시내용의 항-α5β1 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Xenomouse) (Abgenix, Inc.)로 지칭되는 별법적인 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있다; 예를 들어, 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963 (쿠체르라파티(Kucherlapati) 등)에 이같은 마우스가 기술되어 있다.
또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 별법적인 트랜스크로모소믹 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 개시내용의 항-α5β1 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜 양쪽 모두를 보유하는 마우스를 사용할 수 있다; [Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 이같은 마우스가 기술되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 소가 당업계에 기술되어 있고 ([Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894]), 본 개시내용의 항-α5β1 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다.
인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 본 개시내용의 인간 모노클로날 항체를 또한 제조할 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이같은 파지 디스플레이 방법은 당업계에 확립되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (라드너(Ladner) 등); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (다우어(Dower) 등); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (맥카퍼티(McCafferty) 등); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (그리피쓰(Griffiths) 등) 참조.
면역화 시 인간 항체 응답이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 내부로 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 본 개시내용의 인간 모노클로날 항체를 또한 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (윌슨(Wilson) 등)에 이같은 마우스가 기술되어 있다.
인간 Ig 마우스의 면역화
인간 Ig 마우스가 본 개시내용의 인간 항체를 생성시키기 위해 사용되는 경우, [Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474):856-859]; [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]; 및 PCT 공보 WO 98/24884 및 WO 01/14424에 기술된 바와 같이, 이같은 마우스가 α5β1 항원 및/또는 재조합 α5β1, 또는 α5β1 융합 단백질의 정제된 또는 강화된 제제로 면역화될 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 1차 주입 시 6-16주령일 것이다. 예를 들어, α5β1 항원의 정제된 또는 재조합 제제 (5-50 ㎍)가 복강내 주사에 의해 인간 Ig 마우스를 면역화시키는데 사용될 수 있다. 또한, 관련 단백질의 폴리펩티드 단편, 예를 들어, α5 및/또는 β1이 마우스를 면역화시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 단편이 이의 면역원성을 증가시키기 위해 담체 분자에 접합될 수 있다. 이같은 담체 분자는 당업계에 주지되어 있고, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 소 혈청 알부민, 갑상선글로불린, 디프테리아 톡소이드(toxoid), 및 파상풍 톡소이드를 특히 포함한다.
α5β1에 대한 전적으로 인간형인 모노클로날 항체를 생성시키기 위한 상세한 절차가 하기 실시예 1에서 기술된다. 다양한 항원으로의 누적 실험은 먼저 완전 프로인트 애주번트 내의 항원으로 복강내 (IP) 면역화된 후, 격주로 불완전 프로인트 애주번트 내의 항원으로 IP 면역화 (총 6회 이하)되었을 때, 트랜스제닉 마우스가 응답한다는 것을 나타냈다. 그러나, 프로인트 이외의 애주번트 또한 효과적인 것으로 발견된다. 또한, 애주번트의 부재 하의 전체 세포가 고도로 면역원성인 것으로 발견된다. 혈장 샘플을 안와후방 출혈에 의해 수득하면서 면역화 프로토콜의 과정에 걸쳐 면역 응답을 모니터링할 수 있다. 혈장을 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있고 (하기 기술된 바와 같이), 항-α5β1 인간 면역글로불린의 역가가 충분한 마우스가 융합에 사용될 수 있다. 마우스를 희생시켜 지라를 제거하기 3일 전에 정맥내로 항원으로 마우스를 부스팅(boosting)시킬 수 있다. 각각의 면역화에 대해 2-3회 융합이 수행될 필요가 있을 수 있는 것으로 예상된다. 전형적으로 6마리 내지 24마리의 마우스가 각각의 항원에 대해 면역화된다. 일반적으로, HCo7 및 HCo12 품종 양쪽 모두가 사용된다. 또한, HCo7 및 HCo12 트랜스진 양쪽 모두가 2개의 상이한 인간 중쇄 트랜스진 (HCo7/HCo12)을 갖는 단일 마우스 내로 함께 브리딩(breeding)될 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 실시예 1에 기술된 바와 같이, KM 마우스® 품종이 사용될 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본 개시내용의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성시키기 위해, 면역화된 마우스로부터의 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하여, 적합한 무한증식 세포주, 예컨대 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 지라 림프구의 단일 세포 현탁액을 50％ PEG로 1/6개의 P3X63-Ag8.653 비-분비성 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580)에 융합시킬 수 있다. 세포를 약 2×105개로 편평바닥 미량역가 플레이트에 플레이팅한 후, 약 2주 동안 20％ 소 태아 혈청, 18％ "653" 컨디셔닝 배지, 5％ 오리젠 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 유닛/㎖ 페니실린, 50 ㎎/㎖ 스트렙토마이신, 50 ㎎/㎖ 젠타마이신 및 1× HAT (Sigma; HAT은 융합 24시간 후에 첨가된다)를 함유하는 선별 배지에서 인큐베이션한다. 약 2주 후, 세포를 HAT가 HT로 교체된 배지에서 배양할 수 있다. 그후, 개별적인 웰들을 ELISA에 의해 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 발생하면, 일반적으로 10-14일 후에 배지를 관찰할 수 있다. 항체를 분비하는 하이브리도마를 다시 플레이팅하고, 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성이면, 모노클로날 항체를 한계 희석에 의해 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 그후, 안정적인 서브클론을 시험관 내에서 배양하여, 특성화를 위한 조직 배양 배지 내의 소량의 항체를 생성시킬 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선별된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제를 위해 2ℓ 스피너(spinner) 플라스크에서 성장시킬 수 있다. 단백질 A-세파로스 (Pharmacia (Piscataway, N.J.))로의 친화성 크로마토그래피 전에 상등액을 여과 및 농축할 수 있다. 순도를 확실하게 하기 위해, 용출된 IgG를 젤 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 점검할 수 있다. 완충제 용액을 PBS로 교환할 수 있고, 1.43의 흡광 계수를 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하여 -80℃에서 보관할 수 있다.
모노클로날 항체를 생산하는 이입세포의 생성
당업계에 주지된 바와 같이 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 예를 들어 사용하여 숙주 세포 이입세포에서 본 개시내용의 항체를 또한 생산할 수 있다 (예를 들어, [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]).
예를 들어, 항체 또는 이의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분적인 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심 항체를 발현하는 하이브리도마 또는 파지를 이용하는 cDNA 클로닝 또는 PCR 증폭)에 의해 수득할 수 있고, 이러한 DNA를 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이러한 문맥에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이의 의도된 기능을 수행하도록 항체 유전자가 벡터 내로 결찰되는 것을 의미하도록 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 혼화성이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자가 별도의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 또는, 더욱 전형적으로는, 양쪽 유전자가 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 임의의 적절한 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 부위들의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활(blunt) 말단 결찰)에 의해 항체 유전자가 발현 벡터 내로 삽입된다. 원하는 이소타입 및 서브클래스의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하는 발현 벡터 내로 VH 절편이 벡터 내의 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 VK 절편이 벡터 내의 CL 절편에 작동가능하게 연결되도록 본원에 기술된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 삽입함으로써 본원에 기술된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 임의의 항체 이소타입 및 서브클래스의 전장 항체 유전자를 생성시키는데 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 별법적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인-프레임으로 연결되도록 항체 사슬 유전자가 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 더하여, 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. 용어 "조절 서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는, 프로모터, 인핸서(enhancer) 및 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 이같은 조절 서열이, 예를 들어, [Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기술되어 있다. 당업자는 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 디자인이 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 포유류 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열에는 포유류 세포에서의 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)), 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서가 포함된다. 별법적으로, 비-바이러스성 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 추가로, 상이한 공급원들로부터의 서열들, 예컨대 SV40 초기 프로모터로부터의 서열 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복부를 함유하는 SR 프로모터 시스템으로 조절 서열이 구성된다 ([Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472]).
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 추가적인 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기원) 및 선별성 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두 악셀(Axel 등) 참조). 예를 들어, 전형적으로, 선별성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에 약물, 예컨대 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여한다. 선별성 마커 유전자에는 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭으로 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위한 것) 및 neo 유전자 (G418 선별용)가 포함된다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)을 임의의 적절한 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 내로 도입하는데 통상적으로 사용되는 광범위한 기술, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하도록 의도된다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 개시내용의 항체를 발현시키는 것이 가능하지만, 진핵생물 세포, 전형적으로는 포유류 숙주 세포에서의 항체의 발현이 가장 전형적이다.
본 개시내용의 재조합 항체를 발현시키기 위한 포유류 숙주 세포에는, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어, [R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기술된 바와 같이, DHFR 선별성 마커와 함께 사용되는 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기술된 dhfr- CHO 세포 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 특히, NS0 골수종 또는 CHO 세포와 함께 사용하기 위한, 또다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS (글루타민 신쎄테이스) 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 숙주 세포 내에서의 항체의 발현 또는 숙주 세포가 성장된 배양 배지 내로의 항체의 분비를 허용하는데 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체가 생산된다. 임의의 적절한 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 항체를 회수할 수 있다.
항원에 대한 항체 결합의 특성화
본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 α5β1에의 결합에 대해, 예를 들어, 표준 ELISA에 의해 테스트할 수 있다. 간략하게, 미량역가 플레이트를 PBS 내의 0.25 ㎍/㎖의 정제된 α5β1로 코팅한 후, PBS 내의 5％ 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 항체 희석물 (예를 들어, α5β1로 면역화된 마우스로부터의 혈장의 희석물)을 각각의 웰에 첨가하고, 1-2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/트윈(Tween)으로 세정한 후, 알칼리성 포스파테이스에 접합된 2차 시약 (예를 들어, 인간 항체에 대해, 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약)과 함께 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세정 후, 플레이트를 pNPP 기질 (1 ㎎/㎖)로 발색시키고, 405-650의 OD에서 분석하였다. 바람직하게는, 최고의 역가를 나타내는 마우스가 융합에 사용될 것이다.
상기 기술된 바와 같은 ELISA 분석법이 α5β1 면역원과의 양성 반응성을 나타내는 하이브리도마를 스크리닝하는데 또한 사용될 수 있다. α5β1에 높은 결합력(avidity)으로 결합하는 하이브리도마를 서브클로닝하고, 추가로 특성화한다. 어버이 세포의 반응성 (ELISA에 의한 반응성)을 유지하는, 각각의 하이브리도마로부터의 1개의 클론을 -140℃에서 보관되는 5개 내지 10개의 바이알 세포 은행의 제조 및 항체 정제를 위해 선택할 수 있다.
항-α5β1 항체를 정제하기 위해, 선별된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제를 위해 2ℓ 스피너 플라스크에서 성장시킬 수 있다. 단백질 A-세파로스 (Pharmacia (Piscataway, N.J.))로의 친화성 크로마토그래피 전에 상등액을 여과 및 농축할 수 있다. 순도를 확실하게 하기 위해, 용출된 IgG를 젤 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 점검할 수 있다. 완충제 용액을 PBS로 교환할 수 있고, 1.43의 흡광 계수를 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하여 -80℃에서 보관할 수 있다.
추가로, 항체가 결합하는 에피토프를 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 특성화할 수 있다. 이같은 방법은 α5 및/또는 β1의 중첩되는 펩티드 단편들의 어레이를 생산하는 단계 및 다양한 단편에 대한 항체의 결합을 평가하는 단계를 포함한다. 별법적으로, 돌연변이, 예를 들어, 각각의 아미노산이 알라닌 잔기로 교체되는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발이 α5 및/또는 β1 펩티드 내로 도입될 수 있고, 돌연변이체 펩티드에 대한 항체의 결합을 야생형 단백질에 대한 항체의 결합과 비교할 수 있으며, 이에 의해 돌연변이(들)이 결합에 영향을 미치는 부위들이 확인된다. 예를 들어, [Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085] 참조.
