KR20090111320A

KR20090111320A - 항종양 활성을 갖는 신규한 폴리펩티드

Info

Publication number: KR20090111320A
Application number: KR1020097016040A
Authority: KR
Inventors: 김성훈; 한정민; 박상규; 이연숙
Original assignee: 주식회사 이매진
Priority date: 2007-02-01
Filing date: 2008-02-01
Publication date: 2009-10-26
Also published as: AU2008211884A1; US20110124582A1; CA2676640A1; WO2008094012A1; JP2010526527A; EP2121739A4; EP2121739A1; MX2009008270A

Abstract

본 발명은 내피세포 사멸을 유도하여 항암 활성을 가지는 신규한 폴리펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 90％ 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 내피세포의 사멸을 유도하는 방법 및 암의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.

Description

항종양 활성을 갖는 신규한 폴리펩티드{NOVEL POLYPEPTIDE HAVING ANTI-TUMOR ACTIVITY}

본 발명은 항암 활성이 있는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 내피세포의 사멸을 유도하여 항암 활성을 가지는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것이다.

생명체를 구성하고 있는 다양한 종류의 세포들은 여러 경로를 통하여 사멸(死滅)될 수 있다. 1972년에 케어 등(Kerr et al.)에 의해 처음 언급된 세포사멸(apoptosis)은 다세포 생명체의 정상적인 기관의 발달과 조직의 항상성 유지에 필수적인 생리현상 중의 하나로서, 이는 어떤 자극에 대해 반응하는 세포에서 선택적으로 일어나는 대표적인 세포내 작용 메카니즘이다. 구체적으로 세포는 영양분의 고갈, 바이러스, 산소 라디칼 또는 염색체를 손상시키는 약제와 같은 다양한 스트레스에 의해 계획된 죽음을 일으킬 수 있으며, 이러한 세포사멸 현상은 염색제의 응집, 수포 형성, 세포의 응축, 사멸체(apoptotic body) 형성과 같은 특이한 형태적인 변화와 카스파제(caspase) 효소계의 활성화, 핵내 염색체의 분절을 관찰함으로써 알 수 있다(John D R et al, 2000, J. Structur. Biol. 129, 346∼358; Takeuchi M et al, 1999, Apoptosis 4, 461∼468).

상기 세포사멸은 조직의 항상성 유지를 위한 생리적 기능을 수행할 뿐만 아니라 세포사멸의 비정상적인 억제 또는 촉진으로 인한 세포의 증식성 질환 내지는 해당 세포의 소실로 인한 각종 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한 면역반응의 조절기전 중의 하나가 면역담당 세포인 림프구의 세포사멸에 의해 림프구 조직의 항상성을 유지하게 되며, 림프구가 표적세포를 살해하는 과정도 세포사멸에 의해 이루어지게 된다.

최근 세포사멸이 세포 증식과 함께 조직의 항상성 유지에 중요한 역할을 함에 따라 면역질환 및 종양을 비롯한 많은 질환들이 세포사멸의 조절이상으로 발생한다는 새로운 실례가 대두되게 되었다. 따라서 인체의 많은 질환들의 발병기전의 이해 및 이에 따른 치료 방식의 개발을 위해서는 인체 각 조직에서 세포사멸 조절기전에 대한 이해가 큰 관심사로 떠오르게 되었고, 이에 의약학 산업 분야에서의 세포사멸은 부가가치가 높은 부분으로 부상하였다.

한편, AIMP1(ARS-interacting multi-functional protein 1) 단백질은 종래에 p43 단백질로 알려진 것으로서 본 발명자들에 의해 재명명된 것이다(Kim S.H. et al., Trends in Biochemical Sciences. , 30:569-574, 2005). AIMP1은 312개의 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 다중-tRNA 합성효소 복합체(multi-tRNA synthetase complex)에 결합하여 상기 다중-tRNA 합성효소의 촉매적 활성(catalytic activity)을 증진시키는 단백질이다. 상기 AIMP1은 뇌척수염, 신경염 및 포도막염과 같은 실험상의 자가면역질환부위에 있는 미세신경세포에서 높은 수준으로 발현하는데, 이와 같이 특정 발생 단계 및 조직에서 AIMP1의 발현 수준이 높게 나타나는 현상은 AIMP1이 염증반응과 세포 고사에 관여한다는 것을 암시한다(Berger, A. C. et al., J. Immunother. 23:519-527, 2000). 본 발명자들은 AIMP1 및 이의 N-말단 단편이 효과적인 사이토카인, 항암제 및 혈관신생억제제로서 이용될 수 있음을 규명한 바 있다(Park H. et al., J. Leukoc. Biol., 71:223-230, 2002; Park S.G. et al., J. Biol. Chem. , 277:45243-45248, 2002; Park H. et al., Cytokine, 21:148-53, 2002)

한편, 일반적으로 수많은 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드는 생체 내에 투여하면 대사되어 펩티드 결합이 절단되고 의약으로 제제화하는 단계에서 분해되기 쉬운 단점이 있다. 따라서 약제로 사용하기 위해서는 폴리펩타이드의 길이가 될 수 있는 한 짧게 하는 것이 바람직하나 약리 활성은 유지되어야 하기 때문에 장쇄 펩타이드의 최소 활성 발현 단위를 규명하는 것은 의약품 개발에 있어서 중요한 과제이다.

