JP4361371B2

JP4361371B2 - 生体分子伝達モチーフＭｐｈ−１−ＢＴＭ及びその利用方法

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Publication number: JP4361371B2
Application number: JP2003560043A
Authority: JP
Inventors: サング・キョウリー; セウング・キョウリー; ビュング・フィスー; ヲク・ジンチャエ; ジョング・ブムキム; ジョング・スンリー
Original assignee: サング・キョウリー
Priority date: 2002-01-19
Filing date: 2003-01-20
Publication date: 2009-11-11
Anticipated expiration: 2023-01-20
Also published as: KR100978346B1; JP2005531284A; EP1468012A1; KR20040083429A; DE60332993D1; WO2003059941A1; AU2003208020A1; EP1468012A4; ES2347645T3; US20050147971A1; US20060148060A1; EP1468012B1; KR20030062788A; US7700109B2; ATE471336T1

Description

本発明は、生物学的活性を有する生理機能調節分子（biologically active functional or/and regulatory molecule）を生体内（in vivo）及び生体外（in vitro）において、真核若しくは原核細胞内の細胞質、細胞小器官、又は核内に効果的に伝達することができる細胞内分子伝達（transduction）用ペプチド及びその利用方法に関する。

生きている細胞は、一般に蛋白質や核酸のような巨大分子に対して不透過性である。一部小さなサイズの物質だけが非常に低い割合で生きている細胞の細胞膜を通過し、これは、これら巨大分子を利用した治療、予防及び診断において制限要因とされている。一方、治療、予防及び診断を目的として製造される物質は、その実質的な有効量で細胞内に伝達されなければならないため、これらを細胞外部や標的細胞の表面に作用させて細胞内に伝達するための様々な方法が開発されてきている。

生体外で細胞内に巨大分子を伝達する方法には、エレクトロポレーション(electroporation)、リポソームを利用した膜融合、表面にＤＮＡコーティングされた微細投射体を用いた高濃度投射法、カルシウム−リン−ＤＮＡ沈殿体を用いた培養法、ＤＥＡＥ−デキストランを利用したトランスフェクション（transfection）、変形されたウイルス核酸を利用した感染、単一細胞に直接微細注入する方法などがある。また、最近は細胞内に伝達しようとする巨大分子を、ナノ粒子（nanoparticale）を用いて生体の内外にて細胞内に伝達しようとする試みが行なわれているが、技術的な側面及び臨床的な効果の面において未だ初期段階にある。更に、これらの方法では、典型的に巨大分子を導入させようとする全体細胞のうち、ただ一部にしか伝達することができず、これらを細胞内に伝達する時間及び効率はまだ臨床的に適用可能な段階には至っていない。尚、目的細胞ではない他の多くの細胞に対して望ましくない影響を及ぼす可能性もある。

従って、生体内外の何れでも細胞を損傷することなく生理活性を持つ巨大分子を効果的に伝達できる一般的な方法が要望されている［参考文献：L.A. Sternson, Ann. N.Y. Acad. Sci., 57, 19-21（1987）］。その一例として、脂質ペプチドの化学的な追加［参考文献：P. Hoffmann et al. Immunobiol., 177, 158-170（1988）］又はポリリジンやポリアルギニンなどの塩基性重合体を使用する方法［参考文献：W-C. Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1872-1876（1978）］などが提示されているが、これら方法は未だ検証されていない。輸送体として使われる葉酸［参考文献：C.P. Leamon and Low, Proc. Natl. Acd.Sci., USA,88, 5572-5576（1991）］は、葉酸−塩結合体として細胞内に移動されることが報告されているが、細胞質内にまで伝えられるかは未だ確認されていない。また、シュードモナス外毒素(Pseudomonas Exotoxin)も輸送体の一種として使われている［参考文献：T.I. Prior et al., Cell, 64, 1017-1023（1991）］。しかし、このシステムでも生物学的に活性化した目的とする物質の細胞内への移動に関する効果や、基礎医学的及び臨床的な適用可能性については不明である。これゆえ、生きている細胞の細胞質内または核内に生物学的に活性化した物質をより安全で且つ効果的に伝達し得る方法が持続的に要望されている。

また、蛋白質のような巨大分子だけでなく、生体内部又は外部で細胞内へのＤＮＡ及び／又はＲＮＡの伝達もまた、生命工学の基礎研究分野及び医薬学的な応用分野において非常に重要な必須技術として認識されている。ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの細胞内への伝達は、遺伝子治療、遺伝子により生体内部又は外部で生成される蛋白質の機能を明かす基礎研究、及びこれらを用いた新しい治療剤の開発に決定的な役目をしている。しかし、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡも細胞膜を効果的に通過することはできないため、このような問題の解決は、遺伝子を利用した基礎研究及び臨床研究において解決すべき最大の課題の一つである。

そこに、生体内部又は外部でＤＮＡ及び／又はＲＮＡの細胞内伝達のために、リポソーム、ナノ粒子及びウイルスベクターなどが開発され、その利用可能性について研究されているが、これらの効能及び副作用にはまだ改善すべき課題が多く残存している実情である。特に、リポソームを利用した場合には、細胞に対する副作用及び細胞毒性（cytotoxicity）の問題が深刻で、細胞株を利用した基礎研究に局限されており、またナノ粒子の場合は、最近多くの関心を集めているが、生体内での運搬粒子（carrier particle）の分解、伝達効能、及びこれらに対する生体内での免疫反応については、より一層の研究が求められる実情である。現在、基礎研究及び臨床的効能の面で重要視されているレトロウイルスベクターを利用する場合、高力価のウイルス粒子の作製には限界があり、また分裂しない細胞には感染されないといった短所が台頭され、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus）を用いた場合にも、臨床的な利用は非常に制限的なものと知られている。また、これら２つのウイルスベクターの場合、残存するウイルス蛋白質に対する生体内での免疫反応が誘導され、治療効果に対して多くの疑問点が出てきている。従って、生体内部又は外部でのＤＮＡ及び／又はＲＮＡの細胞内伝達にあたって、より効果的でかつ副作用の少ない新しい細胞内伝達方法が継続して要求されている。

一方、生体の多くの生理的現象を調節する医薬学的用途の蛋白質は、 E. coli等のバクテリアで生産される組換え蛋白質の形で製作されて最近まで様々な疾病の治療に使われてきている。しかし、バクテリアで生産された医薬学的用途の蛋白質は、生体内の細胞内で生産される自然状態の蛋白質に比べ、その実質的な構造及び機能が非常に非効率的であるため、これら蛋白質を酵母（yeast）、昆虫細胞、又は動物細胞で生産するか、バクテリアで生産された組換え蛋白質をリフォールディング（refolding）して使用するか、或いは遺伝子導入動物（transgenic animal）を用いて生産しようとする研究が絶えずに行なわれてきている。しかし、このような新しい試みは、多くの分子細胞生物学的な中間段階を要し、収率が非常に低く、更に生産費用面での経済性なども問題とされている。このため、バクテリアで生産された組換え医薬学蛋白質を経済的で且つ容易に自然状態の機能及び構造を有する蛋白質に切り換えることは、疾患の診断、治療及び予防のための新しい蛋白質薬物の開発にあたって決定的な役割を果たすことと考えられる。

これら幾つかの重要な基礎研究及び臨床的要求に対する研究の結果として提示されたものが、ＰＴＤ（Protein Transduction Domain）である。このうち最も進んだ研究は、ヒト免疫不全ウイルス−１（Human Immunodeficiency Virus-１, HIV-1）の転写因子であるＴａｔ蛋白質であって［参考文献；Schwarze SR et al, 3:285(5433):1569-1572, 1999 Science］、この蛋白質は細胞膜の通過に当たり、８６個のアミノ酸からなる完全な形態である時よりも、正電荷を有するアミノ酸が集中的に分布している４７番目から５７番目までのアミノ酸（YGRKKRRQRRR）からなる形態である時に、より効果的であることが明らかになった［参考文献：Fawell S. et al. Proc. Natl. Acad．Sci．USA 91，664-668（1994）］。このようにＰＴＤとしての効果が確認された他の例として、ＨＳＶ−１（Herpes Simplex Virus type 1）のＶＰ２２蛋白質の２６７番目から３００番目までのアミノ酸［参考文献: Elliott G．et al．Cell，88，223-233（1997）］、及びショウジョウバエ（Drosophila）のＡＮＴＰ（Antennapedia）蛋白質の３３９番目から３５５番目までのアミノ酸［参考文献：Schwarze S.R. et al．Trends Pharmacol Sci．21，45-48（2000）］などがある。本発明者等は、これらＰＴＤのアミノ酸の配列を比較してみると、リジンとアルギニンをたくさん含んでおり、特にアルギニンが細胞内分子伝達に当たって重要なものと考えられた。かかる事実は、電気的に陽性のアミノ酸を羅列した人為的なペプチドの場合にも分子伝達効果が確認されたことから証明された［参考文献:Laus R．et al．Nature Biotechnol．18，1269-1272（2000）］。

このようなＰＴＤを用いた巨大分子の細胞内伝達作用メカニズムとしては、細胞表面の細胞膜を破壊して細胞内に伝達するという仮説と、ＰＴＤが細胞外に存在する巨大分子を、細胞膜の一部を利用して細胞内に新しい小胞（vesicle）を形成して移動させ細胞内で放出させるという仮説の２つの仮説が存在する。また、巨大分子の細胞内伝達を可能にするＰＴＤは、小サイズのペプチドや自体内の構造的特性を有していて、細胞膜に新しいチャンネルが形成できるといった仮説も提起されている［参考文献：Becker-Hapak M，et al，2001，Jul：24(3)：247-256］。

しかし、９〜１２個のアルギニン又は９〜１２個のリジンによって特定の蛋白質が細胞内に伝えられたという結果［参考文献：Rothbard JB, et al, Nature Med. 2000 Nov：6(11)：1253-1257］は、ＰＴＤ自体にアルギニン又はリジンが特定の位置に存在してチャンネル構造を形成するという上記の仮説が間違っているかもしれない可能性を見せており、ＰＴＤと共有または非共有の結合によって結合された目的蛋白質のみが細胞内に伝えられるといった本研究者等の研究結果は、細胞膜を破壊して巨大分子を細胞内に伝達するという仮説も信憑性がないということを示している。また、本研究者等の研究結果、ＰＴＤによる細胞内分子伝達は３７℃及び４℃の両方ともで効果的に行なわれており、これは、ＰＴＤ自体がチャンネル構造を形成するという仮説と、細胞内に新しい小胞体を形成して伝達が行われるという仮説が誤っていることを示すものである。

最近、従来のＰＴＤとは異なる性格の新しいＰＴＤであるＭＴＳが合成、製作されており［参考文献：DaeWoong Jo et al., Nat. Biotech.Vol. 19, 2001］、これらのアミノ酸配列は、ＦＧＦ（Fibroblast Growth Factor）のシグナルペプチドのアミノ酸配列を基に合成された。しかし、シグナルペプチドのアミノ酸は、下記のような多様な特性を有しており［（ａ）３〜５個のアルギニン又はリジンがセリン又はスレオニンのように非連続的に存在し、グルタミン酸又はアスパラギン酸は存在せず、（ｂ）１つ以上の塩基性アミノ酸と６〜１２個の疎水性アミノ酸、（ｃ）セリンとスレオニン、小サイズの疎水性アミノ酸が多く存在し、グルタミン酸及びアスパラギン酸は少なく、（ｄ）Ｃターミナル部分にセリン、リジン及びロイシンが多く、（ｅ）１つ又は２つの塩基性アミノ酸が集まっており、これらの間には無作為のアミノ酸が１０個存在する。］、上記既存のＰＴＤアミノ酸とは相当異なる特性を持っている。すなわち、ＭＴＳなどのＰＴＤは、アミノ酸構成の特性はない。

