JP6425356B2 - 胃腸機能を改善するための材料および方法 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2010年9月24日に出願された米国特許仮出願第61/386,317号および2011年1月11日に出願された米国特許仮出願第61/431,629号の優先権の恩典を主張する。
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所(NIH)によって授与された助成金番号RC2-AI-087580のもとで、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
発明の背景
腹部および骨盤中の悪性腫瘍に対する一般的治療法である放射線は、急速に分裂する腸上皮細胞から構成される、胃腸(GI)管の内壁に重度の障害を引き起こす場合がある。胃腸系に対する放射線の毒性作用は、悪心、嘔吐、下痢、電解質平衡異常、および脱水症などの症状を引き起こし、癌治療の過程で患者の回復に悪影響を及ぼす。低線量の場合でさえ、放射線照射後数日内に、小腸の絨毛および刷子縁が連続的に消失することが観察されている。陰窩細胞は、軽度〜中程度の線量の(放射線照射)IR後には、その領域に迅速に再配置することができるが、高線量の放射線照射後には、対数的速度で消失した。
放射線照射は、栄養素および電解質の吸収が起こる場である絨毛上皮にとって特に破壊的である。絨毛上皮は、細胞の消失および再生の連続的なプロセスを経、このプロセスでは、リーベルキューン(Lieberkuhn)の陰窩の下極内に位置する前駆細胞に由来する未成熟な腸細胞が恒常的に供給され、陰窩の一番下にある増殖性区画から出て、絨毛の先端へと移動する。短い寿命の間に、これらの腸細胞は、陰窩-絨毛軸に沿って徐々に成熟して、絨毛細胞になる。腹部および骨盤領域に対する放射線療法は、既存の絨毛細胞だけでなく、新しい絨毛細胞が形成する元となる腸細胞も破壊し、したがって、中程度の線量でさえ、絨毛上皮のほぼ全体を枯渇させ得る。
高い合計放射線量および細胞障害性物質の使用が増えているため、放射線療法は、その急性GI毒性が原因で複雑になっている。GI管への障害は、栄養素および液体の吸収不良および喪失をもたらすだけでなく、腸のバリア機能も妨害する。漏れやすい消化管では、粘膜バリアを通過して病原体が容易に侵入することが可能になって、炎症、菌血症、および内毒素血症が引き起こされる。GI毒性は通常、高線量で発生するが、例えば、急性の放射線腸炎、下痢、および腹痛は、5〜12GYという低さの線量でさえ(従来の放射線照射の分割コースでは、分割1回当たり1.8〜2Gyを使用する)、放射線照射後数日内に発症し得る。慢性の放射線腸炎は、放射線療法後18ヶ月〜6年の間に発症し得るが、15年後でさえ発症する場合がある27〜29。
放射線腸炎に対する治療の選択肢は限定されている。従来の治療計画は、体液喪失を防止するための止痢薬、胆汁酸塩の吸着剤としてのスメクタイト、胃痛または直腸痛を軽減するためのオピオイド、および炎症を緩和するためのステロイドの投与を含む。また、下痢予防に関するアシドフィルス菌(L.acidophilus)、スメクタイト、またはスクラルファートの有効性も臨床試験で調査されたが、急性GI症状はいくらか軽減されたにすぎなかった30。
放射線腸炎の治療法の一般的アプローチは、腸の静止をもたらす完全非経口栄養法(TPN)の使用である。しかしながら、非経口栄養法が患者の栄養所要量を満たしているかどうか、または放射線腸炎に対する治療的効果を実際に有するかどうかは、まだ確認されないでいる。TPNは、一定の患者において栄養不均衡を補正することができるが、それでもなお、重度の放射線腸炎は発症し得る37。また、TPNは、通常は投与から48時間以内に腸萎縮を引き起こす。また、TPNは、機構的バリアおよび免疫学的バリアを弱める38。
TPNの実施中に粘膜萎縮をもたらす厳密な生物学的メカニズムは、十分には確立されていないが、局所的な栄養感知細胞シグナル39および体液シグナル、例えば消化管ホルモン40、41の両方を伴うと考えられている。TPNは、腸血流量の急速な(8時間未満)減少を誘発することが示されており、この減少は、24時間目時点の絨毛萎縮およびタンパク質合成の抑制ならびに48時間目時点の細胞増殖および生存の抑制より先に起こる42。一方、経口栄養を行うと、新生仔動物および成熟動物の腸血流量は急速に増加する43、44。同様に、新生仔の子ブタにおいて経腸栄養を行うと、ほとんどすぐに(1〜3時間以内)、食物を欠乏させた子ブタの値より最大50%多くまで、門脈血流(PBF)は増加する45。したがって、様々な研究で示されているように、経腸栄養は、非経口栄養よりはるかに優れている7、8。
現在、放射線腸炎を効果的に緩和できる栄養療法はない。初期の研究において、成分栄養食または特別な除外食が、特定の症例において有益となり得ることが示唆されたが2、31、32、その後、このアプローチの有効性は確認されていない。現行の食事療法は、慢性放射線腸炎を患っている栄養不良患者に栄養支持の手段を提供しているにすぎない。
動物試験により、グルタミンが、化学療法または放射線療法(RT)によって引き起こされる損傷から上部GI管および下部GI管の両方の粘膜を保護することが実証されている33〜35。しかしながら、臨床試験では、グルタミンの経口栄養によって、骨盤放射線療法を受けた患者の急性下痢を予防または緩和できることを示せていない36。したがって、放射線照射によって誘発されるGI損傷を治療するための改良された栄養用組成物の開発が必要とされている。以下の開示から明らかとなるように、これらの利益および他の利益が本発明によって提供される。
簡潔な概要
本発明は、小腸機能を改善するための治療用組成物および方法を提供する。本組成物は、小腸上皮細胞、特に絨毛領域および刷子縁の消失に関連する胃腸損傷の治療もしくは回復のため、ならびに/または小腸の吸収能力の改変に関連する疾患もしくは病態の治療もしくは回復のために有用である。
本治療用組成物は、小腸上皮細胞の消失によって引き起こされる胃腸系の均衡が損なわれた(misbalanced)吸収状態および小腸における輸送タンパク質機能の改変に合わせることができ、有利である。好ましい態様において、本組成物は、経口投与用に製剤化される。
1つの態様において、治療用組成物は、リジン、グリシン、トレオニン、バリン、チロシン、アスパラギン酸、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、およびセリンより選択される1種または複数種の遊離アミノ酸、ならびに任意で、治療的に許容される担体、電解質、ビタミン、緩衝剤、および香味剤を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。治療用組成物は、腸内経路を介して投与される。1つの態様において、組成物の合計モル浸透圧濃度は、約230mosm〜280mosm、または好ましくは、約250〜260mosmである。1つの態様において、組成物のpHは、約7.1〜7.9、好ましくは、約7.4である。
特定の態様において、本発明の組成物は、グルコース、グルタミン、メチオニン、および/またはラクトースを含まない。
また、小腸上皮細胞、特に絨毛領域および刷子縁の消失に関連する疾患または症状、ならびに小腸上皮における輸送タンパク質機能の改変に関連する疾患または症状の治療または回復のための方法も提供される。この方法は、有効量の本発明の組成物をそのような治療を必要とする対象に腸内経路を介して投与する段階を含む。好ましくは、本組成物は、経口投与され、対象の腸に到達する。
本発明はまた、治療用組成物を調製するための方法、および小腸上皮細胞の破壊後にかなりの吸収能力を保持または獲得する栄養素または電解質を選択することによって、本治療的/食事性組成物中に含めるための栄養素または電解質をスクリーニングするための方法も提供する。個々の患者において使用するためにこれらの方法を適応させ、それによって、個々の患者の必要を満たすように特に設計された組成物および方法の開発を容易にすることができる。
[本発明1001]
特に絨毛萎縮の場合に小腸の健康状態を改善するための無菌の治療用組成物であって、経腸投与用に製剤化され、かつ遊離アミノ酸としてのリジン、グリシン、トレオニン、バリン、およびチロシン;ならびに水を含み;かつ合計モル浸透圧濃度が230mosm〜280mosmである、前記無菌の治療用組成物。
[本発明1002]
グルコース、グルタミン、およびメチオニンより選択される1種もしくは複数種の成分を含まないか、またはこれらの成分が存在する場合には、グルコースが1g/l未満の濃度で存在し、グルタミンが300mg/l未満の濃度で存在し、かつメチオニンが300mg/l未満の濃度で存在する、本発明1001の治療用組成物。
[本発明1003]
アスパラギン酸、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、および/またはセリンをさらに含む、本発明1002の治療用組成物。