이에 본 발명자들은 새로운 항암제를 개발하고자 연구하던 중 공지된 AIMP1 단백질의 중간 영역의 아미노산 서열 일부를 포함하는 폴리펩타이드가 내피세포의 사멸을 유도하여 항암 활성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

기술적 과제

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 90％ 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 이들의 항암 활성에 대한 용도를 제공하는 것이다.

기술적 해결방법

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 90％ 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드 및 이들을 암호화하는 폴리폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 내피세포의 사멸을 유도하는 방법 및 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약제로 사용하기 위한 상기 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 항암제 제조를 위한 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

용어 정의

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다.

본 발명에서 사용된 용어 유효한 양은 시험관 내 또는 생체 내에서 내피세포의 사멸을 유도하거나 항암 활성을 나타내는데 효과적인 양을 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 개체(subject)는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물 또는 상기 동물의 세포, 조직을 의미한다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자(patient)일 수 있다. 또한 상기 세포는 바람직하게는 내피세포일 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 AIMP1 단백질의 101 - 170 아미노산 서열을 포함한다. 한편, AIMP1(ARS-interacting multi-functional protein 1) 단백질은 종래에 p43 단백질로 알려진 것으로서 본 발명자들에 의해 재명명된 것이다(Sang Gyu Park, et al., Trends in Biochemical Sciences , 30:569-574, 2005).

상기 AIMP1 단백질은 312개의 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 다중 tRNA 합성효소 복합체(mult-tRNA synthetase complex)에 결합하여 상기 다중-tRNA 합성효소의 촉매적 활성(catalytic activity)을 증진시키는 단백질이다. AIMP1 단백질은 전립선 암, 면역 및 형질전환 세포를 포함하는 다양한 형태의 세포로부터 분비되며 분비된 AIMP1은 단핵구/마크로파지, 내피세포 및 섬유아세포와 같은 다양한 표적세포에 작용하는 것으로 알려져 있다. 상기 AIMP1 단백질은 세 군데의 SNP가 알려져 있다(NCBI의 SNP 데이터베이스 참조). 즉, 전장 AIMP1 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1) 중 79번째 아미노산인 알라닌(Ala)이 프롤린(Pro)으로 치환된 경우(SNP accession no. rs3133166), 104번째 아미노산인 트레오닌(Thr)이 알라닌(Ala)으로 치환된 경우(SNP accession no. rs17036670), 117번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌(SNP accssion no. rs2230255)으로 치환된 경우가 알려져 있다.

본 발명자들은 내피세포 사멸과 관련된 AIMP1 단백질의 기능 도메인을 결정하기 위하여 AIMP1의 일련의 결손 단편들을 제조한 다음(도 1 및 도 2 참조) 각 단편들의 내피세포의 사멸에 미치는 활성을 조사하였다(실시예 2 참조). 그 결과, AIMP1 단백질의 101-192번 아미노산 영역이 내피세포의 사멸을 유도하는 활성을 가지는 도메인임을 추정할 수 있었다(도 4 및 도 5 참조).

본 발명자들은 내피세포의 사멸을 유도하는 단편을 좀 더 특정하기 위하여 AIMP1-(101-192)단편을 더 작은 단편으로 절단한 단편을 제조하고(실시예 ＜3-1＞ 참조), 이의 내피세포 사멸을 유도하는 활성을 측정하였다(실시예 ＜3-2＞ 참조). 그 결과, AIMP1 단백질의 101-170번 아미노산 영역이 내피세포의 사멸을 유도하는 도메인임을 알 수 있었다(도 8 내지 도 10 참조).

또한 본 발명자들은 AIMP1-(101-170)단편의 변이체도 내피세포의 사멸을 유도하는지 확인하기 위하여 상기 폴리펩타이드에 C161S 점 돌연변이를 유도하여 AIMP1-(101-170)C161S를 제조하였다(실시예 ＜4-1＞ 참조). 그리고 AIMP1 전장 단백질, AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드 및 AIMP1-(101-170)C161S 변이체 폴리펩타이드의 내피세포 사멸효과를 비교한 결과, 상기 변이체 폴리펩타이드는 DTT가 없는 조건에서도 내피세포의 사멸을 유도하는 활성이 있는 것을 확인하였다(도 11 참조).

나아가, 본 발명자들은 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드의 암동물 모델에서 암증식을 억제하는 활성이 있는지 여부를 측정한 결과, 체중 감량의 부작용 없이 항암효과를 가지며(도 12 및 도 13 참조), AIMP1 전장 단백질보다도 항암효과가 우수함을 확인할 수 있었다(도 14 참조).

따라서 본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 90％ 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

상기 본 발명의 폴리펩타이드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는, 서열번호 4 내지 서열번호 8 및 서열번호 10 내지 서열번호 14로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 서열번호 11 내지 서열번호 14의 아미노산 서열은 상기 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열의 공지된 SNP이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 가장 바람직하게는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩타이드의 범위에는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 기능적 동등물, 더욱 바람직하게는 서열번호 9 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 기능적 동등물 및 그들의 염을 포함한다. 상기 기능적 동등물이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 서열번호 9의 폴리펩타이드와 적어도 80％ 이상의, 바람직하게는 90％, 더욱 바람직하게는 95％이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로 예를 들면, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 것을 포함하며, 서열번호 9의 폴리펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩타이드를 말한다. 본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 서열번호 9의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 서열번호 9의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 서열번호 9의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한 상기 서열 동질성은 두개의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두개의 폴리펩타이드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭(matching) 되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 패널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연개되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다: 일치하는 서열(indentical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(machted span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.

