ES2847383T3 - Conjugados de Fc-histidil-ARNt sintetasa - Google Patents

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Abstract

Una composición terapéutica para su uso en la reducción de la inflamación pulmonar, que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y un polipéptido de fusión de histidil-tARN sintetasa (HRS)-Fc que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 98 % idéntica a la SEQ ID NO:337, donde el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene una actividad antiinflamatoria y tiene farmacocinética alterada con respecto a un polipéptido de HRS no modificado que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:6, donde la farmacocinética alterada es mayor semivida en suero, mayor biodisponibilidad y/o disminución del aclaramiento.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de Fc-histidil-ARNt sintetasa
ANTECEDENTES
Campo técnico
La presente descripción se refiere, en general, a conjugados, tales como polipéptidos de fusión, de uno o más polipéptidos de histidil-ARNt sintetasa (HRS) y regiones Fc de inmunoglobulina, composiciones que los comprenden y procedimientos de uso de dichos polipéptidos y composiciones para tratar o diagnosticar diversas afecciones. Descripción de la técnica relacionada
Las fisiocrinas son dominios de proteínas de origen natural generalmente pequeños que se encuentran en la familia de genes de aminoacil-ARNt sintetasas (AARS) de organismos superiores, que no son necesarios para el papel bien establecido de las aminoacil-ARNt sintetasas en la síntesis de proteínas. Hasta que se descubrió el paradigma fisiocrino, las aminoacil-ARNt sintetasas, una familia de aproximadamente 20 enzimas, eran conocidas solo por su expresión ubicua en todas las células vivas, y su papel esencial en el proceso de síntesis de proteínas. Sin embargo, hallazgos científicos más recientes sugieren ahora que las aminoacil-ARNt sintetasas poseen funciones adicionales más allá de la síntesis de proteínas y, de hecho, han evolucionado en organismos multicelulares para desempeñar importantes papeles homeostáticos en la fisiología y las enfermedades de los tejidos.
Los indicios de la existencia de la función no canónica de las AARS incluye comparaciones de secuencias bien definidas que establecen que, durante la evolución de organismos unicelulares simples a formas de vida más complejas, las AARS han evolucionado para ser más estructuralmente complejas a través de la adición de dominios adjuntos, sin perder la capacidad de facilitar la síntesis de proteínas.
De forma coherente con esta hipótesis, se ha descubierto un conjunto rico y diverso de funciones expandidas para las AARS en eucariotas superiores, y en particular para ARNt sintetasas humanas. Estos datos, que se basan tanto en el análisis directo de los dominios individuales como en el descubrimiento de mutaciones en los genes de las ARNt sintetasas que están vinculadas causalmente a la enfermedad, pero que no afectan la actividad de aminoacilación o de síntesis de proteínas, sugieren que estos dominios recién adjuntados o fisiocrinas son fundamentales para las funciones no canónicas recién adquiridas de las AARS.
Adicionalmente, existe un creciente reconocimiento de que las ARNt sintetasas específicas, tales como la histidil-ARNt sintetasa (HRS), pueden ser liberadas o secretadas por las células vivas y pueden proporcionar importantes señales de acción local con propiedades inmunomoduladoras, quimiotácticas y angiogénicas. La confirmación directa del papel de las AARS como moléculas de señalización extracelular se ha obtenido a través de estudios que muestran la secreción y la liberación extracelular de ARNt sintetasas específicas, así como la demostración directa de que la adición de fragmentos de las ARNt sintetasas que comprenden los dominios recién adjuntados (fisiocrinas), pero no otros fragmentos que carecen de estos dominios, están activos en una gama de vías de señalización extracelular. Estas fisiocrinas, tales como la HRS, representan una oportunidad nueva y sin explotar previamente para desarrollar nuevas proteínas terapéuticas de primera clase para tratar enfermedades humanas. Para explotar de la mejor manera estas y otras actividades en entornos terapéuticos o de diagnóstico, existe una necesidad en la técnica de polipéptidos de HRS que tengan propiedades farmacocinéticas mejoradas. Estas formas terapéuticas mejoradas de los polipéptidos de h Rs permiten el desarrollo de regímenes terapéuticos más eficaces para el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos, y requieren una administración significativamente menos frecuente que las proteínas no modificadas.
El documento WO 2010/107825 se refiere a variantes de splicing de histidil-ARNt sintetasa que pueden conjugarse con un enlazador u otra secuencia, tal como una región Fc de inmunoglobulina.
El documento WO 2011/072265 se refiere a histidil-ARNt sintetasas para tratar la inflamación y que pueden fusionarse con una región Fc para mejorar las características deseadas, tales como el aumento de la semivida en circulación y la mejora del direccionamiento in vivo.
El documento WO2013/123432 se refiere a polipéptidos de histidil-ARNt sintetasa que pueden fusionarse con dominios Fc de anticuerpos y usarse para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.
El documento US 2014/066321 se refiere a polipéptidos variantes de histidil-ARNt sintetasa que pueden fusionarse a regiones Fc y que pueden ser útiles para la terapia y el descubrimiento de fármacos.
El documento Carter y col. Experimental cell research, academic press 2011, 1261-1269 divulga la técnica de fusión de proteínas y péptidos a un dominio Fc de una inmunoglobulina con el fin de mejorar sus propiedades farmacocinéticas y biológicas.
El documento Huang y col. Current opinion in biotechnology 2009, 692-699 se refiere a la terapéutica de fusión de receptor-Fc y divulga los diferentes enfoques para diseñar proteínas de fusión Fc.
El documento Haussermann y col. Pneumologie 2010, 496-503 divulga la relación de histidil-ARNt con ciertas enfermedades tales como una forma específica de miositis con enfermedad pulmonar intersticial.
El documento Levine y col. Current opinion in rheumatology 2003, 708-713 se refiere a respuestas inmunitarias antiaminoacil ARNt sintetasa y divulga los enlaces entre las moléculas de ARS, la inflamación y la apoptosis.
El documento US 2011/086058 se refiere a composiciones inmunógenas para prevenir la infección con virus de la gripe y divulga las composiciones inmunógenas tales como hemaglutinina de un virus de la gripe y un inmunopotenciador tal como un fragmento Fc de IgG humana.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 ilustra la composición estructural de una inmunoglobulina ejemplar, y proporciona una visión general de las clases y subclases de anticuerpos.
La figura 2 muestra un alineamiento de las regiones Fc de IgA1 (SEQ ID NO:156), IgA2 (SEQ ID NO:157), IgM (SEQ ID NO:158), IgG1 (SEQ ID NO:159), IgG2 (SEQ ID NO:160), IgG3 (SEQ ID NO:161), IgG4 (SEQ ID NO:162) e IgE (SEQ ID NO:163) humanas. La estructura secundaria de Fca se muestra por encima de las secuencias. Los signos de intercalación (A) y los asteriscos (*) muestran residuos que contribuyen respectivamente al 0-4 % y al 5-12 % de la superficie de unión.
La figura 3 muestra los resultados del análisis SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras de HRS de longitud completa y HRS(1-506). Los resultados muestran que HRS(1-506) reduce drásticamente la formación de la formación de enlaces entre cadenas mediada por disulfuro en comparación con la proteína de longitud completa. Las muestras (10 p g) se cargaron en un gel Bis-Tris al 4-12 %, utilizando un tampón de desplazamiento MOPS-SDS.
La figura 4 muestra las propiedades antiinflamatorias de un polipéptido derivado de HRS ejemplar en un modelo de colitis en ratón inducida por TNBS. Los estudios se realizaron en ratones BDF-1 macho, con 12 ratones/grupo. Se añadieron TNBS y budesonida a 5 mg/kg al agua. La HRS(1-60) (Resokine, (HisRSN4)) se administró diariamente mediante inyección IV, comenzando 3 días antes del tratamiento con TNBS, a una concentración de 1 o 5 mg/kg. Esta figura muestra el porcentaje (%) de supervivencia de ratones tratados y no tratados durante aproximadamente 80 horas.
La figura 5A muestra el régimen de dosificación usado para evaluar la utilidad terapéutica de HRS (1-506) en el modelo de miopatía de estatina. Los grupos de dosificación de tratamiento incluyeron vehículo (n = 11), 0,3 mg/kg HRS(1-506) (n = 8), 1,0 mg/kg HRS(1-506) (n = 8), 3,0 mg/kg HRS(1-506) (n = 8); La figura 5B muestra los resultados de las mediciones de troponina C después de 15 días de tratamiento con estatinas /-HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg. La figura muestra el efecto positivo de HRS (1-506) en la reducción de la inducción de troponina C inducida por estatinas.
La figura 6A muestra los resultados de las mediciones de CK después de 12 días de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg; La figura 6B muestra los mismos datos después de 15 días de tratamiento. La figura muestra el efecto positivo de HRS(1-506) en la reducción de los niveles de CK inducidos por estatinas.
La figura 7 muestra los niveles de HARS circulante después de 15 días de tratamiento con estatinas en comparación con el control con vehículo. La figura muestra que las estatinas inducen la liberación de HARS extracelular.
La figura 8 muestra imágenes representativas de H&E de secciones de isquiotibiales a 10 aumentos después de 15 días de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
La figura 9 muestra los resultados del perfil de expresión génica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina. Los datos muestran cambios en la expresión de 137 genes seleccionados para rastrear los marcadores musculares y la función de las células inmunitarias, la inflamación, el estado metabólico, la recuperación de tejidos, el crecimiento y la atrofia musculares. Los valores de expresión génica se normalizaron respecto a genes de referencia y se representaron como cambio de veces frente al grupo tratado con vehículo.
La figura 10A muestra los resultados del perfil de expresión génica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina. Los datos muestran cambios en la expresión de 137 genes (como en la figura 7) para comparar los cambios relativos en la expresión génica de animales tratados con estatina en comparación con animales tratados con vehículo. La figura 10B muestra los cambios relativos en la expresión génica de los animales tratados con estatina que también se trataron con HRS(1-506) en comparación con los animales tratados con estatina sola.
La figura 11 muestra los resultados del perfil de expresión génica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 10 genes relacionados con diabetes/síndrome metabólico después de 15 días de tratamiento con estatinas /-HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
La figura 12 muestra los resultados del perfil de expresión génica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 26 genes marcadores de células inmunitarias después de 15 días de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
Las figuras 13A-D muestran los resultados del perfil de expresión génica de los genes CD11a, CD11b, CD8a y CD8b en isquiotibiales de ratas tratadas con estatina después de 15 días de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
Las figuras 14A-C muestran los resultados del perfil de expresión génica de los genes CD18, CCR5 y CD45R en isquiotibiales de ratas tratadas con estatina después de 15 días de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
La figura 15 muestra los resultados del perfil de expresión génica de 17 genes marcadores inflamatorios en isquiotibiales de ratas tratadas con estatina después de 15 días de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
Las figuras 16A-D muestran los resultados del perfil de expresión génica de las citocinas inflamatorias IL-6, MCP1, IL-10 e interferón-gamma (IFN-y) en isquiotibiales de ratas tratadas con estatina después de 15 días de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
La figura 17 muestra los resultados del perfil de expresión génica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 14 genes relacionados con la adhesión, el desarrollo y la fibrosis después de 15 días de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
La figura 18 muestra los resultados del perfil de expresión génica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 14 genes relacionados con atrofia/atrofia progresiva musculares después de 15 días de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
La figura 19A muestra los resultados del perfil de expresión génica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 14 genes relacionados con atrofia/atrofia progresiva musculares después de 15 días de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg. La figura 19B muestra cambios específicos en MMP-3, y la figura 19C muestra cambios específicos en la expresión del gen MMP-9 en las mismas condiciones.
La figura 20 muestra los resultados del perfil de expresión génica de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 29 genes relacionados con la miogénesis después de 15 días de tratamiento con estatinas /- HRS(1-506) a 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
La figura 21 muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de proteínas de fusión Fc purificadas. Carril 1: véase escalera de proteínas Blue Plus2 (Life Technologies). Carriles 2 y 6: Fc-HRS (2-60) n.° de lote 472. Carriles 3 y 7: HRS (1-60)-Fc n.° de lote 473. Carriles 4 y 8: Fc-HRS (2-60) n.° de lote 480. Carriles 5 y 9: HRS (1-60)-Fc n.° de lote 482. Los carriles 2-5 se desplazaron en condiciones no reducidas, y los carriles 6-9 en condiciones reducidas.
La figura 22. Muestra un análisis analítico por HPLC de exclusión por tamaño de la fusión Fc-HRS (2-60) representativa purificada después de cromatografía con proteína A, de intercambio catiónico y con hidroxiapatita (superposición de inyecciones duplicadas). La pureza es el 99,2 % del pico principal y el 0,8 % de especies de alto peso molecular (HMW).
La figura 23A muestra el tiempo frente a la concentración de HRS(1-60) después de inyección intravenosa o subcutánea a ratones. La figura 23B muestra el tiempo frente a la concentración de Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc después de inyección intravenosa a ratones. La figura 23C muestra el tiempo frente a la concentración de Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc después de inyección subcutánea a ratones.
La figura 24A muestra las puntuaciones del índice de actividad de la enfermedad (DAI) en el sacrificio en ratones tratados con diferentes proteínas de fusión HRS-Fc. Las barras representan la media de DAI (± SEM) para cada grupo de tratamiento. El DAI incorpora información sobre el sangrado y la diarrea junto con una puntuación para la pérdida de peso. La figura 24B muestra la relación peso:longitud del colon en el sacrificio en ratones tratados con compuestos. Las barras representan la relación media (± SEM) para cada grupo de tratamiento.
La figura 25 muestra una visión general de los cambios transcripcionales en el estudio con TNBS. Se muestran cambios transcripcionales relativos en animales tratados con TNBS (grupo 2), animales tratados con TNBS y budesonida (grupo 3), TNBS y artículo de prueba A (HRS(1-60); grupo 4) y TNBS y artículo de prueba B (Fc-HRS(2-60); grupos 5 y 6) después de la normalización respecto a animales sin tratamiento previo (grupo 1). Cada punto en el diagrama de dispersión representa un gen medido. 7 genes en el grupo 2 fueron regulados positivamente más de 10 veces (Il6, IL1b, m Cp-1, MMP3, MMP9, CD11b e IL10).
Las figuras 26A-26H muestran los genes relacionados con respuestas inmunitaria e inflamatoria regulados positivamente por TNBS. Se muestran cambios transcripcionales relativos de genes individuales en animales tratados con TNBS (grupo 2), animales tratados con TNBS y budesonida (grupo 3), TNBS y artículo de prueba A (HRS(1-60); grupo 4) y TNBS y artículo de prueba B (Fc-HRS(2-60); grupos 5 y 6) después de la normalización respecto a animales sin tratamiento previo (grupo 1). Cada punto en el diagrama de dispersión representa la abundancia del gen de interés en cada animal dentro del grupo. La significación se calculó usando la prueba de la t de Student, donde * = valor p < 0,05 y ** = valor p < 0,01.
Las figuras 27A-27D muestran los porcentajes relativos de diferentes poblaciones de linfocitos T en los bazos de ratones sin tratamiento previo o ratones tratados por vía intracolónica con TNBS para inducir colitis experimental, tratados con TNBS ± 0,5 mg/kg de Fc-HRS (2-60). Se muestra el porcentaje de linfocitos vivos teñidos para (27A) CD3, (27B) CD8, (27C) CD4 y (27d ) Cd25 y FoxP3. Los linfocitos Treg se acotaron adicionalmente en linfocitos CD4+.
RESUMEN
Las realizaciones de la presente descripción se refieren, en general, a conjugados polipeptídicos de histidil-ARNt sintetasa (HRS) que tienen una o más regiones Fc de inmunoglobulina unidas covalentemente a los mismos, composiciones farmacéuticas que comprenden dichas moléculas, procedimientos de fabricación y procedimientos para su uso terapéutico. Entre otras ventajas, los conjugados HRS-Fc de la presente descripción pueden poseer propiedades farmacocinéticas mejoradas y/o actividades biológicas terapéuticamente relevantes mejoradas, con respecto a los polipéptidos de HRS no modificados correspondientes.
Ciertas realizaciones de la presente descripción incluyen, por lo tanto, polipéptidos de fusión HRS, que comprenden un polipéptido de HRS que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 80 % idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 o una secuencia de cualquiera de las tablas D1, D3-D6 o D8, y al menos una región Fc fusionada con el extremo C, el extremo N o ambos, del polipéptido de HRS. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntico a cualquiera de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 o una secuencia de cualquiera de las tablas D1, D3-D6 o D8. En realizaciones particulares de la presente descripción, el polipéptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 o una secuencia de cualquiera de las tablas D1, D3-D6 o D8.
En realizaciones particulares de la presente descripción, el polipéptido de HRS comprende los residuos de aminoácidos 2-40, 2-45, 2-50, 2-55, 2-60, 2-66 o 1-506 de la SeQ iD NO:1, o una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a los residuos 2-40, 2-45, 2-50, 2-55, 2-60, 2-66 o 1-506 de la SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS tiene una longitud de aproximadamente 40-80 aminoácidos y comprende los residuos 2-45 de la SEQ ID NO:1. En realizaciones específicas de la presente descripción, el polipéptido de HRS consiste o consiste esencialmente en los residuos de aminoácidos 2-40, 2-45, 2­ 50, 2-55, 2-60, 2-66 o 1-506 de la SEQ ID NO:1.
En algunas realizaciones de la presente descripción, al menos un residuo de cisteína endógeno del polipéptido de HRS se ha sustituido con otro aminoácido o se ha eliminado. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el al menos un residuo de cisteína endógeno se selecciona de entre Cys174, Cys191, Cys224, Cys235, Cys507 y Cys509. En realizaciones particulares de la presente descripción, el al menos un residuo de cisteína endógeno se selecciona de entre Cys224, Cys235, Cys507 y Cys509. En realizaciones específicas de la presente descripción, los residuos de cisteína endógenos son Cys507 y Cys509. En algunas realizaciones de la presente descripción, todos los residuos de cisteína expuestos en la superficie endógenos se han sustituido con otro aminoácido o se han eliminado.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS se repite en tándem. En realizaciones particulares de la presente descripción, el polipéptido de HRS comprende un dominio WHEP. En realizaciones específicas de la presente descripción, el polipéptido de HRS carece de un dominio de aminoacilación funcional. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS consiste esencialmente en un dominio WHEP. En aspectos específicos de la presente descripción, el dominio WHEP de un polipéptido de HRS o variante o fragmento del mismo tiene la secuencia de consenso en la tabla D5.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la región Fc y el polipéptido de HRS están separados por un enlazador peptídico. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el enlazador peptídico tiene aproximadamente 1-200 aminoácidos, 1-150 aminoácidos, 1-100 aminoácidos, 1-90 aminoácidos, 1-80 aminoácidos, 1-70 aminoácidos, 1 -60 aminoácidos, 1-50 aminoácidos, 1-40 aminoácidos, 1-30 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 1­ 10 aminoácidos o 1-5 aminoácidos de longitud. En realizaciones particulares de la presente descripción, el enlazador peptídico tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoácidos de longitud. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el enlazador peptídico consiste en residuos de Gly y/o Ser. En algunas realizaciones de la presente descripción, el enlazador peptídico es un enlazador fisiológicamente estable. En otras realizaciones de la presente descripción, el enlazador peptídico es un enlazador liberable, opcionalmente un enlazador escindible enzimáticamente. En realizaciones específicas de la presente descripción, el enlazador peptídico comprende una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO:200-260, u otro enlazador peptídico descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la región Fc se fusiona con el extremo C del polipéptido de HRS. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la región Fc se fusiona con el extremo N del polipéptido de HRS.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, la región Fc comprende uno o más de un dominio bisagra, CH2, CH3 y/o CH4 de una IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y/o IgM de mamífero. En algunas realizaciones de la presente descripción, la región Fc comprende los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG1. En algunas realizaciones de la presente descripción, la región Fc comprende los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG2. En algunas realizaciones de la presente descripción, la región Fc comprende los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG3. En realizaciones particulares de la presente descripción, el polipéptido de fusión HRS no comprende las regiones CH1 , CL, VL y VH de una inmunoglobulina.
En realizaciones específicas de la presente descripción, la región Fc comprende una cualquiera de las SEQ ID NOS:128-163 o 339-342, o una variante, o un fragmento, o una combinación de los mismos. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el dominio bisagra es un dominio bisagra de IgG1 modificado que comprende la SEQ ID NO:341.
En realizaciones particulares de la presente descripción, la región Fc comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a MSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:339) o SDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO:340).
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de fusión HRS-Fc comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a Fc-HRS(2-60) (SEQ ID NO:337), o HRS(1-60)-Fc (SEQ ID NO:338), o Fc-HRS(2-40) (SEQ ID NO:381), o HRS(1-40)-Fc (SEQ ID NO:386), o Fc-HRS(2-45) (SEQ ID NO:382), o HRS(1-45)-Fc (SEQ ID NO:387), o Fc-HRS(2-50) (SEQ ID NO:383), o HRS(1-50)-Fc (SEQ ID NO:388), o Fc-HRS(2-55) (SEQ ID NO:384), o HRS(1-55)-Fc (SEQ ID NO:389), o Fc-HRS(2-66) (SEQ ID NO:385), o HRS(1-66)-Fc (SEQ ID NO:390), o Fc-HRS(2-60) HRS(2-60) (SEQ ID NO:396).
En ciertos aspectos, el polipéptido de fusión HRS tiene farmacocinética alterada con respecto a un polipéptido de HRS correspondiente. Los ejemplos de dicha farmacocinética alterada incluyen una mayor semivida en suero, mayor biodisponibilidad, mayor exposición y/o disminución del aclaramiento. En ciertos aspectos, la exposición aumenta en al menos 100 veces. En algunos aspectos, el polipéptido de fusión HRS tiene una semivida de al menos 30 horas en ratones. En ciertos aspectos, la biodisponibilidad es una biodisponibilidad subcutánea que aumenta en al menos aproximadamente un 30 %. En algunos aspectos, el polipéptido de fusión HRS tiene una actividad efectora inmunitaria alterada en relación con un polipéptido de HRS correspondiente. Los ejemplos de dichas actividades efectoras inmunitarias incluyen una o más de activación del complemento, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP).
En ciertas realizaciones de la presente descripción, la región Fc comprende una región Fc variante, con respecto a una región Fc de tipo silvestre. En algunas realizaciones de la presente descripción, la región Fc variante comprende una secuencia que es al menos el 90 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO:128-163 o 341, o una combinación de dichas secuencias. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la región Fc variante comprende un híbrido de una o más regiones Fc de diferentes especies, diferentes clases de Ig o diferentes subclases de Ig. En realizaciones particulares de la presente descripción, la región Fc variante comprende un híbrido de uno o más dominios bisagra, CH2, CH3 y/o CH4 de regiones Fc de diferentes especies, diferentes clases de Ig y/o diferentes subclases de Ig.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, la región Fc variante es una glucoforma modificada, con respecto a una región Fc de tipo silvestre correspondiente. En realizaciones particulares de la presente descripción, la región Fc variante tiene una farmacocinética alterada con respecto a una región Fc de tipo silvestre correspondiente. Los ejemplos de dicha farmacocinética alterada incluyen semivida en suero, biodisponibilidad y/o aclaramiento. En algunas realizaciones de la presente descripción, la región Fc variante tiene una actividad efectora alterada con respecto a una región Fc de tipo silvestre correspondiente. Los ejemplos de dichas actividades efectoras incluyen una o más de activación del complemento, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), o fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP).
En ciertas realizaciones de la presente descripción, la región Fc variante tiene una unión alterada a uno o más receptores de Fcy, con respecto a una región Fc de tipo silvestre correspondiente. Los receptores de Fcy ejemplares se describen en el presente documento y se conocen en la técnica.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, la región Fc variante tiene unión alterada a uno o más receptores FcRn, con respecto a una región Fc de tipo silvestre correspondiente. Los receptores FcRn ejemplares se describen en el presente documento y se conocen en la técnica.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la región Fc variante tiene solubilidad alterada (por ejemplo, aumentada), con respecto a una región Fc de tipo silvestre correspondiente, y el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene solubilidad alterada, con respecto a un polipéptido de HRS no modificado correspondiente.
En realizaciones específicas de la presente descripción, el polipéptido de fusión HRS-Fc está sustancialmente en forma dimérica en una solución fisiológica, o en otras condiciones fisiológicas, tales como condiciones in vivo. En realizaciones específicas de la presente descripción, el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene sustancialmente la misma estructura secundaria que un polipéptido de h Rs no modificado o modificado de forma diferente correspondiente, de acuerdo con se determina mediante un análisis de dicroísmo circular UV.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene un perfil de AUC farmacocinético en plasma o suero al menos 5 veces mayor que un polipéptido de HRS no modificado correspondiente cuando se administra a un mamífero.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene sustancialmente la misma actividad que un polipéptido de HRS no modificado o modificado de forma diferente correspondiente, en un ensayo de actividad antiinflamatoria.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene más de 2 veces la actividad de un polipéptido de HRS no modificado o modificado de forma diferente correspondiente, en un ensayo de actividad antiinflamatoria.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene una estabilidad que es al menos un 30 % mayor que un polipéptido de HRS no modificado o modificado de forma diferente correspondiente, cuando se comparan en condiciones similares a temperatura ambiente, durante 7 días en PBS a pH 7,4.
Los ejemplos específicos de polipéptidos de fusión HRS-Fc pueden comprender al menos una de las SEQ iD nO:107-110 o 337-338 o 349-350 o 381-390 o 396, o una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 % idéntica a la SEQ ID NO:107-110 o 337-338 o 349-350 o 381-390 o 396. Las SEQ ID NO:107 y 338 son las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de fusión Fc C-terminales ejemplares respecto a los residuos 1-60 de la SEQ ID NO:1 (HRS(1-60)_Fc); las SEQ ID NOS:108 y 337 son las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de fusión Fc N-terminales ejemplares respecto a los residuos 1-60 de la SEQ ID NO:1 (Fc_HRS(1-60)); la SEQ ID NO:109 es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión Fc C-terminal ejemplar respecto a los residuos 1-506 de la SEQ ID NO:1 (HRS(1-506)_Fc); y la s Eq ID NO:110 es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión Fc N-terminal ejemplar respecto a los residuos 1-506 de la SEQ ID NO:1 (Fc_HRS(1-506)).
En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene una actividad antiinflamatoria, por ejemplo, en un ensayo basado en células o tras la administración a un sujeto.
También se incluyen composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas o terapéuticas, que comprenden un polipéptido de fusión HRS-Fc descrito en el presente documento y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable o de calidad farmacéutica. En algunas composiciones, el polipéptido es al menos aproximadamente un 95 % puro y menos de aproximadamente un 5 % agregado. En algunas realizaciones de la presente descripción, la composición se formula para administración por vía oral, subcutánea, intranasal, pulmonar o parental. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la composición comprende un vehículo de administración seleccionado del grupo que consiste en liposomas, micelas, emulsiones y células.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la composición es para uso en a) tratar una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria, b) reducir la inflamación muscular o pulmonar asociada opcionalmente con una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, c) inducir tolerancia a un autoantígeno de histidil-ARNt sintetasa (HRS), d) eliminar un conjunto o subconjunto de linfocitos T implicados en una respuesta autoinmunitaria a un autoantígeno de HRS, e) reducir la inflamación tisular en un sujeto, opcionalmente de tejido, muscular, pulmonar y/o cutáneo, f) tratar una distrofia muscular, g) tratar rabdomiólisis, atrofia muscular progresiva, caquexia, inflamación muscular o lesión muscular, y/o h) tratar una enfermedad asociada con un autoanticuerpo.
También se incluyen regímenes de dosificación que mantienen una concentración promedio en situación de equilibrio de un polipéptido de fusión histidil-ARNt sintetasa (HRS)-Fc en el plasma de un sujeto de entre aproximadamente 300 pM y aproximadamente 1000 nM cuando se usa un intervalo de dosificación de 3 días o más, que comprende administrar al sujeto una composición terapéutica o un polipéptido de fusión HRS-Fc descritos en el presente documento.
Algunas realizaciones de la presente descripción incluyen procedimientos para mantener niveles de polipéptido de fusión histidil-ARNt sintetasa (HRS)-Fc por encima del nivel terapéutico efectivo mínimo en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composición terapéutica o un polipéptido de fusión HRS-Fc descritos en el presente documento.
También se incluyen procedimientos para tratar una enfermedad o afección inflamatoria o autoinmunitaria en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composición terapéutica o un polipéptido de fusión HRS-Fc descritos en el presente documento.
Algunas realizaciones de la presente descripción incluyen procedimientos para reducir la inflamación muscular o pulmonar asociada con una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composición terapéutica o un polipéptido de fusión HRS-Fc descritos en el presente documento.
Ciertas realizaciones de la presente descripción incluyen procedimientos para inducir tolerancia a un autoantígeno de histidil-ARNt sintetasa (HRS) en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composición terapéutica o un polipéptido de fusión HRS-Fc descritos en el presente documento.
Algunas realizaciones de la presente descripción incluyen procedimientos para eliminar un conjunto o subconjunto de linfocitos T implicados en una respuesta autoinmunitaria a un autoantígeno de histidil-ARNt sintetasa (HRS) en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composición terapéutica o un polipéptido de fusión HRS-Fc descritos en el presente documento.
También se incluyen procedimientos de reducción de la inflamación tisular en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composición terapéutica o un polipéptido de fusión HRS-Fc descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el tejido se selecciona de entre músculo, intestino, cerebro, pulmón y piel.
Algunas realizaciones de la presente descripción incluyen procedimientos de tratamiento de una distrofia muscular en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composición terapéutica o un polipéptido de fusión HRS-Fc descritos en el presente documento. En realizaciones particulares de la presente descripción, la distrofia muscular se selecciona de entre distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular de la cintura y los miembros, distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia miotónica, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular distal y distrofia muscular congénita.
Ciertas realizaciones de la presente descripción incluyen procedimientos de tratamiento de rabdomiolisis, atrofia muscular progresiva, caquexia, inflamación muscular o lesión muscular en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar al sujeto una composición terapéutica o un polipéptido de fusión HRS-Fc descritos en el presente documento.
Algunas realizaciones de la presente descripción incluyen procedimientos de tratamiento de una enfermedad asociada con un autoanticuerpo, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una composición o un polipéptido AARS/HRS descritos en el presente documento. En algunas realizaciones de la presente descripción, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en miopatías inflamatorias, incluyendo miopatías inflamatorias, polimiositis, dermatomiositis y trastornos relacionados, superposición de polimiositis-esclerodermia, miositis por cuerpos de inclusión (MCI), síndrome anti-sintetasa, enfermedad pulmonar intersticial, artritis y fenómeno de Reynaud. En algunas realizaciones de la presente descripción, la composición se administra al sujeto antes de la aparición de los síntomas de la enfermedad. En algunas realizaciones de la presente descripción, el autoanticuerpo es específico para histidil-ARNt sintetasa. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS comprende al menos un epítopo de la histidil-ARNt sintetasa reconocido por el autoanticuerpo específico de la enfermedad. En algunas realizaciones de la presente descripción, el epítopo es un epítopo inmunodominante reconocido por anticuerpos en sueros del sujeto. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS bloquea la unión del autoanticuerpo a la histidil-ARNt sintetasa nativa. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS causa la eliminación clonal de linfocitos T autorreactivos. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS causa la inactivación funcional de los linfocitos T implicados en la respuesta autoinmunitaria. En algunas realizaciones de la presente descripción, la administración del polipéptido de HRS da como resultado una inflamación reducida de los músculos o los pulmones. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS induce tolerancia a un autoantígeno.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, la composición se formula para administración por vía oral, intranasal, pulmonar, intramuscular o parental.
También se incluyen polinucleótidos aislados, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un conjugado o polipéptido de fusión HRS-Fc descrito en el presente documento, incluyendo vectores que comprenden dichos polinucleótidos y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos y/o vectores.
Algunas realizaciones de la presente descripción incluyen procedimientos para fabricar un polipéptido de fusión HRS-Fc descrito en el presente documento, que comprenden a) cultivar una célula huésped (por ejemplo, una célula huésped de E. coli K-12) para expresar un polipéptido de fusión HRS-Fc, donde la célula huésped comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión HRS-Fc descrito en el presente documento, que está unido operativamente a un elemento regulador; y b) aislar el polipéptido de fusión HRS-Fc a partir de la célula huésped. En realizaciones específicas de la presente descripción, la cepa de E. coli K-12 se selecciona de entre W3110 y UT5600.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención. La puesta en práctica de la presente descripción empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, procedimientos convencionales de biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro del alcance de la técnica, muchos de los cuales se describen a continuación con fines ilustrativos. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a Edición, 2000); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin and Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R.I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 5a Ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3a Edición 2010); Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3a Edición 2005). Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS, Washington, 1997; Veronese, F., and J.M. Harris, Eds., Peptide and protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews, 54(4) 453-609 (2002); Zalipsky, S., y col., «Use of functionalized Poly(Ethylene Glycols) for modification of polypeptides» en Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications.
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por los expertos en la materia a los que pertenece la presente descripción. Aunque puede usarse cualquier procedimiento y material similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la puesta en práctica o a prueba de la presente descripción, se describen procedimientos y materiales preferidos. Para los fines de la presente descripción, los siguientes términos se definen a continuación. Los artículos «un» y «una» se usan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos a uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, «un elemento» significa un elemento o más de un elemento.
Por «aproximadamente» se entiende una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía hasta el 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.
Como se usa en el presente documento, el término «aminoácido» pretende significar tanto aminoácidos de origen natural como de origen no natural, así como análogos y miméticos de aminoácidos. Los aminoácidos de origen natural incluyen los 20 (L)-aminoácidos utilizados durante la biosíntesis de proteínas, así como otros tales como 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, desmosina, isodesmosina, homocisteína, citrulina y ornitina, por ejemplo. Los aminoácidos de origen no natural incluyen, por ejemplo, (D)-aminoácidos, norleucina, norvalina, p-fluorofenilalanina, etionina y similares, que son conocidos por los expertos en la materia. Los análogos de aminoácidos incluyen formas modificadas de aminoácidos de origen natural y de origen no natural. Dichas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, la sustitución o reemplazo de grupos y restos químicos en el aminoácido o por derivatización del aminoácido. Los miméticos de aminoácidos incluyen, por ejemplo, estructuras orgánicas que exhiben propiedades funcionalmente similares tales como características de carga y separación de carga del aminoácido de referencia. Por ejemplo, una estructura orgánica que imita a la arginina (Arg o R) tendría un resto con carga positiva ubicado en un espacio molecular similar y que tiene el mismo grado de movilidad que el grupo e-amino de la cadena lateral del aminoácido Arg natural. Los miméticos también incluyen estructuras restringidas para mantener la separación y las interacciones de carga óptimas del aminoácido o de los grupos funcionales del aminoácido. Los expertos en la materia saben o pueden determinar qué estructuras constituyen análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos funcionalmente equivalentes.
Como se usa en el presente documento, un sujeto «en riesgo» de desarrollar una enfermedad o reacción adversa puede o no tener una enfermedad detectable, o síntomas de la enfermedad, y puede o no haber mostrado una enfermedad detectable o síntomas de la enfermedad antes de los procedimientos de tratamiento descritos en el presente documento. «En riesgo» denota que un sujeto tiene uno o más factores de riesgo, que son parámetros medibles que se correlacionan con el desarrollo de una enfermedad, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. Un sujeto que tenga uno o más de estos factores de riesgo tiene una mayor probabilidad de desarrollar una enfermedad, o una reacción adversa, que un sujeto sin uno o más de estos factores de riesgo.
Una «enfermedad autoinmunitaria» como se usa en el presente documento es una enfermedad o trastorno que surge de y está dirigida contra los propios tejidos de un individuo. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunitarios incluyen, aunque sin limitarse a, respuestas inflamatorias tales como enfermedades inflamatorias de la piel que incluyen psoriasis y dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica); esclerodermia y esclerosis sistémicas; respuestas asociadas con la enfermedad inflamatoria intestinal (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa); síndrome de dificultad respiratoria (incluyendo síndrome de dificultad respiratoria del adulto; SDRA); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis colitis; glomerulonefritis; afecciones alérgicas tales como eccema y asma y otras afecciones que implican la infiltración de linfocitos T y respuestas inflamatorias crónicas; aterosclerosis; deficiencia de adhesión de leucocitos; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistémico (LES); diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes mellitus tipo I o diabetes mellitus dependiente de insulina); esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmunitaria; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes de inicio juvenil; y respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T que se encuentran típicamente en la tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, miopatías inflamatorias, enfermedad pulmonar intersticial, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison); enfermedades que implican diapédesis leucocitaria; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC); síndrome de lesión multiorgánca; anemia hemolítica (que incluye, aunque sin limitarse a, crioglobinemia o anemia positiva de Coombs); miastenia grave; enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo; enfermedad de la membrana basal antiglomerular; síndrome anti-fosfolípido; neuritis alérgica; enfermedad de Graves; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; penfigoide bulloso; pénfigo; poliendocrinopatías autoinmunitarias; enfermedad de Reiter; síndrome de la persona rígida; enfermedad de Behcet; arteritis de células gigantes; nefritis por complejos inmunitarios; nefropatía por IgA; polineuropatías por IgM; púrpura trombocitopénica inmunitaria (PTI) o trombocitopenia autoinmunitaria, etc.
En toda esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que las palabras «comprenden», «comprende» y «que comprende» implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos enunciados, pero no la exclusión de ninguna otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. Por «que consiste en» se entiende que incluye, y se limita a, lo que sigue a la frase «que consiste en». Por lo tanto, la frase «que consiste en» indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, y que no puede haber otros elementos presentes. Por «que consiste esencialmente en» se entiende que incluye todos los elementos enumerados después de la frase, y está limitado a otros elementos que no interfieran en o contribuyan a la actividad o acción especificada en la presente descripción para los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase «que consiste esencialmente en» indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no materialmente a la actividad o acción de los elementos enumerados.
El término «eliminación clonal» se refiere a la eliminación (por ejemplo, pérdida o muerte) de linfocitos T autorreactivos. La eliminación clonal se puede conseguir de manera central en el timo, en la periferia, o en ambos.
El término «conjugado» pretende referirse a la entidad formada como resultado de la unión covalente de una molécula, por ejemplo, una molécula biológicamente activa (por ejemplo, polipéptido de HRS), a una región Fc de inmunoglobulina. Un ejemplo de un polipéptido conjugado es una «proteína de fusión» o «polipéptido de fusión», es decir, un polipéptido que se crea a través de la unión de dos o más secuencias codificantes, que originalmente codificaron polipéptidos independientes; la traducción de las secuencias codificantes unidas da como resultado un único polipéptido de fusión, típicamente con propiedades funcionales derivadas de cada uno de los polipéptidos independientes.
La mención «libre de endotoxinas» o «sustancialmente libre de endotoxinas» se refiere, en general, a composiciones, disolventes y/o recipientes que contienen, como máximo, cantidades traza (por ejemplo, cantidades que no tienen efectos fisiológicos clínicamente adversos para un sujeto) de endotoxina, y preferentemente cantidades indetectables de endotoxina. Las endotoxinas son toxinas asociadas con ciertas bacterias, típicamente bacterias gram negativas, aunque las endotoxinas pueden encontrarse en bacterias gram positivas, tales como Listeria monocytogenes. Las endotoxinas más prevalentes son lipopolisacáridos (LPS) o lipooligosacáridos (LOS) que se encuentran en la membrana externa de diversas bacterias gram negativas, y que representan una característica patógena central en la capacidad de estas bacterias para causar la enfermedad. Pequeñas cantidades de endotoxina en los seres humanos pueden producir fiebre, una disminución de la presión arterial y la activación de la inflamación y la coagulación, entre otros efectos fisiológicos adversos.
Por lo tanto, en la producción farmacéutica, a menudo es deseable eliminar la mayoría o todos los rastros de endotoxina de medicamentos y/o recipientes de medicamentos, ya que incluso pequeñas cantidades pueden causar efectos adversos en los seres humanos. Se puede usar un horno de despirogenación para este fin, ya que típicamente se requieren temperaturas superiores a 300 °C para descomponer la mayoría de las endotoxinas. Por ejemplo, basándose en el material de envasado primario, tal como jeringas o viales, la combinación de una temperatura vítrea de 250 °C y un tiempo de mantenimiento de 30 minutos a menudo es suficiente para conseguir una reducción de 3 log en los niveles de endotoxinas. Se contemplan otros procedimientos para eliminar endotoxinas, que incluyen, por ejemplo, procedimientos de cromatografía y filtración, como se describen en el presente documento y se conocen en la técnica. También se incluyen procedimientos para producir conjugados HRS-Fc y aislarlos de células eucariotas, tales como células de mamífero, para reducir, si no eliminar, el riesgo de que estén presentes endotoxinas en una composición de la presente descripción. Se prefieren los procedimientos de producir conjugados HRS-Fc y aislarlos a partir de células libres de suero.
Las endotoxinas pueden detectarse usando técnicas de rutina conocidas en la técnica. Por ejemplo, el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus, que usa sangre del cangrejo herradura, es un ensayo muy sensible para detectar la presencia de endotoxinas. En esta prueba, niveles muy bajos de LPS pueden causar una coagulación detectable del lisado del limulus debido a una potente cascada enzimática que amplifica esta reacción. Las endotoxinas también se pueden cuantificar mediante un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA). Para estar sustancialmente libre de endotoxinas, los niveles de endotoxinas pueden ser inferiores a aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 UE/ml. Típicamente, 1 ng de lipopolisacárido (LPS) corresponde a aproximadamente 1-10 UE.
Como se usan en el presente documento, los términos «función» y «funcional» y similares se refieren a una función biológica, enzimática o terapéutica.
«Homología» se refiere al porcentaje de aminoácidos que son idénticos o constituyen sustituciones conservativas. La homología se puede determinar usando programas de comparación de secuencias tales como GAP (Deveraux y col., Nucleic Acids Research. 12, 387-395, 1984). De esta manera, las secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente a las citadas en el presente documento podrían compararse mediante la inserción de huecos en el alineamiento, determinándose dichos huecos, por ejemplo, mediante el algoritmo de comparación usado por GAP.
Un enlazador «fisiológicamente estable» se refiere a un enlazador que es sustancialmente estable en agua o en condiciones fisiológicas (por ejemplo, condiciones de cultivo in vivo, in vitro, por ejemplo, en presencia de una o más proteasas), es decir, no experimenta una reacción de degradación (por ejemplo, una reacción degradable enzimáticamente) en condiciones fisiológicas en cualquier grado apreciable durante un período de tiempo prolongado. En general, un enlazador fisiológicamente estable es uno que muestra una tasa de degradación de menos de aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 3 %, aproximadamente el 4 % o aproximadamente el 5 % por día en condiciones fisiológicas.
Por «aislado» se entiende material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. Por ejemplo, un «péptido aislado» o un «polipéptido aislado» y similares, como se usan en el presente documento, incluye el aislamiento y/o la purificación in vitro de una molécula peptídica o polipeptídica a partir de su entorno celular natural, y a partir de la asociación con otros componentes de la célula; es decir, no está significativamente asociado con sustancias in vivo.
La expresión «concentración efectiva semimáxima» o «CE50» se refiere a la concentración de un conjugado HRS-Fc descrito en el presente documento donde induce una respuesta a mitad de camino entre el valor inicial y el máximo después de cierto tiempo de exposición especificado; la CE50 de una curva de respuesta a la dosis graduada, por lo tanto, representa la concentración de un compuesto a la que se observa el 50 % de su efecto máximo. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la CE50 de un agente proporcionado en el presente documento se indica en relación con una actividad «no canónica», como se ha indicado anteriormente. La CE50 también representa la concentración plasmática requerida para obtener el 50 % de un efecto máximo in vivo. De manera similar, la «CE90» se refiere a la concentración de un agente o composición a la cual se observa el 90 % de su efecto máximo. La «CE90» se puede calcular a partir de la «CE50» y la pendiente de Hill, o se puede determinar a partir de los datos directamente, usando el conocimiento de rutina en la técnica. En algunas realizaciones de la presente descripción, el valor de CE50 de un conjugado HRS-Fc es inferior a aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19,20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nM. Preferentemente, la composición bioterapéutica tendrá un valor de CE50 de aproximadamente 1 nM o menos.
La «semivida» de un conjugado HRS-Fc puede referirse al tiempo que tarda el conjugado en perder la mitad de su actividad farmacológica, fisiológica u otra, con respecto dicha actividad en el momento de la administración al suero o tejido de un organismo, o con respecto a cualquier otro punto temporal definido. «Semivida» también puede referirse al tiempo que tarda la cantidad o la concentración de un conjugado HRS-Fc en reducirse a la mitad de la cantidad de partida administrada al suero o tejido de un organismo, con respecto a dicha cantidad o concentración en el momento de la administración al suero o tejido de un organismo, o con respecto a cualquier otro punto temporal definido. La semivida puede medirse en suero y/o en uno o más tejidos seleccionados.
El término «enlace», «enlazador», «resto enlazador» o «L» se usa en el presente documento para referirse a un enlazador que se puede usar para separar un polipéptido de HRS de otro polipéptido de HRS y/o de una o más regiones Fc. El enlazador puede ser fisiológicamente estable o puede incluir un enlazador liberable tal como un enlazador enzimáticamente degradable (por ejemplo, enlazadores escindibles proteolíticamente). En ciertos aspectos de la presente descripción, el enlazador puede ser un enlazador peptídico, por ejemplo, como parte de una proteína de fusión HRS-Fc. En algunos aspectos de la presente descripción, el enlazador puede ser un enlazador no peptídico.
Los términos «modular» y «alterar» incluyen «aumentar», «mejorar» o «estimular», así como «disminuir» o «reducir», típicamente en una cantidad o grado estadísticamente significativo o fisiológicamente significativo con respecto a un control. Una cantidad «aumentada», «estimulada» o «mejorada» es típicamente una cantidad «estadísticamente significativa», y puede incluir un aumento de 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluyendo todos los números enteros y puntos decimales intermedios y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) la cantidad producida sin composición (por ejemplo, en ausencia de cualquiera de los conjugados HRS-Fc de la presente descripción) o una composición de control, muestra o sujeto de prueba. Una cantidad «disminuida» o «reducida» es típicamente una cantidad «estadísticamente significativa», y puede incluir un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de disminución en la cantidad producida sin composición (la ausencia de un agente o compuesto) o una composición de control, incluyendo todos los números enteros intermedios. Como un ejemplo no limitante, un control en la comparación de actividades canónicas y no canónicas podría incluir el conjugado HRS-Fc de interés en comparación con un polipéptido de HRS no modificado o modificado de forma diferente correspondiente (secuencialmente). Otros ejemplos de comparaciones y cantidades «estadísticamente significativas» se describen en el presente documento.
Actividad «no canónica» como se usa en el presente documento, se refiere en general a i) una nueva actividad no de aminoacilación que posee el polipéptido de HRS de la descripción que no posee en ningún grado significativo la proteína parental de longitud completa nativa intacta, o ii) una actividad que poseía la proteína parental de longitud completa nativa intacta, donde el polipéptido de HRS exhibe una actividad específica significativamente mayor (por ejemplo, al menos un 20 % mayor) con respecto a la actividad no canónica en comparación con la proteína parental de longitud completa nativa intacta, o exhibe la actividad en un nuevo contexto; por ejemplo, aislando la actividad de otras actividades que posee la proteína parental de longitud completa nativa intacta. En el caso de los polipéptidos de HRS, los ejemplos no limitantes de actividades no canónicas incluyen la señalización extracelular incluyendo la modulación de la proliferación celular, modulación de la migración celular, modulación de la diferenciación celular (por ejemplo, hematopoyesis, neurogénesis, miogénesis, osteogénesis y adipogénesis), modulación de la transcripción génica, modulación de la apoptosis u otras formas de muerte celular, modulación de la señalización celular, modulación de la captación o secreción celular, modulación de la angiogénesis, modulación de la unión celular, modulación del metabolismo celular, modulación de la producción o actividad de citocinas, modulación de la actividad del receptor de citocinas, modulación de la inflamación, inmunogenicidad y similares.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, la «pureza» de cualquier agente dado (por ejemplo, conjugado HRS-Fc, tal como una proteína de fusión) en una composición puede definirse específicamente. Por ejemplo, ciertas composiciones pueden comprender un agente que es al menos un 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % puro, incluyendo todos los decimales intermedios, de acuerdo con lo medido, por ejemplo y en absoluto limitante, mediante cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC), una forma bien conocida de cromatografía en columna usada frecuentemente en bioquímica y química analítica para separar, identificar y cuantificar compuestos.
Sin desear quedar ligado a teoría particular alguna, un «enlazador enzimáticamente degradable» significa un enlazador, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que está sujeta a degradación por una o más enzimas, por ejemplo, peptidasas o proteasas.
Los términos «polipéptido» y «proteína» se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos y a variantes y análogos sintéticos del mismo. Por lo tanto, estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos donde uno o más residuos de aminoácidos son aminoácidos de origen no natural sintéticos, tales como un análogo químico de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural.
Un «enlazador liberable» incluye, aunque sin limitarse a, un enlazador fisiológicamente escindible y un enlazador enzimáticamente degradable. Por lo tanto, un «enlazador liberable» es un enlazador que puede experimentar hidrólisis espontánea, o escisión por algún otro mecanismo (por ejemplo, catalizada por una enzima, catalizada por un ácido, catalizada por una base, y así sucesivamente) en condiciones fisiológicas. Por ejemplo, un «enlazador liberable» puede implicar una reacción de eliminación que tiene una abstracción de base de un protón, (por ejemplo, un átomo de hidrógeno ionizable, Ha ), como fuerza impulsora. Para los fines del presente documento, un «enlazador liberable» es sinónimo de un «enlazador degradable». En realizaciones particulares de la presente descripción, un enlazador liberable tiene una semivida a pH 7,4, 25 °C, por ejemplo, un pH fisiológico, temperatura del cuerpo humano (por ejemplo, in vivo), de aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 hora, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas o aproximadamente 96 horas o más.
Por «estadísticamente significativo», se entiende que es poco probable que el resultado se haya producido por casualidad. La significación estadística puede determinarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Las medidas de significación comúnmente usadas incluyen el valor p, que es la frecuencia o probabilidad con la que se produciría el acontecimiento observado, si la hipótesis nula fuera cierta. Si el valor de p obtenido es menor que el nivel de significación, entonces se rechaza la hipótesis nula. En casos simples, el nivel de significación se define a un valor p de 0,05 o menos.
El término «solubilidad» se refiere a la propiedad de un polipéptido conjugado HRS-Fc proporcionado en el presente documento para disolverse en un disolvente líquido y formar una solución homogénea. La solubilidad se expresa típicamente como una concentración, ya sea por masa de soluto por unidad de volumen de disolvente (g de soluto por kg de disolvente, g por dl (100 ml), mg/ml, etc.), molaridad, molalidad, fracción molar u otras descripciones similares de concentración. La cantidad máxima en equilibrio de soluto que puede disolverse por cantidad de disolvente es la solubilidad de ese soluto en ese disolvente en las condiciones especificadas, incluyendo temperatura, presión, pH y la naturaleza del disolvente. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la solubilidad se mide a pH fisiológico u otro pH, por ejemplo, a pH 5,0, pH 6,0, pH 7,0 o pH 7,4. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la solubilidad se mide en agua o un tampón fisiológico tal como PBS o NaCl (con o sin NaP). En realizaciones específicas de la presente descripción, la solubilidad se mide a un pH relativamente más bajo (por ejemplo, pH 6,0) y una sal relativamente más alta (por ejemplo, NaCl 500 mM y NaP 10 mM). En ciertas realizaciones de la presente descripción, la solubilidad se mide en un fluido (disolvente) biológico tal como sangre o suero. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la temperatura puede ser aproximadamente temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25 °C) o aproximadamente temperatura corporal (37 °C). En ciertas realizaciones de la presente descripción, un polipéptido conjugado HRS-Fc tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o 30 mg/ml a temperatura ambiente o a 37 °C.
Un «sujeto», como se usa en el presente documento, incluye cualquier animal que exhibe un síntoma, o que esté en riesgo de exhibir un síntoma, que pueda tratarse o diagnosticarse con un polipéptido conjugado HRS-Fc de la presente descripción. Los sujetos (pacientes) adecuados incluyen animales de laboratorio (tales como ratón, rata, conejo o cobaya), animales de granja y animales domésticos o mascotas (tales como un gato o un perro). Se incluyen primates no humanos y, preferentemente, pacientes humanos.
«Sustancialmente» o «esencialmente» significa casi total o completamente, por ejemplo, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de alguna cantidad dada.
«Tratamiento» o «tratar», como se usa en el presente documento, incluye cualquier efecto deseable sobre los síntomas o la patología de una enfermedad o afección, y puede incluir incluso cambios o mejoras mínimos en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que está siendo tratada. «Tratamiento» o «tratar» no necesariamente indica la erradicación o curación completa de la enfermedad o afección, o síntomas asociados de la misma. El sujeto que recibe este tratamiento es cualquier sujeto que lo necesite. Marcadores ejemplares de mejoría clínica serán evidentes para los expertos en la materia.
Polipéptidos derivados de histidil-ARNt sintetasa
Realizaciones de la presente descripción se refieren a conjugados de polipéptidos de histidil-ARNt sintetasa («polipéptidos de HRS o de HisRS»)-Fc, incluidos conjugados HRS-Fc que comprenden secuencias de HRS de tipo silvestre, secuencias de origen natural, secuencias de origen no natural y/o variantes y fragmentos de las mismas. Los ejemplos específicos de polipéptidos derivados de HRS incluyen aquellos con contenido de cisteína alterado. Las histidil-ARNt sintetasas pertenecen a la familia de la ARNt sintetasa de clase II, que tiene tres motivos de secuencia altamente conservados. Las ARNt sintetasas de clase I y II son ampliamente reconocidas como responsables de la unión específica de un aminoácido a su ARNt análogo en una reacción de dos etapas: el aminoácido (AA) es activado primero por ATP para formar AA-AMP y a continuación es transferido al extremo aceptor del ARNt. Las histidil-ARNt sintetasas de longitud completa existen típicamente como un homodímero citosólico o una forma mitocondrial sometida a splicing de forma alternativa.
Más recientemente, se ha establecido que algunos fragmentos biológicos, o isoformas sometidas a splicing de forma alternativa de histidil-ARNt sintetasas eucariotas (fisiocrinas, o polipéptidos de HRS), o en algunos contextos la sintetasa intacta, modulan ciertas vías de señalización celular, o tienen propiedades antiinflamatorias. Estas actividades, que son distintas del papel clásico de las ARNt sintetasas en la síntesis de proteínas, se denominan colectivamente en el presente documento «actividades no canónicas». Estas fisiocrinas pueden producirse naturalmente mediante splicing alternativo o proteólisis, y pueden actuar de forma autónoma celular (es decir, dentro de la célula huésped) o de manera autónoma no celular (es decir, fuera de la célula huésped) para regular diversos mecanismos homeostáticos. Por ejemplo, como se proporciona en la presente descripción, los polipéptidos de HRS tales como el fragmento N-terminal de histidil-ARNt sintetasa (por ejemplo, HRS 1-48, HRS 1-60) son capaces, entre otras cosas, de ejercer una señal antiinflamatoria bloqueando la migración, activación o diferenciación de células inflamatorias (por ejemplo, monocitos, macrófagos, linfocitos T, linfocitos B) asociadas con los sitios de inflamación activa in vivo. Además, ciertas mutaciones o eliminaciones (por ejemplo, HRS 1-506, HRS 1-60) relativas a la secuencia del polipéptido de HRS de longitud completa confieren un aumento de las actividades y/o una mejora de las propiedades farmacológicas. Las secuencias de ciertos polipéptidos de HRS ejemplares se proporcionan en la tabla D1.
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Se han secuenciado una serie de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de histidil-ARNt sintetasa y variantes de origen natural del gen humano, y se sabe en la técnica que son al menos parcialmente funcionalmente intercambiables. Varias de dichas variantes de histidil-ARNt sintetasa (es decir, SNP de histidil ARNt sintetasa representativos) se muestran en la tabla D2.
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Adicionalmente, existen homólogos y ortólogos del gen humano en otras especies, como se enumeran en la tabla D3 y, por lo tanto, sería un asunto de rutina seleccionar un aminoácido de origen natural o una variante de nucleótido presente en un SNP, u otro homólogo de origen natural en lugar de cualquiera de las secuencias polipeptídicas de HRS humana enumeradas en las tablas D1, D4-D6 o D8.
