KR20190064636A - 항-o1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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메간 펜니니
츄? 창
샤오동 샤오
제임스 힐리어드
길라드 카플란
데이비드 코르티
엘리자베타 카메로니
마르티나 벨트라멜로
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메디뮨 엘엘씨
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Abstract

본 개시는 클레브시엘라 뉴모니아 O1에 특이적으로 결합하며, 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 옵소닌 포식 살해를 유도하는 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 제공한다. 또한, 본 개시는 클레브시엘라 뉴모니아 O1 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 감소, 또는 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아) 감염의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

Description

항-O1 항체 및 이의 용도
전자 제출된 서열목록에 대한 참조
본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일 KLEB-101-WO-PCT_SL.txt(크기: 37,313 바이트; 및 생성일: 2017년 10월 6일)의 전자 제출된 서열목록의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명의 분야는 일반적으로 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) O1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 및 이의 항원-결합 단편) 및 클레브시엘라(Klebsiella) 감염의 예방 또는 치료를 위한 이들 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
클레브시엘라는 폐렴, 요로 감염, 신생아 패혈증 및 수술 상처 감염을 포함한 기회 감염 및 병원내 감염에 대한 원인 물질로서 임상적 중요성이 급격히 증가하고 있는 그람 음성 박테리아이다. 또한, 화농성 간농양(PLA), 내안구염, 수막염 및 괴사성 수막염과 같은 클레브시엘라 감염과 관련된 증후군이 출현하고 있다. 클레브시엘라 감염의 임상적 영향은 예를 들어, 문헌[Podschun R. and Ullman U. Clin. Microbiol Rev. 11:589-603 (1998)]에 논의되어 있다.
항생제 내성은 박테리아 감염에 대한 싸움에서 주요한 과제 중 하나로 출현하였다. 예를 들어, 문헌[Iredell J., et al., BMJ 351:h6420 (2015)]을 참조한다. 약물 내성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대하여 약간의 진전은 있었으나, 그람 음성 기회 감염이 가장 문제가 된다. 이들 가운데에서도, 클레브시엘라 뉴모니아는 광범위하게 퍼져 있는 다제 내성 균주에서 특히 도전적이다. 클레브시엘라 뉴모니아 카바페네마제(KPC) 및 뉴 델리 메탈로-베타-락타마제 1(NDM-1)을 포함하는 확장-스펙트럼 베타 락타마제(ESBL) 및 카바페넴 내성 엔테로박테리아(CRE) 카바페네마제와 같은 감염은 전세계적으로 확산되어 현행의 항생제 부류를 대체로 부적절하게 만들었다. 이러한 현실은 줄어들고 있는 항생제 관로와 결부되어, 치료적 대안을 거의 남기지 않는다. 최근의 몇가지 주목할만한 발병은 클레브시엘라 뉴모니아 항생제 내성과 연관된 위기를 강조한다. 따라서, 항생제 요법을 보완하기 위한 전략을 개발하는 것이 중요하다.
클레브시엘라 뉴모니아 발병에는 협막 다당류(capsular polysaccharides, CPS) 및 지질다당류(lipopolysaccharides, LPS)를 포함하는 다수의 독성 인자가 연루되어 있다. LPS 및 CPS에 대하여 유도된 폴리클로날 항체는 치명적인 클레브시엘라 뉴모니아 감염의 전임상 모델에서 방어적이다. 그러나 이들 2가지 항원을 항체로 표적화하는 것은 균주 적용 범위와 관련하여 상당한 과제를 제기한다. 77가지 초과의 공지된 협막 혈청형과 8종류의 O-항원 혈청형이 존재하며, 어느 것이 가장 만연한 것인지 또는 발병과 관련이 있는지가 불분명하다. 또한, LPS 내의 보존된 에피토프를 표적화하는 제한된 수의 모노클로날 항체는 방어 효과가 보고되어 있지 않다(문헌[Brade et al. 2001, J Endotoxin Res, 7(2):119-24]).
따라서, 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아), 특히 항생제 내성 클레브시엘라 감염에 대하여 방어 효과를 갖는 항체를 확인하고 개발하는 것이 매우 필요하다.
본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 클레브시엘라 뉴모니아 O1 결합 단백질을 사용한 클레브시엘라 감염의 치료 방법을 제공한다.
일 예에서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질이 본원에 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 a) 클레브시엘라의 옵소닌 포식 살해(opsonophagocytic killing, OPK)를 유도하거나, b) 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라를 살해하거나, c) 클레브시엘라의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라를 살해한다.
일 예에서, 항원 결합 단백질은 (i) 클레브시엘라의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라를 살해시키고, 지질다당류(LPS)를 중화시키거나, (ii) 클레브시엘라의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라를 살해하지만, LPS를 중화시키지 않는다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 클레브시엘라 그래뉼로마티스(Klebsiella granulomatis), 클레브시엘라 오자에나(Klebsiella ozaenae), 클레브시엘라 리노스클레로마티스(Klebsiella rhinoscleromatis) 또는 클레브시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola)이다. 일 예에서, 클레브시엘라는 다제 내성이며, 표 8의 1행 내지 134행 중 하나에 열거된 균주를 포함한다.
일 예에서, 항원 결합 단백질은 a) 클레브시엘라 뉴모니아의 옵소닌 포식 살해(OPK)를 유도하고/하거나, b) 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라 뉴모니아를 살해하고/하거나, c) 지질다당류(LPS)를 중화시킨다.
일 예에서, 항원 결합 단백질은 다제 내성 클레브시엘라 뉴모니아 균주가 적어도 하나의 항생제에 감수성이 되도록 한다.
일 예에서, 항원 결합 단백질은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원의 D-갈락탄 II 도메인에 결합한다.
또한, 본 발명은 상보성-결정 영역(CDR)의 세트: HCDR1, HDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 제공하며, HCDR1은 SEQ. ID. NO: 1의 아미노산 서열을 가지며; HCDR2는 SEQ. ID. NO: 2의 아미노산 서열을 가지며; HCDR3은 SEQ. ID. NO: 3의 아미노산 서열을 가지며; LCDR1은 SEQ. ID. NO: 4의 아미노산 서열을 가지며; LCDR2는 SEQ. ID. NO: 5 또는 10의 아미노산 서열을 가지며; LCDR3은 SEQ. ID. NO: 11의 아미노산 서열을 갖는다.
일 예에서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질이 본원에 제공되며, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO: 12와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 SEQ ID NO: 13과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일 예에서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO: 12를 포함하는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 13을 포함하는 VL을 포함한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 12를 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 13을 포함하는 VL을 포함하는 항체와 동일한, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 제공한다.
일 예에서, SEQ ID NO: 12를 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 13을 포함하는 VL을 포함하는 항체의 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원으로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 단리된 항원 결합 단백질이 본원에 제공된다.
또한, 본 발명은 상보성-결정 영역(CDR)의 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 제공하며, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 SEQ. ID. NO: 41, 42, 43, 44, 45 및 46; 각각 SEQ. ID. NO: 32, 33, 34, 35, 36 및 38; 각각 SEQ. ID. NO: 32, 33, 34, 35, 37 및 38; 각각 SEQ. ID. NO: 1, 2, 3, 4, 5 및 7; 각각 SEQ. ID. NO: 1, 2, 3, 4, 6 및 7; 각각 SEQ. ID. NO: 14, 15, 16, 17, 18 및 20; 각각 SEQ. ID. NO: 14, 15, 16, 17, 19 및 20; 각각 SEQ. ID. NO: 23, 24, 25, 26, 27 및 29; 또는 각각 SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 28 및 29의 아미노산 서열을 포함한다.
일 예에서, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 30을 포함하는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 31을 포함하는 VL을 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질이 본원에 제공된다.
일 예에서, 각각 SEQ. ID. NO: 47 및 SEQ ID NO: 48; 각각 SEQ. ID. NO: 39 및 SEQ ID NO: 40; 각각 SEQ. ID. NO: 8 및 SEQ ID NO: 9; 각각 SEQ. ID. NO: 21 및 SEQ ID NO: 22; 또는 각각 SEQ. ID. NO: 30 및 SEQ ID NO: 31을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 항체와 동일한, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질이 본원에 제공된다.
일 예에서, 각각 SEQ. ID. NO: 47 및 SEQ ID NO: 48; 각각 SEQ. ID. NO: 39 및 SEQ ID NO: 40; 각각 SEQ. ID. NO: 8 및 SEQ ID NO: 9; 각각 SEQ. ID. NO: 21 및 SEQ ID NO: 22; 또는 각각 SEQ. ID. NO: 30 및 SEQ ID NO: 31을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 항체의 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원으로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 단리된 항원 결합 단백질이 본원에 제공된다.
일 예에서, 항원 결합 단백질은 항체이다. 일 예에서, 항원 결합 단백질은 항체의 항원 결합 단편이다. 일 예에서, 항원 결합 단백질은 모노클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중-특이적 항체, 다중-특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일 예에서, 항원 결합 단백질은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단쇄 Fv 또는 scFv, 이황화 결합된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디(intrabody), IgGΔCH2, 미니바디(minibody), F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2 또는 scFv-Fc를 포함한다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항원 결합 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 일 예에서, 핵산 분자는 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일 예에서, 본원에 제공되는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다.
또한, 본 발명은 본원에 제공되는 핵산 분자 또는 본원에 제공되는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 일 예에서, 숙주 세포는 예를 들어, HEK293 세포, NS0 뮤린 골수종 세포, PER.C6® 인간 세포 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하는 포유동물 숙주 세포이다.
또한, 본 발명은 (a) 항원 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하거나, 본원에 제공되는 숙주 세포 또는 본원에 제공되는 하이브리도마를 배양하는 단계; 및 (b) 이의 항원 결합 단백질을 배양된 숙주 세포로부터 단리하는 단계를 포함하는, 본원에 제공되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항원 결합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 일 예에서, 본원에 제공되는 방법을 사용하여 생성되는 항원 결합 단백질이 본원에 제공된다.
또한, 본 발명은 본원에 제공되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항원 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 예에서, 약제학적으로 허용되는 부형제는 보존제, 안정화제 또는 항산화제이다. 일 예에서, 약제학적 조성물은 의약용이다.
또한, 본 발명은 클레브시엘라 감염과 관련된 질환을 치료하기 위한 본원에 제공되는 항원 결합 단백질(항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함) 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일 예에서, 유효량의 본원에 제공되는 항원 결합 단백질(항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함) 또는 본원에 제공되는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료, 예방 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서의 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료, 예방 또는 개선 방법이 본원에 제공된다. 일 예에서, 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료 방법은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 유효량의 항원 결합 단백질(항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)을 투여하는 단계를 포함한다. 일 예에서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일 예에서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은 본원에 제공되는 항원 결합 단백질 또는 본원에 제공되는 약제학적 조성물이다. 일 예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 플란티콜라, 클레브시엘라 오자에나, 클레브시엘라 리노스클레로마티스 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스이다.
일 예에서, 본원에 제공되는 항원 결합 단백질 또는 본원에 제공되는 약제학적 조성물을 클레브시엘라의 성장의 억제 또는 클레브시엘라의 수의 감소를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 클레브시엘라(항생제-내성 클레브시엘라 포함)로 감염된 대상체에서의 클레브시엘라의 성장의 억제 또는 클레브시엘라의 수의 감소 방법이 본원에 제공된다. 일 예에서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일 예에서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은 본원에 제공되는 항원 결합 단백질 또는 본원에 제공되는 약제학적 조성물이다. 일 예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 플란티콜라, 클레브시엘라 오자에나, 클레브시엘라 리노스클레로마티스 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스이다.
또한, 본 발명은 본원에 제공되는 약제학적 조성물 또는 본원에 제공되는 항원 결합 단백질(항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)을 포함하는, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 유효량의 항원 결합 단백질을 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 동시-감염과 관련된 질환의 치료, 예방 또는 개선을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스 동시-감염과 관련된 질환의 치료, 예방 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서의 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스 동시-감염과 관련된 질환의 치료, 예방 또는 개선 방법을 제공한다.
일 예에서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 유효량의 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스로 동시-감염된 대상체에서의 클레브시엘라 뉴모니아의 독성의 억제, 감소 또는 제거 방법, 또는 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스 둘 모두로 감염된 대상체의 생존의 증가 방법이 본원에 제공된다.
또한, 본 발명은 항체-내성 클레브시엘라 균주를 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질(항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)과 접촉시키는 단계를 포함하는 항생제에 대한 항생제-내성 클레브시엘라 균주의 감작 방법을 제공한다. 일 예에서, 상기 방법은 항생제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일 예에서, 항원 결합 단백질 및 항생제는 상승적 치료 효과를 제공한다.
도 1a 내지 도 1c는 항-클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원 항체의 활성을 보여준다. 도 1a는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의한 정제된 O1 LPS에 결합하는 항체의 능력을 보여준다. 도 1b는 혈청 살균 검정(SBA)을 사용하여 나타난 바와 같은 보체-의존적 살해를 매개하는 항체의 활성을 보여준다. 도 1c는 옵소닌 포식 살해(OPK)를 유도하는 항체의 능력을 보여준다. 부류 I 항체(예를 들어, 54H7 및 KPB202) 및 부류 II 항체(예를 들어, KPA27, KPE33 및 KPJ4) 둘 모두는 클레브시엘라 뉴모니아의 OPK를 유도하고, SBA 검정에서 측정시 클레브시엘라 뉴모니아를 살해한다. 그러나, 부류 I 항체는 또한, LPS를 중화시키는 한편, 부류 II 항체는 그렇지 않다.
도 2는 항-O1-LPS 항체가 클레브시엘라 뉴모니아 균주 Kp8045(O1:K1)에 대한 비강내 폐 감염 모델에서 박테리아 폐 부담을 감소시키는 것을 보여준다. 15 ㎎/㎏의 KPE33은 박테리아 폐 부담을 유의미하게 감소시켰으며, 15 ㎎/㎏의 다른 항-O1 항체는 또한 감염 후 48시간에 투여되는 경우 약 2-3 log의 기관 부담을 감소시켰다. 무관한 인간 IgG1 항체(IgG 대조군)를 대조군으로 사용하였다.
도 3a 내지 도 3c는 항-O1 항원 항체 KPE33이 박테리아 감염 후 1시간에 투여되는 경우 마우스를 치명적인 박테리아 시험감염으로부터 보호하는 것을 보여준다. 도 3a는 KPE33이 인간 IgG1 대조군 항체(R347)와 비교하여 다제 내성 클레브시엘라 뉴모니아 카바페넴-내성(CRE) 균주 Kp1131115(O1)가 있는 치명적인 세균성 폐렴 모델에서 생존을 용량 의존적으로 증진시키는 것을 보여준다. 도 3b는 KPE33이 인간 IgG1 대조군 항체(R347)와 비교하여 확장 스펙트럼 베타-락타마제(ESBL) 균주 Kp8561(O1)이 있는 치명적인 균혈증 모델에서 생존을 유의미하게 증진시켰음을 보여준다. 도 3c는 KPE33-H32+L2016(E1Q)("KPE33-H32") 및 KPE33-H32+L2016(E1Q)("KPE33-H33")이 인간 IgG1 대조군 항체(R347)와 비교하여 다제 내성 클레브시엘라 뉴모니아 카바페넴-내성(CRE) 균주 Kp1131115(O1)가 있는 치명적인 박테리아 폐렴 모델에서 생존을 용량 의존적으로 증진시켰음을 보여준다.
도 4a 및 도 4b는 KPE33이 폐렴(도 4a) 및 균혈증(도 4b) 모델 둘 모두에서 항생제 메로페넴과 상승적으로 작용하는 것을 보여준다. 뉴모니아 O1 균주 Kp8045(도 4a) 또는 Kp8561(도 4b)로의 감염 후에 항생제 및 항체 둘 모두를 투여하였다. 메로페넴 및 KPE33의 조합은 메로페넴 또는 KPE33 중 어느 하나의 단일요법 또는 인간 IgG1 대조군 항체(R347) 및 메로페넴의 조합보다 폐렴 및 균혈증 모델 둘 모두에서 유의미하게 더 나은 보호를 보여주었다.
도 5는 KPE33v2016을 생성하기 위한 KPE33의 서열 최적화를 보여준다. 그래프는 옥텟 플랫폼(Octet platform)에 의해 측정시, O1 LPS로의 KPE33-rIgG1(좌측) 및 KPE33v2016(우측)의 결합을 보여준다. KPE33 및 KPE33v2016은 둘 모두 각각 5.83E-09 및 4.13E-09의 평균으로 유사한 친화성 상수(KD)를 보여주었다. 하측의 패널은 KPE33 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)에 대한 아미노산 서열 및 최적화된 KPE33v2016 VH 및 VL에 대한 아미노산 서열을 보여준다. 도면에는 출현 순서로, 각각 SEQ ID NO: 8, 12, 9 및 13이 개시되어 있다.
도 6은 서열 최적화된 KPE33(KPE33-V-2016)이 치명적인 폐렴 모델에서 보호 활성을 유지하였음을 보여준다. KPE33 또는 KPE33-V-2016을 클레브시엘라 뉴모니아 카바페넴 내성(KPC) 균주로의 박테리아 감염 후 1시간에 6 ㎎/㎏으로 투여하였다. 두 항체 모두는 인간 IgG1 대조군 항체와 비교하는 경우 유사한 수준의 보호를 보여주었다. IgG2 하위부류의 KPE33도 또한 이러한 모델에서 비교하였으며, 이는 KPE33-IgG1보다 약간 더 낮은 활성을 보여주었다.
도 7a 내지 도 7d는 KPE33이 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스 동시-감염 모델에서 보호함을 보여준다. 도 7a는 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스의 하위-치명적인 접종물로의 동시-감염이 치명적인 폐렴을 야기하였음을 보여준다. 클레브시엘라 뉴모니아 박테리아 부담은 단독의 클레브시엘라 뉴모니아로 감염된 마우스에 비하여 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스로 동시-감염된 마우스의 폐(도 7b) 및 비장(도 7c)에서 유의미하게 증가하였다. 도 7d는 동시-감염 24시간 전의 KPE33(0.5 ㎖, 복강내)으로의 단일의 처치가 치명적인 동시-감염으로부터 마우스를 구제하였음을 보여준다.
도 8은 항-O1 항원 항체 54H7이 LPS 시험감염 후에 혈청 사이토카인을 감소시키는 것을 보여준다. 54H7 및 IgG1 대조군 항체를 LPS 시험감염 3시간 전에 마우스에게 제공하였다. 그 다음, 동물을 채혈하고, 혈청 중 사이토카인을 3시간 후에 측정하였다. 54H7은 2개의 O1 LPS 시험감염 모델(Kp43816 LPS 및 Kp15380 LPS)에서 혈청 IL-6, 케모카인 CXCL-1 및 TNF-알파를 감소시켰다. 폴리믹신 B(PMB)를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 9는 54H7이 내독소혈증 LPS-유도된 패혈증 모델에서 마우스를 보호하는 것을 보여준다. 54H7 및 대조군 항체를 LPS로의 시험감염 24시간 전에 마우스에게 제공하였다. 54H7은 대조군 IgG 항체(R347)에 비하여, 1 ㎎/㎏만큼 낮은 농도에서 유의미한 보호를 제공하였다.
도 10a 및 도 10b는 마우스 내의 박테리아 시험감염 모델에서의 54H7의 영향을 보여준다. 도 10a는 15 ㎎/㎏의 54H7이 마우스를 치명적인 폐렴으로부터 보호하는 것을 입증하며, 도 10b는 54H7이 이러한 모델에서 항생제 메로페넴과 상승작용을 보여주는 것을 입증한다.
도 11은 LPS 구조 내의 D-갈락탄 II 도메인을 인코딩하는 wbbYZ 유전자의 결실이 유세포측정 분석에 의해 나타난 바와 같이, 클레브시엘라 뉴모니아 균주 Kp113115로의 KPE33 및 54H7 항체의 결합을 폐지하는 것을 보여준다.
도 12는 지질 A, 코어 올리고당 및 고도의 가변성 O-항원을 포함하는 O1 LPS의 구조가 반복 올리고당 단위로 구성되는 것을 보여준다. 하측의 표는 O1, O2a 및 O2ac LPS 혈청형의 화학 조성을 제공한다.
도 13은 KPE33 및 54H7이 O1 LPS 상의 동일한 에피토프로의 결합을 위해 경쟁하지 않는 것을 보여준다. 경쟁적 결합을 정제된 O1 LPS가 사전-로딩된 포획 프로브를 사용하여 포르테바이오 옥텟(Fortebio Octet)에 의해 측정하였다. 10 ㎍/㎖의 KPE33과의 초기 결합 후에, 프로브를 동일한 농도의 54H7(흑색 선), KPE33(진회색 선) 또는 대조군 항체 R347(연회색 선)과 함께 10 ㎍/㎖의 KPE33을 함유하는 항체 혼합물과 인큐베이션시켰다.
도 14a 내지 도 14d는 γδT 세포 동원 및 IL-17 신호전달이 항-O1 항체 보호와 상호관련된 것을 보여준다. 도 14a는 항-LPS 모노클로날 항체로 예방적으로 처치되고, 클레브시엘라 뉴모니아(1e4 CFU Kp8045)로 감염된 마우스의 폐 내의 γδTCR+ T 세포의 백분율의 유세포측정 분석을 보여준다. 도 14b는 항-LPS 모노클로날 항체로 처치되고(감염 후 1시간), 클레브시엘라 뉴모니아(1e4 CFU Kp8045)로 8시간 동안 감염된 마우스의 폐 내의 γδTCR+ T 세포의 백분율의 유세포측정 분석을 보여준다. 도 14c는 c-IgG 또는 KPE33으로 예방적으로 면역화되고, 24시간 후에 클레브시엘라 뉴모니아(1e4 CFU Kp8045)로 감염된 C57BL/6(야생형) 및 il17a(IL-17 낙아웃) 마우스의 생존을 보여준다(p 값은 KPE33 야생형(WT) 마우스와 KPE33 낙아웃(KO) 마우스 간의 유의성을 나타냄; 군마다 N = 5). 도 14d는 c-IgG 또는 54H7로 예방적으로 면역화되고 24시간 후에 클레브시엘라 뉴모니아(1e4 CFU Kp8045)로 감염된 C57BL/6(야생형) 및 il17a(IL-17 낙아웃) 마우스의 생존을 보여준다(군마다 N = 5). 통계적 유의성을 ANOVA에 이어서 Dunn 검정(도 14a) 또는 로그 순위 검정(도 14c)에 의해 결정하였다. 데이터는 적어도 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단리된 결합 단백질을 제공한다. 관련 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 O1 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물도 또한 제공된다. 또한, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 O1 결합 단백질의 이용 및 제조 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 O1 결합 단백질을 투여함에 의한 클레브시엘라 감염(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아, 예컨대, O1 혈청형 클레브시엘라 뉴모니아)과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명을 더욱 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위하여, 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가의 정의는 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용] 전반에 걸쳐 기술되어 있다.