상기에서 실질적으로 동질의 생리활성이란 내피세포에 작용하여 내피세포의 사멸을 유도하는 활성을 말한다. 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 서열번호 9의 폴리펩타이드의 기본골격과 내피세포 사멸 및 암세포 증식 억제 활성을 유지하면서 폴리펩타이드의 일부 화학 구조가 변형된 유도체가 포함된다. 예를 들어 폴리펩타이드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 발명의 폴리펩타이드는 이를 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의한 유전공학적 방법에 의해 제조할 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 AIMP1 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예:프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 폴리펩티드'라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., supra; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem. , 255:12073-12080, 1990.

또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 당분야에 공지된 기술로 화학적으로 합성할 수 있다(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY (1983)). 즉, 본 발명의 폴리펩타이드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989)). 특히, 바람직한 제조방법은 고체상 합성방법(solid phase synthesis)을 이용하는 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 보호된 아미노산간의 응축반응 (condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로, C-말단으로부터 시작하여 규명된 아미노산 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산 분해(acid decomposition) 또는 아미놀리시스 (aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 폴리펩타이드 합성법은 관련 서적에 상세히 기술되어 있다(Gross and Meienhofer's, The Peptides, vol 2., Academic Press, 1980). 본 발명의 폴리펩타이드의 합성을 위해 사용할 수 있는 고체상의 담체는 이 분야에서 통상 사용되는 담체로서 예를 들어, 치환된 벤질 형태의 폴리스티렌 레진(polystyrene resins of substituted benzyl type), 히드록시메틸페닐아세틱 아미드 형태의 폴리스티렌 레진, 치환된 벤즈히드릴폴리스티렌 레진, 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 기능기를 가진 폴리아크릴아미드 레진 등을 사용할 수 있다. 아미노산 응축 또한 통상의 방법일 수 있으며, 예를 들어 디시클로헥실카보디이미드(DDC), 산 무수물(acid anhydride) 및 활성화 에스테르(activated ester) 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드 합성에 사용된 보호기들은 통상의 폴리펩타이드 합성에 사용되는 보호기들로서 산 분해, 환원 또는 아미놀리시스와 같은 통상의 방법에 의해 쉽게 제거되는 것들이다. 아미노 보호기들의 구체예로는 포밀; 트리플루오로아세틸; 벤질옥시카보닐; (오르쏘- 또는 파라-) 클로로벤질옥시카르보닐 및 (오르쏘- 또는 파라-) 브로모벤질옥시카르보닐과 같은 치환된 벤질옥시카르보닐; t-부톡시카보닐 및 t-아밀록시카보닐과 같은 지방족 옥시카보닐 등이 있다. 아미노산의 카복실기들은 에스테르기로 전환시킴으로써 보호할 수 있다. 에스테르기로는 벤질 에스테르, 메톡시벤질 에스테르와 같은 치환된 벤질 에스테르; 시클로헥실 에스테르, 시클로헵틸 에스테르 또는 t-부틸에스테르와 같은 알킬 에스테르 등이 있다. 구아니디노기는 보호기가 필요하지 않지만, 니트로; 또는 토실, 메톡시벤젠슬포닐 또는 메시틸렌술포닐과 같은 아릴술포닐에 의해 보호될 수 있다. 이미다졸의 보호기로는 토실, 벤질 및 디니트로페릴 등이 있다. 트립토판의 인돌기는 보호기가 없어도 되며 포밀 등으로 보호기를 붙일 수도 있다. 탈보호 및 담체로부터 폴리펩타이드를 분리하는 것은 여러 스캐빈저 (scavenger) 하에 무수 하이드로 플루오라이드에 의해 수행될 수 있다. 스캐빈저의 예로는 아니솔, (오르쏘-, 메타-, 파라-) 크레솔, 디메틸술파이드, 씨오크레솔, 에탄엔디올 및 머캅토피리딘 등을 들 수 있는데 이들은 폴리펩타이드 합성에서 통상 사용되는 것들이다.

상기 유전공학적 방법에 의해 제조된 재조합 폴리펩타이드 또는 화학적으로 합성된 폴리펩타이드는 예를 들면 추출법, 재결정법, 다양한 크로마토크래피(겔 여과법, 이온 교환, 침전, 흡착, 역전상), 전기영동, 역류 분배법 등 당업계에 공지된 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.