선택된 항-α5β1 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 독특한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 각각의 항체를 시판 시약 (Pierce (Rockford, IL))을 사용하여 비오틴화시킬 수 있다. 표지되지 않은 모노클로날 항체 및 비오틴화 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁 연구를 상기 기술된 바와 같이 α5β1이 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다. 비오틴화 mAb 결합을 스트렙타비딘-알칼리성 포스파테이스 프로브로 검출할 수 있다.
정제된 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 특정 이소타입의 항체에 대해 특이적인 시약을 사용하여 이소타입 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 미량역가 플레이트의 웰을 1 ㎍/㎖의 항-인간 면역글로불린으로 하룻밤 동안 4℃에서 코팅할 수 있다. 1％ BSA로의 차단 후, 플레이트를 주위 온도에서 1시간 내지 2시간 동안 1 ㎍/㎖ 이하의 테스트 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조군과 반응시킨다. 그후, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적인, 알칼리성 포스파테이스가 접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 플레이트를 발색시키고 분석한다.
항-α5β1 인간 IgG를 α5β1 항원과의 반응성에 대해 웨스턴 블롯팅에 의해 추가로 테스트할 수 있다. 간략하게, α5β1을 제조하여 소듐 도데실 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 적용할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원들을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 10％ 송아지 태아 혈청으로 차단하고, 테스트될 모노클로날 항체로 프로빙한다. 인간 IgG 결합을 항-인간 IgG 알칼리성 포스파테이스를 사용하여 검출할 수 있고, BCIP/NBT 기질 정제 (Sigma Chem. Co. (St. Louis, Mo.))로 발색시킬 수 있다.
면역접합체
또다른 양상에서, 본 개시내용은 치료 모이어티, 예컨대 세포독소, 약물 (예를 들어, 면역억제제) 또는 방사성독소에 접합된 항-α5β1 항체 또는 이의 단편을 양상으로 한다. 이같은 접합체는 본원에서 "면역접합체"로 지칭된다. 1가지 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제에는 세포에게 해로운 (예를 들어, 세포를 사망시키는) 임의의 작용제가 포함된다. 예로는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신, 및 이들의 유사체 또는 상동체가 포함된다. 치료제에는, 예를 들어, 항대사물질 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신 (기존의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (기존의 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 또한 포함된다.
본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 접합될 수 있는 치료적 세포독소의 또다른 예에는 듀오카르마이신, 칼리키아마이신, 메이탄신 및 오리스타틴, 및 이들의 유도체가 포함된다. 칼리키아마이신 항체 접합체의 예가 시판된다 (Mylotarg™ (Wyeth-Ayerst)).
다양한 링커 기술을 사용하여 세포독소를 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 접합시킬 수 있다. 세포독소를 항체에 접합시키는데 사용된 링커 유형의 예로는 하이드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드-함유 링커가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 리소좀 구획 내의 낮은 pH에 의해 절단되기 쉽거나 또는 프로티에이스, 예컨대 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 프로티에이스 예컨대 카텝신 (예를 들어 카텝신 B, C, D)에 의해 절단되기 쉬운 링커를 선택할 수 있다.
세포독소의 유형, 링커, 및 치료제를 항체에 접합시키는 방법에 관한 추가적인 논의를 위해, [Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215]; [Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337]; [Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212]; [Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763]; [Pastan, I. and Kreitman, R.J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091]; [Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264]를 또한 참조한다.
또한 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 방사성 동위원소에 접합되어, 세포독성 방사성 의약품 (방사성 면역접합체로 또한 지칭됨)이 생성될 수 있다. 진단적으로 또는 치료적으로 사용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예로는 요오드131, 인듐1 11, 이트륨90 및 루테튬177이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 방사성 면역접합체를 제조하는 방법은 당업계에 확립되어 있다. 제발린(Zevalin)™ (IDEC Pharmaceuticals) 및 벡사르(Bexxar)™ (Corixa Pharmaceuticals)가 포함되는 예시적인 방사성 면역접합체가 시판되고, 유사한 방법을 본 개시내용의 항체를 사용하여 방사성 면역접합체를 제조하는데 사용할 수 있다.
본 개시내용의 항체 접합체를 사용하여 소정의 생물학적 응답을 변형시킬 수 있고, 약물 모이어티는 전통적인 화학적 치료제에 한정되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 지니는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이같은 단백질에는, 예를 들어, 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질 예컨대 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 응답 변형제, 예를 들어, 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 기타 성장 인자가 포함될 수 있다.
이같은 치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 주지되어 있고, 예를 들어, [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)], 및 [Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)]를 참조한다.
이중특이적 분자
또다른 양상에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 항-α5β1 항체 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 분자를 양상으로 한다. 본 개시내용의 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 또다른 기능성 분자, 예를 들어 또다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 또다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도체화하거나 이에 연결시켜, 2개 이상의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성시킬 수 있다. 실제로 본 개시내용의 항체를 1개를 초과하는 다른 기능성 분자로 유도체화하거나 이에 연결시켜, 2개를 초과하는 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성시킬 수 있다; 이같은 다중특이적 분자 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 포함되는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 이중특이적 분자를 생성시키기 위해, 본 개시내용의 항체를 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결시켜 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전학적 융합, 비-공유결합 회합 등에 의해), 이중특이적 분자가 초래될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 α5β1에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이성, 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 본 개시내용의 특정 양상에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRI (CD64) 또는 인간 Fcγ 수용체 (CD89)이다. 따라서, 본 개시내용은 FcγR 또는 FcγR를 발현하는 이펙터 세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포 (PMN))와 α5β1를 발현하는 표적 세포 양쪽 모두에 결합할 수 있는 이중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 분자는 α5β1 발현 세포를 이펙터 세포에 표적화시키고, Fc 수용체-매개 이펙터 세포 활성, 예컨대 α5β1 발현 세포의 포식작용, 항체 의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 사이토카인 방출, 또는 과산화물 음이온의 생성을 촉발한다.
이중특이적 분자가 다중특이적인 본 개시 내용의 양상에서, 이러한 분자는 항-Fc 결합 특이성 및 항-α5β1 결합 특이성에 더하여 제3 결합 특이성을 더 포함할 수 있다. 한 사례에서, 제3 결합 특이성은 항-강화 인자 (EF) 부분, 예를 들어, 세포독성 활성에 수반되는 표면 단백질에 결합함으로써 표적 세포에 대한 면역 응답을 증가시키는 분자이다. "항-강화 인자 부분"은 소정의 분자, 예를 들어, 항원 또는 수용체에 결합하고, 이에 의해 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정기의 효과의 강화를 초래하는 항체, 기능성 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. "항-강화 인자 부분"은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원과 결합할 수 있다. 별법적으로, 항-강화 인자 부분은 제1 및 제2 결합 특이성이 결합하는 본체와 상이한 본체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-강화 인자 부분은 세포독성 T-세포와 결합할 수 있다 (예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 표적 세포에 대한 면역 반응의 증가를 초래하는 기타 면역 세포를 통해).
한 사례에서, 본 개시내용의 이중특이적 분자는 결합 특이성으로서 하나 이상의 항체 또는 이의 항체 단편 (예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv 포함)을 포함한다. 또한 항체는 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 이의 임의의 최소 단편 예컨대 Fv 또는 미국 특허 번호 4,946,778 (라드너(Ladner) 등)에 기술된 바와 같은 단일쇄 구축물일 수 있다.
한 사례에서, Fcγ 수용체에 대한 결합 특이성이 모노클로날 항체에 의해 제공되고, 이의 결합은 인간 면역글로불린 G (IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본원에 사용된 용어 "IgG 수용체"는 1번 염색체 상에 위치한 8개의 γ-사슬 유전자 중 임의의 것을 지칭한다. 이러한 유전자들은 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), 및 FcγRIII (CD16)의 3가지 Fcγ 수용체 클래스로 분류되는 총 12개의 막횡단 또는 가용성 수용체 이소형을 코딩한다. 한 사례에서, Fcγ 수용체는 인간 고친화력 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 단량체성 IgG에 대해 높은 친화력 (108 내지 109 M-1)을 나타내는 72 kDa의 분자이다.
특정 항-Fcγ 모노클로날 항체의 생산 및 특성화가 PCT 공보 WO 88/00052 (판저(Fanger) 등) 및 미국 특허 번호 4,954,617에 기술되어 있다. 이러한 항체들은 수용체의 Fcγ 결합 부위와 별개인 부위에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프에 결합하고, 따라서 이들의 결합이 생리학적 수준의 IgG에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 개시내용에서 유용한 특정한 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32를 생산하는 하이브리도마는 <American Type Culture Collection>으로부터 ATCC 접속 번호 HB9469로 입수 가능하다. 또다른 사례에서, 항-Fcγ 수용체 항체는 모노클로날 항체 22의 인간화 형태 (H22)이다. H22 항체의 생산 및 특성화가 [Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002] 및 PCT 공보 WO 94/10332에 기술되어 있다. H22 항체를 생산하는 세포주가 <American Type Culture Collection>에 명칭 HA022CL1로 기탁되었고, 접속 번호는 CRL 11177이다.
또다른 사례에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성이 인간 IgA 수용체, 예를 들어, Fc-알파 수용체 (FcαRI (CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되고, 이의 결합은 전형적으로 인간 면역글로불린 A (IgA)에 의해 차단되지 않는다. 용어 "IgA 수용체"는 19번 염색체 상에 위치한 한 α-유전자의 유전자 생성물 (FcαRI)을 포함하도록 의도된다. 이러한 유전자는 별법적으로 스플라이싱된 55 내지 110 kDa의 여러 막횡단 이소형을 코딩하는 것으로 공지되어 있다. FcαRI (CD89)은 단핵구/대식세포, 호산성 및 호중성 과립구 상에서 구성적으로 발현되지만, 비-이펙터 세포 집단 상에서는 그렇지 않다. FcαRI은 IgA1 및 IgA2 양쪽 모두에 대해 친화력이 중간 정도이고 (약 5 × 107 M-1), 이러한 친화력은 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 사이토카인에의 노출시 증가된다 ([Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 116:423-440)]. IgA 리간드 결합 도메인의 외부에서 FcαRI와 결합하는, A3, A59, A62 및 A77로 확인된 4개의 FcαRI-특이적 모노클로날 항체가 기술되어 있다 ([Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764]).
FcαRI 및 FcγRI는 본 개시내용의 이중특이적 분자에서 사용하기 위한 예시적인 촉발(trigger) 수용체인데, 이는 이들이 (1) 주로 면역 이펙터 세포, 예를 들어 단핵구, PMN, 대식세포 및 수지상 세포 상에서 발현되고; (2) 높은 수준으로 발현되며 (예를 들어, 세포당 5,000 내지 100,000개); (3) 세포독성 활성 (예를 들어, ADCC, 포식작용)의 매개물이고; (4) 이들에 표적화된 항원 (자가 항원 포함)의 강화된 항원 제시를 매개하기 때문이다.
인간 모노클로날 항체가 바람직하지만, 본 개시내용의 이중특이적 분자에서 사용될 수 있는 또다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
임의의 적절한 방법을 사용하여, 구성성 결합 특이성, 예를 들어 항-FcR 및 항-α5β1 결합 특이성을 접합시킴으로써 본 개시내용의 이중특이적 분자를 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이성이 별도로 생성된 후, 서로 접합될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링제 또는 가교제가 공유결합성 접합에 사용될 수 있다. 가교제의 예로는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)가 포함된다 (예를 들어, [Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686]; [Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 기타 방법에는 [Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132]; [Brennan et al. (1985) Science 229:81-83] 및 [Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기술된 것들이 포함된다. 적절한 접합제에는 SATA 및 술포-SMCC (양쪽 모두 피어스 케미칼 코포레이션(Pierce Chemical Co.) (Rockford, IL)로부터 입수가능)가 포함된다.
결합 특이성이 항체들인 경우, 이들을 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합에 의해 접합시킬 수 있다. 한 사례에서, 접합 전에, 힌지 영역이 홀수개의 술프히드릴 잔기, 예를 들어 1개의 잔기를 함유하도록 변형된다.
