JP2002542145A - 血管成長を促進する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 治療を必要とする患者において血管成長を促進する方法は、その患者の血管成長を刺激するのに効果的な分量で、その患者の（例えば、その患者の肺または心臓において）EMAP II活性を阻害するステップを含む。こうした諸方法を実施するために有用な製薬製剤（例えば、製薬的に受容可能なキャリアーにおいてEMAPIIに特異的に結合する抗体）と、こうした諸方法を実行するために使用することができる付加的な化合物を同定するのに有用なスクリーニング技術もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は交付金番号NIH HL−60061の下、政府の支援により行われた。

【０００２】関連出願 本出願は、1998年11月13日に出願された米国出願第60/108,435号に基づく優先
権を主張するものである。この開示は、参照することにより全体として本出願に
組み込まれるものとする。

【０００３】発明の分野 本発明は、虚血性再灌流障害に対する危険がある患者、あるいは気管支肺異形
成に罹患している新生児などの患者の血管成長を促進する方法に関する。前記治
療に対して有用な化合物を同定する諸方法もまた開示される。

【０００４】発明の背景 D. Sternらに付与されている米国特許第5,641,867号 （コロンビア大学に譲渡
） は、精製された内皮単球活性化ポリペプチド（endothelial monocyte activa
ting polypeptide; EMAP）IIと、EMAP IIに特異的に結合する抗体と、罹患患者
にEMAP IIを投与することにより腫瘍を治療する方法とを記載している。

【０００５】 U. Kniesら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 12322-12327 (1998年10月) は
アポトーシスによる内皮単球活性化ポリペプチドII放出の調節を記載している。

【０００６】発明の概要 本発明の第1の態様は、治療を必要としている患者の臓器あるいは組織などに
おける、患者の血管成長を促進する方法である。本方法は、血管成長を刺激する
のに効果的な分量により対象（例えば、前記臓器あるいは組織）においてEMAP I
Iを阻害するステップを含む。

【０００７】 本発明の第2の態様は、EMAP IIに特異的に結合する化合物、EMAP IIの発現を
阻害する化合物、およびEMAP II受容体アンタゴニストからなる群から選択され
る活性化合物と、製薬的に受容可能なキャリアーとを含んでなる製薬製剤である
。

【０００８】 本発明の第3の態様は、患者の血管成長を促進するのに有用な化合物をスクリ
ーニングする方法である。本方法は、EMAP IIとその断片からなる群から選択さ
れるプローブ分子に検査化合物（例えば、タンパク質あるいはペプチド）を接触
させるステップと、その後にそのプローブ分子に対する検査化合物の結合の有無
を検出するステップであって、その結合の存在により、化合物が患者の血管成長
を促進するのに有用であると示されるステップとを含む。

【０００９】 本発明の第4の態様は、患者の血管成長を促進するために有用な化合物をスク
リーニングする方法であって、EMAP IIをコードするDNA、EMAP IIをコードするR
NA、およびその断片からなる群から選択されるプローブ分子に、検査化合物（例
えば、オリゴヌクレオチド）を接触させるステップと、その後にプローブ分子に
検査化合物の結合の有無を検出するステップであって、その結合の存在により、
化合物が患者の血管成長を促進するのに有用であると示されるステップとを含む
。

【００１０】 本発明の第5の態様は、患者の血管成長を促進するために有用な化合物をスク
リーニングする方法であって、検査化合物がEMAP IIの発現を阻害するかどうか
をin vitroにて決定するステップと、その化合物を示すEMAP IIの発現を阻害す
るステップであって、EMAP IIの発現の阻害により、化合物が患者の血管成長を
促進するのに有用であると示されるステップとを含む。

【００１１】 本発明はさらに詳細には、以下に述べられる明細書中で説明される。

【００１２】好適な実施態様の詳細な説明 上記に示したように、本発明の第1態様は、治療を必要とする患者において血
管成長を促進する方法である。この方法は、血管成長を刺激するのに効果的な分
量により患者のEMAP II活性を阻害するステップを含む

【００１３】 血管成長は、肺、腎臓、心臓、大動脈、消化管、脳、肝臓などに限定されない
が、それらを含むいずれかの適当な臓器あるいは組織において阻害することが可
能である。阻害は特定あるいは全身的なものであってもよいが、主に以下に論議
されるように投与の仕方により影響を受ける。本出願人の発明は、血管成長のい
ずれかの特定な理論に限定される意図はなく、またそのため、この用語は一般的
に解釈され、血管新生、新脈管形成などといった血管成長ならびに増殖のいずれ
のタイプをも包摂する。

【００１４】 本発明により治療されると考えられる患者には、いずれかの患者、血管成長を
促進することを所望されているヒトあるいは成人が含まれる。こうした患者には
、上述されている臓器などの臓器に虚血性再灌流障害の危険がある（例えば、移
植の場合、低血圧、心停止など）患者、気管支肺異形成に罹患している新生児患
者、肺高血圧に罹患している患者、肺形成不全に罹患している患者が含まれる。

【００１５】 本発明により治療される患者は主にヒト患者であるが、本発明はまた、獣医学
用にイヌ、ネコ、ウマなどの他の動物患者にも実施することが可能である。

【００１６】 阻害ステップは、何らかの適当な手段により実施されうる。例えば、血管成長
を刺激するのに効果的な分量で、EMAP IIを特異的に結合する化合物を患者に投
与することにより実施されうる。こうした化合物は、抗体（EMAP IIに特異的に
結合する結合領域を保持しているポリクローナル、モノクローナル抗体、抗体断
片、ヒト化あるいはキメラ抗体などを含む）でもよい。抗体はIgGおよびIgM免疫
グロブリンに限定されるわけではないが、それらを含むいずれかのタイプのグロ
ブリンでよい。抗体はニワトリ、ヤギ、ウサギ、ウマなどのいずれかの適当な起
源のものでよいが、好適には哺乳動物であり、もっとも好適にはヒトである。抗
体は直接、あるいは患者において抗体を発現する中間体を通じて投与されうる。
EMAP IIの実施例は、Sternらに付与された米国特許第5,641,867号に提供されて
いて、その開示は参照することにより本明細書に組み込まれる。治療用抗体の異
なる形態の実施例は、米国特許第5,622,700号にみられ、その開示は参照するこ
とにより本出願に組み込まれるものとする。

【００１７】 阻害ステップは、患者の肺において血管成長を刺激するのに有効な分量により
、患者のEMAP II発現をダウンレギュレーションすることにより実施されうる。E
MAP II発現をダウンレギュレーションするために有効な化合物は、一般的には、
EMAP II mRNAに結合し、その翻訳を中断させるアンチセンスオリゴヌクレオチド
であり、あるいはEMAP II DNAに結合し、その転写を中断させるオリゴヌクレオ
チドである。こうしたオリゴヌクレオチドは天然あるいは合成のものでもよく（
Koleに付与された米国特許第5,665,593号に記述されているように。参照するこ
とによりその開示が本明細書に全体として組み込まれるものとする）、また典型
的には少なくとも長さにして4、6あるいは8個のヌクレオチドであり、対応するD
NAあるいはmRNAの完全長までである。こうしたオリゴヌクレオチドは、Sternら
に付与された米国特許第5,641,867号に説明されているように、EMAP II DNAの知
られている配列に基づくワトソン−クリック対によりDNAあるいはmRNAに結合す
るように選択される。この文献の開示は、参照することにより本明細書に全体と
して組み込まれるものとする。例えば、同上のSternらに開示されているEMAP II
DNAに対応する塩基配列を有する4、6あるいは8個あるいはそれ以上のヌクレオ
チド、オリゴヌクレオチド本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドから長さに
して20、30あるいは40個のヌクレオチドあるいはDNA配列の完全長までから構成
されうる。さらに、こうした化合物は以下に説明されるような公知の技術により
同定されうる。

