TWI471332B - 包含人類抗體κ型輕鏈之抗癌劑 - Google Patents

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Description

包含人類抗體κ型輕鏈之抗癌劑 發明領域
本發明係有關於一種含有對於癌細胞，特別是肺癌細胞表現出細胞毒性之人類抗體κ型輕鏈之抗癌劑。
本案係基於2013年3月8日於日本國申請之日本專利特願2012-52334號而主張優先權，並將其內容引用於此。
 發明背景
抗體係由重鏈(H鏈：Heavy chain)及輕鏈(L鏈：Light chain)所構成。重鏈及輕鏈係由可變區(VR：Variable Region)及恆定區(CR：Constant Region)所構成，可變區具有超可變區(CDR：Complementarity Determining Region)。此外，抗體之輕鏈係分類為κ型及λ型。
近年來，具有類酵素活性之抗體，亦即抗體酵素受到注目。抗體酵素同時具有抗體之高度分子辨認能力及酵素活性，在醫療、化學工業、食品工業等多方面的應用受到期待。特別是抗體酵素對於標的分子之專一性高、且藉由酵素活性可發揮對標的分子之阻害性，期待能被製成副作用少之優異抗癌劑。
本發明之發明人等至今對於抗體酵素進行了種種獨創性研究(例如參照專利文獻1)。以往，具有完全人類序列之抗體酵素，除了從多發性骨髓瘤患者獲得本瓊氏蛋白質(BJP)之外則無法獲得。多發性骨髓瘤患者為數不多，加上具有酵素活性之BJP亦少，故取得人類之抗體酵素是困難的。然而，人類之抗體酵素被認為用在人體時的副作用較少，故國內外之製藥公司等對於開發有用的人類之抗體酵素待望已久。
先行技術文獻 專利文獻
專利支獻1：日本專利特開2006-197930號公報
 發明概要
本發明係以提供一種將對於癌細胞，特別是肺癌細胞表現出細胞毒性之人類抗體輕鏈作為有效成份之抗癌劑作為主要目的。
本發明之發明人等使用狂犬病病毒之疫苗，從經過複數次過度免疫之志願者獲得之末梢血取得新穎的人類抗體輕鏈，針對其進行研討時，赫然發現所獲得的人類抗體κ型輕鏈中某些具有對於癌細胞，特別是肺癌細胞之高度細胞毒性，以至於完成本發明。
亦即，本發明之抗癌劑之特徵在於含有： (1)由多肽構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號1之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列；(2)由多肽構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號7之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列；(3)由多肽構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號9之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列；(4)由多肽構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號13之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列；(5)由多肽構成且為單體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號19之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同 性之胺基酸序列；(6)由多肽構成且為單體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號38的第1~113號之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列；(7)由多肽構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號40的第1~112號之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列；或(8)由多肽構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號41的第1~107號之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列。
藉由本發明，可提供一種對於癌細胞，特別是肺癌細胞表現高細胞毒性之抗癌劑。本發明之抗癌劑因為係以抗體酵素作為有效成份，故對於癌細胞之專一性高。此外，該抗體酵素之胺基酸序列完全屬於人類型，故對人沒有過敏等問題。因此，本發明之抗癌劑作為高活性且創新的新型醫藥品及用於其開發之試料係非常有用的。
圖1係顯示野生型之人類抗體κ型輕鏈之胺基酸序列之圖。
圖2係(a)係顯示用以獲得單體人類抗體輕鏈之cDNA的設計概略；(b)係顯示突變導入前的人類抗體輕鏈與突變導入後的人類抗體輕鏈之組成的概略。
圖3係顯示殖株#1之多肽經純化的結果之圖，(a)顯示殖株#1之多肽經新的一次純化的結果；(b)顯示殖株#1之多肽經新的二次純化的結果。
圖4係顯示調查各個殖株對於癌細胞之細胞毒性結果的圖表。
圖5係顯示調查各個殖株對於癌細胞之細胞毒性結果的圖表。
圖6A係顯示野生型之人類抗體κ型輕鏈的胺基酸序列之圖。
圖6B係顯示野生型之人類抗體κ型輕鏈的胺基酸序列之圖。
