JP5798199B2 - 抗がん剤 - Google Patents
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Description
本願は、2012年3月8日に、日本に出願された特願2012−52334号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
また、本願明細書において、「細胞傷害性」とは、細胞に対して死又は機能障害を与える性質を意味する。
(1)可変領域が配列番号1のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
(2)可変領域が配列番号7のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
(3)可変領域が配列番号9のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
(4)可変領域が配列番号13のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
(5)可変領域が配列番号19のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
(6)可変領域が配列番号38の1〜113番目のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
(7)可変領域が配列番号40の1〜112番目のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
(8)可変領域が配列番号41の1〜107番目のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、二量体であるヒト抗体κ型軽鎖。
(1.ヒト末梢血cDNAの調製)
狂犬病ウイルスのワクチンを用いて、複数回にわたって過剰免疫されたボランティアから得られた末梢血から、Ficoll−paqueを用いてリンパ球を分離した。RNA extraction kit(Stratagene)を用いて、分離した約3.0×107個のリンパ球からトータルRNAを得た。TheromoScript RT−PCR System(Invitrogen)を用い、oligo(dT)をプライマーとして、トータルRNAを逆転写することにより、目的とするcDNA(cDNAライブラリ−)を調製した。
前記1.で取得したcDNAを鋳型として、サブグループIIに属するVκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子を増幅するためのプライマーを用いた2段階のPCR反応を行い、約750bpのPCR産物(サブグループIIに属するκ型軽鎖遺伝子)を得た。これらのPCR産物をクローニングし、シーケンス解析を行い、相同性検索により、それぞれの生殖細胞系列遺伝子(germline gene)におけるVκ遺伝子を推定した。この結果、得られた18クローンすべてがサブグループIIに属していた。このうち、クローン#1(生殖細胞系列遺伝子型:A18b)、クローン#2(生殖細胞系列遺伝子型:A3/A19)、クローン#4(生殖細胞系列遺伝子型:O11/o1)、クローン#7(生殖細胞系列遺伝子型:A3/A19)、クローン#8(生殖細胞系列遺伝子型:A18b)、クローン#9(生殖細胞系列遺伝子型:A18b)、クローン#11(生殖細胞系列遺伝子型:A18b)、クローン#13(生殖細胞系列遺伝子型:A3/A19)、及びクローン#14(生殖細胞系列遺伝子型:A3/A19)の9クローンを以降の実験に用いた。
前記2.で取得した各クローンをそれぞれ、Hisタグ配列サイトを有するプラスミドベクターに導入し、当該プラスミドベクターを大腸菌に導入して形質転換体を作製した。各形質転換体を培養し、IPTGによる発現誘導を行ったところ、SDS−PAGE分析及び抗ヒト型(Fab’)2抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、大腸菌において発現したタンパク質がヒト型抗体軽鎖であることを同定することができた。得られたヒト型抗体軽鎖は、N末端にM(開始メチオニン)を、C末端にプラスミドベクター由来のLEHHHHHH(配列番号23)を有していた。
狂犬病ウイルスのワクチンを用いて、複数回にわたって被験者を過剰免疫し、血清の中和活性を測定した。血清の中和活性が最も高かった(7.2IU)被験者をドナーとして末梢血を採取し、Ficoll−paqueを用いて当該末梢血からリンパ球を分離した。RNA extraction kit(Stratagene)を用いて、分離した約3.0×107個のリンパ球からトータルRNAを得た。TheromoScript RT−PCR System(Invitrogen)を用い、oligo(dT)をプライマーとして、トータルRNAを逆転写することにより、後述するPCR反応において鋳型とするcDNAを調製した。
前記4.で取得したcDNAを鋳型として、ヒト抗体軽鎖遺伝子を網羅的に増幅するためのプライマーセットを用いてPCR反応を行い、約660bpのPCR産物を得た。このPCR産物を精製し、大腸菌発現ベクターpET101/D−TOPOベクター(登録商標、Invitrogen)に挿入し、LCAライブラリを構築した。なお、pET101/D−TOPOベクターにPCR産物を挿入した発現ベクターからは、当該PCR産物がコードするタンパク質のC末端にHisタグを付加させたタンパク質が発現される。このLCAライブラリのcDNAを鋳型として、サブグループIIに属するVκ遺伝子を有するヒト抗体軽鎖遺伝子を増幅するためのプライマーを用いてPCR反応を行い、約660bpのPCR産物を得た。これらのPCR産物をクローニングし、シーケンス解析を行い、解析ソフトウェア(GENETIX(登録商標) Ver.8)を用いて、アミノ酸配列ならびに軽鎖の可変領域および定常領域を推定し、それぞれの生殖細胞系列遺伝子(germline gene)におけるVκ遺伝子を推定した。これらのクローンの中から、クローン22F6(生殖細胞系列遺伝子型:A3/A19)及びクローン23D4(生殖細胞系列遺伝子型:A3/A19)の2クローンを以降の実験に用いた。得られたヒト型抗体軽鎖は、N末端にM(開始メチオニン)を、C末端にプラスミドベクター由来のLEHHHHHH(配列番号23)を有していた。
