JP2005531284A - 生体分子伝達モチーフMph−1−BTM及びその利用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
発現ベクターの製造
マウス転写因子であるMph−1(GeneBank Code:U63386)のN−末端より858番目アミノ酸であるチロシンから868番目アミノ酸であるアルギニンまでのペプチドをコーディングする塩基配列と、リポーターとして使われるβ−ガラクトシダーゼをコーディングする塩基配列とを結合させるために、Mph−1のN−末端より858番目アミノ酸であるチロシンから868番目アミノ酸であるアルギニンまでの配列とクローニングのための制限酵素BamHIを含む配列番号2のプライマー、及びβ−ガラクトシダーゼの3´末端に該当する配列とクローニングのための制限酵素BglIIを含む配列番号3のプライマーを合成し、β−ガラクトシダーゼ蛋白質の全体遺伝子を含むpIND/lacZベクター(invitrogen社より入手)を鋳型としてpfu turbo DNAポリメラーゼ(Stratagene, cat. # 600252-51)を使用してPCRを行なった。
実施例1で製造した発現ベクターpMph−1−β−galを用いて大腸菌DH5α(ATCC No. 53863)を熱ショック形質転換法(heat shock transformation)によって形質転換した後、この形質転換された大腸菌を100mlのLB培地に2mlの量で接種し、37℃で12時間撹拌しながら前培養を行なった。その後、これを再び1000mlのLB培地(カゼインのパンクレアチックダイジェスト(pancreatic digest)10g、酵母エキス5g、塩化ナトリウム10g)にそれぞれ接種し、37℃で4時間培養した後、1mM濃度のIPTG(イソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド、GibcoBRL cat. # 15529-019)を添加してlacオペロンの発現を誘導し、8時間培養して融合蛋白質の発現を誘導した。上記培養液を4℃、6,000rpmで20分間遠心分離してペレットのみを残して上澄液を取り除き、1mg/mlのリゾチーム(Sigma, cat. # L-7651)を含む10mlの緩衝溶液1(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0)にペレットを懸濁してから氷に30分間放置した後、超音波粉砕機(Heat systems、ultrasonic processor XL)を用いて、累積の超音波注入時間が3分になるまで300Wの出力で超音波を10秒間注入し10秒間冷却する過程を繰り返した。溶出液を4℃、12,000rpmで20分間遠心分離して大腸菌の破砕物を除去し、純粋な溶出液のみを分離した。分離した溶出液に2.5mlの50%Ni2+−NTAアガローススラリー(Qiagen, cat# 30230)を加え、4℃、200rpmで1時間撹拌して融合蛋白質とNi2+−NTAアガロースとを結合させ、この混合液をクロマトグラフィー用の0.8×4cmコラム(BioRad,cat.# 731-1550)に注ぎ入れた。4mlの緩衝溶液2(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mMイミダゾール、pH8.0)を用いて2回洗浄した後、0.5mlの緩衝溶液3(50mM NaH2PO4、300mM NaCl250mMイミダゾール、pH 8.0)にて4回にわたって融合蛋白質を分画し、分離精製されたMph−1−β−gal融合蛋白質をSDS−PAGE実施した後、クマシーブルー染色法で確認した。それを図2に示す。同図において、第1の列は標準分子量蛋白質、第2の列は融合蛋白質Mph−1−β−galである。