圖6C係接續圖6B，顯示野生型之人類抗體κ型輕鏈的胺基酸序列之圖。
圖6D係顯示野生型之人類抗體κ型輕鏈的胺基酸序列之圖。
圖6E係接續圖6D，顯示野生型之人類抗體κ型輕鏈的胺基酸序列之圖。
圖6F係接續圖6E，顯示野生型之人類抗體κ型輕鏈的胺基酸序列之圖。
圖6G係顯示野生型之人類抗體κ型輕鏈的胺基酸序列之圖。
圖6H係接續圖6G，顯示野生型之人類抗體κ型輕鏈的胺基酸序列之圖。
圖6I係顯示野生型之人類抗體κ型輕鏈的胺基酸序列之圖。
圖7係顯示生體內之試驗的結果之圖。
圖8係顯示安全性試驗(毒性試驗)結果之圖。
 用以實施發明之形態
本發明提供一種含有對癌細胞具有細胞毒性之人類抗體κ型輕鏈之抗癌劑。本案說明書中，「人類抗體κ型輕鏈」意指來自人類之免疫球蛋白之κ型的輕鏈(Light chain)。
本案說明書中，「抗癌劑」意指具有會使癌細胞死亡，或者抑制或阻害其增殖之活性的藥劑。
又，本案說明書中，「細胞毒性」意指會對細胞有使其死亡或機能障礙之性質。
作為本發明之抗癌劑的有效成份之人類抗體κ型輕鏈(以下亦稱為「本發明之人類抗體κ型輕鏈」)，具體而言係下述(1)~(8)之任一者。
(1)由多肽構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號1之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或 缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列；(2)由多肽構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號7之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列；(3)由多肽構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號9之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列；(4)由多肽構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號13之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列；(5)由多肽構成且為單體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號19之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列；(6)由多肽構成且為單體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號38的第1~113號 之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列；(7)由多肽構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號40的第1~112號之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列；(8)由多肽構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號41的第1~107號之胺基酸序列，或者該胺基酸序列中1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列。
由可變區係以序列編號1之胺基酸序列表示之多肽所構成且屬於二聚體之人類抗體κ型輕鏈，亦稱作人類抗體κ型輕鏈(#1)。人類抗體κ型輕鏈(#1)可為於上述可變區中附加周知之人類抗體恆定區者，於一實施型態中，全長的胺基酸序列表示於序列編號2。人類抗體κ型輕鏈(#1)之CDR1為序列編號1及2之胺基酸序列中第24~39號、CDR2為序列編號1及2之胺基酸序列中第55~61號、CDR3為序列編號1及2之胺基酸序列中第94~102號。
野生型的抗體κ型輕鏈中存在有用以形成雙硫鍵之半胱胺酸，會形成二聚體。人類抗體κ型輕鏈(#1)與野生型相同，存在有用以與其他輕鏈形成雙硫鍵之半胱胺酸。 例如人類抗體κ型輕鏈(#1)係由序列編號2之胺基酸序列所表現之多肽所構成時，該半胱胺酸係序列編號2之胺基酸序列中的第220號之半胱胺酸。
人類抗體κ型輕鏈(#1)係如後述實施例所示，具有對於癌細胞，特別是肺癌細胞之細胞毒性。因此，適合作為抗癌劑之有效成份。對於人類抗體κ型輕鏈(#1)之抗癌活性來說，重要的是對標的分子之分子辨認能力高，因此人類抗體κ型輕鏈(#1)之抗癌活性的活性中心位於可變區。
構成多肽之胺基酸殘基中的某些胺基酸係不會顯著影響該多肽之構造或機能而能容易改造，此係該領域中周知之事項。此外，不僅人為改造，在天然蛋白質中，存在有該蛋白質構造或機能無顯著地改變之突變體亦屬周知。又，本案說明書中，令特定胺基酸序列X中1或複數個胺基酸取代、附加或缺失一事稱為令其突變。
本發明之人類抗體κ型輕鏈亦可為形成二聚體且由多肽所構成者，並且該多肽之可變區係以序列編號1之胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列。有時亦將該多肽稱作人類抗體κ型輕鏈(#1)之突變體。人類抗體κ型輕鏈(#1)之突變體亦可由以下述胺基酸序列表示之多肽所構成：序列編號2之胺基酸序列中的第220號之半胱胺酸以外的1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列。