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Por consiguiente, en cualquiera de los procedimientos, composiciones terapéuticas y kits de la descripción, las expresiones «polipéptido de HRS» «proteína de HRS» o «fragmento de proteína de HRS» incluyen todas las formas de origen natural y sintéticas de la histidil-ARNt sintetasa que posee una actividad no canónica, tal como una actividad antiinflamatoria y/o conserva al menos un epítopo que reacciona específicamente de forma cruzada con un autoanticuerpo o un linfocito T autorreactivo de un sujeto con una enfermedad asociada con autoanticuerpos para histidil-ARNt sintetasa. Dichos polipéptidos de HRS incluyen la proteína humana de longitud completa, así como los péptidos de HRS derivados de la proteína de longitud completa enumerados en las tablas D1, D3-D6 o D8. En algunas realizaciones de la presente descripción, la expresión polipéptido de HRS se refiere a una secuencia polipeptídica derivada de histidil-ARNt sintetasa humana (SEQ ID NO:1 en la tabla D1) de aproximadamente 45 o 50 a aproximadamente 250 aminoácidos de longitud. Se apreciará que, en cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento, el ácido N-terminal del polipéptido de HRS (por ejemplo, el Met N-terminal) se puede eliminar de cualquiera de las secuencias enumeradas en las tablas D1, D3-D6 o D8 cuando se crea la proteína de fusión o el conjugado.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS está entre aproximadamente 20-509, 20­ 508, 20-507, 50-506, 20-505, 50-504, 20-503, 20-502, 20-501, 20-500, 20-400, 20-300, 20-250, 20-200 o 20-100 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, en realizaciones específicas de la presente descripción, el polipéptido está entre aproximadamente 20-25, 20-35, 20-40, 20-45, 20-55, 20-60, 20-65, 20-70, 20-75, 20-80, 20-85, 20-90, 20-95 o 20-100 aminoácidos de longitud, o aproximadamente 30-35, 30-40, 30-45, 30-55, 30-60, 30- 65, 30-70, 30-75, 30-80, 30-85, 30-90, 30-95 o 30-100 aminoácidos de longitud, o aproximadamente 40-45, 40-55, 40-60, 40 -65, 40-70, 40­ 75, 40-80, 40-85, 40-90, 40-95 o 40-100 aminoácidos de longitud, o aproximadamente 45-50, 45-55, 50-55, 50-60, 50-65, 50-70, 50-75, 50-80, 50-85, 50-90, 50-95 o 50-100 aminoácidos de longitud, o aproximadamente 60-65, 60­ 70, 60-75, 60-80, 60-85, 60-90, 60-95 o 60-100 aminoácidos de longitud, o aproximadamente 70-75, 70-80, 70-85, 70-90, 70- 95 o 70-100 aminoácidos de longitud, o aproximadamente 80-85, 80-90, 80-95 u 80-100 aminoácidos de longitud. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS tiene aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38., 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508 o 509 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS no compite significativamente por la unión del autoanticuerpo asociado a la enfermedad (por ejemplo, anticuerpo Jo-1) a la histidil-ARNt sintetasa de tipo silvestre en un ELISA competitivo hasta una concentración de aproximadamente 1 a 5 x 10'7 M, o superior. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS tiene una afinidad más baja por el autoanticuerpo asociado a la enfermedad que la histidil-ARNt sintetasa de tipo silvestre (SEQ ID NO:1) de acuerdo con se mide en un ELISA competitivo. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS tiene una afinidad aparente por el autoanticuerpo asociado a la enfermedad (por ejemplo, el anticuerpo Jo-1) que es al menos aproximadamente 10 veces menos, o al menos aproximadamente 20 veces menos, o al menos aproximadamente 50 veces menos, o al menos aproximadamente 100 veces menos que la afinidad del autoanticuerpo asociado a la enfermedad por el ser humano de tipo silvestre (SEQ ID NO:1).
Por lo tanto, todos dichos homólogos, ortólogos e isoformas de origen natural o sintéticas de histidil-ARNt sintetasa (por ejemplo, cualquiera de las proteínas enumeradas en las tablas D1, D3-D6 o D8) se incluyen en cualquiera de los procedimientos, conjugados HRS-Fc, kits y composiciones de la descripción, siempre que conserven al menos un epítopo que reacciona específicamente de forma cruzada con un autoanticuerpo o linfocito T autorreactivo de un sujeto con una enfermedad asociada con autoanticuerpos para histidil ARNt sintetasa, o posea una actividad no canónica. Los polipéptidos de HRS pueden estar en su forma nativa, es decir, como diferentes variantes tal como aparecen en la naturaleza en diferentes especies que pueden verse como variantes funcionalmente equivalentes de histidil-ARNt sintetasa humana, o pueden ser sus derivados naturales funcionalmente equivalentes, que pueden diferir en su secuencia de aminoácidos, por ejemplo, por truncamiento (por ejemplo, desde el extremo N o C o ambos) u otras eliminaciones, adiciones, inserciones, sustituciones o modificaciones postraduccionales de aminoácidos. Los derivados químicos de origen natural, incluyendo modificaciones postraduccionales y productos de degradación de cualquier polipéptido de HRS, también se incluyen específicamente en cualquiera de los procedimientos y composiciones de la descripción, que incluyen, por ejemplo, piroglutamilo, isoaspartilo, variantes proteolíticas, fosforiladas, glucosiladas, oxidadas, isomerizadas y desaminadas de un polipéptido de HRS o conjugado HRS-Fc. Los polipéptidos de HRS y los conjugados HRS-Fc también pueden estar compuestos por aminoácidos de origen natural y/o aminoácidos de origen no natural, como se describe en el presente documento.
Como se ha señalado anteriormente, las realizaciones de la presente descripción incluyen todos los homólogos, ortólogos e isoformas de origen natural de histidil-ARNt sintetasa (por ejemplo, cualquiera de las proteínas enumeradas en o derivables de, o sus correspondientes ácidos nucleicos enumerados en, las tablas o la lista de secuencias) y «variantes» de estos polipéptidos de HRS de referencia. La mención «variante» polipeptídica se refiere a polipéptidos que se distinguen de un polipéptido de HRS de referencia por la adición, eliminación y/o sustitución de al menos un residuo de aminoácido, y que típicamente conservan (por ejemplo, imitan) o modulan (por ejemplo, antagonizan) una o más actividades no canónicas de un polipéptido de HRS de referencia. Las variantes también incluyen polipéptidos que se han modificado mediante la adición, eliminación y/o sustitución de al menos un residuo de aminoácido para tener una estabilidad mejorada u otras propiedades farmacéuticas.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, una variante polipeptídica se distingue de un polipéptido de referencia por una o más sustituciones, que pueden ser conservativas o no conservativas, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la variante polipeptídica comprende sustituciones conservativas y, a este respecto, se entiende bien en la técnica que algunos aminoácidos pueden cambiarse a otros con propiedades ampliamente similares sin cambiar la naturaleza de la actividad del polipéptido. En algunas realizaciones de la presente descripción, la variante comprende uno o más residuos conservados, incluyendo uno o más de Leu7, Gln14, Gly15, Val18, Arg19, Leu21, Lys22, Lys25, Ala26, Val35, Leu38, Leu39, Leu41 y Lys 42 (basándose en la numeración de la SEQ ID NO:1).
Los ejemplos específicos de variantes de polipéptidos de HRS útiles en cualquiera de los procedimientos y composiciones de la descripción incluyen polipéptidos de HRS de longitud completa, o truncamientos o variantes de splicing de los mismos (por ejemplo, cualquiera de las proteínas enumeradas o derivables de las tablas o la lista de secuencias) que i) conservan la actividad no canónica detectable y/o conservan al menos un epítopo que reacciona específicamente de forma cruzada con un autoanticuerpo o linfocito T autorreactivo de un sujeto con una enfermedad asociada con autoanticuerpos para histidil-ARNt sintetasa, y ii) tienen una o más inserciones, sustituciones, eliminaciones y/o truncamientos de aminoácidos adicionales. En ciertas realizaciones de la presente descripción, un polipéptido variante incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %. 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o más de identidad o similitud de secuencia con una secuencia correspondiente de un polipéptido de HRS de referencia, como se describe en el presente documento (por ejemplo, cualquiera de las proteínas enumeradas en o derivables de las tablas o la lista de secuencias) y conserva sustancialmente la actividad no canónica de ese polipéptido de referencia. También se incluyen secuencias que difieren de las secuencias de HRS de referencia por la adición, eliminación o sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16., 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o más aminoácidos, pero que conservan las propiedades del polipéptido de HRS de referencia. En ciertas realizaciones de la presente descripción, las adiciones o eliminaciones de aminoácidos se producen en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal del polipéptido de HRS de referencia. En ciertas realizaciones de la presente descripción, las adiciones de aminoácidos incluyen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más residuos de tipo silvestre (es decir, del polipéptido de HRS de longitud completa correspondiente) que están próximos al extremo C-terminal y/o al extremo N-terminal del polipéptido de HRS de referencia.
En algunas realizaciones de la presente descripción, los polipéptidos de HRS comprenden un fragmento polipeptídico de la histidil ARNt sintetasa de longitud completa de aproximadamente 45 a 250 o aproximadamente 50 a 250 aminoácidos, que comprende, consiste o consiste esencialmente en los aminoácidos de la secuencia de polipéptido de HRS expuesta en una o más de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente en los residuos 1­ 141, 1-408, 1-113 o 1-60 de la SEQ ID NO:1. En algunos aspectos de la presente descripción, el polipéptido de HRS es una variante de splicing que comprende, consiste o consiste esencialmente en los residuos 1-60+175-509, 1­ 60+211-509 o 1-60+101-509 de la SEQ ID NO:1. En aspectos particulares de la presente descripción, el polipéptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente en los residuos 1-48 o 1-506 de la SEQ ID NO:1.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, un polipéptido de HRS de la descripción comprende, consiste o consiste esencialmente en el fragmento activo mínimo de un polipéptido de HRS de longitud completa capaz de modular una actividad antiinflamatoria in vivo o que tiene actividades de bloqueo de anticuerpos o linfocitos T autorreactivos. En un aspecto de la presente descripción, dicho fragmento activo mínimo comprende, consiste o consiste esencialmente en el dominio WHEP (es decir, aproximadamente los aminoácidos 1-43 de la SEQ ID NO:1). En algunos aspectos de la presente descripción, el fragmento activo mínimo comprende, consiste o consiste esencialmente en el dominio de aminoacilación (es decir, aproximadamente los aminoácidos 54-398 de la SEQ ID NO:1). En algunos aspectos de la presente descripción, el fragmento activo mínimo comprende, consiste o consiste esencialmente en el dominio de unión anticodón (es decir, aproximadamente los aminoácidos 406-501 de la SEQ ID NO:1). Otros fragmentos activos ejemplares se muestran en la tabla D4 a continuación.
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Para algunos polipéptidos de HRS, aproximadamente o al menos aproximadamente 20-40, 20-45, 20-50, 20-55, o 20-60, 20-65, o 20-67 aminoácidos contiguos o no contiguos del polipéptido de HRS son de los aminoácidos 1-67 de la SEQ ID NO:1. En realizaciones particulares de la presente descripción, aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 o 67 aminoácidos contiguos o no contiguos del polipéptido de HRS son de los aminoácidos 1-67 de la SEQ ID NO:1. El polipéptido de HRS puede comprender uno o más de un dominio WHEP, un dominio de aminoacilación, un dominio de unión anticodón, o cualquier combinación de los mismos. En realizaciones particulares de la presente descripción, el polipéptido de HRS carece de un dominio de aminoacilación funcional. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido consiste esencialmente en el dominio WHEP de HRS humana. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, la orientación o conformación única del dominio WHEP en ciertos polipéptidos de HRS puede contribuir a las actividades mejoradas no canónicas y/o de bloqueo de anticuerpos observadas en estas proteínas.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de dominio WHEP de HRS humana. En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia del dominio WHEP de HRS humana está definida por ciertos residuos conservados. Por ejemplo, en algunos aspectos de la presente descripción, el polipéptido de HRS comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de consenso del dominio WHEP de HRS humana en la tabla D5 a continuación.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, o todos los 29 aminoácidos de un enlazador flexible que conecta el dominio mínimo a una proteína heteróloga (por ejemplo, dominio Fc), o variante de splicing.
Las menciones «identidad de secuencia» o, por ejemplo, que comprende una «secuencia 50 % idéntica a», como se usan en el presente documento, se refieren al grado en que las secuencias son idénticas nucleótido por nucleótido o aminoácido por aminoácido en una ventana de comparación. Por lo tanto, un «porcentaje de identidad de secuencia» se puede calcular comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) se produce en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
Las expresiones usadas para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polipéptidos incluyen «secuencia de referencia», «ventana de comparación», «identidad de secuencia», «porcentaje de identidad de secuencia» e «identidad sustancial». Una «secuencia de referencia» tiene al menos 12 pero con frecuencia de 15 a 18 y a menudo al menos 25 unidades monoméricas, incluyendo nucleótidos y residuos de aminoácidos, de longitud. Debido a que dos polipéptidos pueden comprender, cada uno, (1) una secuencia (es decir, solo una parte de la secuencia polipeptídica completa) que es similar entre los dos polipéptidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polipéptidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polipéptidos se realizan típicamente comparando secuencias de los dos polipéptidos en una «ventana de comparación» para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una «ventana de comparación» se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 donde se compara una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que la dos secuencias están alineadas de manera óptima. La ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de aproximadamente el 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni eliminaciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse mediante implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en la versión 7.0 del paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EE. UU.) o por inspección y el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el porcentaje más alto de homología en la ventana de comparación) generado por cualquiera de los diversos procedimientos seleccionados. También se puede hacer referencia a la familia de programas BLAST como se divulga, por ejemplo, por Altschul y col., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 3389. Una discusión detallada del análisis de secuencias se puede encontrar en la Unidad 19.3 del documento Ausubel y col., «Current Protocols in Molecular Biology», John Wiley & Sons Inc., 1994-1998, Capítulo 15.
Los cálculos de similitud de secuencia o identidad de secuencia entre secuencias (los términos se usan de manera intercambiable en el presente documento) se pueden realizar de la siguiente manera. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias pueden alinearse para fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico para un alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas se pueden ignorar con fines de comparación). En ciertas realizaciones de la presente descripción, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines de comparación es al menos el 30 %, preferentemente al menos el 40 %, más preferentemente al menos el 50 %, 60 %, e incluso más preferentemente al menos el 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación se comparan los residuos de aminoácidos o los nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición.
El porcentaje de identidad entre las dos secuencias está en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.
La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden conseguir usando un algoritmo matemático. En una realización preferida de la presente descripción, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, (1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realización preferida de la presente descripción, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 o 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto de parámetros particularmente preferido (y el que debe usarse a menos que se especifique lo contrario) es una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización por extensión de hueco de 4 y una penalización de hueco por desplazamiento del marco de 5. El porcentaje de identidad entre dos secuencias aminoácidos o nucleótidos también se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (1989, Cabios, 4: 11-17) que se incorporó al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.
Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas descritas en el presente documento pueden usarse como una «secuencia de consulta» para realizar una búsqueda en bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden realizar usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, y col., (1990, J. Mol. Biol, 215: 403-10). Las búsquedas de nucleótidos en BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la presente descripción. Las búsquedas de proteínas en BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteínas de la descripción. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparación, puede usarse Gapped BLAST como se describe en Altschul y col. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).
En ciertas realizaciones de la presente descripción, los polipéptidos variantes difieren de las secuencias de referencia de HRS correspondientes en al menos un 1 % pero menos del 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de los residuos. Si esta comparación requiere alineamiento, las secuencias deben alinearse para una máxima similitud. Las secuencias
«en bucle» de las eliminaciones o inserciones, o faltas de correspondencia, se consideran diferencias. Las diferencias son, adecuadamente, diferencias o cambios en un residuo no esencial o una sustitución conservativa. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el peso molecular de un polipéptido de HRS variante difiere del peso del polipéptido de HRS de referencia en aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %. 9 %, 10 %,
11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 % o más.
También se incluyen «fragmentos» biológicamente activos de los polipéptidos de HRS de referencia, es decir, fragmentos biológicamente activos de los fragmentos de proteína de HRS. Los fragmentos representativos biológicamente activos generalmente participan en una interacción, por ejemplo, una interacción intramolecular o intermolecular. Una interacción intermolecular puede ser una interacción de unión específica o una interacción enzimática. Una interacción intermolecular puede ser entre un polipéptido de HRS y un socio de unión celular, tal como un receptor celular u otra molécula huésped que participa en la actividad no canónica del polipéptido de HRS.
Un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de HRS de referencia puede ser un fragmento polipeptídico que tiene, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50,
55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300,
320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 38, 359,
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361, 362, 363, 364, 380, 400, 450, 500, 505, o más aminoácidos contiguos o no contiguos, incluyendo todos los números enteros (p ejemplo, 101, 102, 103) e intervalos (por ejemplo, 50-100, 50-150, 50-200) intermedios, de las secuencias de aminoácidos expuestas en cualquiera de los polipéptidos de HRS de referencia descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, un fragmento biológicamente activo comprende una secuencia, dominio o motivo relacionado con la actividad no canónica. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la región C-terminal o N-terminal de cualquier polipéptido de HRS de referencia puede truncarse en aproximadamente
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120,
130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más aminoácidos, o en aproximadamente
10-50, 20-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500 o más aminoácidos, incluyendo todos los números enteros e intervalos intermedios (por ejemplo, 101, 102, 103, 104, 105), siempre que el polipéptido de HRS truncado conserve la actividad no canónica del polipéptido de referencia. Ciertos polipéptidos de HRS truncados ejemplares y una secuencia de consenso del dominio WHEP de HRS humana se muestran en la tabla D5 a continuación.
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Se apreciará que, en cualquiera de los conjugados HRS-Fc de la descripción, el ácido N-terminal del polipéptido de HRS (por ejemplo, el Met N-terminal) puede eliminarse adicionalmente de cualquiera de los polipéptidos de HRS truncados ejemplares u otras secuencias de HRS descritas en el presente documento.
Típicamente, el fragmento biológicamente activo tiene no menos de aproximadamente el 1 %, 10 %, 25 % o 50 % de una actividad del polipéptido de HRS de referencia biológicamente activo (es decir, actividad no canónica) del cual se deriva. Los procedimientos ejemplares para medir dichas actividades no canónicas se describen en los ejemplos. En algunas realizaciones de la presente descripción, las proteínas de HRS, variantes y fragmentos biológicamente activos de las mismas, se unen a uno o más socios de unión celular con una afinidad de al menos aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,60,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 100 o 150 nM. En algunas realizaciones de la presente descripción, la afinidad de unión de un fragmento de proteína de HRS por un socio de unión celular seleccionado, particularmente un socio de unión que participa en una actividad no canónica, puede ser más fuerte que la del polipéptido de HRS de longitud completa correspondiente o una variante del polipéptido de HRS sometida a splicing de forma alternativa, en al menos aproximadamente 1,5x, 2x, 2,5x, 3x, 3,5x, 4x, 4,5x, 5x, 6x, 7x,8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 700x, 800x, 900x, 1000x o más (incluyendo todos los números enteros intermedios).
Como se ha señalado anteriormente, un polipéptido de HRS puede alterarse de diversas maneras, incluyendo las sustituciones, eliminaciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los procedimientos para dichas manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de HRS de referencia se pueden preparar mediante mutaciones en el ADN. Los procedimientos para la mutagenia y las alteraciones de la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 82: 488-492), Kunkel y col., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), Patente de Estados Unidos N.° 4.873.192, Watson, J. D. y col, («Molecular Biology of the Gene», Cuarta Edición, Benjamin/Cummings, Menlo Park, California, 1987) y las referencias citadas en el mismo. En el modelo de Dayhoff y col., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC) se puede encontrar orientación sobre las sustituciones apropiadas de aminoácidos que no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés.
Los polipéptidos de HRS truncados y/o variantes biológicamente activos pueden contener sustituciones de aminoácidos conservativas en diversas ubicaciones a lo largo de su secuencia, en comparación con un residuo de aminoácido de HRS de referencia, y dichas sustituciones adicionales pueden mejorar aún más la actividad o estabilidad de los polipéptidos de HRS con un contenido de cisteína alterado. Una «sustitución de aminoácidos conservativa» es aquella donde el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, que en general se pueden subdividir de la siguiente manera:
Ácidos: el residuo tiene una carga negativa debido a la pérdida de iones H a pH fisiológico y el residuo es atraído por una solución acuosa para buscar las posiciones superficiales en la conformación de un péptido donde está contenido cuando el péptido está en medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral ácida incluyen ácido glutámico y ácido aspártico.
Básicos: el residuo tiene una carga positiva debido a la asociación con el ion H a pH fisiológico o dentro de una o dos unidades de pH del mismo (por ejemplo, histidina) y el residuo es atraído por una solución acuosa para buscar las posiciones superficiales en la conformación de un péptido donde está contenido cuando el péptido está en medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral básica incluyen arginina, lisina e histidina.
Cargados: los residuos están cargados a pH fisiológico y, por lo tanto, incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas o básicas (es decir, ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina e histidina).
Hidrófobos: los residuos no están cargados a pH fisiológico y el residuo es repelido por una solución acuosa para buscar las posiciones internas en la conformación de un péptido donde está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral hidrófoba incluyen tirosina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina y triptófano.
Neutros/polares: los residuos no están cargados a pH fisiológico, pero el residuo no es repelido lo suficiente por las soluciones acuosas de modo que buscara posiciones internas en la conformación de un péptido donde está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral neutra/polar incluyen asparagina, glutamina, cisteína, histidina, serina y treonina.
Esta descripción también caracteriza a ciertos aminoácidos como «pequeños», ya que sus cadenas laterales no son lo suficientemente grandes, incluso si faltan grupos polares, para conferir hidrofobicidad. Con la excepción de la prolina, los aminoácidos «pequeños» son aquellos con cuatro carbonos o menos cuando al menos un grupo polar está en la cadena lateral y tres carbonos o menos cuando no lo está. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral pequeña incluyen glicina, serina, alanina y treonina. El aminoácido secundario codificado por el gen, prolina, es un caso especial debido a sus efectos conocidos sobre la conformación secundaria de las cadenas peptídicas. La estructura de la prolina difiere de todos los otros aminoácidos naturales en que su cadena lateral está unida al nitrógeno del grupo a-amino, así como al carbono a. Se conocen varias matrices de similitud de aminoácidos en la técnica (véase, por ejemplo, matriz PAM120 y matriz PAM250 como es divulgado, por ejemplo, por Dayhoff y col., 1978, A model of evolutionary change in proteins). Matrices para determinar relaciones de distancia En M. O. Dayhoff, (ed.), Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, págs. 345-358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC; y por Gonnet y col., (Science, 256: 14430-1445, 1992), sin embargo, incluyen la prolina en el mismo grupo que la glicina, la serina, la alanina y la treonina. Por consiguiente, para los fines de la presente descripción, la prolina se clasifica como un aminoácido «pequeño».
El grado de atracción o repulsión requerido para la clasificación como polar o no polar es arbitrario y, por lo tanto, los aminoácidos específicamente contemplados por la descripción se han clasificado como uno u otro. La mayoría de los aminoácidos que no se mencionan específicamente pueden clasificarse basándose en el comportamiento conocido.
Los residuos de aminoácidos pueden ser subclasificados como clasificaciones autoexplicativas, cíclicas o no cíclicas, y aromáticas o no aromáticas, con respecto a los grupos sustituyentes de cadena lateral de los residuos, y como pequeños o grandes. El residuo se considera pequeño si contiene un total de cuatro átomos de carbono o menos, incluido el carbono del carboxilo, siempre que esté presente un sustituyente polar adicional; tres o menos si no. Los residuos pequeños siempre son, por supuesto, no aromáticos. Dependiendo de sus propiedades estructurales, los residuos de aminoácidos pueden estar en dos o más clases. Para los aminoácidos de proteínas naturales, la subclasificación de acuerdo con este esquema se presenta en la tabla A .
Tabla A: subclasificación de aminoácidos.
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La sustitución de aminoácidos conservativa también incluye agrupaciones basadas en cadenas laterales. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Por ejemplo, es razonable esperar que el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tenga un efecto considerable sobre las propiedades del polipéptido variante resultante. Si un cambio de aminoácido da como resultado un polipéptido de HRS truncado y/o variante funcional, se puede determinar fácilmente mediante el ensayo de su actividad no canónica, como se describe en el presente documento. Las sustituciones conservativas se muestran en la tabla B bajo el encabezado de sustituciones ejemplares. Las sustituciones de aminoácidos que están dentro del alcance de la presente descripción, se realizan, en general, seleccionando sustituciones que no difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto peptídico en el área de la sustitución, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, (c) la mayor parte de la cadena lateral, o (d) la función biológica. Después de que se introducen las sustituciones, las variantes se examinan para determinar la actividad biológica.
T l ^ B i i n m l r ^ min i
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Como alternativa, los aminoácidos similares para realizar sustituciones conservativas pueden agruparse en tres categorías basándose en la identidad de las cadenas laterales. El primer grupo incluye ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina, histidina, que tienen todos cadenas laterales cargadas; el segundo grupo incluye glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, glutamina, asparagina; y el tercer grupo incluye leucina, isoleucina, valina, alanina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina, como se describe en Zubay, G., Biochemistry, tercera edición, Wm.C. Brown Publishers (1993).
La estructura de RMN del dominio WHEP de HRS humana se ha determinado (véase Nameki y col., Acceso 1X59_A). Además, también se han determinado las estructuras cristalinas de HRS humana de longitud completa y un mutante de eliminación del dominio catalítico interno de HRS (HRSACD) (véase Xu y col., Structure. 20: 1470-7, 2012; y la solicitud de Estados Unidos N.° 61/674.639). Junto con la secuencia de aminoácidos primaria de HRS, estas descripciones físicas detalladas de la proteína proporcionan información precisa sobre los papeles desempeñados por aminoácidos específicos dentro de la proteína. Los expertos en la materia pueden usar esta información para identificar dominios conservados estructuralmente, regiones de enlace, estructuras secundarias tales como hélices alfa, aminoácidos superficiales o expuestos por disolvente, regiones internas o no expuestas, sitios catalíticos y superficies de interacción con ligandos, entre otras características estructurales. Dichos expertos pueden usar esa y otra información para diseñar fácilmente variantes de HRS que conservan o mejoran la actividad no canónica de interés, por ejemplo, conservando o alterando las características de los residuos de aminoácidos dentro o adyacentes a estas y otras características estructurales, tal como por ejemplo conservando o alterando la polaridad, el índice de hidropatía, la carga, el tamaño y/o el posicionamiento (es decir, hacia adentro, hacia afuera) de la o las cadenas laterales de aminoácidos seleccionadas con respecto a los residuos de tipo silvestre (véase, por ejemplo, Zaiwara y col., Mol Biotechnol. 51:67-102, 2012; Perona y Hadd, Biochemistry. 51:8705-29, 2012; Morin y col., Trends Biotechol. 29:159-66, 2011; Collins y col., Annu. Rev. Biophys. 40:81-98, 2011; y solicitud de Estados Unidos N.° 61/674.639).
Por lo tanto, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un polipéptido de HRS truncado y/o variante se reemplaza típicamente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Como alternativa, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de HRS, tal como mediante mutagenia de saturación, y los mutantes resultantes pueden seleccionarse para una actividad del polipéptido parental para identificar mutantes que conservan esa actividad. Después de la mutagenia de las secuencias codificantes, el péptido codificado se puede expresar de forma recombinante y se puede determinar la actividad del péptido. Un residuo de aminoácido «no esencial» es un residuo que se puede alterar de la secuencia de referencia de un polipéptido de realización de la presente descripción sin suprimir o alterar sustancialmente una o más de sus actividades no canónicas. Adecuadamente, la alteración no suprime sustancialmente una de estas actividades, por ejemplo, la actividad es al menos un 20 %, 40 %, 60 %, 70 % o 80 % 100 %, 500 %, 1000 % o más de la secuencia de HRS de referencia. Un residuo de aminoácido «esencial» es un residuo que, cuando se modifica a partir de la secuencia de referencia de un polipéptido de HRS, da como resultado la supresión de una actividad de la molécula parental de manera que menos del 20 % de la actividad de referencia está presente. Por ejemplo, dichos residuos de aminoácidos esenciales incluyen aquellos que se conservan en los polipéptidos de HRS a través de diferentes especies, incluyendo aquellas secuencias que se conservan en el o los sitios de unión activos o en el o los motivos de los polipéptidos de HRS de diversas fuentes.
Los ensayos para determinar la actividad antiinflamatoria, incluyendo las mediciones de rutina de la liberación de citocinas a partir de células in vitro, y los estudios en animales están bien establecidos en la técnica (véase, por ejemplo, Wittmann y col., J Vis Exp. (65):e4203. doi: 10.3791 / 4203, 2012; Feldman y col., Mol Cell. 47: 585-95, 2012; Clutterbuck y col., J. Proteomics. 74: 704-15, 2011, Giddings y Maitra, J Biomol Screen. 15: 1204-10, 2010; Wijnhoven y col., Glycoconj J. 25: 177-85, 2008; y Frow y col., Med Res Rev. 24: 276-98, 2004) y se pueden usar fácilmente para perfilar y optimizar la actividad antiinflamatoria. Un sistema experimental in vivo ejemplar también se describe en los ejemplos adjuntos.
En algunas realizaciones de la presente descripción, los polipéptidos de HRS pueden tener una o más sustituciones de cisteína, donde uno o más residuos de origen natural (no cisteína) están sustituidos con cisteína (por ejemplo, para alterar la estabilidad, para facilitar la conjugación basada en tiol de un fragmento Fc, para facilitar la unión a base de tiol de PEG u otras moléculas). En algunas realizaciones de la presente descripción, las sustituciones de cisteína están cerca del extremo N y/o el extremo C del polipéptido de HRS (por ejemplo, SEQ ID NOS:1-106, 170­ 181 o 185-191), u otras regiones expuestas en la superficie de un polipéptido de h Rs . Las realizaciones particulares de la presente descripción incluyen cuando uno o más residuos dentro de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos en relación con el extremo N y/o el extremo C de cualquiera de las SEQ ID NOS:1-106, 170-181 o 185-191 están sustituidos con un residuo de cisteína. En algunas realizaciones de la presente descripción, pueden añadirse residuos de cisteína al polipéptido de HRS a través de la creación de proteínas de fusión N o C-terminales. Dichas proteínas de fusión pueden ser de cualquier longitud, pero típicamente serán de aproximadamente 1-5, o aproximadamente de 5 a 10, de aproximadamente 10 a 20, o de aproximadamente 20 a 30 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones de la presente descripción, se prefiere la fusión al extremo C.
Realizaciones específicas ejemplares de la presente descripción de dichas proteínas modificadas con cisteína se muestran en la tabla D6, basándose en el polipéptido de HRS, HRS(1-60). Este enfoque es directamente aplicable a los polipéptidos de HRS de la tabla D5, y a otros polipéptidos de HRS descritos en el presente documento.
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En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido HRS puede incluir mutantes donde los residuos de cisteína endógenos o de origen natural se han mutado a aminoácidos alternativos, o se han eliminado. En algunas realizaciones de la presente descripción, la inserción o sustitución de uno o más residuos de cisteína en el polipéptido de HRS se puede combinar con la eliminación de otros residuos de cisteína reactivos expuestos en la superficie. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS puede comprender una o más sustituciones y/o eliminaciones en Cys83, Cys174, Cys191, Cys196, Cys224, Cys235, Cys379, Cys455, Cys507 y/o Cys509 (como se define mediante la SEQ ID NO:1), por ejemplo, para eliminar los residuos de cisteína de origen natural.
Las realizaciones específicas de la presente descripción incluyen cualquiera de las SEQ ID NOS:1-106, 170-181 o 185-191, o variantes o fragmentos de las mismas, que tienen en la mutación o eliminación de uno cualquiera o más de Cys83, Cys174, Cys191, Cys196, Cys224, Cys235, Cys379, Cys455, o la eliminación de Cys507 y Cys509, por ejemplo, mediante la eliminación de los 3 aminoácidos C-terminales (A507-509). Las mutaciones ejemplares en estas posiciones incluyen, por ejemplo, la mutación de cisteína a serina, alanina, leucina, valina o glicina. En ciertas realizaciones de la presente descripción, los residuos de aminoácidos para sustituciones de cisteína específicas pueden seleccionarse de sustituciones naturales que se encuentran en los ortólogos de HRS de otras especies y organismos. Las sustituciones ejemplares de este tipo se presentan en la Tabla D7.
Tabla D7
variación de secuencia de origen natural en posiciones ocupadas por residuos de cisteina en HRS humana
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En algunas realizaciones de la presente descripción, las cisternas de origen natural seleccionadas para la mutagenia se seleccionan basándose en su exposición en la superficie. Por consiguiente, en un aspecto de la presente descripción, los residuos de cisteína seleccionados para la sustitución se seleccionan de entre Cys224, Cys235, Cys507 y Cys509. En algunas realizaciones de la presente descripción, los últimos tres residuos (C-terminales) de la SEQ ID NO:1 se eliminan para eliminar los residuos 507 a 509. En algunas realizaciones de la presente descripción, las cisteínas se seleccionan para su mutación o eliminación para eliminar un par de cisteínas intramoleculares, por ejemplo Cys174 y Cys191.
Los ejemplos adicionales específicos de mutaciones/sustituciones de cisteína deseadas (indicadas en subrayado en negrita) para reducir los residuos de cisteína expuestos en la superficie incluydonde se enumeran a continuación en la tabla D8.
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En algunas realizaciones de la presente descripción, dichos mutantes sustituidos con cisteína se modifican para diseñar, insertar o introducir de otro modo un nuevo residuo de cisteína expuesta en la superficie en una posición expuesta en la superficie definida, donde el residuo introducido no interfiere sustancialmente en la actividad no canónica del polipéptido de HRS. Los ejemplos específicos incluyen, por ejemplo, la inserción (o reinserción) de residuos de cisteína adicionales en el extremo N o C de cualquiera de los polipéptidos de HRS con cisteína reducida descritos anteriormente. En algunas realizaciones de la presente descripción, la inserción de dichas cisteínas expuestas en la superficie N o C-terminales implica la reinserción del último 1, los últimos 2 o los últimos 3 aminoácidos C-terminales naturales de la HRS humana de longitud completa a una variante de cisteína reducida de un polipéptido de HRS, por ejemplo, la reinserción total o parcial de la secuencia CIC (Cys Ile Cys). Los ejemplos de mutantes reducidos de cisteína incluyen, por ejemplo, cualquier combinación de mutaciones (o la eliminación de) en los residuos Cys174, Cys191, Cys224 y Cys235, y o la eliminación o sustitución de Cys507 y Cys509 (basándose en la numeración de HRS humana de longitud completa (SEQ ID NO:1) en cualquiera de los polipéptidos de HRS de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 o las tablas D1, D3-D6 o D8.
Para algunos tipos de conjugación o unión específicas de sitio a moléculas heterólogas tales como las regiones Fc o PEG u otras moléculas heterólogas, los polipéptidos de HRS pueden tener una o más sustituciones de glutamina, donde uno o más residuos de origen natural (no glutamina) están sustituidos con glutamina, por ejemplo, para facilitar la unión catalizada por transglutaminasa de la o las moléculas al grupo amida de la glutamina. En algunas realizaciones de la presente descripción, las sustituciones de glutamina se introducen cerca del extremo N y/o el extremo C del polipéptido de HRS (por ejemplo, SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 o los polipéptidos de HRS de las tablas D1, D3-D6 o D8). Las realizaciones particulares de la presente descripción incluyen cuando uno o más residuos dentro de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos en relación con el extremo N y/o el extremo C de cualquiera de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185­ 191 están sustituidos con un residuo de glutamina. Estos y los polipéptidos de HRS relacionados también pueden incluir sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) para eliminar cualquier residuo de glutamina natural, si se desea, y regular de este modo el grado de conjugación o unión específica del sitio.
Para ciertos tipos de conjugación o unión específica de sitio a moléculas heterólogas tales como regiones Fc o PEG u otras moléculas heterólogas, los polipéptidos de HRS pueden tener una o más sustituciones de lisina, donde uno o más residuos de origen natural (no lisina) están sustituidos con lisina, por ejemplo, para facilitar la acilación o la unión basada en la alquilación de la o las moléculas al grupo amino de la lisina. Estos procedimientos también suelen dar como resultado la unión de una o más moléculas al residuo N-terminal. En algunas realizaciones de la presente descripción, las sustituciones de lisina están cerca del extremo N y/o del extremo C del polipéptido de HRS (por ejemplo, SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 o los polipéptidos de HrS de las tablas D1, d3-D6 o D8). Las realizaciones particulares de la presente descripción incluyen cuando uno o más residuos dentro de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos hasta el extremo N y/o el extremo C de cualquiera de las SEQ ID NO:1-106, 170-181 o 185-191 (o los polipéptidos de HRS de las tablas D1, D3-D6 o D8) están sustituidos con un residuo de lisina. Estos y los polipéptidos de HRS relacionados también pueden incluir sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) para eliminar cualquier residuo de lisina de origen natural, si se desea, y regular de este modo el grado de conjugación o unión específica de sitio.
La conjugación específica de sitio a polipéptidos de HRS también se puede realizar sustituyendo uno o más aminoácidos superficiales accesibles al disolvente de un polipéptido de HRS. Por ejemplo, los aminoácidos accesibles al disolvente adecuados pueden determinarse en función de la accesibilidad al disolvente predicha usando el servidor SPIDDER (http://sppider.cchmc.org/) usando la estructura cristalina publicada de un polipéptido de HRS ejemplar (véase Xu y col. Structure, 20: 1470-7, 2012 y solicitud de Estados Unidos N.° 61/674.639). Basándose en este análisis, varios aminoácidos en la superficie se pueden usar potencialmente como sitios de mutación para introducir grupos funcionales adecuados para la conjugación o unión. La puntuación de accesibilidad superficial de los aminoácidos basada en la estructura cristalina se puede calcular, donde las puntuaciones más altas representan una mejor accesibilidad. En realizaciones particulares de la presente descripción, se prefieren puntuaciones más altas (por ejemplo, >40). Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente descripción, una posición de aminoácido que tiene una puntuación de accesibilidad en la superficie mayor que 40 puede usarse para introducir una cisteína, lisina, glutamina u otro aminoácido no natural.
En realizaciones particulares de la presente descripción, un aminoácido de superficie accesible al disolvente se selecciona del grupo que consiste en: alanina, glicina y serina, y se puede sustituir con aminoácidos de origen natural que incluyen, aunque sin limitarse a, cisteína, glutamina o lisina, o un aminoácido de origen no natural que está optimizado para la conjugación o unión específica de sitio.
En diversas realizaciones de la presente descripción, la presente descripción contempla la conjugación o unión específica de sitio en cualquier posición de aminoácido en un polipéptido de HRS en virtud de la sustitución de un aminoácido de origen no natural que comprende un grupo funcional que formará un enlace covalente con el grupo funcional unido a moléculas heterólogas tales como una región Fc o PEG u otra molécula heteróloga. Los aminoácidos de origen no natural se pueden insertar o sustituir en, por ejemplo, uno o más de los residuos dentro de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos en relación con el extremo N y/o el extremo C de cualquiera de las SEQ ID NO:1-106, 170- 181, o 185-191 (o los polipéptidos de HRS de las tablas D1, D3-D6 o D8); en el extremo N y/o en el extremo C de cualquiera de las SeQ iD nO:1-106, 170-181 o 185-191 (o los polipéptidos de HRS de las tablas D1, D3-D6 o D8); o un residuo de aminoácido superficial accesible al disolvente como se describe en el presente documento.
En realizaciones particulares de la presente descripción, los aminoácidos de origen no natural incluyen, sin limitación, cualquier aminoácido, aminoácido modificado o análogo de aminoácido distinto de la selenocisteína y los siguientes veinte alfa-aminoácidos codificados genéticamente: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina. La estructura genérica de un alfa-aminoácido se ilustra mediante la siguiente fórmula:
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Un aminoácido no natural es típicamente cualquier estructura que tenga la fórmula anterior donde el grupo R es cualquier sustituyente distinto de uno usado en los veinte aminoácidos naturales. Véase, por ejemplo, textos de bioquímica tales como Biochemistry de L. Stryer, 3a ed. 1988, Freeman and Company, Nueva York, para las estructuras de los veinte aminoácidos naturales. Téngase en cuenta que los aminoácidos no naturales divulgados en el presente documento pueden ser compuestos de origen natural distintos de los veinte alfa-aminoácidos anteriores. Debido a que los aminoácidos no naturales divulgados en el presente documento difieren típicamente de los aminoácidos naturales en la cadena lateral solamente, los aminoácidos no naturales forman enlaces amida con otros aminoácidos, por ejemplo, naturales o no naturales, de la misma manera en que se forman en proteínas de origen natural. Sin embargo, los aminoácidos no naturales tienen grupos de cadena lateral que los distinguen de los aminoácidos naturales. Por ejemplo, R en la fórmula anterior comprende opcionalmente un haluro de alquilo, arilo, arilo, haluro de vinilo, haluro de alquilo, acetilo, cetona, aziridina, nitrilo, nitro, haluro, acil-, ceto-, azido-, hidroxil-, hidracina-, ciano-, halo-, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, tio éter, epóxido, sulfona, ácido borónico, éster de boronato, borano, ácido fenilborónico, tiol, seleno-, sulfonil-, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico-, piridilo, naftilo, benzofenona, un anillo restringido tal como un grupo ciclooctilo, tio éster, enona, imina, aldehído, éster, tioácido, hidroxilamina, amino, ácido carboxílico, ácido alfa-ceto carboxílico, ácidos alfa o beta-insaturados y amidas, glioxil amida, u organosilano, o similares, o cualquier combinación de los mismos.
Los ejemplos específicos de aminoácidos no naturales incluyen, aunque sin limitarse a, p-acetil-L-fenilalanina, O-metil-L-tirosina, una L-3-(2-naftil)alanina, una 3-metil-fenilalanina, una O-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcp-serina, p-O-GlcNAc-L-serina, una tri-O-acetil-GalNAc-a-treonina, una a-GalNAc-L-treonina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanina, las enumeradas a continuación, o en otra parte en el presente documento, y similares.
Por consiguiente, se puede seleccionar un aminoácido de origen no natural que comprende un grupo funcional que forma un enlace covalente con cualquier grupo funcional preferido de una molécula deseada (por ejemplo, región Fc, PEG). Los aminoácidos no naturales, una vez seleccionados, pueden adquirirse de proveedores o sintetizarse químicamente. Se puede incorporar cualquier número de aminoácidos no naturales en la molécula diana y puede variar de acuerdo con el número de moléculas deseadas a unir. Las moléculas pueden estar unidas a todos o solo a algunos de los aminoácidos no naturales. Además, se pueden incorporar los mismos o diferentes aminoácidos no naturales en un polipéptido de HRS, dependiendo del resultado deseado. En ciertas realizaciones de la presente descripción, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos no naturales se incorporan a un polipéptido de HRS, cualquiera o todos los cuales pueden estar conjugados a una molécula que comprende un grupo funcional deseado.
En ciertos aspectos de la presente descripción, el uso de aminoácidos no naturales puede utilizarse para modificar (por ejemplo, aumentar) una actividad no canónica seleccionada de un polipéptido de HRS, o para alterar la semivida in vivo o in vitro de la proteína. Los aminoácidos no naturales también se pueden usar para facilitar modificaciones químicas (selectivas) (por ejemplo, pegilación) de una proteína de HRS, como se describe en otra parte en el presente documento. Por ejemplo, ciertos aminoácidos no naturales permiten la unión selectiva de polímeros tales como una región Fc o PEG a una proteína dada, y, por lo tanto, mejoran sus propiedades farmacocinéticas.
Los ejemplos específicos de análogos y miméticos de aminoácidos se pueden encontrar descritos, por ejemplo, en Roberts y Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross y Meinhofer, vol. 5, p. 341, Academic Press, Inc., Nueva York, N.Y. (1983). Otros ejemplos incluyen aminoácidos peralquilados, particularmente aminoácidos permetilados. Véase, por ejemplo, Combinatorial Chemistry, Eds. Wilson y zarnik, cap. 11, p. 235, John Wiley & Sons Inc., Nueva York, N.Y. (1997). Otros ejemplos más incluyen aminoácidos cuya parte (y, por lo tanto, el esqueleto de amida del péptido resultante) se ha reemplazado, por ejemplo, por un anillo de azúcar, esteroide, benzodiazepina o ciclo carbo. Véase, por ejemplo, Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, Ed. Manfred E. Wolff, cap. 15, págs. 619-620, John Wiley & Sons Inc., Nueva York, N.Y. (1995). Los procedimientos para sintetizar péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos y proteínas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.420.109; M. Bodanzsky, Principies of Peptide Synthesis (1a ed. Y 2a ed. rev.), Springer-Verlag, Nueva York, NY (1984 y 1993), véase el capítulo 7; Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (2a ed.), Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois (1984)). Por consiguiente, los polipéptidos de HRS de la presente descripción pueden estar compuestos por aminoácidos de origen natural y de origen no natural, así como por análogos y miméticos de aminoácidos.
Polinucleótidos
Ciertas realizaciones de la presente descripción se refieren a polinucleótidos que codifican un polipéptido de HRS o una proteína de fusión HRS-Fc. También se incluyen los polinucleótidos que codifican una o más de las regiones Fc descritas en el presente documento, solas o en combinación con una secuencia codificante de HRS. Entre otros usos, estas realizaciones de la presente descripción pueden utilizarse para producir de forma recombinante una HRS, región Fc, o polipéptido HRS-Fc o variante del mismo deseado, o para expresar el polipéptido de HRS, la región Fc o HRS-Fc en una célula o sujeto seleccionados. Los expertos en la materia apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de fusión HRS-Fc del polipéptido de HRS como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos pueden tener una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a las diferencias en el uso de codones se contemplan específicamente en la presente descripción, por ejemplo, polinucleótidos que están optimizados para la selección de codones humanos, de levadura o bacterianos.
Como reconocerá el experto en la materia, los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no es necesario, estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente descripción, y un polinucleótido puede, pero es necesario, estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte.
Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un polipéptido de fusión HRS-Fc o una parte del mismo) o pueden comprender una variante, o un equivalente funcional biológico de dicha secuencia. Las variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, eliminaciones y/o inserciones, como se describe adicionalmente a continuación, preferentemente de modo que la actividad del polipéptido codificado no disminuya sustancialmente con respecto al polipéptido no modificado.
En realizaciones adicionales de la presente descripción, la presente descripción proporciona polinucleótidos aislados que comprenden diversas longitudes de tramos contiguos de secuencia idénticos o complementarios a un polipéptido de HRS o proteína de fusión HRS-Fc, donde los polinucleótidos aislados codifican un polipéptido de HRS truncado como se describe en el presente documento.
Por lo tanto, múltiples polinucleótidos pueden codificar los polipéptidos de HRS, las regiones Fc y las proteínas de fusión de la descripción. Además, la secuencia de polinucleótidos se puede manipular por diversas razones. Los ejemplos incluyen, aunque no se limitan a, la incorporación de codones preferidos para mejorar la expresión del polinucleótido en diversos organismos (véase en general Nakamura y col, Nuc. Acid. Res. 28: 292, 2000). Además, se pueden incorporar mutaciones silenciosas para introducir, o eliminar sitios de restricción, disminuir la densidad de los motivos de dinucleótidos CpG (véase, por ejemplo, Kameda y col., Biochys. Biophys. Res. Commun. 349: 1269­ 1277, 2006) o reducir la capacidad de las secuencias monocatenarias para formar estructuras de tallo-bucle: (véase, por ejemplo, Zuker M., Nucl. Acid Res. 31: 3406-3415, 2003). Además, la expresión en mamíferos puede optimizarse aún más al incluir una secuencia de consenso de Kozak (es decir, (a/g)cc(a/g)ccATGg) (SEQ ID NO:199) en el codón de inicio. Las secuencias de consenso de Kozak útiles para este fin son conocidas en la técnica (Mantyh y col., PNAS 92: 2662-2666, 1995; Mantyh y col., Prot. Exp. & Purif. 6: 124, 1995). Las versiones ejemplares de tipo silvestre y con optimización de codones de diversos polipéptidos de HRS se proporcionan en la tabla D9 a continuación.
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Secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no es necesario, estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente descripción, y un polinucleótido puede, pero no es necesario, estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte. Por lo tanto, los polinucleótidos de la presente descripción, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, pueden combinarse con otras secuencias de ADN o ARN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes y similares, de modo que su longitud total puede variar considerablemente.
Por lo tanto, se contempla que se pueda emplear un fragmento de polinucleótido de casi cualquier longitud; con la longitud total preferentemente limitada por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante deseado. Se incluyen polinucleótidos de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 270, 280, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2800, 2900, 3000 o más (incluyendo todos los números enteros intermedios) bases de longitud, incluyendo cualquier parte o fragmento (por ejemplo, mayor de aproximadamente 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de longitud) de un polinucleótido de HRS de referencia (por ejemplo, número de bases X-Y, donde X es aproximadamente 1-3000 o más e Y es aproximadamente 10-3000 o más), o su complemento.
Las realizaciones de la presente descripción también incluyen «variantes» de las secuencias de polinucleótidos de HRS de referencia. Las «variantes» de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, eliminaciones y/o inserciones en relación con un polinucleótido de referencia. Generalmente, las variantes de una secuencia de polinucleótidos de HRS de referencia pueden tener al menos aproximadamente el 30 %, 40 % 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, generalmente al menos aproximadamente el 75 %, 80 %, 85 %, deseablemente aproximadamente del 90 % al 95 % o más, y más adecuadamente aproximadamente el 98 % o más de identidad de secuencia con esa secuencia de nucleótidos particular (tal como por ejemplo, las SEQ ID NO:111-127, 182-184, 192-198; véase también los ejemplos) de acuerdo con lo determinado por los programas de alineamiento de secuencias descritos en otra parte en el presente documento usando parámetros por defecto. En ciertas realizaciones de la presente descripción, las variantes pueden diferir de una secuencia de referencia en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 (incluyendo todos los números enteros intermedios) o más bases. En ciertas realizaciones de la presente descripción, tal como cuando la variante de polinucleótido codifica un polipéptido de HRS que tiene una actividad no canónica, la actividad deseada del polipéptido de HRS codificado no disminuye sustancialmente con respecto al polipéptido no modificado.
El efecto sobre la actividad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones de la presente descripción, las variantes pueden alterar el estado de agregación de los polipéptidos de HRS, por ejemplo para proporcionar polipéptidos de HRS que existen en diferentes realizaciones de la presente descripción principalmente como un monómero, dímero o multímero.
Ciertas realizaciones de la presente descripción incluyen polinucleótidos que hibridan con una secuencia de polinucleótidos de HRS de referencia (tal como por ejemplo, SEQ ID NO:111-127, 182-184, 192-198; véanse también los ejemplos) o sus complementos, bajo condiciones de rigurosidad descritas a continuación. Como se usa en el presente documento, el término «hibrida en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media, alta rigurosidad o rigurosidad muy alta» describe las condiciones para la hibridación y el lavado. Se puede encontrar orientación para realizar reacciones de hibridación en Ausubel y col., (1998, citado anteriormente), Secciones 6.3.1-6.3.6.
Procedimientos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y se pueden usar cualquiera de ellos.
Las referencias en el presente documento a condiciones de baja rigurosidad incluyen y abarcan desde al menos aproximadamente el 1 % v/v hasta al menos aproximadamente el 15 % v/v de formamida y desde al menos aproximadamente 1 M hasta al menos aproximadamente 2 M de sal para hibridación a 42 °C, y al menos aproximadamente 1 M a al menos aproximadamente 2 M de sal para lavado a 42 °C. Las condiciones de baja rigurosidad también pueden incluir albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %, EDTA 1 mM, NaHPO4 0,5 M (pH 7,2), SDS al 7 % para hibridación a 65 °C y (i) 2 * SSC, SDS al 0,1 %; o (ii) BSA al 0,5 %, EDTA 1 mM, NaHPO440 mM (pH 7,2), SDS al 5 % para lavado a temperatura ambiente. Una realización de la presente descripción de condiciones de baja rigurosidad incluye la hibridación en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguida de dos lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % al menos a 50 °C (la temperatura de los lavados se puede aumentar a 55 °C para condiciones de baja rigurosidad).
Las condiciones de rigurosidad media incluyen y abarcan desde al menos aproximadamente el 16 % v/v hasta al menos aproximadamente el 30 % v/v de formamida y desde al menos aproximadamente 0,5 M hasta al menos aproximadamente 0,9 M de sal para hibridación a 42 °C, y al menos aproximadamente 0,1 M a al menos aproximadamente 0,2 M de sal para lavado a 55 °C. Las condiciones de rigurosidad media también pueden incluir albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %, EDTA 1 mM, NaHPO40,5 M (pH 7,2), SDS al 7 % para hibridación a 65 °C y (i) 2 x SSC, SDS al 0,1 %; o (ii) BSA al 0,5 %, EDTA 1 mM, NaHPO440 mM (pH 7,2), SDS al 5 % para lavado a 60­ 65 °C. Una realización de la presente descripción de las condiciones de rigurosidad media incluye la hibridación en 6 x SSC a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % a 60 °C. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen y abarcan desde al menos aproximadamente el 31 % v/v hasta al menos aproximadamente el 50 % v/v de formamida y desde aproximadamente 0,01 M hasta aproximadamente 0,15 M de sal para la hibridación a 42 °C y aproximadamente 0,01 M hasta aproximadamente 0,02 M de sal para el lavado a 55 °C.
Las condiciones de alta rigurosidad también pueden incluir BSA al 1 %, EDTA 1 mM, NaHPO40,5 M (pH 7,2), SDS al 7 % para hibridación a 65 °C y (i) 0,2 x SSC, SDS al 0,1 %; o (ii) BSA al 0,5 %, EDTA 1 mM, NaHPO440 mM (pH 7,2), SDS al 1 % para lavado a una temperatura superior a 65 °C. Una realización de la presente descripción de condiciones de alta rigurosidad incluye la hibridación en 6 x SSC a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % a 65 °C. Una realización de la presente descripción de condiciones de muy alta rigurosidad incluyen la hibridación en fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7 % a 65 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2 x SSC, SDS al 1 % a 65 °C.
Otras condiciones de rigurosidad son bien conocidas en la técnica y un experto en la materia reconocerá que pueden manipularse diversos factores para optimizar la especificidad de la hibridación. La optimización de la rigurosidad de los lavados finales puede servir para garantizar un alto grado de hibridación. Para ejemplos detallados, véase Ausubel y col., mencionado anteriormente en las páginas 2.10.1 a 2.10.16 y Sambrook y col. (1989, mencionado anteriormente) en las secciones 1.101 a 1.104. Mientras que los lavados rigurosos se realizan típicamente a temperaturas de aproximadamente 42 °C a 68 °C, un experto en la materia apreciará que otras temperaturas pueden ser adecuadas para condiciones rigurosas. La tasa máxima de hibridación se produce típicamente entre aproximadamente 20 °C y 25 °C por debajo de la Tm para la formación de un híbrido de ADN-ADN. Es bien conocido en la técnica que la Tm es la temperatura de fusión, o la temperatura a la que se disocian dos secuencias de polinucleótidos complementarias. Los procedimientos para estimar la Tm son bien conocidos en la técnica (véase Ausubel y col., mencionado anteriormente, en la página 2.10.8).
En general, la Tm de un dúplex de ADN perfectamente emparejado se puede predecir como una aproximación mediante la fórmula: Tm = 81,5 16,6 (log10 M) 0,41 (% de G+C) - 0,63 (% de formamida) - (600/longitud) donde: M es la concentración de Na+, preferentemente en el intervalo de 0,01 molar a 0,4 molar; % de G+C es la suma de las bases de guanosina y citosina como porcentaje del número total de bases, dentro del intervalo entre el 30 % y el 75 % de G+C; % de formamida es el porcentaje de concentración de formamida por volumen; longitud es el número de pares de bases en el dúplex de ADN. La Tm de un ADN dúplex disminuye en aproximadamente 1 °C con cada aumento del 1 % en el número de pares de bases con falta de coincidencia aleatoria. El lavado se realiza generalmente a Tm - 15 °C para una rigurosidad alta, o Tm - 30 °C para una rigurosidad moderada.
En un ejemplo de un procedimiento de hibridación, una membrana (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de nylon) que contiene ADN inmovilizado se hibrida durante una noche a 42 °C en un tampón de hibridación (formamida desionizada al 50 %, 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt (ficoll al 0,1 %, polivinilpirrolidona al 0,1 % y albúmina de suero bovino al 0,1 %), SDS al 0,1 % y 200 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado que contiene una sonda etiquetada. La membrana se somete a continuación a dos lavados secuenciales a rigurosidad media (es decir, 2 x SSC, SDS al 0,1 % durante 15 min a 45 °C, seguido de 2 x SSC, SDS al 0,1 % durante 15 min a 50 °C), seguido de dos lavados secuenciales a mayor rigurosidad (es decir, 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % durante 12 min a 55 °C, seguido de 0,2 x SSC y solución de SDS al 0,1 % durante 12 min a 65-68 °C.
Producción de polipéptidos de HRS y conjugados HRS-Fc
Los polipéptidos conjugados HRS-Fc pueden prepararse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante el uso de síntesis de péptidos en fase sólida estándar (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)), o mediante tecnología recombinante usando un huésped modificado genéticamente. La síntesis de proteínas se puede realizar usando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada se puede conseguir, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos 431A de Applied Biosystems (Perkin Elmer). Como alternativa, varios fragmentos pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse usando procedimientos químicos para producir la molécula deseada.