10%FBS(Fetal Bovine Serum)DMEMに培養したHUVEC (ATCC:CRL-1730)、HeLa(ATCC:CCL-2)、293(ATCC:CRL-1573)をLab−tekIIchamber sideに、10%FBS RPMIに培養したJurkat細胞(ATCC:CRL-10915)はポリ−L−リジンコーティングスライドに、それぞれ2Х105ずつ分注し、上記の方法で精製されたMph−1−β−ガラクトシダーゼ蛋白質を0.5μMの濃度で37℃、30分間5%Co2インキュベータで処理した後、上澄液を除去した。氷冷PBSで4回洗浄した後、2%ホルムアルデヒド溶液で10分間固定させた。固定液を取り除いた後、再び氷冷PBSで4回洗浄し、β−ガラクトシダーゼ染色溶液(RoChe. Co.)を700μl添加し、37℃、5%CO2インキュベータで45分間反応させた後、再び上澄液を除去して氷冷PBSで4回洗浄した。その後、70%グリセロールでマウンティング(mounting)を行い、顕微鏡で観察して写真撮影をし、その結果を図3Aに示した。その結果、Mph−1と融合結合されたβ−galは、上記4つの細胞内に効率よく伝えられたが、Mph−1と結合されていないβ−gal蛋白質は細胞内に全く伝えられなかった。また、かかるMph−1−β−galの細胞内伝達が、受容体−媒介エンドサイトーシスによるものか否かを区分するために、37℃及び4℃にて融合蛋白質が細胞内に効果的に伝達されるかどうかを調べた。
既存のPTDであるTatと本発明のMph−1とによる蛋白質の細胞内伝達効果を比較するために、pTat−β−galDNA構造を製作した。HIVのTat蛋白質のN−末端より47番目アミノ酸であるチロシンから57番目アミノ酸であるアルギニンまでのペプチドをコーディングする塩基配列と、リポーターとして使われるβ−ガラクトシダーゼをコーディングする塩基配列とを結合させるために、TatのN−末端より47番目アミノ酸であるチロシンから57番目アミノ酸であるアルギニンまでの塩基配列とクローニングのための制限酵素BamHIを含む配列番号4のプライマーを合成し、β−ガラクトシダーゼの3´末端に該当する塩基配列及びBglII制限酵素に該当する配列番号3のプライマーを使用し、β−ガラクトシダーゼ蛋白質の全体遺伝子を含むpIND/lacZベクター(invitrogen社より入手)を鋳型としてpfu turbo DNAポリメラーゼ(Stratagene, cat. # 600252-51)を用いてPCRを行なった。PCRで収得した反応生成物を制限酵素BamHIとBglIIで切断した後、Quiaquick PCR精製キット(QIAGEN, cat. # 28104)を用いて精製し、ゲル抽出法で精製したプラスミドpTrcHisB(invitrogen, Cat. No V360-20B)のBglII位置にクローニングして組換え発現ベクターを製造し、これをpTat−β−galと命名した。図4Aはその構造を示す図面である。実施例2に提示した方法によりTat−β−gal融合蛋白質を分離精製した後、実施例3に提示した方法により0.1μg/mlと0.5μg/mlとの異なる濃度でJurkatT細胞内へのTat−β−gal及びMph−1−β−galの伝達効果を比較した。図4Bに示すように、上記2つの異なる濃度の下で、Mph−1はTatよりも随分効果的にβ−galが細胞内に伝達され、特に、0.1μg/mlの低い濃度下での伝達効果の差が著しかった。
Mph−1による目的蛋白質の細胞内伝達効果を生体内で確認するために、実施例2で分離精製したMph−1−β−gal融合蛋白質を6週齢のC57BL/6マウスに、750μgのMph−1−β−ガラクトシダーゼ蛋白質をPBSと混合して500μlの体積で腹腔内に1回/1日で3日間注入し、対照マウスには腹腔に同量のPBSのみを注射した。最終の腹腔注射から4時間経過後にマウスを解剖し、各臓器を2mM MgCl2を含むPBSで洗浄した後、氷冷5%ホルマリンで固定させた。固定後、PBSで5回洗浄し、各臓器をβ−gal染色溶液(Roche. Co.)に浸して12時間後に色の変化を観察した。図5Aに示すように、腎臓、脳、肝、肺及び心臓にβ−gal蛋白質が効果的に伝達されていることから見て、生体内でもMph−1−BTMによって目的蛋白質が各臓器内に効果的に伝達されることが確認された。
実施例2で製造された目的蛋白質Mph−1−β−galを特定細胞にのみ選択的に伝達するために、伝達しようとする細胞、組織または臓器に特異的に存在するリガンド又は受容体を利用した。その一例として、目的蛋白質をT細胞に特異的に伝達するために、Mph−1−β−galの3´部分に、細胞の細胞外基質(extracellular matrix)に存在しながら細胞膜に付着しているマトリクスメタロプロテアーゼ(Matrix Metallo Protease, MMP)の切断部位のアミノ酸配列を挿入し、またその3´の後方にT細胞に特異的に存在する受容体CD28のリガンドであるB7.1をクローニングして挿入した発現ベクターp Mph−1−β−gal−B7.1を製作した。