従って、本発明者等はこれら異種のＰＴＤが有する特性と、本発明者の基礎研究結果を基に、ＰＴＤに対する新しい作用メカニズムに対する仮説、及びＰＴＤ構成アミノ酸の要件を見出した：１）フォールディングされていない状態の蛋白質が元の複雑な３次構造を有する蛋白質よりも、随分効果的に伝えられるという研究結果、フォールディングされていない状態の蛋白質が細胞内部及び細胞内小器官に伝えられた後、細胞の外部または細胞内小器官の外部には排出されないといった本研究者等の研究結果、及びＰＴＤが受容体を用いたエンドサイトーシス又はファゴサイトーシスを利用しないという研究結果から、細胞表面に存在するチャンネルを利用することと予測される。このため、アラニンやバリンのような疏水性（hydrophobic）アミノ酸が存在すべきである；２）ＰＴＤの場合、核内にも蛋白質を効果的に伝達することができ、これは、細胞質内に存在している転写因子が核内に移動する作用メカニズムと類似しているように思われるため、ＰＴＤが転写因子に多く存在することと考えられる。従って、ＰＴＤも、トランスロコンという細胞内小器官への蛋白質の移動に使われるチャンネルと類似したチャンネルによって細胞内に移動することと思われる。

かかる新しい２つの仮説と構成要件に基づいて本研究を遂行した。すなわち、既存のＰＴＤの特徴であるリジン及びアルギニンが多いという構成要件でもって遺伝子バンクを検索して１０，０００個の遺伝子を見出し、シグナルペプチドの構成要件を用いて５００余個の遺伝子を選び出し、本発明者が発見した新しい仮説と、アラニンとバリンをコーディングする核酸配列を含む遺伝子１００個を探し出した。最後に、転写因子という要件を用いて２０個を見出した後、これらの細胞内伝達効果を実験し、これら新しい候補ＰＴＤとβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を製作及び分離精製して、ＪｕｒｋａｔＴ細胞内への伝達効果を比較分析した。その結果、マウス転写因子であるＭｐｈ−１（遺伝子バンク番号：U63386）の８５８番目から８６８番目までのアミノ酸からなる新しい分子伝達ペプチドを発見し、これをＭｐｈ−１−ＢＴＭ（Biomolecule Transduction Motif）と命名した。

本発明者等は、マウスＭｐｈ−１転写因子の８５８番目から８６８番目までのアミノ酸からなるペプチドを細胞内分子伝達ペプチドとして用いることにより、生体の内外において目的蛋白質、核酸、脂肪、炭水化物又は化学化合物を真核若しくは原核細胞の細胞質、細胞内小器官又は核内に効果的に伝達できることを証明し、本発明を完成した。また、目的巨大分子を伝達しようとする臓器及び細胞の表面に存在する受容体と選択的に結合できるリガンドの細胞外部分、これら臓器及び細胞に選択的に発現するＭＭＰの切断部位、及びＭｐｈ−１−ＢＴＭを用いて、生体内部または外部で目的巨大分子を特定の臓器及び細胞に伝達できることを立証した。また、伝達するＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合配列と結合可能なＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ及び／又はＲＢＤ）とＭｐｈ−１−ＢＴＭを利用して、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合ドメインと結合可能な特定のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ塩基配列を５個連続している発現ベクター、または特定の臓器、組織、若しくは細胞内で選択的に遺伝子を発現させ得るプロモーターを含む調節エレメント（elements）を有する発現ベクターを、生体内部または外部で特定の臓器や細胞に伝達又は発現できることを発見し、本発明を完成した。尚、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭを用いた細胞内伝達技術は、バクテリアで生産された組換え医薬学的蛋白質を望みの動物細胞内に伝達し、再び分離することで、自然状態のフォールディング構造と機能を有するように組み換え蛋白質を改良することを可能にした。

本発明の目的は、生体内外にて生物学的活性を有する生理機能調節分子を筋肉内（intramuscular）、腹膜内（intraperitoneal）、静脈内（intravein）、鼻内(nasal)、皮下（subcatenaous）、皮内（intradermal）、粘膜（mucosal）、吸入（inhalation）及び経口（oral）などを含む様々な経路を通じて、真核若しくは原核細胞の細胞質または核内に効果的に伝達することができる新規な分子伝達ペプチドである、配列番号１のＭｐｈ−１−ＢＴＭを提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭを含む組換え発現ベクター及びこれを用いて形質転換された微生物を提供することにある。

本発明の他の目的は、上記組換えベクターを適切な宿主細胞で発現させて分子伝達ペプチドと目的蛋白質とを融合した融合蛋白質を提供することにある。

本発明のまた他の目的は、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭを利用して、生体内外で生物学的活性を有する生理機能調節巨大分子を、真核若しくは原核細胞の細胞質、細胞小器官、又は核内に伝達する方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭ、及びＤＮＡ及び／又はＲＮＡワクチンを含む組み換えワクチン、又は、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭを用いた遺伝子治療用の伝達遺伝子をも提供することにある。

本発明の別の目的は、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭを遺伝子治療及び蛋白質を利用した治療に用いることにある。

本発明のまた別の目的は、ウイルスやバクテリア、カビ等を含む感染源、及び様々な癌細胞に対して特異的なＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び蛋白質抗原を用いた、新しいワクチンの開発を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭを用いて生体の内外で生体機能を調節するＤＮＡ及び／又はＲＮＡの遺伝子治療剤の開発を提供することにある。

なお、本発明の更に別の目的は、蛋白質のフォールディング構造を自然状態の構造及び機能を有する蛋白質構造に変換することにより、疾病の診断、治療、及び／又は予防のための蛋白質薬物を提供することにある。

上記の目的を達成するために本発明は、真核若しくは原核細胞の細胞質、細胞小器官、又は核内に生物学的活性を有する生理機能調節分子を生体内又は生体外で伝達するための、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、又はその活性断片を提供する。

また、本発明は、上記配列番号１のアミノ酸の一部が欠失又は置換されるか、アミノ酸構造の一部が生体内での安定性が増加するように変形されるか、或いはアミノ酸の一部又は全部がＬ−又はＤ−アミノ酸に置換された、真核若しくは原核細胞の細胞質、細胞小器官又は核内に生物学的活性を有する生理機能調節巨大分子を生体内又は生体外で伝達するためのペプチド又はその活性断片を提供する。

また、本発明は細胞内分子伝達ペプチドをコーディングするＤＮＡ、及び目的とする蛋白質をコーディングするＤＮＡを含む組換え発現ベクター、及びこれを用いて形質転換させた大腸菌ＤＨ５αＭｐｈ−１（KCCM-10345）を提供する。

また、本発明は上記ペプチド又はこのペプチドと目的蛋白質とを結合した融合蛋白質と、生物学的活性を有する生理機能調節分子（例えば、 chemical drug又はchemical prodrug）との結合体を、生体内部又は外部において筋肉内、腹膜内、静脈内、経口、鼻内、皮下、皮内、粘膜及び吸入などを含む様々な経路を通じて、上記物質を真核若しくは原核細胞の細胞質、細胞小器官、又は核内に伝達する方法を提供する。

本明細書において“生物学的活性を有する生理機能調節分子”とは、生体内のあらゆる生理現象を調節する物質を意味し、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、脂肪、炭水化物及び化学化合物（chemical compound）などを含む。

本明細書において“活性断片”とは、配列番号１のアミノ酸の断片又は配列番号１のアミノ酸中の一部が置換又は欠失されるか、アミノ酸構造の一部が生体内で安定性が増加するように変形されるか、アミノ酸の一部又は全部がＬ−又はＤ−アミノ酸に置換された断片であって、細胞内分子伝達の機能を有するペプチド断片を意味するものと定義される。

本明細書中の“巨大分子（macro molecule）”とは、蛋白質、脂肪、核酸、炭水化物または化学化合物を含むものと定義される。

本明細書中の分子伝達ペプチド“Ｍｐｈ−１−ＢＴＭの類似体”とは、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭの分子伝達活性を有するものであって、一部アミノ酸が置換又は欠失されたか、アミノ酸の構造を生体内部又は外部にて分子伝達ペプチド又はその複合体の安定性を増加させ得るように変形したもの、或いはアミノ酸の一部又は全部がＬ−又はＤ−アミノ酸に置換された配列を含有するペプチド、及びその活性断片を含むものと定義される。

本明細書において融合蛋白質は、分子伝達ペプチドＭｐｈ−１−ＢＴＭと、化学的、物理的な共有又は非共有の結合によって直接的に連結されるか、或いは他の媒介体を介して間接的に連結された蛋白質との結合体として定義される。

本明細書における化学化合物には、細胞の機能が調節できる化学物質、例えば、抗癌剤、免疫疾患治療剤、抗ウイルス治療剤、動物の成長因子、発達因子又は分化因子などが含まれる。

本発明の細胞内分子伝達モチーフは、マウス転写因子であるＭｐｈ−１のＮ−末端８５８番目から８６８番目までのアミノ酸に該当する配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドであり、ここで、アルギニン及びアラニンは、細胞表面に存在する分子伝達チャンネル受容体（channel receptor）との相互作用に重要な役割を果たすものと考えられる。

また、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、アルギニン、バリン及びアラニン部分を含む上記ペプチドの一部のアミノ酸が、機能的かつ構造的に類似したアミノ酸、例えば、バリンに置換された変異配列を有するペプチドもまた本発明の範疇に含まれる。

本発明はまた、上記配列番号１のアミノ酸配列、又はその一部アミノ酸が欠失又は置換されるか、少なくとも一部アミノ酸がＬ−若しくはＤ−アミノ酸に置換された変異配列からなるペプチド、又はこれらの活性断片からなる分子伝達ペプチドをコーディングするＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、及び細胞内に注入しようとする目的の生理機能調節分子及び／又は目的蛋白質をコーディングするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む分子伝達組換え発現ベクターを提供する。この組換え発現ベクターは、融合蛋白質の精製を容易にするタグ（tag）配列、例えば、連続したヒスチジンコドン、ヘマグルチニンコドン、Ｍｙｃコドン、マルトース結合蛋白質コドン等を含むことができ、融合蛋白質の可溶性（solubility）を増大させるための融合パートナー（partner）、例えば、リジンＲＮＡ合成酵素などを含むことができる。また、融合蛋白質の構造の安定、又は各遺伝子がコーディングする蛋白質の柔軟性（flexibility）のために、１つ以上のグリシン、アミノ酸ＡＹＹを含むスペーサ（spacer）アミノ酸、又は塩基配列を更に含むことができる。尚、融合蛋白質の不要な部分を除去するためにある細胞内器官に特異的に存在する酵素によって特異的に認識される切断部位、発現調節配列及び細胞内伝達を確認するためのマーカ（marker）またはリポーター遺伝子配列を含むこともできるが、これらに限るものではない。本発明の組換え発現ベクターに使われる発現調節配列は、目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡが選択的に伝達又は発現される細胞、組織、臓器に特異的なプロモーター又はエンハンサーを含む調節ドメイン（regulatory domain）で構成することができる。