I. 정의
단수형 용어("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명백하게 달리 언급하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "항원 결합 단백질"은 하나 이상의 항원 결합 단백질을 나타내는 것으로 이해된다. 단수형 용어("a"(또는 "an"))뿐만 아니라, 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 또한, "및/또는"이 본원에 사용되는 경우, 두 가지의 명시된 특징 또는 구성요소 각각을 나머지 특징 또는 구성요소와 함께, 또는 나머지 특징 또는 구성요소 없이, 구체적으로 개시하는 것으로 취급된다. 따라서, 본원의 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하고자 한 것이다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 하기의 양태의 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
용어 "포함하다(comprise)"는 일반적으로 포함하다(include), 즉, 하나 이상의 특징 또는 구성요소의 존재를 허용함을 뜻한다는 의미에서 사용된다. 양태를 본원에서 표현 "포함하는(comprising)"과 함께 기술하는 부분은 어디에서든, "~로 이루어진" 및/또는 "본질적으로 ~로 이루어진"의 용어로 기술된 다른 유사한 양태도 제공된다.
본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 수치와 관련하여 사용된 용어 "약"은 해당 분야의 숙련자에게 익숙하고 허용되는 정확도 구간을 나타낸다. 일반적으로, 그러한 정확도 구간은 ± 10%이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명과 관련된 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; 문헌[The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 문헌[the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반 사전을 숙련자에게 제공한다.
단위, 접두사 및 부호는 국제 단위계(Systeme International de Unites, SI) 인정 형식으로 나타나 있다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 달리 표시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카복시 배향으로 좌측에서 우측으로 표기된다. 본원에 제공된 표제는 전체로서 본 명세서를 참고하여 이루어질 수 있는 본 발명의 다양한 양태 또는 양태를 제한하는 것이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 본 명세서를 전체적으로 참고함으로써 더 충분히 정의된다.
용어 "항원 결합 단백질"은 표적, 예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 분자, 예컨대, 항-O1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다.
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 상기의 것의 조합을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 온전한 폴리클로날 항체, 온전한 모노클로날 항체, 다중특이적 항체, 예컨대, 적어도 2개의 온전한 항체로부터 생성된 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체를 포함하는 융합 단백질 및 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 이들의 중쇄 불변 도메인의 아이덴티티를 기초로 한, 임의의 5가지 주요 면역글로불린 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 하위부류(아이소타입)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 것일 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린은 상이하면서도 잘 알려져 있는 서브유닛 구조 및 3차원 입체형태를 갖는다. 항체는 네이키드 항체이거나, 독소, 방사성 동위원소 등과 같은 다른 분자에 컨쥬게이트될 수 있다.
용어 "항체 단편" 또는 "이의 항체 단편"은 온전한 항체의 일부분을 지칭한다. "항원-결합 단편" 또는 "이의 항원-결합 단편"은 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부분을 지칭한다. 항원-결합 단편은 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 함유할 수 있다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv, 및 단쇄 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
모노클로날 항체 및 다른 항체 또는 이의 단편을 취하고, 재조합 DNA 기술의 기법을 이용하여 원래의 항체 또는 단편의 특이성을 보유하는 다른 항체 또는 키메라 분자 또는 이의 단편을 생성하는 것이 가능하다. 이러한 기법은 항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 인코딩하는 DNA를 상이한 면역글로불린의 불변 영역 또는 불변 영역 + 프레임워크 영역에 도입하는 것을 수반할 수 있다. 예를 들어, EP-A-184187호, GB 2188638A호 또는 EP-A-239400호 및 광대한 후속 문헌을 참조한다. 항체를 생성하는 하이브리도마 또는 다른 세포는 유전자 돌연변이 또는 다른 변형을 겪을 수 있는데, 유전자 돌연변이 또는 다른 변형은 생성된 항체 또는 이의 단편의 결합 특이성을 변경할 수 있거나 변경하지 않을 수 있다.
항체 엔지니어링 분야에서 이용할 수 있는 추가적인 기법은 인간 및 인간화 항체 또는 이의 단편을 분리하는 것을 가능하게 했다. 예를 들어, 인간 하이브리도마는 문헌[Kontermann and Sefan. Antibody Engineering, Springer Laboratory Manuals (2001)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 항원 결합 단백질을 생성하기 위한 또 다른 확립된 기법인 파지 디스플레이는 문헌[Kontermann and Sefan. Antibody Engineering, Springer Laboratory Manuals (2001)] 및 WO92/01047호와 같은 많은 간행물에서 상세하게 기술된 바 있다. 마우스 면역계의 다른 구성요소를 온전하게 둔 채 마우스 항체 유전자가 불활성화되고 인간 항체 유전자로 기능적으로 대체된 트랜스제닉 마우스가 인간 항원에 대한 인간 항체를 단리하는 데 이용될 수 있다.
합성 항체 또는 이의 단편은 예를 들어, 문헌[Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86] 또는 문헌[Krebs et al. Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84]에 의해 기술된 바와 같이, 합성되고, 적절한 발현 벡터 내에서 조립된 올리고뉴클레오티드의 수단에 의해 생성된 유전자로부터 발현에 의해 생성될 수 있다.
전체 항체의 단편이 항원 결합의 기능을 수행할 수 있음이 밝혀진 바 있다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일의 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌[Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)], 문헌[McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554]); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 2개의 도메인을 회합시켜 항원 결합 부위를 형성하게 하는 펩티드 링커에 의해 연결되는 단쇄 Fv 분자(scFv)(문헌[Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988]; 문헌[Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988]); (viii) 이중특이적 단쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965호) 및 (ix) "디아바디", 유전자 융합에 의해 작제된 다가 또는 다중특이적 단편(W0 94/13804호; 문헌[P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993])이다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화 가교의 혼입에 의해 안정화될 수 있다(문헌[Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996]). CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디 또한 제조될 수 있다(문헌[S. Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996]).
이중특이적 항체가 사용되는 경우, 이들은 다양한 방법(문헌[Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)])으로 제조될 수 있는, 예를 들어, 화학적으로 제조되거나 혼성 하이브리도마로부터 제조될 수 있는, 통상적인 이중특이적 항체일 수 있거나, 상기 언급된 이중특이적 항체 단편 중 임의의 것일 수 있다. 이중특이적 항체의 예로는 상이한 특이성을 갖는 2개의 항체의 결합 도메인을 사용하여 유연한 짧은 펩티드를 통해 직접적으로 연결할 수 있는 바이트(BiTETM) 기술의 이중특이적 항체가 포함된다. 이것은 짧은 단일 폴리펩티드 쇄 상에 2개의 항체를 조합한다. 디아바디 및 scFv는 Fc 영역 없이 가변 도메인만을 사용하여 작제되어, 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응의 영향을 잠재적으로 감소시킬 수 있다. 또한, 이중특이적 전체 항체와는 대조적으로 이중특이적 디아바디는 그들이 용이하게 작제되고 에스케리키아 콜라이(E. coli)에서 발현될 수 있기 때문에 특히 유용할 수 있다. 적절한 결합 특이성의 디아바디 (및 항체 단편과 같은 많은 다른 폴리펩티드)는 라이브러리로부터 파지 디스플레이를 이용하여 용이하게 선택될 수 있다(WO94/13804호). 예를 들어, O1에 대한 특이성을 갖는, 디아바디의 한쪽 팔이 일정하게 유지될 경우, 다른 쪽 팔이 다른 라이브러리를 제조하여, 적절한 특이성을 나타내는 항체를 선택할 수 있다. 이중특이적 전체 항체는 놉스-인투-홀스(knobs-into-holes) 엔지니어링으로 제조될 수 있다(문헌[J. B. B. Ridgeway et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996]). 다중특이적 및/또는 다가 분자를 생성한, 면역글로불린-유사 도메인을 기반으로 한 기술은 dAb, TandAb, 나노바디, 바이트(BiTE), SMIP, DNL, 애피바디(Affibody), 피노머(Fynomer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인, Albu-dab, DART, DVD-IG, 코브엑스-바디(Covx-body), 펩티바디, scFv-Ig, SVD-Ig, dAb-Ig, 놉스-인-홀스, 듀오바디스(DuoBodiesTM) 및 triomAb를 포함한다. 이중특이적 2가 항체, 및 이들의 제조 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호; 제5,807,706호; 제5,821,333호; 및 미국 특허출원 공개 제2003/020734호 및 제2002/0155537호에 기술되어 있으며, 이들 전부의 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다. 이중특이적 4가 항체 및 이들의 제조 방법은 예를 들어, WO 02/096948호 및 WO 00/44788호에 기술되어 있으며, 이들 둘 모두의 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일반적으로, PCT 공개 WO 93/17715호; WO 92/08802호; WO 91/00360호; WO 92/05793호; 문헌[Tutt et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991)]; 미국 특허 제4,474,893호; 제4,714,681호; 제4,925,648호; 제5,573,920호; 제5,601,819호; 문헌[Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)]을 참조한다.
어구 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 구성성분의 Fc 수용체 또는 보체 구성성분과의 상호작용에서 초래하는 항체의 활성을 지칭한다. 이들 활성은 예를 들어, 항체-의존적 세포-매개의 세포독성(ADCC), 보체-의존적 세포독성(CDC) 및 항체-의존적 세포 포식작용(ADCP)을 포함한다. 따라서, 변경된 이펙터 기능을 갖는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 적어도 하나의 이펙터 기능(예를 들어, ADCC, CDC 및/또는 ADCP)의 활성을 바꾸는, Fc 영역의 변경(예를 들어, 아미노산 치환, 결실, 또는 첨가 또는 올리고당의 변화)을 함유하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 지칭한다. 개선된 이펙터 기능을 갖는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 적어도 하나의 이펙터 기능(예를 들어, ADCC, CDC 및/또는 ADCP)의 활성을 증가시키는 Fc 영역의 변경(예를 들어, 아미노산 치환, 결실, 또는 첨가 또는 올리고당의 변화)을 함유하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 지칭한다.
용어 "특이적"은 특이적 결합 쌍의 한 구성원이 그의 특이적인 결합 상대(들) 이외의 분자에 대해 어떠한 유의미한 결합도 나타내지 않을 상황을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 상기 용어는 예를 들어, 다수의 항원이 지니는 특정 에피토프에 대해 항원 결합 도메인이 특이적인 경우에도 적용될 수 있는데, 이 경우, 항원 결합 도메인을 지닌 항원 결합 단백질은 에피토프를 지닌 다양한 항원에 결합할 수 있을 것이다.
"특이적으로 결합한다"는 일반적으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항원 결합 단백질이 그의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합한다는 것, 그리고 결합은 항원 결합 도메인과 에피토프 사이에 일부 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체가 무작위의 관련 없는 에피토프에 결합하는 것보다 더 용이하게 그의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합할 때, 항체가 그러한 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 한다. 본원에 사용되는 바와 같이 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 "특이적으로 결합하는" 항원 결합 단백질은 클레브시엘라 뉴모니아 O2 항원에 특이적으로 결합하지 않는다.
"친화도"는 리간드 결합 반응의 고유 결합 강도의 척도이다. 예를 들어, 항체(Ab)-항원(Ag) 상호작용 강도의 척도는 해리 상수 kd에 의해 정량화될 수 있는 결합 친화도를 통해 측정된다. 해리 상수는 결합 친화도 상수이고, 하기에 의해 제공된다:
Figure pct00001
친화도는 예를 들어, 비아코어(BIAcore)®, KinExA 친화도 검정, 유세포측정법 및/또는 방사성 면역검정을 이용하여 측정할 수 있다.
"효력"은 주어진 세기의 효과를 생성하는 데 필요한 화합물의 양의 측면에서 표현된 화합물의 약리학적 활성의 척도이다. 그것은 정의된 생물학적 효과를 달성하는 데 필요한 화합물의 양의 지칭하며; 필요한 용량이 적을수록, 약물은 더욱 강력하다. O1과 결합하는 항원 결합 단백질의 효력은 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어, OPK 검정을 이용하여 결정할 수 있다.
"옵소닌 포식 살해" 또는 "OPK"는 면역세포에 의한 포식작용의 결과로 발생하는 세포, 예를 들어, 클레브시엘라의 살해를 지칭한다. OPK 활성은 실시예 4에 사용되는 생물-발광 OPK 활성에 따라 측정된다. 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 OPK를 유도할 수 있으며, 여기서 살해의 백분율은 40% 이상이다. 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 OPK를 강력하게 유도할 수 있으며, 여기서, 살해의 백분율은 80% 이상이다.
또한, 살해는 "혈청 살균 검정"을 사용하여 측정될 수 있다. 박테리아 표면 상의 보체 고정 및 "막 공격 복합체"의 형성을 통한 살해는 실시예 4에 기술된 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 혈청 살균 검정에 의해 측정시 클레브시엘라를 살해할 수 있으며, 여기서, 살해의 백분율은 40% 이상이다. 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 혈청 살균 검정에 의해 측정시 클레브시엘라를 크게 살해할 수 있으며, 여기서, 살해의 백분율은 80% 이상이다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항원 결합 단백질은 그것이 에피토프로의 기준 항체 또는 항원 결합 단편의 결합을 어느 정도 차단할 경우, 주어진 에피토프로의 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합을 경쟁적으로 억제한다거나 기준 항체 또는 항원 결합 단편과 "경쟁한다"고 한다. 경쟁적 억제는 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 경쟁 ELISA 검정에 의해 결정할 수 있다. 결합 분자는 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50% 만큼 주어진 에피토프로의 기준 항체 또는 항원 결합 단편의 결합을 경쟁적으로 억제하거나 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁한다고 할 수 있다.
항원 결합 단백질(예를 들어, 중화 항원 결합 단백질 또는 중화 항체)의 맥락에서 사용될 때 용어 "경쟁하다"는, 시험 하의 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 면역학적 기능성 단편)이 공통 항원(예를 들어, O1 다당류 또는 이의 단편)으로의 기준 항원 결합 단백질(예를 들어, 리간드 또는 기준 항체)의 특이적 결합을 방지하거나 억제하는 검정에 의해 결정되는 바와 같은, 항원 결합 단백질 사이의 경쟁을 의미한다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 검정이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 고체상 직접 또는 간접 방사성 면역검정(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정(EIA), 샌드위치 경쟁 검정(예를 들어, 문헌[Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 92:242-253] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 문헌[Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619] 참조) 고체상 직접 표지 검정(solid phase direct labeled assay), 고체상 직접 표지 샌드위치 검정(예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 이용하는 고체상 직접 표지 RIA(예를 들어, 문헌[Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 문헌[Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552] 참조); 및 직접 표지 RIA(문헌[Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82])가 있다. 전형적으로, 이러한 검정은 표지되지 않은 시험 항원 결합 단백질 및 표지된 기준 항원 결합 단백질, 이들 중 어느 하나를 포함하는 세포 또는 고체 표면에 결합된 정제된 항원의 사용을 수반한다.
경쟁적 억제는 시험 항원 결합 단백질의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정할 수 있다. 대개 시험 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 검정에 의해 확인된 항원 결합 단백질(경쟁하는 항원 결합 단백질)에는 기준 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질, 및 입체장애(steric hindrance)가 일어나도록 기준 항원 결합 단백질에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한, 인접 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질이 포함된다. 보통, 경쟁하는 항원 결합 단백질이 과량으로 존재할 때 그것은 공통 항원으로의 기준 항원 결합 단백질의 특이적인 결합을 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 억제할 것이다. 일부 경우에서는, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% 이상으로 억제된다.
본원에 개시된 항원 결합 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원의 에피토프(들) 또는 부분(들), 예를 들어, 그들이 인식하거나 특이적으로 결합하는 표적 폴리펩티드의 관점에서 기술되거나 명시될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 항원 결합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호 작용하는 O1의 부분은 "에피토프"이다. 에피토프는 인접한 아미노산 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 나란히 놓인 인접하지 않은 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 변성 용매로의 노출 시 전형적으로 유지되지만, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매로의 처리 시 통상적으로 소실된다. 입체형태 에피토프는 항원의 아미노산 서열의 불연속적인 섹션으로 구성될 수 있다. 선형 에피토프는 항원으로부터의 아미노산의 연속 서열에 의해 형성된다. 에피토프 결정기는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐 기와 같은 화학적으로 활성인 표면 기의 분자를 포함할 수 있고, 특정한 3차원의 구조적 특징 및/또는 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 통상적으로 독특한 공간 입체형태 내에 적어도 3, 4, 5, 6, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35개의 아미노산을 포함한다. 에피토프는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
아미노산은 본원에서 일반적으로 그들의 공지된 세 문자의 부호로, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회가 권장하는 한 문자 부호로 지칭된다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 그들의 일반적으로 용인되는 한 문자 코드로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 (펩티드 결합으로도 알려져 있는) 아미드 결합에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 지칭하며, 특정 길이의 생성물을 지칭하지는 않는다. 본원에 사용된 용어 "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 분자를 포함하고자 한 것으로, 이것은 일부 경우에서는 아미드 결합 이외의 결합에 의해 회합될 수 있다. 한편, 단백질은 단일 폴리펩티드 쇄일 수도 있다. 이 후자의 경우, 단일 폴리펩티드 쇄은 일부 경우에서 서로 융합된 둘 이상의 폴리펩티드 서브유닛을 포함하여 단백질을 형성할 수 있다. 또한, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해적 절단, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 제한 없이 포함하는, 발현 후 변형의 생성물도 지칭한다. 폴리펩티드 또는 단백질은 천연의 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 그것은 화학적 합성을 비롯한 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
용어 "단리된"은 본 발명의 항원 결합 단백질 또는 이러한 결합 단백질을 인코딩하는 핵산이 일반적으로 본 발명에 따라 존재할 상태를 지칭한다. 단리된 단백질 및 단리된 핵산은, 그들의 천연의 환경 또는 시험관내 또는 생체내에서 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는 경우 그들이 제조되는 환경(예를 들어, 세포 배양)에서 함께 발견되는 그들이 천연적으로 회합되어 있는 물질, 예컨대 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 존재하지 않거나, 실질적으로 존재하지 않을 것이다. 단백질 및 핵산은 희석제 또는 보조제와 함께 제형화될 수 있고, 실용적인 목적을 위해 여전히 단리될 수 있으며 - 예를 들어, 단백질은 보통 면역검정용의 마이크로타이터 플레이트를 코팅하는 데 사용될 경우 젤라틴 또는 다른 담체와 함께 혼합될 것이거나, 또는 진단 또는 치료에 사용될 경우 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합될 것이다. 항원 결합 단백질은 자연적으로 또는 이종 진핵 세포(예를 들어, CHO 또는 NS0(ECACC 85110503) 세포)의 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, 그들은 (예를 들어, 원핵 세포에서의 발현에 의해 생성되는 경우) 글리코실화되지 않을 수 있다.
"단리된" 폴리펩티드, 항원 결합 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리펩티드, 항원 결합 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 항원 결합 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 그들이 천연에서 발견되는 형태로 더 이상 존재하지 않을 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 항원 결합 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
"재조합" 폴리펩티드, 단백질 또는 항체는 재조합 DNA 기술을 통해 생성된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 항체를 지칭한다. 숙주 세포에서 발현된, 재조합 폴리펩티드, 단백질 및 항체는 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분획화되거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 고유 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드와 같이 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
폴리펩티드의 단편, 변이체, 또는 유도체 및 이의 임의의 조합 또한 본 발명에 포함된다. 용어 "단편"은, 본 발명의 폴리펩티드 및 단백질을 지칭할 때, 기준 폴리펩티드 또는 단백질의 성질 중 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 폴리펩티드의 단편은 단백질 가수분해 단편뿐만 아니라, 결실 단편을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 항체 또는 모 폴리펩티드 서열과는 상이한 항체 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드의 변이체는 단편을 포함하고, 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입으로 인하여 변경된 아미노산 서열이 있는 항체 또는 폴리펩티드도 포함한다. 변이체는 자연적으로 발생하거나 비-천연 발생의 것일 수 있다. 비-천연 발생 변이체는 당해 분야에 공지된 돌연변이유발 기법을 이용하여 생성할 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다.
항체 또는 폴리펩티드에 적용된 용어 "유도체"는 고유 폴리펩티드 또는 단백질에서는 발견되지 않는 추가적인 특징을 나타내도록 변경된 항체 또는 폴리펩티드를 지칭한다. "유도체" 항체의 예는 제2 폴리펩티드 또는 또 다른 분자(예를 들어, PEG와 같은 폴리머, 발색단, 또는 형광단) 또는 원자(예를 들어, 방사성 동위원소)와의 융합체 또는 컨쥬게이트이다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"는 단일의 핵산뿐만 아니라, 복수의 핵산을 포괄하고자 한 것이고, 단리된 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들어, 메신저 RNA(mRNA), 상보적 DNA(cDNA), 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상적인 결합(예를 들어, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함한다.
용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 세그먼트, 예를 들어, DNA, cDNA 또는 RNA 단편을 지칭한다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 적용될 때, 용어 "단리된"은 그의 고유 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 지칭하며, 예를 들어, 벡터 내에 함유된 항원 결합 단백질을 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가적인 예로는 이종 숙주 세포 내에 유지되거나 용액 중의 다른 폴리뉴클레오티드로부터 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 재조합 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물을 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성에 의해 생성된 분자를 추가적으로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결 신호와 같은 조절 요소를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 재조합 핵산을 지니거나 이를 지닐 수 있는 세포 또는 세포 집단을 지칭한다. 숙주 세포는 원핵 세포(예를 들어, 에스케리키아 콜라이)일 수 있거나, 대안적으로 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어, 진균 세포(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerivisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe))와 같은 효모 세포), 및 다양한 동물 세포, 예컨대, 곤충 세포(예를 들어, Sf-9) 또는 포유동물 세포(예를 들어, HEK293F, CHO, COS-7, NIH-3T3, NS0 뮤린 골수종 세포, PER.C6® 인간 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 하이브리도마)일 수 있다.
