CN103153298B - 用于改善胃肠功能的材料和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了治疗组合物及其用于治疗或改善小肠黏膜损伤的用途。在一些优选的实施方案中，所述组合物包含一种或更多种获得或保持相当大吸收能力的营养物和/或电解质。

Description

用于改善胃肠功能的材料和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年9月24日提交的序列号为61/386,317之美国临时申请和2011年1月11日提交的序列号61/431,629之美国临时申请的优先权，其通过引用整体并入本文。

政府支持

本发明在由美国国立卫生研究院(NIH)授予的基金N_o.RC2-AI-087580的政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。

背景技术

辐射(radiation)是用于腹部和骨盆中恶性肿瘤的常用治疗，它可对由快速分裂的肠上皮细胞构成的胃肠(GI)道衬里(lining)造成严重损伤。辐射对胃肠系统的毒性作用引起症状如恶心、呕吐、腹泻、电解质失衡(electrolyteimbalance)和脱水，并且不利地影响患者在癌症治疗过程中的恢复。即便在低剂量下，辐照(irradiation)后数天内也观察到小肠绒毛和刷状缘的连续损失。虽然隐窝细胞(cryptcell)可在轻度至中度剂量的(辐照)IR之后快速地重新填充(repopulate)该区域，但是它们在高剂量的辐照后变得以对数速度损失。

辐照对发生营养物和电解质吸收的绒毛上皮特别有破坏性。绒毛上皮经历连续的细胞损失和再生过程，其中持续供应的未成熟肠细胞(源自位于利伯屈恩隐窝(cryptsofLieberkuhn)下极(lowerpole)内的祖细胞)从隐窝基底部的增殖区室(proliferativecompartment)迁移到达绒毛的顶部。在它们短暂的寿命期间，这些肠细胞沿着隐窝-绒毛轴(crypt-villousaxis)逐渐地成熟成为绒毛细胞。对腹部和骨盆区域进行的放射治疗不仅破坏现有的绒毛细胞，而且破坏形成新绒毛细胞的肠细胞，因此，即便在中等剂量下也可耗尽几乎整个绒毛上皮。

由于越来越多地使用高的总放射剂量和细胞毒性剂，放射治疗因其急性GI毒性而复杂化。对GI道的损伤不仅导致营养物和流体的吸收不良和损失，而且破坏肠屏障功能。肠漏(leakygut)允许病原体容易穿过黏膜屏障而进入，引起炎症、菌血症和内毒素血症。例如，虽然GI毒性通常在较高剂量下发生，但是在辐照后数天内可发生急性放射性肠炎、腹泻和腹痛，即便在低至5～12Gy(辐射的常规分割过程使用每分割1.8～2Gy)的剂量下也是如此。慢性放射性肠炎可在放射治疗后的18个月至6年中发生，但它也可在甚至15年后发生^27-29。

放射性肠炎的治疗选择是有限的。常规治疗方案包括：施用止泄剂以防止流体损失；施用蒙脱石(smectite)作为胆盐的吸附剂；施用阿片样物质以减轻胃痛或直肠痛，以及施用类固醇以减轻炎症。临床试验还研究了嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、蒙脱石或硫糖铝(sucralfate)对腹泻预防的效力，但仅实现了急性GI症状的中度减轻³⁰。

治疗放射性肠炎的常用方法是使用全肠胃外营养(totalparenteralnutrition，TPN)以提供肠休息。但是，仍然需要确定肠胃外营养是否满足患者的营养需求，或者实际上对放射性肠炎是否具有治疗效果。虽然TPN可纠正某些患者中的营养失衡，但是仍可发生严重的放射性肠炎³⁷。TPN还引起肠萎缩，通常在施用的48小时之内。TPN还削弱机械屏障和免疫屏障³⁸。

认为在TPN过程中导致黏膜萎缩的准确生物学机制(尚未确立)涉及局部营养-感知细胞信号³⁹和体液信号(例如胃肠激素)^40，41这二者。已显示TPN诱导肠血流量迅速(＜8h)降低(这先于绒毛萎缩)以及在24小时时抑制蛋白质合成和在48小时时抑制细胞增殖和存活⁴²。相反，经口饲喂迅速地提高新生动物和成熟动物中的肠血流量^43，44。类似地，在新生小猪中，肠内饲喂(enteralfeeding)几乎立即(在1至3小时之内)使门静脉血流量(portalbloodflow，PBF)提高至比食物剥夺小猪中的值高50％⁴⁵。因此，如多个研究所示，肠内饲喂远优于肠胃外饲喂^7，8。

目前，缺少可有效地缓解放射性肠炎的营养治疗。虽然早期研究表明，要素饮食(elementaldiet)或特定排除饮食(specificexclusiondiet)可在选定的情况下有益^2，31，32，但是后来，该方法的效力并未得到证实。现有饮食治疗仅为患有慢性放射性肠炎的营养不良患者提供营养支持方法。

动物研究证实，谷氨酰胺保护上GI道和下GI道二者的黏膜不受由化学治疗或放射治疗(RT)引起的损伤^33-35。但是，临床试验未能示出经口谷氨酰胺饲喂可在接受了骨盆放射治疗的患者中预防或缓解急性腹泻³⁶。因此，需要开发用于治疗辐照诱导之GI损伤的改进的饲喂组合物。如将通过以下公开内容而显而易见的那样，本发明提供了这些和另一些益处。

发明概述

本发明提供了用于改善小肠功能的治疗组合物和方法。本发明组合物可用于治疗或改善与小肠上皮细胞(特别是在绒毛区和刷状缘中)损失相关的胃肠损伤，和/或用于治疗或改善与小肠的吸收能力改变相关的疾病或病症。

有利地，可将本发明治疗组合物定制为适于由小肠上皮细胞的损失和小肠中转运蛋白功能的改变引起的胃肠系统的失衡吸收状态。在一个优选实施方案中，将本发明组合物配制为用于经口施用。

在一个实施方案中，治疗组合物包含以下、基本由以下组成或者由以下组成：选自赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺和丝氨酸中一种或更多种的游离氨基酸；以及任选的可药用载体、电解质、维生素、缓冲剂和矫味剂(flavoringagent)。治疗组合物通过肠内途径施用。在一个实施方案中，组合物的总摩尔渗透压浓度(osmolarity)为约230mosm至280mosm，或者优选为约250mosm至260mosm。在一个实施方案中，组合物的pH为约7.1至7.9，优选为约7.4。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物不包含葡萄糖、谷氨酰胺、甲硫氨酸和/或乳糖。

还提供了用于治疗或改善与小肠上皮细胞(特别是绒毛区和刷状缘中)损失相关之疾病或症状，和与小肠上皮中转运蛋白功能改变相关之疾病或症状的方法。所述方法包括通过肠内途径向有此治疗需要的对象施用有效量的本发明组合物。优选地，本发明组合物经口施用并且到达对象的肠。

本发明还提供了用于制备治疗组合物的方法，和用于通过选择在小肠上皮细胞破坏之后保持或获得相当大吸收能力的营养物或电解质来筛选用于包含到本发明治疗/饮食组合物中的营养物或电解质的方法。这些方法可适用于个体患者，从而有助于开发特别设计以满足个体患者之需要的组合物和方法。

附图简述

图1示出辐照(IR)对净阴离子分泌(netanionsecretion)(A)和电导(B)的影响。(A).在第1、3和4天研究12GyIR组织。在第2天见到I_sc的最大升高。箭头表示添加毛喉素(forskolin)时的时间点。(B).提高剂量的IR对净阴离子分泌的影响。在第6天研究所有这些组织，且n＝12。结果示出电导的IR剂量依赖性升高。

图2示出随着辐照剂量提高，I_sc的变化。所有这些值得自n＝24个组织。在辐照后第4天于常规林格液(Ringersolution)中进行实验，室两侧的总摩尔渗透压浓度为296mosm。组织病理学切片示出，与0Gy相比，3Gy时最小的绒毛和隐窝损伤和7Gy时广泛的绒毛和隐窝损伤。

图3A示出以3Gy辐照后，小鼠上皮细胞中的I_sc随时间推移的变化。值表示平均值±S.E.M，n＝6个组织。在放射后第6天见到I_sc的最大升高。第5、6与7天之间未见到显著性差异。随着时间＞辐照后7天，与第5、6或7天相比，I_sc稍微降低。第5、6和7天的I_sc值类似。图3B示出小肠上皮细胞的离子转运。图3C示出布美他尼(bumetanide)对未经辐照的组织和经3Gy辐照的组织中的基础的I_sc和cAMP-刺激的I_sc的影响。图3D示出HCO₃ ^-对净阴离子分泌的贡献。其通过用等摩尔量的羟乙基磺酸盐(isethionate)来替换林格液中的Cl^-来确定。毛喉素刺激了0Gy(＊：p＜0.02)组织中I_sc的升高，但在3Gy组织中并非如此。图3E示出浴(bath)Na⁺对HCO₃ ^-分泌的影响。图3所示的所有结果来自n＝6个组织。误差线表示SEM。

图4A示出IR后血浆内毒素水平的变化。在IR后第6天，测量血浆内毒素水平。图4B示出针对膜电压变化(稀释电势，dilutionpotential)绘出的Cl^-与Na⁺之间渗透性比值(permeabilityratio)的变化。以7Gy辐照导致选择性的完全丧失。

图5示出辐照使炎性介质(包括IL-1β、TNFα和MIP-α)的水平升高。

图6示出由辐照引起的HCO₃ ^-分泌的变化和HCO₃ ^-分泌机制的免疫染色。(A)示出辐照对浴Na⁺对HCO₃ ^-分泌的影响。实验在A)具有140mMNa⁺的含Cl溶液或B)没有Na⁺的含Cl溶液中进行。用毛喉素刺激组织。比较经0Gy辐照的小鼠和经3Gy辐照的小鼠的HCO₃ ^-分泌。与经3Gy辐照的小鼠相比，在经0Gy辐照的小鼠中观察到了显著更高的浴Na⁺依赖性HCO₃ ^-分泌(p＜0.001)。结果得自n＝6个组织。误差线表示S.E.M。(B-E)示出使用NBCe1a/b抗体，接受了0Gy辐照和3Gy辐照的小鼠的空肠组织的免疫染色。

图7示出葡萄糖转运和动力学的IR剂量依赖性变化。(A)示出辐照导致在尤斯室(Ussingchamber)中测量的葡萄糖刺激的Na⁺I_sc剂量依赖性地降低。(B)示出随着辐照剂量提高，葡萄糖的SGLT1亲和力降低。

图8示出从以1Gy辐照开始，辐照以剂量依赖的方式降低葡萄糖刺激的电流。以7Gy辐照几乎使葡萄糖转运完全失活。

图9显示短路电流，示出随着葡萄糖浓度之升高的饱和动力学。特别地，葡萄糖转运在浓度为4mM时饱和。图9B示出Km值的辐照剂量依赖性升高。在7Gy时观察到K_m的最大升高。这表明辐照引起SGLT-1与葡萄糖的亲和力降低。

图10示出V_max随辐照剂量升高而降低。在7Gy时观察到V_max的最小降低。这表明辐照引起用于葡萄糖转运的功能性SGLT-1减少。

图11示出Km随辐照后时间推移的变化。Km在辐照后立即升高并在辐照后约14天恢复至正常(对照值)。

图12A和B示出9Gy和15.6Gy辐照之后，鼠存活研究的结果。经葡萄糖处理的小鼠在第5和第7天开始发生死亡，而对照小鼠直至辐照后第10天才死亡。在第20天，30％的对照小鼠活着，而经葡萄糖处理的小鼠在第20天均未存活。

图13示出全细胞裂解物中SGLT-1蛋白水平的Western印迹分析。结果示出辐照提高了SGLT-1表达。

图14示出空肠组织的刷状缘膜囊中SGLT-1蛋白水平的W_est_ern印迹分析。辐照以剂量依赖的方式提高了SGLT-1蛋白水平。在结肠组织中未检测到SGLT-1蛋白。

图15示出辐照引起谷氨酰胺刺激的I_sc剂量依赖性地升高。

图16示出辐照引起赖氨酸刺激的I_sc剂量依赖性地降低。

图17A和B示出IR后赖氨酸(A)或葡萄糖(B)处理之后的小鼠存活率。施用赖氨酸导致升高的存活，而施用葡萄糖导致降低的存活。

图18示出多种转运蛋白的Western印迹分析。Western印迹分析示出小鼠空肠中的NKCC1(A)、CFTR(C)和NBCe1-A/B(B)蛋白水平。从左到右，泳道表示0Gy、1Gy、3Gy、5Gy和7Gy。从1Gy至5Gy，辐照使NKCC1蛋白水平升高，这样的升高在7Gy时减小(A)。辐照后，NBCe1-A/B蛋白水平显著降低。与0Gy相比，以3Gy辐照后，空肠组织中CFTR蛋白水平显著升高(C)。与十二指肠、回肠或结肠相比，空肠具有最高的NBCe1-A/B蛋白水平(D)。在辐照后第6天收获组织用于Western印迹。

图19A和B是cAMP-刺激的(A)和辐照诱导的(B)阴离子分泌的图解模式。

图20示出经5-氟尿嘧啶(5-FU)(图20A)和顺铂(图20B)处理的小鼠中小肠黏膜的损伤。(A)示出注射了5-FU的小鼠中的Isc变化。(B)示出注射了顺铂的小鼠中的Isc变化。

图21示出施用本发明的治疗组合物提高了已接受5-FU的小鼠的小肠功能。

发明详述

本发明提供了用于提高小肠功能的治疗组合物和方法。该组合物被配制为用于经肠施用(enteraladministration)。本发明的组合物和方法尤其可用于治疗或改善与小肠上皮细胞(特别是绒毛区和刷状缘中)的损失相关的胃肠损伤，和/或用于治疗与小肠上皮中转运蛋白功能的改变相关的疾病或病症。

有利地，可将本发明治疗组合物定制为适于由小肠上皮细胞(特别是小肠绒毛区和刷状缘中)之损失及转运蛋白功能之改变引起的胃肠系统的失衡吸收状态。特别地，本发明可在有小肠黏膜损伤的患者中改善小肠黏膜愈合、恢复小肠功能、增强液体潴留、预防或缓解小肠萎缩，和/或恢复或增强小肠屏障功能。

在一个实施方案中，治疗组合物包含以下、基本由以下组成或者由以下组成：选自赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺和丝氨酸中的一种或更多种游离氨基酸；以及任选地，可药用载体、电解质、维生素、缓冲剂和矫味剂。治疗组合物通过经肠途径施用。在一个实施方案中，组合物的总摩尔渗透压浓度为约230mosm至280mosm，或者优选为约250mosm至260mosm。在一个实施方案中，组合物的pH为约4.0至8.5，优选为5.0至8.2，更优选为6.0至8.0，更优选为7.1至7.9，最优选为约7.4。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物不包含葡萄糖、谷氨酰胺、甲硫氨酸和/或乳糖。