Los conjugados HRS-Fc también pueden producirse expresando una secuencia de ADN o ARN que codifica el polipéptido de HRS o los conjugados HRS-Fc en cuestión en una célula huésped adecuada mediante técnicas bien conocidas. La secuencia de polinucleótidos que codifica el conjugado HRS-Fc o el polipéptido de HRS puede prepararse sintéticamente mediante procedimientos estándar establecidos, por ejemplo, el procedimiento de la fosforamidita descrito por Beaucage y col., Tetrahedron Letters 22: 1859-1869, 1981; o el procedimiento descrito por Matthes y col., EMBO Journal 3: 801-805, 1984. De acuerdo con el procedimiento de la fosforamidita, los oligonucleótidos se sintetizan, por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, se purifican, se duplexan y se ligan para formar la construcción sintética de ADN. Como alternativa, la construcción de ADN o ARN puede construirse usando técnicas estándar de biología molecular recombinante que incluyen la clonación mediada por enzimas de restricción y la amplificación de genes basada en PCR. En algunas realizaciones de la presente descripción para la expresión directa mediada por ARNm, el polinucleótido puede encapsularse en una nanopartícula o liposoma para permitir un suministro y captación eficientes en la célula, y opcionalmente incluir una estructura de casquete o cola modificada para mejorar la estabilidad y la traducción.
Las secuencias de polinucleótidos también pueden ser de genómica mixta, ADNc, ARN y una de origen sintético. Por ejemplo, una secuencia genómica o de ADNc que codifica un péptido líder puede unirse a una secuencia genómica o de ADNc que codifica el polipéptido de HRS o el conjugado HRS-Fc, después de lo cual la secuencia de ADN o ARN puede modificarse en un sitio insertando oligonucleótidos sintéticos que codifican la secuencia de aminoácidos deseada para recombinación homóloga de acuerdo con procedimientos bien conocidos o, preferentemente, generando la secuencia deseada mediante PCR usando oligonucleótidos adecuados. En algunas realizaciones de la presente descripción, se puede incluir una secuencia señal antes de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica un péptido señal N-terminal a la secuencia codificante que se comunica con la célula huésped para dirigir el polipéptido a la superficie celular o secretar el polipéptido al medio. Típicamente, la célula huésped corta el péptido señal antes de que la proteína salga de la célula. Los péptidos señal se pueden encontrar en diversas proteínas en procariotas y eucariotas.
Se conocen diversos sistemas de vector de expresión/huésped y pueden utilizarse para contener y expresar secuencias de polinucleótidos. Estos incluyen, aunque sin limitarse a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófagos recombinantes, plásmidos o cósmidos; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas celulares vegetales transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales, incluyendo células de mamíferos y más específicamente sistemas de células humanas transformadas con vectores de expresión virales, plasmídicos, episomales o integradores.
Los «elementos de control» o las «secuencias reguladoras» presentes en un vector de expresión son regiones no traducidas del vector--potenciadores, promotores, regiones no traducidas 5' y 3'--que interactúan con las proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Dichos elementos pueden variar en su potencia y especificidad. Dependiendo del sistema de vectores y del huésped utilizado, pueden usarse cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles como el promotor lacZ híbrido del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, California) o el plásmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.) y similares. En sistemas celulares de mamíferos, generalmente se prefieren los promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de la secuencia que codifica un polipéptido, los vectores basados en SV40 o EBV pueden usarse ventajosamente con un marcador seleccionable apropiado.
Ciertas realizaciones de la presente descripción pueden emplear sistemas de expresión basados en E. coli (véase, por ejemplo, Structural Genomics Consortium y col., Nature Methods. 5: 135-146, 2008). Estas y realizaciones relacionadas de la presente descripción pueden basarse parcial o totalmente en la clonación independiente de ligamiento (LIC) para producir un vector de expresión adecuado. En realizaciones específicas de la presente descripción, la expresión de proteínas puede controlarse mediante una ARN polimerasa T7 (por ejemplo, una serie de vectores pET), o vectores pET modificados con promotores alternativos, que incluyen, por ejemplo, el promotor TAC. Estas y otras realizaciones relacionadas de la presente descripción pueden utilizar la cepa huésped de expresión BL21 (DE3), un lisógeno XDE3 de BL21 que soporta la expresión mediada por T7 y es deficiente en proteasas lon y ompT para mejorar la estabilidad de la proteína diana. También se incluyen las cepas huésped de expresión que portan los plásmidos que codifican los ARNt usados raramente en E. coli, tales como las cepas ROSETTA™ (d E3) y Rosetta 2 (DE3). En algunas realizaciones de la presente descripción, se pueden utilizar otras cepas de E. coli, incluyendo otras cepas de E. coli K-12 tales como W3110 (F-lambda-IN (rrnD-rrnE) 1 rph-1) y UT5600 (F, araC14, leuB6 (Am), secA206(aziR), lacYI, proC14, tsx67, A(ompTfepC)266, entA403, glnX44(AS), X-, trpE38, rfbC1, rpsL109(strR), xylA5, mtl-1, thiE1), lo que puede dar como resultado niveles reducidos de modificaciones postraduccionales durante la fermentación. La lisis celular y el manejo de la muestra también se pueden mejorar usando los reactivos comercializados con las marcas registradas nucleasa BENZONASE® y reactivo de extracción de proteínas BUGBUSTER®. Para el cultivo celular, los medios autoinductores pueden mejorar la eficiencia de muchos sistemas de expresión, incluyendo los sistemas de expresión de alto rendimiento. Los medios de este tipo (por ejemplo, el sistema de autoinducción OVERNIGHT EXPRESS™) provocan gradualmente la expresión de proteínas a través del cambio metabólico sin la adición de agentes inductores artificiales tales como IPTG.
Las realizaciones particulares de la presente descripción emplean etiquetas de hexahistidina (tales como las comercializadas con la marca registrada HIS^TAG®), seguidas de la purificación mediante cromatografía por afinidad metálica inmovilizada (IMAC), o técnicas relacionadas. Sin embargo, en ciertos aspectos de la presente descripción, las proteínas de grado clínico se pueden aislar de cuerpos de inclusión de E. coli, con o sin el uso de marcas de afinidad (véase, por ejemplo, Shimp y col., Protein Expr Purif. 50: 58-67, 2006). Como un ejemplo adicional, ciertas realizaciones de la presente descripción pueden emplear un sistema de producción de alto rendimiento de E. coli inducido por choque de frío, porque la sobreexpresión de proteínas en Escherichia coli a baja temperatura mejora su solubilidad y estabilidad (véase, por ejemplo, Qing y col., Nature Biotechnology. 22: 877-882, 2004).
También se incluyen sistemas de fermentación bacteriana de alta densidad. Por ejemplo, el cultivo de alta densidad celular de Ralstonia eutropha permite la producción de proteínas a densidades celulares de más de 150 g/l, y la expresión de proteínas recombinantes a títulos que superan 10 g/l. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, se pueden usar una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Para revisiones, véase Ausubel y col. (mencionado anteriormente) y Grant y col., Methods Enzymol. 153: 516-544, 1987. También se incluyen los sistemas de expresión de Pichia pandoris (véase, por ejemplo, Li y col., Nature Biotechnology. 24, 210-215, 2006; y Hamilton y col., Science, 301: 1244, 2003). Ciertas realizaciones de la presente descripción incluyen sistemas de levadura que están diseñados para glucosilar selectivamente proteínas, incluyendo levaduras que tienen vías de N-glucosilación humanizadas, entre otras (véase, por ejemplo, Hamilton y col., Science. 313: 1441-1443, 2006; Wildt y col., Nature Reviews Microbiol. 3: 119-28, 2005; y Gerngross y col., Nature-Biotechnology. 22: 1409-1414, 2004; patentes de Estados Unidos N.° 7.629.163; 7.326.681; y 7.029.872). Simplemente a modo de ejemplo, los cultivos de levadura recombinante se pueden cultivar en matrices Fernbach o en fermentadores de 15 l, 50 l, 100 l y 200 l, entre otros.
En casos en que se usan vectores de expresión de plantas, la expresión de secuencias que codifican polipéptidos puede ser impulsada por cualquiera de una serie de promotores. Por ejemplo, promotores virales tales como los promotores 35S y 19S de CaMV se pueden usar solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, EMBo J. 6: 307-311,1987). Como alternativa, se pueden usar promotores de plantas tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores por choque térmico (Coruzzi y col., EMBO J. 3: 1671-1680, 1984; Broglie y col., Science. 224: 838-843, 1984; y Winter y col., Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105, 1991). Estas construcciones pueden introducirse en células vegetales mediante transformación directa de ADN o transfección mediada por patógenos. Dichas técnicas se describen en una serie de revisiones generalmente disponibles (véase, por ejemplo, Hobbs en McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, págs. 191-196, 1992).
También se puede usar un sistema de insectos para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en un sistema de este tipo, el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en células de Trichoplusia. Las secuencias que codifican el polipéptido pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y colocarse bajo el control del promotor de la polihedrina. La inserción exitosa de la secuencia que codifica el polipéptido hará que el gen de la polihedrina sea inactivo y produzca un virus recombinante que carezca de proteína de la cubierta. Los virus recombinantes se pueden usar para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o células de Trichoplusia donde se puede expresar el polipéptido de interés (Engelhard y col., PNAS EE. UU. 91: 3224-3227, 1994). También se incluyen los sistemas de expresión de baculovirus, incluidos los que utilizan células SF9, SF21 y T. ni (véase, por ejemplo, Murphy y Piwnica-Worms, Curr Protoc Protein Sci. Capítulo 5: Unidad 5.4, 2001). Los sistemas de insectos pueden proporcionar modificaciones postraduccionales que son similares a los sistemas de mamíferos.
En células huésped de mamífero, una serie de sistemas de expresión son bien conocidos en la técnica y están disponibles en el mercado. Los sistemas de vectores de mamíferos ejemplares incluyen, por ejemplo, pCEP4, pREP4 y pREP7 de Invitrogen, el sistema PerC6 de Crucell y sistemas basados en lentivirus tales como pLP1 de Invitrogen y otros. Por ejemplo, en casos donde se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican un polipéptido de interés pueden ligarse en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región no esencial E1 o E3 del genoma viral se puede usar para obtener un virus viable que sea capaz de expresar el polipéptido en células huésped infectadas (Logan & Shenk, PNAS EE. UU. 81: 3655-3659, 1984). Además, los potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), se pueden usar para aumentar la expresión en células huésped de mamíferos.
Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen Virol. 36: 59, 1977); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata de Buffalo (BRL 3a , ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC Cc L 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, At Cc CCL51); células TR1 (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Otras líneas celulares huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células DHFR-CHO (Urlaub y col., PNAS EE. UU. 77: 4216, 1980); y líneas celulares de mieloma tales como NSO y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas celulares huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B. K.C Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), págs. 255-268. Ciertos sistemas de expresión de células de mamífero preferidos incluyen sistemas de expresión basados en células CHO y HEK293. Los sistemas de expresión de mamíferos pueden utilizar líneas celulares adjuntas, por ejemplo, en matraces T, frascos de cultivo rotatorios o fábricas celulares, o cultivos en suspensión, por ejemplo, en matraces de agitación de 1 l y 5 l, biorreactores con tanque de agitación de 5 l, 14 l, 40 l, 100 l y 200 l. o biorreactores WAVE de 20/50 l y 100/200 l, entre otros conocidos en la técnica.
También se incluyen procedimientos de expresión de proteínas libres de células. Estas y otras realizaciones relacionadas de la presente descripción utilizan típicamente ARN polimerasa purificada, ribosomas, ARNt y ribonucleótidos. Dichos reactivos pueden producirse, por ejemplo, por extracción a partir de células o a partir de un sistema de expresión basado en células.
Además, se puede seleccionar una cepa de células huésped por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada de la manera deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, aunque sin limitarse a, modificaciones postraduccionales tales como acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación, o la inserción de aminoácidos de origen no natural (véase, en general, las patentes de Estados Unidos N.° 7.939.496 7.816.320; 7.947.473; 7.883.866; 7.838.265; 7.829.310; 7.820.766; 7.820.766; 7.7737.226, 7.736.872; 7.638.299; 7.632.924; y 7.230.068). En algunas realizaciones de la presente descripción, dichos aminoácidos de origen no natural pueden insertarse en la posición Cys130. El procesamiento postraduccional que escinde una forma «prepro» de la proteína también se puede usar para facilitar la inserción, el plegamiento y/o la función correctos. Se pueden seleccionar diferentes células huésped tales como levadura, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y W138, además de las células bacterianas, que tienen o incluso carecen de maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraduccionales, para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña.
Los polipéptidos de HRS o conjugados HRS-Fc producidos por una célula recombinante pueden purificarse y caracterizarse de acuerdo con diversas técnicas conocidas en la técnica. Los sistemas ejemplares para realizar la purificación de proteínas y analizar la pureza de proteínas incluyen cromatografía de líquidos de proteína rápida (FPLC) (por ejemplo, sistemas AKTA de AKTA y Bio-Rad), cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) (por ejemplo, HPLC de Beckman y Waters). Químicas ejemplares para la purificación incluyen cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, Q, S), cromatografía de exclusión por tamaño, gradientes de sal, purificación por afinidad (por ejemplo, Ni, Co, FLAG, maltosa, glutatión, proteína A/G), filtración en gel, fase inversa, cromatografía de intercambio iónico HYPERD® de cerámica y columnas de interacción hidrófoba (HIC), entre otras conocidas en la técnica. Varios procedimientos ejemplares también se describen en las secciones de ejemplos.
Conjugados HRS-Fc
Como se señaló anteriormente, las realizaciones de la presente descripción se refieren a conjugados HRS-Fc, que comprenden al menos una región Fc que está unida covalentemente a uno o más polipéptidos de HRS. Los ejemplos de conjugados HRS-Fc incluyen proteínas de fusión y diversas formas de proteínas reticuladas químicamente. Se puede emplear una amplia variedad de secuencias de la región Fc en los conjugados HRS-Fc de la presente descripción, incluyendo secuencias de tipo silvestre de cualquier número de especies, así como variantes, fragmentos, híbridos y formas químicamente modificadas de las mismas. Los polipéptidos de HRS-Fc también pueden comprender (opcionalmente) uno o más enlazadores, que típicamente separan la o las regiones Fc del o de los polipéptidos de HRS, incluyendo enlazadores peptídicos y enlazadores químicos, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. Se apreciará que, en cualquiera de estos conjugados HRS-Fc, el aminoácido N o C terminal nativo de los polipéptidos de HRS, o el aminoácido N o C nativo en el dominio Fc, puede ser eliminado y/o reemplazado con uno o más aminoácidos no nativos, por ejemplo, para facilitar la expresión y/o la clonación o para servir como una secuencia enlazadora entre las dos proteínas.
Los polipéptidos de conjugados HRS-Fc pueden proporcionar diversas ventajas con respecto a los polipéptidos de HRS no conjugados o no modificados, por ejemplo, los polipéptidos de HRS correspondientes de la misma secuencia o secuencia similar que no tienen una o más regiones Fc unidas a ellos. Simplemente a modo de ilustración, la unión covalente de una o más regiones Fc puede alterar (por ejemplo, aumentar, disminuir) la solubilidad, la semivida (por ejemplo, en suero, en un tejido seleccionado, en un tubo de ensayo en condiciones de almacenamiento, por ejemplo, a temperatura ambiente o en refrigeración), las propiedades de dimerización o multimerización, la actividad o actividades biológicas del polipéptido de HRS, por ejemplo, proporcionando funciones efectoras asociadas a la región Fc (por ejemplo, activación de la cascada clásica del complemento, interacción con células efectoras inmunitarias mediante el receptor de Fc (FcR), compartimentación de inmunoglobulinas), captación celular, transporte intracelular, distribución tisular y/o biodisponibilidad, con respecto a un polipéptido de HRS no modificado que tiene la misma secuencia o similar. En ciertos aspectos de la presente descripción, las regiones Fc pueden conferir funciones efectoras relacionadas con citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o fagocitocis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP), que se cree que desempeñan un papel en el aclaramiento de células diana específicas, tales como células tumorales y células infectadas.
Ciertas realizaciones de la presente descripción emplean proteínas de fusión HRS-Fc. Las «proteínas de fusión» se definen en otra parte en el presente documento y son bien conocidas en la técnica, como lo son procedimientos para elaborar proteínas de fusión (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5.116.964; 5.428.130; 5.455.165; 5.514.582; 6.406.697; 6.291.212; y 6.300.099 para descripción general y procedimientos relacionados con las proteínas de fusión Fc). En una proteína de fusión HRS-Fc, la región Fc puede fusionarse con el extremo N del polipéptido de HRS, el extremo C, o ambos. En algunas realizaciones de la presente descripción, una o más regiones Fc pueden fusionarse internamente con respecto a las secuencias de HRS, por ejemplo, colocando una región Fc entre una primera secuencia de HRS (por ejemplo, dominio) y una segunda secuencia de HRS (por ejemplo, dominio), donde la primera secuencia de HRS se fusiona con el extremo N de la región Fc y la segunda secuencia de HRS se fusiona con el extremo C de la región Fc. En realizaciones específicas de la presente descripción, la primera y la segunda secuencias de HRS son idénticas. En otras realizaciones de la presente descripción, la primera y la segunda secuencias de HRS son diferentes (por ejemplo, incluyen diferentes dominios funcionales del polipéptido de HRS). Ciertas proteínas de fusión HRS-Fc también pueden incluir secuencias de proteínas heterólogas adicionales, es decir, secuencias no de región Fc y no de polipéptido de HRS.
El término «HRS-Fc» puede indicar, pero no necesariamente indica, la unión N-terminal o C-terminal de la región Fc al polipéptido de HRS. Por ejemplo, en ciertos casos, el término «Fc-HRS» indica la fusión de la región Fc con el extremo N del polipéptido de HRS, y el término «HRS-Fc» indica la fusión de la región Fc con el extremo C del polipéptido de HRS. Sin embargo, cualquiera de los dos términos puede usarse más generalmente para referirse a cualquier proteína de fusión o conjugado de una región Fc y un polipéptido de HRS.
En algunas realizaciones de la presente descripción, las proteínas de fusión HRS-Fc pueden comprender copias repetidas en tándem del polipéptido de HRS acoplado a un único dominio Fc, opcionalmente separados por péptidos enlazadores. Las proteínas de fusión HRS-Fc repetidas en tándem ejemplares se proporcionan en la tabla D10. La preparación y las secuencias para conjugados HRS-Fc específicos repetidos en tándem se ilustran en los ejemplos.
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Ciertas realizaciones de la presente descripción se refieren a conjugados HRS-Fc, donde, por ejemplo, una o más regiones Fc están conjugadas químicamente o reticuladas con el o los polipéptidos de HRS. En estos y en aspectos relacionados de la presente descripción, la región Fc puede conjugarse al polipéptido HRS en la región N-terminal (por ejemplo, dentro de los primeros 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 aminoácidos más o menos), la región interna (entre las regiones N-terminal y C-terminal), y/o la región C-terminal (por ejemplo, dentro de los últimos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 aminoácidos más o menos). Los polipéptidos se pueden conjugar o reticular con otros polipéptidos de acuerdo con diversas técnicas de rutina en la técnica. Por ejemplo, ciertas técnicas emplean el reticulador de carbodiimida reactivo con carboxilo EDC (o EDAC), que se une covalentemente a través de los grupos carboxilo D, E y C-terminales. Otras técnicas emplean EDC activado, que se une covalentemente a través de los grupos amino K y N-terminal). Todavía otras técnicas emplean el éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) o Sulfo-MBS, que se unen covalentemente mediante el grupo tiol de un residuo de cisteína (véase también la solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0092940 para regiones de Ig diseñadas con cisteína que pueden usarse para la conjugación de tiol). Dichas proteínas reticuladas también pueden comprender enlazadores, incluyendo enlazadores escindibles o liberables de otro modo (por ejemplo, enlazadores escindibles enzimáticamente, enlazadores hidrolizables), y enlazadores no escindibles (es decir, enlazadores fisiológicamente estables). Ciertas realizaciones de la presente descripción pueden emplear polímeros no peptídicos (por ejemplo, polímeros de PEG; conjugado HRS-N-PEG-N-Fc) como un reticulador entre la o las regiones Fc y el o los polipéptidos de HRS, como se describe, por ejemplo, en la solicitud de Estados Unidos N.° 2006/0269553. Véase también la solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0269369 para descripciones ejemplares de los sitios de conjugación de la región Fc.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, descritas con mayor detalle a continuación, pueden emplearse regiones Fc variantes o modificadas de otra manera, incluyendo aquellas que tienen propiedades o actividades biológicas alteradas con respecto a la o las regiones Fc de tipo silvestre. Los ejemplos de regiones Fc modificadas incluyen aquellas que tienen secuencias mutadas, por ejemplo, por sustitución, inserción, eliminación o truncamiento de uno o más aminoácidos con respecto a una secuencia de tipo silvestre, polipéptidos Fc híbridos compuestos por dominios de diferentes clases/subclases de inmunoglobulina, polipéptidos Fc que tienen patrones de glucosilación/sialilación alterados y polipéptidos Fc que se modifican o derivan, por ejemplo, por biotinilación (véase, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2010/0209424), fosforilación, sulfatación, etc., o cualquier combinación de las anteriores. Dichas modificaciones pueden emplearse para alterar (por ejemplo, aumentar, disminuir) las propiedades de unión de la región Fc a uno o más FcR particulares (por ejemplo, FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc, FcyRIIIa, FcyRIIIb, FcRn), sus propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, estabilidad o semivida, biodisponibilidad, distribución tisular, volumen de distribución, concentración, constante de velocidad de eliminación, velocidad de eliminación, área bajo la curva (AUC), aclaramiento, Cm a x , tm a x , Cm in , fluctuación), su inmunogenicidad, su fijación o activación del complemento, y/o las actividades relacionadas con CDC/ADCC/ADCP de la región Fc, entre otras propiedades descritas en el presente documento, con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente.
La «región Fc» de un conjugado HRS-Fc que proporcionada en el presente documento se deriva habitualmente de la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina (Ig). Una molécula de Ig típica está compuesta por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las cadenas pesadas se pueden dividir en al menos tres regiones funcionales: la región Fd, la región Fc (región cristalizable del fragmento) y la región bisagra (véase la figura 1), encontrándose esta última solo en inmunoglobulinas IgG, IgA e IgD. La región Fd comprende los dominios variable (Vh ) y constante (CH1 ) de las cadenas pesadas y, junto con los dominios variable (Vl ) y constante (Cl ) de las cadenas ligeras, forma el fragmento de unión al antígeno o la región Fab.
La región Fc de las inmunoglobulinas IgG, IgA e IgD comprende los dominios constantes de cadena pesada 2 y 3, designados respectivamente como regiones CH2 y CH3 ; y la región Fc de las inmunoglobulinas IgE e IgM comprende los dominios constantes de cadena pesada 2, 3 y 4, designados respectivamente como regiones CH2 , CH3 y CH4. La región Fc es la principal responsable de las funciones efectoras de la inmunoglobulina, que incluyen, por ejemplo, fijación del complemento y unión a los receptores Fc análogos de células efectoras.
La región bisagra (descubierta en IgG, IgA e IgD) actúa como un espaciador flexible que permite que la parte Fab se mueva libremente en el espacio con respecto a la región Fc. En contraste con las regiones constantes, las regiones bisagra son estructuralmente diversas, variando tanto en secuencia como en longitud entre las clases y subclases de inmunoglobulina. La región bisagra también puede contener uno o más sitios de glucosilación, que incluyen varios tipos de sitios estructuralmente distintos para la unión de carbohidratos. Por ejemplo, la IgA1 contiene cinco sitios de glucosilación dentro de un segmento de 17 aminoácidos de la región bisagra, lo que confiere una resistencia significativa del polipéptido de la región bisagra a las proteasas intestinales. Los residuos en la región proximal de la bisagra del dominio CH2 también pueden influir en la especificidad de la interacción entre una inmunoglobulina y su o sus receptores de Fc respectivos (véase, por ejemplo, Shin y col., Intern. Rev. Immunol. 10: 177-186, 1993).
La expresión «región Fc» o «fragmento Fc» o «Fc», como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que contiene una o más de una región CH2, una región CH3 y/o una región CH4 de una o más inmunoglobulinas seleccionadas, incluyendo fragmentos y variantes y combinaciones de los mismos. Una «región
Fc» también puede incluir una o más regiones bisagra de la región constante de cadena pesada de una inmunoglobulina. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la región Fc no contiene una o más de las regiones CH1 , CL, VL y/o VH de una inmunoglobulina.
La región Fc puede derivarse de la región CH2, la región CH3, la región CH4 y/o la o las regiones bisagra de una cualquiera o más de las clases de inmunoglobulina, incluyendo aunque sin limitarse a IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, incluyendo las subclases y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones de la presente descripción, la región Fc se deriva de una inmunoglobulina IgA, incluyendo las subclases IgA1 y/o IgA2. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la región Fc se deriva de una inmunoglobulina IgD. En realizaciones particulares de la presente descripción, la región Fc se deriva de una inmunoglobulina IgE. En algunas realizaciones de la presente descripción, la región Fc se deriva de una inmunoglobulina IgG, incluyendo las subclases IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 y/o
IgG4. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la región Fc se deriva de una inmunoglobulina IgM. La figura 2 muestra un alineamiento de regiones Fc de IgA1 (SEQ ID NO:156), IgA2 (SEQ ID NO:157), IgM
(SEQ ID NO:158), IgG1 (SEQ ID NO:159), IgG2 (SEQ ID NO:160), IgG3 (SEQ ID NO:161), IgG4(SEQ ID NO:162) e
IgE (SEQ ID NO:163) humanas.
Ciertas regiones Fc demuestran una unión específica para uno o más receptores de Fc (FcR). Los ejemplos de clases de receptores de Fc incluyen receptores de Fcy (FcyR), receptores de Fca (FcaR), receptores de Fcc (FceR) y el receptor de Fc neonatal (FcRn). Por ejemplo, ciertas regiones Fc tienen una mayor unión a (o afinidad por) uno o más FcyR, con respecto a FcaR, FceR y/o FcRn. En algunas realizaciones de la presente descripción, las regiones
Fc tienen unión aumentada a FcaR, con respecto a uno o más FcyR, FceR y/o FcRn. En otras realizaciones de la presente descripción, las regiones Fc tienen unión aumentada a FceR (por ejemplo, FcaRI), con respecto a uno o más FcyR, FcaR y/o FcRn. En realizaciones particulares de la presente descripción, las regiones Fc tienen unión aumentada a FcRn, con respecto a uno o más FcyR, FcaR y/o FccR. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la unión (o afinidad) de una región Fc a uno o más FcR seleccionados aumenta con respecto a su unión a (o afinidad por) uno o más FcR diferentes, típicamente en aproximadamente 1,5x, 2x, 2,5x, 3x, 3,5x, 4x, 4,5x, 5x,
6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 700x, 800x, 900x, 1000x o más (incluyendo todos los números enteros intermedios).
Los ejemplos de FcyR incluyen FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc, FcyRIIIa y FcyRIIIb. FcyRI (CD64) se expre macrófagos y células dendríticas y desempeña un papel en la fagocitosis, el estallido respiratorio, la estimulación de citocinas y el transporte endocítico de células dendríticas. La expresión de FcyRI está regulada por incremento tanto por GM-CSF como por el interferón y (y-IFN) y por la interleucina-4 (IL-4). FcyRIIa se expresa en leucocitos polimorfonucleares (PMN), macrófagos, células dendríticas y mastocitos. FcyRIIa desempeña un papel en la fagocitosis, el estallido respiratorio y la estimulación de citocinas. La expresión de FcyRIIa está regulada positivamente por GM-CSF y y-IFN, y es reducida por IL-4. FcyIIb se expresa en linfocitos B, PMN, macrófagos y mastocitos. FcyIIb inhibe las respuestas mediadas por el mecanismo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM) y, por lo tanto, es un receptor inhibidor. La expresión de FcyRIIc está regulada positivamente por la inmunoglobulina intravenosa (IVIG) e IL-4 y es reducida por y-IFN. FcyRIIc se expresa en linfocitos NK. FcyRIIIa se expresa en linfocitos citolíticos naturales (NK), macrófagos, mastocitos y plaquetas. Este receptor participa en la fagocitosis, el estallido respiratorio, la estimulación de citocinas, la agregación y la desgranulación de las plaquetas, y la ADCC mediada por NK. La expresión de FcyRIII está regulada positivamente por C5a, TGF-p y y-IFN y está regulada negativamente por IL-4. FcyRIIIb es un receptor enlazado a GPI expresado en PMN.
Ciertas regiones Fc tienen unión aumentada a FcyRI, con respecto a FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc, FcyRIIIa y/o FcyRIIIb. Algunas realizaciones de la presente descripción tienen unión aumentada a FcyRIIa, con respecto a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIIc, FcyRIIIa y/o FcyRIIIb. Las regiones Fc particulares tienen unión aumentada a FcyRIIb, con respecto a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIc, FcyRIIIa y/o FcyRIIIb. Ciertas regiones Fc tienen unión aumentada a FcyRIIc, con respecto a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa y/o FcyRIIIb. Algunas regiones Fc tienen unión aumentada a FcyRIIIa, con respecto a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc y/o FcyRIIIb. Las regiones Fc específicas tienen unión aumentada a FcyRIIIb, con respecto a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc y/o FcyRIIIa.
Los FcaR incluyen FcaRI (CD89). El FcaRI se encuentra en la superficie de neutrófilos, eosinófilos, monocitos, ciertos macrófagos (por ejemplo, células de Kupffer) y ciertas células dendríticas. El FcaRI está compuesto por dos dominios extracelulares similares a Ig, es miembro tanto de la superfamilia de inmunoglobulinas como de la familia del receptor de reconocimiento inmunitario de múltiples cadenas (MIRR), y constituye una señal al asociarse con dos cadenas de señalización de FcRy.
Los FceR incluyen FcgRI y FcgRII. El receptor de alta afinidad FcgRI es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, se expresa en células de Langerhans epidérmicas, eosinófilos, mastocitos y basófilos, y desempeña un papel fundamental en el control de las respuestas alérgicas. El FcgRI también se expresa en las células presentadoras de antígenos y regula la producción de citocinas proinflamatorias. El receptor de baja afinidad FcgRII (CD23) es una lectina de tipo C que puede funcionar como un receptor unido a la membrana o soluble. El FcgRII regula el crecimiento y la diferenciación de los linfocitos B, y bloquea la unión a IgE de eosinófilos, monocitos y basófilos. Ciertas regiones Fc tienen unión aumentada a FcgRI, con respecto a FcgRII. Otras regiones Fc tienen unión aumentada a FcgRII, con respecto a FcgRI.
La tabla F1 a continuación resume las características de ciertos FcR.
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Las regiones Fc pueden derivarse de las moléculas de inmunoglobulina de cualquier animal, incluyendo vertebrados tales como mamíferos, tales como vacas, cabras, cerdos, perros, ratones, conejos, hámsteres, ratas, cobayas, primates no humanos y seres humanos. Las secuencias de aminoácidos de las regiones CH2, CH3, CH4 y bisagra de las inmunoglobulinas IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM humanas ejemplares de tipo silvestre se muestran a continuación (SEQ ID NO:128-154).
La SEQ ID NO:128 es la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de IgA1 humana (VPSTPPTPSPSTPPTPSPS).
La SEQ ID NO:129 es la secuencia de aminoácidos de una región CH2 de IgA1 humana (CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEP WNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKS).
La SEQ ID NO:130 es la secuencia de aminoácidos de una región CH3 de IgA1 humana (GNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSI LRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVM AEVDGTCY).
La SEQ ID NO:131 es la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de IgA2 humana (VPPPPP).
La SEQ ID NO:132 es la secuencia de aminoácidos de una región CH2 de IgA2 humana (CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQP WNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKS).
La SEQ ID NO:133 es la secuencia de aminoácidos de una región CH3 de IgA2 humana (GNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSI LRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVM AEVDGTCY).
La SEQ ID NO:134 es la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de IgD humana (ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP).
La SEQ ID NO:135 es la secuencia de aminoácidos de una región CH2 de IgD humana (ECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFWGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHS RLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREP).
La SEQ ID NO:136 es la secuencia de aminoácidos de una región CH3 de IgD humana (AAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPRSTTFWAWSVLR VPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK).
La SEQ ID NO:137 es la secuencia de aminoácidos de una región CH2 de IgE humana (VCSRDFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELT LSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCA).
La SEQ ID NO:138 es la secuencia de aminoácidos de una región CH3 de IgE humana (DSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLP VGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS).
La SEQ ID NO:139 es la secuencia de aminoácidos de una región CH4 de IgE humana (GPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEV TRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK).
La SEQ ID NO:140 es la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de IgG1 humana (EPKSCDKTHTCPPCP).
La SEQ ID NO:341 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia derivada de una región bisagra de IgG1 humana modificada (SDKTHTCPPCP).
La SEQ ID NO:141 es la secuencia de aminoácidos de una región CH2 de IgG1 humana (APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK).
La SEQ ID NO:142 es la secuencia de aminoácidos de una región CH3 de IgG1 humana (GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK).
La SEQ ID NO:342 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia de cadena pesada de IgG1 humana (MSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK). Se apreciará que el residuo de Met en esta secuencia de la cadena pesada de IgG1 humana se puede eliminar, por ejemplo, tras la fusión N-terminal a un polipéptido de HRS (véase la SEQ ID NO:340).
La SEQ ID NO:143 es la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de IgG2 humana (ERKCCVECPPCP). La SEQ ID NO:144 es la secuencia de aminoácidos de una región CH2 de IgG2 humana (APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSV LTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK).
La SEQ ID NO:145 es la secuencia de aminoácidos de una región CH3 de IgG2 humana (GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK).
La SEQ ID NO:146 es la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de IgG3 humana (ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP).
La SEQ ID NO:147 es la secuencia de aminoácidos de una región CH2 de IgG3 humana (APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTK).
La SEQ ID NO:148 es la secuencia de aminoácidos de una región CH3 de IgG3 humana (GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK).
La SEQ ID NO:149 es la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de IgG4 humana (ESKYGPPCPSCP). La SEQ ID NO:150 es la secuencia de aminoácidos de una región CH2 de IgG4 humana (APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK).
La SEQ ID NO:151 es la secuencia de aminoácidos de una región CH3 de IgG4 humana (GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK).
La SEQ ID NO:152 es la secuencia de aminoácidos de una región CH2 de IgM humana (VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKV TSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVP).
La SEQ ID NO:153 es la secuencia de aminoácidos de una región CH3 de IgM humana (DQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDD WNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPK).
La SEQ ID NO:154 es la secuencia de aminoácidos de una región CH4 de IgM humana (GVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHS ILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVM SDTAGTCY).
Un conjugado HRS-Fc de la presente descripción puede, por lo tanto, comprender, consistir en, o consistir esencialmente en una o más de las secuencias de aminoácidos de la región Fc humana de las SEQ ID NO:128-163 o 339-342, incluyendo variantes, fragmentos, homólogos, ortólogos, parálogos, y combinaciones de las mismas. Ciertas realizaciones ilustrativas de la presente descripción comprenden una región Fc que varía en tamaño desde aproximadamente 20-50, 20-100, 20-150, 20-200, 20-250, 20-300, 20-400, 50-100, 50-150, 50-200, 50-250, 50-300, 50-400, 100-150, 100-200, 100-250, 100-300, 100-350, 100-400, 200-250, 200-300, 200-350, o 200-400 aminoácidos de longitud, y opcionalmente comprende, consiste en, o consiste esencialmente en una o más de las SEQ ID NO:128-154 o 341-342. Ciertas realizaciones de la presente descripción comprenden una región Fc de hasta aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400 o más aminoácidos, que opcionalmente comprende, consiste en, o consiste esencialmente en una o más de las SEQ ID NO:128-154 o 339-342.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgA1 humana expuestas en las SEQ ID NO:128-130 o 156, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID NO:128 y 129 y 130, las SEQ ID NO:128 y 129; las SEQ ID NO:128 y 130; las SEQ ID NO:129 y 130), y variantes y fragmentos de las mismas. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgA1 humana expuesta en la SEQ ID NO:128. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgA1 humana expuesta en la SEQ ID NO:129. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgA1 humana expuesta en la SEQ ID NO:130.
Algunas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgA2 humana expuestas en las SEQ ID NO:131-133 o 157, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID No :131 y 132 y 133, las SEQ ID NO:131 y 132; las SEQ ID NO:131 y 133; las SEQ ID NO:132 y 133), y variantes y fragmentos de las mismas. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgA2 humana expuesta en la SEQ ID NO:131. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgA2 humana expuesta en la SEQ ID NO:132. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgA2 humana expuesta en la SEQ ID NO:133.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgD humanas expuestas en las SEQ ID NO:134-136, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID NO:134 y 135 y 136, las SEQ ID NO:134 y 135; las Se Q ID NO:134 y 136; las SEQ ID NO:135 y 136), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgD humana expuesta en la SEQ ID NO:134. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgD humana expuesta en la SEQ ID NO:135. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgD humana expuesta en la SEQ ID NO:136.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencia de IgE humana expuestas en las SEQ ID NO:137-139 o 163, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID NO:137 y 138 y 139, las SEQ ID NO:137 y 138; la SEQ ID NO:137 y 139; las SEQ ID NO:138 y 139), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgE humana expuesta en la SEQ ID NO:137. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgE humana expuesta en la SEQ ID NO:138. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgE humana expuesta en la SEQ ID NO:139.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgG1 humana expuestas en las SEQ ID NO:140-142 o 159 o 339-342, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID NO:140 y 141 y 142, las SEQ ID NO:140 y 141; las SEQ ID NO:140 y 142; las SeQ ID NO:141 y 142), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID nO:140. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID NO:141. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID NO:142. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID NO:339. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID NO:340. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID NO:341. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG1 humana expuesta en la SEQ ID NO:342.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgG2 humana expuestas en las SEQ ID NO:143-145 o 160, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID No :143 y 144 y 145, las SEQ ID NO:143 y 144; las SEQ ID NO:143 y 145; las SEQ ID NO:144 y 145), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG2 humana expuesta en la SEQ ID NO:143. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG2 humana expuesta en la SEQ ID NO:144. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG2 humana expuesta en la SEQ ID NO:145.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgG3 humana expuestas en las SEQ ID NO:146-148 o 161, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID No :146 y 147 y 148, las SEQ ID NO:146 y 147; las SEQ ID NO:146 y 148; las SEQ ID NO:147 y 148), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG3 humana expuesta en la SEQ ID NO:146. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG3 humana expuesta en la SEQ ID NO:147. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG3 humana expuesta en la SEQ ID NO:148.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgG4 humana expuestas en las SEQ ID NO:149-151 o 162, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID NO:149 y 150 y 151, las SEQ ID NO:149 y 150; las SeQ ID NO:149 y 151; las SEQ ID NO:150 y 151), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG4 humana expuesta en la SEQ ID NO:149. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG4 humana expuesta en la SEQ ID NO:150. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgG4 humana expuesta en la SEQ ID NO:151.
Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en secuencias de IgM humana expuestas en las SEQ ID NO:152-154 o 158, en cualquier orden leyendo desde el extremo N hasta el extremo C, incluyendo combinaciones de las mismas (por ejemplo, las SEQ ID NO:152 y 153 y 154, las SEQ ID NO:152 y 153; las SEQ ID NO:152 y 154; las SEQ ID NO:153 y 154), y variantes y fragmentos de estas secuencias y combinaciones. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgM humana expuesta en la SEQ ID NO:152. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgM humana expuesta en la SEQ ID NO:153. Ciertas regiones Fc comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de IgM humana expuesta en la SEQ ID NO:154.
Como se señaló anteriormente, ciertas realizaciones de la presente descripción emplean variantes, fragmentos, híbridos y/o formas modificadas de otra manera una región Fc descrita en el presente documento y conocida en la técnica (por ejemplo, las secuencias de Ig humana de las SEQ ID NO:128-163).
Se incluyen variantes que tienen una o más sustituciones, inserciones, eliminaciones y/o truncamientos de aminoácidos con respecto a una secuencia de referencia, tal como una o más de las secuencias de referencia expuestas en las SEQ ID NO:128-163. En ciertas realizaciones de la presente descripción, una región Fc variante incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o más de identidad o similitud u homología de secuencia con una o más de las SEQ ID NO:128-163. También se incluyen las regiones Fc que difieren de una o más de las SEQ ID NO:128-163 por la adición, eliminación, inserción o sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o más aminoácidos. En ciertas realizaciones de la presente descripción, las adiciones o eliminaciones de aminoácidos se producen en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal de la secuencia Fc de referencia.
En realizaciones particulares de la presente descripción, una región Fc variante comprende una secuencia de aminoácidos que puede alinearse de manera óptima con una cualquiera o más de las SEQ ID NO:128-163 para generar una puntuación (bit score) de BLAST o una puntuaciones de similitud de secuencia de al menos aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 o más, incluyendo todos los números enteros e intervalos intermedios, donde el alineamiento de BLAST usó la matriz BLOSUM62, una penalización de existencia de hueco de 11 y una penalización de extensión de hueco de 1.
También se incluyen regiones Fc híbridas, por ejemplo, regiones Fc que comprenden una combinación de dominios Fc (por ejemplo, bisagra, CH2, CH3, CH4) de inmunoglobulinas de diferentes especies, diferentes clases de Ig y/o diferentes subclases de Ig. Los ejemplos generales incluyen regiones Fc híbridas que comprenden, consisten o consisten esencialmente en la siguiente combinación de dominios CH2/CH3: IgA1/IgA1, IgA1/IgA2, IgA1/IgD, IgAl/IgE, IgA1/IgG1, IgA1/IgG2, IgA1/IgG3, IgA1/IgG4, IgAl/IgM, IgA2/IgA1, IgA2/IgA2, IgA2/IgD, IgA2/IgE, IgA2/IgG1, IgA2/IgG2, IgA2/IgG3, IgA2/IgG4, IgA2/IgM, IgD/IgA1, IgD/IgA2, IgD/IgD, IgD/IgE, IgD/IgG1, IgD/IgG2, IgD/IgG3, IgD/IgG4, IgD/IgM, IgE/IgA1, IgE/IgA2, IgE/IgD, IgE/IgE, IgE/IgG1, IgE/IgG2, IgE/IgG3, IgE/IgG4, IgE/IgM, IgG1/IgA1, IgG1/IgA2, IgG1/IgD, IgG1/IgE, IgG1/IgG1, IgG1/IgG2, IgG1/IgG3, IgG1/IgG4, IgG1/IgM, IgG2/IgA1, IgG2/IgA2, IgG2/IgD, IgG2/IgE, IgG2/IgG1, IgG2/IgG2, IgG2/IgG3, IgG2/IgG4, IgG2/IgM, IgG3/IgA1, IgG3/IgA2, IgG3/IgD, IgG3/IgE, IgG3/IgG1, IgG3/IgG2, IgG3/IgG3, IgG3/IgG4, IgG3/IgM, IgG4/IgA1, IgG4/IgA2, IgG4/IgD, IgG4/IgE, IgG4/IgG1, IgG4/IgG2, IgG4/IgG3, IgG4/IgG4, IgG4/IgM, IgM/IgA1, IgM/IgA2, lgM/IgD, IgM/IgE, IgM/IgG1, IgM/IgG2, IgM/IgG3, IgM/IgG4, IgM/IgM (o fragmentos o variantes de los mismos), e incluyen opcionalmente una bisagra de una o más de IgAI, IgA2, IgD, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, y/o un dominio CH4 de IgE y/o IgM. En realizaciones específicas de la presente descripción, los dominios bisagra, CH2, CH3 y CH4 son de Ig humana.
Los ejemplos adicionales incluyen regiones Fc híbridas que comprenden, consisten o consisten esencialmente en la siguiente combinación de dominios CH2/CH4: IgAI/IgE, IgA2/IgE, IgD/IgE, IgE/IgE, IgG1/IgE, IgG2/IgE, IgG3/IgE, IgG4/IgE, IgM/IgE, IgA1/IgM, IgA2/IgM, IgD/IgM, IgE/IgM, IgG1/IgM, IgG2/IgM, IgG3/IgM, IgG4/IgM, IgM/IgM (o fragmentos o variantes de los mismos), y opcionalmente incluyen una bisagra de una o más de IgA1, IgA2, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y/o un dominio CH3 de una o más de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM. En realizaciones específicas de la presente descripción, los dominios bisagra, CH2, CH3 y CH4 son de Ig humana.
Ciertos ejemplos incluyen regiones Fc híbridas que comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la siguiente combinación de dominios CH3/CH4: IgA1 /IgE, IgA2/IgE, IgD/IgE, IgE/IgE, IgG1/IgE, IgG2/IgE, IgG3/IgE, IgG4/IgE, IgM/IgE, IgA1 /IgM, IgA2/IgM, IgD/IgM, IgE/IgM, IgG1/IgM, IgG2/IgM, IgG3/IgM, IgG4/IgM, IgM/IgM (o fragmentos o variantes de los mismos), y opcionalmente incluyen una bisagra de una o más de IgA1, IgA2, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, y/o un dominio CH2 de una o más de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM. En realizaciones específicas de la presente descripción, los dominios bisagra, CH2, CH3 y CH4 son de Ig humana.
Ejemplos particulares incluyen regiones Fc híbridas que comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la siguiente combinación de dominios bisagra/CH2: IgA1/IgA1, IgA1/IgA2, IgA1/IgD, IgA1/IgE, IgA1/IgG1, IgA1/IgG2, IgA1/IgG3, IgA1/IgG4, IgA1 /IgM, IgA2/IgA1, IgA2/IgA2, IgA2/IgD, IgA2/IgE, IgA2/IgG1, IgA2/IgG2, IgA2/IgG3, IgA2/IgG4, IgA2/IgM, IgD/IgA1, IgD/IgA2, IgD/IgD, IgD/IgE, IgD/IgG1, IgD/IgG2, IgD/IgG3, IgD/IgG4, IgD/IgM, IgG1/IgA1, IgG1/IgA2, IgG1/IgD, IgG1/IgE, IgG1/IgG1, IgG1/IgG2, IgG1/IgG3, IgG1/IgG4, IgG1/IgM, IgG2/IgA1, IgG2/IgA2, IgG2/IgD, IgG2/IgE, IgG2/IgG1, IgG2/IgG2, IgG2/IgG3, IgG2/IgG4, IgG2/IgM, IgG3/IgA1, IgG3/IgA2, IgG3/IgD, IgG3/IgE, IgG3/IgG1, IgG3/IgG2, IgG3/IgG3, IgG3/IgG4, IgG3/IgM, IgG4/IgA1, IgG4/IgA2, IgG4/IgD, IgG4/IgE, IgG4/IgG1, IgG4/IgG2, IgG4/IgG3, IgG4/IgG4, IgG4/IgM (o fragmentos o variantes de los mismos), y opcionalmente incluyen un dominio CH3 de una o más de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM, y/o un dominio CH4 de IgE y/o IgM. En realizaciones específicas de la presente descripción, los dominios bisagra, CH2, CH3 y CH4 son de Ig humana.
Ciertos ejemplos incluyen regiones Fc híbridas que comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la siguiente combinación de dominios bisagra/CH3: IgA1/IgA1, IgA1/IgA2, IgA1/IgD, IgA1/IgE, IgA1/IgG1, IgA1/IgG2, IgA1/IgG3, IgA1/IgG4, IgA1/IgM, IgA2/IgA1, IgA2/IgA2, IgA2/IgD, IgA2/IgE, IgA2/IgG1, IgA2/IgG2, IgA2/IgG3, IgA2/IgG4, IgA2/IgM, IgD/IgA1, IgD/IgA2, IgD/IgD, IgD/IgE, IgD/IgG1, IgD/IgG2, IgD/IgG3, IgD/IgG4, IgD/IgM, IgG1/IgA1, IgG1/IgA2, IgG1/IgD, IgG1/IgE, IgG1/IgG1, IgG1/IgG2, IgG1/IgG3, IgG1/IgG4, IgG1/IgM, IgG2/IgA1, IgG2/IgA2, IgG2/IgD, IgG2/IgE, IgG2/IgG1, IgG2/IgG2, IgG2/IgG3, IgG2/IgG4, IgG2/IgM, IgG3/IgA1, IgG3/IgA2, IgG3/IgD, IgG3/IgE, IgG3/IgG1, IgG3/IgG2, IgG3/IgG3, IgG3/IgG4, IgG3/IgM, IgG4/IgA1, IgG4/IgA2, IgG4/IgD, IgG4/IgE, IgG4/IgG1, IgG4/IgG2, IgG4/IgG3, IgG4/IgG4, IgG4/IgM (o fragmentos o variantes de los mismos), y opcionalmente incluyen un dominio CH2 domain de una o más de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM, y/o un dominio CH4 de IgE y/o IgM. En realizaciones específicas de la presente descripción, los dominios bisagra, CH2, CH3 y CH4 son de Ig humana.
Algunos ejemplos incluyen regiones Fc híbridas que comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la siguiente combinación de dominios bisagra/CH4: IgA1/IgE, IgA1/IgM, IgA2/IgE, IgA2/IgM, IgD/IgE, IgD/IgM, IgG1/IgE, IgG1/IgM, IgG2/IgE, IgG2/IgM, IgG3/IgE, IgG3/IgM, IgG4/IgE, IgG4/IgM (o fragmentos o variantes de los mismos), y opcionalmente incluyen un dominio CH2 de una o más de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM, y/o un dominio CH3 de una o más de IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM.
Se pueden encontrar ejemplos específicos de regiones Fc híbridas, por ejemplo, en el documento WO 2008/147143, que se derivan de combinaciones de subclases de IgG o combinaciones de IgD e IgG humanas.
También se incluyen las regiones Fc derivadas o modificadas de otra manera. En ciertos aspectos de la presente descripción, la región Fc puede modificarse por fosforilación, sulfatación, acrilación, glucosilación, metilación, farnesilación, acetilación, amidación y similares, por ejemplo, con respecto a una región Fc de tipo silvestre o de origen natural. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la región Fc puede comprender patrones de glucosilación de tipo silvestre o nativos, o como alternativa, puede comprender glucosilación aumentada con respecto a una forma nativa, glucosilación disminuida con respecto a una forma nativa, o puede estar completamente desglucosilada. Como ejemplo de una glucoforma de Fc modificada, la glucosilación disminuida de una región Fc reduce la unión a la región C1q del primer componente C1 del complemento, una disminución en la actividad relacionada con ADCC y/o una disminución en la actividad relacionada con CDC. Ciertas realizaciones de la presente descripción emplean, por tanto, una región Fc desglucosilada o aglucosilada. Véase, por ejemplo, el documento WO 2005/047337 para la producción de regiones Fc aglucosiladas ejemplares. Otro ejemplo de una glucoforma de la región Fc puede generarse sustituyendo la posición Q295 con un residuo de cisteína (véase, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2010/0080794), de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat y col. Ciertas realizaciones de la presente descripción pueden incluir regiones Fc donde aproximadamente el 80­ 100 % de la glucoproteína en la región Fc comprende una estructura de carbohidrato central madura que carece de fructosa (véase, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2010/0255013). Algunas realizaciones de la presente descripción pueden incluir regiones Fc que están optimizadas por sustitución o eliminación para reducir el nivel de fucosilación, por ejemplo, para aumentar la afinidad por FcyRI, FcyRIa o FcyRMIa, y/o para mejorar la fagocitosis por células que expresan FcyRIIa (véanse las solicitudes de Estados Unidos N.° 2010/0249382 y 2007/0148170).
Como otro ejemplo de una glucoforma de Fc modificada, una región Fc puede comprender N-glucanos de tipo oligomanosa y, opcionalmente, tener una o más de las siguientes: mayor actividad de ADCC, mayor afinidad de unión por FcyRIIIA (y algunos otros FcR), similar o mayor especificidad de unión para la diana del polipéptido de HRS, similar o mayor afinidad de unión por la diana del polipéptido de HRS, y/o similar o menor afinidad de unión por el receptor de manosa, con respecto a la región Fc correspondiente o el conjugado HRS-Fc que contiene complejos tipo N-glucanos (véase, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0092521 y la patente de Estados Unidos N.° 7.700.321). Como otro ejemplo, la afinidad mejorada de las regiones Fc por FcyR se ha conseguido usando glucoformas creadas por ingeniería genética generadas por la expresión de anticuerpos en líneas celulares variantes o modificadas por ingeniería genética (véase, por ejemplo, Umana y col., Nat Biotechnol. 17: 176-180, 1999; Davies y col., Biotechnol Bioeng. 74: 288-294, 2001; Shields y col., J. Biol Chem. 277: 26733-26740, 2002; Shinkawa y col., 2003, J Biol Chem. 278: 3466-3473, 2003 y la solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0111281). Ciertas glucoformas de la región Fc comprenden una proporción aumentada de cadenas de azúcares complejas de tipo N-glucósido, que no tienen la posición 1 de fucosa unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar (véase, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2010/0092997). Las realizaciones particulares de la presente descripción pueden incluir la región Fc de IgG que está glucosilada con al menos un resto galactosa conectado a un resto de ácido siálico terminal respectivo mediante un enlace a-2,6, opcionalmente cuando la región Fc tiene una mayor actividad antiinflamatoria con respecto a una región Fc de tipo silvestre correspondiente (véase la solicitud de Estados Unidos N.° 2008/0206246). Ciertos de estos enfoques de glucosilación alterada y otros relacionados han generado mejoras sustanciales de la capacidad de las regiones Fc para unirse selectivamente a FcR tales como FcyRIII, para mediar la ADCC y para alterar otras propiedades de las regiones Fc, como se describe en el presente documento.
Ciertas regiones Fc variantes, fragmentos, híbridas o modificadas de otra manera pueden tener unión alterada a uno o más FcR, con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente (por ejemplo, la misma especie, la misma clase de Ig, la misma subclase de Ig). Por ejemplo, dichas regiones Fc pueden tener una unión aumentada a uno o más de los receptores de Fcy, receptores de Fca, receptores de Fce y/o el receptor de Fc neonatal, con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. En otras realizaciones de la presente descripción, regiones Fc variantes, fragmentos, híbridas o modificadas pueden tener una unión disminuida a uno o más de los receptores de Fcy, receptores de Fca, receptores de Fce y/o el receptor de Fc neonatal, con respecto a una secuencia de Fc de tipo silvestre correspondiente. Los FcR específicos se describen en otra parte en el presente documento.
Los ejemplos específicos de variantes de Fc que tienen unión a FcR alterada (por ejemplo, aumentada, disminuida) se pueden encontrar, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.° 5.624.821 y 7.425.619; las solicitudes de Estados Unidos N.° 2009/0017023, 2009/0010921 y 2010/0203046; y los documentos WO 2000/42072 y WO 2004/016750. Ciertos ejemplos incluyen regiones Fc humanas que tienen una o más sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334, por ejemplo, S298A, E333A y/o K334A (basándose en la numeración del índice UE de Kabat y col.), que se ha demostrado que aumenta la unión al receptor activador FcyRMIa y reduce la unión al receptor inhibidor FcyRIIb. Estas mutaciones se pueden combinar para obtener variantes de mutación dobles y triples que tienen mejoras adicionales en la unión a FcR. Ciertas realizaciones de la presente descripción incluyen un mutante triple S298A/E333A/K334A, que tiene unión aumentada a FcyRMIa, unión disminuida a FcyRIIb y ADCC aumentada (véase, por ejemplo, Shields y col., J Biol Chem. 276: 6591-6604, 2001, y Presta y col., Biochem Soc Trans. 30: 487-490, 2002). Véase también las glucoformas de Fc diseñadas por manipulación genética que tienen una mayor unión a los FcR, como se describe en Umana y col., mencionado anteriormente; y la patente de Estados Unidos N.° 7.662.925. Algunas realizaciones de la presente descripción incluyen regiones Fc que comprenden una o más sustituciones seleccionadas de 434S, 252Y/428L, 252Y/434S y 428L/434S (véase las solicitudes de Estados Unidos N.° 2009/0163699 y 20060173170), basadas en el índice UE de Kabat y col.
Ciertas regiones Fc variantes, fragmentos, híbridas o modificadas pueden tener funciones efectoras alteradas, con respecto a una secuencia de Fc de tipo silvestre correspondiente. Por ejemplo, dichas regiones Fc pueden tener una mayor fijación o activación del complemento, mayor afinidad de unión a C1q, mayor actividad relacionada con CDC, mayor actividad relacionada con ADCC y/o mayor actividad relacionada con ADCP, con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. En otras realizaciones de la presente descripción, dichas regiones Fc pueden tener una fijación o activación del complemento disminuida, una afinidad de unión a C1q disminuida, una actividad relacionada con CDC disminuida, una actividad relacionada con ADCC disminuida y/o una actividad relacionada con ADCP disminuida, con respecto a una secuencia de Fc de tipo silvestre correspondiente. Como meramente un ejemplo ilustrativo, una región Fc puede comprender una eliminación o sustitución en un sitio de unión al complemento, tal como un sitio de unión a C1q, y/o una eliminación o sustitución en un sitio de ADCC. Ejemplos de dichas eliminaciones/sustituciones se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 7.030.226. Muchas funciones efectoras de Fc, tales como ADCC, pueden ensayarse de acuerdo con técnicas de rutina en la técnica (véase, por ejemplo, Zuckerman y col., CRC Crit Rev Microbiol. 7: 1-26, 1978). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen, aunque sin limitarse a, linfocitos citolíticos naturales (NK), macrófagos y otras células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Como alternativa, o adicionalmente, ciertas funciones efectoras de Fc pueden evaluarse in vivo, por ejemplo, empleando un modelo animal descrito en Clynes y col. PNAS. 95: 652-656, 1998.