作為本發明之人類抗體κ型輕鏈的人類抗體κ型輕鏈(#1)之突變體，係與人類抗體κ型輕鏈(#1)有同樣抗癌作用之二聚體。因此，關於人類抗體κ型輕鏈(#1)之突變體，其CDR1、CDR2及CDR3係與序列編號1或2之胺基酸序列相同(被保留)，且相當於序列編號2胺基酸序列中第220號半胱胺酸之半胱胺酸亦被保存下來。亦即，人類抗體κ型輕鏈(#1)之突變體係CDR1、CDR2及CDR3以外的區域中之胺基酸突變，且以可變區之其他區域中的胺基酸突變者為佳。
由可變區係以序列編號9之胺基酸序列表示的多肽所構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，亦稱作人類抗體κ型輕鏈(#4)。人類抗體κ型輕鏈(#4)可為於上述可變區中附加周知之人類抗體恆定區者，於一實施型態中，全長的胺基酸序列表示於序列編號10。人類抗體κ型輕鏈(#4)之CDR1為序列編號9及10之胺基酸序列中第24~40號、CDR2為序列編號9及10之胺基酸序列中第56~62號、CDR3為序列編號9及10之胺基酸序列中第95~102號。此外，用以與其他輕鏈形成雙硫鍵之半胱胺酸係序列編號10之胺基酸序列中第220號之半胱胺酸。
人類抗體κ型輕鏈(#4)係如後述實施例所示，具有對於癌細胞，特別是肺癌細胞之細胞毒性。因此，適合作為抗癌劑之有效成份。
本發明之人類抗體κ型輕鏈亦可為形成二聚體且由多肽所構成者，並且該多肽之可變區係以序列編號9之胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸 序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列。亦將該多肽稱作人類抗體κ型輕鏈(#4)之突變體。人類抗體κ型輕鏈(#4)之突變體亦可由以下述胺基酸表示之多肽所構成：序列編號10之胺基酸序列中的第220號之半胱胺酸以外有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列。
作為本發明之人類抗體κ型輕鏈的人類抗體κ型輕鏈(#4)之突變體，係一與人類抗體κ型輕鏈(#4)具有同樣抗癌作用之二聚體。因此，關於人類抗體κ型輕鏈(#4)之突變體，其CDR1、CDR2及CDR3係與序列編號9或10之胺基酸序列相同(被保留)，且相當於序列編號10胺基酸序列中第220號半胱胺酸之半胱胺酸亦被保存下來。亦即，人類抗體κ型輕鏈(#4)之突變體係以CDR1、CDR2及CDR3以外的區域中之胺基酸突變，且可變區之其他區域中的胺基酸突變者為佳。
由可變區係以序列編號13之胺基酸序列表示的多肽所構成且為二聚體之人類抗體κ型輕鏈，亦稱作人類抗體κ型輕鏈(#7)。人類抗體κ型輕鏈(#7)可為於上述可變區中附加周知之人類抗體恆定區者，於一實施型態中，全長的胺基酸序列表示於序列編號14。人類抗體κ型輕鏈(#7)之CDR1為序列編號13及14之胺基酸序列中第24~39號、CDR2為序列編號13及14之胺基酸序列中第55~61號、CDR3為序列編號13及14之胺基酸序列中第94~101號。此外，用以與其他輕鏈形成雙硫鍵之半胱胺酸係序列編號14之胺基酸序 列中第219號之半胱胺酸。
人類抗體κ型輕鏈(#7)係如後述實施例所示，具有對於癌細胞，特別是肺癌細胞之細胞毒性。因此，適合作為抗癌劑之有效成份。
本發明之人類抗體κ型輕鏈亦可為形成二聚體且由多肽所構成者，並且該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號13之胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列。亦將該多肽稱作人類抗體κ型輕鏈(#7)之突變體。人類抗體κ型輕鏈(#7)之突變體亦可為序列編號14之胺基酸序列中的第219號之半胱胺酸以外的1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列所表現之多肽構成者。
作為本發明之人類抗體κ型輕鏈的人類抗體κ型輕鏈(#7)之突變體，係一與人類抗體κ型輕鏈(#7)具有同樣抗癌作用之二聚體。因此，關於人類抗體κ型輕鏈(#7)之突變體，其CDR1、CDR2及CDR3係與序列編號13或14之胺基酸序列相同(被保存)，且相當於序列編號14胺基酸序列中第219號半胱胺酸之半胱胺酸亦被保存下來。亦即，人類抗體κ型輕鏈(#7)之突變體係以CDR1、CDR2及CDR3以外的區域中之胺基酸突變，且可變區之其他區域中的胺基酸突變者為佳。
由可變區係以序列編號19之胺基酸序列表示的 多肽所構成且為單體之人類抗體κ型輕鏈，亦稱作人類抗體κ型輕鏈(22F6-單體)。人類抗體κ型輕鏈(22F6-單體)可為於上述可變區中附加周知之人類抗體恆定區者，於一實施型態中，全長的胺基酸序列表示於序列編號20之胺基酸序列中第219號之半胱胺酸被除去或被其他胺基酸(例如丙胺酸)取代之胺基酸序列。人類抗體κ型輕鏈(22F6-單體)之CDR1為序列編號19及20之胺基酸序列中第24~39號、CDR2為序列編號19及20之胺基酸序列中第55~61號、CDR3為序列編號19及20之胺基酸序列中第94~101號。
人類抗體κ型輕鏈(22F6-單體)係如後述實施例所示，具有對於癌細胞，特別是肺癌細胞之細胞毒性。因此，適合作為抗癌劑之有效成份。