还提供了用于治疗或改善与小肠上皮细胞(特别是绒毛区和刷状缘中)损失相关之疾病或病症和与小肠上皮中转运蛋白功能改变相关之疾病或病症的方法。该方法包括通过经肠途径向有此治疗需要的对象施用有效量的本发明组合物。

本发明至少部分地基于这样的发现：在小肠黏膜损伤之后，仅以保持或获得充分吸收能力的营养物向对象进行经肠饲喂改善黏膜愈合、恢复小肠功能、增强流体潴留，以及缓解一系列相关疾病症状，所述症状包括但不限于吸收不良、腹泻、恶心、呕吐、电解质失衡和脱水。

根据本发明，已确定，辐射和化学治疗之后，参照例如葡萄糖、谷氨酰胺和赖氨酸以及电解质(如Na⁺、HCO₃ ^-和Cl^-)观察到了转运蛋白功能的改变。此外，辐照引起升高的净阴离子分泌。营养物和电解质吸收能力的改变在辐射和化学治疗后立即发生，但吸收能力可恢复至正常(在小鼠模型中，辐照后约8至14天)。

具体地，辐照引起葡萄糖吸收辐照剂量依赖地降低，这是由于钠依赖的葡萄糖转运系统(SGLT-1)对葡萄糖的亲和力下降。对葡萄糖刺激的功能性研究示出，辐照引起葡萄糖转运活性剂量依赖性地下降以及SGLT-1对葡萄糖的亲和力下降。

已知肠腔中未吸收营养物或溶质的存在可引起渗透性腹泻。根据本发明，已发现对经辐照对象经口饲喂葡萄糖和/或谷氨酰胺引起渗透性腹泻和降低的存活，而经口饲喂选自以下的每种氨基酸或其组合延长存活：赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺和/或丝氨酸。

用于升高小肠功能的治疗组合物

在一个方面，本发明提供了用于提高小肠功能的治疗组合物。在一个实施方案中，治疗组合物包含以下、基本由以下组成或者由以下组成：选自赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺和丝氨酸中的一种或更多种游离氨基酸；以及任选地，可药用载体、电解质、维生素、缓冲剂和矫味剂。治疗组合物通过经肠途径施用。

优选地，组合物是弱碱性的，并且与小肠上皮细胞(如小肠的绒毛细胞和隐窝细胞)的渗透压相比是低渗的。优选地，本发明组合物包含水。优选地，将组合物配制为用于提高因绒毛上皮细胞的损失或损伤而被破坏之小肠功能的经口再水化饮品(oralrehydrationdrink)。

在一个实施方案中，组合物的总摩尔渗透压浓度为约230mosm至280mosm，或者其间的任何值。优选地，总摩尔渗透压浓度为约250mosm至260mosm。在另一个实施方案中，组合物的总摩尔渗透压浓度为低于280mosm的任何值。

在一个实施方案中，组合物的pH为约7.1至7.9，或其间的任何值。优选地，组合物的pH为约7.3至7.5，更优选为约7.4。

在某些实施方案中，各游离氨基酸可以4mM至40mM或其间任何值的浓度存在，其中组合物的总摩尔渗透压浓度为约230mosm至280mosm。或者，如果基于mg/l计算氨基酸浓度，则各游离氨基酸可以300mg/l至8000mg/L或其间任何值的浓度存在，其中组合物的总摩尔渗透压浓度为约240mosm至280mosm。

在某些具体的实施方案中，治疗组合物包含以如下各浓度存在的一种或更多种游离氨基酸：浓度为约730mg/l至6575mg/l或其间任何值的赖氨酸；浓度为约532mg/l至4792mg/l或其间任何值的天冬氨酸；浓度为约300mg/l至2703mg/l或其间任何值的甘氨酸；浓度为约525mg/l至4722mg/l或其间任何值的异亮氨酸；浓度为约476mg/l至4288mg/l或其间任何值的苏氨酸；浓度为约725mg/l至6523mg/l或其间任何值的酪氨酸；浓度为约469mg/l至4217mg/l或其间任何值的缬氨酸；浓度为约817mg/l至7352mg/l或其间任何值的色氨酸；浓度为约528mg/l至4756mg/l或其间任何值的天冬酰胺；和/或浓度为约420mg/l至3784mg/l或其间任何值的丝氨酸；其中，组合物的总摩尔渗透压浓度为约240mosm至280mosm。

在一个实施方案中，本发明提供了包含以下组分的饮品：赖氨酸(11mosm至21mosm)、天冬氨酸(3mosm至13mosm)、甘氨酸(19mosm至29mosm)、异亮氨酸(19mosm至29mosm)、苏氨酸(19mosm至29mosm)、酪氨酸(0.5mosm至5mosm)、缬氨酸(19mosm至29mosm)、色氨酸(5mosm至20mosm)、天冬酰胺(3mosm至13mosm)和丝氨酸(3mosm至8mosm)或这些成分的子集(subset)。

在一个具体的实施方案中，组合物包含游离氨基酸形式的赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸和酪氨酸。在另一个具体实施方案中，组合物包含游离氨基酸形式的赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺和丝氨酸。

在另一个实施方案中，组合物包含由选自以下的相同或不同氨基酸制成的一种或更多种二肽：赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺或丝氨酸。

在一个实施方案中，组合物不包含谷氨酰胺和/或甲硫氨酸；以及可水解为谷氨酰胺和/或甲硫氨酸的任何二肽、寡肽或多肽或者蛋白质。

在一个替选实施方案中，组合物可包含游离氨基酸谷氨酰胺，和任选地，一种或更多种含谷氨酰胺的二肽，其中游离氨基酸谷氨酰胺和含谷氨酰胺之二肽的总浓度为小于300mg/l，或者低于300mg/l的任何浓度，例如100mg/l、50mg/l、10mg/l、5mg/l、1mg/l、0.5mg/l或0.01mg/l。

在另一个替选实施方案中，治疗组合物可包含游离氨基酸甲硫氨酸，和任选地，一种或更多种含甲硫氨酸的二肽，其中游离氨基酸甲硫氨酸和含甲硫氨酸之二肽的总浓度为小于300mg/l，或者低于300mg/l的任何浓度，例如100mg/l、50mg/l、10mg/l、5mg/l、1mg/l、0.5mg/l或0.01mg/l。

在一个实施方案中，治疗组合物不包含任何糖类，所述糖类包括任何单糖、二糖、寡糖、多糖和碳水化合物。在一个具体的实施方案中，治疗组合物不包含葡萄糖，和/或可水解为葡萄糖的任何二糖、寡糖、多糖和碳水化合物。在一个具体的实施方案中，组合物不包含乳糖。在另一个具体的实施方案中，治疗组合物不包含果糖和/或半乳糖，和/或可水解为果糖和/或半乳糖的任何二糖、寡糖、多糖和碳水化合物。

在一个替选实施方案中，治疗组合物可包含单糖葡萄糖，和任选地，一种或更多种包含葡萄糖的二糖(乳糖除外)，其中单糖葡萄糖和包含葡萄糖之二糖的总浓度为小于3g/l，或低于3g/l的任何浓度，如1g/l、500mg/l、300mg/l、100mg/l、50mg/l、10mg/l、5mg/l、1mg/l、0.5mg/l或0.01mg/l。

在某些实施方案中，治疗组合物包含选自例如以下的一种或更多种电解质：Na⁺；K⁺；HCO₃ ^-；CO₃ ^2-；Ca²⁺；M_g ²⁺；Fe²；Cl^-；磷酸根离子，如H₂PO₄ ^-、HPO₄ ^2-和PO₄ ^3-；锌；碘；铜；铁；硒；铬；和钼。在一个替选实施方案中，组合物不包含HCO₃ ^-或CO₃ ^2-。在另一个替选实施方案中，组合物包含总浓度小于5m_g/l或者浓度低于5m_g/l的HCO₃ ^-和CO₃ ^2-。

在另一个实施方案中，治疗组合物包含一种或更多种维生素，包括但不限于维生素A、维生素C、维生素D(例如，维生素D₁、D₂、D₃、D₄和/或D₅)、维生素E、维生素B₁(硫胺素)、维生素B₂(例如，核黄素)、维生素B₃(例如，烟酸或烟酰胺)、维生素B₅(泛酸)、维生素B₆(吡多醇)、维生素B₇(生物素)、维生素B₉(例如，叶酸)、维生素B₁₂(钴胺素)和维生素K(例如，维生素K₁、K₂、K₃、K₄和K₅)和胆碱。

在某些实施方案中，组合物不包含选自以下的一种或更多种成分：寡糖、多糖和碳水化合物；寡肽或多肽或蛋白质；脂质；小链、中链和/长链脂肪酸；和/或包含一种或更多种上述营养物的食物。

在一个实施方案中，使用磷酸根离子(如H₂PO₄ ^-、HPO₄ ^2-和PO₄ ^3-)来缓冲本发明的组合物。在一个实施方案中，治疗组合物使用HCO₃ ^-或CO₃ ^2-作为缓冲剂。在另一个实施方案中，治疗组合物不使用HCO₃ ^-或CO₃ ^2-作为缓冲剂。

本文所使用的术语“基本由...组成”将成分和步骤的范围限制为指定的材料或步骤以及不在本质上影响本发明的基本特征和新特征的那些，即，用于治疗小肠上皮(特别是绒毛区和刷状缘中)损伤的组合物和方法。例如，通过使用“基本由...组成”，治疗组合物不包含任何未指定的成分，包括但不限于对小肠上皮(特别是绒毛区和刷状缘中)损伤的治疗具有直接的有利或不利治疗效果的游离氨基酸、二肽、寡肽或多肽或蛋白质以及单糖、二糖、寡糖、多糖和碳水化合物。此外，通过使用术语“基本由...组成”，组合物可包含对小肠上皮损伤的治疗不具有治疗效果的物质；这样的成分包括载体、赋形剂、辅料(adjuvant)、矫味剂等，它们不影响被损伤小肠上皮(特别是绒毛区和刷状缘中)的健康或功能。

本文所使用的术语“寡肽”是指由三至二十个氨基酸组成的肽。本文所使用的术语“寡糖”是指由三至二十个单糖组成的糖。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含与没有小肠上皮细胞(如绒毛细胞、隐窝细胞、肠细胞和肠祖细胞(intestinalprojenitorcell))损伤的正常对照的吸收能力相比，在有小肠上皮细胞损伤的对象中保持或获得提高的吸收能力的营养物(如游离氨基酸)和/或电解质。

在另一个实施方案中，本发明的组合物不包含不被吸收或者与没有小肠上皮细胞(如绒毛细胞、隐窝细胞、肠细胞和肠祖(projenitor)细胞)损伤的正常对照的吸收能力相比，在有小肠上皮细胞损伤的对象中具有降低之吸收的营养物(如氨基酸)和/或电解质。有利地，本发明的组合物有助于小肠容易地吸收营养物，以降低不适当的能量消耗，从而在黏膜损伤后即时提供肠休息。

用于提高小肠功能的治疗方法

本发明的另一方面提供了用于治疗或改善与小肠上皮细胞(特别是绒毛区和刷状缘中)的损失或损伤相关之疾病或病症的方法。在一个实施方案中，小肠上皮细胞的损失或损伤引起营养物、电解质和/或流体的吸收能力改变。有利地，针对有小肠上皮细胞损失或损伤的患者，特别是针对有小肠绒毛萎缩的患者，本发明改善小肠上皮黏膜愈合；提高小肠功能；增强小肠中营养物吸收和流体潴留；预防或缓解小肠萎缩；减轻腹部疼痛；预防和/或治疗腹泻；恢复或增强小肠屏障功能；和/或减轻小肠黏膜炎症、菌血症和/或内毒素血症。

因此，本发明特别有利于改善以下对象的胃肠健康：接受了细胞毒性化学治疗剂、骨盆或腹部辐射、质子治疗和腹部手术的对象；患有与急性或慢性小肠炎症相关的感染或自身免疫疾病的对象；经常性地或者偶尔地暴露于辐射的对象，如经常性地暴露于空间辐射的宇航员和飞行员；以及由于核事故、战争行为或恐怖行为而暴露于辐射的对象。

在一个实施方案中，该方法包括通过经肠途径向有此治疗需要的患者或对象施用有效量的本发明组合物。组合物可在损伤小肠上皮细胞之前即刻、期间和/或之后施用于患者或对象，并且每天可施用一次或多次。

本文所使用的术语“对象”或“患者”描述了可向其提供用根据本发明的组合物进行治疗的生物(包括哺乳动物如灵长类动物)。可从所公开的治疗方法获益的哺乳动物物种包括但不限于：猿(ape)、黑猩猩、猩猩、人、猴；驯养动物(domesticatedanimal)如狗、猫；畜禽(livestock)如马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡；以及动物如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。

在一个具体的实施方案中，有治疗需要的对象是有小肠黏膜上皮细胞(包括十二指肠、空肠和回肠的黏膜层)损伤的患者。特别地，有治疗需要的对象是有小肠绒毛区和刷状缘损伤的患者。例如，有治疗需要的对象与正常相比有绒毛萎缩(例如，绒毛区和刷状缘的部分地或完全地日渐衰减(wastingaway))；小肠中绒毛细胞减少至少5％(如至少10％、20％、30％或50％)；损失至少5％(如至少10％、20％、30％或50％)的绒毛高度；损失小肠的绒毛区和刷状缘中一种或更多种转运蛋白(transporter)的功能，其中转运蛋白包括但不限于SGLT-1转运蛋白、AE2转运蛋白、NHE1转运蛋白和NBCe1-A/B转运蛋白，其中转运蛋白功能的损失为至少5％(如至少10％、20％、30％或50％)；和/或小肠中一种或更多种营养物的吸收能力变化，其中所述营养物选自：异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、组氨酸、酪氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、葡萄糖、果糖和/或乳糖，其中吸收能力的变化为至少5％(如至少10％，20％、30％或50％)。

例如，可通过如本文的“材料和方法”部分所述使用尤斯室来确定小肠的吸收能力。例如，可通过例如测量指标(包括，例如K_m、V_max和I_sc)的组合来确定吸收状态的变化。可通过例如对小肠黏膜的生物活检样本的检查来确定小肠的绒毛区和其他区的损伤。

熟练的医师可容易地确定造成小肠黏膜上皮细胞(如小肠绒毛细胞)损伤的疾病和治疗方法。如在医疗职业中公知的，患有某些疾病(如炎性肠病(IBD))、溃疡性结肠炎、十二指肠溃疡和克罗恩病(Crohn’sdisease)的患者遭受小肠黏膜的慢性破坏。放射治疗、化学治疗和质子治疗也引起小肠细胞的损伤。

本文所使用的术语“治疗”或其任何语法变化形式包括但不限于缓解疾病或病症的症状；和/或减轻、压制、抑制、降低或影响疾病或病症的进程、严重程度和/或范围。

本文所使用的术语“改善”或其任何语法变化形式包括但不限于延迟发病，或者降低疾病或病症(例如，腹泻，菌血症和/或内毒素血症)的严重程度。本文所使用的改善不要求症状完全不存在。