용어 "아미노산 치환"은 모 서열에 존재하는 아미노산 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 아미노산은 모 서열에서 예를 들어, 화학적 펩티드 합성을 통해 또는 당해 분야에 공지된 재조합 방법을 통해 치환될 수 있다. 따라서, "위치 X에서의 치환" 또는 "위치 X에서의 치환"에 대한 언급은 위치 X에 존재하는 아미노산의 대안적인 아미노산 잔기로의 치환을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치환 패턴은 도식 AXY에 따라 기술될 수 있는데, 이때, A는 위치 X에 자연적으로 존재하는 아미노산에 해당하는 단일 문자 코드이고, Y는 치환하는 아미노산 잔기이다. 다른 양태에서, 치환 패턴은 도식 XY에 따라 기술될 수 있는데, 이때, Y는 위치 X에 자연적으로 존재하는 아미노산을 치환하는 아미노산 잔기에 해당하는 단일 문자 코드이다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄을 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산의 과가 당해 분야에 정의되어 있다. 따라서, 폴리펩티드의 아미노산이 동일한 측쇄 과로부터의 또 다른 아미노산으로 대체되는 경우, 치환은 보존적인 것으로 간주된다. 또 다른 양태에서, 아미노산의 스트링은 순서 및/또는 측쇄 과 구성원의 조성이 상이한, 구조적으로 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
비-보존적인 치환은 (i) 양전성 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Arg, His 또는 Lys)가 음전성 잔기(예를 들어, Glu 또는 Asp)를 치환하거나 이에 의해 치환되거나, (ii) 친수성 잔기(예를 들어, Ser 또는 Thr)가 소수성 잔기(예를 들어, Ala, Leu, Ile, Phe 또는 Val)를 치환하거나 이에 의해 치환되거나, (iii) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기를 치환하거나 이에 의해 치환되거나, (iv) 부피가 큰 소수성 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Val, His, Ile 또는 Trp)가 더 작은 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Ala, Ser) 또는 측쇄가 없는 잔기(예를 들어, Gly)를 치환하거나 이로 치환되는 것들을 포함한다.
다른 치환은 당업자가 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 알라닌의 경우, D-알라닌, 글리신, 베타-알라닌, L-시스테인 및 D-시스테인 중 임의의 것으로부터의 치환이 선택될 수 있다. 리신의 경우, 대체물은 D-리신, 아르기닌, D-아르기닌, 호모-아르기닌, 메티오닌, D-메티오닌, 오르니틴, 또는 D-오르니틴 중 임의의 것일 수 있다. 일반적으로, 단리된 폴리펩티드의 성질 변화를 유도할 것으로 예상될 수 있는 기능적으로 중요한 영역의 치환은 (i) 극성 잔기, 예를 들어, 세린 또는 트레오닌이 소수성 잔기, 예를 들어, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 또는 알라닌 대신에 (또는 이에 의해) 치환되거나; (ii) 시스테인 잔기가 임의의 다른 잔기 대신에 (또는 이에 의해) 치환되거나; (iii) 양전성 측쇄을 갖는 잔기, 예를 들어, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘이 음전성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 글루탐산 또는 아스파르트산 대신에 (또는 이에 의해) 치환되거나; (iv) 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌이 그러한 측쇄를 갖지 않는 잔기, 예를 들어, 글리신 대신에 (또는 이에 의해) 치환되는 것들이다. 전술한 비-보존적 치환 중 하나가 단백질의 기능적 성질을 변경시킬 수 있는 가능성은 단백질의 기능적으로 중요한 영역에 대한 치환의 위치와도 관련이 있다: 이에 따라 일부 비-보존적인 치환은 생물학적 성질에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않을 수 있다.
용어 "아미노산 삽입"은 모 서열에 존재하는 2개의 아미노산 잔기 사이에 새로운 아미노산 잔기를 도입하는 것을 지칭한다. 아미노산은 모 서열에, 예를 들어, 화학적 펩티드 합성을 통해 또는 당해 분야에 공지된 재조합 방법을 통해 삽입될 수 있다. 따라서, X와 Y가 아미노산 위치에 해당하는 본원에 사용된 어구 "위치 X와 Y 사이의 삽입", "IMGT 위치 X와 Y 사이의 삽입" 또는 "카밧 위치 X와 Y 사이의 삽입"(예를 들어, 위치 239와 240 사이의 시스테인 아미노산 삽입)은 X와 Y 위치 사이의 아미노산의 삽입을 지칭하며, 위치 X와 Y의 아미노산을 인코딩하는 코돈 사이에 아미노산을 인코딩하는 코돈의 핵산 서열의 삽입도 지칭한다. 삽입 패턴은 도식 AXins에 따라 기술될 수 있는데, 이때, A는 삽입되는 아미노산에 해당하는 단일 문자 코드이고, X는 삽입 앞의 위치이다.
용어 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 "서열 동일성 백분율" 또는 "동일성 백분율"은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 하는 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 고려하여, 비교 창에 걸쳐 서열이 공유한 동일한 일치된 위치의 수를 지칭한다. 일치된 위치는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 표적 및 기준 서열 둘 다에서 존재하는 임의의 위치이다. 표적 서열에 제시된 갭은 계수되지 않는데, 갭은 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아니기 때문이다. 마찬가지로, 기준 서열에 존재하는 갭은 계수되지 않는데, 표적 서열 뉴클레오티드 또는 아미노산이 계수되고 기준 서열로부터의 뉴클레오티드 또는 아미노산은 계수되지 않기 때문이다. 서열 동일성의 백분율은, 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 두 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 얻고, 일치된 위치의 수를 비교 창의 총 위치 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 얻음으로써 계산한다. 두 서열 사이의 서열 비교 및 서열 동일성 백분율의 결정은 쉽게 이용할 수 있는 소프트웨어 프로그램을 이용하여 달성될 수 있다. 적합한 소프트웨어 프로그램이 단백질 및 뉴클레오티드 서열 둘 다의 정렬을 위하여 다양한 공급처로부터 이용 가능하다. 서열 동일성 백분율을 결정하기에 적합한 하나의 프로그램은 미국 정부의 국립생물공학정보센터 BLAST 웹사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 이용할 수 있는 BLAST 프로그램 모음의 일부분인 b12seq이다. B12seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘 중 어느 하나를 이용하여 2개의 서열 사이의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용되지만, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용된다. 다른 적합한 프로그램은 예를 들어, Needle, Stretcher, Water 또는 Matcher, EMBOSS 생물정보학 프로그램 모음의 일부분이고, 또한 www.ebi.ac.uk/Tools/psa에서 EBI(European Bioinformatics Institute)로부터 이용 가능하다.
"특이적 결합 구성원"은 서로에 대해 결합 특이성을 갖는 분자 쌍의 구성원을 기술한다. 특이적 결합 쌍의 구성원은 자연적으로 유래될 수 있거나 전체적으로 또는 부분적으로 합성에 의해 생성될 수 있다. 분자 쌍의 한 구성원은 그의 표면 상의 영역 또는 구멍을 갖는데, 이는 분자 쌍의 다른 구성원의 특정 공간적 및 극성 구조에 특이적으로 결합하며, 따라서 그에 대해 상보적이다. 따라서, 쌍의 구성원은 서로에 대해 특이적으로 결합하는 성질을 갖는다. 특이적인 결합 쌍의 유형의 예는 항원-항체, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이다. 본 발명은 항원-항체 유형 반응과 관련이 있다.
본원에 사용된 용어 "IgG"는 인식되는 면역글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 인코딩되는 항체 부류에 속하는 폴리펩티드를 지칭한다. 인간에서 이러한 부류는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함한다. 마우스에서 이러한 부류는 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3을 포함한다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이에 상보적인 영역을 포함하는 항체의 부분을 말한다. 항원이 큰 경우, 항체는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있는데, 이 부분을 에피토프라 한다. 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항체 가변 도메인(예를 들어, VH 도메인으로 이루어진 소위 Fd 항체 단편)에 의해 제공될 수 있다. 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있다.
용어 "항원 결합 단백질 단편" 또는 "항체 단편"은 온전한 항원 결합 단백질 또는 항체의 일부분을 지칭하고, 온전한 항원 결합 단백질 또는 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음은 당해 분야에 공지되어 있다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, 단쇄 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "모노클로날 항체"는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 관여하는 동종의 항체 집단을 지칭한다. 이것은 전형적으로 상이한 항원 결정기에 대하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체와는 대조적이다. 용어 "모노클로날 항체"는 온전한 모노클로날 항체와 전장 모노클로날 항체 둘 모두와, 항체 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단쇄(scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 또한, "모노클로날 항체"는 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 및 트랜스제닉 동물에 의한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 수의 방식으로 제조된 항체를 지칭한다.
용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체 또는 당해 분야에 공지된 임의의 기법을 이용해 제조된 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭한다. 이러한 인간 항체의 정의는 온전한 항체 또는 전장 항체, 이의 단편, 및/또는 예를 들어, 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체와 같은, 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 용어 "인간화 항체"는 최소의 비-인간(예를 들어, 뮤린) 서열을 함유하도록 조작된, 비-인간(예를 들어, 뮤린) 면역글로불린으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 둘 이상의 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 포유동물의 한 종(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼 등)으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 해당하되, 불변 영역은 그 종에서 면역 반응을 유도하는 것을 막기 위해 또 다른 종(통상적으로 인간)으로부터 유래된 항체의 서열에 상응한다.
용어 "항체 결합 부위"는 상보적인 항체가 특이적으로 결합하는 연속적 또는 불연속적인 부위(즉, 에피토프)를 포함하는 항원(예를 들어, O1)의 영역을 지칭한다. 따라서, 항체 결합 부위는 에피토프를 넘어서며 결합 친화도 및/또는 안정성과 같은 성질을 결정할 수 있거나 항원 효소 활성 또는 이량체화와 같은 성질에 영향을 미칠 수 있는 항원의 추가적인 영역을 함유할 수 있다. 따라서, 2개의 항체가 항원 내의 동일한 에피토프에 결합하더라도, 항체가 에피토프 외측의 아미노산과 별개의 분자내 접촉을 확립한다면, 항체는 별개의 항체 결합 부위에 결합하는 것으로 간주된다.
IMGT 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인의 잔기(대략적으로 경쇄의 잔기 1 내지 107 및 중쇄의 잔기 1 내지 113)를 지칭할 때 사용된다(예를 들어, 문헌[Lefranc, M.-P. et al. Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77 (2003)]).
어구 "카밧에서와 같은 아미노산 위치 넘버링", "카밧 위치" 및 이의 문법적 변형은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서 항체의 편집물의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용되는 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하면, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 단축 또는 가변 도메인의 FW 또는 CDR 내로의 삽입에 상응하는 더 적은 아미노산 또는 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 이후에 단일 아미노산 삽입물(카밧에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FW 잔기 82 이후에 삽입된 잔기(예를 들어, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 항체 54H7은 카밧 시스템에 따라 넘버링된다.
잔기의 카밧 넘버링은 주어진 항체에 대해 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카밧 넘버링된 서열과 정렬시킴으로써 결정할 수 있다. 코티아(Chothia)는 대신 구조적 루프의 위치를 지칭한다(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). 코티아 CDR-H1 루프의 말단은 카밧 넘버링 관례를 사용하여 넘버링했을 때 루프의 길이에 따라 H32 내지 H34로 달라진다(이는 카밧 넘버링 체계가 삽입을 H35A 및 H35B에 위치시키기 때문이다; 만일 35A와 35B가 존재하지 않는다면, 루프는 32에서 종결되고; 35A만 존재할 경우, 루프는 33에서 종결되며; 35A 및 35B 둘 다 존재할 경우, 루프는 34에서 종결된다). AbM 과가변 영역은 카밧 CDR 및 코티아 구조적 루프 사이의 절충물을 나타내며, 옥스포드 몰레큘러(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. CDR의 IMGT(문헌[Lefranc, M.-P. et al. Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77 (2003)]) 분류가 사용될 수도 있다.
용어 "카밧에서와 같은 EU 인덱스"는 문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 기술된 인간 IgG1 EU 항체의 넘버링 시스템을 지칭한다. 예를 들어, "L234"와 "EU L234" 둘 다는 카밧에 기술된 바와 같이 EU 인덱스에 따른 위치 234의 아미노산 류신을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "Fc 도메인", "Fc 영역" 및 "IgG Fc 도메인"은 IgG 분자의 파파인 소화에 의해 얻어진, 결정화 가능한 단편과 관련이 있는, 면역글로불린, 예를 들어, IgG 분자의 부분을 지칭한다. Fc 영역은 이황화 결합에 의해 연결된 IgG 분자의 2개의 중쇄의 C-말단 절반을 포함한다. 그것은 어떠한 항원 결합 활성도 갖고 있지 않지만, 탄수화물 모이어티와 보체 및 FcRn 수용체를 포함한 Fc 수용체를 위한 결합 부위를 함유한다. 예를 들어, Fc 도메인은 전체의 제2 불변 도메인 CH2(인간 IgG1의 EU 위치 231 내지 340의 잔기) 및 제3 불변 도메인 CH3(인간 IgG1의 EU 위치 341 내지 447의 잔기)을 함유한다.
Fc는 단리된 이러한 영역을, 또는 항체, 항체 단편 또는 Fc 융합 단백질의 맥락에서 이러한 영역을 지칭할 수 있다. EU 위치 270, 272, 312, 315, 356 및 358을 포함하나 이에 한정되지 않는 Fc 도메인 내의 다수의 위치에서 다형성이 관찰되었다. 따라서, "야생형 IgG Fc 도메인" 또는 "WT IgG Fc 도메인"은 임의의 천연 발생 IgG Fc 영역(즉, 임의의 대립형질)을 지칭한다. 무수한 Fc 돌연변이체, Fc 단편, Fc 변이체, 및 Fc 유도체가 예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호; 제5,885,573호; 제5,677,425호; 제6,165,745호; 제6,277,375호; 제5,869,046호; 제6,121,022호; 제5,624,821호; 제5,648,260호; 제6,528,624호; 제6,194,551호; 제6,737,056호; 제7,122,637호; 제7,183,387호; 제7,332,581호; 제7,335,742호; 제7,371,826호; 제6,821,505호; 제6,180,377호; 제7,317,091호; 제7,355,008호; 미국 특허 공개 제2004/0002587호; 및 PCT 공개 WO 99/058572호, WO 2011/069164호 및 WO 2012/006635호에 기술되어 있다.
인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 중쇄의 서열은 다수의 서열 데이터베이스, 예를 들어, 각각 수탁 번호 P01857(IGHG1_HUMAN), P01859(IGHG2_HUMAN), P01860(IGHG3_HUMAN), 및 P01861(IGHG1_HUMAN) 하에 Uniprot 데이터베이스(www.uniprot.org)에서 찾아볼 수 있다.
용어 "YTE" 또는 "YTE 돌연변이체"는 인간 FcRn으로의 결합을 증가시키고 돌연변이를 갖는 항체의 혈청 반감기를 개선하는 IgG1 Fc 도메인에서의 돌연변이 세트를 지칭한다. YTE 돌연변이체는 IgG의 중쇄 내로 도입된 3개의 "YTE 돌연변이": M252Y, S254T, 및 T256E의 조합을 포함하며, 여기서, 넘버링은 카밧에서와 같은 EU 인덱스에 따른 것이다. 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제7,658,921호를 참조한다. YTE 돌연변이체는 동일한 항체의 야생형 버전과 비교하여 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 문헌[Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-24 (2006)] 및 미국 특허 제7,083,784호를 참조하며, 이들 문헌은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. "Y" 돌연변이체는 M256Y 돌연변이만을 포함하고; 유사하게 "YT" 돌연변이는 M252Y 및 S254T만을 포함하며, "YE" 돌연변이는 M252Y 및 T256E만을 포함한다. 다른 돌연변이가 EU 위치 252 및/또는 256에 존재할 수 있음이 특별히 고려된다. 특정 양태에서, EU 위치 252에서의 돌연변이는 M252F, M252S, M252W 또는 M252T일 수 있고/있거나, EU 위치 256에서의 돌연변이는 T256S, T256R, T256Q 또는 T256D일 수 있다.
용어 "N3" 또는 "N3 돌연변이체"는 FcRn으로의 결합의 증가를 초래하며, 돌연변이를 갖는 항체의 혈청 반감기를 개선시키는 IgG1 Fc 도메인 내의 돌연변이의 세트를 지칭한다. N3 돌연변이체는 야생형 IgG1 불변 도메인 염기 구조 내로 혼입되는 위치 432 내지 437에 서열 Cys-Ser-Trp-His-Leu-Cys(SEQ ID NO: 68)을 포함한다. 본원에 참조로 포함되는 WO2015175874호를 참조한다.
용어 "천연 발생 O1"은 일반적으로 O1 다당류 또는 이의 단편이 발생할 수 있는 상태를 지칭한다. 천연 발생 O1은 재조합 기술을 이용하여 인코딩하는 핵산의 이전 도입 없이, 세포에 의해 천연적으로 생성되는 O1 다당류를 의미한다. 따라서, 천연 발생 O1은 예를 들어 클레브시엘라 뉴모니아에 의해 생성된 것일 수 있고/있거나, 클레브시엘라 속의 상이한 구성원으로부터 단리된 것일 수 있다.
용어 "재조합 O1"은 O1 다당류 또는 이의 단편이 발생할 수 있는 상태를 지칭한다. 재조합 O1은 예를 들어, 이종 숙주에서, 재조합 DNA에 의해 생성된 O1 다당류 또는 이의 단편을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "반감기" 또는 "생체내 반감기"는 주어진 동물의 순환계에서의 본 발명의 특정 유형의 항체, 항원 결합 단백질, 또는 폴리펩티드의 생물학적 반감기를 지칭하며, 동물에서 투여된 양의 절반이 동물의 순환계 및/또는 다른 조직으로부터 제거되는 데에 필요한 시간으로 표현된다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 특정 치료의 수여자가 되는, 인간, 비-인간 영장류, 설치류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 곰, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 동물(예를 들어, 포유동물)을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 진단, 예후, 또는 치료를 위한, 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 지칭한다. "클레브시엘라 감염과 관련된 질환을 갖는 환자"와 같은 본원에 사용된 어구는 클레브시엘라 감염과 관련된 그 질환을 위한 치료법, 영상화 또는 기타 진단 절차, 및/또는 예방적 처치의 시행으로부터 이익을 얻을 포유동물 대상체와 같은 대상체를 포함한다.
"클레브시엘라"는 엔테로박테리아과의 그람 음성, 조건 혐기성, 간상 박테리아의 속을 지칭한다. 클레브시엘라는 예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 플란티콜라, 클레브시엘라 그래뉼로마티스, 클레브시엘라 오자에나 및 클레브시엘라 리노스클레로마티스를 포함한다.
클레브시엘라 속의 구성원은 전형적으로 그들의 세포 표면 상에 적어도 2가지 유형의 탄수화물 항원, O 항원 및 K 항원을 발현한다. O 항원은 지질다당류이고, K 항원은 협막 다당류이다. 이들 항원의 구조적 가변성은 클레브시엘라 "혈청형"에서의 그들의 분류를 위한 기초를 형성한다. 따라서, 다수의 클레브시엘라 균주 또는 혈청형에 결합하는 O1 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 능력은 상이한 O 및/또는 K 항원을 가진 클레브시엘라에 결합하는 O1 결합 단백질의 능력을 지칭한다. 본원에 제공되는 일부 구현예에서, 클레브시엘라는 O1 혈청형의 것이다.
본원에 사용된 용어 "약제학적 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과를 나타낼 수 있게 하는 형태로 존재하고, 조성물이 투여될 대상체에게 허용 불가능하게 독성인 추가적인 성분은 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 조성물은 멸균일 수 있다.
본원에 개시된 항원 결합 단백질(항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적과 관련하여, 경험적으로 및 통상적인 방식으로 결정할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 대상체 또는 포유동물에서 질병 또는 질환을 "치료하기에" 효과적인 폴리펩티드, 예를 들어, 항체를 포함한 항원 결합 단백질, 또는 다른 약물의 양을 지칭하며, 클레브시엘라-매개의 질병 또는 질환을 갖는 대상체에 약간의 개선 또는 이익을 제공한다. 따라서, "치료적으로 유효한" 양은 클레브시엘라-매개의 질병 또는 질환의 적어도 하나의 임상적 증상의 약간의 완화, 경감, 및/또는 감소를 제공하는 양이다. 본 발명의 방법 및 시스템에 의해 치료될 수 있는 클레브시엘라-매개의 질병 또는 질환과 관련된 임상적 증상은 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 또한, 해당 분야의 숙련자라면 치료적 효과는, 약간의 이익이 대상체에 제공되기만 한다면, 완벽하거나 치유력이 있을 필요는 없음을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 용어 "치료적으로 유효한"은 이를 필요로 하는 환자에서 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아) 또는 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아) 활성을 감소시킬 수 있는 치료제의 양을 지칭한다. 투여된 실제 양 및 투여 속도 및 시간-과정은 치료되는 것의 성질 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 치료 처방, 예를 들어, 투여량 등에 대한 결정은 일반 의사 및 다른 의사의 책임 내이다. 항체 및 이의 항원 결합 단편의 적절한 용량은 당해 분야에 잘 알려져 있으며; 문헌[Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664]; 문헌[Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922]을 참조한다.
본원에 사용된 "충분량" 또는 클레브시엘라-매개의 질병 또는 질환을 갖는 환자에서 특정 결과를 달성하기에 "충분한 양"은, 선택적으로는 치료적 효과인 (즉, 치료적 유효량의 투여에 의해) 원하는 효과를 생성하기에 유효한 치료제(예를 들어, 본원에 개시된 항체를 포함한, 항원 결합 단백질)의 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이러한 특정 결과는 이를 필요로 하는 환자에서의 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아) 또는 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아) 활성의 감소이다.
