CN101970006A - α5-β1抗体和它们的用途 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了以高和亲力特异性结合整联蛋白α5β1的分离的单克隆抗体,特别地人单克隆抗体,或其抗原结合部分。还提供了编码本公开内容的抗体的核酸分子、表达载体、宿主细胞和用于表达本公开内容的抗体的方法。还提供了包含抗体或其抗原结合部分的免疫缀合物、双特异性分子和药物组合物。本公开内容还提供了使用本文中描述的抗α5β1抗体或其抗原结合部分治疗各种癌症的方法。
Description
本申请要求对2008年2月5日提交的美国临时申请案61/026,027和2008年9月9日提交的美国临时申请案61/095,429(其两者以其全文通过引用合并入本文)的优先权。
领域
本公开内容涉及结合α5β1的抗体和其抗原结合部分。本公开内容还涉及编码此类抗体和抗原结合部分的核酸分子、制备α5β1抗体和抗原结合部分的方法、包含此类抗体和抗原结合部分的组合物和使用抗体、抗原结合部分和组合物的方法。
背景
整联蛋白α5β1是结合纤连蛋白并且参与细胞附着和血管生成的异二聚体细胞表面蛋白。该异二聚体由α5亚基和β1亚基组成。整联蛋白α5β1称为“经典纤连蛋白受体”,其在基质附着、迁移、增殖、分化和存活中起着至关重要的作用。虽然几种整联蛋白结合纤连蛋白(FN),但α5β1对于FN具有选择性,因为其需要FN的第9(PHSRN)和第10(RGDS)III型重复上的肽序列来进行配体识别和最佳相互作用。(Danen等人J.Biol.Chem.270(37):21612-21618(1995);Redick等人J.Cell Biol.149(2):521-527(2000);Takagi等人BMBO J.22:4607-4615(2003))。整联蛋白介导的细胞至FN的附着可触发钙流、激活酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶以及肌醇脂质代谢,并且调控控制肌动蛋白细胞骨架和细胞周期进程的小GTP酶的Rho家族的活性。
在大多数胚胎组织中观察到α5β1的表达,但水平在出生后以与终末细胞分化一致的方式减少(Muschler & Horwitz Development 113(1):327-337(1991))。在野生型成年小鼠中,表达主要存在于脉管系统和结缔组织中,虽然低水平的受体广泛分布。α5β1和FN的表达在人肿瘤的血管上和在生长因子及细胞因子刺激的组织中得到显著地和协同地增强。血管生成细胞因子(angiogenic cytokine)例如bFGF、VEGF,IL-8,TGF-β和TNF-α在体外和体内上调内皮细胞上的α5β1表达,然而此类分子在正常人血管和组织中以最低限度表达(Kim等人Am.J.Path.156(4):1345-62(2000);Enaida等人Fukushima J.Med.Sci 44(1):43-52(1998);Klein等人Mol Biol.Cell4(10):973-982(1993))。
高水平的α5β1表达不限定于脉管系统中,因为在许多类型的癌症中也频繁观察到肿瘤细胞表达α5β1。肿瘤缺氧与增加的肿瘤α5β1表达相关联(Mousa等人J.Cell.Biochem.74:135-143(1999))。整联蛋白据认为对于肿瘤内渗入新形成的毛细血管和外渗至远距离部位,从而导致肿瘤扩散和转移性疾病是非常重要的。总的说来,α5β1的表达模式与在促进癌症(通过介导基质和肿瘤细胞的活性)中的多个作用相符。多种临床研究已使肿瘤细胞上α5β1的上调与人黑素瘤、口腔鳞状细胞癌和B细胞白血病的进展相关联(Jin & Varner,Br.J.Cancer 90:561-565(2004);Danen等人Histopathology 24(3):249-256(1994);Shinohara等人,Am.J.Clin.Pathol 111(1):75-88(1999))。
概述
本公开内容提供了展示对人整联蛋白α5β1的高亲和力结合的分离的单克隆抗体,特别地人单克隆抗体。本公开内容中描述的抗体通常是人抗体,虽然在备选情况下抗体可以是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在一个方面,本公开内容涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其中抗体:(a)以1x10-7M或更小的KD结合人整联蛋白α5β1;和(b)能够诱导抗体依赖性细胞毒性。例如,在一种情况下,抗体属于能够诱导ADCC的亚类例如IgG1或IgG3。在另一种情况下,ADCC活性是向Fc区域导入糖修饰例如改变的糖基化模式(与天然糖模式相比较)的结果。
在某些情况下,抗体以5x10-8M或更小,2x10-8M或更小,1x10-8M或更小,5x10-9M或更小,4x10-9M或更小,3x10-9M或更小,或2.7x10-9M或更小的KD结合人整联蛋白α5β1。
在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其中抗体:(a)以1x10-7M或更小的KD结合人整联蛋白α5β1;和(b)显示与可比较的抗体相比增强的ADCC活性。例如,在一种情况下,与野生型Fc区域相比较,具有增强的ADCC活性的抗体在Fc区域中包含至少一个突变,并且增强的ADCC活性是相对于相同的但包含野生型Fc区域的抗体而言的。在某些实例中,抗体以5x10-8M或更小,2x10-8M或更小,1x10-8M或更小,5x10-9M或更小,4x10-9M或更小,3x10-9M或更小或2.7x10-9M或更小的KD结合人整联蛋白α5β1。在另外的实例中,相对于可比较的抗体,抗体显示增强的ADCC活性,所述ADCC活性与可比较的抗体相比,为至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍或至少1000倍,其中可比较的抗体是相同的但具有野生型Fc区域的抗体。
在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其中抗体:(a)以1x10-7M或更小的KD结合人整联蛋白α5β1;和(b)与野生型Fc区域相比较在Fc区域中包含至少一个突变。例如,在一种情况下,抗体的亚类是IgG1并且IgG1亚类的Fc区域中至少一个氨基酸被突变。在另外的实例中,至少一个突变在IgG1亚类的Fc区域中的位点丝氨酸247、丙氨酸338或异亮氨酸340上发生。在另外的实例中,至少一个突变选自S247D、A338L和I340E。在另外的实例中,抗体包含突变S247D、A338L和I340E。
本公开内容的另外的方面是分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其中该抗体与包含下列的抗体交叉竞争或竞争与人整联蛋白α5β1的结合:(a)重链可变区,其含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列,或其保守修饰形式;和(b)轻链可变区,其含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列,或其保守修饰形式。
本公开内容的另外的方面是分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含作为人VH 4-39基因的产物或源自人VH 4-39基因的重链可变区,其中抗体特异性结合人整联蛋白α5β1。
本公开内容的另外的方面是分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含作为人VκL6基因的产物或源自人VκL6基因的轻链可变区,其中抗体特异性结合人整联蛋白α5β1。
在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:1或其保守修饰形式的重链可变区CDR1。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:2或其保守修饰形式的重链可变区CDR2。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:3或其保守修饰形式的重链可变区CDR3。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:4或其保守修饰形式的轻链可变区CDR1。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:5或其保守修饰形式的轻链可变区CDR2。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:6或其保守修饰形式的轻链可变区CDR3。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含:
(a)含有SEQ ID NO:1或其保守修饰形式的重链可变区CDR1;
(b)含有SEQ ID NO:2或其保守修饰形式的重链可变区CDR2;
(c)含有SEQ ID NO:3或其保守修饰形式的重链可变区CDR3;
(d)含有SEQ ID NO:4或其保守修饰形式的轻链可变区CDR1;
(e)含有SEQ ID NO:5或其保守修饰形式的轻链可变区CDR2;和
(f)含有SEQ ID NO:6或其保守修饰形式的轻链可变区CDR3。
在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区。例如,本公开内容提供了包含重链可变区的抗体或其抗原结合部分,所述重链可变区与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少97%,至少98%或至少99%同一。在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其保守修饰形式的轻链可变区。例如,本公开内容提供了包含轻链可变区的抗体或其抗原结合部分,所述轻链可变区与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列至少80%,至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一。在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其保守修饰形式的轻链可变区。例如,本公开内容提供了包含重链可变区和轻链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,所述重链可变区与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列至少80%,至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一,所述轻链可变区与SEQ IDNO:8中所示的氨基酸序列至少80%,至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一。
在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:13或其保守修饰形式的重链可变区CDR1。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:14或其保守修饰形式的重链可变区CDR2。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:15或其保守修饰形式的重链可变区CDR3。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:16或其保守修饰形式的轻链可变区CDR1。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:17或其保守修饰形式的轻链可变区CDR2。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:18或其保守修饰形式的轻链可变区CDR3。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含:
(a)含有SEQ ID NO:13或其保守修饰形式的重链可变区CDR1;
(b)含有SEQ ID NO:14或其保守修饰形式的重链可变区CDR2;
(c)含有SEQ ID NO:15或其保守修饰形式的重链可变区CDR3;
(d)含有SEQ ID NO:16或其保守修饰形式的轻链可变区CDR1;
(e)含有SEQ ID NO:17或其保守修饰形式的轻链可变区CDR2;和
(f)含有SEQ ID NO:18或其保守修饰形式的轻链可变区CDR3。
在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区。在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列或其保守修饰形式的轻链可变区。在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列或其保守修饰形式的轻链可变区。
在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:23或其保守修饰形式的重链可变区CDR1。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:24或其保守修饰形式的重链可变区CDR2。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:25或其保守修饰形式的重链可变区CDR3。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:26或其保守修饰形式的轻链可变区CDR1。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:27或其保守修饰形式的轻链可变区CDR2。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:28或其保守修饰形式的轻链可变区CDR3。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含:
(a)包含SEQ ID NO:23或其保守修饰形式的重链可变区CDR1;
(b)包含SEQ ID NO:24或其保守修饰形式的重链可变区CDR2;
(c)包含SEQ ID NO:25或其保守修饰形式的重链可变区CDR3;
(d)包含SEQ ID NO:26或其保守修饰形式的轻链可变区CDR1;
(e)包含SEQ ID NO:27或其保守修饰形式的轻链可变区CDR2;和
(f)包含SEQ ID NO:28或其保守修饰形式的轻链可变区CDR3。
在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区。在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其保守修饰形式的轻链可变区。在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区和含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其保守修饰形式的轻链可变区。
在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:33或其保守修饰形式的重链可变区CDR1。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:34或其保守修饰形式的重链可变区CDR2。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:35或其保守修饰形式的重链可变区CDR3。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:36或其保守修饰形式的轻链可变区CDR1。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:37或其保守修饰形式的轻链可变区CDR2。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:38或其保守修饰形式的轻链可变区CDR3。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含:(a)包含SEQ ID NO:33或其保守修饰形式的重链可变区CDR1;(b)包含SEQ ID NO:34或其保守修饰形式的重链可变区CDR2;(c)包含SEQ ID NO:35或其保守修饰形式的重链可变区CDR3;(d)包含SEQ ID NO:36或其保守修饰形式的轻链可变区CDR1;(e)包含SEQ ID NO:37或其保守修饰形式的轻链可变区CDR2;和(f)包含SEQ ID NO:38或其保守修饰形式的轻链可变区CDR3。
在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区。在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列或其保守修饰形式的轻链可变区。在另外的方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列或其保守修饰形式的重链可变区和含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列或其保守修饰形式的轻链可变区。
在另外的方面,提供了分离的抗体或其抗原结合部分,其结合与本文中公开的任何抗体相同的人整联蛋白α5β1上的表位和/或与这样的抗体竞争对人整联蛋白α5β1的结合。
在一个实施方案中,本公开内容提供了以保藏号PTA-9377保藏在ATCC的材料。在另一个实施方案中,本公开内容提供了以保藏号PTA-9378保藏在ATCC的材料。在另一个实施方案中,本公开内容提供了包含以保藏号PTA-9377保藏在ATCC的重链可变区的分离的抗体。在另一个实施方案中,本公开内容提供了包含以保藏号PTA-9378保藏在ATCC的轻链可变区的分离的抗体。在另一个实施方案中,本公开内容提供了包含以保藏号PTA-9377保藏在ATCC的重链可变区的分离的抗体,但其中已在VH区域产生了种系突变I30S和N33S。在另外的实施方案中,本公开内容提供了包含分别以保藏号PTA-9377和PTA-9378保藏在ATCC的重链和轻链可变区的分离的抗体,或其中已在VH区中产生了种系突变I30S和N33S的所述抗体。在另外的实施方案中,本公开内容提供了分离的抗体,所述分离的抗体包含以保藏号PTA-9377保藏在ATCC的重链可变区的重链CDR1、CDR2和CDR3区,或当所述重链可变区包含种系突变I30S和N33S时包含所述CDR1、CDR2和CDR3。在另外的实施方案中,本公开内容提供了分离的抗体,所述分离的抗体包含以保藏号PTA-9378保藏在ATCC的轻链可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3区。在另外的实施方案中,本公开内容提供了分离的抗体,所述分离的抗体包含分别以保藏号PTA-9377和PTA-9378保藏在ATCC的重链和轻链可变区的轻链CDR1、CDR2和CDR3区和重链CDR1、CDR2和CDR3区,或当所述重链可变区包含种系突变I30S和N33S时,包含所述CDR1、CDR2和CDR3区。
本公开内容的抗体可以是,例如全长抗体,例如IgG1或IgG4亚类的全长抗体。备选地,抗体可以是抗体片段例如Fab或Fab′2片段或单链抗体。在一种情况下,本公开内容提供了上述任何抗体,其是亚类IgG1的人全长抗体,其中IgG1亚类的Fc区域中的至少一个氨基酸被突变。在另外的情况下,至少一个突变发生在位点丝氨酸247、丙氨酸338或异亮氨酸340上。在另外的情况下,至少一个突变选自S247D、A338L和I340E。在另外的情况下,抗体包含突变S247D、A338L和I340E。
在另外的方面,本公开内容提供了包含SEQ ID NO:9或其保守修饰形式中显示的重链的分离的单克隆抗体。例如,抗体包含与SEQ IDNO:9中所示的氨基酸序列至少80%,至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一的重链。在另外的方面,本公开内容提供了包含SEQ ID NO:10或其保守修饰形式中显示的轻链的分离的单克隆抗体。例如,抗体包含与SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少80%,至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一的轻链。在另外的方面,本公开内容提供了包含SEQ ID NO:9或其保守修饰形式中显示的重链和SEQ ID NO:10或其保守修饰形式中显示的轻链的分离的单克隆抗体。例如,抗体包含与SEQ ID NO:9中显示的氨基酸序列至少80%,至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一的重链和与SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列至少80%,至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一的轻链。
在一些实施方案中,所述的本公开内容的任何抗α5β1抗体的重链的C末端赖氨酸被切割,从而不存在。例如,在一些实施方案中本公开内容的抗体包含SEQ ID NO:43中显示的IgG1重链恒定区,但其中C末端赖氨酸不存在。在多种情况下,抗α5β1抗体的重链和轻链可任选地包含信号序列。
在另外的方面,本公开内容提供了包含本文中描述的任何抗体或其抗原结合部分和可药用载体的组合物。
在另外的方面,本公开内容提供了包含连接至治疗剂的本文中描述的任何抗体或其抗原结合部分的免疫缀合物。在一种情况下,治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。在另外的方面,本公开内容提供了包含本文中描述的任何免疫缀合物和可药用载体的组合物。本公开内容还提供了包含连接至第二功能性部分的抗体或其抗原结合部分的双特异性分子,所述第二功能性部分具有与所述抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。
还提供了包含本公开内容的抗体或其抗原结合部分,或免疫缀合物或双特异性分子以及可药用载体的组合物。
本公开内容还包括编码抗体或其抗原结合部分的核酸分子以及包含此类核酸的表达载体和包含此类表达载体的宿主细胞。一个方面,例如,是包含SEQ ID NO:11中显示的序列或其保守修饰形式的分离的核酸分子,或表达载体。另外的方面是包含SEQ ID NO:12中显示的序列或其保守修饰形式的分离的核酸分子或表达载体。另外的方面是包含选自SEQ ID NO:21、22、31、32、41和42的序列或其保守修饰形式的分离的核酸分子或表达载体。本公开内容还提供了包含人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠(其中小鼠表达本公开内容的抗体)以及从这样的小鼠制备的杂交瘤(其中杂交瘤产生本公开内容的抗体)。
本公开内容还提供了包含本文中所述的任何表达载体的宿主细胞。
在另外的方面,本公开内容提供了用于制备抗整联蛋白α5β1抗体的方法,其包括在本文中描述的任何宿主细胞中表达抗体和从宿主细胞分离抗体。
在另外的方面,本公开内容提供了用于抑制表达整联蛋白α5β1的肿瘤细胞生长的方法,所述方法包括将细胞与抗体或其抗原结合部分(其以1x10-7M或更小的KD结合人整联蛋白α5β1并且能够诱导抗体依赖性细胞毒性)接触。在一种情况下,抗体是全长人抗体。在另外的情况下,抗体或其抗原结合部分经工程改造增强了其诱导抗体依赖性细胞毒性的能力。在另外的情况下,通过Fc区域中至少一个氨基酸残基的突变来获得增强。
在另外的方面,本公开内容提供了抑制表达整联蛋白α5β1的肿瘤细胞生长的方法,包括将细胞与有效地抑制肿瘤细胞生长的量的本文中所述的任何抗体或其抗原结合部分接触。
在另外的方面,本公开内容提供了本文中描述的任何抗体或其抗原结合部分用于制造用于治疗异常细胞生长的药剂的用途。在另外的方面,本公开内容提供了本文中描述的任何抗体或其抗原结合部分,其用于治疗和/或诊断异常细胞生长。在该方法的一个实施方案中,异常细胞生长是癌症,包括,但不限于,间皮瘤、肝胆管(肝和胆管)肿瘤、原发性或继发性CNS肿瘤、原发性或继发性脑肿瘤、肺癌(NSCLC和SCLC)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、胃肠(胃、结直肠和十二指肠)癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌(carcinoma of the vulva)、何杰金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸癌、慢性或急性白血病、慢性髓性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、脊轴肿瘤(spinal axis tumor)、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌症、胆囊癌(gall bladder cancer)、多发性骨髓瘤、胆管癌、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤或一种或多种上述癌症的组合。