Ciertas regiones Fc variantes, híbridas o modificadas pueden tener estabilidad o semivida relativas a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. En ciertas realizaciones de la presente descripción, dichas regiones Fc pueden tener una semivida aumentada con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. En otras realizaciones de la presente descripción, las regiones Fc híbridas variantes o modificadas pueden tener una semivida reducida con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. La semivida se puede medir in vitro (por ejemplo, en condiciones fisiológicas) o in vivo, de acuerdo con técnicas de rutina en la técnica, tales como radioetiquetado, ELISA u otros procedimientos. Las mediciones in vivo de estabilidad o semivida se pueden medir en uno o más fluidos corporales, incluyendo sangre, suero, plasma, orina o líquido cefalorraquídeo, o un tejido dado, tal como hígado, riñones, músculos, tejidos del sistema nervioso central, hueso, etc. Como ejemplo, las modificaciones a una región Fc que alteran su capacidad para unirse al FcRn pueden alterar su semivida in vivo. Los ensayos para medir las propiedades farmacocinéticas in vivo (por ejemplo, la semivida de eliminación media in vivo) y los ejemplos no limitantes de modificaciones de Fc que alteran su unión al FcRn se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.° 7.217.797 y 7.732.570; y las solicitudes de Estados Unidos N.° US 2010/0143254 y 2010/0143254.
Ejemplos no limitantes adicionales de modificaciones para alterar la estabilidad o la semivida incluyen sustituciones/eliminaciones en uno o más de los residuos de aminoácidos seleccionados de entre 251-256, 285-290 y 308-314 en el dominio CH2, y 385-389 y 428-436 en el dominio CH3, de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat y col. Véase la solicitud de Estados Unidos N.° 2003/0190311. Los ejemplos específicos incluyen la sustitución con leucina en la posición 251, la sustitución con tirosina, triptófano o fenilalanina en la posición 252, la sustitución con treonina o serina en la posición 254, la sustitución con arginina en la posición 255, la sustitución con glutamina, arginina, serina, treonina o glutamato en la posición 256, sustitución con treonina en la posición 308, la sustitución con prolina en la posición 309, la sustitución con serina en la posición 311, la sustitución con aspartato en la posición 312, la sustitución con leucina en la posición 314, la sustitución con arginina, aspartato o serina en la posición 385, la sustitución con treonina o prolina en la posición 386, la sustitución con arginina o prolina en la posición 387, la sustitución con prolina, asparagina o serina en la posición 389, la sustitución con metionina o treonina en la posición 428, la sustitución con tirosina o fenilalanina en la posición 434, la sustitución con histidina, arginina, lisina o serina en la posición 433 y/o la sustitución con histidina, tirosina, arginina o treonina en la posición 436, incluyendo cualquier combinación de las mismas. Dichas modificaciones aumentan opcionalmente la afinidad de la región Fc por el FcRn y, por lo tanto, aumentan la semivida, con respecto a una región Fc de tipo silvestre correspondiente.
Ciertas regiones Fc variantes, híbridas o modificadas, pueden tener una solubilidad alterada con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. En ciertas realizaciones de la presente descripción, dichas regiones Fc pueden tener mayor solubilidad con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. En otras realizaciones de la presente descripción, las regiones Fc variantes, híbridas o modificadas pueden tener una solubilidad disminuida con respecto a una secuencia Fc de tipo silvestre correspondiente. La solubilidad se puede medir, por ejemplo, in vitro (por ejemplo, en condiciones fisiológicas) de acuerdo con técnicas de rutina en la técnica. Las mediciones de solubilidad ejemplares se describen en otra parte en el presente documento.
Los ejemplos adicionales de variantes incluyen regiones Fc de IgG que tienen sustituciones conservativas o no conservativas (como se describe en otra parte en el presente documento) en una o más de las posiciones 250, 314 o 428 de la cadena pesada, o en cualquier combinación de las mismas, tal como en las posiciones 250 y 428, o en las posiciones 250 y 314, o en las posiciones 314 y 428, o en las posiciones 250, 314 y 428 (véase, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2011/0183412). En realizaciones específicas de la presente descripción, el residuo en la posición 250 está sustituido con ácido glutámico o glutamina, y/o el residuo en la posición 428 está sustituido con leucina o fenilalanina. Como otro ejemplo ilustrativo de una variante de Fc de IgG, uno cualquiera o más de los residuos de aminoácidos en las posiciones 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 y/o 327 a 331 se pueden usar como una diana adecuada para la modificación (por ejemplo, sustitución conservativa o no conservativa, eliminación). En realizaciones particulares de la presente descripción, el dominio CH2 variante de Fc de IgG contiene sustituciones de aminoácidos en las posiciones 228, 234, 235 y/o 331 (por ejemplo, IgG4 humana con mutaciones Ser228Pro y Leu235Ala) para atenuar las funciones efectoras de la región Fc (véase la patente de Estados Unidos N.° 7.030.226). En este contexto, la numeración de los residuos en la cadena pesada es la del índice UE (véase Kabat y col., «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5a edición, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Algunas de estas y realizaciones relacionadas de la presente descripción tienen alterada (por ejemplo, aumentada, disminuida) la unión a FcRn y/o la semivida en suero, opcionalmente sin funciones efectoras reducidas tales como actividades relacionadas con ADCC o CDC.
Los ejemplos adicionales incluyen regiones Fc variantes que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 279, 341, 343 o 373 de una región Fc de tipo silvestre, o cualquier combinación de las mismas (véase, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0224188). Los residuos de aminoácidos de tipo silvestre en estas posiciones para la IgG humana son valina (279), glicina (341), prolina (343) y tirosina (373). La o las sustituciones pueden ser conservativas o no conservativas, o pueden incluir aminoácidos o miméticos de origen no natural, como se describe en el presente documento. Solas o en combinación con estas sustituciones, ciertas realizaciones de la presente descripción también pueden emplear una región Fc variante que comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas de entre las siguientes: 235G, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238E, 238G, 238H, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 244L, 245R, 247A, 247D, 247E, 247F, 247M, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247T, 247W, 247Y, 248F, 248P, 248Q, 248W, 249L, 249M, 249N, 249P, 249Y, 251H, 251I, 251W, 254D, 254E, 254F, 254G, 254H, 254I, 254K, 254L, 254M, 254N, 254P, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256H, 256I, 256K, 256L, 256V, 256W, 256Y, 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 258D, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267H, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271T, 272H, 272K, 272L, 272R, 279A, 279D, 279F, 279G, 279H, 279I, 279K, 279L, 279M, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280T, 283F, 283G, 283H, 283I, 283K, 283L, 283M, 283P, 283R, 283T, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288P, 292E, 292F, 292G, 292I, 292L, 293S, 293V, 301W, 304E, 307E, 307M, 312P, 315F, 315K, 315L, 315P, 315R, 316F, 316K, 317P, 317T, 318N, 318P, 318T, 332F, 332G, 332L, 332M, 332S, 332V, 332W, 339D, 339E, 339F, 339G, 339H, 339I, 339K, 339L, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 341D, 341E, 341F, 341H, 341I, 341K, 341L, 341M, 341N, 341P, 341Q, 341R, 341S, 341T, 341V, 341W, 341Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343G, 343H, 343I, 343K, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 343W, 343Y, 373D, 373E, 373F, 373G, 373H, 373I, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 373V, 373W, 375R, 376E, 376F, 376G, 376H, 3761, 376L, 376M, 376N, 376P, 376Q, 376R, 376S, 376T, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377P, 378N, 379N, 379Q, 379S, 379T, 380D, 380N, 380S, 380T, 382D, 382F, 382H, 382I, 382K, 382L, 382M, 382N, 382P, 382Q, 382R, 382S, 382T, 382V, 382W, 382Y, 385E, 385P, 386K, 423N, 424H, 424M, 424V, 426D, 426L, 427N, 429A, 429F, 429M, 430A, 430D, 430F, 430G, 430H,
4301, 430K, 430L, 430M, 430N, 430P, 430Q, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431H, 431K, 431P, 432R,
432S, 438G, 438K, 438L, 438T, 438W, 439E, 439H, 439Q, 440D, 440E, 440F, 440G, 440H, 440I, 440K, 440L, 440M, 440Q, 440T, 440V o 442K. Como anteriormente, la numeración de los residuos en la cadena pesada es la del índice UE (véase Kabat y col., mencionado anteriormente). Dichas regiones Fc variantes confieren típicamente una función efectora alterada o una semivida en suero alterada al polipéptido de HRS al que está unida operativamente la región Fc variante. Preferentemente, la función efectora alterada es un aumento en ADCC, una disminución en ADCC, un aumento en CDC, una disminución en CDC, un aumento en la afinidad de unión a C1q, una disminución en la afinidad de unión a C1q, un aumento en la afinidad de unión a FcR (preferentemente FcRn) o una disminución en la afinidad de unión a FcR (preferentemente FcRn) en comparación con una región Fc correspondiente que carece de dicha o dichas sustituciones de aminoácidos.
Los ejemplos adicionales incluyen regiones Fc variantes que comprenden una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones 221, 222, 224, 227, 228, 230, 231, 223, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243,
244, 245, 246, 247, 249, 250, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 27 280, 281, 283, 285, 286, 288, 290, 291, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 302, 313, 317, 318, 320 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335336 y/o 428 (véase, por ejemplo, la patente Unidos N.° 7.662.925). En realizaciones específicas de la presente descripción, la región Fc variante comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: P230A, E233D, L234E, L234Y, L234I, L235D, L235S, L235Y, L235I, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239T, V240I, V240M, F243L, V264I, V264T, V264Y, V266I, E272Y, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276L, Y278T, V302I, E318R, S324D, S324I, S324V, N325T, K326I, K326T, L328M, L328I, L328Q, L328D, L328V, L328T, A330Y, A330L, A330I, I332D,
I332E, I332N, I332Q, T335D, T335R y T335Y. En otras realizaciones específicas de la presente descripción, la región Fc variante comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
V264I, F243L/V264I, L328M, I332E, L328M/I332E, V264I/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, S239E, A330Y, I332D, L328I/I332E, L328Q/I332E, V264T, V240I, V266I, S239D, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N, S239D/I332Q, S239E/I332D, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239N/I332D, S239N/I332E, S239Q/I332D, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E, A330L/I332E, V264I/A330L/I332E, L234E, L234Y, L234I, L235D, L235S, L235Y, L235I, S239T, V240M, V264Y, A330I, N325T, L328D/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328I/I332E, S239E/V264I/I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/I332E, V264I/S298A/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V264I/S298A/I332E, S239D/V264I/A330L/I332E, S239D/I332E/A330I, P230A, P230A/E233D/I332E, E272Y, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276L, Y278T, V302I, E318R, S324D, S324I, S324V, K326I, K326T, T335D, T335R, T335Y, V240I/V266I, S239D/A330Y/I332E/L234I, S239D/A330Y/I332E/L235D, S239D/A330Y/I332E/V240I, S239D/A330Y/I332E/V264T, S239D/A330Y/I332E/K326E y S239D/A330Y/I332E/K326T, En realizaciones más específicas de la presente descripción, la región Fc variante comprende una serie de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:
N297D/I332E, F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E, S239D/N297D/I332E, S239E/N297D/I332E, S239D/D265Y/N297D/I332E, S239D/D265H/N297D/I332E, V264E/N297D/I332E, Y296N/N297D/I332E, N297D/A330Y/I332E, S239D/D265V/N297D/I332E, S239D/D265I/N297D/I332E y N297D/S298A/A330Y/I332E. En realizaciones específicas de la presente descripción, la región Fc variante comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 332 (usando la numeración del índice UE, Kabat y col., mencionado anteriormente). Los ejemplos de sustituciones incluyen 332A, 332D, 332E, 332F, 332G, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q,
332R, 332S, 332T, 332V, 332W y 332Y. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice UE de Kabat y col. Entre otras propiedades descritas en el presente documento, dichas regiones Fc variantes pueden tener afinidad aumentada por un FcyR, estabilidad aumentada y/o solubilidad aumentada, con respecto a una región Fc de tipo silvestre correspondiente.
Otros ejemplos incluyen regiones Fc variantes que comprenden una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 224N/Y, 225A, 228L, 230S, 239P, 240A, 241L, 243S/L/G/H/I, 244L, 246E, 247L/A, 252T, 254T/P,
258K, 261Y, 265V, 266A, 267G/N, 268N, 269K/G, 273A, 276D, 278H, 279M, 280N, 283G, 285R, 288R, 289A, 290E,
291L, 292Q, 297D, 299A, 300H, 301C, 304G, 305A, 306I/F, 311R, 312N, 315D/K/S, 320R, 322E, 323A, 324T, 325S, 326E/R, 332T, 333D/G, 335I, 338R, 339T, 340Q, 341E, 342R, 344Q, 347R, 351S, 352A, 354A, 355W, 356G, 358T, 361D/Y, 362L, 364C, 365Q/P, 370R, 372L, 377V, 378T, 383N, 389S, 390D, 391C, 393A, 394A, 399G, 404S, 408G,
409R, 4111, 412A, 414M, 421S, 422I, 426F/P, 428T, 430K, 431S, 432P, 433P, 438L, 439E/R, 440G, 441F, 442T,
445R, 446A, 447E, opcionalmente, cuando la variante tiene reconocimiento alterado de un ligando de Fc y/o una función efectora alterada en comparación con un polipéptido Fc parental, y donde la numeración de los residuos es la del índice UE como en Kabat y col. Los ejemplos específicos de estas y realizaciones relacionadas de la presente descripción incluyen regiones Fc variantes que comprenden o consisten en los siguientes conjuntos de sustituciones:
(1) N276D, R292Q, V305A, I377V, T394A, V412A y K439E; (2) P244L, K246E, D399G y K409R; (3) S304G, K320R, S324T, K326E y M358T; (4) F243S, P247L, D265V, V266A, S383N y T411I; (5) H224N, F243L, T393A y H433P; (6) V240A, S267G, G341E y E356G; (7) M252T, P291L, P352A, R355W, N390D, S408G, S426F y A431S; (8) P228L, T289A, L365Q, N389S y 5440G; (9) F241L, V273A, K340Q y L441F; (10) F241L, T299A, I332T y M428T; (11) E269K, Y300H, Q342R, V422I y G446A; (12) T225A, R301c, S304G, D312N, N315D, L351S y N421S; (13) S254T, L306I, K326R y Q362L; (14) H224Y, P230S, V323A, E333D, K338R y S364C; (15) T335I, K414M y P445R; (16) T335I y K414M; (17) P247A, E258K, D280N, K288R, N297D, T299A, K322E, Q342R, S354A y L365P; (18) H268N, V279M, A339T, N361D y S426P; (19) C261Y, K290E, L306F, Q311R, E333G y Q438L; (20) E283G, N315K, E333G, R344Q, L365P y S442T; (21) Q347R, N361Y y K439R; (22) S239P, S254P, S267N, H285R, N315S, F372L, A378T, N390D, Y391C, F404S, E430K, L432P y K447E; y (23) E269G, Y278H, N325S y K370R, donde la numeración de los residuos es la del índice UE como en Kabat y col., (véase, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2010/0184959).
Otro ejemplo específico de una variante de Fc comprende la secuencia de la SEQ ID NO:155, donde Xaa en la posición 1 es Ala o está ausente; Xaa en la posición 16 es Pro o Glu; Xaa en la posición 17 es Phe, Val o Ala; Xaa en la posición 18 es Leu, Glu o Ala; Xaa en la posición 80 es Asn o Ala; y/o Xaa en la posición 230 es Lys o está ausente (véase, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos N.° 2007/0253966). Ciertas de estas regiones Fc, y los conjugados HRS-Fc relacionados, tienen semivida aumentada, actividad efectora reducida y/o son significativamente menos inmunógenas que las secuencias Fc de tipo silvestre.
Las regiones Fc variantes también pueden tener una o más regiones bisagra mutadas, como se describe, por ejemplo, en la solicitud de Estados Unidos N.° 2003/0118592. Por ejemplo, una o más cisteínas en una región bisagra se pueden eliminar o sustituir con un aminoácido diferente. La región bisagra mutada puede no comprender residuos de cisteína, o puede comprender 1, 2 o 3 residuos de cisteína menos que una región bisagra de tipo silvestre correspondiente. En algunas realizaciones de la presente descripción, una región Fc que tiene una región bisagra mutada de este tipo exhibe una capacidad reducida para dimerizar, con respecto a una región bisagra de Ig de tipo silvestre.
Como se ha señalado anteriormente, los conjugados HRS-Fc, tales como las proteínas de fusión HRS-Fc, típicamente tienen propiedades farmacocinéticas alteradas (por ejemplo, mejoradas, aumentadas, disminuidas) con respecto a los polipéptidos de HRS correspondientes. Los ejemplos de propiedades farmacocinéticas incluyen estabilidad o semivida, biodisponibilidad (la fracción de un fármaco que se absorbe), distribución tisular, volumen de distribución (volumen aparente donde un fármaco se distribuye inmediatamente después de haber sido inyectado por vía intravenosa y se equilibra entre plasma y los tejidos circundantes), concentración (concentración inicial o en equilibrio del fármaco en plasma), constante de la tasa de eliminación (tasa a la que se eliminan los fármacos del cuerpo), tasa de eliminación (tasa de infusión requerida para equilibrar la eliminación), área bajo la curva (AUC o exposición; integral de la curva de concentración-tiempo, después de una dosis única o en situación de equilibrio), aclaramiento (volumen de plasma aclarado del fármaco por unidad de tiempo), Cmax (concentración plasmática máxima de un fármaco después de la administración oral), tmax (tiempo hasta alcanzar la Cmax), Cmin (la concentración más baja que alcanza un fármaco antes de que se administre la siguiente dosis) y la fluctuación (fluctuación entre máximos dentro un intervalo de dosificación en situación de equilibrio). En algunos aspectos de la presente descripción, estas propiedades mejoradas se consiguen sin alterar significativamente la estructura secundaria y/o reducir la actividad biológica no canónica del polipéptido de HRS. De hecho, algunos conjugados HRS-Fc tienen un aumento de la actividad biológica no canónica.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción, el conjugado HRS-Fc o el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene un perfil de AUC farmacocinético en plasma o suero al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 veces mayor que un polipéptido de HRS no modificado o modificado de manera diferente correspondiente, cuando se administra a un mamífero en condiciones iguales o comparables. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el conjugado HRS-Fc o el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene una estabilidad (por ejemplo, medida mediante semivida) que es al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 % mayor que un polipéptido de HRS no modificado o modificado de manera diferente correspondiente, cuando se compara en condiciones similares a temperatura ambiente, por ejemplo, en PBS a pH 7,4 durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 días, o 1, 2, 3, 4 semanas más o menos.
En realizaciones particulares de la presente descripción, un conjugado HRS-Fc o un polipéptido de fusión HRS-Fc tiene una semivida biológica a pH 7,4, 25 °C, por ejemplo, un pH fisiológico, temperatura corporal humana (por ejemplo, in vivo, en suero, en un tejido dado, en una especie dada tal como rata, ratón, mono o ser humano), de aproximadamente o al menos aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 50 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 70 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 80 horas, aproximadamente 84 horas, aproximadamente 90 horas, aproximadamente 96 horas, aproximadamente 120 horas, o aproximadamente 144 horas o más o cualquier semivida intermedia.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el conjugado HRS-Fc o el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene una mayor biodisponibilidad después de la administración subcutánea (SC) en comparación con un polipéptido de HRS no modificado correspondiente. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el conjugado HRS-Fc o el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 100 %, o más biodisponibilidad en comparación con el polipéptido de HRS no modificado correspondiente.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene sustancialmente la misma estructura secundaria que un polipéptido de HRS no modificado o modificado de manera diferente correspondiente, de acuerdo con se determina mediante un análisis de dicroismo circular UV. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene sustancialmente la misma actividad que un polipéptido de HRS no modificado o modificado de manera diferente correspondiente, en un ensayo de actividad antiinflamatoria. En otras realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces la actividad de un polipéptido de HRS no modificado o modificado de manera diferente correspondiente, en un ensayo de actividad antiinflamatoria.
Enlazadores peptídicos
En ciertas realizaciones de la presente descripción, se puede emplear una secuencia de enlazador peptídico para separar el o los polipéptidos de HRS y la o las regiones Fc en una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliegue a sus estructuras secundarias y terciarias deseadas. Dicha secuencia de enlazador peptídico puede incorporarse a la proteína de fusión usando técnicas estándar bien conocidas en la técnica.
Ciertas secuencias de enlazador peptídico se pueden seleccionar basándose en los siguientes factores ejemplares: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podría interactuar con los epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptidos; (3) su estabilidad fisiológica; y (4) la falta de residuos hidrófobos o cargados que puedan reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido, u otras características. Véase, por ejemplo, George y Heringa, J Protein Eng. 15: 871­ 879, 2002.
La secuencia de enlazador generalmente puede tener una longitud de 1 a aproximadamente 200 aminoácidos. Los enlazadores particulares pueden tener una longitud global de aminoácidos de aproximadamente 1-200 aminoácidos, 1-150 aminoácidos, 1-100 aminoácidos, 1-90 aminoácidos, 1-80 aminoácidos, 1-70 aminoácidos, 1-60 aminoácidos, 1-50 aminoácidos, 1-40 aminoácidos, 1-30 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-5 aminoácidos, 1-4 aminoácidos, 1-3 aminoácidos, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más aminoácidos.
Un enlazador peptídico puede emplear uno cualquiera o más aminoácidos de origen natural, aminoácidos de origen no natural, análogos de aminoácidos y/o miméticos de aminoácidos como se describe en otra parte en el presente documento y se conoce en la técnica. Ciertas secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de manera útil como enlazadores incluyen las divulgadas en Maratea y col., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy y col., PNAS EE. UU.
83: 8258-8262, 1986; patente de Estados Unidos N.° 4.935.233 y patente de Estados Unidos N.° 4.751.180. Las secuencias de enlazador peptídico particulares contienen residuos Gly, Ser y/o Asn. Si se desea, también se pueden emplear otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, en la secuencia de enlazador peptídico.
Ciertos enlazadores ejemplares incluyen enlazadores que contienen Gly, Ser y/o Asn, de la siguiente manera: enlazadores [G]x, [S]x, [N]x, [GS]x, [GGS]x, [GSS]x, [GSGS]x (SEQ ID NO:200), [GGSG]x (SEQ ID NO:201), [GGGS]x (SEQ ID NO:202), [GGGGS]x (SEQ ID NO:203), [GN]x, [GGN]x, [GNN]x, [GNGN]x (SEQ ID NO:204), [GGNG]x (SEQ ID NO:205), [GGGN]x (SEQ ID NO:206), [GGGGN]x (SEQ ID NO:207), donde x es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 o más. Otras combinaciones de estos y aminoácidos relacionados serán evidentes para los expertos en la materia.
Los ejemplos adicionales de péptidos enlazadores incluyen, aunque sin limitarse a las siguientes secuencias de aminoácidos: Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQ ID NO:208); Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQ ID NO:209); Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQ ID NO:210); Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-(SEQ ID NO:211); y Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg-(SEQ ID NO:212).
Otros ejemplos no limitantes de péptidos enlazadores incluyen DGGGS (SEQ ID NO:213); TGEKP (SEQ ID NO:214) (véase, por ejemplo, Liu y col., PNAS. 94: 5525-5530, 1997); GGRR (SEQ ID NO:215) (Pomerantz y col. 1995); (GGGGS)n (SEQ ID NO:203) (Kim y col., PNAS. 93: 1156-1160, 1996); EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO:216) (Chaudhary y col., PNAS. 87: 1066-1070, 1990); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO:217) (Bird y col., Science.
242: 423-426, 1988), GGRRGGGS (SEQ ID NO:218); LRQRDGERP (SEQ ID NO:219); LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO:220); LRQKd(GGGS)2 ERP (SEQ ID NO:221). En realizaciones específicas de la presente descripción, la secuencia de enlazador comprende una secuencia de enlazador Gly3, que incluye tres residuos de glicina. En realizaciones particulares de la presente descripción, los enlazadores flexibles pueden diseñarse racionalmente usando un programa informático capaz de modelizar tanto los sitios de unión a ADN como los propios péptidos (Desjarlais y Berg, PNAS. 90: 2256-2260, 1993; y PNAS. 91: 11099-11103, 1994) o mediante procedimientos de presentación en fagos.
Los enlazadores peptídicos pueden ser fisiológicamente estables o pueden incluir un enlazador liberable tal como un enlazador fisiológicamente degradable o enzimáticamente escindible (por ejemplo, un enlazador escindible proteolíticamente). En ciertas realizaciones de la presente descripción, uno o más enlazadores liberables pueden dar como resultado una semivida más corta y un aclaramiento más rápido del conjugado. Estas y otras realizaciones relacionadas de la presente descripción se pueden usar, por ejemplo, para mejorar la solubilidad y la vida útil en la circulación sanguínea de los polipéptidos de HRS en el torrente sanguíneo, mientras que también se suministra un polipéptido de HRS al torrente sanguíneo que, posteriormente a la degradación del enlazador, está sustancialmente libre de la o las regiones Fc. Estos aspectos de la presente descripción son especialmente útiles en aquellos casos donde los polipéptidos de HRS, cuando se conjugan permanentemente a una región Fc, demuestran una actividad reducida. Usando los enlazadores que se proporcionan en el presente documento, dichos polipéptidos de HRS pueden mantener su actividad terapéutica cuando están en forma conjugada. Como otro ejemplo, se puede administrar un polipéptido conjugado HRS-Fc grande y relativamente inerte, que a continuación se degrada in vivo (mediante el enlazador degradable) para generar un polipéptido de HRS bioactivo que posee una parte de la región Fc o que carece por completo de la región Fc. De esta y otras maneras, las propiedades del polipéptido conjugado HRS-Fc se pueden adaptar de manera más eficaz para equilibrar la bioactividad y la semivida en circulación del polipéptido de HRS a lo largo del tiempo.
En realizaciones particulares de la presente descripción, el péptido enlazador comprende un sitio de escisión del péptido autocatalítico o de autoescisión. En una realización particular de la presente descripción, los péptidos de autoescisión incluyen aquellas secuencias polipeptídicas obtenidas de péptidos de potyvirus y cardiovirus 2A, FMDV (virus de la fiebre aftosa), virus A de rinitis equina, virus de Thosea asigna y tescovirus porcino. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el sitio del polipéptido de autoescisión comprende un sitio, secuencia o dominio 2A o similar a 2A (Donnelly y col., J. Gen. Virol. 82: 1027-1041, 2001). Los sitios 2A ejemplares incluyen las siguientes secuencias: LLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:222); TLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:223); LLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:224); NFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:225); QLLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:226); APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:227); VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQT (SEQ ID NO:228); LNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:229); LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:230); y EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:231). En una realización de la presente descripción, el sitio de escisión del péptido autocatalítico comprende una secuencia señal de traducción 2A, tal como, por ejemplo, la región 2A de la poliproteína del virus de la fiebre aftosa (FMDV), que es una secuencia de 18 aminoácidos. Los ejemplos adicionales de secuencias similares a 2A que pueden usarse incluyen poliproteínas de virus de insectos, la proteína NS34 de los rotavirus de tipo C y secuencias repetidas en Trypanosoma spp., Como se describe, por ejemplo, en Donnelly y col., Journal of General Virology. 82: 1027-1041, 2001.
Los sitios de escisión de proteasas y los péptidos de autoescisión adecuados son conocidos por los expertos (véase, por ejemplo, Ryan y col., J. Gener. Virol. 78: 699-722, 1997; y Scymczak y col., Nature Biotech. 5: 589-594, 2004). Los sitios ejemplares de escisión de proteasas incluyen, aunque sin limitarse a, los sitios de escisión de proteasas NIa de potyvirus (por ejemplo, proteasas del virus del jaspeado del tabaco), las proteasas HC de potyvirus, las proteasas P1 (P35) de potyvirus, las proteasas NIa de biovirus, las proteasas codificadas por ARN-2 de biovirus, proteasas L de aftovirus, proteasas 2A de enterovirus, proteasas 2A de rinovirus, proteasas 3C de picornavirus, proteasas 24K de comovirus, proteasas 24K de nepovirus, proteasa similar a 3C de RTSV (virus esférico del tungro del arroz), proteasa similar a 3c de PYVF (virus del moteado amarillo de la chirivía), heparina, trombina, factor Xa y enterocinasa. Debido a su alta rigurosidad de escisión, los sitios de escisión de la proteasa de TEV (virus de jaspeado del tabaco) se incluyen en algunas realizaciones de la presente descripción, por ejemplo, EXXYXQ (G/S) (SEQ ID NO:232), por ejemplo, ENLYFQG (SEQ ID NO:233) y ENLYFQS (SEQ ID NO:234), donde X representa cualquier aminoácido (la escisión por TEV se produce entre Q y G o Q y S).
Otros ejemplos de enlazadores degradables enzimáticamente adecuados para uso en realizaciones particulares de la presente descripción incluyen, aunque sin limitarse a: una secuencia de aminoácidos escindida por una serina proteasa tal como trombina, quimotripsina, tripsina, elastasa, calicreína o substilisina. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoácidos escindibles por trombina incluyen, aunque sin limitarse a: -Gly-Arg-Gly-Asp-(SEQ ID NO:235), -Gly-Gly-Arg-, -Gly- Arg-Gly-Asp-Asn-Pro-(SEQ ID NO:236), -Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-(SEQ ID NO:237), -Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-(SEQ ID NO:238), -Gly-Pro-Arg-, -Val-Pro-Arg-, y -Phe- Val -Arg-. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoácidos escindibles por elastasa incluyen, aunque sin limitarse a: -Ala-Ala-Ala-, -Ala-Ala-Pro-Val-(SEQ ID NO:239), - Ala-Ala-Pro-Leu-(SEQ ID NO:240), -Ala-Ala-Pro-Phe-(SEQ ID NO:241), -Ala-Ala-Pro-Ala-(SEQ ID NO:242) y -Ala-Tyr-Leu-Val-(SEQ ID NO:243).
Los enlazadores enzimáticamente degradables también incluyen secuencias de aminoácidos que pueden ser escindidas por una metaloproteinasa de la matriz tal como colagenasa, estromelisina y gelatinasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoácidos escindibles por metaloproteinasas de la matriz incluyen, aunque sin limitarse a: -Gly-Pro-Y-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO:244), -Gly-Pro-, Leu-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO:245), -Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO:246), y -Ala-Pro-Gly-Leu-Z-(SEQ ID NO:247), donde Y y Z son aminoácidos. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de aminoácidos escindibles por colagenasa incluyen, aunque sin limitarse a: -Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-Z-(SEQ ID NO:248), -Pro-Leu-Gly-Leu-Leu-Gly-Z-(SEQ ID NO:249), -Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Trp-(SEQ ID NO:250), -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-(SEQ ID NO:251), -Pro-Leu-Gly-Leu-Tyr-Ala-(SEQ ID NO:252), -Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-(SEQ ID NO:253) y -Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg-(SEQ ID No :254), donde Z es un aminoácido. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de aminoácidos escindible por estromelisina es -Pro-Tyr-Ala-Tyr-Tyr-Met-Arg-(SEQ ID NO:255); y un ejemplo de una secuencia de aminoácidos escindible por gelatinasa es -Pro-Leu-Gly-Met-Tyr-Ser-Arg-(SEQ ID NO:256).
Los enlazadores enzimáticamente degradables para uso en realizaciones particulares de la presente descripción también incluyen secuencias de aminoácidos que pueden ser escindidas por una enzima convertidora de angiotensina, tales como, por ejemplo, -Asp-Lys-Pro-, -Gly-Asp-Lys-Pro-(SEQ ID NO:257) y -Gly-Ser-Asp-Lys-Pro-(SEQ ID NO:258).
Los enlazadores enzimáticamente degradables para uso en realizaciones particulares de la presente descripción también incluyen secuencias de aminoácidos que pueden ser degradadas por catepsina B, tales como, por ejemplo, Val-Cit, Ala-Leu-Ala-Leu-(SEQ ID NO:259), Gly-Phe-Leu-Gly-(SEQ ID NO:260) y Phe-Lys.
En realizaciones particulares de la presente descripción, un conector liberable tiene una semivida a pH 7,4, 25 °C, por ejemplo, un pH fisiológico, temperatura del cuerpo humano (por ejemplo, in vivo, en suero, en un tejido dado), de aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas o aproximadamente 96 horas o más o cualquier semivida intermedia. Un experto en la materia apreciaría que la semivida de un polipéptido conjugado HRS-Fc puede adaptarse a medida de manera precisa usando un enlazador liberable particular.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, sin embargo, uno o más de los enlazadores peptídicos son opcionales. Por ejemplo, las secuencias de enlazador pueden no ser necesarias cuando el primer y el segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos N-terminales y/o C-terminales no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia estérica.
Procedimientos para uso
Las realizaciones de la presente descripción se refieren al descubrimiento de que los polipéptidos conjugados de región Fc-histidil-ARNt sintetasa (HRS-Fc), y los fragmentos y variantes de los mismos, ofrecen procedimientos mejorados para modular las respuestas inflamatorias de diversas maneras útiles, tanto in vitro como in vivo Las composiciones de la descripción pueden ser útiles, por lo tanto, como inmunomoduladores para el tratamiento de una amplia gama de indicaciones proinflamatorias, inflamatorias y/o autoinmunitarias, incluyendo las respuestas inflamatorias, la inflamación crónica, la inflamación aguda y las enfermedades inmunitarias, modulando las células que median, ya sea directa o indirectamente, dichas enfermedades afecciones y trastornos inflamatorios y/o autoinmunitarios. La utilidad de las composiciones de la descripción como inmunomoduladores se puede monitorizar usando cualquiera de una serie de técnicas conocidas y disponibles en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ensayos de migración (por ejemplo, usando leucocitos o linfocitos), ensayos de producción de citocinas o ensayos de viabilidad celular o diferenciación celular (por ejemplo, usando linfocitos B, linfocitos T, monocitos o linfocitos NK).
La «inflamación» se refiere en general a la respuesta biológica de los tejidos a estímulos perjudiciales, tales como patógenos, células dañadas (por ejemplo, heridas) e irritantes. La expresión «respuesta inflamatoria» se refiere a los mecanismos específicos mediante los cuales se consigue y regula la inflamación, incluyendo, simplemente a modo de ilustración, activación o migración de las células inmunitarias, migración, autoinmunidad y enfermedad autoinmunitaria, producción de citocinas, vasodilatación, incluyendo liberación de quinina, fibrinólisis y coagulación, entre otros descritos en el presente documento y conocidos en la técnica. Idealmente, la inflamación es un intento de protección por parte del cuerpo tanto para eliminar los estímulos perjudiciales como para iniciar el proceso de curación del tejido o tejidos afectados. En ausencia de inflamación, las heridas e infecciones nunca se curarían, creando una situación donde la destrucción progresiva del tejido amenazaría la supervivencia. Por otro lado, la inflamación excesiva o crónica puede asociarse con diversas enfermedades, tales como la fiebre del heno, la aterosclerosis y la artritis reumatoide, entre otras descritas en el presente documento y conocidas en la técnica.
Los signos clínicos de la inflamación crónica dependen de la duración de la enfermedad, las lesiones inflamatorias, la causa y la zona anatómica afectada (ver, por ejemplo, Kumar y col., Robbins Basic Pathology-8ft Ed., 2009 Elsevier, Londres; Miller, LM, Pathology Lecture Notes, Atlantic Veterinary College, Charlottetown, p Ei, Canadá). La inflamación crónica se asocia con diversas afecciones o enfermedades patológicas, incluyendo, por ejemplo, alergias, enfermedad de Alzheimer, anemia, estenosis de la válvula aórtica, artritis tal como artritis reumatoide y osteoartritis, cáncer, insuficiencia cardíaca congestiva, fibromialgia, fibrosis, ataque cardíaco insuficiencia renal, lupus, pancreatitis, accidente cerebrovascular, complicaciones quirúrgicas, enfermedad pulmonar inflamatoria, enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (CU), aterosclerosis, trastornos neurológicos, diabetes, trastornos metabólicos, obesidad y psoriasis, entre otras descritas en el presente documento y conocidas en la técnica. Muchas otras enfermedades crónicas también pueden incluir un componente inflamatorio y, por lo tanto, pueden tratarse con los conjugados HRS-Fc de la descripción, incluyendo, por ejemplo, distrofias musculares y rabdomiolisis. Por lo tanto, los conjugados HRS-Fc pueden usarse para tratar o gestionar inflamación crónica, modular cualquiera de una o más de las respuestas inflamatorias crónicas individuales, o tratar una o más enfermedades o afecciones asociadas con la inflamación crónica.
Ciertas respuestas inflamatorias específicas incluyen la producción y actividad de citocinas y rutas relacionadas. Por ejemplo, ciertas realizaciones ejemplares de la presente descripción se refieren a la modulación de la señalización celular a través del factor nuclear-kB (NF-kB), tal como aumentando las actividades aguas abajo de este factor de transcripción. En ciertos aspectos, los aumentos en la actividad de NF-kB pueden causar a aumentos en la señalización o actividad de citocinas, tales como citocinas proinflamatorias (por ejemplo, TNF-alfa o beta) y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-10).
Criterios para evaluar los signos y síntomas de afecciones inflamatorias y otras, incluso para fines de diagnóstico diferencial y también para monitorizar tratamientos, tales como determinar si se ha administrado una dosis terapéuticamente efectiva en el ciclo de tratamiento, por ejemplo, determinando la mejoría de acuerdo con criterios clínicos aceptado, serán evidentes para los expertos en la materia y se ejemplifican con las enseñanzas de, por ejemplo, Berkow y col., eds., The Merck Manual, 16a edición, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Goodman y col., eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a edición, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y., (2001); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3a edición, ADIS Press, Ltd., Williams and Wilkins, Baltimore, MD. (1987); Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, (1985); Osolci al., eds., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990); Katzung, Basic and Clinical Pharmacology, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992).
También se incluyen procedimientos para modular una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta inmunitaria innata o adaptativa mediante el uso de cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, la expresión «respuesta inmunitaria» incluye una reacción medible u observable a un antígeno, una composición de vacuna o una molécula inmunomoduladora mediada por una o más células del sistema inmunitario. Una respuesta inmunitaria generalmente comienza con un antígeno o una molécula inmunomoduladora que se une a una célula del sistema inmunitario. Una reacción a un antígeno o molécula inmunomoduladora puede estar mediada por muchos tipos de células, incluyendo una célula que inicialmente se une a un antígeno o molécula inmunomoduladora y células que participan en la mediación de una respuesta inmunitaria innata, humoral, mediada por células.
También se incluyen procedimientos de tratamiento de enfermedades inmunitarias. Las enfermedades, trastornos o afecciones ilustrativas del sistema inmunitario que pueden tratarse de acuerdo con la presente descripción incluyen, aunque sin limitarse a, inmunodeficiencias primarias, trombocitopenia mediada por el sistema inmunitario, síndrome de Kawasaki, trasplante de médula ósea (por ejemplo, trasplante reciente de médula ósea en adultos o niños), leucemia linfocítica crónica de linfocitos B, infección por VIH (por ejemplo, infección por VIH en adultos o pediátrica), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, púrpura postransfusional y similares.
Adicionalmente, otras enfermedades, trastornos y afecciones que pueden tratarse con cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento incluyen el síndrome de Guillain-Barré, anemia (por ejemplo, anemia asociada con parvovirus B19, pacientes con mieloma múltiple estable que tienen un alto riesgo de infección (por ejemplo, infección recurrente), anemia hemolítica autoinmunitaria (por ejemplo, anemia hemolítica autoinmunitaria de tipo cálido), trombocitopenia (por ejemplo, trombocitopenia neonatal) y neutropenia mediada por el sistema inmunitario), trasplante (por ejemplo, receptores negativos para citomegalovirus (CMV) de órganos positivos para CMV), hipogammaglobulinemia (por ejemplo, neonatos hipogammaglobulinémicos con factor de riesgo de infección o morbilidad), epilepsia (por ejemplo, epilepsia intratable), síndromes vasculíticos sistémicos, miastenia grave (por ejemplo, descompensación en miastenia grave) dermatomiositis y polimiositis.
Otras enfermedades, trastornos y afecciones autoinmunitarias que pueden tratarse con cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento incluyen, aunque sin limitarse a, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombocitopenia neonatal autoinmunitaria, púrpura trombocitopenia idiopática, autoinmunocitopenia, anemia hemolítica, síndrome antifosfolípido, dermatitis, encefalomielitis alérgica, miocarditis, policondritis recidivante, cardiopatía reumática, glomerulonefritis (por ejemplo, nefropatía por IgA), esclerosis múltiple, neuritis, uveítis oftalmia, poliendocnopatías, púrpura (por ejemplo, púrpura de Henloch-Scoenlein) inflamación pulmonar autoinmunitaria, síndrome de Guillain-Barré, diabetes mellitus dependiente de insulina y enfermedad ocular inflamatoria autoinmunitaria.
Enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias adicionales que pueden tratarse con cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento incluyen, aunque sin limitarse a, tiroiditis autoinmunitaria; hipotiroidismo, incluyendo tiroiditis de Hashimoto y tiroiditis caracterizadas, por ejemplo, por citotoxicidad tiroidea mediada por células y humoral; LES (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por complejos inmunitarios circulantes y generados localmente); síndrome de Goodpasture (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos contra la membrana basal); pénfigo (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos acantolíticos epidérmicos); autoinmunidades del receptor como, por ejemplo, enfermedad de Graves (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos contra un receptor de la hormona estimuladora de la tiroides; miastenia grave, que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos para el receptor de acetilcolina); resistencia a la insulina (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos para el receptor de insulina); anemia hemolítica autoinmunitaria (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por la fagocitosis de glóbulos rojos sensibilizados por anticuerpos); y púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por la fagocitosis de plaquetas sensibilizadas por anticuerpos).
Otras enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias que pueden tratarse con cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento incluyen, aunque sin limitarse a, artritis reumatoide (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por complejos inmunitarios en las articulaciones); esclerodermia con anticuerpos anticolágeno (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos nucleolares y otros anticuerpos nucleares); enfermedad mixta del tejido conectivo, (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos para antígenos nucleares extraíbles, por ejemplo, ribonucleoproteína); polimiositis/dermatomiositis (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos antihistamínicos sin histona); anemia perniciosa (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos anticélulas parietales, antimicrosomas y antifactor intrínseco); enfermedad de Addison idiopática (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por citotoxicidad suprarrenal humoral y mediada por células); esterilidad (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos antiespermatozoides); glomerulonefritis (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos contra la membrana basal glomerular o complejos inmunitarios); por glomerulonefritis primaria, por nefropatía por IgA; penfigoide bulloso (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por IgG y complemento en la membrana basal); síndrome de Sjogren (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por múltiples anticuerpos tisulares y/o el anticuerpo antinuclear no histona específico (SS-B)); diabetes mellitus (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos contra células de los islotes mediados por células y humorales); y resistencia farmacológica adrenérgica, incluyendo resistencia farmacológica adrenérgica con asma o fibrosis quística (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos contra receptores betaadrenérgicos).
Otras enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias adicionales que pueden tratarse con cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento incluyen, aunque sin limitarse a, hepatitis crónica activa (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos contra músculo liso); cirrosis biliar primaria (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos antimitocondriales); otra insuficiencia de la glándula endocrina (que se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos tisulares específicos en algunos casos); vitíligo (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos antimelanocitos); vasculitis (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por inmunoglobulina y complemento en las paredes de los vasos y/o bajo complemento de suero); afecciones posinfarto de miocardio (que a menudo se caracterizan, por ejemplo, por anticuerpos antimiocardio); síndrome de cardiotomía (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos antimiocardio); urticaria (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM contra IgE); dermatitis atópica (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM contra IgE); asma (que a menudo se caracteriza, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM contra IgE); miopatías inflamatorias; y otros trastornos inflamatorios, granulomatosos, degenerativos y atróficos. Enfermedades y trastornos adicionales que pueden tratarse con cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento incluyen aquellos que resultan de o están asociados con un desequilibrio de Th17 u otros subtipos de células Th. Los ejemplos incluyen psoriasis, artritis psoriásica, dermatitis atópica (eccema), esclerosis concéntrica de Balo, esclerosis difusa de Schilder, EM de Marburg, EII, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis por derivación, enfermedad de Behqet, colitis indeterminada, asma, miocarditis autoinmunitaria, endometriosis, trastorno de Still de inicio en adultos (TSIA), púrpura de Schonlein-Henoch (PHS), Vogt-Koyanagi-Harada (VKH), enfermedad periodontal, insuficiencia de trasplante de órganos, enfermedad de injerto contra huésped y enfermedad de Devic (neuromielitis óptica).
En algunos aspectos de la presente descripción, la presente descripción incluye un procedimiento de reducción de la inflamación muscular o pulmonar asociada con una enfermedad autoinmunitaria que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una composición que comprende cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento. Las enfermedades y trastornos inflamatorios musculares ejemplares incluyen distrofias musculares, inflamación muscular inducida por el ejercicio, inflamación asociada con lesión o cirugía muscular, rabdomiólisis y enfermedades y trastornos relacionados como se describen en el presente documento.
También se incluyen procedimientos de tratamiento de una enfermedad asociada con un autoanticuerpo que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una composición terapéutica que comprende cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento, donde el polipéptido de HRS comprende al menos un epítopo específicamente reconocido por el autoanticuerpo.
Ciertas realizaciones de la presente descripción incluyen procedimientos de inducción de tolerancia a un antígeno de histidil-ARNt sintetasa (HisRS), comprendiendo dicho procedimiento administrar a un sujeto una composición que comprende cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento, donde el polipéptido de HRS comprende al menos un epítopo específicamente reconocido por el autoanticuerpo, y donde la administración de la composición causa tolerancia al autoantígeno.
También se incluyen procedimientos para eliminar un conjunto o subconjunto de linfocitos T implicados en una respuesta autoinmunitaria a un autoantígeno de histidil ARNt sintetasa (HisRS), comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto una composición que comprende cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento. El polipéptido de HRS comprende al menos un epítopo específicamente reconocido por el autoanticuerpo, o el linfocito T autorreactivo, y donde la administración de la composición causa la eliminación clonal de linfocitos T autorreactivos.
En otra realización de la presente descripción, la presente descripción incluye un procedimiento para inducir anergia en linfocitos T implicados en una respuesta autoinmunitaria a un autoantígeno de histidil ARNt sintetasa (HRS), comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto una composición que comprende cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento, donde el polipéptido HRS comprende al menos un epítopo específicamente reconocido por el autoanticuerpo o linfocito T, y donde la administración de la composición causa la inactivación funcional de los linfocitos T implicados en la respuesta autoinmunitaria.
En otra realización de la presente descripción, la presente descripción incluye una terapia de sustitución para tratar una enfermedad asociada con una insuficiencia de histidil ARNt sintetasa que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una composición terapéutica que comprende cualquiera de los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento, donde el polipéptido de HRS compensa funcionalmente la insuficiencia de histidil ARNt sintetasa.
En un aspecto de la presente descripción de esta terapia de sustitución, la insuficiencia de histidil ARNt sintetasa es causada por la presencia de anticuerpos anti-Jo-1. En un aspecto de la presente descripción de esta terapia de sustitución, la insuficiencia de histidil ARNt sintetasa está causada por mutaciones en una histidil ARNt sintetasa endógena que modula la actividad, expresión o distribución celular de la histidil ARNt sintetasa endógena. En un aspecto de la presente descripción, la insuficiencia de histidil ARNt sintetasa está asociada con el síndrome de Perrault o el síndrome de Usher.
En cualquiera de estos procedimientos, el término «tolerancia» se refiere a la reducción o ausencia sostenida de una respuesta inmunitaria a un antígeno específico en un mamífero, particularmente un ser humano. La tolerancia es distinta de la inmunosupresión generalizada, donde todas, o toda una clase específica de las respuestas inmunitarias mediadas por células inmunitarias, tales como linfocitos B, de respuestas inmunitarias se reducen o eliminan. El desarrollo de la tolerancia puede monitorizarse rutinariamente mediante la ausencia, o una disminución, de la concentración de anticuerpos contra polipéptidos de HRS en el suero del sujeto huésped después de la administración, en dosis únicas o sucesivas del conjugado HRS-Fc de tratamiento. El desarrollo de tolerancia típicamente será suficiente para disminuir los síntomas de la enfermedad autoinmunitaria en el paciente, por ejemplo, un paciente puede haber mejorado suficientemente para mantener las actividades normales en ausencia, o en presencia de cantidades reducidas, de inmunosupresores generales, por ejemplo, corticoides.
En cualquiera de estos procedimientos, la tolerancia de las composiciones típicamente será sostenida, lo que significa que tendrá una duración de aproximadamente un mes, aproximadamente dos meses, aproximadamente tres meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses o aproximadamente 6 meses o más. La tolerancia puede dar lugar a una anergia selectiva de los linfocitos B, o una anergia de los linfocitos T o ambas. En cualquiera de estos procedimientos, tratamientos y composiciones terapéuticas, la expresión «una enfermedad asociada con autoanticuerpos específicos para histidil ARNt sintetasa» se refiere a cualquier enfermedad o trastorno en el cual los anticuerpos para histidil ARNt sintetasa se detectan o son detectables, independientemente de si otros autoanticuerpos también se detectan, o se cree que desempeñan un papel en la progresión o la causa de la enfermedad. Los procedimientos para detectar anticuerpos en muestras de pacientes pueden llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento estándar incluyendo, por ejemplo, mediante RIA, ELISA, mediante inmunoprecipitación, mediante tinción de tejidos o células (incluyendo células transfectadas), micromatrices de antígeno, análisis de espec. de masas, ensayos de neutralización específicos o uno de una serie de otros procedimientos conocidos en la técnica para identificar la especificidad por un antígeno deseado. En algunos aspectos de la presente descripción, la especificidad del anticuerpo puede caracterizarse adicionalmente determinando la capacidad de los anticuerpos para unirse selectivamente a diferentes variantes de splicing y formas truncadas o proteolíticas de histidil ARNt sintetasa. Un autoanticuerpo humano relativamente bien conocido para la histidil ARNt sintetasa incluye, por ejemplo, anticuerpos para Jo-1.
En algunas realizaciones de la presente descripción de cualquiera de los procedimientos y composiciones divulgados, el polipéptido de HRS o el conjugado HRS-Fc comprende un epítopo de histidil ARNt sintetasa que reacciona específicamente de forma cruzada con un autoanticuerpo asociado a enfermedad para histidil ARNt sintetasa. En algunas realizaciones de la presente descripción de cualquiera de los procedimientos y composiciones divulgados, el polipéptido de HRS o el conjugado HRS-Fc comprende un epítopo de histidil ARNt sintetasa que reacciona específicamente de forma cruzada con un linfocito T asociado a enfermedad autorreactivo para histidil ARNt sintetasa. En algunas realizaciones de cualquiera de los procedimientos y composiciones divulgados, el polipéptido de HRS o el conjugado HRS-Fc comprenden un epítopo que reacciona específicamente de forma cruzada con un autoanticuerpo asociado a enfermedad para otra ARNt sintetasa, o con un autoanticuerpo no para ARNt sintetasa.
En algunas realizaciones de la presente descripción de cualquiera de los procedimientos descritos, el polipéptido de HRS o el conjugado HRS-Fc comprenden un epítopo inmunodominante que es reconocido específicamente por la mayoría de los anticuerpos de los sueros de un paciente con una enfermedad asociada con autoanticuerpos para histidil-ARNt sintetasa. En algunas realizaciones de la presente descripción de cualquiera de los procedimientos descritos, el polipéptido de HRS o el conjugado HRS-Fc comprende un epítopo inmunodominante que es reconocido específicamente por la mayoría de los linfocitos T autorreactivos de los sueros de un paciente con una enfermedad asociada con autoanticuerpos para histidil-ARNt sintetasa.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el epítopo está comprendido dentro del dominio WHEP del polipéptido de HRS (aproximadamente los aminoácidos 1-43 de la SEQ ID NO:1); el dominio de aminoacilación (aproximadamente los aminoácidos 54-398 de la SEQ ID NO:1); o el dominio de unión anticodón (aproximadamente los aminoácidos 406-501 de la SEQ ID NO:1) o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS no comprende un epítopo que reacciona específicamente de manera cruzada con un autoanticuerpo asociado a enfermedad para histidil-ARNt sintetasa. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS no compite significativamente por la unión de un autoanticuerpos asociado a enfermedad para histidil-ARNt sintetasa en un ELISA competitivo hasta una concentración de aproximadamente 1 x 10-7 M. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS no compite significativamente por la unión de un autoanticuerpo asociado a enfermedad para histidil-ARNt sintetasa en un ELISA competitivo hasta una concentración de aproximadamente 5 x 10-7 M. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS no compite significativamente por la unión de un autoanticuerpo asociado a enfermedad para histidil-ARNt sintetasa en un ELISA competitivo hasta una concentración de aproximadamente 1 x 10-6 M.
Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS tiene una afinidad más baja por un autoanticuerpo asociado a enfermedad que la histidil-ARNt sintetasa de tipo silvestre (SEQ ID NO:1) de acuerdo con se mide en un ELISA competitivo. En algunas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido de HRS tiene una afinidad aparente por el autoanticuerpo asociado a enfermedad que es al menos aproximadamente 10 veces menos, o al menos aproximadamente 20 veces menos, o al menos aproximadamente 50 veces menos, o al menos aproximadamente 100 veces menos que la afinidad del autoanticuerpo asociado a enfermedad para ser humano de tipo silvestre (SEQ ID NO:1). En un aspecto de la presente descripción, el autoanticuerpo para histidil-ARNt sintetasa se dirige al antígeno Jo-1.
Los ejemplos de enfermedades asociadas con autoanticuerpos específicos para histidil-ARNt sintetasa (así como enfermedades asociadas con una insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa) incluyen, sin limitación, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias y miopatías inflamatorias, incluyendo miopatías inflamatorias idiopáticas, polimiositis, miopatías inducidas por estatinas, dermatomiositis, enfermedad pulmonar intersticial (y otras afecciones fibróticas pulmonares) y trastornos relacionados, tales como superposición de polimiositis-esclerodermia y miositis por cuerpos de inclusión (MCI) y afecciones tales como las que se encuentran en los síndromes antisintetasa, incluyendo por ejemplo enfermedad pulmonar intersticial, artritis, dismotilidad esofágica, enfermedad cardiovascular y otras manifestaciones vasculares tales como fenómeno de Reynaud; otros ejemplos de enfermedades asociadas con una insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa incluyen trastornos genéticos que dan como resultado una insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa activa, incluyendo el síndrome de Usher y el síndrome de Perrault.
La polimiositis afecta los músculos esqueléticos (implicados en la realización de movimientos) en ambos lados del cuerpo. Rara vez se ve en personas menores de 18 años; la mayoría de los casos son en personas de 31 a 60 años de edad. Además de los síntomas mencionados anteriormente, la debilidad muscular progresiva causa dificultad para tragar, hablar, levantarse de una posición sentada, subir escaleras, levantar objetos o juntar las manos por encima de la cabeza. Las personas con polimiositis también pueden experimentar artritis, dificultad para respirar y arritmias cardíacas. La polimiositis a menudo se asocia con anticuerpos para sintetasas, incluyendo HisRS, dando como resultado la invasión de células inmunitarias en las células musculares dañadas. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activación y la invasión de las células inmunitarias y para tratar la polimiositis.
La dermatomiositis se caracteriza por una erupción cutánea que precede o acompaña a la debilidad muscular progresiva. La erupción es de aspecto irregular, con decoloraciones púrpuras o rojas, y se desarrolla característicamente en los párpados y en los músculos utilizados para extender o enderezar las articulaciones, incluyendo nudillos, codos, rodillas y dedos del pie. También pueden aparecer erupciones rojas en la cara, el cuello, los hombros, la parte superior del tórax, la espalda y otras ubicaciones, y puede haber hinchazón en las zonas afectadas. La erupción a veces se produce sin implicación muscular evidente. Los adultos con dermatomiositis pueden experimentar pérdida de peso o décimas de fiebre, tener los pulmones inflamados y ser sensibles a la luz. La dermatomiositis en adultos, a diferencia de la polimiositis, puede acompañar a tumores de mama, pulmón, genitales femeninos o intestino. Los niños y adultos con dermatomiositis pueden desarrollar depósitos de calcio, que aparecen como protuberancias duras debajo de la piel o en el músculo (llamada calcinosis). La calcinosis se produce con mayor frecuencia de 1 a 3 años después del inicio de la enfermedad, pero puede producirse muchos años después. Estos depósitos se ven con más frecuencia en la dermatomiositis infantil que en la dermatomiositis que comienza en adultos. La dermatomiositis puede estar asociada con enfermedades del colágeno vascular o autoinmunitarias.
