JP5199516B2 - 抗ウイルス剤、抗体酵素、プライマーセット、ポリヌクレオチドの製造方法、および、ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗ウイルス剤、ヒト型の抗体酵素、プライマーセット、ポリヌクレオチドの製造方法、および、ポリペプチドの製造方法に関するものである。

本発明者らは、これまで、抗体酵素に関して種々の独創的な研究を行ってきている（例えば、特許文献１を参照のこと）。従来、完全ヒト型配列を有する抗体酵素は、多発性骨髄腫患者から得られるベンスジョーンズタンパク（ＢＪＰ）以外には得ることができなかった。多発性骨髄腫患者の患者数は少なく、また酵素活性を有するＢＪＰも少ないため、ヒト型の抗体酵素を取得することは困難であった。しかし、ヒト型の抗体酵素は、人体に投与した際の副作用が少ないと予想されるために、国内外の製薬会社などは、有用なヒト型の抗体酵素が開発されることを待ち望んでいる。

ところで、狂犬病は、発展途上国で今なお大きな疾病負荷を有する感染症であり、発症すれば死亡率が１００％である致死的な疾患である。狂犬病に対しては、現時点では、狂犬病ウイルス（rabies virus）曝露後における発症予防ワクチンの投与以外に、有効な治療法が無い。そのため、新たな視点からの治療法の開発が求められている。

また、インフルエンザウイルスは、その抗原性が多様であることから、しばしば広範囲に亘って大流行し、甚大な被害をもたらす。そのため、これもまた同様に新たな視点からの治療法の開発が求められている。

日本国公開特許公報「特開２００６−１９７９３０号公報（２００６年８月３日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００４−９７２１１号公報（２００４年４月２日公開）」

本発明は、新規で有用なヒト型抗体軽鎖を提供することを主たる目的とする。

まず、本発明者らは、ＢＪＰ以外のヒト型の抗体酵素を得る手法を確立することを目的として、鋭意検討を行い、１段階目のプライマーとしてサブグループＩＩに属するＶκ遺伝子に特徴的なリーダー配列に基づいて設計したプライマーを用いた２段階のＰＣＲ反応により、ヒトｃＤＮＡから、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を含むヒト抗体のκ型軽鎖のｃＤＮＡまたは少なくとも可変領域をコードするそのフラグメントをより選択的かつ効率的に増幅できることを見出し、発明を完成させた。なお、本発明者らは、特許文献１において、配列番号５の塩基配列に示されるポリヌクレオチドを含むプライマーを用いたＰＣＲ反応を用いた方法について言及している。本発明は、この特許文献１に記載の方法に対して、本発明者らの独自の発想に基づき、配列番号５の塩基配列を配列番号１または配列番号２の塩基配列に改変し、加えて２段階目のＰＣＲ反応を適用することによって、飛躍的な改良を図ったものである。

次に、本発明者らは、この技術を用いて取得した新規なヒト型抗体軽鎖について検討したところ、驚くべきことに、得られたヒト抗体κ型軽鎖のいくつかが、高い抗ウイルス活性を有していることを見出し、発明を完成させた。

すなわち、本発明に係る抗ウイルス剤は、可変領域が配列番号２６、１４、２２、３０、５０、５４または３５のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるヒト抗体κ型軽鎖を含有することを特徴としている。

本発明はまた、狂犬病ウイルスに対するヒト抗体の軽鎖であって、酵素活性を有するヒト型の抗体酵素を提供する。

すなわち、本発明に係るヒト型の抗体酵素は、狂犬病ウイルスに対するヒト抗体のκ型軽鎖であって、アミダーゼ活性を有しており、その可変領域が、配列番号２６、１４、１６、１８、３０、３５または４０のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなることを特徴としている。本発明に係るヒト型の抗体酵素は、また、狂犬病ウイルスに対するヒト抗体κ型軽鎖であって、核酸分解活性を有しており、その可変領域が、配列番号２６、１４、３０、５０または５４のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。本発明に係るヒト型の抗体酵素は、また、狂犬病ウイルスに対するヒト抗体κ型軽鎖であって、がん細胞に対する細胞障害性を有しており、その可変領域が、配列番号１４または３０のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。本発明に係るヒト型の抗体酵素は、また、狂犬病ウイルスに対するヒト抗体κ型軽鎖であって、抗ウイルス活性を有しており、その可変領域が、配列番号１４、２６、２２、３０、５０、５４または３５のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。これらの抗体酵素は、ヒト型の抗体酵素であり、ヒトに投与しても副作用が極めて少ないと考えられる。

本発明はまた、本発明に係るヒト型の抗体酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクター、本発明に係るポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を提供する。

また、本発明に係るプライマーセットは、ヒトｃＤＮＡを鋳型とする２段階のＰＣＲ反応によって、ヒト抗体κ型軽鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーセットであって、１段階目のＰＣＲ反応のためのプライマーとして、該１段階目のＰＣＲ反応において該鋳型とハイブリダイズする領域が、配列番号４３または４４の塩基配列によって示されるポリヌクレオチドである第１のプライマーを備えていることを特徴としている。

本発明に係るプライマーセットを用いることにより、ヒトｃＤＮＡから、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖ｃＤＮＡまたは少なくとも可変領域をコードするそのフラグメントをより選択的かつ効率的に増幅することができる。これにより、抗体酵素であるヒト型抗体κ型軽鎖を効率よく取得することができる。

本発明は、また、本発明に係るプライマーセットを用いた２段階のＰＣＲ反応により、ヒトｃＤＮＡからヒト抗体κ型軽鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを増幅する工程を包含している、ポリヌクレオチドの製造方法、および、当該ポリヌクレオチドの製造方法により製造したポリヌクレオチドを、宿主細胞内で発現させる工程を包含している、ポリペプチドの製造方法を包含する。

本発明によれば、非常に有用な、新規なヒト抗体κ型軽鎖を含有する抗ウイルス剤、新規なヒト抗体κ型軽鎖であるヒト型の抗体酵素、これらのヒト抗体κ型軽鎖に関連するポリヌクレオチド、ベクター、および形質転換体、抗ウイルス剤または抗体酵素としての機能を有するヒト抗体κ型軽鎖を効率よく取得するためのプライマーセット、ならびに、当該プライマーセットを利用するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造方法を提供することができる。

本発明の一実施形態に係るプライマーセットの概略構成を示す模式図である。 １段階目のＰＣＲ反応後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。 ２段階目のＰＣＲ反応後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。 ２段階のＰＣＲ反応の反応産物を確認するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。 各クローンのシーケンス結果の一部を示す図である。 ヒートショックによって形質転換された大腸菌のコロニー形成を示す図である。 形質転換した大腸菌において、発現誘導を受けた状態の発現タンパク質を示す図である。 形質転換した大腸菌において、発現誘導を受けていない状態の発現タンパク質を示す図である。 形質転換した大腸菌において、菌体の可溶性画分に含まれる発現タンパク質を示す図である。 形質転換した大腸菌において、菌体の不溶性画分に含まれる発現タンパク質を示す図である。 形質転換した大腸菌における発現タンパク質をウエスタンブロッティングによって同定した図である。 大腸菌において発現させた目的タンパク質の一次精製時におけるクロマトグラムを示す図である。 目的タンパク質を一次精製した後の精製状態を示す図である。 大腸菌において発現させた目的タンパク質の二次精製時におけるクロマトグラムを示す図である。 目的タンパク質を二次精製した後の精製状態を示す図である。 様々な基質に対するクローン＃１１のポリペプチドの酵素活性を示す図である。 様々な基質に対するクローン＃１６のポリペプチドの酵素活性を示す図である。 様々な基質に対するクローン＃１のポリペプチドの酵素活性を示す図である。 様々な基質に対するクローン＃７のポリペプチドの酵素活性を示す図である。 クローン＃１のポリペプチドを精製した結果を示す図であり、（ａ）は、クローン＃１のポリペプチドを新たに一次精製した結果を示し、（ｂ）は、クローン＃１のポリペプチドを新たに二次精製した結果を示す。 クローン＃１のポリペプチドをウイルスと反応させる際の条件について調べた結果を示す図であり、（ａ）は、クローン＃１のポリペプチドをウイルスと反応させる際の温度および時間について調べた結果を示し、（ｂ）は、クローン＃１のポリペプチドをウイルスと反応させる際の濃度および時間について調べた結果を示す。 クローン＃１のポリペプチドの種々のウイルスに対する抗ウイルス活性を調べた結果を示す図である。 クローン＃１のポリペプチドの狂犬病ウイルスＣＶＳ株に対する抗ウイルス活性を調べたプラークアッセイの結果を示す図である。 クローン＃１のポリペプチドの膜融合活性を調べた赤血球凝集反応の結果を示す図である。 本発明の一実施形態におけるｃＤＮＡの設計を説明するための図であり、（ａ）は、単量体のヒト型抗体軽鎖を得るためのｃＤＮＡの設計の概略を示し、（ｂ）は、変異導入前のヒト型抗体軽鎖と変異導入後のヒト型抗体軽鎖との組成の概略を示す。 クローン＃１のポリペプチドの水疱性口内炎ウイルスに対する抗ウイルス活性について温度を変化させて調べた結果を示す図である。 クローン＃７のポリペプチドの狂犬病ウイルスＣＶＳ株に対する抗ウイルス活性を調べた結果を示す図である。 本発明の一実施形態に係るプライマーセットの概略構成を示す模式図である。 本発明の一実施形態におけるＰＣＲ反応後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。 本発明の一実施形態におけるＰＣＲ反応後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。 本発明の一実施形態における粗精製後の各サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。 クローン２３Ｄ４およびクローン２２Ｆ６の酵素活性を示す図である。 クローン２３Ｄ４の種々のウイルスに対する抗ウイルス活性を調べた結果を示す図である。 クローン２３Ｄ４の膜融合活性を調べた赤血球凝集反応の結果を示す図である。 クローン２３Ｄ４の抗ウイルス活性を調べた結果を示す図である。 ジスルフィド結合を形成するシステインを置換したヒト抗体κ型軽鎖のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。 ジスルフィド結合を形成するシステインを置換したヒト抗体κ型軽鎖の抗ウイルス活性を調べた結果を示す図である。 ジスルフィド結合を形成するシステインを置換したヒト抗体κ型軽鎖の抗ウイルス活性を調べた結果を示す図である。 ジスルフィド結合を形成するシステインを置換したヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。 ジスルフィド結合を形成するシステインを置換したヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。 各クローンのインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を調べた結果を示すグラフである。 各クローンによる核酸分解試験の結果を示す図である。 サブグループＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子のリーダー配列を示す図である。 サブグループＩＩおよびＩＩＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子のリーダー配列を示す図である。 サブグループＩＶ〜ＶＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子のリーダー配列を示す図である。 各リーダー配列の本発明の一実施形態に係る第１のプライマーに対応する部分を示す図である。 サブグループＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子の５’末端側約６０塩基を示す図である。 サブグループＩＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子の５’末端側約６０塩基を示す図である。 サブグループＩＩＩ〜ＶＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子の５’末端側約６０塩基を示す図である。 各５’末端側の配列の本発明の一実施形態に係る第２のプライマーに対応する部分を示す図である。 各クローンのがん細胞に対する細胞障害性を調べた結果を示すグラフである。

本発明の実施形態について以下に説明する。以下の記載は、本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。

〔１．ヒト抗体κ型軽鎖〕
本発明は、新規かつ有用なヒト抗体κ型軽鎖を提供する。本明細書において、「ヒト抗体κ型軽鎖」は、ヒト由来の免疫グロブリンのκ型の軽鎖（Light chain）を指す。

本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、単量体であることが好ましい。後述するように、いくつかのヒト抗体κ型軽鎖において、単量体の方が、二量よりもはるかに抗ウイルス活性が高い。

本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、その可変領域が、配列番号１４、１６、１８、２２、２６、３０、３５、４０、５０または５４のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、狂犬病ウイルスに反応する。

なお、配列番号１４のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなる可変領域を有するヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号１に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）におけるＣＤＲ１は、配列番号１および１４のアミノ酸配列における第２４〜３９番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号１および１４のアミノ酸配列における第５５〜６０番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号１および１４のアミノ酸配列における第９４〜１０３番目である。

また、配列番号１６のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなる可変領域を有するヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１６）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（＃１６）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号３に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（＃１６）におけるＣＤＲ１は、配列番号３および１６のアミノ酸配列における第２４〜３９番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号３および１６のアミノ酸配列における第５５〜６０番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号３および１６のアミノ酸配列における第９４〜１０３番目である。

また、配列番号１８のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなる可変領域を有するヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（＃７）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（＃７）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号５に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（＃７）におけるＣＤＲ１は、配列番号５および１８のアミノ酸配列における第２４〜３９番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号５および１８のアミノ酸配列における第５５〜６０番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号５および１８のアミノ酸配列における第９４〜１０２番目である。

また、配列番号２２のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなる可変領域を有するヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（＃６）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（＃６）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号２０に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（＃６）におけるＣＤＲ１は、配列番号２０および２２のアミノ酸配列における第２４〜３９番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号２０および２２のアミノ酸配列における第５５〜６０番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号２０および２２のアミノ酸配列における第９４〜１０２番目である。

また、配列番号２６のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなる可変領域を有するヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号２４に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）におけるＣＤＲ１は、配列番号２４および２６のアミノ酸配列における第２４〜３９番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号２４および２６のアミノ酸配列における第５５〜６０番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号２４および２６のアミノ酸配列における第９４〜１０２番目である。

また、配列番号３０のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなる可変領域を有するヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｄ４）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｄ４）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号２８に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｄ４）におけるＣＤＲ１は、配列番号２８および３０のアミノ酸配列における第２４〜３９番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号２８および３０のアミノ酸配列における第５５〜６０番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号２８および３０のアミノ酸配列における第９４〜１０２番目である。

また、配列番号３５のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなる可変領域を有するヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号３３に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６）におけるＣＤＲ１は、配列番号３３および３５のアミノ酸配列における第２４〜３９番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号３３および３５のアミノ酸配列における第５５〜６０番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号３３および３５のアミノ酸配列における第９４〜１０２番目である。

また、配列番号４０のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなる可変領域を有するヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｆ１）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｆ１）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号３８に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｆ１）におけるＣＤＲ１は、配列番号３８および４０のアミノ酸配列における第２４〜３９番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号３８および４０のアミノ酸配列における第５５〜６０番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号３８および４０のアミノ酸配列における第９４〜１０２番目である。

また、配列番号５０のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなる可変領域を有するヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号４８に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）におけるＣＤＲ１は、配列番号４８および５０のアミノ酸配列における第２４〜４０番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号４８および５０のアミノ酸配列における第５６〜６１番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号４８および５０のアミノ酸配列における第９５〜１０３番目である。

また、配列番号５４のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなる可変領域を有するヒト抗体κ型軽鎖は、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１１）と称することもある。ヒト抗体κ型軽鎖（＃１１）は、上述した可変領域に、公知のヒト抗体定常領域が付加されたものであり得、一実施形態において、全長のアミノ酸配列は、配列番号５２に示される。ヒト抗体κ型軽鎖（＃１１）におけるＣＤＲ１は、配列番号５２および５４のアミノ酸配列における第２４〜３９番目であり、ＣＤＲ２は、配列番号５２および５４のアミノ酸配列における第５５〜６０番目であり、ＣＤＲ３は、配列番号５２および５４のアミノ酸配列における第９４〜１０２番目である。

また、一実施形態において、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、上述したヒト抗体κ型軽鎖の変異体であってもよい。好ましい変異体は、そのアミノ酸配列において、他の軽鎖とジスルフィド結合を形成するためのシステインが、削除またはシステイン以外のアミノ酸に置換されている。これにより、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖同士がジスルフィド結合により二量体化することを避け、単量体を容易に得ることができる。この場合、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖は、例えば、配列番号１５、１７、１９、２３、２７、３１、３６、４１、５１または５５のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものである。なお、これらの末尾における「ＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１２）」は、ヒト抗体κ型軽鎖の精製のための配列であり、適宜変更することができる。

なお、上記変異体のアミノ酸配列において上記システイン以外の変異が存在する場合、その変異は、上記アミダーゼ活性、核酸分解活性、がん細胞に対する細胞障害性、または抗ウイルス活性を変化させないものであり、上述したＣＤＲ配列の外に存在するものであることが好ましく、可変領域の外において存在するものであることがより好ましい。

ヒト抗体κ型軽鎖（＃６）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）、ヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｄ４）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１１）およびヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６）は、後述する実施例に示すように、抗ウイルス活性を有している。また、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）、ヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｄ４）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃７）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１６）、ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６）およびヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｆ１）は、後述する実施例に示すように、アミダーゼ活性を有しており、本発明に係る抗体酵素とも称される。また、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）、ヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｄ４）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）、および、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１１）は、後述する実施例に示すように、核酸分解活性を有しており、同様に、本発明に係る抗体酵素とも称される。また、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）、および、ヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｄ４）は、後述するように、がん細胞に対する細胞障害性を有しており、同様に、本発明に係る抗体酵素とも称される。また、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃６）、ヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｄ４）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１１）、および、ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６）は、後述するように、抗ウイルス活性を有しており、同様に、本発明に係る抗体酵素とも称される。

また、別の観点から言えば、本発明は、ヒト抗体のκ型の軽鎖またはそのフラグメントであり、アミダーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。本発明に係るポリペプチドは、アミダーゼ活性を示すヒト由来の免疫グロブリンである。

本発明に係るポリペプチドは、単量体または二量体の形態として提供され得、特に、単量体の形態であることが好ましい。

本発明に係るポリペプチドは、アミダーゼ活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖またはそのフラグメントであることが好ましく、例えば、配列番号１、３または５のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドあるいはその変異体である。なお、配列番号１のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドまたはその変異体を第１のポリペプチド、配列番号３のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドまたはその変異体を第２のポリペプチド、なお、配列番号５のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドまたはその変異体を第３のポリペプチドと称することもある。

本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、目的のポリペプチドが有する特定の活性を保持したポリペプチドが意図され、「配列番号１、３、または５のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドの変異体」は、アミダーゼ活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖またはそのフラグメントであるポリペプチドが意図され、好ましくは、抗ウイルス活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖またはそのフラグメントであるポリペプチドが意図される。