本公开内容还提供了基于本文中提供的抗α5β1抗体的序列制造“第二代”抗α5β1抗体的方法。例如,本公开内容提供了用于制备抗α5β1抗体的方法,其包括:(a)提供:(i)包含SEQ ID NO:1、13、23或33中显示的CDR1序列、SEQ ID NO:2、14、24或34中显示的CDR2序列和/或SEQ ID NO:3、15、25或35中显示的CDR3序列的重链可变区抗体序列;和/或(ii)包含SEQ ID NO:4、16、26或36中显示的CDR1序列、SEQ ID NO:5、17、27或37中显示的CDR2序列和/或SEQ ID NO:6、18、28或38中显示的CDR3序列的轻链可变区抗体序列;(b)改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列;和(c)将改变的抗体序列表达为蛋白质。
根据下列不应当被解释为限定的详细描述和实施例,本公开内容的其他特征和有利方面将变得显然。在整个本说明书中引用的所有参考资料、Genbank条目(Genbank entry)、专利和公布的专利申请的内容明确地通过引用合并入本文。
附图概述
图1A显示22B5重链可变区的DNA序列(SEQ ID NO:11);图1B显示22B5重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)-CDR区以下划线标示;图1C显示22B5轻链可变区的DNA序列(SEQ ID NO:12);图1D显示22B5轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)-CDR区以下划线标示;图1E显示24C7重链可变区的DNA序列(SEQ ID NO:21);图1F显示24C7重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)-CDR区以下划线标示;图1G显示24C7轻链可变区的DNA序列(SEQ ID NO:22);
图1H显示24C7轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)-CDR区以下划线标示;图1I显示1D9重链可变区的DNA序列(SEQ ID NO:31);
图1J显示1D9重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)-CDR区以下划线标示。图1K显示1D9轻链可变区的DNA序列(SEQ ID NO:32);
图1L显示1D9轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)-CDR区以下划线标示;图1M显示2D2重链可变区的DNA序列(SEQ ID NO:41);
图1N显示2D2重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:39)-CDR区以下划线标示;图10显示2D2轻链可变区的DNA序列(SEQ ID NO:42);
图1P显示2D2轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)-CDR区以下划线标示;图1Q显示IgG1重链恒定区的氨基酸序列,突变S247D、A338L和I340E以下划线标示;和图1R显示IgG1轻链恒定区的氨基酸序列。
图2显示22B5重链可变结构域(VH)与相应的种系序列的比对。还显示的是22B5轻链可变结构域(Vκ)与相应的种系序列的比对。CDR区域以下划线标示,相同的残基由虚线表示,点表示缺失。
图3显示通过在固定的22B5/DLE的上方注射不同浓度的α5β1重组细胞外结构域获得的传感图的叠加。在4.0mM CaCl2存在的情况下收集该数据。注射的顺序是从低浓度至高浓度。
图4显示通过FACS获得的22B5/DLE对HUVEC的剂量依赖性结合。
图5显示比较人与小鼠Fcγ受体的平衡解离常数,″wt″是指22B5野生型IgG1;″DLE″是指22B5/DLE。
图6显示HUVEC细胞附着阻断测定的结果。结果显示22B5和不同亚类的变体以及阴性对照(BHA2 IgG1)对HUVEC附着至纤连蛋白的抑制的水平。还显示了计算的IC50值。
图7显示通过Western印迹法测量的HUVEC和20个肿瘤细胞系的人α5表达。
图8显示由22B5/DLE诱导的体外ADCC(与22B5wt IgG1相比)。图8A显示测量在人PBMC存在的情况下通过22B5/DLE和22B5wt IgG1产生的U87MG细胞的ADCC的基于LDH的检测测定。图8B显示测量在人PBMC存在的情况下通过22B5/DLE和22B5wt IgG1产生的HUVEC的ADCC的基于ToxiLight的检测测定。
图9显示基于LDH的检测测定,该检测测定显示在广泛的抗原表达水平上高于wt 22B5 IgG1的来自22B5/DLE的显著的ADCC增强。
图10显示A549-Luc实验性转移模型中22B5/DLE的抑制活性。图10A:在第8周通过BLI测量的肺转移体积(对于对照组n=11,对于22B5 IgG2组n=14以及对于22B5/DLE组n=12)。图10B:给药后22B5IgG2处理组中肺肿瘤的再生长停止。相比之下,22B5/DLE处理组几乎不显示再生长。图10C:各处理组的动物存活率的Kaplan-Meier曲线(终点=BLI 1x108个光子/秒),p<0.0001,对照媒介物组与所有其他组比较,以及p<0.05,22B5/DLE与22B5 IgG2组之间的比较。
图11显示通过FACS获得的1D9、1D9/DLE、24C7/DLE、2D2/DLE、22B5和22B5/DLE对HUVEC的剂量依赖性结合。
图12显示由1D9、1D9/DLE、2D2/DLE、22B5/DLE和24C7/DLE诱导的体外ADCC。
图13显示转移性黑素瘤的同基因模型(syngeneic model)中1D9/DLE的ADCC依赖性抗肿瘤功效。图13A:切取自所有组的肺的大体外观(gross appearance)。图13B:肺重量的定量(*p<0.05,1D9 IgG1DLE对1D9 IgG2)。图13C:肺表面上可见的转移集落的数目的定量。使用ANOVA和Bonferroni′s多重比较检验进行统计分析(*p<0.05,1D9 IgG1 DLE对1D9 IgG2;*p<0.05,1D9 IgG1DLE对抗KLH IgG2)。
详细描述
本公开内容涉及以高和亲力特异性结合α5β1的分离的单克隆抗体,特别地人单克隆抗体。在某些情况下,本公开内容的抗体来源于特定的重链和轻链种系序列和/或包含特定的结构特征例如含有特定氨基酸序列的CDR区。本公开内容提供了分离的抗体、制备此类抗体的方法、包含此类抗体的免疫缀合物和双特异性分子以及包含本公开内容的抗体、免疫缀合物或双特异性分子的药物组合物。本公开内容还涉及使用抗体例如检测α5β1以及治疗与α5β1的表达相关的疾病例如异常细胞生长(例如癌症)的方法。因此,本公开内容还提供了使用抗α5β1抗体或其抗原结合部分治疗各种类型的异常细胞生长例如癌症的方法。
为了可以更容易地理解本公开内容,首先定义某些术语。另外的定义示于整个详细描述中。
除非在本文中另外定义,否则与本公开内容结合使用的科学和技术术语将具有本领域技术人员通常所理解的意义。此外,除非上下文另外要求,否则单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。一般地,结合本文中描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名和技术是本领域内熟知的,且常用于本领域。
除非另外指出,否则通常按照本领域内熟知的和在整个本说明书中引用和论述的各种一般和更特别的参考资料中描述的方法进行本公开内容的方法和技术。此类参考资料包括,例如,Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Approach.Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2001),Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(2002),以及Harlow和Lane Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1990)。如在本领域通常进行的或如本文中描述的,按照厂商的说明书进行酶促反应和纯化技术。结合本文中描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名以及实验室方法和技术是本领域内熟知的,且常用于本领域。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
如本文中所使用的,每一个下列术语在该部分具有与其相关的意义。
冠词“a”和“an”在本文中用于指一个或多于一个(即,至少一个)冠词的语法对象。例如,“an element”是指一个元素或多于一个元素。
如本文中所使用的,20个常规氨基酸和它们的缩写遵从习惯用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))。
术语“α5β1”和“整联蛋白α5β1”可互换使用,并且包括人α5β1的变体、同种型和物种同源物。天然人α5β1,例如,由α5亚基(其来源于随后切割成通过二硫键连接的两条链的前体序列)(Genbank登录号P08648)和β1亚基(其来源于随后加工成成熟形式的前体序列)(Genbank登录号P05556-1)组成。β1亚基已知以通过选择性剪接产生的数个同种型的形式存在(参见,例如,Genbank登录号P05556-2,P05556-3,P05556-4和P05556-5)。本公开内容的人α5β1抗体可以,在某些情况下,与来自除人以外的物种的α5β1交叉反应。在其他情况下,抗体可以完全特异于人α5β1,且可以不展示物种或其他类型的交叉反应性。
“免疫应答”,如本领域技术人员所理解的,包括,但不限于,任何可检测的辅助T细胞或细胞毒性T细胞应答的抗原特异性或同种异体(allogenic)激活、抗体的产生、T细胞介导的变态反应的激活等。该术语包括例如,淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用,所述作用导致对侵入的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌性细胞或在自身免疫或病理性炎症的情况下正常人细胞或组织的选择性损伤、破坏或从人体清除。
“信号转导途径”是指在信号从细胞的一个部分传递至细胞的另一部分中起作用的许多信号转导分子之间的生物化学关系。如本文中所使用的,短语“细胞表面受体”包括,例如,能够接收信号并且将这样的信号传递穿过细胞质膜的分子和复合物。本公开内容的“细胞表面受体”的实例是α5β1整联蛋白。
术语“抗体”,如本文中提及的,包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即,“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键链间连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。各重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。各轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域CL组成。VH和VL区还可进一步细分成与较保守的区域(称为构架区(FR))相间的称为互补决定区(CDR)的高变区。各VH和VL由3个CDR和4个FR组成,其以下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基端至羧基端排列。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一补体(C1q))的结合。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12个或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包括大约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般参见,Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版.Raven Press,N.Y.(1989))。
术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”),如本文中所使用的,是指保留特异性结合抗原(例如,α5β1)的能力的一个或多个抗体片段。已显示可通过全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”包括的结合片段的实例包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab′)2片段,包含通过铰链区上的二硫桥连接的2个Fab片段的双价片段;(iii)Fd片段,其由VH和CH1结构域组成;(iv)Fv段,其由抗体的单臂的VL和VH结构域组成,(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546),其由VH结构域组成;和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外,尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码,但可使用重组方法,通过合成的连接体将它们连接起来,所述合成的连接体使得它们能够形成其中VL和VH部分配对形成单价分子的单个蛋白链(称为单链Fv(scFv);参见例如,Bird等人(1988)Science 242:423-426;和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段可使用任何合适的技术,包括本领域技术人员已知的常规技术获得,并且可以以与对于完整抗体所进行的相同的方式就效用筛选片段。
“分离的抗体”,如本文中所使用的,意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如,特异性结合α5β1的分离的抗体基本上不含特异性结合除了α5β1外的抗原的抗体)。然而,特异性结合α5β1的分离的抗体可以具有与其他抗原例如来自其他物种的α5β1分子的交叉反应性。此外,分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学药品。
术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”,如本文中所使用的,是指单分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物展示对于特定表位的单结合特异性和亲和力。
术语“人抗体”或“完全人抗体”,如本文中所使用的,意在包括具有其中构架区和CDR区都来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外,如果抗体包含恒定区,则恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本公开内容的人抗体或其抗原结合部分可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,由体外随机或定点诱变或由体内体细胞突变导入的突变)。然而,术语“人抗体”,如本文中所使用的,不希望包括其中已将来源于另一哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列移植至人构架序列的抗体。
术语“人单克隆抗体”或“完全人单克隆体”是指展示单结合特异性的抗体,所述抗体具有其中构架区和CDR区都来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中,人单克隆抗体由包含从转基因非人动物例如转基因小鼠(其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组)获得的B细胞的杂交瘤产生,其中B细胞被融合至永生化细胞。
术语“重组人抗体”,如本文中所使用的,包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体,例如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(在下文中进一步描述)分离的抗体,(b)从经转化表达人抗体的宿主细胞,例如从转染瘤分离的抗体,(c)从重组组合人抗体文库分离的抗体,和(d)通过任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体,所述方法牵涉人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的拼接。此类重组人抗体具有其中构架区和CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。然而,在某些实施方案中,可使此类重组人抗体经历体外诱变(或,当使用人Ig序列的转基因动物时,体内体细胞诱变),从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列,其来源于人种系VH和VL序列且与其相关,但可能不天然地存在于体内人抗体种系库(repertoire)中。
如本文中所使用的,“同种型”或“类型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类型(例如,IgM或IgG)。抗体的恒定结构域不参与对抗原的结合,但展示不同的效应子功能。取决于重链恒定区的氨基酸序列,可将给定的人抗体或免疫球蛋白分配至5个主要类型的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中的一个类型。不同类型的免疫球蛋白的结构和三维构型是熟知的。在各种人免疫球蛋白类型中,只有人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM已知活化补体。人IgG1和IgG3已知介导人中的ADCC。
如本文中所使用的,“亚类”是指重链恒定区基因的同种型中的进一步分类,例如,IgG同种型中的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。
如本文中所使用的,术语“化合物”或“药物化合物”包括抗体、其抗原结合部分、免疫缀合物和双特异性分子。
短语“识别抗原的抗体”和“特异于抗原的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“抗体依赖性细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应,其中非特异性细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞等)识别靶细胞上结合的抗体,然后引起靶细胞裂解。介导ADCC的此类细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。介导ADCC的原代细胞(NK细胞)表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。造血细胞上的FcR表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9:457-92(1991)中。为了估计分子的ADCC活性,可进行体外ADCC测定,例如美国专利5,500,362或5,821,337中描述的测定。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地,可以例如在动物模型例如Clynes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估目的分子的ADCC活性。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体的Fc区域的受体,其中Fc区域包含重链的铰链区和CH2及CH3结构域。例如FcR可以是天然序列人FcR。FcR可以是结合IgG抗体的FcR(γ受体),包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcγRIV亚类的受体,包括此类受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),其两者具有主要不同在于其细胞质结构域的相似的氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见,Daeron,Annu.Rev.Immunol.,15:203-234(1997))。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol,9:457-92(1991);Capel等人,Immunomethods,4:25-34(1994);和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41(1995)中。其他FcR,包括将来鉴定的FcR,由本文中的术语“FcR”包括。该术语还包括新生儿受体FcRn,其负责将母源IgG转移至胎儿(Guyer等人,Immunol,117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol,24:249(1994))。免疫球蛋白Fc片段上的主要FcR结合部位存在于CH1与CH2结构域之间的铰链区中。该铰链区与各种白细胞上的FcR1-3相互作用并且触发此类细胞攻击靶(Wines等人,J.Immunol,164:5313-5318(2000))。铰链区包括,但不限于,美国专利6,165,476中描述的序列。
术语“能够诱导抗体依赖性细胞毒性”是指试剂例如抗体展现ADCC的能力,如通过本领域技术人员已知的测定法测量的。这样的活性通常特征在于Fc区域与不同FcR的结合。不受任何特定机制的限制,本领域技术人员将认识到,抗体显示ADCC的能力可以例如,通过其亚类(例如IgG1或IgG3),通过导入Fc区域的突变或通过对抗体的Fc区域中的糖模式的修饰来获得。此类修饰描述于例如美国专利申请案2007-0092521中。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式,例如,抗体与另一种试剂或抗体的缀合物。
术语“人源化的抗体”意指其中已将来源于另一个哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列移植至人构架序列上的抗体。可在人构架序列中进行另外的构架区修饰。
术语“嵌合抗体”意指其中可变区序列来源于一个物种并且恒定区序列来源于另一个物种的抗体,例如其中可变区序列来源于小鼠抗体并且恒定区序列来源于人抗体的抗体。
短语“特异性结合”,如本文中所使用的,意指识别并且结合特定分子但基本上不识别或结合相同样品中的其他分子的化合物,例如,蛋白质、核酸、抗体等。例如,抗体或肽抑制剂(例如,与相关抗原α5β1结合的抗α5β1抗体)识别和结合样品中的相关配体但基本上不识别或结合样品中的其他分子。因此,在指定的测定条件下,指定的结合部分(例如抗体或其抗原结合部分)优先结合特定靶分子例如α5β1,并且不以显著的量结合存在于测试样品中的其他成分。可使用许多种测定形式来选择特异性结合目的分子的抗体。例如,固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、BIAcore、FACS和Western印迹分析是可用于鉴定与α5β1特异性反应的抗体的测定。通常,特异性或选择性反应为背景信号或噪声的至少2倍,并且更常见地是背景的10倍以上,甚至更特别地,当平衡解离常数(KD)≤1μM,例如≤100nM和另外地例如≤10nM时,抗体被认为“特异性”结合抗原。
如本文中所使用的,“特异性结合人整联蛋白α5β1”的抗体意指以1x10-7M或更小,5x10-8M或更小,3x10-8M或更小,1x10-8M或更小或5x10-9M或更小的KD结合人整联蛋白α5β1的抗体。
术语“kon”,如本文中所使用的,意指特定抗体-抗原相互作用的结合速率(on-rate)或缔合速率(association rate),而术语“koff”,如本文中使用的,意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率(off-rate)或分解速率。术语“KD”,如本文中所使用的,意指解离常数,其获自koff对kon的比(即koff/kon)并且以摩尔浓度(M)表示。可使用本领域内良好建立的方法测定抗体的KD值。用于测定抗体的KD的一个方法是使用表面等离子共振术,通常使用生物传感器系统例如系统。
如本文中所使用的,术语IgG抗体的“高亲和力”是指对于靶抗原具有1x10-7M或更小,5x10-8M或更小,或5x10-9M或更小的KD的抗体。然而,对于其他抗体同种型,“高亲力”结合可变化。例如,IgM同种型的“高亲和力”结合是指具有10-6M或更小,10-7M或更小,或10-8M或更小的KD的抗体.