나아가, 본 발명은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드와 적어도 90％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 분리된 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 48 내지 서열번호 58로 표시되는 염기서열을 갖는다. 상기 서열번호 55 내지 서열번호 58의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 폴리펩타이드의 공지된 SNP를 암호화한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 천연에서 분리되거나 당업계에 공지된 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있으며 상기 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 벡터에 삽입시킨 후, 감염(infection), 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction) 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 구체적으로 플라스미드 발현 벡터를 이용한 유전자 전달 방법은 포유동물 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로서, FDA로부터 승인받은 인간에게 사용할 수 있는 방법이다(Nabel, E. G., et al., Science, 249:1285-1288, 1990). 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392 (PharMingen) 등이 대표적이다. 상기 폴리뉴클레오타이드을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 표적 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

또한, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 발현 벡터로는 이에 한정되지는 않으나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus), 아비폭스바이러스(avipox virus) 및 렌티바이러스(lenti virus) 등이 포함된다. 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 작제된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다(Miller, A.D., Nature, 357:455-460, 1992). FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6:2895-2902, 1986). 비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다(Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155, 1992; Jaffe et al., Nature Genetics, 1:372-378, 1992; Lemarchand et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6482-6486, 1992). 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)를 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J.H., et al., Nature Genetics, 1:379-384, 1992). 렌티 바이러스는 레트로바이러스의 일종으로 1990년대 후반부터 개발되기 시작한 새로운 레트로 바이러스 수송체로서 HIV 골격(backbone)을 변형한 것이다. 기존의 레트로바이러스 수송체들과 달리 세포분열 주기에 영향을 받지 않아 분열이 활발한 세포뿐 만 아니라 분열이 활발하지 않은 세포에서도 유전자 발현 효율이 비교적 좋다. 따라서 조혈 줄기세포 등과 같이 분열이 느린 세포에서도 다른 바이러스성 수송체보다 발현 효율이 좋아 최근 조혈 줄기세포 각질세포를 이용한 세포 치료 분야에서 유전자 전달용 수송체로서 연구가 활발히 진행되고 있다. 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다.

상기 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)를 이용할 수 있으며, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이에 한정되지 않지만 상기 본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 항암용 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제로는 분산제, 습윤제, 현탁제, 희석제 및 충진제가 포함된다. 특정의 약학적으로 허용되는 담체와 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 발현 벡터의 비율은 조성물의 용해도와 화학적 성질, 특정의 투여방식 등에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 AIMP1을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 약학적 조성물의 치료학적 또는 예방학적 유효량은 투여대상, 연령, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다.

상기 "약학적으로 허용 되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 약학적으로 허용되는 염으로는 무기염기와의 염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염 및 염기성 또는 산성 아미노산과의 염이 포함된다. 무기 염기와의 염은 예를 들면 나트륨 염 및 칼륨 염과 같은 알칼리 금속 염, 칼슘 염 및 마그네슘 염과 같은 알카리 토금속 염, 알루미늄 염 및 암모늄 염이 포함된다. 유기 염기와의 염으로는 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 사이클로헥실아민, 디사이클로헥실아민 및 N,N-디벤질에틸렌디아민과의 염을 예로 들 수 있다. 무기산과의 염의 예로는 염산, 붕산, 질산, 황산 및 인산과의 염을 들 수 있다. 유기산과의 염을 예로 들면 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 석신산 말산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산 또는 p-톨루엔설폰산과의 염이 포함된다. 염기성 아미노산과의 염은 예를 들면 아르기닌, 라이신, 오르니틴이 포함된다. 산성 아미노산과의 염의 예로는 아스파르트산 및 글루탐산과의 염을 들 수 있다. 적절한 염의 목록은 본 명세서에서 그 전문을 참고로 인용한 문헌(Remingtons Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p1418, 1985)에 개시되어 있다.

또한 본 발명의 약학적 조성물은 이에 한정되지 않지만 경구 투여용 제형으로 제조될 수 있다. 경구 투여용의 경우, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 약학적으로 허용 가능한 염을 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 그 자체를 그대로 투여하거나 상술한 바와 같은 여러 제형으로 제조되어 투여될 수 있으며, 바람직하게는 원하는 효과 즉, 내피세포 사멸 및/또는 항암 효과가 도출될 때까지 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다. 즉, 경구 또는 비경구, 예컨대 구강, 근육내, 정맥내, 피내, 동맥내, 골수내, 경막내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 설하 또는 피하 투여되거나, 위장관, 점막 또는 호흡기로 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 피부에 직접적으로 도포하는 방법 또는 상기 폴리펩티드를 주사용 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부 아래층에 일정량을 주입하거나 주사바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 피부에 직접 도포될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 표적 세포나 조직(예: 피부 세포나 피부 조직)에 고친화성 결합을 유발하는 분자와 결합되거나 상기 분자 내에 캡슐화된 형태로 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 스테롤(예: 콜레스테롤), 지질(예: 양이온 지질, 비로좀 또는 리포좀) 또는 표적 세포 특이적 결합제(예: 표적세포 특이적 수용체에 의해 인지되는 리간드)와 결합될 수 있다. 적합한 커플링제 또는 가교제로는 예컨대 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오테이트 (SPDP) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 개체에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 본 발명의 약학적 조성물은 투여 목적에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 1회 투여시 0.1㎍ 내지 1g의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 유효 용량은 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 치료가 필요한 개체의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 각 개체에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 투여목적에 따라 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

다른 측면으로서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 개체의 내피세포 사멸을 유도하는 방법에 이용될 수 있다. 따라서 본 발명은 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 내피세포 사멸을 유도하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 '암'은 이에 한정되지는 않으나 유방암, 대장암, 폐암, 소세포 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종과 같은 암 또는 이들 암의 하나 이상의 조합일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약제로 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 항암제 제조를 위한 용도를 제공한다.