ポリペプチドを構成するアミノ酸残基のうちのいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。上述したように、本発明に係るポリペプチドは、アミダーゼ活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖またはそのフラグメントであり、その活性中心は可変領域にある。したがって、本発明に係る第１のポリペプチドは、配列番号１（または配列番号７）のアミノ酸配列における、可変領域に対応する第１〜１１３番目、特にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３にそれぞれ対応する第２４〜３９番目、第５５〜６０番目、および第９４〜１０３番目については変異がないものである。本発明に係る第２のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列における、可変領域に対応する第１〜１１３番目、特にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３にそれぞれ対応する第２４〜３９番目、第５５〜６０番目、および第９４〜１０３番目については変異がないものである。本発明に係る第３のポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列における、可変領域に対応する第１〜１１２番目、特にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３にそれぞれ対応する第２４〜３９番目、第５５〜６０番目、および第９４〜１０２番目については変異がないものである。

当業者は、周知技術を使用してポリペプチドを構成するアミノ酸残基のうちの１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。

好ましい変異体は、保存性または非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。これらは、本発明に係るポリペプチドのアミダーゼ活性または抗ウイルス活性を変化させない。

第１のポリペプチドの特に好ましい変異体は、配列番号７のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドである。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドは、２２０番目のシステインが他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。例えば、２２０番目のシステインはアラニンに置換され得る。このようなアミノ酸置換によって、本発明に係る第１のポリペプチドを単量体の形態で容易に取得することができる。これは、２２０番目のシステイン同士によるＳ−Ｓ結合が形成されないためである。後述の実施例に示すように、本発明に係る第１のポリペプチドは、単量体の形態において特に高い抗ウイルス活性を示す。このようなアミノ酸置換は、例えば、ヒト型抗体酵素の全長をコードする鋳型ＤＮＡをＰＣＲによって増幅する場合に、３’末端側のプライマーとして制限酵素認識部位の隣にＡＧＣを有し、その隣から鋳型ＤＮＡに対する特異的な配列を有するプライマーを用いればよい。これ以外にも当該分野に公知の方法（例えば、部位特異的変異生成法）によって、このような変異を導入し得る。また、鋳型ＤＮＡのうち２１９番目のアミノ酸をコードする領域までに対して特異的なプライマーを設計してＰＣＲ増幅しても、単量体のみを形成するヒト型抗体酵素を作製し得る。

また、配列番号７のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドに対して、さらなる変異を加えてもよい。また、同様に、第２のポリペプチドについて２１９番目のシステインを、第３のポリペプチドについて２２０番目のシステインを、それぞれ他のアミノ酸に置換することにより、単量体を容易に得ることができる。

このように、本実施形態に係るポリペプチドは、アミダーゼ活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖またはそのフラグメントであって、（１）配列番号１、３、５もしくは７のアミノ酸配列によって示されるポリペプチド、または（２）配列番号１、３、５もしくは７のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であることが好ましい。

これら、１個もしくは数個のアミノ酸の変異は、定常領域においてなされることが好ましい。すなわち、本発明に係る第１のポリペプチドにおける変異は、配列番号１のアミノ酸配列の第１１４〜２２０番目に導入されるか、または配列番号７のアミノ酸配列の第１１４〜２１９番目に導入されることが好ましい。本発明に係る第２のポリペプチドにおける変異は、配列番号３のアミノ酸配列の第１１４〜２２０番目に導入されることが好ましい。本発明に係る第３のポリペプチドにおける変異は、配列番号５のアミノ酸配列の第１１３〜２１９番目に導入されることが好ましい。

本発明に係るポリペプチドは、ヒト抗体のκ型の軽鎖またはそのフラグメントであり、アミダーゼ活性を有する抗体酵素でもあり得る。一実施形態において、本発明に係る抗体酵素は、狂犬病ウイルスに対する抗体であり得る。また、好ましくは、本発明に係る抗体酵素は、抗ウイルス活性を有する。

本発明に係る第１の抗体酵素は、可変領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第１〜１１３番目からなり、第２４〜３９番目、第５５〜６０番目、および第９４〜１０３番目がそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する。本発明に係る第２の抗体酵素は、可変領域が、配列番号３に示されるアミノ酸配列の第１〜１１３番目からなり、第２４〜３９番目、第５５〜６０番目、および第９４〜１０３番目がそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する。本発明に係る第３の抗体酵素は、可変領域が、配列番号５に示されるアミノ酸配列の第１〜１１２番目からなり、第２４〜３９番目、第５５〜６０番目、および第９４〜１０２番目がそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する。

本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖およびポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。

本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖およびポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。

また、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖およびポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。

他の局面において、本発明は、アミダーゼ活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖またはそのフラグメントであるポリペプチド、または、抗ウイルス活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖またはそのフラグメントであるポリペプチドの生産方法を提供する。本発明に係るポリペプチドの生産方法は、ヒト抗体κ型軽鎖または抗体酵素の生産方法でもあり得る。

一実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。

本実施形態の１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターが組換え発現系において用いられることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主（形質転換体）内で翻訳されて得られるポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。

このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。

本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、当該ポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。

本実施形態の他の局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターが無細胞タンパク質合成系において用いられることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットが用いられ得る。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。

無細胞タンパク質合成系は細胞内ｍＲＮＡやクローニングされたｃＤＮＡにコードされているさまざまなタンパク質の同定等に広く用いられる手法であり、無細胞タンパク質合成系（無細胞タンパク質合成法、無細胞タンパク質翻訳系とも呼ぶ）に用いられるのが無細胞タンパク質合成液である。

無細胞タンパク質合成系としては、コムギ胚芽抽出液を用いる系、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系、大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる系、および植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液が挙げられる。一般的には、真核生物由来遺伝子の翻訳には真核細胞の系、すなわち、コムギ胚芽抽出液を用いる系またはウサギ網状赤血球抽出液を用いる系のいずれかが選択されるが、翻訳される遺伝子の由来（原核生物／真核生物）や、合成後のタンパク質の使用目的を考慮して、上記合成系から選択されればよい。

なお、種々のウイルス由来遺伝子産物は、その翻訳後に、小胞体、ゴルジ体等の細胞内膜が関与する複雑な生化学反応を経て活性を発現するものが多いので、各種生化学反応を試験管内で再現するためには細胞内膜成分（例えば、ミクロソーム膜）が添加される必要がある。植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液は、細胞内膜成分を保持した無細胞タンパク質合成液として利用し得るのでミクロソーム膜の添加が必要とされないので、好ましい。

本明細書中で使用される場合、「細胞内膜成分」は、細胞質内に存在する脂質膜よりなる細胞小器官（すなわち、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞内顆粒全般）が意図される。特に、小胞体およびゴルジ体はタンパク質の翻訳後修飾に重要な役割を果たしており、膜タンパク質および分泌タンパク質の成熟に必須な細胞成分である。

別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、当該ポリペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することが好ましい。本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、抗体またはオリゴヌクレオチドを用いて本発明に係るポリペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。

さらに他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを化学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明に係るポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。

以上のように、本発明に係るポリペプチドを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在する変異ポリペプチドであっても、人為的に作製された変異ポリペプチドであってもよい。

このように、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、少なくとも、当該ポリペプチドのアミノ酸配列、または当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。つまり、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。

〔２：ポリヌクレオチド〕
１つの局面において、本発明は、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖または本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子を提供する。本明細書中で使用される場合、「ヒト抗体κ型軽鎖をコードする遺伝子」は、ヒト抗体κ型軽鎖またはそのフラグメントであるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。

本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするものであることが好ましい。特定のポリペプチドのアミノ酸配列が得られた場合、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を容易に設計することができる。

本発明に係るポリヌクレオチドは、アミダーゼ活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖をコードする遺伝子であるか、核酸分解活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖をコードする遺伝子であるか、がん細胞に対する細胞障害性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖をコードする遺伝子であるか、抗ウイルス活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖をコードする遺伝子であることが好ましく、配列番号２、４、６、８、２１、２５、２９、３４、３９、４９または５３の塩基配列によって示されるポリヌクレオチドまたはその変異体であることがより好ましい。なお、配列番号２の塩基配列によって示されるポリヌクレオチドまたはその変異体は、第１のポリペプチドをコードするものであり、第１のポリヌクレオチドと称することもある。配列番号４の塩基配列によって示されるポリヌクレオチドまたはその変異体は、第２のポリペプチドをコードするものであり、第２のポリヌクレオチドと称することもある。配列番号６の塩基配列によって示されるポリヌクレオチドまたはその変異体は、第３のポリペプチドをコードするものであり、第３のポリヌクレオチドと称することもある。なお、配列番号８の塩基配列によって示されるポリヌクレオチドは、配列番号７のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドをコードするものであり、第３のポリヌクレオチドに相当する。

本明細書中においてポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、特定のポリペプチドの活性と同じ活性を保持しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図され、「配列番号２、４、６、８、２１、２５、２９、３４、３９、４９または５３の何れかの塩基配列によって示されるポリヌクレオチドの変異体」は、アミダーゼ活性、核酸分解活性、がん細胞に対する細胞障害性、または抗ウイルス活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖をコードするポリヌクレオチドが意図される。すなわち、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドの観点における変異体は、アミダーゼ活性、核酸分解活性、がん細胞に対する細胞障害性、または抗ウイルス活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、
・配列番号配列番号２、４、６、８、２１、２５、２９、３４、３９、４９もしくは５３の何れかの塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失または付加されている塩基配列によって示されるポリヌクレオチド；
・配列番号２、４、６、８、２１、２５、２９、３４、３９、４９もしくは５３の何れかの塩基配列によって示される相補鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド；または
・配列番号２、４、６、８、２１、２５、２９、３４、３９、４９もしくは５３の何れかの塩基配列において、システインをコードする末尾のＴＧＴが、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換されたポリヌクレオチド
であり得る。

上述したように、本発明に係るポリペプチドは、アミダーゼ活性、核酸分解活性、がん細胞に対する細胞障害性、または抗ウイルス活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖またはそのフラグメントであり、その活性中心は可変領域にある。したがって、本発明に係るポリヌクレオチドがコードするヒト抗体κ型軽鎖は、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列においてＣＤＲに対応するアミノ酸については変異がなく、好ましくは、可変領域に対応するアミノ酸については変異がないものである。例えば、本発明に係る第１のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列において可変領域に対応する第１〜１１３番目、特にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３にそれぞれ対応する第２４〜３９番目、第５５〜６０番目、および第９４〜１０３番目については変異がないものである。本発明に係る第２のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列において可変領域に対応する第１〜１１３番目、特にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３にそれぞれ対応する第２４〜３９番目、第５５〜６０番目、および第９４〜１０３番目については変異がないものである。本発明に係る第３のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列において可変領域に対応する第１〜１１２番目、特にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３にそれぞれ対応する第２４〜３９番目、第５５〜６０番目、および第９４〜１０２番目目については変異がないものである。

また、抗体軽鎖のＣ末端のジスルフィド結合を形成するシステインを置換することにより、上述したように本発明に係るヒト抗体軽鎖の単量体を容易に得ることができる。配列番号２、４、６、８、２１、２５、２９、３４、３９、４９もしくは５３の何れかの塩基配列において、システインをコードする末尾のＴＧＴが、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換されたポリヌクレオチドは、そのために好適に用いることができる。他のアミノ酸をコードする塩基配列としては、例えば、ＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１２）（＋終止コドン）をコードするＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ（配列番号１３）を用いることができる。

本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。

本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。

本発明に係るポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。

ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。

本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。

以上のように、本発明に係るポリヌクレオチドは、アミダーゼ活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖、核酸分解活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖、がん細胞に対する細胞障害性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖、または、抗ウイルス活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、以下のいずれかであることが好ましい：（１）配列番号２、４、６、８、２１、２５、２９、３４、３９、４９もしくは５３の塩基配列によって示されるポリヌクレオチド；（２）配列番号２、４、６、８、２１、２５、２９、３４、３９、４９もしくは５３の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列によって示されるポリヌクレオチド；（３）配列番号２、４、６、８、２１、２５、２９、３４、３９、４９もしくは５３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列によって示される相補鎖からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または（４）配列番号配列番号２、４、６、８、２１、２５、２９、３４、３９、４９もしくは５３の何れかの塩基配列において、システインをコードする末尾のＴＧＴが、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換されたポリヌクレオチド。

本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。

なお、本発明に係るベクターは、周知の遺伝子組換え技術により、本発明に係るポリヌクレオチドを所定のベクターに挿入することにより作製することができる。上記ベクターとしては、これに限定されるものではないが、後述する組換え発現ベクターの他に、クローニングベクターを用いることができる。

本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。例えば、実施例に後述する様に、ヒトリンパ球を好適に用いることができるが、これに限定されない。

〔３：抗ウイルス剤〕
本発明はまた、抗ウイルス剤を提供する。本明細書において、抗ウイルス活性とは、ウイルスの感染性、増殖能または免疫回避能を低下させる活性を意味する。ウイルスの感染性とは、ウイルスが宿主細胞に吸着または侵入する性質を意味する。このときの抗ウイルス活性は、例えば、ヒト型抗体酵素の活性によってウイルス粒子の表面タンパク質を、少なくとも部分的に切断または分解して、宿主細胞に対するウイルスの吸着または侵入を抑制する活性を示す。つまり、当該抗ウイルス活性は、ウイルスの中和活性と言い換えることができる。

ウイルスの増殖能は、宿主細胞におけるウイルス粒子の構成タンパク質の合成能、ウイルス粒子の形成能またはウイルス遺伝子の複製能を意味する。このときの抗ウイルス活性は、例えば、宿主細胞において、あるウイルスタンパク質を分解して成熟したウイルス粒子の形成を抑制する活性を意味する。当該ウイルスタンパク質としては、ウイルスタンパク質の合成を促進するか、もしくは合成に必須なウイルスタンパク質、ウイルス粒子の形成を促進するか、もしくは形成に必須なウイルスタンパク質、またはウイルス遺伝子の複製を促進するか、もしくは複製に必須なウイルスタンパク質が挙げられる。

ウイルスの免疫回避能は、宿主の免疫機構を回避する能力を意味する。このときの抗ウイルス活性は、例えば、ウイルス粒子の表面タンパク質の一部を切断して、抗原として認識可能な形態に変化させる活性、または宿主の免疫機構の一部を妨害するウイルスタンパク質を分解する活性である。

本発明に係る第１の抗ウイルス剤が標的とするウイルスは、エンベロープウイルスであり得、マイナス一本鎖ＲＮＡウイルスであり得、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）に属するウイルス（例えば、狂犬病ウイルス（rabies virus）および水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus））であり得、特に、狂犬病ウイルスを標的としている。

本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖（＃１）（第１のポリペプチド）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃６）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）およびヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｄ４）は、後述の実施例に示すように、狂犬病ウイルスの感染性を著しく低下させる作用を有している。狂犬病ウイルスの感染症は、ワクチン接種によって容易に予防し得る。しかし、狂犬病ウイルスの感染症を発症した場合、現在のところ確実な治療法が存在しない上に、免疫応答が誘導されたとしても、当該感染症を発症した患者のほぼ１００％が死亡する。よって、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖（＃１）（第１のポリペプチド）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃６）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）およびヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｄ４）は、発症した狂犬病ウイルスの感染症を処置するために特に有用であり得る。

したがって、一実施形態において、本発明に係る第１の抗ウイルス剤は、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖（＃１）（第１のポリペプチド）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃６）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）およびヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｄ４）の何れかを含んでいるものである。また、当該抗ウイルス剤は、ラブドウイルス科に属するウイルスに対して抗ウイルス活性を示し得る。当該抗ウイルス剤が抗ウイルス活性を示す上記ウイルスは、例えば、狂犬病ウイルスまたは水疱口内炎ウイルスである。

本発明に係る第２の抗ウイルス剤が標的とするウイルスは、エンベロープウイルスであり得、マイナス一本鎖ＲＮＡウイルスであり得、オルトミクソウイルス科に属するウイルスであり得、特に、インフルエンザウイルスを標的としている。標的とするインフルエンザウイルスの型は特に限定されないが、Ａ型のインフルエンザウイルスを好適に標的とし得る。

本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖（＃１）（第１のポリペプチド）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１１）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）およびヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６）は、後述の実施例に示すように、インフルエンザウイルスの感染性を著しく低下させる作用を有している。インフルエンザウイルスは、変異の起こり易さ、被害の大きさなどの理由により、医学的に注視されているウイルスの一つである。本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖（＃１）（第１のポリペプチド）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１１）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）およびヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６）は、インフルエンザウイルスの流行を阻止するために特に有用であり得る。

したがって、一実施形態において、本発明に係る第２の抗ウイルス剤は、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖（＃１）（第１のポリペプチド）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１１）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）およびヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６）の何れかを含んでいるものである。また、当該抗ウイルス剤は、インフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性を示し得る。当該抗ウイルス剤が抗ウイルス活性を示す上記ウイルスは、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスである。

また、本発明の抗ウイルス剤は、脂質二重膜の融合活性を示さないことが好ましい。これは、本発明の抗ウイルス剤がエンベロープに作用して抗ウイルス活性を示す場合、宿主細胞を障害する可能性があるためである。なお、実施例において後述するように、本発明に係るヒト型抗体酵素は、脂質二重膜の融合活性を示さない。

一実施形態において、本発明に係る抗ウイルス剤は、ヒトまたは動物についての使用のために、直接注入により投与され得る。本発明に係る抗ウイルス剤はまた、非経口投与、粘膜投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、眼内投与または経皮的投与のために処方され得る。代表的には、組成物中に含まれるタンパク質は、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量、好ましくは、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与され得る。

本実施形態に係る抗ウイルス剤は、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖（＃１）（第１のポリペプチド）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃６）、ヒト抗体κ型軽鎖（＃１８）またはヒト抗体κ型軽鎖（２３Ｄ４）以外に、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含み得る。

本実施形態に係る抗ウイルス剤は、ヒトまたは動物についての使用のためのものであり、そして代表的には、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、または賦形剤の任意の１つ以上を含む。治療的使用のための薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤は、薬学分野で周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載される。薬学的に需要可能なキャリア、賦形剤または希釈剤の選択は、意図された投与経路および標準的薬学的慣行に従って、当業者によって容易に選択され得る。また、本実施形態に係る抗ウイルス剤は、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、被覆剤または可溶化剤をさらに含み得る。