如本文中所使用的,关于抗体的术语“竞争”,是指第一抗体或其抗原结合部分与第二抗体或其抗原结合部分竞争结合,其中与在第二抗体不存在的情况下第一抗体的结合相比较,第一抗体与其关联表位的结合在第二抗体存在的情况下发生可检测的减少。其中第二抗体对其表位的结合在第一抗体存在的情况下也可检测地减少的备选情况可以存在但不是必须存在。即,第一抗体可抑制第二抗体对其表位的结合,而该第二抗体没有抑制第一抗体对其各自表位的结合。然而,在各抗体可检测地抑制其他抗体与其关联表位或配体的结合的情况下,不论达到相同、更大或更小的程度,抗体都被认为彼此之间“交叉竞争”对它们各自表位的结合。例如,交叉竞争抗体可结合本文中公开的抗体所结合的表位或表位的部分。竞争和交叉竞争抗体的用途包括在本公开内容中。无论此类竞争或交叉竞争籍以发生的机制是什么(例如,位阻、构象变化或对共同表位或其部分的结合等),本领域技术人员基于本文中提供的教导将理解,这样的竞争和/或交叉竞争抗体包括在并且可用于本文中公开的方法中。
术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇(Epitopic determinant)通常由分子的化学上活跃的表面基团例如氨基酸或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征,以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于对前者(而非后者)的结合在变性溶剂存在的情况下丧失。
“糖形”是指包含多种糖单位的连接的复杂低聚糖结构。此类结构描述于例如,Essentials of Glycobiology Varki等人,eds.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1999)(其还提供了标准糖生物学命名法的综述)中。此类糖形包括但不限于G2、G1、G0、G-1和G-2(参见,例如,国际专利公开案WO 99/22764)。
“糖基化模式”定义为共价连接至蛋白质的糖单位(例如,糖形)的模式以及糖形共价连接至蛋白质(更特别地免疫球蛋白)的肽主链的位点的模式。
由不同细胞系或在转基因动物中表达的抗体彼此相比,可能将具有不同的糖形和/或糖基化模式。然而,无论此类抗体的糖基化如何,由本文中提供的核酸分子编码的或包含本文中提供的氨基酸序列的所有抗体是本公开内容的一部分。
如本文中所使用的,术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物,例如哺乳动物和非哺乳动物,例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
如本文中所使用的,“治疗”是指减少患者经历疾病症状(即,肿瘤生长和/或转移,或由免疫细胞的数量和/或活性等介导的其他效应)的频率。该术语包括施用本公开内容的化合物或试剂以预防或延迟疾病的症状、并发症或生物化学指标(indicia)的发作,减轻疾病、病状或病症的症状或阻止或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。治疗可以是预防性的(以预防或延迟疾病的发作或预防其临床或亚临床症状的表现)或治疗性抑制或减轻疾病表现后的病状。
在下列小部分更详细地描述本公开内容的各个方面。
抗α5β1抗体
本公开内容的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或性质。例如,抗体特异性结合人α5β1。优选,本公开内容的抗体以高亲和力例如以1x10-7M或更小的KD结合α5β1。
优选,抗体以5x10-8M或更小,2x10-8M或更小,5x10-9M或更小,4x10-9M或更小,3x10-9M或更小或2.7x10-9M或更小的KD结合人α5β1。估计抗体对α5β1的结合能力的测定在本领域内是已知的,包括例如,ELISA、Western印迹法、RIA和流式细胞术分析。合适的测定法详细地描述于实施例中。抗体的结合动力学(例如,结合亲和力)还可通过本领域内已知的测定法例如通过Biacore分析来估计。
本公开内容的抗α5β1抗体还能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。例如,可以通过使用特定亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3)(包括可进一步增强抗体的ADCC活性水平的对Fc结构域的突变)来获得这样的功能性。此类突变和测量ADCC的方法进一步描述于实施例中。
单克隆抗体22B5
本公开内容的一个举例说明性抗体是人单克隆抗体22B5,如实施例1和2中所描述的。22B5的VH氨基酸序列示于图1B中以及示于SEQID NO:7中。22B5的VL氨基酸序列示于图1D中以及示于SEQ ID NO:8中。如图1B和图2中所示,22B5的重链可变区包含回复至人种系基因序列的两个突变。即,22B5包含一个在氨基酸残基编号30上从异亮氨酸至丝氨酸的突变(I30S)和在氨基酸残基编号33上从天冬酰胺至丝氨酸的突变(N33S)。如本文中所使用的,“22B5”是指其中已产生所述I30S和N33S重链可变区种系突变的抗体。
鉴于22B5可结合α5β1,可将VH和VL序列与其他抗α5β1抗体“混合和匹配”以产生本公开内容的另外的抗α5β1结合分子。可使用上述和实施例中的结合测定法(例如,ELISA)检测此类“混合和匹配的”抗体的α5β1结合。在一种情况下,当将VH和VL链混合和匹配时,用结构上相似的VH序列置换来自特定VH/VL配对的VH序列。同样地,在另一个情况下,用结构上相似的VL序列置换来自特定的VH/VL配对的VL序列。
在另一个方面,本公开内容提供了包含22B5的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3的抗体。22B5的VH CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。22B5的VH CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2。22B5的VH CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3。22B5的VL CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO:4。22B5的VL CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO:5。22B5的VL CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO:6。使用Kabat系统(Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)描绘CDR区。
鉴于22B5结合α5β1以及该抗原-结合特异性主要由CDR1、CDR2和CDR3区域提供,因此可将VH CDR1、CDR2和CDR3序列和VL CDR1、CDR2和CDR3序列“混合和匹配”(即,可将来自不同α5β1抗体的CDR混合和匹配,虽然各抗体通常将包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3)以产生本公开内容的另外的抗α5β1结合分子。可使用上述和实施例中的结合测定法(例如,ELISA、Biacore分析)来检测此类“混合和匹配的”抗体的α5β1结合。在一种情况下,当将VH CDR序列混合和匹配时,用结构上相似的CDR序列置换来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。同样,当将VL CDR序列混合和匹配时,通常用结构上相似的CDR序列置换来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。对于本领域技术人员来说显而易见的是,可通过用结构上相似的序列(其来自本文中公开的CDR序列)置换一个或多个VH和/或VL CDR区序列来产生新型VH和VL序列。
因此,在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含:(a)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1;(b)含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2;(c)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3;(d)含有SEQID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1;(e)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2;和/或(f)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3;其中抗体特异性结合α5β1,优选人α5β1。
单克隆抗体2D2、24C7和1D9
本公开内容的另一个举例说明性抗体是实施例1和8中描述的人单克隆抗体2D2。2D2的VH氨基酸序列示于SEQ ID NO:39中。2D2的VL氨基酸序列示于SEQ ID NO:40中。
本公开内容的另一个举例说明性抗体是实施例1和8中描述的人单克隆抗体24C7。24C7的VH氨基酸序列示于SEQ ID NO:19中。24C7的VL氨基酸序列示于SEQ ID NO:20中。
本公开内容的另一个举例说明性抗体是实施例1和8中描述的人单克隆抗体1D9。1D9的VH氨基酸序列示于SEQ ID NO:29中。1D9的VL氨基酸序列示于SEQ ID NO:30中。
鉴于2D2、24C7和1D9可结合α5β1,因此可将此类抗体的VH和VL序列与其他抗α5β1抗体“混合和匹配”以产生本公开内容的另外的抗α5β1结合分子。可使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如,ELISA)检测此类“混合和匹配的”抗体的α5β1结合。在一种情况下,当将VH和VL链混合和匹配时,用结构上相似的VH序列置换来自特定VH/VL配对的VH序列。同样地,在另一个情况下,用结构上相似的VL序列置换来自特定的VH/VL配对的VL序列。
在另一个方面,本公开内容提供了包含2D2、24C7和1D9的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3的抗体。这些CDR的相应的氨基酸序列示于下面。
抗体 | CDR | SEQ ID NO: | 抗体 | CDR | SEQ ID NO: | |
2D2 | VHCDR1 | 33 | 24C7 | VLCDR1 | 16 | |
2D2 | VHCDR2 | 34 | 24C7 | VLCDR2 | 17 | |
2D2 | VHCDR3 | 35 | 24C7 | VLCDR3 | 18 | |
2D2 | VLCDR1 | 36 | 1D9 | VHCDR1 | 23 | |
2D2 | VLCDR2 | 37 | 1D9 | VHCDR2 | 24 | |
2D2 | VLCDR3 | 38 | 1D9 | VHCDR3 | 25 | |
24C7 | VHCDR1 | 13 | 1D9 | VLCDR1 | 26 | |
24C7 | VHCDR2 | 14 | 1D9 | VLCDR2 | 27 | |
24C7 | VHCDR3 | 15 | 1D9 | VLCDR3 | 28 |
使用Kabat系统(Kabat,E.A.,等人.(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)描绘CDR区。
鉴于2D2、24C7和1D9结合α5β1以及抗原-结合特异性主要由CDR1、CDR2和CDR3区域提供,因此可将VHCDR1、CDR2和CDR3序列和VL CDR1、CDR2和CDR3序列“混合和匹配”(即,可将来自不同α5β1抗体的CDR混合和匹配,虽然各抗体通常将包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3)以产生本公开内容的另外的抗α5β1结合分子。可使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如,ELISA、Biacore分析)来检测此类“混合和匹配的”抗体的α5β1结合。在一种情况下,当将VH CDR序列混合和匹配时,用结构上相似的CDR序列置换来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。同样,当将VL CDR序列混合和匹配时,通常用结构上相似的CDR序列置换来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。对于本领域技术人员来说将显而易见的是,可通过用来自本文中公开的CDR序列的结构上相似的序列置换一个或多个VH和/或VL CDR区序列来产生新型VH和VL序列。
因此,在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含:(a)含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链可变区CDR1;(b)含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链可变区CDR2;(c)含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链可变区CDR3;(d)含有SEQID NO:36的氨基酸序列的轻链可变区CDR1;(e)含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区CDR2;和/或(f)含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链可变区CDR3;其中抗体特异性结合α5β1,优选人α5β1。
在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含:(a)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区CDR1;(b)含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区CDR2:(c)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区CDR3;(d)含有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的轻链可变区CDR1;(e)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区CDR2;和/或(f)含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区CDR3;其中抗体特异性结合α5β1,优选人α5β1。
在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含:(a)含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区CDR1;(b)含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区CDR2:(c)含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链可变区CDR3;(d)含有SEQ IDNO:26的氨基酸序列的轻链可变区CDR1:(e)含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链可变区CDR2;和/或(f)含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变区CDR3;其中抗体特异性结合α5β1,优选人α5β1。
具有特定种系序列的抗体
在某些方面,本公开内容的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
例如,在一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含作为人VH 4-39基因的产物或源自人VH 4-39基因的重链可变区,其中抗体特异性结合α5β1。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含作为人VH3-30.3基因的产物或源自人VH 3-30.3基因的重链可变区,其中抗体特异性结合α5β1。在另一个方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含作为人VκL6基因的产物或源自人VκL6基因的轻链可变区,其中抗体特异性结合α5β1。在另一个示例性方面,本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其中抗体:
(a)包含作为人VH 4-39基因(该基因编码示于SEQ ID NO:7中的氨基酸序列)或人3-30.3基因(该基因编码示于SEQ ID NO:19、29或39的氨基酸序列)的产物或源自其的重链可变区;
(b)包含作为人VκL6基因(该基因编码示于SEQ ID NO:8、20、30或40的氨基酸序列)的产物或源自其的轻链可变区;和
(c)特异性结合α5β1,优选人α5β1。
具有分别地VH4-39和VκL6的VH和VL的抗体的实例是22B5。具有分别地VH3-30.3和VκL6的VH和VL的抗体的实例是24C7、2D2和1D9。
如本文中所使用的,人抗体包含重链或轻链可变区,所述可变区是特定种系序列的产物或“源自”特定种系序列(如果抗体的可变区获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统)。此类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或用目的抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。这样可通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列相比较,然后选择在序列上与人抗体的序列最接近(即,最大百分比同一性)的人种系免疫球蛋白序列来鉴定作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”其的人抗体。与种系序列相比,作为特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”其的人抗体可包含由于例如,天然发生的体细胞突变或有意导入的定点突变而产生的氨基酸差异。然而,选择的人抗体通常在氨基酸序列上与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90%同一并且包含将人抗体鉴定为人的抗体的氨基酸残基(当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如,鼠种系序列)相比较时)。在某些情况下,人抗体可以在氨基酸序列上与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%同一。在某些情况下,人抗体在氨基酸序列上与由种系Ig基因编码的氨基酸序列同一。通常,来源于特定人种系序列的人抗体将展示不超过10个氨基酸的差异(与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比)。在某些情况下,与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比,人抗体可展示的不超过5个或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。
同源抗体
在另一个方面,本公开内容的抗体包含重链和轻链可变区,所述可变区包含与本文中描述的举例说明性抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列,并且其中抗体保持本公开内容的抗α5β1抗体的期望的功能性质。
例如,本公开内容提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含重链可变区和轻链可变区,其中:
(a)重链可变区包含与选自SEQ ID NO:7、19、29和39的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列;
(b)轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:8、20、30和40的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列;并且抗体展示一个或多个下列性质:
(i)抗体以1x10-7M或更小的KD结合人α5β1;
(ii)抗体能够诱导抗体依赖性细胞毒性。
在不同的实例中,抗体可以是例如,人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其他实例中,VH和/或VL氨基酸序列可以与上文中所示的序列85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%同源。可通过诱变(例如,定点诱变或PCR介导的诱变)编码SEQ ID NO:7、19、29、39、8、20、30和/或40的核酸分子,然后使用本文中描述的功能测定法就保留的功能(即,上述(i)和/或(ii)中所示的性质)测试所编码的改变的抗体来获得具有VH和VL区(其与上文中所示的序列的VH和VL区具有高度(即,80%或更大)的同源性)的抗体。
如本文中所使用的,两个氨基酸序列之间的百分比同源性等于两个序列之间的百分比同一性。两个序列之间的百分比同一性是在考虑为了两个序列的最佳比对而需要导入的缺口的数目和各缺口的长度的情况下,由序列共有的相同位点的数目的函数(即,%同源性=相同位点的#/位点的总#x100)。可使用下文非限定性实例中描述的数学算法来进行两个序列之间的序列比较和百分比同一性的测定。
可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller 的算法(Comput Appl.Biosci.,4:11-17(1988)),使用PAM 120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。此外,可使用已整合入GCG软件包(可在http://www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法,使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵,以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重(length weight)来测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。
另外地或备选地,本公开内容的蛋白质序列还可用作“查询序列”以针对公共数据库进行检索,从而例如,鉴定相关序列。可使用Altschul,等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)来进行此类检索。可使用XBLAST程序,评分=50,字长=3来进行BLAST蛋白质检索以获得与本公开内容的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带缺口的比对(gapped alignment),可如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时,可使用各自程序(例如,XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守修饰的抗体
在某些情况下,本公开内容的抗体包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区,其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文中所述的举例说明性抗体(例如,22B5、1D9、24C7和2D2)的特定的氨基酸序列或其保守修饰形式,并且其中抗体保留本公开内容的抗α5β1抗体的一个或多个期望的功能性质。因此,本公开内容提供了包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其中:
(a)重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO:3、15、25和35以及其保守修饰形式的氨基酸序列;
(b)轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO:6、18、28和38以及其保守修饰形式的氨基酸序列;并且抗体展示一个或多个下列性质:
(i)抗体以1x10-7M或更小的KD结合人α5β1;
(ii)抗体能够诱导抗体依赖性细胞毒性。
在其他情况下,重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO:2、14、24和34以及其保守修饰形式的氨基酸序列;并且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO:5、17、27和37以及其保守修饰形式的氨基酸序列。在另一个情况下,重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO:1、13、23和33以及其保守修饰形式的氨基酸序列;并且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO:4、16、26和36以及其保守修饰形式的氨基酸序列。