유리한 효과

본 발명의 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 내피세포의 사멸을 유도하여 암세포 증식을 억제하는 활성을 가지고 있다. 따라서 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 내피세포 사멸을 유도하거나 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 AIMP1 단편의 개념도를 나타낸 그림이다.

도 2는 본 발명의 AIMP1 단편의 전기영동 결과를 나타낸 그림이다.

도 3은 본 발명의 AIMP1 단편의 세포 사멸 효과를 측정한 사진이다.

도 4는 본 발명의 AIMP1 단편의 세포 사멸 효과를 측정한 그래프이다.

도 5는 본 발명의 AIMP1 단편의 카스파제 (caspase)-3 활성에 미치는 효과를 측정한 그래프이다.

도 6은 본 발명의 AIMP1-(101-192) 단편의 개념도를 나타낸 그림이다.

도 7은 본 발명의 AIMP1-(101-192) 단편의 전기영동 결과를 나타낸 그림이다.

도 8은 본 발명의 AIMP1-(101-192) 단편의 세포 사멸 효과를 측정한 현미경 결과이다.

도 9는 본 발명의 AIMP1-(101-192) 단편의 MTT 분석을 통하여 생존 세포수를 측정한 그래프이다.

도 10은 본 발명의 AIMP1-(101-192) 단편의 카스파제(caspase)-3 활성에 미치는 효과를 측정한 그래프이다.

도 11은 본 발명의 AIMP1-(101-170)C161S 변이체 폴리펩타이드의 내피세포 사멸효과를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 12는 본 발명의 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드에 의한 암 성장 억제 정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 13은 본 발명의 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드에 의한 체중 감량 정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 14는 본 발명의 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드에 의한 암 성장 억제 정도를 AIMP1 전장 단백질과 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 15는 본 발명의 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드에 의한 체중 감량 정도를 AIMP1 전장 단백질과 비교하여 나타낸 그래프이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

＜실시예 1＞

AIMP1 단백질 및 그의 단편 제조

312개의 아미노산으로 이루어진 AIMP1 단백질(서열번호 1)은 당업계에 공지된 방법(Park S. G. et al., J. Biol. Chem., 277:45243-45248, 2002)에 따라 제조하였다. 또한 도 1에 도시되어 있는 AIMP1의 결손단편, 즉, AIMP1-(1-192)(서열번호 2), AIMPI-(6-192)(서열번호 3), AIMP1-(30-192)(서열번호 4), AIMP1-(47-192)(서열번호 5), AIMP1-(54-192)(서열번호 6), AIMP1-(101-192)(서열번호 7), AIMP1-(114-192), AIMP1-(1-46), AIMP1-(1-53) 및 AIMP1-(193-312) 단편은 AIMP1의 cDNA(서열번호 1)를 주형으로 하고 각 단편에 대한 특이적인 프라이머 세트(표 1)를 이용하여 PCR 증폭함으로써 제조하였다. PCR 증폭 조건은 다음과 같다: 95℃ 2분간; 95℃ 30 초, 56℃ 30 초, 72℃ 1분간 30 사이클 및; 72℃ 5분간.

표 1

AIMP1 단편의 제조에 사용된 프라이머 세트

상기 PCR 산물들을 EcoRI 및 XhoI로 자르고 동일한 효소로 절단한 pGEX4T3 벡터(Amersham Biosciences)에 라이게이트하였다. 상기 벡터로 E Coli BL21(DE3)를 형질전환하고 이를 배양하여 폴리펩타이드의 발현을 유도하였다. 각 폴리펩타이드들은 GST-tag 융합 단백질로 발현되었으며 이를 GSH 아가로스로 정제하였다. 리포폴리사카라이드를 제거하기 위해, 단백질 용액을 파이로젠 무첨가 완충액(10mM 인산칼륨 완충액, pH 6.0, 100 mM NaCl)에서 투석하였다. 투석 후 단백질을 동일한 완충액으로 평형시킨 폴리마이신 수지(Bio-Rad)에 로딩하고 20분간 배양한 다음 용출시켰다. 이 때 상기 잔존 리포폴리사카라이드의 농도는 Limulus Amebocyte GCL-1000 키트를 사용하여 20pg/㎖이하로 하였다. 정제된 각 단백질들을 SDS-PAGE로 확인하고 그 결과를 도 2에 기재하였다.

상기 도 2에 기재한 바와 같이, AIMP1-(1-192)(서열번호 2), AIMPI-(6-192)(서열번호 3), AIMP1-(30-192)(서열번호 4), AIMP1-(47-192)(서열번호 5), AIMP1-(54-192)(서열번호 6), AIMP1-(101-192)(서열번호 7), AIMP1-(114-192), AIMP1-(1-46), AIMP1-(1-53) 및 AIMP1-(193-312) 단편을 각각 제조할 수 있었다.

＜실시예 2＞

AIMP1의 세포사멸효과가 있는 도메인의 동정

＜2-1＞ 내피세포 사멸에 미치는 단편 동정

상기 ＜실시예 1＞에서 제조된 AIMP1 단편들이 세포 사멸을 유도하는 활성이 있는지를 확인하기 위하여, 상기 AIMP1 단편들을 소 대동맥 내피세포(Bovine aorta endotheilial cells; 이하 BAECs라 함)에 처리하여 세포 사멸에 미치는 영향을 조사하였다.