異なる送達系に依存して、組成／処方の必要条件は、異なり得る。例示として、本発明に係る抗ウイルス剤は、ミニポンプを使用してまたは粘膜経路により、例えば、吸入のための鼻スプレーまたはエアロゾルとして、あるいは非経口的に送達するために処方され得る（ここで本発明に係る抗ウイルス剤は、例えば、静脈内経路、筋肉内経路もしくは皮下経路による送達のために注射可能形態として処方される）。あるいは、この処方物は、両方の経路により送達されるように設計され得る。

また、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖または抗ウイルス剤を生体内に投与する用途で用いる場合、ヒト抗体κ型軽鎖の生体内における安定性（血中半減期）を向上させるための様々な技術が用いられ得る。例えば、ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲｎ）がＦｃに結合すると、ＩｇＧなどの抗体の血中半減期が延長することが知られており（例えば、Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｖｏｌ．７ ７１５−７２５（２００７）参照）、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖のＣ末端を、ＦｃＲｎとの結合活性を有するように改変することができる。また、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖をダイマー化すること、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を付加することもできる。

本明細書中の記載に基づけば、当業者は、本実施形態に係る抗ウイルス剤の別の形態（例えば、キット）、および本発明に係る抗ウイルス剤を用いて疾患を処理（予防および／または治療）する方法もまた本発明の範囲内であることを、容易に理解する。本発明に係る抗ウイルス剤を用いて疾患を処置する方法において、処置対象となる疾患は、ウイルス感染症であり得、例えば、狂犬病ウイルス感染症、水疱口内炎ウイルス感染症、インフルエンザウイルス感染症であり得る。また、本発明に係る抗ウイルス剤を用いて疾患を処置する方法において、被処置対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。

また、他の実施形態において、本発明に係る抗ウイルス剤は、ウイルスを除去すべき被処理物からウイルスを除去するために用いられ得る。例えば、本発明に係る抗ウイルス剤は、噴霧剤、塗布剤、浸漬剤等の形態であり得、それぞれ、被処理物に対して噴霧、塗布または被処理物を浸漬するために用いられ得る。本実施形態に係る抗ウイルス剤は、用途に応じて、公知の抗ウイルス剤、界面活性剤、安定剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、保存料、粘張剤、溶媒等をさらに含んでいてもよい。

〔４．プライマーセット〕
本発明者らは、酵素活性を有するマウスのモノクローナル抗体（抗体酵素）の配列および立体構造を解析することによって、抗体酵素はκ型の軽鎖を有し、当該軽鎖に触媒三つ組残基様構造を有している場合が多いことを見出した。なお、触媒三つ組残基様構造とは、例えば、セリン残基、ヒスチジン残基およびアスパラギン残基によって形成された、触媒活性を有していると考えられる構造である。

κ型の抗体軽鎖の遺伝子は、生殖細胞遺伝子（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｇｅｎｅ）に存在するＶκ遺伝子群、Ｊκ遺伝子群および定常領域の遺伝子群から各遺伝子が選択されて再編成されることにより構築される。

そこで、本発明者らは、マウスのκ型の抗体軽鎖について、Ｖκ遺伝子の生殖細胞遺伝子型と立体構造との関係について解析を進めた。その結果、Ｖκ遺伝子における９３種類の生殖細胞遺伝子型のうち、触媒三つ組残基様構造を有する抗体軽鎖を構築するものは、わずか１０種類ほどであることを見出した。そして、Ｖκ遺伝子の生殖細胞遺伝子型がこれら１０種類ほどに含まれる場合には、抗体軽鎖は高い確率で抗体酵素となることを見出した（特許文献２）。

本発明者らは、医療などへの応用を考慮し、マウスの抗体だけでなくヒトの抗体についても同様のことが生じているか否かについてさらに解析を進めた。本発明者らは、これまでに報告されている抗体に関する世界中の情報を検討した。その結果、ヒトの場合では、Ｖκ遺伝子が、サブグループＩＩ（ｓｕｂｇｒｏｕｐ ＩＩ）に属する場合に、抗体軽鎖が触媒三つ組残基様構造を高頻度に有することを見出した（特許文献１）。

したがって、ヒトｃＤＮＡライブラリーから、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖ｃＤＮＡまたは少なくとも可変領域をコードするそのフラグメントを取得することができれば、有用である。

しかし、Ｖκ遺伝子の塩基配列は、各サブグループ間において類似しているため、例えば、ＰＣＲ反応を用いて、ヒトリンパ球のｃＤＮＡから、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖ｃＤＮＡまたはそのフラグメントのみを確実に選択して増幅することは容易ではない。

また、Ｖκ遺伝子が同じサブグループＩＩに属していたとしても、ヒトのリンパ球から実際に得られたｃＤＮＡには、上述した再編成に起因する多様性が存在する。それゆえ、選択したｃＤＮＡから得られる抗体酵素の活性の高さ、標的とする基質等が異なる可能性がある。また、三つ組残基様構造を有している抗体のすべてが酵素活性を有するわけではない。抗体が酵素活性を有するか否かは、抗体の立体構造における三つ組残基様構造以外のコンフォメーションのわずかな差異によって決まると考えられる。

したがって、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを非常に多種類にわたって取得することによって、用途の異なる抗体酵素および特定の用途に有用性の高い抗体酵素を製造し得る。このため、有用な抗体酵素の開発を目的として、ヒトｃＤＮＡライブラリーから、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを選択的かつ効率的に増幅するための技術が求められている。

そこで、本発明は、２段階のＰＣＲ反応により、ヒトｃＤＮＡを鋳型に、サブグループＩＩに属するヒト抗体のκ型軽鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーセットを提供する。本発明に係るプライマーセットを使用し、ヒトｃＤＮＡを鋳型として、２段階のＰＣＲ反応を実施することにより、上述したような抗ウイルス剤または抗体酵素として機能するヒト抗体κ型軽鎖を、効率よく取得することができる。

一回のＰＣＲ反応のためのプライマーとして、５’末端側プライマーおよび３’末端側プライマーが設計される。５’末端側プライマーは、典型的には、増幅したいポリヌクレオチドの５’末端からその下流側の領域の相補鎖と特異的にハイブリダイズする、典型的には１５〜３０塩基のポリヌクレオチドを含んでおり、好ましくは、増幅したいポリヌクレオチドの５’末端からその下流側の領域と同じ塩基配列を有する。また、３’末端側プライマーは、典型的には、増幅したいポリヌクレオチドの３’末端からその上流側の領域と特異的にハイブリダイズする典型的には１５〜３０塩基のポリヌクレオチドを含んでおり、好ましくは、増幅したいポリヌクレオチドの３’末端からその上流側の領域の相補鎖と同じ塩基配列を有する。

本発明に係るプライマーセットは、５’末端側プライマーとして、１段階目のＰＣＲ反応のための５’末端側プライマー（第１のプライマー）および２段階目のＰＣＲ反応のための５’末端側プライマー（第２のプライマー）を備えており、３’末端側プライマーとして、１段階目のＰＣＲ反応のための３’末端側プライマー（第３のプライマー）および２段階目のＰＣＲ反応のための３’末端側プライマー（第４のプライマー）を備えている。第１〜第４のプライマーは、図１に示すように、入れ子の関係になっている。

本明細書において、特異的にハイブリダイズするとは、鋳型となるポリヌクレオチドの標的となる領域以外とはポリヌクレオチド二本鎖を形成しないことを指し、Ｔｍ値が５０℃以上であることが好ましく、５５℃以上であることがより好ましく、６０℃以上であることがさらに好ましく、６５℃以上であってもよい。

各５’末端プライマーは、ＰＣＲ反応において鋳型とハイブリダイズするための領域を少なくとも有していればよいが、例えば、当該領域の５’末端側に任意の制限酵素認識部位を含んでいてもよい。この制限酵素認識部位は、例えば、市販の制限酵素によって切断される部位である。制限酵素認識部位の配列は、制限酵素を提供している種々の製造者によって配布されているカタログなどに記載されている公知の配列である。よって、制限酵素認識部位は、（サブ）クローニングまたは発現に使用するベクターに合わせて、適宜選択すればよい。制限酵素認識部位には、例えば、制限酵素に切断されて平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）を生じる制限酵素部位または制限酵素に切断されて粘着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄ）を生じる制限酵素部位がある。例えば、サブクローニング用のベクターとして、トポイソメラーゼを利用して、平滑末端を有するＤＮＡ断片をライゲーション可能なベクターを使用する場合、ベクターの制限酵素消化および制限酵素処理後のベクターの精製が不要になるので、操作が簡略化される。

また、各５’末端プライマーは、上記制限酵素認識部位の５’末端側にさらなる塩基を含んでいてもよい。当該さらなる塩基は、プライマーダイマー形成の回避、ヘアピン形成の回避およびＰＣＲ反応条件の緩和など、適切にＰＣＲ産物を増幅させるために、当業者であれば、その数および種類を適宜設計することができる。

各３’末端プライマーは、ＰＣＲ反応において標的配列とハイブリダイズするための領域を少なくとも有していればよいが、当該領域の３’末端側に、上述したような制限酵素認識部位を含んでいてもよい。また、３’末端プライマーは、上記制限酵素認識部位の３’末端側にさらなる塩基を含んでいてもよい。３’末端プライマーにおける制限酵素認識部位およびさらなる塩基は、５’末端プライマーの設計と同様の基準において任意に選択することができる。

ＰＣＲ反応は、市販のサーマルサイクラーを用いて行うことができる。また、ＰＣＲ用の試薬も市販されたものを用いることができる。上記サーマルサイクラーの操作は、添付された指示書に従えばよいが、例えば、ＤＮＡを変性させる温度として９４℃、ＤＮＡをアニーリングさせる温度として５０〜６０℃、ＤＮＡの伸張反応をさせる温度として６８℃を用いることができる。

ヒトｃＤＮＡは、抗体軽鎖のｃＤＮＡを含んでいるものであれば特に限定されず、ヒトの体液、組織、好ましくは、血液、リンパ液、脾臓組織等から採取され得るが、ヒトリンパ球から調製されたヒトリンパ球由来のｃＤＮＡであることが特に好ましい。ヒトリンパ球由来のｃＤＮＡは、例えば、末梢血等のヒトリンパ球を含む体液から、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ等を用いてリンパ球を分離し、市販のＲＮＡ抽出キットを用いることにより、トータルＲＮＡを抽出した上、公知のＲＴ−ＰＣＲ法を適用することにより取得することができるが、その方法は特に限定されない。

続いて、第１〜第４のプライマーの塩基配列、特に、ＰＣＲ反応において鋳型とハイブリダイズするための領域の塩基配列について詳細に説明する。

図１に、第１〜第４のプライマーの設計の一例を示す。図１に示すように、κ型の抗体軽鎖遺伝子は、５’末端側からＶ遺伝子、Ｊ遺伝子およびＣ遺伝子の順に並んでおり、全長が約６６０塩基である。また、抗体軽鎖遺伝子の５’末端側にはリーダー配列がつながっている。一実施形態において、１段階目のＰＣＲ反応のためのフォワードプライマー（第１のプライマー）は、リーダー配列の途中に設けられている。２段階目のＰＣＲ反応のためのフォワードプライマー（第２のプライマー）は、抗体軽鎖遺伝子（Ｖ遺伝子）の５’末端領域に設けられている。１段階目および２段階目のリバースプライマー（第３および第４のプライマー）は、抗体軽鎖遺伝子（Ｃ遺伝子）の３’末端領域に設けられている。

一実施形態において、１段階目のＰＣＲ反応のための５’末端側プライマー（第１のプライマー）の１段階目のＰＣＲ反応において鋳型とハイブリダイズする領域の塩基配列は、ＡＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＴＧ（配列番号４３）またはＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＴＧ（配列番号４４）である。第１のプライマーをこのように設計することにより、２段階のＰＣＲ反応によって、サブグループＩＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子をより選択的かつ効率的に増幅することができる。以下、その理由を述べる。

図４３は、サブグループＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子のリーダー配列を示す図であり、図４４は、サブグループＩＩおよびＩＩＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子のリーダー配列を示す図であり、図４５は、サブグループＩＶ〜ＶＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子のリーダー配列を示す図である。図４３〜４５では、合わせて、第１のプライマーとの相同性を示している。図中、上部に記載したＡＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＴＧ（配列番号４３）と同一の配列の部分には、下線を付して示している。各リーダー配列の第１のプライマーに対応する部分について、図４６にまとめた。

図４４に示すように、サブグループＩＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子のリーダー配列は、ＡＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＴＧ（配列番号４３）またはＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＴＧ（配列番号４４）とほぼ同一の塩基配列を有する。したがって、第１のプライマーを用いたＰＣＲ反応により、サブグループＩＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子を好適に増幅することができる。

図４３〜４６に示すように、各サブグループに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子のリーダー配列と第１のプライマー（２０塩基）とは、２〜３塩基（サブグループＩ）、９塩基以上（サブグループＩＩＩ）、１４塩基（サブグループＩＶ）、１２塩基（サブグループＶ）、または８塩基以上（サブグループＶＩ）が異なっている。このように、サブグループＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子のリーダー配列が近い配列を有するだけであり、他のサブグループに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子のリーダー配列は大きく異なる配列を有し、１段階目のＰＣＲ反応のための５’末端側プライマーとして、上記のような配列を有する第１のプライマーを用いて、２段階のＰＣＲ反応を行うことにより、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子またはそのフラグメントを選択的に増幅可能である。

なお、第１のプライマーの塩基配列は、若干の変更があってもよい。例えば、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子のリーダー配列の第１のプライマーに対応する部分には、図４４に示すように、５’末端から５塩基目がＴであるものもあるため、第１のプライマーの、配列番号４３に示される部分の左から５塩基目をＴに変更してもよい。このように、サブグループＩＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子をより選択的かつ効率的に増幅することができる範囲で、例えば、配列番号４３または配列番号４４の塩基配列に対する相補配列によって示されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを第１のプライマーとして用いてもよい。ただし、特許文献１に記載の配列番号４７の塩基配列のように、配列番号４３または配列番号４４の塩基配列の５’末端側にＴＣを加えるか、または３’末端側にＣＴを加えることは好ましくない。なぜなら、図４３に示すように、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子のリーダー配列との親和性が増し、非特異的増幅が生じやすくなるためである。また、図４４に示すように、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子の特異的増幅も生じやすくなると予測される。以上のことから、１段階目のＰＣＲ反応のための５’末端側プライマー（第１のプライマー）の１段階目のＰＣＲ反応において鋳型とハイブリダイズする領域（鋳型に特異的な配列）は、ＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＴＧ（配列番号４３）またはＡＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＴＧ（配列番号４４）であることが特に好ましい。

このように、本実施形態に係るプライマーセットでは、特許文献１に記載のプライマーとは異なるプライマーを用いることによって、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子またはそのフラグメントをより選択的かつ効率的に増幅可能である。さらに、本実施形態に係るプライマーセットは、特許文献１に記載のプライマーセットとは異なり、２段階目のプライマーを備えている。これにより、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子またはそのフラグメントをさらに選択的かつ効率的に増幅可能である。

一実施形態において、２段階目のＰＣＲ反応のための５’末端側プライマー（第２のプライマー）は、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子またはそのリーダー配列の一部の相補鎖と特異的にハイブリダイズするものであればよいが、当該抗体軽鎖遺伝子の５’末端領域に相当するＧＡＴＲＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＹＣＡＧ（配列番号４５：ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）に対する相補鎖に特異的にハイブリダイズするものが好ましく、例えば、２段階目のＰＣＲ反応において当該鋳型とハイブリダイズする領域の塩基配列が、ＧＡＴＲＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＹＣＡＧ（配列番号４５）であるものであり得る。これにより、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子またはそのフラグメントをさらに選択的かつ効率的に増幅可能である。以下、その理由を述べる。

図４７は、サブグループＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子の５’末端側約６０塩基を示す図であり、図４８は、サブグループＩＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子の５’末端側約６０塩基を示す図であり、図４９は、サブグループＩＩＩ〜ＶＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子の５’末端側約６０塩基を示す図である。図４７〜４９では、合わせて、第２のプライマーとの相同性を示している。図中、上部に記載したＧＡＴＲＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＹＣＡＧ（配列番号４５）と同一の配列の部分には下線を付して示し、選択可能な塩基の一方と同じである場合にはさらに網掛けを付している。各リーダー配列の第２のプライマーに対応する部分について、図５０にまとめた。

図４８に示すように、サブグループＩＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子の５’末端は、ＧＡＴＲＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＹＣＡＧ（配列番号４５）とほぼ同一の塩基配列を有する。なお、５’末端から４塩基目がＡまたはＧであり、２０塩基目がＣまたはＴである。したがって、第２のプライマーを用いたＰＣＲ反応により、サブグループＩＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子またはそのフラグメントを好適に増幅することができる。

図４７および図５０に示すように、サブグループＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子の５’末端と、第２のプライマーとは、最小でも４塩基が異なる。そして、ＲをＧにしてＹをＴにした場合には最小でも６塩基が異なる。したがって、第２のプライマーを用いて２段階目のＰＣＲ反応を行った場合、サブグループＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子の非特異的な増幅を抑えることができる。ここで、上述したように、第１のプライマーは、サブグループＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子のリーダー配列に近いものであるが、第１のプライマーおよび第２のプライマーを併用して２段階のＰＣＲ反応を行うことにより、さらに選択的かつ効率的に、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子またはそのフラグメントを増幅可能である。

また、図４８〜５０に示すように、サブグループＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子の５’末端は、第２のプライマーとほぼ同一の塩基配列を有し、サブグループＶに属しているＶκ遺伝子を有するκ型抗体軽鎖遺伝子の５’末端は、第２のプライマーと大きく異なる塩基配列を有している。このように、第２のプライマーを用いた１段階のＰＣＲ反応では、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子を首尾よく選択的に増幅することは困難である。

以上のように、本発明に係る５’末端プライマー（第１のプライマー）を２段階のＰＣＲ反応の１段階目のＰＣＲ反応のためのプライマーとして用いて、任意の好適なプライマーを用いて２段階目のＰＣＲをさらに行えば、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子またはそのフラグメントを選択的かつ効率的に増幅することができる。また、本発明に係る５’末端プライマー（第２のプライマー）を２段階のＰＣＲ反応の２段階目のＰＣＲ反応のためのプライマーとして用いれば、さらに好適に、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子またはそのフラグメントを選択的かつ効率的に増幅することができる。