En algunos casos de polimiositis y dermatomiositis, los músculos distales (lejos del tronco del cuerpo, como los de los antebrazos y alrededor de los tobillos y las muñecas) pueden verse afectados a medida que avanza la enfermedad. La polimiositis y la dermatomiositis pueden asociarse con enfermedades del colágeno vascular o autoinmunitarias que dan como resultado la invasión de células inmunitarias hacia las células musculares dañadas. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activación e invasión de las células inmunitarias y para tratar la dermatomiositis.
La miositis por cuerpos de inclusión (MCI) se caracteriza por debilidad y atrofia musculares progresivas. El inicio de la debilidad muscular es generalmente gradual (durante meses o años) y afecta tanto a los músculos proximales como a los distales. La debilidad muscular puede afectar solo un lado del cuerpo. En ocasiones, se ven pequeños orificios llamados vacuolas en las células de las fibras musculares afectadas. Las caídas y los tropiezos suelen ser los primeros síntomas perceptibles de MCI. Para algunas personas, el trastorno comienza con debilidad en las muñecas y los dedos que causa dificultad para pellizcar, abotonar y agarrar objetos. Puede haber debilidad en los músculos de la muñeca y los dedos y atrofia (adelgazamiento o pérdida de masa muscular) de los músculos del antebrazo y los músculos del cuádriceps en las piernas. La dificultad para tragar se produce en aproximadamente la mitad de los casos de MCI. Los síntomas de la enfermedad generalmente comienzan después de los 50 años, aunque la enfermedad puede ocurrir antes. A diferencia de la polimiositis y la dermatomiositis, la MCI se presenta con más frecuencia en hombres que en mujeres. Al igual que con otras distrofias musculares, la MCI también da como resultado una invasión progresiva de células inmunitarias en las células musculares dañadas. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activación e invasión de las células inmunitarias y para tratar la MCI.
La miositis juvenil tiene algunas similitudes con la dermatomiositis y polimiositis en adultos. Típicamente afecta a niños de 2 a 15 años, con síntomas que incluyen debilidad e inflamación de los músculos proximales, edema (una acumulación anormal de líquidos en los tejidos corporales que causa inflamación), dolor muscular, fatiga, erupciones en la piel, dolor abdominal, fiebre y contracturas (acortamiento crónico de los músculos o tendones alrededor de las articulaciones, causado por la inflamación en los tendones musculares, que evita que las articulaciones se muevan libremente). Los niños con miositis juvenil también pueden tener dificultad para tragar y respirar, y el corazón puede verse afectado. Aproximadamente del 20 al 30 por ciento de los niños con dermatomiositis juvenil desarrollan calcinosis. Los niños afectados pueden no mostrar niveles más altos de lo normal de la enzima creatina cinasa en su sangre, pero tienen niveles más altos de lo normal de otras enzimas musculares. La miositis juvenil también produce una invasión progresiva de células inmunitarias en las células musculares dañadas. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activación e invasión de las células inmunitarias y para tratar la miositis juvenil.
Las miopatías inducidas por estatinas están asociadas con el uso a largo plazo de estatinas que actúan a través de la inhibición de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMGCR). Generalmente bien tolerados, estos medicamentos se han descrito como inductores de miotoxicidad. Más recientemente, ha habido informes de pacientes donde las miopatías con estatinas persisten incluso después del cese del fármaco, formulándose la hipótesis de que tienen una causa autoinmunitaria. Los beneficios de las estatinas son indiscutibles en la reducción del riesgo de cardiopatía coronaria y la progresión de la aterosclerosis coronaria. No obstante, las complicaciones asociadas pueden ser potencialmente mortales. En la actualidad, se estima que más de 38 millones de personas en los EE. u U., toman estatinas y se espera que hasta el 7 % (> 2,6 millones) de estas desarrollen síntomas musculares, y hasta el 0,5 % (> 190.000) de estas personas potencialmente desarrollen miopatías potencialmente mortales.
Todas las estatinas pueden causar problemas musculares y el riesgo aumenta junto con los aumentos en su lipofilicidad, la potencia para reducir el colesterol y la dosis. La cerivastatina en particular ha estado implicada como causante de un mayor riesgo y se ha retirado del mercado estadounidense. De las estatinas restantes, la atorvastatina y la simvastatina tienen tasas de miotoxicidad más altas. Otros agentes hipolipemiantes no estatinas, tales como la niacina y los fibratos, también conllevan riesgos de problemas musculares, especialmente cuando se combinan con estatinas. Aunque no es posible predecir qué pacientes tendrán problemas musculares inducidos por estatinas, los problemas musculares previos pueden ser un factor de riesgo y deben considerarse al iniciar el tratamiento con estatinas. Antecedentes familiares de miopatía son relevantes si un paciente puede ser portador de una miopatía genética, ya que podría ser desenmascarado por el estrés añadido del tratamiento con estatinas. Otros factores de riesgo pueden incluir la edad de más de 80 años, bajo peso corporal, sexo femenino, hipotiroidismo, ciertos defectos genéticos y descendencia asiática, así como el uso concomitante de ciertos medicamentos, incluidos los bloqueadores de los canales de calcio, antibióticos macrólidos, omeprazol, amiodarona, antifúngicos azólicos, antagonistas del receptor de histamina H2, nefazodona, ciclosporina, inhibidores de la proteasa del VIH, warfarina y zumo de pomelo.
El síntoma muscular más común causado por las estatinas es el dolor muscular o mialgia y se presenta en aproximadamente el 7 % de los usuarios de estatinas. La mialgia puede ser de leve a grave y, a menudo, empeora con la actividad muscular. Si el síntoma es tolerable y la indicación para el tratamiento con estatinas es fuerte, por ejemplo, en un paciente con hipercolesterolemia y un infarto de miocardio reciente, el tratamiento con estatinas continuado puede ser apropiado.
Los niveles iniciales de creatina cinasa (CK) no se recomiendan uniformemente antes del inicio del tratamiento con estatinas por parte de las organizaciones que guían el tratamiento con estatinas, pero los niveles de CK pueden proporcionar información muy útil si posteriormente se desarrollan síntomas musculares. También puede producirse debilidad muscular, y con frecuencia produce fatiga y se combina con dolor y CK elevada. Como la mayoría de las miopatías, la debilidad es más pronunciada proximalmente. Episodios raros de rabdomiolisis también se han producido con el tratamiento con estatinas; estos son mucho menos frecuentes pero pueden ser posiblemente mortales. Los cambios que se pueden observar en la histología muscular que son más típicos de una miopatía por estatinas son fibras negativas de citocromo oxidasa, aumento del contenido de lípidos y fibras rojas irregulares. La miopatía necrotizante autoinmunitaria es una forma rara de miopatía por estatinas. En estos pacientes, la interrupción del medicamento con estatinas no se traduce en recuperación, incluso después de varios meses sin tomar el medicamento. Los pacientes tienen una debilidad predominantemente proximal, a menudo sin dolor.
El diagnóstico se basa en los antecedentes médicos del individuo, los resultados de una exploración física y pruebas de fuerza muscular y muestras de sangre que muestran niveles elevados de diversas enzimas musculares y autoanticuerpos. Las herramientas de diagnóstico incluyen la electromiografía para registrar la actividad eléctrica que controla los músculos durante la contracción y en reposo, ecografía para detectar inflamación muscular e imágenes de resonancia magnética para revelar músculo anómalo y evaluar la enfermedad muscular. Una biopsia muscular puede examinarse mediante microscopía para detectar signos de inflamación crónica, muerte de la fibra muscular, deformidades vasculares o cambios específicos del diagnóstico de MCI. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activación y la invasión de células inmunitarias en el músculo dañado, y para tratar las miopatías inducidas por estatinas y la rabdomiolisis.
La enfermedad pulmonar intersticial (EPI) es una categoría amplia de enfermedades pulmonares que incluye más de 130 trastornos caracterizados por cicatrización (es decir, «fibrosis») y/o inflamación de los pulmones. La EPI representa el 15 por ciento de los casos vistos por los neumólogos. La enfermedad pulmonar intersticial (EPI) puede desarrollarse a partir de diversas fuentes, que van desde otras enfermedades hasta factores ambientales. Algunas de las causas conocidas de la EPI incluyen: enfermedad del tejido conectivo o autoinmunitaria, incluyendo, por ejemplo, esclerodermia/esclerosis sistémica progresiva, lupus (lupus eritematoso sistémico), artritis reumatoide y polimiositis/dermatomiositis; y exposiciones ocupacionales y ambientales, incluyendo, por ejemplo, exposición al polvo y ciertos gases, venenos, quimioterapia y radioterapia.
En EPI, el tejido en los pulmones se inflama y/o cicatriza. El intersticio del pulmón incluye el área dentro y alrededor de los pequeños vasos sanguíneos y los alvéolos (sacos de aire) donde tiene lugar el intercambio de oxígeno y dióxido de carbono. La inflamación y la cicatrización del intersticio alteran este tejido y causan una disminución en la capacidad de los pulmones para extraer oxígeno del aire. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activación y la invasión de células inmunitarias en el pulmón dañado, y para tratar la EPI.
La progresión de la EPI varía de una enfermedad a otra y de una persona a otra. Debido a que la enfermedad pulmonar intersticial interrumpe la transferencia de oxígeno y dióxido de carbono en los pulmones, sus síntomas generalmente se manifiestan como problemas respiratorios. Los dos síntomas más comunes de la EPI son dificultad para respirar al hacer ejercicio y una tos no productiva.
El síndrome de Usher es la afección más común que afecta tanto a la audición como a la visión. Los principales síntomas del síndrome de Usher son la pérdida de audición y la retinitis pigmentaria (RP). La RP causa ceguera nocturna y pérdida de la visión periférica (visión lateral) a través de la degeneración progresiva de la retina. A medida que RP avanza, el campo de visión se reduce hasta que solo queda la visión central. Muchas personas con síndrome de Usher también tienen problemas graves de equilibrio. Aproximadamente del 3 al 6 por ciento de todos los niños sordos y otro 3 al 6 por ciento de los niños con problemas de audición tienen el síndrome de Usher. En países desarrollados como los Estados Unidos, aproximadamente cuatro bebés de cada 100.000 nacimientos tienen el síndrome de Usher. El síndrome de Usher se hereda como un rasgo autosómico recesivo. Varios loci genéticos se han asociado con el síndrome de Usher, incluyendo la histidil t-ARN sintetasa (Puffenberger y col., (2012) PLoS ONE 7(1) e28936 doi: 10.1371 / journal. pone.0028936).
Hay tres tipos clínicos de síndrome de Usher: tipo 1, tipo 2 y tipo 3. En los Estados Unidos, los tipos 1 y 2 son los tipos más comunes. Juntos, representan aproximadamente del 90 al 95 por ciento de todos los casos de niños que tienen síndrome de Usher.
Los niños con síndrome de Usher de tipo 1 son profundamente sordos al nacer y tienen problemas graves de equilibrio. Debido a los problemas de equilibrio asociados con el síndrome de Usher de tipo 1, los niños con este trastorno tardan en sentarse sin apoyo y, por lo general, no caminan de forma independiente antes de los 18 meses. Habitualmente, estos niños comienzan a desarrollar problemas de visión en la primera infancia, casi siempre cuando cumplen los 10 años. Los problemas de visión generalmente comienzan con dificultades para ver de noche, pero tienden a progresar rápidamente hasta que la persona está completamente ciega.
Los niños con síndrome de Usher de tipo 2 nacen con pérdida auditiva de moderada a grave y un equilibrio normal. Aunque la gravedad de la pérdida auditiva varía, la mayoría de estos niños pueden beneficiarse de los audífonos y pueden comunicarse oralmente. Los problemas de visión en el síndrome de Usher de tipo 2 tienden a progresar más lentamente que los del tipo 1, y la aparición de RP a menudo no se manifiesta hasta la adolescencia.
Los niños con síndrome de Usher de tipo 3 tienen una audición normal al nacer. Aunque la mayoría de los niños con el trastorno tienen un equilibrio de normal a casi normal, algunos pueden desarrollar problemas de equilibrio más adelante. La audición y la vista empeoran con el tiempo, pero la velocidad a la que se deterioran puede variar de persona a persona, incluso dentro de la misma familia. Una persona con síndrome de Usher de tipo 3 puede desarrollar pérdida de audición en la adolescencia y, habitualmente, necesitará audífonos en la edad adulta media o tardía. La ceguera nocturna generalmente comienza en algún momento durante la pubertad. Los puntos ciegos aparecen desde la adolescencia tardía hasta la edad adulta temprana y, a mediados de la edad adulta, la persona suele ser legalmente ciega.
El síndrome de Perrault (SP) se caracteriza por la asociación de disgenesia ovárica en mujeres con discapacidad auditiva neurosensorial y, en algunos sujetos, anomalías neurológicas, incluyendo ataxia cerebelosa progresiva y déficit intelectual. La prevalencia exacta para el síndrome de Perrault es desconocida, y probablemente se diagnostique de manera insuficiente, particularmente en hombres donde el hipogonadismo no es una característica y el síndrome no se detecta. La edad media en el momento del diagnóstico es 22 años después de la presentación con pubertad tardía en mujeres con sordera neurosensorial. Se observaron defectos auditivos en todos los casos menos uno (edad media en el momento del diagnóstico 8 años). La pérdida auditiva es siempre neurosensorial y bilateral, pero la gravedad es variable (leve a profunda), incluso en pacientes afectados de la misma familia. Se ha notificado disgenesia ovárica en todos los casos femeninos, pero no se detectan defectos gonadales en los hombres. La amenorrea es generalmente primaria, pero también se ha notificado amenorrea secundaria. El crecimiento tardío (altura por debajo del tercer percentil) se notificó en la mitad de los casos documentados. Se desconoce la frecuencia exacta de las anomalías neurológicas, pero se han notificado nueve mujeres y dos hombres (16 a 37 años de edad) que carecen de anomalías neurológicas. Los signos neurológicos son progresivos y generalmente aparecen más tarde en la vida, sin embargo, se ha observado retraso en la marcha o caídas frecuentes y tempranas en pacientes jóvenes con SP. Los signos neurológicos comunes son ataxia, dispraxia, movimientos extraoculares limitados y polineuropatía. También se han notificado algunos casos de escoliosis. La transmisión de SP es autosómica recesiva y recientemente se han identificado mutaciones en la histidil ARNt sintetasa mitocondrial como causantes de disgenesia ovárica y pérdida de audición neurosensorial asociadas con el síndrome de Perrault. (Pierce y col., PNAS EE. UU. 108 (16) 6543-6548, 2011).
La distrofia muscular se refiere a un grupo de trastornos hereditarios donde la fuerza y la masa muscular disminuyen gradualmente. Todas las distrofias musculares están marcadas por una debilidad muscular que es impulsada por un defecto genético primario en uno o más genes específicos del músculo. Adicionalmente, las distrofias musculares, típicamente tienen un componente inflamatorio variable que impulsa la inflamación muscular y, en última instancia, potencia la degeneración de los tejidos musculares. Por consiguiente, los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activación y la invasión de células inmunitarias en el músculo dañado, y para tratar las distrofias musculares. Generalmente se reconocen al menos nueve tipos de distrofias musculares. En algunos aspectos de la presente descripción, la distrofia muscular se selecciona entre la distrofia muscular de Duchenne, la distrofia muscular de Becker, la distrofia muscular de Emery-Dreifuss, la distrofia muscular de la cintura y los miembros, la distrofia muscular facioescapulohumeral, la distrofia miotónica, la distrofia muscular oculofaríngea, la distrofia muscular distal y la distrofia muscular congénita.
Distrofia muscular de Duchenne (DMD): la DMD afecta a los niños pequeños y causa una debilidad muscular progresiva, que habitualmente comienza en las piernas. Esta es la forma más grave de distrofia muscular. La DMD se produce en aproximadamente 1 de cada 3.500 nacimientos masculinos y afecta a aproximadamente 8.000 niños y hombres jóvenes en los Estados Unidos. Una forma más leve se produce en muy pocas mujeres portadoras.
La DMD es causada por mutaciones en el gen que codifica la distrofina, una proteína del subsarcolema que funciona dentro del complejo de glucoproteínas asociado a la distrofina (DGC) que previene la producción de proteína funcional. La cantidad de distrofina se correlaciona con la gravedad de la enfermedad (es decir, cuanto menos distrofina esté presente, más grave será el fenotipo). El complejo DGC conecta el citoesqueleto intracelular a la matriz extracelular. La DGC se concentra en las líneas Z del sarcómero y confiere la transmisión de fuerza a través de la fibra muscular. La interrupción de este enlace da como resultado la inestabilidad de la membrana, lo que, en última instancia, conduce a rupturas sarcolémicas. El flujo de calcio extracelular altera procesos moleculares como la contracción muscular y activa la actividad proteolítica. Las fibras musculares afectadas se vuelven necróticas o apoptóticas, y liberan quimioatrayentes mitógenos, que inician procesos inflamatorios. Los ciclos de degeneración y regeneración conducen eventualmente a la pérdida muscular irreversible y al reemplazo por tejido fibrótico y adiposo.
Un niño con distrofia muscular de Duchenne por lo general comienza a mostrar síntomas como un niño en edad preescolar. Las piernas resultan afectadas primero, lo que dificulta el caminar y causa problemas de equilibrio. La mayoría de los pacientes caminan de tres a seis meses después de lo esperado y tienen dificultades para correr. Las contracturas (endurecimiento muscular permanente) generalmente comienzan a la edad de cinco o seis años, más severamente en los músculos de la pantorrilla. Las caídas frecuentes y los huesos rotos son comunes a partir de esta edad. Subir escaleras y levantarse sin ayuda puede llegar a ser imposible a los nueve o diez años, y la mayoría de los niños usan una silla de ruedas para moverse a los 12 años. El debilitamiento de los músculos del tronco alrededor de esta edad a menudo causa escoliosis (una curvatura de la columna vertebral de un lado a otro) y cifosis (una curvatura de adelante hacia atrás).
Una de las debilidades más graves de la DMD es la debilidad del diafragma, la lámina de músculos en la parte superior del abdomen que realiza el trabajo principal de respirar y toser. La debilidad del diafragma causa una reducción de la energía y la resistencia física, y un aumento de infecciones pulmonares debido a la incapacidad de toser de manera efectiva. Los hombres jóvenes con DMD pueden vivir hasta los veinte años, siempre que cuenten con asistencia de ventilación mecánica y una buena higiene respiratoria.
En algunas realizaciones de la presente descripción, un sujeto que tiene DMD se caracteriza por uno o más de los siguientes: un signo de Gower positivo, que refleja el deterioro de los músculos de las extremidades inferiores; niveles altos de creatina cinasa (CPK-MM) en la sangre; errores genéticos en el gen Xp21; o niveles reducidos de ausencia de distrofina, por ejemplo, medidos por biopsia muscular.
Los conjugados HRS-Fc se pueden usar en el tratamiento de la DMD, ya sea solos o en combinación con otras terapias, tales como oligonucleótidos antisentido (por ejemplo, terapias de omisión de exón tales como Eteplirsen), corticoides, beta2-agonistas, terapia física, asistencia respiratoria, terapias con células madre y terapias de sustitución genética. En algunas realizaciones de la presente descripción, la administración de conjugados HRS-Fc conduce a mejoras estadísticamente significativas en la prueba de marcha de 6 minutos.
Distrofia muscular de Becker (DMB): la DMB afecta a los niños mayores y a los hombres jóvenes, siguiendo un curso más suave que la DMD. La DMB se produce en aproximadamente 1 de cada 30.000 nacimientos masculinos. La distrofia muscular de Becker es una variante menos grave de la distrofia muscular de Duchenne y es causada por la producción de una forma truncada, pero parcialmente funcional, de distrofina.
Los síntomas de la DMB suelen aparecer en la infancia tardía hasta la edad adulta temprana. Aunque la progresión de los síntomas puede ser paralela a la de la DMD, los síntomas generalmente son más leves y el curso es más variable. La escoliosis puede producirse, pero generalmente es más leve y progresa más lentamente. La enfermedad del músculo cardíaco (cardiomiopatía) se produce con más frecuencia en la DMB. Los problemas pueden incluir latidos cardíacos irregulares (arritmias) e insuficiencia cardíaca congestiva. Los síntomas pueden incluir fatiga, dificultad para respirar, dolor en el pecho y mareos. La debilidad respiratoria también se produce, y puede causar necesidad de ventilación mecánica. Los conjugados HRS-Fc pueden usarse en el tratamiento de la DMB, ya sea solos o en combinación con otras terapias.
Distrofia muscular de Emery-Dreifuss (DMED): la DMED afecta a los niños pequeños, causando contracturas y debilidad en las pantorrillas, debilidad en los hombros y la parte superior de los brazos y problemas en la forma en que los impulsos eléctricos viajan a través del corazón para hacerlo latir (defectos de la conducción cardíaca). Hay tres subtipos de distrofia muscular de Emery-Dreifuss, que se distinguen por su patrón de herencia: ligada al cromosoma X, autosómica dominante y autosómica recesiva. La forma ligada al cromosoma X es la más común. Cada tipo varía en prevalencia y síntomas. La enfermedad es causada por mutaciones en el gen LMNA, o más comúnmente, el gen EMD. Ambos genes codifican componentes proteicos de la envoltura nuclear.
La DMED generalmente comienza en la primera infancia, a menudo con contracturas que preceden a la debilidad muscular. La debilidad afecta originalmente al hombro y la parte superior del brazo, junto con los músculos de la pantorrilla, lo que causa una postura del pie caído. La mayoría de los hombres con DMED sobreviven a la mediana edad, aunque un defecto en el ritmo cardíaco (bloqueo cardiaco) puede ser mortal si no se trata con un marcapasos. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar en el tratamiento de la DMED, ya sea solos o en combinación con otras terapias.
Distrofia muscular de la cintura y los miembros (DMCM): la DMCM comienza en la infancia tardía hasta la edad adulta temprana y afecta a hombres y mujeres, causando debilidad en los músculos alrededor de las caderas y los hombros. Es la más variable de las distrofias musculares, y ahora se reconocen varias formas diferentes de la enfermedad. Muchas personas con sospecha de DMCM probablemente hayan sido mal diagnosticadas en el pasado y, por lo tanto, la prevalencia de la enfermedad es difícil de estimar. El número de personas afectadas en los Estados Unidos puede ser de unos pocos miles.
Aunque hay al menos media docena de genes que causan los diversos tipos de DMCM, habitualmente se reconocen dos formas clínicas principales de DMCM. Una forma infantil grave es similar en apariencia a la DMD, pero se hereda como un rasgo autosómico recesivo.
La distrofia muscular de la cintura y los miembros de tipo 2B (DMCM2B) es causada por la pérdida de mutaciones de la función en el gen de la disferlina. La disferlina se expresa principalmente en el músculo esquelético y cardíaco, pero también en monocitos, macrófagos y otros tejidos donde se localiza en vesículas citoplasmáticas y la membrana celular. La disferlina parece estar implicada en la fusión y el tráfico de membranas, así como en los procesos de reparación. La DMCM2B es una enfermedad muscular de inicio tardío (adolescentes/adultos jóvenes) que se caracteriza por una progresiva debilidad muscular simétrica y una patología inmunitaria/inflamatoria notablemente agresiva. Las biopsias musculares típicamente muestran una marcada infiltración de células inflamatorias, que consisten principalmente en macrófagos/marcadores de activación de macrófagos (HLA-DR, HLA-ABC, CD86), linfocitos T citotóxicos CD8+ y linfocitos T CD4+, junto con la degeneración/regeneración de las fibras musculares. Por consiguiente, los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activación y la invasión de células inmunitarias en el músculo dañado, y para tratar la distrofia muscular de la cintura y los miembros.
Los síntomas de DMCM de inicio en adultos generalmente aparecen en los adolescentes o en los veinte años de una persona, y están marcados por una debilidad progresiva y la atrofia progresiva de los músculos más cercanos al tronco. Pueden producirse contracturas, y la capacidad de caminar generalmente se pierde unos 20 años después del inicio. Algunas personas con DMCM desarrollan una debilidad respiratoria que requiere el uso de un respirador. La esperanza de vida se puede acortar un poco. (Las formas autosómicas dominantes habitualmente se producen más tarde en la vida y progresan de manera relativamente lenta).
Distrofia muscular facioescapulohumeral (FEH): la FEH, también conocida como enfermedad de Landouzy-Dejerine, comienza en la infancia tardía hasta la edad adulta temprana y afecta tanto a hombres como a mujeres, causando debilidad en los músculos de la cara, los hombros y la parte superior de los brazos. Las caderas y las piernas también pueden verse afectadas. La FEH se produce en aproximadamente 1 de cada 20.000 personas y afecta a aproximadamente 13.000 personas en los Estados Unidos.
La FEH varía en su gravedad y edad de inicio, incluso entre miembros de la misma familia. Los síntomas generalmente comienzan en la adolescencia o en los primeros años de la veintena, aunque es posible un inicio en bebés o niños. Los síntomas tienden a ser más graves en aquellos con un inicio más temprano. La enfermedad lleva el nombre de las regiones del cuerpo más afectadas por la enfermedad: los músculos de la cara (facio-), los hombros (escapulo-) y la parte superior de los brazos (humeral). Las caderas y las piernas también pueden verse afectadas. Los niños con FEH a menudo desarrollan sordera parcial o completa.
Se necesitan dos defectos para EFEH, el primero es la eliminación de las repeticiones de D4Z4 y el segundo es una «ganancia de función tóxica» del gen DUX4. El primer síntoma observado es a menudo dificultad para levantar objetos por encima de los hombros. La debilidad puede ser mayor en un lado que en el otro. La debilidad del hombro también hace que los omóplatos sobresalgan hacia atrás, lo que se denomina aleteo escapular. La EFEH está asociada con la invasión inflamatoria en grupos musculares específicos y, por consiguiente, los conjugados HRS-Fc se pueden usar para reducir la activación y la invasión de células inmunitarias de los músculos dañados y para tratar la EFEH.
Distrofia miotónica: la distrofia miotónica, también conocida como enfermedad de Steinert, afecta tanto a hombres como a mujeres, causando una debilidad generalizada que se observa por primera vez en la cara, los pies y las manos. Se acompaña de la incapacidad de relajar los músculos afectados (miotonía). Los síntomas pueden comenzar desde el nacimiento hasta la edad adulta. La distrofia muscular miotónica de tipo 1 (DM1) es la forma más común de distrofia muscular y afecta a más de 30.000 personas en los Estados Unidos. Es el resultado de la expansión de una repetición corta (CTG) en la secuencia de ADN del gen DMG/KG (proteína cinasa de la distrofia miotónica). La distrofia muscular miotónica de tipo 2 (DM2) es mucho más rara y es el resultado de la expansión de la repetición CCTG en el gen ZNF9 (proteína de dedo de zinc 9).
Los síntomas de la distrofia miotónica incluyen debilidad facial y mandíbula floja, párpados caídos (ptosis) y atrofia muscular progresiva en los antebrazos y las pantorrillas. Una persona con esta distrofia tiene dificultad para relajar su agarre, especialmente si el objeto está frío. La distrofia miotónica afecta al músculo cardíaco, causando arritmias y bloqueo cardíaco, y a los músculos del sistema digestivo, lo que causa trastornos de motilidad y estreñimiento. Otros sistemas corporales también se ven afectados: la distrofia miotónica puede causar cataratas, degeneración de la retina, bajo coeficiente intelectual, calvicie frontal, trastornos de la piel, atrofia testicular, apnea del sueño y resistencia a la insulina. Un aumento en la necesidad o el deseo de dormir es común, al igual que una motivación disminuida. La discapacidad grave afecta a la mayoría de las personas con este tipo de distrofia dentro de los 20 años del inicio, aunque la mayoría no requiere una silla de ruedas incluso en una edad avanzada. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para tratar la distrofia miotónica, por ejemplo, reduciendo la inflamación asociada con el tejido muscular, incluyendo el músculo esquelético (por ejemplo, los músculos del cuádriceps) y/o el tejido cardiaco, entre otros tejidos.
Distrofia muscular oculofaríngea (DMOF): la DMOF afecta a adultos de ambos sexos y causa debilidad en los músculos de los ojos y la garganta. Es más común entre las familias francocanadienses en Quebec y en las familias hispanoamericanas en el suroeste de los Estados Unidos.
La DMOF generalmente comienza en los años treinta o cuarenta de una persona, con debilidad en los músculos que controlan los ojos y la garganta. Los síntomas incluyen párpados caídos, dificultad para tragar (disfagia), y la debilidad progresa hacia otros músculos de la cara, el cuello y, ocasionalmente, las extremidades superiores. La dificultad para tragar puede causar aspiración o la introducción de alimentos o saliva en las vías respiratorias. La neumonía puede seguir. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para tratar la DMOF, por ejemplo, reduciendo la inflamación asociada con el tejido muscular.
Distrofia muscular distal (DD): la DD comienza en la mediana edad o más tarde, causando debilidad en los músculos de los pies y las manos. Es más común en Suecia y rara en otras partes del mundo. La DD suele comenzar en los años veinte o treinta, con debilidad en las manos, antebrazos y parte inferior de las piernas. Dificultad con movimientos finos tales como escribir a máquina o abrochar botones pueden ser los primeros síntomas. Los síntomas progresan lentamente, y la enfermedad generalmente no afecta a la esperanza de vida. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para tratar la DD, reduciendo la inflamación asociada con la inflamación del tejido muscular.
Distrofia muscular congénita (DMC): la DMC está presente desde el nacimiento, produce una debilidad generalizada y, habitualmente, progresa lentamente. Un subtipo, llamado DMC de Fukuyama, también implica retraso mental. Ambos son raros; DMC de Fukuyama es más común en Japón.
La DMC está marcada por una grave debilidad muscular desde el nacimiento, con bebés que muestran «flacidez» y muy poco movimiento voluntario. No obstante, un niño con DMC puede aprender a caminar, con o sin algún dispositivo de asistencia, y vivir hasta la edad adulta temprana o más allá. En contraste, los niños con DMC de Fukuyama rara vez pueden caminar y tienen un retraso mental grave. La mayoría de los niños con este tipo de DMC mueren en la infancia. Al igual que con las otras distrofias musculares, los conjugados HRS-Fc se pueden usar para tratar la DMC, por ejemplo, reduciendo la inflamación asociada con la inflamación del tejido muscular.
Caquexia: la caquexia (o síndrome de atrofia progresiva) se caracteriza típicamente por pérdida de peso, atrofia muscular, fatiga, debilidad y pérdida significativa de apetito en alguien que no está intentando activamente perder peso. La definición formal de caquexia es la pérdida de masa corporal que no puede revertirse nutricionalmente. Incluso si el paciente afectado consume más calorías, la masa corporal magra se pierde, lo que indica la existencia de una patología primaria.
La caquexia es experimentada por pacientes con cáncer, SIDA, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, esclerosis múltiple, insuficiencia cardíaca congestiva, tuberculosis, polineuropatía amiloide familiar, envenenamiento por mercurio (acrodinia) y deficiencia hormonal, entre otras enfermedades.
La caquexia también puede ser un signo de diversos trastornos subyacentes, tales como cáncer, acidosis metabólica (es decir, disminución de la síntesis de proteínas y aumento del catabolismo de proteínas), ciertas enfermedades infecciosas (por ejemplo, tuberculosis, SIDA), pancreatitis crónica, trastornos autoinmunitarios o adicción a las anfetaminas. La caquexia debilita físicamente a los pacientes hasta un estado de inmovilidad derivado de la pérdida de apetito, astenia y anemia, y la respuesta al tratamiento estándar suele ser deficiente.
Aproximadamente el 50 % de todos los pacientes con cáncer padecen caquexia. Aquellos con cánceres gastrointestinales y pancreáticos superiores tienen la mayor frecuencia de desarrollo de un síntoma caquéxico. Además de aumentar la morbilidad y la mortalidad, agravando los efectos secundarios de la quimioterapia y reduciendo la calidad de vida, la caquexia se considera la causa inmediata de muerte de una gran proporción de pacientes con cáncer, que va del 22 % al 40 % de los pacientes. Los síntomas de la caquexia cancerosa incluyen la pérdida progresiva de peso y el agotamiento de las reservas de tejido adiposo y músculo esquelético de huésped. Los enfoques de tratamiento tradicionales incluyen el uso de estimulantes del apetito, antagonistas de 5-HT3, suplementos de nutrientes e inhibidores de la COX-2.
Aunque la patogenia de la caquexia se entiende de forma deficiente, se espera que estén implicadas múltiples vías biológicas, incluyendo citocinas proinflamatorias tales como TNF-a, hormonas neuroendocrinas, IGF-1 y factores específicos de tumores tales como el factor inductor de proteólisis.
Los conjugados HRS-Fc se pueden usar para tratar la caquexia y cualquiera de sus trastornos o complicaciones relacionadas, subyacentes o secundarias. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar solos o en combinación con otras terapias, tales como la suplementación dietética con una combinación con alto contenido de proteínas, leucina y aceite de pescado, antioxidantes, progestágenos (acetato de megestrol, acetato de medroxiprogesterona) y anticiclooxigenasa 2, estimulantes del apetito, y antagonistas de 5-HT3, entre otros.
Rabdomiolisis: la rabdomiolisis es la descomposición de las fibras musculares en el tejido muscular esquelético. Los productos de descomposición se liberan al torrente sanguíneo, y algunos de estos productos, tales como la mioglobina, son perjudiciales para los riñones y pueden provocar insuficiencia renal.
Los síntomas incluyen dolor muscular, vómitos, confusión, coma o frecuencia y ritmo cardíacos anormales, y su gravedad generalmente depende de la extensión del daño muscular y de si se desarrolla insuficiencia renal. El daño a los riñones puede causar disminución o ausencia de producción de orina, generalmente entre 12 y 24 horas después del daño muscular inicial. La inflamación del músculo dañado puede causar el síndrome compartimental o la compresión de los tejidos circundantes, tales como los nervios y los vasos sanguíneos, en el mismo compartimento fascial, y causar la pérdida de sangre y daños en (por ejemplo, pérdida de función) las partes del cuerpo afectadas. Los síntomas de esta complicación incluyen dolor o sensación reducida en la extremidad afectada. Otras complicaciones incluyen la coagulación intravascular diseminada (CID), una perturbación grave en la coagulación de la sangre que puede causar una hemorragia incontrolable.
El daño muscular inicial puede ser causado, por ejemplo, por factores físicos (por ejemplo, lesión por aplastamiento, ejercicio vigoroso), suministro sanguíneo alterado (por ejemplo, trombosis arterial, embolia), metabolismo alterado (por ejemplo, estado hiperosmolar hiperglucémico, hiper- e hiponatremia, hipopotasemia, hipocalcemia, hipofosfatemia, cetoacidosis, hipotiroidismo), temperatura corporal alterada (hipertermia, hipotermia), medicamentos y toxinas (por ejemplo, estatinas, medicamentos antipsicóticos, agentes bloqueadores neuromusculares, diuréticos, metales pesados, cicuta, venenos de insecto o de serpientes), abuso de drogas (por ejemplo, alcohol, anfetamina, cocaína, heroína, ketamina, LDS, MDMA), infecciones (por ejemplo, virus de Coxsackie, virus de la gripe A, virus de la gripe B, virus de Epstein-Barr, infección primaria por VIH, Plasmodium falciparum, virus del herpes, Legionella neumophila, salmonela) y daño muscular autoinmunitario (por ejemplo, polimiositis, dermatomiositis). Además, ciertas afecciones hereditarias aumentan el riesgo de rabdomiolisis, incluyendo defectos de glucólisis y glucogenólisis (por ejemplo, enfermedad de McArdle, deficiencia de fosfofructocinasa, enfermedades por almacenamiento de glucógeno VIII, IX, X y XI), defectos del metabolismo de lípidos (por ejemplo, deficiencia de carnitina palmitoiltransferasa I y II, deficiencia de subtipos de acil CoA deshidrogenasa (por ejemplo, deficiencia de LCAD, SCAD, MCAD, VLCAD, 3-hidroxiacil-coenzima A deshidrogenasa), deficiencia de tiolasa), miopatías mitocondriales (por ejemplo, deficiencia de succinato dehidrogenasa, citocromo c oxidasa y coenzima Q10) y otros, tales como deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, deficiencia de mioadenilato desaminasa y distrofias musculares.
La rabdomiólisis habitualmente se diagnostica con análisis de sangre y análisis de orina, y puede indicarse por niveles anormalmente elevados o en aumento de creatinina y urea, disminución de la producción de orina o decoloración marrón-rojiza de la orina. Los tratamientos primarios incluyen fluidos intravenosos, diálisis y hemofiltración.
Los conjugados HRS-Fc se pueden usar, por lo tanto, para tratar la rabdomiolisis y cualquiera de sus trastornos o complicaciones relacionadas, secundarias o subyacentes. Los conjugados HRS-Fc se pueden usar solos o en combinación con otras terapias, incluyendo aquellas destinadas a tratar el shock y preservar la función renal. Las terapias ejemplares incluyen la administración de fluidos intravenosos, habitualmente solución salina isotónica (0,9 % en peso por volumen de solución de cloruro de sodio) y terapias de sustitución renal (TSR) tales como hemodiálisis, hemofiltración continua y diálisis peritoneal.
Más generalmente, los conjugados HRS-Fc descritos en el presente documento pueden reducir una respuesta inflamatoria, tal como reduciendo la activación, diferenciación, migración o infiltración de células inmunitarias en tejidos seleccionados, aumentando la producción de citocinas antiinflamatorias, o reduciendo la producción o actividad de citocinas proinflamatorias, entre otros mecanismos. Además, ciertos de los presentes procedimientos, bloqueando la unión, la acción o la producción de anticuerpos anti-histidil-ARNt sintetasa o linfocitos T autorreactivos, tienen utilidad para tratar una amplia gama de enfermedades y trastornos autoinmunitarios e inflamatorios asociados con anticuerpos anti-histidil-ARNt sintetasa, otros autoanticuerpos, así como otras causas de insuficiencia de histidil-ARNt sintetasa.
Formulaciones farmacéuticas, adm inistración y kits
Las realizaciones de la presente descripción incluyen composiciones que comprenden polipéptidos conjugados HRS-Fc formulados en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para administración a una célula, sujeto o animal, ya sea solos o en combinación con una o más modalidades de terapia. También se entenderá que, si se desea, las composiciones de la descripción pueden administrarse en combinación con otros agentes también, por ejemplo, otras proteínas o polipéptidos o diversos agentes farmacéuticamente activos. Prácticamente no hay límite a otros componentes que también pueden incluirse en las composiciones, siempre que los agentes adicionales no afecten adversamente a los efectos moduladores u otros que se desean conseguir. Para la producción farmacéutica, las composiciones terapéuticas de conjugado HRS-Fc estarán típicamente sustancialmente libres de endotoxinas. Las endotoxinas son toxinas asociadas con ciertas bacterias, típicamente bacterias gram negativas, aunque las endotoxinas pueden encontrarse en bacterias gram positivas, tales como Listeria monocytogenes. Las endotoxinas más prevalentes son los lipopolisacáridos (LPS) o los lipooligosacáridos (LOS) que se encuentran en la membrana externa de diversas bacterias gram negativas, y que representan una característica patógena crucial en la capacidad de estas bacterias para causar enfermedad. Pequeñas cantidades de endotoxinas en los seres humanos pueden producir fiebre, una disminución de la presión arterial y la activación de la inflamación y la coagulación, entre otros efectos fisiológicos adversos.
Las endotoxinas pueden detectarse usando técnicas de rutina conocidas en la técnica. Por ejemplo, el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus, que usa sangre del cangrejo herradura, es un ensayo muy sensible para detectar la presencia de endotoxinas. En esta prueba, niveles muy bajos de LPS pueden causar una coagulación detectable del lisado del limulus debido a una potente cascada enzimática que amplifica esta reacción. Las endotoxinas también se pueden cuantificar mediante un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA).
Para estar sustancialmente libre de endotoxinas, los niveles de endotoxinas pueden ser inferiores a aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 UE/mg de proteína. Típicamente, 1 ng de lipopolisacárido (LPS) corresponde a aproximadamente 1-10 UE. En ciertas realizaciones de la presente descripción, como se indica en el presente documento, las composiciones de conjugado HRS-Fc tienen un contenido de endotoxina de menos de aproximadamente 10 UE/mg de conjugado HRS-Fc, o menos de aproximadamente 5 UE/mg de conjugado HRS-Fc, menos de aproximadamente 3 UE/mg de conjugado HRS-Fc, o menos de aproximadamente 1 UE/mg de conjugado HRS-Fc o menos de aproximadamente 0,1 UE/mg de conjugado HRS-Fc, o menos de aproximadamente 0,01 UE/mg de conjugado HRS-Fc. En ciertas realizaciones de la presente descripción, como se ha indicado anteriormente, las composiciones farmacéuticas de conjugado HRS-Fc están en un 95 % libres de endotoxinas, preferentemente en un 99 % libres de endotoxinas, y más preferentemente en aproximadamente un 99,99 % libres de endotoxinas basándose en p/p de proteína.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden una dosis terapéutica de un polipéptido conjugado HRS-Fc incluyen todos los homólogos, ortólogos e isoformas naturales de histidil-ARNt sintetasa.
En algunas realizaciones de la presente descripción, dichas composiciones farmacéuticas pueden comprender un tampón de histidina, que puede estar presente en cualquiera de las composiciones farmacéuticas dentro del intervalo de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones de la presente descripción, el tampón de histidina puede estar presente a una concentración de aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 70 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 90 mM o aproximadamente 100 mM, incluyendo todos los números enteros e intervalos entre dichas concentraciones.
En un aspecto de la presente descripción, dichas composiciones pueden comprender polipéptidos conjugados HRS-Fc que son sustancialmente monodispersos, lo que significa que las composiciones de conjugado HRS-Fc existen principalmente (es decir, al menos aproximadamente el 90 %, o más) en una forma de peso molecular aparente cuando se evalúa, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por tamaño, dispersión dinámica de la luz o ultracentrifugación analítica.
En otro aspecto de la presente descripción, dichas composiciones tienen una pureza (basándose en proteínas) de al menos aproximadamente el 90 %, o en algunos aspectos de la presente descripción al menos aproximadamente el 95 % de pureza, o en algunas realizaciones de la presente descripción, al menos el 98 % de pureza. La pureza puede determinarse mediante cualquier procedimiento analítico de rutina como se conoce en la técnica.
En otro aspecto de la presente descripción, dichas composiciones tienen un contenido de agregados de alto peso molecular de menos de aproximadamente el 10 %, en comparación con la cantidad total de proteína presente, o en algunas realizaciones de la presente descripción, dichas composiciones tienen un contenido de agregados de alto peso molecular de menos de aproximadamente el 5 %, o en algunos aspectos de la presente descripción, dichas composiciones tienen un contenido de agregados de alto peso molecular de menos de aproximadamente el 3 %, o en algunas realizaciones de la presente descripción un contenido de agregados de alto peso molecular de menos de aproximadamente el 1 %. El contenido de agregados de alto peso molecular se puede determinar mediante una variedad de técnicas analíticas que incluyen, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño, dispersión dinámica de la luz o ultracentrifugación analítica.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables de un polipéptido conjugado HRS-Fc. Para una revisión de las sales adecuadas, véase Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use de Stahl y Wermuth (Wiley-VCH, 2002). Las sales básicas adecuadas se forman a partir de bases que forman sales no tóxicas. Los ejemplos representativos incluyen las sales de aluminio, arginina, benzatina, calcio, colina, dietilamina, diolamina, glicina, lisina, magnesio, meglumina, olamina, potasio, sodio, trometamina y zinc. También se pueden formar hemisales de ácidos y bases, por ejemplo, sales de hemisulfato y hemicalcio. Las composiciones a usar en la descripción adecuadas para administración parenteral pueden comprender soluciones acuosas y/o suspensiones estériles de los ingredientes farmacéuticamente activos, que preferentemente se hacen isotónicos con la sangre del receptor, generalmente usando cloruro de sodio, glicerina, glucosa, manitol, sorbitol y similares. Los ácidos orgánicos adecuados para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido hexanoico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido palmítico, ácido benzoico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácidos alquilsulfónicos (por ejemplo, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 1,2-etano-disulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico), ácidos arilsulfónicos (por ejemplo, ácido bencenosulfónico, ácido 4-clorobencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 4-toluenosulfónico, ácido alcanforsulfónico), ácido 4-metilbiciclo(2.2.2)-octo-2-eno-1-carboxílico, ácido glucoheptónico, ácido 3-fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciario, ácido laurilsulfúrico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido hidroxinaftoico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucónico, y similares.
En realizaciones particulares de la presente descripción, el portador puede incluir agua. En algunas realizaciones de la presente descripción, el portador puede ser una solución acuosa de solución salina, por ejemplo, agua que contiene concentraciones fisiológicas de sodio, potasio, calcio, magnesio y cloruro a un pH fisiológico. En algunas realizaciones de la presente descripción, el portador puede ser agua y la formulación puede incluir además NaCl. En algunas realizaciones de la presente descripción, la formulación puede ser isotónica. En algunas realizaciones de la presente descripción, la formulación puede ser hipotónica. En otras realizaciones de la presente descripción, la formulación puede ser hipertónica. En algunas realizaciones de la presente descripción, la formulación puede ser isoosmótica. En algunas realizaciones de la presente descripción, la formulación está sustancialmente libre de polímeros (por ejemplo, polímeros formadores de gel, agentes de aumento de viscosidad poliméricos). En algunas realizaciones de la presente descripción, la formulación está sustancialmente libre de agentes que aumentan la viscosidad (por ejemplo, carboximetilcelulosa, polímeros polianiónicos). En algunas realizaciones de la presente descripción, la formulación está sustancialmente libre de polímeros formadores de gel. En algunas realizaciones de la presente descripción, la viscosidad de la formulación es aproximadamente la misma que la viscosidad de una solución salina que contiene la misma concentración de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo).
En las composiciones farmacéuticas de la descripción, la formulación de excipientes farmacéuticamente aceptables y soluciones portadoras es bien conocida por los expertos en la materia, como es el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en diversos regímenes de tratamiento, que incluyen, por ejemplo, administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el polipéptido conjugado HRS-Fc tiene una solubilidad que es deseable para el modo particular de administración, tal como administración intravenosa. Los ejemplos de solubilidad deseable incluyen al menos aproximadamente 1 mg/ml, al menos aproximadamente 10 mg/ml, al menos aproximadamente 25 mg/ml y al menos aproximadamente 50 mg/ml.
En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse mediante administración oral a un sujeto. Por tanto, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un portador comestible, o pueden incluirse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente al alimento de la dieta.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el suministro de conjugados de HRS-Fc y los procedimientos para su preparación serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia. Dichas composiciones y procedimientos para su preparación se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a edición (Mack Publishing Company, 1995).
La administración de una dosis terapéutica de un conjugado HRS-Fc puede realizarse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en las técnicas médicas, incluyendo, por ejemplo, administración oral, intranasal, parenteral que incluye intravítrea, subconjuctival, subcapsular, retrobulbar, supracoroidal intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular, intrasinovial, intraocular, tópica y subcutánea. Los dispositivos adecuados para la administración parenteral incluyen inyectores de aguja (incluyendo microagujas), inyectores sin aguja y técnicas de infusión.
Las formulaciones parenterales son típicamente soluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, carbohidratos y agentes tamponantes (preferentemente a un pH de 3 a 9), pero, para algunas aplicaciones, pueden formularse más adecuadamente como una solución no acuosa estéril o como una forma seca a usar junto con un vehículo adecuado, tal como agua estéril sin pirógenos. La preparación de formulaciones parenterales en condiciones estériles, por ejemplo, mediante liofilización, puede conseguirse fácilmente usando técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por los expertos en la materia.
Las formulaciones para administración parenteral pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o sostenida. Las composiciones de liberación sostenida incluyen la liberación retardada, modificada, pulsada, controlada, dirigida y programada. Por lo tanto, un conjugado HRS-Fc se puede formular como una suspensión o como un sólido, semisólido o líquido tixotrópico para la administración como un depósito implantado que proporciona una liberación sostenida de conjugados HRS-Fc. Los ejemplos de dichas formulaciones incluyen, sin limitación, endoprótesis vasculares recubiertas de fármaco y semisólidos y suspensiones que comprenden vesículas laminares o micropartículas cargadas de fármaco de ácido poli-(DL-láctico-co-glucólico) (PGLA), poli(DL-lactida-co-glucólido) (PLG) o poli(lactida) (PLA), hidrogeles (Hoffman AS: Ann. NY Acad. Sci. 944: 62-73 (2001)), sistemas de nanopartículas de poli-aminoácidos, tales como el sistema Medusa desarrollado por Flamel Technologies Inc., sistemas de gel no acuoso, tal como Atrigel, desarrollado por Atrix, Inc., y SABER (acarato de sacarosa, isobutirato de liberación prolongada), desarrollado por Durect Corporation, y sistemas basados en lípidos, tales como DepoFoam, desarrollado por SkyePharma.
Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (patente de Estados Unidos N.° 5.466.468). En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil capacidad de inyección con jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede facilitarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe ser adecuadamente tamponada si es necesario y el diluyente líquido primero debe hacerse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, un medio acuoso estéril que puede emplearse será conocido por los expertos en la materia a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de líquido hipodermoclítico o inyectarse en el lugar propuesto para la infusión (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a edición, págs. 1035-1038 y 1570-1580). Una cierta variación en la dosificación ocurrirá necesariamente dependiendo de la condición del sujeto que está siendo tratado. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis adecuada para el sujeto individual. Además, para la administración humana, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad y seguridad y pureza generales que exigen los estándares de la Oficina de Productos Biológicos de la FDA.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con los otros ingredientes enumerados anteriormente, conforme sea necesario, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución del mismo filtrada previamente estéril.
Las composiciones divulgadas en el presente documento pueden formularse en forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en diversas formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco y similares.
Como se usa en el presente documento, «portador» incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, revestimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción, tampones, soluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en la composición terapéutica. Principio activos suplementarios también pueden incorporarse en las composiciones.
La frase «farmacéuticamente aceptable» se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o adversa similar cuando se administran a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como principio activo se entiende bien en la técnica. Típicamente, dichas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse.
Los polipéptidos conjugados de HRS-Fc para uso en la presente descripción también pueden administrarse por vía tópica, (intra)dérmica o transdérmica a la piel, mucosa o superficie del ojo, ya sea solos o en combinación con uno o más antihistamínicos, uno o más antibióticos, uno o más agentes antifúngicos, uno o más bloqueadores beta, uno o más agentes antiinflamatorios, uno o más agentes antineoplásicos, uno o más agentes inmunosupresores, uno o más agentes antivirales, uno o más agentes antioxidantes u otros agentes activos. Las formulaciones para administración tópica y ocular pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, sostenida, pulsada, controlada, dirigida y programada.
Las formulaciones típicas para este fin incluyen geles, hidrogeles, lociones, soluciones, colirios, cremas, pomadas, polvos de espolvorear, apósitos, espumas, películas, parches cutáneos, obleas, implantes, esponjas, fibras, vendas y microemulsiones. También se pueden usar liposomas. Los portadores típicos incluyen alcohol, agua, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, glicerina, polietilenglicol y propilenglicol. Pueden incorporarse potenciadores de la penetración, véase, por ejemplo, Finnin y Morgan: J. Pharm. Sci. 88 (10): 955-958, (1999). Otros medios de administración tópica incluyen el suministro por electroporación, iontoforesis, fonoforesis, sonoforesis e inyección con microagujas o sin agujas (por ejemplo, los sistemas comercializados con las marcas comerciales POWDERJECT™, BIOJECT™).
Los ejemplos de antihistamínicos incluyen, aunque sin limitarse a, loradatina, hidroxizina, difenhidramina, clorfeniramina, bromfeniramina, ciproheptadina, terfenadina, clemastina, triprolidina, carbinoxamina, difenilpiralina, fenindamina, azatadina, tripelenamina, dexclorfeniramina, dexbromfeniramina, metdilazina y trimprazina, doxilamina, feniramina, pirilamina, clorciclizina, tonzilamina, y derivados de las mismas.
Los ejemplos de antibióticos incluyen, aunque sin limitarse a, aminoglucósidos (por ejemplo, amikacina, apramicina, arbekacina, bambermicinas, butirosina, dibekacina, dihidroestreptomicina, fortimicina(s), gentamicina, isepamicina, kanamicina, micronomicina, neomicina, undecilenato de neomicina, netilmicina, paromomicina, ribostamicina, sisomicina, espectinomicina, estreptomicina, tobramicina, trospectomicina), anfenicoles (por ejemplo, azidanfenicol, cloranfenicol, florfenicol, tianfenicol), ansamicinas (por ejemplo, rifamida, rifampicina, rifamicina sv, rifapentina, rifaximina), lactamas (por ejemplo, carbacefemos (por ejemplo, loracarbef), carbapenemos (por ejemplo, biapenem, imipenem, meropenem, panipenem), cefalosporinas (por ejemplo, cefaclor, cefadroxil, cefamandol, cefatrizina, cefazedona, cefazolina, cefcapeno pivoxil, cefclidina, cefdinir, cefditoren, cefepima, cefetamet, cefixima, cefmenoxima, cefodizima, cefonicid, cefoperazona, ceforanida, cefotaxima, cefotiam, cefozopran, cefpimizol, cefpiramida, cefpiroma, cefpodoxima proxetil, cefprozil, cefroxadina, cefsulodina, ceftazidima, cefteram, ceftezol, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefuroxima, cefuzonam, cefacetrilo sódico, cefalexina, cefaloglicina, cefaloridina, cefalosporina, cefalotina, cefapirina sódica, cefradina, pivcefalexina), cefamicinas (por ejemplo, cefbuperazona, cefmetazol, cefminox, cefotetan, cefoxitina), monobactamas (por ejemplo, aztreonam, carumonam, tigemonam), oxacefemas, flomoxef, moxalactama), penicilinas (por ejemplo, amdinocilina, amdinocilina pivoxil, amoxicilina, ampicilina, apalcilina, aspoxicilina, azidocilina, azlocilina, bacampicilina, ácido bencilpenicilínico, bencilpenicilina sódica, carbenicilina, carindacilina, clometocilina, cloxacilina, ciclacilina, dicloxacilina, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, hetacilina, lenampicilina, metampicilina, meticilina sódica, mezlocilina, nafcilina sódica, oxacilina, penamecilina, yodhidrato de penetamato, penicilina g benetamina, penicilina g benzatina, penicilina g benzhidrilamina, penicilina g cálcica, penicilina g hidrabamina, penicilina g potásica, penicilina g procaía, penicilina n, penicilina o, penicilina v, penicilina v benzatina, penicilina v hidrabamina, penimepiciclina, feneticilina potásica, piperacilina, pivampicilina, propicilina, quinacilina, sulbenicilina, sultamicilina, talampicilina, temocilina, ticarcilina), otros (por ejemplo, ritipenem), lincosamidas (por ejemplo, clindamicina, lincomicina), macrólidos (por ejemplo, azitromicina, carbomicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, acistrato de eritromicina, estolato de eritromicina, glucoheptonato de eritromicina, lactobionato de eritromicina, propionato de eritromicina, estearato de eritromicina, josamicina, leucomicinas, midecamicinas, miokamicina, oleandomicina, primicina, rokitamicina, rosaramicina, roxitromicina, espiramicina, troleandomicina), polipéptidos (por ejemplo, anfomicina, bacitracina, capreomicina, colistina, enduracidina, enviomicina, fusafungina, gramicidina s, gramicidina(s), mikamicina, polimixina, pristinamicina, ristocetina, teicoplanina, tiostreptona, tuberactinomicina, tirocidina, tirotricina, vancomicina, viomicina, virginiamicina, bacitracina de zinc), tetraciclinas (por ejemplo, apiciclina, clortetraciclina, clomociclina, demeclociclina, doxiciclina, guameciclina, limeciclina, meclociclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, penimepiciclina, pipaciclina, rolitetraciclina, sanciclina, tetraciclina) y otros (por ejemplo, cicloserina, mupirocina, tuberina). 2.4-diaminopirimidinas (por ejemplo, brodimoprima, tetroxoprima, trimetoprima), nitrofuranos (por ejemplo, furaltadona, cloruro de furazolio, nifuradeno, nifuratel, nifurfolina, nifurpirinol, nifurprazina, nifurtoinol, nitrofurantoína), quinolonas y análogos (por ejemplo, cinoxacina, ciprofloxacina, clinafloxacina, difloxacina, enoxacina, fleroxacina, flumequina, grepafloxacina, lomefloxacina, miloxacina, nadifloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, ácido oxolínico, pazufloxacina, pefloxacina, ácido pipemídico, ácido piromídico, rosoxacina, rufloxacina, esparfloxacina, temafloxacina, tosufloxacina, trovafloxacina), sulfonamidas (por ejemplo, acetil sulfametoxipirazina, bencilsulfamida, cloramina-b, cloramina-t, dicloramina t, n2-formilsulfisomidina, mafenida, 4'-(metilsulfamoil)sulfanilanilida, noprilsulfamida, ftalilsulfacetamida, ftalilsulfatiazol, salazosulfadimidina, succinilsulfatiazol, sulfabenzamida, sulfacetamida, sulfaclorpiridazina, sulfacrisoidina, sulfacitina, sulfadiazina, sulfadicramida, sulfadimetoxina, sulfadoxina, sulfaetidol, sulfaguanidina, sulfaguanol, sulfaleno, ácido sulfalóxico, sulfamerazina, sulfámetro, sulfametazina, sulfametizol, sulfametomidina, sulfametoxazol, sulfametoxipiridazina, sulfametrol, sulfamidocrisoidina, sulfamoxol, sulfanilamida, ácido 4-sulfanilamidosalicílico, n4-sulfanililsulfanilamida, sulfanililurea, n-sulfanilil-3,4-xilamida, sulfanitán, sulfaperina, sulfafenazol, sulfaproxilina, sulfapirazina, sulfapiridina, sulfasomizol, sulfasimazina, sulfatiazol, sulfatourea, sulfatolamida, sulfisomidina, sulfisoxazol) sulfonas (por ejemplo, acedapsona, acediasulfona, acetosulfona sódica, dapsona, diatiosulfona, glucosulfona sódica, solasulfona, sucisulfona, ácido sulfanílico, psulfanililbencilamina, sulfoxona sódica, tiazolsulfona) y otros (por ejemplo, clofoctol, hexedina, metenamina, anhidrometilencitrato de metenamina, hipurato de metenamina, mandelato de metenamina, sulfosalicilato de metenamina, nitroxolina, taurolidina, xibornol).