具体的な一例として、本発明の細胞内分子伝達ペプチドを含む組換え発現ベクターであるｐＭｐｈ−１−β−ｇａｌは、配列番号１のアミノ酸からなるペプチドをコーディングするＤＮＡ、宿主細胞で発現した蛋白質の精製のための６つの連続したヒスチジンコドン、エンテロキナーゼによって特異的に切断されるＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ配列またはＴｅｖによって特異的に切断されるＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、及び細胞内への融合蛋白質の伝達を確認するためのマーカとしてβ−ガラクトシダーゼをコーディングするＤＮＡを含む。

本発明のｐＭｐｈ−１−β−ｇａｌは、ベクターはｐＩＮＤ／ｌａｃＺベクター（Invitrogen社より入手）を鋳型として、通常のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法により簡単に製造することができる。また、本発明では、組換え発現ベクター内のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を適した制限酵素を用いて除去し、細胞内に伝達させようとする目的蛋白質をコーディングするＤＮＡを挿入することにより、分子伝達組換え発現ベクターを製造することができる。目的蛋白質は、生理機能調節蛋白質であるか、又は生理機能調節蛋白質と、この蛋白質を伝達しようとする細胞、組織（tissue）若しくは臓器（organ）などに特異的に伝達するための受容体（receptor）に選択的に結合するリガンド（ligand）の細胞外部分とが、化学的又は物理的な方法で連結された融合蛋白質であってもよく、これらリガンド又は受容体は、蛋白質、脂肪、炭水化物、化学化合物またはこれらの複合体であってもよい。上記目的蛋白質がＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、及びインフルエンザを含む感染性ウイルスから選ばれた一つ以上のウイルス特異的蛋白質、または肝癌細胞や胃癌細胞を含む腫瘍細胞に特異的に発現する腫瘍特異的蛋白質である場合、組換え発現ベクターは生体内で、抗原プロセシングの中にＭＨＣクラスII媒介経路をＭＨＣクラスI媒介経路に切り換えＣＴＬ（cytotoxic leukocyte）を誘導することができ、望ましくは、１つ以上のユビキチン（ubiquitin）をコーディングするＤＮＡを更に含む。

本発明の組換え発現ベクターを用いて大腸菌など適切な宿主細胞を形質転換させ、収得した形質転換体を適切な条件の下で培養し融合蛋白質を生産した後、公知となった通常の蛋白質精製方法、例えば、ポリヒスチジンとＮｉ^２＋−ＮＴＡとの結合を用いた方法などを利用して目的蛋白質を分離、精製することができる。また、本発明は、上記組換え発現ベクターを、生物学的活性を有する生理機能調節分子を伝達しようとする細胞と一緒に培養することにより、細胞質、細胞小器官又は核内に生理機能調節分子を効果的に伝達する方法を提供する。

より具体的には、本発明は、分子伝達ペプチドＭｐｈ−１−ＢＴＭ又はその類似体、及び細胞内に伝達しようとする目的ＤＮＡ及び／またはＲＮＡに含まれたＤＢＳ及び／又はＲＢＳ（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合配列）と選択的に結合するＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合蛋白質をコーディングするＤＮＡを含む組換え発現ベクターを製造する段階；上記組換えベクターを適切な宿主細胞で発現させて収得した融合蛋白質と、上記ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合蛋白質に結合するＤＮＡまたはＲＮＡ塩基配列を目的ＤＮＡまたはＲＮＡの３´末端に有している目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡとを結合反応させ、結合体を収得する段階；及び、上記結合体を目的とする細胞の培養物と混合培養し、細胞内に目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを伝達する段階；を含む細胞内分子伝達方法を提供する。

また、本発明は、分子伝達ペプチドＭｐｈ−１−ＢＴＭ又はその類似体、若しくは分子伝達ペプチドと目的蛋白質との融合蛋白質を結合誘導体によって活性化し、これを目的化合物と結合反応させて結合体を収得する段階、及びこの収得した結合体を、目的化合物を伝達しようとする細胞の培養物と混合培養することにより、細胞内に目的化合物を伝達する段階を含む分子伝達方法を提供する。上記結合誘導体には、分子伝達ペプチド又は分子伝達ペプチドと目的蛋白質との融合蛋白質を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、脂肪、蛋白質または化合物と化学的及び／又は物理的な方法で結合させる結合試薬、例えば、ＢＭＯＥ（Pierce Cat. No 22323）、ＤＳＰ（Pierce Cat. No 22585）、ｐＨ感受性リンカー［参考文献：Rothbard JB, et al, Nat. Med. 2000, Nov：6(11):1253-1257］などが含まれる。

また、本発明は、分子伝達ペプチドＭｐｈ−１−ＢＴＭ又はその類似体、若しくは分子伝達ペプチドと生体内の生理現象を調節する生理活性調節蛋白質である目的蛋白質との融合蛋白質を、バクテリアで多量発現させ分離精製した後、これら組換え融合蛋白質を、元より生体内でこれら目的蛋白質を生産する細胞又はこれと同等な水準の蛋白質プロセシング（processing）及び修飾（modification）が可能な細胞内に伝達し、これら細胞内に伝達された目的蛋白質が細胞内の蛋白質フォールディングメカニズムによって自然状態の構造及び機能に変換して、基礎的及び臨床的な治療剤として使用可能な医薬学的用途の蛋白質を生産することができる方法を提供する。

また、上記目的ＤＮＡ、目的ＲＮＡ、または目的化学化合物の細胞内伝達に当たって、これを分子伝達ペプチドと目的蛋白質との融合蛋白質に物理的かつ化学的に結合させて特定の細胞、組織または臓器に伝達しようとする場合、上記目的蛋白質は、それが伝えられる特定の細胞、組織、臓器に特異的に発現する受容体と選択的に相互作用可能なリガンドの細胞外部分蛋白質、またはこれら受容体やリガンドと特異的に結合可能な単クローン抗体（mAb）及び単クローン抗体（mAb）の変形された形態、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ´）断片、一本鎖Ｆｖ或いはヒト化した単クローン抗体と結合して生体分子伝達複合体を形成することができる。

従って、本発明はまた、i）細胞内に伝達しようとする目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合蛋白質が特異的に結合するＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列を１つ以上連続して含有するＤＮＡ及び／又はＲＮＡ断片、及び作動可能に結合された発現調節配列を含む第１の組換え発現ベクターを製造する段階；ii）配列番号１のペプチドまたはその活性断片、上記段階i）の細胞内に伝達しようとする目的の組換え発現ベクター中のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ断片に含まれた特定ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列と選択的に結合可能なＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合蛋白質をコーディングするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む第２の組換え発現ベクターを製造する段階、iii）上記第２の組換え発現ベクターを用いて宿主細胞から融合蛋白質を収得する段階；iv）上記段階iii）の融合蛋白質と段階i）の第１の組換え発現ベクターとを結合反応させ、融合蛋白質及び目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの結合体を収得する段階；及びv）上記結合体を、目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを伝達しようとする細胞と混合し、混合培養する段階；を含み、目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを細胞内に伝達する方法を含む。本発明によって生理機能調節分子を細胞内に伝達するにあたって、インターロイキン−４、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、またはγ−インターフェロンを含むサイトカイン及びケモカイン、または成長因子（EGF）など目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの発現及び機能が調節可能な生理機能調節因子を一緒に使用することができる。

本発明の目的蛋白質は、望ましくは、翻訳後にユビキチン化（ubiquitination）、ホスホリル化（phosphorylation）、アシル化（fatty acylation）、例えば、パルミトイレーション（palmitoylation）、ミリストイレーション(myristoylation)、又はファネシレーション（farnesylation）などを含む翻訳後修飾（post-translation modification）によって修飾され、上記アシル化には、例えば、Ｌｃｋ蛋白質のアミノ酸配列の一部（Met-Gly-Cys-Val-Cys-Ser-Ser-Asn-Pro-Glu-Asp-Asp-Trp-Met-Glu-Asn）が利用できる。

また、本発明による融合蛋白質を、筋肉内、腹膜内、静脈内、経口、鼻内、皮下、皮内、粘膜または吸入を含む経路を通じて生体内外で導入しようとする細胞に接触させる段階を含み、生理機能調節分子を真核細胞若しくは原核細胞の細胞質、細胞小器官又は核内に伝達する場合、これらの構造及び機能、安定性を増加させるために、クロロキン（chloroquine）、モネンシン（monensin）、アマンタジン（amantadine）、及びメチルアミン（methylamine）からなる群から選ばれた、リソソーモトロフィック（lysosomotrophic）製剤を加えるのが望ましい。

本発明の細胞内分子伝達ペプチドは、非常に小さなサイズのペプチドであるため、活性物質に対する生物学的干渉を最小化することができる。

以下、実施例に基づいて本発明をより詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。尚、本明細書上の技術参考文献は本発明に参考として統合される。

実施例１：分子伝達ペプチドＭｐｈ−１−ＢＴＭを含む
発現ベクターの製造
マウス転写因子であるＭｐｈ−１（GeneBank Code：U63386）のＮ−末端より８５８番目アミノ酸であるチロシンから８６８番目アミノ酸であるアルギニンまでのペプチドをコーディングする塩基配列と、リポーターとして使われるβ−ガラクトシダーゼをコーディングする塩基配列とを結合させるために、Ｍｐｈ−１のＮ−末端より８５８番目アミノ酸であるチロシンから８６８番目アミノ酸であるアルギニンまでの配列とクローニングのための制限酵素ＢａｍＨIを含む配列番号２のプライマー、及びβ−ガラクトシダーゼの３´末端に該当する配列とクローニングのための制限酵素ＢｇｌIIを含む配列番号３のプライマーを合成し、β−ガラクトシダーゼ蛋白質の全体遺伝子を含むｐＩＮＤ／ｌａｃＺベクター（invitrogen社より入手）を鋳型としてｐｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene, cat. # 600252-51）を使用してＰＣＲを行なった。

ＰＣＲで収得した反応生成物を制限酵素ＢａｍＨIとＢｇｌIIとで切断し、ＱｕｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（QIAGEN, cat. # 28104）を用いて精製した後、ゲル抽出法で精製したｐＴｒｃＨｉｓＢ（Invitrogen, Cat. No. V360-20B）のＢｇｌＩＩ位置にクローニングして組換え発現ベクターを製造し、これをｐＭｐｈ−1−β−ｇａｌと命名した。図１Ａは、本発明の発現ベクターｐＭｐｈ−1−β−ｇａｌの構造を示すもので、発現ベクターｐＭｐｈ−1−β−ｇａｌを制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄIIIとで切断し、１％アガロースゲルで電気永働した後、エチジウムブロマイド染色を行い、図１Ｂに示した。ここで、第２の列は本発明の発現ベクターｐＭｐｈ−1−β−ｇａｌを、第１の列は標準サイズのＤＮＡをそれぞれ示す。