なお、上述したように、各５’末端側プライマー（第１および第２のプライマー）は、その５’末端側に、制限酵素認識部位およびさらなる塩基がつながっていてもよい。そのような第１のプライマーの一例は、ＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＴＧ（配列番号９）の塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、そのような第２のプライマーの一例は、ＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＲＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＹＣＡＧ（配列番号１１）の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。

１段階目および２段階目のＰＣＲ用の３’末端プライマー（第３および第４のプライマー）は、上述の５’末端プライマーと組み合わせて、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子またはその可変領域をコードするフラグメントを増幅し得るものであればよい。

このようなプライマーとしては、例えば、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子の可変領域の３’末端の約１５〜２０塩基と特異的にハイブリダイズするプライマー、当該κ型抗体軽鎖遺伝子の定常領域の一部と特異的にハイブリダイズするプライマーが挙げられる。これらのプライマーのうち、当該抗体軽鎖遺伝子（定常領域）の３’末端領域の一部（例えば、ＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧ（配列番号４６）に対する相補鎖）に特異的にハイブリダイズするものが好ましく、例えば、ＰＣＲ反応において鋳型とハイブリダイズする領域の塩基配列が、ＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧ（配列番号４６）に示されるプライマーであり得る。第３および第４のプライマーが、抗体軽鎖遺伝子（定常領域）の３’末端領域に特異的にハイブリダイズする場合、抗体軽鎖遺伝子の全体を増幅することができる。しかし、抗体軽鎖からなる抗体酵素は、その可変領域に触媒三つ組残基様構造を有し、可変領域において活性を有していると考えられるため、抗体軽鎖遺伝子における、可変領域を少なくともコードするフラグメントを増幅できれば本発明の目的を達成することができる。

上述したように、各３’末端側プライマー（第３および第４のプライマー）は、その３’末端側に、制限酵素認識部位およびさらなる塩基がつながっていてもよい。そのような第３および第４のプライマーの一例は、ｃｃｇｔＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧ（配列番号１０）の塩基配列によって示されるポリヌクレオチドである。

〔５．ポリヌクレオチドの製造方法〕
本発明は、ポリヌクレオチドの製造方法を提供する。一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドの製造方法は、上述したプライマーセットを用いた２段階のＰＣＲ反応により、ヒトｃＤＮＡからヒト抗体のκ型軽鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを増幅する工程を包含している。用いるプライマーの設計、ＰＣＲ反応の条件、鋳型ｃＤＮＡ等は、上述したとおりである。

当該工程の後に、２段階のＰＣＲ反応の反応産物は、例えば、所望の長さを有するポリヌクレオチドであるか否かについて、公知の方法（例えばアガロースゲル電気泳動など）によって確認され得る。所望の長さを有することが確認された上記反応産物は、例えば、精製されてシーケンス用のサブクローニングベクターに導入され得る。サブクローニングベクターに導入された上記反応産物は、シーケンス解析および相同性検索によってどの生殖細胞遺伝子型（ジャームラインジーン）に由来するのかが確認され得る。

本実施形態に係る方法によれば、１００％に近い割合でサブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子またはそのフラグメントであるポリヌクレオチドを増幅することができる。多種類のサブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子またはそのフラグメントを増幅することによって、これらの抗体軽鎖遺伝子またはそのフラグメントから、高い活性を有するか、または異なる基質に作用する抗体酵素を発現させることができる。ここで、抗体酵素が有する酵素活性は、特に限定はないが、プロテアーゼ活性またはペプチダーゼ活性であることが好ましい。

〔６．ポリペプチドの製造方法〕
本発明にかかるポリヌクレオチドの製造方法によって製造したポリヌクレオチドは、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子または可変領域を少なくともコードするそのフラグメントであるので、適当な宿主（例えば細菌、酵母）に導入して、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖または可変領域を少なくとも含むそのフラグメントを発現させることができる。

上記ポリヌクレオチドの導入には、例えば、上記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを作製し、宿主細胞に導入する手法が用いられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるためにプロモーター配列を適宜選択し、これと上記ポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。

上記ポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。

上記宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、上記〔２：本発明にかかる遺伝子〕に記載の遺伝子が全長ＤＮＡの場合の宿主細胞としては、ヒト又はマウス由来の細胞をはじめとして、線虫、アフリカツメガエルの卵母細胞、各種哺乳動物（ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等などの動物細胞が挙げられ、ＤＮＡフラグメントの場合の宿主細胞としては、例えば、大腸菌等の細菌、酵母（出芽酵母や分裂酵母）などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。

上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。

宿主細胞に導入された上記ポリヌクレオチドは、例えば、ＩＰＴＧ誘導法等を用いて発現させることができる。

〔６．まとめ〕
すなわち、本発明に係る抗ウイルス剤は、可変領域が配列番号２６、１４、２２、３０、５０、５４または３５のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるヒト抗体κ型軽鎖を含有することを特徴としている。

本発明に係る抗ウイルス剤では、上記κ型軽鎖が、単量体であることが好ましい。

従来、狂犬病ウイルスに対する中和抗体は、天然の抗体と同様、軽鎖２本および重鎖２本からなる四量体であり、狂犬病ウイルスに結合することにより、その中和活性を示す。中和抗体としてκ型軽鎖の単量体を用いる技術は従来全く知られておらず、また、κ型軽鎖の単量体を単独で用いることにより、高い抗ウイルス活性が得られることは、当業者が予測し得たものではなかった。

本発明に係る抗ウイルス剤では、上記κ型軽鎖のアミノ酸配列において、他の軽鎖とジスルフィド結合を形成するためのシステインが、削除またはシステイン以外のアミノ酸に置換されていることが好ましく、上記κ型軽鎖が、配列番号２７、１５、２３、３１、５１、５５または３６のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってよい。これにより、高い抗ウイルス活性を有するκ型軽鎖の単量体を容易に提供することができる。

本発明に係る抗ウイルス剤は、上記ウイルスがマイナス一本鎖ＲＮＡウイルスであることが好ましい。後述する実施例に示すように、本発明に係るウイルス剤は、マイナス一本鎖ＲＮＡウイルス（(-)ssRNA virus）に対して高い効果を有している。

本発明に係る抗ウイルス剤は、上記可変領域が、配列番号２６、１４、２２または３０のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、上記ウイルスが、ラブドウイルス科に属するウイルスであってもよい。可変領域が上記のようなポリペプチドからなる場合、本発明に係る抗ウイルス剤は、後述する実施例に示すように、狂犬病ウイルスおよび水疱口内炎ウイルスといったラブドウイルスに対して高い効果を有している。

本発明に係る抗ウイルス剤は、また、上記可変領域が、配列番号２６、１４、５０、５４または３５のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなり、上記ウイルスが、インフルエンザウイルスであってもよい。可変領域が上記のようなポリペプチドからなる場合、本発明に係る抗ウイルス剤は、後述する実施例に示すように、インフルエンザウイルスに対して高い効果を有している。

本発明はまた、狂犬病ウイルスに対するヒト抗体の軽鎖であって、酵素活性を有するヒト型の抗体酵素を提供する。

すなわち、本発明に係るヒト型の抗体酵素は、狂犬病ウイルスに対するヒト抗体のκ型軽鎖であって、アミダーゼ活性を有しており、その可変領域が、配列番号２６、１４、１６、１８、３０、３５または４０のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなることを特徴としている。本発明に係るヒト型の抗体酵素は、また、狂犬病ウイルスに対するヒト抗体κ型軽鎖であって、核酸分解活性を有しており、その可変領域が、配列番号２６、１４、３０、５０または５４のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。本発明に係るヒト型の抗体酵素は、また、狂犬病ウイルスに対するヒト抗体κ型軽鎖であって、がん細胞に対する細胞障害性を有しており、その可変領域が、配列番号１４または３０のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。本発明に係るヒト型の抗体酵素は、また、狂犬病ウイルスに対するヒト抗体κ型軽鎖であって、抗ウイルス活性を有しており、その可変領域が、配列番号１４、２６、２２、３０、５０、５４または３５のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってもよい。これらの抗体酵素は、ヒト型の抗体酵素であり、ヒトに投与しても副作用が極めて少ないと考えられる。

本発明に係るヒト型の抗体酵素は、上記κ型軽鎖のアミノ酸配列において、他の軽鎖とジスルフィド結合を形成するためのシステインが、削除またはシステイン以外のアミノ酸に置換されていることが好ましく、配列番号２７、１５、１７、１９、２３、３１、３６、４１、５１または５５のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるものであってよい。これにより、活性の強い、κ型軽鎖の単量体であるヒト型の抗体酵素を容易に提供することができる。

本発明はまた、本発明に係るヒト型の抗体酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクター、本発明に係るポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を提供する。

なお、本発明は当然に以下の発明を含む。

本発明に係るポリペプチドは、下記（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドであることを特徴としている：（Ａ）配列番号１、３、５もしくは７のアミノ酸配列によって示される、ポリペプチド；（Ｂ）配列番号１、３、５もしくは７のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているアミノ酸配列によって示されるポリペプチドであって、アミダーゼ活性を有する、ポリペプチド。

上記ポリペプチドは、ヒト抗体のκ型の軽鎖であることが好ましい。

本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチドをコードすることを特徴としている。

本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のポリヌクレオチドであってもよい：（Ａ）配列番号２、４、６もしくは８の塩基配列によって示される、ポリヌクレオチド；（Ｂ）配列番号２、４、６もしくは８の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されている塩基配列によって示されるポリヌクレオチドであって、アミダーゼ活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖をコードする、ポリヌクレオチド；（Ｃ）配列番号２、４、６もしくは８の塩基配列によって示される相補鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アミダーゼ活性を有するヒト抗体のκ型の軽鎖をコードする、ポリヌクレオチド。

本発明に係るベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。

本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。

本発明に係る抗体酵素は、ヒト抗体のκ型の軽鎖またはそのフラグメントであり、配列番号１のアミノ酸配列の第１〜１１３番目、配列番号３のアミノ酸配列の第１〜１１３番目、または配列番号５のアミノ酸配列の第１〜１１２番目によって示される可変領域を備え、アミダーゼ活性を有することを特徴としている。

本発明に係る抗ウイルス剤は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る抗体酵素を含有していることを特徴としている。

上記抗ウイルス剤は、ラブドウイルス科に属するウイルスに対する抗ウイルス剤であることが好ましく、上記ウイルスが、狂犬病ウイルスまたは水疱口内炎ウイルスであることがより好ましい。

また、本発明に係るプライマーセットは、ヒトｃＤＮＡを鋳型とする２段階のＰＣＲ反応によって、ヒト抗体κ型軽鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーセットであって、１段階目のＰＣＲ反応のためのプライマーとして、該１段階目のＰＣＲ反応において該鋳型とハイブリダイズする領域が、配列番号４３または４４の塩基配列によって示されるポリヌクレオチドである第１のプライマーを備えていることを特徴としている。

本発明に係るプライマーセットを用いることにより、ヒトｃＤＮＡから、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖ｃＤＮＡまたは少なくとも可変領域をコードするそのフラグメントをより選択的かつ効率的に増幅することができる。これにより、抗体酵素であるヒト型抗体κ型軽鎖を効率よく取得することができる。

なお、本発明に係るプライマーセットは、２段階目のＰＣＲ反応のためのプライマーとして、配列番号４５の塩基配列に対する相補配列によって示されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである第２のプライマーを備えていることが好ましい。

あるいは、本発明に係るプライマーセットは、２段階のＰＣＲ反応により、ヒトｃＤＮＡを鋳型に、ヒト抗体κ型軽鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーセットであって、１段階目のＰＣＲ反応のためのプライマーとして、配列番号４３または４４の塩基配列に対する相補配列によって示されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである第１のプライマーを備え、２段階目のＰＣＲ反応のためのプライマーとして、配列番号４５の塩基配列に対する相補配列によって示されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである第２のプライマーを備えているものであってもよい。

また、本発明に係るプライマーセットは、１段階目のＰＣＲ反応のためのプライマーとして、ヒト抗体κ型軽鎖の定常領域の遺伝子の一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである第３のプライマーをさらに備え、２段階目のＰＣＲ反応のためのプライマーとして、ヒト抗体κ型軽鎖の定常領域の遺伝子の一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである第４のプライマーをさらに備えていることが好ましい。第３のプライマーは、配列番号４６の塩基配列に対する相補配列によって示されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、第４のプライマーは、配列番号４６の塩基配列に対する相補配列によって示されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであることが好ましい。

また、本発明に係るプライマーセットにおいて、上記ヒトｃＤＮＡは、リンパ球由来のｃＤＮＡであってもよい。

本発明は、また、本発明に係るプライマーセットを用いた２段階のＰＣＲ反応により、ヒトｃＤＮＡからヒト抗体κ型軽鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを増幅する工程を包含している、ポリヌクレオチドの製造方法、および、当該ポリヌクレオチドの製造方法により製造したポリヌクレオチドを、宿主細胞内で発現させる工程を包含している、ポリペプチドの製造方法を包含する。

本発明は、ここまでに説明した実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示される範囲内で種々の変更、改変および組合せが可能であり、種々の変更、改変および組合せによって得られる実施形態は、本発明に包含される。

〔１：独自に開発した２段階のＰＣＲ反応によるクローンの取得〕
（１−１．プライマーの設計）
図１に示すように、１段階目のＰＣＲ反応のためのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、２段階目のＰＣＲ反応のためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計した。

発明者らは、ペプチドまたは抗原タンパク質を切断または分解する活性を有するヒト由来の抗体酵素を用いて、その性質や構造の特徴を詳細に解析した。その結果、ペプチドまたは抗原タンパク質を切断または分解する活性を有する抗体酵素は、いずれもその立体構造中に、セリン残基、アスパラギン酸残基およびヒスチジン残基が立体構造において近接して存在することを明らかにした。ここで、「立体構造において近接して存在する」とは、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基との距離が、少なくとも３〜２０Åの範囲内、好ましくは３〜１０Åの範囲内にあることを意味する。以下において上記３つのアミノ酸残基が立体構造において近接している構造を「触媒三つ組残基様構造」と称する。上記３つのアミノ酸残基間の距離が３〜２０Å、特に３〜１０Åの範囲内であれば、三つ組み残基様構造と基質（ペプチドや抗原タンパク質）とが十分に反応できると考えられる。

抗体は、重鎖（Ｈ鎖：Heavy chain）および軽鎖（Ｌ鎖：Light chain）から構成されている。重鎖および軽鎖は、可変領域（ＶＲ：Variable Region）および定常領域（ＣＲ：Constant Region）から構成されており、可変領域は、超可変領域（ＣＤＲ：Complimentarity Determining Region）を有している。さらに、抗体の軽鎖は、κ型およびλ型に分類される。

抗体遺伝子は、可変領域および定常領域をコードしている。軽鎖の可変領域の構造遺伝子は、Ｖ遺伝子およびＪ遺伝子から構成されている。生殖細胞系列（germline）遺伝子は、それぞれコードするアミノ酸配列が異なるため、抗体遺伝子を構成する可変領域の構造遺伝子によってそれぞれの遺伝子産物である抗体も配列が異なる。これによって、抗体の多様性が生じる。そして、この生殖細胞系列遺伝子は、その塩基配列に基づいて、サブグループに分類される。

発明者らは、ヒト抗体において、サブグループＩＩに属するκ型軽鎖のＶ遺伝子（サブグループＩＩのＶκ遺伝子）にコードされるポリペプチドが上記三つ組様残基構造を高頻度に有していることを明らかにした（例えば、特許文献１を参照のこと）。このことから、抗原との結合部位を構成する可変領域において上記三つ組様残基構造が形成されて、この構造に基づいて酵素活性を獲得した場合に、特に有用なヒト型抗体酵素が得られると考えられる。

しかし、Ｖκ遺伝子の各サブグループ間の配列が非常に類似しているため、ＰＣＲ反応を利用して、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子を増幅するためのプライマーの設計は非常に困難であった。本発明者らは、試行錯誤の結果、後述するような塩基配列のプライマーを用いた２段階のＰＣＲ反応によれば、効率的にサブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子を増幅することを見出した。

（１−２．ヒト末梢血ｃＤＮＡの調製）
狂犬病ウイルスのワクチンを用いて、複数回にわたって過剰免疫されたボランティアから得られた末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅを用いてリンパ球を分離した。ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、分離した約３．０×１０^７個のリンパ球からトータルＲＮＡを得た。ＴｈｅｒｏｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）をプライマーとして、トータルＲＮＡを逆転写することにより、目的とするｃＤＮＡ（ｃＤＮＡライブラリ−）を調製した。

（１−３．１段階目のＰＣＲ反応）
１段階目のＰＣＲ反応では、１−２．で調製したヒト末梢血ｃＤＮＡを鋳型として使用した。フォワードプライマーとしては、塩基配列が、ａｇｔｔＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＴＧ（配列番号９）であるオリゴヌクレオチドを用いた。なお、５〜１０番目（ＣＣＡＴＧＧ）は、制限酵素サイトである。リバースプライマーとしては、塩基配列が、ｃｃｇｔＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧ（配列番号１０）であるオリゴヌクレオチドを用いた。なお、５〜１０番目（ＣＴＣＧＡＧ）は、制限酵素サイトである。プライマーの詳細を表１にまとめた。

ＰＣＲ反応は、ＰＣＲチューブの中で、総量２０．０μｌの反応液により行った。反応液は、上記ヒト末梢血ｃＤＮＡ：０．５μｌ、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦバッファー：４．０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ：０．４μｌ、１０μＭリバースプライマー：０．８μｌ、１０μＭフォワードプライマー：０．８μｌ、滅菌ミリＱ水：１３．３μｌを混合したものに、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ：０．２μｌを加えることにより調製した。

サーマルサイクルの反応時間は、９８℃：３０秒→（１）９８℃：１０秒→（２）６０℃：３０秒→（３）７２℃：３０秒→（１）〜（３）の繰り返し（２９サイクル）→７２℃：５分→４℃で維持、とした。

ＰＣＲ反応後の反応液を、２％アガロースゲル(ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース）で電気泳動した。電気泳動後のゲルをＥｔＢｒ染色し、ＵＶ照射したところ、約７５０ｂｐ付近に、目的遺伝子の増幅を示すバンドが観察された（図２）。