【００１８】 阻害ステップは、患者の肺に血管成長を刺激するのに効果的な分量で、EMAP I
I受容体アンタゴニストを患者に投与することにより実施されうる。EMAP II受容
体アンタゴニストは、公知の技術により同定されうるが、一般的には、3〜5個の
N末端および／またはC末端のアミノ酸が欠損しているEMAP IIなどのEMAP IIのア
ナログである。

【００１９】 前述の阻害ステップを実行するのに有用な活性化合物は、腹腔内、皮下、動脈
内、静脈内、筋肉内、クモ膜下ないしは髄腔内注射を含むいずれかの適当な手段
により投与されうる。注射は、シリンジ、カニューレあるいはカテーテルにより
、所望される脈管あるいは臓器などに投入される。化合物は気道中に吸入により
投与しうるが、その活性化合物を含む、呼吸により吸収できるエアゾール粒子（
例えば、1〜5ミクロン直径粒子）の吸入などにより、とくに肺の肺胞中に投与さ
れうる。

【００２０】 本発明の製薬製剤は、典型的には、EMAP IIに特異的に結合する化合物（例え
ば、上述のような抗体）、EMAP IIの発現を阻害する化合物、およびEMAP II受容
体アンタゴニストからなる群から選択される活性化合物と、製薬的に受容可能な
キャリアーとを含んでなる。滅菌生理食塩水、滅菌水などのいずれかの製薬的に
受容可能なキャリアーが用いられる。活性化合物は約0.001、0.005あるいは0.01
重量％から約10、20あるいは50重量％の間などといった、いずれかの適当な分量
で製薬的に受容可能なキャリアーに含まれる。

【００２１】 その活性化合物の投与量は、その特定の活性化合物、投与経路、治療される特
定の障害、年齢、体重、およびその患者の状態などによる。例えば、アンチセン
スオリゴヌクレオチドに関しては、投与は好適には0.05〜50 μMのオリゴヌクレ
オチドの細胞内濃度を生じる量であり、典型的には、ヒトに対する投与では、約
0.01、0.1あるいは1 mg/Kgから50、100あるいは150 mg/Kgまでである。1つの追
加的な例では、抗体に関しては、その投与量は典型的には0.01、0.05あるいは0.
1から20、40あるいは60 mg/Kgまでである。

【００２２】 ヌクレオチドあるいはタンパク質である活性化合物（例えば、抗体）は、上述
のように直接、あるいは患者において同じ活性化合物を発現するベクター中間体
を通じて投与されうる。このように、本発明を実施するベクターは一般的には、
レンチウイルスベクター、パポバウイルスベクター（例えば、SV40ベクターおよ
びポリオーマベクター）、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベ
クターなどのRNAウイルスあるいはDNAウイルスベクターである。これについては
一般的なものとして、T. Friedmann、Science 244, 1275 16(1989年6月) を参照
されたい。本発明を実施するのに使用されうるレンチウイルスベクターの例とし
ては、Kohnに付与された米国特許第5,707,865号に記載されているモロニーネズ
ミ白血病ウイルスベクターなどが使用されうる。いずれかのアデノウイルスベク
ターは本発明を実施するのに使用することができる。これについては、例えば、
米国特許第5,518,913号、米国特許第5,670,488号、米国特許第5,589,377号、米
国特許第5,616,326号、米国特許第5,436,146号、米国特許第5,585,362号を参照
されたい。アデノウイルスは、S. Woo、Adenovirus redirected、Nature Biotec
hnology 14, 1538 (1996年11月)に説明されているように、その天然の向性を変
更するあるいは広範なものにするように修飾することができる。いずれかのアデ
ノ関連ウイルスベクター（あるいはAAVベクター）は、本発明を実施するのに使
用することができる。これについては、例えば、米国特許第5,681,731号、米国
特許第5,677,158号、米国特許第5,658,776号、米国特許第5,658,776号、米国特
許第5,622,856号、米国特許第5,604,090号、米国特許第5,589,377号、米国特許
第5,587,308号、米国特許第5,474,935号、米国特許第5,436,146号、米国特許第5
,354,678号、米国特許第5,252,479号、米国特許第5,173,414号、米国特許第5,13
9,941号、米国特許第4,797,368号を参照されたい。

【００２３】 ベクターの調節配列あるいは転写および翻訳制御配列は、標的細胞で異種核酸
の発現を遂げるかぎり、何らかの適当な資源とすることができる。例えば、通常
使用されるプロモーターは、LacZプロモーター、またポリオーマ、アデノウイル
ス2およびシミアンウイルス40（SV40）から得られたプロモーターである。これ
については、例えば、米国特許第4,599,308号を参照されたい。異種核酸はその
翻訳を妨害するあるいは阻害するようにEMAP II mRNAに特異的に結合するアンチ
センスオリゴヌクレオチド、その翻訳を妨害あるいは阻害するようにEMAP II mR
NAに特異的に結合するリボザイム、あるいはEMAP II二本鎖DNAに結合し、その転
写を妨害しあるいは阻害する三重鎖核酸など、ベクターに感染される細胞におけ
るEMAＰ II遺伝子の発現を阻害する産物をコードするものでよい。これらのすべ
ては、（例えば）トリプレックスに関して米国特許第5,650,316号、米国特許第5
,176,996号、米国特許第5,650,316号、アンチセンス化合物に関して米国特許第5
,811,537号、米国特許第5,801,154号、米国特許第5,734,039号、リボザイムに関
して米国特許第5,817,635号、米国特許第5,811,300号、米国特許第5,773,260号
、米国特許第5,766,942号、米国特許第5,747,335号、米国特許第5,646,020号（
これらの開示は、参照することによって全体として本明細書に組み込まれるもの
とする）に説明されているように、公知技術により実施することが可能である。
その意図されている機能が達成されれば、異種核酸の長さはさほど重要ではない
が、異種核酸は典型的には長さ5、8、10あるいは20個の核酸から長さ20、30、40
あるいは50個の核酸、EMAP II遺伝子の完全長に等しい長さまでである。一度作
成されると、組換えベクターは、（a）そのベクターの増加と再生産を可能にす
る細胞を含む細胞培養物中でそのベクターを増やすことと、またその後（b）す
べて公知技術によるが、その細胞培養物からその組換えベクターを収集すること
とにより再生産することができる。その培養物から収集されたウイルスベクター
は、公知技術により培養培地から分離され、また、患者に対して投与される適当
な製薬キャリアーと組み合わせることが可能である。こうした製薬キャリアーに
は、滅菌無発熱水あるいは滅菌無発熱生理食塩水溶液を含むが、それらに制限さ
れるわけではない。所望される場合は、ベクターは知られている技術により、投
与のためにリポソーム中にパッケージすることも可能である。

【００２４】 治療される特定の状態により、いずれかの適当な投与経路を本発明を実施する
のに使用することができる。適当な経路には、皮下、静脈内、動脈内、クモ膜下
ないしは髄腔内、腹腔内、筋肉内、病巣内注射が含まれるが、それらに限定され
るわけではない。病巣内注射が現行のものでは好適である。

【００２５】 投与される組換えベクターの投与量は、特定の障害、選択された特定のベクタ
ー、ベクターの形成、患者の状態、投与経路などの要素によるが、また、特定の
状況に対して最適化することができる。一般的には、投与量は約10⁷、10⁸あるい
は10⁹から約10¹¹、10¹²、10¹³プラーク形成単位（pfu）までである。

【００２６】 製薬あるいは獣医使用用に加えて、本発明の組換えベクター（本出願では「活
性薬剤」ともときに呼ばれている）は、その活性薬剤に対する反応に基づいて培
養物において細胞を見分け、あるいはアトポーシスを誘導するために、in vitro
で有用である。こうした技術は細胞培養手順と薬剤スクリーニング目的の両方で
実施するのに有用である。