BAECs(Bovine aorta endothelial cells)를 소의 흉부 대동맥으로부터 분리하 고 20％ FBS(fetal bovine serum)을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 37℃, 5％ CO₂의 조건으로 배양하였다. 상기 배양된 BAECs에 24시간 동안 AIMP1 단편들(50nM)을 처리하고 사멸세포의 수를 계수하였다. 구체적으로 EGFP(Enhanced Green Fluorescence Protein)로 BAECs를 형질 전환한 후 24시간 동안 발현시키고 형질전환된 세포에 24시간 동안 AIMP1 단편들(50nM)을 처리한 다음 형광 현미경을 사용하여 사멸세포의 수를 계수하였다. 상기 사멸세포의 ％는 사멸 형태를 가진 세포(green cell)의 수를 총 세포(green cell)의 수로 나누어 계산하여 그 결과를 도 3 및 도 4에 기재하였다.

상기 도 3 및 도 4에 기재된 바와 같이, 상기 ＜실시예 1＞에서 제조된 AIMP1 단편들 중에 AIMP1-(1-312), AIMP1-(1-192), AIMP1-(6-192), AIMP1-(30-192), AIMP1-(47-192), AIMP1-(54-192), 및 AIMP1-(101-192) 단편들은 내피세포 사멸을 강하게 유도하나, AIMP1-(114-192), AIMP1-(1-46), AIMP1-(1-53), AIMP1-(30-192) 및 AIMP1-(193-312) 단편들은 유도 효과가 없음을 알 수 있었다. 상기 결과를 토대로 AIMP1의 중간 영역, 그 중에서도 특히 AIMP1-(101-192) 영역이 내피세포에서 세포 사멸을 유도하는 도메인일 것으로 추정되었다.

＜2-2＞ 카스파제-3의 활성 측정

AIMP1이 카스파제(caspase)-3의 활성을 통하여 세포 사멸을 유도(S.G. Park, et. al., J. Biol.Chem., 277:4524345248, 2002)므로 카스파제(caspase)-3의 활성을 측정함으로써 AIMP1의 세포 사멸 유도 여부를 재확인하였다. 구체적으로 상기 배양된 BAECs(2×10⁶)를 300㎕의 세포 용해 완충액(20mM HEPES, pH 7.5, 1mM dithiothreitol (DTT), 0.1mM EDTA, 0.5％ NP-40, 및 0.1mM PMSF)에 용해시키고, 세포 용해물을 5분 동안 원심분리(15000×g)한 다음, 상층액을 카스파제 활성 측정을 위하여 사용하였다. 상기 제조된 세포 용해물 단백질(cell lysate potein, 40㎕)의 약수(aliquot)를 카스파제-3 기질(Ac-DEVD-p-nitroanilide) 또는 카스파제-1 기질(Ac-YVAD-p-nitroanilide)을 함유하고 있는 분석용 완충용액(20mM HEPES, pH 7.5, 2mM DTT, 10％ 글리세롤)에 30℃에서 2시간 동안 배양하였다. 카스파제에 의하여 유도된 p-nitroanilide의 양을 405nm에서 OD값(optimal density)을 측정함으로써 계산하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.

상기 도 5에 나타낸 결과는 상기 도 3 및 도 4에 기재된 바와 유사한 결과를 나타내었고 상기 결과를 토대로 AIMP1의 중간 영역, 그 중에서도 특히 AIMP1-(101-192) 영역이 내피세포에서 세포 사멸을 유도하는 도메인인 것으로 확인되었다.

＜실시예 3＞

AIMP1-(101-192) 단편의 추가적 결손 단편 제조 및 그 활성 측정

＜3-1＞ AIMP1-(101-192) 단편의 추가적 결손 단편 제조

상기 ＜실시예 2＞의 결과로 내피세포에서 세포 사멸을 유도하는 도메인으로 추정된 AIMP1-(101-192) 영역 중에, 세포 사멸을 유도하는 도메인을 좀 더 구체적으로 특정하기 위하여 AIMP1-(101-192) 단편의 추가적 결손 단편을 제조하였다.

상기 AIMP1-(101-192)의 C-말단 부분이 연속적으로 절단된 도 6과 같이 AIMP1-(101-192)의 단편들을 하기 표 2에 기재된 프라이머를 이용하여 제조하였다. 구체적으로 상기 단편을 제조하고 정제하는 방법은 상기 ＜실시예 1＞과 동일한 방법으로 수행하고 정제된 각 단백질들을 SDS-PAGE로 확인하고 그 결과를 도 7에 기재하였다.

표 2

AIMP1-(101-192) 단편의 제조에 사용된 프라이머 세트

상기 도 7에 기재된 바와 같이, AIMP1-(101-192)(서열번호 7), AIMP1-(101-180)(서열번호 8), AIMP1-(101-170)(서열번호 9), AIMP1-(101-160) 및 AIMP1-(101- 146) 단편들이 제조되었다.