上記ゲルから、フェノールクロロホルム法を用いてＰＣＲ産物を精製した。

（１−４．２段階目のＰＣＲ反応）
２段階目のＰＣＲ反応では、１−３．で得た一段階目のＰＣＲ産物を鋳型として使用した。フォワードプライマーとしては、塩基配列が、ａｇｔｔＣＣＡＴＧＧＡＴＲＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＹＣＡＧ（配列番号１１）であるオリゴヌクレオチドを用いた。なお、５〜１０番目（ＣＣＡＴＧＧ）は、制限酵素サイトである。リバースプライマーとしては、塩基配列が、ｃｃｇｔＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧ（配列番号１０）であるオリゴヌクレオチドを用いた。なお、５〜１０番目（ＣＴＣＧＡＧ）は、制限酵素サイトである。プライマーの詳細を表２にまとめた。

ＰＣＲ反応は、ＰＣＲチューブの中で、総量２０．０μｌの反応液により行った。反応液は、１−３．で得た一段階目のＰＣＲ産物（１／１０または１／１００に希釈）：０．５μｌ、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦバッファー：４．０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ：０．４μｌ、１０μＭリバースプライマー：０．８μｌ、１０μＭフォワードプライマー：０．８μｌ、滅菌ミリＱ水：１３．３μｌを混合したものに、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ：０．２μｌを加えることにより調製した。

サーマルサイクルの反応時間は、９８℃：３０秒→（１）９８℃：１０秒→（２）６０℃：３０秒→（３）７２℃：３０秒→（１）〜（３）の繰り返し（２９サイクル）→７２℃：５分→４℃で維持、とした。

増幅後のＰＣＲ産物は、１−３．と同様に、２％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ）電気泳動により検出した。図３に示す様に、７５０ｂｐ付近に目的遺伝子の増幅を示すバンドが観察された。なお、図に示すように、２段階目のＰＣＲ産物（１／１０希釈の鋳型を使用）および２段階目のＰＣＲ産物（１／１００希釈の鋳型を使用）は、１段階目のＰＣＲ産物よりもやや短くなっていることが判る。

上記ゲルから、フェノールクロロホルム法を用いて２段階目のＰＣＲ産物を精製した。

（１−５．ベクターへの組み込み）
１−４．における二段階のＰＣＲ反応により得られた約７５０ｂｐのＰＣＲ産物（サブグループＩＩに属するκ型軽鎖遺伝子）をｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯベクターへ組み込んだ。上記ＰＣＲ産物（約７５０ｂｐ）：０．５μｌ、食塩水：０．５μｌ、ミリＱ水：１．５μｌ、およびＴＯＰＯベクター：０．５μｌから、総量２．５μｌの反応液を調製し、２３℃で５分間反応させた。

（１−６．大腸菌の形質転換）
３３．３μｌのコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）に、サブグループＩＩに属するκ型軽鎖遺伝子をクローニングしたＴＯＰＯベクターを２μｌ加え、氷中に１０分間静置した。次に、４２℃のウォーターバスで４５秒間ヒートショックを行い、直ちに氷中に戻して２分間静置した。その後、クリーンベンチ内において、３００ｍｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間、震とう培養した（復活培養）。

復活培養の終了した培養液を、暖めておいた２×ＹＴ(Ｋｍ＋)固形培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。

（１−７．インサートの確認）
２０個のコロニー（コロニー＃１〜＃２０）について、インサートを確認した。まず、定法を用いて菌体からプラスミドを回収した。回収したプラスミド：１．０μｌ、１０×Ｈバッファー：１．５μｌ、Ｅｃｏ ＲＩ：０．３μｌ、および滅菌ミリＱ水：１２．２μｌからなる総量１５．０μｌの反応液を調製して、３７℃で一晩制限酵素反応を行った。その後、２％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース）を用いて電気泳動を行った。図４に示すように、コロニー＃１〜＃１６、＃１８、＃１９について、目的遺伝子の挿入を確認した。以降、これらをクローン＃１〜＃１６、＃１８、＃１９と称する。

（１−８．シーケンス解析および生殖細胞系列遺伝子（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｇｅｎｅ）の特定）
クローン＃１〜１６、＃１８および＃１９についてシーケンス解析を行い、相同性検索により、それぞれの生殖細胞系列遺伝子におけるＶκ遺伝子を判定した。結果を表３に示す。得られた１８クローンすべてがサブグループＩＩに属していた。

また、クローン＃１（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ１８ｂ）、クローン＃１６（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ１７）、クローン＃７（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ３／Ａ１９）、およびクローン＃１１（生殖細胞系列遺伝子型：Ａ１８ｂ）について、シーケンスの結果から推定されるアミノ酸配列の一部を図５の（ａ）〜（ｄ）に示す。他のクローンについてのシーケンスの結果から推定されるアミノ酸配列は図３９および図４０を参照のこと。なお、図３９および図４０に示すアミノ酸配列は、先頭にメチオニンが存在し、末尾のシステインがアラニンに置換され、さらにロイシンおよびヒスチジンが付加されている。しかし、当業者であれば、図３９および図４０の先頭からメチオニンを取り、末尾のＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１２）をＣに置換することにより、抗体軽鎖のアミノ酸配列を取得し得ることを容易に理解する。なお、図３９および図４０には、可変領域、定常領域およびＣＤＲ１〜３の位置が示されている。

さらに詳細に述べれば、クローン＃１の全長の塩基配列は、配列番号２に示される塩基配列であり、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードすることが推定される。なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列において第１〜１１３番目が可変領域であり、そのうち、第２４〜３９番目がＣＤＲ１であり、第５５〜６０番目がＣＤＲ２であり、第９４〜１０３番目がＣＤＲ３である。なお、可変領域のみのアミノ酸配列を配列番号１４に示した。

クローン＃１６の全長の塩基配列は、配列番号４に示される塩基配列であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードすることが推定される。なお、配列番号３に示されるアミノ酸配列において第１〜１１３番目が可変領域であり、そのうち、第２４〜３９番目がＣＤＲ１であり、第５５〜６０番目がＣＤＲ２であり、第９４〜１０３番目がＣＤＲ３である。なお、可変領域のみのアミノ酸配列を配列番号１６に示した。

クローン＃７の全長の塩基配列は、配列番号６に示される塩基配列であり、配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードすることが推定される。なお、配列番号５に示されるアミノ酸配列において第１〜１１２番目が可変領域であり、そのうち、第２４〜３９番目がＣＤＲ１であり、第５５〜６０番目がＣＤＲ２であり、第９４〜１０２番目がＣＤＲ３である。なお、可変領域のみのアミノ酸配列を配列番号１８に示した。

クローン＃６の全長の塩基配列は、配列番号２１に示される塩基配列であり、配列番号２０に示されるアミノ酸配列をコードすることが推定される。なお、配列番号２０に示されるアミノ酸配列において第１〜１１２番目が可変領域であり、そのうち、第２４〜３９番目がＣＤＲ１であり、第５５〜６０番目がＣＤＲ２であり、第９４〜１０２番目がＣＤＲ３である。なお、可変領域のみのアミノ酸配列を配列番号２２に示した。

クローン＃１８の全長の塩基配列は、配列番号２５に示される塩基配列であり、配列番号２４に示されるアミノ酸配列をコードすることが推定される。なお、配列番号２４に示されるアミノ酸配列において第１〜１１２番目が可変領域であり、そのうち、第２４〜３９番目がＣＤＲ１であり、第５５〜６０番目がＣＤＲ２であり、第９４〜１０２番目がＣＤＲ３である。なお、可変領域のみのアミノ酸配列を配列番号２６に示した。

（１−９．ヒートショックによる形質転換）
クローン＃１、クローン＃１６、クローン＃７、およびクローン＃１１をそれぞれ、Ｈｉｓタグ配列サイトを有するプラスミドに導入した。濃度５ｎｇ／μＬに調製した上記プラスミドＤＮＡ１μｌを、氷上にて融解させた５０μＬのＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに加え、５分間にわたって氷上に静置した。その後、４２℃のウォーターバスにて３０秒間インキュベーションした後、２分以上氷上に静置した。クリーンベンチ内において、さらに、３７℃に温めておいた２５０μＬのＳＯＣ培地を加え、ラウンドチューブに移し替えて、３７℃、２００ｒｐｍにて１時間振とう培養（復活培養）した。復活培養の後、プレートに５０μＬまたは１０μＬの培養液を播いて、３７℃で一晩インキュベーションした後、プレート上に形成されたコロニーの個数をカウントした。

図６の（ａ）は、５０μＬの培養液を播いたプレートを示す図であり、図６の（ｂ）は、５０μＬの培養液を播いたプレートを示す図である。示すように、５０μＬの培養液を播いたプレートには５個のコロニーが形成され、形質転換効率は７．２×１０^３ｐｆｕ／ｇＤＮＡであった。１００μＬの培養液を播いたプレートには３５個のコロニーが形成され、形質転換効率は２．１×１０^４ｐｆｕ／ｇＤＮＡであった。

（１−１０．エレクトロポレーションによる形質転換）
１−９．におけるヒートショックによる形質転換とは別に、エレクトロポレーションによる形質転換についても実施した。５０μＬのコンピテントセルに５μＬの上記プラスミドを加えた後に、これをキュベットに素早く移して、１分間氷上に放置した。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定し、キュベットをエレクトロポレーターに配置してパルスを印加した。直後に４５０μＬのＳＯＣ培地を加え、転倒混和し、２ｍＬのチューブに移して、３７℃で１時間振とう培養した。

（１−１１．タンパク質発現誘導（前培養および本培養）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）
３ｍＬのＬＢ培地および６μＬのアンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を試験管に入れ、形質転換した菌のグリセロールストックから竹串を用いて菌の一部を試験管に移し、３７℃にて一晩前培養した。前培養の後、５ｍＬのＬＢ培地および５μＬのアンピシリン（最終濃度５ｎｇ／ｍＬ）を試験管に入れ、前培養した培養液をＬＢ培地の１／１００量（５０μＬ）だけ当該試験管に移し、２５℃にて本培養を開始した。本培養は、Ｏ．Ｄ．_６６０が約０．６〜０．８になるまで続けた。Ｏ．Ｄ．_６６０が約０．６〜０．８に達した後、０．１ＭのＩＰＴＧ５０μＬを試験管内に加え、３７℃にて６時間培養した。６時間後に５ｍＬチューブに培養液を入れ、４℃、１８０００×ｇにて１０分間遠心した。培地（上清）をデカンテーションによってファルコンチューブに移した。また、菌体（ペレット）に１×ＰＢＳを加え、菌体をピペットによって懸濁し、別のファルコンチューブに移した。培地および菌体の各々を凍結して保存した。

ＩＰＴＧによる誘導あり（＋）および誘導なし（−）の条件下において上記培地をサンプルとして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって目的のタンパク質の発現を確認した。その結果を図７および図８に示す。図７は、ＩＰＴＧ添加あり（＋）の菌体懸濁液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。図８は、ＩＰＴＧ添加なし（−）の菌体懸濁液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。なお、抗体のκ型軽鎖の理論分子量は約２４ｋＤａであるが、還元条件においてＳ−Ｓ結合が切断されるので、約３１ｋＤａの位置にバンドが現れる。図では、抗体のκ型軽鎖のバンドが現れる位置を矢印によって示している。

図７に示すように、ＩＰＴＧによる誘導あり（＋）の場合に、所望のタンパク質の発現を確認した。各サンプルにおける目的のタンパク質のバンドの濃度は、９レーンのＢＳＡ（濃度１００μｇ／ｍｌ、１０μｌ）のバンドの濃度と同程度であるので、サンプルの濃度は１μｇ／１ｍｌと推定される。なお、図８に示すように、ＩＰＴＧによる誘導なしの場合は、所望のタンパク質の発現は確認されなかった。

（１−１２．菌体の可溶性画分および不溶性画分の回収ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）
また、１−１１．において得られた菌体（ペレット）の懸濁液を、粘性がなくなるまで液体窒素を用いて繰り返し凍結融解させた後、１４０００ｒｐｍ、４℃にて２５分間遠心した。得られたペレットを不溶性画分とし、上清を可溶性画分としてそれぞれ回収した。不溶性画分には、サンプバッファーを加えてペレットを溶解させた。

ＩＰＴＧによる誘導あり（＋）およびＩＰＴＧによる誘導なし（−）の可溶性画分および不溶性画分をサンプルとして用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって、目的のタンパク質の発現を確認した。その結果を図９および図１０に示す。図９は、菌体可溶性画分におけるタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。示すように、目的のタンパク質（矢印によって示した約３１ｋＤａのバンド）は、ＩＰＴＧによる誘導あり（＋）のレーン２においてわずかに検出された。図１０は、菌体不溶性画分におけるタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。示すように、ＩＰＴＧによる誘導あり（＋）のレーン１〜６において目的のタンパク質が若干検出された。

（１−１３．ウエスタンブロッティングによる発現タンパク質の同定）
タンパク質の発現を確認することができたため、続いて、発現されたタンパク質が抗体軽鎖であるか否かを同定するために、抗ヒト型（Ｆａｂ’）_２抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。まず、２−４．において得られたＩＰＴＧによる誘導あり（＋）およびＩＰＴＧによる誘導なし（−）の各々の培地を、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿により濃縮し、電気泳動用ゲルの各レーンに流して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。続いて、電極を用いてメンブレンへの転写を行い、当該メンブレンをブロッキングした後、抗ヒト型（Ｆａｂ’）_２抗体と免疫反応させた。その後、発色基質液を加え、メンブレンを観察した。結果を図１１に示す。図１１は、目的タンパク質のバンドを可視化したメンブレンを示す写真である。示すように、図７、図９および図１０においてバンドが確認された３１ｋＤａ付近に、強いバンドが検出された。これにより、大腸菌において発現したタンパク質がヒト型抗体軽鎖であることを同定することができた。

（１−１４．発現タンパク質の精製）
発現タンパク質（ヒト型抗体軽鎖）を、一次精製および二次精製した。

一次精製としては、抗体カラムを用いたアフィニティー精製を行った。アフィニティー精製におけるクロマトグラムを図１２に示す。また、得られた各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）で分析した結果を図１３に示す。図１３の（ａ）は、サンプルとして、還元していない発現タンパク質をアプライしたときの結果を示し、図１３の（ｂ）は、サンプルとして、還元していない発現タンパク質をアプライしたときの結果を示す。示すように、フラクション２（Ｆｒ．２）以降においてかなり綺麗に精製されていた。非還元下（図１３（ａ））では、約２６ｋＤａ付近、還元下（図１３の（ｂ））では、約３１ｋＤａ付近に目的のヒト型抗体軽鎖の単量体が検出された。また、非還元下（図１３の（ａ））では、約５０ｋＤａ付近に、２量体が検出された。なお、約４０ｋＤａ付近の薄いバンドは不純物である。フラクション１〜３（Ｆｒ．１、Ｆｒ．２、およびＦｒ．３）をまとめて二次精製を行った。

二次精製としては、Ｈｉｓタグを用いた精製を行った。Ｈｉｓタグ精製におけるクロマトグラムを図１４に示す。また、得られた各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）で分析した結果を図１５に示す。図１５の（ａ）は、サンプルとして、還元していない発現タンパク質をアプライしたときの結果を示し、図１５の（ｂ）は、サンプルとして、還元していない発現タンパク質をアプライしたときの結果を示す。示すように、二次精製後では、全フラクションにおいて綺麗に精製されていた。非還元下（図１５の（ａ））では、約２６ｋＤａ付近、還元下（図１５の（ｂ））では、約３１ｋＤａ付近に目的のヒト型抗体軽鎖の単量体が検出された。また、非還元下（図１５の（ａ））では、約５０ｋＤａ付近に、２量体が検出された。このように、銀染色の結果、ヒト抗体軽鎖以外のバンドが検出されたいことから、二次精製により高純度に精製されたと考えられる。二次精製されたサンプルを用いて以下の酵素活性試験を実施した。

（１−１５．酵素活性試験）
１−１４．において精製したクローン＃１、＃７、＃１１および＃１６由来のヒト型抗体軽鎖のそれぞれについて、酵素活性を測定した。酵素活性の測定には、市販されている配列の異なるペプチドにＭＣＡ（Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｙｌ−Ａｍｉｄｅ）を結合させた基質（ＭＣＡ標識ペプチド）を使用した。ＭＣＡ標識ペプチドを使用するプロテアーゼ活性試験では、標識ペプチドが切断されて遊離する部分が、切断前の標識ペプチドと異なる波長の蛍光を発することを利用してプロテアーゼ活性を測定する。より詳細には、ＭＣＡ標識ペプチドでは、蛍光物質であるＭＣＡに隣接するリジン残基のεアミノ基がアセチル化されている。ＭＣＡ標識ペプチドが、上記リジン残基のカルボキシル末端側において切断されると、ペプチド部分とＡＭＣ（Ａｍｉｎｏ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｉｎ）とに分かれる。ＡＭＣは、切断前のＭＣＡに由来する。遊離したＡＭＣが発する蛍光の波長は、ペプチジル−ＭＣＡとは異なるので、ＡＭＣによって発せられる蛍光の強度の変化を利用して、どれだけの基質が切断を受けたのかを測定することができる。

（１−１６．材料および器具）
サンプルとして、１−１４．においてクローン＃１、＃７、＃１１および＃１６から生産し、精製したヒト型抗体軽鎖を用いた。ネガティブコントロールとして、ヒト型抗体軽鎖遺伝子が挿入されていないｐＥＴ２０ｂ（＋）からの発現生成物を使用した。試薬などの調製に際しては、滅菌したミリＱ水を使用し、使用するマイクロチューブおよびチップは、オートクレーブ処理によって滅菌されたものを用いた。無菌操作は、全てクリーンベンチ内で行った。測定時の励起波長は３６０ｎｍとし、測定する蛍光波長は４６５ｎｍとした。

（１−１７．ＭＣＡ分解試験）
精製した各ヒト型抗体軽鎖の濃縮サンプル（１０μＭ、５μＭおよび１μＭ）を各ＭＣＡ標識ペプチドに加えた反応液を調製して、２５℃の気相インキュベータおよび３７℃の気相インキュベータの中で反応させた。