[本発明1004]
グルコースも、グルタミンも、メチオニンも含まない、本発明1001の治療用組成物。
[本発明1005]
電解質、ビタミン、ミネラル、および/または香味剤をさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
本発明1001の組成物を経腸投与によって対象に投与する段階を含む、絨毛萎縮を有する対象を治療するための方法。
[本発明1007]
対象がヒトである、本発明1006の方法。
[本発明1008]
正常状態と比べた場合に、対象の絨毛領域の小腸上皮細胞の総数が少なくとも10%減少している、本発明1006の方法。
[本発明1009]
正常状態と比べた場合に、対象の小腸の絨毛の高さが少なくとも10%減少している、本発明1006の方法。
[本発明1010]
組成物が、グルコース、グルタミン、およびメチオニンより選択される1種もしくは複数種の成分を含まないか、またはこれらの成分の内の1種もしくは複数種が存在する場合には、グルコースが1g/l未満の濃度で存在し、グルタミンが300mg/l未満の濃度で存在し、かつメチオニンが300mg/l未満の濃度で存在する、本発明1006の方法。
[本発明1011]
組成物が、アスパラギン酸、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、および/またはセリンをさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1012]
組成物が、グルコース、グルタミン、またはメチオニンより選択される1種または複数種の成分を含まない、本発明1006の方法。
[本発明1013]
絨毛萎縮が、疾患、放射線、化学療法、陽子線治療、腹部手術、および/または細胞障害性物質によって引き起こされる、本発明1005の方法。
[本発明1014]
対象が放射線、化学療法、陽子線治療を受けるか、または細胞障害性物質を投与されてから、1日〜14日の期間中に組成物が投与される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
放射線腸炎を治療するために使用される、本発明1013の方法。
[本発明1016]
化学療法、またはシスプラチン、5-フルオロウラシル(5-FU)、ヒドロキシ尿素、エトポシド、アラビノシド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、フルダラビン、メトテキサート、ステロイド、もしくはそれらの組合せより選択される細胞障害性物質によって引き起こされる小腸損傷を治療するために使用される、本発明1013の方法。
[本発明1017]
炎症性腸疾患(IBD)、潰瘍性大腸炎、十二指腸潰瘍、またはクローン病を治療するために使用される、本発明1013の方法。
[本発明1018]
遊離アミノ酸、ジペプチド、単糖、二糖、またはそれらの組合せより選択される1種または複数種の成分を混合する段階を含む、絨毛萎縮を有する対象の腸の健康を増進するための無菌の治療用組成物を調製するための方法であって、
各成分が、正常状態と比べた場合に、絨毛萎縮を有する対象の小腸において少なくとも50%の吸収能力を保持するように決定されており、かつ
該組成物が、1g/lより高い濃度のグルコースも、300mg/lより高い濃度のグルタミンも含まない、前記方法。
[本発明1019]
本発明1018の方法によって作製される組成物。
[本発明1020]
水を含み、かつモル浸透圧濃度が230mosm〜280mosmである、本発明1019の組成物。
[本発明1021]
粉末形態である、本発明1019の組成物。
[本発明1022]
本発明1001の組成物か、または水と混合した場合に本発明1001の組成物を生じる粉末を含むパッケージであって、絨毛萎縮を有するか、または発症すると予想される患者に該組成物を投与するための指示書をさらに含む、前記パッケージ。
正味の陰イオン分泌(A)およびコンダクタンス(B)に対する放射線照射(IR)の影響を示す。(A)12Gy IR組織を1日目、3日目、および4日目に試験した。Iscの最大の増加は2日目に認められた。矢印は、ホルスコリンを添加した時点を示す。(B)正味の陰イオン分泌に対する、IRの線量増加の影響。全組織を6日目にn=12で試験した。結果から、コンダクタンスのIR線量依存的な増加が示された。 放射線照射の線量増加に伴うIsc変化を示す。値はすべて、n=24個の組織に由来する。放射線照射後4日目に、チャンバーの両側の通常のリンガー溶液において、合計モル浸透圧濃度296mosmで実験を実施した。組織病理切片は、0Gyと比べた場合、3Gyの際に最小限の絨毛および陰窩の障害、ならびに7Gyの際に大規模な絨毛および陰窩の障害を示した。 放射線照射の線量増加に伴うIsc変化を示す。値はすべて、n=24個の組織に由来する。放射線照射後4日目に、チャンバーの両側の通常のリンガー溶液において、合計モル浸透圧濃度296mosmで実験を実施した。組織病理切片は、0Gyと比べた場合、3Gyの際に最小限の絨毛および陰窩の障害、ならびに7Gyの際に大規模な絨毛および陰窩の障害を示した。 放射線照射の線量増加に伴うIsc変化を示す。値はすべて、n=24個の組織に由来する。放射線照射後4日目に、チャンバーの両側の通常のリンガー溶液において、合計モル浸透圧濃度296mosmで実験を実施した。組織病理切片は、0Gyと比べた場合、3Gyの際に最小限の絨毛および陰窩の障害、ならびに7Gyの際に大規模な絨毛および陰窩の障害を示した。 放射線照射の線量増加に伴うIsc変化を示す。値はすべて、n=24個の組織に由来する。放射線照射後4日目に、チャンバーの両側の通常のリンガー溶液において、合計モル浸透圧濃度296mosmで実験を実施した。組織病理切片は、0Gyと比べた場合、3Gyの際に最小限の絨毛および陰窩の障害、ならびに7Gyの際に大規模な絨毛および陰窩の障害を示した。 図3Aは、3Gyの放射線照射後のマウス上皮細胞におけるIscの経時的変化を示す。値は、平均値±S.E.Mを表す。n=6個の組織。Iscの最大の増加は、放射線照射後6日目に認められた。5日目、6日目、および7日目とで有意な差は認められなかった。放射線照射後の時間が7日より長くなると、5日目、6日目、または7日目のIscと比べて、Iscは少し減少した。5日目、6日目、および7日目のIsc値は同様であった。図3Bは、小腸上皮細胞のイオン輸送を示す。図3Cは、放射線照射を受けていない組織および3Gyの放射線照射を受けた組織における基礎レベルのIscおよびcAMPによって刺激されたIscに対するブメタニドの影響を示す。図3Dは、正味の陰イオン分泌におけるHCO3 -の寄与を示す。これは、リンガー溶液中のCl-を等モル量のイセチオン酸と交換することによって確認した。ホルスコリンは、0Gyの場合にはIscの増加を促進した(* p<0.02)が、3Gy組織では促進しなかった。図3Eは、HCO3 -分泌に対する浴中Na+の影響を示す。図3に示す結果はすべて、n=6個の組織に由来する。誤差棒は、SEMを表す。 図4Aは、IR後の血漿エンドトキシンレベルの変化を示す。IR後6日目に血漿エンドトキシンレベルを測定した。図4Bは、膜電位の変化(希釈電位)(dilution potential)に対してプロットした、Cl-およびNa+の透過性比の変化を示す。7Gyの放射線照射は、選択性の完全な喪失を引き起こす。 放射線照射により、IL-1βを含む炎症メディエーターのレベルが上昇することを示す。 放射線照射により、TNFαを含む炎症メディエーターのレベルが上昇することを示す。 放射線照射により、MIP-αを含む炎症メディエーターのレベルが上昇することを示す。 放射線照射に起因するHCO3 -分泌の変化およびHCO3 -分泌機構の免疫染色を示す図であり、HCO3 -分泌に対する、浴中Na+存在下の放射線照射の影響を示す。A)140mM Na+を含むCl含有溶液中またはB)Na+を含まないCl含有溶液中において実験を実施した。ホルスコリンを用いて組織を刺激した。HCO3 -分泌を、0Gyおよび3Gyの放射線照射を受けたマウス間のものと比較した。0Gyの場合に、3Gyの放射線照射を受けたマウスと比べて有意に多い浴中Na+依存的HCO3 -分泌が観察された(p<0.001)。結果は、n=6個の組織に由来する。誤差棒は、S.E.Mを表す。 放射線照射に起因するHCO3 -分泌の変化およびHCO3 -分泌機構の免疫染色を示す図であり、NBCe1a/b抗体を用いた、0Gyおよび3Gyの放射線照射を受けたマウスの空腸組織の免疫染色を示す。 放射線照射に起因するHCO3 -分泌の変化およびHCO3 -分泌機構の免疫染色を示す図であり、NBCe1a/b抗体を用いた、0Gyおよび3Gyの放射線照射を受けたマウスの空腸組織の免疫染色を示す。 