本發明之人類抗體κ型輕鏈亦可為單體且由多肽構成者，並且該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號20之胺基酸序列中有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列。亦將該多肽稱作人類抗體κ型輕鏈(22F6-單體)之突變體。人類抗體κ型輕鏈(22F6-單體)之突變體亦可係序列編號20之胺基酸序列中的第219號之半胱胺酸被除去或被其他胺基酸取代，且219號之胺基酸以外的1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列，或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列所表現之多肽構成者。
作為本發明之人類抗體κ型輕鏈的人類抗體κ型 輕鏈(22F6-單體)之突變體，係與人類抗體κ型輕鏈(22F6-單體)具有同樣抗癌作用之單體。因此，關於人類抗體κ型輕鏈(22F6-單體)之突變體，其CDR1、CDR2及CDR3係與序列編號19或20之胺基酸序列相同(被保存)，且相當於序列編號20之胺基酸序列中第219號半胱胺酸之半胱胺酸被除去或被其他胺基酸取代。亦即，人類抗體κ型輕鏈(22F6-單體)之突變體係以CDR1、CDR2及CDR3以外的區域中之胺基酸突變，且可變區之其他區域中的胺基酸突變者為佳。
本發明之人類抗體κ型輕鏈亦可含有附加的多肽。作為附加的多肽，可舉例如His標籤(tag)、Myc、Flag等抗原決定基標識多肽。
該業者能夠使用周知技術來容易地使構成多肽之胺基酸殘基中1或數個胺基酸突變、或附加抗原決定基標識多肽等。例如，依據周知的點突變導入法，可使編碼成為多肽之多核苷酸中任選的鹼基突變。此外，還可以對應於編碼成為多肽之多核苷酸中任選的部位來設計啟動子以製作缺失突變體或附加突變體。
本發明之人類抗體κ型輕鏈包含天然的純化產物、化學合成程序之產物、及原核生物宿主或真核生物宿主(例如包含細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆蟲細胞、及哺乳動物細胞)經重組技術而產生的產物。根據重組產生程序中所使用的宿主，本發明之人類抗體κ型輕鏈可醣化，亦可不醣化。另外，本發明之人類抗體κ型輕鏈亦在某些場合可含有起始之改造甲硫胺酸殘基作為宿主媒介處理 之結果。
本發明之人類抗體κ型輕鏈只要屬於由胺基酸以肽鍵結合之多肽即可，但不以此為限，亦可為含有多肽以外的構造之複合多肽。於本說明書中使用到的場合，可舉出醣鏈及類異戊二烯基等作為「多肽以外的構造」，但無特別限定。
本發明之人類抗體κ型輕鏈係可利用含有編碼該人類抗體κ型輕鏈(多肽)之多核苷酸的載體，使用重組表現系統或無細胞表現系統等在該技術領域為周知之表現系統來製造。
使用重組表現系統時，可以採用將編碼本發明之人類抗體κ型輕鏈之多核苷酸殖入載體後，藉由周知方法導入至可表現之宿主，將於宿主(轉形體)內轉譯所獲得的多肽進行純化之方法等。重組表現載體可以是質體亦可不是質體，只要能將標的多核苷酸導入至宿主即可。
像這樣將外來多核苷酸導入宿主的情況，表現載體係以能使外來多核苷酸表現之方式，將會於宿主內發揮功能之啟動子殖入為佳。欲純化由重組方式產生的多肽之方法，會依使用的宿主、多肽的性質而有異，然而藉由標籤之利用等可較為容易純化標的之多肽。
在使用無細胞表現系統(無細胞蛋白質合成系統)之情況，較佳地，係將用以編碼本發明之人類抗體κ型輕鏈的多核苷酸添加至含有核醣體、t-RNA等蛋白質轉譯、合成所須成份的溶液中，在適當溫度下培養，藉此將合成出的 多肽進行純化。
作為無細胞蛋白質合成系統，可舉出使用小麥胚芽萃取液之系統、使用兔網狀紅血球萃取液之系統、使用大腸菌S30萃取液之系統、及使用植物之脫液泡化原生質體所獲得的細胞成份萃取液之系統。一般而言，來自真核生物之基因轉譯會使用真核細胞之系統，亦即，會選擇使用小麥胚芽萃取液之系統或使用兔網狀紅血球萃取液之系統的其中一者，在考慮到轉譯之基因的出處(原核生物/真核生物)與合成後的蛋白質之使用目的，並從上述合成系統來選擇即可。作為該等合成系統，可使用各種市售套件。
另外，各種來自病毒之基因產物在其轉譯後，大多會經過與內質網、高基氏體等細胞內膜有關的複雜生物化學反應而表現活性，欲使各種生物化學反應於試管內再現則需要添加細胞內膜成份(例如微粒體膜)。由植物之脫液泡化原生質體所獲得的細胞成份萃取液可作為保有細胞內膜成份之無細胞蛋白質合成液來利用，不需添加微粒體膜，故較合適。
在本說明書中提及時，所謂「細胞內膜成份」係指由存在於細胞質內之脂質膜所構成的細胞小器官(亦即內質網、高基氏體、粒線體、葉綠體、液泡等所有細胞內顆粒)。特別是內質網及高基氏體在蛋白質轉譯後修飾時會發揮重要的功能，是膜蛋白質及分泌蛋白質之成熟所必須的細胞成份。
藉由宿主之表現系統與無細胞蛋白質合成系統 來合成之人類抗體κ型輕鏈係以進行純化為佳。欲純化人類抗體κ型輕鏈之步驟係以周知方法(例如破壞細胞或組織後進行離心分離並回收可溶性部份的方法)調製來自細胞或組織的細胞萃取液後，將該細胞萃取液以周知方法(例如硫酸胺沈澱法或酒精沈澱法、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水性交互作用層析法、親和力層析法、氫氧基磷灰石層析法、及嗜醣蛋白層析法)來純化之步驟為佳，但不以此等為限。用於純化者係以高速液體層析法(「HPLC」)為最佳。