本文所使用的术语“有效量”是指能够治疗或改善疾病或病症或者能够产生预期治疗效果的量。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了用于促进有小肠上皮细胞损伤之对象的肠健康的方法，其中所述方法包括：鉴定有小肠上皮细胞损伤，或者将遭受这样的损伤以及需要治疗或改善的对象，并且通过经肠途径向对象施用有效量的包含以下、基本由以下组成或者由以下组成的组合物：选自赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺和丝氨酸中的一种或更多种游离氨基酸；水；以及任选地，可治疗用载体、电解质、维生素、缓冲剂和矫味剂，其中组合物的总摩尔渗透压浓度为240mosm至280mosm，pH为约7.1至7.9。

在一个实施方案中，未通过经肠途径向有(或者即将有)小肠上皮细胞损伤的对象施用一种或更多种以下营养物，其中所述营养物选自：谷氨酰胺、甲硫氨酸、和可水解为谷氨酰胺和/或甲硫氨酸的任何二肽、寡肽或多肽或蛋白质；葡萄糖和可水解为葡萄糖的任何二糖、寡糖、多糖和碳水化合物；和/或消化后需要在小肠中吸收任何上述营养物的食物。

在另一个实施方案中，对于有(或即将有)小肠上皮细胞损伤的对象而言，未通过经肠途径施用以下营养物，其中所述营养物选自：糖类、脂质、脂肪酸和/或消化后需要在小肠中吸收任何上述营养物的食物。对于暴露于辐射或者接受放射治疗、化学治疗和质子治疗的患者而言，小肠上皮细胞的损伤通常持续至少3、7、14、21、30天或者1至30天之间的任何时间。

在另一个实施方案中，在1至30天之间的任何时间(如3、7、14、21、30天)之后，因为对象暴露于辐照或者接受放射治疗、化学治疗和/或质子治疗，所以通过经肠途径施用一种或更多种以下营养物以增强黏膜愈合，其中所述营养物选自：谷氨酰胺、甲硫氨酸和可水解为谷氨酰胺和/或甲硫氨酸的任何二肽、寡肽或多肽或蛋白质；葡萄糖和可水解为葡萄糖的任何二糖、寡糖、多糖和碳水化合物；和/或消化后需要在小肠中吸收任何上述营养物的食物。

在一个具体的实施方案中，本发明组合物经口施用并且达到对象的小肠。任选地，该方法还包括通过肠胃外途经施用未以充分量通过经肠途径施用的所需营养物和电解质。

在一个实施方案中，本发明未用于向对象提供显著量的或者全部的必需营养物，但用于改善小肠黏膜愈合、恢复小肠功能、增强流体潴留、预防或缓解小肠绒毛萎缩、预防和/或治疗腹泻，和/或恢复或增强肠屏障功能。在一个具体的实施方案中，饮品组合物也基于屏障功能的提高。屏障功能可通过使用多种技术来确定，包括：a)对安放在尤斯室中组织的电导测量结果升高，b)用于测量Cl和Na的相对渗透性(PCl/PNa)的稀释电势(只有完整的和功能性的屏障可保持离子选择性；当失去屏障功能时，离子选择比值接近于1)，以及c)测量血浆内毒素水平。当失去黏膜屏障功能时，共生的肠道细菌可找到进入体循环的途径，导致升高的血浆内毒素水平。可测量患者血液样本中的内毒素水平。血浆内毒素水平还可用作测量治疗改善的指标。

本发明的组合物可用于治疗或改善与小肠上皮细胞的损失、破坏或减少(特别是小肠的绒毛细胞、肠细胞和/或肠祖细胞的功能或数目的损失、破坏或减少)相关的任何疾病或病症。本发明尤其可用于治疗或改善与小肠上皮细胞中的转运蛋白(特别是小肠绒毛细胞中的转运蛋白)的损失、失活或功能改变相关的任何疾病或病症。

在一个实施方案中，本发明的组合物和方法可用于治疗或改善产生自以下或者与以下相关的疾病或病症：钠依赖的葡萄糖转运系统(SGLT-1)对葡萄糖的亲和力下降；NH₂-末端产电Na+-HCO₃(-)协同转运蛋白(NBCe1-A/B)的损失或活性下降；顶端Cl^--HCO₃ ^-交换转运蛋白(AE1)的损失或活性下降；和/或CFTR和/或NKCC-1转运蛋白系统的水平或活性升高。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的组合物和方法可用于治疗或改善由辐射引起的小肠损伤。在一个具体的实施方案中，本发明可用于治疗或改善由放射治疗(特别是骨盆和腹部放射治疗)引起的小肠损伤。在一个具体的实施方案中，辐照治疗用于癌症治疗。

此外，本发明可用于治疗或改善由经常性辐射暴露(如宇航员和飞行员暴露于空间辐射，如由放射性武器和意外核泄露引起的辐射暴露)引起的小肠损伤。具体地，本发明可用于治疗或改善急性和/或慢性放射性肠炎。

在某些具体的实施方案中，本发明的组合物和方法可用于治疗或改善小肠损伤，其中患者接受了以下辐射：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20Gy。在另一个实施方案中，对象接受了剂量高于20Gy的辐射。

此外，本发明可用于治疗或改善由化学治疗剂引起的小肠损伤，所述化学治疗剂包括但不限于：顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、羟基脲、依托泊苷、阿糖胞苷(arabinoside)、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氟达拉滨、甲氨蝶呤、类固醇和/或其组合。

此外，本发明可用于治疗或改善由质子治疗引起的小肠损伤。

在某些实施方案中，本发明可用于治疗或改善涉及小肠损伤的疾病，包括但不限于炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、十二指肠溃疡、克罗恩病、和/或乳糜泻(还称为腹腔疾病)。本发明可用于治疗或改善由病原性感染(如病毒、细菌、真菌或其他微生物感染)引起的小肠损伤。

在一个具体的实施方案中，本发明可用于治疗或改善小肠绒毛萎缩，即，绒毛区和刷状缘的部分地或完全地日渐衰减，以及产生自小肠绒毛萎缩、与小肠绒毛萎缩相关和/或由小肠绒毛萎缩引起的疾病和病症。

在某些实施方案中，本发明可用于治疗或改善局灶性绒毛萎缩和/或弥漫性绒毛萎缩；增生性绒毛萎缩和/或发育不良性绒毛萎缩；和/或有和没有黏膜炎症的绒毛萎缩。

在某些实施方案中，本发明可用于治疗或改善增生性绒毛萎缩(有隐窝增生)和相关疾病和病症，包括但不限于乳糜泄(有面筋(gluten)敏感性肠病)；慢性创伤；小肠移植；尿回肠导管；肠黏膜炎症；肠溃疡；肠吻合；胰高血糖素瘤；广泛性小肠切除；原发性回肠绒毛萎缩；显微镜结肠炎(microscopiccolitis)萎缩；肠微绒毛萎缩；和线粒体细胞病(线粒体呼吸链异常)。

在某些实施方案中，本发明可用于治疗或改善发育不良性绒毛萎缩(没有隐窝增生)和相关疾病或病症，包括但不限于：恶性肿瘤；帕内特细胞缺陷(panethcelldeficiency)；垂体功能减退；对无面筋饮食不响应的乳糜泄；热带口炎性腹泻(tropicalsprue)；辐射相关的局部缺血；药物诱导的绒毛萎缩，如由新霉素和硫唑嘌呤诱导的绒毛萎缩。

在某些实施方案中，本发明可用于治疗或改善有黏膜炎症的绒毛萎缩以及相关的疾病和病症，包括但不限于：乳糜泄；严重的食物不耐受(alimentaryintolerance)；先天性克罗恩病；自身免疫性肠病；小肠结肠炎；和免疫缺陷综合征。

在某些实施方案中，本发明可用于治疗或改善由包括但不限于以下的疾病引起的绒毛萎缩：肝炎；肠癌；肠淋巴瘤；1型糖尿病；变态反应；嗜酸细胞性胃肠炎(eosinophilicgastroenteritis)；病毒性胃肠炎；以及自身免疫性肠病。

在某些实施方案中，本发明可用于治疗或改善与小肠中与乳糜泄相关的绒毛萎缩，包括但不限于Marsh3a型绒毛萎缩(每100个肠细胞＞40个上皮内淋巴细胞)、Marsh3b型绒毛萎缩(每100个肠细胞＞40个上皮内淋巴细胞；显著的绒毛萎缩)、Marsh3c型绒毛萎缩(每100个肠细胞＞40个上皮淋巴细胞，绒毛区不存在或几乎不存在)(基于乳糜泄和肠绒毛萎缩的经修改的Marsh分类)。

本发明还可用于治疗或改善与小肠损伤相关的症状，包括但不限于吸收不良、腹泻、恶心、呕吐、电解质失衡、吸收不良和脱水。

制备用于提高小肠功能的治疗组合物

在另一方面，提供了用于制备本发明治疗组合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括制备用于促进有小肠上皮细胞损失或损伤之对象的肠健康的组合物，其中所述组合物包含以下、基本由以下组成或者由以下组成：有效量的一种或更多种成分，其中这些成分被有小肠上皮细胞损失或损伤的对象的小肠吸收，其中该组合物的总摩尔渗透压浓度为230mosm至280mosm，或其间的任何值(优选为约250mosm至260mosm)，其中该组合物的pH为约7.1至7.9或其间的任何值(优选为约7.4)，其中该组合物被配制为用于经肠施用。

在一个实施方案中，成分选自：游离氨基酸、二肽、单糖、二糖或其组合，以及任选地，电解质、维生素、矫味剂和/或载体。

在一个实施方案中，本发明提供了通过筛选在绒毛和隐窝区的小肠上皮细胞破坏之后保持或获得吸收能力的营养物或电解质，筛选用于包含进本发明治疗组合物之营养物或电解质的方法。

本发明的筛选方法可用于确定可用于治疗或改善与小肠上皮细胞的损失、破坏或减少(特别是绒毛细胞、肠细胞和/或肠祖细胞的损失、破坏或减少)相关的疾病或病症的治疗营养物和/或电解质。在一些具体的实施方案中，该方法可用于设计用以满足特定患者或患者群体之需求的组合物和方法。在一个具体的实施方案中，本发明组合物可用于治疗或改善放射治疗、化学治疗治疗、质子治疗之后的或者由小肠的急性或慢性炎症引起的小肠损伤。

在一个实施方案中，本发明筛选方法包括：

a)使有黏膜损伤的小肠上皮组织与候选营养物或电解质相接触；

b)确定小肠上皮组织吸收所述营养物或电解质的能力水平；

c)将所述水平与预定水平(如正常组织中)进行比较；以及

d)如果候选营养物或电解质的吸收能力是预定水平的至少例如50％、60％、70％、80％或90％，则选择该候选营养物或电解质。

在一个实施方案中，本发明筛选方法包括：

a)通过经肠途径向有小肠黏膜损伤的对象施用候选营养物或电解质；

b)确定所述营养物或电解质的肠吸收能力水平；

c)将所述水平与预定水平(如正常对象中)进行比较；以及

d)如果候选营养物或电解质的吸收水平是预定水平的至少例如50％、60％、70％、80％或90％，则选择该候选营养物或电解质。

可根据指标(包括，例如K_m、V_max和I_sc)的组合来确定吸收能力的水平。

本领域技术人员可建立预定参考值。例如，可通过测量没有黏膜(如绒毛细胞、隐窝细胞、肠细胞和肠祖细胞)损伤的正常小肠上皮组织中的所述营养物或电解质的吸收能力水平来建立预定的参考值。在另一情况下，可通过测量没有小肠上皮细胞(如绒毛细胞、隐窝细胞、肠细胞和肠祖细胞)损伤的正常群体中的所述营养物或电解质的吸收能力水平来建立预定参考值。

在另一个实施方案中，本发明筛选方法包括：

a)确定有黏膜损伤的小肠组织的功能；

b)使候选营养物或电解质与小肠组织相接触；

c)确定小肠组织与候选营养物或电解质接触后小肠组织的功能；以及

d)如果所述候选营养物或电解质提高了小肠功能，则选择该候选营养物或电解质。

在另一个实施方案中，本发明筛选方法包括：

a)确定有小肠黏膜损伤的对象的小肠功能；

b)通过经肠途径向对象施用候选营养物或电解质；

c)确定施用候选营养物后对象的小肠功能；以及

d)如果所述候选营养物或电解质提高了小肠功能，则选择该候选营养物或电解质。

在某些实施方案中，如果候选营养物或电解质的施用使细胞旁通透性(paracellularpermeability)下降、增强了小肠屏障功能，则小肠功能得到了提高。此外，如果候选营养物或电解质的经肠施用预防或治疗了腹泻和/或延长了存活，则小肠功能得到了提高。

在某些实施方案中，可使用如实施例(特别是实施例15至17)中所说明的方法来选择提高了有小肠黏膜损伤之对象的小肠功能的营养物和电解质。

合适的候选电解质包括例如Na⁺、K⁺、HCO₃ ^-、Cl^-、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺和/或Zn²⁺。

合适的候选营养物包括选自例如以下的必需氨基酸和非必需氨基酸：异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、组氨酸、酪氨酸、硒半胱氨酸(selenocysteine)、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺和吡咯赖氨酸。合适的候选营养物还可包括脂肪酸、糖类(例如，单糖、二糖和寡糖)、电解质和维生素。

候选营养物还可包括非天然氨基酸，如鸟氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸(homoserine)、苯甘氨酸、牛磺酸、碘化酪氨酸、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、正亮氨酸(norleucine)、正缬氨酸(norvaline)、肌氨酸(sarcosine)、高瓜氨酸(homocitrulline)、磺基丙氨酸(cysteicacid)、τ-丁基甘氨酸、τ-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸和β-丙氨酸。

在另一个实施方案中，营养物和电解物的选择还至少部分取决于对象所接受的IR剂量、辐射源、被辐照的身体部分、和/或辐射后的时间；化学治疗剂的类型、剂量、和/或化学治疗后的时间；以及对象所接受的质子治疗的剂量，和/或质子治疗后的时间。

本发明筛选测定可采用本领域中公知的技术组合来进行，包括但不限于尤斯室研究、细胞学、免疫组化、Western印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)、离子通量实验(ionfluxexperiment)、免疫沉淀、免疫荧光、放射免疫测定和免疫细胞化学。

具体地，成分可根据成分被患者小肠黏膜吸收的能力(如通过原位或分离的肠制备物确定的)来选择，采用技术如尤斯室来测量小肠对此类成分的吸收能力。

制剂和施用

本发明提供了包含治疗有效量的本发明组合物和任选的可药用载体的治疗组合物或药物组合物。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水。治疗组合物还可包含不影响受损伤小肠上皮(特别是绒毛区和刷状缘中)之健康或功能的赋形剂、辅料、矫味剂等。在一个实施方案中，治疗组合物和其中所包含的全部成分都是无菌的。