実施例２：大腸菌形質転換体の製造及び融合蛋白質の発現並びに精製
実施例１で製造した発現ベクターｐＭｐｈ−1−β−ｇａｌを用いて大腸菌ＤＨ５α（ATCC No. 53863）を熱ショック形質転換法（heat shock transformation）によって形質転換した後、この形質転換された大腸菌を１００ｍｌのＬＢ培地に２ｍｌの量で接種し、３７℃で１２時間撹拌しながら前培養を行なった。その後、これを再び１０００ｍｌのＬＢ培地（カゼインのパンクレアチックダイジェスト（pancreatic digest）１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ）にそれぞれ接種し、３７℃で４時間培養した後、１ｍＭ濃度のＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド、GibcoBRL cat. # 15529-019）を添加してｌａｃオペロンの発現を誘導し、８時間培養して融合蛋白質の発現を誘導した。上記培養液を４℃、６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してペレットのみを残して上澄液を取り除き、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Sigma, cat. ＃ L-7651）を含む１０ｍｌの緩衝溶液１（５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）にペレットを懸濁してから氷に３０分間放置した後、超音波粉砕機（Heat systems、ultrasonic processor XL）を用いて、累積の超音波注入時間が３分になるまで３００Ｗの出力で超音波を１０秒間注入し１０秒間冷却する過程を繰り返した。溶出液を４℃、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して大腸菌の破砕物を除去し、純粋な溶出液のみを分離した。分離した溶出液に２．５ｍｌの５０％Ｎｉ^２＋−ＮＴＡアガローススラリー（Qiagen, cat# 30230）を加え、４℃、２００ｒｐｍで１時間撹拌して融合蛋白質とＮｉ^２＋−ＮＴＡアガロースとを結合させ、この混合液をクロマトグラフィー用の０．８×４ｃｍコラム（BioRad，cat.# 731-1550）に注ぎ入れた。４ｍｌの緩衝溶液２（５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ^４、３００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて２回洗浄した後、０．５ｍｌの緩衝溶液３（５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ NaCl２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）にて４回にわたって融合蛋白質を分画し、分離精製されたＭｐｈ−１−β−ｇａｌ融合蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ実施した後、クマシーブルー染色法で確認した。それを図２に示す。同図において、第１の列は標準分子量蛋白質、第２の列は融合蛋白質Ｍｐｈ−１−β−ｇａｌである。

実施例３：融合蛋白質の細胞内伝達
１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）ＤＭＥＭに培養したＨＵＶＥＣ（ATCC：CRL-1730）、ＨｅＬａ（ATCC：CCL-2）、２９３（ATCC：CRL-1573）をＬａｂ−ｔｅｋIIｃｈａｍｂｅｒｓｉｄｅに、１０％ＦＢＳＲＰＭＩに培養したＪｕｒｋａｔ細胞（ATCC：CRL-10915）はポリ−Ｌ−リジンコーティングスライドに、それぞれ２Х１０^５ずつ分注し、上記の方法で精製されたＭｐｈ−1−β−ガラクトシダーゼ蛋白質を０．５μＭの濃度で３７℃、３０分間５％Ｃｏ_２インキュベータで処理した後、上澄液を除去した。氷冷ＰＢＳで４回洗浄した後、２％ホルムアルデヒド溶液で１０分間固定させた。固定液を取り除いた後、再び氷冷ＰＢＳで４回洗浄し、β−ガラクトシダーゼ染色溶液（RoChe. Co.）を７００μｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータで４５分間反応させた後、再び上澄液を除去して氷冷ＰＢＳで４回洗浄した。その後、７０％グリセロールでマウンティング（mounting）を行い、顕微鏡で観察して写真撮影をし、その結果を図３Ａに示した。その結果、Ｍｐｈ−１と融合結合されたβ−ｇａｌは、上記４つの細胞内に効率よく伝えられたが、Ｍｐｈ−１と結合されていないβ−ｇａｌ蛋白質は細胞内に全く伝えられなかった。また、かかるＭｐｈ−１−β−ｇａｌの細胞内伝達が、受容体−媒介エンドサイトーシスによるものか否かを区分するために、３７℃及び４℃にて融合蛋白質が細胞内に効果的に伝達されるかどうかを調べた。

１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）ＲＰＭＩ培地で培養した３Х１０^６のＪｕｒｋａｔ細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）ＲＰＭＩ培地で顕濁させ６０ｍｍディッシュに分注し、１ｍｇ／ｍｌＭｐｈ−１−β−ガラクトシダーゼ蛋白質を処理した後、３０分間、４℃及び３７℃にて５％ＣＯ_２インキュベータで反応させた。その後、処理されたＪｕｒｋａｔ細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１％ＮＰ−４０溶解緩衝液（１％ＮＰ−４０１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４００μＭＥＤＴＡ、１ｍＭＮａ_３ＶＯ_４、１ｍＭＮａＦ、１０μｇアプロチニン、１０μｇロイペプチン（leupeptin））に溶解させた。４℃で２０分間遠心分離した後、ＢＣＡ蛋白質定量キット（PIERCE）で定量し、この中で２０μgのサンプルをβ−ガラクトシダーゼ分析緩衝液（１００ХＭｇ^２＋溶液３μl、ＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）溶液６６μｌ、及び０．１Ｍリン酸ナトリウム（sodium phosphate））と一緒に混合し、３７℃で３０分間反応させた後、１ＭＮａ_２ＣＯ_３を加えて反応を終了させた。４２０ｎｍにてマイクロプレートリーダー（Molecular devices）を用いて吸光度を測定した結果を図３Ｂに示す。これは３回実験した結果で標準偏差を含むものである。この結果、Ｍｐｈ−１−β−ｇａｌ融合蛋白質は３７℃でだけでなく、４℃でも極めて効果的に伝達されており、これは、本発明の分子伝達ペプチドによる目的蛋白質の細胞内伝達が、受容体−媒介エンドサイトーシス（receptor-mediated endocytosis）またはファゴサイトーシス（phagocytosis）によるものではないことを明らかにした。

実施例４：Ｔａｔ及びＭｐｈ−１の細胞内伝達効果の比較
既存のＰＴＤであるＴａｔと本発明のＭｐｈ−１とによる蛋白質の細胞内伝達効果を比較するために、ｐＴａｔ−β−ｇａｌＤＮＡ構造を製作した。ＨＩＶのＴａｔ蛋白質のＮ−末端より４７番目アミノ酸であるチロシンから５７番目アミノ酸であるアルギニンまでのペプチドをコーディングする塩基配列と、リポーターとして使われるβ−ガラクトシダーゼをコーディングする塩基配列とを結合させるために、ＴａｔのＮ−末端より４７番目アミノ酸であるチロシンから５７番目アミノ酸であるアルギニンまでの塩基配列とクローニングのための制限酵素ＢａｍＨIを含む配列番号４のプライマーを合成し、β−ガラクトシダーゼの３´末端に該当する塩基配列及びＢｇｌII制限酵素に該当する配列番号３のプライマーを使用し、β−ガラクトシダーゼ蛋白質の全体遺伝子を含むｐＩＮＤ／ｌａｃＺベクター（invitrogen社より入手）を鋳型としてｐｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene, cat. # 600252-51）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲで収得した反応生成物を制限酵素ＢａｍＨIとＢｇｌIIで切断した後、ＱｕｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（QIAGEN, cat. # 28104）を用いて精製し、ゲル抽出法で精製したプラスミドｐＴｒｃＨｉｓＢ（invitrogen, Cat. No V360-20B）のＢｇｌII位置にクローニングして組換え発現ベクターを製造し、これをｐＴａｔ−β−ｇａｌと命名した。図４Ａはその構造を示す図面である。実施例２に提示した方法によりＴａｔ−β−ｇａｌ融合蛋白質を分離精製した後、実施例３に提示した方法により０．１μｇ／ｍｌと０．５μｇ／ｍｌとの異なる濃度でＪｕｒｋａｔＴ細胞内へのＴａｔ−β−ｇａｌ及びＭｐｈ−1−β−ｇａｌの伝達効果を比較した。図４Ｂに示すように、上記２つの異なる濃度の下で、Ｍｐｈ−１はＴａｔよりも随分効果的にβ−ｇａｌが細胞内に伝達され、特に、０．１μｇ／ｍｌの低い濃度下での伝達効果の差が著しかった。

実施例５：生体内でのＭｐｈ−１による目的蛋白質の細胞内伝達
Ｍｐｈ−１による目的蛋白質の細胞内伝達効果を生体内で確認するために、実施例２で分離精製したＭｐｈ−１−β−ｇａｌ融合蛋白質を６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、７５０μgのＭｐｈ−１−β−ガラクトシダーゼ蛋白質をＰＢＳと混合して５００μｌの体積で腹腔内に１回／１日で３日間注入し、対照マウスには腹腔に同量のＰＢＳのみを注射した。最終の腹腔注射から４時間経過後にマウスを解剖し、各臓器を２ｍＭＭｇＣｌ_２を含むＰＢＳで洗浄した後、氷冷５％ホルマリンで固定させた。固定後、ＰＢＳで５回洗浄し、各臓器をβ−ｇａｌ染色溶液（Roche. Co.）に浸して１２時間後に色の変化を観察した。図５Ａに示すように、腎臓、脳、肝、肺及び心臓にβ−ｇａｌ蛋白質が効果的に伝達されていることから見て、生体内でもＭｐｈ−１−ＢＴＭによって目的蛋白質が各臓器内に効果的に伝達されることが確認された。

尚、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭによって各臓器に伝えられたβ−ｇａｌ蛋白質が臓器の表面ではなく、臓器を構成している細胞内に伝えられたことを確かめるために、マウス転写因子Ｍｐｈ−１（遺伝子バンクコード：U63386）のＮ−末端より８５８番目アミノ酸であるチロシンから８６８番目アミノ酸であるアルギニンまでのペプチドをコーディングする塩基配列と、リポーターとして使われるｅＧＦＰ（enhanced Green Fluorescent Protein）をコーディングする塩基配列とを結合するために、Ｍｐｈ−１のＮ−末端より８５８番目アミノ酸であるチロシンから８６８番目アミノ酸であるアルギニンとクローニングのための制限酵素ＢａｍＨIを含む配列番号２のプライマー、及びｅＧＦＰの３´末端とクローニングのための制限酵素ＢｇｌIIを含む配列番号５のプライマーを合成し、ｅＧＦＰ蛋白質の全体遺伝子を含むｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（invitrogen社より入手）を鋳型として、ｐｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene, cat. # 600252-51）を用いてＰＣＲを行なった。

ＰＣＲで収得した反応生成物を制限酵素ＢａｍＨIとＢｇｌIIとで切断し、ＱｕｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（QIAGEN, cat. # 28104）を使用して精製した後、ゲル抽出法で精製したプラスミドｐＴｒｃＨｉｓＢ（invitrogen, Cat. No V360-20B）のＢｇｌII位置にクローニングして組換え発現ベクターを製造し、これをｐＭｐｈ−1−ｅＧＦＰと命名した。上記実施例２と同様に、ＤＨ５αで発現されたＭｐｈ−１−ｅＧＦＰ蛋白質を分離精製した後、生体内に腹腔注射してから４時間経過後に脾臓を除去した。除去された脾臓を粉砕した後、抗体形成細胞（splenocyte）を分離し、これら細胞内に伝えられたｅＧＦＰをＦＡＣＳ分析で調査し、その結果を図５Ｂに示した。図５Ｂに示すように、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭによって脾臓に伝えられたｅＧＦＰが脾臓を構成している抗体形成細胞にも効果的に伝えられている。