制限酵素BamHIとB7.1のN末端配列を含む配列番号6のプライマー、及び制限酵素BglIIとB7.1のC末端配列を含む配列番号7のプライマーを使用し、本研究室で製作したヒト一次(primary)T細胞のcDNA混合物を鋳型として上記実施例1と同様に、PCR及び分子クローニング方法を用いて発現ベクターpMph−1−β−gal−B7.1を製作した。図6Aは発現ベクターp Mph−1−β−gal−B7.1の構造を示す図面である。p Mph−1−β−gal−B7.1発現ベクターを用いて上記実施例2と同様にバクテリアDH5αを形質転換した後、これらバクテリアを培養してMph−1−β−gal−B7.1融合蛋白質を分離精製した。この融合蛋白質を実験用マウスにI.P.法で注射し、4時間後に血液からT細胞を分離してβ−galの活性を調べた。図6Bの結果から明らかなように、T細胞で高いβ−galの活性が現れたが、B細胞では活性が殆ど現れなかった。この結果は、融合蛋白質のB7.1と、T細胞のCD28又はCTLA−4とが結合した後、T細胞の表面に存在しているMMPによって融合蛋白質が切断され、その後Mph−1−β−gal融合蛋白質がT細胞内に選択的に伝達されたことを示す。
(段階1)Mph−1とGal4とが融合した遺伝子を含む
発現ベクターの製造
実施例1で製作されたp Mph−1−β−galベクターを制限酵素XbaI及びBglIIで処理してβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を分離し、DNA結合蛋白質であるGAL4のN末端の配列とXbaI制限酵素を有する配列番号8のプライマー、及びGAL4のC末端配列とBglII制限酵素を有する配列番号9のプライマーを利用し、発現ベクターpcDNAGal4を鋳型として実施例1でのような通常のPCR及び分子クローニング法でpMph−1−Gal4プラスミドを製作した。図7は発現ベクターp Mph−1−Gal4の構造を示す。
DNA塩基配列(GBS)を含む発現ベクターpCD8−z−5XGBSの製造
上記段階1のMph−1−Gal4との効率的な結合のために、CD8−ζがpcDNA3発現ベクター(invtrogen社より)のXbaI及びBamHI制限酵素認識部位に挿入されたpcDNA3−CD8−zのStuI制限酵素認識部位に、Gal4が選択的に結合する塩基配列であるGBS(Gal4結合配列)が5回繰り返されるようにクローニングしたpCD8−z−5XGBSを製作した。
上記段階1で製造された発現ベクターpMph−1−Gal4を用いて、実施例2と同様な方法で発現及び精製されたMph−1−Gal4融合蛋白質に上記段階2で製造されたpCD8−ζ−5XGBS DNAを常温で結合させ、Mph−1−Gal4融合蛋白質のGal4と、pCD8−ζ−5XGBSが有する5個のGal4結合部位であるGBSとを相互結合させた。連結された結合体をPBSで混ぜた後、107一次T細胞を接種して反応させ、その後、37℃で48時間培養して細胞内に伝えられたDNA構造によるCD8−ζ融合体の過剰発現を誘導した。細胞表面におけるCD8−ζ融合蛋白質の過剰発現の有無を確認するために、CD8分子に対する単クローン抗体OKT8(ATCC No CRL-8014)を用いてFACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter)分析法(参考文献:Current Protocol for Immunology)で発現を調べ、その結果を図9Aに示した。図9Aに示すように、Mph−1分子伝達ペプチドが融合されたCD8−ζ蛋白質が細胞内に伝えられたことが確認された。陰性対照区として、pCD8−ζ−5XGBSを含まないMph−1−Gal4融合蛋白質、またはpCD8−ζ−5XGBS自体のみを反応させたT細胞でのCD8−ζキメラ分子(chimeric molecule)の発現をFACSで分析した。この結果から明らかなように、Mph−1−BTMと融合したDNA結合蛋白質(binding protein)は、細胞内に伝達しようとするDNA構造に人為的に挿入させたDNA結合蛋白質の結合配列と相互結合し、Mph−1−BTMにより目的DNA構造を細胞内に効率的に伝達し発現させることができる。
(段階1)Mph−1、Gal4、B7.1が融合した遺伝子を
含む発現ベクターの製造