Los ejemplos de agentes antifúngicos incluyen, aunque sin limitarse a, polienos (por ejemplo, anfotericina b, candicidina, dermostatina, filipina, fungicromina, hachimicina, hamicina, lucensomicina, mepartricina, natamicina, nistatina, pecilocina, perimicina), otros, (por ejemplo, azaserina, griseofulvina, oligomicinas, undecilenato de neomicina, pirrolnitrina, siccanina, tubercidina, viridina), alilaminas (por ejemplo, butenafina, naftifina, terbinafina), imidazoles (por ejemplo, bifonazol, butoconazol, clordantoína, clormidazol, cloconazol, clotrimazol, econazol, enilconazol, fenticonazol, flutrimazol, isoconazol, ketoconazol, lanoconazol, miconazol, omoconazol, nitrato de oxiconazol, sertaconazol, sulconazol, tioconazol), tiocarbamatos (por ejemplo, tolciclato, tolindato, tolnaftato), triazoles (por ejemplo, fluconazol, itraconazol, saperconazol, terconazol) otros (por ejemplo, acrisorcina, amorolfina, bifenamina, bromosaliclorcloranilida, buclosamida, propionato de calcio, clorfenesina, ciclopirox, cloxiquina, coparafinato, diclorhidrato de diamtazol, exalamida, flucitosina, haletazol, hexetidina, loflucarbán, nifuratel, yoduro de potasio, ácido propiónico, piritiona, salicilanilida, propionato de sodio, sulbentina, tenonitrozol, triacetina, ujotión, ácido undecilénico, propionato de zinc).
Los ejemplos de bloqueadores beta incluyen, aunque sin limitarse a, acebutolol, atenolol, labetalol, metoprolol, propranolol, timolol y derivados de los mismos.
Los ejemplos de agentes antineoplásicos incluyen, aunque sin limitarse a, antibióticos y análogos (por ejemplo, aclacinomicinas, actinomicina fi, antramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carubicina, carzinofilina, cromicicinas, dactinomicina, daunorubicina, 6-diazo-5 norleucina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, menogarilo, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, pirarubicina, plicamicina, porfiromicina, puromicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, zinostatina, zorubicina), antimetabolitos (por ejemplo, análogos de ácido fólico (por ejemplo, denopterina, edatrexato, metotrexato, piritrexima, pteropterina, Tomudex®, trimetrexato), análogos de purina, (por ejemplo, cladribina, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina), análogos de pirimidina (por ejemplo, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, doxifluridina, emitefur, enocitabina, floxuridina, fluorouracilo, gemcitabina, tagafur).
Los ejemplos de agentes antiinflamatorios incluyen, aunque sin limitarse a, agentes antiinflamatorios esteroideos y agentes antiinflamatorios no esteroideos. Los agentes antiinflamatorios esteroideos ejemplares incluyen acetoxipregnenolona, alclometasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacort, desonida, desoximetasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, flunisolida, fluocinolona acetónida, fluocinonida, fluocortin butilo, fluocortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandrenolida, propionato de fluticasona, formocortal, halcinonida, propionato de halobetasol, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, etabonato de loteprednol, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 25-dietilamino-acetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolona, prednisona, prednival, prednilideno, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, triamcinolona acetónida, triamcinolona benetónida y triamcinolona hexacetónida.
Los agentes antiinflamatorios no esteroideos ejemplares incluyen derivados del ácido aminoarilcarboxílico (por ejemplo, ácido enfenámico, etofenamato, ácido flufenámico, isonixina, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, ácido niflúmico, talniflumato, terofenamato, ácido tolfenámico), derivados del ácido arilacético (por ejemplo, aceclofecaco, acemetacina, alclofenaco, amfenaco, amtolmetin guacil, bromfenaco, bufexamaco, cinmetacina, clopiraco, diclofenaco de sodio, etodolaco, felbinaco, ácido fenclózico, fentiazaco, glucametacina, ibufenaco, indometacina, isofezolaco, isoxepaco, lonazolaco, ácido metiazínico, mofezolaco, oxametacina, pirazolaco, proglumetacina, sulindaco, tiaramida, tolmetina, tropesina, zomepiraco), derivados del ácido arilbutírico (por ejemplo, bumadizona, butibufeno, fenbufeno, xenbucina), ácidos arilcarboxílicos (por ejemplo, clidanaco, ketorolaco, tinoridina), derivados del ácido arilpropiónico (por ejemplo, alminoprofeno, benoxaprofeno, bermoprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenoprofeno, flunoxaprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, ibuproxam, indoprofeno, ketoprofeno, loxoprofeno, naproxeno, oxaprozina, piketoprofeno, pirprofeno, pranoprofeno, ácido protizínico, suprofeno, ácido tiaprofénico, ximoprofeno, zaltoprofeno), pirazoles (por ejemplo, difenamizol, epirizol), pirazolonas (por ejemplo, apazona, benzpiperilona, feprazona, mofebutazona, morazona, oxifenbutazona, fenilbutazona, pipebuzona, propifenazona, ramifenazona, suxibuzona, tiazolinobutazona), derivados del ácido salicílico (por ejemplo, acetaminosalol, aspirina, benorilato, bromosaligenina, acetilsalicilato de calcio, diflunisal, etersalato, fendosal, ácido gentísico, salicilato de glicol, salicilato de imidazol, acetilsalicilato de lisina, mesalamina, salicilato de morfolina, 1-naftil salicilato, olsalazina, parsalmida, acetilsalicilato de fenilo, salicilato de fenilo, salacetamida, salicilamida ácido o­ acético, ácido salicilsulfúrico, salsalato, sulfasalazina), tiazincarboxamidas (por ejemplo, ampiroxicam, droxicam, isoxicam, lornoxicam, piroxicam, tenoxicam), ácido g-acetamidocaproico, s-adenosilmetionina, ácido 3-amino-4-hidroxibutírico, amixetrina, bendazac, bencidamina, bucoloma, difenpiramida, ditazol, emorfazona, fepradinol, guaiazuleno, nabumetona, nimesulida, oxaceprol, paranilina, perisoxal, proquazona, superóxido dismutasa, tenidap y zileutón.
Los ejemplos de agentes antivirales incluyen interferón gamma, zidovudina, clorhidrato de amantadina, ribavirina, aciclovir, valciclovir, didesoxicitidina, ácido fosfonofórmico, ganciclovir y derivados de los mismos.
Los ejemplos de agentes antioxidantes incluyen ascorbato, alfa-tocoferol, manitol, glutatión reducido, diversos carotenoides, cisteína, ácido úrico, taurina, tirosina, superóxido dismutasa, luteína, zeaxantina, criotpxantina, astazantina, licopeno, N-acetil-cisteína, carnosina, gamma-glutamilcisteína, quercitina, lactoferrina, ácido dihidrolipoico, citrato, extracto de Ginkgo Biloba, catequinas del té, extracto de arándano, vitaminas E o ésteres de vitamina E, palmitato de retinilo y derivados de los mismos. Otros agentes terapéuticos incluyen escualamina, inhibidores de la anhidrasa carbónica, agonistas del receptor adrenérgico alfa-2, antiparasitarios, antifúngicos y derivados de los mismos.
La dosis exacta de cada componente administrado diferirá, por supuesto, dependiendo de los componentes específicos prescritos, del sujeto que está siendo tratado, de la gravedad de la enfermedad, por ejemplo, la gravedad de la reacción inflamatoria, de la forma de administración y del criterio del médico prescriptor. Por lo tanto, debido a la variabilidad de paciente a paciente, las dosis dadas anteriormente son una guía y el médico puede ajustar las dosis de los compuestos para conseguir el tratamiento que el médico considere apropiado.
Como entenderá el experto en la materia, para formulaciones de conjugados HRS-Fc donde el portador incluye un polímero formador de gel, en ciertas formulaciones, la inclusión de una o más sales, en particular solución salina, está contraindicada, ya que la inclusión de sal puede causar la solución a gel antes de la administración tópica, como con ciertos polímeros formadores de gel in situ (por ejemplo, gel de goma gellan), o la inclusión de sales puede inhibir las propiedades gelificantes del polímero formador de gel. El experto en la materia podrá seleccionar combinaciones apropiadas basándose en las propiedades deseadas de la formulación y las características de los polímeros formadores de gel conocidos en la técnica.
Los expertos en la materia entenderán las soluciones salinas acuosas adecuadas y estas pueden incluir, por ejemplo, soluciones a un pH de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente pH 8,0. En variaciones adicionales de soluciones acuosas (donde el agua está incluida en el portador), el pH de la formulación está entre cualquiera de aproximadamente 6 y aproximadamente 8,0; entre aproximadamente 6 y aproximadamente 7,5; entre aproximadamente 6 y aproximadamente 7,0; entre aproximadamente 6,2 y aproximadamente 8; entre aproximadamente 6,2 y aproximadamente 7,5; entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8; entre aproximadamente 6,2 y aproximadamente 7,2; entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0; entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7,5; entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 8,0; entre aproximadamente 6,1 y aproximadamente 7,7; entre aproximadamente 6,2 y aproximadamente 7,6; entre aproximadamente 7,3 y aproximadamente 7,4; aproximadamente 6,0; aproximadamente 7,1; aproximadamente 6,2; aproximadamente 7,3; aproximadamente 6,4; aproximadamente 6,5; aproximadamente 6,6; aproximadamente 6,7; aproximadamente 6,8; aproximadamente 6,9; aproximadamente 7,0; aproximadamente 7,1; aproximadamente 7,2; aproximadamente 7,3; aproximadamente 7,4; aproximadamente 7,5; aproximadamente 7,6; o aproximadamente 8,0. En algunas variaciones, la formulación de conjugado HRS-Fc tiene un pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0. En algunas variaciones, la formulación tiene un pH de aproximadamente 7,4. En variaciones particulares, la formulación tiene un pH de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 7,5.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, la concentración de la sal (por ejemplo, NaCI) será, por ejemplo, de aproximadamente el 0 % a aproximadamente el 0,9 % (p/v). Por ejemplo, la concentración de sal puede ser de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,02 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 9 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,9 % de aproximadamente el 0,07 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,09 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,9 % de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,3 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,4 % a aproximadamente el 0,9 % de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,6 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,7 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,8 % a aproximadamente el 0,9 %, aproximadamente el 0,9 %, aproximadamente el 0 %, aproximadamente el 0,05 %, aproximadamente el 0,01 %, aproximadamente el 0,09 %, aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,2 %, aproximadamente el 0,3 %, aproximadamente el 0,4 %, aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 0,6 %, aproximadamente el 0,7 % o aproximadamente el 0,8 %. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la solución salina acuosa será isotónica (por ejemplo, una concentración de NaCl de aproximadamente un 0,9 % de NaCl (p/v)). En ciertas realizaciones de la presente descripción, la solución acuosa contendrá una concentración de NaCl de aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 0,7 %, aproximadamente el 0,8 %, aproximadamente el 0,85, o aproximadamente el 0,75 %. Como se apreciará el experto en la materia, dependiendo de las concentraciones de otros componentes, por ejemplo, cuando los conjugados HRS-Fc están presentes como sales de, la concentración de NaCl u otra sal necesaria para conseguir una formulación adecuada para la administración puede variar.
En algunas realizaciones de la presente descripción, cuando la formulación está sustancialmente libre de agentes que aumentan la viscosidad, la formulación puede estar sustancialmente libre de agentes que aumentan la viscosidad tales como, aunque sin limitarse a, polímeros polianiónicos, derivados de celulosa solubles en agua (por ejemplo, hipromelosa (también conocida como HPMC, hidroxipropilmetilcelulosa e hidroxipropilcelulosa), hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, etc.), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, sulfato de condroitina, ácido hialurónico, almidones solubles, etc. En algunas variaciones, la formulación no incorpora un hidrogel u otro agente de retención (por ejemplo, tal como los divulgados en la publicación de patente de Estados Unidos N° 2005/0255144), por ejemplo, donde el hidrogel puede incluir hidrogeles que incorporan homopolímeros; copolímeros (por ejemplo, tetrapolímeros de hidroximetilmetacrilato, etilenglicol, dimetilmetacrilato y ácido metacrílico), copolímeros de trimetilencarbonato y ácido poliglicólico, poliglactina 910, gluconato, poli-p-dioxanona, ácido poliglicólico, fieltro de ácido poliglicólico, poli-4-hidroxibutirato, una combinación de poli(L-lactida) y poli(L-lactida-coglucólido), metacrilato de glicol, poli-DL-lactida o Primacryl); compuestos de celulosa regenerada oxidada, polipropileno y polidioxanona o un compuesto de polipropileno y poligelcaprona; etc. En algunas variaciones, las formulaciones no incluyen uno o más de alcohol polivinílico, hidroxipropilmetilcelulosa, emulsión en aceite de ricino de polietilenglicol 400, carboximetilcelulosa sódica, propilenglicol, hidroxipropil guar, carboximetilcelulosa sódica, baselina blanca, aceite mineral, dextrano 70, glicerina, hipromelosa, aceite de linaza, aceites de pescado, ácidos grasos omega 3 y omega 6, luteína o aceite de onagra. En algunas variaciones, las formulaciones no incluyen uno o más de los portadores descritos en la patente de Estados Unidos N.° 4.888.354, por ejemplo, tal como uno o más de ácido oleico, etanol, isopropanol, monooleato de glicerol, diooleato de glicerol, laurato de metilo, propilenglicol, propanol o dimetilsulfóxido. En algunas variaciones, las formulaciones están sustancialmente libres de diooleato de glicerol e isopropanol.
En realizaciones particulares de la presente descripción, el polímero formador de gel puede ser, por ejemplo, un polisacárido. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el polisacárido es goma gellan. La goma gellan se refiere a un heteropolisacárido elaborado por la bacteria Pseudomonas elodea, aunque el nombre «goma gellan» se usa más comúnmente en este campo. La goma gellan, en particular la formulación GELRITE® se describe en detalle en la patente de Estados Unidos N.° 4.861.760), en particular en su uso en la formulación de timolol. GELRITE®, una forma clarificada de goma gellan de baja graduación de acetilo, está disponible en el mercado de Merck & Co (Rahway, N.J.) y la goma gellan puede obtenerse comercialmente de, entre otros, CPKelco (Atlanta, Ga.). La preparación de polisacáridos tales como la goma gellan se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N. ° 4.326.053 y 4.326.052.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el polímero formador de gel está presente a una concentración de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 2 % (p/v). En algunas realizaciones de la presente descripción, el polímero formador de gel está presente a una concentración de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 1,75 %; de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 1,5 %, de aproximadamente el O, 03 % a aproximadamente el 1,25 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,8 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,7 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,6 %, de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,5 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 1,75 %; de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 1,5 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 1,25 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,8 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,7 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,6 %, de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 0,5 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1,75 %; de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1.5 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1,25 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,8 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,7 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,6 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,5 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 1,75 %; de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 1,5 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 1,25 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 0,9 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 0,8 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 0,7 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 0,6 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 0,5 %, o de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 1.5 %. En algunas realizaciones de la presente descripción, la concentración de polímero formador de gel es aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,2 %, aproximadamente el 0,4 %, aproximadamente el 0,6 %, aproximadamente el 0,8 %, aproximadamente el 1 %.
En realizaciones particulares de la presente descripción, el polímero formador de gel es goma gellan a una concentración de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 2 % (p/v), de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 2 % (p/v), de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1 % (p/v), de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 1 % (p/v) o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 0,6 % (p/v). En algunas realizaciones de la presente descripción, la concentración de goma gellan es aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,2 %, aproximadamente el 0,4 %, aproximadamente el 0,6 %, aproximadamente el 0,8 %, aproximadamente el 1 %.
En algunas realizaciones de la presente descripción de las formulaciones, la formulación puede incluir componentes adicionales tales como uno o más conservantes, uno o más tensioactivos, o uno o más agentes farmacéuticos. En realizaciones particulares de la presente descripción, la formulación puede incluir componentes adicionales tales como uno o más conservantes, uno o más tensioactivos, uno o más agentes de tonicidad, uno o más agentes tamponantes, uno o más agentes quelantes, uno o más agentes que aumentan la viscosidad, una o más sales, o uno o más agentes farmacéuticos. En ciertas de estas realizaciones de la presente descripción, la formulación puede incluir (además de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) y un portador): uno o más conservantes, uno o más agentes tamponantes (por ejemplo, uno, dos, tres, etc.), uno o más agentes quelantes, y una o más sales. En algunas realizaciones de la presente descripción, la formulación puede incluir (además de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) y un portador): uno o más conservantes, uno o más agentes de tonicidad, uno o más agentes tamponantes, uno o más agentes quelantes, y uno o más agentes que aumentan la viscosidad.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la viscosidad de la formulación es aproximadamente la misma que la viscosidad de una solución salina que contiene la misma concentración de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo). En algunas realizaciones de la presente descripción, la formulación está sustancialmente libre de polímeros formadores de gel. En ciertas realizaciones de la presente descripción, cuando el portador es agua, la formulación puede incluir adicionalmente uno o más agentes quelantes (por ejemplo, EDTA disódico (EDTA), uno o más conservantes (por ejemplo, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, clorhexidina, clorobutanol, metilparabeno, alcohol feniletílico, propilparabeno, timerosal, nitrato fenilmercúrico, borato fenilmercúrico, acetato fenilmercúrico o combinaciones de dos o más de los anteriores), sal (por ejemplo, NaCl) y uno o más agentes tamponantes (por ejemplo, uno o más tampones de fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, combinaciones de los mismos, etc.), tampones de citrato, tampones de maleato, tampones de borato y combinación de dos o más de los anteriores).
En realizaciones particulares de la presente descripción, el agente quelante es EDTA disódico, el conservante es cloruro de benzalconio, la sal es NaCl y los agentes tamponantes son fosfato de sodio dibásico y fosfato de sodio monobásico. En ciertas de estas realizaciones de la presente descripción, la formulación está sustancialmente libre de polímero. En algunas realizaciones de la presente descripción, la formulación está sustancialmente libre de uno o más agentes que aumentan sustancialmente la viscosidad (por ejemplo, carboximetilcelulosa, polímeros polianiónicos, etc.). En algunas realizaciones de la presente descripción, la viscosidad de la formulación es aproximadamente la misma que la viscosidad de una solución salina que contiene la misma concentración de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo). En algunas de estas realizaciones de la presente descripción, la concentración de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) es de aproximadamente el 0,02 % a aproximadamente el 3 %, de aproximadamente el 0,02 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,02 % a aproximadamente el 1 % (p/v). En ciertas realizaciones de la presente descripción, la concentración de un conjugado HRS-Fc (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) es aproximadamente el 0,01 %, aproximadamente el 0,02 %, aproximadamente el 0,03 %, aproximadamente el 0,05 %, aproximadamente el 0,07 %, aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,3 %, aproximadamente el 0,4 %, aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 0,6 %, aproximadamente el 0,8 % o aproximadamente el 1 % (p/v).
En ciertas realizaciones de la presente descripción, donde el vehículo incluye agua, también se puede incluir un agente que aumenta la viscosidad en la formulación. El experto en la materia estará familiarizado con los agentes que aumentan la viscosidad que son adecuados (por ejemplo, derivados de celulosa solubles en agua (por ejemplo, hipromelosa (también conocida como HPMC, hidroxipropilmetilcelulosa e hidroxipropilcelulosa), hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, etc.), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, sulfato de condroitina, ácido hialurónico y almidones solubles. Se pretende que, cuando se usan agentes que aumentan la viscosidad, no se incluyan en concentraciones suficientemente altas, de modo que la formulación formara un gel antes o después de la administración (por ejemplo, donde la concentración del agente que aumenta la viscosidad no es suficiente para inducir la formación de gel).
Aunque las concentraciones exactas de los agentes que aumentan la viscosidad dependerán de la selección y concentración de otros componentes en la formulación, así como del agente o agentes de que aumentan la viscosidad seleccionados, en general, los agentes que aumentan la viscosidad pueden estar presentes en una concentración tal que la viscosidad de la solución resultante es menor de aproximadamente 1000 centipoises. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la viscosidad de la formulación es menor de aproximadamente 900, menor de aproximadamente 800, menor de aproximadamente 700, menor de aproximadamente 600, menor de aproximadamente 500, menor de aproximadamente 400, menor de aproximadamente 300, menor de aproximadamente 200, menor de aproximadamente 150, menor de aproximadamente 100, menor de aproximadamente 50 centipoises. En algunas realizaciones de la presente descripción, la viscosidad de la formulación es aproximadamente 200, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50 centipoises. En realizaciones particulares de la presente descripción, la viscosidad es menor de aproximadamente 200 centipoises. En otras, menor de aproximadamente 120 centipoises o menor de aproximadamente 100 centipoises. En algunas realizaciones de la presente descripción, la viscosidad es de aproximadamente 100 centipoises. En otras aproximadamente 50 centipoises. En aún otras realizaciones de la presente descripción, la viscosidad es de aproximadamente 200 centipoises. Los procedimientos para medir la viscosidad son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, como se describe en la Farmacopea de los Estados Unidos 29 (Capítulo 911) Viscosidad, página 2785. Como es bien sabido por los expertos en la materia, las formulaciones comúnmente consideradas «geles» tendrán una viscosidad significativamente mayor de 1000 centipoises, por ejemplo, mayor de aproximadamente 2000 centipoises, mayor de aproximadamente 5000 centipoises.
En algunas realizaciones de la presente descripción, incluyendo (aunque sin limitarse a) que el uso de sales está contraindicado como se ha descrito anteriormente, la formulación puede incluir además uno o más agentes de tonicidad. Como se usa en el presente documento, la expresión «agente de tonicidad» y sus análogos se refieren a agentes que ajustan la tonicidad de la formulación, pero no son sales (por ejemplo, no NaCl), que, como apreciará el experto en la materia a la vista de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, están contraindicados para algunas formulaciones debido a la presencia de ciertos polímeros formadores de gel o agentes que aumentan la viscosidad. Estos agentes pueden usarse para preparar formulaciones que son isotónicas o casi isotónicas (por ejemplo, algo hiper- o hipoisotónicas, por ejemplo, dentro de aproximadamente ± 20 %, aproximadamente ± 15 %, aproximadamente ± 10 %, aproximadamente ± 5 % de ser isotónicos). El o los agentes de tonicidad también se pueden usar en formulaciones donde el uso de sales no está contraindicado.
Los agentes de tonicidad que se pueden usar para ajustar la tonicidad de la formulación de las formulaciones descritas en el presente documento y que son conocidos por los expertos en la materia y pueden seleccionarse basándose en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, los agentes de tonicidad incluyen polioles (por ejemplo, alcoholes de azúcar (por ejemplo, manitol, etc.), alcoholes de trihidroxi (por ejemplo, glicerina, etc.), propilenglicol o polietilenglicol, etc.), o combinaciones de dos o más polioles. Del mismo modo, la concentración del o de los agentes de tonicidad dependerá de la identidad y las concentraciones de los otros componentes en la formulación y puede ser determinada fácilmente por el experto en la materia en vista de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el agente de tonicidad es glicerina o manitol. En algunas realizaciones de la presente descripción, el agente de tonicidad es glicerina. En otras realizaciones de la presente descripción, es manitol. En todavía otras se puede usar una combinación de manitol y glicerina. Las concentraciones ejemplares de agentes de tonicidad incluyen, por ejemplo, de aproximadamente el 0,001 a aproximadamente el 3 %. En algunas realizaciones de la presente descripción, la concentración del agente de tonicidad (por ejemplo, manitol o glicerina) es, por ejemplo, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 2,7 %, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 2,5 %, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 1,5 %, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 3 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 2,7 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 2,5 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 1,5 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 3 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 2,7 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 2,5 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1,5 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 0,01 % de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 3 %; de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 2,5 %; de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 2 %; de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 1,8 %; de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 1,5 %; o aproximadamente el 0,001 %, aproximadamente el 0,01 %, aproximadamente el 0,05 %, aproximadamente el 0,08 %, aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,2 %, aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 0,8 %, aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 1,5 %, aproximadamente el 1,8 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 2,2 %, aproximadamente el 2,5 %, aproximadamente el 2,8 % o aproximadamente el 3 % (p/v). En ciertas realizaciones de la presente descripción, el agente de tonicidad es manitol. En algunas de estas realizaciones de la presente descripción, el portador incluye un agente formador de gel (por ejemplo, goma gellan).
En algunas realizaciones de la presente descripción, el agente de tonicidad es manitol. En ciertas de estas realizaciones de la presente descripción, el portador incluye un agente que aumenta la viscosidad (por ejemplo, derivados de celulosa solubles en agua (por ejemplo, hipromelosa), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, sulfato de condroitina, ácido hialurónico o almidones solubles).
En algunas realizaciones de la presente descripción, la formulación puede incluir adicionalmente un conservante (por ejemplo, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, clorhexidina, clorobutanol, metilparabeno, alcohol feniletílico, propilparabeno, timerosal, nitrato fenilmercúrico, borato fenilmercúrico, o acetato fenilmercúrico, peróxidos), o una combinación de dos o más de los conservantes anteriores. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el conservante es cloruro de benzalconio.
Como apreciará el experto en la materia, los conservantes pueden estar presentes en concentraciones de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,7 % (p/v). En realizaciones particulares de la presente descripción, el o los conservantes pueden estar presentes en una concentración de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,5 % (p/v); de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,05 % (p/v), de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,02 % (p/v), de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,015 % (p/v), de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,005 % (p/v), de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,02 %, de aproximadamente el 0,002 % a aproximadamente el 0,01 %, de aproximadamente el 0,015 % a aproximadamente el 0,05 %, menos de aproximadamente <0,5 %, de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 0,01 %, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,15 %, de aproximadamente el 0,002 % a aproximadamente el 0,004 %, de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 0,002 %. En algunas realizaciones de la presente descripción, la concentración del conservante puede ser, por ejemplo, aproximadamente el 0,001 %, aproximadamente el 0,005 %, aproximadamente el 0,01 %, aproximadamente el 0,02 %, aproximadamente el 0,03 %, aproximadamente el 0,05 %, aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,2 %, aproximadamente el 0,5 %, o aproximadamente el 0,7 % (p/v). Las concentraciones típicas (p/v) para diversos conservantes de uso común se enumeran en la tabla C a continuación.
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En ciertas realizaciones de la presente descripción, la formulación puede incluir adicionalmente un tensioactivo, o combinaciones de dos o más tensioactivos. En realizaciones particulares de la presente descripción, la formulación está sustancialmente libre de tensioactivo. Tal como se usa en el presente documento, el término «sustancialmente libre» pretende referirse a niveles de un componente particular que no son detectables usando procedimientos y protocolos de detección de rutina conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, HPLC (incluyendo HPLC quiral, HPLC quiral/MS, LC/MS/MS, etc.), cromatografía en capa fina, espectrometría de masas, mediciones polarimétricas, cromatografía de gases-espectrometría de masas, u otros.
En realizaciones particulares de la presente descripción, la formulación puede incluir además un agente quelante (por ejemplo, EDTA disódico (EDTA) (por ejemplo, EDTA disódico (dihidrato), etc.) citratos, etc.). En algunas realizaciones de la presente descripción, puede estar presente una combinación de agentes quelantes. Como apreciarán los expertos en la materia, los agentes quelantes se pueden usar para impedir la degradación de los componentes de la formulación y, por lo tanto, aumentar la vida útil de las formulaciones. Como apreciará el experto en la materia, el uso de EDTA en combinación con una formulación de goma gellan puede estar contraindicado, ya que el EDTA puede causar la formación de gel antes de la administración de la formulación de goma gellan.
Las concentraciones típicas para los agentes quelantes son de aproximadamente el 0,005 % al 0,1 % (p/v). Por ejemplo, de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 0,09 %, de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 0,08 %, de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 07 %, de aproximadamente el 0,005 %, a aproximadamente el 0,06 %, de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 0,05 %, de aproximadamente el 0,005 a aproximadamente el 0,04 %, de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 0,03 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,1 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,09 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,08 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,07 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,06 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,05 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,04 %, etc. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la concentración de uno o más agentes quelantes es aproximadamente el 0,005 %, aproximadamente el 0,01 %, aproximadamente el 0,02 %, aproximadamente el 0,03 %, aproximadamente el 0,05 %, aproximadamente el 0,06 %, aproximadamente el 0,07 %, aproximadamente el 0,08 %, aproximadamente el 0,09 % o aproximadamente el 0,1 %.
En realizaciones particulares de la presente descripción, el agente quelante es EDTA disódico. En ciertas realizaciones de la presente descripción, el agente quelante es EDTA disódico (dihidrato). En algunas de estas realizaciones de la presente descripción, el EDTA disódico dihidrato está presente a una concentración de aproximadamente el 0,01 % (p/v).
En algunas realizaciones de la presente descripción, la formulación puede incluir adicionalmente uno o más agentes tamponantes (por ejemplo, uno o más tampones de fosfato (por ejemplo, tampones de fosfato de sodio (por ejemplo, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, etc.), tampones de citrato, tampones de maleato, tampones de borato, etc.) Como apreciará el experto en la materia, el uno o más agentes tamponantes, deben seleccionarse en combinación con los otros componentes de una formulación dada para conseguir un pH adecuado para su uso (por ejemplo, pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 8).
En ciertas realizaciones de la presente descripción, el agente tamponante es un tampón fosfato o una combinación de dos o más tampones fosfato. En ciertas realizaciones de la presente descripción, los agentes tamponantes son fosfato sódico dibásico y fosfato sódico monobásico.
Las concentraciones típicas para el agente o agentes tamponantes, por ejemplo, el agente o agentes tamponantes de fosfato pueden ser de aproximadamente 0,005 molar a 0,1 molar. En algunas realizaciones de la presente descripción, el agente o agentes tamponantes pueden estar a una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,08, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,04, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,1, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,08, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,06, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,05, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,04 molar, etc. En realizaciones particulares de la presente descripción, hay dos agentes tamponantes. Los agentes tamponantes ejemplares incluyen una combinación de fosfato de sodio dibásico (por ejemplo, fosfato de sodio dibásico, 7 H2O) y fosfato de sodio monobásico (por ejemplo, fosfato de sodio monobásico anhidro). En algunas realizaciones de la presente descripción, la concentración del o de los agentes tamponantes es aproximadamente 0,005 molar, aproximadamente 0,01 molar, aproximadamente 0,02 molar, aproximadamente 0,03 molar, aproximadamente 0,04 molar, aproximadamente 0,05 molar, aproximadamente 0,06 molar, aproximadamente 0,07 molar, o aproximadamente 0,1 molar.
Un aspecto adicional de la presente descripción incluye el uso de las formulaciones como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento. Particularmente, la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento y/o la prevención de afecciones como se describe en el presente documento. Además, las formulaciones, que se describen de manera diversa en el presente documento, también están destinadas para uso en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento y/o la prevención de las afecciones y, de acuerdo con los procedimientos, descritos en el presente documento, a menos que se indique lo contrario.
Los procedimientos de formulación son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19a Edición (1995). Las composiciones y agentes proporcionados en el presente documento pueden administrarse de acuerdo con los procedimientos de la presente descripción en cualquier régimen de dosificación terapéuticamente efectivo. La cantidad y la frecuencia de dosificación se seleccionan para crear un nivel efectivo del agente sin efectos perjudiciales. La cantidad efectiva de un compuesto de la presente descripción dependerá de la vía de administración, el tipo de animal de sangre caliente que esté siendo tratado y las características físicas del animal específico de sangre caliente en consideración. Estos factores y su relación con la determinación de esta cantidad son bien conocidos por los expertos en medicina. Esta cantidad y el procedimiento de administración pueden adaptarse para conseguir una eficacia óptima, pero dependerán de factores tales como el peso, la dieta, la medicación concurrente y otros factores que reconocerán los expertos en medicina.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante pulverizaciones intranasales, inhalación y/u otros vehículos de administración en aerosol. Los procedimientos para administrar genes, polinucleótidos y composiciones peptídicas directamente a los pulmones a través de pulverizaciones nasales en aerosol se han descrito, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 5.756.353 y la patente de Estados Unidos N.° 5.804.212. Del mismo modo, la administración de fármacos que utilizan resinas de micropartículas intranasales (Takenaga y col., 1998) y compuestos de lisofosfatidilglicerol (patente de Estados Unidos N.° 5.725.871) también son bien conocidos en las técnicas farmacéuticas. Del mismo modo, la administración de un fármaco transmucoso en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno se describe en la patente de Estados Unidos N.° 5.780.045.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, la administración puede producirse mediante el uso de liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas y similares, para la introducción de las composiciones de la presente descripción en células huésped adecuadas. En particular, las composiciones de la presente descripción pueden formularse para la administración encapsulada en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, una nanopartícula o similares. La formulación y el uso de dichos vehículos de administración pueden llevarse a cabo usando técnicas conocidas y convencionales.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, los agentes proporcionados en el presente documento pueden unirse a un sustrato sólido farmacéuticamente aceptable, que incluye sustratos biocompatibles y biodegradables tales como polímeros y matrices. Los ejemplos de dichos sustratos sólidos incluyen, sin limitación, poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de Estados Unidos N.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y y-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-glicólico degradables tales como poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) y LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico, colágeno, metal, hidroxiapatita, Bioglass, aluminato, materiales biocerámicos y proteínas purificadas.
En una realización particular de la presente descripción, el sustrato sólido comprende Atrigel™ (QLT, Inc., Vancouver, B.C.). El sistema de administración de fármacos Atrigel® consiste en polímeros biodegradables disueltos en portadores biocompatibles. Los productos farmacéuticos pueden mezclarse en este sistema de administración de líquidos en el momento de la fabricación o, dependiendo del producto, el médico puede añadirlos más tarde en el momento de su uso. Cuando el producto líquido se inyecta en el espacio subcutáneo a través de una aguja de pequeño calibre o se coloca en sitios de tejido accesibles a través de una cánula, el agua en los fluidos tisulares hace que el polímero precipite y atrape el fármaco en un implante sólido. El fármaco encapsulado dentro del implante se libera a continuación de forma controlada a medida que la matriz polimérica se biodegrada con el tiempo.
En realizaciones particulares de la presente descripción, la cantidad de una composición de conjugado HRS-Fc administrada variará generalmente de una dosis de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/kg, y típicamente de aproximadamente 0,1 a 10 o 20 mg/kg cuando se administra por vía oral, por vía subcutánea o por vía intravenosa. En realizaciones particulares de la presente descripción, una dosis es aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 7,5 mg/kg, o aproximadamente 10 mg/kg. En ciertas realizaciones de la presente descripción, una composición se administra en una dosis única de 0,1 a 10 mg/kg o de 0,5 a 5 mg/kg. En algunas realizaciones de la presente descripción, una composición se administra en una dosis de 0,1 a 50 mg/kg, 0,5 a 20 mg/kg, o 5 a 20 mg/kg.
Para seres humanos, la dosis diaria usada puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a 5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg a 10 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a 20 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg a 30 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg a 50 mg/kg, y aproximadamente 50 mg/kg a 100 mg/kg/24 horas.
Para conjugados HRS-Fc con semividas más largas, la dosificación humana usada puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg/kg/semana a 0,5 mg/kg/semana, aproximadamente 1 mg/kg/semana a 5 mg/kg/semana, aproximadamente 5 mg/kg/semana a 10 mg/kg/semana, aproximadamente 10 mg/kg/semana a 20 mg/kg/semana, aproximadamente 20 mg/kg/semana a 30 mg/kg/semana, aproximadamente 30 mg/kg/semana a 50 mg/kg/semana, o aproximadamente 50 mg/kg/semana a 100 mg/kg/semana.
Los conjugados HRS-Fc con semividas aún más largas se pueden dosificar en seres humanos de aproximadamente 0,1 mg/kg/mes a 0,5 mg/kg/mes, aproximadamente 1 mg/kg/mes a 5 mg/kg/mes, aproximadamente 5 mg/kg/mes a 10 mg/kg/mes, aproximadamente 10 mg/kg/mes a 20 mg/kg/mes, aproximadamente 20 mg/kg/mes a 30 mg/kg/mes, aproximadamente 30 mg/kg/mes a 50 mg/kg/mes, o aproximadamente 50 mg/kg/mes a 100 mg/kg/mes.
En diversas realizaciones de la presente descripción, la dosificación es de aproximadamente 50-2500 mg por día, 100-2500 mg/día, 300-1800 mg/día, o 500-1800 mg/día, o 500-2500 mg por semana, 1000 -2500 mg/semana, 300­ 1800 mg/semana, o 500-1800 mg/semana, o 500-2500 mg por mes, 1000-2500 mg/mes, 300-1800 mg/mes, o 500­ 1800 mg/mes. En algunas realizaciones de la presente descripción, la dosis está entre aproximadamente 100 y 600 mg/día, 100 y 600 mg/semana, o 100 y 600 mg/mes. En algunas realizaciones de la presente descripción, la dosis está entre aproximadamente 300 y 1200 mg/día, 300 y 1200 mg/semana, o 300 y 1200 mg/mes. En realizaciones particulares de la presente descripción, la composición o el agente se administra en una dosificación de 100 mg/semana, 2,4 mg/semana 300 mg/semana, 600 mg/semana, 1000 mg/semana, 1200 mg/semana o 1800 mg/semana, en una o más dosis por semana o por mes (es decir, cuando las dosis combinadas consiguen la dosis semanal o mensual deseada). En algunas realizaciones de la presente descripción, una dosis es 100 mg dos veces al día, 150 mg dos veces al día, 240 mg dos veces al día, 300 mg dos veces al día, 500 mg dos veces al día o 600 mg dos veces al día. En diversas realizaciones de la presente descripción, la composición o el agente se administra en dosis únicas o repetidas. La dosificación inicial y las dosificaciones posteriores pueden ser iguales o diferentes.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la dosis diaria total puede ser aproximadamente 0,001 mg, aproximadamente 0,005 mg, aproximadamente 0,01 mg, aproximadamente 0,05 mg, aproximadamente 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 90 mg o aproximadamente 100 mg/24 horas.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la dosis semanal total puede ser de aproximadamente 0,001 mg, aproximadamente 0,005 mg, aproximadamente 0,01 mg, aproximadamente 0,05 mg, aproximadamente 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 90 mg o aproximadamente 100 mg/ semana.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la dosis mensual total puede ser de aproximadamente 0,001 mg, aproximadamente 0,005 mg, aproximadamente 0,01 mg, aproximadamente 0,05 mg, aproximadamente 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 90 mg o aproximadamente 100 mg/mes.
Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. El progreso de estas y otras terapias (por ejemplo, terapias ex vivo) puede monitorizarse fácilmente mediante procedimientos y ensayos convencionales y basándose en criterios conocidos por el médico u otras personas expertas en la materia.
Se apreciará además que, para dispositivos y composiciones de administración sostenida, la dosis total de HRS contenida en dicho sistema de administración será correspondientemente mayor dependiendo del perfil de liberación del sistema de liberación sostenida. Por lo tanto, una composición o dispositivo de liberación sostenida que está concebido para administrar conjugados HRS-Fc durante un período de 5 días típicamente comprenderá al menos aproximadamente de 5 a 10 veces la dosis diaria de conjugado HRS-Fc; una composición o dispositivo de liberación sostenida que está concebido para administrar un conjugado HRS-Fc durante un período de 365 días típicamente comprenderá al menos aproximadamente de 400 a 800 veces la dosis diaria del conjugado HRS-Fc (dependiendo de la estabilidad y la biodisponibilidad del conjugado HRS-Fc cuando se administra usando el sistema de liberación sostenida).
En ciertas realizaciones de la presente descripción, una composición o agente se administra por vía intravenosa, por ejemplo, por infusión durante un período de tiempo de aproximadamente, por ejemplo, 10 minutos a 90 minutos. En otras realizaciones relacionadas de la presente descripción, una composición o agente se administra mediante infusión continua, por ejemplo, a una dosis de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 mg/kg/h durante un período de tiempo. Aunque el período de tiempo puede variar, en ciertas realizaciones de la presente descripción, el período de tiempo puede estar entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 24 horas o entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente tres días.
En realizaciones particulares de la presente descripción, una cantidad efectiva o una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad suficiente para mantener una concentración del conjugado HRS-Fc en el plasma sanguíneo de un sujeto por encima de aproximadamente 300 pM, por encima de aproximadamente 1 nM, por encima de aproximadamente 10 nM, por encima de aproximadamente 100 nM, o por encima de aproximadamente 1000 nM.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, una dosificación IV o SC es una cantidad suficiente para alcanzar una concentración en plasma sanguíneo (Cm a x) de entre aproximadamente 1.000 nM y aproximadamente 5.000 nM o entre aproximadamente 200 nM y aproximadamente 1.000 nM, o aproximadamente 20 nM y aproximadamente 200 nM.
En realizaciones particulares de la presente descripción, un conjugado HRS-Fc se administra en una cantidad y frecuencia suficientes para conseguir en el mamífero una concentración en plasma sanguíneo que tenga una concentración mínima media de entre aproximadamente 300 pM y aproximadamente 1 nM y/o una concentración en situación de equilibrio de entre aproximadamente 300 pM y aproximadamente 1 nM. En algunas realizaciones de la presente descripción, la Cm in del conjugado HRS-Fc en el plasma sanguíneo del mamífero se mantiene por encima de aproximadamente 1 nM y/o una concentración en situación de equilibrio de entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 10 nM. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la Cm in del conjugado HRS-Fc en el plasma sanguíneo del mamífero se mantiene por encima de aproximadamente 10 nM y/o una concentración en situación de equilibrio de entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 100 nM. En ciertas realizaciones de la presente descripción, la Cm in del conjugado HRS-Fc en el plasma sanguíneo del mamífero se mantiene por encima de aproximadamente 100 nM y/o una concentración en situación de equilibrio de entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 1000 nM.
En realizaciones particulares de la presente descripción, una cantidad efectiva del conjugado HRS-Fc, o la concentración en plasma sanguíneo del conjugado HRS-Fc, se alcanza o mantiene, con una administración única, por ejemplo, durante al menos 15 minutos, al menos 30 minutos, al menos 45 minutos, al menos 60 minutos, al menos 90 minutos, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos una semana, al menos 2 semanas, al menos un mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, o al menos 6 meses.
En realizaciones particulares de la presente descripción, la dosificación eficaz alcanza los niveles en plasma sanguíneo o la concentración mínima media de una composición o agente descrito en el presente documento. Estos pueden determinarse fácilmente usando procedimientos de rutina.
Las realizaciones de la presente descripción, en otros aspectos de la presente descripción, proporcionan kits que comprenden uno o más recipientes llenos con uno o más de los conjugados HRS-Fc, polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, complejos de múltiples unidades, composiciones de los mismos, etc., de la descripción, como se describe en el presente documento. Los kits pueden incluir instrucciones escritas sobre cómo usar dichas composiciones (por ejemplo, para modular la señalización celular, la angiogénesis, el cáncer, las afecciones inflamatorias, el diagnóstico, etc.).
Los kits en el presente documento también pueden incluir uno o más agentes terapéuticos adicionales u otros componentes adecuados o deseados para la indicación que está siendo tratada, o para la aplicación de diagnóstico deseada. Un agente terapéutico adicional puede estar contenido en un segundo recipiente, si se desea. Los ejemplos de agentes terapéuticos adicionales incluyen, aunque sin limitarse a, agentes antineoplásicos, agentes antiinflamatorios, agentes antibacterianos, agentes antivirales, agentes angiogénicos, etc.
Los kits en el presente documento también pueden incluir una o más jeringas u otros componentes necesarios o deseados para facilitar un modo de administración previsto (por ejemplo, endoprótesis vasculares, depósitos implantables, etc.).
Ciertas realizaciones de la presente descripción se ilustrarán a continuación mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos que no están dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención.
EJEMPLOS EJEMPLO 1
PRODUCCIÓN DE SU RESOKINE ETIQUETADA CON HIS (HRS QUE COMPRENDE LOS AMINOÁCIDOS 1-60) Optimización de codones y síntesis génica. El ADN que codifica Resokine (HRS (1-60)) se sometió a optimización de codones para la expresión de E. coli usando el algoritmo desarrollado por DNA2.0 (Menlo Park, CA). La secuencia de ADN con optimización de codones es la siguiente:
AT GGC AGAAC GT GCGGC ATT GGA AGAATT GGTT AAACT GC AAGGT G AAC GT GTT C GT GG TCT GAAGC AGCAGAAGGCTAGCGCGGAGCT GATCGAAGAAGAGGT GGCCAAACT GCT G AAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAACCCC GAAACACCACCATCACCATCAC (SEQ ID NO:261)
La secuencia de proteína traducida es la siguiente:
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKH HHHHH (SEQ ID NO:262)
Adicionalmente, se prepararon versiones modificadas por ingeniería de esta construcción con residuos de cisteína insertados cerca del extremo N (que comprende residuos adicionales de Met y Cys en el extremo N), el extremo C (que comprende una cisteína C-terminal adicional en la posición 61) y en el dominio enlazador que une las 2 secciones alfa helicoidales de la molécula (que comprende la mutación Ala 26^Cys). Las secuencias de ADN con optimización de codones y las secuencias de aminoácidos correspondientes para estas construcciones se enumeran a continuación.
H-N4:1-H (codón-HRS(1-60)-M1MC-6xHis):
ATGTGTGCAGAAAGAGCCGCCCTGGAAGAGTTAGTTAAGTTGCAAGGTGAACGTGTCCG T GGT CT GAAGC AGC AGAAGGCTAGCGCGGAGCT GATCGAAGAAGAGGT GGCCAAACT G CTGAAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAAC CCCGAAACACCACCATCACCATCAC (SEQ ID NO:263)
La secuencia de proteína traducida es la siguiente:
MCAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPK HHHHHH (SEQ ID NO:264)
H-N4:2-H (codón-HRS(1-60)-A26C-6xHis):
AT GGC AGAAC GT GCGGC ATT GGA AGAATT GGTT AAACT GC AAGGT G AAC GT GTT C GT GG TCT GAAGC AGCAGAAGT GC AGCGCGGAGCT GATCGAAGAAGAGGT GGCCAAACT GCT G AAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAACCCC GAAACACCACCATCACCATCAC (SEQ ID NO:265)
La secuencia de proteína traducida es la siguiente:
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKCSAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKH HHHHH (SEQ ID NO:266)
H-N4:3-H (codón-HRS(1-60)-C61-6xHis):
ATGGCAGAACGTGCGGCATTGGAAGAATTGGTTAAACTGCAAGGTGAACGTGTTCGTGG TCT GAAGC AGCAGAAGGCTAGCGCGGAGCT GATCGAAGAAGAGGT GGCCAAACT GCT G AAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAACCCC GAAATGCCACCACCATCACCATCAC (SEQ ID NO:267)
La secuencia de proteína traducida es la siguiente:
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKC H H H H H H (SEQ ID N O :268)
Los genes correspondientes se sintetizaron (ADN 2.0) con una etiqueta 6xHis C-terminal y se subclonaron en el vector de expresión pJexpress411 donde se usó el promotor T7 para impulsar la transcripción y se usó resistencia a kanamicina para la selección de antibióticos.
Cepa de expresión. Las células competentes BL21(DE3) (Novagen, n.° de cat. 69450) se transformaron con la construcción de expresión con optimización de codones relevante, tal como se describe. En resumen, el plásmido (1 |l) se añadió a 50 | l de las células competentes. La reacción se mezcló y se incubó en hielo durante 30 minutos. La reacción se sometió a un choque de calor a 42 °C durante 30 segundos, seguido de un choque de frío sobre hielo durante 2 minutos. A continuación se añadió el medio SOC (500 |l) y el tubo se incubó a 37 °C, 250 rpm durante 1 hora. Finalmente, se extendió una parte alícuota del cultivo (50 |l) sobre la placa de kanamicina (Teknova S9641) y se incubó a 37 °C durante una noche. Se seleccionó una sola colonia y se usó para el aumento de escala de la expresión.
Medio. El medio M9YE se preparó mezclando 200 ml de sal mínima M9 estéril 5X (BD248510), 778 ml de 30 g/l de extracto de levadura en agua purificada estéril (BD212750), 20 ml de glucosa esterilizada al 20 % (Sigma G7021) y 2 ml de MgSO4 1,0 M estéril (Sigma M7506). La solución de alimentación contiene 5 % de extracto de levadura, 50 % de glucosa, oligoelementos y 2 g/l de sulfato de magnesio. Se añadió sulfato de kanamicina (Invitrogen 15160) a una concentración final de 100 pg/ml tanto en M9YE como en la solución de alimentación.
Fermentación por lotes alimentados. Se usó un fermentador de 4 l (Sartorius Biostat B plus) con el software MFCS/DA para la fermentación por lotes alimentados. La agitación se ajustó a 1000 rpm. El valor del pH se controló automáticamente a 7,0 mediante la adición de un 30 % de hidróxido de amonio (Sigma 221228) y un 30 % de ácido fosfórico (Sigma P5811). El aire se proporcionó a un caudal de 4 l/min con un compresor de aire de diafragma sin aceite (Cole-Parmer). El aire se hizo pasar a través de un filtro Midisart 2000 de 0,2 pm (Sartorius 17805). El oxígeno puro (West Air) se suministró automáticamente para controlar el nivel de oxígeno disuelto al 70 %. La temperatura se controló a 30 °C con un circulador Neslab RTE7 (Thermo Scientific). La formación de espuma se controló mediante la adición del antiespumante 204 (Sigma A8311). El volumen inicial de medio M9Ye en el fermentador fue 3 l. El fermentador se inoculó con 150 ml del cultivo de siembra que se hizo crecer durante una noche a 30 °C y 250 rpm. Cuando la glucosa se agotó en el recipiente, la solución de alimentación concentrada se introdujo en el recipiente mediante una bomba peristáltica ajustada a 0,9 ml/min. Cuando la densidad óptica de las células a 600 nm alcanzó aproximadamente 30, se indujo el cultivo con IPTG 0,5 mM (Fisher Scientific BP1755). El cultivo se realizó durante una noche (aproximadamente 18 horas en fase de lote alimentado) y se recogió mediante centrifugación a 6.000 x g durante 1 hora. El sedimento celular se almacenó a -20 °C hasta la purificación. La expresión de Resokine se confirmó en SDS-PAGE.
Purificación de proteínas. Resokine y las variantes de Cys de la misma se purificaron a partir de pasta celular de E. coli a través de lisis celular y clarificación; cromatografía por afinidad metálica inmovilizada y cromatografía de intercambio catiónico. Las células congeladas que pesaban 10 g y que contenían Resokine o variantes de Cys se descongelaron y se resuspendieron en tampón NiNTA 1X (Tris 50 mM, NaCl 0,3 M, imidazol 25 mM, pH 8) en una proporción de pasta de 4:1 ml/g junto con beta-mercaptoetanol 5 mM (Sigma n.° de cat. M7154-25ML) y 1 comprimido de cóctel inhibidor de proteasa (Roche n.° de cat. 05056489001). Después de que todas las células se resuspendieron, las células se lisaron en hielo en un Microfluidizador M-110Y, 2 pases a 15000 psi en hielo para liberar Resokine soluble o variantes de Cys. Se añadió tampón NiNTA después del segundo pase para limpiar el lisado restante a través del Microfluidizador (100-120 ml de volumen final después de la lisis). El lisado se centrifugó a 15000 x g a 4°C durante 30 min. El sobrenadante se filtró a 0,45/0,2 um con un Acropak 200 (Pall n.° de cat.
12094). El sobrenadante filtrado es lisado clarificado.
Purificación por cromatografía por afinidad metálica inmovilizada (IMAC). El lisado clarificado de 10 g de pasta celular se cargó en una columna de flujo por gravedad que contenía 3 ml de resina NiNTA (Qiagen n.° 30210) y se equilibró previamente en tampón NiNTA. La resina se lavó con 50 volúmenes de columna (VC) de Triton X-114 al 0,1 % en 1X tampón NiNTA para eliminar la endotoxina, a continuación con 30 VC de 1X tampón NiNTA, seguido de elución con 5 VC de tampón de elución NiNTA (Tris 50 mM, NaCl 0,3 M, Imidazol 0,3 M pH 8 @ 4 °C.
Purificación por cromatografía de intercambio catiónico (CEX). La carga de CEX se preparó diluyendo el eluyente NiNTA 1/20x en el tampón CEX A (fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0, DTT 2 mM), a continuación se cargó en una columna de alto rendimiento SP Sepharose equilibrada en CEX A. La proteína se eluyó con un gradiente lineal del 0-100 % B sobre 20 VC, donde A = fosfato de sodio 10 mM pH 7,0, DTT 2 mM y B = fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 1 M, DTT 2 mM, pH 7,0, monitorizando la absorbancia a 214 nm. Las fracciones se agruparon correspondientes al pico principal en el gradiente de elución por absorbancia a 214 nm. El agrupamiento de c Ex se intercambió con tampón en PBS 1X pH 7,4 (Gibco n.° 10010) usando dispositivos ultracentrífugos Amicon Ultra-153 kD MWCO.
EJEMPLO 2
PRODUCCIÓN DE HISTIDIL-ARNT SINTETASA DE LONGITUD COMPLETA (HRS) ETIQUETADA CON HIS Optimización de codones y síntesis génica. El gen HisRS de longitud completa se sometió a optimización de codones para la expresión de E. coli y se subclonó en el vector pET21a, donde se usó el promotor T7 para impulsar la transcripción. Además, se unieron un enlazador de 5 aminoácidos y una etiqueta 6xHis al extremo C.
La secuencia de ADN es la siguiente:
ATGGCGGAACGTGCCGCACTGGAAGAATTGGTTAAATTACAGGGAGAACGCGTACGTGG T CTTAAAC AACAAAAAGCCT CT GCGGAATT GATT GAAGAAGAAGTT GCC AAATTACT GA AACTGAAAGCTCAACTTGGACCCGATGAAAGTAAACAAAAATTTGTGTTGAAlAAlCGCCC AAAGGAACCCGTGATTATAGTCCACGTCAAATGGCCGTTCGTGAAAAAGTGTTCGACGTT ATTATTCGCTGTTTTAAACGTCACGGTGCTGAAGTAATCGATACCCCCGTATTTGAATTG AAAGAG ACT CT GAT GGGC AAAT AT GGT G AAGATT CT A AACT GATTT AT GATTT GAAAGA CCAAGGAGGTGAACTGCTGAGCCTGCGCTACGACTTAACTGTGCCTTTTGCCCGTTACTT AGCCATGAATAAaTTaACCAACATCAAACGTTACCATATTGCAAAAGTATATCGCCGCGA CAACCCTGCAATGACTCGTGGACGCTATCGCGAATTCTATCAGTGTGATTTTGATATTGC CGGAAATTTCGACCCGATGATCCCGGATGCCGAGTGTTTGAAAATTATGTGTGAAATTCT GAGTTCGTTGCAGATCGGAGACTTTCTTGTAAAAGTTAATGACCGCCGTATTCTGGATGG TATGTTTGCTATTTGCGGTGTTTCTGATTCCAAATTCCGTACAATCTGCTCAAGCGTGGAC AAATT GGAT AAAGT GT C TT GGGAAGAAGT AA AAAAT GAAAT GGT GGGAGAAAAAGGCC TGGCTCCAGAAGTAGCAGACCGTATTGGTGACTATGTTCAACAACATGGCGGTGTGTCCT TAGTCGAACAGTTATTACAGGATCCTAAACTGAGCCAAAATAAACAAGCACTTGAAGGA CTGGGAGATCTGAAATTACTCTTTGAATATCTGACCTTATTTGGGATTGATGATAAAATT AGCTTTGATCTGAGCTTGGCCCGCGGTCTTGATTATTATACCGGCGTGATTTACGAAGCT GTT CT CTT GC AAACCCC AGCCC AGGCGGGCGAAGAGCCTTT GGGAGTCGGCAGT GT GGC AGCCGGTGGTCGTTATGATGGTTTGGTAGGAATGTTTGACCCTAAAGGCCGTAAAGTACC AT GT GT GGGGCTTT CTAT CGGT GT CGAACGTAT CTTTT CTATT GTT GAAC AACGT CTT GAA GCTTTGGAGGAAAAGATCCGTACCACGGAAacCCAAGTCTTAGTTGCaAGTGCCCAAAAA AAACTGTTAGAAGAACGCCTGAAACTCGTATCAGAACTTTGGGACGCCGGCATCAAGGC CGAACTGCTGTATAAAAAGAACCCGAAATTGTTAAACCAACTCCAGTATTGTGAAGAAG CTGGGATCCCACTCGTAGCTATTATTGGTGAGCAAGAATTAAAAGATGGCGTGATTAAAC TGCGTTCAGTAACAAGCCGTGAAGAGGTAGATGTACGTCGCGAAGACTTAGTGGAAGAA ATTAAACGCCGCACCGGTCAACCGTTATGTATTTGCGCGGCCGCACTCGAGCACCACCAC CACCACCACTGA (SEQ ID NO:269)
La secuencia de la proteína traducida es la siguiente:
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKG
TRDYSPRQMAYREKYFDYIIRCFKRHGAEYIDTPYFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGE
LLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDP
MIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEE
VKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEY
LTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMF
DPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWD
AGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVE
EIKRRTGQPLCICAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:270)
Cepa de expresión. Las células competentes BL21(DE3) (Novagen, n.° de cat. 69450) se transformaron con la construcción de expresión con optimización de codones. En resumen, el plásmido (1 pl) se añadió a 50 pl de las células competentes. La reacción se mezcló y se incubó en hielo durante 30 minutos. La reacción se sometió a un choque de calor a 42 °C durante 30 segundos, seguido de un choque de frío sobre hielo durante 2 minutos. A continuación se añadió el medio SOC (500 pl) y el tubo se incubó a 37 °C, 250 rpm durante 1 hora. Finalmente, se extendió una parte alícuota del cultivo (50 pl) sobre la placa de ampicilina (Teknova S9641) y se incubó a 37 °C durante una noche. Se seleccionó una sola colonia y se usó para el aumento de escala de la expresión.