본원에 사용될 때 용어 "표지"는 "표지된" 폴리펩티드 또는 항체를 생성하기 위해, 폴리펩티드, 예를 들어, 항체를 포함하는 항원 결합 단백질에 직접적으로 또는 간접적으로 컨쥬게이트되는 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소적 표지의 경우, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매 작용시킬 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "완화하는" 또는 "완화하기 위한" 또는 "또는 완화"와 같은 용어는 진단된 병리학적 질환 또는 장애를 치유, 둔화, 이의 증상을 경감, 및/또는 이의 진행을 중단하는 치료적 조치를 지칭한다. "예방하는"과 같은 용어는 표적화된 병리학적 질환 또는 장애를 예방하고/하거나 그의 발생을 늦추는 예방적 조치를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 이들은 질병 또는 질환을 이미 갖고 있는 이들을 포함한다. 예방을 필요로 하는 이들은 질병을 앓기 쉬운 이들 및 질병 또는 질환이 예방되어야 하는 이들을 포함한다. 예를 들어, 어구 "클레브시엘라-매개의 질병 또는 질환을 갖는 환자를 치료하는"은 클레브시엘라-매개의 질병 또는 질환의 중증도를, 바람직하게는 대상체가 그로 인한 불편함 및/또는 변경된 기능으로 고통 받지 않을 정도까지, 감소시키는 것을 지칭한다(예를 들어, 치료되지 않은 환자와 비교할 때, 천식 악화의 상대적인 감소). 어구 "클레브시엘라-매개의 질병 또는 질환을 예방하는"은 클레브시엘라-매개의 질병 또는 질환의 가능성을 감소시키는 것 및/또는 클레브시엘라-매개의 질병 또는 질환의 발생을 감소시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "클레브시엘라 감염과 관련된 질환"은 질병 또는 질환을 갖는 대상체에서 클레브시엘라 감염(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 플란티콜라, 클레브시엘라 오자에나, 클레브시엘라 리노스클레로마티스 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스로의 감염)에 의해 (단독으로 또는 다른 매개자와 관련하여) 유발되거나, 이에 의해 악화되거나, 이와 관련되거나, 또는 이에 의해 지속된 임의의 병리학을 지칭한다. 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 비 제한적인 예로는 폐렴, 요로 감염, 패혈증(septicemia/sepsis), 신생아 패혈증, 설사, 연조직 감염, 장기 이식 후 감염, 수술 감염, 상처 감염, 폐 감염, 화농성 간농양, 눈속염증, 수막염, 괴사성 수막염, 강직성 척추염 및 척추관절병이 포함된다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라 감염은 병원내 감염이다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라 감염은 기회 감염이다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라 감염은 장기 이식에 뒤따른 것이다. 일부 구현예에서, 대상체는 클레브시엘라에 오염된 의료 장치, 예를 들어, 인공호흡기, 카테터, 또는 정맥내 카테터에 노출된다.
CDR 또는 CDR 세트를 지니기 위한 구조는 일반적으로, CDR 또는 CDR 세트가, 재정렬된 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 자연 발생 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR 또는 CDR 세트에 해당하는 위치에 위치한, 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 이의 상당한 부분일 것이다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌[Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987]과 인터넷에서 이용할 수 있는 이의 업데이트 내용(http://immuno.bme.nwu.edu 또는 임의의 검색 엔진을 이용하여 "Kabat" 검색)을 참조하여 결정할 수 있는데, 이들은 본원에 참조로 포함된다. CDR은 또한 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B와 같은 다른 스캐폴드가 지닐 수도 있다.
본원에 실질적으로 기술된 CDR 아미노산 서열은 인간 가변 도메인 또는 이의 상당한 부분에 CDR로서 전달될 수 있다. 본원에 실질적으로 기술된 HCDR3 서열은 본 발명의 구현예를 나타내며, 이들 각각은 인간 중쇄 가변 도메인 또는 이의 상당한 부분에 HCDR3으로 전달될 수 있다.
본 발명에 이용된 가변 도메인은 임의의 생식계열 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 수득할 수 있거나, 공지된 인간 가변 도메인의 공통 서열을 기초로 한 합성 가변 도메인일 수 있다. CDR 서열(예를 들어, CDR3)은 재조합 DNA 기술을 이용하여 CDR(예를 들어, CDR3)이 없는 가변 도메인의 레퍼토리 내로 도입될 수 있다.
예를 들어, Marks 등(본원에 참조로 포함된, 문헌[Bio/Technology, 1992, 10:779-783])은 CDR3이 없는 VH 가변 도메인 레퍼토리를 제공하도록, 가변 도메인 영역의 5' 말단에 지향된 또는 그에 인접한 공통 프라이머가 인간 VH 유전자의 제3 프레임워크 영역에 대한 공통 프라이머와 함께 이용되는 항체 가변 도메인의 레퍼토리 생성 방법을 제공한다. Marks 등은 또한 이러한 레퍼토리가 특정 항체의 CDR3과 어떻게 결합될 수 있는지를 기술하고 있다. 유사한 기법을 이용하여, 본 발명의 CDR3-유래 서열은 CDR3이 없는 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리와 셔플(shuffle)될 수 있고, 셔플된 완전한 VH 또는 VL 도메인은 동족 VL 또는 VH 도메인과 조합되어 항원 결합 단백질을 제공할 수 있다. 이어서, 레퍼토리는 WO92/01047호 또는 문헌[Kay, B.K., Winter, J., and McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press]을 포함한 다수의 임의의 후속 문헌의 파지 디스플레이 시스템과 같은 적합한 숙주 시스템에 디스플레이될 수 있으며, 그 결과 적합한 항원 결합 단백질이 선택될 수 있다. 레퍼토리는 104개 이상의 개별 구성원, 예를 들어, 106 내지 108 또는 1010개 구성원으로부터의 임의의 것으로부터 구성될 수 있다. 다른 적합한 숙주 시스템은 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, T7 디스플레이, 리보솜 디스플레이 등을 포함한다. 리보솜 디스플레이에 대한 검토는 본원에 참조로 포함된, 문헌[Lowe D and Jermutus L, 2004, Curr. Pharm, Biotech, 517-27], 또한 WO92/01047호를 참조한다.
유사한 셔플링 또는 조합 기법 또한 Stemmer(본원에 참조로 포함되는 문헌[Nature, 1994, 370:389-391])가 개시하고 있는데, 그는 기법을 β-락타마제 유전자와 관련하여 기술하고 있으나, 접근법이 항체 생성을 위해 이용될 수 있음을 관찰하였다.
추가적인 대안은 전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 발생시키기 위하여 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이유발을 이용하여 본 발명의 CDR-유래 서열을 지닌 신규한 VH 또는 VL 영역을 발생시키는 것이다. 그러한 기법은 Gram 등(문헌[1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580])이 기술하였는데, 그는 오류-유발(error-prone) PCR을 이용했다. 일부 구현예에서, 하나 또는 두 개의 아미노산 치환이 HCDR 및/또는 LCDR 세트 내에 이루어진다.
이용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 돌연변이유발을 유도하는 것이다. 이러한 기법은 Barbas 등(문헌[1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813])과 Schier 등(문헌[1996, J. Mol. Biol. 263:551-567])에 의해 개시되었다.
본 발명의 방법 및 기법은 일반적으로 당해 분야에 잘 알려져 있는 통상적인 방법에 따라, 그리고 달리 표시되지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적인 참고문헌 및 더욱 구체적인 참고문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)] 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)] 및 문헌[Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]을 참조하며, 이들 전부는 본원에 참조로 포함된다.
숙련자는 당해 분야의 통상적인 방법론을 이용하여 본 발명의 항원 결합 단백질을 제공하기 위해 상기 기술된 기법을 이용할 수 있을 것이다.
II. O1 항원 결합 분자
본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 O1 항원 결합 분자, 예를 들어, 항원 결합 단백질, 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본원에 정의되는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하는 "O1 항원 결합 분자"는 O2에 결합하지 않는다. 종합하여, 이들 작용제는 본원에 "O1 결합 분자" 또는 "O1-결합제"로 지칭된다.
클레브시엘라 지질다당류(LPS)의 O1 항원은 반복 단위 D-갈락탄(D-Gal I) I 및 D-갈락탄 II(D-Gal II)로 구성된 2개의 구조적으로 별개의 도메인을 함유한다. 도 12를 참조한다. 저분자량 D-Gal I 폴리머는 코어 올리고당에 직접 연결되며, 구조 →3)-β-D-Galp-(1→3)-α-D-Galp-(1→의 반복 단위로 구성된다. O-항원 생합성은 부분적으로 6개의 유전자(wzm, wzt, glf, wbbM, wbbN 및 wbbO)로 구성된 wb(rfb) 유전자 클러스터의 생성물에 의해 수행된다(문헌[Whitfield, C. et al. 1991. Expression of two structurally distinct D-Galactan O antigens in the lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae serotype O1. J. Bacteriology. 1420-1431]; 문헌[Clarke, B. R. and Whitfield C. 1992. Molecular cloning of the rfb region of Klebsiella pneumoniae serotype O1:K20. J. Bacteriology. 174: 4614-4621]). D-Gal I 도메인은 또한 클레브시엘라 O2 LPS에 대한 주요 O-항원 구성성분이다. D-Gal I의 원위 말단에 연결된 고분자량 D-Gal II 폴리머는 구조 →3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→의 반복 단위로 이루어져 있다. D-Gal II 생합성에 필요한 유전자는 최근에 wbbY 및 wbbZ로 확인되었으며, 이는 wb 클러스터에 연결되지 않는다(문헌[Hsieh, P. et al. 2014. D-galactan II is an immunodominant antigen in O1 LPS and affects virulence in Klebsiella pneumoniae: implication in vaccine design. Frontiers in Microbiology. 5: 1-13] 참조). D-Gal II의 첨가에 의해 O1 혈청형이 정의되며, 혈청 저항 및 PLA를 야기하는 클레브시엘라 뉴모니아 중에 높은 유병률에 기여한다(문헌[Hsieh, P.F. 2012. Lipopolysaccharide O1 antigen contributes to the virulence in Klebsiella pneumoniae causing primary pyogenic liver abscess.]; 문헌[Pan Y-J., et al., PLoS ONE 7(3): e33155 (2013) doi:10.1371/journal.pone.0033155]).
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 폴리펩티드인 단리된 항원 결합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편이다.
특정 구현예에서, O1 결합 분자는 항체 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 뮤린, 비-인간, 인간화, 키메라, 재표면화 또는 인간 항원 결합 단백질인 단리된 항원 결합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 인간화, 키메라, 재표면화 또는 인간 항원 결합 단백질인 단리된 항원 결합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, O1 결합 분자는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, O1 결합 분자는 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은: a) 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 옵소닌 포식 살해(OPK)를 유도하거나; b) 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)를 살해하거나, c) 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)를 살해한다.
또한, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 OPK를 유도하지만, LPS를 중화시키지 않는다. 본원에 제공되는 실시예에서 입증된 바와 같이, 높은 수준의 생체내 활성은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하며, OPK를 유도하지만, LPS를 중화시키지 않는 항원 결합 단백질과 연관된다.
또한, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 OPK를 유도하고, LPS를 중화시킨다.
O1-결합제는 항-O1 항원 항체 KPE33, KPE33V2016, KPA27, KPB202, KBJ4, 54H7 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 또한, O1-결합제는 KPE33, KPE33V2016, KPA27, KPB202, KBJ4 또는 54H7과 동일한 클레브시엘라 뉴모니아 O1 에피토프에 특이적으로 결합하는 O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함한다.
일부 구현예에서, O1-결합제, 예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 클론 Ru-O1을 포함하지 않는다. 문헌[Rukavina T., et al., Infect Immun 65:1754-60 (1997)]을 참조한다. 일부 구현예에서, O1-결합제, 예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린 항체가 아니다.
일부 구현예에서, O1 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원의 D-갈락탄 II 도메인에 결합한다. 일부 구현예에서, O1 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원의 D-갈락탄 II 도메인 내의 에피토프에 결합한다.
또한, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원 결합 단편)는 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원으로의 KPE33, KPE33V2016, KPA27, KPB202, KPJ4 또는 54H7의 결합을 경쟁적으로 억제하는 O1-결합제를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-O1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쟁 ELISA 검정에서 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원으로의 KPE33, KPE33V2016, KPA27, KPB202, KPJ4 또는 54H7의 결합을 경쟁적으로 억제한다. 일부 구현예에서, 항-O1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쟁 ELISA 검정에서 클레브시엘라 뉴모니아로의 KPE33, KPE33V2016, KPA27, KPB202, KPJ4 또는 54H7의 결합을 경쟁적으로 억제한다.
일부 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원 결합 단편)는 또한, 예를 들어, 옥텟 플랫폼에 의해 측정시, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원으로의 54H7의 결합을 경쟁적으로 억제하지만, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원으로의 KPE33의 결합을 경쟁적으로 억제하지 않는 O1-결합제를 포함한다. 일부 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원 결합 단편)는 또한, 예를 들어, 옥텟 플랫폼에 의해 측정시, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원으로의 KPE33의 결합을 경쟁적으로 억제하지만, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원으로의 54H7의 결합을 경쟁적으로 억제하지 않는 O1-결합제를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-O1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (예를 들어, FACS 검정에 의해 측정시) (예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 균주를 포함하는) O1 클레브시엘라 균주에 결합하지만, 상응하는 wbbYZ 낙아웃 균주에는 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 항-O1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (예를 들어, FACS 검정에 의해 측정시) 클레브시엘라 균주 Kp1131115에 결합하지만, Kp1131115ΔwbbYZ 낙아웃 균주에 결합하지 않는다.
O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원 결합 단편)는 또한, KPE33, KPE33V2016, KPA27, KPB202, KBJ4 또는 54H7의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 서열을 포함하는 O1-결합제를 포함한다. KPE33, KPE33V2016, KPA27, KPB202, KBJ4 및 54H7의 CDR 서열은 하기 표 1 및 표 2에 기술되어 있다. 54H7 이외의 모든 항체에 있어서, 표 1 및 표 2에 열거된 CDR을 IMGT 시스템을 사용하여 결정하였다. 54H7에 있어서, CDR을 카밧 시스템을 사용하여 결정하였다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
본원에 기술된 항원 결합 단백질(항-O1 항원 항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)은 본원에 기술된 개별 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 중 하나를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 항원 결합 단백질(항-O1 항원 항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)은 또한, 가변 경쇄 및 가변 중쇄 둘 모두를 포함할 수 있다. 항-O1 항원 KPE33, KPE33V2016, KPA27, KPB202, KBJ4 및 54H7 항체의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 서열은 하기 표 3 및 표 4에 제공되어 있다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO: 8, 12, 21 또는 30과 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 9, 13, 22, 31과 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)은 SEQ ID NO: 8, 12, 21 또는 30의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 9, 13, 22, 31의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 8, 9, 12, 13, 21, 22, 30 또는 31과 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)은 오직 보존적 아미노산 치환에 의해서만, SEQ ID NO: 8, 9, 12, 13, 21, 22, 30 또는 31과 상이하다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)은 SEQ ID NO: 8, 12, 21 또는 30과 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 9, 13, 22, 31과 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)은 항체 클론 Ru-O1이 아니다(문헌[Rukavina T., et al., Infect Immun 65:1754-60 (1997)] 참조).
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 95% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 OPK를 유도하며, 선택적으로, 항원 결합 단백질은 LPS를 중화시키지 않거나, LPS를 중화시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 95% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 혈청 살균 검정에 의해 측정시 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)를 살해한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 95% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)를 살해한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 95% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 항생제(예를 들어, 메로페넴, 카바페넴 또는 콜리스틴(colistin))와 상승적으로 작용한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 96% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 OPK를 유도하며, 선택적으로, 항원-결합 단백질은 LPS를 중화시키지 않거나, LPS를 중화시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 96% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 혈청 살균 검정에 의해 측정시 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)를 살해한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 96% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)를 살해한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 96% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 항생제(예를 들어, 메로페넴, 카바페넴 또는 콜리스틴)와 상승적으로 작용한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 97% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 OPK를 유도하며, 선택적으로, 항원-결합 단백질은 LPS를 중화시키지 않거나, LPS를 중화시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 97% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 혈청 살균 검정에 의해 측정시 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)를 살해한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 97% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)를 살해한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 97% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 항생제(예를 들어, 메로페넴, 카바페넴 또는 콜리스틴)와 상승적으로 작용한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 98% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 OPK를 유도하며, 선택적으로, 항원 결합 단백질은 LPS를 중화시키지 않거나, LPS를 중화시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 98% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 혈청 살균 검정에 의해 측정시 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)를 살해한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 98% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)를 살해한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 98% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 항생제(예를 들어, 메로페넴, 카바페넴 또는 콜리스틴)와 상승적으로 작용한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 99% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 OPK를 유도하며, 선택적으로, 항원 결합 단백질은 LPS를 중화시키지 않거나, LPS를 중화시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 99% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 혈청 살균 검정에 의해 측정시 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)를 살해한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 99% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)를 살해한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 각각 SEQ ID NO: 8 및 9, 12 및 13, 31 및 22, 또는 30 및 31과 적어도 99% 동일한 VH 및 VL을 포함하며, 항원 결합 단백질은 항생제(예를 들어, 메로페넴, 카바페넴 또는 콜리스틴)와 상승적으로 작용한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 더하여, 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 플란티콜라, 클레브시엘라 오자에나, 클레브시엘라 리노스클레로마티스 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스 O1 항원에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 더하여, 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 플란티콜라, 클레브시엘라 오자에나, 클레브시엘라 리노스클레로마티스 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스 O1 항원에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)을 제공하며, 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)은 항체 클론 Ru-O1가 아니다(문헌[Rukavina T., et al., Infect Immun 65:1754-60 (1997)] 참조). O1 항원에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질의 능력을 문헌[Trautmann M., et al., J. Med. Microbiol 44: 44-51 (1996)]에 제공되는 것들과 같은 방법을 사용하여 시험할 수 있다.
모노클로날 항체는 문헌[Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]에 의해 기술된 것들과 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법을 이용하여 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 면역화시켜 면역화 항원에 특이적으로 결합할 항체의 림프구에 의한 생성을 유발한다. 림프구는 시험관내에서 면역화될 수도 있다. 면역화 후, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 단리하고 적합한 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한 후, 이 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 림프구 및 골수종 세포로부터 선별할 수 있다. 그 다음, 면역침전, 면역블롯팅 또는 시험관내 결합 검정(예를 들면, 방사성면역검정(RIA); 효소결합 면역흡착 검정(ELISA))으로 결정된 바에 따라, 선택된 항원에 대해 특이적으로 유도된 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를, 표준 방법(문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986])을 이용하여 시험관내 배양물에서 증식시킬 수 있거나 동물의 생체내에서 증식시킬 수 있다. 그 후, 상기 폴리클로날 항체에 대하여 기술된 바와 같이, 배양 배지 또는 복수액으로부터 모노클로날 항체를 정제할 수 있다.
대안적으로 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 이용하여 제조될 수도 있다. 모노클로날 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해서 성숙 B 세포 또는 하이브리도마 세포로부터 단리되고, 그들의 서열은 통상적인 절차를 이용하여 결정된다. 그 다음, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는, 숙주 세포, 예컨대, 에스케리키아 콜라이 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 달리 생성하지 않는 골수종 세포 내로 트랜스펙션시킬 때 숙주 세포에 의해 모노클로날 항체가 생성되는, 적합한 발현 벡터 내로 클로닝된다. 또한, 원하는 종의 재조합 모노클로날 항체 또는 이의 단편은 기술된 바와 같이 원하는 종의 CDR을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다(문헌[McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554]; 문헌[Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628]; 및 문헌[Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597]).
모노클로날 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)는 재조합 DNA 기술을 이용하여 다수의 상이한 방식으로 더 변형되어 대안적인 항체를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들면, 마우스 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인은 1) 키메라 항체를 생성하기 위해 예를 들면, 인간 항체의 이들 영역들 대신에 치환될 수 있거나, 2) 융합 항체를 생성하기 위해 비-면역글로불린 폴리펩티드 대신에 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 모노클로날 항체의 원하는 항체 단편을 생성하기 위해 절단되거나 제거된다. 가변 영역의 위치-지정 또는 고밀도 돌연변이유발이 모노클로날 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화하는 데 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 대한 모노클로날 항체는 인간화 항체이다. 특정 구현예에서, 이러한 항체는 인간 대상체에게 투여될 때 항원성 및 HAMA(인간 항-마우스 항체) 반응을 감소시키기 위해 치료적으로 이용된다. 인간화 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 특정 대안적인 구현예에서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 대한 항체는 인간 항체이다.
인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기법을 이용하여 직접적으로 제조될 수 있다. 표적 항원에 대하여 유도된 항체를 생성하는, 시험관내에서 면역화되었거나 면역화된 개체로부터 단리된 불멸화된 인간 B 림프구가 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; 문헌[Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95]; 및 미국 특허 제5,750,373호 참조). 또한, 인간 항체는 예를 들어, 문헌[Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314], 문헌[Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162], 문헌[Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381] 및 문헌[Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581]에 기술된 바와 같이, 파지 라이브러리로부터 선별될 수 있고, 여기서 그러한 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다. 항체 파지 라이브러리의 생성 및 이용을 위한 기법 또한 미국 특허 제5,969,108호, 제6,172,197호, 제5,885,793호, 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호; 제6,593,081호; 제6,300,064호; 제6,653,068호; 제6,706,484호; 및 제7,264,963호; 및 문헌[Rothe et al., 2008, J. Mol. Bio., 376: 1182-200](이들 각각은 전체가 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 친화도 성숙 전략 및 체인 셔플링 전략(그 전체가 참조로 포함된 문헌[Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783])이 당해 분야에 공지되어 있으며, 고친화도 인간 항체를 생성하기 위하여 이용될 수 있다.
인간화 항체는 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에서 면역화 시에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 인간 면역글로불린 유전자좌를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서도 제조될 수 있다. 이 접근법은 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호에 기술되어 있다.
본 발명에 따르면, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적인 단쇄 항체의 생성 기법이 채택될 수 있다(미국 특허 제4,946,778호 참조). 또한, O1 항원 또는 이의 단편에 대한 원하는 특이성을 가진 모노클로날 Fab 단편의 신속하고 효과적인 확인을 가능하게 하기 위해 Fab 발현 라이브러리(문헌[Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989)])를 작제하는 방법이 채택될 수 있다. (a) 항체의 펩신 소화에 의해 생성된 F(ab')2 단편; (b) F(ab')2 단편의 이황화 가교의 환원에 의해 생성된 Fab 단편, (c) 항체의 파파인 및 환원제 처리에 의해 생성된 Fab 단편 및 (d) Fv 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는 항체 단편이 당해 분야의 기법에 의해 생성될 수 있다.