별법적으로, 양쪽 모두의 결합 특이성이 동일한 벡터 내에 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 분자가 mAb × mAb, mAb × Fab, Fab × F(ab')2 또는 리간드 × Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 개시내용의 이중특이적 분자는 1개의 단일쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 2개 이상의 단일쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자의 제조 방법이, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기술되어 있다.
이중특이적 분자가 이의 특이적 표적에 결합하는 것을, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 방사성 면역분석법 (RIA), FACS 분석법, 생물학적 분석법 (예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 확인할 수 있다. 일반적으로 각각의 이러한 분석법들은 특정 관심 대상인 단백질-항체 복합체의 존재를 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)를 사용함으로써 검출한다. 예를 들어, 항체-FcR 복합체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 효소-결합 항체 또는 항체 단편을 예를 들어 사용하여 FcR-항체 복합체를 검출할 수 있다. 별법적으로, 임의의 다양한 기타 면역분석법을 사용하여 복합체를 검출할 수 있다. 예를 들어, 항체를 방사성으로 표지하여 방사성 면역분석법 (RIA)에서 사용할 수 있다 (예를 들어, [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986] 참조). γ 계수기 또는 섬광 계수기를 사용하는 것과 같은 수단에 의해, 또는 자가방사선술에 의해 방사성 동위원소를 검출할 수 있다.
제약 조성물
또다른 양상에서, 본 개시내용은 제약상 허용되는 담체와 함께 제형된, 본 개시내용의 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분(들) 중 1가지 또는 이들의 조합물을 함유하는 조성물, 예를 들어, 제약 조성물을 제공한다. 이같은 조성물은 본 개시내용의 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 1가지 또는 이들의 조합물 (예를 들어, 2가지 이상의 상이한 본 개시내용의 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자의 조합물)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 제약 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프들에 결합하거나 상보적인 활성을 갖는 항체들 (또는 면역접합체들 또는 이중특이적 분자들)의 조합물을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물은 조합 치료법에서 또한 투여될 수 있고, 즉 다른 작용제와 조합될 수 있다. 예를 들어, 조합 치료법은 1가지 이상의 다른 항-염증제 또는 면역억제제와 조합된 본 개시내용의 항-α5β1 항체를 포함할 수 있다. 조합 치료법에서 사용될 수 있는 치료제의 예는 본 개시내용의 항체의 사용에 대한 섹션에서 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
본원에서 사용된 "제약상 허용되는 담체"에는 생리학적으로 혼화성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항균 및 항진균 작용제, 등장화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 전형적으로, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 투여)에 적절하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이의 항원 결합 부분, 면역접합체 또는 이중특이적 분자는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 기타 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 천연 형태 (쯔비터 이온 형태 포함)로, 또는 양성 또는 음성 전하를 띠는 종으로 존재할 수 있다. 일부 사례에서, 제약상 허용가능함 염을 형성하도록 항체가 카운터이온과 복합체를 형성할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 제약 화합물은 하나 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다.
"제약상 허용되는 염"은 어버이 화합물 (예를 들어 ,항체)의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 원치 않는 독물학적 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, [Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 예를 들어, 용어 "제약상 허용되는 염"은 하나 이상의 항체 및 하나 이상의 카운터이온을 포함하는 복합체를 포함하고, 이때 카운터이온은 제약상 허용되는 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유래된다.
이같은 염의 예로는 산 부가염 및 염기 부가염이 포함된다. 산 부가염에는 비-독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 인 등, 뿐만 아니라 비-독성 유기 산 예컨대 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐-치환 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것들이 포함된다. 염기 부가염에는 알칼리토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등, 뿐만 아니라 비-독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것들이 포함된다.
또한, 제약상 허용되는 무기 염기에는 금속성 이온이 포함된다. 금속성 이온에는 적합한 알칼리금속 염, 알칼리토금속 염 및 기타 생리학적으로 허용되는 금속 이온이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 무기 염기로부터 유래된 염에는 일반적인 원자가의 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 코발트, 니켈, 몰리브덴, 바나듐, 망간, 크롬, 셀레늄, 주석, 구리, 제2철, 제1철, 리튬, 마그네슘, 망간 염, 제1망간, 칼륨, 루비듐, 나트륨, 및 아연이 포함된다.
본 개시내용의 항체의 제약상 허용되는 산 부가염은 하기의 산이 비제한적으로 포함되는 산으로부터 제조될 수 있다: 포름산, 아세트산, 아세트아미도벤조산, 아디프산, 아스코르브산, 붕산, 프로피온산, 벤조산, 캄포르산, 탄산, 사이클람산, 디하이드로콜산, 말론산, 에데트산, 에틸황산, 펜디조산, 메타인산, 숙신산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 말산, 타르타르산, 탄닌산, 시트르산, 질산, 아스코르브산, 글루쿠론산, 말레산, 엽산, 푸마르산, 프로피온산, 피루브산, 아스파르트산, 글루탐산, 벤조산, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 라이신, 이소시트르산, 트리플루오로아세트산, 파모산, 프로피온산, 안트라닐산, 메실산, 오로트산, 옥살산, 옥살아세트산, 올레산, 스테아르산, 살리실산, 아미노살리실산, 실리케이트, p-하이드록시벤조산, 니코틴산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산, 술폰산, 메탄술폰산, 인산, 포스폰산, 에탄술폰산, 에탄디술폰산, 암모늄, 벤젠술폰산, 판토텐산, 나프탈렌술폰산, 톨루엔술폰산, 2-하이드록시에탄술폰산, 술파닐산, 황산, 질산, 아질산, 황산 모노메틸 에스테르, 사이클로헥실아미노술폰산, β-하이드록시부티르산, 글리신, 글리실글리신, 글루탐산, 카코딜레이트, 디아미노헥산산, 캄포르술폰산, 글루콘산, 티오시안산, 옥소글루타르산, 피리독살 5-포스페이트, 클로로페녹시아세트산, 운데칸산, N-아세틸-L-아스파르트산, 갈락타르산 및 갈락투론산.
제약상 허용되는 유기 염기에는 트리메틸아민, 디에틸아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디벤질아민, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루민 (N-메틸글루카민), 프로카인, 고리형 아민, 4차 암모늄 양이온, 아르기닌, 베타인, 카페인, 클레미졸, 2-에틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄디아민, 부틸아민, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸모르폴린, N-에틸피페리딘, 에틸글루카민, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 하이드라바민, 이미다졸, 이소프로필아민, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피리딘, 피리독신, 네오디뮴, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, 메틸아민, 타우린, 콜레이트, 6-아미노-2-메틸-2-헵타놀, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올, 2-아미노-2-메틸-1-프로파놀, 지방족 모노- 및 디카복실산, 페닐-치환 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 및 방향족 술폰산, 스트론튬, 트리신, 하이드라진, 페닐사이클로헥실아민, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산, 비스(2-하이드록시에틸)아미노-트리스(하이드록시메틸)메탄, N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산, 1,4-피페라진디에탄술폰산, 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판술폰산, 1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]프로판, 4-모르폴린프로판술폰산, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산, 2-[(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)아미노]에탄술폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산, 4-(N-모르폴리노)부탄술폰산, 3-(N,N-비스[2-하이드록시에틸]아미노)-2-하이드록시프로판술폰산, 2-하이드록시-3-[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-1-프로판술폰산, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-(2-하이드록시프로판술폰산), 피페라진-1,4-비스(2-하이드록시프로판술폰산) 2수화물, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판술폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄술폰산), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판술폰산, N-트리스(하이드록시메틸)메틸-4-아미노부탄술폰산, N-(1,1-디메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판술폰산, 2-(사이클로헥실아미노)에탄술폰산, 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판술폰산, 3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판술폰산, N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산, 4-(사이클로헥실아미노)-1-부탄술폰산, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신, 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올, 및 트로메타몰이 포함된다
본 개시내용의 제약 조성물은 제약상 허용되는 항산화제를 또한 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등이 포함된다.
본 개시내용의 제약 조성물에서 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비-수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적절한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트가 포함된다. 예를 들어, 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해, 적절한 유동성이 유지될 수 있다.
이러한 조성물들은 보조제 예컨대 방부제, 습윤화제, 유화제 및 분산제를 또한 함유할 수 있다. 멸균 절차 (상기), 및 다양한 항균 및 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함 양쪽 모두에 의해 미생물 존재의 방지가 보증될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 작용제 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함함으로써 주사용 제약 제형의 장기(長期) 흡수가 이루어질 수 있다.
제약상 허용되는 담체에는 무균성 수성 용액 또는 분산액, 및 무균성 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균성 분말이 포함된다. 제약상 활성인 물질에 대한 이같은 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비혼화성이지 않는 한, 본 개시내용의 제약 조성물에서의 이의 사용이 구현된다. 추가적인 활성 화합물이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 제작 및 보관 조건 하에 무균성이고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적절한 기타 정돈된 구조물로서 제형될 수 있다. 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물을 예를 들어 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 코팅물 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해, 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 주사용 조성물의 장기 흡수가 이루어질 수 있다.
무균성 주사 용액은 원하는 양의 활성 화합물을, 필요하다면 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께, 적절한 용매 내에 혼입시킨 후, 멸균 미세여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 무균성 비히클 내로 혼입시킴으로써 분산액이 제조된다. 무균성 주사 용액의 제조를 위한 무균성 분말의 경우, 제조 방법은 이전의 무균성-여과 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말이 산출되는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
단일 투약 제형이 생산되도록 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상, 및 특정 투여 방식에 좌우될 것이다. 일반적으로, 단일 투약 제형이 생산되도록 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료 효과를 일으키는 조성물의 양이다. 일반적으로, 100％ 중에서, 이러한 양은 제약상 허용되는 담체와 조합된 약 0.01％ 내지 약 99％의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1％ 내지 약 70％, 가장 바람직하게는 약 1％ 내지 약 30％의 활성 성분의 범위일 것이다.
최적의 원하는 응답 (예를 들어, 치료적 응답)을 제공하도록 투여량 처방계획이 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 수회의 분할 용량이 경시적으로 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 요건에 의해 지시되는 바와 같이 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 비경구 조성물을 제형하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 투여량 단위 형태는 치료될 대상에 대한 단위 투여량으로 적절한 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다; 각각의 단위는 필요한 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 일으키도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 개시내용의 투여량 단위 형태에 대한 상세사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성하려는 특정 치료 효과, 및 (b) 개체에서의 민감성의 치료를 위해 이같은 활성 화합물을 조제하는 분야에 고유한 제한사항에 의해 지시되고, 이에 직접적으로 의존적이다.
항체의 투여를 위해, 투여량은 수용자 체중 1 ㎏ 당 약 0.0001 내지 100 ㎎, 더욱 일반적으로는 0.01 내지 5 ㎎ 범위이다. 예를 들어, 투여량은 체중 1 ㎏ 당 0.3 ㎎, 체중 1 ㎏ 당 1 ㎎, 체중 1 ㎏ 당 3 ㎎, 체중 1 ㎏ 당 5 ㎎, 또는 체중 1 ㎏ 당 10 ㎎일 수 있거나, 또는 체중 1 ㎏ 당 1-10 ㎎의 범위일 수 있다. 예시적인 치료 처방계획은 1주일에 1번, 2주일에 1번, 3주일에 1번, 4주일에 1번, 1개월에 1번, 3개월에 1번 또는 3개월 내지 6개월에 1번 투여하는 것을 수반한다. 본 개시내용의 항-α5β1 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 대한 투여량 처방계획은, 예를 들어, 정맥내 투여를 통한 체중 1 ㎏ 당 1 ㎎ 또는 체중 1 ㎏ 당 3 ㎎을 포함하고, 이때 항체는 (i) 6회의 투여량에 대해 4주에 1번에 이어서 3개월에 1번; (ii) 3주에 1번; (iii) 체중 1 ㎏ 당 3 ㎎을 1회 투여한 후 체중 1 ㎏ 당 1 ㎎을 3주에 1번 투여하는 투약 계획 중 하나를 사용하여 제공된다.