ＭＣＡ標識ペプチドとしては、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）およびトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）の基質としてＶＰＲ−ＭＣＡ、ＱＡＲ−ＭＣＡ、Ｄ（ＯＢｚｌ）ＰＲ−ＭＣＡおよびＢｚ−Ｒ−ＭＣＡの単体を混合したもの（Ｒ１グループ）、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａおよびｔ−ＰＡの基質としてＩＥＧＲ−ＭＣＡおよびＰｙｒ−ＧＲ−ＭＣＡを混合したもの（Ｒ２グループ）、プラスミン（Ｐｌａｓｍｉｎ）の基質としてＥＫＫ−ＭＣＡおよびＶＬＫ−ＭＣＡを混合したもの（Ｋグループ）、ならびに、エラスターゼ（Ｅｌａｓｔａｓｅ）およびキモトリプシン（Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）の基質としてＡＰＡ−ＭＣＡ、ＡＡＦ−ＭＣＡおよびＡＡＡ−ＭＣＡを混合したもの（ＡＦグループ）、Ｑ（ＯＢｚｌ）ＡＲ−ＭＣＡ、ＩＥＧＲ−ＭＣＡ、ＰｙｒＧＲ−ＭＣＡ、ＶＰＲ−ＭＣＡ、ＱＡＲ−ＭＣＡ、ＥＫＫ−ＭＣＡ、ＥＡＲ−ＭＣＡ、Ｒ−ＭＣＡ、ＤＰＲ−ＭＣＡ、ＰＦＲ−ＭＣＡ、ならびにＦＳＲ−ＭＣＡを用いた。なお、反応液における各ＭＣＡペプチドの合計の濃度は２００μＭに調整した。

すなわち、試験用の反応液として、濃縮サンプル溶液：５０μｌ、１０ｍＭのＭＣＡ標識ペプチド（混合物）：４μｌ、および５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）：１４６μｌを混合し（総量２００μｌ）、ヒト型抗体軽鎖をＭＣＡ基質と反応させた。ネガティブコントロール用の反応液として、ｐＥＴ２０ｂ（＋）発現生成物の溶液：５０μｌ、１０ｍＭのＭＣＡ標識ペプチド（混合物）：４μｌおよび５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）：１４６μｌを混合し（総量２００μｌ）、ｐＥＴ２０ｂ（＋）の発現生成物をＭＣＡ基質と反応させた。未反応液として、１０ｍＭのＭＣＡ標識ペプチド（混合物）：４μｌおよび５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）：１９６μｌを混合した（総量２００μＬ）。比較対照用の反応液として、２００ｐＭのトリプシン：１００μｌ、１０ｍＭのＭＣＡ標識ペプチド（混合物）：４μｌおよび５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）：９６μｌを混合し（総量２００μＬ）、トリプシンをＭＣＡ基質と反応させた。なお、クローン＃１、＃７、＃１６由来のヒト型抗体軽鎖に係る試験では、反応液におけるヒト型抗体軽鎖の濃度は２μＭに、トリプシンの濃度は５０ｐＭに調整した。

（１−１８．試験結果）
クローン＃１、＃７、＃１１および＃１６由来のヒト型抗体軽鎖のＭＣＡ分解試験の結果を図１６〜１９に示す。

図１６は、クローン＃１１由来のヒト型抗体軽鎖のＭＣＡ分解試験の結果を示す図である。ｐＥＴ２０ｂ（＋）は、ネガティブコントロールを示し、Ａ１８＃１１／ｐＥＴ２０ｂ（＋）が、クローン＃１１由来のヒト型抗体軽鎖を用いた結果を示し、Ｔｒｙｐｓｉｎは、トリプシンを用いた結果を示す。示すように、クローン＃１１のヒト型抗体軽鎖は、３７℃において反応させた場合、Ｒ１、Ｒ２、ＫおよびＡＦのいずれグループに対しても、分解活性を示さないか、またはわずかな分解活性しか示さなかった（図１６の（ａ）〜（ｄ））。反応温度を２７℃とした場合も結果は同様であった（データ示さず）。

さらに、クローン＃１１のヒト型抗体軽鎖について、Ｄ（ＯＢｚｌ）ＰＲ−ＭＣＡ、ＩＥＧＲ−ＭＣＡおよびＰｙｒ−ＧＲ−ＭＣＡに対する分解活性を個別に試験したが、ＩＥＧＲ−ＭＣＡに対してわずかに分解活性を示したのみであった（図１６の（ｅ）〜（ｇ））。

図１７は、クローン＃１６由来のヒト型抗体軽鎖のＭＣＡ分解試験の結果を示す図である。「−×−」は、ネガティブコントロールを示し、「−●−」が、クローン＃１１由来のヒト型抗体軽鎖を用いた結果を示す。示すように、クローン＃１６のヒト型抗体軽鎖は、ＱＡＲ−ＭＣＡおよびＶＰＲ−ＭＣＡに対して分解活性を示した（図１７の（ａ）および（ｂ））。しかし、ＫグループおよびＥＫＫ−ＭＣＡに対して分解活性をほとんど示さず（図１７の（ｃ）および（ｄ））、ＡＦグループに対しては分解活性をまったく示さなかった（図１７の（ｅ））。

図１８は、クローン＃１由来のヒト型抗体軽鎖のＭＣＡ分解試験の結果を示す図である。「−×−」は、ネガティブコントロールを示し、「−●−」が、クローン＃１由来のヒト型抗体軽鎖を用いた結果を示し、「−○−」は、トリプシンを用いた結果を示す。示すように、クローン＃１由来のヒト型抗体軽鎖は、ＥＡＲ−ＭＣＡ、ＱＡＲ−ＭＣＡおよびＥＫＫ−ＭＣＡに対して強い分解活性を示し（図１８の（ａ）〜（ｃ）および（ｅ））、Ｋに対しても弱いながら分解活性を示した（図１８の（ｄ））。一方、ＡＦグループに対しては分解活性をまったく示さなかった（データ示さず）。

図１９は、クローン＃７由来のヒト型抗体軽鎖のＭＣＡ分解試験の結果を示す図である。ＰＢＳは、ネガティブコントロールを示し、ｒｅｃ＃７−Ｌが、クローン＃７由来のヒト型抗体軽鎖を用いた結果を示し、Ｔｒｙｐｓｉｎは、トリプシンを用いた結果を示す。示すように、クローン＃７由来のヒト型抗体軽鎖は、ＱＡＲ−ＭＣＡおよびＢｚ−Ｒ−ＭＣＡに対して分解活性を示した（図１９の（ｃ）および（ｄ））。ＥＫＫ−ＭＣＡに対して分解活性をわずかに示した（図１９の（ｇ））。ＫグループおよびＡＦグループに対してが分解活性をまったく示さなかった（図１９の（ｆ））。

以上のように、ペプチドの分解活性を有するヒト型抗体軽鎖を得ることができた。特に、クローン＃１のヒト型抗体軽鎖は、強い活性を有するので有用性が高いと考えられる。また、クローン＃１およびクローン＃１１のヒト型抗体軽鎖は、同じ生殖細胞系列遺伝子（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｇｅｎｅ）に由来するにもかかわらず、一方は高活性であり、他方はほとんど活性を示さなかった。

（１−１９．クローン＃６およびクローン＃１８について）
クローン＃６およびクローン＃１８についても、１−９．から１−１８．までと同様に、形質転換、発現タンパク質の精製および酵素活性の測定を行った。結果、クローン＃６は酵素活性を有しておらず、クローン＃１８は酵素活性を有していた。

〔２：ＬＣＡライブラリおよびＬＣ２ライブラリからのクローンの取得〕
以下のような手順により、ＬＣＡライブラリおよびＬＣ２ライブラリの二つのライブラリを構築した。

（２−１．ヒト末梢血ｃＤＮＡの調製）
狂犬病ウイルスのワクチンを用いて、複数回にわたって被験者を過剰免疫し、血清の中和活性を測定した。血清の中和活性が最も高かった（７．２ＩＵ）被験者をドナーとして末梢血を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅを用いて当該末梢血からリンパ球を分離した。ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、分離した約３．０×１０^７個のリンパ球からトータルＲＮＡを得た。ＴｈｅｒｏｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）をプライマーとして、トータルＲＮＡを逆転写することにより、後述するＰＣＲ反応において鋳型とするｃＤＮＡを調製した。

（２−２．ＬＣＡライブラリの構築）
まず、図２８に示すようなプライマーを設計した。詳しくは、ＮＣＢＩのＩｇＢＬＡＳＴ（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）に登録されているヒト抗体軽鎖遺伝子の配列情報に基づき、これらのヒト抗体軽鎖遺伝子を網羅的に増幅するためのプライマーセットとして、５’（フォワード）プライマー２０種類と、３’（リバース）プライマー１種類とからなる計２０ペアのプライマーセットを設計した。５’プライマーは、ヒト抗体軽鎖のＶ領域のＮ末端領域に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとし、３’プライマーは、ヒト抗体軽鎖の定常（Ｃ）領域のＣ末端領域に対応する塩基配列に対する相補配列を有するオリゴヌクレオチドとした。なお、５’プライマーには、大腸菌発現ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入するための４塩基（ＣＡＣＣ）を付加した。

表１に各プライマーの塩基配列を示す。表１には、各５’プライマーを用いて増幅されるヒト抗体軽鎖遺伝子のＶκ遺伝子のサブグループを併せて示した。

次に、上述したｃＤＮＡおよび２０ペアのプライマーセットを用い、各ペア毎にＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応では、初めに９５℃で５分間インキュベートした後、９５℃で１５秒間、５４℃で５０秒間、および７２℃で９０秒間のサイクルを３５サイクル繰り返し、さらに７２℃で１０分間保持した後、４℃で保存した。ポリメラーゼとしてはＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従い使用した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、ゲルから目的の６６０ｂｐ付近のバンドを切り出し、精製した。

図２９に、ＰＣＲ産物の電気泳動結果の一部を示す。ＭＭは、マーカー（１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を示し、（１）は、５’プライマーとしてＶｋ３ｂＴＯＰＯを用いたＰＣＲ反応の産物を示し、（２）は、５’プライマーとしてＶｋ４ａＴＯＰＯを用いたＰＣＲ反応の産物を示す。図２９に示すように、目的の６６０ｂｐ付近に主要なバンドが観察され、ヒト抗体軽鎖遺伝子が効率よく増幅されたことが示された。なお、他の５’プライマーを用いたＰＣＲ反応の産物についても同様の結果が得られた。

続いて、精製した各ＰＣＲ産物を、製造者の指示に従い、大腸菌発現ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ＬＣＡライブラリを構築した。ＬＣＡライブラリのサイズは、１．３５×１０⁵ＣＦＵであり、十分な多様性を有していた。

（２−３．ＬＣ２ライブラリの構築）
サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有するヒト抗体軽鎖遺伝子のみを増幅するために、５’プライマーとして、サブグループＩＩに対応するプライマー（表４に示すＶｋ２ａＴＯＰＯ、Ｖｋ２ｂＡＴＯＰＯ、Ｖｋ２ｂＧＴＯＰＯおよびＶｋ２ｃＴＯＰＯの４種類）を用い、３’プライマーとして、ＶＣＲ２８６２を用いて、２−２．と同様の手順でＰＣＲ反応を実施した。

図３０に、ＰＣＲ産物の電気泳動結果の一部を示す。ＭＭは、マーカー（１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を示し、（１）は、５’プライマーとしてＶｋ２ａＴＯＰＯを用いたＰＣＲ反応の産物を示し、（２）は、５’プライマーとしてＶｋ２ｂＡＴＯＰＯを用いたＰＣＲ反応の産物を示し、（３）は、５’プライマーとしてＶｋ２ｂＧＴＯＰＯを用いたＰＣＲ反応の産物を示し、（４）は、５’プライマーとしてＶｋ２ｃＴＯＰＯを用いたＰＣＲ反応の産物を示す。図３０に示すように、目的の６６０ｂｐ付近に主要なバンドが観察され、ヒト抗体軽鎖遺伝子が効率よく増幅されたことが示された。

続いて、２−２．と同様に、精製した各ＰＣＲ産物を、製造者の指示に従い、大腸菌発現ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ＬＣ２ライブラリを構築した。ＬＣ２ライブラリのサイズは、２．５８×１０⁴ＣＦＵであり、十分な多様性を有していた。

なお、本発明者らは、ヒト抗体において、サブグループＩＩに属するκ型軽鎖のＶ遺伝子（サブグループＩＩのＶκ遺伝子）にコードされるポリペプチドが上記三つ組様残基構造を高頻度に有していることを明らかにしている（特許文献１を参照のこと）。そのため、ＬＣ２ライブラリに含まれるクローンがコードするヒト抗体軽鎖は、触媒三つ組様アミノ酸残基を有し、酵素活性を有する可能性が高いと考えられる。

（２−４．大腸菌の形質転換）
構築した２つのライブラリ（ＬＣＡライブラリ、ＬＣ２ライブラリ）のそれぞれについて、大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。ＴＯＰ１０内で、プラスミドを十分に増幅させた後、菌体を破壊してプラスミドを回収した。回収したプラスミドを精製した後、抗体軽鎖の効率のよい発現系である大腸菌ＢＬ２１の形質転換に供した。得られた形質転換体から、ライブラリ毎に３８４クローンをランダムに選び（計７６８クローン）、以下のスクリーニングに供した。

（２−５．第１および第２スクリーニング）
以下のように第１スクリーニングを実施した。具体的には、各大腸菌クローンを１５０μｌのＬＢ培地において培養し、その上清について、ＥＬＩＳＡ法により、抗体軽鎖の発現および狂犬病ウイルス抗原２種類に対する結合活性を測定した。測定結果に基づき、ＬＣＡライブラリから２０クローン、ＬＣライブラリから２３クローン、計４３クローンを、狂犬病ウイルス抗原２種類に対する結合活性がみられるクローンとして選択した。

さらに、第１スクリーニングにおいて選択されたクローンについて、ＬＢ培地による培養のスケールを１０ｍｌとし、第１スクリーニングと同様の手順で、第２スクリーニングを実施した。第２スクリーニングの際、各大腸菌クローンからプラスミドを回収し、回収効率のよいものを選択した。

また、得られたプラスミドについて、シーケンスを実施した。得られたシーケンスに基づき、Ｖκ領域のＮ末端の塩基配列を決定し、対応する抗体軽鎖のサブグループおよび由来する生殖細胞系列遺伝子（ジャームライン遺伝子）を推定するとともに、セリン、ヒスチジン、およびアスパラギン酸からなる触媒三つ組様残基を有すクローンを４つ、ＬＣ２ライブラリから見出した（ＬＣ２２Ｆ６、ＬＣ２２Ｇ２、ＬＣ２３Ｄ４およびＬＣ２３Ｆ１）。

以上の結果を表５に示す。この結果に基づき、ＬＣ２ライブラリから上記４クローンを選択し、ＬＣＡライブラリから３クローン（ＬＣＡ１Ｂ８、ＬＣＡ２Ｃ２およびＬＣＡ２Ｈ９）を選択し、第３スクリーニングに供した。

（２−６．粗精製）
上記７クローンについて、１００ｍｌの培養系で培養を行った。抗体軽鎖を発現させた菌体を、凍結融解を繰り返して破砕し、遠心分離して上清を回収した。回収した上清を、抗体軽鎖を含むサンプルとして、発現ベクター由来のＨｉｓタグを利用して抗体軽鎖を粗精製した。精製は、オープンカラムに担体（Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＴＭ６ ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）を充填し、緩衝液を自然落下させることにより実施した。カラムの平衡化、バインディング、およびサンプルアプライ後のウォッシュのための緩衝液の組成としては、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、および２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４）を用いた。溶出のための緩衝液の組成としては、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ演歌ナトリウム、および５００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４）を用いた。溶出後、タンパク質溶出画分を、ＰＢＳ（−）によって一晩透析した後、分画分子量１００００の限外ろ過膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて遠心操作により濃縮して粗精製品とした。粗製製品について、ＳＤＳ電気泳動およびクーマシーブリリアントブルー染色によって確認した（図３１）。図３１中、四角枠で示したバンドは、低分子量側が抗体軽鎖のモノマーを、高分子量側が抗体軽鎖のダイマーを示すと考えられる。なお、抗体軽鎖モノマーの分子量は、タグ等が付加されているため、約２７ｋＤａとなった。

（２−７．第３スクリーニング）
得られた粗精製品のうち、精製の際に沈殿を形成しなかったものについて、ＥＬＩＳＡプレートに固定した狂犬病ウイルス抗原（狂犬病ウイルス標品（αＣＶＳ）および精製ニワトリ胚細胞狂犬病ワクチン（αＰＥＣＥ））との親和性（ｋｄ）を測定した。

また、２２Ｄ４および２２Ｆ６について、酵素活性試験を行った。抗体軽鎖精製は全ての過程を低温下（４℃）、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下で行った。抗体軽鎖発現細胞の培養上清を濃縮した後、３倍量の移動層（ＰＢＳ＋２０％グリセロール＋１ｍＭＤＴＴ）で希釈してサンプルとした。公知の方法に基づき、アフィニティー精製およびゲルろ過を行った。ウェスタンブロットおよび銀染色によって精製純度を確認した。

酵素活性の測定に用いる基質（ＭＣＡ標識ペプチド）としては、Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＭＣＡ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＭＣＡ（いずれもペプチド研究所、ＤＭＳＯにより１０ｍＭに調整）を用いた。バッファーとしては、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、１００ｍＭグリシン、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０２％ＮａＮ₃からなるバッファー２を用いた。

６０μｌずつ各基質のおよび１２６０μｌのバッファー２を混合して、１５００μｌの反応液を調製した。反応液１００μｌに、各サンプル１００μｌを加えて３７℃においてインキュベートし、各時間における蛍光を測定した。結果を図３２に示す。なお、ネガティブコントロールとしては、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１００ｍＭグリシンおよび０．０２％ＮａＮ₃からなるバッファー１を用いた。ポジティブコントロールとしては、１ｍｇ／ｍｌ（４２μＭ）トリプシン１．６ｍｇおよび１ｍＭ ＨＣｌ１．６ｍｌを、バッファー１により４０ｐＭに希釈したものを用いた。また、１０ｍＭ ＡＭＣをバッファー１を用いて４００ｍＭとなるように希釈したものについても、反応液に加え、蛍光を測定した。示すように、２２Ｄ４および２２Ｆ６ともに、酵素活性を有していた。また、同様に２３Ｆ１についても酵素活性を測定した。

以上の結果を表６にまとめた。この結果に基づき、Ｌ２２Ｆ６、ＬＣ２３Ｄ４およびＬＣ２３Ｆ１を、抗ウイルス活性を有する抗体酵素の候補とした。なお、表６には、Ｌ２２Ｆ６およびＬＣ２３Ｄ４の分子量を併せて示す。