【００２７】 上述されている治療方法を実施する際の効き目に関する化合物のスクリーニン
グのin vitroの諸方法もまた本出願では開示される。一般的には、1つの実施態
様では、こうした諸方法は、その化合物がEMAP IIの発現（好適には、哺乳動物
遺伝子と、もっとも好適にはヒト遺伝子）を阻害するかどうかをin vitroで決定
するステップを含む。EMAP IIの発現の阻害がある場合は、その化合物が上述さ
れた治療の諸方法において有用であることを示す。こうした数々のスクリーニン
グの諸方法は利用可能である。この方法は、1つの細胞あるいは複数の細胞で実
施することができ、あるいは基本的に無細胞系で作成が実施できる。この方法は
、EMAP IIの転写あるいは翻訳のいずれかを特異的に中断させる化合物をスクリ
ーニングすることにより実施できる。スクリーニングされる化合物は化合物のラ
イブラリーのメンバーでありうる（「化合物」という用語は小さな有機化合物と
、組換えウイルスベクターなどのその他の治療薬剤の両方に言及するといった場
合に使用される）。この方法は単一の分析法として実施されるか、あるいはさま
ざまな知られている諸技術と一緒に高スループットスクリーニング(throughput
screen)の形態で実施されうる。もう1つの実施態様では、化合物をスクリーニン
グする方法は、前記化合物がEMAP II（その断片を含む）（好適には哺乳動物遺
伝子産物、もっとも好適にはヒト遺伝子産物）に特異的に結合するかどうかをin
vitroで決定するステップを含む。決定ステップは、検査化合物あるいはプロー
ブ分子による、完全長EMAP II遺伝子産物全体またはそのヘプチド断片（例えば
、長さ5あるいは10個のアミノ酸の断片からEMAP IIの完全長に至るまでの断片）
への結合をスクリーニングすることにより実施されうる。EMAP IIへの化合物の
結合は、その化合物が本出願で説明されている治療の諸方法で有用であることを
示している。こうした技術は公知のさまざまなコンビナトリアルケミストリー技
術のいずれかにおいてEMAP IIあるいはその断片にプローブ化合物を接触させる
ことにより実施することができる（スプリットプール技術、チップに基づく技術
、ピンに基づく技術が含まれるが、それらに限定されない）。EMAP IIとその断
片に対する特異的な結合パートナーを見つけ出すために、いずれかの適当な固体
支持体をEMAP IIあるいはその断片を固定する（あるいはEMAP IIとその断片に対
する特異的な結合パートナーを見つけ出すために、EMAP IIあるいはその断片を
接触させるライブラリーのメンバーを固定する）のに使用することができ、また
数多くの異なる固体支持体は当業技術に熟練している者にはよく知られている。
その固体支持体が形成される適当な材料の実施例には、セルロース、有孔ガラス
、シリカゲル、ポリスチレン、とくにジビニルベンジンで架橋されたポリスチレ
ン、ポリエチレングリコール／ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックス
、ジメチルアクリルアミド、とくにN, N'ビス−アクリロイルエチレンジアミン
で架橋され、またN−t−ブトキシカルボニル−β−アラニル−N'アクリロイルヘ
キサメチレンジアミンから成るジメチルアクリルアミドなどのグラフト共重合体
、架橋ポリスチレンあるいはフッ化エチレン重合体にグラフトされる鎖状ポリス
チレンなどの親水性重合体により被膜されているガラスなどの合成物が含まれる
。したがって、「固体支持体」という用語には、半固体支持体であると通常考え
られる材料が含まれる。共有結合反応官能性を含む有用な固体支持体についての
総説はAthertonら、『Prospectives in Peptide Chemistry、Karger社刊, 101〜
117頁 (1981); Amamathら、Chem. Rev. 77: 183 (1977)、Fridkin『The Peptide
s』第2巻、第3章、Academic Press社刊、333〜363頁 (1979)にみられる。固体支
持体はビーズあるいはマイクロ粒子、試験管、プレート、マイクロプレートウェ
ル、ガラス顕微鏡カバースリップなどのいずれかの適当な形態をとりうる。

【００２８】 いずれの型のプローブ分子あるいはライブラリー（異なるプローブ分子のグル
ープが用いられる）によっても使用することができる。一般的には、こうしたプ
ローブ分子は、オリゴマー、非オリゴマー、あるいはそれらを組み合わせたもの
を含む本発明を実施するのに使用することが可能なものを含む有機化合物である
が、それらに限定されるわけではない。非オリゴマーには、複素環式化合物、芳
香族化合物、脂環式化合物、脂肪族化合物およびそれらを組み合わせたもの、ス
テロイド、抗生物質、酵素阻害剤、リガンド、ホルモン、薬剤、アルカロイド、
オピオイド、ベンゾジアゼピン、テルペン、プロフィリン、毒素、触媒とその組
み合わせたものから成るさまざまな広範な有機分子が含まれる。オリゴマーには
、ペプチド（すなわち、オリゴペプチド）と、タンパク質と、DNAとRNAのような
オリゴヌクレオチド（この用語オリゴヌクレオチドはまた本明細書では単に「オ
レゴヌクレオチド」とも呼ばれる）と、オリゴ糖と、ポリ脂質と、ポリエステル
と、ポリアミドと、ポリウレタンと、ポリウレアと、ポリエーテルと、リン酸エ
ステル、ホスホン酸エステル、ホスホルアミド、ホスホンアミド、亜リン酸エス
テル、亜リン酸アミドなどのリン酸ポリリン誘導体と、スルホン、スルホン酸エ
ステル、亜硫酸エステル、スルフェンアミドなどのポリ硫黄誘導体とが含まれ、
ここで、亜リン酸と硫黄誘導体については、大部分で示されているヘテロ原子が
C、H、N、OあるいはSおよびそれらを組み合わせたものに結合される。こうした
固体支持体上のこうしたプローブ分子を合成あるいは適用する数々ある方法（そ
こではプローブは固体支持体に共有かあるいは非共有結合される）が知られてお
り、またこうしたプローブ分子は当業技術分野に熟練した者には知られている手
順にしたがって作成することができる。これについては、例えば、Stillらに付
与された米国特許第5,565,324号、Ellmanらに付与された米国特許第5,284,514号
、Fodorらに付与された米国特許第5,445,934号を参照されたい（本明細書に引用
されているすべての米国特許の開示は、参照することにより全体として本明細書
に組み込まれる）。

【００２９】 本発明を実施するのに使用される検査化合物は、上のプローブ分子に関連して
上述された型のオリゴマーあるいは非オリゴマーの両方を含む、いずれの型のも
のでもよい。またこうした検査化合物は公知であり、公知技術により作成するこ
とができる。

【００３０】 複数の異なるプローブ分子が検査されることを所望される場合には、「チップ
に基づく」コンビナトリアルケミストリー技術および「ピンに基づく」コンビナ
トリアルケミストリー技術などにおける分子相互作用の高いスループットスクリ
ーニングに有用なスクリーニング基板は、公知技術により作成することができる
。すべて、公知技術で作成することができる。これについては、例えば、Fodor
らに付与された米国特許第5,445,934号、Ellmanに付与された米国特許第5,288,5
14号、Sundrbergらに付与された米国特許第5,624,711号を参照されたい。

【００３１】 一方、プローブ分子のライブラリーのスクリーニングは「スプリットプール(sp
lit-pool)」コンビナトリアルケミストリーにおいて使用されるような固相支持
体の混合物を用いて使用される。そのような混合物は、公知の手順によって作成
することができ、タグ成分は公知の手順によって慎重な固相支持体に付着されう
る。Stillらに付与された米国特許5,565,324号を参照されたい。