＜3-2＞ AIMP1-(101-192) 단편의 추가적 결손 단편의 내피세포 사멸 유도 조사

상기 ＜실시예 2-1＞에 기재되어 있는 방법과 동일한 방법으로 배양된 BAECs(Bovine aorta endothelial cells)에 상기 ＜3-1＞에서 제조된 AIMP1 단편들과 상기 ＜실시예 1＞에서 제조된 AIMP1 전장 단백질 및 AIMP1-(101-192)을 각각 50nM씩 처리하고 세포의 모양변화에 의해 내피세포 사멸을 광학 현미경(CX31 light microscope, OLYMPUS)으로 측정한 결과를 도 8에 나타내었다. 또한 BAECs에 상기 ＜3-1＞에서 제조된 AIMP1 단편들과 상기 ＜실시예1＞에서 제조된 AIMP1 전장 단백질 및 AIMP1-(101-192)을 각각 50nM 씩 24시간 처리하고 5㎎/ml MTT 용액을 세포배양액 부피의 1/10만큼 첨가하여 1시간 동안 반응시키고 나서 배양액을 전부 제거한 후 DMSO를 200㎕ 첨가하여 570nm 파장에서의 흡광도 측정를 측정하여 그 결과를 도 9에 나타내었다. 상기 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, AIMP1의 전장 단백질, AIMP1-(101-192), AIMP1-(101-180), AIMP1-(101-170) 단편들은 내피세포의 사멸을 유도하는 효과가 있으나, AIMP1-(101-160), AIMP1-(101-146) 단편들에는 내피세포의 사멸을 유도하는 효과가 없음을 알 수 있었다. 상기 결과를 토대로 AIMP1의 중간 영역, 그 중에서도 특히 AIMP1-(101-170) 영역이 내피세포에서 세포 사멸을 유도하는 도메인일 것으로 추정되었다.

또한 상기 데이터를 검증하기 위하여 상기 ＜실시예 2-2＞에 기재되어 있는 방법과 동일하게 상기 AIMP1-(101-192)의 단편들이 카스파제(caspase)-3의 활성에 미치는 효과를 측정하고 그 결과를 도 10에 기재하였다.

상기 도 8 내지 도 10에 기재된 바와 같이, AIMP1-(1-312)(서열번호 1), AIMP1-(101-192)(서열번호 7), AIMP1-(101-180)(서열번호 8) 및 AIMP1-(101-170)(서열번호 9)는 내피세포의 사멸을 유도하는 활성이 높게 나타났으나 AIMP1-(101-160) 및 AIMP1-(101-146)은 활성을 나타내지 않는 것으로 확인되어, AIMP1의 중간 영역, 그 중에서도 특히 AIMP1-(101-170) 영역이 내피세포에서 세포 사멸을 유도하는 도메인임을 알 수 있었다. 따라서 상기 AIMP1-(101-170)(서열번호 9) 도메인이 항암치료나 항-혈관형성 치료에 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

＜실시예 4＞

AIMP1-(101-170)의 변이체 제조 및 그 활성 측정

＜4-1＞ AIMP1-(101-170)C161S 단백질의 제조

AIMP1-(101-170)의 변이체를 제조하기 위하여 상기 ＜실시예 3＞에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 확인된 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드에 C161S 점 돌연변이를 PCR을 이용하여 유발시켰다. 구체적으로 AIMP1의 cDNA를 주형으로 하고 하기 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭으로 합성하였다.

정방향 프라이머: 5'-CGCATATGGCAGTAACAACCGTATCTTCTGGT-3'(서열번호 43),

역방향프라이머: 5'-CGCTCGAGTTAATCAGGGTGTTTTCTAGCAGTTATGATGCTACCAATTCGAA

GATCCAGACGGGA-3'(서열번호 44)을 사용하였다.

상기 PCR 증폭 조건은 다음과 같다: 92℃ 2분간; 92℃ 30 초, 56℃ 30 초, 72℃ 20초 30 사이클 및; 72℃ 5분간

상기 합성 후 pET49b(Novagen)를 NdeI/XhoI 제한효소로 절단한 후 상기 PCR 반응 산물을 삽입하여 클로닝하고, 상기 ＜실시예 1＞에 기재되어 있는 방법과 동일한 방법으로 정제하여 AIMP1-(101-170)C161S(서열번호 10)을 제조하였다.

＜4-2＞ 전장 AIMP1, AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드 및 변이체의 세포사멸 효과 분석

본 발명자들은 전장 AIMP1(서열번호 1) 또는 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드(서열번호 9)는 강력한 환원제인 DTT(dithiothreitol)가 없는 상태에서는 내피세포의 사멸을 유도하는 활성이 없는 것을 확인하였다(결과 미도시). 따라서 상기 ＜실시예 1＞에서 제조된 전장 AIMP1(서열번호 1), AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드(서열번호 9)는 DTT가 있는 조건에서, 상기 ＜실시예 4-1＞에서 제조된 AIMP1-(101-170)C161S(서열번호 10)는 DTT가 없는 조건에서 내피세포 사멸에 미치는 영향을 조사하였다.

구체적으로 상기 ＜실시예 1＞에서 제조된 전장 AIMP1(100nM), AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드(10, 100nM)는 DTT가 있는 조건에서, 상기 ＜실시예 4-1＞에서 제조된 AIMP1-(101-170)C161S(10, 100nM)는 DTT가 없는 조건에서 정제를 한 다음에, 수득된 결과물을 BAECs에 각각 투여하여 24시간 동안 배양한 다음 상기 ＜실시예 3＞에 기재되어 있는 방법과 동일하게 MTT assay를 하여 cell viability를 측정하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 변이체인 AIMP1-(101-170)C161S 폴리펩타이드(서열번호 10)는 강력한 환원제인 DTT가 없는 조건에서도 AIMP1 전장(서열번호 1) 및 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드(서열번호 9)와 거의 유사한 세포 사멸효과를 가지는 것을 알 수 있었다.