일부 방법에서, 결합 특이성이 상이한 2가지 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되고, 이러한 경우 투여되는 각각의 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 속한다. 항체는 일반적으로 여러번 투여된다. 단일 투여량들 간의 간격은, 예를 들어, 1주일, 1개월, 3개월, 또는 1년일 수 있다. 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 간격이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 약 1-1000 ㎍/㎖의 혈장 항체 농도를 달성하도록 투여량이 조정되고, 일부 경우에는 약 25-300 ㎍/㎖이다.
별법적으로, 항체는 지속 방출형 제형으로 투여될 수 있고, 이러한 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자 내에서의 항체의 반감기에 따라 변한다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비-인간 항체가 뒤를 잇는다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치유적인지 여부에 따라 변할 수 있다. 예방 용도에서는, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 남은 여생 동안 계속 치료를 받는다. 치유 용도에서는, 질환의 진행이 감소 또는 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 완화를 나타낼 때까지 비교적 짧은 간격의 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그후, 환자에게 예방 요법을 투여할 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이지 않으면서, 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대한 원하는 치료 응답을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 특정한 본 개시내용의 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용될 특정 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 사용된 특정 화합물과 조합되어 사용된 또다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 병력, 및 의학 분야에 주지된 유사한 인자가 포함되는 다양한 약동학적 인자에 좌우될 것이다.
바람직하게는, "치료적 유효 투여량"의 본 개시내용의 항-α5β1 항체는 질환 증상의 중증도에서의 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 기간에서의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지를 초래할 수 있다. 예를 들어, α5β1-양성 종양의 치료에 대해, "치료적 유효 투여량"은 세포 성장 또는 종양 성장을 치료되지 않은 대상에 비해 바람직하게는 약 20％ 이상만큼, 더욱 바람직하게는 약 40％ 이상만큼, 더욱더 바람직하게는 약 60％이상만큼, 더더욱 바람직하게는 약 80％ 이상만큼 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력을 인간 종양에서의 효능을 예보하는 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 별법적으로, 조성물의 이러한 성질을 당업자에게 공지된 분석법에 의해 화합물의 억제 능력, 예컨대 시험관내 억제를 시험함으로써 평가할 수 있다. 치료적 유효량의 치료 화합물은 종양 크기를 감소시킬 수 있거나, 또는 다른 방식으로 대상에서의 증상을 완화시킬 수 있다. 당업자는 대상의 크기, 대상의 증상의 중증도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자들을 기초로 이같은 양을 결정할 수 있을 것이다.
본 개시내용의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법들 중 1가지 이상을 사용하는 1가지 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 변할 것이다. 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 대한 투여 경로에는, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한, 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 기타 비경구 투여 경로가 포함된다. 본원에서 사용된 구절 "비경구 투여"는 일반적으로 주사에 의한, 장 및 국소 투여를 제외한 투여 방식을 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수강내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 비제한적으로 포함한다.
별법적으로, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 비경구 경로가 아닌 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어, 비내, 경구, 질내, 직장내, 설하 또는 국소 투여에 의해 투여될 수 있다.
이식물, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템이 포함되는 제어 방출 제형과 같이, 급속한 방출에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께 활성 화합물이 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물(polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이같은 제형의 제조를 위한 다수의 방법이 특허를 받았거나 또는 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조.
당업계에 공지된 의료 장치로 치료 조성물이 투여될 수 있다. 예를 들어, 무침 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치로 본 개시내용의 치료 조성물이 투여될 수 있다. 본 개시내용에서 유용한 주지된 이식물 및 모듈의 예로는 의약을 제어된 속도로 분배하기 위한 이식성 마이크로-주입 펌프가 개시된 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료 장치가 개시된 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프가 개시된 미국 특허 번호 4,447,233; 연속적인 약물 전달을 위한 가변성 유동식의 이식성 주입 기구가 개시된 미국 특허 번호 4,447,224; 다중-챔버 구획이 있는 삼투압 약물 전달 시스템이 개시된 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투압 약물 전달 시스템이 개시된 미국 특허 번호 4,475,196이 포함된다. 다수의 또다른 이같은 이식물, 전달 시스템, 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.
특정 사례에서, 생체 내에서의 적절한 분포를 확실히 하도록 본 개시내용의 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제형될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 다수의 고도로 친수성인 화합물들을 배제한다. 본 개시내용의 치료 화합물이 BBB를 가로지르는 것을 확실히 하기 위해 (원하는 경우), 예를 들어, 리포솜 내에 이를 제형할 수 있다. 리포솜의 제작 방법에 대해, 예를 들어, 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포솜은 특정 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되는 1가지 이상의 모이어티를 포함할 수 있고, 따라서 표적화된 약물 전달을 강화시킨다 (예를 들어, [V.V. Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 대표적인 표적화 모이어티에는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어, 미국 특허 5,416,016 (로우(Low) 등) 참조); 만노시드 ([Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]); 항체 ([P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140]; [M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 ([Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134]); p120 ([Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090])이 포함된다; [K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123]; [J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 또한 참조한다.
본 개시내용의 용도 및 방법
본 개시내용의 항체, 특히 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 α5β1 매개 장애의 진단 및 치료를 수반하는 다수의 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이러한 분자들은 다양한 장애의 치료, 예방 및 진단을 위해 시험관내 또는 생체외의 배양물 내의 세포에게, 또는 인간 대상에게, 예를 들어, 생체 내로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "대상"은 인간 및 비-인간 동물을 포함하도록 의도된다. 비-인간 동물에는 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류, 및 파충류가 포함된다. 바람직한 대상에는 α5β1 활성에 의해 매개되는 장애가 있는 인간 환자가 포함된다. 이 방법은 비정상적인 α5β1 발현과 관련된 장애가 있는 인간 환자를 치료하는데 특히 적절하다. α5β1에 대한 항체가 또다른 작용제와 함께 투여되는 경우, 이들은 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다.
α5β1에 대한 본 개시내용의 항체의 특이적 결합을 고려하여, 본 개시내용의 항체는 세포 표면 상에서의 α5β1 발현을 특이적으로 검출하는데 사용될 수 있고, 더욱이 면역친화성 정제를 통해 α5β1을 정제하는데 사용될 수 있다.
또한, 다양한 종양 세포 상에서의 α5β1의 발현 (예를 들어, 실시예 6, 도 7 참조), 및 혈관형성에서의 수반을 고려하여, 본 개시내용의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 중피종, 간-담도 (간 및 담관), 원발성 또는 속발성 CNS 종양, 원발성 또는 속발성 뇌 종양, 폐암 (NSCLC 및 SCLC), 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 난소암, 결장암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 위장 (위, 결장직장 및 십이지장), 유방암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 음문 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연질 조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 고환암, 만성 또는 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 비-호지킨 림프종, 척추 종양, 뇌간교종, 뇌하수체 선종, 부신피질암, 담낭암, 다발성 골수종, 담관 암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 조합이 예를 들어 포함되는, 비정상적인 세포 성장, 예를 들어, α5β1을 발현하는 종양 세포의 존재를 특징으로 하는 장애가 있는 대상을 치료하는데 사용될 수 있다.
한 사례에서, 본 개시내용의 항체 (예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물) 또는 이의 항원 결합 부분은 α5β1의 수준, 또는 막 표면에 α5β1을 함유하는 세포의 수준을 검출하는데 사용될 수 있고, 그후 이러한 수준이 특정 질환 증상에 연결될 수 있다. 별법적으로, 항체는 α5β1 기능을 억제 또는 차단하는데 사용될 수 있고, 차례로 이는 특정 질환 증상의 방지 또는 완화에 연결될 수 있어, α5β1을 질환의 매개물로서 관련시킨다. 이는 항체와 α5β1 간의 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에 샘플 및 대조군 샘플을 항-α5β1 항체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 항체와 α5β1 간에 형성된 임의의 복합체를 검출하고, 샘플 및 대조군에서 비교한다.
또다른 사례에서, 본 개시내용의 항체 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물) 또는 이의 항원 결합 부분이 시험관 내에서의 치료 또는 진단 용도와 관련된 결합 활성에 대해 먼저 테스트될 수 있다. 예를 들어, 하기의 실시예에 기술된 유동 세포측정 분석법을 사용하여 본 개시내용의 조성물을 테스트할 수 있다.
본 개시내용의 항체 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자, 면역접합체 및 조성물) 또는 이의 항원 결합 부분은 α5β1-관련 질환의 치료법 및 진단에서의 추가적인 유용성을 갖는다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 면역접합체가 생체 내에서 또는 시험관 내에서 하기의 생물학적 활성들 중 하나 이상을 도출하는데 사용될 수 있다: α5β1을 발현하는 세포의 성장을 억제하고/하거나 이러한 세포를 사망시킴; 인간 이펙터 세포의 존재 하에 α5β1을 발현하는 세포의 포식작용 또는 ADCC를 매개함, 또는 α5β1에 대한 α5β1 리간드 결합을 차단함.
특정 사례에서, 항체 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물) 또는 이의 항원 결합 부분은 다양한 α5β1-관련 질환의 치료, 예방 또는 진단을 위해 생체 내에서 사용된다. α5β1-관련 질환의 예로는 비정상적인 세포 성장, 예컨대 암이 특히 포함된다. 한 실시양태에서, 비정상적인 세포 성장은 중피종, 간-담도 (간 및 담관), 원발성 또는 속발성 CNS 종양, 원발성 또는 속발성 뇌 종양, 폐암 (NSCLC 및 SCLC), 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 난소암, 결장암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 위장 (위, 결장직장 및 십이지장), 유방암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 음문 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연질 조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 고환암, 만성 또는 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 비-호지킨 림프종, 척추 종양, 뇌간교종, 뇌하수체 선종, 부신피질암, 담낭암, 다발성 골수종, 담관 암종, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 암이다.
생체 내 및 시험관 내에서의 본 개시 내용의 항체 조성물 (예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체) 또는 이의 항원 결합 부분의 적절한 투여 경로는 당업계에 주지되어 있고, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물이 주사 (예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사)에 의해 투여될 수 있다. 사용된 분자의 적절한 투여량은 대상의 연령 및 체중 및 항체 조성물의 농도 및/또는 제형에 좌우될 것이다.
앞서 기술된 바와 같이, 본 개시내용의 인간 항-α5β1 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 하나 이상의 다른 치료제, 예를 들어, 세포독성제, 방사성 독성제 또는 면역억제제와 공동-투여될 수 있다. 항체는 이러한 작용제들에 연결될 수 있거나 (면역복합체로서), 또는 이러한 작용제와 분리되어 투여될 수 있다. 후자의 경우 (분리 투여), 항체는 작용제 전에, 작용제 후에, 또는 작용제와 동시에 투여될 수 있거나, 또는 또다른 공지된 요법, 예를 들어, 항암 요법, 예를 들어, 방사선과 공동-투여될 수 있다. 이같은 치료제에는 단독으로는 환자에게 독성 또는 준독성인 수준에서만 효과적인 항신생물제 예컨대 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴, 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 및 시클로포스파미드, 하이드록시우레아가 특히 포함된다. 시스플라틴은 4주마다 한번씩 100 ㎎/용량으로 정맥내 투여될 수 있고, 아드리아마이신은 21일마다 한번씩 60 내지 75 ㎎/㎖ 용량으로 정맥내 투여된다. 본 개시내용의 인간 항-α5β1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 화학요법제의 공동투여는 인간 종양 세포에 대한 세포독성 효과를 일으키는 상이한 메커니즘으로 작동하는 2가지 항암제를 제공한다. 이같은 공동투여는 종양 세포를 항체와 비반응성이도록 하는 종양 세포의 항원성에서의 변화 또는 약물에 대한 저항성의 발달로 인한 문제점들을 해결할 수 있다.