术语“载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、辅料、赋形剂或载剂。合适的药用载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington′sPharmaceuticalSciences”中。这样的组合物包含治疗有效量的治疗组合物，以及合适量的载体以向患者提供适当的施用形式。制剂应当适合经肠施用模式。

本发明还提供了药物包(pharmaceuticalpack)或药盒(kit)，其包括填充有一种或更多种成分(例如，本发明的化合物、载体或药物组合物)的一个或更多个容器。

在一个实施方案中，药物包或药盒还包括施用说明书，例如，关于有效治疗剂量，和/或参考例如暴露于辐射、化学治疗或质子治疗后之时间的施用时间。在一个实施方案中，组合物的治疗剂量根据小肠黏膜的损伤程度来确定。例如，对于接受了或者即将接受辐射的对象，组合物的治疗剂量根据辐射源、被辐照的身体部分和/或辐射后的时间来确定。对于接受了或者即将接受化学治疗的对象，组合物的治疗剂量根据化学治疗剂的类型、化学治疗剂的剂量和/或化学治疗后的时间来确定。对于接受了或者即将接受质子治疗的对象，组合物的治疗剂量根据对象所接受的质子治疗的剂量和/或质子治疗后的时间来确定。

材料和方法

实验动物

为了研究活性HCO₃ ^-分泌，从国家癌症研究所(NationalCancerInstitute)获得8周龄的、未经辐照和经辐照的雄性BALB/c小鼠。将小鼠随机分组，使用以1.84Gy/分钟递送γ-辐照的¹³⁷Cs源，根据胃肠急性放射综合征(gastrointestinalacuteradiationsyndrome，GIARS)模型以ShepherdMark-I辐照腹部。辐射以单分割(singlefraction)给出。在骨盆或腹部肿瘤的放射治疗期间，GIARS模型将实现肠组织的最大辐射损伤，并模拟肠损伤。

检查作为辐射后的时间和辐射剂量升高二者之函数的短路电流(shortcircuitcurren，I_sc)的变化以确定产生显著的I_sc变化所需的最早时间和最小辐射剂量。这些研究经罗切斯特大学动物管理与使用委员会(UniVersityofRochesterAnimalCareandUseCommittee)批准。

离子通量研究

放血(exsanguination)之后，通过排除邻近盲肠的小肠远端的12cm而得到空肠段。在从下面的肌肉层剥离黏膜之前，在冰冷的林格液中清洗和冲洗该段(Zhang，Ameen等.2007)。将黏膜安放在面积为0.30cm²的尤斯型璐彩特(Lucite)室(P2304，Physiologicinstruments，SanDiego，CA92128USA)的两半之间，使用电压/电流钳装置(VCCMC-8，Physiologicinstruments，SanDiego，CA92128USA)记录电参数(Vidyasagar等.2005；Vidyasagar等.2004；Zhang等.2007；Vidyasagar和Ramakrishna2002)。在包含8mM的谷氨酰胺且用95％氧气(O₂)与5％二氧化碳(CO₂)之混合物充气的常规林格液(表1)中沐浴(bathed)肠制备物的两边。

表1.溶液的组成

注释：值以mM计。离子溶液用于离子置换实验。所有溶液的pH均为7.4。

在不含Cl^-的溶液中，使用H₂SO₄将pH调节至7.4，

而在所有其他溶液中，使用HCl进行调节。

缩略语：UB，未缓冲的溶液

HCO₃ ^-运动的测量

使用双-滴定管(bi-burette)TIM856(RadiometerAnalyticalSAS，Villeurbanne，France)来测量剥离的空肠片中的HCO₃ ^-分泌(Vidyasagar等.2005；Vidyasagar等.2004；Zhang等.2007)。通过添加0.01μl的0.025M硫酸(H₂SO₄)，自动化泵使腔溶液的pH保持恒定。通过向包含升高浓度的HCO₃ ^-的弱缓冲溶液中添加已知量的H₂SO₄来建立标准至稳定(standard-to-stat)pH校准以产生线性滴定曲线。

将空肠组织的浴侧(浆膜侧)暴露于缓冲溶液，而腔侧暴露于不含HCO₃ ^-的低缓冲溶液(0.1-mMHEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲剂，pH7.4)。HCO₃ ^-分泌相当于添加到腔溶液中用以将pH保持在7.4(或稳定pH)之酸的量。所有这些实验均在电压钳条件下进行。不含的HCO₃ ^-的溶液用100％O₂充气，含HCO₃ ^-的溶液用95％O₂和5％CO₂充气。HCO₃ ^-分泌表示为μeq·h^-1·cm^-2(Vidyasagar等.2005；Vidyasagar等2004；Zhang等.2007)。

在组织安放好之后，在开始不存在浴HCO₃ ^-时，存在HCO₃ ^-分泌，但在20至30分钟之内迅速降至0。如果在滴定期间不存在浴HCO₃ ^-，则HCO₃ ^-分泌依然接近0。浴溶液中HCO₃ ^-的存在导致HCO₃ ^-分泌迅速升高，其在至少2小时中保持恒定(Vidyasagar等.2005；Vidyasagar等.2004；Zhang等.2007)。当将抑制剂添加到黏膜溶液中时，调节pH，并使之平衡30分钟，直至观察到稳定速率的HCO₃ ^-分泌。当将抑制剂添加到浴侧(bathside)时，同样将组织平衡30分钟以达到稳定速率的HCO₃ ^-分泌(参见表3)。

所有实验均在起始的1小时稳定态期间进行。使用来自每只动物的1个组织来进行每个实验；对于各组织样本，只研究1个实验条件。所有实验均重复至少4次。

免疫组化

使用抗NBCe1-A/B抗体(Bevensee，Schmitt等.2000)对来自未经辐照和经辐照小鼠二者的冷冻组织切片进行免疫荧光染色。NBCe1-A/B是针对碳酸氨钠协同转运蛋白(NBCe1-A和NBCe1-B)二者共有的羧基末端产生的多克隆抗体。在辐照后第6天完成免疫染色操作。在冰冷的常规林格液中清洗分离的组织，包埋于冰冻切片包埋介质中，并置于液氮中；在低温恒温器(cryostat)中制作6-μm切片。

Western印迹研究

从未经辐照和经辐照小鼠的黏膜碎屑制备空肠裂解物。通过Western印迹(Bevensee等.2000)分析组织的NKCC1(SantaCruzCA，USA)、NBCe1-A/B(MarkDanielParker，CaseWesternReserveUniversityMedicalSchool，Cleveland，OH)和囊性纤维化跨膜传导调节因子(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator，CFTR)(SantaCruzCA，USA)蛋白表达。

在pH为7.4的包含25-mMHEPES、10％甘油和含有蛋白酶抑制剂混合物(10mM碘乙酰胺、1mM苯甲基磺酰氟和2μg·ml^-1亮抑酶肽)之1％TritonX-100(聚乙二醇对-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚)的三酰甘油水解酶缓冲液中裂解黏膜碎屑(除非另有说明，否则所有化学品均获自Sigma-AldrichCo.，USA)。蛋白质浓度使用Bradford测定来确定。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来分析来自经辐照和未经辐照样本的蛋白质的等效负荷。使用亲和纯化多克隆抗体来检测NKCC1、NBCe1-A/B和CFTR蛋白。

统计

结果表示为平均值±平均值的标准误。在2个步骤中进行统计分析：1)使用方差分析(ANOVA)(或其非参数等同形式Kruskal-Wallis)来检验总体差异；和2)计算Bonferroni校正的P值用于全部成对比较。

实施例

以下是举例说明用于实施本发明之方法的实施例。这些实施例不应当解释为限制。除非另有指明，否则所有百分比按重量计，并且所有溶剂混合物比例按体积计。

实施例1-辐照使净阴离子分泌升高

该实施例示出，辐照使净阴离子分泌升高，并且引起绒毛上皮细胞与隐窝细胞相比更大的损失。具体地，从接受了12Gy辐照的小鼠得到小肠上皮组织，采用尤斯室研究来检查阴离子分泌。在第1、2、3和4天测量跨上皮I_sc(阴离子分泌的指标)。

如图1A所示，与未暴露于IR的组织和辐照后24小时和72小时的暴露于IR的组织相比，在辐照后48小时观察到跨上皮I_sc的最大升高(图1A)。在48小时结束时I_sc的显著升高表明，辐照破坏了吸收与分泌之间的精密平衡。相比之下，在48小时和72小时结束时记录的I_sc低于未经IR小鼠组织。

组织病理学切片还示出由于辐照，绒毛上皮细胞与隐窝细胞相比更大的损失。虽然48小时之前获取的组织病理学切片示出最小的绒毛损伤和很小或者没有隐窝细胞损伤，但是在第3天和第4天获取的组织病理学切片示出隐窝细胞和绒毛细胞的广泛损伤。特别地，3天后，绒毛细胞变得几乎完全耗尽。如由应答于IR后72和96小时的分泌刺激而未能刺激阴离子分泌所证实的，还观察到了隐窝细胞的损失(图1A)。在高剂量的IR下，有不充分的隐窝干细胞，其成熟并分化形成绒毛上皮细胞。

图1B示出辐照使跨上皮电导升高(图1B)。通过尤斯室实验测量了跨上皮电导(S)(复合的跨细胞电导和细胞旁电导)。

根据欧姆定律(Ohmslaw)1/S＝R，跨上皮电导的升高表明跨上皮电阻(transepithelialresistance，TER或R)下降。小鼠小肠具有低上皮电阻。细胞旁途径的电阻比跨细胞电阻^65-67低得多。如1/TER＝(1/R_{跨细 胞})+(1/R_旁细胞)所示，细胞旁途径和跨细胞途径平行；因此，所测量的TER大体上反映了细胞旁电阻。

实施例2-辐照引起短路电流(I_sc)的剂量依赖性升高

该实施例揭示了辐照引起短路电流的剂量依赖性升高，表明升高的产电阴离子分泌。简要地，在第4天处死接受了0、1、3、5、7、9或12Gy辐照的小鼠。图2示出与以0Gy和1Gy辐照的那些相比，以3、5和7Gy辐照的小鼠组织中I_sc显著升高(＊p＜0.001)。与以3、5和7Gy辐照的小鼠相比，在以9和12Gy辐照的小鼠组织中观察到了降低的I_sc(＊＊p＜0.01，图2)。以1至3Gy辐照引起I_sc的最高升高和最小的组织病理学变化。

此外，辐照引起I_sc随时间变化。对于在第0、1、2、3、4、5、6或7天处死的小鼠，在IR后第5和第6天观察到了I_sc的最高升高(图3A)。为了确定作为时间的函数的I_sc的最大升高，以3Gy辐照小鼠，并在第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11和14天处死以记录电参数Kruskal-Wallis(P＜0.001)。事后分析在辐照后第6天示出I_sc的最大升高。

如图3A所示，在辐照后第1和第2天记录的I_sc示出非常小的统计差异。但是，在辐照后时间＞2天记录的I_sc与第0天相比时示出显著性差异(＊P＜0.01)。在第4、5、6和7天记录的I_sc中，观察到了很小的显著性差异。在辐照后第9和第10天记录的I_sc与在辐照后第7天记录的也没有显著性差异(＊＊P＝_Ns)。虽然，示出在接受了3Gy(4.8±0.5μeq.h^-1.cm^-2)IR的小鼠中，第6天后I_sc示出显著升高，但是其在辐照后第14天以及在甚至2年内都继续保持在升高的水平。图3A示出在以3Gy辐照的小鼠中，在第6天发生I_sc的最大升高。

辐照后所观察到的I_sc升高主要是由于产电阴离子分泌的净升高。I_sc升高有3种可能的机制：1)升高的产电阴离子分泌(例如，Cl^-和/或HCO₃ ^-)；2)升高的产电Na⁺吸收；或3)升高的产电K⁺吸收。辐照不大可能引起小鼠小肠中升高的产电Na⁺吸收过程。此外，因为辐照引起腹泻，其导致K⁺损失而非K⁺吸收，所以I_sc的升高不可能是由于升高的K⁺吸收。

实施例3-N_a ⁺和Cl^-吸收的降低

该实施例示出辐照使N_a ⁺和Cl^-吸收降低。如表2所示，使用²²N_a-置换的尤斯室通量研究揭示，在未经IR(0G_y)的小鼠中有Na⁺的净吸收(表2)，因为黏膜/浆膜通量(J_ms)超过浆膜/黏膜通量(J_sm)。辐照使J_ms以剂量依赖方式降低，并引起降低的净Na⁺吸收(J_NetNa)。在7Gy和9Gy的剂量下，J_sm远远超过J_ms，引起净分泌。此外，在高剂量辐照下，小鼠粪便样本变得疏松或者不良地形成，进一步证实电解质降低的吸收和升高的分泌。类似地，净Cl^-吸收还随IR剂量升高而降低。在9G_y下观察到净Cl^-分泌。Cl^-吸收降低是由于J_msCl^-降低。

表2Na⁺和Cl^-的单向净通量(J_Net＝J_ms-J_sm)

实施例4-辐照引起升高的细胞旁渗透性

该实施例示出辐照引起小肠衬里黏膜(liningmucosa)的损失，引起削弱的小肠屏障功能。该升高的小肠渗透性使得肠共生细菌、肽和毒素易于进入系统隔室(systemiccompartment)，从而引起内毒素血症。如图4A所示，辐照使如由东方鲎鲎试剂(tachypleusamebocytelysate)试剂盒测量的血浆内毒素水平升高。

如在尤斯室研究中确定的稀释电势的变化所表明的，辐照还升高Cl^-和Na⁺(PCl/PNa)渗透性。使用稀释电势作为膜渗透性的指标基于以下原理。具体地，完整的半透膜(如小肠黏膜)维持通过用不同离子强度沐浴黏膜和浆膜侧溶液而人工地产生的电化学电势梯度。但是，使得易于扩散通过膜的漏膜(leakymembrane)具有降低的膜电化学电势。因而，跨膜的渗透性越高，则电势梯度越低。自由渗透之膜的Cl^-和Na⁺(PCl/PNa)的相对渗透性为1，其表明选择性的完全损失。

在未经IR的小鼠中，保留了膜选择性，与Cl^-相比，Na⁺更易于渗透通过膜。辐照使膜稀释电势降低。特别地，在7Gy时，Na⁺和Cl^-变得相等地渗透通过膜，表明选择性的显著损失(图4B)。由辐照引起的电解质渗透性的升高与图4A所示的血浆内毒素水平升高相一致。监测膜渗透性的变化可用作敏感性工具以监测由对象经口辐射饮食引起的黏膜屏障功能的升高。

实施例5-由辐照引起的炎性介质水平的升高

使用LUMINEX多重珠阵列技术(multiplebeadarraytechnique)来测量经IR暴露和未经IR暴露的小鼠中的炎性介质水平。如图5所示，辐照使IL1-β、TNF-α和MIP-α的产生提高(图5)。