分子伝達ペプチドMph−1を用いてpCD8−ζDNAをT細胞に特異的に伝達するために実施例7で製造された発現ベクターpMph−1−Gal4の3´部分に、実施例6でのようにT細胞に選択的に存在するマトリクスメタロプロテアーゼ切断部位をクローニングした後、B7.1の細胞外部分を、配列番号6及び7のプライマーを利用し本研究室で製作したT細胞cDNA混合物を鋳型として、上記実施例1と同様に通常のPCR及び分子クローニング法でクローニングして挿入したpMph−1−Gal4−B7.1DNA構造を製作した。図10Aはその構造を示す。
実施例7の段階2で製作されたpLCD8−ζ−5XGBSのプロモーターであるCMVプロモーターの代わりに、T細胞に特異的に遺伝子を発現させるlckプロモーターを、HindIII制限酵素認識部位を用いて通常の分子クローニング方法で置換した。図10Bはその発現ベクターであるpLCD8−ζ−5XGBSの構造を示す図面である。
DNAのT細胞特異的な伝達
上記段階1で製造された発現ベクターpMph−1−Gal4−B7.1DNAを用いて上記実施例7の段階2で製作された発現ベクターpCD8−ζ−5XGBSを生体内でT細胞に選択的に伝達するために、実施例7と同様な方法で発現及び精製されたMph−1−Gal4−B7.1融合蛋白質と発現ベクターpCD8−ζ−5XGBSとの結合体を常温で誘導した。連結された結合体をPBSで混ぜた後、腹腔内に注射し、48時間経過後に血液内のT細胞とB細胞をそれぞれ抗−CD2 mAb、抗−B220 mAb、MACSを用いて分離した後、これら細胞で発現している表面キメラ分子であるCD8−ζの発現程度を抗−CD8 mAbであるOKT8とFACSを利用して分析した。その結果を図10Cに示す。この結果は、Mph−1とGal4を利用して生体内に伝えられた発現ベクターpCD8−ζ−5XGBSは、融合蛋白質Mph−1−Gal4−B7.1におけるB7.1の細胞外部分と、T細胞の表面に存在するCD28またはCTLA−4との結合によってT細胞の周囲に移動した後、T細胞の表面に選択的に存在するMMPにより切断され、その後、Mph−1−Gal4とpCD8−ζ−5XGBSとの結合体が周囲に多く存在するT細胞の内に伝えられて発現していることを示す。しかし、B細胞では発現ベクターが伝えられず、CD8−zキメラ分子は殆ど発現しなかった。
DNAの
T細胞選択的な発現
上記実施例7の段階2で製造されたMph−1−Gal4融合蛋白質を用いて上記段階2で製作された発現ベクターpLCD8−ζ−5XGBSをT細胞に特異的に発現させるために、上記段階3と同様に室温で結合誘導されたMph−1−Gal4とpLCD8−ζ−5XGBSとの結合体を生体内に伝達し、48時間経過後に血液中のB細胞とT細胞を分離し、これら細胞の表面に発現する表面キメラ蛋白質であるCD8−ζの発現程度をOKT8及びFACSを利用して分析した。その結果を図10Dに示す。この結果から、T細胞に選択的に発現を誘導するLckプロモーターによって生体内に伝えられた発現ベクターpLCD8−ζ−5XGBSは、T細胞にのみ選択的に発現していることが分かる。
生体内の様々な生理作用が調節できる化学化合物をMph−1−BTMによって生体内に効果的に伝達するために、Mph−1とB7.1の細胞外部分との融合蛋白質を製作すべく、BamHI制限酵素、Mph−1のBTM及びB7のN末端塩基配列を含む配列番号11のプライマー、制限酵素BglIIの配列とB7のC末端塩基配列を含む配列番号12のプライマーを使用し、本研究室で製作したマウスT細胞cDNAライブラリーを鋳型として発現ベクターpMph−1−B7.1を製作した。Mph−1とB7.1との間にT細胞に選択的に発現するMMPによる切断部位を挿入した。DH5αで発現し分離精製された融合蛋白質Mph−1−B7.1が、図11Aに示すpH感受性化学的リンカーを用いてTMCと化学的に連結された構造を製作した。TMC−Mph−1−B7.1(0.1μg/ml)結合構造をJurkatT細胞に処理してから5時間経過後に、TMCによって誘導されたJurkatT細胞のアポトーシスをPI染色[参考文献:I. Schmid et. al Cytometry 13:204-208(1992)]及びFACSを利用して分析し、その結果を図11Bに示した。これから、Mph−1−B7融合蛋白質によってJurkatT細胞内に伝えられたTMCは、アポトーシスを効率よく引き起こすことが確認された。JurkatT細胞で効率よくアポトーシスを引き起こすTMC−Mph−1−2−B7.1が、生体内でもT細胞に選択的に伝えられアポトーシスを誘導することで、免疫抑制効果を奏することができるかを分析するために、臓器移植拒否反応のモデルとして異種心臓他家移植ラット(rat heterocardiac allograft)を用いて[参考文献:Jae-Hyuck Sim et al. PNAS vol. 99, no. 16, 10617-10622, 2002]免疫抑制効果を調べた。その結果を下記の表1に示す。