본 개시내용의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)에 연결된 표적-특이적 이펙터 세포, 예를 들어, 이펙터 세포가 치료제로서 또한 사용될 수 있다. 표적화를 위한 이펙터 세포는 인간 백혈구 예컨대 대식세포, 호중구 또는 단핵구일 수 있다. 또다른 세포에는 호산구, 천연 킬러 세포 및 기타 IgG- 또는 IgA-수용체 보유 세포가 포함된다. 원한다면, 치료될 대상으로부터 이펙터 세포를 수득할 수 있다. 생리적으로 허용되는 용액 내의 세포의 현탁액으로서 표적-특이적 이펙터 세포가 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 개수는 약 108개 내지 109개이지만, 치료 목적에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 표적 세포, 예를 들어, α5β1을 발현하는 종양 세포에서의 국소화를 수득하기에, 그리고 세포 사멸 (예를 들어, 포식작용에 의해)을 일으키기에 충분할 것이다. 투여 경로 또한 변할 수 있다.
표적-특이적 이펙터 세포로의 요법이 표적화된 세포의 제거를 위한 또다른 기술과 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및/또는 이러한 조성물로 무장된 이펙터 세포를 사용하는 항-종양 요법이 화학요법과 함께 사용될 수 있다. 추가적으로, 2개의 별개의 세포독성 이펙터 집단이 종양 세포 거부에 대해 지시되도록 조합 면역요법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마 RI 또는 항-CD3에 연결된 항-α5β1 항체가 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 함께 사용될 수 있다.
본 개시내용의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 이펙터 세포 상의 FcγR 또는 FcγR 수준을, 예컨대 세포 표면 상의 수용체의 캡핑(capping) 및 제거에 의해, 조정하는데 또한 사용될 수 있다. 항-Fc 수용체들의 혼합물이 이러한 목적에 또한 사용될 수 있다.
보체 결합 부위, 예컨대 보체에 결합하는 IgG1, -2, 또는 -3 또는 IgM으로부터의 일부분이 있는 본 개시내용의 조성물 (예를 들어, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)이 보체의 존재 하에 또한 사용될 수 있다. 한 사례에서, 표적 세포를 포함하는 세포들의 집단을 본 개시내용의 결합제 및 적합한 이펙터 세포로 생체외 처리하는 것이 보체 또는 보체를 함유하는 혈청의 첨가에 의해 보충될 수 있다. 본 개시내용의 결합제로 코팅된 표적 세포의 포식작용이 보체 단백질의 결합에 의해 개선될 수 있다. 또다른 사례에서, 본 개시내용의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포가 보체에 의해 또한 용해될 수 있다. 또다른 사례에서, 본 개시내용의 조성물은 보체를 활성화시키지 않는다.
본 개시내용의 조성물 (예를 들어, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)은 보체와 함께 투여될 수 있다. 따라서, 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물이 본 개시내용의 범주 내에 속한다. 이러한 조성물은 보체가 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자에 근접하여 위치한다는 점에서 유리하다. 별법적으로, 본 개시내용의 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자와 보체 또는 혈청이 분리되어 투여될 수 있다.
본 개시내용의 항체 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자, 또는 면역접합체) 및 사용설명서를 포함하는 키트 또한 본 개시내용의 범주 내이다. 키트는 하나 이상의 추가적인 시약, 예컨대 면역억제 시약, 세포독성제 또는 방사성 독성제, 또는 하나 이상의 추가적인 본 개시내용의 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분 (예를 들어, 제1 인간 항체와 별개의 α5β1 항원 상의 에피토프에 결합하는 상보적인 활성이 있는 인간 항체)를 추가로 함유할 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 항체 조성물로 처치된 환자에게 또다른 치료제, 예컨데 세포독성제 또는 방사성 독성제를 추가적으로 투여할 수 있고 (본 개시내용의 인간 항체의 투여 전에, 이의 투여와 동시에 또는 이의 투여 후에), 이는 인간 항체의 치료 효과를 강화하거나 증대시킨다.
또다른 사례에서, 예를 들어, 대상을 사이토카인으로 처치함으로써, Fcγ 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조정하는, 예를 들어 강화 또는 억제하는 작용제로 추가적으로 대상을 처치할 수 있다. 다중특이적 분자로의 처치 동안 투여하기 위한 사이토카인에는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ), 및 종양 괴사 인자 (TNF)가 포함된다.
본 개시내용의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)는 FcγR 또는 α5β1을 발현하는 세포를 표적화하는데, 예를 들어, 이같은 세포를 표지시키기 위해 또한 사용될 수 있다. 이같은 용도를 위해, 검출될 수 있는 분자에 결합제가 연결될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 Fc 수용체, 예컨대 FcγR, 또는 α5β1을 발현하는 세포를 생체외에서 또는 시험관 내에서 국소화시키는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는, 예를 들어, 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자일 수 있다.
특정 사례에서, 본 개시내용은 샘플 및 대조군 샘플과 α5β1에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 이러한 항체 또는 이의 일부분과 α5β1 간의 복합체 형성을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플 내의 α5β1 항원의 존재를 검출하거나 α5β1 항원의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 그후, 복합체의 형성을 검출하고, 이때 대조군 샘플과 비교하여 샘플 간의 상이한 복합체 형성은 샘플 내의 α5β1의 존재를 가리킨다.
또다른 사례에서, 본 개시내용은 대상에게 상기 기술된 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 투여함으로써 대상에서의 α5β1 매개 장애, 예를 들어. 비정상적인 세포 성장 예컨대 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이같은 항체 및 이의 유도체는 특정 장애와 관련된 α5β1 유도 활성, 예를 들어, 혈관형성, 증식 및 분화를 억제하는데 사용된다. 항체를 α5β1과 접촉시킴으로써 (예를 들어, 항체를 대상에게 투여함으로써), 이같은 활성들을 유도하는 α5β1의 능력이 억제되고, 따라서 관련된 장애가 치료된다. 항체 조성물은 α5β1 매개 질환을 치료 또는 예방하기 위해 항체 조성물과 함께 또는 상승작용적으로 작용하는 또다른 치료제, 예컨대 세포독성제 또는 방사성 독성제와 함께 또는 단독으로 투여될 수 있다..
또다른 사례에서, 본 개시내용의 면역접합체는 화합물 (예를 들어, 치료제, 표지, 세포독소, 방사성독소, 면역억제제 등)을 항체에 연결시킴으로써 이같은 화합물을 α5β1 세포 표면 수용체가 있는 세포에 표적화하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 α5β1을 발현하는 세포를 (예를 들어, 검출가능한 표지, 예컨대 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자로) 생체외에서 또는 생체내에서 국소화하는 방법을 또한 제공한다. 별법적으로, 세포독소 또는 방사성독소를 α5β1에 표적화함으로써 α5β1 세포 표면 수용체가 있는 세포를 사망시키는데 면역접합체가 사용될 수 있다.
추가적인 제한으로 해석되지 않아야 하는 하기의 실시예들에 의해 본 개시내용이 추가로 설명된다. 본 개시내용 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 거명에 의해 전문이 본원에 명확하게 포함된다.
실시예
실시예 1 : 항-α5β1 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
예시적인 본 개시내용에 따른 항체를 하기와 같이 제조하고, 선별하고, 분석하였다:
면역화 및 하이브리도마 생성:
하기의 면역원들이 하이브리도마 생성에 사용되었다: 정제된 재조합 인간 인테그린-α5 단백질-Fc; 인테그린-α5-His (R&D Systems; 주문 제작); 인간 α5를 발현하도록 형질감염된 NIH3T3 세포; 천연적으로 인간 인테그린 α5β1을 발현하는 저캣(Jurkat) 세포주, U-937 세포주 (ATCC 카탈로그 번호 CRL-1593) 및 K-562 세포주 (ATCC 카탈로그 번호 CCL-243).
정제된 재조합 인간 인테그린-α5 단백질-Fc는 293-프리스타일(FreeStyle) 시스템 (Invitrogen)을 사용하여 pSecTag2 벡터 내로 클로닝되고 발현된 래트 Fc 도메인에 융합된 인간 인테그린 α5의 세포외 도메인 (아미노산 42-995)의 키메라 구축물이다. 인간 α5를 발현하도록 형질감염된 NIH3T3 세포는 하기와 같이 생산되었다. 전장 인간 인테그린 α5 cDNA (Invitrogen; 카탈로그 번호 FL1002, 클론 ID:3629647)를 전장 인간 인테그린 α5 MGC 클론 (Invitrogen)으로부터 클로닝하고, 레트로바이러스 발현 벡터 (pBabe) 내로 서브클로닝하였다. 바이러스 입자가 생성되었고, 이를 사용하여 NIH3T3 세포 (ATCC 카탈로그 번호 CRL-1658)를 감염시켰다. 푸로마이신을 첨가하여, 안정적인 양성 세포 클론을 선별하였다. 인간 α5 단백질 발현의 웨스턴 블롯 및 FACS 분석을 수행하여, 고도로 발현된 안정적인 세포 클론을 채집하였다.
인간 Ig 트랜스제닉 마우스 품종 Hco7/Hco12, 뿐만 아니라 인간 트랜스크로모소멀/트랜스제닉 품종 KM (Medarex, Inc.)를 사용하여 인간 인테그린 α5β1에 대한 전적으로 인간형인 모노클로날 항체를 제조하였다. 이러한 품종들은 모두 인간으로부터 단리된 항체와 구별할 수 없는 전적으로 인간형인 항체를 발현한다. 이러한 마우스 품종에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자가 [Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820]에 기술된 바와 같이 동종접합에 의해 파괴되었고, 내인성 마우스 중쇄 유전자가 PCT 공보 WO 01/09187의 실시예 1에 기술된 바와 같이 동종접합에 의해 파괴되었다. 각각의 이러한 마우스 품종들은 [Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 기술된 바와 같은 인간 카파 경쇄 트랜스진인 KCo5를 보유한다. HCo7 품종은 미국 특허 번호 5,545,806; 5,625,825; 및 5,545,807에 기술된 바와 같은 HCo7 인간 중쇄 트랜스진을 보유한다. HCo12 품종은 PCT 공보 WO 01/09187의 실시예 2에 기술된 바와 같은 HCo12 인간 중쇄 트랜스진을 보유한다. HCo7/HCo12 품종은 HCo7 및 HCo12 중쇄 트랜스진 양쪽 모두를 보유한다. KM 품종은 [Ishida et al., (2002), Cloning and Stem Cells, 4:91-102]에 기술된 바와 같은 인간 미니-염색체를 보유한다.
α5β1에 대한 전적으로 인간형인 인간 모노클로날 항체를 생성시키기 위해, Hco7/Hco12 및 KM 품종의 HuMab 마우스를 재조합 인간 인테그린-α5 단백질-Fc 또는 인테그린-α5-His, 인간 α5를 발현하도록 형질감염된 NIH3T3 세포, 및 천연적으로 인간 α5β1을 발현하는 저캣 세포주, U-937 세포주 및 K-562 세포주로 면역화시켰다. [Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859]; [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851] 및 PCT 공보 WO 98/24884에 HuMab 마우스에 대한 일반적인 면역화 계획이 기술되어 있다. 마우스들은 항원의 1차 주입시 6-16주령이었다. 인간 인테그린-α5 단백질-Fc 또는 인테그린-α5- his 항원 (15-20 ㎍)의 정제된 재조합 제제, 형질감염된 NIIT3T3 또는 저캣 세포, U-937 세포 및 K-562 세포 (1×107개의 세포)의 제제를 사용하여, 복강내 (IP) 및 피하 (Sc) 주사에 의해 HuMab 마우스를 면역화시켰다.
트랜스제닉 마우스를 1-4주 간격으로 복강내 및 피하 주사에 의해 리비(Ribi) 애주번트 내의 항원으로 면역화시켰다 (총 16회까지의 면역화). 안와후방 출혈에 의해 수득한 혈액에서 면역 응답을 모니터링하였다. FACS (하기에 기술됨)에 의해 혈청을 스크리닝하고, 항-α5β1 인간 면역글로불린의 역가가 충분한 마우스를 융합에 사용하였다. 희생시켜 지라 및/또는 림프절을 제거하기 3일전 및 2일 전에 항원으로 마우스를 부스팅시켰다. 전형적으로, 각각의 항원에 대해 10-20회의 융합을 수행하였다. 총 60마리의 Hco7/Hco12 및 KM 마우스를 면역화시켰다. 각각의 항원에 대해 수십마리의 마우스를 면역화시켰다.