Ｌ２２Ｆ６、ＬＣ２３Ｄ４およびＬＣ２３Ｆ１の３つのクローンについて、全塩基配列を決定し、決定した塩基配列に基づき、解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＩＸ Ｖｅｒ．８）を用いて、アミノ酸配列ならびに軽鎖の可変領域および定常領域を推定した。ＬＣ２３Ｄ４のＶκ部位（生殖細胞系列遺伝子におけるＶκ遺伝子）は、生殖細胞系列遺伝子Ａ１９／Ａ３と、１００％の相同性を有し、ＬＣ２２Ｆ６のＶκ部位（生殖細胞系列遺伝子におけるＶκ遺伝子）は、生殖細胞系列遺伝子Ａ１９／Ａ３と、９７．７％の相同性を有していた。

クローンＬＣ２３Ｄ４の全長の塩基配列は、配列番号２９に示される塩基配列であり、配列番号２８に示されるアミノ酸配列をコードすることが推定される。なお、配列番号２８に示されるアミノ酸配列において第１〜１１２番目が可変領域であり、そのうち、第２４〜３９番目がＣＤＲ１であり、第５５〜６０番目がＣＤＲ２であり、第９４〜１０２番目がＣＤＲ３である。なお、可変領域のみのアミノ酸配列を配列番号３０に示した。

クローンＬ２２Ｆ６の全長の塩基配列は、配列番号３４に示される塩基配列であり、配列番号３３に示されるアミノ酸配列をコードすることが推定される。なお、配列番号３３に示されるアミノ酸配列において第１〜１１２番目が可変領域であり、そのうち、第２４〜３９番目がＣＤＲ１であり、第５５〜６０番目がＣＤＲ２であり、第９４〜１０２番目がＣＤＲ３である。なお、可変領域のみのアミノ酸配列を配列番号３５に示した。

クローンＬＣ２３Ｆ１の全長の塩基配列は、配列番号３９に示される塩基配列であり、配列番号３８に示されるアミノ酸配列をコードすることが推定される。なお、配列番号３８に示されるアミノ酸配列において第１〜１１２番目が可変領域であり、そのうち、第２４〜３９番目がＣＤＲ１であり、第５５〜６０番目がＣＤＲ２であり、第９４〜１０２番目がＣＤＲ３である。なお、可変領域のみのアミノ酸配列を配列番号４０に示した。

〔３：抗ウイルス活性の評価〕
（３−１．クローン＃１由来のヒト型抗体軽鎖の精製）
評価に用いるクローン＃１由来のヒト型抗体軽鎖を以下の様に一次精製および二次精製した。図２０の（ａ）は、一次精製におけるＮｉ−ＮＴＡカラムクロマトグラムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。図２０の（ｂ）は、二次精製における陽イオン交換クロマトグラムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。

図２０の（ａ）左段に示すように、サンプルのアプライ後に素通り画分が流れ切るまで、緩衝液Ａ（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）を流した。そして、左段のグラフにおける破線に示されるように、イミダゾールの濃度を４０ｍＭから３００ｍＭまで漸次的に上昇させて、ゲルと結合した成分を溶出させた。カラムとしてＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（直径１ｃｍ、２ｍｌ）を用い、精製を通して流速を０．１ｍＬ／分に維持した。図２０の（ａ）の右段に示すように、目的とする約３１ｋＤａのバンドが、フラクション番号３０〜３７に検出された。このサンプルを１つにまとめて、次の二次精製を行った。

図２０の（ｂ）の左段に示すように、サンプルのアプライ後に素通り画分が流れ切るまで、緩衝液Ａ（５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）、０．２ＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）を流した。そして、左段のグラフにおける破線に示されるように、ＮａＣｌの濃度を０．２Ｍから０．４Ｍまで漸次的に上昇させて、ゲルと結合した成分を溶出させた。カラムとしてＳＰ５ＰＷ（ＴＯＳＨＯ）を用い、精製を通して流速を０．１ｍｌ／分に維持した。精製前のサンプル、グラフ中の破線に囲まれた「ａ」の領域（フラクション番号１０〜１５）、およびグラフ中の破線に囲まれた「ｃ」の領域（フラクション番号２５〜３０）に含まれる成分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図２０の（ｂ）の右段に示すように、還元サンプルにおいて目的とする約３１ｋＤａのバンドが、ａおよびｃにおいて検出された。また、非還元サンプルにおいて約３１ｋＤａのバンドがａのみにおいて検出され、約５１ｋＤａのバンドがｃのみにおいて検出された。上述のように、抗体軽鎖の単量体は約３１ｋＤａであり、二量体は約５１ｋＤａである。したがって、サンプルａは抗体軽鎖の単量体の画分であり、サンプルｃは抗体軽鎖の二量体の画分である。

（３−２．抗ウイルス活性を示す反応温度および反応時間、ならびに使用濃度の検討）
続いて、ヒト型抗体酵素およびウイルスを用いたウイルスの中和試験によって、ヒト型抗体軽鎖の抗ウイルス活性を調べた。試験に用いたウイルスは、狂犬病ウイルス（以下、ＲＡＢＶと記載）のＣＶＳ−１１株（以下、ＣＶＳと記載）、ＥＲＡ株（以下、ＥＲＡと記載）およびＨＥＰ−Ｆｌｕｒｙ株（以下、ＨＥＰと記載）、水疱口内炎ウイルス（以下、ＶＳＶと記載）ならびにレオウイルス（以下、ＲｅｏＶと記載）である。ウイルスを感染させる細胞として、ＲＡＢＶ用にＮＡ細胞、他のウイルス用にＬ９２９細胞を用いた。

６ウェルプレートの各ウェルに、ＮＡ細胞を適当数播き、３７℃で一晩インキュベートすることにより、各ウェルに細胞を単層に吸着させた。感染価１００〜２００ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍａｉｏｎ ｕｎｉｔ）のＲＡＢＶ（ＣＶＳ）と、ヒト型抗体酵素（最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）またはＰＢＳとを混合し、２４時間または４８時間インキュベートした。インキュベート時の温度は、各サンプルごとに１５℃、２５℃または３０℃の３系列にした。各ウェルの培地を捨てて、ヒト型抗体酵素と反応させたウイルス液およびＰＢＳを加えたウイルス液を、各ウェルに入れた。３７℃にてインキュベートして、ウイルスを細胞に吸着させた。吸着後にウイルス液を捨てて適宜培地を加え、プラークが十分に形成されるまで（１〜２日間）３７℃にてインキュベートした。インキュベート後に、培地を捨ててから、細胞を固定した。

（３−３．感染フォーカスのプラークアッセイによる計測）
固定した細胞を洗浄し、クリスタルバイオレットを各ウェルにいれて細胞を染色した。細胞の染色後にクリスタルバイオレットを捨て、ウェルを水洗した。各ウェルを肉眼または実態顕微鏡によって観察し、ウイルス感染によって細胞がウェルから剥離して、染色されていない「抜け」をプラークとして計測した。ＰＢＳおよびウイルスの混合液をかけたウェルに形成されたプラーク数を１００％として、ヒト型抗体酵素およびウイルスの混合液をかけたウェルに形成されたプラーク数のパーセンテージを算出した。結果を図２１に示す。図２１の（ａ）は、ヒト型抗体酵素が高活性を示す温度について評価した図である。図２１の（ｂ）は、ヒト型抗体酵素が高活性を示す濃度について評価した図である。

図２１の（ａ）に示すように、本発明に係るヒト型抗体酵素は、２５℃にて４８時間ウイルスとインキュベートすることによって、ほとんどのウイルスの感染を抑制した。また、３０℃にて２４時間ＣＶＳとインキュベートした場合にもほとんどのウイルスの感染を抑制した。そして、図２１の（ｂ）に示すように、本発明に係るヒト型抗体酵素は、２５℃にて、濃度を種々の値に振ったとき、３０℃におけるウイルスの抑制能と比べて同様か、または多少、優れて活性を示した。よって、以降の実験において、ヒト型抗体酵素とウイルスとのインキュベーションは、１．５ｍｇ／ｍｌのヒト型抗体酵素を用いて、２５℃にて４８時間実施することとした。

（３−４．種々のウイルスに対する抗ウイルス活性の試験）
ヒト型抗体酵素とウイルスとのインキュベーションの手順は、３−２．において確認した通りであり、ウイルス感染の手順は、３−３．に記載の通りである。ヒト型抗体酵素は、単量体のみを含むもの、および二量体のみを含むものに分けて、その抗ウイルス活性を調べた。ここでは、３種の株の狂犬病ウイルス株、ＶＳＶおよびＲｅｏＶに対するヒト型抗体酵素の抗ウイルス活性について試験した。３−３．と同様に、プラークアッセイを用いて、ＰＢＳおよび各ウイルスの混合液をかけたウェルに形成されたプラーク数を１００％として、ヒト型抗体酵素および各ウイルスの混合液をかけたウェルに形成されたプラーク数のパーセンテージを算出した。この結果をまとめたものをグラフ化して図２２に示す。

図２２に示すように、ｇｅｒｍｌｉｎｅＡ１８ｂの＃１クローンのヒト型抗体酵素の単量体（Ｍｏｎｏｍｅｒ）の形態は、ＲｅｏＶ以外に対して非常に高い抗ウイルス活性を示した。ＲＡＢＶのＥＲＡはわずかに感染プラークが観察された（約１０％）。また、二量体（Ｄｉｍｅｒ）の形態は、ＲｅｏＶには抗ウイルス活性を示さずに、ＲＡＢＶの３つの株の感染を約半数にまで抑制し、ＶＳＶの感染をほぼ１００％抑制した。ＲＡＢＶの各株に対して多少の差はあるものの、本発明に係るヒト型抗体酵素は、ＲＡＢＶの感染を顕著に抑制することが分かった。また、ＶＳＶの感染を非常に良好に抑制することから、本発明に係るヒト型抗体酵素は、ラブドウイルス科に属するウイルスに対して有効であると考えられる。特にヒト型抗体酵素の単量体は、抗ウイルス活性が非常に高く、種々の条件において高い抗ウイルス活性を示すことが予想される。

本試験の一例として、ヒト型抗体酵素の単量体をＣＶＳと反応させた後のプラークアッセイの結果を図２３に示す。図２３に示すように、左から２列の６つのウェルは、ＰＢＳとウイルスを混合して感染させたものであり、多数のプラークが形成された。一方において、右から２列の６つのウェルは、ト型抗体酵素の単量体とウイルスを混合して感染させたものであり、ウイルスの感染および増殖によって形成されるプラークがまったく見られなかった。

（３−５．膜融合活性についての検討）
図２２において確認したように、本発明に係るヒト型抗体酵素は、ラブドウイルス科のウイルスに高い抗ウイルス活性を示し、ＲｅｏＶにはほぼ活性を示さなかった。ここで、ラブドウイルス科のウイルスは、宿主細胞の膜に由来するエンベロープを有している。エンベロープウイルスは、エンベロープが壊されると感染性を失ってしまう。もし、本発明に係るヒト型抗体酵素がエンベロープを破壊する活性を有する場合、宿主細胞にも傷害性であり得る。そこで、本発明に係るヒト型抗体酵素の安全性を確認するために、トリ赤血球の凝集作用の有無について調べた。本発明に係るヒト型抗体酵素またはＰＢＳと１％のトリ赤血球浮遊液とを混合して、２５℃にて４８時間反応させた。その結果を図２４に示す。図２４に示すように、本発明に係るヒト型抗体酵素によって、赤血球の凝集は起こっていない。よって、本発明に係るヒト型抗体酵素は、膜融合活性を有していないため、宿主細胞を傷害する活性を有していないと考えられる。つまり、本発明に係るヒト型抗体酵素は、ウイルスに特異的なタンパク質に作用して抗ウイルス活性を示す、安全性の高い抗ウイルス剤として使用可能と考えら得る。

（３−６．改良された単量体のヒト型抗体軽鎖の作製）
上述のように、＃１クローン（ｇｅｒｍｌｉｎｅ：Ａ１８ｂ）のヒト型抗体酵素は、単量体の形態において特に高い抗ウイルス活性を示した。このため、Ｓ−Ｓ結合を介して二量体の形成に必須と考えられる２２０番目のシステインに変異を導入して、単量体のヒト型抗体酵素のみが形成されるように、ｃＤＮＡを設計した。この設計の詳細を図２５に示す。図２５の（ａ）に示すように、全長のヒト型抗体酵素の遺伝子における２２０番目のシステインをコードするＴＧＴを、ＧＣＴに置換した。これによって、図２５の（ｂ）に示すように、元のアミノ酸配列では２２０番目がシステインであるために、単量体および二量体が混在していたが、置換後のアミノ酸では２２０番目がアラニンであるために、Ｓ−Ｓ結合が形成されず、単量体のみが得られた。アミノ酸置換によるコンフォメーションの変化などの影響を受けて、抗ウイルス活性が変化するおそれがあったが、３−４．において確認された抗ウイルス活性と同様に、この２２０番目をアラニン置換したヒト型抗体酵素は、ラブドウイルス科に属するウイルスに対する抗ウイルス活性を示した。以下、その試験手順および結果を説明する。

ヒト型抗体酵素とウイルスとのインキュベーションの手順は、３−２．において確認した通りであり、ウイルス感染の手順は、３−３．に記載の通りである。ヒト型抗体酵素としては、２２０番目をアラニン置換した単量体の抗ウイルス活性を調べた。ウイルスとしては、ＶＳＶウイルスに対するヒト型抗体酵素の抗ウイルス活性について試験した。３−３．と同様に、プラークアッセイを用いて、ＰＢＳおよび各ウイルスの混合液をかけたウェルに形成されたプラーク数を１００％として、ヒト型抗体酵素および各ウイルスの混合液をかけたウェルに形成されたプラーク数のパーセンテージを算出した。この結果をまとめたものをグラフ化して図２６に示す。

図２６に示すように、２２０番目をアラニン置換した単量体は、ＶＳＶウイルスに対するウイルス抑制効果を、特に、３７℃において顕著に示した。

（３−８．クローン＃７由来のヒト型抗体酵素の抗ウイルス活性についての試験）
クローン＃７由来のヒト型抗体酵素についても、クローン＃１由来のヒト型抗体酵素と同様にウイルス抑制効果を試験した。ヒト型抗体酵素とウイルスとのインキュベーションの手順は、３−２．において確認した通りであり、ウイルス感染の手順は、３−３．に記載の通りである。ヒト型抗体酵素としては、単量体の抗ウイルス活性を調べた。ウイルスとしては、ＣＶＳウイルスに対するヒト型抗体酵素の抗ウイルス活性について試験した。３−３．と同様に、プラークアッセイを用いて、ＰＢＳおよび各ウイルスの混合液をかけたウェルに形成されたプラーク数を１００％として、ヒト型抗体酵素および各ウイルスの混合液をかけたウェルに形成されたプラーク数のパーセンテージを算出した。この結果をまとめたものをグラフ化して図２７に示す。

図２７に示すように、クローン＃７由来のヒト型抗体酵素は、クローン＃１由来のヒト型抗体酵素程ではないが、抗ウイルス活性を示した。

（３−９．クローン２３Ｄ４の抗ウイルス活性についての試験）
クローン２３Ｄ４由来のヒト型抗体酵素についても、クローン＃１由来のヒト型抗体酵素と同様にウイルス抑制効果を試験した。ヒト型抗体酵素とウイルスとのインキュベーションの手順は、３−２．において確認した通りであり、ウイルス感染の手順は、３−３．に記載の通りである。ヒト型抗体酵素は、単量体のみを含むもの、および二量体のみを含むものに分けて、その抗ウイルス活性を調べた。ここでは、３種の株の狂犬病ウイルス株、ＶＳＶおよびＲｅｏＶに対するヒト型抗体酵素の抗ウイルス活性について試験した。３−３．と同様に、プラークアッセイを用いて、ＰＢＳおよび各ウイルスの混合液をかけたウェルに形成されたプラーク数を１００％として、ヒト型抗体酵素および各ウイルスの混合液をかけたウェルに形成されたプラーク数のパーセンテージを算出した。この結果をまとめたものをグラフ化して図３３に示す。

図３３に示すように、２３Ｄ４クローンのヒト型抗体酵素の単量体（Ｍｏｎｏｍｅｒ）の形態は、ＲｅｏＶ以外に対して非常に高い抗ウイルス活性を示した。ＲＡＢＶのＥＲＡはわずかに感染プラークが観察された（約２０％）。また、二量体（Ｄｉｍｅｒ）の形態は、ＲｅｏＶには抗ウイルス活性を示さずに、ＲＡＢＶの３つの株の感染を約半数にまで抑制し、ＶＳＶの感染をほぼ１００％抑制した。ＲＡＢＶの各株に対して多少の差はあるものの、本発明に係るヒト型抗体酵素は、ＲＡＢＶの感染を顕著に抑制することが分かった。また、ＶＳＶの感染を非常に良好に抑制することから、本発明に係るヒト型抗体酵素は、ラブドウイルス科に属するウイルスに対して有効であると考えられる。特にヒト型抗体酵素の単量体は、抗ウイルス活性が非常に高く、種々の条件において高い抗ウイルス活性を示すことが予想される。

（３−１０．クローン２３Ｄ４についての膜融合活性についての検討）
３−５．と同様に、クローン２３Ｄ４についても膜融合活性を検討した。その結果、図３４に示すように、クローン２３Ｄ４に係るヒト型抗体酵素によって、赤血球の凝集は起こっていない。よって、本発明に係るヒト型抗体酵素は、膜融合活性を有していないため、宿主細胞を傷害する活性を有していないと考えられる。つまり、本発明に係るヒト型抗体酵素は、ウイルスに特異的なタンパク質に作用して抗ウイルス活性を示す、安全性の高い抗ウイルス剤として使用可能と考えら得る。

（３−１１．改良された単量体のヒト型抗体軽鎖の作製）
上述のように、本発明に係るヒト型抗体軽鎖は、単量体の形態において特に高い抗ウイルス活性を示した。このため、各クローンに係るヒト型抗体軽鎖について、３−６．と同様に、Ｓ−Ｓ結合を介して二量体の形成に必須と考えられるＣ末端のシステインに変異を導入して、単量体のヒト型抗体軽鎖のみが形成されるように、ｃＤＮＡを設計した。すなわち、全長のヒト型抗体酵素の遺伝子における上記システインをコードするＴＧＴを、ＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１２）（＋終止コドン）をコードするＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ（配列番号１３）に置換した。例えば、クローン２３Ｄ４については、配列番号３２の塩基配列とし、クローン２２Ｆ６については、配列番号３７の塩基配列とし、クローン２３Ｆ１については、配列番号４２の塩基配列とした。