【００３２】 本願発明は、以下の非限定的な実施例においてより詳細に説明される。

【００３３】例１ EMAP IIは肺新生血管形成、上皮形態形成および上皮−間充識相互作用を阻害す
る。 新生血管形成は、肺の発達には非常に重要であり、またさまざまな新脈管形成
因子および抗新脈管形成因子により媒介される。本出願では、抗新脈管形成タン
パク質である過剰の内皮単球活性化ポリペプチド（EMAP）IIが、胎児肺新生血管
形成を阻害するだけではなく、肺上皮形態形成をも有意に改変してしまう。肺の
新生血管形成と形態形成に関するマウスの異種間移植モデルでは、EMAP IIを腹
腔内に投与された免疫無防備状態のマウスの皮膚下に移植した胎児性肺は、対照
に比べて血管濃度（p<0.0001）で56％減少させた。EMAP IIで治療された肺移植
片では、II型肺胞細胞形成の欠如を含め、肺形態形成で顕著な変化を示した。対
照的に、EMAP IIに対する遮断抗体を受けた動物での肺移植は、血管濃度で50％
（p<0.0001）増加させ、またもっとも遠位の上皮細胞で界面活性剤タンパク質C
を発現した。胎児性上皮と間充識細胞の共培養は、EMAP II発現が周辺の上皮嚢
胞領域に局在化していることを示した。これらの共培養物を過剰EMAP IIに曝露
すると、71％まで（p<0.0001）まで上皮嚢胞形成が阻害された。一方、反対に、
EMAP II抗体は54％まで（p<0.0001）嚢胞形成を増加させた。外植片モデルの上
皮細胞におけるアポトーシス誘導により確認された共培養物システムにおける上
皮細胞に限定されたEMAP IIによるアトポーシスの時間依存性誘導があった。こ
うした研究から、発達肺でEMAP IIが脈管成長、脈管成長の阻害を調節しており
、また肺形態形成を改変するという結果を生み、血管成長が欠如してアポトーシ
スを誘導する上皮−間充識細胞の相互作用をEMAP IIが実行していることが示さ
れた。したがって、EMAP IIは、肺上皮形態形成の停止およびアポトーシスを導
くだけではなく、肺新生血管形成を否定的に調節する。

【００３４】Ｉ．実験手順 E. Coliからの組換え(r)EMAP IIの合成およびペプチド抗体の生成 成熟ヒトEMAP IIのcDNAが、遺伝子バンクから得たプライマー（寄託番号＃101
19）に基づいて、U937細胞の全RNAのRT-PCR産物からTAベクター（Invitrogen）
の中にクローニングされた。クローンの確認は配列分析により提供され、その後
、そのcDNAが6X his標識を含むプラスミドであるPET28aに挿入された。E.coli（
DE3）はEMAP II / PET28aプラスミドにより形質転換され、また1〜4 mMのIPTGに
より誘導された。誘導の3〜4時間後、細胞はペレット化され、溶解分離され、ま
たEMAP IIタンパク質は4℃ですべての手順を行ってプロトコル（Qiagen）により
ニッケルカラムの使用により精製された。手短に言えば、ペレット化された細胞
は、1 mg/mlのリゾチームの存在下で50 mM NaH₂PO₄ pH 8.0 300 mM NaClおよび1
0 mMイミダゾールにより分解分離された。音波破砕処理後、細胞破片は、Ni-NTA
スラリー上に載置される前に遠心分離により除去された。カラムの洗浄後、rEMA
P IIが8 M尿素、0.1 M NaH₂PO₄および0.01 M Tris-Cl pH 5.9により溶出される
。分取され、また−80℃で凍結される前に3回、精製されたrEMAP IIはPBSに対し
て4℃で透析される。rEMAP IIの分取量が解凍されたら、すぐにそれを実験に使
用した（それは再凍結されず、将来の研究で使用されない）。これは、rEMAP II
活性を保持するためには不可欠である。

【００３５】 成熟EMAP IIのヒトおよびマウスの相同性領域内に位置している13個のアミノ
酸残基のペプチド配列が、抗体を生成するのに使用された。このペプチドは合成
されたが、またプロトコルに基づきZymed Laboratories社により抗体が生産され
、また免疫組織化学およびウエスタンブロッティングに使用される。過剰EMAP I
Iによってインキュベートされた後にブロックされたウエスタンブロットの単一
バンドを産生することにより同定されるEMAP IIに、その抗体は特異的である（
データは示せず）。

【００３６】共培養のための上皮と間充識細胞の分離 マウス肺の器官培養が、Schugerらのプロトコルに従って実施された［Schuger
, Development 110, 1091-9 (1990); Schuger, J. Cell. Boil. 139, 553-62 (1
997); Schuger, Int. J. Dev. Biol. 42, 217- 220 (1998)］。手短に言うと、
時間どおりの妊娠15日目の胎児がスイス−ウエブスターマウス（Simonsen社、Mo
rgan Hill市、カリフォルニア州）から切り出され、肺が分離され、100μm孔メ
ッシュによりフィルターされる前に、37℃で10分間0.3%トリプシンと0.1％ EDTA
を含有するPBS中で加水分解を受けた。混合された上皮−間充識細胞はその後に
、非必須アミノ酸を加えた最小必須培地（MEM-Gibco-BRL）中で再懸濁され、ま
た8穴チャンバースライドに2〜2.5 X 10⁶細胞/mlという濃度で蒔かれた。実験は
溶媒、rEMAP II (成熟0.8〜3.2μg/ml)、EMAP IIペプチド抗体（3〜6μg/ml）、
ウサギIgG（対照）の存在下で行われた。上皮嚢胞形成は、高倍率（HPF）顕微鏡
により上皮嚢胞の数を数えることにより評価され、我々は条件毎に10の視野を分
析し、またそれらの平均値を算出した。

【００３７】異種間肺移植モデル 妊娠第12日目の時間通りに妊娠したスイスウエブスターマウス（膣栓の出現＝
第1日目に基づき）が得られ、収容され、またCHLARI（ロサンジェルス調査研究
所の小児病院"Children's Hospital of Los Angeles Research Institute"）の
動物保護委員会により承認されたプロトコルにより取り扱いを受けた。第14.5日
目に、母親を犠牲にしてその胎児を取り出した。肺と心臓がブロックマイクロ切
片として取り出され、氷冷PBS中に置かれた。心臓はその後に除去され、また肺
は0.80μM Milliporeフィルターディスク（Millipore社）の一番上に置かれ、ま
た、滅菌技術を用いてヌードマウスの背部の皮膚を折り返して作った空間に移植
された。皮膚は皮膚ステープルで閉じられた。同胞の肺は組織学的分析と移植肺
との比較に使用された。ヌードマウスがその後に、溶媒(リン酸塩緩衝生理食塩
水−PBSとアルブミン)、EMAP II（1μg/日）、ウサギIgGまたはEMAP II抗体（25
あるいは50μg/3日毎）かのいずれかにより1日単位で腹腔内に注射された。