Medio. El medio M9YE se preparó mezclando 200 ml de sal mínima M9 estéril 5X (BD248510), 778 ml de 30 g/l de extracto de levadura en agua purificada estéril (BD212750), 20 ml de glucosa esterilizada al 20 % (Sigma G7021) y 2 ml de MgSO4 1,0 M estéril (Sigma M7506). La solución de alimentación contiene 5 % de extracto de levadura, 50 % de glucosa, oligoelementos y 2 g/l de sulfato de magnesio. Se añadió ampicilina a una concentración final de 100 pg/ml tanto en M9YE como en la solución de alimentación.
Fermentación por lotes alimentados. Se usó un fermentador de 4 l (Sartorius Biostat B plus) con el software MFCS/DA para la fermentación por lotes alimentados. La agitación se ajustó a 1000 rpm. El valor del pH se controló automáticamente a 7,0 mediante la adición de un 30 % de hidróxido de amonio (Sigma 221228) y un 30 % de ácido fosfórico (Sigma P5811). El aire se proporcionó a un caudal de 4 l/min con un compresor de aire de diafragma sin aceite (Cole-Parmer). El aire se hizo pasar a través de un filtro Midisart 2000 de 0,2 pm (Sartorius 17805). El oxígeno puro (West Air) se suministró automáticamente para controlar el nivel de oxígeno disuelto al 70 %. La temperatura se controló a 30 °C con un circulador Neslab RTE7 (Thermo Scientific). La formación de espuma se controló mediante la adición del antiespumante 204 (Sigma A8311). El volumen inicial de medio M9YE en el fermentador fue 3 l. El fermentador se inoculó con 150 ml del cultivo de siembra que se hizo crecer durante una noche a 30 °C y 250 rpm. Cuando la glucosa se agotó en el recipiente, la solución de alimentación concentrada se introdujo en el recipiente mediante una bomba peristáltica ajustada a 0,9 ml/min. Cuando la densidad óptica de las células a 600 nm alcanzó aproximadamente 30, se indujo el cultivo con IPTG 0,5 mM (Fisher Scientific BP1755). El cultivo se realizó durante una noche (aproximadamente 18 horas en fase de lote alimentado) y se recogió mediante centrifugación a 6.000 x g durante 1 hora. El sedimento celular se almacenó a -20 °C hasta la purificación. La expresión de HisRS se confirmó en SDS-PAGE.
Purificación de HisRS. La pasta celular congelada (40 g) se resuspendió en 160 ml (es decir, 4 ml/g de pasta celular) de tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 400 mM, imidazol 20 mM, p-ME 14 mM, pH 8,0 a 4 °C). Se añadieron a la suspensión comprimidos completos de inhibidor de proteasa libre de EDTA (Roche) en una proporción de 1 comprimido/50 ml. La suspensión se hizo pasar a través de un microfluidizador (Microfluidics) dos veces a 15.000 psi con enfriamiento con hielo. El lisado se centrifugó a 35.000 x g durante 45 minutos a 4 °C. El sobrenadante se filtró a través de filtros de cápsula Acropak 200 de 0,22 pm (Pall).
El lisado clarificado se unió a la resina Ni-NTA (Qiagen), se equilibró previamente con tampón de unión Ni-NTA (Tris 20 mM, NaCl 400 mM, imidazol 20 mM, p-ME 5 mM, pH 8,0 a 4 °C). La columna se lavó con 500 volúmenes de columna de tampón de unión Ni-NTA Triton X-114 al 0,1 %, seguido de 50 volúmenes de columna del tampón de unión Ni-NTA. La proteína unida, HisRS, se eluyó con 5 volúmenes de columna de tampón de elución Ni-NTA (Tris 20 mM, NaCI 400 mM, Imidazol 500 mM, p-ME 5 mM, pH 8,0 a 4 °C).
El eluato de Ni-NTA se purificó adicionalmente mediante una columna de intercambio aniónico. Específicamente, el eluato de Ni-NTA se dializó contra el tampón de unión Q (Tris 20 mM, NaCl 50 mM, DTT 1 mM, pH 7,4) y se cargó en una columna de Q-Sepharose de 5 ml, previamente equilibrada con el tampón de unión Q. El producto deseado se eluyó de la columna con un gradiente lineal de NaCl 0-1 M en el tampón de unión Q en 10 volúmenes de columna. La HisRS purificada se concentró y el tampón se intercambió en PBS (producto Invitrogen n.° 10010) DTT 1 mM y se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm.
EJEMPLO 3
TITULACIÓN DE SITIOS ACTIVOS DE LOS RESIDUOS DE CISTEINA EN HARS DE LONGITUD COMPLETA
Para determinar la ubicación e identidad de los residuos de cisteína expuestos en la superficie en HARS de longitud completa, se incubó proteína recombinante purificada con yodoacetamida en condiciones nativas y desnaturalizadas para alquilar cualquier residuo de cisteína expuesta en la superficie. Las muestras se analizaron a continuación limitando la proteólisis seguida por un análisis por LC-masa para determinar la ubicación y la identidad de los residuos de cisteína modificados.
Para realizar los estudios de alquilación, HARS etiquetada con polihistidina de longitud completa (6,65 mg/ml en PBS, glicerol al 10 %, DTT 2 mM, pH 7,4, (ejemplo 2) se redujo completamente por primera vez mediante incubación con DTT 10 mM durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las incubaciones con yodoacetamida se llevaron a cabo con una concentración de yodoacetamida a 30 mM («Baja») o a 100 mM («Alta») durante 30 minutos en la oscuridad, y se llevaron a cabo en muestras nativas y desnaturalizadas de HARS para confirmar que la reacción fue exitosa. Se preparó HARS desnaturalizada mediante pre-incubación de la proteína con guanidina 4 M durante 45 minutos a 50 °C. Después de la incubación con yodoacetamida, las muestras se dializaron en PBS pH 7,4 a 4 °C usando una membrana de diálisis de valor de corte de peso molecular de 10 KDa, y con al menos 3 intercambios de tampón, y seguidamente se usó para el análisis por espectroscopia de masas como se describe a continuación. En resumen, las muestras se prepararon diluyendo las proteínas en ácido fórmico al 0,1 % hasta una concentración final de 1 m/ml y se inyectaron y analizaron muestras de 5 pg de las proteínas mediante HPLC de fase inversa, seguido de un análisis del espectro de masas usando un espectrómetro de masas Agilent TOF. Las muestras se separaron primero en una columna de HPLC C3 (Agilent ZORBAX 300SB-C3, 5 pm, columna de 2,1x150 mm) usando un gradiente lineal de (fase móvil B al 2-60 %) durante 18 minutos (fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 %; fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo). El análisis por espectrometría de masas de las muestras se realizó en modo de perfil. Los datos fueron adquiridos y analizados por MassHunter (Agilent). El peso molecular medido fue calculado por MassHunter Bioconfirm (Agilent).
Los resultados (datos no mostrados) demostraron que, en condiciones nativas, solo se modifican fácilmente 3 o 4 residuos de cisteína, mientras que, en comparación, cuando la proteína se desnaturaliza por primera vez para romper su conformación nativa, las 10 cisteínas se desnaturalizaron fácilmente.
Para identificar la identidad de los residuos de cisteína modificados, las muestras antes y después de la incubación con yodoacetamida se sometieron a desnaturalización en Guanidina HCl 4 M a 37 °C durante 30 minutos, seguida de escisión proteolítica con LysC usando una proporción de 10:1 (p/p) a temperatura ambiente durante 20 h. Las digestiones de proteínas se analizaron por LC/MS/MS usando HPLC Dionex y el espectrómetro de masas Thermo LTQ XL. Las muestras se separaron primero en una columna de HPLC C18 (Agilent ZORBAX 300SB-C18, 5 pm, 2,1x150 mm) usando un gradiente de fase móvil B (fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 %; fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo). El gradiente comienza con 1-3 % de B en 10 minutos y a continuación 40 % de B en 76 minutos. Las digestiones de proteínas separadas se analizaron mediante MS completa en modo de perfil o mediante una exploración de MS completa, se analizaron mediante exploración de MS/MS en tándem en los tres iones superiores identificados. Los datos fueron adquiridos y analizados por Xcalibur (Thermo). La secuenciación de péptidos se basó en los espectros de MS/MS de cada péptido, donde los picos de iones b e y coinciden con sus iones teóricos. La identificación de los péptidos y el mapeo de los sitios de modificación se basan en el peso molecular y se confirman mediante secuenciación de péptidos usando espectros de MS/MS, y se enumeran en la tabla E1.
Figure imgf000118_0001
Los resultados revelaron (datos no mostrados) que Cys235, Cys507 y Cys509 se modifican fácilmente mediante el tratamiento con yodoacetamida y, por lo tanto, probablemente sean residuos expuestos en la superficie que son fácilmente susceptibles de modificación química.
EJEMPLO 4
CREACIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE HRS MODIFICADOS CON CONTENIDO DE CISTEÍNA ALTERADO
Para determinar si alguno de los 10 residuos de cisteína de origen natural en e1HRS de longitud completa podría mutarse a residuos de aminoácidos de origen natural alternativos, o eliminarse, se diseñaron cebadores para mutar selectivamente cada residuo de cisteína. Para conseguir esto, se pueden usar cebadores basados en lo siguiente (véase la tabla E2).
Figure imgf000118_0002
Figure imgf000119_0001
Para confirmar los datos de titulación del sitio activo, se analizó la estructura cristalina de HRS de longitud completa usando el programa Getarea1.1 para evaluar la ubicación relativa de los 10 residuos de cisteína. Los resultados (datos no mostrados) sugieren que además de C235, C507 y C509, las cisteínas en las posiciones C174, C191 y C224 de la SEQ ID NO:1, están expuestas al menos parcialmente en la superficie y probablemente podrían modificarse mediante reactivos estándar. Adicionalmente, el análisis de la estructura cristalina de HRS sugiere que C174 y C191 son capaces de formar un enlace disulfuro interno, mientras que C507 y C509 son capaces de formar enlaces disulfuro entre cadenas dentro del dímero de HRS, ambos contribuyendo potencialmente a la microheterogeneidad que podría eliminarse de manera beneficiosa.
Para evaluar directamente la importancia de los dos residuos de cisteína C-terminales para contribuir a la formación de enlaces disulfuro entre cadenas, se compararon las versiones etiquetadas con His de la longitud completa y las versiones C-terminales eliminadas de HRS (HRS(1-506)) mediante análisis de SDS-PAGE antes y después de la reducción. Los resultados, que se muestran en la figura 3, demuestran que la HRS de longitud completa es una mezcla ~50:50 de dímeros no covalentes y unidos a SS, mientras que HRS(1-506) reduce drásticamente el dímero unido a SS. La comparación de las dos proteínas por ELISA competitivo, como se describe a continuación, reveló que ambas proteínas tenían valores de CI50 comparables con respecto a la unión del anticuerpo Jo-1 (datos no mostrados). La formación de enlaces disulfuro entre cadenas drásticamente reducida asociada con HRS(1-506) sugiere que esta variante es un punto de partida adecuado para el desarrollo de formas mejoradas de productos de nueva generación.
Para determinar si cualquiera de los cuatro residuos de cisteína parcialmente expuestos en la HRS de longitud completa podría mutarse a los residuos de aminoácidos de origen natural alternativos, se diseñaron cebadores para mutar selectivamente los residuos C174, C191, C224 y C235. Para conseguir esto, se usaron los siguientes cebadores que se enumeran en la tabla E3:
Figure imgf000119_0003
Figure imgf000119_0002
Figure imgf000120_0001
Se introdujeron mutaciones por mutagenia usando el kit de mutagenia dirigida QuikChange Lightning (Agilent, n.° cat. 210518) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la mutagenia, las muestras se trataron con enzima Dpn I a 37 °C y se transformaron en células competentes de oro XL10 usando procedimientos rutinarios. Se cultivan múltiples colonias en caldo Terrific durante una noche a 37 °C y los plásmidos resultantes se purifican con el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen n.° cat. 27106). Los plásmidos se secuencian para confirmar la identidad de la sustitución de aminoácidos de cada clon. Los clones representativos se transformaron en células competentes NovaBlue (Novagen n.° cat. 70181) y se cultivaron en 250 ml de medio M9YE a 37 °C durante una noche. Se realizó una preparación máxima con el kit HiSpeed Plasmid Maxi (Qiagen n.° cat. 12663) para crear una reserva de plásmidos de mutantes para su posterior análisis. La concentración y la pureza se determinaron midiendo A260, A280 y A230. Los plásmidos purificados se almacenaron a -20 °C antes de la transfección en células de E. coli o de mamífero de acuerdo con protocolos estándar.
Para evaluar el impacto de la mutación de cada residuo, se transformaron clones representativos en células de E. coli o de mamífero, y el rendimiento de producción, el contenido de endotoxinas, la estabilidad y la actividad relativa se midieron en un ensayo ELISA para determinar la unión de anticuerpos Jo-1 como se describe más adelante.
Producción de proteínas. Se transformaron células competentes BL21 (DE3) (Novagen, n.° cat. 69450) o W3110 (ATTC) con la construcción de expresión con optimizaciones de codones que codifican las construcciones de cisteína reducidas tal como se ha descrito anteriormente. El sistema de expresión, los medios de fermentación, las condiciones de fermentación y las etapas de purificación usados para producir proteínas recombinantes fueron esencialmente los mismos que los descritos en el ejemplo 4 mostrado a continuación, después de ajustar a la escala de producción y la cantidad de pasta celular usada. La tabla E4 a continuación muestra los rendimientos de purificación y los niveles de endotoxinas para las proteínas preparadas.
Figure imgf000120_0002
Los resultados muestran que todas las variantes de Cys reducidas estaban relativamente bien expresadas, y se purificaron con éxito con bajos niveles de endotoxinas. En particular las variantes de cisteína reducidas basadas en la mutación de Cys191 y Cys235 mostraron niveles de expresión favorables; aunque todos los clones mostraron niveles de expresión razonables y bajos niveles de endotoxinas.
Para evaluar el impacto de las mutaciones de cisteína en la heterogeneidad de carga de las proteínas purificadas, las muestras de cada clon se analizaron por enfoque isoeléctrico. Las muestras (10 pg) se cargaron en un gel de enfoque isoeléctrico (pH 3-10) usando un gel IEF de Life Technologies Novex de pH 3-10 de 1,0 mm (n.° cat. P/N EC6645BOX), marcador IEF Novex 3-10 (n.° cat. P/N 391201), kit de tampón IEF Novex pH 3-10 (n.° cat. P/N LC5317), se hicieron pasar con tampón de cátodo 1X (cámara superior) y tampón de ánodo 1X (cámara inferior) a 100 V durante 1 hora, 200 V durante 1 hora y 500 V durante 30 minutos. Los geles se fijaron con TCA al 12 % con ácido sulfosalicílico al 3,5 % durante 30 minutos y se tiñeron con Expedeon InstantBlue (n.° cat. P/N ISB1L). Los datos (resultados no mostrados) demuestran que la mutación de la cisteína en la posición 174 redujo significativamente la heterogeneidad de punto isoeléctrico, consecuente con la posibilidad de que este residuo de cisteína experimente una formación de enlace de disulfuro intramolecular con cisteína 191.
Para evaluar el impacto de las modificaciones de cisteína en la estabilidad térmica, la propensión a la agregación, la estructura y la actividad de ARNt sintetasa de las proteínas resultantes, se evaluaron las proteínas por fluorimetría diferencial de barrido, HPLC de exclusión por tamaño (SE-HPLC), ELISA competitivo y titulación de sitios activos. Los resultados se muestran en la tabla E5 más adelante.
Se realizó fluorimetría diferencial de barrido en muestras de proteínas monitorizando la fluorescencia en función de la intensidad de fluorescencia de un colorante lipófilo durante desnaturalización térmica. Los estudios se llevaron a cabo en muestras después de ser diluidos a 0,5 mg/ml en un volumen final de 100 pl de PBS pH 7,0 (NaCl 150 mM, fosfato 20 mM) y mezclados con una solución de colorante de desplazamiento térmico, que se preparó diluyendo la solución madre (Applied Biosystems/Life Technologies, P/N 4461146) 20 veces en agua destilada ultrapura (Gibco, P/N 10977). Se añadieron cinco pl del colorante diluido a 100 pl de muestra. La mezcla se sembró en una placa de reacción óptica transparente de 384 pocillos (Applied Biosystems/Life Technologies P/N 4309849) a 20 pl cada pocillo y replicados de 4 pocillos por muestra. La placa se leyó mediante ViiA 7 Real Time PCR Instrument (Applied Biosystems/Life Technologies, P/N 4453552). El protocolo de desnaturalización térmica comenzó con un cambio de velocidad de 1,6 °C/s, hasta que se alcanzó una temperatura de 25 °C, punto en el cual el instrumento se mantuvo a esta temperatura durante 2 minutos, antes de aumentar adicionalmente la temperatura a 99 °C, a una velocidad de 0,5 °C/s punto en el cual se mantuvo esta temperatura durante 2 minutos más.
El análisis por HPLC de exclusión por tamaño se completó en las muestras de proteína purificada usando TSkgel Super SW3000, DI 4,6 mm x 30 cm, tamaño de partícula 4 pm, columna 250 A (Tosoh, 18675) usando una fase móvil de fosfato de Na 200 mM, NaCl 150 mM pH 7,0, a un caudal de 0,3 ml/min, con un sistema HPLC Agilent 1260 equipado con un desgasificador de vacío, bomba binaria/cuaternaria, muestreador automático con termostato, compartimento de columna con termostato, detector de matriz de diodos (DAD) y software de cromatografía Chemstation). Se inyectaron muestras no diluidas (40 pg) de cada proteína después de una breve centrifugación. Se usó una muestra de adecuación del sistema (albúmina de suero bovino, BSA, Thermo Scientific, P/N: 23209) y un control interno (HRS de tipo silvestre) para encuadrar las muestras y garantizar la validez de la prueba.
Se realizaron ensayos ELISA competitivos en placas de 96 pocillos (Immulon 4HBX) que se habían revestido con una solución de 50 pl de HARS con etiqueta His de longitud completa, ajustada a una concentración de 2 pg/ml con PBS. Se sellaron las placas y se incubó durante toda la noche a 4 °C. Antes de usar, se lavaron las placas cinco veces con PBST y posteriormente se bloquearon con 100 pl de BSA al 1 % en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Mientras las placas ELISA estaban bloqueadas, se incubaron las moléculas de competencia de cisteína reducida (en un intervalo de concentración de 1 x 10-6 M a 1 x 10-13 M) con anticuerpos a-Jo-1 (GenWay GWB-FB7A3D o Immunovision HJO-0100) a dilución 1:10.000 en BSA al 1 % en PBS en una placa de incubación separada (Costar 3357 de 96 pocillos) durante una hora a 4 °C. Después de finalizar el bloqueo, se lavaron las placas de ELISA tres veces con PBST y se añadieron 50 pl de solución que contenía anticuerpo y competidor a la placa de ELISA y se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Después de la incubación de unión inicial, se lavaron las placas cinco veces con PBST. A continuación se añadieron, 50 pl de anticuerpo de detección (IgG F(ab')2:HRP antihumana de cabra AbD Serotec 0500-0099) a una dilución 1:5.000 y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación de unión secundaria, se lavaron las placas con cinco veces con PBST y se añadieron 50 pl de sustrato TMB (Thermo Scientific Pierce TMB Substrate PI-34021). Las reacciones prosiguieron durante 8 minutos hasta el momento en que se añadieron 50 pl de solución de detención de ácido sulfúrico 2 M. Se realizó cuantificación colorimétrica con un lector de placas SpectraMax a 450 nM.
Para determinar el número de sitios activos catalíticos en cada variante de cisteína HARS506 se empleó el ensayo de titulación de sitios activos (tal como se describe en Fersht y col., (1975) Biochemistry). En resumen, los ensayos se realizaron a temperatura ambiente con HARS 5 pM, MgCl2 10 mM, ATP 50 pM, L-histidina 20 mM, 2 ug/ml de pirofosfatasa inorgánica, [y-32P]ATP 1,65 pM en tampón estándar (HEPES 100 mM pH 7,5, KCl 20 mM). Las reacciones se iniciaron con enzima en placas PCR de perfil bajo y se inactivaron los puntos temporales en placas de filtro MultiScreen PVDF de 96 pocillos Millipore que contenían suspensión de HClO4/carbón (suspensión 1:4 de HClO4 al 7 %:carbón al 10 %) a 30 s, 1 min, 2 min, 4 min, 6 min y 10 min. Después de mezcla y pipeteo, se agitaron las muestras en una placa de recogida con centelleo Supermix, y se contaron con un lector de placas Microbetae.
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Los resultados de estos estudios confirman que todos los mutantes de cisteína están activos, con pérdida escasa o nula de actividad, estabilidad o conformación tal como se mide por titulación de sitios activos, unión ELISA y determinaciones de Tf para desnaturalización térmica. La titulación de sitios activos de la actividad de ARNt sintetasa revela que todos los mutantes de cisteína reducida están activos, y son, de este modo, adecuados para su uso en cualquiera de las composiciones, procedimientos y kits de la presente descripción. En general, las sustituciones Cys191 mostraron menor termoestabilidad global, mientras que los mutantes Cys174 mostraron una heterogeneidad significativamente menor determinada por enfoque isoeléctrico.
EJEMPLO 5
CREACIÓN DE POLIPEPTIDOS DE HRS MODIFICADOS (SIN ETIQUETAS) CON TRUNCAMIENTO C-TERMINAL (HisRSN8) o (HRS(1-506)
Para eliminar los últimos tres aminoácidos y el enlazador entre HisRS de tipo silvestre y la etiqueta His, se diseñaron cebadores para uso con el kit de mutagenia dirigida QuikChange Lightning (Agilent, n.° de cat. 210519). Para conseguir esto, se usan los siguientes cebadores como se enumeran en la tabla E6.
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La eliminación se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de mutagenia dirigida QuikChange Lightning. Después de la mutagenia, la muestra se trató con la enzima Dpn I a 37 °C y se transformó en células competentes de oro XL10 usando procedimientos de rutina. Se hicieron crecer múltiples colonias en caldo de Luriabertani durante una noche a 37 °C y los plásmidos resultantes se purificaron con el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen n.° de cat. 27106). Los plásmidos se secuenciaron para confirmar la identidad de la sustitución de aminoácidos de cada clon. Para eliminar la etiqueta His, se diseñaron cebadores para usarlos con el kit de mutagenia dirigida QuikChange Lightning (Agilent, n.° de cat. 210519). Para conseguir esto, se usaron los siguientes cebadores como se enumeran en la tabla E7.
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La eliminación se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de mutagenia dirigida QuikChange Lightning, como se ha descrito anteriormente.
Producción de proteínas. Las células competentes BL21(DE3) (Novagen, n.° de cat. 69450) o las células W3110 (ATTC) se transformaron con la construcción de expresión con optimización de codones que codifica HisRSN8 (HRS(1-506)) como se describe en el ejemplo 2. El sistema de expresión, los medios de fermentación y las condiciones de fermentación usadas para producir proteínas recombinantes fueron esencialmente las mismas que las descritas en el ejemplo 2.
Purificación de HisRSN8 sin etiqueta (HisRS(1-506)). La pasta celular congelada (400 g) se resuspendió en 4 volúmenes (1600 ml) de tampón de lisis (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, MgCh 5 mM, L-cisteína 2 mM, pH 7,4). Se añadieron a la suspensión comprimidos completos de inhibidor de proteasa LIBRE de EDTA (Roche, N° de cat. 05 056 489001) en una proporción de 1 comprimido/50 ml. La suspensión se hizo pasar a través de un microfluidizador (Microfluidics) dos veces a 18.000 psi con enfriamiento con hielo. El lisado se centrifugó a 15.000 x g durante 45 minutos a 4 °C. El sobrenadante se filtró a través de 2-3 cápsulas AcroPak 1500 (0,8/0,2 pm, Pall, PN12675).
El lisado clarificado se cargó en una columna Q HP de 382 ml (5 x 19,5 cm) previamente equilibrada con tampón Q A (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, pH 7,4). El producto se eluyó con un gradiente lineal del 0-30 % de Tampón Q B (Tris 50 mM, NaCl 1 M, pH 7,4) en 10 volúmenes de columna (VC). Las fracciones se recogieron a 1/2 VC/fracción y se analizaron mediante SDS-PAGE. La agrupación se basó en el análisis de gel.
Se añadió una solución de sulfato de amonio 3,5 M al agrupamiento de Q HP anterior hasta una concentración final de 1,2 M. La mezcla se filtró a través de un AcroPak 200 (0,2 um) y se cargó en una columna Pheny1HP de 481 ml (5 x 24,5 cm) previamente equilibrada con Tris 20 mM, sulfato de amonio 1,2 M, pH 7,0. El producto se eluyó con un gradiente lineal de sulfato de amonio 1,2 - 0 M en Tris 20 mM/pH 7,0 a en 10 Vc . Se agruparon las fracciones (^ VC/fracción) que contenían el producto basándose en el análisis SDS-PAGE.
El agrupamiento de Phenyl de arriba se concentró a 0,5 l mediante un sistema TFF, que consiste en un soporte de casetes Pellicon Mini (Millipore N° de cat. XX42PMINI), una bomba Masterflex I/P y 2 casetes de 0,1 m2 (30 kD MWCO, Novasep N° de cat. PP030M01L). La solución concentrada se intercambió a continuación con tampón con 6 diavolúmenes (3 l) de Tampón CHT A (fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0). El material retenido se filtró a través de un filtro Millex GP-50 de 0,2 pm (Millipore número de pieza SLGP 05010) antes de continuar con la siguiente etapa.
La solución anterior se cargó en una columna de 380 ml de hidroxiapatita cerámica (CHT) (5x19,4 cm) previamente equilibrada con Tampón CHT A. La columna se lavó con tampón A y se siguió con un tampón B al 6 % (fosfato de sodio 500 mM, 150 , NaCl mM, pH 7,0). El producto se eluyó con un gradiente lineal del 6-56 % de tampón B en 10 VC. Se agruparon las fracciones ( ^ VC/fracción) que contenían el producto basándose en el análisis SDS-PAGE. Usando el mismo sistema de TFF, el agrupamiento de CHT se concentró a ~0,2 l, el tampón se intercambió con 6 diavolúmenes del tampón de formulación actual (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) y se concentró a una concentración diana de ~10 mg/ml. La solución del producto se filtró a través de un filtro Millex GP-50 de 0,2 pm (Millipore número de pieza SLGP 05010) y se almacenó en un congelador a -80 °C.
EJEMPLO 6
EVALUACIÓN DE RESOKINE (HRS(1-60)) COMO UN AGENTE INFLAMATORIO
Para evaluar la potencial propiedad antiinflamatoria de los polipéptidos derivados de HRS, se probó una variante de splicing natural N-terminal que comprendía los aminoácidos 1-60 de HRS («Resokine») en un modelo de colitis inducida por TNBS. Los estudios se realizaron en ratones BDF-1 machos, con 12 ratones/grupo; se añadió budesonida a 5 mg/kg por vía oral.
En este estudio, se administró Resokine diariamente mediante inyección IV, comenzando 3 días antes del tratamiento con TNBS, a una concentración de 1 o 5 mg/kg. Los datos que se muestran en la figura 4 demuestran que el tratamiento con Resokine a cualquiera de las concentraciones dio como resultado un aumento significativo de la supervivencia. Por consiguiente, Resokine parece tener potentes efectos antiinflamatorios, compatibles con la hipótesis de que los polipéptidos de HRS están implicados en el control local de los procesos inflamatorios.
EJEMPLO 7
EVALUACIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE HRS PARA EL TRATAMIENTO DE MIOSITIS Y RABDOMIOLISIS INDUCIDAS POR ESTATINAS
Las estatinas son inhibidores de la HMG CoA reductasa que inhiben la síntesis de mevalonato, la etapa limitante de la velocidad en la síntesis de colesterol. El tratamiento con estatinas ha demostrado ser beneficioso para reducir los niveles de colesterol en los pacientes. Sin embargo, los efectos secundarios y las complicaciones de la terapia con estatinas incluyen debilidad muscular, miositis y rabdomiolisis. La miopatía muscular es una complicación con varias estatinas en el mercado y los pacientes a menudo interrumpen su tratamiento con estatinas si presentan alguno de estos síntomas. Al igual que muchas otras miopatías, distrofias musculares y trastornos inflamatorios del músculo, la progresión de la enfermedad en la miopatía inducida por estatinas parece ocurrir como resultado de una lesión química, genética o física inicial, que se inflama cada vez más como resultado de la invasión de células inmunitarias en las células musculares dañado.
Por consiguiente, la miopatía inducida por estatinas representa un sistema modelo ampliamente aplicable para estudiar la miositis inducida por fármacos, que es directamente aplicable a otras miopatías y distrofias musculares, todas las cuales comparten un componente inflamatorio común que media la progresión de la enfermedad promoviendo la invasión de células inmunitarias del tejido muscular dañado.
El propósito de este estudio fue evaluar la eficacia de HRS(1-506) para revertir los efectos de la miositis muscular inducida por estatinas, como lo indican los niveles de enzimas circulantes alterados, y los cambios en la expresión génica de la función muscular y los marcadores inflamatorios en respuesta al tratamiento con HRS(1-506).
Para conseguir esto, las ratas recibieron una dosis diaria de 1 mg/kg de cerivastatina y a continuación se cambiaron a una dosis cada dos días (qod) con cerivastatina. El objetivo de este régimen de dosificación era mantener un estado de enfermedad sostenido en los animales, pero no tener una enfermedad tan grave como para que la supervivencia de la rata se viera afectada en gran medida. La eficacia de un intervalo de dosis de HRS(1-506) se evaluó a continuación en ratas después de que la dosificación de estatinas ya había iniciado cambios medibles en los marcadores de miositis circulantes.
Protocolo y procedimientos. En este estudio, se trataron ratas Sprague-Dawley hembra de 10 semanas de edad con 1 mg/kg de cerivastatina ((Sigma, N° de cat. SML0005) en metilcelulosa al 0,5 %, a partir del día 1 mediante sonda oral. Después de 7 días de administración diaria, las ratas se cambiaron a una estrategia de dosificación cada dos días (qod) en los días 9, 11 y 13. La administración de HRS(1-506) y de vehículo se iniciaron el día 6 mediante inyección intravenosa y a las ratas se les administraron dosis diariamente hasta el día 14 (se muestra esquemáticamente en la figura 5A). Todas las ratas se sometieron a disminución programada el día 15, 24 horas después de la dosis final del artículo de prueba y 48 horas después de la última administración de estatinas. Se administró HRS(1-506) a 3 dosis (0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg) en NaPO420 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,0 diariamente.
Para abordar el objetivo principal de este estudio, se realizaron las siguientes mediciones y criterios de valoración del estudio: supervivencia de ratas, peso, niveles de CK en suero circulante los días 12 y 15, tinción con H&E en muestras de isquiotibiales el día 15, ELISA de troponina I, hemograma completo en sangre del día 15, qPCR en muestras de isquiotibiales y niveles de HARS endógenos en suero.
Procedimientos de qPCR. Se extirparon los isquiotibiales de ratón de los animales y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis. El tejido se preparó en grupos de 10 isquiotibiales usando el kit RNeasy Fibrous Tisue Midi de Qiagen (n.° de catálogo 75742). Una vez que el ARN se eluyó de la columna Qiagen, se hizo pasar por un Bioanalyzer 2100 de Agilent para poner a prueba la integridad del ARN y un NanoDrop para determinar la concentración y pureza del ARN. A continuación se almacenó el ARN a -80 °C.
La transcripción inversa (RT) de ARN a ADNc se realizó en un formato de placa de PCR de 96 pocillos en la máquina de PCR Mastercycler de Eppendorf con el siguiente programa: 37 °C durante 60 minutos, 95 °C durante 5 minutos. Los pocillos de borde de la placa de 96 pocillos no se usaron y se llenaron con 50 mcl de agua para evitar la evaporación de los pocillos internos. Se usaron 20 mcl de ARN y 30 mcl de la mezcla maestra de transcripción inversa (TaqMan PreAmp Cells to CT Kit de Ambion n.° de catálogo 4387299) por muestra de RT. Una vez que se completó la RT, la siguiente etapa fue amplificar previamente los genes de interés en la muestra de ADNc. Se combinaron cebadores de genes de interés (cebadores DELTAgene diseñados por Fluidigm) hasta una concentración final de 200 nM. Usando estos cebadores, los genes de interés se amplificaron previamente en cada muestra. La preamplificación se realizó en reacciones de 10 mcl (2,5 mcl de ADNc, 7,5 mcl de mezcla maestra Pre-AMp) en formato de 384 pocillos usando una máquina de PCR ViiA7 de Applied Biosystems con el siguiente programa: 95 °C durante 10 minutos, 14 ciclos de 95 °C Durante 15 segundos y 60 °C durante 4 minutos. Después de la etapa de preamplificación, se añadió exonucleasa (New England BioLabs n.° de catálogo M0293L) para eliminar los cebadores no incorporados de cada muestra. Esta reacción de exonucleasa también se completó en la máquina de PCR ViiA7 con el siguiente programa: 37 °C durante 30 minutos, 80 °C durante 15 minutos. Después de la exonucleasa, la muestra de RT se diluyó adicionalmente a 1:5 (7 mcl de muestra de exonucleasa 18 mcl de tampón de EDTA bajo).
El chip usado para ejecutar qPCR en el sistema Biomark de Fluidigm fue un 96.96 Dynamic Array IFC para la expresión génica. El chip se cebó primero con el controlador IFC HX de acuerdo con las recomendaciones del fabricante antes de cargar la muestra y los ensayos. Para preparar los ensayos que se cargarán en un chip, se prepararon 4,4 mcl de la mezcla maestra del ensayo (reactivo de carga del ensayo 2X de Fluidigm n.° de catálogo 8500736 y bajo EDTA TE) a 3,6 mcl los cebadores directos e inversos de 20 mcM para cada gen de interés se prepararon en una placa de 96 pocillos. Para preparar muestras, se añadieron 4,5 mcl de mezcla maestra de muestra (Mezcla maestra de expresión de genes TaqMan 2X de Ambion, Reactivo de carga de ADN 20X de Fluidigm, número de catálogo 100-0388, y 20X EvaGreen de Biotium n.° de catálogo 31000) a 3 mcl de muestra diluida preamplificada/exonucleasa en una placa de 96 pocillos. Una vez que se había cebado el chip, se cargaron en el chip 5 mcl de una muestra o ensayo preparado anteriormente. El chip fue devuelto a continuación al controlador de IFC para que las muestras se carguen en el chip. Una vez que el chip terminó de cargarse, la qPCR podía ejecutarse en el Biomark usando un programa preestablecido para 96.96 Dynamic Array para la expresión génica con una curva de fusión para determinar la especificidad del cebador. La expresión génica relativa se determinó mediante el procedimiento Ct delta delta.
Cuantificación de HARS extracelular. Se desarrolló internamente un ELISA basado en 96 pocillos usando 2 anticuerpos monoclonales anti-HARS de ratón M03 (Sigma n.° SAB1403905 y Abnova n.° H00003035-M03) y M01 (Abgent n.° AT2317a) en un formato de sándwich para detectar HARS en suero de rata. Los ensayos se realizaron en placas Costar de 96 pocillos (placa Costar de 96 pocillos n.° 3369) usando una curva estándar de siete puntos que se generó en un intervalo de 75 a 0,1 ng/ml usando una solución madre de HRS(1-506); (7,5 mg/ml en NaPO4 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,0, usando 1x PBST (Tween-20 al 0,05 %) como diluyente). El clon monoclonal de ratón M01, clon 1C8 (Abgent n.° AT2317a) se biotiniló internamente y se usó como el anticuerpo de detección, y el anticuerpo monoclonal de ratón M03 (Sigma n.° SAB1403905, n.° de lote 11238, 0,5 mg/ml y Abnova n.° H00003035-M03, n.° de lote 11238, 0,5 mg/ml) se usó como un anticuerpo de captura. Se usó caseína (Thermo Scientific n.° 37528) como agente de bloqueo, y se usó 1x PBST (Tween-20 al 0,05 %) como tampón de lavado. La unión del anticuerpo se cuantificó usando estreptavidina-HRP (Invitrogen n.° de cat 434323, n.° de lote 816755A) usando sustrato TMB (Thermo n.° 34021) y con ácido sulfúrico 2 M como solución de detención.
Los ensayos ELISA se realizaron revistiendo las placas durante una noche con de 0,6 a 2 pg/ml de anticuerpo M03 en 1X PBS, que a continuación se bloquearon mediante incubación con caseína durante una hora, y se lavaron 3x con PBST. Las placas se incubaron a continuación con estándares y muestras durante 1 hora, se lavaron 3 x PBST y a continuación se incubaron con 500 ng/ml de M01 biotinilado diluido en PBST, 1 hora, se lavaron 3 x PBST, se incubaron con 200 ng/ml de estreptavidina-HRP durante 1 hora, se lavaron 3x con PBST y a continuación se añadió el sustrato TMB durante 4 minutos. Las reacciones se detuvieron con la solución de detención y se leyó la absorbancia a 450 nm.
Los resultados se cuantificaron basándose en la curva estándar basándose en los valores de absorbancia bruta promedio sin sustracción de fondo. Se usó Prism para el ajuste de curvas estándar. Modelo: ajuste de Log(agonista) frente respuesta [regresión logística de 4 parámetros] El porcentaje de recuperación se calculó para cada punto de concentración individual (no promediado) mediante:
(medido - real) * 100 %
(real)
Otras lecturas. Las ratas se pesaron diariamente. Las muestras de suero se tomaron los días 1, 8, 12 (a través de la vena caudal) y el día 15 (terminal) para usarse para el análisis de enzimas circulantes (Idexx) y mediciones de la troponina-I del músculo esquelético, se midieron con un kit comercial de ELISA. El análisis de orina se realizó los días 3, 5, 8, 10, 12 y 15 antes de la dosificación en ese día. El análisis de hemograma completo se realizó en sangre aislada el día 15 antes de sacrificar las ratas. El día 15, las ratas se sacrificaron y se colocó una parte del músculo isquiotibial y el pulmón (no inflado) en NBF al 10 % para la inclusión en parafina y la tinción con H&E de las secciones (Premier Laboratory). Otra parte del músculo isquiotibial y el pulmón se colocó a -80 °C para usar en la extracción y perfilado de ARN. El hígado, el riñón y el corazón también se aislaron el día 15 y se colocaron en zincformalina para inclusión en parafina (TSRI Histology) para el almacenamiento de tejido a largo plazo.
Resultados. Hubo un 100 % de supervivencia en este estudio, y todas las ratas sobrevivieron a la disminución programada programado el día 15. Las ratas con dosis de estatina tenían pesos promedio más bajos que las ratas de control que no recibieron estatina. El día 15, el grupo de estatinas vehículo tenía el peso promedio más bajo de rata de todos los grupos, mientras que el grupo de estatinas 3 mg/kg de HRS(1-506) tenía el promedio de peso más alto de todos los animales tratados con estatinas (datos no mostrados). El análisis de hemograma completo mostró patrones similares globales de cambios entre diferentes grupos de tratamiento de animales (datos no mostrados).
Se observó un pequeño aumento de la CK sérica en ratas tratadas con estatina en comparación con los controles no tratados los días 12 y 15. El día 12, las ratas a las que se les administró dosis de 1 mg/kg y 3 mg/kg de HRS(1-506) tuvieron promedios de CK más pequeños y ajustados en comparación con los animales tratados con estatina vehículo (figuras 6A-B), consecuente con un impacto positivo del tratamiento con HRS(1-506) sobre la miositis inducida por estatinas, también consecuente con un efecto positivo de HRS(1-506) sobre la función muscular, los niveles de troponina C muscular también se redujeron en animales tratados con HRS(1-506) (figura 5B). Además, los niveles séricos endógenos de HRS se elevaron en las ratas tratadas con estatina en comparación con las ratas que no recibieron estatina (figura 7), lo que sugiere que la liberación de HRS puede jugar un papel como regulador endógeno de la inflamación muscular. La tinción de H&E en los isquiotibiales demostró una reducción en las puntuaciones de degeneración/necrosis e inflamación muscular en ratas tratadas con estatinas a las que se les administró 1 mg/kg y 3 mg/kg de HRS(1-506) en comparación con ratas a las que se administró vehículo y 0,3 mg/kg de HRS(1-506) (figura 8).
Para investigar más a fondo la base mecánica de los efectos de HRS sobre la miopatía inducida por estatinas, se examinaron los cambios en la expresión génica en los isquiotibiales de los animales tratados después de la finalización del estudio. El perfil de ARN se realizó en los músculos isquiotibiales aislados de las ratas el día 15 como se ha descrito anteriormente. Los resultados de estos estudios demostraron que los 13 genes que se elevaron más de 5 veces en respuesta al tratamiento con estatinas se redujeron con el tratamiento con HRS(1-506) (véase la tabla E8 y las figuras 9-10)
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Perfil transcripcional de isquiotibiales de ratas tratadas con estatina: reveló que 10 genes relacionados con la diabetes/el síndrome metabólico (figura 11) y varios genes de mantenimiento (datos no mostrados) no se vieron afectados significativamente por el tratamiento con HRS. Por el contrario, el perfil transcripcional de los isquiotibiales de ratas tratadas con estatina de 26 genes marcadores de células inmunitarias reveló cambios significativos en un mayor número de genes (véase las figuras 12-14), incluyendo la inhibición dependiente de la dosis de ITGAL (CD11a), CD11b, CD8a, CD8b, CD18, CCR5, PTPPC y la expresión (CD45R). Además, HRS(1-506) fue eficaz para reducir la expresión de varios genes marcadores inflamatorios, incluidos IL6, MCP1, IL10 e IFN gamma (véase las figuras 15-16). También se observaron cambios transcripcionales en 14 genes relacionados con la adhesión, el desarrollo y la fibrosis (véase las figuras 17-18), el gen de la contractilidad muscular Neb (datos no mostrados) y en genes asociados con atrofia muscular progresiva, atrofia y miogénesis (véase las figuras 19-20).
Conclusiones. Se observó una disminución de la CK, la troponina I en suero y la degeneración/necrosis de las células musculares y la inflamación muscular en animales que recibieron dosis más altas de HRS(1-506), ya sea a 1,0 mg/kg o 3,0 mg/kg en contraste con los animales que recibieron, bien vehículo o bien dosis bajas de 0,3 mg/kg de HRS(1-506). Los datos de perfiles de ARN respaldaron estos resultados al demostrar la expresión reducida de CD8a, IL-6, MCP-1 y MMP-9 en los isquiotibiales de ratas tratadas con estatina que recibieron dosis más altas de HRS(1-506). La regulación positiva de estos genes es más probable debido al aumento del infiltrado de células inmunitarias en el tejido muscular dañado. Basándose en la identidad de los genes expresados, es probable que las células inmunitarias infiltrantes estén formadas por uno o más de los siguientes tipos de células, linfocitos T, células dendríticas, linfocitos NK y macrófagos/monocitos. Todos estos tipos de células se han asociado con la inflamación muscular, y la capacidad de los polipéptidos de HRS, incluyendo HRS(1-506) para mediar una inhibición drástica de esta afluencia de células inmunitarias, sugiere que los polipéptidos de HRS tales como HRS(1-506) representan inmunorreguladores potentes, que son capaces de actuar como inmunomoduladores potentes en una amplia gama de enfermedades y trastornos inflamatorios y autoinmunitarios.
EJEMPLO 8
PREPARACIÓN DE POLIPÉPTIDOS HRS-FC
Se prepararon, purificaron y analizaron las proteínas de fusión N-terminal y C-terminal Fc-histidil-ARNt sintetasa (HRS-Fc) de la siguiente manera.
Construcción de plásmidos. El dominio Fc de la IgG1 humana se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) antes de insertarse en el extremo C o en el extremo N del polipéptido de HRS, HRS(1-60), mediante reacciones de PCR secuenciales usando los cebadores a continuación y los fragmentos de ADN amplificados resultantes insertados en el extremo C o en el extremo N de HRS(1-60) ubicado en el vector de expresión pET28 (Novagen 69864). Se apreciará que la creación de la proteína de fusión Fc N-terminal da como resultado la eliminación/sustitución de la metionina N-terminal en HRS(1-60) con el aminoácido C-terminal del dominio Fc, y viceversa, donde sea apropiado.
Se usaron los siguientes cebadores para crear la proteína de fusión Fc HRS(1-60) fusionada en el extremo N (Fc-HRS(2-60)) (tabla E9):
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Se usaron los siguientes cebadores para crear la proteína de fusión HRS (1-60) Fc fusionada en el extremo C (HRS(1-60)-Fc) (tabla E10).
Figure imgf000128_0001
Las reacciones de PCR se realizaron usando los parámetros de ciclos térmicos recomendados, y los fragmentos amplificados por PCR se verificaron mediante electroforesis en gel. Las secuencias se confirmaron realizando alineamientos con las secuencias teóricas usando los algoritmos de alineamiento por pares EMBOSS. Las secuencias de ADN y proteínas clonadas de Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc se muestran a continuación.
Secuencia de ADN de Fc-HRS(2-60) (fusión de Fc N-terminal):
ATGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGA GGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAA CAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCT CCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAG GAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGA CATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACT ACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGCAGAGCGTGCGGCGCTGGAGGAG CT GGT GAAACTT CAGGGAGAGCGCGT GCGAGGCCT C AAGC AGCAGAAGGCC AGCGCCG AGCT GATCGAGGAGGAGGT GGCGAAACTCCT GAAACT GAAGGCAC AGCT GGGT CCT GAT GAAAGCAAACAGAAATTTGTGCTCAAAACCCCCAAG TGA (SEQ ID NO:335)
Secuencia de ADN de HRS(1-60)-Fc (fusión de Fc C-terminal).
AT GGC AGAGCGT GCGGCGCT GGAGGAGCT GGT GAAACTT CAGGGAGAGCGCGT GCGAG
GC CT C AAGC AGCAGAAGGCC AGCGCCGAGCT GATCGAGGAGGAGGT GGCGAAACTCCT GAAACT GAAGGC ACAGCT GGGTCCT GAT GAAGCAAACAGAAATTT GT GCT C AAAACCCC CAAGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC CGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGT C AC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAGACCCT GAGGT CAAGTT CAACT GG TACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACA ACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATC TCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGA GGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCG ACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCC TCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG C AGGT GGC AGCAGGGGAACGT CTT CT CAT GCT CCGT GAT GC ACGAGGCT CT GC ACAACC ACTACACGCAGAAGAGC CTC TCC CTG TCT CCG GGTAAATGA (SEQ ID NO:336)
Secuencia de proteína de Fc-HRS(2-60) (fusión de Fc N-terminal) MSDKTHTCPPCPAPELLGGPSYFLFPPKPKDTLMISRTPEYTCYYYDYSHEDPEYKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVV S VLT VLHQD WLN GKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAERAALEELVKLQGERVR GLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPK (SEQ ID NO:337)
Secuencia de proteínas de HRS(1-60)-Fc (fusión de Fc C-terminal)
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKS DKTHT CPPCPAPELLGGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVT C V W D V S HEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO:338)
Se prepararon construcciones de ADN adicionales de Fc-histidil ARNt sintetasa (HRS-Fc) N-terminal y C-terminal de la siguiente manera.
Construcción de plásmidos. HRS(2-60) con una Fc N-terminal o HRS (1-60) con una Fc C-terminal (ejemplo 8) se subclonaron en un vector pET24b modificado (EMD, Gibbstown, NJ) que contenía un promotor TAC en lugar de T7 («pET24b_TAC»). Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores a continuación que contienen un sitio NdeI 5' y un sitio XhoI 3', y el ADN amplificado resultante se subclonó en pET24b_TAC usando los sitios de restricción de NdeI y XhoI.
Se usaron los siguientes cebadores para amplificar Fc-HRS(2-60) (fusión de Fc N-terminal) (tabla E11):
Figure imgf000130_0001
Se usaron los siguientes cebadores para amplificar HRS (1-60)-Fc (fusión de Fc C-terminal) (tabla E12).
Figure imgf000130_0002
Las reacciones de PCR se realizaron usando los parámetros de ciclos térmicos recomendados y los fragmentos amplificados por PCR se verificaron mediante electroforesis en gel. Las secuencias se confirmaron realizando alineamientos con las secuencias teóricas usando DNASTAR Lasergene SeqMan Pro. Las secuencias de ADN y proteínas clonadas de Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc se muestran a continuación.
Secuencia de ADN de Fc-HRS(2-60) (fusión de Fc N-terminal):
AT GT CT GACAAAACT CAC ACAT GCCCACCGT GCCC AGCACCT GAACT CCT GGGGGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGA GGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAA CAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCT CCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAG GAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGA CATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA GGT GGC AGC AGGGGAACGT CTT CT C AT GCT CCGT GATGCACGAGGCT CT GC ACAACCACT ACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGCAGAGCGTGCGGCGCTGGAGGAG CT GGT GAAACTT CAGGGAGAGCGCGT GCGAGGCCT C AAGC AGCAGAAGGCC AGCGCCG AGCT GAT CGAGGAGGAGGT GGCGAAACTCCT GAAACT GAAGGCAC AGCT GGGT CCT GAT GAAAGC AAAC AGAAATTT GT GCT C AAAACCCCC AAG tga (SEQ ID NO:347)
Secuencia de ADN de HRS(1-60)-Fc (fusión de Fc C-terminal):
AT GGC AGAGCGT GCGGCGCT GGAGGAGCT GGT GAAACTT CAGGGAGAGCGCGT GCGAG GCCT C AAGC AGCAGAAGGCC AGCGCCGAGCT GAT CGAGGAGGAGGT GGCGAAACTCCT GAAACT GAAGGC ACAGCT GGGTCCT GAT GAAAGCAAACAGAAATTT GT GCT CAAAACCC CCAAGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT GAGGT C AC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAGACCCT GAGGT CAAGTT CAACT G GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGG AGGAGAT GACC AAGAACCAGGT CAGCCT GACCT GCCT GGT C AAAGGCTT CTATCCC AGC GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGA GC AGGT GGC AGCAGGGGAACGT CTT CT C AT GCTCCGT GAT GCACGAGGCT CT GCAC AAC CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA tga (SEQ ID NO:348)
Secuencia de proteína de Fc-HRS(2-60) (fusión de Fc N-terminal):
MSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAERAALEELVKLQGERVR GLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPK. (SEQ ID NO:349)
Secuencia de proteínas de HRS(1-60)-Fc (fusión de Fc C-terminal):
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:350)
Se prepararon construcciones de ADN adicionales de Fc-histidil ARNt sintetasa (HRS-Fc) N-terminal y C-terminal como se indica a continuación.
Construcción de plásmidos. HRS (2-40), (2-45), (2-50), (2-55), (2-66) con una Fc N-terminal o HRS (1-40), (1-45), (1-50), (1-55), (1-66) con una Fc C-terminal se generaron usando Quikchange Mutagenesis (Agilent, Santa Clara, CA). Las construcciones pET24b_TAC generadas anteriormente que contenían Fc-HRS (2-60) y HRS (1-60)-Fc en combinación con los cebadores enumerados a continuación, se usaron en la reacción de Quikchange para generar las construcciones de HRS-Fc.
Se usaron los siguientes cebadores para amplificar los polipéptidos Fc-HRS (2-40), (2-45), (2-50), (2-55), (2-66) (fusión de Fc N-terminal) (tabla E13):
Figure imgf000132_0001
Se usaron los siguientes cebadores para amplificar HRS (1-40), (1-45), (1-50), (1-55), (1-66)-Fc (fusión de Fc C-terminal): (tabla E14).
Figure imgf000132_0002
Figure imgf000133_0001
Las reacciones de PCR se realizaron usando los parámetros de ciclos térmicos recomendados por el fabricante. Las secuencias se confirmaron realizando alineamientos con las secuencias teóricas usando DNASTAR Lasergene SeqMan Pro. Las secuencias de ADN y proteínas clonadas de las construcciones de HRS-Fc se muestran a continuación.