항-α5β1 항체를 생산하는 HuMab 마우스의 선별:
α5β1에 결합하는 항체를 생산하는 HuMab 마우스를 선별하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 혈청을 전장 인간 α5β1을 발현하는 세포주에는 결합하지만 α5β1을 발현하지 않는 대조군 세포주에는 결합하지 않는 것에 대해 유동 세포측정법 (FACS)에 의해 스크리닝하였다. 간략하게, α5-발현 NIH3T3 세포를 1:20으로 희석된 면역화된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 세포들을 세정하고, 특이적 항체 결합을 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. FACS 유동 세포측정법 기구 (Becton Dickinson (San Jose, CA)) 상에서 유동 세포측정 분석을 수행하였다. 가장 높은 역가의 항-α5β1 항체가 발달된 마우스를 융합에 사용하였다. 하기에 기술된 바와 같이 융합을 수행하였고, 하이브리도마 상등액을 FACS에 의해 항-α5β1 활성에 대해 테스트하였다.
α5β1에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성:
HuMab 마우스로부터 단리된 마우스 비장세포 및/또는 림프절 림프구를 전기융합 (E-융합, 사이토 펄스(Cyto Pulse)™ 기술; Cyto Pulse™ Sciences, Inc. (Glen Burnie, MD))을 사용하여 마우스 골수종 세포주 Sp2/0 (ATCC, CRL-1581, Manassas, VA)에 제조사가 권장하는 프로토콜을 사용하여 융합시켰다. 간략하게, 면역화된 마우스로부터의 지라 및/또는 림프절 림프구의 단일 세포 현탁액을 E-융합을 사용하여 동일한 개수의 Sp2/0 비-분비형 마우스 골수종 세포에 융합시켰다. 세포를 2×104개의 비장세포/웰로 편평 바닥 미량역가 플레이트에 플레이팅하고, 10일 내지 14일 동안 10％ 소 태아 혈청, 10％ P388D1 (ATCC, CRL-TIB-63) 컨디셔닝 배지, DMEM (Mediatech (Herndon, VA); 카탈로그 번호 CRL 10013, 고농도의 글루코스, L-글루타민 및 피루브산나트륨) 내의 3-5％ (IGEN), 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 ㎎/㎖ 젠타마이신 및 1× HAT (Sigma, 카탈로그 번호 CRL-P-7185)를 함유하는 선별 배지에서 인큐베이션하였다. 1-2주 후, HAT가 HT로 교체된 배지에서 세포를 배양하였다. 세포를 플레이팅하고 나서 약 10-14일 후, 개별적인 웰로부터의 상등액을 인간 감마, 카파 항체를 함유하였는지 여부에 대해 1차로 스크리닝하였다. 이어서, 인간 감마, 카파에 대해 양성으로 채점된 상등액을 FACS (상기 기술됨)에 의해 인간 항-α5β1에 대해 스크리닝하였다.
모노클로날 IgG 항체:
항체를 분비하는 하이브리도마를 24웰 플레이트로 옮기고, 다시 스크리닝하고, 인간 항-α5β1 IgG 모노클로날 항체에 대해 양성으로 확인되면, 한계 희석에 의해 2회 이상 서브클로닝하였다. 그후, 안정적인 서브클론을 시험관내에서 배양하여, 추가적인 특성화를 위한 조직 배양 배지 내의 소량의 항체가 생성되었다. 상기 기술된 절차들을 사용하여, 본원에 기술된 "22B5", "24C7", "1D9", 및 "2D2"로 지정된 항체들이 포함되는 여러 항-α5β1 모노클로날 항체를 생산하였다.
실시예 2 : 인간 모노클로날 항체 22B5의 구조적 특성화
22B5 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA 서열을 22B5 하이브리도마로부터 표준 PCR 기술을 사용하여 수득하였고, 표준 DNA 서열분석 기술을 사용하여 서열을 분석하였다.
22B5의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 1a 및 1b 및 서열 11 및 7에서 제시된다. 22B5의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 1c 및 1d 및 서열 12 및 8에서 제시된다.
원래의 22B5 분자의 서브클래스는 IgG4였다. FcγR 결합 및 이펙터 기능, 예컨대 ADCC를 제공하도록 IgG 서브클래스를 IgG1로 전환시켰다. FcγR에 대한 결합 및 이펙터 기능 활성을 추가로 증가시키기 위해 3개의 돌연변이가 부위-지정 돌연변이유발에 의해 IgG1 불변 영역 내로 도입되었다 (S247D, A338L, 및 I340E). IgG1 서브클래스이고 이러한 3개의 돌연변이를 함유하는 22B5가 "22B5/DLE" 또는 "22B5 IgG1 DLE"로 지칭된다. 면역원성을 최소화하기 위해 중쇄 가변 도메인의 2개의 돌연변이가 배선으로 역행되었다 (I30S 및 N33S). 경쇄 가변 서열에서는 돌연변이가 발견되지 않았다. 22B5/DLE의 중쇄가 서열 9에서 제시되고, 22B5/DLE의 경쇄가 서열 10에서 제시된다.
22B5 중쇄 면역글로불린 서열과 공지된 인간 배선 면역글로불린 중쇄 서열의 비교는 22B5 중쇄가 인간 배선 VH 4-39로부터의 VH 절편, 인간 배선 3-10으로부터의 D 절편, 및 인간 배선 JH 6b로부터의 JH 절편을 사용함을 나타냈다. 22B5 VH 서열과 배선 VH 4-39 서열의 정렬이 도 2에서 제시된다. CDR 영역 결정을 위한 캐벗 시스템을 사용한 22B5 VH 서열의 추가적인 분석으로 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역이 도 1b, 및 각각 서열 1, 2 및 3에 제시된 바와 같이 서술되었다.
22B5 경쇄 면역글로불린 서열과 공지된 인간 배선 면역글로불린 경쇄 서열의 비교는 22B5 경쇄가 인간 배선 VK L6으로부터의 VL 절편 및 인간 배선 JK 4로부터의 JK 절편을 사용함을 나타냈다. 22B5 VL 서열과 배선 VK L6 서열의 정렬이 도 2에서 제시된다. CDR 영역 결정을 위한 캐벗 시스템을 사용한 22B5 VL 서열의 추가적인 분석으로 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역이 도 1d, 및 각각 서열 4, 5 및 6에 제시된 바와 같이 서술되었다.
실시예 3 : 인간 모노클로날 항체 22B5의 결합 특이성 및 결합 동역학의 특성화
본 실시예에서, IgG1 DLE 돌연변이가 있는 22B5 인간 항-α5β1 항체 (22B5/DLE)의 결합 친화력 및 결합 동역학을 비아코어 분석에 의해 시험하였다. 또한, 결합 특이성을 유동 세포측정법 (FACS)에 의해 시험하였다.
결합 친화력 및 동역학
α5β1의 세포외 도메인에 대한 22B5/DLE의 결합 동역학 및 공칭 결합력을 비아코어 분석 (Biacore AB (Uppsala, Sweden))을 사용하여 결정하였다. 비아코어 동역학 분석을 수행하기 위해, 22B5/DLE 항체를 바이오센서 칩 상에 고정하고, 다양한 농도의 인간 재조합 α5β1 세포외 도메인을 25.0℃에서 표면을 가로질러 유동시켰다 (도 3 참조). 기준선 상승(drift)과 함께 간단한 일-대-일 결합 모델에 결합 데이터가 포괄적으로 피팅(fitting)되었다. 22B5/DLE는 α5β1에 가역적으로 결합한다. 인간 재조합 α5β1 세포외 도메인에 대한 결합 상수 (KD)는 2.7 내지 4.1 nM 범위였다. 인테그린의 양이온-의존적 활성화와 일관되게, 2가 양이온의 부재 하에 측정했을 때 KD가 더 컸다. 동역학 결합 파라메터는 온-속도에 대해 3.4×10-5 내지 4.5×10-5 M-1S-1, 오프 속도에 대해 1.2×10-3 내지 1.4×10-3 s-1 범위였다 (도 3 및 표 1 참조).
공칭 결합력 측정을 수득하기 위해, 인간 재조합 α5β1 세포외 도메인을 바이오센서 칩 상에 고정하고, 다양한 농도의 22B5/DLE를 25.0℃에서 표면을 가로질러 유동시켰다. 공칭 결합력 값이 20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005 ％ P20 + 4.0 mM MgCl2에서 0.05 pM인 것으로 추정되었다.
Figure pct00002
FACS 에 의한 α5β1에 대한 세포 친화력 결정
내인성 인간 인테그린 α5β1 발현 세포 (HUVEC)를 사용하여, 22B5/DLE 항체를 세포 표면 인테그린 α5에 대한 이의 결합 친화력에 대해 FACS 분석법을 이용하여 테스트하였다. 간략하게, 세포를 트립신-EDTA를 사용하여 박리시키고, 저온 PBS로 세정하였다. 96웰 플레이트 내로 분취한 후, 세포를 혈청으로 차단하고, 여러 농도의 특이적 mAb와 함께 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세정하고, R-PE 형광단과 접합된 항-인간 κ 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, 팩스캘리버(FACSCalibur) 유동 세포측정기를 사용하여 분석하였다. 어떠한 게이팅(gating)도 적용하지 않으면서 각각의 샘플에 대해 10,000개의 이벤트를 수집하였다. KD 결정을 위해, 각각의 샘플 막대 그래프의 기하 평균을 계산하고, mAb 농도의 함수로 플롯팅하였다. 2-상(two-state) 평형 모델에의 피팅 후 KD가 계산되었다. 22B5/DLE는 HUVEC에서 내인성 α5β1에 2.15 nM (n=4)의 KD로 결합한다 (도 4 참조).
실시예 4 : 비아코어에 의한 Fc γ 수용체에 대한 친화력
IgG1 DLE 삼중 돌연변이를 함유하는 22B5/DLE (앞서 실시예 2에 논의됨)의 FcγR에의 결합을 강화하는 능력을 비아코어 결합 실험에서 평가하였다. 22B5/DLE의 FcγR 결합 친화력을 야생형 (wt) IgG1의 결합 친화력과 비교하였다. 테스트된 3가지 클래스의 FcγR는 하기와 같았다: 1) 고-친화력 수용체 FcγRI; 2) 저-친화력 수용체의 2개의 다형성 변이체 FcγRIIa/131H 및 FcγRIIa/131R; 및 3) 중-친화력 수용체의 2개의 다형성 변이체 FcγRIIIa/158F 및 FcγRIIIa/158V. 결과 (도 5에 제시되고, 표 2에서 요약됨)는 고-친화력 수용체 FcγRI에 대한 약 6배 증가를 나타냈다. 중-친화력 수용체 FcγRIII/158F 및 158V에의 결합에 대해 각각 122배 및 70배 강화가 관찰되었다. 22B5/DLE와 야생형 IgG1의 결합 친화력 비교가 뮤린 Fcγ 수용체에 대해 또한 평가되었다. 결합에서의 최고의 강화는 mFcγRIV에 대해서였고, mFcγRI 및 mFcγRIII이 뒤를 이었다 (도 5 참조).