蛋白質薬物による生体内での免疫抑制効果
上記の何れの実施例からも確認されるように、Mph−1−BTMは、生体内の生理現象を調節する生理調節蛋白質、DNA及び/又はRNA、及び化学的薬物を共有又は非共有の結合によって結合させ、生体内外で種々の臓器及び臓器内の細胞の中に効果的に伝達することができる。従って、Mph−1−BTMを利用して生体内の免疫反応が調節可能な細胞内信号伝達調節蛋白質の野生型(wild type)または変形された形態を細胞内に伝達することにより、生体内の免疫反応が調節可能な新しい蛋白質薬物の作製を試みた。
巨大分子の伝達
Mph−1−BTMによる動物細胞ではない他の細胞内への目的蛋白質の効果的な伝達を調べるために、培養された植物細胞カルス(calus)に10μM濃度のMph−1−β−gal融合蛋白質を入れてから1時間経過後に、植物カルス内へのβ−ガラクトシダーゼの効果的な伝達を顕微鏡(confocal microscope)で分析し、その結果を図14に示した。植物カルスの培養は、タバコ葉を採取してオキシンとサイトカインを含むカルス誘導培地で培養した後、生成された植物のカルスをアガー(agar)を含有しないMS培地で培養(suspension culture)して準備した。この結果、Mph−1−BTMにより、融合蛋白質を投入してから15経過後に植物カルス内にβ−ガラクトシダーゼが効果的に伝えられ、特に、矢印で示すように核内にも効果的に伝えられることが確認された。
巨大分子の伝達
Mph−1−BTMによる多様なバクテリア細胞内への目的蛋白質の効果的な伝達を調べるために、培養されたバクテリア細胞としてサルモネラ・チフィミリウム(salmonella typhymirium)、リステリア・モノサイトゲネス(listeria monocytogenesis)、ストレプトコッカス・アウレウス(streptococcus aureus)及び結核菌に1μMのMph−1−β−gal融合蛋白質を加え、1時間経過後に細胞内に伝えられたβ−ガラクトシダーゼの活性を基質を用いて測定し、その結果を図15に示した。これから、Mph−1−BTMを用いて巨大分子β−ガラクトシダーゼが多様なバクテリア細胞内に効果的に伝えられていることを確認した。
有する医薬学的用途の蛋白質の生産
バクテリア細胞で発現し分離精製されたMph−1−BTMと生体内の生理活性調節蛋白質との融合蛋白質を、生体内で生産された生理活性調節蛋白質の自然状態の構造及び機能を有する蛋白質に変換させるために、バクテリアで生産され分離精製された上記の融合蛋白質を、再びCHO(Chinese Hamster Ovary)細胞内に伝達した後、CHO細胞内で自然状態の構造と機能を表すための完全な蛋白質フォールディングがなされた蛋白質を再び分離及び精製して、これら2つの融合蛋白質について生体内での生理現象調節能力の差異を調べた。本実験のために、Mph−1−BTMとヒトインスリンとの融合蛋白質の製作のための発現ベクターであるpMph−1−インスリンを作製した。XbaIの塩基配列、Mph−1−BTM及びヒトインスリンのN末端を含む配列番号17の5´プライマーと、Hind制限酵素配列及びヒトインスリンのC末端配列を含む配列番号18の3´プライマーを製作し、本研究室で製作したヒト膵臓(pancease)beta細胞のcDNAライブラリーを鋳型として、通常のPCRと分子クローニング方法により上記実施例10でのように蛋白質を可溶性の形で効果的に発現し得る発現ベクターpGELysRSのATG−LysRSの5´に存在するもう一つのXbaI制限酵素を除去したpGELysRS(2)発現ベクターのXbaIとHindIII位置にクローニングして、pMph−1−インスリン発現ベクターを完成した。これを図16に示す。製作されたpMph−1−インスリンを用いて大腸菌BL21を熱ショック形質転換法(heat shock transformation)で形質転換した後、上記実施例2と同様な方法で融合蛋白質を発現及び分離精製し、Mph−1−インスリン融合蛋白質を製作した。