【００３８】肺移植のRT−PCR 14日後、肺異種間移植片がキャリアーマウスの皮膚から分離されたrEMAP II、
EMAP IIに対する抗体、あるいは溶媒により治療されたマウスから除去され、総R
NAがRNA−STAT−60（Tel−Test"B"社、Friendswood市、テキサス州）により抽出
され、また、総RNA鋳型の3μg、5 X RT緩衝液の4μl、18μlという総反応量にお
いて標的遺伝子特異的3'プライマーの0.5μg 、0.1M DTTの2μlを使用して、ス
ーパースクリプトII RNアーゼH−逆転写酵素（GIBCO−BRL社）により、移植肺の
RNAが逆転写された。反応混合液は2分間氷上でインキュベートされた後、10分間
70℃でインキュベートされた。10 mM dNTPの1μl、スーパースクリプトII RNア
ーゼH−逆転写酵素の1μlが加えられた。その混合液は70℃で10分間で行った後
、49℃で1時間30分間インキューベートされた。このように合成された第1鎖cDNA
は標的cDNAのPCR増殖に直接使用された。標的cDNAプライマーは、1)マウスPECAM
−1 5'プライマー−5'GTC ATC GCC ATG GTC GAG TA3' (配列番号1)と、3'プライ
マー−5' CTC CTC GGC ATC TTG CTG AA 3' (配列番号2)、2)マウスtie−2 5'プ
ライマー5'TTG AAG TGA CGA ATG AGA T3' (配列番号3)と、3'プライマー−5' AT
T TAG AGC TGT CTG GCT T 3' (配列番号4)、3)マウスSP−C 5' プライマー−5'C
AT ACT GAG ATG GTC CTT GAG-3' (配列番号5)、および3' プライマー−5'TCT GG
A GCC ATC TTC ATG ATG-3' (配列番号6)および4) マウスT1−α 5' プライマー
−5' GAA CAT GAG AGT ACG ACC ACT GTC AAA 3' (配列番号7)および3' プライマ
ー−5' TTA GGG CGA GAA CCT TCC AGA AAT CTT 3' (配列番号8)。ハウスキーピ
ング遺伝子として使用されるβアクチンは、以下のプライマーを使用してすべて
のサンプル上で働いた。すなわち、5' プライマー−5' GTA TGG AAT CCT GTG GC
A TCC 3' (配列番号9)および3' プライマー−5' TAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC
3' (配列番号10)である。さらに、対照群が第1鎖cDNA鋳型の存在無しにプライマ
ー対を使用してすべての標的cDNA配列について行われた。標的cDNAセグメントは
、上の第1鎖cDNA鋳型の1/10、10×緩衝液の10μl、10 mM dNTPの0.5μl、5'と3'
末端特異的プライマーのそれぞれ300 ng、および50μl反応液の中のTaqポリメラ
ーゼ（Stratagene社）の1 μlを使用して増幅された。PCRプログラムは、1分間9
4℃、30秒間62℃、30秒間72℃を30サイクル行った。すべての増幅cDNA断片の等
量が、アガロースゲル電気泳動法により分析され、写真が撮影され、また分析さ
れた。

【００３９】in situハイブリダイゼーションおよびcDNAプローブの構築 総RNAは15日妊娠マウス肺組織から、RNA STAT−60 (Tel−Test "B"社、Friend
swood市、テキサス州)により抽出された。RNA（3μg）は70℃で10分間オリゴ（d
T）プライマーによりインキュベートされた。第1鎖cDNA合成が製造業者の指示（
GIBCO BRL社、Grand Island市、ニューヨーク州）により実施された。特異的第1
鎖の合成後、増幅（94℃1分間、62℃1分間、72℃1分間）30サイクルの間、特異
的なプライマーの10 pmolを使用してcDNAがPCR増幅により生成された。使用され
たプライマーは以下のとおりである。すなわち、SP−C、センス、5'-CAT ACT GA
G ATG GTC CTT GAG-3' (配列番号11)、およびアンチセンス、5'-TCT GGA GCC AT
C TTC ATG ATG-3' (配列番号12)である。EMAP IIのためのRNAプローブは456 bp
のサイズで、他の公知タンパク質との相同性が最も小さい領域から得られた。RN
Aのin vitro転写のため、生成されたSP−C PCR産物はTAベクター（Invitrogen社
、Carlsbad市、カリフォルニア州）にサブクローニングされた。

【００４０】in vitro転写によるジゴキシゲニンRNAプローブ標識化 T7 RNAポリメラーゼによるアンチセンスRNAのin vitro転写に関して良好な定
位にあるSP−CサブクローンのDNAがHind III加水分解により鎖状化され、プロー
ブ標識のための鋳型として使用された。T7 RNAポリメラーゼによりin vitro転写
によりジゴキシゲニン−UTPによるアンチセンスRNAプローブ標識化が製造業者の
指示書により行われた（DIG RNA標識化キット、Boehringer Mannheim社、インデ
ィアナポリス市、インディアナ州）。

【００４１】DIG標識化されたcRNAプローブを使用したRNA in situハイブリダイゼーション（ RISH） マウス胎児対照肺第14 日目g. a.とマウス移植第１４日目g. a. +3.5、14 g.
a. + 7、14 g. a. + 10.5、および第14日目 g. a.＋14がin situハイブリダイゼ
ーションのために得られた。Dig RNAプローブアンチセンスとセンス（対照）が
、Boehringer Mannheim社（インディアナポリス市、インディアナ州）から入手
可能なDig RNA標識化キット（SP6/T7）を使用して作成された。RISHは非放射性i
n situハイブリダイゼーション適用マニュアル（Boehringer Mannheim社、イン
ディアナポリス市、インディアナ州）により5mmパラフィン包埋材料部分上で行
われた。DEPC処理装置と溶液を使用して、パラフィン包埋標本は、切片化、再脱
水および予め暖められた5μg/mlプロテイナーゼK溶液でのインキュベーションを
受けた。スライドはその後、4％PFAに再び液浸され、0.25％無水酢酸により処理
され、また脱水された。切片は、dig標識化RNAプローブの150〜300 ng/mを含有
する、l50％ホルムアミド、10％デキストラン硫酸、1mg/ml tRNA、1 X デンハル
ト溶液、4 X SSC、50 mMトリスおよび5 mM EDTAを含むハイブリダイゼーション
溶液に50℃で一夜曝された。スライドは、RNアーゼA（20μg/ml）で37℃で30分
間インキュベートする前に、2 X SSC/50%ホルムアミド、1 X SSC および0.1 SSC
で30分間55℃で洗浄された。2 X SSCで洗浄した後、Dig核酸検出が、Boehringer
Mannheim社から入手可能なGenius3キットを使用して遂行された。手短に言うと
、スライドは、0.1 M マレイン酸/0.15 M NaCl pH 7.5で5分間インキュベートさ
れ、その後に、1%ブロック試薬で遮断された。遮断後、スライドが一夜4℃で抗D
ig−AP共役でインキュベートされ、洗浄され、また、室温にて3時間希釈NBT /B
CIP溶液によりインキュベートされた。スライドはその後、2分間0.02%ファース
トグリーン溶液で対比染色を受け、水で洗浄され、空気乾燥されて、顕微鏡に載
置された。センスプローブにより、あるいはプローブ無しでハイブリダイゼーシ
ョンがネガティブコントロールとして行われたが、これらのコントロールは常に
何のシグナルもみせなかった。すべての切片が調べられ、また光学顕微鏡下で写
真撮影された。

【００４２】マウス肺移植片の組織および免疫組織化学的分析 14日後、キャリアーマウスの皮膚から分離され、4％パラホルムアルデヒドで
固定され、脱水され、またパラフィン包埋された（すべての手順の間、DEPC水と
RNアーゼに対する予防処置がとられた）rEMAP II、EMAP IIに対する遮断抗体、
あるいは溶媒で処理され、肺異種移植片がマウスから除去された。固定された組
織は5ミクロン間隔で切片化された。肺移植片はその後に構造分析のためにH & E
染色を受けた。PECAM−1抗原（Pharmigen社、サンディエゴ市、カリフォルニア
州）の免疫局在化に関しては、ラット抗マウスPECAM−1抗体（4μg/ml）が用い
られた。組織は脱パラフィン化され、また過酸化物クエンチングを受けた。Zyme
d（サンフランシスコ市、カリフォルニア州）から入手可能な組織染色キットを
使用して、遮断後、切片が4℃で一晩一次抗体に曝した。切片はその後に二次ビ
オチン化抗体により、製造業者のプロトコルによりインキュベートされた。スト
レプタビジン−HRPコンジュゲートシステム（Zymed）による短いインキュベート
の後、クロモゲン基板アミノエチルカルバゾールを使用して現像した。製造業者
の指示書によりSigma社（セントルイス市、ミズーリ州）から入手可能なキット
を使用して、過ヨウ素酸−シッフ（PAS）染色が行われた。