放射線照射に起因するHCO3 -分泌の変化およびHCO3 -分泌機構の免疫染色を示す図であり、NBCe1a/b抗体を用いた、0Gyおよび3Gyの放射線照射を受けたマウスの空腸組織の免疫染色を示す。 放射線照射に起因するHCO3 -分泌の変化およびHCO3 -分泌機構の免疫染色を示す図であり、NBCe1a/b抗体を用いた、0Gyおよび3Gyの放射線照射を受けたマウスの空腸組織の免疫染色を示す。 グルコース輸送および動態のIR線量依存的な変化を示す。(A)は、放射線照射が、Ussingチャンバーにおいて測定された、グルコースによって刺激されたNa+Iscの線量依存的減少をもたらしたことを示す。(B)は、照射線量が増加するにつれ、グルコースに対するSGLT1親和性が低下したことを示す。 放射線照射により、グルコースによって刺激された電流が、1Gyの放射線照射を始まりとして線量依存的に減少したことを示す。7Gyの放射線照射により、グルコース輸送はほぼ完全に不活性化された。 短絡電流を表示して、グルコース濃度の上昇に伴って飽和動態を示す。特に、グルコース輸送は、濃度4mMで頭打ちになる(saturated)。 放射線照射により、Km値が照射線量依存的に増加することを示す。Kmの最大の増加は、7Gyの場合に観察された。このことから、放射線照射がグルコースに対するSGLT-1の親和性の低下を引き起こしたことが示される。 照射線量が増加するにつれ、Vmaxが減少したことを示す。Vmaxの最小限の減少は、7Gyの場合に観察された。このことから、放射線照射がグルコース輸送のための機能的SGLT-1の減少を引き起こすことが示される。 放射線照射後のKmの経時変化を示す。Kmは、放射線照射の直後に増加し、放射線照射後約14日目に正常(対照値)に戻った。 9Gyおよび15.6Gyの放射線照射後のマウス生存研究の結果を示す。グルコースで処置したマウスの死亡は、5日目および7日目に起こり始めるのに対し、対照マウスは放射線照射後10日目まで死亡しなかった。20日目の時点で、対照マウスの30%が生きていたのに対し、グルコースで処置したマウスは一匹も20日目に生存していなかった。 9Gyおよび15.6Gyの放射線照射後のマウス生存研究の結果を示す。グルコースで処置したマウスの死亡は、5日目および7日目に起こり始めるのに対し、対照マウスは放射線照射後10日目まで死亡しなかった。20日目の時点で、対照マウスの30%が生きていたのに対し、グルコースで処置したマウスは一匹も20日目に生存していなかった。 全細胞溶解物中のSGLT-1タンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す。これらの結果から、放射線照射によってSGLT-1発現が増大することが示された。 空腸組織の刷子縁膜小胞中のSGLT-1タンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す。放射線照射により、SGLT-1タンパク質レベルが線量依存的に上昇した。SGLT-1タンパク質は結腸組織では検出されなかった。 放射線照射が、グルタミンによって刺激されたIscの線量依存的な増加を引き起こしたことを示す。 放射線照射が、リジンによって刺激されたIscの線量依存的な減少を引き起こしたことを示す。 IR後のリジン(A)療法またはグルコース(B)療法の後のマウス生存率を示す。リジンを投与すると生存が増加したのに対し、グルコースを投与すると生存が減少した。 様々な輸送タンパク質のウェスタンブロット解析を示す。マウスの空腸中のNKCC1(A)、CFTR(C)、およびNBCe1-A/B(B)タンパク質レベルを示すウェスタンブロット解析。左から右に向かって、レーンは0Gy、1Gy、3Gy、5Gy、および7Gyに相当する。1〜5Gyの放射線照射からNKCC1タンパク質レベルは上昇し、このような上昇は7Gyで低下した(A)。NBCe1-A/Bタンパク質レベルは、放射線照射後、有意に低下した。空腸組織中のCFTR(C)タンパク質レベルは、0Gyと比べた場合、3Gyの放射線照射後に有意に上昇した。空腸のNBCe1-A/Bタンパク質レベルは、十二指腸、回腸、または結腸でのレベルと比べて最も高かった(D)。組織は、放射線照射後6日目にウェスタンブロットのために採取した。 cAMPによって刺激された(A)陰イオン分泌および放射線照射によって誘発された(B)陰イオン分泌の概略モデルである。 5-フルオロウラシル(5-FU)で処置したマウスの小腸粘膜の損傷を示す図であり、5-FUを注射したマウスにおけるIscの変化を示す。 シスプラチンで処置したマウスの小腸粘膜の損傷を示す図であり、シスプラチンを注射したマウスにおけるIscの変化を示す。 本発明の治療用組成物の投与により、5-FUを与えられたマウスの小腸機能が改善することを示す。 本発明の治療用組成物の投与により、5-FUを与えられたマウスの小腸機能が改善することを示す。
詳細な開示
本発明は、小腸機能を改善するための治療用組成物および方法を提供する。組成物は、経腸投与用に製剤化される。本発明の組成物および方法は、小腸上皮細胞、特に絨毛領域および刷子縁の消失に関連する胃腸損傷の治療もしくは回復のため、ならびに/または小腸上皮における輸送タンパク質機能の改変に関連する疾患もしくは病態の治療のために特に有用である。
本治療用組成物は、小腸上皮細胞、特に小腸の絨毛領域および刷子縁の消失によって引き起こされる、胃腸系の均衡が損なわれた吸収状態、ならびに輸送タンパク質機能の改変に合わされ、有利である。特に、本発明は、小腸粘膜の治癒を改善し、小腸機能を修復し、液体保持を強化し、小腸萎縮を予防もしくは緩和し、かつ/または小腸粘膜が損傷した患者の小腸バリア機能を修復もしくは増強することができる。
1つの態様において、治療用組成物は、リジン、グリシン、トレオニン、バリン、チロシン、アスパラギン酸、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、およびセリンより選択される1種または複数種の遊離アミノ酸、ならびに任意で、治療的に許容される担体、電解質、ビタミン、緩衝剤、および香味剤を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。治療用組成物は、腸内経路を介して投与される。1つの態様において、組成物の合計モル浸透圧濃度は、約230mosm〜280mosmであり、または好ましくは、約250〜260mosmである。1つの態様において、組成物のpHは、約4.0〜8.5、好ましくは5.0〜8.2、より好ましくは6.0〜8.0、より好ましくは7.1〜7.9、および最も好ましくは約7.4である。
特定の態様において、本発明の組成物は、グルコース、グルタミン、メチオニン、および/またはラクトースを含まない。
また、小腸上皮細胞、特に絨毛領域および刷子縁の消失に関連する疾患または病態、ならびに小腸上皮における輸送タンパク質機能の改変に関連する疾患または病態の治療または回復のための方法も提供される。この方法は、有効量の本発明の組成物をそのような治療を必要とする対象に腸内経路を介して投与する段階を含む。
本発明は、小腸粘膜の損傷後に十分な吸収能力を保持または獲得する栄養素のみを対象に経腸栄養すると、粘膜の治癒が改善され、小腸機能が修復され、液体保持が強化され、かつ吸収不良、下痢、悪心、嘔吐、電解質平衡異常、および脱水症を非限定的に含む関連する数々の疾患症状が緩和されるという発見に、少なくともある程度基づいている。
本発明により、放射線療法および化学療法後に、例えば、グルコース、グルタミン、およびリジン、ならびに電解質、例えばNa+、HCO3 -、およびCl-に関して輸送タンパク質機能の改変が観察されることが確認された。さらに、放射線は、正味の陰イオン分泌を増加させる。栄養素および電解質の吸収能力の改変は、放射線療法および化学療法後すぐに起こるが、吸収能力は正常状態に回復することが可能である(マウスモデルの場合、放射線照射後約8〜14日)。
具体的には、放射線は、グルコースに対するナトリウム依存的グルコース輸送系(SGLT-1)の親和性低下が原因で、グルコース吸収に照射線量依存的な減少を引き起こす。グルコース刺激に関する機能研究により、放射線がグルコース輸送活性に線量依存的な低下を引き起こし、グルコースに対するSGLT-1の親和性を低下させることが示された。
腸管腔中に未吸収の栄養素または溶質が存在すると、浸透圧性下痢が生じ得ることが公知である。本発明によれば、放射線照射を受けた対象にグルコースおよび/またはグルタミンを経口栄養すると、浸透圧性下痢および生存短縮が引き起こされることが見出されているが、リジン、グリシン、トレオニン、バリン、チロシン、アスパラギン酸、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、および/またはセリンより選択される各アミノ酸またはそれらの組合せを経口栄養すると、生存が延長する。
小腸機能を改善するための治療用組成物