バクテリアで発現し分離精製されたMph−1−インスリン融合蛋白質(1mg/ml)をCHO細胞内に再び伝達した後、これらCHO細胞内に存在する蛋白質フォールディングメカニズムを用いて自然状態の構造及び機能を有するものと考えられるMph−1−インスリン融合蛋白質を再分離精製し、この融合蛋白質をMph−1−インスリン−PRと命名した。これら2つの融合蛋白質をSDS−PAGE実施した後、クマシーブルー染色法で確認し図17Aに示した。これら2つの融合蛋白質がMph−1−BTMによってJurkatT細胞内に効果的に伝えられるかどうかを調べるために、上記実施例3と同様に、これら融合蛋白質及びMph−1−BTMの無い組換えインスリンで培養されたJurkatT細胞を処理した後、インスリンに対するmAbを用いてインスリン蛋白質の細胞内伝達効果を細胞内染色(intracellular staining)で比較した。その結果を図17Bに示す。この結果から分かるように、Mph−1−BTMを有しない組換えインスリンの場合、JurkatT細胞内に殆ど伝えられていない反面、Mph−1−BTMに連結された2つの融合蛋白質Mph−1−インスリン、Mph−1−インスリン−PRは、両方とも細胞内に効果的に伝えられた。
生体内血糖低下効果
上記実施例14で製作された組換えインスリン、Mph−1−インスリン及びMph−1−インスリン−PRの生体内での血糖低下効果を分析するために、インスリン依存性糖尿病の動物モデルであるSTZ(Streptozotocin)誘導糖尿マウスを用いた。3日間絶食させた後、STZ(Sigma Chemical Co, St Louis, USA)60 mg/kgを静脈注射によって投与した。ポリユリア及び他の糖尿病症状とともに血糖が20mmol/L又はそれ以上になった場合をインスリン依存性糖尿マウスとして分類した。全ての生体内実験は、糖尿病が誘導されてから2週経過後に実施された。上記実施例13の組換えインスリン、Mph−1−インスリン及びMph−1−インスリン−PRを腹腔注射を通して1−10mMの濃度で上記糖尿マウスに投与した後、血液内のグルコース濃度を調べた。血糖の分析は、麻酔したマウスから0.2ml程度の血液を採取し、13,000rpmの速度で3分間遠心分離した後、15ml程度の血漿を1.5mlのグルコースキット試薬(BiosystemSA, Barcelona, Spain)に加え、37℃の水槽に10分程度インキュベーションした。血糖分析は、分析器(Quik-Lab,Ames,Miles Inc. Elkart,Indiana,USA)を用いて行なわれた。その結果を下記の表3に示す。
Claims (37)
- 真核若しくは原核細胞の細胞内に生物学的に生理機能調節分子を伝達するための、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチド又はその活性断片。
- アルギニン、リジン、及びアラニンの中の1つ以上が構造的及び/又は機能的に類似したアミノ酸によって置換されることを特徴とする請求項1に記載のペプチド又はその活性断片。
- 生理機能調節分子が蛋白質、DNA、RNA、炭水化物、脂肪、及び化学化合物からなる群から選ばれた一つ以上の物質であることを特徴とする、請求項1又は2に記載のペプチド又はその活性断片。
- 筋肉内(intramuscular)、腹膜内(intraperitoneal)、静脈内(intravein)、経口(oral)、鼻内(nasal)、皮下(subcutaneous)、皮内(intradermal)、粘膜(mucosal)又は吸入(inhale)を含む投与経路により、真核若しくは原核細胞の細胞内に伝達されることを特徴とする請求項1乃至3の何れか一項に記載のペプチド又はその活性断片。
- 上記請求項1乃至3の何れか一項に記載のペプチド又はその活性断片をコーディングするDNA、生理機能調節分子である同種又は異種の1つ以上の蛋白質をコーディングするDNA、及び作動可能に結合された発現調節配列を含む組換え発現ベクター。
- 上記請求項1乃至3の何れか一項に記載のペプチド又はその活性断片;特定DNA及び/又はRNA配列と結合するDNA及び/又はRNA結合蛋白質をコーディングするDNA及び/又はRNA、又は細胞内に伝達しようとする目的DNA及び/又はRNA;特定DNA及び/又はRNA結合蛋白質と選択的に結合する核酸配列を1つ以上連続して含有するDNA及び/又はRNA断片;及び作動可能に結合された発現調節配列;を含む組換え発現ベクター。