【００４３】胎児性上皮−間充識細胞共培養物のTUNEL分析 アポトーシスの空間的誘導がBoehringer Mannheim社から入手可能なIn Situ細
胞死検出キットを使用して上皮−間充識細胞共培養物で、あるいは肺異種間移植
片で分析された。手短に言うと、共培養細胞は溶媒、EMAP II (3.2μg/ml)、EMA
P II抗体（6μg/ml）あるいはウサギIgGに曝した。アトポーシスに関しては、細
胞は第1日目から第3日目までで評価された。細胞は、4％パラホルムアルデヒド
で固定され、0.1％トリトン−Xにより透過性を上げて、またTUNEL反応に曝され
た（反応緩衝液中に末端デオキシヌクレオチジル転移酵素とヌクレオチド混合液
を含有）。その後、細胞はフルオロレセイン抗体に曝され、プロピジウムヨード
により対比染色され（0.05μg/ml）、PBS/グリセロールと一緒に顕微鏡に載置さ
れ、蛍光顕微鏡（オリンパス社）下で観察された。肺異種間移植片は4％パラホ
ルムアルデヒドで固定され、脱水され、またパラフィン包埋された。TUNEL反応
への曝露前に、5ミクロン切片が切断され、再び脱水された。アルカリホスファ
ターゼを使用してアポトーシス細胞が示され、また光学顕微鏡下で観察された。

【００４４】 統計：統計学的分析が、コンピュータプログラムスタットビュー上の学生版t
−検定ソフトを使用して行われた。

【００４５】ＩＩ．結果 組換えEMAP IIの精製 肺の発達期におけるEMAP IIの機能を正確に確定するためには、組換えEMAP II
のための簡単で再現性のある生産システムを開発することが重要であった。われ
われは、在来の条件下で成熟rEMAP IIを迅速かつ効率的に分離するPET28a 6X Hi
s-標識システムを使用した。組換え(r)EMAP IIはE. coliで発現され（クーマシ
ーブルーゲルで示され、第1コラム図1）、1〜4 mM IPTGにより誘導され、またE.
coliは誘導後3〜4時間後にペレット化された（第2カラム図1）。EMAP IIの精製
された組換え成熟型（カラム3、図1）は還元および非還元SDS−PGEの両方の上に
MR 23kDa (6X His標識付き)を有していた。TNF−αの誘導と単核細胞の移入［Ka
o、1994＃44］により測定されたrEMAP IIの活性は、meth A−誘導EMAP IIで以前
に観察されたものと密接に類似していることが判明した。LPS値は、LALキット（
Biowhittaker QCL-1000）により測定されたものは<15 pg/mlであった。加熱処理
されたEMAP IIがこれらの分析では不活性であった。ウサギで生成されたペプチ
ド抗体は、EMAP IIに特異的であり、過剰EMAP IIによりインキュベートされた後
に遮断されるウエスタン分析上の単一バンドを生成することにより同定される（
データは図示せず）。

【００４６】胎児性肺血管発達に関するEMAP II 胎児性肺の新生血管形成におけるEMAP IIの役割をより良く定義するために、
妊娠14.5日齢で得られたマウスの肺がヌードマウスの皮下に移植された。マウス
はその後、14日間毎日、溶媒か、あるいはrEMAP II (1μg/日)かのいずれかを腹
腔内に投与された。マウスの別のグループはEMAP II遮断抗体(25ないしは50μg)
か、あるいはウサギIgGかのいずれかにより14日の間3日毎に処置された。肺移植
片はその後に切除され、PECAM−1、ヘマトキシリンおよびエオシン染色をそれぞ
れ使用して血管と構造的な発達に関して評価された。溶媒だけで治療されたマウ
スに移植された異種間肺移植片に比べて、抗新脈管形成タンパク質EMAP IIを受
容したマウスでの移植片は肺脈管形成において56％という驚くべき減少を示した
。対照における肺脈管形成（図2A）（PECAM−1抗体により高倍率視野により同定
される脈管の数を数えることにより評価）と、EMAP II治療（図2B、D）動物の間
の差は学生版t−検定ソフト（p<0.0001）により統計的に高度に有意なものであ
った。対照的に、EMAP IIに対する遮断抗体を受容した動物は、高倍率視野毎に
脈管数で50％（p<0.0001）という有意な投与依存性の増加をみた（図2C、E）（n
=10移植／群、3回の別々の機会に行われた）。これらの組織学的発見と軌を一に
して、rEMAP IIにより治療された動物の肺の異種間移植片から収集されたmRNAは
、対照に比較して、RT−PCR法によりPECAM−1とTie−2で減少を示した。その逆
のけっかであるPECAM−1とTie−2 PCR産物での増加が、遮断EMAP II抗体により
治療された動物の異種間移植片から得られた（図2F）。PECAM−1とTie−2転写の
PCR増幅に関するネガティブコントロールは、RTを行わなかったが、各rxnにおけ
る特定PCR産物を示した（データは図示せず）。

【００４７】EMAP IIは上皮成熟を阻害する 肺の血管形成は上皮細胞分化に影響を与えるのではないかということを前提に
した。rEMAP IIの投与後に、これらのマウスにおける肺の異種間移植片の組織学
的分析は、溶媒治療動物（図3A〜C）に比べて構造的成熟の顕著な阻害を示した
（図3D〜F）。これは、溶媒のみを投与したマウスにおける移植片（図3B、C）に
比べて、明確な特徴的な上皮を伴う気管支の欠如（図3A）あるいは肺胞上皮と軌
を一にして減衰した上皮を伴う遠位の気道により示された。さらに、溶媒のみを
投与したマウスにおける移植片（図3A）に比べて、EMAP IIで処置されたマウス
における肺異種間移植片には異形成がみられた肺胞上皮細胞（図3E、F）と、呼
吸器気管形成でうっ血してみえる肺胞上皮細胞（図3D、矢印）を有していた。形
態形成進行が実際に起こっているかどうかをはっきりと認めるために、我々は遠
位の肺の形態形成マーカーについて異種間移植片を評価した。溶媒のみを受容し
たマウスにおける肺異種間移植片は、SP−C発現によりマーカーされたII型肺胞
細胞分化を受けた（図4A、B）。対照的に、EMAP IIを受容した動物における肺異
種間移植片は、もっとも周辺にある気道でも、移植された肺全体を通じて、SP−
C発現では著しい減少をみせた（図4C、D）。さらに、我々の発見したものを支持
するものとしては、遮断EMAP II抗体を受容した動物は、SP−Cを発現した基本的
にすべての遠位の上皮細胞で、II型細胞の数が驚くほど増加したことが挙げられ
る（図4E、F）。したがって、過剰EMAP IIは周辺部の肺の上皮形態形成と分化の
徹底した阻害につながる。

【００４８】 In situハイブリダイゼーションで発見したものと軌を一にして、rEMAP IIで
処置された動物の肺異種間移植片から収集されたmRNAは、対照に比べて、RT−PC
R法によりSP−Cの減少を示した。対照的に、遮断EMAP II抗体により治療された
動物はin situの結果を確認するSP−Cアンプリコンにおいて増加を示した（図4G
）。興味深いことに、T1−αのI型肺胞上皮細胞マーカーは、rEMAP IIにより治
療された異種間移植片において少々上昇し、一方、T1−αにおける顕著な減少が
、遮断EMAP II抗体で治療された肺ではみられ、SP−C発現の高値の反対に減少、
II型細胞マーカーの減少がみられた（図4G）。SP−CとT1−αの転写のPCR増幅に
関するネガティブコントロールは、RTを実施しなかったが、各rxnにおいて特定
のPCR産物を示さなかった（データは図示せず）。