此外，本發明之人類抗體κ型輕鏈亦可將會天然地表現該人類抗體κ型輕鏈之細胞或組織進行純化。例如利用抗體或寡核甘酸能鑑別出會天然地表現本發明之人類抗體κ型輕鏈之細胞或組織。對於來自細胞或組織的人類抗體κ型輕鏈之純化亦能與使用宿主表現系統等合成出的人類抗體κ型輕鏈進行純化之情況同樣地進行。
此外，本發明之人類抗體κ型輕鏈亦可以化學合成。化學合成之方法並無特別限定，以化學合成多肽時使用的任一方法進行亦可。
本發明之抗癌劑係以本發明之人類抗體κ型輕鏈作為有效成份。本發明之人類抗體κ型輕鏈對於癌細胞表現細胞毒性之作用機制到目前為止尚未完全明瞭，然而能推論的是，本發明之人類抗體κ型輕鏈對於癌細胞表面之特定分子或構造進行專一性辨認而結合的同時，以自身所擁有的酵素活性分解癌細胞的一部分成份，結果癌細胞的機能 受損，其增殖受到阻害，並誘導細胞死亡。
本發明之抗癌劑對於人類或動物之使用，可採取直接注入來施用。本發明之抗癌劑亦可處方使其可用於非經口投藥、黏膜投藥、肌肉內投藥、靜脈內投藥、皮下投藥、眼內投藥或經皮投藥。具代表性地，組成物中所含的蛋白質係能以0.01~30mg/kg體重之用量，較佳為0.1~10mg/kg體重，更佳為0.1~1mg/kg體重之用量來施用。
本發明之抗癌劑除了本發明之人類抗體κ型輕鏈以外，還可包含藥學上可容許的載體、稀釋劑或賦形劑(包含該等之組合)。為了治療性使用之藥學上可容許的載體或賦形劑在藥學領域上係屬周知，例如Remington`s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編，1985)所記載。藥學上可使用的載體、稀釋劑或賦形劑之選擇可依循所欲投藥途徑及標準藥學上慣例，由該業者容易地進行選擇。又，本發明之抗癌劑更可包含任選之適當的結合劑、潤滑劑、懸濁劑、被覆劑或可溶化劑。
根據不同的送達系統，組成/處方之必要條件可以相異。作為例示，本發明之抗癌劑可以使用迷你幫浦或藉由黏膜途徑，例如作為用於吸入之噴鼻器或氣溶膠、或者用於非經口地送達來處方(在此，本發明之抗癌劑可舉例如處方成為用於靜脈內途徑、肌肉內途徑、皮下途徑來送達之可注射型態)。或者該處方物可設計成能藉由兩方途徑來送達。例如本發明之抗癌劑對於肺癌細胞之細胞毒性特別高。因此，本發明之抗癌劑亦以用於吸入之噴鼻器或氣 溶膠等能夠由鼻或支氣管等有效地送達肺細胞之型態為佳。
本發明之抗癌劑使用在生體內投藥之用途時，為了使有效成份之人類抗體κ型輕鏈提高在生體內之安定性(血中半衰期)，可利用各種技術。例如，已知新生兒Fc受體(FcRn)與Fc結合時，IgG等抗體之血中半衰期會延長(例如，參照Roopenian,D.C.et.al.,Nat Rev Immunol vol.7 715-725(2007))，可將本發明之人類抗體κ型輕鏈的C末端改造成具有與FcRn之結合活性。又，將本發明之人類抗體κ型輕鏈二聚化，附加PEG(聚乙二醇)亦可。
本發明之抗癌劑亦可與例如關於服用之態樣的說明書等一起套件化。該套件亦可包含能與本發明之抗癌劑併用的各種醫藥。
此外，本發明之抗癌劑係以標的分子之辨識能力高之抗體κ型輕鏈作為有效成份，故對於細胞表面不存在抗體κ型輕鏈之標的分子的癌細胞不會發揮細胞毒性。因此，可期待本發明之抗癌劑在癌的種類識別上具有功用。
[實施例]
接下來，藉由實施例對本發明進行更詳細的說明，但本發明並非受該等例子限定者。
[實施例1] (1.人類末梢血cDNA之調製)
使用狂犬病病毒之疫苗，從經過複數次過度免疫之志願者獲得之末梢血使用Ficoll-paque分離淋巴球。使用RNA 萃取套件(Stratagene)由經分離之約3.0×107 個淋巴球獲得全RNA(total RNA)。使用ThermoScriptTM RT-PCR System(Invitrogen)，以oligo(dT)作為引子，藉由將全RNA反轉錄來調製作為標的之cDNA(cDNA基因庫)。
(2.人類抗體κ型輕鏈基因之取得)
以前述1.所取得的cDNA作為模型，以用於放大抗體輕鏈基因(具有屬於亞群(subgroup)II之Vκ基因)之引子進行2階段PCR反應，獲得約750bp之PCR產物(屬於亞群II之κ型輕鏈基因)。將該等PCR產物複製並進行序列分析，藉由相同性檢索來推定個別的生殖細胞系列基因(germline gene)之Vκ基因。其結果，所獲得的18殖株皆屬於亞群II。其中，殖株#1(生殖細胞系列基因型：A18b)、殖株#2(生殖細胞系列基因型：A3/A19)、殖株#4(生殖細胞系列基因型：O11/o1)、殖株#7(生殖細胞系列基因型：A3/A19)、殖株#8(生殖細胞系列基因型：A18b)、殖株#9(生殖細胞系列基因型：A18b)、殖株#11(生殖細胞系列基因型：A18b)、殖株#13(生殖細胞系列基因型：A3/A19)、及殖株#14(生殖細胞系列基因型：A3/A19)這9殖株使用於以下之實驗。
(3.人類抗體κ型輕鏈之表現)
將前述2.所取得的各殖株分別導入具有His標籤序列位置之質體載體，將該質體載體導入大腸菌並製作轉形體。培養各轉形體，以IPTG進行表現誘導時，藉由SDS-PAGE分析及使用抗人類型(Fab')2 抗體之西方墨點法，可鑑別出在大腸菌中表現之蛋白質為人類抗體輕鏈。所獲得之人類抗 體輕鏈在N末端具有M(起始甲硫胺酸)，在C末端具有來自質體載體之LEHHHHHH(序列編號23)。
(4.人類末梢血cDNA之調製)