- 発現調節配列が、目的DNA及び/又はRNAが選択的に伝達され発現される細胞、組織、或いは臓器に特異的なプロモーター又はエンハンサーを含む調節ドメイン(regulatory domain)であることを特徴とする請求項6に記載の組換え発現ベクター。
- 筋肉内、腹膜内、静脈内、経口、鼻内、皮下、皮内、粘膜、又は吸入を含む投与経路により、真核若しくは原核細胞へのベクターの伝達が行なわれることを特徴とする請求項5乃至7の何れか一項に記載の組換え発現ベクター。
- 細胞表面に存在するプロテアーゼによって特異的に認識され切断される核酸配列;及び目的蛋白質が伝達される細胞、組織或いは臓器に特異的に存在する受容体(receptor)と特異的に結合可能なリガンドの細胞外部分をコーディングするDNA、又は上記受容体と選択的に結合する単クローン抗体(mAb)をコーディングするDNA;を含むことを特徴とする請求項5乃至7の何れか一項に記載の組換え発現ベクター。
- 細胞表面に存在する上記プロテアーゼは、MMP(Matrix Metallo Protease)であることを特徴とする請求項9に記載の組換え発現ベクター。
- 上記単クローン抗体(mAb)は、Fab断片、F(ab´)断片、一本鎖Fv、又はヒト化した単クローン抗体であることを特徴とする請求項9又は10に記載の組換え発現ベクター。
- 目的蛋白質の精製を容易にするためのタグ(tag)配列を更に含むことを特徴とする請求項5乃至11の何れか一項に記載の組換え発現ベクター。
- 6個の連続したヒスチジンコドンをコーディングする遺伝子を更に含むことを特徴とする請求項12に記載の組換え発現ベクター。
- 細胞内酵素によって特異的に認識され切断されるアミノ酸配列を更に含むことを特徴とする請求項5乃至13の何れか一項に記載の組換え発現ベクター。
- 細胞内酵素によって特異的に認識され切断されるアミノ酸配列が、エンテロキナーゼ切断部位(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)、又はTev切断部位(Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly)であることを特徴とする請求項14に記載の組換え発現ベクター。
- 蛋白質の構造と機能の安定、又は蛋白質の柔軟性(flexibility)のために、1つ以上のグリシン、アミノ酸AYYを含むスペーサ(spacer)アミノ酸又は核酸を更に含むことを特徴とする請求項5乃至15の何れか一項に記載の組換え発現ベクター。
- i)上記請求項1又は2に記載のペプチド又はその活性断片;及び、ii)蛋白質、DNA、RNA、炭水化物、脂肪及び化学化合物からなる群から選ばれた1つ以上の生理機能調節分子;が融合されるか、或いは化学的及び/又は物理的な方法で結合された生体分子伝達複合体。
- i)上記請求項1又は2に記載のペプチド又はその活性断片;
ii)生体内(in vivo)又は生体外(in vitro)において生理機能調節に関与する同種または異種の1つ以上の目的蛋白質、及び細胞表面に存在するプロテアーゼによって特異的に切断されるアミノ酸配列の融合蛋白質;及び
iii)目的蛋白質が選択的に伝達される細胞、臓器、又は組織に存在する受容体と選択的に結合するリガンドの細胞外部分(ecto domain)又は単クローン抗体が、化学的、物理的、共有又は非共有結合によって形成された生体分子伝達複合体。 - 細胞表面に存在する上記プロテアーゼは、MMP(Matrix Metallo Protease)であることを特徴とする請求項18に記載の生体分子伝達複合体。
- 上記単クローン抗体(mAb)は、Fab断片、F(ab´)断片、一本鎖Fv、又はヒト化した単クローン抗体であることを特徴とする請求項18又は19に記載の生体分子伝達複合体。
- 融合蛋白質の精製を容易にするためのタグ(tag)配列を更に含むことを特徴とする請求項18乃至20の何れか一項に記載の生体分子伝達複合体。
- 6個の連続したヒスチジンコドンをコーディングする遺伝子を更に含むことを特徴とする請求項21に記載の生体分子伝達複合体。
- 融合蛋白質から不要な部分を取り除くために、細胞内、細胞内小器官又は核内に存在する酵素によって特異的に切断されるアミノ酸配列を更に含むことを特徴とする請求項21に記載の生体分子伝達複合体。