특히 항체 단편의 경우에, 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위하여 항체를 변형시키는 것이 추가로 바람직할 수 있다. 이것은 예를 들면, 항체 단편의 적절한 영역의 돌연변이로 살비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체 단편 내로 도입하거나, (예를 들면, DNA 또는 펩티드 합성에 의해) 어느 한 말단 또는 중간에 항체 단편에 융합되는 펩티드 태그 내로 에피토프를 혼입시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)은 항체 불변 영역 또는 이의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 그의 C 말단 끝에서 인간 Cκ 또는 Cγ 쇄를 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인을 기초로 한 항원 결합 단백질이 그의 C 말단 끝에서 임의의 항체 아이소타입, 예를 들어, IgG, IgA, IgE 및 IgM, 및 임의의 아이소타입 하위-부류, 특히 IgG1 및 IgG4로부터 유래된 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부(예를 들어, CH1 도메인)에 부착될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄는 항체 아이소타입 하위-부류 IgG1로부터 유래될 수 있다. 이들 성질을 가지며 가변 영역을 안정화하는 임의의 합성 또는 기타 불변 영역 변이체 또한 본 발명의 구현예에 사용하기 위해 고려된다. 항체 불변 영역은 YTE 돌연변이가 있는 Fc 영역일 수 있으며, 그 결과 Fc 영역은 다음과 같은 아미노산 치환을 포함한다: M252Y/S254T/T256E. 이 잔기 넘버링은 카밧 넘버링을 기초로 한다. Fc 영역의 YTE 돌연변이는 항원-결합 단백질의 혈청 지속성을 증가시킨다(문헌[Dall'Acqua, W.F. et al. (2006) The Journal of Biological Chemistry, 281, 23514-23524] 참조). 항체 불변 영역은 Fc 영역이 카밧 넘버링에 기초하여 위치 432 내지 437(위치 437과 438 사이에 삽입 부재)에 서열 Cys-Ser-Trp-His-Leu-Cys(SEQ ID NO: 68)을 포함하도록 N3 돌연변이가 있는 Fc 영역일 수 있다. 또한, Fc 영역 내의 N3 돌연변이는 항원-결합 단백질의 혈청 지속성을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 항체 불변 영역은 YTE 돌연변이, N3 돌연변이, 또는 YTE 및 N3 돌연변이 둘 모두를 포함할 수 있다.
본원의 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이펙터 기능을 향상시키기 위해, 예컨대, 항원-의존적 세포-매개의 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 증진시키기 위해, 변형된다. 이것은 하나 이상의 아미노산 치환을 만들거나 Fc 영역에 시스테인을 도입하여 달성할 수 있다. 항체의 이펙터 기능을 증진시키거나 약화시킬 수 있는 및/또는 항체의 약동학적 성질(예를 들어, 반감기)을 변경할 수 있는 Fc 영역의 변이체(예를 들어, 아미노산 치환 및/또는 부가 및/또는 결실)가 예를 들어, 미국 특허 제6,737,056B1호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0132101A1호, 미국 특허 제6,194,551호 및 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호에 개시되어 있다. 하나의 특정한 치환 세트인 3중 돌연변이 L234F/L235E/P331S("TM"; 카밧 넘버링)는 인간 IgG1 분자의 인간 C1q, CD64, CD32A 및 CD16으로의 결합 활성의 극심한 감소를 유발한다. 예컨대, 문헌[Oganesyan et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64:700-704 (2008)]을 참조한다. 다른 경우에서는, 그것은 불변 영역 변형이 혈청 반감기를 증가시키는 것일 수 있다. FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화도를 증가시킴으로써 Fc 영역을 포함하는 단백질의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다.
항원-결합 단백질이 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 때, 그것은 (a) IgA 불변 도메인; (b) IgD 불변 도메인; (c) IgE 불변 도메인; (d) IgG1 불변 도메인; (e) IgG2 불변 도메인; (f) IgG3 불변 도메인; (g) IgG4 불변 도메인; 및 (h) IgM 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단백질은 IgG1 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단백질은 IgG1/IgG3 키메라 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)은 (a) Ig 카파 불변 도메인; 및 (b) Ig 람다 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 면역글로불린 불변 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)은 인간 IgG1 불변 도메인 및 인간 람다 불변 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)은 인간 IgG2 불변 도메인 및 인간 람다 불변 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 단백질은 위치 252, 254 및 256에 돌연변이를 함유하는 IgG1 Fc 도메인을 포함할 수 있는데, 이때, 위치 넘버링은 카밧에서의 EU 인덱스에 따른 것이다. 예를 들어, IgG1 Fc 도메인은 M252Y, S254T, 및 T256E의 돌연변이를 함유할 수 있는데, 이때, 위치 넘버링은 카밧에서의 EU 인덱스에 따른 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항원-결합 단백질의 단리된 VH 도메인 및/또는 본 발명의 항원-결합 단백질의 단리된 VL 도메인에 관한 것이다.
본 발명의 항원-결합 단백질(항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)은 검출 가능한 또는 기능적인 표지로 표지될 수 있다. 검출 가능한 표지로는 131I 또는 99Tc와 같은 방사성 표지를 포함하는데, 이들은 항체 영상화 분야에서 공지된 통상적인 화학을 이용하여 본 발명의 항체에 부착될 수 있다. 또한, 표지에는 호스래디쉬 페록시다제와 같은 효소 표지가 포함된다. 표지는 특이적인 동족의 검출 가능한 모이어티, 예컨대, 표지된 아비딘으로의 결합을 통해 검출될 수 있는 비오틴과 같은 화학적 모이어티를 추가로 포함한다. 본 발명의 항원-결합 단백질(항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)에 부착될 수 있는 기타 검출 가능한 또는 기능적인 표지의 비 제한적인 예에는 동위원소 표지, 자성 표지, 산화환원 활성 모이어티, 광학 염료, 비오티닐화된 기, 형광 모이어티, 예컨대, 비오틴 신호전달 펩티드, 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(BFP), 시안 형광 단백질(CFP) 및 황색 형광 단백질(YFP), 및 2차 리포터에 의해 인식되는 폴리펩티드 에피토프, 예컨대, 히스티딘 펩티드(his), 헤마글루티닌(HA), 금 결합 펩티드, Flag; 방사성 동위원소, 방사성 핵종, 독소, 치료제 및 화학치료제가 포함된다.
III. 약제학적 조성물
또한, 본 발명은 (예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는) 본원에 기술된 O1-결합제 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 비히클 또는 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 약제학적 조성물은 인간 환자에서 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아) 감염과 관련된 질환을 치료, 예방 또는 개선하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 이들 약제학적 조성물은 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)의 성장을 억제하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)는 O1 혈청형의 것이다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는) O1-결합제 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물은 항체 클론 Ru-O1을 포함하지 않는다(문헌[Rukavina T., et al., Infect Immun .65:1754-60 (1997)] 참조).
특정 구현예에서, 제형은 본원에 기술된 항체 또는 항-O1 결합제를 약제학적으로 허용되는 비히클(예를 들어, 담체, 부형제)과 조합하여 보관 및 사용을 위해 제조된다(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000] 참조). 일부 구현예에서, 제형은 보존제를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료를 위하여 임의의 수의 방법으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, (예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는) 본원에 기술된 O1-결합제 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물은 폐렴, 요로 감염, 패혈증, 신생아 패혈증, 설사, 연조직 감염, 장기 이식 후 감염, 수술 감염, 상처 감염, 폐 감염, 화농성 간농양(PLA), 눈속염증, 수막염, 괴사성 수막염, 강직성 척추염, 또는 척추관절병을 치료하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는) 본원에 기술된 O1-결합제 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물은 병원내 감염, 기회 감염, 장기 이식 후 감염, 및 클레브시엘라 감염(예컨대, 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 플란티콜라, 클레브시엘라 오자에나, 클레브시엘라 리노스클레로마티스 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스 감염)과 관련된 기타 질환에 유용하다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 (예컨대, 항-O1 항원 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는) O1-결합제 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물은 클레브시엘라 오염 장치, 예컨대, 인공호흡기, 카테터, 또는 정맥내 카테터에 노출된 대상체에서 유용하다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 대상체에서 클레브시엘라의 성장을 억제하기에 유효한 양의 O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함한다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 플란티콜라, 클레브시엘라 오자에나, 클레브시엘라 리노스클레로마티스 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스이다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스이다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아이다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)는 O1 혈청형의 것이다.
일부 구현예에서, 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료, 예방 및/또는 개선 방법은 클레브시엘라에 감염된 대상체를 O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물과 생체내에서 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, O1-결합제를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체가 박테리아에 노출됨과 동시에 또는 그 직후에 감염을 예방하기 위해 투여된다. 일부 구현예에서, O1-결합제를 포함하는 약제학적 조성물은 감염 후 치료제로서 투여된다.
특정 구현예에서, 클레브시엘라 감염의 치료, 예방 및/또는 개선 방법은 O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체가 클레브시엘라에 감염되기 전에 투여된다. 일부 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체가 클레브시엘라에 감염된 후에 투여된다.
특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 인공호흡기를 단 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 카테터(예컨대, 요로 카테터 또는 정맥 내 카테터)를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 항생제(예를 들어, 메로페넴, 카바페넴, 플루오로퀴놀론, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 트리메토프림, 술폰아미드 및/또는 콜리스틴)를 받고 있다.
특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 병원내 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 기회 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 장기 이식 후 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이다.
특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이며, 클레브시엘라는 확장 스펙트럼 베타-락타마제(ESBL) 생성 클레브시엘라이다. 특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이며, 클레브시엘라는 비-확장 스펙트럼 베타-락타마제(ESBL) 생성 클레브시엘라이다. 특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이며, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아 카바페넴 내성 엔테로박테리아(CRE) 클레브시엘라이다. 특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이며, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아 카바페네마제(KPC) 생성 클레브시엘라이다.
특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 세팔로스포린 내성 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 아미노글리코시드 내성 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 퀴놀론 내성 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 카바페넴 내성 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 콜리스틴 내성 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 세팔로스포린, 아미노글리코시드, 퀴놀론, 플루오로퀴놀론, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 트리메토프림, 술폰아미드, 카바페넴 및 콜리스틴 내성 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 특정 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함하는 약제학적 조성물은 항생제에 민감성인 클레브시엘라 감염의 치료 또는 예방을 위한 것이다.
클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료, 예방 및/또는 개선을 위해, 본원에 기술된 약제학적 조성물, 항체 또는 항-O1 결합제의 적합한 투여량은 질환의 유형, 질환의 중증도 및 전개, 질환의 반응성, 약제학적 조성물, 항체 또는 항-O1 결합제가 치료적 목적을 위해 투여되는지 예방적 목적을 위해 투여되는지, 이전의 치료법, 환자의 임상 이력 등, 치료하는 의사의 재량에 따라 전부 달라진다. 약제학적 조성물, 항체 또는 항-O1 결합제는 1회에 또는, 수 일 내지 수 개월간 지속되는 일련의 치료에 걸쳐, 또는 치유가 이루어지거나 질환의 약화가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적의 투약 스케쥴은 환자의 신체 내의 약물 누적 측정치로부터 계산할 수 있으며, 개별적인 항체 또는 작용제의 상대적인 효능에 따라 달라질 것이다. 투여하는 의사는 최적 투여량, 투여 방법 및 반복 비율을 용이하게 결정할 수 있다.
IV. 이용 방법
본원에 기술된 O1-결합제(항-O1 항원 항체 및 이의 항원-결합 단편 포함)는 폐렴, 요로 감염, 패혈증, 신생아 패혈증, 설사, 연조직 감염, 장기 이식 후 감염, 수술 감염, 상처 감염, 폐 감염, 화농성 간농양 (PLA), 눈속염증, 수막염, 괴사성 수막염, 강직성 척추염, 및 척추관절병을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 응용에서 유용하다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 O1-결합제(항-O1 항원 항체 및 이의 항원-결합 단편 포함)는 병원내 감염, 기회 감염, 장기 이식 후 감염 및 클레브시엘라 감염(예컨대, 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 플란티콜라, 클레브시엘라 오자에나, 클레브시엘라 리노스클레로마티스 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스 감염)과 관련된 기타 질환에 유용하다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 O1-결합제(항-O1 항원 항체 및 이의 항원-결합 단편 포함)는 예를 들어, 인공호흡기, 카테터, 또는 정맥내 카테터를 포함하는, 클레브시엘라로 오염된 장치에 노출된 대상체에 유용하다.
일부 구현예에서, 본 발명은 유효량의 O1-결합제(예컨대, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 양은 대상체에서 클레브시엘라의 성장을 억제하는 데에 효과적이다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 플란티콜라, 클레브시엘라 오자에나, 클레브시엘라 리노스클레로마티스 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스이다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스이다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아이다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)는 O1 혈청형의 것이다. 일부 구현예에서, 대상체는 클레브시엘라에 노출된 적이 있다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라는 대상체에서 검출된 적이 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 예를 들어, 증상을 기초로 하여, 클레브시엘라에 감염되어 있는 것이 의심된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 O1-결합제(예컨대, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 클레브시엘라의 성장의 억제 방법을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 플란티콜라, 클레브시엘라 오자에나, 클레브시엘라 리노스클레로마티스 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스이다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스이다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아이다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아)는 O1 혈청형의 것이다. 일부 구현예에서, 대상체는 클레브시엘라에 노출된 적이 있다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라는 대상체에서 검출된 적이 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 예를 들어, 증상을 기초로 하여, 클레브시엘라에 감염되어 있는 것이 의심된다.
일부 구현예에서, 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료, 예방 및/또는 개선 방법은 클레브시엘라로 감염된 대상체를 생체내에서 O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포를 O1-결합제와 접촉시키는 단계는 동물 모델에서 착수된다. 예를 들어, O1-결합제를 뮤린 클레브시엘라 감염 모델에 투여하여, 박테리아 부담을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 동물로의 박테리아의 도입 이전에 투여하여, 감염을 예방한다. 일부 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 동물이 박테리아에 노출됨과 동시에 또는 그 직후에 투여하여, 감염을 예방한다. 일부 구현예에서, O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 감염 후에 치료제로서 투여한다. 일부 구현예에서, 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료, 예방 및/또는 개선 방법은 클레브시엘라로 감염된 대상체를 생체내에서 O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)와 접촉시키는 단계를 포함하며, 단리된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)은 항체 클론 Ru-O1이 아니다(문헌[Rukavina T., et al., Infect Immun 65:1754-60 (1997)] 참조).
특정 구현예에서, 클레브시엘라 감염의 치료, 예방 및/또는 개선 방법은 유효량의 O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 유효량의 O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)는 대상체가 클레브시엘라로 감염되기 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 유효량의 O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)는 대상체가 클레브시엘라로 감염된 후에 투여된다.
특정 구현예에서, 대상체는 인공호흡기를 달고 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 카테터(예컨대, 요로 카테터 또는 정맥내 카테터)를 갖는다. 일부 구현예에서, 이러한 대상체는 항생제(예를 들어, 메로페넴, 카바페넴 또는 콜리스틴)를 받고 있다.
특정 구현예에서, 클레브시엘라 감염은 병원내 감염이다. 특정 구현예에서, 클레브시엘라 감염은 기회 감염이다. 특정 구현예에서, 클레브시엘라 감염은 장기 이식에 뒤따른 것이다.
특정 구현예에서, 클레브시엘라는 확장 스펙트럼 베타-락타마제(ESBL) 생성 클레브시엘라이다. 특정 구현예에서, 클레브시엘라는 비-ESBL 생성 클레브시엘라이다. 특정 구현예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아 카바페네마제(KPC) 생성 클레브시엘라이다. 특정 구현예에서, 클레브시엘라는 클레브시엘라 뉴모니아 카바페넴 내성 엔테로박테리아(CRE) 클레브시엘라이다.
특정 구현예에서, 클레브시엘라는 세팔로스포린 내성이다. 특정 구현예에서, 클레브시엘라는 아미노글리코시드 내성이다. 특정 구현예에서, 클레브시엘라는 퀴놀론 내성이다. 특정 구현예에서, 클레브시엘라는 카바페넴 내성이다. 특정 구현예에서, 클레브시엘라는 세팔로스포린, 아미노글리코시드, 퀴놀론 및 카바페넴 내성이다. 특정 구현예에서, 클레브시엘라는 세팔로스포린, 아미노글리코시드 및 퀴놀론 내성이다. 특정 구현예에서, 클레브시엘라는 항생제에 민감성이다.
특정 구현예에서, 클레브시엘라 감염의 치료, 예방 및/또는 개선 방법은 유효량의 O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 및 항생제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 및 항생제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 및 항생제는 동일한 약제학적 조성물에서 투여될 수 있다. O1-결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 및 항생제는 개별 약제학적 조성물에서 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 항생제는 클레브시엘라 감염을 치료하기에 적합한 항생제이다. 특정 구현예에서, 항생제는 메로페넴이다. 특정 구현예에서, 항생제는 카바페넴 또는 콜리스틴이다. 특정 구현예에서, 항생제는 세팔로스포린, 아미노글리코시드, 퀴놀론, 플루오로퀴놀론, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 트리메토프림, 술폰아미드, 카바페넴 및/또는 콜리스틴이다.
또한, 본 발명은 O1 지질다당류 또는 O1 항원을 함유하는 클레브시엘라의 검출 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, O1 또는 O1 항원을 함유하는 클레브시엘라의 검출 방법은 시료를 본원에 제공되는 O1 결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)와 접촉시키는 단계 및 시료로의 결합제(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)의 결합에 대하여 검정하는 단계를 포함한다. 결합의 평가 방법은 해당 분야에 널리 알려져 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 O1 지질다당류 또는 O1 항원을 함유하는 클레브시엘라를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, O1 또는 O1을 함유하는 클레브시엘라의 검출 방법은 시료를 본원에 제공되는 O1 결합제(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)와 접촉시키는 단계 및 시료로의 결합제(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)의 결합에 대하여 검정하는 단계를 포함한다.
V. 키트
본 발명의 임의의 양태 또는 구현예에 따른 단리된 항원-결합 단백질(예컨대, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 포함하는 키트는 또한 본 발명의 양태로서 제공된다. 키트에서, 항원-결합 단백질, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 시료 내에서 그의 반응성이 결정될 수 있도록 표지될 수 있다. 키트의 구성요소는 일반적으로 멸균된 것이고, 밀봉된 바이알 또는 기타 용기에 존재한다. 키트는 진단적 분석 또는 항체가 유용한 기타 방법에 이용될 수 있다. 키트는 방법, 예컨대, 본 발명에 따른 방법에서, 구성요소들의 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있다. 이러한 방법을 수행하는 것을 돕거나 이러한 방법을 수행할 수 있게 하는 부수적인 물질들이 본 발명의 키트 내에 포함될 수 있다.
시료에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 반응성은 임의의 적합한 수단에 의해 결정할 수 있다. 방사성면역검정(RIA)이 한 가지 가능성이다. 방사성 표지된 항원을 표지되지 않은 항원(시험 시료)과 혼합하고, 항체에 결합하게 한다. 결합된 항원을 결합되지 않은 항원으로부터 물리적으로 분리시키고, 항체에 결합된 방사성 항원의 양을 결정한다. 시험 시료에 더 많은 항원이 존재할수록, 방사성 항원은 항체에 더 적게 결합할 것이다. 또한, 항원 또는 리포터 분자에 연결된 유사체를 이용하는 경쟁적 결합 분석법이 비 방사성 항원과 함께 이용될 수 있다. 리포터 분자는 형광 색소, 인광체 또는 분광 분리된 흡수 또는 발광 특성을 나타내는 레이저 염료일 수 있다. 적절한 형광 색소로는 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린 및 텍사스 레드가 포함된다. 적절한 발색 염료에는 디아미노벤지딘이 포함된다.
기타 리포터로는 거대분자 콜로이드 입자 또는 입자성 물질, 예컨대, 유색, 자성 또는 상자성 라텍스 비드 및 검출 가능한 신호가 육안적으로 관찰되거나 전기적으로 검출되거나 다르게 기록되도록 직접적으로 또는 간접적으로 야기할 수 있는 생물학적 또는 화학적 활성제가 포함된다. 이들 분자는, 예컨대 색을 발색 또는 변화시키거나, 전기적 성질을 변화시키는 반응을 촉매화하는 효소일 수 있다. 이들은 에너지 상태의 전기 전이에 따라 특성적인 스펙트럼이 흡수 또는 방출되도록 분자적으로 여기될 수 있다. 이들은 바이오센서와 함께 사용되는 화학적 실체를 포함할 수 있다. 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙타비딘 및 알칼리성 포스파타제 검출 시스템이 사용될 수 있다.
개별적인 항체-리포터 컨쥬게이트에 의해 발생된 신호는 시료(정상 및 시험) 내 관련 항체의 정량화할 수 있는 절대적인 또는 상대적인 데이터를 유도하는 데에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 경쟁 분석에서 본 발명에 의해 제공되는 항원 결합 단백질을 이용하여 시료 내의 O1 항원 또는 O1 항원을 함유하는 클레브시엘라의 수준을 측정하는 방법을 포함하는, 경쟁 분석에서 항원 수준을 측정하기 위한 상기 기술된 항원 결합 단백질의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 결합되지 않은 항원으로부터 결합된 항원의 물리적인 분리는 필요하지 않다. 일부 구현예에서, 리포터 분자는 이러한 항원 결합 단백질에 연결되어, 결합 시 물리적 또는 광학적 변화가 발생한다. 이러한 리포터 분자는 검출 가능하고 바람직하게는 측정 가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 리포터 분자의 연결은 예를 들어 펩티드 결합을 통해, 또는 비 공유적 상호작용을 통한, 직접적이거나 간접적, 또는 공유적 연결이다. 펩티드 결합을 통한 연결은 리포터 분자 및 항체를 인코딩하는 유전자 융합의 재조합 발현의 결과일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항원-결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 활용함으로써, O1 항원 수준을 직접적으로 측정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 이들 방법은 바이오센서 시스템을 활용한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 항원-결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 활용함으로써 O1 항원을 검출하는 단계를 포함한다.
VI. 폴리뉴클레오티드 및 숙주 세포
추가적인 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항원-결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편), VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 항원-결합 단백질, VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 생성을 초래하는 조건 하에서 상기 핵산을 발현시키는 단계, 및 선택적으로, 상기 항원-결합 단백질, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 회수하는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 항원-결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편), VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 의해 제공되는 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 일 양태에서, 이러한 핵산은 cDNA이다. 일 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같이 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원-결합 부위 또는 항체, 예를 들어, scFv, IgG1 또는 IgG2를 코딩하는 핵산을 제공한다(예를 들어, 표 1 내지 표 4 참조).