实施例6-由辐照引起的阴离子分泌降低是NKCC1依赖的和CFTR依赖的

该实施例示出辐照下的阴离子分泌是NKCC1依赖的和CFTR依赖的。为了确定NKCC1对基础I_sc的贡献，向浴溶液中添加100μM的布美他尼(bumetanide)(Sigma-AldrichCo.，USA)。图3C示出经辐照组织中的布美他尼-可抑制电流(5.5±0.5μeq.h^-1.cm^-2对0.6±0.1μeq.h^-1.cm^-2)，但在0Gy小鼠中并非如此(1.6±0.2μeq.h^-1.cm^-2对0.9±0.1μeq.h^-1.cm^-2)。此外，cAMP刺激引起经0Gy辐照小鼠(1.6±0.2μeq.h^-1.cm^-2对6.9±0.6μeq.h^-1.cm^-2，P＜0.001)和经3Gy辐照小鼠(5.5±0.5μeq.h^-1.cm^-2对7.3±0.5μeq.h^-1.cm^-2，P＜0.05)中的I_sc升高。

此外，在3Gy中，布美他尼使得毛喉素(Sigma-AldrichCo.，USA)刺激的I_sc降低(7.3±0.5μeq.h^-1.cm^-2对0.4±0.1μeq.h^-1.cm^-2)，但在0Gy中并非如此(6.9±0.6μeq.h^-1.cm^-2对1.3±0.2μeq.h^-1.cm^-2)。这表明没有辐照时较大的NKCC1依赖的阴离子分泌(P＜0.05)。

结果还示出辐照下的阴离子分泌是CFTR依赖的。为了确定I_sc的布美他尼不敏感性部分是否通过顶端膜阴离子通道发生，采用非特异性阴离子通道阻断剂5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)-苯甲酸(Sigma-AldrichCo.，USA)(10μMNPPB)和特异性囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)阻断剂(100μM格列本脲(glibenclamide)，Sigma-AldrichCo.，USA)。通过非特异性阴离子通道阻断剂(NPPB)(0.1±0.01μeq.h^-1.cm^-2)和格列本脲(0.1±0.01μeq.h^-1.cm^-2)的黏膜添加，消除了0Gy小鼠中的布美他尼不敏感性I_sc。这表明阴离子分泌通过阴离子通道或CFTR而发生(图3B)。

实施例7-由辐照引起的HCO₃ ^-分泌的降低

感染性腹泻(如霍乱)导致粪便中富含HCO₃ ^-流体的损失，并且引起代谢性酸中毒。该实施例表明，与感染性腹泻相反，IR诱导升高的Cl^-分泌和降低的HCO₃ ^-分泌。

为了确定Cl^-对净阴离子分泌的贡献，采用了Cl^-吸收入细胞中的阻断剂(Na-K-2Cl协同转运阻断剂)。10μM布美他尼的添加消除了几乎所有与IR相关I_sc，表明IR诱导的阴离子分泌主要是由于升高的Cl^-分泌，并且该分泌是NKCC1-依赖的(图3A-C)。

pH稳定实验证实了IR诱导的HCO₃ ^-分泌(表3)。当浆膜浴溶液(浴)中的Na⁺被非渗透性阳离子NMDG所置换时，HCO₃ ^-的分泌消除，表明HCO₃ ^-转运到细胞的基底侧膜是浴Na⁺依赖的。在IR后第6天的小鼠中以5Gy重复类似的实验。在浴Na⁺的存在下，HCO₃ ^-分泌显著降低。

使用NBCe1a/b抗体进行得自未经IR小鼠和经IR小鼠二者的冷冻组织切片的免疫荧光染色(图6B-E)。NBCe1a/b抗体特异性染色表明，NBCe1a/b在绒毛上皮细胞中表达，但在隐窝细胞中不表达。来自经IR小鼠组织的免疫染色示出NBCe1a/b抗体在绒毛或隐窝中未被识别。来自经3Gy(IR)辐照小鼠的组织未在绒毛或隐窝中表达NBCe1-A/B-特异性染色图案。在高剂量的IR下，HCO₃ ^-分泌功能下降是由于绒毛上皮细胞的损失。监测Na⁺和HCO₃ ^-分泌的变化可以是用以监测因对象经口辐射饮食引起的黏膜屏障功能提高的敏感性工具。

辐照下的HCO₃ ^-分泌是NKCC1依赖的

为了确定HCO₃ ^-是否有助于阴离子分泌，在不存在浴Cl^-的条件下进行实验。认为HCO₃ ^-有助于对继发于辐照或毛喉素刺激的I_sc升高。结果示出，辐照下HCO₃ ^-的分泌不是浴Cl^-依赖的；因此，在辐照下，HCO₃ ^-分泌不涉及顶端膜中的Cl^--HCO₃交换转运蛋白(AE1)。在不含Cl^-的溶液中，经3Gy辐照的小鼠中的基础(1.0±0.2μeq.h^-1.cm^-2vs0.3±0.1μeq.h^-1.cm^-2；P＝ns)I_sc和毛喉素刺激的(1.7±0.2μeq.h^-1.cm^-2对0.3±0.1μeq.h^-1.cm^-2；P＜0.001)I_sc较低(图3D)。与在3Gy下相比，在0Gy下毛喉素刺激的I_sc更高(P＜0.001)，表明由辐照引起HCO₃ ^-分泌降低。

为了确定在基础刺激条件和毛喉素刺激条件下，NKCC1是否介导HCO₃ ^-运动，将布美他尼添加到两侧在不含Cl^-的溶液中平衡的组织的浴侧。结果示出，布美他尼不抑制基础的I_sc升高和毛喉素刺激的I_sc升高；缺少该抑制表明基底侧膜处HCO₃ ^-吸收的NKCC1非依赖机制。

辐照下的HCO₃ ^-分泌是内腔Cl^-非依赖的

经辐照小鼠中HCO₃ ^-分泌的直接测量示出与未经辐照小鼠(0.8±0.2μeq.h^-1.cm^-2对6.7±0.2μeq.h^-1.cm^-2)相比降低的HCO₃ ^-分泌。通过去除内腔Cl^-，经辐照小鼠中的HCO₃ ^-分泌不变(表3)。经辐照小鼠中NPPB(0.2±0.01μeq.h^-1.cm^-2)和格列本脲(0.11±0.1μeq.h^-1.cm^-2)(而非DIDS)的黏膜添加，结束了HCO₃ ^-分泌。这表明HCO₃ ^-分泌是由阴离子通道(CFTR通道)介导的，而非通过Cl^--HCO₃ ^-交换而介导(图19B)。

相比之下，未经辐照小鼠中的HCO₃ ^-分泌是内腔Cl^-依赖的和Cl^-非依赖的。跨上皮电测量结果表明产电HCO₃ ^-分泌；但是，这不表明HCO₃ ^-分泌是通道介导的和/或通过电中性的Cl^--HCO₃ ^-交换。

在不存在内腔Cl^-的条件下进行pH-稳定实验，以研究未经辐照小鼠中的Cl^--HCO₃ ^-交换。在不含内腔Cl^-的溶液中，HCO₃ ^-分泌较低(4.5±0.1μeq.h^-1.cm^-2，P＜0.01)。这表明，未经辐照小鼠中的基础HCO₃ ^-分泌部分地是内腔Cl^-依赖的，部分地是Cl^-非依赖的(表3)。添加100μM4，4-二异硫氰基-2，2′-茋二磺酸(DIDS)(Sigma-AldrichCo.，USA)部分地抑制了HCO₃ ^-分泌(P＜0.001)，该抑制类似于以内腔Cl^-去除中所观察到的。毛喉素刺激的内腔Cl^-非依赖性HCO₃ ^-分泌

对于0Gy小鼠，向浴溶液中添加毛喉素示出显著升高的基础HCO₃ ^-分泌(P＜0.001)，其不随内腔Cl^-去除而改变(8.4±0.4μeq.h^-1.cm^-2对8.7±0.4μeq.h^-1.cm^-2；n＝6)。NPPB消除了毛喉素刺激的HCO₃ ^-分泌(0.2±0.01μeq.h^-1.cm^-2；n＝6)；这表明阴离子通道在cAMP刺激的HCO₃ ^-分泌中的作用。

cAMP刺激的HCO₃ ^-分泌是NKCC1非依赖的

为了确定cAMP刺激的HCO₃ ^-分泌是否需要顶端CFTR通道，向腔侧添加格列本脲。格列本脲抑制了(0.1±0.1μeq.h^-1.cm^-2)HCO₃ ^-分泌(表3和图19)，表明cAMP不仅抑制净HCO₃ ^-分泌的基础Cl^--HCO₃ ^-交换组分，而且诱导顶端阴离子通道介导的HCO₃ ^-分泌。经辐照小鼠的毛喉素刺激示出与基础HCO₃ ^-分泌相比很少的升高(0.6±0.2μeq.h^-1.cm^-2对0.78±0.2μeq.h^-1.cm^-2)。这还表明内腔Cl^-非依赖的HCO₃ ^-分泌或抑制Cl^--HCO₃ ^-交换。

跨上皮电测量结果示出，HCO₃ ^-运动的降低也是NKCC1非依赖的。在基础条件和毛喉素刺激条件二者下，经辐照小鼠中最小的HCO₃ ^-分泌不受添加布美他尼的影响(表3)。类似地，在未经辐照的小鼠中，布美他尼不改变毛喉素刺激的HCO₃ ^-分泌，表明cAMP刺激的HCO₃ ^-分泌是NKCC1非依赖的(8.4±0.4μeq.h^-1.cm^-2对8.6±0.4μeq.h^-1.cm^-2)(表3和图3B)。

HCO₃ ^-分泌是浴Cl^-非依赖的

需要浴Cl^-用于基底侧HCO₃ ^-吸收的转运过程示于图3B中。结果示出布美他尼不改变cAMP刺激的HCO₃ ^-分泌。这表明，在辐照下，Cl^--HCO₃ ^-交换(AE2)转运蛋白受到抑制。浴Cl^-的去除还可抑制NKCC1和AE2相关的HCO₃ ^-吸收(表3)。从浴溶液中去除Cl^-不改变HCO₃ ^-分泌(6.7±0.3μeq.h^-1.cm^-2对7.1±0.6μeq.h^-1.cm^-2)。

HCO₃ ^-分泌是浴Na⁺依赖的

Na⁺偶联的基底侧HCO₃ ^-进入的转运过程示于图3B中。图3C和3D表明NKCC1不影响HCO₃ ^-分泌。将1mM3-甲基磺酰基-4-哌啶子基苯甲酰基胍盐酸盐(HOE694)添加到浴侧通过与Cl^--HCO₃ ^-交换偶联的NHE1而消除了HCO₃ ^-吸收。Counillon，Scholz等(1993)还描述了1mM3-甲基磺酰基-4-哌啶子基苯甲酰基胍盐酸盐(HOE694)可抑制Na⁺-H⁺交换(NHE1)。

HOE694不抑制cAMP刺激的HCO₃ ^-分泌(8.4±0.4μeq.h^-1.cm^-2对7.2±0.9μeq.h^-1.cm^-2)。在未经辐照小鼠中，用N-甲基-D-葡糖胺(NMDG)替换浴Na⁺消除了毛喉素刺激的HCO₃ ^-分泌(8.4±0.4μeq.h^-1cm^-2对0.3±0.01μeq.h^-1cm^-2)，其表明Na⁺偶联的HCO₃ ^-协同转运(NBC)(图3E)。

表3.未经辐照(0Gy)和经辐照(3Gy)小鼠的空肠中测量的HCO₃ ^-分泌

注释：值表示平均值±SEMn＝6个组织。*p＜0.001，

0Gy与3Gy组之间的比较。现有组之间的比较。

在未经辐照小鼠的布美他尼实验中，用10mM毛喉素来处理组织。

缩略语：ns，组间没有显著性；4，4-二异硫氰基-2，2′-芪二磺酸，DIDS

对于顶端膜处的活性HCO₃ ^-分泌，需要其基底侧吸收。直接或间接地涉及基底侧膜处HCO₃ ^-运动的四个已知交换机制是：1)Na⁺-K⁺-2Cl^-协同转运作为可能的HCO₃ ^-转运蛋白；2)通过NKCC1吸收入细胞的Cl^-通过基底侧Cl^--HCO₃ ^-交换(AE2)而再循环，导致基底侧膜处的净HCO₃ ^-吸收；3)Na⁺-H⁺交换将质子挤到胞内空间，导致降低的胞内HCO₃ ^-浓度，然后其刺激顶端电中性Cl^--HCO₃ ^-交换；以及4)Na⁺偶联的HCO₃ ^-协同转运。这些转运蛋白可以是电中性的或产电的，取决于每分子Na⁺转运的HCO₃ ^-分子的数目(图3B)。

在未经辐照小鼠中，HCO₃ ^-吸收通过位于基底侧表面的Na⁺偶联的协同转运蛋白(NBCe1-A/B)而发生。顶端输出通过与Na⁺-H⁺交换结合的电中性Cl^--HCO₃ ^-交换以及通过CFTR(产电阴离子分泌)而发生。通过添加毛喉素实现的胞内cAMP升高导致升高Cl^-和HCO₃ ^-的分泌，以及同时抑制电中性的Na⁺和Cl^-吸收(Na⁺-H⁺交换与Cl^--HCO₃ ^-交换偶联)。Cl^-吸收通过NKCC1而发生，HCO₃ ^-吸收通过NBCe1-A/B而发生；Cl^-和HCO₃ ^-二者的输出通过顶端表面的CFTR而发生。

根据本发明，已发现辐照抑制电中性的Na⁺和Cl^-吸收。辐照还抑制NBCe1-A/B，该抑制导致基底侧膜处HCO₃ ^-吸收降低，最终，其在顶端膜处输出。因而，辐照导致产电Cl^-分泌，以及电中性的和产电的HCO₃ ^-分泌二者的选择性抑制(图19B)。

辐照引起小肠上皮组织中升高的NKCC-1蛋白表达和降低的NBCe1-A/B表达。辐照还抑制顶端Cl^--HCO₃ ^-交换转运蛋白(AE1)。放射性腹泻中的HCO₃ ^-分泌是Na⁺依赖的，但是内腔Cl^-非依赖的以及NKCC-1非依赖的。辐照下的Cl^-转运涉及基底侧NKCC-1转运蛋白，而非Cl^--HCO₃ ^-交换转运蛋白(AE1)。

如图19B所示，辐照还改变胃肠道中的电解质(如HCO₃-和Cl-)转运。经辐照小鼠主要显示出Cl^-分泌和最小的HCO₃ ^-分泌。推测由辐照引起的最小HCO₃ ^-分泌是由抑制HCO₃ ^-吸收引起的。相反，在促分泌素(secretagogue)诱导的腹泻中有活跃的Cl^-以及HCO₃ ^-分泌。

实施例8-辐照引起葡萄糖吸收的降低

该实施例示出在IR诱导的肠炎中，葡萄糖吸收剂量依赖性地降低。此外，肠内腔中未吸收葡萄糖的存在可导致渗透性腹泻，还劣化与IR相关的腹泻性病症。图7A示出辐照引起I_sc剂量依赖性地降低。图7B示出辐照以剂量依赖的方式提高葡萄糖转运中的K_m。