- アミノ酸配列は、エンテロキナーゼ切断部位であるAsp-Asp-Asp-Asp-Lys、又は、Tev切断部位であるGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Glyであることを特徴とする請求項23に記載の生体分子伝達複合体。
- 上記目的蛋白質は、翻訳後にユビキチン化(ubiquitination)、ホスホリル化(phosphorylation)、ファネシレーション(farnesylation)、又はアシル化(fatty acylation)を含む翻訳後修飾(Post Translational Modification)によって修飾されることを特徴とする請求項23又は24に記載の生体分子伝達複合体。
- 上記請求項5乃至16に記載の組換え発現ベクターにより、真核若しくは原核細胞を含む宿主細胞で発現された融合蛋白質。
- Mph−1−zA1A2またはMph−CTLA−4であることを特徴とする請求項26に記載の融合蛋白質。
- 化学的及び/又は物理的な方法により、DNA、RNA、炭水化物、脂肪又は化学化合物からなる群から選ばれた1つ以上の追加的な生理機能調節分子と結合することを特徴とする請求項26に記載の融合蛋白質。
- 化学的及び/又は物理的な方法が、共有又は非共有の結合による直接結合であるか、若しくは媒介体を用いた間接結合であることを特徴とする請求項28に記載の融合蛋白質。
- 上記請求項3に記載のペプチド又はその活性断片を、筋肉内、腹膜内、静脈内、経口、鼻内、皮下、皮内、粘膜又は吸入を含む投与経路により、真核若しくは原核細胞の細胞内に伝達する方法。
- 上記請求項17乃至24の何れか一項に記載の生体分子伝達複合体を、細胞の培養物と混合培養する段階を含む、蛋白質、DNA、RNA、炭水化物、脂肪及び化学化合物からなる群から選ばれた1つ以上の生理機能調節分子を真核若しくは原核細胞の細胞内に伝達する方法。
- 上記請求項26乃至29の何れか一項に記載の融合蛋白質を、細胞の培養物と混合培養する段階を含む、蛋白質、DNA、RNA、炭水化物、脂肪及び化学化合物からなる群から選ばれた1つ以上の物質を真核若しくは原核細胞の細胞内に伝達する方法。
- i)細胞内に伝達しようとする目的DNA及び/又はRNA、DNA及び/又はRNA結合蛋白質が特異的に結合するDNA/RNA配列を1つ以上連続して含有するDNA及び/又はRNA断片、及び作動可能に結合された発現調節配列を含む第1の組換え発現ベクターを製造する段階;
ii)配列番号1のペプチド又はその活性断片、上記段階i)の第1の組換え発現ベクター中のDNA及び/又はRNA断片に含まれた、DNA及び/又はRNA結合蛋白質が特異的に結合する特定DNA及び/又はRNA塩基配列と選択的に結合可能なDNA及び/又はRNA結合蛋白質をコーディングするDNA及び/又はRNAを含む第2の組換え発現ベクターを製造する段階;
iii)上記第2の組換え発現ベクターを用いて宿主細胞から融合蛋白質を収得する段階;
iv)上記段階iii)の融合蛋白質と、上記段階i)の第1の組換え発現ベクターとを結合反応させ、融合蛋白質及び目的DNA及び/又はRNAの結合体を収得する段階;及び
v)上記結合体を目的DNA及び/又はRNAを伝達しようとする細胞と混合し、混合培養する段階;を含み、目的DNA及び/又はRNAを真核若しくは原核細胞の細胞内に伝達する方法。 - インターロイキン−4、インターロイキン−2、インターロイキン−12、又はγ−インターフェロンなどを含むサイトカイン及びケモカイン、または成長因子(Egf)を含む生理機能調節因子が一緒に伝えられることを特徴とする、目的DNA及び/又はRNAを真核若しくは原核細胞の細胞内に伝達する方法。
- i)上記請求項1又は2に記載のペプチド又はその活性断片と目的蛋白質との融合蛋白質を第1の宿主細胞から収得する段階;及び
ii)上記段階i)の融合蛋白質を第2の宿主細胞に伝達する段階;を含み、
iii) 第2の宿主細胞から自然状態のフォールディング構造及び機能を有する目的蛋白質を分離精製する段階;を含む目的蛋白質を生産するシステム。 - 上記請求項35に記載のシステムから分離精製された自然状態の構造及び機能を有する目的蛋白質。
- 上記請求項27に記載の融合蛋白質を含む免疫抑制剤。
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