1つの局面において、本発明は、小腸機能を改善するための治療用組成物を提供する。1つの態様において、治療用組成物は、リジン、グリシン、トレオニン、バリン、チロシン、アスパラギン酸、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、およびセリンより選択される1種または複数種の遊離アミノ酸、ならびに任意で、治療的に許容される担体、電解質、ビタミン、緩衝剤、および香味剤を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。治療用組成物は、腸内経路を介して投与される。
好ましくは、組成物は若干アルカリ性であり、小腸上皮細胞(小腸の絨毛細胞および陰窩細胞など)の浸透圧と比べた場合に低浸透圧性である。好ましくは、本組成物は水を含む。好ましくは、組成物は、絨毛上皮細胞の消失または損傷が原因で衰えている小腸機能を改善するための経口補水飲料として調製される。
1つの態様において、組成物の合計モル浸透圧濃度は、約230mosm〜280mosm、またはその間の任意の値である。好ましくは、合計モル浸透圧濃度は、約250〜260mosmである。別の態様において、組成物の合計モル浸透圧濃度は、280mosmより小さい任意の値である。
1つの態様において、組成物のpHは、約7.1〜7.9、またはその間の任意の値である。好ましくは、組成物のpHは、約7.3〜7.5、より好ましくは約7.4である。
特定の態様において、各遊離アミノ酸は、4mM〜40mM、またはその間の任意の値の濃度で存在してよく、その際、組成物の合計モル浸透圧濃度は、約230mosm〜280mosmである。あるいは、アミノ酸濃度をmg/lに基づいて算出する場合、各遊離アミノ酸は、300mg/l〜8000mg/L、またはその間の任意の値の濃度で存在してよく、その際、組成物の合計モル浸透圧濃度は、約240mosm〜280mosmである。
特定の具体的な態様において、治療用組成物は、以下の各濃度で存在する1種または複数種の遊離アミノ酸を含む:約730〜6575mg/lもしくはその間の任意の値の濃度のリジン;約532〜4792mg/lもしくはその間の任意の値の濃度のアスパラギン酸;約300〜2703mg/lもしくはその間の任意の値の濃度のグリシン;約525〜4722mg/lもしくはその間の任意の値の濃度のイソロイシン;約476〜4288mg/lもしくはその間の任意の値の濃度のトレオニン;約725〜6523mg/lもしくはその間の任意の値の濃度のチロシン;約469〜4217mg/lもしくはその間の任意の値の濃度のバリン;約817〜7352mg/lもしくはその間の任意の値の濃度のトリプトファン;約528〜4756mg/lもしくはその間の任意の値の濃度のアスパラギン;および/または約420〜3784mg/lもしくはその間の任意の値の濃度のセリン;ここで、組成物の合計モル浸透圧濃度は、約240mosm〜280mosmである。
1つの態様において、本発明は、次の構成要素:リジン(11〜21mosm)、アスパラギン酸(3〜13mosm)、グリシン(19〜29mosm)、イソロイシン(19〜29mosm)、トレオニン(19〜29mosm)、チロシン(0.5〜5mosm)、バリン(19〜29mosm)、トリプトファン(5〜20mosm)、アスパラギン(3〜13mosm)、およびセリン(3〜8mosm)、またはこれらの成分の部分集団を含む飲料を提供する。
1つの特定の態様において、組成物は、遊離アミノ酸の形態のリジン、グリシン、トレオニン、バリン、およびチロシンを含む。別の特定の態様において、組成物は、遊離アミノ酸の形態のリジン、グリシン、トレオニン、バリン、チロシン、アスパラギン酸、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、およびセリンを含む。
さらなる態様において、組成物は、リジン、グリシン、トレオニン、バリン、チロシン、アスパラギン酸、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、またはセリンより選択される同じアミノ酸または異なるアミノ酸からできている1種または複数種のジペプチドを含む。
1つの態様において、組成物は、グルタミンおよび/またはメチオニン;ならびに加水分解されてグルタミンおよび/またはメチオニンになり得る任意のジペプチド、オリゴペプチド、もしくはポリペプチドまたはタンパク質を含まない。
代替の態様において、組成物は、遊離アミノ酸グルタミン、および任意で、1種または複数種のグルタミン含有ジペプチドを含んでよく、その際、遊離アミノ酸グルタミンおよびグルタミン含有ジペプチドの合計濃度は300mg/l未満であるか、または300mg/l未満の任意の濃度、例えば、100mg/l、50mg/l、10mg/l、5mg/l、1mg/l、0.5mg/l、もしくは0.01mg/lなどである。
別の代替の態様において、治療用組成物は、遊離アミノ酸メチオニン、および任意で、1種または複数種のメチオニン含有ジペプチドを含んでよく、その際、遊離アミノ酸メチオニンおよびメチオニン含有ジペプチドの合計濃度は300mg/l未満であるか、または300mg/l未満の任意の濃度、例えば、100mg/l、50mg/l、10mg/l、5mg/l、1mg/l、0.5mg/l、もしくは0.01mg/lなどである。
1つの態様において、治療用組成物は、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、および炭水化物を含むいかなる糖類も含まない。1つの特定の態様において、治療用組成物は、グルコース、ならびに/または加水分解されてグルコースになり得る任意の二糖、オリゴ糖、多糖、および炭水化物を含まない。特定の態様において、組成物はラクトースを含まない。別の特定の態様において、治療用組成物は、フルクトースおよび/もしくはガラクトース、ならびに/または加水分解されてフルクトースおよび/もしくはガラクトースになり得る任意の二糖、オリゴ糖、多糖、および炭水化物を含まない。
代替の態様において、治療用組成物は、単糖グルコース、および任意で、ラクトース以外の1種または複数種のグルコース含有二糖を含んでよく、その際、単糖グルコースおよびグルコース含有二糖の合計濃度は3g/l未満であるか、または3g/l未満の任意の濃度、例えば、1g/l、500mg/l、300mg/l、100mg/l、50mg/l、10mg/l、5mg/l、1mg/l、0.5mg/l、もしくは0.01mg/lなどである。
特定の態様において、治療用組成物は、例えば、Na+、K+、HCO3 -、CO3 2-、Ca2+、Mg2+、Fe2、Cl-;リン酸イオン、例えば、H2PO4 -、HPO4 2-、およびPO4 3-;亜鉛、ヨウ素、銅、鉄、セレニウム、クロミウム、およびモリブデンより選択される1種または複数種の電解質を含む。代替の態様において、組成物はHCO3 -もCO3 2-も含まない。別の代替の態様において、組成物は、合計濃度が5mg/l未満または5mg/l未満の濃度であるHCO3 -およびCO3 2-を含む。
さらなる態様において、治療用組成物は、限定されるわけではないが、ビタミンA、ビタミンC、ビタミンD(例えば、ビタミンD1、D2、D3、D4、および/またはD5)、ビタミンE、ビタミンB1(チアミン)、ビタミンB2(例えばリボフラビン)、ビタミンB3(例えば、ナイアシンまたはナイアシンアミド)、ビタミンB5(パントテン酸)、ビタミンB6(ピリドキシン)、ビタミンB7(ビオチン)、ビタミンB9(例えば、葉酸塩または葉酸)、ビタミンB12(コバラミン)、およびビタミンK(例えば、ビタミンK1、K2、K3、K4、およびK5)、ならびにコリンを含む、1種または複数種のビタミンを含む。
特定の態様において、組成物は、オリゴ糖、多糖、および炭水化物;オリゴペプチドもしくはポリペプチドまたはタンパク質;脂質;短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸、および/もしくは長鎖脂肪酸より選択される1種もしくは複数種の成分;ならびに/または1種もしくは複数種の前記栄養素を含む食物を含まない。
1つの態様において、H2PO4 -、HPO4 2-、およびPO4 3-などのリン酸イオンが、本発明の組成物を緩衝するために使用される。1つの態様において、治療用組成物は、HCO3 -またはCO3 2-を緩衝剤として使用する。別の態様において、治療用組成物は、HCO3 -もCO3 2-も緩衝剤として使用しない。