Figure pct00003
실시예 5 : 22B5/ DLE 의 세포 기능적 활성
세포 부착 차단
인테그린 α5β1-매개 세포 부착을 중단시키는 22B5/DLE의 능력을 테스트하였다. HUVEC 세포를 항체 (22B5/DLE, 22B5 IgG1, IgG2 및 IgG4 서브클래스 변이체, 또는 음성 대조군 mAb (BHA2 IgG1))와 함께 예비 인큐베이션한 후, 피브로넥틴 (FN) 또는 콜라겐으로 코팅된 플레이트에 플레이팅함으로써 세포 부착 분석법을 수행하였다. HUVEC 세포 (15,000개)를 부착 완충제(글루코스 및 소 혈청 알부민을 함유하는 헤페스(Hepes)-완충 염 용액) 내의 항체와 20분 동안 실온에서 혼합하였다. 세포를 피브로넥틴 또는 콜라겐으로 코팅된 96웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 37℃/5％ CO2에서 플레이트에 부착되도록 하였다. 각각의 웰을 3회 세정함으로써 비-부착성 세포를 제거하였다. 각각의 웰에 잔존하는 부착성 세포의 양을 측정하였다. CyQUANT GR 염료를 함유하는 완충제를 첨가함으로써 부착성 세포를 용해시키고, 플레이트 판독기로 Ex/Em: 485/535 nm에서 형광을 측정하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 기능-차단 인테그린 α5β1 mAb가 피브로넥틴에 대한 HUVEC 부착을 선택적으로 억제하지만, 콜라겐에 대해서는 그렇지 않다 (음성 대조군). 도 6에 나타난 바와 같이, 22B5/DLE 및 이의 서브클래스 변이체 (야생형 IgG1, IgG1 DLE, IgG2, 및 IgG4)에 대한 IC50이 이러한 1시간 분석법에서 유사하였다. 이러한 데이터는 항체와 α5 및/또는 α5β1의 결합이 인테그린과 피브로넥틴의 결합을 억제한다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 α5β1이 세포의 표면 상에서 발현되는 경우에 항체가 α5β1에 결합한다는 것을 추가로 가리킨다. 즉, 항체가 인식하는 에피토프가 α5 및 β1 사슬이 회합되는 경우에 이용가능하고, 인테그린이 세포 표면 상에 발현되는 경우에 에피토프가 결합에 대해 이용가능하다.
실시예 6 : 시험관내 ADCC 이펙터 기능
표준 방법을 사용하여 α5β1-양성 표적 세포에 대해 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMC)의 존재 하에 ADCC 분석법을 통해 이펙터 기능 활성을 평가하였다. 광범위한 세포주에 걸친 인테그린 α5 발현 수준을 하기와 같이 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정하였다. 세포를 프로티에이스 (Roche) 및 포스파테이스 억제제 (Calbiochem)를 함유하는 RIPA 용해 완충제 (Upstate)에서 용해시켰다. 용해물 (각각 총 단백질 3 ㎍)을 SDS-PAGE 젤 상에서 전기영동하고, 항-인테그린 α5 항체로 면역블롯팅(immunoblotting)하였다. 면역반응성 밴드를 확인하고, 오디세이 인프라레드 이미징 시스템(Odyssey Infrared Imaging System) (LI-COR Bioscience)으로 분석하였다. 발현 범위의 예가 도 7에서 제시된다.
ADCC를 측정하기 위해, 표준 방법에 따라 샌디에고 혈액 은행 샘플로부터 피콜(Ficoll) 구배 원심분리를 사용하여 이펙터 세포 (PBMC)를 단리하였다. 10,000개의 표적 세포 (HUVEC 또는 종양 계통)를 성장 배지에서 항체와 함께 실온에서 20분 동안 예비-인큐베이션한 후, 백만개의 인간 PBMC (E:T=100:1)를 첨가하고, 혼합물을 37℃/5％ CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 표준 프로토콜에 따라, ADCC 매개 세포 용해를 락테이트 탈수소효소 (LDH) 방출 검출 (Roche) 또는 톡시라이트 바이오어세이 키트(ToxiLight BioAssay Kit) (Cambrex)를 사용하여 측정하였다.
22B5/DLE는 wt 22B5 IgG1에 대한 0.23 nM과 비교하여 0.04 nM의 EC50으로 종양 또는 내피-발현 인테그린 α5β1에 결합하고 ADCC (80％까지의 표적 세포 용해)를 촉진한다. 이러한 데이터는 DLE 돌연변이가 야생형 IgG1과 비교하여 ADCC 활성을 강화하였음을 가리킨다. 4시간 분석법에서 22B5 IgG2 또는 22B5 IgG4에 대해서는 ADCC가 관찰되지 않았다. KLH IgG1이 음성 대조군 mAb로 사용되었다. HUVEC 및 대표적인 종양 세포주 (U87MG)에서의 ADCC의 예가 도 8에서 제시된다 (양쪽 모두의 검출 방법을 나타냄).
도 9에 제공된 데이타에 나타난 바와 같이, 22B5/DLE 및 wt 22B5 IgG1에 의해 유도된 세포성 세포독성은 세포주에 의한 α5β1 발현 수준과 상관된다. α5β1이 가장 높게 발현된 세포 (패널 A, U87MG)가 가장 높은 수준의 독성을 나타냈고, 중도로 발현된 세포주 (도 9, Hs578T 및 3T3,a5)는 중등도의 세포독성을 나타냈다. 특히, 22B5/DLE은 낮은 수준의 α5β1을 발현한 M24met 세포 (도 9의 아래쪽 패널 내의 예)에서 ADCC 효과를 강화시켰다. 이러한 데이터는 ADCC가, 적어도 부분적으로, 세포에 의해 발현된 α5β1과의 항체 결합에 의해 매개된다는 것을 나타낸다.
실시예 7 : 생체내 항-전이 효능
내피 및 종양 세포에서의 프로(pro)-증식, 프로-이동 및 프로-생존 활성에 더하여, 인테그린 α5β1은 종양 세포 혈관외유출 및 원위 기관으로의 이동을 촉진함으로써 종양 전이에서 또한 연루된다. 하기의 연구는 전임상(preclinical) 모델에서의 22B5/DLE의 항-전이 효능을 실연하는 것을 목표로 하였다.
폐에 대한 실험적 A549- Luc 전이의 억제
A549-Luc는 루시퍼레이스 유전자로 형질감염된 인간 비-소세포 폐암 (NSCLC) 세포주이다. 정맥내 이식되는 경우, 바람직하게는 이러한 세포주는 폐 내에 국소화되고, 생체발광 영상화 (BLI)에 의해 이를 측정할 수 있다. 본 연구에서, 주사 이틀 전에 관련 항체가 예비 투약된 SCID BALB/c 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 A549-Luc 세포를 주사하였다 (3×106개/동물). 이식 후, 제8주까지 1주일에 1회씩 동물에게 투약하였다. 개별적인 동물들의 생체발광을 제20주까지 1주일에 1회씩 측정하였다.
22B5/DLE는 우수한 항-종양 전이 효능을 나타냈고, 이때 제8주 (최종적으로 투약한 주)에 TGI (종양 성장 억제)가 97％이었으며, 이는 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하였다 (p<0.01). 이러한 모델에서 ADCC를 매개할 것으로 예상되지 않는 22B5 IgG2로의 투약 또한 제8주에 89％의 유의한 TGI를 달성하였다 (도 10a). 제5주, 제6주, 제7주, 및 제8주의 22B5/DLE와 22B5 IgG2 간의 비교의 p 값은 각각 0.07, 0.03, 0.08 및 0.17이었다. 제8주 후에는 모든 처치를 정지하는 한편, 불리한 생리학적 징후에 대해 매일 모니터링하는 것 및 동물을 BLI에 의해 매주 측정하는 것은 계속하였다.
22B5/DLE로 처치된 군에서의 종양은 제13주까지 여전히 억제된 한편, 22B5 IgG2로 처치된 군에서의 종양은 투약을 중단하고 나서 약 2주 후에 급속히 증가하기 시작하였다 (도 10b). 종양 BLI가 1×108개의 광자/초에 도달하면 연구 종점에 도달한 것으로 간주하였고, 이 시점에 마우스를 희생시켰다. 카플란-마이어 플롯 (도 10c)은 22B5/DLE가 동물의 중앙 생존 시간을 22B5 IgG2로 처치된 동물에 대한 14주 및 대조군 동물에 대한 10주와 비교하여 20주로 유의하게 연장시켰음을 나타낸다.
이러한 데이터는 이러한 모델에서, 22B5의 항-종양 효과가 ADCC에 의해 배타적으로 매개되지 않는다는 것을 나타낸다. 즉, 인간 IgG2가 이펙터 기능 (세포성 세포독성 포함)을 매개하는 것으로 공지되지 않았음에도 불구하고 22B5-IgG2가 종양 성장/침습을 억제하였고, 항체가 항-종양 효과를 매개하였다. 또한, 데이터는 22B5-IgG1-DLE의 투여가 중단된 후에 종양 성장이 여전히 억제되었음을 나타냈다. 이러한 데이터들은 FN과의 α5β1 결합을 차단하는 것이 항-종양 효과를 매개하고 (22B5-IgG2), 이러한 효과가 ADCC에 의해 추가로 강화된다 (22B5-IgG1/DLE)는 것을 나타낸다.
실시예 8 : 인간 모노클로날 24 C7 , 1 D9 , 및 2 D2 의 구조적 특성화
24C7, 1D9, 및 2D2 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA 서열을 (각각) 24C7, 1D9, 및 2D2 하이브리도마로부터 표준 PCR 기술을 사용하여 수득하였고, 표준 DNA 서열분석 기술을 사용하여 서열을 분석하였다.
24C7의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 1e 및 1f 및 서열 21 및 19에서 제시된다. 24C7의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 1g 및 1h 및 서열 22 및 20에서 제시된다.
1D9의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 1i 및 1j 및 서열 31 및 29에서 제시된다. 1D9의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 1k 및 1l 및 서열 32 및 30에서 제시된다.
2D2의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 1m 및 1n 및 서열 41 및 39에서 제시된다. 1D9의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 각각 도 1o 및 1p 및 서열 42 및 40에서 제시된다.
원래의 24C7, 1D9, 및 2D2 분자의 서브클래스는 IgG1이었다. IgG1 서브클래스에 대해, FcγR에의 결합 및 이펙터 기능 활성을 추가로 증가시키기 위해 3개의 돌연변이가 부위-지정 돌연변이유발에 의해 IgG1 불변 영역 내로 도입되었다 (S247D, A338L, 및 I340E). 따라서, IgG1 서브클래스이고 이러한 3개의 돌연변이를 함유하는 24C7이 "24C7/DLE" 또는 "24C7 IgG1 DLE"로 지칭된다. 유사하게, 이러한 3개의 돌연변이를 함유하는 유사 항체가 본원에서 "1D9/DLE" 또는 "1D9 IgG1 DLE", 및 "2D2/DLE" 또는 "2D2 IgG1 DLE"로 지칭된다. 유사하게, 2개의 돌연변이 S247D 및 I340E이 있는 항체가 본원에서 "DE" 돌연변이체, 예를 들어 "24C7/DE", 또는 "24C7 IgG1 DE"로 지칭된다. 상기 언급된 돌연변이들 중 임의의 1개, 2개 또는 3개가 있는 본원에 기술된 항체들 중 임의의 것에 대한 유사한 명칭이 유사한 방식으로 지칭된다. 예를 들어, "1D9/DE"는 Fc 영역 내에 S247D 및 I340E 돌연변이가 있는 IgG1 서브클래스의 본원에 기술된 1D9 항체를 지칭한다. 유사하게, "2D2/L"은 IgG1 이소타입이고 A338L 돌연변이를 함유하는 본원에 기술된 2D2 항체를 지칭할 것이다.
24C7 중쇄 면역글로불린 서열과 공지된 인간 배선 면역글로불린 중쇄 서열의 비교는 24C7 중쇄가 인간 배선 VH 3-30.3로부터의 VH 절편, 인간 배선 7-27로부터의 D 절편, 및 인간 배선 JH 6b로부터의 JH 절편을 사용함을 나타냈다. CDR 영역 결정을 위한 캐벗 시스템을 사용한 24C7 VH 서열의 분석으로 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역이 도 1f, 및 각각 서열 13, 14 및 15에 제시된 바와 같이 서술되었다.