＜실시예 5＞

AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드의 항암 효과

상기 ＜실시예 3-1＞에서 제조된 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드(서열번호 9)가 항암 효과가 있는지를 확인하기 위하여 이종이식(xenograft) 시스템(BALB/c-nu/nu mouse-MKN-45)을 사용하였다. 구체적으로 마우스(BALB/c-nu/nu nude mice, 5주, 수컷)를 구입(Harlan Co. Ltd. 미국)하여 12시간 주기로 낮과 밤을 자동적으로 조절해 주는 무균 사육시설에서 기르고, MKN-45(인체 위암세포, human gastric adenocarcinoma) 라인을 셀 뱅크 기관(KRIBB)에서 분양받았다.

상기 MKN-45 세포(2×10⁵cells/㎖)를 총 50㎕의 PBS에 넣어 상기 마우스 각각의 우측 견갑부에 경피 주사로 주입한 후, 종양의 성장정도를 모니터링하였다. 이 때 종양의 크기를 캘리퍼스를 사용하여 3차원으로 측정하여 종양의 부피를 길이× 넓이× 깊이× 0.5로 계산하였다. 종양의 크기가 50mm³이 되었을 때, 상기 ＜실시예 3-1＞에서 제조된 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드를 각각 10㎍/dose 또는 50㎍/dose를 매일 7일 동안 투여하면서 상대적인 종양의 부피를 측정하였다. 상기 상대적인 종양의 부피는 Vi(특정시간의 부피)/Vo(초기부피)로 계산하여 그 결과를 바탕으로 Student's t-test를 이용하여 p＜0.01 유의수준에서 종양성장 억제 데이터를 분석하고 그 결과를 도 12에 나타내었다.

상기 도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 7일째 종양의 부피가 초기 종양의 크기의 34배로 커진 반면, 10㎍/dose의 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드가 투여된 군에서는 15배, 50㎍/dose의 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드가 투여된 군에서는 5배로 커질 뿐이었다. 한편 실험대상인 마우스의 체중 감량 여부를 측정해본 결과, 상기 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드 투여가 체중 감량을 유발하지는 않는 것으로 확인되었다(도 13 참조).

한편 상기 7일째 종양을 적출하여 무게를 재고 종양 성장 억제율(TGI)을 하기 수학식 1에 의하여 측정하고 그 결과를 표 3에 기재하였다.

수학식 1

표 3

AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드의 종양 성장 억제 효과

상기 실험결과 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드는 체중 감량의 부작용 없이 항 암 효과를 가지는 것으로 확인되어 항암치료에 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

＜실시예 6＞

AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드과 전장 AIMP 단백질의 항암 효과 비교

상기 ＜실시예 3-1＞에서 제조된 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드(서열번호 9) 및 전장 AIMP 단배질의 항암 효과를 비교하기 위하여 상기 ＜실시예 5＞와 동일한 방법을 수행하였다. 다만 각 마우스에 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드 및 전체 AIMP 단배질을 각각 10㎍/dose를 투여하고 10일 동안 종양의 부피를 측정하고 그 결과를 도 14에 기재하였다.

상기 도 14에 기재된 바와 같이, 대조군에서는 10일째 종양의 부피가 초기 종양의 크기의 12.3배로 커진 반면, 10㎍/dose의 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드가 투여된 군에서는 5배(p=0.0052), 10㎍/dose의 전장 AIMP1 단백질이 투여된 군에서는 9.2배(p=0.022)로 증가하였다. 한편 실험대상인 마우스의 체중 감량 여부를 측정해본 결과, 상기 단백질 투여가 체중 감량을 유발하지는 않는 것으로 확인되었다(도 15 참조). 상기 결과를 통하여 10㎍/dose의 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드가 투여된 군은 대조군에 비해서 종양 부피가 58.75％ 만큼 감소한 것으로 나타났으며, 10㎍/dose의 전장 AIMP1 단백질이 투여된 군에 비해서는 종양 부피가 24.75％만큼 감소한 것으로 나타나, AIMP1 전장 단백질보다 AIMP1-(101-170) 폴리펩타이드의 항암효과가 우수한 것으로 나타났다.

Claims

서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 90％ 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 서열번호 4 내지 서열번호 8 및 서열번호 10 내지 서열번호 14로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 분리된 폴리펩타이드.
제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 가지는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 48 내지 서열번호 58으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
제3항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
제5항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
(a) 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90％ 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 분리된 폴리펩타이드; 또는 (b) 이들을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드와 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조성물이 항암용 조성물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90％ 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 분리된 폴리펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 내피세포의 사멸을 유도하는 방법.
서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90％ 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 분리된 폴리펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.
약제로 사용하기 위한 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90％ 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 분리된 폴리펩타이드.
약제로 사용하기 위한 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90％ 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90％ 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 분리된 폴리펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드의 항암제 제조를 위한 용도.