「本質的に〜からなる」という用語は、本明細書において使用される場合、成分および段階の範囲を、指定された材料または段階、および本発明の基本的特徴および新規な特徴、すなわち、小腸上皮、特に絨毛領域および刷子縁の損傷を治療するための組成物および方法に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。例えば、「本質的に〜からなる」を用いる場合、治療用組成物は、限定されるわけではないが、小腸上皮、特に絨毛領域および刷子縁の損傷の治療に対して直接的で有益な治療的効果または有害な治療的効果を有する遊離アミノ酸、ジペプチド、オリゴペプチド、もしくはポリペプチド、またはタンパク質;ならびに単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、および炭水化物を含むいかなる不特定成分も含まない。また、「本質的に〜からなる」という用語を用いる場合、組成物は、小腸上皮の損傷の治療に対して治療的効果を有していない物質を含んでよい;このような成分には、損傷した小腸上皮、特に絨毛領域および刷子縁の健康状態にも機能にも影響を及ぼさない担体、賦形剤、補助剤、香味剤などが含まれる。
「オリゴペプチド」という用語は、本明細書において使用される場合、3〜20個のアミノ酸からなるペプチドを意味する。「オリゴ糖」という用語は、本明細書において使用される場合、3〜20個の単糖からなる糖類を意味する。
1つの態様において、本発明の組成物は、小腸上皮細胞(絨毛細胞、陰窩細胞、腸細胞、および腸前駆細胞など)に損傷がない正常対照の吸収能力と比べた場合に、小腸上皮細胞に損傷がある対象において向上した吸収能力を保持または獲得する栄養素(例えば遊離アミノ酸)および/または電解質を含む。
さらなる態様において、本発明の組成物は、小腸上皮細胞(絨毛細胞、陰窩細胞、腸細胞、および腸前駆細胞など)に損傷がない正常対照の吸収能力と比べた場合に、小腸上皮細胞に損傷がある対象において吸収されない、または吸収が減少している栄養素(例えばアミノ酸)および/または電解質を含まない。本発明の組成物は、腸による栄養素の容易な吸収を促進して過度のエネルギー消費を減少させ、それによって、粘膜損傷後の直後の時間帯に腸を安静にさせるため、有利である。
小腸機能を改善するための治療方法
本発明の別の局面は、小腸上皮細胞、特に絨毛領域および刷子縁の消失または損傷に関連する疾患または病態の治療または回復のための方法を提供する。1つの態様において、小腸上皮細胞の消失または損傷は、栄養素、電解質、および/または液体の吸収能力の改変をもたらす。有利なことには、小腸上皮細胞が消失または損傷した患者、特に小腸絨毛萎縮の患者に対して、本発明は、小腸粘膜の治癒を改善し;小腸機能を改善し;小腸における栄養素吸収および液体保持を強化し;小腸萎縮を予防もしくは緩和し;腹痛を緩和し;下痢を予防および/もしくは治療し;小腸バリア機能を修復もしくは増強し;かつ/または小腸粘膜の炎症、菌血症、および/もしくは内毒素血症を軽減する。
したがって、本発明は、細胞障害性の化学療法剤、骨盤放射線療法または腹部放射線療法、陽子線治療、および腹部手術を施されている対象;小腸の急性または慢性の炎症を伴う感染症または自己免疫疾患に苦しんでいる対象;放射線に日常的または偶発的に被爆する対象、例えば、宇宙放射線に日常的に被爆している宇宙飛行士およびパイロットならびに核事故、戦争行為、またはテロ行為が原因で放射線に被曝する対象の胃腸の健康状態を改善するために特に有益である。
1つの態様において、方法は、有効量の本発明の組成物をそのような治療を必要とする患者または対象に腸内経路を介して投与する段階を含む。組成物は、小腸上皮細胞の損傷の直前、最中、および/または後に患者または対象に投与することができ、毎日1回または複数回投与することができる。
「対象」または「患者」という用語は、本明細書において使用される場合、本発明による組成物を用いた治療が提供され得る、霊長類のような哺乳動物を含む生物を示す。開示される治療方法から利益を受け得る哺乳動物種には、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト、サル;イヌ、ネコなど飼い慣らされた動物;ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜;ならびにマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの動物が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
1つの特定の態様において、治療を必要とする対象は、十二指腸、空腸、および回腸の粘膜層を含む、小腸粘膜上皮細胞が損傷している患者である。特に、治療を必要とする対象は、小腸の絨毛領域および刷子縁が損傷している患者である。例えば、治療を必要とする対象は、絨毛萎縮(例えば、絨毛領域および刷子縁の部分的または全面的な萎縮)が起こっているか;小腸中の絨毛細胞が少なくとも5%(少なくとも10%、20%、30%、もしくは50%など)減少しているか;正常状態と比べた場合に、絨毛の高さが少なくとも5%(少なくとも10%、20%、30%、もしくは50%など)減少しているか;小腸の絨毛領域および刷子縁中の1つもしくは複数の輸送体の機能が消失しており、輸送体には、SGLT-1輸送体、AE2輸送体、NHE1輸送体、およびNBCe1-A/B輸送体が非限定的に含まれ、輸送体機能の消失は、少なくとも5%(少なくとも10%、20%、30%、もしくは50%など)であるか;かつ/または小腸における1種もしくは複数種の栄養素の吸収能力が変化しており、栄養素は、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、ヒスチジン、チロシン、アラニン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸、アスパルタート、システイン、グリシン、プロリン、セリン、アスパラギン、グルコース、フルクトース、および/もしくはラクトースより選択され、吸収能力の変化は少なくとも5%(少なくとも10%、20%、30%、もしくは50%など)である。
小腸の吸収能力の変化は、本明細書において材料および方法のセクションで示すように、例えばUssing Chamberを用いて測定することができる。例えば、吸収状態の変化は、例えば、Km、Vmax、およびIscを例として含む指数の組合せを測定することによって確認することができる。小腸の絨毛領域および他の領域の損傷は、例えば、小腸粘膜の生検試料を検査することによって確認することができる。
熟練した臨床家は、小腸絨毛細胞のような小腸粘膜上皮細胞に損傷を引き起こす疾患および治療的処置を容易に決定することができる。医学界で公知であるように、炎症性腸疾患(IBD)、潰瘍性大腸炎、十二指腸潰瘍、およびクローン病など特定の疾患に罹患している患者は、小腸粘膜の慢性的な破壊に苦しんでいる。放射線療法、化学療法、および陽子線治療もまた、小腸細胞の損傷を引き起こす。
「治療(treatment)」という用語またはその任意の文法的変形(例えば、治療する(treat)、治療すること(treating)、および治療(treatment)など)は、本明細書において使用される場合、疾患もしくは病態の症状を緩和すること;ならびに/または疾患もしくは病態の進行、重症度、および/もしくは範囲を低減するか、抑えるか、抑制するか、減らすか、もしくはそれらに影響を及ぼすことを含むが、それに限定されるわけではない。
「回復(amelioration)」という用語またはその任意の文法的変形(例えば、回復させる(ameliorate)、回復させること(ameliorating)、および回復(amelioration)など)は、本明細書において使用される場合、疾患もしくは病態(例えば、下痢、菌血症、および/もしくは内毒素血症)の発症を遅らせること、またはその重症度を軽くすることを含むが、それに限定されるわけではない。本明細書において使用される場合、回復とは、症状が全くないことを求めはしない。
「有効量」という用語は、本明細書において使用される場合、疾患もしくは病態を治療するかもしくは回復させることができるか、またはそうでなければ、所期の治療的効果をもたらすことができる量を意味する。
1つの特定の態様において、本発明は、小腸上皮細胞が損傷した対象の腸の健康を増進するための方法を提供し、該方法は、小腸上皮細胞が損傷しているか、またはそのような損傷を今にも負おうとしており、治療もしくは回復を必要としている対象を特定する段階、ならびにリジン、グリシン、トレオニン、バリン、チロシン、アスパラギン酸、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、およびセリンより選択される1種または複数種の遊離アミノ酸、水、ならびに任意で、治療的に許容される担体、電解質、ビタミン、緩衝剤、および香味剤を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる組成物であって、合計モル浸透圧濃度が、240〜280mosmであり、pHが約7.1〜7.9である組成物の有効量を対象に腸内経路を介して投与する段階を含む。