如本文中所使用的,术语“保守修饰”意指氨基酸修饰,其不显著影响或改变包含所述氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变将修饰导入本公开内容的抗体。给定序列的保守修饰形式可包括与该序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%同一的序列。保守氨基酸置换是其中用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换。在本领域内已定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支的侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此,本公开内容的抗体的CDR区域中的一个或多个氨基酸残基可用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换,并且可使用本文中描述的功能测定法就保留的功能(即,上述(i)至(ii)中所示的性质)测试改变的抗体。另一种类型的氨基酸修饰是消除形成潜在的脱酰胺位点的天冬酰胺-甘氨酸对(通过改变一个或两个所述残基)。在另一个实例中,本公开内容的α5β1抗体的重链的C末端赖氨酸已被切除,从而不存在。C末端赖氨酸切除可预先通过工程改造来进行或可由用于表达和纯化抗体的条件引起。在多种情况下,α5β1抗体的重链和轻链可任选地包含信号序列。
结合与本公开内容的举例说明性抗α5β1抗体相同的表位的抗体
在另一个方面,本公开内容提供了结合与本公开内容的任何举例说明性α5β1单克隆抗体相同的人α5β1上的表位的抗体(即,具有与本公开内容的任何单克隆抗体交叉竞争对α5β1的结合的能力的抗体)。例如,用于交叉竞争研究的参照抗体可以是单克隆抗体22B5(具有分别在SEQ ID NO:7和8中显示的VH和VL序列)或单克隆抗体24C7(具有分别示于SEQ ID NO:19和20中的VH和VL序列)或单克隆抗体1D9(具有分别示于SEQ ID NO:29和30中的VH和VL序列)或单克隆抗体2D2(具有分别示于SEQ ID NO:39和40中的VH和VL序列)。可基于它们在标准α5β1结合测定中与22B5、24C7、1D9或2D2交叉竞争的能力鉴定此类交叉竞争性抗体。例如,可使用BIAcore分析、ELISA测定或流式细胞术来证明与本公开内容的举例说明性抗体的交叉竞争。测试抗体抑制例如,22B5、24C7、1D9或2D2对人α5β1的结合的能力证明测试抗体可与22B5、24C7、1D9或2D2竞争对人α5β1的结合,从而结合与22B5、24C7、1D9或2D2相同的人α5β1上的表位。在一个情况下,结合与22B5、24C7、1D9或2D2相同的人α5β1上的表位的抗体是人单克隆抗体。可如例如实施例中所述,制备和分离这样的人单克隆抗体。
工程改造的和修饰的抗体
还可使用具有本文中公开的一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始材料来工程改造修饰的抗体以制备本公开内容的抗体或其抗原结合部分,所述修饰的抗体与起始抗体相比可具有改变的性质。可通过修饰一个或两个可变区(即,VH和/或VL)内,例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内的一个或多个残基来工程改造抗体。此外或备选地,可通过修饰恒定区内的残基来工程改造抗体,例如以改变抗体的效应子功能。
可进行的一种类型的可变区工程改造是CDR移植。抗体主要通过位于6个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此,CDR中的氨基酸序列在个体抗体之间比CDR外的序列更多样。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用,因此可能通过构建表达载体来表达模拟特定的天然发生的抗体的性质的重组抗体,所述表达载体包含被移植至来自不同抗体(其具有不同性质)的构架序列上的来自特定的天然发生的抗体的CDR序列(参见,例如,Riechmann,L.等人(1998)Nature 332:323-327;Jones,P.等人(1986)Nature321:522-525;Queen,C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.86:10029-10033;属于Winter的美国专利5,225,539和属于Queen等人的美国专利5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。
因此,本公开内容的另一个方面涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含含有分别选自SEQ ID NO:1,13,23和33、SEQ ID NO:2、14、24和34以及SEQ ID NO:3、15、25和35的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3序列,所述轻链可变区包含含有分别选自SEQ ID NO:4、16、26和36、SEQ ID NO:5、17、27和37以及SEQ ID NO:6、18、28和38的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3序列。因此,此类抗体包含单克隆抗体22B5、24C7、1D9和2D2的VH和VL CDR序列,还可包含与这些抗体不同的构架序列。
此类构架序列可获自包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或出版的参考资料。例如,人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“VBase”人种系序列数据库(可在互联网上在www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase获得),以及见于Kabat,E.A.,等人(1991),Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242;Tomlinson,I.M.,等人(1992),J.Mol.Biol.227:776-798;和Cox,J.P.L等人(1994),Eur.J.Immunol.24:827-836中;其各自的内容明确地通过引用合并入本文)。作为另一个实例,人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于Genbank数据库。例如,在HCo7 HuMAb小鼠中发现的下列重链种系序列可在所附Genbank登录号中获得:1-69(NG_0010109,NT_024637和BC070333),3-33(NG_0010109和NT_024637)以及3-7(NG_0010109和NT_024637)。作为另一个实例,在HCo12 HuMAb小鼠中发现的下列重链种系序列可在所附Genbank登录号中获得:1-69(NG_0010109,NT_024637和BC070333)、5-51(NG_0010109和NT_024637)、4-34(NG_0010109和NT_024637)、3-30.3(X92283)和3-23(AJ406678)。
用于本公开内容的抗体的构架序列包括但不限于在结构上与本公开内容的选择的抗体使用的构架序列相似,例如与本公开内容的举例说明性单克隆抗体使用的VH4-39和/或VH3-30.3构架序列和/或VκL6构架序列相似的构架序列。例如,可将VH CDR1、CDR2和CDR3序列和VL CDR1、CDR2和CDR3序列移植至具有与在构架序列所源自的种系免疫球蛋白基因中发现的序列相同的序列的构架区,或可将CDR序列移植至与种系序列相比较包含一个或多个突变的构架区。例如,已发现在某些情况下,突变构架区内的残基以保持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如,属于Queen等人的美国专利5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基,从而提高目的抗体的一个或多个结合性质(例如,亲和力)。可进行定点诱变或PCR介导的诱变以导入突变,并且可在本文中描述的和实施例中提供的体外或体内测定中估计对抗体结合或其他目的功能性质的影响。通常,导入保守置换(如上论述的)。突变可以是氨基酸置换、添加或缺失。此外,CDR区中通常不超过1、2、3、4或5个残基被改变。
因此,在另一个实施方案中,本公开内容提供了包含重链可变区的分离的抗α5β1单克隆抗体或其抗原结合部分,所述重链可变区包含:(a)含有选自SEQ ID NO:1、13、23和33以及与SEQ ID NO:1、13、23或33相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列的VH CDR1区;(b)含有选自SEQ ID NO:2、14、24和34以及与SEQ ID NO:2、14、24或34相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列的VH CDR2区;(c)含有选自SEQ ID NO:3、15、25和35以及与SEQ ID NO:3、15、25或35相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列的VH CDR3区;(d)含有选自SEQ ID NO:4、16、26和36以及与SEQ ID NO:4、16、26或36相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列的VL CDR1区;(e)含有选自SEQ ID NO:5、17、27和37以及与SEQ ID NO:5、17、27或37相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列的VL CDR2区;和(f)含有选自SEQ ID NO:6、18、28和38以及与SEQ ID NO:6、18、28或38相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列的氨基酸序列的VL CDR3区。
本公开内容的工程改造的抗体包括其中已对VH和/或VL中的构架残基进行修饰例如以提高抗体的性质的抗体。通常产生此类构架修饰以减少抗体的免疫原性。例如,一个方法是将一个或多个构架残基“回复突变”至相应的种系序列。更特别地,已经历体细胞突变的抗体可包含与抗体所源自的种系序列不同的构架残基。此类残基可通过将抗体的构架序列与抗体所源自的种系序列相比较来鉴定。为了使构架区序列返回至它们的种系构型,可通过例如定点诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”至种系序列。
另一种类型的构架修饰包括突变构架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基,以除去T细胞表位,从而减少抗体的潜在的免疫原性。该方法也称为“去免疫(deimmunization)”并且更详细地描述于Carr等人的美国专利公开案20030153043。
除了构架区或CDR区内产生的修饰外或作为所述修饰的另外选择,可对本公开内容的抗体进行工程改造以在Fc区域内包含修饰,通常以改变抗体的一个或多个功能性质例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性。此外,可对本公开内容的抗体进行化学修饰(例如,可将一个或多个化学部分连接至抗体)或进行修饰以改变其糖基化,从而改变抗体的一个或多个功能性质。下面更详细地描述此类方面的每一个方面。Fc区域中的残基编号是EUindex或Kabat的编号。
在一种情况下,修饰CH1的铰链区以便改变例如增加或减少铰链区中半胱氨酸残基的数目。该方法进一步描述于属于Bodmer等人的美国专利5,677,425。改变CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数目以例如促进轻链和重链的装配或增加或减少抗体的稳定性性。
在另一个情况下,突变抗体的Fc铰链区以减少抗体的生物学半衰期。更特别地,将一个或多个氨基酸突变导入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域交界区域以便抗体具有削弱的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合(相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合)。该方法更详细地描述于属于Ward等人的美国专利6,165,745中。
在另一种情况下,修饰抗体以增加其生物学半衰期。不同的方法是可能的。例如,可导入下列突变中的一个或多个:T252L、T254S、T256F,如属于Ward的美国专利6,277,375中所描述的。备选地,为了增加生物学半衰期,可在CH1或CL区域中改变抗体以包含取自IgG的Fc区域的CH2结构域的2个环的补救受体结合表位,如属于Presta等人的美国专利5,869,046和6,121,022中所描述的。
在其他情况下,通过用不同的氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区域,从而改变抗体的效应子功能。例如,可使用不同的氨基酸残基置换选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸以便抗体具有改变的对效应子配体的亲和力但仍然保持亲本抗体的抗原结合能力。对于其的亲和力被改变的效应子配体可以是例如,Fc受体或补体的C1成分。该方法更详细地描述于属于Winter等人的美国专利5,624,821和5,648,260中。
在另一种情况下,可用不同氨基酸残基置换选自氨基酸残基329,331和322的一个或多个氨基酸以便抗体具有改变的C1q结合和/或减少的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法更详细地描述于属于Idusogie等人的美国专利6,194,551中。
在另一个实例中,改变氨基酸位点231和239内的一个或多个氨基酸残基,从而改变抗体结合补体的能力。该方法进一步描述于属于Bodmer等人的PCT公开案WO 94/29351。
在另一个实例中,通过修饰下列位点上的一个或多个氨基酸来修饰Fc区域以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力:238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方法进一步描述于属于Presta的PCT公开案WO 00/42072。此外,已对人IgG1上用于FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合部位作图并且已描述了具有提高的结合的变体(参见Shields,R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。位点256、290、298、333、334和339上的特定突变经显示提高了对FcγRIII的结合。此外,下列组合突变体经显示提高FcγRIII结合:T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。例如,本文中描述的22B5/DLE抗体使用IgG同种型的IgG1亚类,但已通过定点诱变整合了下列突变(与野生型IgG1亚类比较):S247D;A338L和I340E。类似地,如在下面更详细地描述的,已将这样的S247D、A338L和I340E突变导入24C7、1D9和2D2单克隆抗体。如在实施例中进一步描述的,此类突变可增加抗体对Fcγ受体的亲和力,从而增加其效应子功能。因此,本公开内容提供了在Fc区域中包含至少一个突变并且与不包含所述至少一个突变的相同抗体相比具有可检测的更大的ADCC应答的抗体。
在另一个实例中,修饰抗体的糖基化。例如,可产生非糖基化抗体(即,抗体不存在糖基化)。可改变糖基化以例如,增加抗体对抗原的亲和力。此类糖修饰可通过例如,改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来实现。例如,可进行一个或多个氨基酸置换,所述氨基酸置换导致一个或多个可变区构架糖基化位点消除,从而消除在该位点上的糖基化。此类非糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。这样的方法更详细地描述于Co等人的美国专利5,714,350和6,350,861中。
另外或备选地,可制备具有改变的糖基化类型的抗体,例如具有减少的岩藻糖基残基量的低岩藻糖基化的(hypofucosylated)抗体或具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。此类改变的糖基化模式经证明增加抗体的ADCC能力。此类糖修饰可通过例如,在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域内进行了描述并且可用作宿主细胞以表达本公开内容的重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如,细胞系Ms704、Ms705和Ms709不存在岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)岩藻糖基转移酶),以便在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的糖上缺乏岩藻糖。使用两个置换载体通过靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因来产生Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系(参见Yamane等人的美国专利公开案20040110704和Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol Bioeng 87:614-22)。作为另一个实例,属于Hanai等人的EP 1,176,195描述了具有功能上被破坏的FUT8基因(其编码岩藻糖基转移酶)的细胞系,以便通过减少或消除α1,6键相关的酶,使这样的细胞系中表达的抗体展示低岩藻糖基化。Hanai等人还描述了具有较低的将岩藻糖加至结合抗体的Fc区域的N-乙酰葡糖胺的酶活性或不具有酶活性的细胞系,例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。属于Presta的PCT公开案WO 03/035835描述了变异CHO细胞系Lee 13细胞,其具有减少的将岩藻糖连接至Asn(297)-连接的糖的能力,从而也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。属于Umana等人的PCT公开案WO 99/54342描述了经工程改造表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如,β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系以便工程改造的细胞系中表达的抗体展示增加的平分型GlcNac结构,所述结构导致增加的抗体的ADDC活性(也参见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。备选地,可使用岩藻糖苷酶切除抗体的岩藻糖残基。例如,岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体除去岩藻糖残基(Tarentino,A.L.等人(1975)Biochem.14:5516-23)。
本公开内容涉及的本文中的抗体的另一种修饰是PEG化(pegylation)。可PEG化抗体以例如增加抗体的生物学(例如,血清)半衰期。为了PEG化抗体,通常将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)例如PEG的反应性酯或醛衍生物在其中一个或多个PEG基团连接至抗体或抗体片段的条件下反应。一般地,通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行PEG化。如本文中所使用的,术语“聚乙二醇”意欲包括已用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG,例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些情况下,待PEG化的抗体是非糖基化抗体。用于PEG化蛋白质的方法在本领域内是已知的并且可用于本公开内容的抗体。参见,例如,属于Nishimura等人的EP 0 154 316和属于Ishikawa等人的EP 0 401 384。
工程改造抗体的方法
如上所论述的,通过修饰VH和/或VL序列或与其连接的恒定区,可将具有本文中公开的VH和VL序列的抗α5β1抗体用于产生新型抗α5β1抗体。因此,在本公开内容的另一个方面,本公开内容的抗α5β1抗体例如22B5、24C7、1D9或2D2的结构特征用于产生结构上相关的保持本公开内容的抗体的至少一个功能性质(例如结合人α5β1)的抗α5β1抗体。例如,可将22B5、24C7、1D9或2D2的一个或多个CDR区或其突变形式与已知的构架区和/或其他CDR重组地组合来产生本公开内容的另外的重组工程改造的抗α5β1抗体,如上所论述的。其他类型的修饰包括前面部分中描述的修饰。用于工程改造方法的起始材料是本文中提供的一个或多个VH和/或VL序列或其一个或多个CDR区。为了产生工程改造的抗体,不必实际制备(即,表达蛋白质)具有本文中提供的一个或多个VH和/或VL序列或其一个或多个CDR区的抗体。相反,序列中包含的信息可用作起始材料来产生来源于原始序列的“第二代”序列,然后制备“第二代”序列并且将其表达为蛋白质。
因此,在另一个方面,本公开内容提供制备抗α5β1抗体的方法,其包括:
(a)提供:(i)包含选自SEQ ID NO:1、13、23和33的CDR1序列、选自SEQ ID NO:2、14、24和34的CDR2序列和/或选自SEQ IDNO:3、15、25和35的CDR3序列的重链可变区抗体序列;和/或(ii)包含选自SEQ ID NO:4、16、26和36的CDR1序列、选自SEQ ID NO:5、17、27和37的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO:6、18、28和38的CDR3序列的轻链可变区抗体序列;
(b)改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列;和
(c)将改变的抗体序列表达为蛋白质。
标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体序列。
优选,由改变的抗体序列编码的抗体是保持本文中描述的抗α5β1抗体的一个、一些或所有功能性质的抗体,所述功能性质包括但不限于:
(i)以1X10-7M或更小的KD结合人α5β1;
(ii)能够诱导ADCC。
可使用可在本领域内获得的和/或本文中描述的标准测定法例如实施例中所示的测定法(例如,流式细胞术、结合测定法)评估改变的抗体的功能性质。
在工程改造本公开内容的抗体的方法的某些方面,可随机地或选择性地沿着抗α5β1抗体编码序列的全部或部分导入突变,并且可就本文中所描述的结合活性和/或其他功能性质筛选所得的经修饰的抗α5β1抗体。突变方法已在本领域中进行了描述。例如,属于Short的PCT公开案WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接装配或其组合产生和筛选抗体突变的方法。备选地,属于Lazar等人的PCT公开案WO 03/074679描述了使用计算机化筛选方法最优化抗体的物理化学性质的方法。
编码本公开内容的抗体的核酸分子
本公开内容的另一方面涉及编码本公开内容的抗体的核酸分子。核酸可存在完整细胞中、细胞裂解物中或以部分纯化或大体上纯化的形式存在。当通过任何合适的技术,包括碱性/SDS处理、CsCl分带(CsCl banding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其他技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白质中纯化出来时,核酸是“分离的”或“变得大体上纯的”。参见,F.Ausubel,等人,ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本公开内容的核酸可以是例如DNA或RNA并且可以包含或可以不包含内含子序列。通常,核酸是cDNA分子。
可使用任何合适的分子生物学技术获得本公开内容的核酸。对于通过杂交瘤(例如,如下面进一步描述的,从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体,可通过PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码杂交瘤产生的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如,使用噬菌体展示技术),可从文库回收编码抗体的核酸。
本公开内容的核酸分子包括例如,编码22B5单克隆抗体的VH和VL序列的核酸分子。编码22B5的VH序列的DNA序列示于SEQ ID NO:11中。编码22B5的VL序列的DNA序列示于SEQ ID NO:12中。本文中公开的其他举例说明性核酸分子是编码24C7、1D9和2D2单克隆抗体的VH和VL序列的核酸分子。编码24C7的VH序列的DNA序列示于SEQ IDNO:21中。编码24C7的VL序列的DNA序列示于SEQ ID NO:22中。编码1D9的VH序列的DNA序列示于SEQ ID NO:31中。编码1D9的VL序列的DNA序列示于SEQ ID NO:32中。编码2D2的VH序列的DNA序列示于SEQ ID NO:41中。编码2D2的VL序列的DNA序列示于SEQ IDNO:42中。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段,可通过任何合适的重组DNA技术进一步操作这些DNA片段,例如以将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在此类操作中,将编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质例如抗体恒定区或柔软的连接体的另一个DNA片段有效连接。术语“有效连接的”,如本说明书中使用的,意指连接两个DNA片段以使由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合读框。