前記2.及び5.で取得したクローンのヒト抗体κ型軽鎖は、C末端にあるシステインによりジスルフィド(S−S)結合が形成されるため、二量体を形成している。そこで、S−S結合に関与するシステイン(図1のアミノ酸配列のC末端のシステイン)をアラニンに置換する変異を導入して、単量体のヒト型抗体酵素のみが形成されるように、cDNAを設計した。C末端にプラスミドベクター由来のLEHHHHHHを付加したヒト型抗体軽鎖(#1_WT)に対するこの設計の詳細を図2に示す。図2の(a)に示すように、全長のヒト型抗体酵素の遺伝子における220番目のシステインをコードするTGTを、GCTに置換した。これによって、図2の(b)に示すように、元のアミノ酸配列では220番目がシステインであるために二量体が形成されるが、置換後のアミノ酸では220番目がアラニンであるために、S−S結合が形成されず、単量体となる。
各ヒト型抗体軽鎖を以下の様に一次精製および二次精製した。図3の(a)は、ヒト型抗体軽鎖(#1_WT)及びヒト型抗体軽鎖(#1_C220A)の一次精製におけるNi−NTAカラムクロマトグラムおよびSDS−PAGE分析の結果を示す図である。図3の(b)は、二次精製における陽イオン交換クロマトグラムおよびSDS−PAGE分析の結果を示す図である。
図3の(a)左段に示すように、サンプルのアプライ後に素通り画分が流れ切るまで、緩衝液A(25mMのTris−HCl(pH8.0)、0.25MのNaCl、40mMのイミダゾール、0.005%のTween20)を流した。そして、左段のグラフにおける破線に示されるように、イミダゾールの濃度を40mMから300mMまで漸次的に上昇させて、ゲルと結合した成分を溶出させた。カラムとしてNi−NTAアガロースカラム(直径1cm、2ml)を用い、精製を通して流速を0.1mL/分に維持した。図3の(a)の右段に示すように、目的とする約31kDaのバンドが、フラクション番号30〜37に検出された。このサンプルを1つにまとめて、次の二次精製を行った。
各種ヒト抗体κ型軽鎖のがん細胞に対する細胞障害性について試験した。がん細胞は、ATCCより購入したA549(ヒト肺胞上皮がん細胞株)を用い、10%FCS(ウシ胎児血清)含有F−12K培地を用いる通常の方法で培養した。
当該4クローンのうち、クローン(#4_WT)及びクローン(#7_WT)は特に強い細胞傷害性を示した。中でもクローン(#7_WT)は、ヒト抗体κ型軽鎖添加前(0時間)とヒト抗体κ型軽鎖添加後(48時間)において、ウェル内の細胞数がほとんど変化しなかったことから、クローン(#7_WT)、すなわちヒト抗体κ型軽鎖(#7)は、A549細胞の増殖を抑制する効果があることが示唆された。
また、今回用いたクローンの結果から、二量体(WT)のほうが単量体よりも細胞傷害性が強い傾向が観察されたことから、二量体に強い細胞傷害性が存在することも示唆された。
また、他のクローンを含めたものについても、各種細胞株に対し、上記と同様にヒト抗体κ型軽鎖の細胞障害性を評価した。その結果を表3に示す。
なお、クローン(#1_H31Y C220A)のアミノ酸配列は配列番号38に、クローン(#7 VL(I))のアミノ酸配列は配列番号39に、クローン(#7 RLI)のアミノ酸配列は配列番号40に、クローン(C51)のアミノ酸配列は配列番号41に、クローン(C87)のアミノ酸配列は配列番号42に、クローン(#7 EI)のアミノ酸配列は配列番号43に、クローン(#7 TR)のアミノ酸配列は配列番号44に、クローン(#7 VL)のアミノ酸配列は配列番号45に、クローン(S13)のアミノ酸配列は配列番号46に、クローン(S21)のアミノ酸配列は配列番号47に、クローン(S38)のアミノ酸配列は配列番号48に、クローン(#10)のアミノ酸配列は配列番号49に、クローン(C67)のアミノ酸配列は配列番号50に、クローン(C82)のアミノ酸配列は配列番号51に、クローン(C88)のアミノ酸配列は配列番号52に、クローン(#7 G)のアミノ酸配列は配列番号53に、それぞれ記載されている。
また、図7、図8に示す通り、本願のヒト抗体κ型軽鎖を含有する抗がん剤は、動物実験において毒性を全く示さなかった。
Claims (2)
- 可変領域が配列番号19のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうち、第24〜39番目、第55〜61番目、及び第94〜101番目のアミノ酸残基以外の領域において1若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうち、第24〜39番目、第55〜61番目、及び第94〜101番目のアミノ酸残基以外の領域中のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失しており、かつ当該アミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示され、かつ肺がん細胞に対する細胞障害性を有するポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖を含有することを特徴とする肺がんに対する抗がん剤。
- 前記ヒト抗体κ型軽鎖が、配列番号20のアミノ酸配列中の219番目のシステインが削除又はシステイン以外のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうち、第24〜39番目、第55〜61番目、及び第94〜101番目のアミノ酸残基以外の領域において1若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうち、第24〜39番目、第55〜61番目、及び第94〜101番目のアミノ酸残基以外の領域中のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失しており、かつ当該アミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列によって示され、かつ肺がん細胞に対する細胞障害性を有するポリペプチドからなり、単量体であるヒト抗体κ型軽鎖である、請求項1に記載の肺がんに対する抗がん剤。
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