1つの態様において、以下の栄養素の内の1種または複数種は、小腸上皮細胞が損傷しているか(または今にも損傷する)対象に腸内経路を介して投与されず、これらの栄養素は、グルタミン、メチオニン、ならびに加水分解されてグルタミンおよび/もしくはメチオニンになり得る任意のジペプチド、オリゴペプチド、もしくはポリペプチドまたはタンパク質;グルコース、ならびに加水分解されてグルコースになり得る任意の二糖、オリゴ糖、多糖、および炭水化物;ならびに/または消化された際に、小腸において前述の栄養素の内のいずれかの吸収を必要とする食物より選択される。
さらなる態様において、小腸上皮細胞が損傷しているか(または今にも損傷する)対象に対して、以下の栄養素の内のどれも、腸内経路を介して投与されず、これらの栄養素は、糖類、脂質、脂肪酸、および/または消化された際に、小腸において前述の栄養素の内のいずれかの吸収を必要とする食物より選択される。放射線に被曝するか、または放射線療法、化学療法、および陽子線治療を受ける患者の場合、典型的には小腸上皮細胞の損傷は少なくとも3日間、7日間、14日間、21日間、30日間、または1〜30日の間の任意の期間、続く。
さらなる態様において、対象が放射線に被爆するか、または放射線療法、化学療法、および/もしくは陽子線治療を受けてから1〜30日の間の任意の期間の後(3日後、7日後、14日後、21日後、30日後など)、以下の栄養素の内の1種または複数種が、粘膜治癒を促進するために腸内経路を介して投与され、これらの栄養素は、グルタミン、メチオニン、ならびに加水分解されてグルタミンおよび/もしくはメチオニンになり得る任意のジペプチド、オリゴペプチド、もしくはポリペプチドまたはタンパク質;グルコース、ならびに加水分解されてグルコースになり得る任意の二糖、オリゴ糖、多糖、および炭水化物;ならびに/または消化された際に、小腸において前述の栄養素の内のいずれかの吸収を必要とする食物より選択される。
特定の態様において、本組成物は、経口投与され、対象の小腸に到達する。任意で、方法は、腸内経路を介しては十分な量が投与されない必要な栄養素および電解質を非経口経路を介して投与する段階をさらに含む。
1つの態様において、本発明は、不可欠な栄養のかなりの量またはすべてを対象に提供するためには使用されないが、小腸粘膜の治癒を改善し、小腸機能を修復し、液体保持を強化し、小腸繊毛萎縮を予防もしくは緩和し、下痢を予防および/もしくは治療し、かつ/または腸バリア機能を修復もしくは増強するために使用される。特定の態様において、飲料の組成はまた、バリア機能の改善に基づいている。バリア機能は、a)Ussingチャンバーに取り付けた組織におけるコンダクタンス測定値の増加、b)ClおよびNaの相対的透過性(PCl/PNa)を測定するために使用される希釈電位(無傷で機能的なバリアのみが、イオン選択性を維持できる;バリア機能が失われた場合、イオン選択比は1に近い)、ならびにc)血漿エンドトキシンレベルの測定を含む複数の技術を用いて判定することができる。粘膜のバリア機能が失われた場合、片利共生の腸細菌は、体循環に侵入することができ、その結果、血漿エンドトキシンレベルが上がる。エンドトキシンレベルは、患者の血液試料において測定することができる。また、血漿エンドトキシンレベルは、治療による改善を測定するための指標としても使用され得る。
本発明の組成物は、小腸上皮細胞の消失、破壊、または減少、特に、小腸の絨毛細胞、腸細胞、および/または腸前駆細胞の機能または数の損失、破壊、または減少に関連する任意の疾患または病態の治療または回復において使用され得る。本発明は、小腸上皮細胞中の輸送タンパク質、特に、小腸の絨毛細胞中の輸送タンパク質の消失、不活性化、または機能改変に関連する任意の疾患または病態の治療または回復のために特に有用である。
1つの態様において、本発明の組成物および方法は、グルコースに対するナトリウム依存的グルコース輸送系(SGLT-1)の親和性低下;NH2末端起電性Na+-HCO3(-)共輸送体(NBCe1-A/B)の活性の消失もしくは低下;頂端側Cl--HCO3 -交換輸送体(AE1)の活性の消失もしくは低下;ならびに/またはCFTR輸送体系および/もしくはNKCC-1輸送体系のレベルもしくは活性の上昇に起因するか、または関連している疾患または病態の治療または回復において使用され得る。
特に好ましい態様において、本発明の組成物および方法は、放射線によって引き起こされる小腸損傷の治療または回復において使用され得る。特定の態様において、本発明は、放射線療法、特に骨盤放射線療法および腹部放射線療法によって引き起こされる小腸損傷の治療または回復において使用され得る。特定の態様において、放射線療法は、癌治療のためのものである。
さらに、本発明は、日常的な放射線被爆、例えば、宇宙飛行士およびパイロットの宇宙放射線被爆;放射性武器および不慮の核放出によるものなどの放射線被爆によって引き起こされる小腸損傷の治療または回復において使用され得る。具体的には、本発明は、急性および/または慢性の放射線腸炎を治療するか、または回復させるために使用され得る。
特定の具体的な態様において、本発明の組成物および方法は、1Gy、2Gy、3Gy、4Gy、5Gy、6Gy、7Gy、8Gy、9Gy、10Gy、11Gy、12Gy、13Gy、14Gy、15Gy、16Gy、17Gy、18Gy、19Gy、または20Gyの放射線を受けた患者において、小腸損傷の治療または回復において使用され得る。別の態様において、対象は、20Gyより高い線量の放射線を受けた。
さらに、本発明は、限定されるわけではないが、シスプラチン、5-フルオロウラシル(5-FU)、ヒドロキシ尿素、エトポシド、アラビノシド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、フルダラビン、メトテキサート、ステロイド、および/またはそれらの組合せを含む化学療法剤によって引き起こされる小腸損傷の治療または回復において使用され得る。
さらに、本発明は、陽子線治療によって引き起こされる小腸損傷の治療または回復においても使用され得る。
特定の態様において、本発明は、限定されるわけではないが、炎症性腸疾患(IBD)、潰瘍性大腸炎、十二指腸潰瘍、クローン病、および/または小児脂肪便症(セリアック病としても公知)を含む、小腸損傷を伴う疾患の治療または回復において使用され得る。本発明は、ウイルス性感染症、細菌感染症、真菌感染症、または他の微生物感染症などの病原体感染症に起因する小腸損傷の治療または回復において使用され得る。
1つの特定の態様において、本発明は、小腸の絨毛萎縮、すなわち絨毛領域および刷子縁の部分的または全面的な萎縮、ならびに小腸の絨毛萎縮に起因するか、関連するか、かつ/またはそれらによって引き起こされる疾患および病態の治療または回復において使用され得る。
特定の態様において、本発明は、限局性の絨毛萎縮および/もしくは広汎性の絨毛萎縮;過形成性の絨毛萎縮および/もしくは低形成性の絨毛萎縮;ならびに/または粘膜炎症を伴う絨毛萎縮および粘膜炎症を伴わない絨毛萎縮の治療または回復において使用され得る。
特定の態様において、本発明は、(陰窩過形成を伴う)過形成性の絨毛萎縮、ならびに限定されるわけではないが、(グルテン感受性腸疾患を伴う)小児脂肪便症;慢性的外傷;小腸移植;尿管回腸導管(urinary ileal conduit);腸粘膜炎症;腸潰瘍;腸管吻合;グルカゴノーマ;広範囲の小腸切除;原発性の回腸絨毛萎縮;顕微鏡的大腸炎による萎縮;腸微絨毛萎縮;およびミトコンドリア細胞症(ミトコンドリア呼吸鎖異常)を含む関連する疾患および病態の治療または回復において使用され得る。
特定の態様において、本発明は、低形成性の絨毛萎縮(陰窩過形成を伴わない)、ならびに限定されるわけではないが、悪性腫瘍;パネート細胞欠損;下垂体機能低下症;グルテンを含まない食事に無応答性の小児脂肪便症;熱帯性スプルー;放射線に関連した虚血;ネオマイシンおよびアザチオプリンによって誘発される絨毛萎縮のような薬剤誘発性絨毛萎縮を含む関連する疾患および病態の治療または回復において使用され得る。
特定の態様において、本発明は、粘膜炎症を伴う絨毛萎縮、ならびに限定されるわけではないが、小児脂肪便症;重度の食事性不耐症;先天性クローン病;自己免疫性腸疾患;全腸炎;および免疫不全症候群を含む関連する疾患および病態の治療または回復において使用され得る。
特定の態様において、本発明は、限定されるわけではないが、肝炎;腸癌;腸リンパ腫;1型糖尿病;アレルギー;好酸球性胃腸炎;ウイルス性胃腸炎;および自己免疫性腸疾患を含む疾患によって引き起こされる絨毛萎縮の治療または回復において使用され得る。
特定の態様において、本発明は、限定されるわけではないが、マーシュ分類の3a型絨毛萎縮(腸細胞100個当たりの上皮内リンパ球数>40;中程度の絨毛萎縮)、マーシュ分類の3b型絨毛萎縮(腸細胞100個当たりの上皮内リンパ球数>40;著しい絨毛萎縮)、マーシュ分類の3c型絨毛萎縮(腸細胞100個当たりの上皮内リンパ球数>40;絨毛領域がない、またはほとんどない)(小児脂肪便症および腸絨毛萎縮の改良型マーシュ分類に基づく)を含む、小腸の小児脂肪便症に関連した絨毛萎縮の治療または回復において使用され得る。