可通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一个DNA分子有效连接来将编码VH区的分离的DNA转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域内是已知的(参见例如,Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)并且包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区,但最优选是IgG1或IgG4恒定区。IgG1恒定区序列可以是已知在不同个体间发生的各种等位基因或同种异型的任一个,例如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)和Gm(17)。此类同种异型代表IgG1恒定区中天然发生的氨基酸置换。对于Fab片段重链基因,可将编码VH的DNA与只编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子有效连接。
可通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子有效连接来将编码VL区的分离的DNA转变成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域内是已知的(参见例如,Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)并且可通过标准PCR扩增获得包含此类区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因,将编码VH和VL的DNA片段与编码柔软的连接体例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一个片段有效连接,以便VH和VL序列可表达为VL和VH区通过柔软的连接体连接的连续单链蛋白质(参见,例如,Bird等人(1988)Science 242:423-426;Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:5879-5883;McCafferty等人,(1990)Nature 348:552-554)。
本公开内容的单克隆抗体的产生
本公开内容的单克隆抗体(mAb)可通过许多技术产生,所述技术包括常规单克隆抗体方法学例如,Kohler和Milstein(1975)Nature256:495的标准体细胞杂交技术。还可使用用于产生单克隆抗体的其他技术,例如,B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。小鼠中杂交瘤的产生是已非常良好地建立的方法。免疫方案和用于经免疫的脾细胞(用于融合)的分离的技术在本领域内是已知的。融合伴侣(例如,鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
可基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列来制备本公开内容的嵌合或人源化抗体。可从目的鼠杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA,并且使用合适的分子生物学技术对其进行工程改造以获得非鼠(例如,人)免疫球蛋白序列。例如,为了产生嵌合抗体,可使用本领域内已知的方法(参见例如,属于Cabilly等人的美国专利4,816,567)将鼠可变区连接至人恒定区。为了产生人源化抗体,可使用本领域内已知的方法(参见例如,属于Winter的美国专利5,225,539,属于Queen等人的美国专利5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)将鼠CDR区插入人构架。
在一些情况下,本公开内容的抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统的部分而非鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生此类抗α5β1的人单克隆抗体。此类转基因和转染色体小鼠包括本文中分别称为HuMAb Mouse和KM Mouse的小鼠,且在本文中统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb Mouse(Medarex,Inc.)包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微小基因座和使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如,Lonberg,等人(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此,小鼠展示减少的小鼠IgM或κ的表达,并且响应免疫,导入的人重链和轻链转基因经历类别转换(class switching)和体细胞突变产生高亲合力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg,N,等人(1994),同上;综述于Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101中;Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93,以及Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。HuMAb Mouse的制备和用途和此类小鼠携带的基因修饰进一步描述于Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295;Chen,J.等人(1993)International Immunology 5:647-656;Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724;Choi等人(1993)Nature Genetics 4:117-123;Chen,J.等人(1993)EMBO J.12:821-830;Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152:2912-2920;Taylor,L.等人(1994)International Immunology 6:579-591;和Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851中。进一步参见,全都属于Lonberg和Kay的美国专利5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,789,650;5,877,397;5,661,016;5,814,318;5,874,299和5,770,429;属于Surani等人的美国5,545,807;全都属于Lonberg和Kay的PCT公开案WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962;以及属于Korman等人的PCT公开案WO 01/14424。
在另一种情况下,可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠,例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生本公开内容的人抗体。此类小鼠,在本文中称为“KM小鼠TM”,详细地描述于属于Ishida等人的PCT公开案WO 02/43478中。
此外,表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统在本领域内是可获得的并且可用于产生本公开内容的抗α5β1抗体。例如,可使用称为Xenomouse(Abgenix,Inc.)的备选转基因系统;此类小鼠描述于例如,属于Kucherlapati等人的美国专利5,939,598;6,075,181;6,114,598;6,150,584和6,162,963中。
此外,表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统在本领域内是可获得的并且可用于产生本公开内容的抗α5β1抗体。例如,可使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠;此类小鼠描述于Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci USA97:722-727中。此外,已在本领域内描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20:889-894),其可用于产生本公开内容的抗α5β1抗体。
还可使用用于筛选人免疫球蛋白基因的文库的噬菌体展示方法制备本公开内容的人单克隆抗体。用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法已在本领域内建立。参见例如:属于Ladner等人的美国专利5,223,409;5,403,484和5,571,698;属于Dower等人的美国专利5,427,908和5,580,717;属于McCafferty等人的美国专利5,969,108和6,172,197;以及属于Griffiths等人的美国专利5,885,793;6,521,404;6,544,731;6,555,313;6,582,915和6,593,081。
还可使用已向其中重建了人免疫细胞(以便在免疫后可产生人抗体应答)的SCID小鼠来制备本公开内容的人单克隆抗体。此类小鼠描述于例如属于Wilson等人的美国专利5,476,996和5,698,767。
人Ig小鼠的免疫
当将人Ig小鼠用于产生本公开内容的人抗体时,如由Lonberg,N.等人(1994)Nature 368(6474):856-859;Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851;和PCT公开案WO 98/24884和WO 01/14424中所描述的,使用纯化的或富集的α5β1抗原制备物和/或重组α5β1或α5β1融合蛋白免疫此类小鼠。优选,在第一次输注时小鼠为6至16周龄。例如,可使用α5β1抗原的纯化或重组制备物(5-50μg)腹膜内免疫人Ig小鼠。此外,相关蛋白质例如,α5和/或β1的多肽片段可用于免疫小鼠。例如,可将多肽片段缀合至载体分子以增加它们的免疫原性。此类载体分子在本领域内是熟知的,并且特别地,包括钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、白喉类毒素和破伤风类毒素。
产生抗α5β1的完全人单克隆抗体的详细方法描述于下面的实施例1中。使用各种抗原的累积经验(Cumulative experience)已显示,当用完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内(IP)初始免疫,然后每隔一周用不完全弗氏佐剂中的抗原IP免疫(达到总共6次)时,转基因小鼠产生应答。然而,还发现除了弗氏佐剂以外的佐剂也是有效的。此外,发现在佐剂不存在的情况下完整细胞具有高度免疫原性。可在使用通过眶后放血(retroorbital bleed)获得的血浆样品的免疫方案的过程中监控免疫应答。可利用ELISA(如下文中所描述的)筛选血浆,可将具有足够滴度的抗α5β1人免疫球蛋白的小鼠用于融合。可在杀死并且取出脾脏前3天用抗原静脉内加强免疫小鼠。预期对于每一个免疫可能需要进行2至3次融合。对于每一种抗原,通常免疫6至24只小鼠。通常使用HCo7和HCo12品系。此外,可将HCo7和HCo12转基因一起培育入具有两个不同人重链转基因(HCo7/HCo12)的单个小鼠。备选地或另外地,可如实施例1中所述,使用KM Mouse品系。
产生人单克隆抗体的杂交瘤的产生
为了产生用于产生本公开内容的人单克隆抗体的杂交瘤,可分离来自经免疫的小鼠的脾细胞和/或淋巴节细胞,然后将其融合至合适的永生化细胞系,例如小鼠骨髓瘤细胞系。可就抗原特异性抗体的产生筛选所得的杂交瘤。例如,可使用50%的PEG将来自经免疫的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与1/6数目的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC,CRL 1580)融合。将细胞以大约2x105个涂板在平底微量滴定板上,然后在含有20%胎儿克隆血清(fetal Clone Serum)、18%″653″条件化培养基、5%三甲氧唑辛(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma;在融合后24小时加入HAT)的选择培养基中温育2周。在大约2周后,将细胞培养在其中用HT替代了HAT的培养基中。然后利用ELISA就人单克隆IgM和IgG抗体筛选单独的孔。当大量的杂交瘤生长发生时,通常可在10至14天后观察培养基。将分泌抗体的杂交瘤再涂板,再筛选,如果对于人IgG仍然呈阳性,则通过有限稀释将单克隆抗体亚克隆至少2次。然后可在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量的抗体用于表征。
为了纯化人单克隆抗体,可将选择的杂交瘤培养在2升转瓶(spinner-flask)中以用于单克隆抗体纯化。可在使用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和层析之前过滤和浓缩上清液。可通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲液换成PBS,然后可使用1.43的消光系数利用OD280测定浓度。可将单克隆抗体等分,然后在-80℃下贮存。
产生单克隆抗体的转染瘤的产生
还可使用例如本领域内熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如,Morrison,S.(1985)Science 229:1202)来在宿主细胞转染瘤中产生本公开内容的抗体。
例如,为了表达抗体或其抗体片段,可通过标准分子生物学技术(例如,PCR扩增或使用表达目的抗体的杂交瘤或噬菌体的cDNA克隆)来获得编码部分或全长轻链和重链的DNA,然后可将DNA插入表达载体以便将基因与转录和翻译控制序列有效连接。在本说明书中,术语“有效连接的”意指将抗体基因连接入载体以便载体中的转录和翻译控制序列发挥它们的期望的调控抗体基因的转录和翻译的功能。选择与使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分开的载体或更常见地,将两个基因插入相同的表达载体。通过任何合适的方法(例如,连接抗体基因片段与载体上的互补限制性位点,或如果不存在限制性位点进行平端连接)将抗体基因插入表达载体。可使用本文中描述的抗体的轻链和重链可变区,通过将它们插入已编码期望的同种型和亚类的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体(以便VH区段与载体内的CH区段有效连接以及VΚ区段与载体内的CL区段有效连接)来产生任何抗体同种型和亚类的全长抗体基因。此外或备选地,重组表达载体可编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆入载体以便信号肽符合读框地连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即,来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因外,本公开内容的重组表达载体通常具有控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。术语“调控序列”意在包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如,多腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于例如Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。本领域技术人员将理解,表达载体的设计,包括调控序列的选择,可取决于这样的因素如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件,例如来源于巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如,腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。备选地,可使用非病毒调控序列,例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。此外,调控元件可由来自不同来源的序列组成,例如SR启动子系统,其包含来自SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒I型的长末端重复的序列(Takebe,Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol 8:466-472)。
除了抗体链基因和调控序列外,本公开内容的重组表达载体还可具有额外的序列,例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如,复制起点)和选择标记基因。选择标记基因帮助选择已向其中导入了载体的宿主细胞(参见,例如,全都属于Axel的美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如,通常选择标记基因赋予已向其中导入了载体的宿主细胞对药物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(与甲氨蝶呤选择/扩增一起用于dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
为了轻链和重链的表达,通过任何合适的技术将编码重链和轻链的表达载体转染入宿主细胞。术语“转染”的各种形式意在包括众多的通常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术,例如,电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。虽然可以在原核或真核宿主细胞中表达本公开内容的抗体,但最常见地在真核细胞,通常哺乳动物宿主细胞中表达抗体。
用于表达本公开内容的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞,描述于Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中,与DHFR选择标记一起使用,例如如在R.J.Kaufman和P.A.Sbarp(1982)Mol.Biol.159:601-621)中描述的)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和Sp2细胞。特别地,为了与NS0骨髓瘤或CHO细胞一起使用,另一种表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS(谷氨酰胺合成酶)基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时,可通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达或抗体分泌入宿主细胞在其中生长的培养基的时间来产生抗体。可使用任何合适的蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。
结合抗原的抗体的表征
可通过例如标准ELISA就对α5β1的结合测试本公开内容的抗体或其抗原结合部分。简而言之,用纯化的α5β1以0.25μg/ml(于PBS中)包被微量滴定板,然后用5%的于PBS中的牛血清白蛋白进行封闭。向各孔中加入抗体的稀释物(例如,来自α5β1免疫的小鼠的血浆的稀释物),然后在37℃下温育1至2小时。用PBS/Tween清洗板,然后用缀合至碱性磷酸酶的第二试剂(例如,对于人抗体,山羊抗人IgGFc-特异性多克隆试剂)在37℃下温育1小时。在清洗后,用pNPP底物(1mg/ml)对板进行显色,在405-650的OD处进行分析。优选,将产生最高滴度的小鼠用于融合。
还可将上述ELISA测定用于筛选显示与α5β1免疫原的阳性反应性的杂交瘤。亚克隆以高亲合力结合α5β1的杂交瘤,并且进行进一步表征。可从各杂交瘤选择一个克隆(其保持亲本细胞的反应性(通过ELISA))用于制备5至10小瓶细胞库(于-140℃下贮存)和用于抗体纯化。
为了纯化抗α5β1抗体,可将选择的杂交瘤培养在2升转瓶中以用于单克隆抗体纯化。可在使用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,NJ)进行亲和层析之前过滤和浓缩上清液。通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲液更换成PBS,然后使用1.43的消光系数利用OD280测定浓度。将单克隆抗体等分并且于-80℃下贮存。
此外,可通过本领域内已知的标准方法表征被抗体结合的表位。此类方法包括产生α5和/或β1的交叠肽片段的阵列,然后评估抗体对各种片段的结合。备选地,可将突变,例如其中用丙氨酸残基置换各氨基酸的丙氨酸扫描诱变,导入α5和/或β1肽,可将抗体对突变体肽的结合与抗体对野生型蛋白质的结合相比较,从而鉴定其中突变影响结合的位点。参见,例如,Cunningham等人,(1989)Science 244:1081-1085。
为了确定选择的抗α5β1单克隆抗体或其抗原结合部分是否结合独特的表位,可使用可商购获得的试剂(Pierce,Rockford,IL)生物素化各抗体。如上所述,可使用α5β1包被的-ELISA板进行使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究。可使用链霉抗生物素蛋白碱性磷酸酶探针检测生物素化的mAb的结合。
为了确定纯化的抗体的同种型,可使用特异于特定同种型的抗体的试剂进行同种型ELISA。例如,为了确定人单克隆抗体的同种型,可用1μg/ml的抗人免疫球蛋白在4℃下包被微量滴定板的孔,进行过夜。在用1%BSA封闭后,将板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应,进行1至2小时。然后可将孔与人IgG1或人IgM-特异性碱性磷酸酶缀合的探针反应。如上所述对板进行显色和分析。
还可通过Western印迹,使用α5β1抗原就反应性测试抗α5β1人IgG。简而言之,可制备α5β1,使其经历十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后,将分开的抗原转移至硝酸纤维素膜,用10%胎牛血清封闭,然后用待测单克隆抗体进行探测。使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合,用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.,St.Louis,Mo.)进行显色。
免疫缀合物
在另一个方面,本公开内容的特征在于缀合至治疗性部分例如细胞毒素、药物(例如,免疫抑制剂)或放射性毒素的抗α5β1抗体或其片段。此类缀合物在本文中称为“免疫缀合物”。包含一个或多个细胞毒素的免疫缀合物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒素剂包括对细胞有害(例如,杀伤)的任何试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、普卡霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌罗霉素以及其类似物或同源物。治疗剂还包括,例如,抗代谢药(例如,甲氨蝶呤,6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷,5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂(例如,氮芥、塞替派(thioepa)苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C,以及顺二氯二氨基铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如,柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如,放线菌素D(以前称为放线菌素),博莱霉素、普卡霉素和安曲霉素(AMC)),和抗有丝分裂剂(例如,长春新碱和长春碱)。
可缀合至本公开内容的抗体或其抗原结合部分的治疗性细胞毒素的其他实例包括多卡米星(duocarmycin)、刺孢霉素、美登素和auristatin和其衍生物。刺孢霉素抗体缀合物的实例是可商购获得的(MylotargTM;Wyeth-Ayerst)。
可使用不同的连接体技术将细胞毒素缀合至本公开内容的抗体或其抗原结合部分。已用于将细胞毒素缀合至抗体的连接体类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽连接体。可选择例如易于被溶酶体区室中低pH切割的或易于被蛋白酶例如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶(例如组织蛋白酶(例如,组织蛋白酶B、C、D))切割的连接体。
为了进一步论述细胞毒素、连接体的类型和用于将治疗剂缀合至抗体的方法,也参见Saito,G.等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215;Trail,P.A.等人(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337;Payne,G.(2003)Cancer Cell 3:207-212;Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2:750-763;Pastan,I.和Kreitman,R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091;Senter,P.D.和Springer,CJ.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53:247-264。