SGLT1是多功能的转运蛋白。SGLT1在感染性腹泻(如霍乱)中维持其功能。在感染性腹泻中SGLT1功能的保持已被用于Na⁺吸收的经口再水化治疗。

为了研究SGLT-1的功能及其对辐照后葡萄糖吸收的影响，在以0、1、3、5或7GyIR暴露后的第6天获得Swiss小鼠的小肠黏膜。在尤斯室中测量葡萄糖刺激的短路电流(I_sc)以研究SGLT1转运功能。以9Gy对TBI和15.6-亚-TBI小鼠实施存活研究。

具体地，使得自国立卫生研究院(NIH)的8周龄Balb/c小鼠经历137C亚全身(sub-totalbody)辐照(亚-TBI)(保护一条腿不受辐照)和全身(total-body)辐照(TBI)。

在动物存活研究中，将小鼠分为2组：9GyTBI和15.6Gy亚-TBI。用生理盐水处理对照小鼠；其他小鼠用5％葡萄糖处理。在实验过程中采用管饲法(gavage)，在辐照后前5天和辐照后直至10天的隔天给予处理。

在尤斯室研究中采用多通道电压/电流钳(PhysiologicalInstruments，SanDiego，CA)。在经常规改良的林格液中沐浴用于安放的小鼠空肠切片，并以95％O₂和5％CO₂充气以测量短路I_sc。在辐照后6天处死所有小鼠。

为了研究SGLT-1动力学，底物(葡萄糖)浓度始于0.05mM，终于10mM。以始于0.05mM并且进展至0.1mM、0.5mM和1mM的速度添加葡萄糖。用Origin8软件(OriginLabCorp.，Northhampton，MA)分析结果。I_sc绘制为Y轴，葡萄糖浓度绘制为X轴。使曲线拟合为Hill’s方程(Hill′sequation)。

为了制备空肠全细胞裂解物，在包含25mMHEPES、10％甘油、1％TritonX-100的三酰甘油水解酶缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物(10mM碘乙酰胺、1mM苯甲基磺酰氟和2μg/ml亮抑酶肽，pH7.4)中裂解正常小鼠和经辐照小鼠的黏膜碎屑。

为了制备刷状缘膜囊泡裂解物，在2mMTris-HCl(pH7.1)/50mMKCl/1MPMSF溶液中使正常小鼠和经辐照小鼠的黏膜碎屑匀浆。用离心机分别以8000RPM和13,000RPM将样本离心，然后再用结核菌素(turberculin)注射器(27G针)和TEFLON匀浆器进行匀浆。然后以4,000RPM离心样本，再以15,000RPM离心样本。用包含蛋白酶抑制剂混合物(10mM碘乙酰胺，1mM苯甲基磺酰氟和2μg/ml亮抑酶肽，pH7.4)的常规林格液重悬样本。

通过Western印迹来分析空肠全细胞裂解物和刷状缘膜囊泡二者的SGLT-1蛋白的蛋白浓度。通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析来自经辐照样本和对照样本的蛋白质等价负荷。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上，并使用亲和纯化的多克隆抗体检测SGLT-1蛋白。

如图8至14所示，结果证明：1)辐照以剂量依赖的方式降低葡萄糖刺激的I_sc；2)在0、1、3、5和7Gy，葡萄糖的K_m值分别为(mM)0.38±0.04、0.49±0.06、1.76±0.16、1.91±0.3、2.32±0.4；3)在0、1、3、5和7Gy，葡萄糖的V_max值分别为387.4±16.2、306.6±16.4、273.2±14.9、212.9±9.14、188.1±9.12；4)IR后约14天，K_m和V_max值恢复到正常水平；5)在辐照后的头10天抑制葡萄糖摄入提高了存活；6)SGLT-1刷状缘膜的Western印迹分析示出SGLT-1蛋白水平随IR的剂量升高而升高。

SGLT-1K_m的升高表明，由于辐照，SGLT-1对葡萄糖的亲和力降低。V_max的降低表明由于辐照引起的绒毛上皮细胞损失也如由组织病理学检查所证明的那样。如在Western印迹分析中所示的，经IR处理的小鼠组织中蛋白质水平的升高表明表达了SGLT1转运蛋白，但其是非功能性的。

结果还证明经口葡萄糖饲喂引起葡萄糖和电解质的吸收不良，这导致渗透性腹泻，因而提高了IR诱导的GI毒性。相反，在IR后的前14天对来自经口饲喂之葡萄糖的抑制预防或者减轻了腹泻症状，并提高了总体存活。

实施例9辐照引起谷氨酰胺转运降低

虽然谷氨酰胺是非必需氨基酸，但是它是肠细胞的主要营养物，并且以高浓度存在于血浆(26％)和骨骼肌(75％)中。随着机体对谷氨酰胺需求的提高，在手术后患者、外伤患者或者危重患者中谷氨酰胺水平下降。因而，认为谷氨酰胺对于消化系统、肾系统、免疫系统和神经系统的正常运作而言是重要的。

该实施例示出，辐照引起转运到细胞中的谷氨酰胺剂量依赖性地降低。在IR≥7Gy时，谷氨酰胺变得主要存在于肠腔中，从而引起渗透性腹泻。谷氨酰胺转运蛋白的饱和动力学示出K_m的IR剂量依赖性地升高(图15)，表明谷氨酰胺转运蛋白对谷氨酰胺的亲和力降低。

实施例10-辐照引起赖氨酸转运的剂量依赖性升高

向小肠内腔侧添加赖氨酸引起I_sc升高，表明赖氨酸的产电转运(图16)。来自未经IR小鼠的组织示出1.16±0.04mM的K_m，而3GyIR组织具有0.27±0.01mM的K_m。不同于葡萄糖和谷氨酰胺，结果示出辐照提高了赖氨酸转运蛋白对赖氨酸的亲和力，因而，升高了赖氨酸吸收。

实施例11-经口赖氨酸饲喂对小鼠存活的影响

该实施例示出，抑制来自经口饲喂的未吸收营养物同时选择性地饲喂吸收的营养物预防或者减轻了腹泻，并且提高了辐照后的存活。

在第一系列实验中，将葡萄糖(10mMi/m，5天，然后隔天)经口施用于经IR小鼠。结果示出，葡萄糖施用降低了总体存活(图17B)。相比之下，作为胃灌洗，将赖氨酸(20mg/小鼠/天)经口施用于经IR小鼠，保持5天，随后隔天。与对照组相比，用赖氨酸处理的小鼠示出升高的存活(图17A)。因而，降低或者限制未吸收营养物(如葡萄糖)的经口摄入，以及被吸收营养物(如赖氨酸)升高的经口摄入可延长经辐照患者的存活。

实施例12-由辐照引起的离子转运蛋白表达水平的变化

该实施例说明了由辐照引起的转运蛋白表达水平的变化。

具体地，在辐照后第6天，收获组织用于Western印迹。如图18所示，回肠组织的Western印迹揭示了1至5Gy的辐照引起升高的NKCC1蛋白水平；而与接受了1至5GyIR的组织相比，NKCC1表达这样的升高在接受了7GyIR的组织中下降(A)。

在辐照之后，NBCe1-A/B蛋白水平显著下降，即便在低至1Gy的剂量下也是如此(B)。与0Gy空肠组织相比，在3Gy辐照之后，空肠组织中的CFTR蛋白水平显著升高(C)。与未经辐照小鼠中的十二指肠、回肠和结肠相比，NBCe1-A/B特异性抗体在空肠中示出升高的表达水平(D)。空肠组织与十二指肠、回肠和结肠相比具有最高的NBCe1-A/B蛋白水平(D)。转运蛋白水平的变化对应于IR后所观察到的功能变化。与未经IR的组织相比，辐照后转运蛋白的表达方式可用于监测经口辐射饮食的有效性。

实施例13-有小肠黏膜损伤的小鼠中营养物和电解质吸收能力的变化

在小肠用辐射、化学治疗处理的以及有小肠炎症的C57BL/6小鼠中观察到了类似方式的小肠吸收能力改变。如实施例1至12所述构建辐射模型。

在化学治疗模型中，所有小鼠均注射了单剂量的5-FU或顺铂。在一些小鼠中，第一次注射后3天，注射第二剂量的5-FU或顺铂。在每次注射之后，在如图20所示的时间点，使用尤斯室测量跨上皮Isc(净阴离子分泌的指标)。对于每次测量，最少检查32个组织。

结果示出，在注射了单剂量顺铂(图20B)或5-FU(图20A)的小鼠中，在第3天净阴离子分泌显著升高。同样，与接受单剂量的小鼠相比，注射了第二剂量化学治疗剂的小鼠显示出显著更高的净阴离子分泌升高。

在克罗恩病模型中，小鼠注射了抗-CD3mAb(模拟克罗恩病之状况的急性炎性模型)。小肠的净阴离子分泌(基于细胞旁电导确定的)和细胞旁渗透性也显著升高。还观察到了营养物和电解质吸收能力的改变。

使用有小肠黏膜损伤的疾病模型(即，辐射模型、化学治疗模型和克罗恩病模型)来确定营养物的吸收能力改变。具体地，将候选营养物经口施用于对照小鼠和分别接受了辐照、化学治疗和抗-CD3mAb的小鼠。此外，经口施用包含候选营养物之多种组合的组合物。

候选营养物选自：赖氨酸、组氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸和葡萄糖。

为了确定各营养物的吸收能力，使用尤斯室进行生物电测量。测量包括：a)钠偶联的氨基酸电流(Isc)和电导变化；b)施用各营养物后，各营养物的饱和动力学变化和Isc变化；c)在存在和不存在特异性候选营养物的条件下，采用同位素通量研究的电解质吸收研究。结果表明，在辐射模型、化学治疗模型和克罗恩病模型中，对于所研究的所有氨基酸和葡萄糖，吸收能力以类似的方式改变。具体地，结果示出经口施用选自以下氨基酸中的每一种改善了小肠愈合，降低了细胞旁电导(从而改善了小肠黏膜屏障机制)，提高了电解质吸收和/或提高了动物存活：赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺和丝氨酸。结果还示出在辐射模型、化学治疗模型和克罗恩病模型中，经口施用葡萄糖和/或谷氨酰胺损伤了小肠黏膜屏障，并且对小鼠存活具有不利作用。

实施例14-在已接受化学治疗的小鼠中改善小肠功能

该实施例示出，本发明的治疗组合物改善了已接受化学治疗之小鼠的小肠愈合。在所研究的所有化学治疗药物中，5-FU示出对小肠的最大毒性。因此，使用5-FU来表征化学治疗模型中电解质和营养物转运的改变。

用5-FU注射NIHSwiss小鼠。注射后5或6天，分离来自小鼠的肠组织，并在尤斯室中研究，暴露于林格液或本发明的治疗组合物。治疗组合物包含赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺和丝氨酸；水；和可治疗用载体，电解质和缓冲剂。治疗组合物是弱碱性(pH7.4)的。治疗组合物不包含葡萄糖、谷氨酰胺或甲硫氨酸。

结果示出，治疗组合物显著地提高了已接受5-FU之小鼠的小肠功能。具体地，治疗组合物显著地降低注射了5-FU之小鼠的小肠中跨上皮Isc(图21A)和跨上皮电导的病理性升高。

实施例15-确定由辐照引起的GI功能的变化

主要的GI功能包括：营养物、电解质和水的吸收，这样的吸收发生于分化良好且成熟的绒毛上皮细胞中。流体和电解质吸收的80％发生在小肠中。如本文所示，IR导致取决于IR剂量的绒毛和/或隐窝的选择性损失，从而导致Na⁺、Cl^-和营养物吸收的降低。该实施例说明了用于确定由随时间IR的多种剂量引起的GI功能改变的实验设计。

方法

使用来自NCI的C57BL/6小鼠(8周龄，雄性)。将身体观察、细胞学、免疫组化、Western分析、血浆替代标记和功能研究确定为IR诱导之GI毒性的特定指标。将小鼠随机分组，使用以1.84Gy/分钟的剂量速率递送IR到腹部的Cs源，以ShepherdMark-I辐照腹部。使小鼠经历0、1、3、5、7和9Gy的IR。在第0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25和30天检测葡萄糖和氨基酸转运变化，每组10只小鼠。在收获组织之前收集血浆样本。收获回肠和空肠组织用于组织病理学、Western印迹、免疫组化和尤斯室研究(进行单独评价)。

A)确定电解质(Na⁺、Cl^-和HCO₃ ^-)的功能改变

该实施例说明了用于确定与IR后电解质吸收相关的转运蛋白功能改变的实验设计。然后使电解质转运功能与血浆标记、细胞学和身体观察(如每日活动、体重、粪便形成和粪便潜血)相关联。使用隐窝测定、H&E染色、BrdU染色、免疫组化和Western印迹分析进行细胞学检查。

首先，在尤斯室中检查Na⁺和Cl^-的跨上皮通量以评价IR后的电解质吸收。处死小鼠，检查未经IR小鼠和经不同剂量IR处理的小鼠中的基础离子转运变化。在规则的上皮中Na⁺和Cl^-吸收是电中性的。

在该实施例中，进行同位素(²²Na和³⁶Cl)置换研究以确定基础的Na⁺和Cl^-运动。简要地，将²²Na和³⁶Cl添加到黏膜或浆膜侧。在每30分钟结束时，从冷侧收集0.5ml样本。使用标准公式来计算单向通量，并表示为μmol.h^-1.cm^-2。计算净通量(J_Net)作为组织对的J_ms通量与J_sm通量的差。实验在短路条件下进行。

此外，使用pH稳定技术来测量HCO₃ ^-分泌的变化。如本文所示，IR使空肠中的HCO₃ ^-分泌降低。HCO₃ ^-分泌对于肠的上段的酸碱平衡和酸中和而言是关键的^72-74。这些实验提出了HCO₃ ^-分泌的可能机制，并且表明正常小鼠和经辐照小鼠中的1)内腔Cl-依赖的HCO₃ ^-分泌，和2)内腔Cl^--非依赖的HCO₃ ^-分泌。碳酸氨盐分泌表示为如下：

其中，D2和D1是在两个时间点之间所添加的总酸之差，0.025表示所添加的酸的常态，2是H₂SO₄的化合价，60表示以分钟计的时间以最终表示每小时的分泌。1.13表示在时间t时尤斯室中所使用组织的表面积。使用pH稳定技术所研究的HCO₃ ^-分泌将补足跨上皮Na⁺和Cl^-通量测量。

离子通量实验、pH稳定研究和跨上皮电测量结果可说明未经IR小鼠和经IR小鼠中的转运过程。

B)确定由辐照引起的营养物吸收功能变化

营养物的肠吸收不良影响IR后的营养状态。如本文所述，在IR后发生营养物的选择性吸收。肠中未吸收的营养物的存在引起渗透性腹泻，这进一步使由辐照引起的损伤复杂化。该实施例说明了用于确定在IR后从肠吸收的营养物的实验设计。