使用狂犬病病毒之疫苗，使受驗者過度免疫經複數次，測定血清之中和活性。血清之中和活性最高(7.2IU)的受驗者作為供給者來採取末梢血，使用Ficoll-paque從該末梢血分離出淋巴球。使用RNA萃取套件(Stratagene)由經分離之約3.0×107 個淋巴球獲得全RNA。使用ThermoScriptTM RT-PCR System(Invitrogen)，以oligo(dT)作為引子，藉由將全RNA反轉錄來調製作為後述PCR反應的模型之cDNA。
(5.人類抗體κ型輕鏈基因之取得)
以前述4.所取得的cDNA作為模型，以用於全面性地放大人類抗體輕鏈基因之引子組進行PCR反應，獲得約660bp之PCR產物。將該PCR產物純化並送入大腸菌表現載體pET101/D-TOPO載體(註冊商標，Invitrogen)，構築出LCA基因庫。此外，於pET101/D-TOPO載體送入了PCR產物後之表現載體表現出該PCR產物所編碼之蛋白質的C末端附加了His標籤的蛋白質。將該LCA基因庫之cDNA作為模型，以用於放大抗體輕鏈基因(具有屬於亞群(subgroup)II之Vκ基因)之引子進行PCR反應，獲得約660bp之PCR產物。將該等PCR產物複製並進行序列分析，使用解析軟體(GENETIX(註冊商標)Ver.8)推定胺基酸序列和輕鏈之可變區及恆定區，推定出個別的生殖細胞系列基因(germline gene)之Vκ基因。該等殖株中，殖株22F6(生殖細胞系列基 因型：A3/A19)、殖株23D4(生殖細胞系列基因型：A3/A19)這2個殖株使用於以下之實驗。所獲得之人類抗體輕鏈在N末端具有M(起始甲硫胺酸)，在C末端具有來自質體載體之LEHHHHHH(序列編號23)。
關於各個殖株之序列的結果，殖株#1之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#1_WT))之全長係如序列編號27所示之鹼基序列；殖株#8之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#8_WT))之全長係如序列編號28所示之鹼基序列；殖株#9之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#9_WT))之全長係如序列編號29所示之鹼基序列；殖株#11之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#11_WT))之全長係如序列編號30所示之鹼基序列；殖株#4之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#4_WT))之全長係如序列編號31所示之鹼基序列；殖株#2之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#2_WT))之全長係如序列編號32所示之鹼基序列；殖株#7之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#7_WT))之全長係如序列編號33所示之鹼基序列；殖株#13之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#13_WT))之全長係如序列編號34所示之鹼基序列；殖株#14之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#14_WT))之全長係如序列編號35所示之鹼基序列；殖株22F6之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(22F6_WT))之全長係如序列編號36所示之鹼基序列；殖株23D4之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(23D4_WT))之全長係如序列編號37所示之鹼基序列。
由各鹼基序列推定之胺基酸序列如圖1所示。 又，圖1中亦顯示可變區、恆定區及CDR1~3之位置。殖株#1之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#1_WT))係序列編號2所示之胺基酸序列；殖株#8之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#8_WT))係序列編號4所示之胺基酸序列；殖株#9之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#9_WT))係序列編號6所示之胺基酸序列；殖株#11之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#11_WT))係序列編號8所示之胺基酸序列；殖株#4之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#4_WT))係序列編號10所示之胺基酸序列；殖株#2之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#2_WT))係序列編號12所示之胺基酸序列；殖株#7之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#7_WT))係序列編號14所示之胺基酸序列；殖株#13之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#13_WT))係序列編號16所示之胺基酸序列；殖株#14之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(#14_WT))係序列編號18所示之胺基酸序列；殖株22F6之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(22F6_WT))係序列編號20所示之胺基酸序列；殖株23D4之人類抗體輕鏈(人類抗體輕鏈(23D4_WT))係序列編號22所示之胺基酸序列。