还可将本公开内容的抗体或其抗原结合部分缀合至放射性同位素以产生也称为放射免疫缀合物(radioimmunoconjugate)的细胞毒性放射性药物。可被缀合至抗体以进行诊断或治疗应用的放射性同位素的实例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域中已建立用于制备放射免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物的实例是可商购获得的,包括ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals),并且可使用相似的方法,使用本公开内容的抗体制备放射免疫缀合物。
本公开内容的抗体缀合物可用于修饰给定的生物学应答,并且药物部分不被解释为限于经典化学治疗剂。例如,药物部分可以是加工期望的生物学活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可包括例如酶促活性毒素或其活性片段,例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A(ricin A)、假单胞菌外毒素或白喉毒素;蛋白质例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ;或,生物学应答修饰剂例如,淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
用于将此类治疗部分缀合至抗体的技术是已知的,参见,例如,Arnon等人,″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″,于Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中,Reisfeld等人(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985);Hellstrom等人,″Antibodies For Drug Delivery″,于Controlled Drug Delivery(第2版)中,Robinson等人(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe,″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review″,于Monoclonal Antibodies′84:Biological And Clinical Applications中,Pinchera等人(eds.),pp.475-506(1985);″Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″,于Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy中,Baldwin等人(eds.),pp.303-16(Academic Press 1985),和Thorpe等人,″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″.Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
双特异性分子
在另一个方面,本公开内容特征在于包含本公开内容的抗α5β1抗体或其片段的双特异性分子。本公开内容的抗体或其抗原结合部分可被衍生或连接至另一个功能性分子,例如另一个肽或蛋白质(例如,另一个抗体或受体的配体)以产生结合至少两个不同结合部位或靶分子的双特异性分子。事实上,本公开内容的抗体可被衍生或连接至多于一个的其他的功能性分子以产生结合2个以上的不同结合部位和/或靶分子的多特异性分子;此类多特异性分子也意欲包括在本文中所使用的术语“双特异性分子”中。为了产生本公开内容的双特异性分子,可将本公开内容的抗体功能性连接(例如,通过化学偶联、基因融合、非共价结合等)至一个或多个其他的结合分子例如另一个抗体、抗体片段、肽或结合模拟物,以便产生双特异性分子。
因此,本公开内容包括双特异性分子,其包含至少一个对于α5β1的第一结合特异性和对于第二靶表位的第二结合特异性。在本公开内容的特定方面,第二靶表位是Fc受体,例如,人FcγRI(CD64)或人Fcγ受体(CD89)。因此,本公开内容包括能够结合FcγR或表达FcγR的效应细胞(例如,单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))和表达α5β1的靶细胞的双特异性分子。此类双特异性分子将表达α5β1的细胞靶向效应细胞并且触发Fc受体介导的效应细胞活性,例如表达α5β1的细胞的吞噬、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧阴离子(superoxide anion)的产生。
在其中双特异性分子是多特异性的本公开内容的方面,除了抗Fc结合特异性和抗α5β1结合特异性外,分子还可包括第三结合特异性。在一种情况下,第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分,例如,结合参与细胞毒性活性的表面蛋白,从而增加抗靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是结合给定的分子例如抗原或受体,从而导致Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的效应增强的抗体或功能性抗体片段或配体。“抗增强因子部分”可结合Fc受体或靶细胞抗原。备选地,抗增强因子部分可结合与第一和第二结合特异性所结合的实体不同的实体。例如,抗增强因子部分可结合细胞毒性T细胞(例如通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或导致增加的抗靶细胞的免疫应答的其他免疫细胞)。
在一种情况下,本公开内容的双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段,包括例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv作为结合特异性。抗体还可以是轻链或重链二聚体或其任何最小片段例如Fv或单链构建体,如Ladner等人的美国专利4,946,778中描述的。
在一种情况下,对于Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供,其结合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻断。如本文中所使用的,术语“IgG受体”是指位于1号染色体上的8个γ链基因的任一个。此类基因编码总共12个跨膜或可溶性受体同种型,所述受体同种型可分类为3个Fcγ受体类型:FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一种情况下,Fcγ受体是人高亲和力FcγRI。人FcγRI是72kDa分子,其显示对于单体IgG的高和力(108-109 M-1)。
某些抗Fcγ单克隆抗体的产生和特征在Fanger等人的PCT公开案WO 88/00052和美国专利4,954,617中进行了描述。此类抗体在与受体的Fcγ结合部位不同的部位上结合FcγRI、FcγRI I或FcγRIII的表位,因此,它们的结合基本上不被生理水平的IgG阻断。用于本公开内容的特异性抗FcγRI抗体是mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62和mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心,ATCC登录号HB9469获得。在其他情况下,抗Fcγ受体抗体是单克隆抗体22的人源化形式(H22)。H22抗体的产生和特征描述于Graziano,R.F.等人(1995)J.Immunol 155(10):4996-5002和PCT公开案WO94/10332中。产生H22抗体的细胞系以名称HA022CL1保藏在美国典型培养物保藏中心,并且具有登录号CRL 11177。
在其他情况下,对于Fc受体的结合特异性由结合人IgA受体例如Fc-α受体(FcαRI(CD89))的抗体提供,其结合通常不被人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语“IgA受体”意在包括位于19号染色体上的一个α-基因(FcαRI)的基因产物。已知该基因编码数个55至110 kDa的选择性剪接的跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性和嗜中性粒细胞上(但不在非效应细胞群体上)组成型表达。FcαRI具有对于IgA1和IgA2的中等亲和力(约等于5x107 M-1),当暴露于细胞因子例如G-CSF或GM-CSF时,该亲和力增加(Morton,H.C.等人(1996)Critical Reviews in Immunology 16:423-440)。鉴定为A3、A59、A62和A77的4个FcαRI-特异性单克隆抗体(其在IgA配体结合结构域的外部结合FcαRI)已进行了描述(Monteiro,R.C.等人(1992)J.Immunol.148:1764)。
FcαRI和FcγRI是用于本公开内容的双特异性分子的举例说明性触发受体,因为它们(1)主要在免疫效应细胞例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞上表达;(2)以高水平(例如,5,000-100,000个/细胞)表达;(3)是细胞毒性活性(例如,ADCC、吞噬作用)的介体;(4)介导增强的靶向它们的抗原(包括自体抗原)的抗原呈递。
虽然人单克隆抗体是优选的,但可用于本公开内容的双特异性分子的其他抗体可以是鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。
可使用任何合适的方法,通过缀合组成结合特异性例如抗FcR和抗α5β1结合特异性来制备本公开内容的双特异性分子。例如,可分开产生双特异性分子的各结合特异性,然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时,可将多种偶联或交联剂用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-SMCC)(参见例如,Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160:1686;Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci USA 82:8648)。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78,118-132;Brennan等人(1985)Science 229:81-83),和Glennie等人(1987)J.Immunol.139:2367-2375)中描述的方法。合适的缀合剂包括SATA和sulfo-SMCC,两者都可从Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)获得。
当结合特异性是抗体时,可通过两条重链的C端铰链区的巯基键合来缀合它们。在一种情况下,在缀合前,修饰铰链区以包含奇数个巯基残基例如1个残基。
备选地,可在相同的载体中编码两个结合特异性,和可在相同的宿主细胞中表达和装配两个结合特异性。当双特异性分子是mAb xmAb、mAb x Fab、Fab x F(ab′)2或配体x Fab融合蛋白时,该方法特别有用。本公开内容的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子或包含2个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少2个单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利5,260,203;美国专利5,455,030;美国专利4,881,175;美国专利5,132,405;美国专利5,091,513;美国专利5,476,786;美国专利5,013,653;美国专利5,258,498和美国专利5,482,858中。
双特异性分子对它们的特异性靶的结合可通过例如,酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如,生长抑制)或Western印迹分析来确认。此类测定中的每一个通常通过使用特异于目的复合物的标记试剂(例如,抗体)来检测特定目的蛋白质-抗体复合物的存在。例如,可使用例如,识别和特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段检测FcR-抗体复合物。备选地,可使用多种其他的免疫测定法中的任一个检测复合物。例如,可放射性标记抗体,然后将其用于放射免疫测定(RIA)(参见,例如,Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,March,1986)。可利用这样的方法如使用γ计数器或闪烁计数器或利用放射自显影术检测放射性同位素。
药物组合物
在另一个方面,本公开内容提供了组合物例如药物组合物,其包含与可药用载体一起配制的一种或组合的本公开内容的单克隆抗体或其抗原结合部分。此类组合物可包含的一种或组合的(例如,两种或更多种不同的)本公开内容的抗体或免疫缀合物或双特异性分子。例如,本公开内容的药物组合物可包含结合靶抗原上的不同表位或具有补体活性的抗体(或免疫缀合物或双特异性分子)的组合。
还可以以联合治疗即与其他试剂组合来施用本公开内容的药物组合物。例如,联合治疗可包括与至少一种其他抗炎剂或免疫抑制剂组合的本公开内容的抗α5β1抗体。可用于联合治疗的治疗剂的实例在下文中关于本公开内容的抗体的用途的部分中进行更详细地描述。
如本文中所使用的,“可药用载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。通常,载体适合用于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、经脊柱或表皮施用(例如,通过注射或输注)。取决于施用的途径,可用材料包被活性化合物即抗体、其抗原结合部分、免疫缀合物或双特异性分子以保护化合物免受可使所述化合物失活的酸性和其他天然条件的作用。
在某些实施方案中,本公开内容的抗体可以以中性形式(包括两性离子形式)或作为带正电荷或负电荷的类别存在。在一些情况下,可将抗体与抗衡离子复合以形成可药用的盐。因此,本公开内容的药物化合物包括一种或多种可药用的盐。
“可药用的盐”是指保持亲本化合物(例如抗体)的期望的生物学活性并且不提供不希望的毒理学效应的盐(参见例如,Berge,S.M.,等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。例如,术语“可药用的盐”包括包含一种或多种抗体和一种或多种抗衡离子的复合物,其中抗衡离子来源于可药用的无机和有机酸及碱。
此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来源于无毒无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等的盐,以及来自无毒有机酸例如脂肪族单和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等的盐。碱加成盐包括来源于碱土金属例如钠、钾、镁、钙等的盐以及来自无毒有机胺例如N,N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的盐。
此外,可药用的无机碱包括金属离子。金属离子包括但不限于合适的碱金属盐、碱土金属盐和其他生理可接受的金属离子。来源于无机碱的盐包括铝、铵、钙、钴、镍、钼、钒、锰、铬、硒、锡、铜、铁、亚铁(ferrous)、锂、镁、正锰盐(manganic salts)、亚锰(manganous)、钾、铷、钠和和锌,并且以它们通常的化合价存在。
可从下列酸制备本公开内容的抗体的可药用的酸加成盐,所述酸包括但不限于,甲酸、乙酸、乙酰氨基苯甲酸、脂肪酸、抗坏血酸、硼酸、丙酸、苯甲酸、樟脑酸、碳酸、环拉酸、去氢胆酸、丙二酸、依地酸、乙基硫酸、芬地柞酸、偏磷酸、琥珀酸、羟基乙酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、鞣酸、柠檬酸、硝酸、抗坏血酸、葡萄糖醛酸、马来酸、叶酸、富马酸、丙酸、丙酮酸、天门冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、赖氨酸、异柠檬酸、三氟乙酸、扑酸(pamoic)、丙酸、邻氨基苯甲酸、甲磺酸(mesylic)、乳清酸、草酸、草酰乙酸、油酸、硬脂酸、水杨酸、氨基水杨酸、硅酸盐、对羟基苯甲酸、烟酸、苯乙酸、扁桃酸(mandelic)、双羟萘酸(embonic)、磺酸、甲磺酸、磷酸、膦酸、乙磺酸、乙二磺酸(ethanedisulfonic)、铵(ammonium)、苯磺酸、泛酸、萘磺酸、甲苯磺酸、2-羟基乙磺酸、对氨基苯磺酸(sulfanilic)、硫酸、硝酸、亚硝酸、硫酸单甲酯、环己基氨基磺酸、β-羟基丁酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、谷氨酸、二甲基胂酸、二氨基己酸、樟脑磺酸、葡糖酸、硫氰酸、酮戊二酸、5-磷酸吡哆醛、氯苯氧基乙酸、十一酸、N-乙酰基-L-天冬氨酸、半乳糖二酸和半乳糖醛酸。
可药用的有机碱包括三甲胺、二乙胺、N,N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二苄胺、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、普鲁卡因、环胺、季铵阳离子、精氨酸、甜菜碱、咖啡因、克立咪唑(clemizole)、2-乙氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙二胺、丁胺、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、乙基葡糖胺、葡糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、hydrabamine、咪唑、异丙胺、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、吡啶、吡哆辛、钕、哌啶、聚胺树脂(polyamine resin)、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三丙胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、甲胺、牛磺酸、胆酸盐/酯(cholate)、6-氨基-2-甲基-2-庚醇、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、脂肪族单和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸、锶、三(羟甲基)甲基甘氨酸、肼、苯基环己胺、2-(N-吗啉代)乙磺酸、二(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸、1,4-哌嗪二乙磺酸、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸、1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、4-吗啉丙磺酸、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸、2-[(2-羟基-1,1-二(羟甲基)乙基)氨基]乙磺酸、N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、4-(N-吗啉代)丁磺酸、3-(N,N-二[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸、2-羟基-3-[三(羟甲基)甲氨基]-1-丙磺酸、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)、哌嗪-1,4-二(2-羟基丙磺酸)二水合物、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸)、N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸、N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸、2-(环己基氨基)乙磺酸、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸、N-(2-乙酰胺基)亚氨二乙酸,4-(环己基氨基)-1-丁磺酸、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇和氨基丁三醇。
本公开内容的药物组合物还可包括可药用的抗氧化剂。可药用的抗氧化剂的实例包括:(1)水溶性抗氧化剂例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等;(2)油溶性抗氧化剂例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等;和(3)金属螯合剂例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇,酒石酸,磷酸等。
可用于本公开内容的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其合适的混合物、植物油例如橄榄油和可注射的有机酯例如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂,在分散相的情况下通过维持所需颗粒大小,以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
此类组合物还可包含佐剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌方法(同上)和通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂例如,对羟苯甲酸、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的存在。还期望组合物包含等渗剂例如糖、氯化钠等。此外,可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生可注射药物形式的延迟吸收。
可药用的载体包括无菌水性溶液或分散体以及用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉剂。用于药物活性物质的此类介质和试剂的用途在本领域内是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容,否则预期其在本公开内容的药物组合物中的用途。还可将增补的活性化合物整合入组合物。
治疗性组合物在制造和贮存的条件下通常必须是无菌和稳定的。可将组合物配制成溶液、微乳剂、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质,其包含例如水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物。可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂,在分散体的情况下通过维持所需颗粒大小,以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下,优选在组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生可注射组合物的延迟吸收。
可通过将活性化合物以所需的量与一种或组合的上文例举的成分(根据需要)在合适的溶剂中混合,然后进行无菌微过滤来制备无菌可注射溶液。通常,通过将活性化合物整合入无菌媒介物来制备分散体,所述无菌媒介物包含基本分散介质和来自上文例举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下,制备方法包括但不限于真空干燥和冷冻干燥(冻干),其产生活性成分和来自其之前无菌过滤的溶液的任何另外的期望的成分的粉剂。
可与载体材料组合以产生单个剂型的活性成分的量将取决于待治疗的受试者和具体的施用模式。可与载体材料组合以产生单个剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的组合物的量。一般地,除了百分之百外,该量可在大约0.01%至大约99%的活性成分,优选大约0.1%至大约70%,最优选大约1%至大约30%的活性成分(与可药用的载体组合)的范围内变化。
调整给药方案以提供最佳的期望的响应(例如,治疗响应)。例如,可施用单次团注,可在一段时间内施用几个分份剂量,或根据治疗状况的紧迫性按比例减少或增加剂量。特别有利地以剂量单位形式配制胃肠外组合物以方便剂量的施用和一致性。剂量单位形式,如本文中所使用的,是指适合作为待治疗的受试者的单一剂量的物理上分开的单位;每一个单位包含经计算产生期望的治疗效果的预先确定量的活性成分和需要的药物载体。本公开内容的剂量单位形式的规格由下列确定并直接取决于下列:(a)活性化合物的独特特征和要获得的特定治疗效果,和(b)配制这样的用于治疗个体中敏感性的活性化合物的工艺中固有的限制。