본 발명의 일 양태는 본원에 기술된 VH CDR 또는 VL CDR 서열을 인코딩하는 핵산, 일반적으로는 단리된 핵산, 선택적으로는 cDNA를 제공한다. 일부 구현예에서, VH CDR은 SEQ ID NO: 1 내지 3, 14 내지 16 및 23 내지 25로부터 선택된다. 일부 구현예에서, VL CDR은 SEQ ID NO: 4 내지 7, 10, 11, 17 내지 20 및 26 내지 29로부터 선택된다. 표 1 및 표 2에 기술된 바와 같은 개별 CDR, HCDR, LCDR 및 CDR, HCDR, LCDR의 세트를 인코딩하는 핵산과 같이, HCDR의 KPE33, KPE33V2016, KPA27, KPB202, KBJ4 또는 54H7 세트를 인코딩하는 핵산 및 LCDR의 KPE33, KPE33V2016, KPA27, KPB202, KBJ4 또는 54H7 세트를 인코딩하는 핵산도 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산은 표 3 및 표 4에 기술된 바와 같은 KPE33, KPE33V2016, KPA27, KPB202, KBJ4 또는 54H7의 VH 및/또는 VL 도메인을 인코딩한다.
본 발명은 하기 표 5 및 표 6에 나타낸 것들로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
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또한, 표 5 또는 표 6에 제공되는 SEQ ID NO 중 임의의 것과 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 따라서, 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 (a) 표 5에 제공되는 SEQ ID NO 중 임의의 것과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 (b) 표 6에 제공되는 SEQ ID NO 중 임의의 것과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 (a) 표 5에 제공되는 SEQ ID NO의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드; 및/또는 (b) 표 6에 제공되는 SEQ ID NO의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 본원에 개시된 핵산 분자의 단편 또는 그의 상보물인, 혼성화 프로브, PCR 프라이머 또는 시퀀싱 프라이머로 사용하기에 충분한, 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 cDNA 분자를 제공한다. 핵산 분자는 예를 들어, 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 작제물을 제공한다(예를 들어, 표 5 및 표 6 참조).
또한, 본 발명은 하나 이상의 핵산, 플라스미드, 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포, 또는 상기 기술된 바와 같은 재조합 숙주 세포를 제공한다(예를 들어, 표 5 및 표 6 참조). 임의의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원-결합 부위, 항체, 예를 들어, 제공된 바와 같은 scFv, IgG1 또는 IgG2(예를 들어, 표 1 내지 표 4 참조)를 인코딩하는 핵산은, 인코딩된 생성물의 생성 방법이 그러하듯, 그 자체가 본 개시의 양태를 형성하며, 이때, 이러한 방법은 이러한 생성물(예를 들어, 본원에 개시된 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 예를 들어, 항원 결합 단백질)을 인코딩하는 핵산으로부터의 발현을 포함한다. 발현은 편리하게는, 본원에 기술된 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양함으로써 이루어질 수 있다. 발현에 의한 생성 후, CDR, CDR 세트, VH 또는 VL 도메인, 항원-결합 단백질은 임의의 적합한 기법을 이용하여 단리 및/또는 정제될 수 있다.
일부 경우에, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포, 예컨대, HEK293 세포, HeLa 세포, NS0 뮤린 골수종 세포, PER.C6® 인간 세포, 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
항원-결합 단백질, VH 및/또는 VL 도메인, 및 인코딩 핵산 분자 및 벡터는 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로, 또는, 핵산의 경우, 원하는 기능의 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 이외의 핵산 또는 유전자 기원이 전혀 없거나 실질적으로 없이, 그것들의 자연적인 환경으로부터, 단리 및/또는 정제될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 전체적으로 또는 부분적으로 합성형일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 명시된 서열을 갖는 DNA 분자를 포괄하며, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, T 대신 U로 치환된 명시된 서열을 갖는 RNA 분자를 포괄한다.
다양한 숙주 세포에서의 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 잘 알려져 있다. 적합한 숙주 세포로는 박테리아, 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 및 배큘로바이러스 시스템 및 트랜스제닉 식물 및 동물이 포함된다. 이종 폴리펩티드의 발현을 위한, 당해 분야에서 이용할 수 있는 포유동물 세포주에는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 흑색종 세포, YB2/0 랫트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 그 외 다수가 포함된다. 일반적인 박테리아 숙주는 에스케리키아 콜라이이다.
에스케리키아 콜라이와 같은 원핵 세포에서의 항체 및 항체 단편의 발현은 당해 분야에 잘 확립되어 있다. 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Plueckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)]을 참조한다. 배양 중인 진핵 세포에서의 발현 또한 항원 결합 단백질의 생성을 위한 옵션으로서 당업자에게 이용 가능하며, 예를 들어, 문헌[Chadd HE and Chamow SM (2001) 110 Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194], 문헌[Andersen DC and Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117], 문헌[Larrick JW and Thomas DW (2001) Current opinion in Biotechnology 12:411-418]이 있다.
프로모터 서열, 종결자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 기타 적절한 서열을 포함하는, 적절한 조절 서열을 함유하는 적절한 벡터가 선택되거나 작제될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 예컨대, '파지, 또는 적절한 파지플라스미드 복합체일 수 있다. 더욱 상세한 사항은 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook and Russell,2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다. 예를 들어, 핵산 작제물의 제조, 돌연변이 유발, 시퀀싱, 세포 내 DNA 도입과 유전자 발현, 및 단백질 분석에 있어서 핵산 조작을 위한 여러 가지 공지된 기법 및 프로토콜은 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubelet al. eds., John Wiley & Sons, 1988], 문헌[Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelet al. eds., John Wiley & Sons, 4th edition 1999]에 상세하게 기술되어 있다. Sambrook 등 및 Ausubel 등의 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다.
따라서, 본 발명의 추가적인 양태는 본원에 개시된 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 항원-결합 단백질 또는 본 발명의 항체 CDR, CDR 세트 또는 항원-결합 단백질의 VH 및/또는 VL 도메인(예를 들어, 표 1 내지 표 4 참조)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 5 및 표 6 참조)을 포함하는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 발명의 발현된 항원-결합 단백질 또는 본 발명의 항체 CDR, CDR 세트, 항원-결합 단백질의 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다(예를 들어, 표 1 내지 표 4 참조).
이러한 숙주 세포는 시험관내의 숙주 세포일 수 있고, 배양 중인 숙주 세포일 수 있다. 이러한 숙주 세포는 단리된 숙주 세포일 수 있다. 이러한 숙주 세포는 생체내 숙주 세포일 수 있다.
본원에 제공된 추가적인 양태는 이러한 핵산을 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는 방법이다. 도입은 임의의 이용 가능한 기법을 활용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적절한 기법은 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란, 전기천공법, 리포좀 매개의 트랜스펙션 및 레트로바이러스 또는 기타 바이러스, 예컨대, 백시니아 또는, 곤충 세포의 경우, 배큘로바이러스를 이용한 형질도입을 포함할 수 있다. 숙주 세포, 특히 진핵 세포에서 핵산 도입은 바이러스 또는 플라스미드 기반의 시스템을 이용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피솜으로 유지될 수 있거나, 숙주 세포 내로 또는 인위적인 염색체 내로 도입될 수 있다. 도입은 단일 또는 여러 좌에서 하나 이상의 카피의 무작위 또는 표적화된 통합에 의한 것일 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적절한 기법으로는 염화칼슘 형질전환, 전기천공법 및 박테리오파지를 이용한 트랜스펙션이 포함될 수 있다.
도입에는 예컨대, 유전자의 발현을 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써, 핵산으로부터의 발현 유발 또는 허용이 이어질 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈(예컨대, 염색체) 내로 통합된다. 통합은 표준 기법에 따라, 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열들을 포함시켜 촉진할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 발현 시스템에서 작제물(예컨대, 상기 기술된 바와 같은 플라스미드, 벡터 등)를 이용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항원-결합 단백질(예컨대, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 생성하는 하이브리도마를 제공한다.
본 발명의 추가적인 양태는 본 발명의 항체 결합 단백질(예를 들어, 항-O1 항원 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 인코딩 핵산으로부터 발현을 유발하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 상기 항원-결합 단백질의 생성에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 생성 방법은 숙주 세포 또는 하이브리도마로부터 생성된 (항-O1 항원 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는) 항원 결합 단백질을 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
실시예
재료 및 방법
달리 언급되지 않는 한, 모든 클레브시엘라 뉴모니아 분리주를 아메리카 타입 컬쳐 콜렉션(America Type Culture Collection), 국제 건강 관리 협회(International Health Management Associates, IHMA) 또는 유로핀 콜렉션(Eurofin collection)으로부터 구입하고, 배양물을 37℃에서 적절한 경우 항생제가 보충된 2xYT 배지에서 유지하였다.
모든 통계 분석을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 6에서 수행하였다. 박테리아 부담을 비교하기 위하여, 항-O1 항원 항체 처치된 동물을 독립표본 t 검정(unpaired t test)에 의해 인간 아이소타입 대조군 항체 처치된 동물과 비교하였다. 생존 결과를 카플란-마이어 곡선으로서 플롯팅하고, 로그-순위(멘탈-콕스) 검정으로서 분석하였다.
실시예 1: 클레브시엘라 뉴모니아 LPS-O1에 대하여 높은 항체 역가를 갖는 PBMC 및 편도 공여자의 선택
말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 혈청을 건강한 혈액 공여자(N=567) 유래의 버피 코트로부터 분리하였다. PMBC를 액체 질소에 보관하는 한편, 혈장을 4℃에서 보관하였다. 클레브시엘라 뉴모니아 면역 공여자를 확인하기 위하여, 모든 이용 가능한 혈청을 Kp43816 및 Kp4211(LPS-O1 혈청형), 및 비협막화된 돌연변이 균주 Kp43816ΔcpsB 및 이중 돌연변이 Kp43816ΔcpsBΔwaaL로의 결합에 대하여 시험하였다. 이중 돌연변이 Kp43816ΔcpsBΔwaaL은 그의 표면 상에 LPS O 항원을 발현하지 않는다. 또한, 모든 이용 가능한 혈청을 고효율 혈청 살균 검정(SBA 검정)을 사용하여 보체의 존재 하의 그들의 살균 활성에 대하여 시험하였다. 발광 클레브시엘라 뉴모니아 균주 4211(lux)의 밤샘 배양물을 Muller Hinton II 배지 중에 희석하여, OD600이 0.003이 되도록 하였다. 동일한 부피의 혈청, 4211lux 및 토끼 새끼 혈청(Cedarlane)을 384 웰 플레이트에서 혼합하고, 37℃에서 2시간 동안 진탕시키면서(250 rpm) 인큐베이션시켰다. 그 다음, 상대 발광 단위(RLU)를 엔비젼(Envision) 멀티라벨(Multilabel) 플레이트 판독기(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 측정하였다. 항체 부재의 검정으로부터 유래된 RLU를 인간 혈청으로부터 수득되는 RLU와 비교함으로써 사멸의 백분율을 결정하였다.
PBMC 공여자를 그들의 결합 역가 및 그들의 SBA 및 OPK 활성에 기초하여 평가하였다. OPK 검정을 변형과 함께 기재된 바와 같이 수행하였다(문헌[Wang, Q. et al. Target-Agnostic Identification of Functional Monoclonal Antibodies Against Klebsiella pneumoniae Multimeric MrkA Fimbrial Subunit J Infect Dis. 2016 Jun 1;213(11):1800-8]). 약술하면, 발광 클레브시엘라 뉴모니아 협막 돌연변이 균주 43816ΔcpsB(43816ΔcpsB Lux)의 지수증식기 배양물을 약 2x106개 세포/㎖로 희석하였다. 박테리아, 보체를 제공하는 희석된 토끼 새끼 혈청(Cedarlane, Kp43816ΔcpsB로 사전-흡수시킴, 1:10), 디메틸포름아미드(DMF) 분화된 HL-60 세포 및 혈청을 384-웰 플레이트에서 혼합하고, 37℃에서 진탕시키면서(250 rpm) 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 상대 발광 단위(RLU)를 엔비젼 멀티라벨 플레이트 판독기(퍼킨 엘머)를 사용하여 측정하였다. 사멸의 백분율을 항체 부재의 검정으로부터 유래된 RLU를 인간 혈청으로부터 수득되는 RLU와 비교함으로써 결정하였다.
편도 및 아데노이드 공여자 선택을 위하여, 편도 단핵 세포를 문헌[Pinna, D., et al., European Journal of Immunology 39: 1260-1270 (2009)]에 기재된 바와 같이 다클론으로 자극하였다. 폴리클로날 항체 혼합물을 함유하는 상청액을 사용하여, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 상이한 박테리아 균주의 풀 또는 정제된 박테리아 항원(예를 들어, LPS 또는 다른 다당류, 박테리아 단백질)으로의 항체 결합의 존재를 결정하였다. 클레브시엘라 뉴모니아에 대하여 강한 폴리클로날 항체 역가를 갖는 편도를 실시예 2에 기재된 바와 같이 항체 생성을 위해 선택하였다.
실시예 2: 모노클로날 KPA27, KPB202, KPE33 및 KPJ4의 확인
기억 B 세포를 CD19 마이크로비드를 사용하여 동결보존된 PMBC로부터 단리하고, 세포 분류에 의해 IgM, IgD 및 IgA를 지니는 세포를 고갈시켰다. 기억 B 세포를 문헌[Traggiai, E. et al., Nature Medicine 10: 871-875 (2004)]에 기재된 바와 같이 불멸화시켰다.
KPA27 및 KPE33을 2명의 상이한 면역 공여자: 각각 #487 및 #262의 말초 혈액으로부터 단리하였다. 이들은 일차 스크리닝에서 LPS-O1 혈청형의 클레브시엘라 뉴모니아에 결합하고, 균주 Kp4211(LPS-O1)의 보체-의존적 사멸(SBA)을 매개하는 것이 나타났다. KPA27 및 KPE33을 면역 공여자로부터 IgG2 항체로서 단리하였다.
KPB202 및 KPJ4를 2명의 상이한 공여자: T6(KPB202) 및 T8(KPJ4)의 편도 B 세포로부터 단리하였다. 이들은 일차 스크리닝에서 LPS-O1 혈청형의 클레브시엘라 뉴모니아에 결합하고, 균주 Kp4211(LPS-O1)의 보체-의존적 사멸(SBA)을 매개하는 것이 나타났다. KPB202 및 KPJ4를 공여자로부터 각각 IgG1 및 IgG2 항체로서 단리하였다.
실시예 3: 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원 특이적 하이브리도마의 단리
클레브시엘라 뉴모니아 분리주를 아메리카 타입 컬쳐 콜렉션 또는 유로핀 콜렉션으로부터 구입하였다. Balb/c 마우스를 4주 동안 복강내(ip) 경로를 통해 클레브시엘라 뉴모니아 43816DM으로 주마다 면역화시킨 후에, 야생형 클레브시엘라 뉴모니아 임상 분리주의 혼합물로 최종 부스팅시켰다. 면역화의 마지막에, 림프절 및 비장 B 세포를 수집하고, P3X 골수종과 융합시켰다. 그 다음, 생성된 하이브리도마로부터의 상청액을 전체 박테리아 ELISA에 의해 43816DM으로의 결합에 대하여 스크리닝하였다. 양성 하이브리도마를 무 항생제 배지에서 계대-배양하고, 상청액을 SBA 및 OPK 검정으로 처리하여, 잠재적으로 클레브시엘라 뉴모니아에 대하여 보호적인 것을 선택하였다. 하나의 양성 하이브리도마는 54H7 항체를 생성하였다.
실시예 4: 항-O1 항원 항체 특성화
단리된 항체를 전체 박테리아로의 이들의 결합, 옵소닌 포식 살해(OPK), 보체-의존적 사멸(SBA), LPS 중화 및 정제된 O1 LPS로의 결합에 대하여 시험하였다. 단리된 항-O1 항원 항체의 특성화는 표 7에 요약되어 있다.
OPK 검정을 변형과 함께 기재된 바와 같이 수행하였다(문헌[Wang, Q. et al., J. Infect. Dis. 213:1800-8 (2016)]). 약술하면, 발광 클레브시엘라 뉴모니아 협막 돌연변이 균주 43816ΔcpsB(43816ΔcpsB Lux)의 지수증식기 배양물을 약 2x106개 세포/㎖로 희석하였다. 박테리아, 보체를 제공하는 희석된 토끼 새끼 혈청(Cedarlane, Kp43816ΔcpsB로 사전-흡수시킴, 1:10), 디메틸포름아미드(DMF) 분화된 HL-60 세포 및 항체를 384-웰 플레이트에서 혼합하고, 37℃에서 진탕시키면서(250 rpm) 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 상대 발광 단위(RLU)를 엔비젼 멀티라벨 플레이트 판독기(퍼킨 엘머)를 사용하여 측정하였다. 사멸의 백분율을 항체 부재의 검정으로부터 유래된 RLU를 항-클레브시엘라 뉴모니아 mAb 및 음성 대조군 mAb로부터 수득되는 RLU와 비교함으로써 결정하였다. 결과는 도 1c에 나타나 있다. 54H7, KPB202, KPA27, KPE33 및 KPJ4 항체는 OPK 사멸을 유도하였다.
혈청에 대한 클레브시엘라 뉴모니아 균주 Kp4211lux의 감수성 및 항체 의존적 사멸을 고효율 혈청 살균 검정(SBA)에 의해 측정하였다. 발광 클레브시엘라 뉴모니아 균주 4211(lux)의 밤샘 배양물을 Muller Hinton II 배지 중에 희석하여, OD600이 0.003이 되도록 하였다. 동일한 부피의 항체, 4211lux 및 새끼 토끼 혈청(Cedarlane)을 384 웰 플레이트에서 혼합하고, 37℃에서 진탕시키면서(250 rpm) 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 상대 발광 단위(RLU)를 엔비젼 멀티라벨 플레이트 판독기(퍼킨 엘머)를 사용하여 측정하였다. 사멸의 백분율을 항체 부재의 검정으로부터 유래된 RLU를 항-클레브시엘라 뉴모니아 mAb 및 음성 대조군 mAb로부터 수득되는 RLU와 비교함으로써 결정하였다. 결과는 도 1b에 나타나 있다. 54H7, KPB202, KPA27, KPE33 및 KPJ4 항체는 모두 혈청 살균 검정(SBA)에 의해 나타난 바와 같이 보체-의존적 사멸을 통해 클레브시엘라 뉴모니아를 사멸시켰다.
NF-κB-반응성 프로모터의 제어 하에 반딧불이 루시퍼라제 리포터 유전자를 지니는 뮤린 RAW264.7 대식구 세포주(RAW264.7-lux)를 사용하여 LPS 중화를 검정하였다. 단계 희석된 항체 원액을 1:1 비로 LPS와 혼합하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 항체/LPS 혼합물을 사전-씨딩된 RAW264.7-lux 세포(5e3개 세포/웰)를 함유하는 검정 플레이트로 1:10 희석하고, 이를 이어서 37℃/5% CO2에서 2.5시간 동안 배치하였다. 인큐베이션 후에, 스테디 글로(Steady Glo)(프로메가(Promega))를 이어서 각 웰에 첨가하고, 광으로부터 보호하여 다시 20분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 상대 발광 단위(RLU)를 엔비젼 멀티라벨 플레이트 판독기(퍼킨 엘머)를 사용하여 측정하였다. 억제의 백분율을 항체 부재의 검정으로부터 유래된 RLU를 항-클레브시엘라 뉴모니아 mAb 및 음성 대조군 mAb로부터 수득되는 RLU와 비교함으로써 결정하였다. 박테리아 LPS에 의한 TLR4 수용체의 활성화는 NF-κB 전사 조절자의 하류 활성화를 야기한다. NF-κB-반응성 루시퍼라제 활성의 유도의 감소를 사용하여, LPS mAb에 의한 LPS 중화 활성을 정량화하였다. 결과는 표 7에 나타나 있다. 54H7 및 KPB202 항체는 LPS를 중화시켰지만, KPA27, KPE33 및 KPJ4 항체는 그렇지 않았다.
정제된 O1 LPS로의 결합을 표준 ELISA 방법에 의해 검정하였다. 약술하면, ELISA 플레이트(넌크 맥시소르프(Nunc MaxiSorp))를 4℃에서 하룻밤 PBS, pH 7.2 중 정제된 O1 LPS로 코팅한 다음, 플레이트를 1% BSA가 보충된 PBS(PBS-B)로 블록킹시켰다. 코팅된 플레이트를 모노클로날 항체의 단계 희석물과 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 플레이트를 0.1% Tween-20(PBS-T)을 함유하는 PBS로 세척한 다음, HRP-컨쥬게이트된 항-인간 이차 항체를 1시간 동안 첨가한 후에, TMB TMB(3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘) 기질을 첨가하였다. 450 nm의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(몰레큘러 디바이스즈(Molecular Devices))에 의해 측정하고, 데이터를 프리즘(Prism) 소프트웨어로 플롯팅하였다. 결과는 도 1a에 나타나 있다. 54H7, KPB202, KPA27, KPE33 및 KPJ4 항체는 정제된 O1 LPS에 결합하였다.
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실시예 5: 항-O1 항원 항체는 클레브시엘라 기관 부담을 감소시킨다
기관 부담을 감소시키는 항-O1 항원 항체의 능력을 박테리아 감염 모델에서 시험하였다. 이들 실험에서, C57BL/6 마우스를 잭슨 래보러터리즈(Jackson laboratories)로부터 받고, 특수 병원체 부재 시설에서 유지하였다. 모든 동물 실험을 IACUC 프로토콜 및 지침에 따라 행하였다. 클레브시엘라 뉴모니아 균주를 아가 플레이트에서 하룻밤 성장시키고, 적절한 농도로 염수 중에 희석하였다. 시험감염 이전 및 이후에 박테리아의 단계 희석물을 아가 플레이트 상으로 플레이팅함으로써 접종물 역가를 결정하였다.
15 ㎎/㎏의 항체 및 대조군을 박테리아 감염 전 24시간에 투여하였다. C57BL/6 마우스에 40 ㎕의 염수 중 1e4 CFU Kp8045(O1:K1) 박테리아를 비강내 접종하여, 폐렴을 유도하였다. 폐 균질액을 아가 플레이트 상으로 플레이팅하여, 감염 후 48시간의 CFU를 결정함으로써 폐 박테리아 부담을 측정하였다. 결과는 도 2에 나타나 있다. KPE33은 기관 부담을 유의미하게 감소시켰으며, 다른 항-O1 항원 항체도 또한 클레브시엘라 뉴모니아 감염 후 48시간에 약 2 내지 3 log에 있어서 기관 부담을 감소시켰다.