結果、図３９および図４０に示すように、上記システインが置換されているヒト型抗体軽鎖が得られた。改良されたクローン＃１に係るヒト型抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列番号１５に示し、改良されたクローン＃１６に係るヒト型抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列番号１７に示し、改良されたクローン＃７に係るヒト型抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列番号１９に示し、改良されたクローン＃６に係るヒト型抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列番号２３に示し、改良されたクローン＃１８に係るヒト型抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列番号２７に示し、改良されたクローン２３Ｄ４に係るヒト型抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列番号３１に示し、改良されたクローン２２Ｆ６に係るヒト型抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列番号３６に示し、改良されたクローン２３Ｄ４に係るヒト型抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列番号４１に示す。

図３６に、これらの改良されたヒト型抗体軽鎖の電気泳動結果を示す。示すように、元のアミノ酸配列ではシステインであるために、単量体および二量体が混在していたが、置換後のアミノ酸では２２０番目がアラニンであるために、Ｓ−Ｓ結合が形成されず、単量体のみが得られた。

この改良されたヒト型抗体軽鎖について、抗ウイルス活性を調べた。ヒト型抗体酵素とウイルスとのインキュベーションの手順は、３−２．において確認した通りであり、ウイルス感染の手順は、３−３．に記載の通りである。ヒト型抗体酵素としては、２２０番目をアラニン置換した単量体の抗ウイルス活性を調べた。ウイルスとしては、ＶＳＶウイルスに対するヒト型抗体酵素の抗ウイルス活性について試験した。３−３．と同様に、プラークアッセイを用いて、ＰＢＳおよび各ウイルスの混合液をかけたウェルに形成されたプラーク数を１００％として、ヒト型抗体酵素および各ウイルスの混合液をかけたウェルに形成されたプラーク数のパーセンテージを算出した。この結果をまとめたものをグラフ化して図３５、図３７および図３８に示す。

図３５に示すように、改良されたクローン＃１８に係るヒト型抗体軽鎖および改良されたクローン２３Ｄ４に係るヒト型抗体軽鎖は、高い抗ウイルス活性を示した。また、図３７に示すように、改良されたクローン＃１に係るヒト型抗体軽鎖および改良されたクローン＃６に係るヒト型抗体軽鎖もまた、高い抗ウイルス活性を示した。また、図３８に示すように、改良されたクローン＃１８に係るヒト型抗体軽鎖は、抗ウイルス活性を特に、３７℃において顕著に示した。

（３−１２．インフルエンザウイルス感染試験）
続いて、本発明に係るヒト抗体軽鎖クローンが、インフルエンザウイルスに対して感染抑制能を有するか否かを試験した。インフルエンザウイルスとしては、Ａ／広島／７１／２００１（Ｈ３Ｎ２）株を用いた。ウイルスは、孵化後１１日目のニワトリ卵の尿膜腔において培養され、感染性の尿膜腔液として、使用時まで−８０℃にて保管した。感染させる細胞としては、１０％の牛血清が加えられたＥａｇｌｅ’ｓ最小培地（ＭＥＭ）中で培養されたＭＤＣＫ細胞を用いた。

各クローンのサンプルは、ＰＢＳによって２０μｇ／ｍｌの濃度に希釈して使用した。インフルエンザウイルスは、Ｅａｇｌｅ’ｓ最小培地によって、約５×１０^２または５×１０^３ＰＦＵ／０．２ｍｌに希釈した。サンプルと、ウイルスとを等量（各０．２５ｍｌ）混合し、２０℃で４８時間インキュベートした。インキュベート後、ウイルスの感染価をプラーク法により算定した。具体的には、サンプル−ウイルス混合物は、組織培養トレイ上の単層のＭＤＣＫ細胞に予備接種し、３７℃において６０分間吸着させた。その後、接種材料を除去し、ＰＢＳで洗浄した。そして、ＭＤＣＫ細胞を、１．０％のアガロースＭＥおよび２０ｍｇ／ｍｌのトリプシンを含むＭＥＭ培地（第１被覆培地）によって被覆し、３７℃において加湿された５％ＣＯ₂インキュベータ内で、４日間インキュベートした。その後、細胞を、第１被覆培地に０．００５％ニュートラルレッドを加えた第２被覆培地で被覆した。プラーク数は次の日に計測した。

結果を図４１の（ａ）および（ｂ）に示す。なお、図４１では、感染価をコントロールに対するパーセンテージで示している。また、「ｄｉｍｅｒ」は、サンプルが、ダイマーであることを示し、「Ｃ２２０Ａ」は、サンプルが、ジスルフィド結合がされないようにアミノ酸配列を改変して得られたモノマーであることを示す。

図４１に示すように、＃１クローン、＃４クローン、＃１１クローン、＃１８クローン、および２２Ｆ６クローンが、インフルエンザウイルスの感染を抑制する効果を有していた。特に、＃１８クローンおよび＃１クローンは、狂犬病ウイルスおよびインフルエンザウイルスの両者について好適に感染抑制することができた。

（３−１３．インビボにおける中和試験）
本発明に係るヒト抗体軽鎖クローンの抗ウイルス活性について、国際標準法を用いてインビボにおける中和試験を行った。すなわち、狂犬病ウイルスＣＶＳ（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔｒａｉｎ）と、抗体とをインビトロにて一定時間反応させた後、マウス脳内に反応液を接種し、マウスの生存率から、抗体のウイルス中和能を評価した。

まず、ＣＶＳウイルスを１０％ＦＣＳ−ＥＭＥＭ培地によって所定の濃度に希釈した。次いで、ウイルス希釈液を等量のサンプルと混合し、２５℃で２４時間インキュベートした。インキュベート後、反応液をｄｄｙマウス（生後７週間、メス）に、１匹当たり０．０３ｍｌ接種した。接種後、１４日間マウスを観察し、生存率を評価した。

ＣＶＳウイルスの濃度を１３２０〜２６４００ＦＦＵ（Ｆｏｃｕｓ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ：ウイルスの数）／ｍｌとし、サンプル（抗体軽鎖：ＬＣ）として０．５ｍｇ／ｍｌの＃１８クローンを用い、ポジティブコントロールとして１ＩＵ／ｍｌのＥＲＩＧ（Ｅｑｕｉｎｅ Ｒａｂｉｅｓ ＩｍｍｕｎｏＧｌｏｂｕｌｉｎ、ポリクローナル抗体）を用い、ネガティブコントロールとしてＰＢＳを用いたときの結果を表７に示す。表中の各列は、接種時（０日目）からの１４日目までの各時点において生存していたマウスの数を示す。なお、ＣＶＳのウイルス感染価は、マウス１匹当たり１．５ＦＦＵの接種で１ＬＤ₅₀に相当する。

表７に示すように、ウイルスの濃度が低い時（１３２０〜６６００ＦＦＵ／ｍｌ）は、マウスが死亡しないため、評価が不可能であった。一方、ウイルスの濃度が１３２００ＦＦＵ／ｍｌ以上であれば、評価が可能であった。表７中、太枠で囲んだ部分に示すように、＃１８クローンをウイルスと反応させた場合、ＰＢＳをウイルスと反応させた場合に比べて、明らかに死亡率が減少していた。

続いて、抗体酵素（＃１８クローン）の効果をよりはっきりと確認するために、抗体酵素の濃度を増大させて試験を行った。ウイルス希釈液としては、２６４００ＦＦＵ／ｍｌのものを用いた。サンプルとして、５ｍｇ／ｍｌの＃１８クローン、４．９ｍｇ／ｍｌの＃２クローン、５．９ｍｇ／ｍｌの＃４クローン、および０．９４ｍｇ／ｍｌの＃１８クローンを用いた。結果を表８に示す。

表８に示すように、＃１８クローンが濃度依存的なウイルスの感染抑制能を有していることが明確に示された（ｐ ｖａｌｕｅ（Ｌｏｇ−ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）＝０．００７３ ＣＶＳ＋ＰＢＳ ｖｓ． ＣＶＳ＋ＬＣ５ｍｇ／ｍｌ）。

（３−１４．核酸分解活性試験）
本発明に係るヒト抗体軽鎖クローンの核酸分解活性を試験した。各サンプルは、Ｈｉｓ−Ｔａｇ精製の後、陽イオンカラムクロマトグラフィーにより精製したものを用いた。各サンプルの濃度は、後述の表９に示す。基質となる核酸としては、プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）を用いた。ネガティブコントロールとしては、反応させていない基質（ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）を用いた。ポジティブコントロールとしては、ＤＮａｓｅ１を反応させたものを用いた。各サンプルについては、３７℃のサーマルサイクラーにおいて、２４時間または４８時間反応させた。ポジティブコントロールについては、ＤＮａｓｅ１を３０分間反応させた。ネガティブコントロールについては、サーマルサイクラーにおいて、０時間、２４時間または４８時間インキュベートした。そして、反応後のサンプルに、１０×ローディングバッファおよびミリＱ水を加え、−３０℃で凍結した。その後、アガロースゲル電気泳動を行った。結果の一部を図４２（ａ）に示す。

図４２（ａ）において、３０００ｂｐ近くの濃いバンドは、スーパーコイル形態のＤＮＡを示し、４０００〜６０００ｂｐのバンドは、ほどけた形態のＤＮＡを示す。図４２（ｂ）は、核酸分解活性の強さの段階と、バンドの状態との対応を示す図であり、最も右（１）は、全く活性が無い状態を示し、左に進むにつれ活性が高まり（２〜４）、最も左（５）が最も高い活性を示す。例えば、図４２（ａ）に示すように、＃４クローンでは、ＤＮＡのバンドが消失しており、＃４クローンが高いＤＮＡ分解活性（図４２（ｂ）における「５」）を有していることがわかった。これを各クローンの結果について当てはめたものを、表９にまとめた。

表９に示すように、＃４クローンの他、＃１８クローン、＃１クローン、２３Ｄ４クローンおよび＃１１クローンが確かな核酸分解活性を有していることがわかった。

核酸分解活性を有する抗体酵素は、自己免疫疾患患者の血清中の抗体酵素によく見られることから、＃４クローンなどのクローンは、自己免疫疾患に関連する働きを有しているのかもしれない。また、＃４クローンなどのクローンは、ウイルスのＤＮＡを破壊する能力を有している可能性がある。

（３−１５．がん細胞に対する細胞障害性についての試験）
本発明に係るヒト抗体軽鎖クローンのがん細胞に対する細胞障害性について試験した。まず、前述したような手法を用いて以下のヒト型抗体型鎖を作製した：＃１＿Ｃ２２０Ａ（＃１クローンのモノマー）、＃１＿ｄｉｍｅｒ（＃１クローンのダイマー）、２３Ｄ４＿Ｃ２２０Ａ（２３Ｄ４クローンのモノマー）、２３Ｄ４＿ｄｉｍｅｒ（２３Ｄ４クローンのダイマー）、＃４＿Ｃ２２０Ａ（＃４クローンのモノマー）、＃９ａ＿Ｃ２２０Ａ（＃９クローンのモノマー）、および、＃１３＿Ｃ２２０Ａ（＃１３クローンのモノマー）。なお、本明細書において、「Ｃ２２０Ａ」は、ジスルフィド結合がされないように２２０番目のシステインをアラニンに改変して得たモノマーを示し、「ｄｉｍｅｒ」は、ワイルタイプから調製したダイマーを示す。

また、ＡＴＣＣより購入したＳＮＵ−１（ヒト胃がん細胞株）の細胞培養液は３×１０⁴細胞／ウェルおよびＡ５４９（ヒト肺がん細胞株）の細胞培養液は５×１０⁴細胞／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種した。培地としては、ＳＮＵ−１では１０％のウシ退治血清を加えたＲＰＭＩ−１６４培地を用い、細胞播種と同時に後述のヒト抗体軽鎖を加えた。Ａ５４９細胞では、１０％ウシ胎児血清を加えたＦ−１２Ｋ培地で２４時間培養して細胞を定着させた後、培養液を廃棄して後述の抗体軽鎖を添加したＦ−１２Ｋ培地（血清無添加）を加えた。

ＳＮＵ−１およびＡ５４９に加えた各ヒト型抗体軽鎖は、次の通りである。：＃１＿Ｃ２２０Ａ（１．０ｍｇ／ｍｌ）、＃１＿ｄｉｍｅｒ（１．０５ｍｇ／ｍｌ）、２３Ｄ４＿Ｃ２２０Ａ（１．０５ｍｇ／ｍｌ）、２３Ｄ４＿ｄｉｍｅｒ（０．７ｍｇ／ｍｌ）、＃４＿Ｃ２２０Ａ（１．２ｍｇ／ｍｌ）、＃９ａ＿Ｃ２２０Ａ（１．３ｍｇ／ｍｌ）、および、＃１３＿Ｃ２２０Ａ（１．４ｍｇ／ｍｌ）。その後、２４時間インキュベートし、ＷＳＴアッセイ（ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）、λ₁＝４５０ｎｍ、λ₂＝６２０ｎｍ）を行った。結果を図５１に示す。

図５１の（ａ）は、ＳＮＵ−１に対する各ヒト型抗体軽鎖の細胞障害性を示すグラフであり、図５１の（ｂ）は、Ａ５４９に対する各ヒト型抗体軽鎖の細胞障害性を示すグラフである。図５１に示すように、＃１＿Ｃ２２０Ａおよび＃１＿ｄｉｍｅｒについて、強い抗がん活性が認められた。また、２３Ｄ４＿ｄｉｍｅｒおよび＃４＿Ｃ２２０Ａについては、Ａ５４９に対して弱い抗がん活性が認められた。また、２３Ｄ４＿ｄｉｍｅｒについて、ＳＮＵ−１に対する強い細胞障害性が認められた。一方、＃９ａ＿Ｃ２２０Ａおよび＃１３＿Ｃ２２０Ａについては、がん細胞障害性は殆ど認められなかった。

また、ＡＴＣＣより購入したＳＮＵ−１（ヒト胃がん細胞株）およびＡ５４９（ヒト肺がん細胞株）の細胞培養液を、それぞれ、細胞播種濃度が１．６×１０⁴細胞／ウェル（１〜５×１０⁵細胞／ｍｌ）となるように９６ウェルプレート上に播種した。培地としては、１．５ｇ／ｌの重炭酸ナトリウムを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（高グルコース）を用いた。なお、ＳＮＵ−１の細胞培養液には１０％のウシ胎児血清を加えた。Ａ５４９の細胞培養液は、無血清とした。

続いて、上記の各ヒト型抗体軽鎖を、以下の終濃度になるようにプレート上の各がん細胞株の細胞培養液に添加した：＃１＿Ｃ２２０Ａ（１．０ｍｇ／ｍｌ）、＃１＿ｄｉｍｅｒ（１．０５ｍｇ／ｍｌ）、２３Ｄ４＿Ｃ２２０Ａ（１．０５ｍｇ／ｍｌ）、２３Ｄ４＿ｄｉｍｅｒ（０．７ｍｇ／ｍｌ）、＃４＿Ｃ２２０Ａ（１．２ｍｇ／ｍｌ）、＃９ａ＿Ｃ２２０Ａ（１．３ｍｇ／ｍｌ）、および、＃１３＿Ｃ２２０Ａ（１．０ｍｇ／ｍｌ）。その後、２４時間インキュベートし、ＷＳＴアッセイ（ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）、λ₁＝４５０ｎｍ、λ₂＝６２０ｎｍ）を行った。結果を図５１に示す。

図５１の（ａ）は、ＳＮＵ−１に対する各ヒト型抗体軽鎖の細胞障害性を示すグラフであり、図５１の（ｂ）は、Ａ５４９に対する各ヒト型抗体軽鎖の細胞障害性を示すグラフである。図５１に示すように、＃１＿Ｃ２２０Ａおよび＃１＿ｄｉｍｅｒについて、強い抗がん活性が認められた。また、２３Ｄ４＿Ｃ２２０Ａおよび＃４＿Ｃ２２０Ａについては、Ａ５４９に対して弱い抗がん活性が認められた。また、２３Ｄ４＿ｄｉｍｅｒについて、ＳＮＵ−１に対する強い細胞障害性が認められた。一方、＃９ａ＿Ｃ２２０Ａおよび＃１３＿Ｃ２２０Ａについては、がん細胞障害性は殆ど認められなかった。

本発明は、医療、製薬、試薬の開発、医療機器の開発および食品の開発に利用可能である。

Claims (7)

1. 狂犬病ウイルスに対するヒト抗体κ型軽鎖であって、抗ラブドウイルス活性、および抗インフルエンザウイルス活性を有しており、その可変領域が、配列番号２６のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなることを特徴とするヒト型の抗体酵素。
2. 狂犬病ウイルスに対するヒト抗体κ型軽鎖であって、抗ラブドウイルス活性、抗インフルエンザウイルス活性、およびがん細胞傷害性を有しており、その可変領域が、配列番号１４のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなることを特徴とするヒト型の抗体酵素。
3. 狂犬病ウイルスに対するヒト抗体κ型軽鎖であって、抗ラブドウイルス活性およびがん細胞傷害性を有しており、その可変領域が、配列番号３０のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなるヒト型の抗体酵素を含有していることを特徴とする抗ラブドウイルス剤。
4. 狂犬病ウイルスに対するヒト抗体κ型軽鎖であって、抗インフルエンザウイルス活性、および核酸分解活性を有しており、その可変領域が、配列番号５０のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなることを特徴とするヒト型の抗体酵素。
5. 狂犬病ウイルスに対するヒト抗体κ型軽鎖であって、抗インフルエンザウイルス活性を有しており、その可変領域が、配列番号３５のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなることを特徴とするヒト型の抗体酵素。
6. 狂犬病ウイルスに対するヒト抗体κ型軽鎖であって、抗インフルエンザウイルス活性を有しており、その可変領域が、配列番号５４のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなることを特徴とするヒト型の抗体酵素。
7. 狂犬病ウイルスに対するヒト抗体κ型軽鎖であって、抗ラブドウイルス活性を有しており、その可変領域が、配列番号２２のアミノ酸配列によって示されるポリペプチドからなることを特徴とするヒト型の抗体酵素。