【００４９】 我々はまた、肺異種間移植片におけるグリコーゲン産生を評価した。rEMAP II
により治療されたマウスから得られた異種間移植片は、溶媒のみ（図5A〜C）に
比べて、過剰グリコーゲン産生を示しており（マジェンタ色により示す）（図5D
〜F）、さらにEMAP IIが上皮分化を阻害したという考え方を支持した。

【００５０】上皮−間充識インターフェイスのEMAP II崩壊 肺形態形成における抗新脈管形成タンパク質EMAP IIの役割をさらに調べるた
めに、上皮−間充識共培養におけるEMAP IIの局在化が明確化された。インキュ
ベーションの3日後の肺上皮−間充識共培養の評価では、胎児肺組織でみられる
結果と軌を一にして、免疫組織化学（図6B）だけではなく、in situハイブリダ
イゼーション（図6A）の両方ともにより周辺上皮嚢胞領域においてEMAP IIが優
勢であることが明らかになった［Schwarz, Am. J. Physiol. 276, L365-75 (199
9)］。興味深いことに、EMAP IIが上皮および間充識細胞において発現される一
方で、そのもっとも強力な発現が、図6A中の矢印により示されているように、上
皮−間充識接合部でみられることが特記される。

【００５１】 上皮嚢胞形成上のEMAP IIの効果を測定するために、上皮−間充識共培養が、r
EMAP II、EMAP II遮断抗体あるいは溶媒（それぞれ、PBSあるいはウサギIgG）の
増加させた濃度に曝した。上皮嚢胞形成は、高倍率視野（HPF）により形成され
た嚢胞の全数として分析された。そこでは、対照（図7A、矢印は平坦化ラミニン
陽性細胞により囲まれた上皮細胞による正常上皮嚢胞形成を示す）と比較して、
投与依存性である、上皮嚢胞形成の71％の阻害（p<0.0001）と、EMAP IIに曝さ
れた共培養物では構造上改変がみられた（図7B、D）。反対に、EMAP II遮断抗体
の存在下で（図7C、E）、投与依存性でもあった嚢胞形成における54％増加（p<0
.01）がみられた。我々は最近、上皮細胞を成長させ、また分裂される際にEMAP
IIがアポトーシスを誘導するのを観察し［Schwarz, Journal of Experimental.
Medicine 290 (1999)］、我々は、EMAP IIによるアポトーシスの誘導が、上皮細
胞の数の減少に対する原因となっていたかどうかを正確に確定するために、TUNE
L分析法を用いた。われわれは、対照に比べて、周辺の上皮嚢胞領域で開始し、
またrEMAP IIで治療された、共培養物の上皮嚢胞全体を含むように進行する、時
間依存性のアポトーシス誘導を見出している（データは図示せず）。アポトーシ
スはまた、対照に比較して、EMAP II遮断抗体に曝された培養物で顕著に減少し
た。われわれがin vitroで発見したものと軌を一にして、EMAP IIにより治療さ
れた動物における肺異種間移植片は、上皮細胞に局在化しているアポトーシスの
顕著な増加をみせた（データは図示せず）。

【００５２】 前記は本発明を説明するものであり、また前記は限定するものとして解釈され
るべきものではない。本発明は特許請求の範囲と、そこに含められるべき、請求
項と等価なものとにより定義される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 組換え（r）EMAP IIの精製。PET28a6X his標識システムにおけるrEMAP IIは大
腸菌（E.coli）からイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）誘導後に分離された
。このクーマーシーブルーゲル上にあるレーン1はrEMAP IIの最初の発現である
。レーン2はIPTGによるrEMAP II誘導を示し、またレーン3では、精製されたrEMA
P IIが示されている。

【図２】 EMAP IIは胎児の肺血管の発達を阻害する。rEMAP II、EMAPII抗体あるいは溶
媒（それぞれPBSあるいはウサギ血清）により腹腔内（IP）的に治療された免疫
無防備状態のマウスに皮下的に移植された胎児肺異種間移植では、移植後14日後
に、PECAM−1を使用して血管形成を評価された。溶媒のみ（図2A）と比較してrE
MAP II（図2B）を受けているマウスの移植において新生血管形成の著しい阻害が
みられた。HPF毎の血管数（肺移植毎の10 HPFから得られる平均数、n＝20移植／
群、4回の別個の機会に行われた）を数えることにより評価される血管形成の分
析では、対象（図2D）（p<0.0001）に比較してrEMAP IIを受けている動物におけ
る新生血管形成で56%の減少を示した。これは、対照（図2E）（n=10移植／群、3
回の別個の機会に行われた）に比較して血管数で投与依存性に50%増加がみられ
たEMAP IIを受けた動物（p<0.0001）（2C）での移植とは著しく対照的なもので
あった。EMAPIIにより治療を受けたマウスからの肺異種間移植におけるポリメラ
ーゼチェーン反応（PCR）法によるPECAM−1バンドとTieバンドmRNAでの減少と、
EMAP II抗体により治療を受けた動物におけるPECAM−1バンドとTieバンドmRNAで
の増加が免疫組織化学的な結果として確かめられた（図2F）。RT−PCR法による
結果は、内的対照としてβ−アクチンを使用して標準化された。PECAM−1とTie
−2転写のPCR増幅に関するネガティブコントロールでは、RTせずに、各rxn（デ
ータは図示せず）で特定PCR産物が示されることはなかった。横棒＝500μｍであ
る。

【図３】 EMAP IIが過剰である場合は、肺の上皮形態に変化がみられるようになる。rEM
AP IIによる処置を受けたマウスでの肺異種間移植は、中央気道領域にある扁平
上皮細胞の存在（図3Dに矢印）と貧弱に形成された末梢気道（図3E、F）により
規定される、顕著な肺異形成を示した。これは、よく明確な気管支、上皮（図3A
）と、肺胞（図3B、C）と軌を一にして減衰した上皮を伴う遠位側腔となった、
溶媒により処置されたマウスでの移植部分とは顕著な対照をみせている。A、B、
D、Eの横棒＝500μm、C、Fの横棒＝250μmである。

【図４】 過剰なEMAP IIは胎児の肺発生における細胞分化を有意に変える。胎児肺異種
間移植は、溶媒のみの存在下で免疫無防備状態のマウス（図4A、B）での移植の1
4日後に、SP-Cを発現したII型肺胞細胞の外見を伴う細胞分化を受けた。対照的
に、過剰rEMAP II を腹腔内的に投与した動物は、異形成末梢気道として組織学
的に出現した区域を含む異種間移植全体を通じてSP-C発現は示していない（図4C
、D）。対照的に、遮断EMAP II抗体により治療を受けた動物での異種間移植でII
型細胞過剰がみられる（図4E、F）。これは、肺上皮成熟において、EMAP IIの顕
著な効果を示すものである。これらのin situハイブリダイゼーションによる発
見は、対照およびEMAP II抗体により治療を受けた動物における増加と比較してE
MAP IIにより治療されたマウスから得られる肺異種間移植におけるSP-C RNAにお
ける減少によって支持された（図4G）。I型肺胞細胞マーカーの評価により、対
照と比較してrEMAP IIにより治療された異種間移植でのT1-α値のわずかな上昇
が明らかになった。II型細胞でのSP-Cのin situハイブリダイゼーションの高い
値とは反対に、遮断EMAP IIによる処置を受けた動物における異種間移植でのT1-
α値の顕著な減少もまたみられた（図4G）。RT-PCR法による結果は、ハウスキー
ピング遺伝子β-アクチン（350bp）を使用して標準化された。ネガティブコント
ロールではバンドには表わされなかった（データ図示せず）。A、C、Eでは横棒
＝500μmであり、B、D、Fでは横棒＝250μmである。