실시예 6: 항-O1 항원 항체는 치명적인 박테리아 시험감염에 대하여 보호한다
치명적인 박테리아 시험감염에 대하여 보호하는 항-O1 항원 항체의 능력도 또한 평가하였다.
급성 폐렴 모델에서, C57BL/6 마우스를 1e4 내지 1e8 CFU의 다제 내성 클레브시엘라 뉴모니아 카바페넴 내성(CRE) 임상 분리 균주 KP1131115(O1)로 비강내 접종하였다. 0.2, 1 및 5 ㎎/㎏의 항-클레브시엘라 뉴모니아 모노클로날 항체 KPE33 및 5 ㎎/㎏의 인간 IgG1 대조군 항체를 박테리아 시험감염(치료적 투여) 후 1시간에 제공하였다. 마우스 생존을 최대 제8일까지 매일 모니터링하였다. 결과는 도 3a에 나타나 있다.
또한, 급성 폐렴 모델에서, C57BL/6 마우스를 1e4 내지 1e8 CFU의 다제 내성 클레브시엘라 뉴모니아 카바페넴 내성(CRE) 임상 분리 균주 KP1131115(O1)로 비강내 접종하였다. 0.2 및 1 ㎎/㎏의 항-클레브시엘라 뉴모니아 모노클로날 항체 KPE33-H32+L2016(EQ1) 및 KPE33-H32+L2016(EQ1), 및 5 ㎎/㎏의 인간 IgG1 대조군 항체를 박테리아 시험감염(치료적 투여) 후 1시간에 제공하였다. 마우스 생존을 최대 제8일까지 매일 모니터링하였다. 결과는 도 3c에 나타나 있다.
이들 결과는 박테리아 시험감염 후 치료적으로 제공되는 KPE33, KPE33-H32+L2016(EQ1) 및 KPE33-H32+L2016(EQ1)이 마우스를 약물 내성 클레브시엘라 뉴모니아 균주 KPC Kp1131115로의 치명적인 박테리아 시험감염으로부터 보호하는 것을 보여준다.
균혈증 모델에서, C57BL/6 마우스를 1e8 CFU의 스펙트럼 연장 베타 락타마제(ESBL) 임상 분리 균주 Kp8561(O1)로 복강내 접종하였다. 1.5, 5 및 15 ㎎/㎏의 항-클레브시엘라 뉴모니아 모노클로날 항체 KPE33 및 45 ㎎/㎏의 인간 IgG1 대조군 항체를 박테리아 시험감염(치료적 투여) 후 1시간에 제공하였다. 마우스 생존을 최대 제8일까지 매일 모니터링하였다. 결과는 도 3b에 나타나 있다.
결과는 박테리아 시험감염 후에 치료적으로 제공되는 KPE33이 마우스를 스펙트럼 연장 베타-락타마제(ESBL) 균주 Kp8561로부터 보호하는 것을 보여준다.
실시예 7: 항-O1 항원 항체 KPE33과 항생제의 상승작용
항-O1 항원 항체 및 항생제의 상승작용을 또한 폐렴 및 균혈증 마우스 모델에서 평가하였다.
폐렴 실험에서, C57BL/6 마우스를 1e4 내지 1e8 CFU의 Kp8045 클레브시엘라로 비강내 접종하였다. (도 4a를 참조한다.) 균혈증 실험에서, 마우스를 Kp8561 클레브시엘라로 접종하였다. (도 4b를 참조한다.) 하위-치료 용량의 항체(Kp8045에 대하여 1 mpk 및 Kp8561에 대하여 2.5 mpk) 및 메로페넴 항생제(Kp8045에 대하여 2.5 mpk 및 Kp8561에 대하여 5 mpk) 둘 모두를 박테리아 시험감염 후에 투여하였다. 마우스 생존을 최대 제8일까지 매일 모니터링하였다.
결과는 도 4에 나타나 있으며, 메로페넴 및 KPE33의 조합이 유의미한 상승작용과, 메로페넴 또는 KPE33 중 어느 하나의 단일요법 또는 인간 IgG1 대조군 항체(R347) 및 메로페넴의 조합보다 더 나은 보호를 보였음을 나타낸다.
실시예 8: KPE33 서열 최적화
항-약물 항체로 인한 잠재적인 면역원성을 포함하는 항체 발생에 대한 잠재적인 서열 책임을 감소시키기 위하여, KPE3의 경쇄 CDR3 내의 쌍형성되지 않은 시스테인을 트레오닌(T)과 교환하였으며, KPE33의 프레임워크 1, 2 및 4 내의 체세포 돌연변이를 생식계 잔기로 대체하였다(도 5에 요약된 바와 같음). 상기 기재된 C107T 치환을 제외하고, CDR을 야생형과 같이 유지하였다. 최적화된 KPE33을 KPE33v2016으로 명명하였다. 서열 최적화가 LPS O1과의 상호작용을 변경시키지 않는 것을 확인하기 위하여, O1 LPS로의 KPE33 및 KPE33v2016의 결합을 옥텟 플랫폼에 의해 용액 상에서 시험하였다. 이러한 플랫폼은 생물학적으로 더욱 의미 있는 환경에서 생체분자 복합체 형성 속도 및 복합체 안정성을 측정하기 위한 강력한 도구를 제공한다. 약술하면, 단백질 A 코팅된 센서를 10분 동안 2 ㎍/㎖의 O1 LPS로 코팅한 다음, Kinetics 완충액(포르테바이오(ForteBio), PBS를 사용하여 10X를 1X로 희석) 중 0.2 ㎍/㎖의 항-O1 LPS mAb를 함유하는 용액 내로 침지시켰다. 바이오센서에 결합되는 분자의 수의 변화는 간섭 패턴의 이동을 야기하였으며, 이를 실시간으로 기록하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, mAb는 O1 LPS에 결합하였다. O1 LPS에 대한 KPE33 및 KPE33v2016의 친화성 상수(KD)를 옥텟 센서그램(sensorgram)으로부터 온-속도 및 오프-속도에 기초하여 계산하였다. KPE33 및 KPE33v2016은 둘 모두 각각 5.83E-09 및 4.13E-09의 평균으로 유사한 친화성 상수를 보였다(도 5). KPE33v2016을 추가로 최적화시켜, 그에 의해, 2가지 새로운 변이체 - KPE33 H32+L2016(1EQ) 및 KPE33 H33+L2016(1EQ)을 생성하였다. 이들 변이체 둘 모두는 CDRH1에 인접한 메티오닌에서 이소류신으로의 돌연변이, CDRH2 내의 트립토판에서 티로신으로의 돌연변이, CDRH2에 인접한 아스파르트산염에서 글루탐산염으로의 돌연변이, FRH3 내의 아스파라긴에서 글루타민 및 메티오닌에서 류신으로의 돌연변이, 및 CDRH3 내의 아스파르트산염에서 아스파라긴으로의 돌연변이를 함유한다. 또한, KPE33 H32+L2016(1EQ)은 4개의 FRH3 잔기가 생식계열 잔기로 변경된 한편, KPE33 H33+L2016(1EQ)은 동일한 FRH3 잔기 중 오직 3개만이 생식계열로 변경된다. 이들 변이체 둘 모두는 잔기 1의 단일의 글루탐산염에서 글루타민으로의 돌연변이를 제외하고, KPE33v2016과 동일한 경쇄를 함유한다. KPE33 H32+L2016(1EQ) 및 KPE33 H33+L2016(1EQ)의 친화성을 옥텟에 의해 측정하고, 각각 4.46E-09 및 5.01E-09의 값을 제공하였다.
서열 최적화가 KPE33 항체의 효능을 억제하지 않았음을 확인하기 위하여, 최적화된 KPE33V2016 항체를 실시예 6에 기재된 동일한 치명적인 폐렴 모델에서 검정하였다. KPE33 또는 KPE33-V-2016을 클레브시엘라 뉴모니아 카바페넴 내성 균주로의 박테리아 감염 후 1시간에 6 ㎎/㎏의 용량으로 투여하였다. 도 6에 나타낸 결과는 KPE33 및 KPE33V2016 둘 모두가 인간 IgG1 대조군 항체와 비교하는 경우 유사한 수준의 보호를 보였음을 나타낸다. IgG2 버전의 KPE33은 KPE33-IgG1보다 약간 더 낮은 활성을 보였다(도 6 참조).
실시예 9: 항-O1 항원 항체는 동시-감염 모델에서 보호한다
동시-감염에서 항-O1 항원 항체의 효능을 평가하기 위하여, 암컷 7 내지 8주령 C57BL/6 마우스를 간단하게 3% 이소플루란에서 마취시키고, 50 ㎕의 박테리아 현탁액을 콧구멍에 배치하였다. 동물을 단독으로 또는 1.5e2 CFU의 클레브시엘라 뉴모니아와 조합하여 5e7 CFU의 스타필로코커스 아우레우스 SF8300(USA300)으로 접종하고, 생존 연구를 위하여 최대 7일 모니터링하였다. 기관 부담 연구를 위하여, 폐 및 비장을 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 시험감염 후 24 또는 48시간에 수집하였다. 보호 연구를 위하여, 마우스를 KPE33 또는 대조군 mAb로 수동으로 면역화시킨 다음(0.5 ㎖, 복강내), 치명적인 박테리아 시험감염을 행하였다. 모든 데이터를 프리즘에서 플롯팅하였다.
결과는 도 7a 내지 도 7d에 나타나 있다. 스타필로코커스 아우레우스 및 클레브시엘라 뉴모니아의 하위-치사 접종물로의 동시-감염은 치명적인 폐렴을 야기하였으며(도 7a), 클레브시엘라 뉴모니아 박테리아 부담은 단독의 클레브시엘라 뉴모니아로 감염된 마우스에 비하여, 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스로 동시-감염된 마우스의 폐(도 7b) 및 비장(도 7c)에서 유의미하게 증가하였다. 동시-감염 24시간 전의 KPE33으로의 단일의 예방적 처치는 마우스를 구제하였다(도 7d).
실시예 10: 항-O1 항원 항체는 LPS 시험감염 후에 혈청 사이토카인을 감소시킨다
LPS 시험감염 후 혈청 사이토카인에 대한 항-O1 항원 항체의 효과를 결정하기 위하여, C57BL/6 마우스를 항-O1 투여 후 24시간에 0.3 ㎎/㎏의 LPS로 복강내 시험감염하였다. 3시간 후에, 동물을 희생시키고, 제조처의 지침에 기초하여, 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery, MSD) 전염증성 사이토카인 키트를 사용하여 혈청 사이토카인을 측정하였다. 폴리믹신 B(PMB)를 양성 대조군으로 사용하였다. 혈청 IL-6, TNF-알파 및 CXCL1 농도를 프리즘에서 플롯팅하였다.
결과는 도 8에 나타나 있으며, 54H7이 Kp43816 LPS 및 Kp15380 LPS로의 LPS 시험감염 후에 혈청 IL-6, KC 및 TNF-알파 수준을 감소시키는 것을 나타낸다.
실시예 11: 항-O1 항원 항체는 내독소혈증 모델에서 마우스를 보호한다
항-O1 항원 항체의 보호 효과를 결정하기 위하여, 6 내지 8주령의 암컷 마우스(Balb/c)를 D-갈락토스(D-Gal, 12 ㎎/㎏)로 감작시킨 후에, 항-O1 항원 항체 투여 후 24시간에 10 내지 50 ng의 LPS로 복강내(ip) 시험감염하였다. 항체를 0.2 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏의 용량으로 투여하였다. 마우스의 생존을 LPS 시험감염 후 6일까지 모니터링하였다.
결과는 도 9에 나타나 있으며, 54H7이 1 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏의 용량으로 투여되는 경우 대조군 IgG 항체 1 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏의 용량으로 투여되는 경우 대조군 IgG 항체(R347)에 비하여 내독소혈증 LPS-유도된 패혈증 모델에서 마우스를 보호하는 것을 나타낸다.
실시예 12: 항-O1 항원 항체 5H47은 클레브시엘라 기관 부담을 감소시키며, 항생제와 상승작용을 갖는다.
기관 부담을 감소시키는 항-O1 항원 항체 5H47의 능력을 박테리아 감염 모델에서 시험하였다.
항생제외 조합되는 항-O1 항원 항체의 효능을 결정하기 위하여, 54H7을 급성 폐렴 모델에서 시험하였다. C57BL/6 마우스를 1e4 CFU의 고 독성 균주 Kp43816(O1)으로 비강내 접종하였다. 15 ㎎/㎏의 항-클레브시엘라 뉴모니아 모노클로날 항체 54H7 및 15 ㎎/㎏의 인간 IgG1 대조군 항체를 박테리아 시험감염 24시간 전에 제공하였다(예방적 투여). 마우스 생존을 제14일까지 매일 모니터링하였다. 결과는 도 10a에 나타나 있다.
항-O1 항원 항체와 항생제의 상승작용을 또한 폐렴 마우스 모델에서 평가하였다. C57BL/6 마우스를 1e4 내지 1e8 CFU의 Kp8045 클레브시엘라로 비강내 접종하였다. 하위-치료적 용량의 항체(1 mpk) 및 메로페넴 항생제(1.5 mpk) 둘 모두를 각각 박테리아 시험감염 후 1시간 또는 4시간에 투여하였다. 마우스 생존을 제8일까지 매일 모니터링하였다. 결과는 도 10b에 나타나 있다.
54H7은 Kp43816 폐렴 모델에 대한 단일요법에서 15mpk에서 유의미한 보호를 보였다. 하위-치료적 용량의 54H7 및 메로페넴을 사용하는 경우, 조합은 단독의 메로페넴 또는 54H7의 단일요법 또는 인간 IgG1 대조군 항체(R347) 및 메로페넴의 조합보다 유의미한 상승작용 및 더 나은 보호를 보였다.
실시예 13: 에피토프 연구
클레브시엘라 뉴모니아 wbbYZ 유전자좌는 LPS 구조에서 D-갈락탄 II 도메인을 인코딩하며, 이는 O2에 대하여 O1 혈청형을 정의한다. (문헌[Hsieh, PF. et al., Front Microbiol. 5: 608 (2014)]). 본원에 개시된 항-O1 항원 항체가 D-갈락탄 II 도메인에 결합하는지를 조사하기 위하여, wbbYZ 유전자좌를 유전적으로 낙아웃시킴으로써 O1 균주 Kp1131115를 O2 혈청형으로 전환시켰다. Kp1131115 야생형(야생형 균주) 및 Kp1131115ΔwbbYZ 균주로의 클레브시엘라 뉴모니아 O1 LPS 항체의 결합을 FACS 분석에 의해 시험하였다. 인간 IgG1 및 항-MrkA 항체를 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로서 사용하였다. WbbYZ 유전자 낙아웃은 54H7 및 KPE33의 결합을 완전하게 폐지하였다. 그러나, 이러한 유전자의 낙아웃은 MrkA 항체로의 결합을 변경시키지 않았다. 도 11에 나타낸 이들 데이터는 KPE33 및 54H7 둘 모두가 클레브시엘라 뉴모니아 O1 LPS 항원의 D-갈락탄 II 도메인에 결합하는 것을 나타낸다. (도 12는 O1 LPS의 구조를 보여준다.)
KPE33 및 54H7은 둘 모두 O1 LPS의 D-갈락탄 II 도메인에 결합하지만, 이들은 KPE33 및 54H7을 사용한 경쟁적 결합 연구에서 정제된 O1 LPS가 사전-로딩된 포획 프로브를 사용하여 포르테바이오 옥텟에 의해 측정시 동일한 에피토프에 결합하지 않는다. 약술하면, 10 ㎍/㎖의 KPE33과의 초기 결합 후에, 프로브를 동일한 농도의 54H7, KPE33 또는 대조군 항체 R347과 함께 10 ㎍/㎖의 KPE33을 함유하는 항체 혼합물과 인큐베이션시켰다. 결과는 도 13에 나타나 있다. 오직 54H7만이 추가의 결합을 보여줄 수 있었으며, 이는 KPE33 및 54H7이 O1 LPS 상의 상이한 에피토프를 점유하는 것을 나타낸다.
실시예 14: 항-O1 항원 항체는 임상적으로 관련있는 클레브시엘라에 결합한다
항-O1 항원 항체가 임상적으로 관련있는 클레브시엘라 균주에 결합하는지를 결정하기 위하여, 임상적 분리주로의 KPE33의 결합을 웨스턴 블롯 검정에 의해 결정하였다. KPE33이 결합하는 임상적으로 관련있는 클레브시엘라 균주의 요약은 표 8에 나타나 있다. 모든 이들 균주에 결합하는 KPE33의 능력 및 생체내에서 4가지 상이한 균주에 대하여 보호하는 그의 능력은 KPE33이 많은 임상적으로 관련있는 클레브시엘라 균주를 사멸시킬 수 있음을 나타낸다.
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표 8의 1행 내지 36행의 분리주는 클레브시엘라 뉴모니아 카바페넴 내성(CRE) 균주이다. 표 8의 37행 내지 134행의 분리주는 스펙트럼 연장 베타 락타마제(ESBL) 균주이며, 표 8의 135행 내지 184행의 분리주는 항생제-민감성 균주이다.
이들 결과는 KPE33, 항-O1 항원 항체가 크고 다양한 군의 임상적 균주 뿐만 아니라, 임상적으로 관련있는 항생제 내성 균주에 결합하는 것을 나타낸다. 이들 결과는 KPE33이 표 8에 개시된 클레브시엘라 균주 중 하나 이상에 대하여 본원에 기재된 바와 같은 치료제 및/또는 진단제로서 유용할 수 있음을 시사한다.
실시예 15: γδ T 세포 동원 및 IL-17 신호전달은 항-O1 항체 보호와 상호관련된다
TLR4 신호전달은 점막의 선천 면역 방어에 주요한 세포 집단인 γδ T 세포의 동원 및 활성화에 연루된다. γδ T 세포 동원에 대한 LPS-중화 및 LPS-비-중화 항-O1 항체의 영향을 시험하기 위하여, γδTCR+ T 세포의 백분율은 항-O1 항체로 처치되고, 클레브시엘라 뉴모니아(1e4 CFU Kp8045)로 감염된 마우스의 폐에서 측정하였다. 유세포측정 분석에 의해, 조기 γδ T 세포 동원이 54H7로의 예방에 의해 억제되었으나, KPE33에 의해서는 억제되지 않았음이 드러났다(도 14a). 감염 1시간 후의 54H7 또는 KPE33 중 어느 하나로의 마우스의 처치는 γδ T 세포의 동원을 억제하지 않았으며, 이는 조기 LPS 신호전달의 중화가 이들 유익한 세포의 동원을 예방함을 시사한다(도 14b).
γδ T 세포는 IL-17의 주요 생성자이며, 이는 주요 항미생물 경로 및 호중구의 식세포 기능을 활성화시킨다. IL-17A-/- 마우스를 사용하여, KPE33에 의해 제공되는 보호에 대한 이러한 경로의 기여를 입증하였다. 야생형 및 IL-17A-/- 마우스를 c-IgG, 54H7 또는 KPE33으로 예방적으로 처치하고, 치명적인 클레브시엘라 뉴모니아의 수로 감염시켰다. c-IgG 또는 54H7로 예방적으로 면역화된 야생형 및 IL-17A-/- 마우스 간에는 생존의 차이가 관찰되지 않았다(도 14c). 대조적으로, 생존의 유의미한 감소는 KPE33을 제공한 야생형 마우스에 비하여 KPE33으로 수동으로 면역화된 IL-17A-/- 마우스에서 관찰되었다(도 14d). 이들 결과는 γδ T 세포의 주요 특징인 IL-17 신호전달이 KPE33에 의해 제공되는 최적의 보호에 필요한 것을 뒷받침한다.
* * *
특정 구현예에 대한 전술한 설명은 다른 이들이 당업계의 기술 이내의 지식의 적용에 의해 본 발명의 일반적인 개념으로부터 벗어나지 않고서, 과도한 실험 없이, 그러한 특정 구현예와 같은 다양한 적용을 위하여 용이하게 변형 및/또는 수정할 수 있도록 충분히 본 발명의 일반적인 성질을 나타낼 것이다. 따라서, 그러한 수정 및 변형은 본원에 제시된 교시 및 지침을 기반으로 하여, 개시된 구현예의 균등물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원의 어구 또는 용어는 설명의 목적을 위한 것이지 제한의 목적이 아니어서, 본 명세서의 용어 또는 어구는 교시 및 지침을 고려하여 당업자에 의해 해석된다고 이해되어야 한다.
본 발명의 폭 및 범위는 위에서 기술된 예시적인 구현예 중 어느 것에 의해서도 제한되어서는 안 되며, 다음의 청구범위 및 그것들의 균등물에 따라서만 정의되어야 한다.