24C7 경쇄 면역글로불린 서열과 공지된 인간 배선 면역글로불린 경쇄 서열의 비교는 24C7 경쇄가 인간 배선 VK L6으로부터의 VL 절편 및 인간 배선 JK 2로부터의 JK 절편을 사용함을 나타냈다. CDR 영역 결정을 위한 캐벗 시스템을 사용한 24C7 VL 서열의 분석으로 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역이 도 1h, 및 각각 서열 16, 17 및 18에 제시된 바와 같이 서술되었다.
1D9 중쇄 면역글로불린 서열과 공지된 인간 배선 면역글로불린 중쇄 서열의 비교는 1D9 중쇄가 인간 배선 VH 3-30.3로부터의 VH 절편, 및 인간 배선 JH 6b로부터의 JH 절편을 사용함을 나타냈다. D 절편은 과도한 돌연변이로 인해 배선 서열에 할당될 수 없었다. CDR 영역 결정을 위한 캐벗 시스템을 사용한 1D9 VH 서열의 분석으로 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역이 도 1j, 및 각각 서열 23, 24 및 25에 제시된 바와 같이 서술되었다.
1D9 경쇄 면역글로불린 서열과 공지된 인간 배선 면역글로불린 경쇄 서열의 비교는 1D9 경쇄가 인간 배선 VK L6으로부터의 VL 절편 및 인간 배선 JK 1로부터의 JK 절편을 사용함을 나타냈다. CDR 영역 결정을 위한 캐벗 시스템을 사용한 1D9 VL 서열의 분석으로 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역이 도 1l, 및 각각 서열 26, 27 및 28에 제시된 바와 같이 서술되었다.
2D2 중쇄 면역글로불린 서열과 공지된 인간 배선 면역글로불린 중쇄 서열의 비교는 2D2 중쇄가 인간 배선 VH 3-30.3로부터의 VH 절편, 인간 배선 7-27로부터의 D 절편, 및 인간 배선 JH 6b로부터의 JH 절편을 사용함을 나타냈다. CDR 영역 결정을 위한 캐벗 시스템을 사용한 2D2 VH 서열의 분석으로 중쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역이 도 1n, 및 각각 서열 33, 34 및 35에 제시된 바와 같이 서술되었다.
2D2 경쇄 면역글로불린 서열과 공지된 인간 배선 면역글로불린 경쇄 서열의 비교는 2D2 경쇄가 인간 배선 VK L6으로부터의 VL 절편 및 인간 배선 JK 3으로부터의 JK 절편을 사용함을 나타냈다. CDR 영역 결정을 위한 캐벗 시스템을 사용한 2D2 VL 서열의 분석으로 경쇄 CDR1, CDR2 및 CD3 영역이 도 1p, 및 각각 서열 36, 37 및 38에 제시된 바와 같이 서술되었다. 항체 22B5, 2D2. 24C7, 및 1D9 모노클로날 항체에 대한 유전자 사용을 나타내는 표가 하기에 표 3으로 제시된다.
Figure pct00004
실시예 9 : 인간 모노클로날 항체 22B5, 24 C7 , 1 D9 , 및 2 D2 의 결합 친화력 및 결합 동역학의 특성화
본 실시예에서, IgG1 DLE 돌연변이가 있거나 없는 IgG1 서브클래스의 22B5, 24C7, 1D9, 및 2D2 인간 항-α5β1 항체 (즉 "22B5 G1 DLE", "22B5 G1", "1D9 G1 DLE", "1D9 G1" 등)의 결합 특이성을 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 시험하였다.
FACS 에 의한 α5β1에 대한 세포 친화력 결정
내인성 인간 인테그린 α5β1 발현 세포 (HUVEC)를 사용하여, 22B5/DLE, 24C7/DLE, 1D9/DLE, 및 2D2/DLE 항체를 세포 표면 인테그린 α5에 대한 이의 결합 친화력에 대해 FACS 분석법을 이용하여 테스트하였다. 간략하게, 세포를 트립신-EDTA를 사용하여 박리시키고, 저온 PBS로 세정하였다. 96웰 플레이트 내로 분취한 후, 세포를 혈청으로 차단하고, 여러 농도의 특이적 mAb와 함께 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세정하고, R-PE 형광단과 접합된 항-인간 κ 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, 팩스캘리버 유동 세포측정기를 사용하여 분석하였다. 어떠한 게이팅도 적용하지 않으면서 각각의 샘플에 대해 10,000개의 이벤트를 수집하였다. KD 결정을 위해, 각각의 샘플 막대 그래프의 기하 평균을 계산하고, mAb 농도의 함수로 플롯팅하였다. 2-상 평형 모델에의 피팅 후 KD가 계산되었다. 도 11a 및 11b에서 결과가 제시된다.
실시예 10 : 인간 모노클로날 항체 22B5, 24 C7 , 1 D9 , 및 2 D2 의 시험관내 ADCC 이펙터 기능
앞서 실시예 6에 기술된 바와 같은 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 분석법을 통해 이펙터 기능 활성을 평가하였다. 대표적인 종양 세포주 (U87MG)에서 ADCC (80％까지의 표적 세포 용해)를 촉진하는 것에 대한 EC50 값이 항체 1D9, 1D9/DLE, 2D2/DLE, 22B5/DLE, 및 24C7/DLE에 대해 도 12에서 제시된다.
실시예 11 : 전이성 흑색종의 동계 모델에서의 생체내 ADCC -의존적 항-종양 효능
ADCC 특이적 응답을 증명하기 위해, 인간 모노클로날 항체 1D9/DLE (인간 및 뮤린 α5β1에 결합하지만, α5β1을 기능적으로 중화하지는 않음)를 무손상 면역 이펙터 세포가 있는 동계 마우스에서의 종양 성장 억제 (TGI) 모델에서 테스트하였다. 구체적으로, 뮤린 흑색종 B16F10 세포가 α5β1을 발현한 동계 마우스 모델에서 ADCC-매개 항-종양 활성을 평가하였다. 인테그린 α5를 발현하는 마우스 흑색종 세포주 B16F10은 고도로 전이성이고, 일단 정맥내 주사되면 주로 폐로 집락화된다. 종양 세포를 면역-수용성 C57BL/6 마우스 내로 정맥내 주사하였다. 주사 하루 전에 항체 (10 ㎎/kg, n=10/군)가 예비 투약된 동계 숙주 C57BL/6 마우스 내로 B16F10 세포 (2×105개/동물)을 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 총 3주 동안 1주일에 1회씩 항체를 동물에게 피하 투약하였다. 제21일에 동물을 희생시키고 폐를 절제하였다.
도 13의 결과에 나타난 바와 같이, 1D9/DLE 항체가 유의한 생체내 항-종양 효능을 일으켰고, 이는 ADCC 응답 단독이 TGI를 일으키는데 충분하다는 것을 가리킨다. 이러한 모델에서의 ADCC의 구체적인 영향을 서술하기 위해, 동물을 1D9 IgG2 (ADCC를 매개하는 것으로 공지되지 않음) 및 1D9 IgG1 DLE (DLE 돌연변이에 의해 Fc가 강화된 IgG1 이소타입)로 처리하였다. 1D9 IgG2에 비해 1D9 IgG1 DLE로 더 큰 항-종양 효능이 관찰되었다. 이소타입 쌍들은 항원 결합 도메인 내의 아미노산 서열 및 시험관내 활성이 동일하기 때문에, 데이터는 DLE 돌연변이의 결과로서의 강화된 ADCC가 1D9 IgG1 DLE의 우수한 효능을 초래하였음을 나타낸다.
기탁 정보
출원인은 본원에서 22B5로 지정된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 <American Type Culture Collection (ATCC)> (Manassas, VA 20110-2209 U.S.A)에 기탁하였다. 22B5 VH 영역은 2008년 7월 16일에 기탁되었고, ATCC 기탁 번호 PTA-9377이 할당되었다. 22B5 VL 영역은 2008년 7월 16일에 기탁되었고, ATCC 기탁 번호 PTA-9377이 할당되었다. 이러한 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이의 규정 (부다페스트 조약)의 조항 하에 이루어졌다. 이러한 기탁물은 제한 없이 ATCC 기탁기관에 30년 동안, 또는 가장 최근의 요청 후 5년 동안, 또는 특허의 유효 기간 동안 (어느 쪽이든 더 긴 것) 유지될 것이고, 기탁물이 이러한 기간 동안 생육성이지 않게 되면 교체될 것이다. 기탁된 물질의 입수가능성은 임의의 정부의 권한 하에 이의 특허법에 따라 수여된 권리를 위반하여 본 개시내용의 임의의 양상을 실행할 권리로 해석되지 않아야 한다. 상기에 기록된 명세서는 당업자가 본 개시내용의 모든 양상을 실행할 수 있게 하는데 충분한 것으로 간주된다. 기탁된 실시양태는 본 개시내용의 특정 양상들의 한 실례인 것으로 의도되고, 기능적으로 등가인 임의의 구축물이 본 개시내용의 범주 내에 속하기 때문에, 본 개시내용은 기탁된 물질들에 의해 범주가 한정되지 않아야 한다. 본원에서의 물질의 기탁은 본원의 기술된 설명이 본 개시내용의 임의의 양상 (이의 최상의 양식 포함)의 실행을 가능하게 하는데 불충분하다거나, 또는 청구항의 범주를 이러한 설명이 나타내는 구체적인 실례들에 한정하는 것으로 해석되어야 함을 시인하지 않는다. 오히려, 본원에서 제시되고 기술된 것들에 더하여 본 개시내용의 다양한 변형이 상기의 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이고, 첨부된 청구항의 범주 내에 속할 것이다.
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SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc and Medarex, Inc. <120> Alpha-5 Beta-1 Antibodies and Their Uses <130> PC33646 <160> 44 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Ser Ser Tyr Trp Gly 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Arg Asn Tyr Asn Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 His Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Asp Leu Asp 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln 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ctctcctgca gggccagtca gagtgttaac agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctcggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 43 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (20)

  1. (a) 인간 인테그린 α5β1에 1×10-7 M 이하의 KD로 결합하고,
    (b) 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있는
    단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  2. 제1항에 있어서, 서브클래스(subclass) IgG1의 전장 인간 항체인 항체.
  3. 제1항에 있어서, 인간 인테그린 α5β1에 5×10-8 M 이하의 KD로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  4. 인간 인테그린 α5β1에 1×10-7 M 이하의 KD로 결합하고,
    서열 7에 기재된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상 동일한 중쇄 가변 영역을 포함하는
    단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  5. 제4항에 있어서, 서열 8에 기재된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상 동일한 경쇄 가변 영역을 더 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  6. (a) 서열 1을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열 2를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2:
    (c) 서열 3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열 4를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열 5를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열 6을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  7. 제6항에 있어서,
    (a) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체 또는 항원 결합 부분.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 전장 IgG1 항체이고, 그의 Fc 영역 내의 1개 이상의 아미노산이 돌연변이되었으며, 추가로 상기 1개 이상의 아미노산이 돌연변이되지 않은 동일한 항체보다 큰 ADCC를 나타내는 항체.
  9. 제8항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 아미노산 위치 세린 247, 알라닌 338, 또는 이소류신 340에서 발생한 항체.
  10. 제9항에 있어서, 1개 이상의 돌연변이가 세린 247 → 아스파르트산 (S247D), 알라닌 338 → 류신 (A338L), 및 이소류신 340 → 글루탐산 (I340E)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  11. 제10항에 있어서, 돌연변이 S247D, A338L, 및 I340E를 포함하는 항체.
  12. 제6항에 있어서, 서열 9에 기재된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상 동일한 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  13. 제6항에 있어서, 서열 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  14. 제6항에 있어서, 서열 9에 기재된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상 동일한 중쇄 아미노산 서열 및 서열 10에 기재된 아미노산 서열에 대해 90％ 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 부분, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분 중 임의의 것의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  17. 제16항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  18. 제17항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  19. 제18항의 숙주 세포에서 항-α5β1 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 발현시키는 단계를 포함하는, 항-α5β1 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 제조 방법.
  20. 종양 세포의 성장을 억제하는데 효과적인 양의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인테그린 α5β1을 발현하는 종양 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 인테그린 α5β1을 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
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