生体内でＭｐｈ−１−ＢＴＭによって血液内に伝えられ体内の各臓器に伝えられるかどうかを様々な投与経路を通して調べるために、分離精製されたＭｐｈ−１−β−ｇａｌ融合蛋白質を、６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに７５０μｇのＭｐｈ−１−β−ｇａｌ蛋白質とＰＢＳとを混合して５００μｌの体積で腹腔注射、ＩＶ、皮膚、または鼻内（nasal）の経路を通じて１回／１日で３日間注入し、対照マウスには同量のＰＢＳのみを腹腔に注射した。融合蛋白質を投与したマウスから血液を採取しＴ細胞をＭＡＣＳと抗−ＣＤ３ｍＡｂを利用して分離した後、上記実施例３と同様にこれらＴ細胞に伝達されたβ−ガラクトシダーゼ酵素の活性を測定した。その結果を図５Ｃに示した。この結果から、生体内の腹腔、ＩＶ、皮膚及び鼻内など様々な投与経路を通しても、分子伝達モチーフであるＭｐｈ−１−ＢＴＭによって血液内のＴ細胞内に融合蛋白質が効果的に伝えられることが分かった。

実施例６：Ｍｐｈ−１と目的蛋白質との融合蛋白質の細胞特異的伝達
実施例２で製造された目的蛋白質Ｍｐｈ−１−β−ｇａｌを特定細胞にのみ選択的に伝達するために、伝達しようとする細胞、組織または臓器に特異的に存在するリガンド又は受容体を利用した。その一例として、目的蛋白質をＴ細胞に特異的に伝達するために、Ｍｐｈ−１−β−ｇａｌの３´部分に、細胞の細胞外基質（extracellular matrix）に存在しながら細胞膜に付着しているマトリクスメタロプロテアーゼ（Matrix Metallo Protease, MMP）の切断部位のアミノ酸配列を挿入し、またその３´の後方にＴ細胞に特異的に存在する受容体ＣＤ２８のリガンドであるＢ７．１をクローニングして挿入した発現ベクターｐＭｐｈ−１−β−ｇａｌ−Ｂ７．１を製作した。制限酵素ＢａｍＨIとＢ７．１のＮ末端配列を含む配列番号６のプライマー、及び制限酵素ＢｇｌIIとＢ７．１のＣ末端配列を含む配列番号７のプライマーを使用し、本研究室で製作したヒト一次（primary）Ｔ細胞のｃＤＮＡ混合物を鋳型として上記実施例１と同様に、ＰＣＲ及び分子クローニング方法を用いて発現ベクターｐＭｐｈ−１−β−ｇａｌ−Ｂ７．１を製作した。図６Ａは発現ベクターｐＭｐｈ−１−β−ｇａｌ−Ｂ７．１の構造を示す図面である。ｐＭｐｈ−１−β−ｇａｌ−Ｂ７．１発現ベクターを用いて上記実施例２と同様にバクテリアＤＨ５αを形質転換した後、これらバクテリアを培養してＭｐｈ−１−β−ｇａｌ−Ｂ７．１融合蛋白質を分離精製した。この融合蛋白質を実験用マウスにＩ．Ｐ．法で注射し、４時間後に血液からＴ細胞を分離してβ−ｇａｌの活性を調べた。図６Ｂの結果から明らかなように、Ｔ細胞で高いβ−ｇａｌの活性が現れたが、Ｂ細胞では活性が殆ど現れなかった。この結果は、融合蛋白質のＢ７．１と、Ｔ細胞のＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４とが結合した後、Ｔ細胞の表面に存在しているＭＭＰによって融合蛋白質が切断され、その後Ｍｐｈ−１−β−ｇａｌ融合蛋白質がＴ細胞内に選択的に伝達されたことを示す。

実施例７：Ｍｐｈ−１−ＢＴＭによるＤＮＡ（CD8-ζ）の細胞内伝達
（段階１）Ｍｐｈ−１とＧａｌ４とが融合した遺伝子を含む
発現ベクターの製造
実施例１で製作されたｐＭｐｈ−１−β−ｇａｌベクターを制限酵素ＸｂａI及びＢｇｌIIで処理してβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を分離し、ＤＮＡ結合蛋白質であるＧＡＬ４のＮ末端の配列とＸｂａI制限酵素を有する配列番号８のプライマー、及びＧＡＬ４のＣ末端配列とＢｇｌII制限酵素を有する配列番号９のプライマーを利用し、発現ベクターｐｃＤＮＡＧａｌ４を鋳型として実施例１でのような通常のＰＣＲ及び分子クローニング法でｐＭｐｈ−１−Ｇａｌ４プラスミドを製作した。図７は発現ベクターｐＭｐｈ−１−Ｇａｌ４の構造を示す。

（段階２）ＤＮＡ結合蛋白質であるＧａｌ４が選択的に結合する
ＤＮＡ塩基配列（GBS）を含む発現ベクターｐＣＤ８−ｚ−５ＸＧＢＳの製造
上記段階１のＭｐｈ−１−Ｇａｌ４との効率的な結合のために、ＣＤ８−ζがｐｃＤＮＡ３発現ベクター（invtrogen社より）のＸｂａI及びＢａｍＨI制限酵素認識部位に挿入されたｐｃＤＮＡ３−ＣＤ８−ｚのＳｔｕI制限酵素認識部位に、Ｇａｌ４が選択的に結合する塩基配列であるＧＢＳ（Ｇａｌ４結合配列）が５回繰り返されるようにクローニングしたｐＣＤ８−ｚ−５ＸＧＢＳを製作した。

すなわち、ＧＢＳに該当する塩基配列をプライマーで合成し、これらをハイブリダイゼーションした後、キナーゼで５´突出末端（overhanging）をリン酸化し、その後、ｐＣＤ８−ζの３´にあるＳｔｕIにクローニングさせた。図８は発現ベクターｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳの構造を示すものであり、配列番号１０はＧＢＳの塩基配列を示す。

（段階３）Ｍｐｈ−１によるＣＤ８−ζＤＮＡの細胞内伝達の確認
上記段階１で製造された発現ベクターｐＭｐｈ−１−Ｇａｌ４を用いて、実施例２と同様な方法で発現及び精製されたＭｐｈ−１−Ｇａｌ４融合蛋白質に上記段階２で製造されたｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳＤＮＡを常温で結合させ、Ｍｐｈ−１−Ｇａｌ４融合蛋白質のＧａｌ４と、ｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳが有する５個のＧａｌ４結合部位であるＧＢＳとを相互結合させた。連結された結合体をＰＢＳで混ぜた後、１０^７一次Ｔ細胞を接種して反応させ、その後、３７℃で４８時間培養して細胞内に伝えられたＤＮＡ構造によるＣＤ８−ζ融合体の過剰発現を誘導した。細胞表面におけるＣＤ８−ζ融合蛋白質の過剰発現の有無を確認するために、ＣＤ８分子に対する単クローン抗体ＯＫＴ８（ATCC No CRL-8014）を用いてＦＡＣＳ（Fluorescence-Activated Cell Sorter）分析法（参考文献：Current Protocol for Immunology）で発現を調べ、その結果を図９Ａに示した。図９Ａに示すように、Ｍｐｈ−１分子伝達ペプチドが融合されたＣＤ８−ζ蛋白質が細胞内に伝えられたことが確認された。陰性対照区として、ｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳを含まないＭｐｈ−１−Ｇａｌ４融合蛋白質、またはｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳ自体のみを反応させたＴ細胞でのＣＤ８−ζキメラ分子（chimeric molecule）の発現をＦＡＣＳで分析した。この結果から明らかなように、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭと融合したＤＮＡ結合蛋白質（binding protein）は、細胞内に伝達しようとするＤＮＡ構造に人為的に挿入させたＤＮＡ結合蛋白質の結合配列と相互結合し、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭにより目的ＤＮＡ構造を細胞内に効率的に伝達し発現させることができる。

かかるＭｐｈ−１−ＢＴＭによるＤＮＡの細胞内伝達が生体内でも可能であるかどうかを調べるために、常温で結合を誘導されたＭｐｈ−１−Ｇａｌ４融合蛋白質とｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳとの結合体を実施例５でのように腹腔内に注射し、４８時間経過後に血液内のＴ細胞を、Ｔ細胞に選択的に結合する抗−ＣＤ２ｍＡｂとＭＡＣＳを用いて分離し、脾臓の抗体形成細胞を分離してから、これら細胞の表面に発現しているＣＤ８−ζキメラ蛋白質の発現程度をＦＡＣＳを用いて調べた。その結果を図９Ｂに示す。この結果、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭ及びＧａｌ４によって生体内に伝えられた発現ベクターｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳは、血液内のＴ細胞だけでなく、脾臓の抗体形成細胞の内にも効率よく伝えられたことが確認された。

実施例８：ｐＣＤ８−ζＤＮＡのＴ細胞特異的伝達及び選択的発現
（段階１）Ｍｐｈ−１、Ｇａｌ４、Ｂ７．１が融合した遺伝子を
含む発現ベクターの製造
分子伝達ペプチドＭｐｈ−１を用いてｐＣＤ８−ζＤＮＡをＴ細胞に特異的に伝達するために実施例７で製造された発現ベクターｐＭｐｈ−１−Ｇａｌ４の３´部分に、実施例６でのようにＴ細胞に選択的に存在するマトリクスメタロプロテアーゼ切断部位をクローニングした後、Ｂ７．１の細胞外部分を、配列番号６及び７のプライマーを利用し本研究室で製作したＴ細胞ｃＤＮＡ混合物を鋳型として、上記実施例１と同様に通常のＰＣＲ及び分子クローニング法でクローニングして挿入したｐＭｐｈ−１−Ｇａｌ４−Ｂ７．１ＤＮＡ構造を製作した。図１０Ａはその構造を示す。

（段階２）Ｔ細胞に特異的なプロモーターＬｃｋ、ｐＬＣＤ８−ζ及び５個のＧＢＳを含む発現ベクターの製造
実施例７の段階２で製作されたｐＬＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳのプロモーターであるＣＭＶプロモーターの代わりに、Ｔ細胞に特異的に遺伝子を発現させるｌｃｋプロモーターを、ＨｉｎｄIII制限酵素認識部位を用いて通常の分子クローニング方法で置換した。図１０Ｂはその発現ベクターであるｐＬＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳの構造を示す図面である。

（段階３）Ｍｐｈ−１によるｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳ
ＤＮＡのＴ細胞特異的な伝達
上記段階１で製造された発現ベクターｐＭｐｈ−１−Ｇａｌ４−Ｂ７．１ＤＮＡを用いて上記実施例７の段階２で製作された発現ベクターｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳを生体内でＴ細胞に選択的に伝達するために、実施例７と同様な方法で発現及び精製されたＭｐｈ−１−Ｇａｌ４−Ｂ７．１融合蛋白質と発現ベクターｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳとの結合体を常温で誘導した。連結された結合体をＰＢＳで混ぜた後、腹腔内に注射し、４８時間経過後に血液内のＴ細胞とＢ細胞をそれぞれ抗−ＣＤ２ｍＡｂ、抗−Ｂ２２０ｍＡｂ、ＭＡＣＳを用いて分離した後、これら細胞で発現している表面キメラ分子であるＣＤ８−ζの発現程度を抗−ＣＤ８ｍＡｂであるＯＫＴ８とＦＡＣＳを利用して分析した。その結果を図１０Ｃに示す。この結果は、Ｍｐｈ−１とＧａｌ４を利用して生体内に伝えられた発現ベクターｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳは、融合蛋白質Ｍｐｈ−１−Ｇａｌ４−Ｂ７．１におけるＢ７．１の細胞外部分と、Ｔ細胞の表面に存在するＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４との結合によってＴ細胞の周囲に移動した後、Ｔ細胞の表面に選択的に存在するＭＭＰにより切断され、その後、Ｍｐｈ−１−Ｇａｌ４とｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳとの結合体が周囲に多く存在するＴ細胞の内に伝えられて発現していることを示す。しかし、Ｂ細胞では発現ベクターが伝えられず、ＣＤ８−ｚキメラ分子は殆ど発現しなかった。