另外，本實施例所使用的野生型之人類抗體輕鏈係如圖1所示各胺基酸序列在N末端附加有甲硫胺酸，在C末端附加有來自質體載體之LEHHHHHH(序列編號23)之多肽。
(6.單體之人類抗體輕鏈的製作)
關於前述2.及5.所取得之選殖人類抗體κ型輕鏈，因為位於C末端之半胱胺酸會形成雙硫(S-S)鍵結，故會形成二 聚體。在此，以導入一種突變而使得只有單體之人類抗體酵素能被形成之方式設計出cDNA，其中該突變係用丙胺酸取代與S-S鍵結有關的半胱胺酸(圖1之胺基酸序列的C末端之半胱胺酸)者。對於在C末端附加有來自質體載體之LEHHHHHH之人類抗體輕鏈(#1_WT)，該設計之詳細顯示於圖2。如圖2(a)所示，以GCT取代編碼出全長之人類抗體酵素基因中第220號半胱胺酸之TGT。藉此，如圖2(b)所示，以原本胺基酸序列來說，因為第220號為半胱胺酸而能夠形成二聚體，但因為在取代後之胺基酸之第220號為丙胺酸，故無法形成S-S鍵結而變成單體。
具體而言，將野生型之全長的人類抗體酵素基因中編碼出上述半胱胺酸之TGT，用編碼出ALEHHHHHH(序列編號25)(+終止密碼子)之GCTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA(序列編號26)取代之。亦即，於本實施例使用之單體人類抗體輕鏈係如圖1所示之各胺基酸序列在N末端附加有甲硫胺酸，且在C末端之半胱胺酸被替換成附加有ALEHHHHHH之多肽。又，如此獲得之突變體(有S-S鍵結功用之半胱胺酸經丙胺酸取代)中，人類抗體輕鏈(#1_WT)之突變體稱為人類抗體輕鏈(#1_C220A)；人類抗體輕鏈(#8_WT)之突變體稱為人類抗體輕鏈(#8_C220A)；人類抗體輕鏈(#9_WT)之突變體稱為人類抗體輕鏈(#9_C220A)；人類抗體輕鏈(#11_WT)之突變體稱為人類抗體輕鏈(#11_C220A)；人類抗體輕鏈(#4_WT)之突變體稱為人類抗體輕鏈(#4_C220A)；人類抗體輕鏈 (#2_WT)之突變體稱為人類抗體輕鏈(#2_C220A)；人類抗體輕鏈(#7_WT)之突變體稱為人類抗體輕鏈(#7_C220A)；人類抗體輕鏈(#13_WT)之突變體稱為人類抗體輕鏈(#13_C220A)；人類抗體輕鏈(#14_WT)之突變體稱為人類抗體輕鏈(#14_C220A)；人類抗體輕鏈(22F6_WT)之突變體稱為人類抗體輕鏈(22F6_C220A)；人類抗體輕鏈(23D4_WT)之突變體稱為人類抗體輕鏈(23D4_C220A)。
(7.人類抗體輕鏈之純化)
將各個人類抗體輕鏈依下述方式進行一次純化及二次純化。圖3的(a)係顯示人類抗體輕鏈(#1_WT)及人類抗體輕鏈(#1_C220A)之一次純化當中Ni-NTA管柱層析圖譜及SDS-PAGE分析的結果之圖。圖3的(b)係顯示二次純化當中陽離子交換層析圖譜及SDS-PAGE分析的結果之圖。
如圖3的(a)左段所示，試樣添加後讓緩衝液A(25mM Tris-HCl(pH8.0)、0.25M NaCl、40mM咪唑、0.005% Tween20)流動直到流動部份(flow-through)流盡為止。其次，如左段圖表中虛線所示，令咪唑之濃度由40mM漸漸上升到300mM，讓與凝膠結合的成份溶出。使用Ni-NTA瓊脂管柱(直徑1cm、2ml)作為管柱，在純化過程中將流速維持在0.1mL/分鐘。如圖3的(a)右段所示，作為目標之約31kDa之層帶係於分液管(fraction)編號30~37被檢測出。將該試樣整合為1個並進行接下來的二次純化。
如圖3的(b)左段所示，試樣添加後讓緩衝液A(50mM醋酸鈉(pH5.4)、0.2M NaCl、0.005% Tween20)流動 直到流動部份流盡為止。其次，如左段圖表中虛線所示，令NaCl之濃度由0.2M漸漸上升到0.4M，讓與凝膠結合的成份溶出。使用SP5PW(TOSHO)作為管柱，在純化過程中將流速維持在0.1ml/分鐘。有關於純化前的試樣、圖表中被虛線包圍的「a」區域(分液管編號10~15)、及圖表中被虛線包圍的「c」區域(分液管編號25~30)所含的成份，係以SDS-PAGE進行分析。如圖3的(b)右段所示，還原試樣中作為目標之約31kDa之層帶係於a及c中被檢測出。此外，非還原試樣中約31kDa之層帶係僅於a中被檢測出，而約51kDa之層帶係僅於c中被檢測出。如上所述，抗體輕鏈之單體係約31kDa，而二聚體係約51kDa。因此，試樣a係抗體輕鏈之單體的部份，而試樣c係抗體輕鏈之二聚體的部份。
關於其他殖株，亦與殖株(#1)同樣地，在野生型人類抗體輕鏈之表現產物中含有二聚體與單體，藉由Ni-NTA管柱層析圖譜及陽離子交換層析圖譜之2階段純化來純化出二聚體，而令有S-S鍵結功用之半胱胺酸經丙胺酸突變之突變體的表現產物中含有單體，藉由同樣的2階段純化來純化出單體。
(8.對於癌細胞之細胞毒性)
針對各種人類抗體κ型輕鏈對於癌細胞之細胞毒性進行了實驗。癌細胞係使用從ATCC購得之A549(人類肺胞上皮癌細胞株)，以使用含有10%FCS(牛胎兒血清)的F-12K培養基之通常方法進行培養。