本発明はまた、限定されるわけではないが、吸収不良、下痢、悪心、嘔吐、電解質平衡異常、吸収不良、および脱水症を含む、小腸損傷に関連する症状を治療するか、または回復させるためにも使用され得る。
小腸機能を改善するための治療用組成物の調製
別の局面において、本発明の治療用組成物を調製するための方法が提供される。1つの態様において、この方法は、小腸上皮細胞が消失または損傷した対象の腸の健康を増進するための組成物を調製する段階を含み、この組成物は、小腸上皮細胞が消失または損傷した対象の小腸によって吸収される有効量の1種または複数種の成分を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、組成物の合計モル浸透圧濃度は、230mosm〜280mosmまたはその間の任意の値(好ましくは約250mosm〜260mosm)であり、組成物のpHは、約7.1〜7.9またはその間の任意の値(好ましくは約7.4)であり、組成物は経腸投与用に製剤化される。
1つの態様において、それらの成分は、遊離アミノ酸、ジペプチド、単糖、二糖、またはそれらの組合せ、ならびに任意で、電解質、ビタミン、香味剤、および/または担体より選択される。
1つの態様において、本発明は、小腸上皮細胞の絨毛領域および陰窩領域の破壊後に吸収能力を保持または獲得する栄養素または電解質を選択することによって、本治療用組成物中に含めるための栄養素または電解質をスクリーニングするための方法も提供する。
本スクリーニング方法は、腸上皮細胞の消失、破壊、または減少、特に、絨毛細胞、腸細胞、および/または腸前駆細胞の消失、破壊、または減少に関連する疾患または病態の治療または回復において使用され得る治療的な栄養素および/または電解質を決定するために使用され得る。特定の態様において、これらの方法は、特定の患者または患者群の必要を満たすための組成物および方法を設計するために使用され得る。特定の態様において、本組成物は、放射線療法、化学療法、陽子線治療後の、または小腸の急性炎症もしくは慢性炎症に起因する、小腸損傷の治療または回復のために有用である。
1つの態様において、本スクリーニング方法は、以下の段階を含む:
a)粘膜が損傷している小腸上皮組織を候補の栄養素または電解質と接触させる段階;
b)小腸上皮組織が該栄養素または電解質を吸収する能力のレベルを判定する段階;
c)該レベルを(正常組織の場合のような)あらかじめ定められたレベルと比較する段階;および
d)候補の栄養素または電解質の吸収能力が、例えば、あらかじめ定められたレベルの少なくとも50%、60%、70%、80%、または90%である場合、候補の栄養素または電解質を選択する段階。
1つの態様において、本スクリーニング方法は、以下の段階を含む:
a)小腸粘膜が損傷している対象に腸内経路を介して候補の栄養素または電解質を投与する段階;
b)該栄養素または電解質の腸吸収能力のレベルを判定する段階;
c)該レベルを(正常対象の場合のような)あらかじめ定められたレベルと比較する段階;および
d)候補の栄養素または電解質の吸収レベルが、例えば、あらかじめ定められたレベルの少なくとも50%、60%、70%、80%、または90%である場合、候補の栄養素または電解質を選択する段階。
吸収能力のレベルは、例えば、Km、Vmax、およびIscを含む指数の組合せに基づいて判定することができる。
あらかじめ定められた参照値は、当業者によって明らかにされ得る。例えば、あらかじめ定められた参照値は、粘膜が損傷していない正常な小腸上皮組織(絨毛細胞、陰窩細胞、腸細胞、および腸前駆細胞など)における前記栄養素または電解質の吸収能力のレベルを測定することによって明らかにされ得る。別の例として、あらかじめ定められた参照値は、小腸上皮細胞(絨毛細胞、陰窩細胞、腸細胞、および腸前駆細胞など)が損傷していない正常な集団における前記栄養素または電解質の腸吸収能力のレベルを測定することによって明らかにされ得る。
別の態様において、本スクリーニング方法は、以下の段階を含む:
a)粘膜が損傷した小腸組織の機能を判定する段階;
b)候補の栄養素または電解質を小腸組織と接触させる段階;
c)小腸組織を候補の栄養素または電解質と接触させた後に、小腸組織の機能を判定する段階;および
d)候補の栄養素または電解質が小腸機能を改善する場合、該候補の栄養素または電解質を選択する段階。
別の態様において、本スクリーニング方法は、以下の段階を含む:
a)小腸粘膜が損傷している対象の小腸機能を判定する段階;
b)対象に腸内経路を介して候補の栄養素または電解質を投与する段階;
c)候補の栄養素を投与した後に、対象の小腸機能を判定する段階;および
d)候補の栄養素または電解質が小腸機能を改善する場合、該候補の栄養素または電解質を選択する段階。
特定の態様において、候補の栄養素または電解質の投与によって、傍細胞透過性が低下し、小腸バリア機能が増強される場合、小腸機能は改善されている。また、候補の栄養素または電解質の経腸投与によって、下痢が予防もしくは治療されるか、かつ/または生存が延長される場合も、小腸機能は改善されている。
特定の態様において、小腸粘膜が損傷している対象の小腸機能を改善する栄養素および電解質は、実施例、特に実施例15〜17に例示する方法を用いて選択することができる。
適切な候補電解質には、例えば、Na+、K+、HCO3 -、Cl-、Mg2+、Ca2+、Fe2+、および/またはZn2+が含まれる。
適切な候補栄養素には、例えば、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、ヒスチジン、チロシン、セレノシステイン、アラニン、アルギニン、アスパルタート、システイン、グリシン、プロリン、セリン、アスパラギン、およびピロリジンより選択される必須アミノ酸および非必須アミノ酸が含まれる。また、適切な候補栄養素には、脂肪酸、糖類(例えば、単糖、二糖、およびオリゴ糖)、電解質、ならびにビタミンも含まれ得る。
また、候補栄養素には、例えば、オルニチン、シトルリン、ヒドロキシプロリン、ホモセリン、フェニルグリシン、タウリン、ヨードチロシン、2,4-ジアミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、2-アミノ酪酸、γ-アミノ酪酸、ε-アミノヘキサン酸、6-アミノヘキサン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、ノルロイシン、ノルバリン、サルコシン、ホモシトルリン、システイン酸、τ-ブチルグリシン、τ-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、およびβ-アラニンなどの非天然アミノ酸も含まれ得る。
さらなる態様において、栄養素および電解質の選択はまた、対象が受けるIR線量、放射線源、放射線照射される身体部分、および/または照射後に経過した時間;化学療法剤のタイプ、投薬量、および/または化学療法後に経過した時間;ならびに対象が受ける陽子線治療の線量、および/または陽子線治療後に経過した時間にも、少なくともある程度依存する。
本スクリーニングアッセイ法は、限定されるわけではないが、Ussingチャンバー試験、細胞診、免疫組織化学、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、イオン流束実験、免疫沈降法、免疫蛍光法、ラジオイムノアッセイ法、および免疫細胞化学を含む、当技術分野において周知の技術の組合せを用いて、実施することができる。
具体的には、成分は、患者の小腸粘膜によって吸収されるそれらの能力に基づいて選択することができ、この能力は、このような成分に対する小腸の吸収能力を測定するためのUssing Chamberのような技術を用いてインサイチューでまたは単離された腸調製物を用いて測定される。
製剤および投与
本発明は、治療的有効量の本組成物および任意で薬学的に許容される担体を含む、治療用組成物または薬学的組成物を提供する。このような薬学的担体は、滅菌済みの液体、例えば水でよい。また、治療用組成物は、損傷した小腸上皮、特に絨毛領域および刷子縁の健康状態にも機能にも影響を及ぼさない賦形剤、補助剤、香味剤なども含んでよい。ある態様において、治療用組成物およびその中に含まれる全成分は、無菌である。
「担体」という用語は、化合物が一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを意味する。適切な薬学的担体の例は、E.W.Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」において説明されている。このような組成物は、患者に適切に投与するための形態を提供するように、適切な量の担体と共に治療的有効量の治療用組成物を含む。製剤は、経腸投与様式に適するべきである。
本発明はまた、1種または複数種の成分、例えば、化合物、担体、または本発明の薬学的組成物を詰めた1つまたは複数の容器を含む、薬学的なパックまたはキットも提供する。