（段階４）Ｍｐｈ−１によるｐＬＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳ
ＤＮＡの
Ｔ細胞選択的な発現
上記実施例７の段階２で製造されたＭｐｈ−１−Ｇａｌ４融合蛋白質を用いて上記段階２で製作された発現ベクターｐＬＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳをＴ細胞に特異的に発現させるために、上記段階３と同様に室温で結合誘導されたＭｐｈ−１−Ｇａｌ４とｐＬＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳとの結合体を生体内に伝達し、４８時間経過後に血液中のＢ細胞とＴ細胞を分離し、これら細胞の表面に発現する表面キメラ蛋白質であるＣＤ８−ζの発現程度をＯＫＴ８及びＦＡＣＳを利用して分析した。その結果を図１０Ｄに示す。この結果から、Ｔ細胞に選択的に発現を誘導するＬｃｋプロモーターによって生体内に伝えられた発現ベクターｐＬＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳは、Ｔ細胞にのみ選択的に発現していることが分かる。

実施例９：Ｍｐｈ−１とＴ細胞に選択的に作用する免疫抑制剤ＴＭＣとの融合構造の細胞内伝達
生体内の様々な生理作用が調節できる化学化合物をＭｐｈ−１−ＢＴＭによって生体内に効果的に伝達するために、Ｍｐｈ−１とＢ７．１の細胞外部分との融合蛋白質を製作すべく、ＢａｍＨI制限酵素、Ｍｐｈ−１のＢＴＭ及びＢ７のＮ末端塩基配列を含む配列番号１１のプライマー、制限酵素ＢｇｌIIの配列とＢ７のＣ末端塩基配列を含む配列番号１２のプライマーを使用し、本研究室で製作したマウスＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として発現ベクターｐＭｐｈ−１−Ｂ７．１を製作した。Ｍｐｈ−１とＢ７．１との間にＴ細胞に選択的に発現するＭＭＰによる切断部位を挿入した。ＤＨ５αで発現し分離精製された融合蛋白質Ｍｐｈ−１−Ｂ７．１が、図１１Ａに示すｐＨ感受性化学的リンカーを用いてＴＭＣと化学的に連結された構造を製作した。ＴＭＣ−Ｍｐｈ−１−Ｂ７．１（０．１μｇ／ｍｌ）結合構造をＪｕｒｋａｔＴ細胞に処理してから５時間経過後に、ＴＭＣによって誘導されたＪｕｒｋａｔＴ細胞のアポトーシスをＰＩ染色［参考文献：I. Schmid et. al Cytometry 13：204-208（1992）］及びＦＡＣＳを利用して分析し、その結果を図１１Ｂに示した。これから、Ｍｐｈ−1−Ｂ７融合蛋白質によってＪｕｒｋａｔＴ細胞内に伝えられたＴＭＣは、アポトーシスを効率よく引き起こすことが確認された。ＪｕｒｋａｔＴ細胞で効率よくアポトーシスを引き起こすＴＭＣ−Ｍｐｈ−１−２−Ｂ７．１が、生体内でもＴ細胞に選択的に伝えられアポトーシスを誘導することで、免疫抑制効果を奏することができるかを分析するために、臓器移植拒否反応のモデルとして異種心臓他家移植ラット（rat heterocardiac allograft）を用いて［参考文献：Jae-Hyuck Sim et al. PNAS vol. 99, no. 16, 10617-10622, 2002］免疫抑制効果を調べた。その結果を下記の表１に示す。

臓器移植拒否反応の動物モデルにおいて、従来の免疫抑制剤であるｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡ（CsA）を腹腔に投与した場合、移植された臓器は１００日以上動いた反面、上記作製したＴＭＣ−Ｍｐｈ−1−Ｂ７．１融合構造を０．０５μｇ／ｍｌの濃度で腹腔に投与するか、または０．０３μｇ／ｍｌの濃度で皮膚を通して投与した場合には、いずれも１６０日以上動いて、効果的な生体内での免疫抑制効果を示した。しかし、ｃｒｅｍｏｐｈｏｒのみを投与した場合には、移植された心臓は、ただ９〜１０日程度しか動かなかった。

実施例１０：Ｍｐｈ−１−ｚＡ１Ａ２及びＭｐｈ−１−ＣＴＬＡ−４
蛋白質薬物による生体内での免疫抑制効果
上記の何れの実施例からも確認されるように、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭは、生体内の生理現象を調節する生理調節蛋白質、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、及び化学的薬物を共有又は非共有の結合によって結合させ、生体内外で種々の臓器及び臓器内の細胞の中に効果的に伝達することができる。従って、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭを利用して生体内の免疫反応が調節可能な細胞内信号伝達調節蛋白質の野生型（wild type）または変形された形態を細胞内に伝達することにより、生体内の免疫反応が調節可能な新しい蛋白質薬物の作製を試みた。

Ｔ細胞による免疫反応を阻害し免疫抑制効果を示す目的蛋白質として、生体内に入ってきた抗原の一部ペプチドとＭＨＣ分子の複合構造を認識し、細胞内に活性化信号を伝達するに当たって最も重要な役目をするＴｃＲ複合体の信号伝達鎖（chain）であるｚ鎖の細胞質ドメイン（cytoplasmic domain）を選択した。本発明者等は、基礎研究を通してＴｃＲｚ鎖の細胞質ドメインのうち、第１ＩＴＡＭに存在するチロシンアミノ酸をフェニルアラニンに変化させた構造であるｚＡ１Ａ２の形態を細胞内で過剰発現した場合、Ｔ細胞の活性化信号が効果的に遮断できることを立証した［参考文献：Wook-Jin Chae et al. JBC 2003］。このような基礎研究の結果を用いてＭｐｈ−１−ＢＴＭとＴｃＲｚ鎖のｚＡ１Ａ２形態とを融合させた発現ベクターを製作した。その構造を図１２の（ａ）に示す。この発現ベクターを製作するために、ＸｂａI制限酵素、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭの配列、ＴｃＲｚ鎖の細胞質ドメインのＮ末端に該当する配列を含む配列番号１３の５´プライマーを製作し、ｚ鎖のＣ末端に該当する配列とＨｉｎｄIIIを含む配列である配列番号１２の３´プライマーを製作し、また本研究室で製作したｐｃＤＮＡ３−ｚＡ１Ａ２発現ベクター［参考文献：Wook-Jin Chae et al. JBC 2003 submitted］を鋳型として通常のＰＣＲと分子クローニング方法を用いて蛋白質を可溶性の形態で効果的に発現できる発現ベクターｐＧＥＬｙｓＲＳのＡＴＧ−ＬｙｓＲＳの５´に存在するもう一つのＸｂａI制限酵素を取り除いたｐＧＥＬｙｓＲＳ（２）発現ベクターのＸｂａIとＨｉｎｄIII認識部位にクローニングして、ｐＭｐｈ−１−２−ｚＡ１Ａ２発現ベクターを作り出した。

Ｍｐｈ−１−ＢＴＭを用いて生体内の免疫反応が調節可能な他の目的蛋白質を製作するために、Ｔ細胞の活性化過程で負の調節因子（negative regulator）として働くＣＴＬＡ−４蛋白質の細胞質ドメインをＭｐｈ−１−ＢＴＭとの融合パートナーとして選んだ。ＣＴＬＡ−４は、活性化したＴ細胞の表面に存在する細胞膜蛋白質であって、抗原提示細胞（Antigen Presenting Cell）の表面に存在するＢ７群の蛋白質と結合してＴ細胞の活性を阻害する役目をする蛋白質として知られている。Ｍｐｈ−１−ＢＴＭとＣＴＬＡ−４の細胞質ドメインとの融合蛋白質を製作するために、発現ベクターであるｐＭｐｈ−１−ＣＴＬＡ−４を製作した。その構造は図１２の（ｂ）に示す通りである。上記ｐＭｐｈ−１−ｚＡ１Ａ２発現ベクターの製作でのように、ＸｂａI制限酵素、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭ、ＣＴＬＡ−４のＮ末端塩基配列を含む配列番号１５の５´プライマー、及びＨｉｎｄIII制限酵素配列とＣＴＬＡ−４のＣ末端配列を含む配列番号１３の３´プライマーを利用し、本研究室で製作した一次Ｔ細胞のｃＤＮＡ混合物を鋳型として通常のＰＣＲと分子クローニング方法で蛋白質を可溶性の形態で効果的に発現し得る発現ベクターｐＧＥＬｙｓＲＳのＡＴＧ−ＬｙｓＲＳの５′に存在するもう一つのＸｂａI制限酵素を除去したｐＧＥＬｙｓＲＳ（２）発現ベクターのＸｂａIとＨｉｎｄIII位置にクローニングして、ｐＭｐｈ−１−ＣＴＬＡ−４発現ベクターを完成した。

製作されたｐＭｐｈ−１−ｚＡ１Ａ２、ｐＭｐｈ−１−ＣＴＬＡ−４発現ベクターを用いて、大腸菌ＢＬ２１（invitrogen, cat. No.：c7010-03）を熱ショック形質転換法（heat shock transformation）で形質転換させた後、上記の実施例２と同様な方法で融合蛋白質を発現及び分離精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、クマシーブルー染色法で確認した。その結果を図１３の（ａ）と（ｂ）にそれぞれ示す。

分離精製されたＭｐｈ−１−ｚＡ１Ａ２、Ｍｐｈ−１−ＣＴＬＡ−４融合蛋白質の生体内での免疫抑制効果を実験するために、上記実施例９でのように、臓器移植拒否反応の動物モデルとして異種心臓他家移植ラットを用いて［参考文献：Jae-Hyuck Sim et al. PNAS vol. 9, no. 16, 10617-10622, 2002］免疫抑制効果を調べた。その結果は下記表２の通りである。

臓器移植拒否反応の動物モデルに、従来の免疫抑制剤であるＣｓＡを腹腔投与した場合、移植された臓器は１００日以上動き、本発明で製作されたＭｐｈ−１−ｚＡ１Ａ２、Ｍｐｈ−１−ＣＴＬＡ−４融合蛋白質をそれぞれ０．０５μｇ／ｍｌ、又は０．０４μｇ／ｍｌの濃度で腹腔又は皮膚に投与した場合には、何れも１６０日以上動いて、生体内で効果的な免疫抑制効果を表すものと分析された。しかし、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒのみを投与した場合、移植された心臓は、ただ９〜１０日程度しか動かなかった。これは、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭによってＴｃＲｚ鎖の変形された形態であるｚＡ１Ａ２とＣＴＬＡ−４が生体内のＴ細胞内に効果的に伝えられ、Ｔ細胞の活性化を抑制することにより、免疫抑制効果が現れることを示す。