首先，使凍結的A549細胞融解令其回復後，以 每100μL播種於96井盤使之成為5×103 細胞/井。在37℃下培養24小時後，以傾析除去添加於該96井盤之培養基後，將調製成1mg/mL之各個人類抗體κ型輕鏈以每井100μL添加至各井中。在添加人類抗體κ型輕鏈經24小時後以及48小時後(播種細胞經48小時後、72小時後)將WST-1試藥(Roche公司製)以每井10μL添加至各井中，在1、1.5、及2小時後測定所生成的甲臢染料(formazan dye)之吸光度(Abs450nm)。以所獲得之吸光度的結果為基礎，將沒有添加人類抗體κ型輕鏈的井(N.C.)之細胞存活率視為100%，求出各井之細胞存活率，評價添加了人類抗體κ型輕鏈之細胞毒性。
關於各人類抗體κ型輕鏈，在添加人類抗體κ型輕鏈經24小時後以及48小時後之細胞存活率表示於圖4、圖5、表1及表2。生殖細胞系列基因型為A18b或O11/o1之殖株的結果顯示於圖4及表1；生殖細胞系列基因型為A3/A19之殖株的結果顯示於圖5及表2。此外，表1及表2亦顯示井內之人類抗體κ型輕鏈的濃度。
其結果，殖株(#1_WT)、殖株(#4_WT)、殖株(#7_WT)、及殖株(22F6_C220A)這4個殖株對A549細胞表現了40~50%左右的細胞毒性。關於其他殖株則幾乎無法確認到對A549細胞之癌細胞毒性。
該等4個殖株中，殖株(#4_WT)以及殖株(#7_WT)表現出特別強的細胞毒性。其中殖株(#7_WT)在人類抗體κ型輕鏈添加前(0小時)至人類抗體κ型輕鏈添加後(48小時)當中，因為井內的細胞數幾乎沒有變化，表示殖株(#7_WT)，亦即人 類抗體κ型輕鏈(#7)具有抑制A549細胞之增殖的效果。
此外，從此次使用之殖株的結果來看，觀察到二聚體(WT)相較於單體的細胞毒性較強的傾向，故表示二聚體存在有強的細胞毒性。
此外，關於含有其他殖株者，對於各種細胞株，亦與上述相同地對於人類抗體κ型輕鏈之細胞毒性進行評價。其結果顯示於表3。
其結果，殖株(#1_H31Y C220A)對於A549細胞、MOLT-4細胞、ES-2細胞表現出高細胞毒性。又，殖株(#7 RLI)、殖株(C51)對於MOLT-4細胞表現出高細胞毒性。此外，殖株(#4)對於ES-2細胞表現出高細胞毒性。
另外，殖株(#1_H31Y C220A)之胺基酸序列記載於序列編號38；殖株(#7 VL(I))之胺基酸序列記載於序列編號39；殖株(#7 RLI)之胺基酸序列記載於序列編號40；殖株(C51)之胺基酸序列記載於序列編號41；殖株(C87)之胺基酸序列 記載於序列編號42；殖株(#7 EI)之胺基酸序列記載於序列編號43；殖株(#7 TR)之胺基酸序列記載於序列編號44；殖株(#7 VL)之胺基酸序列記載於序列編號45；殖株(S13)之胺基酸序列記載於序列編號46；殖株(S21)之胺基酸序列記載於序列編號47；殖株(S38)之胺基酸序列記載於序列編號48；殖株(#10)之胺基酸序列記載於序列編號49；殖株(C67)之胺基酸序列記載於序列編號50；殖株(C82)之胺基酸序列記載於序列編號51；殖株(C88)之胺基酸序列記載於序列編號52；殖株(#7 G)之胺基酸序列記載於序列編號53。
此外，如圖7、圖8所示，本案之含有人類抗體κ型輕鏈之抗癌劑在動物實驗上完全沒有表現毒性。
另外，圖7是顯示胞外試驗(經口)。又，圖8是顯示人類「超級抗體酵素」之安全性實驗(毒性實驗)，該安全性實驗(毒性實驗)可舉例如，1.單次經口投藥試驗(觀察期間7日)、2.單次腹腔內投藥急性毒性試驗(觀察期間7日)、3.單次尾靜脈內投藥急性毒性試驗(觀察期間7日)、4.7日間反覆投藥毒性試驗及5.單次靜脈內投藥毒性試驗(觀察期間28日)。於圖8中，左圖表示7日間反覆投藥毒性試驗(尾靜脈)之小鼠體重變化，右圖表示7日間反覆投藥毒性試驗(尾靜脈)時的小鼠之解剖檢視，前述者皆完全沒有異常。
產業上之可利用性
本發明能夠利用在新穎抗癌劑之開發與癌症治療之領域。
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Claims (2)

  1. 一種抗癌劑，其特徵在於含有：由多肽構成且為單體之人類抗體κ型輕鏈，該多肽之可變區係以下述胺基酸序列表示：序列編號19之胺基酸序列；或者該胺基酸序列中，除第24~39號、第55~61號及第94~101號之胺基酸殘基以外的區域，有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列；或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列，且於序列編號19之胺基酸序列中，除了第24~39號、第55~61號及第94~101號之胺基酸殘基以外的區域，胺基酸會取代、附加或缺失。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗癌劑，其中前述人類抗體κ型輕鏈係一由多肽構成且為單體之人類抗體κ型輕鏈，並且該多肽係以下述胺基酸序列表示：序列編號20之胺基酸序列中第219號之半胱胺酸被去除或被半胱胺酸以外的胺基酸取代而成之胺基酸序列；或者該胺基酸序列中，除第24~39號、第55~61號及第94~101號之胺基酸殘基以外的區域，有1或數個胺基酸經取代、附加或缺失之胺基酸序列；或者與該胺基酸序列有95%以上相同性之胺基酸序列，且於序列編號20之胺基酸序列中，除了第24~39號、第55~61號及第94~101號之胺基酸殘基以外的區域，胺基酸會取代、附 加或缺失。
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