Secuencia de ADN de Fc-HRS (2-40) (fusión de Fc N-terminal):
ATGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG
GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CT GAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCC ACGAAGACCCT GAGGT CAAGTT C AAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT ACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATG GCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAA GAGC AGGT GGCAGC AGGGGAACGT CTTCT CAT GCTCCGT GAT GCACGAGGCT CT GCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGCAGAGCGTGCGGCGCTG GAGGAGCT GGT GAAACTT C AGGGAGAGCGCGT GCGAGGCCT C AAGC AGCAGAAGGCC A GCGCCGAGCTGATCGAGGAGGAGGTGGCGAAACTCCTGAAATGA (SEQ ID NO:371)
Secuencia de ADN de Fc-HRS (2-45) (fusión de Fc N-terminal):
ATGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG
GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT ACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATG GCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAA GAGC AGGT GGCAGC AGGGGAACGT CTTCT CAT GCTCCGT GAT GCACGAGGCT CT GCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGCAGAGCGTGCGGCGCTG GAGGAGCT GGT GAAACTT C AGGGAGAGCGCGT GCGAGGCCT C AAGC AGCAGAAGGCC A GCGCCGAGCT GAT CGAGGAGGAGGT GGCGAAACT CCT GAAACT GAAGGC ACAGCT GT GA
(SEQ ID NO:372)
Secuencia de ADN de Fc-HRS (2-50) (fusión de Fc N-terminal):
ATGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG
GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT AC AAC AGC ACGTACCGT GT GGT C AGCGT CCT CACCGT CCT GC ACC AGGACT GGCT GAAT G GCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GC GACATCGCCGT GGAGT GGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC AC GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAA GAGC AGGT GGCAGC AGGGGAACGT CTTCT CAT GCTCCGT GAT GCACGAGGCT CT GCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGCAGAGCGTGCGGCGCTG GAGGAGCT GGT GAAACTT C AGGGAGAGCGCGT GCGAGGCCT C AAGC AGCAGAAGGCC A GC GCCGAGCT GATCGAGGAGGAGGT GGCGAAACT CCT GAAACT GAAGGCACAGCT GGGT CCT GAT GAAAGCT GA (SEQ ID NO:373)
S e cu e n c ia de A D N de F c -H R S (2 -55 ) (fus ió n de Fc N -te rm in a l):
ATGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG
GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CT GAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCC ACGAAGACCCT GAGGT CAAGTT C AAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT ACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATG GCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAA GAGC AGGT GGC AGC AGGGGAACGT CTTCT CAT GCTCCGT GAT GCACGAGGCT CT GC AC A ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGCAGAGCGTGCGGCGCTG GAGGAGCT GGT GAAACTT C AGGGAGAGCGCGT GCGAGGCCT C AAGC AGCAGAAGGCC A GCGCCGAGCT GAT CGAGGAGGAGGT GGCGAAACT CCT GAAACT GAAGGC ACAGCT GGGT C CT GAT GAAAGC AAAC AGA AATTT GT GT G A (SEQ ID NO:374)
Secuencia de ADN de Fc-HRS (2-66) (fusión de Fc N-terminal):
ATGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG
GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CT GAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCC ACGAAGACCCT GAGGT CAAGTT C AAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT ACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATG GCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAA GAGC AGGT GGCAGC AGGGGAACGT CTTCT CAT GCTCCGT GAT GCACGAGGCT CT GCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGCAGAGCGTGCGGCGCTG GAGGAGCT GGT GAAACTT C AGGGAGAGCGCGT GCGAGGCCT C AAGC AGCAGAAGGCC A GCGCCGAGCT GAT CGAGGAGGAGGT GGCGAAACTCCT GAAACT GAAGGC ACAGCT GGGT CCTGATGAAAGCAAACAGAAATTTGTGCTCAAAACCCCCAAGGGAACCCGTGATTATAG TTGA (SEQ ID NO:375)
S e cu e n c ia de A D N de H R S (1 -40 )-F c (fus ió n de Fc C -te rm in a l):
AT GGC AGAGCGT GCGGCGCT GGAGGAGCT GGT GAAACTT C AGGGAGAGCGCGT G
CGAGGCCTCAAGCAGCAGAAGGCCAGCGCCGAGCTGATCGAGGAGGAGGTGGCGAAAC TCCTGAAATCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CT GAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCC ACGAAGACCCT GAGGT CAAGTT C AAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT ACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATG GCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGAT GACCAAGAACC AGGT C AGCCT GACCT GCCT GGT CAAAGGCTT CT ATCCC A GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAA GAGC AGGT GGCAGC AGGGGAACGT CTTCT CAT GCTCCGT GAT GCACGAGGCT CT GCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO:376) Secuencia de ADN de HRS(1-45)-Fc (fusión de Fc C-terminal):
AT GGC AGAGCGT GCGGCGCT GGAGGAGCT GGT GAAACTT CAGGGAGAGCGCGT GCGAG GCCT C AAGC AGCAGAAGGCC AGCGCCGAGCT GAT CGAGGAGGAGGT GGCGAAACTCCT GAAACTGAAGGCACAGCTGTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTG AACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGA TCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG GT CAAGTT C AACT GGTACGT GGACGGCGT GGAGGT GCATAAT GCC AAGAC AAAGCCGCG GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGG ACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCC ATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAAC TACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTC ACCGT GGACAAGAGC AGGT GGC AGC AGGGGAACGT CTT CT CAT GCT CCGT GAT GC ACGA GGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO:377)
S e cu e n c ia de A D N de H R S (1 -50 )-F c (fus ió n de Fc C -te rm in a l):
AT GGC AGAGCGT GCGGCGCT GGAGGAGCT GGT GAAACTT CAGGGAGAGCGCGT GCGAG GCCTCAAGCAGCAGAAGGCCAGCGCCGAGCTGATCGAGGAGGAGGTGGCGAAACTCCT GAAACTGAAGGCACAGCTGGGTCCTGATGAAAGCTCTGACAAAACTCACACATGCCCAC CGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA CCGTCCT GC ACCAGGACT GGCT GAAT GGC AAGGAGTACAAGT GC AAGGT CT CC AAC AAA GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CT CTAC AGC AAGCT CACCGT GGAC AAGAGC AGGT GGC AGC AGGGGAACGT CTT CT C AT G CTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC GGGTAAATGA (SEQ ID NO:378)
Secuencia de ADN de HRS(1-55)-Fc (fusión de Fc C-terminal):
AT GGC AGAGCGT GCGGCGCT GGAGGAGCT GGT GAAACTT CAGGGAGAGCGCGT GCGAG GCCTCAAGCAGCAGAAGGCCAGCGCCGAGCTGATCGAGGAGGAGGTGGCGAAACTCCT GAAACT GAAGGC AC AGCT GGGT CCT GAT GAAAGCAAAC AGAAATTT GT GT CT GAC AAAA CTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCT TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG T GGT GGACGT GAGCC ACGAAGACCCT GAGGT C AAGTT CAACT GGTACGT GGACGGCGT G GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTG T GGT C AGCGTCCT CACCGTCCT GC ACCAGGACT GGCT GAAT GGC AAGGAGT ACAAGT GC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGG GCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC GACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG GAACGT CTT CT CAT GCT CCGT GAT GC ACGAGGCT CT GC AC AACC ACTAC ACGC AGAAGA GCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 379)
S e cu e n c ia de A D N de H R S (1 -66 )-F c (fus ió n de Fc C -te rm in a l):
ATGGCAGAGCGTGCGGCGCTGGAGGAGCTGGTGAAACTTCAGGGAGAGCGCGTGCGAG GCCT C AAGC AGCAGAAGGCC AGCGCCGAGCT GAT CGAGGAGGAGGT GGCGAAACTCCT GAAACTGAAGGCACAGCTGGGTCCTGATGAAAGCAAACAGAAATTTGTGCTCAAAACCC CCAAGGGAACCCGTGATTATAGTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCA CCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCC T GAGGT C AAGTT C A ACT GGT AC GT GGAC GGCGT GG AGGT GC AT AAT GCC AAGAC AAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCAC CAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACA CCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC AAAGGCTT CTAT CCCAGCGAC AT CGCCGT GGAGT GGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAA CAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA GCT CACCGT GGAC AAGAGC AGGT GGC AGC AGGGGAACGT CTT CT C AT GCTCCGT GAT GC ACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
(SEQ ID NO:380)
Secuencia de proteína de Fc-HRS (2-40) (fusión de Fc N-terminal):
MSDKTHTCPPCPAPELLGGPSYFLFPPKPKDTLMISRTPEYTCYYYDYSHEDPEYKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAERAALEELVKLQGERVR GLKQQKASAELIEEEVAKLLK (SEQ ID NO:381)
Secuencia de proteína de Fc-HRS (2-45) (fusión de Fc N-terminal):
MSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQ YN S T Y R W S VLTVLHQD WLN GKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAERAALEELVKLQGERVR GLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQL (SEQ ID NO:382)
Secuencia de proteína de Fc-HRS (2-50) (fusión de Fc N-terminal):
MSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAERAALEELVKLQGERVR GLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDES (SEQ ID NO:383)
Secuencia de proteína de Fc-HRS (2-55) (fusión de Fc N-terminal):
MSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAERAALEELVKLQGERVR GLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFV (SEQ ID NO:384)
Secuencia de proteína de Fc-HRS (2-66) (fusión de Fc N-terminal):
MSDKTHTCPPCPAPELLGGPSYFLFPPKPKDTLMISRTPEYTCYVYDYSHEDPEYKFNWYYD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAERAALEELVKLQGERVR GLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYS (SEQ ID NO:385) Secuencia de proteínas de HRS(1-40)-Fc (fusión de Fc C-terminal):
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:386)
Secuencia de proteínas de HRS(1-45)-Fc (fusión de Fc C-terminal):
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLSDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:387)
S e cu e n c ia de p ro te ín a s de H R S (1 -50 )-F c (fus ión de Fc C -te rm in a l):
MAERAALEELYKLQGERYRGLKQQKASAELIEEEYAKLLKLKAQLGPDESSDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQ YN S T Y R W S VLTVLHQD WLN GKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPP SR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:388)
Secuencia de proteínas de HRS(1-55)-Fc (fusión de Fc C-terminal):
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVSDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:389)
Secuencia de proteínas de HRS(1-66)-Fc (fusión de Fc C-terminal):
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKG TRD Y S SDKTHT CPPCPAPELLGGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVT C VYVD VSEIEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:390)
La construcción de ADN de fusión en tándem Fc-histidil ARNt sintetasa (HRS-Fc) N-terminal se preparó de la siguiente manera.
Construcción de plásmidos. HRS (2-60)_HRS (2-60) con una Fc N-terminal se generó usando la construcción pET24b_TAC_Fc-HRS (2-60). El gen HRS(2-60) se amplificó por PCR con los cebadores enumerados a continuación, que contienen un sitio de XhoI 5' y 3'. Las reacciones de PCR se realizaron usando los parámetros de ciclado térmico recomendados. La construcción pET24b_TAC_Fc-HRS (2-60) se digirió con XhoI, se desfosforiló y se purificó en gel. El fragmento generado por PCR también se digirió con XhoI y se purificó en gel. E1HRS purificado en gel (2-60) se subclonó en el sitio XhoI de pET24b_TAC_Fc-HRS (2-60). Para generar la construcción final, se usó la mutagenia QuikChange para eliminar el codón de parada y el sitio XhoI entre los fragmentos de HRS (2-60) en tándem usando los cebadores que se enumeran a continuación. Las secuencias se confirmaron realizando alineamientos con las secuencias teóricas usando DNASTAR Lasergene SeqMan Pro.
Se usaron los siguientes cebadores para amplificar Fc-HRS (2-60) (tabla E15):
Figure imgf000140_0001
Secuencia de ADN de Fc-HRS(2-60) HRS(2-60) (fusión de Fc N-terminal):
AT GT CT GACAAAACT CAC ACAT GCCCACCGT GCCC AGCACCT GAACT CCT GGGGGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGA GGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAA CAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCT CCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAG GAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGA C AT CGCCGT GGAGT GGGAGAGC AAT GGGC AGCCGGAGAAC AACTAC AAGACC ACGCCT C CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA GGT GGC AGC AGGGGAACGT CTT CT C AT GCTCCGT GAT GC ACGAGGCT CT GCAC AACCACT ACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGCAGAGCGTGCGGCGCTGGAGGAG CTGGTGAAACTTCAGGGAGAGCGCGTGCGAGGCCTCAAGCAGCAGAAGGCCAGCGCCG AGCT GAT CGAGGAGGAGGT GGCGAAACTCCT GAAACT GAAGGCAC AGCT GGGT CCT GAT GAAAGC AAAC AGAAATTT GT GCT C AAAACCCCC AAGGC AGAGCGT GCGGCGCT GGAGG AGCT GGT GAAACTT CAGGGAGAGCGCGT GCGAGGCCT CAAGC AGC AGAAGGCCAGCGC CGAGCT GAT CGAGGAGGAGGT GGCGAAACTCCT GAAACT GAAGGCAC AGCT GGGT CCTG AT GAAAGC AAAC AGAAATTT GT GCT C AAAACCCCCAAGT GA (SEQ ID NO:395)
Secuencia de proteína de Fc-HRS(2-60) HRS(2-60) (fusión de Fc N-terminal):
MSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GYEYHNAKTKPREEQYNSTYRWSYLTYLHQDWLNGKEYKCKYSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAERAALEELVKLQGERVR GLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKAERAALEELVKLQGERVRGL KQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPK (SEQ ID NO:396)
Preparación y purificación de proteínas de fusión HRS(1-60)-Fc y Fc-HRS(2-60). Cepa de E. coli. Las células competentes de E. coli BL21-CodonPlus® (DE3) RIPL (Agilent 230280) transformadas con las construcciones de expresión pET descritas anteriormente se usaron para la producción inicial de proteínas de fusión de Fc.
Medios. El medio M9YE se preparó mezclando sal mínima 5X M9 estéril (BD 248510), solución de extracto de levadura en agua purificada estéril (BD 212750), glucosa al 20 % esterilizada (Sigma G7021) y MgSO41,0 M estéril (Sigma M7506). Para la solución de alimentación, la solución de extracto de levadura (5 %), solución de glucosa (50 %) y 10 ml de solución de oligoelemento concentrado (que contenía Fe3+, Mn2+, ácido bórico, Mo6+, Co2+, Cu2+, Zn2+ y EDTA), así como 10 ml de solución de sulfato de magnesio, se autoclavaron por separado. Los componentes se mezclaron justo antes de la fase de lote alimentado. Se añadió sulfato de kanamicina a una concentración final de 100 pg/ml en el medio de cultivo.
Fermentación por lotes alimentados. Se usó un fermentador Multifors (HT-Infors) de 0,5 l con el software Iris para el proceso de fermentación por lotes alimentados. La agitación se ajustó a 1000 rpm. El valor del pH se controló automáticamente a 7,0 mediante la adición de un 30 % de hidróxido de amonio (Sigma 221228) y un 30 % de ácido fosfórico (Sigma P5811). Se proporcionó aire a un caudal de 0,5 l/min con un compresor de aire de diafragma sin aceite (Cole-Parmer) y se hizo pasar a través de un filtro de 0,2 pm. El nivel de oxígeno disuelto se controló al 70 % proporcionando oxígeno puro (West Air). La temperatura se controló a 30 °C con un circulador Neslab RTE7 (Thermo Scientific). La formación de espuma se controló mediante la adición del antiespumante 204 (Sigma A8311).
El volumen inicial de medio M9YE en el fermentador fue 0,3 l. El fermentador se inoculó con 15 ml del cultivo de siembra que se hizo crecer durante una noche a 30 °C y 250 rpm. Cuando la fuente de carbono se agotó en el recipiente, la solución de alimentación concentrada se introdujo en el recipiente mediante una bomba peristáltica a 0,12 ml/min. Cuando la densidad óptica de las células a 600 nm alcanzó la fase exponencial, el cultivo se indujo con IPTG 0,5 mM (Fisher Scientific BP1755). El cultivo se hizo crecer durante una noche (aproximadamente 17 horas de inducción) y la DO600 final alcanzó aproximadamente 120. Las células se recogieron mediante centrifugación a 8.000 g durante 30 min. El sobrenadante se decantó y el sedimento se almacenó a -20 °C hasta la purificación.
Se prepararon proteínas de fusión HRS-Fc adicionales usando un vector pET24b modificado (EMD, Gibbstown, NJ) que contenía un promotor TAC en lugar de T7 («pET24b_TAC») y se transformaron en células competentes UT5600. Se prepararon células competentes UT5600 a partir de material bacteriano obtenido del Coli Genetic Stock Center (CGSC, Yale). UT5600 es una cepa derivada de K12 de E. coli y se designa como genotipo: F, araC14, leuB6 (Am), secA206 (aziR), lacYI, proC14, tsx-67, A(ompT-fepC) 266, entA403, glnX44 (AS), X, trpE38, rfbCI, rpsL109 (strR), xylA5, mtl-1, thiEI.
Los vectores de expresión que comprenden estas construcciones se transformaron en células UT5600 usando procedimientos estándar y se prepararon reservas de glicerol.
Medio de fermentación. El medio UT5600_M9_YE se preparó mezclando, para los medios por lotes: 16 gramos/l de extracto de Levadura (Difco 212750), 8 g/l de glicerol (Sigma G2025), 11,28 g/l de Sales M9 (Difco 248510) y 100 pl/l de Antifoam 204 ( Sigma AG6426) con agua desionizada y esterilizando mediante autoclave. Las adiciones posteriores al autoclave fueron de 0,64 ml/l de solución de metales traza, 2,3 ml/l de sulfato de magnesio 100x y 45,83 g/l de leucina. Los medios de alimentación se prepararon mezclando 250 g/l de extracto de levadura, 225 g/l de glicerol y 100 pl/l de antiespumante 204 en agua desionizada y se esterilizaron mediante autoclave. Las adiciones posteriores a la esterilización fueron 10 ml/l de solución de metales traza, 2,3 ml/l de sulfato de magnesio 100x, 45,83 ml/l de L-leucina.
Fermentación por lotes alimentados. Se utilizó un fermentador de 0,5 l (Infors) con el software MFCS/DA para la fermentación por lotes alimentados. La agitación se ajustó en cascada a 500-1200 rpm. El valor del pH se controló a 7,0 ± 0,1 automáticamente mediante la adición de un 30 % de hidróxido de amonio (Sigma 221228) y un 30 % de ácido fosfórico (Sigma P5811). El aire se proporcionó a un caudal de 0,5 l/min con un compresor de aire de diafragma sin aceite (Cole-Parmer). El aire se hizo pasar a través de un filtro Midisart 2000 de 0,2 pm (Sartorius 17805). El oxígeno puro (West Air) se suministró automáticamente para controlar el nivel de oxígeno disuelto al 30 %. La temperatura se controló a 30 °C con un circulador Neslab RTE7 (Thermo Scientific). La formación de espuma se controló mediante la adición del antiespumante 204 (Sigma A8311) de acuerdo con fuera necesario. El volumen inicial de medio UT5600_M9_YE en el fermentador fue de 0,24 l. El fermentador se inoculó con “ 10 Unidades de DO (aproximadamente 1-2 ml de siembra a una DO de 5-10) del cultivo de siembra que se hizo crecer durante 6 horas a 37 °C y 250 rpm. Cuando el lote de glicerol se agotó en el recipiente (aproximadamente 4 horas), la solución de alimentación concentrada se introdujo en el recipiente mediante una bomba peristáltica ajustada en un programa de alimentación exponencial. Cuando la densidad óptica de las células a 600 nm alcanzó aproximadamente 150, se indujo el cultivo con IPTG 0,5 mM (Fisher Scientific BP1755). El cultivo se incubó 4 horas después de la inducción y se recogió mediante centrifugación a 10.000 x g durante 30 minutos. El rendimiento aproximado del sedimento celular final fue de 150-200 gramos por litro de peso celular húmedo (WCW). El sedimento celular se almacenó a -80 °C hasta la purificación. La expresión de la proteína diana se confirmó a través de SDS-PAGE y transferencia de Western para IgG antihumana de cabra, anticuerpo conjugado con HRP (Thermo p/n 31413).
Purificación de proteínas de fusión de FC. Los sedimentos celulares congelados se resuspendieron en 4 volúmenes (es decir, 4 ml/g de sedimento celular) de tampón de lisis (Tris 50 mM, NaCl 500 mM, p-ME 14 mM, pH 7,5). Se añadieron a la suspensión comprimidos completos de inhibidor de proteasa LIBRE de EDTA (Roche) en una proporción de 1 comprimido/50 ml. La suspensión se hizo pasar a través de un microfluidizador (Microfluidics) dos veces a 14.000 psi con enfriamiento con hielo. El lisado se centrifugó a > 10.000 x g durante 45 minutos a 4 °C. El sobrenadante se filtró a través de filtros de cápsula de Sartobran de 0,45 0,22 pm (Sartorius).
El lisado clarificado se unió a la resina MabSelect (GE Healthcare), se equilibró previamente con tampón de unión (Tris 50 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5) en una proporción de 1 ml de resina por 10 g de pasta celular. La columna se lavó con 500 volúmenes de columna de tampón de unión 0,1 % de Tritón X-114 seguido de 100 volúmenes de columna del tampón de unión. Con la proteína unida, las proteínas de fusión se eluyeron con 3,75 volúmenes de columna de tampón de elución (glicina 0,1 M, arginina 0,5 M, pH 3,0) a un tubo de recogida que contenía 1,25 volúmenes de columna de tampón de neutralización (Tris 1 M, pH 8,0).
Opcionalmente, para la eliminación adicional de especies de alto peso molecular, el material se concentró en dispositivos de concentración ultracentrífuga Amicon de 30 kDa (Millipore) y se cargó en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño HiLoad Superdex 200 pg 16/600 (GE Healthcare). El material se eluyó en 1,1 volúmenes de columna de 1X PBS pH 7,4 (Gibco n.° 10010), y se agruparon las fracciones correspondientes al pico principal basándose en el proceso de absorbancia del cromatograma a 280 nm.
Si no se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño, las proteínas de fusión Fc purificadas se intercambiaron en un tampón que contenía PBS, a pH 7,4. La proteína dializada se hizo pasar a través de un filtro de membrana Q (Sartobind-Q de Sartorius o Mustang-Q de Pall) o una columna de Q-Sepharose (GE Healthcare) para la eliminación adicional de endotoxinas, y se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 pm.
Proceso de purificación escalable para proteínas de fusión FC. El proceso de purificación con MabSelect seguido de cromatografía de exclusión por tamaño se usó para purificar múltiples proteínas de fusión Fc usando un proceso robusto, efectivo con un desarrollo de purificación mínimo. Sin embargo, el uso de lavado con detergente durante la una etapa de cromatografía de Proteína A (MabSelect) y de exclusión por tamaño limita la capacidad de aumentar la purificación. También se desarrolló un proceso de purificación para el aumento de escala para las proteínas de fusión de Fc utilizando floculación de lisado, cromatografía de proteína A, intercambio de cationes (CEX) y cromatografía de hidroxiapatita cerámica (CHT).
La resuspensión y la lisis se realizaron como se ha descrito anteriormente, con la omisión de las tablas de inhibidores de proteasa y p-ME del tampón de lisis. Después de la lisis, el lisado se floculó con la adición de polietilenimina, pm 1300 (Sigma Aldrich) a 0,04 % (v/v) y se incubó durante 30 minutos a 4 °C. La centrifugación y la clarificación se realizaron como se ha descrito anteriormente. La cromatografía de Proteína A se realizó en un lisado clarificado usando resina MabSelect en una columna de cromatografía rellena a una proporción de carga de 1 ml de resina por 4 g de pasta celular, con una etapa de lavado de 5 volúmenes de columna en Tris 50 mM, NaCl 500 mM pH 7,5, seguida de elución en 3 volúmenes de columna de glicina 0,1 M pH 3,0 y neutralización en 0,3 volúmenes de columna de Tris 1 M pH 8,0. Después de la Proteína A, se preparó la carga de CEX mediante dilución 5x del eluyente post-Proteína A en el tampón de equilibrio de CEX (fosfato de sodio 20 mM, pH 6,0), se cargó en una columna de alto rendimiento SP Sepharose, se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrio, y se eluyó en un gradiente de cloruro de sodio lineal de 0 a 300 mM de NaCl en 10 volúmenes de columna. Las fracciones de CEX se agruparon basándose en el análisis SDS-PAGE de las fracciones de pico de elución. La hidroxiapatita cerámica se realizó en el grupo CEX cargando en una columna CHT Tipo I de 40 kDa pm (Bio-Rad) equilibrada en tampón de equilibrio de CHT (5 mM de fosfato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, 1 pM de cloruro de calcio pH 6,5), se lavó con 5 columnas de tampón de equilibrio y se eluyó en un gradiente de cloruro de sodio lineal de 150 mM a cloruro de sodio 1,5 M en 10 volúmenes de columna y un NaCl 1,5 M se mantuvo hasta 20 volúmenes de columna para completar la elución. Después de CHT, la proteína se intercambió con tampón en PBS 1X pH 7,4 usando dispositivos de concentración centrífuga Amicon de 30 kDa (Millipore).
La concentración de proteína de fusión se determinó mediante el ensayo de proteínas de Bradford (Thermo Scientific) o mediante absorbancia UV a 280 nm. La concentración de proteína de fusión se determinó mediante el ensayo de proteína de Bradford (Thermo Scientific). El nivel de endotoxinas estaba por debajo de 4 UE/mg de acuerdo con lo determinado por el ensayo EndoSafe PTS LAL (Charles River).
Análisis de proteínas de fusión HRS-Fc. Las proteínas de fusión HRS-Fc purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE como se muestra en la figura 21. Las muestras de 10 pg de carga proteica se procesaron en geles Bis-Tris NuPAGE 4-12 %, 150 V durante 60 minutos en tampón MOPS-SDS y se tiñeron con Instant Blue. Las muestras reducidas tenían DTT 25 mM, y se calentaron a 95 °C durante 10 minutos en tampón LDS 1X antes de la carga.
Las proteínas de fusión HRS-Fc purificadas también se analizaron mediante un procedimiento de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Las muestras se cargaron en una columna aTSK-Gel Super SW3000 (TOSOH, 4,6 mm de diámetro x 30 cm, 4 pm) en un sistema de HPLC Agilent 1260. Se llevó a cabo una prueba isocrática de 30 minutos a 0,3 ml/min con una fase móvil que contenía NaCl 0,1 M, fosfato de Na 0,2 M y 5 % de 2-propanol a pH 7. La detección por UV se realizó a 280 nm. El cromatograma se muestra en la figura 22.
Aproximadamente el 83 % de la proteína está en la forma de dímero deseado, después de la proteína A y antes de la purificación por cromatografía de exclusión de tamaño, con la cantidad restante presente como especie de alto peso molecular. Después de la cromatografía de exclusión por tamaño, la proporción de dímero aumenta del 95 al 99 %. Usando el proceso de purificación de Proteína A, intercambio catiónico e hidroxiapatita, la proporción de dímero es mayor al 99 %. La mayor parte de la proteína dímera contiene el enlace disulfuro intercatenario en la región bisagra Fc, mientras que también existe un dímero no covalente.
El análisis de los datos de espectros de masas intactos obtenidos usando LC/ESI-MS demuestra que el tamaño molecular de las proteínas de fusión FC en condiciones no reductoras es consecuente con la masa molecular esperada de aproximadamente 64.520 daltons (datos no mostrados). Los espectros de CD de las proteínas de fusión Fc en las regiones UV lejana y cercana revelan que la estructura de las proteínas de fusión es consecuente con las estructuras de dominio esperadas. Adicionalmente, los datos de calorimetría diferencial de barrido decovolucionados obtenidos de las proteínas de fusión HRS-Fc demuestran que las proteínas de fusión Fc están plegadas con dos transiciones térmicas principales características de los dominios CH1 y CH2 del componente Fc (datos no mostrados), compatibles con las estructuras predichas.
Para evaluar las características farmacocinéticas de las construcciones de proteínas de fusión HRS-Fc en comparación con las proteínas HRS no modificadas, se administraron proteínas a ratones C57BL/6 normales a través de una única embolada intravenosa o subcutánea en una dosis de 8 mg/kg. Se tomaron muestras de sangre en serie con los tiempos de muestreo distribuidos en nueve animales por forma de producto. Para cada punto temporal, se extrajeron los sueros de tres ratones independientes. Las concentraciones del artículo de prueba se midieron mediante ELISA y los parámetros farmacocinéticos se obtuvieron usando un análisis no compartimental en el software Phoenix.
Los resultados, que se muestran en las figuras 23A, 23B y 23C demuestran que la creación de las proteínas de fusión Fc dio como resultado una semivida, exposición y biodisponibilidad SC significativamente mejoradas
Figure imgf000144_0001
El análisis farmacocinético mostrado en la tabla E16 demuestra que las construcciones de fusión HRS-Fc exhiben una exposición, aclaramiento y semivida sistémicas significativamente mejoradas en comparación con las proteínas no modificadas. La creación de las proteínas de fusión Fc también mejoró la biodisponibilidad subcutánea de las proteínas en comparación con las proteínas no modificadas. En particular, Fc-HRS(1-60) aumentó la exposición en comparación con la proteína no modificada de 200 a 300 veces, dependiendo de la vía de administración, además, la biodisponibilidad SC y la semivida aumentaron significativamente.
EJEMPLO 9
PRUEBAS DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN FC EN COLITIS INDUCIDA POR TNBS
El intestino grueso está recubierto por una mucosa epitelial que está invaginada en estructuras similares a un matraz, las criptas. A diferencia del intestino delgado, no hay vellosidades en esta región, con la parte superior de las criptas abriéndose en una región de mesa plana. Las células de la cripta son generadas por células madre ubicadas en la base de la cripta, cuyas células hijas se dividen rápidamente y se diferencian en colonocitos predominantes y células caliciformes que producen mucina (también se produce un número menor de células endocrinas y células M).
El tamaño de la cripta y el número de células caliciformes por cripta aumentan a lo largo del intestino grueso desde el ciego hasta el recto, presumiblemente para ayudar al paso de las heces y proporcionar suficiente protección de las células madre y de la mucosa a medida que el agua es absorbida por las heces.
Normalmente, la tasa de producción de células en la cripta intestinal se ajusta de manera precisa a la tasa de pérdida de células - opera un mecanismo homeostático muy sensible. La ruptura de la barrera mucosa permite la entrada de bacterias en el cuerpo, con implicaciones de enfermedades resultantes. A la inversa, la hiperplasia puede generar pólipos y finalmente tumores. La ruptura de la barrera intestinal puede ser causada por la exposición a agentes citotóxicos no específicos del tipo celular (a menudo específicos de la proliferación) - típicamente terapias contra el cáncer. Sin embargo, la perturbación del recambio de células epiteliales también es una característica común de las enfermedades inflamatorias.
Los modelos actuales de roedores de la enfermedad intestinal inflamatoria (EII) incluyen, por ejemplo, modelos generados al desencadenar una enfermedad autoinmunitaria mediante la manipulación de la población de linfocitos T, que irritan el revestimiento mucoso del intestino por la acumulación de material particulado en el intestino grueso (como con DSS, sulfato sódico de dextrano), o ruptura química del epitelio (como con el sulfonato de trinitrobenceno, TNBS).
En cualquiera de estos modelos, la gravedad de la enfermedad puede evaluarse mediante una variedad de evaluaciones subjetivas de los grados patológicos observados, así como medidas más objetivas y cuantitativas del daño, para proporcionar información más significativa sobre la biología subyacente. Es posible ampliar el análisis usando medidas de longitud/área asistidas por ordenador para mapear los cambios en la mucosa/submucosa y obtener más medidas cuantitativas del daño, y por lo tanto, la eficacia terapéutica. Aunque cada uno de estos modelos presenta diferentes ventajas y desventajas, el modelo de colitis por TNBS es un modelo establecido de diversos aspectos de la presente descripción de la enfermedad intestinal inflamatoria en seres humanos, que se ha usado con éxito para validar y optimizar la eficacia de los productos terapéuticos humanos.
Modelo en ratón de TNBS. En este modelo de colitis, la irritación del colon se induce por la administración intracolónica de TNBS en etanol. Esto provoca una colitis aguda que tiene un perfil de citocinas tipo TH1, que se caracteriza por la expresión de genes que codifican TNF-a, IFN-y e IL-12 entre otros (Fichtner-Feigl y col, J. Clin. Invest. 2005. 115: 3057-3071). La colitis puede ser grave y localizada en el área del colon donde se introduce el TNBS. La respuesta inflamatoria da como resultado hinchazón localizada, infiltración de células inflamatorias y pérdida epitelial.
En este estudio, la eficacia del polipéptido de HRS no modificado, (HRS(1-60), se comparó con las proteínas de fusión Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc para evaluar su eficacia en mejorar la colitis aguda inducida por TNBS en ratones. Se evaluaron tres regímenes de dosificación diferentes, que emplean la administración iv o sc del elemento de prueba. Se utilizó budesonida (p.o.) como elemento de referencia para el estudio.
Animales y enjaulado: en el estudio se usaron un total de 100 ratones macho BDF-1 (libres de H.pylori, libres de norovirus murino) (Harlan Laboratories, Reino Unido). Los animales tenían 8-10 semanas de edad en el suministro y se usaron a las 10-12 semanas de edad. Todos los ratones se mantuvieron en jaulas ventiladas individualmente (IVC) en una unidad de barrera SPF (libre de patógenos específicos). Los animales fueron identificados por jaulas numeradas y punciones auriculares.
Dieta y bienestar animal: los animales fueron alimentados con dieta expandida de rata y ratón de B & K. El agua se suministró en bolsas de agua HYDROPAC™ (agua RO filtrada; productos de Hydropac/lab, Delaware, EE. UU.). Tanto el alimento como el agua estaban disponibles ad libitum. Había una temperatura ambiente constante de 21 ± 2 °C y una humedad relativa media de 55 ± 10 %. El ciclo día-noche fue constante, con fases de luz y oscuridad de 12 horas cada una (turnos de 07:00 h/19:00 h). La salud animal fue monitorizada diariamente y las jaulas fueron limpiadas a intervalos regulares. Todos los procedimientos fueron certificados de acuerdo con la Ley de Reino Unido (Procedimientos Científicos) de Animales de 1986.
Grupos, dosis, administración y formulaciones: un total de 100 ratones se asignaron al azar a diez grupos de estudio (tabla E17). Todos los ratones en una jaula recibieron el mismo tratamiento y fueron perforados en la oreja para identificarlos. Las mediciones diarias de peso corporal se utilizaron para calcular el volumen del artículo de prueba o el vehículo administrado a los grupos aplicables.
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Preparación y administración de TNBS y artículos de prueba. TNBS: TNBS (Sigma; n.° de lote SLBD6811V) se preparó como una solución de 15 mg/ml en solución salina/50 % de etanol. Se instiló una dosis única de 200 pl (3 mg de TNBS) en el colon, usando un catéter de plástico, colocado a 4 cm proximal al borde anal, a las 11:00 horas del día de estudio 0. Los animales se mantuvieron en posición invertida durante 1 minuto después de la introducción de TNBS en el colon, para minimizar las fugas del compuesto.
HRS (1-60): el artículo de prueba se recibió como cuatro viales de solución madre congelada (0,033 ml de volumen en cada uno) a 17,1 mg/ml, que se almacenaron a -80 °C hasta su uso. En cada día de la administración del artículo de prueba, se tomó una única alícuota y se descongeló en hielo húmedo. Después de descongelar, los contenidos del vial se mezclaron pipeteando arriba y abajo diez veces. Posteriormente, el artículo de prueba se diluyó con vehículo frío (estéril, x 1 PBS, pH 7,4) para dar una solución a 0,2 mg/ml; la solución se mezcló pipeteando arriba y abajo diez veces. Esta solución se administró diariamente (desde el día 0 del estudio hasta el día 3 del estudio) mediante inyección intravenosa, a 5 ml/kg, para dar una dosis de 1 mg/kg.
Fc-HRS (2-60): el artículo de prueba se recibió como cuatro viales de solución madre congelada (un vial de 2,51 ml y tres viales de 2,01 ml) a 4,7 mg/ml, que se almacenaron a -80 °C hasta su uso. En cada día de la administración del artículo de prueba, se tomó una única alícuota y se descongeló en hielo húmedo. Después de descongelar, los contenidos del vial se mezclaron pipeteando arriba y abajo diez veces. Posteriormente, el artículo de prueba se diluyó con vehículo frío (estéril, x1 PBS, pH 7,4) para dar soluciones a 3 mg/ml y 1 mg/ml; las soluciones se mezclaron pipeteando arriba y abajo diez veces. Se administró Fc-HRS(2-60) de acuerdo con 3 regímenes diferentes: i) la solución de 1 mg/ml se administró diariamente (desde el día 0 del estudio hasta el día 3 del estudio) mediante inyección intravenosa, a 5 ml/kg, para dar un dosis de 5 mg/kg; ii) la solución de 1 mg/ml se administró diariamente, solo una vez en el día 0 del estudio, mediante inyección intravenosa, a 5 ml/kg, para dar una dosis de 5 mg/kg; iii) la solución de 3 mg/ml se administró diariamente (desde el día 0 del estudio hasta el día 3 del estudio) mediante inyección subcutánea, a 5 ml/kg, para dar una dosis de 15 mg/kg.
HRS (1-60)-Fc: el artículo de prueba se recibió como cuatro viales de solución madre congelada (un vial de 2,37 ml y tres viales de 1,89 ml) a 4,99 mg/ml, que se almacenaron a -80 °C hasta su uso. En cada día de la administración del artículo de prueba, se tomó una única alícuota y se descongeló en hielo húmedo. Después de descongelar, los contenidos del vial se mezclaron pipeteando arriba y abajo diez veces. Posteriormente, el artículo de prueba se diluyó con vehículo frío (estéril, x1 PBS, pH 7,4) para dar soluciones a 3 mg/ml y 1 mg/ml; las soluciones se mezclaron pipeteando arriba y abajo diez veces. Se administró HRS(1-60)-Fc de acuerdo con 3 regímenes diferentes: i) la solución de 1 mg/ml se administró diariamente (desde el día 0 del estudio hasta el día 3 del estudio) mediante inyección intravenosa, a 5 ml/kg, para dar una dosis de 5 mg/kg; ii) la solución de 1 mg/ml se administró diariamente, solo una vez en el día 0 del estudio, mediante inyección intravenosa, a 5 ml/kg, para dar una dosis de 5 mg/kg; iii) la solución de 3 mg/ml se administró diariamente (desde el día 0 del estudio hasta el día 3 del estudio) mediante inyección subcutánea, a 5 ml/kg, para dar una dosis de 15 mg/kg.
Budesonida: la budesonida se obtuvo de Tocris (Tocris 1101, n.° de lote 1A/128902) y se almacenó en la oscuridad a temperatura ambiente hasta su uso. En cada día de administración, se formuló budesonida como una solución de 1 mg/ml en aceite de cacahuete (Sigma). La budesonida se administró diariamente (desde el día 0 del estudio hasta el día 3 del estudio) mediante sonda oral, a 5 ml/kg, para dar una dosis de 5 mg/kg.
Exámenes clínicos y analgesia. Cualquier animal que demostraba una pérdida de peso superior al 15 % se consideraba enfermo y el tratamiento pudo haberse suspendido. Cualquier animal fue sacrificado si la pérdida de peso era superior al 20 %. El bienestar animal fue monitorizado diariamente. Una vez al día, desde el día -1 hasta el final del estudio, todos los ratones fueron pesados y evaluados para determinar la consistencia de las heces y la presencia de san re manifiesta en las heces o alrededor del ano de acuerdo con los criterios de la tabla E18.
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Uso de la analgesia: no se usó analgesia en este estudio, siguiendo las indicaciones el Patrocinador, ya que podría haber interferido con la acción del artículo de prueba.
Recolección y preparación de tejido para examen histológico: en el momento del sacrificio, los ratones se anestesiaron con 4 % de isofluorano, con 2 l/min de O2 y 2 l/min de N2 O. Cuando estaban completamente anestesiados, la sangre se retiró mediante punción cardíaca directa y la muerte se confirmó mediante dislocación cervical.
Preparación de muestras de sangre completa y plasma. La sangre se recogió mediante punción cardíaca de todos los ratones en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Las muestras de sangre se colocaron inmediatamente en hielo y se dejaron coagular durante 60 minutos. Las muestras se centrifugaron a 3000 g durante 7 minutos, a 4 °C. Inmediatamente después de la centrifugación, el suero se transfirió con una pipeta estéril a viales previamente etiquetados y se congeló inmediatamente en hielo seco.
Preparación de muestras intestinales. Se extirpó el intestino grueso y se enjuagó con PBS y se registraron su longitud y peso húmedo, antes de cortar en las regiones proximal, media y distal y la fijación en la solución de Carnoy. Además, una pequeña muestra de colon se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido. El tejido fijado se deshidrató a través de una serie de alcoholes y xileno y se incluyó en parafina, usando un procesador de tejidos Leica TP1020 y una estación de trabajo EG1140H. Las secciones (5 pm de espesor) se cortaron usando un microtomo Leica RM2125RTF y se secaron al aire en portaobjetos de microscopio, durante una noche a 37 °C. Posteriormente, las diapositivas se desceraron en xileno y se rehidrataron a través de alcoholes graduados a PBS. Todas las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se montaron.
Análisis histológico: las secciones histológicas se evaluaron a ciegas. Las secciones se observaron al microscopio y se les asignó una puntuación de gravedad subjetiva que oscila entre 0 y 5, de acuerdo con los criterios descritos en la tabla E19. Se evaluaron hasta doce secciones transversales desde el intestino grueso medio y distal.
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Análisis estadístico: donde se mencionó, las comparaciones estadísticas de los datos del grupo se realizaron usando ANOVA, en combinación con pruebas post hoc, utilizando Graph Pad Prism.
Análisis de qPCR: se extirpó el colon de ratón de los animales y se almacenó a -80 °C hasta el análisis. El ARN se preparó a partir de dos cólones usando el RNeasy Mini Kit de Qiagen (número de catálogo 74106). Una vez que el ARN se eluyó de la columna Qiagen, se hizo pasar por un Bioanalyzer 2100 de Agilent para poner a prueba la integridad del ARN y un NanoDrop para determinar la concentración y pureza del ARN. A continuación se almacenó el ARN a -80 °C.
La transcripción inversa (RT) de ARN a ADNc se realizó en un formato de placa de PCR de 96 pocillos en la máquina de PCR Mastercycler de Eppendorf con el siguiente programa: 37 °C durante 60 minutos, 95 °C durante 5 minutos. Los pocillos de borde de la placa de 96 pocillos no se usaron y se llenaron con 50 mcl de agua para evitar la evaporación de los pocillos internos. Se usaron 100 ng de ARN en 25 mcl de la mezcla maestra de transcripción inversa (life Technologies n.° 4387406) por muestra de RT. Una vez que se completó la RT, la siguiente etapa fue amplificar previamente los genes de interés en la muestra de ADNc. Se combinaron cebadores de genes de interés (cebadores DELTAgene diseñados por Fluidigm) hasta una concentración final de 200 nM. Usando estos cebadores, los genes de interés se amplificaron previamente en cada muestra. La preamplificación se realizó en reacciones de 10 mcl (2,5 mcl de ADNc, 7,5 mcl de mezcla maestra Pre-AMp) en formato de 384 pocillos usando una máquina de PCR ViiA7 de Applied Biosystems con el siguiente programa: 95 °C durante 10 minutos, 14 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 4 minutos. Después de la etapa de preamplificación, se añadió exonucleasa (New England BioLabs n.° de catálogo M0293L) para eliminar los cebadores no incorporados de cada muestra. Esta reacción de exonucleasa también se completó en la máquina de PCR ViiA7 con el siguiente programa: 37 °C durante 30 minutos, 80 °C durante 15 minutos. Después de la exonucleasa, la muestra de RT se diluyó adicionalmente a 1:5 (7 mcl de muestra de exonucleasa 18 mcl de tampón de EDTA bajo).
El chip usado para ejecutar qPCR en el sistema Biomark de Fluidigm fue un 96.96 Dynamic Array IFC para la expresión génica. El chip se cebó primero con el controlador IFC HX de acuerdo con las recomendaciones del fabricante antes de cargar la muestra y los ensayos. Para preparar los ensayos que se cargarán en un chip, se prepararon 4,4 mcl de la mezcla maestra del ensayo (reactivo de carga del ensayo 2X de Fluidigm n.° de catálogo 8500736 y bajo EDTA TE) a 3,6 mcl los cebadores directos e inversos de 20 mcM para cada gen de interés se prepararon en una placa de 96 pocillos. Para preparar muestras, se añadieron 4,5 mcl de mezcla maestra de muestra (mezcla maestra de expresión de genes TaqMan 2X de Ambion, Reactivo de carga de ADN 20X de Fluidigm, número de catálogo 100-0388, y 20X EvaGreen de Biotium n.° de catálogo 31000) a 3 mcl de muestra diluida preamplificada/exonucleasa en una placa de 96 pocillos. Una vez que se había cebado el chip, se cargaron en el chip 5 mcl de una muestra o ensayo preparado anteriormente. El chip fue devuelto a continuación al controlador de IFC para que las muestras se carguen en el chip. Una vez que el chip terminó de cargarse, la qPCR podía ejecutarse en el Biomark usando un programa preestablecido para 96.96 Dynamic Array para la expresión génica con una curva de fusión para determinar la especificidad del cebador. La expresión génica relativa se determinó mediante el procedimiento Ct delta delta usando múltiples genes de mantenimiento.
Resultados:
Parámetros en vida: todos los grupos de receptores de TNBS demostraron una disminución aguda del peso corporal medio, de entre el 8-10 % del peso corporal inicial durante las primeras 24 horas después de la administración del agente colítico; posteriormente, hubo una disminución más lenta en el peso corporal medio, con todos los grupos mostrando una disminución significativa en el peso corporal medio entre 80-90 % del peso inicial al final del estudio (p<0,0158). El peso corporal de los ratones tratados solo con vehículo mostró un cambio mínimo durante el período del estudio, con un peso corporal medio final del 99,6 ± 1,7 % del peso corporal inicial, el día 4 del estudio (media ± desviación estándar). El grupo de TNBS/vehículo tuvo el peso corporal final medio más bajo, con un 79,8 ± 1,8 %. Los pesos corporales medios finales para algunos grupos (es decir, grupo de TNBS/Fc-HRS(2-60)-s.c. y grupo de TNBS/budesonida) fueron artificialmente altos, debido a la mayor incidencia de morbilidad temprana en estos grupos. De los grupos que demostraron la menor morbilidad temprana, el TNBS/Fc-HRS(2-60)-todos los días-i.v. El grupo tuvo el peso corporal final medio más alto del 85,6 ± 7,1 %, aunque no fue significativamente diferente del grupo de TNBS/vehículo (p> 0,05) (datos no mostrados).
La mayoría de los ratones receptores de TNBS demostraron diarrea en algún momento durante el estudio, aunque las observaciones de sangrado de la mucosa fueron menos comunes. Hubo reducciones en la incidencia de diarrea en respuesta a algunos tratamientos con artículos de prueba. El grupo de TNBS/vehículo tuvo una puntuación de diarrea acumulada (normalizada) de 31 al final del estudio el día 4; con los grupos de TNBS/Fc-HRS (2-60)-todos los días-i.v. y de TNBS/HRS(1-60)-Fc-todos los días-i.v. con las puntuaciones más bajas de 26 (datos no mostrados).
La afección clínica de los ratones se puede obtener mejor combinando información sobre el sangrado y la diarrea junto con una puntuación para la pérdida de peso, con el fin de obtener una puntuación del índice de actividad de la enfermedad (DAI). Esto puede determinarse con mayor precisión el día en que se sacrifica a un ratón, ya que los datos de observación de consistencia de heces faltantes se pueden complementar con observaciones de heces en el recto. Para los ratones que sobrevivieron el día 4, hubo un aumento significativo en las puntuaciones medias de DAI para todos los grupos de receptores de TNBS, en comparación con el grupo de control no tratado (a p<0,0062), excepto para el grupo de TNBS/Fc-HRS(2-60)-sc, aunque en este grupo solo tres ratones permanecieron en el estudio en el punto final programado. El DAI medio para los ratones supervivientes en el día 4 en el grupo de TNBS/vehículo fue de 7,13 ± 0,64; en comparación, los grupos de TNBS/budesonida y TNBS/HRS(1-60)-Fc-una vez-i.v. tenían DAI medios significativamente más bajos, a 4,33 ± 1,97 y 4,20 ± 3,03, respectivamente (p<0,0304). La inclusión de todos los ratones, que sobrevivieron al menos a las 07:00 horas del día 1, en el cálculo de DAI dio resultados similares, aunque el efecto observado en los grupos de TNBS/budesonida y TNBS/HRS (1-60)-Fc-una vez-i.v. ya no eran significativo (p>0,05) (véase la figura 24A).
Observaciones post mortem - Para los ratones con solo vehículo, el peso y la longitud del intestino grueso medios fueron de 200,4 ± 21,7 mg y 108,3 ± 7,8 mm, respectivamente; la relación peso/longitud del intestino grueso media fue de 1,85 ± 0,12 (mg/mm). Todos los grupos tratados con TNBS demostraron un aumento significativo en el peso del intestino grueso con respecto a los ratones de control no tratados (p<0,0215), con el grupo de TNBS/vehículo que tiene un peso intestinal medio de 368,4 ± 70,1 mg. El grupo de TNBS/budesonida tuvo el peso intestinal medio más bajo de todos los grupos receptores de TNBS, con 298,0 ± 62,0 mg. La administración de TNBS también se asoció con una reducción significativa en la longitud del intestino grueso en todos los grupos receptores de TNBS (p<0,0285), con el grupo de TNBS/vehículo teniendo una longitud media del intestino grueso de 75,6 ± 9,3 mm; en comparación, el grupo de TNBS/HRS(1-60)-Fc-todos los días-i.v. demostró una mejoría significativa del acortamiento del intestino grueso, con una longitud media del intestino grueso de 94,9 ± 11,8 mm (p=0,0019). Los cambios en el peso y la longitud del intestino grueso dieron como resultado un aumento significativo en la relación peso:longitud del intestino grueso para todos los grupos receptores de TNBS (p<0,0116). El grupo de TNBS/vehículo tenía la relación media más alta entre peso:longitud del intestino grueso de todos los grupos, en 4,92 ± 0,99 (mg/mm). El grupo de TNBS/budesonida, el grupo de TNBS/Fc-HRS(2-60)-s.c., el grupo de TNBS/HRS(1-60)-Fc-todos los días-i.v. y el grupo de TNBS/HRS(1-60)-Fc-una vez-i.v. demostraron todos una reducción significativa en la relación peso:longitud del intestino grueso, con respecto al grupo de control de TNBS/vehículo, aunque la relación media para el grupo de TNBS/HRS(1-60)-Fc-todos los días-i.v. estuvo distorsionada por la cantidad de ratones que se sacrificaron al inicio del estudio. Las relaciones medias de peso:longitud del intestino grueso para los grupos de TNBS/budesonida y TNBS/HRS(1-60)-Fc-todos los días-i.v. fueron 3,57 ± 1,01 y 3,56 ± 0,80, respectivamente (p = 0,0143 y p = 0,0456) (véase la figura 24B).
Histopatología - Los cambios histopatológicos asociados con la colitis inducida por TNBS se evaluaron de acuerdo con el procedimiento estándar de puntuación histológica de Epistem. Todos los grupos de receptores de TNBS demostraron un aumento significativo en la puntuación de histopatología (p<0,0036). El grupo de linfocitos T/vehículo tuvo una puntuación histopatológica media de 2,32 ± 0,65, con el grupo de TNBS/HRS(1-60)-Fc -s.c. con la puntuación media más alta en histopatología: 2,41 ± 0,68. Otros grupos de tratamiento tuvieron puntuaciones medias más bajas en histopatología que el grupo de TNBS/vehículo, con los grupos de TNBS/budesonida y TNBS/Fc-HRS(2-60)-todos los días-i.v. teniendo las puntuaciones más bajas de 1,66 ± 1,08 y 1,68 ± 1,03, respectivamente, aunque estas reducciones no fueron estadísticamente significativas. A nivel regional, el efecto de estos tratamientos fue más evidente en el tercio distal del intestino grueso, aunque todavía sin significación estadística.
Morbilidad - Solo un grupo, TNBS/HRS (1-60)-Fc-todos los días-i.v. demostró la supervivencia de todos los ratones (elegibles) (se excluyó el ratón 75 debido a la gran perforación intestinal durante la administración de TNBS y se excluyó el ratón 78 debido a la falta de inducción de la enfermedad). La supervivencia en otros grupos varió del 80 % (grupo de TNBS/Fc-HRS(2-60)-todos los días-i.v.) al 33,3 % (grupo de Tn Bs/Fc-HRS(2-60)-s.c.); la supervivencia en el grupo de TNBS/budesonida fue del 60 %. Los ratones se sacrificaron cuando presentaron mal estado (se retiraron/no consiguieron demostrar un comportamiento normal); a pesar de los controles de seis horas, dos ratones (40 y 50) fueron encontrados muertos a las 19:00 horas del día 3 del estudio (datos no mostrados).
Resultados de qPCR. Para investigar más a fondo la base mecánica de los efectos de HRS(1-60) y Fc-HRS(2-60) sobre la colitis inducida por TNBS, se examinaron los cambios en la expresión génica en los cólones de animales después de la finalización del estudio. El perfil de ARN se realizó en dos cólones aislados de los ratones en el día como se ha descrito anteriormente. Los resultados de estos estudios demostraron que siete genes se elevaron en más de 10 veces en respuesta al tratamiento con TNBS y se redujeron significativamente mediante el tratamiento con Fc-HRS(2-60) (véase la tabla E20 y la figura 25).
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El perfil transcripcional de cólones de ratón tratados con TNBS reveló muchos genes, incluidos varios genes de mantenimiento (datos no mostrados) que no se vieron afectados significativamente por el tratamiento con Fc-HRS(2-60). Por el contrario, el perfil transcripcional de los cólones de ratón tratados con TNBS reveló una reducción significativa de los genes relacionados con el sistema inmunitario e inflamatorio regulados por TNBS por Fc-HRS(2-60). Este resultado se vio fortalecido por el descubrimiento de que HRS(1-60) también reduce significativamente los niveles de MCP1, MMP3, CD11b e Il 10 inducidos por TNBS (véase las figuras 26A-26H).
Conclusión: la administración intracolónica de TNBS a ratones BDF-1 dio como resultado el desarrollo de colitis caracterizada por una pérdida de peso aguda, con un aumento moderado en la incidencia de diarrea y sangrado de la mucosa. La exploración post mortem demostró un cambio significativo en la relación de peso:longitud del intestino grueso y lesiones ulcerativas en el intestino grueso, con estenosis y acumulación de heces en el intestino. El tratamiento con budesonida se asoció con mejoras en los parámetros de la enfermedad tanto en vida como post mortem, y aunque tiene la puntuación media más baja en histopatología de todos los grupos de receptores de TNBS, la reducción de este parámetro de la enfermedad no alcanzó significación. El tratamiento con Fc-HRS(2-60)-todos los días-i.v. tuvo un efecto similar a la budesonida en la reducción de la puntuación de histopatología y se asoció con una supervivencia superior. El grupo de TNBS/HRS(1-60)-Fc-todos los días-i.v. mostró el nivel más alto de supervivencia y mejora significativa en la relación de peso:longitud del intestino grueso, aunque fue menos eficaz que budesonida o Fc-HRS(2-60) para reducir la puntuación de histopatología. Con respecto a la puntuación de histopatología, los tres de estos artículos de prueba parecieron tener su mayor efecto en el tercio distal del intestino grueso. Se observaron mejoras en los parámetros de la enfermedad para el grupo de TNBS/Fc-HRS(2-60)-s.c. y el grupo de TNBS/HRS(1-60)-Fc-una vez-i.v. (por ejemplo, peso corporal y relación peso:longitud del intestino grueso). Adicionalmente, el perfil transcripcional de los cólones de ratón tratados con TNBS reveló una reducción significativa de los genes relacionados con el sistema inmunitario e inflamatorio regulados por TNBS por Fc-HRS (2-60). Este resultado se vio fortalecido por el descubrimiento de que HRS(1-60) también reduce significativamente los niveles de MCP1, MMP3, CD11b e IL10 inducidos por TNBS, demostrando que las proteínas de fusión HRS-Fc eran activas en la expresión de genes inmunomoduladores en este sistema.
En general, los datos sugieren que Fc-HRS(2-60) y HRS(1-60)-Fc tienen un potencial significativo en el tratamiento de la inflamación intestinal y otras afecciones inflamatorias.
EJEMPLO 10
IMPACTO DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN HRS-FC SOBRE LAS POBLACIONES DE LINFOCITOS T Para evaluar el impacto potencial de los conjugados HRS-Fc sobre las poblaciones de linfocitos T in vivo, se puso a prueba Fc-HRS(2-60) en un modelo de colitis inducida por TNBS, similar al descrito anteriormente. Los estudios se realizaron en ratones BDF-1 macho. En resumen, los ratones BDF-1 macho (Jackson Laboratories) se aclimataron durante un mínimo de 1 semana antes de la experimentación, se mantuvieron en ayunas 16 horas antes de la administración de TNBS y 13 horas antes de la dosificación. Se administró Fc-HRS(2-60) en una dosis única, 0,5 mg/kg, IV al mismo tiempo que comenzaba el tratamiento con TNBS. Se analizaron esplenocitos de tres animales por grupo para determinar las poblaciones inmunes. Para elegir los animales para el análisis, se excluyeron los ratones que tenían las puntuaciones de enfermedad más graves y menos graves (de acuerdo con las observaciones clínicas, la consistencia de las heces y el peso corporal). De los animales restantes, se seleccionaron tres animales de cada grupo de tratamiento en función de la media de su grupo respectivo.
Procedimientos. Se recogieron los bazos de ratones BDF-1 y se colocaron directamente en 10 ml de tampón de tinción de células frío (Biolegend, n.° de catálogo 420201, n.° de lote B166478) en hielo. Los bazos se disociaron mecánicamente entre dos portaobjetos autoclavados esmerilados en una placa de cultivo tisular. La suspensión celular se filtró a través de un filtro de 70 pm y las células se sedimentaron mediante centrifugación a 300 g durante 5 minutos a 4 °C. Las células se lavaron una vez en 10 ml de tampón de tinción celular y se contaron con el contador

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    I. Una composición terapéutica para su uso en la reducción de la inflamación pulmonar, que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y un polipéptido de fusión de histidil-tARN sintetasa (HRS)-Fc que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 98 % idéntica a la SEQ ID NO:337, donde el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene una actividad antiinflamatoria y tiene farmacocinética alterada con respecto a un polipéptido de HRS no modificado que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:6, donde la farmacocinética alterada es mayor semivida en suero, mayor biodisponibilidad y/o disminución del aclaramiento.
  2. 2. La composición terapéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la inflamación pulmonar está asociada con una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria.
  3. 3. La composición terapéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria se selecciona de sarcoidosis, esclerodermia sistémica, síndrome de dificultad respiratoria incluyendo síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA), granulomatosis, asma y respuestas inmunitarias mediadas por hipersensibilidad aguda y retardada.
  4. 4. La composición terapéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, para trarar una enfermedad pulmonar intersticial (EPI).
  5. 5. La composición terapéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, donde la EPI está causada por tejido conectivo o enfermedad autoinmunitaria, o exposición ocupacional y ambiental.
  6. 6. La composición terapéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde el tejido conectivo o la enfermedad autoinmunitaria incluye esclerodermia/esclerosis sistémica progresiva, lupus (lupus eritematoso sistémico), artritis reumatoide o polimiositis/dermatomiositis.
  7. 7. La composición terapéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde la exposición ocupacional y ambiental incluye exposición a polvo, gases, venenos, quimioterapia o radioterapia.
  8. 8. La composición terapéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, donde el polipéptido de fusión HRS-Fc reduce la activación y la invasión de células inmunitarias en el pulmón dañado.
  9. 9. La composición terapéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la región Fc y el polipéptido HRS están separados por un enlazador peptídico.
  10. 10. La composición terapéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde el enlazador peptídico tiene 1-10 aminoácidos, o 1-5 aminoácidos de longitud.
  11. I I . La composición terapéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el polipéptido de fusión HRS-Fc tiene una semivida de al menos 30 horas en ratones.
  12. 12. La composición terapéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la biodisponibilidad es una biodisponibilidad subcutánea que está aumentada en al menos un 30 %.
  13. 13. La composición terapéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el polipéptido de fusión HRS-Fc es al menos un 95 % puro y menos del 5 % agregado, y donde la composición está sustancialmente libre de endotoxinas.
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