可将易于吸收的营养物包含到本发明的治疗/饮食组合物中以检查多种IR剂量随时间对葡萄糖吸收的作用。

具体地，在IR后于在尤斯室中确定葡萄糖转运的变化。还研究了葡萄糖转运蛋白恢复其正常功能(未经IR的水平)所需的时间。根据小鼠耐受经口葡萄糖的能力得到制剂(ORD)。通过经口支持方案扣除葡萄糖直至葡萄糖转运开始改善。

此外，检查了IR后氨基酸(a.a)转运的变化。由于当转运氨基酸时发生净电荷运动，所以在尤斯室中可检测到产电氨基酸转运。因为没有与电中性氨基酸相关的电荷运动，所以，在刷状缘膜囊泡研究(BBMV)中研究这些转运。在BBMV中研究了产电氨基酸和电中性氨基酸二者以在不同实验方法之间进行比较。

具体地，通过测试来自未经IR和经IR小鼠的刷状缘膜囊泡(BBMV)中代表性氨基酸L-亮氨酸(中性氨基酸)、L-脯氨酸(亚氨基酸(IMINOacid))、L-谷氨酸(酸性氨基酸)和L-半胱氨酸(含硫氨基酸(sulfurateaminoacid))的吸收来研究氨基酸转运系统的四个主要类型。

由IR引起的产电氨基酸转运变化

氨基酸大致分为中性、阳离子性和阴离子性，因为它们的转运特性主要基于电荷(表4)。产电氨基酸转运可通过B^0/+(中性和阳离子性氨基酸)或x^- _AG而发生。通过在存在或不存在内腔Na⁺下进行实验来确定Na偶联的和Na非依赖的氨基酸转运。此外，使用¹⁴C标记的氨基酸在BBMV中研究电中性氨基酸转运。

表4小肠刷状缘膜中的氨基酸转运系统

制备BBMV以研究氨基酸转运和Western印迹

使用镁沉淀方法来分离BBMV⁷⁵。使用Bradford法确定BBMV的总蛋白含量⁷⁶。囊泡贮存于液氮中或者于-80℃下。

评估BBMV的氨基酸吸收

在25℃下，使用由Hopfer等⁷⁵描述的迅速过滤技术(略有更改)进行BBMV的氨基酸吸收。将BBMV悬液(5μl)添加到孵育培养基(45μl)中，所述孵育培养基包含1mmol/l的未标记氨基酸、25μCi/ml的放射性标记的底物L-[U-¹⁴C]亮氨酸、L-[U-¹⁴C]脯氨酸、L-[U-¹⁴C]谷氨酸或L-[³⁵S]半胱氨酸、100mmol/lNaSCN或KSCN、100mmol/l甘露醇、0.1mmol/lMgSO₄和10mmol/lHEPES(pH7.4)。在存在Na⁺梯度(使用含NaSCN的培养基)和不存在Na⁺梯度(含KSCN的培养基)的条件下，测量氨基酸吸收的时间过程。在特定时间间隔，通过添加5ml的冰冷终止液(含150mmol/lKSCN和10mmol/lTris-HEPES(pH7.4))结束吸收过程。立即将悬液倒到预润湿的微孔滤器上，所述预润湿的微孔滤器(Milliporefilter)用3ml冰冷终止液洗涤3次，并浸于5ml的闪烁剂Hisafe3流体(LKBProducts，Bromma，Sweden)中。然后在流体闪烁计数器中对滤器进行计数。先前已测量与过滤器的非特异性结合，并将其从总吸收中减去。结果表示为每毫克蛋白质之氨基酸吸收的皮摩尔数。

C)确定由IR引起的细胞旁渗透性变化

采用以下技术来确定细胞旁渗透性的改变。i)稀释电势；ii)TEER；iii)不同大小的大非离子溶质的渗透；FITC缀合的葡聚糖和罗丹明B异硫氰酸-葡聚糖(isothionate-dextran)。

IR后缓解的稀释电势变化

稀释电势测量用于使用能斯特方程(Nernstequation)来确定Na⁺与Cl^-之间渗透比值的变化。在未经IR小鼠组和经IR小鼠之间比较这些实验的结果。使来自细胞旁渗透性和血浆内毒素研究的结果与电生理学数据和存活数据相关联。

通过黏膜灌注林格液(包含不同浓度的Na⁺)来诱导稀释电势，用甘露醇来调节总摩尔渗透压浓度以保持实验间的等摩尔渗透压浓度。估计其他离子对电导的贡献小于5％，因此被忽略。使用AgCl-AgCl电极和万用表(VCCMC8，PhysiologicinstrumentsInc.)来测量跨膜电势差。针对接界电势(junctionpotential)(通常小于1mV)变化来校正稀释电势。这些实验允许使用以下公式来计算细胞旁通路的氯和钠电导。

IR后通过细胞旁空间之非离子容质渗透变化

使用FITC缀合的葡聚糖和罗丹明B异硫氰酸-葡聚糖(Sigma)在安放于尤斯室的小肠组织中研究对水溶性不带电的多种大小之溶质的细胞旁渗透性。这些研究允许确定由IR引起的细胞旁渗透性变化。

通过紧密连接(tightjunction)形成的细胞间屏障是高度受控的，并且对大小和离子敏感。因此，该细胞间屏障代表半渗透性扩散屏障。设计了实验以确定在基础条件下在正常上皮和暴露于辐射的上皮中对安放于尤斯室中的回肠或空肠组织中不同大小的水溶性不带电溶质的细胞旁渗透性。

向尤斯室的黏膜侧添加溶于林格液中的浓度为3mg/ml的FITC缀合的葡聚糖和罗丹明B异硫氰酸-葡聚糖(Sigma)，并在37℃下保持60分钟。对基底侧浴溶液中的溶液进行取样以对荧光标记的葡聚糖进行定量。FITC-葡聚糖：Exc485nm和Em：544nm，罗丹明B异硫氰酸-葡聚糖：Exc520nm和Em590nm。从安放于浴尤斯室中的小鼠回肠或空肠组织获得标准曲线，以检查渗透性随时间的任何变化。然后，比较经IR小鼠和未经IR小鼠之组织的这些值。

D)确定辐照作用

将处死用于尤斯室和pH稳定研究之小鼠的组织用于H&E染色、BrdU、粪便形成、潜血、体重、免疫组化和Western分析。然后，将这些结果与未经IR和经IR小鼠中电解质和营养物的功能改变以及细胞旁渗透性变化进行比较。

通过隐窝测定、H&E、BrdU染色进行病理学分析

a)隐窝测定/微集落存活测定

使用推测多细胞结构中的克隆源性(‘结构-挽救’)细胞根据泊松统计(Poissonstatistics)起作用的细胞杀伤模型来使目标曲线拟合于数据。推测结构保持完整，直至平均起来每个结构小于3个细胞存活；细胞的存活在所分析的剂量范围中是指数性的(exponential)；并且该结构可从一个或更多个存活细胞再生(regrow)。认为各上皮中心表示能够产生再生性隐窝的一个或更多个克隆源性干细胞的存活。

在IR后3.5天处死小鼠用于隐窝微集落测定。该间隔位于IR后隐窝中有丝分裂恢复的峰处或附近。其用于研究IR的急性作用。

对于对辐照的生物学响应，计算了D₀值和D₁₀值。研究表明，虽然D₀值之间缺少统计上的显著性差异，但是关于的D₀的方差极大地取决于小鼠的数目和每数据点的区间。通过提高大于二之区间的数目和大于四的小鼠数目，不能得到变异系数(～5％)值的降低。因而，以每只小鼠3个区间和每数据点6只小鼠来设计该研究。

b)BrdU染色以检测IR后的有丝分裂活性

用BrdU(30mg/kg体重)注射小鼠，在12、24、48或72小时时处死动物，同时收获组织用于功能研究。每24小时重复一次BrdU注射，在其注射后超过24小时继续进行BrdU标记研究。BrdU标记后，制备小鼠小肠的石蜡切片，并用抗BrdU抗体(Ab)进行染色。针对整个隐窝和绒毛单位，对细胞进行评分。针对每个小鼠分析至少60个隐窝和相应的绒毛。将BrdU标记的细胞以每个隐窝或绒毛的总细胞数目进行归一化。然后，将所得百分数针对诱导时间绘图。这些研究允许确定隐窝祖细胞转变为有丝分裂期后绒毛室的速度、与隐窝中细胞分裂速度和迁移隐窝细胞动力学直接相关⁷⁷。

IR后身体参数的变化

研究了小鼠中的体重、粪便形成和粪便潜血以检测IR后的动物的营养状态变化。对于每日活动和疾病迹象，针对腹泻、缺乏梳理(grooming)、竖起的毛发(ruffledhair)、降低的饮食习性、嗜睡等对所有小鼠每天观察一次，并仔细记录。

将这些研究中的发现与替代标记的血浆分析、病理学观察、Western印迹、免疫组化和功能研究进行比较。

用于确定电解质和营养物转运中所涉及的转运过程之分子改变的Western印迹分析

检查了电解质和营养物吸收中所直接或间接涉及的以下转运蛋白的活性变化。所述转运蛋白包括：CFTR活性(与产电Cl^-分泌相关)、NHE3活性(与Na⁺吸收相关)、绒毛中的NBCe1-A/B活性(与HCO₃ ^-分泌相关)、NKCC1(Na⁺、K⁺和Cl^-基底侧吸收入细胞)、SGLT-1(葡萄糖吸收)、B⁰、B^0/+、b^0/+、PAT(质子偶联的产电转运系统)和X^- _AG(表2)。将这些研究与未经IR、经IR和用ORD处理后的功能数据进行比较。

用于检测转运蛋白、隐窝和绒毛细胞标记的表达方式变化的免疫组化

当处死动物用于功能研究以及用于使用对多种转运蛋白(CFTR、NHE3、NKCC、NBCe1-A/B、SGLT、B⁰、B^0/+、b^0/+、PAT1和X^- _AG)具有特异性的多种抗体进行免疫染色时制作冷冻切片。此外，检测细胞表面标记表达方式以提供对隐窝与绒毛细胞比率的认识。这些研究允许确定经IR或ORD处理之转运蛋白的表达方式改变。

E)用于辐照作用的替代标记的鉴定

虽然有若干研究试图鉴定替代标记以确定从辐射开始的辐射剂量和时间以确定GI毒性的发生，但是这些研究基本上不成功。该实施例说明了允许鉴定替代标记以预测GI毒性发作的实验设计，证明其还可用于涉及多种器官的情形。

具体地，当处死动物用于功能评价(尤斯室)时，收集血浆。在暴露于0、1、3、5、7或9Gy的IR剂量之后，在第1、2、3、6或9天处死小鼠。为了鉴定替代标记物，研究了肠肽、细胞因子和内毒素。

内毒素的血浆分析

测量了血浆内毒素水平。将血浆内毒素水平的变化与细胞旁渗透性、血浆肠肽水平、疾病和存活率的变化相关联。

细胞因子的血浆分析

使用LUMINEX多重珠阵列技术在经IR小鼠和未经IR小鼠中检查血浆细胞因子水平的变化。

肠肽的血浆分析

研究了肠特异性肽，包括胰岛素、胰高血糖素、胰泌素(secretin)、缩胆囊素(cholecystokinin)、瓜氨酸(citrullin)、生长抑素、肽YY、胃饥饿素(ghrelin)、NPY和GLP-2。所有这些肠肽试剂盒购自PhoenixPharmaceuticals，Inc.(CA，USA)。根据制造商的说明书进行实验。

统计分析

比较了正常组织与经IR组织之间的功能差异。使用方差分析(ANOVA)来计算统计显著性。比较这些测定的数据。分析相关系数(R)以确定最佳功能标记。所有统计分析均使用Window的SAS系统的版本9.1(2002-2003SASInstituteInc.，Cary，NC，USA.)进行。如果违反了与特定统计步骤相关的分布假设，则使用合适的转换或非参替代物。构建接受者操作特征(ROC)曲线，使用DeLong等.(1988)的非参方法比较多种功能测试中ROC曲线下方的面积(AUC)。使用用于多重比较的Tukey’s法，将总体1类误差率(family-wiseType1errorrate)控制在0.05。报道了皮尔森(Pearson)相关系数和相关p值及95％置信区间。

实施例16-开发用于治疗IR诱导的胃肠损伤的理想经口方案

该实施例说明了用于开发治疗或改善辐射诱导的GI毒性的经口治疗组合物的实验设计。其还确定了经口再水化饮食(oralrehydrationdiet，ORD)应当开始的时间以及在暴露于多种剂量的IR后至少多长时间应当施用组合物。需要施用ORD的时间取决于K_m恢复至基础水平所需的时间。

方法

使用来自NCI的C57BL/6小鼠(8周龄，雄性)。为了确定转运蛋白的亲和力，通过使用升高浓度的各营养物来计算饱和动力学。初步研究表明，一些氨基酸具有升高的吸收，而一些示出降低的吸收，其中IR后K_m和V_max发生变化。将升高浓度的氨基酸添加到回肠或空肠(进行单独评价)引起I_sc升高。将氨基酸的已知浓度对I_sc绘图允许确定饱和动力学。施用IR后通过胃灌洗选择性地吸收的氨基酸使小鼠存活升高。确定以0、1、3、5、7或9Gy在第0、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25和30天IR的小鼠中确定营养物的K_m和V_max，每组10只小鼠。

A)用于开发理想经口辐射饮食(ORD)的必需氨基酸及葡萄糖的K_m和V_max的确定

如本文所述，辐照引起营养物的转运动力学的变化，表明对各转运蛋白亲和力改变的。使用该技术确定的对葡萄糖转运蛋白的亲和力示出显著下降并且需要约两周以恢复至基础水平。已知肠内腔中未吸收葡萄糖和营养物的存在引起腹泻。确定暴露于不同剂量IR并且在IR后追踪多至30天时间的小鼠中营养物的K_m和V_max。这些研究可用于配制ORD，基于其随时间和辐射剂量的吸收方式。此外，IR后示出提高吸收的营养物可用作系统的替代能量来源。于是，制剂(ORD)可用于存活研究中。

IR后尤斯室中葡萄糖转运的K_m和V_max变化

研究了葡萄糖转运。具体地，研究了葡萄糖的K_m和V_max。在尤斯室实验中将升高浓度的葡萄糖添加到内腔侧，并且记录I_sc的升高。从经口扣除方案中拒绝葡萄糖直至葡萄糖转运开始改善。该制剂基于小鼠耐受经口葡萄糖的能力。

IR后氨基酸(a.a)转运的K_m和V_max变化

通过确定各氨基酸的K_m和V_max来研究基于IR剂量和IR后时间的氨基酸动力学方式。在如上所述设置的尤斯室中确定产电氨基酸的动力学指标。简要地，升高添加到内腔液中的氨基酸的浓度导致升高的I_sc响应，在特定氨基酸浓度下饱和。从饱和曲线计算K_m和V_max。