【図５】 異種間内のグリコーゲンに関する過剰なrEMAP IIの効果。グリコーゲン（PAS
染色のマジェンタ色として表わされる）は、rEMAP II により腹腔に治療された
マウスでの肺移植では顕著に上昇している（図5D〜F）。対照的に、溶媒で治療
されたマウスにおける異種間移植片にはグリコーゲンの正規分布が包摂され、こ
れは後期嚢状段階でみられるものと一致している（図5A〜C）。このように、過
剰EMAP IIが存在する場合には、グリコーゲン豊富上皮段階では、肺胞II型上皮
細胞分化のすぐ前である、小管（血管）段階の始まりと関連して肺形成が停止し
ているようにみえる。A、B、D、Eでは横棒＝500μmであり、C、Fでは250μmであ
る。

【図６】 EMAP IIのin situハイブリダイゼーションでは、免疫組織化学により確かめら
れるEMAP II発現（図6A）の上皮細胞周囲細胞パターンを示している（図6B）。
遠位の間充識細胞でのEMAP IIの非常に少ない産生とは対照的に、上皮細胞と密
接に接触している間充識細胞では、図6Bに矢印で示されているように、EMAP II
の顕著な増加を示している。したがって、上皮と間充識細胞におけるEMAP IIの
発現に加えて、これはEMAP IIの発現を増加させる上皮と間充識細胞の間にある
実際に起こっている細胞間相互作用であると考えられる。A、Cでは横棒＝500μm
であり、B、Dでは250μmである。

【図７】 共培養での上皮嚢胞形成に関するEMAP IIの効果。過剰rEMAP IIに曝した上皮
と間充識細胞の共培養では、溶媒のみ（図7A）に比較すると、投与依存性に上皮
嚢胞形成（図7B）が71％という顕著な減少をみせている。さらに、嚢胞を取り囲
むラミニン細胞集団と軌を一にして、扁平細胞集団（図7Aのはめ込み写真の矢印
）により囲まれている図7Aのはめ込み写真中に示されている正常嚢胞形成とは対
照的に、EMAP II、あるいはEMAP II抗体（図7C、写真中にはめ込み）で処置され
た共培養のものは正常嚢胞形成を欠いている。対照的に、EMAP II抗体の存在下
で成長した共培養では、これも性質上投与依存性である嚢胞形成（図7C）におい
て54％の増加をみせている（図7E）。われわれは過剰EMAP IIは上皮嚢胞形成と
安定を干渉していると推測する。（n＝7移植／群、4回の異なる機会で行われた
）A〜Cでは横棒＝500μmであり、A〜Cのはめ込み写真では250μmである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｃ０８５ 11/00 11/00 ４Ｈ０４５ 43/00 １０１ 43/00 １０１ Ｃ０７Ｋ 2/00 Ｃ０７Ｋ 2/00 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＣＣ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 ＺＮＡＡ 1/68 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｍ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＣＣＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ ，ＺＷ (72)発明者 ツァン，ファンロン アメリカ合衆国カリフォルニア州90026， ロス・アンジェルス，マッカラム・ストリ ート 1741 (72)発明者 ゲッブ，サラ・エイ アメリカ合衆国コロラド州80237，デンヴ ァー，サウス・ウォバッシュ・ストリート 4021 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB26 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 CA04 CA09 CA11 DA06 EA04 GA11 HA13 HA14 4B063 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QR32 QR36 QR40 QR56 QR77 QS34 QX02 QX10 4C076 AA12 BB11 CC11 CC15 DD23D FF14 4C084 AA17 AA24 MA02 NA14 ZA361 ZA591 ZB211 ZC422 ZC752 4C085 AA13 BB11 EE03 4H045 AA10 AA11 AA30 BA09 BA10 CA40 DA75 EA20 EA50 FA10 FA71

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 患者の血管増殖を刺激するのに効果的な分量で、前記患者に
   おいてEMAP II活性を阻害するステップを含む、治療を必要とする患者において
   血管成長を促進する方法。
2. 【請求項２】 前記阻害ステップが、前記患者の血管成長を刺激するのに効
   果的な分量で、EMAP IIに特異的に結合する化合物を前記患者に投与することに
   より実施される請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記阻害ステップが、前記患者の血管成長を刺激するのに効
   果的な分量で、前記患者におけるEMAP II発現をダウンレギュレーションするこ
   とにより実施される請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記阻害ステップが、前記患者の血管成長を刺激するのに効
   果的な分量で、EMAP II受容体アンタゴニストを前記患者に投与することにより
   実施される請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記患者が、肺に虚血性再灌流障害の危険があり、前記阻害
   ステップが、前記患者の虚血性再灌流障害を抑制するために実施される請求項１
   に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記患者が新生児患者であり、前記阻害ステップが前記患者
   の気管支肺の異形成を抑制するために実施される請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 患者の血管成長を促進するために有用な化合物をスクリーニ
   ングする方法であって、 EMAP IIおよびその断片からなる群から選択されるプローブ分子に、検査化合
   物を接触させるステップと、 前記プローブ分子に対する前記検査化合物の結合の有無を検出するステップで
   あって、その結合の存在により、前記検査化合物は患者の血管成長を促進するた
   めに有用であることが示されるステップと を含む方法。
8. 【請求項８】 前記検査化合物が、コンビナトリアルライブラリーのメンバ
   ーである請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記検査化合物が、タンパク質あるいはペプチドである請求
   項７に記載の方法。
10. 【請求項１０】 患者の血管成長を促進するために有用な化合物をスクリー
    ニングするための方法であって、 EMAP IIをコードするDNA、EMAP IIをコードするRNA、およびそれらの断片から
    なる群から選択されるプローブ分子に検査化合物を接触させるステップと、 前記プローブ分子に対する前記検査化合物の結合の有無を検出するステップで
    あって、その結合の存在により、前記検査化合物は患者の血管成長を促進するた
    めに有用であることが示されるステップと を含む方法。
11. 【請求項１１】 前記検査化合物が、コンビナトリアルライブラリーのメン
    バーである請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記検査化合物が、オリゴヌクレオチドである請求項１０
    に記載の方法。
13. 【請求項１３】 患者の血管成長を促進するために有用な化合物をスクリー
    ニングする方法であって、 検査化合物がEMAP IIの発現を阻害しているかどうかをin vitroで決定するス
    テップであって、EMAP IIの発現の阻害により前記化合物が患者における血管成
    長を促進するために有用であることが示されるステップ を含む方法。
14. 【請求項１４】 前記決定ステップは、細胞の中で実施される請求項１３に
    記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記決定ステップは、前記化合物がEMAP IIの転写を阻害
    するかどうかを決定することを含む請求項１３に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記決定ステップは、前記化合物がEMAP IIの翻訳を阻害
    するかどうかを決定することを含む請求項１３に記載の方法。
17. 【請求項１７】 EMAP IIに特異的に結合する化合物、EMAP IIの発現を阻害
    する化合物、およびEMAP II受容体アンタゴニストからなる群から選択される活
    性化合物と、 製薬的に受容可能なキャリアーと を含んでなる製薬製剤。
18. 【請求項１８】 前記製薬的に受容可能なキャリアーが、滅菌生理食塩水溶
    液である請求項１７に記載の製薬製剤。
19. 【請求項１９】 前記活性化合物が、約0.001から50重量％の分量で、前記
    製薬的に受容可能なキャリアー溶液の中に含まれる請求項１７に記載の製薬製剤
    。
20. 【請求項２０】 前記活性化合物は、EMAP IIに特異的に結合する抗体であ
    る請求項１７に記載の製薬製剤。