実施例１１：Ｍｐｈ−１−ＢＴＭによる植物細胞カルス（calus）内への
巨大分子の伝達
Ｍｐｈ−１−ＢＴＭによる動物細胞ではない他の細胞内への目的蛋白質の効果的な伝達を調べるために、培養された植物細胞カルス（calus）に１０μＭ濃度のＭｐｈ−１−β−ｇａｌ融合蛋白質を入れてから１時間経過後に、植物カルス内へのβ−ガラクトシダーゼの効果的な伝達を顕微鏡（confocal microscope）で分析し、その結果を図１４に示した。植物カルスの培養は、タバコ葉を採取してオキシンとサイトカインを含むカルス誘導培地で培養した後、生成された植物のカルスをアガー（agar）を含有しないＭＳ培地で培養（suspension culture）して準備した。この結果、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭにより、融合蛋白質を投入してから１５経過後に植物カルス内にβ−ガラクトシダーゼが効果的に伝えられ、特に、矢印で示すように核内にも効果的に伝えられることが確認された。

実施例１２：Ｍｐｈ−１−ＢＴＭによる多様なバクテリア内への
巨大分子の伝達
Ｍｐｈ−１−ＢＴＭによる多様なバクテリア細胞内への目的蛋白質の効果的な伝達を調べるために、培養されたバクテリア細胞としてサルモネラ・チフィミリウム（salmonella typhymirium）、リステリア・モノサイトゲネス（listeria monocytogenesis）、ストレプトコッカス・アウレウス（streptococcus aureus）及び結核菌に１μＭのＭｐｈ−１−β−ｇａｌ融合蛋白質を加え、１時間経過後に細胞内に伝えられたβ−ガラクトシダーゼの活性を基質を用いて測定し、その結果を図１５に示した。これから、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭを用いて巨大分子β−ガラクトシダーゼが多様なバクテリア細胞内に効果的に伝えられていることを確認した。

実施例１３：Ｍｐｈ−１−ＢＴＭを用いた自然状態の構造と機能を
有する医薬学的用途の蛋白質の生産
バクテリア細胞で発現し分離精製されたＭｐｈ−１−ＢＴＭと生体内の生理活性調節蛋白質との融合蛋白質を、生体内で生産された生理活性調節蛋白質の自然状態の構造及び機能を有する蛋白質に変換させるために、バクテリアで生産され分離精製された上記の融合蛋白質を、再びＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞内に伝達した後、ＣＨＯ細胞内で自然状態の構造と機能を表すための完全な蛋白質フォールディングがなされた蛋白質を再び分離及び精製して、これら２つの融合蛋白質について生体内での生理現象調節能力の差異を調べた。本実験のために、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭとヒトインスリンとの融合蛋白質の製作のための発現ベクターであるｐＭｐｈ−１−インスリンを作製した。ＸｂａIの塩基配列、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭ及びヒトインスリンのＮ末端を含む配列番号１７の５´プライマーと、Ｈｉｎｄ制限酵素配列及びヒトインスリンのＣ末端配列を含む配列番号１８の３´プライマーを製作し、本研究室で製作したヒト膵臓（pancease）ｂｅｔａ細胞のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、通常のＰＣＲと分子クローニング方法により上記実施例１０でのように蛋白質を可溶性の形で効果的に発現し得る発現ベクターｐＧＥＬｙｓＲＳのＡＴＧ−ＬｙｓＲＳの５´に存在するもう一つのＸｂａI制限酵素を除去したｐＧＥＬｙｓＲＳ（２）発現ベクターのＸｂａIとＨｉｎｄIII位置にクローニングして、ｐＭｐｈ−１−インスリン発現ベクターを完成した。これを図１６に示す。製作されたｐＭｐｈ−１−インスリンを用いて大腸菌ＢＬ２１を熱ショック形質転換法（heat shock transformation）で形質転換した後、上記実施例２と同様な方法で融合蛋白質を発現及び分離精製し、Ｍｐｈ−１−インスリン融合蛋白質を製作した。バクテリアで発現し分離精製されたＭｐｈ−１−インスリン融合蛋白質（１ｍｇ／ｍｌ）をＣＨＯ細胞内に再び伝達した後、これらＣＨＯ細胞内に存在する蛋白質フォールディングメカニズムを用いて自然状態の構造及び機能を有するものと考えられるＭｐｈ−１−インスリン融合蛋白質を再分離精製し、この融合蛋白質をＭｐｈ−１−インスリン−ＰＲと命名した。これら２つの融合蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ実施した後、クマシーブルー染色法で確認し図１７Ａに示した。これら２つの融合蛋白質がＭｐｈ−１−ＢＴＭによってＪｕｒｋａｔＴ細胞内に効果的に伝えられるかどうかを調べるために、上記実施例３と同様に、これら融合蛋白質及びＭｐｈ−１−ＢＴＭの無い組換えインスリンで培養されたＪｕｒｋａｔＴ細胞を処理した後、インスリンに対するｍＡｂを用いてインスリン蛋白質の細胞内伝達効果を細胞内染色（intracellular staining）で比較した。その結果を図１７Ｂに示す。この結果から分かるように、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭを有しない組換えインスリンの場合、ＪｕｒｋａｔＴ細胞内に殆ど伝えられていない反面、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭに連結された２つの融合蛋白質Ｍｐｈ−１−インスリン、Ｍｐｈ−１−インスリン−ＰＲは、両方とも細胞内に効果的に伝えられた。

実施例１４：Ｍｐｈ−１に連結されたインスリン融合蛋白質による
生体内血糖低下効果
上記実施例１４で製作された組換えインスリン、Ｍｐｈ−１−インスリン及びＭｐｈ−１−インスリン−ＰＲの生体内での血糖低下効果を分析するために、インスリン依存性糖尿病の動物モデルであるＳＴＺ（Streptozotocin）誘導糖尿マウスを用いた。３日間絶食させた後、ＳＴＺ（Sigma Chemical Co, St Louis, USA）６０ｍｇ／ｋｇを静脈注射によって投与した。ポリユリア及び他の糖尿病症状とともに血糖が２０ｍｍｏｌ／Ｌ又はそれ以上になった場合をインスリン依存性糖尿マウスとして分類した。全ての生体内実験は、糖尿病が誘導されてから２週経過後に実施された。上記実施例１３の組換えインスリン、Ｍｐｈ−１−インスリン及びＭｐｈ−１−インスリン−ＰＲを腹腔注射を通して１−１０ｍＭの濃度で上記糖尿マウスに投与した後、血液内のグルコース濃度を調べた。血糖の分析は、麻酔したマウスから０．２ｍｌ程度の血液を採取し、１３，０００ｒｐｍの速度で３分間遠心分離した後、１５ｍｌ程度の血漿を１．５ｍｌのグルコースキット試薬（BiosystemSA, Barcelona, Spain）に加え、３７℃の水槽に１０分程度インキュベーションした。血糖分析は、分析器（Quik-Lab，Ames，Miles Inc. Elkart，Indiana，USA）を用いて行なわれた。その結果を下記の表３に示す。

上記の表３から明らかなように、組換えインスリンの場合に血糖を約５０％程度、Ｍｐｈ−１−インスリンの場合は約７０％程度減少したが、ＣＨＯ細胞内に伝えられ自然状態の構造及び機能を有するものと推測されるＭｐｈ−１−インスリン−ＰＲの場合には、９０％以上の血糖減少効果が現れた。このように、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭによって動物細胞内に伝えられた融合蛋白質は、細胞内の蛋白質フォールディングメカニズム（folding mechanism）により自然状態の構造及び機能に変換されることと考えられ、Ｍｐｈ−１−ＢＴＭを用いて種々の医薬学的用途の蛋白質をバクテリアから量産し、これら組換え蛋白質を、元より生体内でこれら蛋白質を生産する細胞の内にＭｐｈ−１−ＢＴＭを用いて伝達させた後、再びこれら細胞から再分離、精製して基礎的及び臨床的な治療剤として使用した場合には、卓越した効果を奏することと期待される。

このように、本発明の配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドＭｐｈ−１は、生物学的活性を有する生理機能調節分子を生体内外で真核若しくは原核細胞内の細胞質、細胞小器官または核内に、筋肉内、腹膜内、静脈内、経口、鼻内、皮下、皮内、粘膜、及び吸入などを含む様々な経路を通して効果的に伝達することができるため、蛋白質新薬の開発、組換えワクチンの開発、ＤＮＡ又はＲＮＡワクチンの開発；蛋白質、遺伝子、化学化合物を用いた疾病の新しい治療法；自然状態の構造及び機能を有する医薬学蛋白質の生産；及び新しい薬物伝達システムの開発；に有用である。

図１Ａは本発明のＭｐｈ−１−ＢＴＭを用いた発現ベクターp Ｍｐｈ−１−β−ｇａｌの構造を示す図面である。図１Ｂは図１Ａの発現ベクターを制限酵素で処理した後のアガロースゲル（agarose gel）を示す図面である。図２は発現ベクターp Ｍｐｈ−１−β−ｇａｌ融合蛋白質のクマシーブルー染色結果を示す図面である図３ＡはＭｐｈ−１−β−ｇａｌ融合蛋白質の細胞内伝達効果を示す結果である。図３Ｂは４℃及び３７℃でのＭｐｈ−１−β−ｇａｌ（１ｍｇ／ｍｌ）融合蛋白質の効果的な細胞内伝達を示す図面である。図４Ａは発現ベクターｐＴａｔ−β−ｇａｌの構造を示す図面である。図４ＢはＭｐｈ−1−β−ｇａｌ融合蛋白質及びＴａｔ−β−ｇａｌ融合蛋白質の細胞内への分子伝達結果を比較して示す図面である。図５ＡはＭｐｈ−１−ＢＴＭによるβ−ｇａｌの多様な臓器内への伝達効果を示す図面である。図５ＡはＭｐｈ−１−ＢＴＭによるβ−ｇａｌの多様な臓器内への伝達効果を示す図面である。図５ＡはＭｐｈ−１−ＢＴＭによるβ−ｇａｌの多様な臓器内への伝達効果を示す図面である。図５ＢはＭｐｈ−１−ＢＴＭによるｅＧＦＰの脾臓細胞内への伝達効果を示す図面である。図５ＣはＭｐｈ−１−ＢＴＭを用いてβ−ｇａｌ蛋白質を生体内で多様な投与経路を通して血液内Ｔ細胞に伝達した結果を示す図面である。図６Ａは組換え発現ベクターｐＭｐｈ−１−β−ｇａｌ−Ｂ７.１の構造を示す図面である。図６Ｂは目的蛋白質であるβ−ｇａｌがＴ細胞に特異的に伝えられたのを示す図面である。図７は組換え発現ベクターｐＭｐｈ−1−Ｇａｌ４の構造を示す図面である。図８は組換え発現ベクターｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳ（Ｇａｌ４結合配列）の構造を示す図面である。図９ＡはＭｐｈ−１−ＢＴＭによる、発現ベクターｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳのＴ細胞内への伝達を示す図面である。図９ＢはＭｐｈ−１−ＢＴＭによる、生体内での血液内Ｔ細胞及び抗体形成細胞（splenocyte）への発現ベクターｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳの伝達及び発現効果を示す図面である。図１０Ａは組換え発現ベクターｐＭｐｈ−１−Ｇａｌ４−Ｂ７.１の構造を示す図面である。図１０Ｂは組換え発現ベクターｐＬＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳの構造を示す図面である。図１０ＣはＭｐｈ−１−ＢＴＭによる発現ベクターｐＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳの生体内Ｔ細胞特異的伝達効果を示す図面である。図１０ＤはＭｐｈ−１−ＢＴＭによる発現ベクターｐＬＣＤ８−ζ−５ＸＧＢＳの生体内Ｔ細胞特異的発現効果を示す図面である。図１１ＡはＭｐｈ−１−ＢＴＭと免疫抑制剤のトウトマイセチン（TMC）とを連結するｐＨ感受性化学的リンカーの構造を示す図面である。図１１ＢはＭｐｈ−１−ＢＴＭによるＴＭＣのＪｕｒｋａｔＴ細胞内への伝達を示す図面である。図１２はＭｐｈ−１−ＢＴＭによる発現ベクターｐＭｐｈ−１−ｚＡ１Ａ２の構造（ａ）及びｐＭｐｈ−１−ＣＴＬＡ−４の構造（ｂ）をそれぞれ示す図面である。図１３は分離精製された融合蛋白質Ｍｐｈ−１−ｚＡ１Ａ２に対するクマシーブルー染色結果（ａ）及びＭｐｈ−１−ＣＴＬＡ−４に対するクマシーブルー染色結果（ｂ）をそれぞれ示す図面である。図１４はＭｐｈ−１−ＢＴＭを用いたβ−ｇａｌ蛋白質の植物カルス（calus）細胞内への伝達効果を示す図面である。図１５はＭｐｈ−１−ＢＴＭを用いたβ−ｇａｌ蛋白質のバクテリア、サルモネラ、ストレプトコッカス及び結核菌内への伝達効果を示す図面である。図１６はＭｐｈ−１−ＢＴＭとインスリンとの融合蛋白質を作製するための発現ベクターｐＭｐｈ−１−インスリンの構造を示す図面である。図１７Ａは分離精製された融合蛋白質Ｍｐｈ−１−インスリン及びＭｐｈ−１−インスリン−ＰＲに対するクマシーブルー染色結果を示す図面である。図１７Ｂは融合蛋白質組換えインスリンであるＭｐｈ−１−インスリン及びＭｐｈ−１−インスリン−ＰＲによるＪｕｒｋａｔＴ細胞内への伝達効果を示す図面である。