关于抗体的施用,剂量在大约0.0001至100mg/kg,更常见地0.01至5mg/kg的宿主体重的范围内变化。例如剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1至10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周1次,每2周1次,每3周1次,每4周1次,每月1次,每3个月1次或每3至6个月1次施用。本公开内容的抗α5β1抗体或其抗原结合部分的给药方案包括例如,1mg/kg体重或3mg/kg体重(通过静脉内施用),对于给定的抗体,使用下列给药方案之一:(i)每4周1次,进行6个剂量,然后每3个月1次;(ii)每3周1次;(iii)3mg/kg体重1次,然后每3周1次1mg/kg体重。
在一些方法中,同时施用具有不同结合特异性的2个或更多个单克隆抗体,在该情况下施用的各抗体的剂量落在指定的范围内。通常在多个场合施用抗体。单个剂量之间的间隔可以是例如,每周1次、每月1次、每3个月1次或每年1次。如通过测量患者中抗靶抗原的抗体的血液水平所显示的,间隔也可以是无规律的。在一些方法中,调整剂量以获得大约1至1000μg/ml的血浆抗体浓度和在一些方法中大约25至300μg/ml的血浆抗体浓度。
备选地,可将抗体作为持续释放制剂施用,在该情况下需要较低的施用频率。剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期。一般地,人抗体显示最长的半衰期,然后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可视治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中,在长时期内以相对低频率的间隔施用相对低的剂量。一些患者在他们的余生中持续接受治疗。在治疗性应用中,有时在相对短的间隔需要相对高的剂量直至疾病的进展减慢或终止,优选直至患者显示疾病的症状部分或完全改善。之后,可给患者施用预防性方案。
为了获得有效地实现对于特定患者、组合物和施用模式的期望的治疗响应而对患者无毒性的活性成分的量,本公开内容的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可变化。选择的剂量水平将取决于许多药物动力学因素,包括使用的本公开内容的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与使用的特定组合物结合使用的其他药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和以前的医疗史等医学领域中熟知的因素。
本公开内容的抗α5β1抗体的“治疗有效剂量”优选导致疾病症状的严重度的减轻、无疾病症状期的频率和持续时间的增加或由于疾病折磨而导致的削弱或失能的预防。例如,关于α5β1阳性肿瘤的治疗,相对于未治疗的受试者,“治疗有效剂量”优选抑制细胞生长或肿瘤生长达至少大约20%,更优选至少大约40%,更优选至少大约60%和更优选至少大约80%。可在预测人肿瘤中的功效的动物模型系统中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。备选地,组合物的该性质可通过利用本领域技术人员已知的测定法体外检查化合物抑制的能力来进行评估。治疗性化合物的治疗有效量可减小受试者中的肿瘤大小或改善症状。本领域技术人员将能够基于这样的因素如受试者的大小、受试者的症状的严重度以及选择的特定组合物或施用途径来确定这样的量。
可使用本领域内已知的许多方法中的一个或多个,经由一个或多个施用途径施用本公开内容的组合物。如本领域技术人员所理解的,施用途径和/或模式将取决于期望的结果。用于本公开内容的抗体或其抗原结合部分的施用途径包括静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、皮下、经脊柱或其他胃肠外施用途径(例如通过注射或输注)。短语“胃肠外施用”,如本文中所使用的,是指除了经肠和局部施用外的施用模式(通常通过注射),并且包括但不限于,静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜上和胸骨内注射和输注。
备选地,可通过非胃肠外途径例如局部、表皮或粘膜施用途径,例如鼻内、口服、经阴道、经直肠、舌下或局部地施用本公开内容的抗体或其抗原结合部分。
可用保护化合物免受快速释放的载体来制备活性化合物,例如控制释放制剂,包括埋植剂、透皮贴片和微型胶囊递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已取得专利或通常对于本领域技术人员来说是已知的。参见,例如,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可用本领域内已知的医疗装置施用治疗性组合物。例如,可用无针皮下注射装置例如美国专利5,399,163;5,383,851;5,312,335;5,064,413;4,941,880;4,790,824或4,596,556中公开的装置施用本公开内容的治疗性组合物。可用于本公开内容的熟知的埋植剂和组件(module)的实例包括:美国专利4,487,603,其公开了用于以受控的速率分配药物的可植入微量输注泵;美国专利4,486,194,其公开了用于通过皮肤施用药剂的治疗性装置;美国专利4,447,233,其公开了用于以精确的输注速率递送药剂的药剂输注泵;美国专利4,447,224,其公开了用于连续药物递送的流速可变的可植入输注装置;美国专利4,439,196,其公开了具有多个区室的渗透药物递送系统;和美国专利4,475,196,其公开了渗透药物递送系统。许多其他此类埋植剂、递送系统和组件对于本领域技术人员来说是已知的。
在某些情况下,可配制本公开内容的人单克隆抗体或其抗原结合部分以确保合适的体内分配。例如,血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水的化合物。为了确保本公开内容的治疗性化合物穿过BBB(需要时),可将它们配制在例如脂质体中。关于制备脂质体的方法,参见,例如,美国专利4,522,811;5,374,548和5,399,331。脂质体可包含一个或多个部分,其被选择性转运入特定细胞或器官从而增强靶向药物递送(参见,例如,V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见,例如,属于Low等人的美国专利5,416,016);甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBSLett.357:140;M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180);表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol 1233:134);p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090);也参见K.Keinanen;M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123;J.J.Killion;I.J.Fidler(1994;Immunomethods 4:273。
本公开内容的用途和方法
本公开内容的抗体,特别地人抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内诊断性和治疗性用途,包括α5β1介导的病症的诊断和治疗。例如,可体外或离体地给培养中的细胞或例如体内给人受试者施用此类分子以治疗、预防和诊断众多的病症。如本文中所使用的,术语“受试者”意在包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物,例如哺乳动物和非哺乳动物,例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物。优选的受试者包括患有由α5β1活性介导的病症的人患者。所述方法特别适合用于治疗患有与异常α5β1表达相关的病症的人患者。当将抗α5β1的抗体与另一种试剂一起施用时,可以顺序地或同时地施用两种试剂。
鉴于本公开内容的抗体对α5β1的特异性结合,本公开内容的抗体可用于特异性检测细胞表面上的α5β1表达和此外,可用于通过免疫亲和层析纯化α5β1。
此外,鉴于α5β1在多种肿瘤细胞上表达(参见,例如实施例6,图7),和其参与血管生成,本公开内容的人抗体、抗体组合物和方法可用于治疗具有异常细胞生长,例如特征在于表达α5β1的肿瘤细胞的存在的病症的受试者,所述病症包括,例如,间皮瘤、肝胆管(肝和胆管)肿瘤、原发性或继发性CNS肿瘤、原发性或继发性脑肿瘤、肺癌(NSCLC和SCLC)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤黑素瘤或眼内黑素瘤、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、胃肠道(胃、结直肠和十二指肠)癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸癌、慢性或急性白血病、慢性髓性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、脊轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌症、胆囊癌、多发性骨髓瘤、胆管癌、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤或一种或多种上述癌症的组合。
在一种情况下,本公开内容的抗体(例如,人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)或其抗原结合部分可用于检测α5β1的水平或在它们的膜表面上含有α5β1的细胞的水平,然后可将该水平与某些疾病症状相关联。备选地,抗体可用于抑制或阻断α5β1功能,反过来可将这与某些疾病症状的预防或改善相关联,从而暗示α5β1可作为疾病的介体(mediator)。这可通过在允许抗体与α5β1之间形成复合物的条件下将样品和对照样品与抗α5β1抗体接触来获得。检测和比较样品和对照中抗体与α5β1之间形成的任何复合物。
在另一种情况下,就与治疗或诊断用途相关的结合活性在体外初步测试本公开内容的抗体(例如,人抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)或其抗原结合部分。例如,可使用下面实施例中描述的流式细胞测定法测试本公开内容的组合物。
本公开内容的抗体(例如,人抗体、多特异性和双特异性分子、免疫缀合物和组合物)或其抗原结合部分在α5β1相关疾病的治疗和诊断中具有额外的功用。例如,人单克隆抗体、多特异性或双特异性分子和免疫缀合物可用于体内或体外引发一种或多种下列生物学活性:抑制表达α5β1的细胞的生长和/或杀死所述细胞;在人效应细胞存在的情况下介导表达α5β1的细胞的吞噬作用或ADCC,或阻断α5β1配体对α5β1的结合。
在特定的情况下,在体内使用抗体(例如,人抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)或其抗原结合部分治疗、预防或诊断众多种α5β1相关疾病。α5β1相关疾病的实例,特别地,包括异常细胞生长例如癌症。在一个实施方案中,异常细胞生长是癌症,包括,但不限于,间皮瘤、肝胆管(肝和胆管)肿瘤、原发性或继发性CNS肿瘤、原发性或继发性脑肿瘤、肺癌(NSCLC和SCLC)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤黑素瘤或眼内黑素瘤、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、胃肠道(胃、结直肠和十二指肠)肿瘤、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸癌、慢性或急性白血病、慢性髓性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、脊轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌症、胆囊癌、多发性骨髓瘤、胆管癌、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤或一种或多种上述癌症的组合。
体内和体外施用本公开内容的抗体组合物(例如,人单克隆抗体,多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)或其抗原结合部分的合适途径在本领域内是熟知的并且可由本领域技术人员选择。例如,可通过注射(例如,静脉内或皮下)施用抗体组合物。使用的分子的合适剂量将取决于受试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或制剂。
如之前所描述的,可将本公开内容的人抗α5β1抗体或其抗原结合部分与一种或多种其他治疗剂例如细胞毒性剂、放射性毒性剂或免疫抑制剂共施用。可将抗体连接至试剂(作为免疫复合物)或与试剂分开施用。在后一种情况下(分开施用),抗体可在试剂之前、之后施用,或与试剂同时施用,或可与其他已知的疗法例如抗癌疗法例如辐照一起共施用。此类治疗剂包括,特别地,抗肿瘤剂例如多柔比星(阿霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟基脲(此类试剂,就它们本身而言,只有在对患者是毒性或亚毒性的水平上才有效)。可以每4周1次以100mg/剂量静脉内施用顺铂和每21天1次以60至75mg/ml剂量静脉内施用阿霉素。本公开内容的人抗α5β1抗体或其抗原结合片段与化疗剂的共施用提供了通过不同机制(其对人肿瘤细胞产生细胞毒性效应)起作用的两种抗癌剂。这样的共施用可解决由于对药物的抗性的发展或肿瘤细胞的抗原性的变化(这可使它们不与抗体反应)而导致的问题。
本公开内容的靶特异性效应细胞,例如,连接至组合物(例如,人抗体、多特异性和双特异性分子)的效应细胞还可用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人白细胞例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞和其他具有IgG-或IgA-受体的细胞。需要时,可从待治疗的受试者获得效应细胞。可以以细胞悬浮液(在生理上可接受的溶液中)的形式施用靶特异性效应细胞。施用的细胞的数目可以是108至109的量级但取决于治疗目的。一般地,该量将足以在靶细胞例如表达α5β1的肿瘤细胞上获得定位并且通过例如吞噬作用实现细胞杀伤。施用途径也可变化。
可结合用于除去被靶向的细胞的其他技术进行使用靶特异性效应细胞的治疗。例如,将使用本公开内容的组合物(例如,人抗体、多特异性和双特异性分子)的抗肿瘤疗法和/或配备有此类组合物的效应细胞与化学疗法结合使用。此外,可将联合免疫疗法用于将两种不同的细胞毒性效应子群体导向肿瘤细胞排斥。例如,可将连接至抗Fc-γRI或抗CD3的抗α5β1抗体与IgG-或IgA-受体特异性结合剂结合使用。
本公开内容的双特异性和多特异性分子还可用于调节FcγR或效应细胞上的FcγR水平,例如通过对细胞表面上的受体进行加帽(capping)或清除所述受体。抗Fc受体的混合物也可用于该目的。
还可在补体存在的情况下使用具有补体结合部位(例如来自结合补体的IgG1、-2或-3或IgM的部分)的本公开内容的组合物(例如,人、人源化或嵌合抗体、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)。在一种情况下,可通过加入补体或含有补体的血清来补充包含具有本公开内容的结合剂的靶细胞和合适的效应细胞的细胞群体的离体治疗。可通过结合补体蛋白提高用本公开内容的结合剂包被的靶细胞的吞噬作用。在另一种情况下,还可利用补体裂解用本公开内容的组合物(例如,人抗体、多特异性和双特异性分子)包被的靶细胞。在另一种情况下,本公开内容的组合物不激活补体。
还可将本公开内容的组合物(例如,人、人源化或嵌合抗体、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)与补体一起施用。因此,在本公开内容的范围内的是包含人抗体、多特异性或双特异性分子以及血清或补体的组合物。此类组合物是有利的,因为补体位于人抗体、多特异性或双特异性分子的邻近。备选地,可分开施用本公开内容的人抗体、多特异性或双特异性分子以及补体或血清。
也在本公开内容的范围内的是包括本公开内容的抗体组合物(例如,人抗体、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物)和使用说明书的试剂盒。试剂盒还可包含一种或多种额外的试剂例如免疫抑制剂、细胞毒性剂或放射性毒性剂或本公开内容的一种或多种另外的人抗体或其抗原结合部分(例如,具有补体活性的人抗体,其结合与第一人抗体不同的α5β1抗原中的表位)。
因此,可对使用本公开内容的抗体组合物进行治疗的患者额外地施用(在施用本公开内容的人抗体之前、同时或之后)增强或提高人抗体的治疗效果的另一种治疗剂,例如细胞毒性剂或放射性毒性剂。
在其他情况下,可以通过例如,用细胞因子治疗受试者来用调节例如增强或抑制Fcγ或Fcγ受体的表达或活性的试剂额外地治疗受试者。在使用多特异性分子的治疗过程中,可施用的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。
还可使用本公开内容的组合物(例如,人抗体、多特异性和双特异性分子)靶向表达FcγR或α5β1的细胞,例如以标记此类细胞。为了该用途,可将结合剂连接至能够被检测的分子。因此,本公开内容提供了离体或体外定位表达Fc受体例如FcγR或α5β1的细胞的方法。可检测的标记可以是例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
在特定的情况下,本公开内容提供了用于检测α5β1抗原在样品中的存在或测量α5β1抗原的量的方法,其包括在允许抗体或其部分与α5β1之间形成复合物的条件下将样品和对照样品与特异性结合α5β1的人单克隆抗体或其抗原结合部分接触。然后检测复合物的形成,其中与对照样品样相比,样品之间的不同的复合物形成表示α5β1抗原存在于样品中。
在其他情况下,本公开内容提供了通过给受试者施用上述人抗体或其抗原结合部分来治疗受试者中α5β1介导的病症,例如异常细胞生长例如癌症的方法。此类抗体和其衍生物用于抑制α5β1诱导的与某些病症相关的活性,例如,血管生成、增殖和分化。通过将抗体与α5β1接触(例如,通过给受试者施用抗体),α5β1诱导此类活性的能力被抑制,从而相关的病症得到治疗。可将抗体组合物单独地或与另一种治疗剂例如细胞毒性剂或放射性毒性剂一起施用,所述治疗剂与抗体组合物一起或协同地起作用以治疗或预防α5β1介导的疾病。
在另一种情况下,本公开内容的免疫缀合物可用于通过将化合物连接至抗体来将这样的化合物(例如,治疗剂、标记、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向具有α5β1细胞表面受体的细胞。因此,本公开内容还提供了离体或体内定位表达α5β1的细胞的方法(例如,使用可检测的标记例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。备选地,免疫缀合物可用于通过将细胞毒素或放射性毒素靶向α5β1来杀死具有α5β1细胞表面受体的细胞。
本公开内容进一步通过下列不应当解释为进一步限定的实施例来举例说明。在整个本公开内容中引用的所有图和所有参考资料、专利和公开的专利申请的内容明确地以其全文通过引用合并入本文。
实施例
实施例1:产生抗α5β1抗体的杂交瘤的产生
如下制备、选择和测定根据本公开内容的举例说明性抗体:
免疫和杂交瘤的产生:
将下列免疫原用于杂交瘤的产生:纯化的重组人整联蛋白-α5蛋白-Fc;整联蛋白-α5-His(R&D Systems,custom order);经转染表达人α5的NIH3T3细胞;天然地表达人整联蛋白α5β1的Jurkat细胞系、U-937细胞系(ATCC Cat No CRL-1593)和K-562细胞系(ATCC Cat No CCL-243)。
纯化的重组人整联蛋白-α5蛋白-Fc是融合至大鼠Fc结构域的人整联蛋白α5的细胞外结构域(氨基酸42-995)的嵌合构建体,其被克隆入pSecTag2载体并且使用293-FreeStyle系统(Invitrogen)进行表达。如下产生经转染表达人α5的NIH3T3细胞。从全长人整联蛋白α5MGC克隆(Invitrogen)克隆全长人整联蛋白α5 cDNA(Invitrogen,Cat.No.FL 1002,克隆ID:3629647)并且将其亚克隆入逆转录病毒表达载体(pBabe)。产生病毒颗粒并且将其用于感染NIH3T3细胞(ATCCCat No CRL-1658)。加入嘌呤霉素以选择阳性稳定细胞克隆。进行人α5蛋白表达的Western印迹和FACS分析以挑选高表达稳定细胞克隆。
使用人Ig转基因小鼠品系Hco7/Hco12以及人转染色体/转基因品系,KM(Medarex,Inc.)制备抗人整联蛋白α5β1的全长人单克隆抗体。此类品系都表达不能与从人分离的抗体相区别的完全人抗体。在此类小鼠品系中,已如Chen等人(1993)EMBO J.12:811-820中所述对内源小鼠κ轻链基因进行了纯合破坏,并且已如PCT公开案WO01/09187的实施例1中所述对内源小鼠重链基因进行了纯合破坏。此类小鼠品系的每一个都携带人κ轻链转基因KCo5,如Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851中所描述的。HCo7品系具有HCo7人重链转基因,如美国专利5,545,806、5,625,825和5,545,807中所描述的。HCo12品系具有HCo12人重链转基因,如PCT公开案WO 01/09187的实施例2中所描述的。HCo7/Hco12品系具有HCo7和HCo12重链转基因。KM品系具有人微型染色体,如Ishida等人,(2002),Cloning and Stem Cells,4:91-102中所描述的。
为了产生抗α5β1的完全人单克隆抗体,用重组人整联蛋白-α5蛋白-Fc或整联蛋白-α5-His、经转染表达人α5的NIH3T3细胞和天然表达人α5β1的Jurkat细胞系、U-937细胞系和K-562细胞系免疫Hco7/Hco12和KM品系的HuMab小鼠。用于HuMab小鼠的一般免疫方案描述于Lonberg,N,等人(1994)Nature 368(6474):856-859;Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851和PCT公开案WO 98/24884中。在第一次抗原输注时小鼠为6-16周龄。将人整联蛋白-α5蛋白-Fc或整联蛋白-α5-his抗原的纯化的重组制备物(15-20μg)、经转染的NIH3T3细胞或Jurkat细胞、U-937细胞和K-562细胞(1x107个细胞)的制备物用于腹膜内(IP)和皮下(Sc)免疫HuMab小鼠。
以1至4周的间隔(直至总共16次免疫)用Ribi佐剂中的抗原腹膜内和皮下免疫转基因小鼠。在通过眶后放血采集的血液中监控免疫应答。利用FACS筛查血清(如下所述),将具有足够滴度的抗α5β1人免疫球蛋白的小鼠用于融合。在杀死并且取出脾脏和/或淋巴结之前3和2天用抗原静脉内加强免疫小鼠。通常,对于每一个抗原进行10至20个融合。免疫总共60只Hco7/Hco12和KM小鼠。对于每一种抗原免疫数打小鼠。
产生抗α5β1抗体的HuMab小鼠的选择:
为了选择产生结合α5β1的抗体的HuMab小鼠,利用流式细胞术(FACS)就与表达全长人α5β1的细胞系结合但不与不表达α5β1的对照细胞系结合筛选经免疫的小鼠的血清。简而言之,将表达α5的NIH3T3细胞与以1∶20稀释的经免疫的小鼠的血清一起温育。清洗细胞,使用FITC-标记的抗人IgG Ab检测特异性抗体结合。在FACS流式细胞仪(Becton Dickinson.San Jose,CA)上进行流式细胞术分析。将产生最高滴度的抗α5β1抗体的小鼠用于融合。如下所述进行融合,通过FACS就抗α5β1活性测试杂交瘤上清液。
产生抗α5β1的人单克隆抗体的杂交瘤的产生:
利用厂商推荐的方案,使用电融合(E-融合,Cyto PulseTMtechnology,Cyto PulseTM Sciences,Inc.,Glen Burnie.MD)将从HuMab小鼠分离的小鼠脾细胞和/或淋巴结淋巴细胞融合至小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0(ATCC,CRL-1581,Manassas,VA)。简而言之,使用E-融合将来自经免疫的小鼠的脾和/或淋巴结淋巴细胞的单细胞悬浮物与等数量的Sp2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞融合。将细胞以大约2x104个脾细胞/孔涂板在平底微量滴定板中,然后在选择培养基(其包含10%胎牛血清、10% P388D1(ATCC,CRL-TIB-63)条件化培养基、在具有高葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM(Mediatech,Herndon,VA,Cat.No,CRL 10013)中的3至5%(IGEN)、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50mg/ml庆大霉素和1xHAT(Sigma,Cat.No.CRL-P-7185))中温育10至14天。在1至2周后,将细胞培养在其中用HT替代HAT的培养基中。在细胞涂板后大约10至14天,首先就它们是否含有人γ、κ抗体筛选来自单个孔的上清液。然后利用FACS(如上所述的)就人抗α5β1筛选对于人γ、κ评分为阳性的上清液。
单克隆IgG抗体:
将抗体分泌型杂交瘤转移至24孔板,再次进行筛选,并且如果对于人抗α5β1 IgG单克隆抗体确认为阳性,则通过有限稀释将其亚克隆至少2次。然后体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量抗体用于进一步表征。上述方法用于产生数种抗α5β1单克隆抗体,包括本文中描述的称为“22B5”、“24C7”、“1D9”和“2D2”的抗体。
实施例2:人单克隆抗体22B5的结构特征
使用标准PCR技术从22B5杂交瘤获得编码22B5单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列,然后使用标准DNA测序技术进行测序。