使用BBMV来研究电中性的氨基酸。在不同浓度的底物(0.025mmol/l至7mmol/l)的存在下，以3s(19)的固定转运时间进行BBMV的氨基酸吸收。使用各实验组的BBMV合并(n＝12)以三个重复进行每个测定。最大速度V_max)表示为在3秒内底物的皮摩尔数/毫克蛋白质，并且转运亲和力常数(K_m)表示为毫摩尔/升。

优化ORD治疗以减轻GI毒性和提高存活

发现剂量范围为20mg/小鼠/天的赖氨酸可提高小鼠的存活。为了通过选择合适施用剂量、频率和间隔来优化ORD方案，对ORD对7天的存活、粪便形成、潜血和体重的影响进行分析。在致死剂量(15.6Gy＝1.2×LD_50/7值)的IR后早至3小时开始ORD，IR的剂量范围由各氨基酸或葡萄糖的K_m值来确定。根据目前用于成人中的葡萄糖和必需氨基酸的推荐日用量，由K_m来计算用于胃灌洗的葡萄糖或氨基酸的浓度。人至小鼠的剂量换算基于K_m因子⁷⁸。因而，K_m与营养物的日剂量之间存在逆相关。如果IR提高K_m(表明对转运蛋白的亲和力下降)，则各营养物的日剂量成比例降低。配制了额外两份ORD剂量，即比所计算的剂量高和低3倍。根据存活研究来确定最佳ORD剂量。

每天重复一次胃灌洗，保持7天。根据存活研究的结果，使ORD胃灌洗的剂量频率和间隔发生变化。GI毒性在IR后第2至3天达峰，然后如果ORD有效的话，到7天逐渐恢复。每天观察小鼠至IR后7天以监测它们的存活。

在IR后7天内，接受常规饮食的所有小鼠均死亡或者被处死(垂死；定义为体重损失20％、不能再梳理、活动降低以及好奇性降低的组合)。如果保护接受ORD处理的小鼠使其不受IR诱导的致死性，那么用额外的10只小鼠/组以相同的处理重复存活实验以确保结果的可重复性。通过Fisher’s精确检验(exacttest)来分析存活数据。

10只动物每组的样本大小确保用以检测对于载剂组而言接近0％与对于各干扰而言60％或更高(在0.017≈0.05/3的经调整α水平下进行成对比较)的存活差异的足够高的效能(power)(＞80％)，以确保5％的总体α水平。在其中未观察到统计显著性差异或者通过ORD处理仅实现部分减轻的事件中，将进行之前所述的新循环的方案优化以确保针对IR诱导之致死性的最大减轻效力。在选择最佳剂量之后，评价是否需要更频繁(每天两次)的ORD胃灌洗以达到更大的辐射减轻和更迅速的隐窝恢复。确定DMF和ORD对IR后治疗的有效性的窗口

剂量变更因子(dosemodificationfactor，DMF)是用以测量辐射缓和剂之有效性的最重要参数之一，其定义为其中T是ORD治疗组，C表示进行常规饮食的对照组⁵¹。为了确定ORD治疗在减轻IR诱导的致死性中的效力，使用由之前的实验所定义的最佳方案，以载剂或ORD处理平均10只C57BL/6小鼠(根据IR剂量，10至20只小鼠/组不等)的组。将经载剂处理的小鼠暴露于11Gy至13GyIR，采用0.5Gy至1Gy的增量。在IR后7天的观察期记录这些小鼠的存活情况。在观察期结束时或者当它们变得垂死时，使小鼠安乐死。

在安乐死后收集小肠和血浆。血液样本用于肠肽分析，而小肠组织样本用于研究IR诱导的肠损伤。LD_50/7值是IR诱导的GI毒性的良好指标。

根据我们实验室之前的观察，经载剂处理的小鼠的LD_50/7接近13Gy。将经ORD处理的组暴露于范围为14.5至16.5GyIR的IR(0.5至1Gy的增量)，如针对经载剂处理小鼠的上述方法进行观察和检查。如果ORD处理组中大量小鼠存活(即便在暴露于16.5Gy后也是如此)，则在后续研究中给予小鼠更高的IR剂量。根据经ORD处理动物的存活曲线来计算其LD_50/7值，然后计算ORD的DMF。经ORD处理小鼠的LD_50/7DMF大于1.2。

为了确定IR后多长时间给出ORD处理，在IR后0、1、3、5、7、9、12和24小时向5组动物施用以ORD，接着进行预定的ORD处理，观察7天，与阳性对照(IR处理后3小时)和阴性对照(盐水载剂)同时进行。根据7天时间点的存活情况比较动物的存活情况。

在该模型中，考虑了IR后已施用ORD的八组的若干逻辑性回归(logistic-regression)模型(结果变量，在7天死亡/存活)和多个时间趋势。考虑了线性模型(因为治疗延缓升高，所以最有可能降低存活)和非线性模型(呈指数的存活下降)二者。

使用Fisher’s精确检验以成对方式进行IR后3小时施用与载剂的比较。存在成对比较(不同时间组对IR后3小时，ORD组以及对载剂)，将个体检验α水平保持在0.005(≈0.05/10)。

a)存活率

对于ORD的处理效果而言的一个主要指标是确定存活率。每天记录两次，并生成存活曲线。

b)每日活动或疾病迹象

针对疾病迹象，如腹泻、缺乏梳理、竖起的毛发、降低的饮食习性、嗜睡等，对所有小鼠每天观察一次，并仔细记录。

c)体重、粪便形成和潜血

为了确定ORD是否可逆转IR诱导的GI毒性的一些作用，将在处死那些动物用于本文所述的功能研究时取出结肠，针对粪便形成绘图并分析粪便的潜血。这些研究允许确定缓和剂是否能够保持裸眼可见的GI黏膜完整性及其功能。

d)免疫组化

使用来自空肠或回肠的H&E染色的切片分析固有层(laminapropria)中的炎性细胞浸润。仔细确定淋巴滤泡的分布频数。

顺序确定针对急性GI毒性的最佳剂量、起始时间和ORD方案。在IR暴露后用不同剂量配方的ORD处理小鼠。通过确定经7天的存活(是对否)作为响应变量以及剂量水平作为说明性变量来在逻辑性回归模型中确定最佳剂量。由于剂量响应曲线的不确定性，提出若干似乎合理的剂量响应模型。确定剂量响应模型之后，计算最小有效剂量(minimumeffectivedose，MED)。通过采用ANOVA模型中的方差和估计平均响应的等效检验回答治疗的起始时间和最佳持续时间。

实施例17确定GI功能的功能改善

在该实施例中，进行电生理学实验以确定ORD如何有助于恢复IR损伤的肠黏膜以吸收电解质和营养物。使功能变化与血浆替代标记、细胞学和身体观察(如每日活动、体重和粪便形成)相关联。粪便潜血、细胞学如隐窝测定、H&E染色、BrdU染色、免疫组化和Western印迹分析。这些研究允许确定在分子、细胞和功能水平上ORD对GI功能的保护作用。

方法

使用来自NCI的C57BL/6小鼠(8周龄，雄性)。进行功能研究、身体观察、细胞学、免疫组化、Western分析，将血浆替代标记用作IR诱导的GI毒性的特定指标。将小鼠随机分组，使用以1.84Gy/分钟的剂量速率递送IR的Cs源以ShepherdMark-I辐照腹部。用1、3、5、7和9Gy辐照小鼠，然后施用ORD。用ORD处理小鼠。在第6天处死小鼠，组织用于功能研究、组织病理学、Western印迹和免疫组化。

A)ORD的作用与电解质和营养物吸收之功能性改善的相关性

使用一系列指标来评价处理效果：1)对小鼠每天称重，紧密观察任何疾病迹象；2)当处死动物用于功能研究(电解质和营养物吸收)、隐窝测定、免疫组化和western印迹分析时，分析血液样本和物理参数。血液样本用于测量血浆内毒素(肠屏障功能障碍的指标)、细胞因子、肠肽(胰岛素、胰高血糖素、胰泌素、缩胆囊肽、瓜氨酸、生长抑素、肽YY、胃饥饿素、NPY和GLP2)、瓜氨酸、葡萄糖和胰岛素。

尤斯室研究中Na⁺和Cl^-的跨上皮通量的确定

为了研究ORD的功能改善，将得自小鼠的空肠和回肠片(进行单独评价)安放于尤斯室中，并如实施例15所述进行实验。比较未经IR、经IR和经ORD处理小鼠组的Na⁺和Cl^-吸收。

使用pH稳定技术确定pfHCO₃ ^-分泌

如实施例15所述进行实验。经ORD处理的HCO₃ ^-分泌恢复表明功能改善。比较未经IR、经IR和经ORD处理小鼠组的HCO₃ ^-分泌。

尤斯室中营养物吸收的确定以及囊泡研究

如实施例15所述，确定葡萄糖、产电氨基酸和电中性氨基酸的吸收。比较未经IR、经IR和经ORD处理小鼠组这些研究的结果。

确定IR后缓和的细胞旁渗透性变化

经ORD处理的细胞旁渗透性降低表明上皮完整性的改善。这些变化将表明血浆内毒素水平的伴随改善。

将ORD作用与隐窝测定、H&E染色、BrdU、粪便形成、潜血、体重、免疫组化和Western分析相关联

该研究类似于之前实施例15所述，并且比较未经IR、经IR和经ORD处理小鼠组的结果。

用以确定解剖学改善的组织病理学分析

如实施例15所示，处理样本用于H&E染色和病理分析，包括隐窝测定、BrdU染色。简要地，将组织在福尔马林中固定，在石蜡块中处理，用H&E染色。

免疫组化用以检测转运蛋白、隐窝和绒毛细胞标记的表达谱(expressionpattern)变化

采用对多种转运蛋白(NHE3、NBCe1-A/B、SGLT、B^0/+、b^0/+、X^- _AG)和细胞表面标记(Lgr5、EphB2和EphB3)具有特异性的多种抗体，将所收获的组织用于免疫染色。该方法类似于实施例15所述。这些研究将有助于确定用ORD处理之后绒毛和隐窝细胞形成的程度。

Western印迹分析用以研究电解质和营养物转运中所涉及的转运过程的分子改变

该方法类似于实施例15所述。将检查CFTR活性(与产电Cl^-分泌相关)、NHE3活性(与Na⁺吸收相关)、绒毛中的NBCe1-A/B活性(与HCO₃ ^-分泌相关)、SGLT-1、B^0/+、b^0/+或X^- _AG。

采用替换标记的血浆分析与ORD的作用相关联

初步研究已示出IR后小鼠中肠肽的变化。检查了替换标记水平相对于基础水平的变化，结果将表明经ORD处理的全身改善。

统计分析

计算原始数据的平均和标准偏差，将采用图解技术如条形图。用以比较这两组(处理对载剂)的主要方法采用基于纵向数据的混合作用模型(线性或非线性)。

本文中所引用的全部参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过引用并入，程度如同各参考文献单独地并且特别是示出通过引用并入并且在本文中以其整体给出。

除非在本文中另有指明，或者明确地与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中所使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。

本文中的值之范围的叙述仅意在作为单独地指落在该范围内的各单独的值的便捷方法，在本文中另有指明除外，各单独的值并入说明书中，如同其在本文中单独引用。除非另有指明，否则本文中所提供的所有准确的值是相应近似值的代表(例如，关于特定因素或测量结果而提供的所有准确的示例性值可理解为还提供相应的近似测量结果，适当时由“约”修饰)。

本文中所提供的任何和全部实施例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅意在更好地说明本发明，并且不对本发明的范围作出限制，另有指明除外。说明书中的任何语言都不应当解释为表示对于本发明的实施而言必要的任何要素，明示地陈述除外。

除非上下文中另有指明，或者明确地与上下文相矛盾，否则使用提及要素的术语如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”的本发明任意方面或实施方案的本文中的描述意在为“由...组成”、“基本由...组成”或“基本包含”特定要素的本发明的类似方面或实施方案提供支持，(例如，除非上下文中另有指明，或者明确地与上下文相矛盾，否则包含特定要素的本文所述的组合物应当理解为还描述由该要素组成的组合物)。

应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅出于举例说明的目的，并且鉴于其的多种修改或变化将提示给本领域技术人员并且包含在本申请的精神和范围内。

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Claims (18)

1.一种无菌的治疗组合物，其用于改善小肠健康，其中所述组合物配制为用于经肠施用，并且包含作为游离氨基酸的色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和酪氨酸；以及水；并且其中所述组合物不包含葡萄糖、谷氨酰胺和甲硫氨酸，或者，如果存在这些成分，则葡萄糖以小于1g/l的浓度存在，谷氨酰胺以小于300mg/l的浓度存在，甲硫氨酸以小于300mg/l的浓度存在。

2.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述组合物的总摩尔渗透压浓度为230mosm至280mosm。

3.根据权利要求2所述的治疗组合物，其还包含天冬氨酸和/或异亮氨酸。

4.根据权利要求1所述的治疗组合物，其中所述组合物不包含葡萄糖、谷氨酰胺和甲硫氨酸。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含电解质、维生素、矿物质和/或矫味剂。

6.权利要求1所述的组合物在制备用于治疗有绒毛萎缩之对象的药物中的用途，其中所述治疗包括通过经肠施用向所述对象施用权利要求1所述的组合物。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述对象是人。

8.根据权利要求6所述的用途，其中所述对象的绒毛区中小肠上皮细胞的总数目与正常相比减少至少10％。

9.根据权利要求6所述的用途，其中所述对象的小肠中绒毛的高度与正常相比损失至少10％。

10.根据权利要求6所述的用途，其中所述组合物不包含葡萄糖、谷氨酰胺和甲硫氨酸，或者，如果存在这些成分中的一种或更多种，则葡萄糖以小于1g/l的浓度存在，谷氨酰胺以小于300mg/l的浓度存在，甲硫氨酸以小于300mg/l的浓度存在。

11.根据权利要求6所述的用途，其中所述组合物还包含天冬氨酸和/或异亮氨酸。

12.根据权利要求6所述的用途，其中所述组合物不包含葡萄糖、谷氨酰胺和甲硫氨酸。

13.根据权利要求6所述的用途，其中所述绒毛萎缩是由疾病、辐射、化学治疗、质子治疗、腹部手术和/或细胞毒性剂造成的。

14.根据权利要求13所述的用途，其中在所述对象接受辐射、化学治疗、质子治疗或细胞毒性剂后施用所述组合物1至14天时间。

15.根据权利要求13所述的用途，其中所述药物用于治疗放射性肠炎。

16.根据权利要求13所述的用途，其用于治疗由化学治疗或选自以下的细胞毒性剂造成的小肠损伤：顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、羟基脲、依托泊苷、阿糖胞苷、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氟达拉滨、甲氨蝶呤、类固醇或其组合。

17.根据权利要求13所述的用途，其中所述药物用于治疗炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、十二指肠溃疡或克罗恩病。

18.一种成套试剂，其包含权利要求1所述的组合物或当与水组合时形成权利要求1所述组合物的粉末，其中所述成套试剂还包含用于向有或预期发生绒毛萎缩之患者施用所述组合物的说明书。