配列表

Claims

真核若しくは原核細胞の細胞内に生物学的に生理機能調節分子を伝達するための、配列番号１のアミノ酸配列から成るペプチド。
生理機能調節分子が蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、脂肪、及び化学化合物からなる群から選ばれた一つ以上の物質であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
原核細胞内、又は、筋肉内（intramuscular）、腹膜内（intraperitoneal）、静脈内（intravein）、経口（oral）、鼻内（nasal）、皮下（subcutaneous）、皮内（intradermal）、粘膜（mucosal）若しくは吸入（inhale）を含む投与経路により真核細胞内に伝達されることを特徴とする請求項１又は２記載のペプチド。
上記請求項１乃至３の何れか一項に記載のペプチドをコーディングするＤＮＡ、生理機能調節分子である同種又は異種の１つ以上の蛋白質をコーディングするＤＮＡ、及び作動可能に結合された発現調節配列を含む組換え発現ベクター。
上記請求項１乃至３の何れか一項に記載のペプチド；特定ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列と結合するＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合蛋白質をコーディングするＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、又は細胞内に伝達しようとする目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ；特定ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合蛋白質と選択的に結合する核酸配列を１つ以上連続して含有するＤＮＡ及び／又はＲＮＡ断片；及び作動可能に結合された発現調節配列；を含む組換え発現ベクター。
発現調節配列が、目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡが選択的に伝達され発現される細胞、組織、或いは臓器に特異的なプロモーター又はエンハンサーを含む調節ドメイン（regulatory domain）であることを特徴とする請求項５に記載の組換え発現ベクター。
原核細胞、又は、筋肉内、腹膜内、静脈内、経口、鼻内、皮下、皮内、粘膜、若しくは吸入を含む投与経路により真核細胞へのベクターの伝達が行なわれることを特徴とする請求項４乃至６の何れか一項に記載の組換え発現ベクター。
細胞表面に存在するプロテアーゼによって特異的に認識され切断される部位をコーディングする核酸配列；及び目的蛋白質が伝達される細胞、組織或いは臓器に特異的に存在する受容体（receptor）と特異的に結合可能なリガンドの細胞外部分をコーディングするＤＮＡ、又は上記受容体と選択的に結合する単クローン抗体（ｍＡｂ）をコーディングするＤＮＡ；を含むことを特徴とする請求項４乃至６の何れか一項に記載の組換え発現ベクター。
細胞表面に存在する上記プロテアーゼは、ＭＭＰ（Matrix Metallo Protease）であることを特徴とする請求項８に記載の組換え発現ベクター。
上記単クローン抗体（ｍＡｂ）は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ´）断片、一本鎖Ｆｖ、又はヒト化した単クローン抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の組換え発現ベクター。
目的蛋白質の精製を容易にするためのタグ（tag）をコーディングするＤＮＡを更に含むことを特徴とする請求項４乃至１０の何れか一項に記載の組換え発現ベクター。
６個の連続したヒスチジンコドンをコーディングする遺伝子を更に含むことを特徴とする請求項１１に記載の組換え発現ベクター。
細胞内酵素によって特異的に認識され切断されるアミノ酸配列をコーディングするＤＮＡを更に含むことを特徴とする請求項４乃至１２の何れか一項に記載の組換え発現ベクター。
細胞内酵素によって特異的に認識され切断されるアミノ酸配列が、エンテロキナーゼ切断部位（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）、又はＴｅｖ切断部位（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly）であることを特徴とする請求項１３に記載の組換え発現ベクター。
蛋白質の構造と機能の安定、又は蛋白質の柔軟性（flexibility）のために、１つ以上のグリシン、アミノ酸ＡＹＹを含むスペーサ（spacer）アミノ酸をコーディングするＤＮＡを更に含むことを特徴とする請求項４乃至１４の何れか一項に記載の組換え発現ベクター。
i）上記請求項１に記載のペプチド；及び、ii）蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、脂肪及び化学化合物からなる群から選ばれた１つ以上の生理機能調節分子；が融合されるか、或いは化学的及び／又は物理的な方法で結合された生体分子伝達複合体。
i）上記請求項１に記載のペプチド；
ii）生体内（in vivo）又は生体外（in vitro）において生理機能調節に関与する同種または異種の１つ以上の目的蛋白質、及び細胞表面に存在するプロテアーゼによって特異的に切断されるアミノ酸配列の融合蛋白質；及び
iii）目的蛋白質が選択的に伝達される細胞、臓器、又は組織に存在する受容体と選択的に結合するリガンドの細胞外部分（ecto domain）又は単クローン抗体が、化学的、物理的、共有又は非共有結合によって形成された生体分子伝達複合体。
細胞表面に存在する上記プロテアーゼは、ＭＭＰ（Matrix Metallo Protease）であることを特徴とする請求項１７に記載の生体分子伝達複合体。
上記単クローン抗体（ｍＡｂ）は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ´）断片、一本鎖Ｆｖ、又はヒト化した単クローン抗体であることを特徴とする請求項１７又は１８に記載の生体分子伝達複合体。
融合蛋白質の精製を容易にするためのタグ（tag）配列を更に含むことを特徴とする請求項１７乃至１９の何れか一項に記載の生体分子伝達複合体。
６個の連続したヒスチジンを更に含むことを特徴とする請求項２０に記載の生体分子伝達複合体。
融合蛋白質から不要な部分を取り除くために、細胞内、細胞内小器官又は核内に存在する酵素によって特異的に切断されるアミノ酸配列を更に含むことを特徴とする請求項２０に記載の生体分子伝達複合体。
アミノ酸配列は、エンテロキナーゼ切断部位であるAsp-Asp-Asp-Asp-Lys、又は、Ｔｅｖ切断部位であるGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Glyであることを特徴とする請求項２２に記載の生体分子伝達複合体。
上記目的蛋白質は、翻訳後にユビキチン化（ubiquitination）、ホスホリル化（phosphorylation）、ファネシレーション（farnesylation）、又はアシル化（fatty acylation）を含む翻訳後修飾（Post Translational Modification）によって修飾されることを特徴とする請求項２２又は２３に記載の生体分子伝達複合体。
上記請求項４乃至１５に記載の組換え発現ベクターにより、真核若しくは原核細胞を含む宿主細胞で発現された融合蛋白質。
化学的及び／又は物理的な方法により、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、脂肪又は化学化合物からなる群から選ばれた１つ以上の追加的な生理機能調節分子と結合することを特徴とする請求項２５に記載の融合蛋白質。
化学的及び／又は物理的な方法が、共有又は非共有の結合による直接結合であるか、若しくは媒介体を用いた間接結合であることを特徴とする請求項２６に記載の融合蛋白質。
請求項２５に記載の融合蛋白質を含む免疫抑制剤。
上記請求項３に記載のペプチドを、原核細胞内、又は、筋肉内、腹膜内、静脈内、経口、鼻内、皮下、皮内、粘膜若しくは吸入を含む投与経路によりヒト以外の動物の真核細胞内に伝達する方法。
上記請求項１６乃至２３の何れか一項に記載の生体分子伝達複合体を細胞の培養物と混合培養する段階を含む、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、脂肪及び化学化合物からなる群から選ばれた１つ以上の生理機能調節分子を真核若しくは原核細胞の細胞内に伝達する方法。
上記請求項２５乃至２７の何れか一項に記載の融合蛋白質を、細胞の培養物と混合培養する段階を含む、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、脂肪及び化学化合物からなる群から選ばれた１つ以上の物質を真核若しくは原核細胞の細胞内に伝達する方法。
i）細胞内に伝達しようとする目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合蛋白質が特異的に結合するＤＮＡ／ＲＮＡ配列を１つ以上連続して含有するＤＮＡ及び／又はＲＮＡ断片、及び作動可能に結合された発現調節配列を含む第１の組換え発現ベクターを製造する段階；
ii）配列番号１のペプチド、上記段階i）の第１の組換え発現ベクター中のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ断片に含まれた、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合蛋白質が特異的に結合する特定ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ塩基配列と選択的に結合可能なＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合蛋白質をコーディングするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む第２の組換え発現ベクターを製造する段階；
iii）上記第２の組換え発現ベクターを用いて宿主細胞から融合蛋白質を収得する段階；
iv）上記段階iii）の融合蛋白質と、上記段階i）の第１の組換え発現ベクターとを結合反応させ、融合蛋白質及び目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの結合体を収得する段階；及び
v）上記結合体を目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを伝達しようとする細胞と混合し、混合培養する段階；を含み、目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを真核若しくは原核細胞の細胞内に伝達する方法。
目的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを、インターロイキン−４、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、及びγ−インターフェロンを含むサイトカイン，ケモカイン、及び成長因子（ＥＧＦ）を含む群から選択されるいずれか一つの生理機能調節因子と一緒に伝えることを特徴とする、請求項２９乃至３２の何れか一項に記載の方法。
インビトロにおいて、i）上記請求項１に記載のペプチドと目的蛋白質との融合蛋白質を第１の宿主細胞において発現させ、該細胞から収得する段階；
ii）上記段階i）の融合蛋白質を第２の宿主細胞に伝達する段階；及び、
iii) 第２の宿主細胞から自然状態のフォールディング構造及び機能を有する目的蛋白質を分離精製する段階；を含む目的蛋白質を生産する方法。
上記請求項３４に記載の方法から分離精製された自然状態の構造及び機能を有する目的蛋白質。