22B5的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图1A和1B中以及SEQ ID NO:11和7中。22B5的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图1C和1D中以及SEQ ID NO:12和8中。
原始22B5分子的亚类为IgG4。将IgG亚类转换成IgG1以提供FcγR结合和效应子功能例如ADCC。通过定点诱变将3个突变导入IgG1恒定区(S247D、A338L和I340E)以进一步增加对FcγR的结合和效应子功能活性。具有IgG1亚类且包含这3个突变的22B5称为“22B5/DLE”或“22B5 IgG1 DLE”。将重链可变结构域的2个突变回复至种系以使免疫原性最小(I30S和N33S)。在轻链可变序列中未发现突变。22B5/DLE的重链示为SEQ ID NO:9,而22B5/DLE的轻链示为SEQ IDNO:10。
22B5重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列的比较显示,22B5重链利用来自人种系VH 4-39的VH区段、来自人种系3-10的D区段和来自人种系JH 6b的JH区段。22B5 VH序列与种系VH 4-39序列的比对示于图2中。使用确定CDR区的Kabat系统对22B5VH序列的进一步分析导致重链CDR1、CDR2和CD3区(如图1B中所示以及分别示于SEQ ID NO:1、2和3中)的确定。
22B5轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列的比较显示,22B5轻链利用来自人种系VK L6的VL区段和来自人种系JK4的JK区段。22B5 VL序列与种系VK L6序列的比对示于图2中。使用确定CDR区的Kabat系统对22B5 VL序列的进一步分析导致轻链CDR1、CDR2和CDR3区(如图1D中所示以及分别示于SEQ ID NO:4、5和6中)的确定。
实施例3:人单克隆抗体22B5的结合特异性和结合动力学的表征
在本实施例中,通过Biacore分析检查具有IgG1 DLE突变的22B5人抗α5β1抗体(22B5/DLE)的结合亲和力和结合动力学。此外,利用流式细胞术(FACS)检查结合特异性。
结合亲和力和动力学
使用Biacore分析(Biacore AB,Uppsala,Sweden)测定22B5/DLE对α5β1的细胞外结构域的结合动力学和额定亲合力(nominal avidity)。为了进行BIAcore动力学分析,将22B5/DLE抗体固定在生物传感器芯片上,然后在25.0℃下将不同浓度的人重组α5β1细胞外结构域流过表面(参见图3)。将结合数据全局拟合至简单的一对一结合模型(具有漂移基线(drifting baseline))。22B5/DLE可逆地结合α5β1。对人重组α5β1细胞外结构域的结合常数(KD)在2.7至4.1nM之间。当在二价阳离子不存在的情况下测量时KD更大,这与整联蛋白的阳离子依赖性激活一致。动力学结合参数在3.4x10-5至4.5x10-5 M-1s-1之间(对于结合速率)和1.2x10-3至1.4x10-3s-1之间(对于解离速率)(参见图3和表1)。
为了获得额定亲合力测量值,将人重组α5β1细胞外结构域固定在生物传感器芯片上,在25.0℃下使不同浓度的22B5/DLE流过表面。额定亲合力值估计为0.05pM(于20mM HEPES pH7.4,150mM NaCl,0.005%P20和4.0mM MgCl2中)。
表1:根据BIAcore研究获得的结合和动力学数据的概述
CaCl2是指具有4.0mM CaCl2的10mM HEPES pH7.4,150mM NaCl,0.005%P20的缓冲条件;MgCl2是指具有4.0mM MgCl2的10mM HEPESpH 7.4,150mM NaCl,0.005% P20的缓冲条件。
通过FACS测定的对于α5β1的细胞亲和力
使用FACS测定,利用表达内源人整联蛋白α5β1的细胞(HUVEC),就22B5/DLE抗体对细胞表面整联蛋白α5的结合亲合力测试22B5/DLE抗体。简而言之,使用胰蛋白酶-EDTA使细胞分离,并用冷PBS清洗细胞。在等分入96孔板后,用血清封闭细胞,然后将其与不同浓度的特异性mAb在4℃下温育1小时。随后,清洗细胞,将其与缀合有R-PE荧光团的抗人κ二抗一起温育,然后使用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。对于每一个样品收集10,000个事件而不使用任何门控(gating)。为了进行KD测定,计算各样品直方图的几何平均值,将其作为mAb浓度的函数作图。在拟合至两态平衡模型(two-state equilibrium model)后计算KD。22B5/DLE在HUVEC中以2.15nM的KD(n=4)结合内源性α5β1(参见图4)。
实施例4:通过Biacore测量的对Fcγ受体的亲和力
在Biacore结合实验中评估包含IgG1 DLE三突变(如之前在实施例2中论述的)的22B5/DLE增强对FcγR的结合的能力。将22B5/DLE的FcγR结合亲和力与野生型(wt)IgG1的结合亲和力相比较。测试的FcγR的三个类型是:1)高亲和力受体FcγRI;2)低亲和力受体的两个多态性变体FcγRIIa/131H和FcγRIIa/131R;和3)中等亲和力受体的两个多态性变体FcγRIIIa/158F和FcγRIIIa/158V。结果(示于图5中,和概述于表2中)显示对于高亲和力受体FcγRI大约6倍的增加。对于与中等亲和力受体FcγRIII/158F和158V的结合,分别观察到122和70倍的增强。也评估22B5/DLE和野生型IgG1对鼠Fcγ受体的结合亲和力比较。结合的最大增强是与mFcγRIV的结合,然后与mFcγRI和mFcγRIII的结合(参见图5)。
表2:对FcγR的Biacore结合(KD,超过wt IgG1的倍数增强)
FcγR | KD(超过wt IgG1的倍数增强) |
人FcγRI | 5.8nM(6X) |
人FcγRIIa/131H | 1000nM(1.6X) |
人FcγRIIa/131R | 650nM(2.3X) |
人FcγRIII/158F | 27nM(122X) |
人FcγRIII/158V | 9.4nM(70X) |
鼠FcγRI | 96nM(14X) |
鼠FcγRIII | 1700nM(5X) |
鼠FcγRIV | 9.1nM(260X) |
实施例5:22B5/DLE的细胞功能活性
细胞附着阻断
测试22B5/DLE中断整联蛋白α5β1介导的细胞附着的能力。通过将HUVEC细胞与抗体(22B5/DLE、22B5 IgG1、IgG2和IgG4亚类变体或阴性对照mAb(BHA2 IgG1))一起预温育,然后将其涂板在纤连蛋白(FN)或胶原包被的板上来进行细胞附着测定。将HUVEC细胞(15,000个)与抗体在附着缓冲液(adhesion buffer)(含有葡萄糖和牛血清白蛋白的Hepes缓冲的盐溶液)中于室温下混合20分钟。向用纤连蛋白或胶原包被的96孔板的孔中加入细胞,让其在37℃/5% CO2下附着至板进行1小时。通过清洗各孔3次除去未附着的细胞。测量保留在各孔中的附着细胞的量。通过加入含有CyQUANT GR染料的缓冲液来裂解附着细胞,使用板读出器(plate reader)在Ex/Em:485/535nm处测量荧光。如可在图6中看到的,功能阻断性整联蛋白α5β1 mAb选择性抑制HUVEC至纤连蛋白但非至胶原(阴性对照)的附着。如图6中所示的,22B5/DLE和其亚类变体(野生型IgG1、IgG1 DLE、IgG2和IgG4)的IC50在该1小时的测定中相似。这些数据证明,抗体与α5和/或α5β1的结合抑制整联蛋白与纤连蛋白的结合。这些数据进一步表明,当α5β1在细胞表面上表达时抗体结合α5β1。即,当α5和β1链结合时,被抗体识别的表位是可获得的,当整联蛋白在细胞表面上表达时,表位可获得用于结合。
实施例6:体外ADCC效应子功能
使用标准方法在抗α5β1-阳性靶细胞的人外周血单核细胞(PBMC)存在的情况下通过ADCC测定评估效应子功能活性。如下通过Western印迹分析测量众多细胞系的整联蛋白α5的表达水平。在含有蛋白酶(Roche)和磷酸酶抑制剂(Calbiochem)的RIPA裂解缓冲液(Upstate)中裂解细胞。将裂解物(各3μg的总蛋白)在SDS-PAGE凝胶上电泳,然后用抗整联蛋白α5抗体进行免疫印迹。利用来自LI-CORBioscience的Odyssey红外成像系统鉴定和分析免疫反应性条带。表达范围的实例示于图7中。
为了测量ADCC,按照标准方法,使用Ficoll梯度离心从San Diego血库样品中分离效应细胞(PBMC)。将1万个靶细胞(HUVEC或肿瘤细胞系)在室温下与抗体一起在生长培养基中预温育20分钟,然后加入1百万个人PBMC(E∶T=100∶1),将混合物在37℃/5%CO2下温育4小时。按照标准方案,使用乳酸脱氢酶(LDH)释放检测(Roche)或ToxiLight BioAssay试剂盒(Cambrex)测量ADCC介导的细胞裂解。
22B5/DLE结合肿瘤或内皮表达的整联蛋白α5β1并且与对于wt22B5 IgG1的0.23nM相比,以0.04nM的EC50促进ADCC(直至80%的靶细胞裂解)。这些数据表明与野生型IgG1相比较,DLE突变增强ADCC活性。在4小时的测定中对于22B5 IgG2或22B5 IgG4未观察到ADCC。KLH IgG1用作阴性对照mAb。HUVEC和代表性肿瘤细胞系(U87MG)中的ADCC的实例示于图8中(两种检测方法的代表)。
由22B5/DLE和wt 22B5 IgG1诱导的细胞的细胞毒性与细胞系表达的α5β1的水平相关,如图9中提供的数据所显示的。具有最高的α5β1表达的细胞(图框A,U87MG)显示最高水平的细胞毒性,而具有中等表达的细胞系(图9,Hs578T和3T3,a5)显示中等细胞毒性。值得注意地,22B5/DLE增强表达低水平α5β1的M24met细胞中的ADCC效应(图9的下图框中的实例)。这些数据表明,ADCC至少部分由与细胞表达的α5β1结合的抗体介导。
实施例7:体内抗转移功效
除了其在内皮和肿瘤细胞中的促增殖、促迁移和促存活活性外,整联蛋白α5β1还通过促进肿瘤细胞外渗和迁移至远端器官牵涉肿瘤转移。下列研究意在证明22B5/DLE在临床前模型中的抗转移功效。
A549-Luc至肺的实验性转移的抑制
A549-Luc是用萤光素酶基因转染的人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系。当静脉内植入时,其优选定位在肺中,这可通过生物发光成像(BLI)来测量。在该研究中,通过尾静脉将A549-Luc细胞注射(3x106个/动物)入SCID BALB/c小鼠,所述小鼠在注射前2天已接受前剂量(pre-dose)的相关抗体。在植入后,每周1次给动物给药直至第8周。每周1次测量个体动物的生物发光直至第20周。
22B5/DLE展示优良的抗肿瘤转移功效,在第8周(给药的最后一周)具有97%的TGI(肿瘤生长抑制),与对照组相比较,其在统计学上是显著的(p<0.01)。使用预期不在该模型中介导ADCC的22B5 IgG2的给药,也在第8周获得了89%的显著的TGI(图10A)。在第5、6、7和8周,22B5/DLE与22B5 IgG2之间的比较的p值分别为0.07、0.03、0.08和0.17。在第8周后停止所有处理,然而继续每天监控不利的生理学体征并且每周通过BLI测量动物。
22B5/DLE处理组中的肿瘤在第13周的过程中被持续抑制,然而22B5 IgG2处理组中的肿瘤在给药停止后大约2周开始迅速生长(图10B)。当肿瘤BLI达到1x108个光子/秒时,认为达到研究终点,在该时间点杀死小鼠。Kaplan-Meier曲线(图10C)显示,22B5/DLE将动物的中值存活时间显著延长至20周,相比之下22B5 IgG2处理的动物为14周,对照组为10周。
这些数据证明在该模型中,22B5的抗肿瘤效应不完全由ADCC介导。即,22B5-IgG2抑制肿瘤生长/侵袭,即使已知IgG2不介导效应子功能,包括细胞的细胞毒性,但抗体仍然介导抗肿瘤效应。此外,数据显示,在停止22B5-IgG1-DLE的施用后肿瘤生长仍然受到抑制。这些数据显示,α5β1与FN的结合的阻断介导了抗肿瘤效应(22B5-IgG2),所述效应进一步被ADCC(22B5-IgG1/DLE)增强。
实施例8:人单克隆抗体24C7、1D9和2D2的结构特征
使用标准PCR技术从24C7、1D9和2D2(分别地)杂交瘤获得编码24C7、1D9和2D2单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列,然后使用标准DNA测序技术进行测序。
24C7的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图1E和1F中以及SEQ ID NO:21和19中。24C7的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图1G和1H中以及SEQ ID NO:22和20中。
1D9的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图1I和1J中以及SEQ ID NO:31和29中。1D9的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图1K和1L中以及SEQ ID NO:32和30中。
2D2的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图1M和1N中以及SEQ ID NO:41和39中。1D9的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别示于图10和1P中以及SEQ ID NO:42和40中。
原始24C7、1D9和2D2分子的亚类为IgG1。对于IgG1亚类,通过定点诱变将3个突变导入IgG1恒定区(S247D、A338L和I340E)以进一步增加对FcγR的结合和效应子功能活性。因此,具有IgG1亚类且包含这3个突变的24C7称为“24C7/DLE”或“24C7 IgG1 DLE”。类似地,具有这3个突变的类似的抗体在本文中称为“1D9/DLE”或“1D9IgG1 DLE”以及“2D2/DLE”或“2D2 IgG1 DLE”。类似地,具有2个突变S247D和I340E的抗体在本文中称为“DE”突变体,例如“24C7/DE”或“24C7 IgG1 DE”。本文中描述的和具有上述突变中的任何1、2或3个的任何抗体的相似名称以相似的方式提及。例如,“1D9/DE”是指本文中描述的1D9抗体,其具有IgG1亚类并且在Fc区域中具有下列突变-S247D和I340E。类似地,“2D2/L”是指本文中描述的2D2抗体,其具有IgG1同种型并且包含A338L突变,等。
24C7重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列的比较显示,24C7重链利用来自人种系VH 3-30.3的VH区段、来自人种系7-27的D区段和来自人种系JH 6b的JH区段。使用确定CDR区的Kabat系统对24C7 VH序列的分析导致重链CDR1、CDR2和CD3区(如图1F中所示和分别示于SEQ ID NO:13、14和15中)的划定。
24C7轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列的比较显示,24C7轻链利用来自人种系VK L6的VL区段和来自人种系JK2的JK区段。使用确定CDR区的Kabat系统对24C7 VL序列的分析导致轻链CDR1、CDR2和CD3区(如图1H中所示和分别示于SEQ IDNO:16、17和18中)的划定。
1D9重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列的比较显示,1D9重链利用来自人种系VH 3-30.3的VH区段,和来自人种系JH 6b的JH区段。由于存在大量的突变,D区段不能被赋予种系基因。使用确定CDR区的Kabat系统对1D9 VH序列的分析导致如图1J中所示和分别示于SEQ ID NO:23、24和25中的重链CDR1、CDR2和CD3区的划定。
1D9轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列的比较显示,1D9轻链利用来自人种系VK L6的VL区段和来自人种系JK1的JK区段。使用确定CDR区的Kabat系统对1D9 VL序列的分析导致如图1L中所示的和分别示于SEQ ID NO:26、27和28中的轻链CDR1、CDR2和CD3区的划定。
2D2重链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白重链序列的比较显示,2D2重链利用来自人种系VH 3-30.3的VH区段、来自人种系7-27的D区段和来自人种系JH 6b的JH区段。使用确定CDR区的Kabat系统对2D2VH序列的分析导致如图1N中所示和分别示于SEQ IDNO:33、34和35中的重链CDR1、CDR2和CD3区的划定。
2D2轻链免疫球蛋白序列与已知的人种系免疫球蛋白轻链序列的比较显示,2D2轻链利用来自人种系VK L6的VL区段和来自人种系JK3的JK区段。使用确定CDR区的Kabat系统对2D2 VL序列的分析导致如图1P中所示的和分别示于SEQ ID NO:36、37和38中的轻链CDR1、CDR2和CD3区的划定。显示抗体22B5、2D2、24C7和1D9单克隆抗体的基因利用的表在下文显示为表3。
表3:基因利用
实施例9:人单克隆抗体22B5、24C7、1D9和2D2的结合特异性和结合动力学的表征
在本实施例中,使用荧光活化细胞分选系统(fluorescence activated cell sorting,FACS)通过流式细胞术检查具有和不具有IgG1 DLE突变的IgG1亚类的22B5、24C7、1D9和2D2人抗α5β1抗体(即“22B5 G1 DLE”、“22B5 G1”、“1D9 G1 DLE”、“1D9 G1”等)的结合特异性。
通过FACS测定的对α5β1的细胞亲和力
使用FACS测定,利用表达内源人整联蛋白α5β1的细胞(HUVEC),就它们对细胞表面整联蛋白α5的结合亲合力测试22B5/DLE、24C7/DLE、1D9/DLE和2D2/DLE抗体。简而言之,使用胰蛋白酶-EDTA分离细胞,并且用冷PBS清洗细胞。在等分入96孔板后,用血清封闭细胞,然后将其与不同浓度的特异性mAb在4℃下温育1小时。随后,清洗细胞,将其与缀合有R-PE荧光团的抗人κ二抗一起温育,然后使用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。对于每一个样品收集10,000个事件而不使用任何门控。为了测定KD,计算各样品直方图的几何平均值,将其作为mAb浓度的函数进行作图。在拟合至两态平衡模型后计算KD。结果示于图11A和11B中。
实施例10:人单克隆抗体22B5、24C7、1D9和2D2的体外ADCC效应子功能
如之前实施例6中所述,通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定评估效应子功能活性。抗体1D9、1D9/DLE、2D2/DLE、22B5/DLE和24C7/DLE在代表性肿瘤细胞系(U87MG)中促进ADCC(直至80%的靶细胞裂解)的EC50值示于图12中。
实施例11:转移性黑素瘤的同基因模型中的体内ADCC依赖性抗肿瘤功效
为了证明ADCC特异性应答,在具有未受损的免疫效应细胞的同基因小鼠中,在肿瘤生长抑制(TGI)模型中测试人单克隆抗体1D9/DLE(其结合人和鼠α5β1但不功能性中和α5β1)。具体地,在其中鼠黑素瘤B16F10细胞表达α5β1的同基因小鼠模型中评估ADCC介导的抗肿瘤活性。表达整联蛋白α5的小鼠黑素瘤细胞系B16F10是高度转移的并且在静脉内注射后主要定殖至肺。将肿瘤细胞静脉内注射入具有免疫能力的C57BL/6小鼠。通过尾静脉将B16F10细胞(2x105个/动物)注射入同基因宿主C57BL/6小鼠,在注射前1天小鼠用抗体(10mg/kg,n=10/组)预先给药。每周1次用抗体皮下给动物给药,进行总共3周。在第21天,杀死动物并且切取肺。
如图13中的结果所示,1D9/DLE抗体产生显著的体内抗肿瘤功效,这表明单独的ADCC应答足以产生TGI。为了描述该模型中ADCC的特殊作用,用1D9 IgG2(已知不介导ADCC)和1D9 IgG1 DLE(通过DLE突变而Fc增强的IgG1同种型)处理动物。对于1D9 IgG1 DLE,观察到比1D9 IgG2更大的抗肿瘤功效。因为同种型对具有相同的氨基酸序列(在抗原结合结构域中)和体外活性,因此数据显示,作为DLE突变的结果的增强的ADCC是产生1D9 IgG1 DLE的优良功效的原因。
保藏信息
申请人已将在本文中称为22B5的抗体的重链和轻链可变区保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)Manassas,VA 20110-2209 U.S.A。22B5 VH区域在2008年7月16日保藏,并且分配以ATCC保藏号PTA-9377。22B5 VL区在2008年7月16日保藏,并且分配ATCC保藏号PTA-9377。根据关于国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约和其下细则(布达佩斯条约)的条款进行这些保藏。这些保藏物将在ATCC保藏单位无限制地维持30年,或在收到最新请求后维持5年,或维持专利的有效期,无论哪者更长,并且如果在该时期期间保藏物变得不能存活,其将被替代。保藏材料的可获得性不被解释为在违反任何政府管理机构根据其专利法律授予的权利的情况下实施本公开内容的任何方面的许可。前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本公开内容的所有方面。本公开内容不限于保藏材料的范围,因为保藏的实施方案意欲作为本公开内容的某些方面的举例说明,并且功能上等价的任何构建体在本公开内容的范围内。本文中材料的保藏不构成承认,即本文中的书面描述不足以使得能够实施本公开内容的任何方面,包括其最佳模式,也不被解释为将权利要求书的范围限定至其代表的特定举例说明。事实上,除了本文中显示和描述的那些外,根据前述说明书,本公开内容的各种修饰对于本领域技术人员来说将变得很显然,并且落在所附权利要求书的范围内。
序列表的概述(a.a.=氨基酸;n.a.=核酸)
Claims (20)
1.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其:
(a)以1x10-7M或更小的KD结合人整联蛋白α5β1;和
(b)能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
2.权利要求1的抗体,其是亚类IgG1的全长人抗体。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合部分,其中所述抗体或抗原结合部分以5x10-8M或更小的KD结合人整联蛋白α5β1。
4.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其以1x10-7M或更小的KD结合人整联蛋白α5β1,并且包含与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列至少90%同一的重链可变区。
5.权利要求4的抗体或其抗原结合部分,其还包含与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列至少90%同一的轻链可变区。
6.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包含:
(a)含有SEQ ID NO:1的重链可变区CDR1;
(b)含有SEQ ID NO:2的重链可变区CDR2;
(c)含有SEQ ID NO:3的重链可变区CDR3;
(d)含有SEQ ID NO:4的轻链可变区CDR1;
(e)含有SEQ ID NO:5的轻链可变区CDR2;和
(f)含有SEQ ID NO:6的轻链可变区CDR3。
7.权利要求6的抗体或抗原结合部分,其包含:
(a)含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区;和
(b)含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区。
8.权利要求1至7的任一项的抗体,其中所述抗体是人全长IgG1抗体,并且其中所述抗体的Fc区域中至少一个氨基酸被突变,并且其中所述抗体与其中所述至少一个氨基酸未突变的相同抗体相比,展示更大的ADCC。
9.权利要求8的抗体,其中所述至少一个突变在氨基酸位点丝氨酸247、丙氨酸338或异亮氨酸340上发生。
10.权利要求9的抗体,其中所述至少一个突变选自丝氨酸247至天冬氨酸的突变(S247D)、丙氨酸338至亮氨酸的突变(A338L)以及异亮氨酸340至谷氨酸的突变(I340E)。
11.权利要求10的抗体,其中所述抗体包含突变S247D、A338L和I340E。
12.权利要求6的抗体,其中所述抗体包含与SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列至少90%同一的重链氨基酸序列。
13.权利要求6的抗体,其中所述抗体包含与SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少90%同一的轻链氨基酸序列。
14.权利要求6的抗体,其中所述抗体包含与SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列至少90%同一的重链氨基酸序列以及与SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少90%同一的轻链氨基酸序列。
15.组合物,其包含权利要求1至14的任一项的抗体或抗原结合部分以及可药用的载体。
16.分离的核酸分子,其编码权利要求1至14的任一项的任何抗体的重链和/或轻链,或其抗原结合部分。
17.包含权利要求16的核酸分子的表达载体。
18.包含权利要求17的表达载体的宿主细胞。
19.用于制备抗α5β1抗体或其抗原结合部分的方法,其包括在权利要求18的宿主细胞中表达所述抗体或抗原结合部分。
20.抑制表达整联蛋白α5β1的肿瘤细胞的生长的方法,其包括将细胞与以有效抑制肿瘤细胞生长的量存在的权利要求1至14的任一项的抗体或其抗原结合部分接触。
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