본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 문헌은 각각의 개별적인 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 문헌이 개별적으로 모든 목적을 위하여 참조로 포함되는 것으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위하여 그 전체가 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> MEDIMMUNE, LLC HUMABS BIOMED SA <120> ANTI-O1 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> KLEB-101-WO-PCT <140> <141> <150> 62/410,005 <151> 2016-10-19 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> KPE33 KPE33V2016 VH-CDR1 <400> 1 Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> KPE33 KPE33V2016 VH-CDR2 <400> 2 Ile Ala Trp Lys Ser Gly Ala Thr 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> KPE33 KPE33V2016 VH-CDR3 <400> 3 Thr Arg Arg Arg Ala Ser Gly Asp Asp Thr Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> KPE33 KPE33V2016 VL-CDR1 <400> 4 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Synthetic peptide <220> <223> 54H7 VL-CDR2 <400> 45 Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> 54H7 VL-CDR3 <400> 46 Leu Gln His Thr Asp Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 47 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> 54H7 VH <400> 47 Gln Val His Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asn Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> 54H7 VL Amino Acid Sequence <400> 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu Asn Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Ser Glu Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln His Thr Asp Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 49 <211> 364 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> KPA27 VH Polynucleotide Sequence <400> 49 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaaac ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctgaaaa caccttcaac gacttctata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atccaccctg acggtgttgt cacaaactat 180 gcacagaaat ttcagggcag ggtcactatg accagggaca cgtccatcaa cacagtctac 240 atggaattga acggcctgat ctctgacgac acggccgtgt attactgtat gagagacggg 300 ccaggatcag aaggttcctg gtttgactat tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tcag 364 <210> 50 <211> 310 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> KPA27 VL Polynucleotide Sequence <400> 50 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gcctgttagt aatagattgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggagagccc ctacactcct gatctacaag gcgtctactt tacaaagtgg ggtcccatta 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tctcagacct tcggccaagg gaccaaggtg 300 gaaatcaaac 310 <210> 51 <211> 352 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> KPD202 VH Polynucleotide Sequence <400> 51 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagcctc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aacttttggg tgggctgggg ccgccaggct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtggccaat ataaacccag atggaagtga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg agtcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtct 240 ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac gcggctgtgt actactgtgc gagactaggg 300 ccgttccatc ctgactgctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc ag 352 <210> 52 <211> 337 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> KPD202 VL Polynucleotide Sequence <400> 52 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacaccta cttgaattgg 120 tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt atgaggtttc taaccgggac 180 tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tattggggtt tattactgca tgcaaggaac acactggccg 300 tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaac 337 <210> 53 <211> 361 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> KPJ4 VH Polynucleotide Sequence <400> 53 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaggc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacactg ctgcttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat attacaggtc cgagtggtat 180 aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240 cagttctccc tgcagttgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agaatttcct ggaacgacct cccagcttgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 g 361 <210> 54 <211> 340 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> KPJ4 VL Polynucleotide Sequence <400> 54 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccact 60 atcaactgca agtccagcca gagtatttta tacagctccc acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aaggtgctca tttactgggc gtctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcaacc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcagta ttgtaatatc 300 ccgtacactt ttggccaggg gaccaagctg gagatcaaac 340 <210> 55 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> KPE33 VH Polynucleotide Sequence <400> 55 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggggcc ttggtacagc ctggcgggtc cctgagactc 60 tcgtgtgcag tttctggatt catctttgat gattatgcca tccactgggt ccggcgagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggc attgcttgga agagtggtgc cacaaactat 180 gcggactctg tgaagggccg cttcgccatc tctagagaca actccaagaa atctatgtat 240 ctacaaatga acagtctggg aactgaagac acggccttgt attactgtac aagacgacgg 300 gcgtctgggg atgatacttt ttattacttt gactattggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 56 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> KPE33 VL Polynucleotide Sequence <400> 56 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccaggaga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gaatgttaat accaacttag cctggtacca gcagcgacct 120 ggacagtctc ccagactcct catttatgat gcatccacca gggccgctgg cctcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtctacta ttgtcagcag tgtaccaact ggcggtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 57 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> KPE33V2016 VH Polynucleotide Sequence <400> 57 gaggtgcagc tggtcgaatc cggcggggga ctggtgcagc ctggccgctc actgagactg 60 agctgcgccg cttccgggtt catctttgac gattacgcta tgcactgggt gcggcaggca 120 cctggcaagg gactggagtg ggtctctggg atcgcctgga aaagtggagc aaccaactac 180 gccgactcag tgaaggggag attcgccatt agccgggata actctaagaa aagtatgtat 240 ctgcagatga attccctggg aaccgaagac acagccctgt actattgtac acggagaagg 300 gcttctggcg acgatacttt ctactatttt gattattggg gacagggcac tctggtgacc 360 gtcagctcc 369 <210> 58 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> KPE33V2016 VL Polynucleotide Sequence <400> 58 gagatcgtgc tgacacagtc cccagccact ctgtctctga gtcccgggga acgggcaact 60 ctgtcttgca gagccagtca gaacgtcaat accaacctgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggacaggcac ctcgactgct gatctatgac gccagcaata gggctacagg cattccagca 180 cgcttctcag gatctggatc tggaaccgac tttactctga ccatcagctc cctggagccc 240 gaagatttcg ccgtgtacta ttgtcagcag accacaaact ggagatacac ctttggccag 300 gggacaaagc tggagatcaa g 321 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Ile Ala Tyr Lys Ser Gly Ala Thr 1 5 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Thr Arg Arg Arg Ala Ser Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 61 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 61 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ala Tyr Lys Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gln Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Arg Ala Ser Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 62 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 62 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ala Tyr Lys Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gln Ser Lys Lys Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Arg Ala Ser Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 63 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asn Thr Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Thr Asn Trp Arg Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 64 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 64 caggtgcagc tcgtggagtc cggcggtggc ctggttcagc ctggccgctc tcttagactg 60 agttgcgccg ctagcggttt tattttcgac gactatgcga tccactgggt tagacaagca 120 ccaggaaagg gacttgaatg ggtttctggg attgcgtata aatcaggggc cacgaactac 180 gctgagagcg ttaaggggcg atttactata agcagggatc agtccaaaaa ctcactgtac 240 ttgcagatga actcactcag agccgaggac acggcgttgt actactgcac acgaaggagg 300 gcatcaggag ataatacctt ttattacttc gactactggg gccaaggcac gttggtaacg 360 gtgagttct 369 <210> 65 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 65 caggtgcagc tcgtggagtc cggcggtggc ctggttcagc ctggccgctc tcttagactg 60 agttgcgccg ctagcggttt tattttcgac gactatgcga tccactgggt tagacaagca 120 ccaggaaagg gacttgaatg ggtttctggg attgcgtata aatcaggggc cacgaactac 180 gctgagagcg ttaaggggcg atttactata agcagggatc agtccaaaaa gtcactgtac 240 ttgcagatga actcactcag agccgaggac acggcgttgt actactgcac acgaaggagg 300 gcatcaggag ataatacctt ttattacttc gactactggg gccaaggcac gttggtaacg 360 gtgagttct 369 <210> 66 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 66 cagattgtgt tgacgcagag tcccgcgaca cttagcctct ctcccggaga gagagcgacg 60 cttagttgcc gagcatccca gaacgtcaac actaatctcg cgtggtatca gcagaagccg 120 ggccaagccc ccaggctgtt gatttacgac gctagtaacc gcgccacagg aatcccggca 180 agatttagtg ggtcaggatc aggaactgac tttaccttga cgataagtag tctggaacca 240 gaagatttcg ccgtatatta ctgtcaacag acaacaaact ggcgctacac cttcggccaa 300 ggaacaaaac ttgagatcaa g 321 <210> 67 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 67 cagattgtgt tgacgcagag tcccgcgaca cttagcctct ctcccggaga gagagcgacg 60 cttagttgcc gagcatccca gaacgtcaac actaatctcg cgtggtatca gcagaagccg 120 ggccaagccc ccaggctgtt gatttacgac gctagtaacc gcgccacagg aatcccggca 180 agatttagtg ggtcaggatc aggaactgac tttaccttga cgataagtag tctggaacca 240 gaagatttcg ccgtatatta ctgtcaacag acaacaaact ggcgctacac cttcggccaa 300 ggaacaaaac ttgagatcaa g 321 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Cys Ser Trp His Leu Cys 1 5

Claims (88)

  1. 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질로서, 상기 항원 결합 단백질이 a) 클레브시엘라의 옵소닌 포식 살해(opsonophagocytic killing, OPK)를 유도하거나, b) 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라를 살해하거나, c) 클레브시엘라의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라를 살해하는, 단리된 항원 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 지질다당류(LPS)를 중화시키지 않는, 항원 결합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 LPS를 중화시키는, 항원 결합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 항원 결합 단백질이 (i) 클레브시엘라의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라를 살해하고, 지질다당류(LPS)를 중화시키거나, (ii) 클레브시엘라의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라를 살해하지만, LPS를 중화시키지 않는, 항원 결합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 치명적인 클레브시엘라 시험감염에 노출된 마우스에서 치료적으로 유효한, 항원 결합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 클레브시엘라가 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카(K. oxytoca), 클레브시엘라 그래뉼로마티스(K. granulomatis), 클레브시엘라 오자에나(K. ozaenae), 클레브시엘라 리노스클레로마티스(K. rhinoscleromatis) 또는 클레브시엘라 플란티콜라(K. planticola)인, 항원 결합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 클레브시엘라가 클레브시엘라 뉴모니아인, 항원 결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클레브시엘라가 다제 내성인, 항원 결합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 클레브시엘라 뉴모니아가 균주 Kp113115 또는 Kp8561인, 항원 결합 단백질.
  10. 제8항에 있어서, 상기 클레브시엘라 뉴모니아가 표 8의 1행 내지 134행 중 하나에 열거된 균주인, 항원 결합 단백질.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 다제 내성 클레브시엘라 뉴모니아 균주가 적어도 하나의 항생제에 감수성이 되도록 하는, 항원 결합 단백질.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클레브시엘라가 항생제에 민감성인, 항원 결합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 클레브시엘라 뉴모니아가 표 8의 135행 내지 184행 중 하나에 열거된 균주인, 항원 결합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원의 D-갈락탄 II 도메인에 결합하는, 항원 결합 단백질.
  15. 상보성-결정 영역(CDR)의 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질로서,
    HCDR1이 SEQ. ID. NO: 1의 아미노산 서열을 가지며;
    HCDR2가 SEQ. ID. NO: 2 또는 59의 아미노산 서열을 가지며;
    HCDR3이 SEQ. ID. NO: 3 또는 60의 아미노산 서열을 가지며;
    LCDR1이 SEQ. ID. NO: 4의 아미노산 서열을 가지며;
    LCDR2가 SEQ. ID. NO: 5 또는 10의 아미노산 서열을 가지며;
    LCDR3이 SEQ. ID. NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 단리된 항원 결합 단백질.
  16. 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질로서, 상기 항원 결합 단백질이 SEQ ID NO: 12, 61 또는 62와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 SEQ ID NO: 13 또는 63과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단리된 항원 결합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 상기 이의 항원 결합 단백질이 SEQ ID NO: 12, 61 또는 62를 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 13 또는 63을 포함하는 VL을 포함하는, 항원 결합 단백질.
  18. SEQ ID NO: 12를 포함하는 VH를 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질.
  19. SEQ ID NO: 13을 포함하는 VL을 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질.
  20. SEQ ID NO: 12, 61 또는 62를 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 13 또는 63을 포함하는 VL을 포함하는 항체와 동일한, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질.
  21. SEQ ID NO: 12, 61 또는 62를 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 13 또는 63을 포함하는 VL을 포함하는 항체의 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원으로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 단리된 항원 결합 단백질.
  22. 상보성-결정 영역(CDR)의 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질로서, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3이 하기의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항원 결합 단백질:
    각각 SEQ. ID. NO: 41, 42, 43, 44, 45 및 46;
    각각 SEQ. ID. NO: 32, 33, 34, 35, 36 및 38;
    각각 SEQ. ID. NO: 32, 33, 34, 35, 37 및 38;
    각각 SEQ. ID. NO: 1, 2, 3, 4, 5 및 7;
    각각 SEQ. ID. NO: 1, 2, 3, 4, 6 및 7;
    각각 SEQ. ID. NO: 14, 15, 16, 17, 18 및 20;
    각각 SEQ. ID. NO: 14, 15, 16, 17, 19 및 20;
    각각 SEQ. ID. NO: 23, 24, 25, 26, 27 및 29; 또는
    각각 SEQ. ID. NO: 23, 24, 25, 26, 28 및 29.
  23. 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질로서, 상기 항원 결합 단백질이 하기와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 및 VL을 포함하는 단리된 항원 결합 단백질:
    각각 SEQ. ID. NO: 47 및 SEQ ID NO: 48;
    각각 SEQ. ID. NO: 39 및 SEQ ID NO: 40;
    각각 SEQ. ID. NO: 8 및 SEQ ID NO: 9;
    각각 SEQ. ID. NO: 21 및 SEQ ID NO: 22; 또는
    각각 SEQ. ID. NO: 30 및 SEQ ID NO: 31.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 하기를 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 항원 결합 단백질:
    각각 SEQ. ID. NO: 47 및 SEQ ID NO: 48;
    각각 SEQ. ID. NO: 39 및 SEQ ID NO: 40;
    각각 SEQ. ID. NO: 8 및 SEQ ID NO: 9;
    각각 SEQ. ID. NO: 21 및 SEQ ID NO: 22; 또는
    각각 SEQ. ID. NO: 30 및 SEQ ID NO: 31.
  25. SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 21 또는 SEQ ID NO: 30을 포함하는 VH를 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질.
  26. SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 31을 포함하는 VL을 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질.
  27. 하기를 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 항체와 동일한, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질:
    각각 SEQ. ID. NO: 47 및 SEQ ID NO: 48;
    각각 SEQ. ID. NO: 39 및 SEQ ID NO: 40;
    각각 SEQ. ID. NO: 8 및 SEQ ID NO: 9;
    각각 SEQ. ID. NO: 21 및 SEQ ID NO: 22; 또는
    각각 SEQ. ID. NO: 30 및 SEQ ID NO: 31.
  28. 하기를 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 항체의 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원으로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 단리된 항원 결합 단백질:
    각각 SEQ. ID. NO: 47 및 SEQ ID NO: 48;
    각각 SEQ. ID. NO: 39 및 SEQ ID NO: 40;
    각각 SEQ. ID. NO: 8 및 SEQ ID NO: 9;
    각각 SEQ. ID. NO: 21 및 SEQ ID NO: 22; 또는
    각각 SEQ. ID. NO: 30 및 SEQ ID NO: 31.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 뮤린, 비-인간, 인간화, 키메라, 재표면화 또는 인간인 항원 결합 단백질.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 인간화, 키메라, 재표면화 또는 인간인 항원 결합 단백질.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 항체인 항원 결합 단백질.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 항체의 항원 결합 단편인 항원 결합 단백질.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중-특이적 항체, 다중-특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 항원 결합 단백질.
  34. 제1항 내지 제30항, 제32항 또는 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단쇄 Fv 또는 scFv, 이황화 결합된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디(intrabody), IgGΔCH2, 미니바디(minibody), F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2 또는 scFv-Fc를 포함하는 항원 결합 단백질.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4.0E-09 내지 6.0E-09 nM 범위의 Kd로 클레브시엘라 O1 항원에 결합하는 항원 결합 단백질.
  36. 제35항에 있어서, 결합 친화도가 유세포측정, 비아코어(Biacore), KinExa 또는 방사성면역검정에 의해 측정되는 항원 결합 단백질.
  37. 제15항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 a) 클레브시엘라 뉴모니아의 옵소닌 포식 살해(OPK)를 유도하고/하거나, b) 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라 뉴모니아를 살해하고/하거나, c) 지질다당류(LPS)를 중화시키는 항원 결합 단백질.
  38. 제37항에 있어서, 항원 결합 단백질이 (i) 클레브시엘라 뉴모니아의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라 뉴모니아를 살해하고, LPS를 중화시키거나, (ii) 클레브시엘라 뉴모니아의 OPK를 유도하고, 혈청 살균 검정에 의해 측정시 보체 의존적 살해를 통해 클레브시엘라 뉴모니아를 살해하지만, LPS를 중화시키지 않는 항원 결합 단백질.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 클레브시엘라 뉴모니아가 다제 내성인 항원 결합 단백질.
  40. 제39항에 있어서, 상기 클레브시엘라 뉴모니아가 균주 Kp113115 또는 Kp8561인 항원 결합 단백질.
  41. 제39항에 있어서, 상기 클레브시엘라 뉴모니아가 표 8의 1행 내지 134행 중 하나에 열거된 균주인 항원 결합 단백질.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질은 다제 내성 클레브시엘라 뉴모니아 균주가 항생제에 감수성이 되도록 하는 항원 결합 단백질.
  43. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 클레브시엘라가 항생제에 민감성인 항원 결합 단백질.
  44. 제43항에 있어서, 상기 클레브시엘라 뉴모니아가 표 8의 135행 내지 184행 중 하나에 열거된 균주인 항원 결합 단백질.
  45. 제15항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 지질다당류(LPS)를 중화시키지 않는 항원 결합 단백질.
  46. 제15항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 LPS를 중화시키는 항원 결합 단백질.
  47. 제15항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 치명적인 클레브시엘라 시험감염에 노출된 마우스에서 치료적으로 유효한 항원 결합 단백질.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질:
    (a) IgA 불변 도메인;
    (b) IgD 불변 도메인;
    (c) IgE 불변 도메인;
    (d) IgG1 불변 도메인;
    (e) IgG2 불변 도메인;
    (f) IgG3 불변 도메인;
    (g) IgG4 불변 도메인; 및
    (h) IgM 불변 도메인.
  49. 제48항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질이 IgG1 불변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질:
    (a) Ig 카파 불변 도메인; 및
    (b) Ig 람다 불변 도메인.
  51. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단백질이 인간 IgG1 불변 도메인 및 인간 람다 불변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 이의 항원 결합 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산 분자.
  53. 제52항에 있어서, 핵산 분자가 제어 서열에 작동 가능하게 연결되는 핵산 분자.
  54. 제52항 또는 제53항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  55. 제52항 또는 제53항의 핵산 분자 또는 제54항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  56. 제55항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 숙주 세포인 숙주 세포.
  57. 제56항에 있어서, 숙주 세포가 HEK293 세포, NS0 뮤린 골수종 세포, PER.C6® 인간 세포 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 포유동물 숙주 세포.
  58. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 생성하는 하이브리도마.
  59. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 생성하는 단리된 숙주 세포.
  60. (a) 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하거나 제55항 내지 제57항 및 제59항 중 어느 한 항의 숙주 세포 또는 제58항의 하이브리도마를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 숙주 세포로부터 상기 이의 항원 결합 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질의 제조 방법.
  61. 제60항의 방법을 사용하여 생성되는 항원 결합 단백질.
  62. 제1항 내지 제51항 또는 제61항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 부형제가 보존제, 안정화제 또는 항산화제인 약제학적 조성물.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  65. 표지화 기 또는 이펙터 기를 추가로 포함하는, 제1항 내지 제51항 또는 제61항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질 또는 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 표지화 기가 동위원소 표지, 자성 표지, 산화환원 활성 모이어티, 광학 염료, 비오티닐화된 기, 형광 모이어티, 예컨대, 비오틴 신호전달 펩티드, 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(BFP), 시안 형광 단백질(CFP) 및 황색 형광 단백질(YFP), 및 2차 리포터에 의해 인식되는 폴리펩티드 에피토프, 예컨대, 히스티딘 펩티드(his), 헤마글루티닌(HA), 금 결합 펩티드 및 Flag로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 결합 단백질 또는 약제학적 조성물.
  67. 제65항에 있어서, 이펙터 기가 방사성 동위원소, 방사성 핵종, 독소, 치료제 및 화학치료제로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 결합 단백질 또는 약제학적 조성물.
  68. 클레브시엘라 감염과 관련된 질환을 치료하기 위한 제1항 내지 제51항 또는 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질 또는 약제학적 조성물의 용도.
  69. 제1항 내지 제51항 또는 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항의 유효량의 항원 결합 단백질 또는 약제학적 조성물을 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료, 예방 또는 개선을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료, 예방 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서의 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료, 예방 또는 개선 방법.
  70. 제1항 내지 제51항 또는 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질 또는 약제학적 조성물을 클레브시엘라의 성장의 억제 또는 클레브시엘라의 수의 감소를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 클레브시엘라로 감염된 대상체에서의 클레브시엘라의 성장의 억제 또는 클레브시엘라의 수의 감소 방법.
  71. 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 유효량의 항원 결합 단백질을 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 클레브시엘라 감염과 관련된 질환의 치료 방법.
  72. 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 유효량의 항원 결합 단백질을 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 동시-감염과 관련된 질환의 치료, 예방 또는 개선을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스 동시-감염과 관련된 질환의 치료, 예방 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서의 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스 동시-감염과 관련된 질환의 치료, 예방 또는 개선 방법.
  73. 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 유효량의 항원 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스로 동시-감염된 대상체에서의 클레브시엘라 뉴모니아의 독성의 억제, 감소 또는 제거 방법.
  74. 클레브시엘라 O1 항원에 특이적으로 결합하는 유효량의 항원 결합 단백질을 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스 둘 모두로 감염된 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 클레브시엘라 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스 둘 모두로 감염된 대상체의 생존의 증가 방법.
  75. 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클레브시엘라가 항생제-내성인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 클레브시엘라가 세팔로스포린(cephalosporin), 퀴놀론(quinolone), 카바페넴(carbapenem), 메로페넴(meropenem), 플루오로퀴놀론(fluoroquinolone), 테트라사이클린(tetracycline), 클로람페니콜(chloramphenicol), 트리메토프림(trimethoprim), 술폰아미드(sulfonamide) 및/또는 콜리스틴(colistin)에 대하여 내성인 방법.
  77. 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 클레브시엘라가 항생제에 대하여 민감성인 방법.
  78. 항생제-내성 클레브시엘라 균주를 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는 항생제에 대한 항생제-내성 클레브시엘라 균주의 감작 방법.
  79. 제69항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질 및 상기 항생제가 상승적 치료 효과를 제공하는 방법.
  81. 항생제 및 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 대상체에게 동시-투여하는 단계를 포함하는 항생제-내성 클레브시엘라 균주로 감염된 대상체에서의 클레브시엘라 감염의 예방 또는 치료 방법으로서, 동시-투여가 항원 결합 단백질 또는 항생제의 등몰량의 투여의 개별 효과의 합보다 더 큰 치료 효과를 제공하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 치료 효과가 항원 결합 단백질 또는 항생제 중 오직 하나만이 투여되는 대상체의 상가적 생존 백분율보다 더 큰 생존 백분율을 초래하는 방법.
  83. 제79항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제가 메로페넴인 방법.
  84. 제71항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
  85. 제71항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 클레브시엘라 뉴모니아 O1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질이 제1항 내지 제51항 또는 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질 또는 약제학적 조성물인 방법.
  86. 제69항 내지 제71항 또는 제75항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 클레브시엘라가 클레브시엘라 뉴모니아, 클레브시엘라 옥시토카, 클레브시엘라 플란티콜라, 클레브시엘라 오자에나, 클레브시엘라 리노스클레로마티스 및/또는 클레브시엘라 그래뉼로마티스인 방법.
  87. 제68항, 제69항, 제71항, 제72항, 제75항 내지 제77항, 제79항, 제80항 또는 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 폐렴, 요로 감염, 패혈증(septicemia/sepsis), 신생아 패혈증, 설사, 연조직 감염, 장기 이식 후 감염, 수술 감염, 상처 감염, 폐 감염, 화농성 간농양(PLA), 눈속염증, 수막염, 괴사성 수막염, 강직성 척추염 및 척추관절병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도 또는 방법.
  88. 제68항, 제69항, 제71항, 제72항, 제75항 내지 제77항, 제79항, 제80항 또는 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 병원내 감염인 용도 또는 방법.
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