1つの態様において、薬学的なパックまたはキットは、例えば、放射線被爆、化学療法、または陽子線治療からの経過時間に応じた、例えば、有効な治療用量、および/または投与時期に関する投与指示書をさらに含む。1つの態様において、組成物の治療用量は、小腸粘膜の損傷の程度に基づいて決定される。例えば、放射線を受けているか、またはまさに受けようとする対象に関しては、組成物の治療用量は、放射線源、放射線照射される身体部分、および/または照射後に経過した時間に基づいて決定される。化学療法を受けているか、またはまさに受けようとする対象に関しては、組成物の治療用量は、化学療法剤のタイプ、化学療法剤の投薬量、および/または化学療法後に経過した時間に基づいて決定される。陽子線治療を受けているか、またはまさに受けようとする対象に関しては、組成物の治療用量は、対象が受けた陽子線治療の線量、および/または陽子線治療後に経過した時間に基づいて決定される。
材料および方法
実験動物
活性なHCO3 -分泌を調査するために、放射線照射を受けていない8週齢のオスBALB/cマウスおよび放射線照射を受けた8週齢のオスBALB/cマウスをNational Cancer Instituteから入手した。マウスを無作為にいくつかの群に分け、1.84Gy/分のγ線照射を与える137Cs供給源を用いてShepherd Mark-Iによって、胃腸管急性放射線症候群(GI ARS)モデルに従って腹部に放射線照射した。放射線は、単回照射(single fraction)として与えた。GI ARSモデルは、腸組織に対する最大限の放射線障害を実現し、骨盤腫瘍または腹部腫瘍の放射線療法期間中の腸損傷を再現する。
短絡電流(Isc)の、照射後の時間の関数としての変化と放射線の線量増加に伴う変化の両方を調査して、Iscに有意な変化をもたらすのに必要とされる最も短い時間および最小限の放射線量を決定した。これらの研究は、Rochester大学の実験動物委員会(University of Rochester Animal Care and Use Committee)による認可を受けた。
イオン流束調査
全採血後、盲腸に隣接した小腸の遠位部12cmを除外することによって、空腸部分を得た。下にある筋肉層から粘膜を剥がす前に、この部分を洗浄し、氷冷したリンガー溶液中で洗い流した(Zhang, Ameen et al. 2007)。この粘膜を、面積0.30cm2のUssing型Luciteチャンバー(P2304、Physiologic instruments、San Diego、CA 92128 USA)の2つの半室(2 halves)の間に取り付け、電圧/電流固定機器(VCC MC-8、Physiologic instruments、San Diego、CA 92128 USA)を用いて電気的パラメーターを記録した(Vidyasagar et al. 2005; Vidyasagar et al. 2004; Zhang et al. 2007; Vidyasagar and Ramakrishna 2002)。8mMグルタミンを含有し、95%酸素(O2)および5%二酸化炭素(CO2)の混合物を供給された通常のリンガー溶液(表1)に腸調製物の両側を浸した。
（表１）溶液の組成
Figure 0006425356
注意:値の単位はmMである。イオン置換実験のために、イオン溶液を使用した。いずれの溶液もpHは7.4であった。Cl-を含まない溶液では、H2SO4を用いてpHを7.4に調整し、他の場合はいずれもHClを使用した。
略語:UB、非緩衝液。
HCO3 -移動の測定
2つのビュレットを装備した(Bi-burette)TIM856(Radiometer Analytical SAS、Villeurbanne、France)を用いて、剥がされた空腸の薄層におけるHCO3 -分泌を測定した(Vidyasagar et al. 2005; Vidyasagar et al. 2004; Zhang et al. 2007)。自動ポンプで0.025M硫酸(H2SO4)0.01μlを添加することにより、管腔溶液のpHを一定に維持した。線形の(linear)滴定曲線を得るために漸増濃度のHCO3 -を含有する弱い緩衝液に公知の量のH2SO4を添加することによって、標準pHから一定pHまで(Standard-to-stat pH)の校正を確立した。
空腸組織の浴槽側(漿膜側)を緩衝液に曝露し、管腔側は、HCO3 -を含まない緩衝化の程度が低い(low-buffered)溶液(0.1mM HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)緩衝液、pH7.4)に曝露した。HCO3 -分泌は、pHを7.4(または一定のpH)に維持するために管腔液に添加した酸の量と同等であった。実験はすべて、電圧固定条件下で実施した。HCO3 -を含まない溶液には100%O2を供給し、HCO3 -含有溶液には95%O2および5%CO2を供給した。HCO3 -分泌は、μeq・h-1・cm-2として表した(Vidyasagar et al. 2005; Vidyasagar et al. 2004; Zhang et al. 2007)。
組織を取り付けた後、HCO3 -分泌は浴中HCO3 -の非存在下で最初は存在したが、20〜30分以内に急速に0に向かって減少した。滴定中に浴中HCO3 -が存在しなかった場合は、HCO3 -分泌は0に近いままであった。浴溶液中にHCO3 -が存在した場合は、HCO3 -分泌が急速に増加し、少なくとも2時間、一定であった(Vidyasagar et al. 2005; Vidyasagar et al. 2004; Zhang et al. 2007)。粘膜溶液に阻害物質を添加した場合、pHは調整され、一定速度のHCO3 -分泌が観察されるまで、30分間平衡を保つことが可能になった。浴槽側に阻害物質を添加した場合、組織も同様に30分間平衡を保って、一定速度のHCO3 -分泌を達成した(表3を参照されたい)。
実験はすべて、最初の1時間の定常状態期間中に実施した。各実験には、各動物から得た1つの組織を使用し、各組織試料を用いて、ただ1つの実験条件を調査した。実験はすべて、少なくとも4回繰り返した。
免疫組織化学
放射線照射を受けていないマウスと放射線照射を受けたマウスの両方に由来する凍結した組織薄片を、抗NBCe1-A/B抗体を用いて免疫蛍光染色した(Bevensee, Schmitt et al. 2000)。NBCe1-A/Bは、両方の重炭酸ナトリウム共輸送体(NBCe1-AおよびNBCe1-B)に共通のカルボキシ末端に対して産生させたポリクローナル抗体である。免疫染色処置は、放射線照射後6日目に実施した。単離した組織を、氷冷した通常のリンガー溶液中で洗浄し、凍結切片包埋剤中に包埋し、液体窒素中に置いた。6μmの切片を低温槽中で作製した。
ウェスタンブロット研究
放射線照射を受けていないマウスおよび放射線照射を受けたマウスの粘膜擦過標本から、空腸溶解物を調製した。ウェスタンブロットにより、NKCC1タンパク質(Santa Cruz CA, USA)、NBCe1-A/Bタンパク質(Mark Daniel Parker, Case Western Reserve University Medical School, Cleveland, OH)、および嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)(Santa Cruz CA, USA)タンパク質の発現について組織を解析した(Bevensee et al. 2000)。
粘膜擦過標本を、25mM HEPES;10%グリセロール;ならびにpH7.4のプロテアーゼインヒビター混合物(10mMヨードアセトアミド、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、および2μg・ml-1ロイペプチン)を含有する1%トリトンX-100(ポリエチレングリコールp-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェニルエーテル)を含有するトリアシルグリセロールヒドロラーゼ緩衝液中に溶解した(別段の定めが無い限り、化学物質はすべて、Sigma-Aldrich Co.,USAから入手した)。ブラッドフォードアッセイ法を用いて、タンパク質濃度を測定した。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を用いて、放射線照射を受けた試料および放射線照射を受けていない試料に由来する同等のロード量(load)のタンパク質を解析した。アフィニティー精製したポリクローナル抗体を用いて、NKCC1タンパク質、NBCe1-A/Bタンパク質、およびCFTRタンパク質を検出した。
統計
平均値±平均値の標準誤差として結果を示す。統計学的解析は2段階で実施した:1)分散分析(ANOVA)(またはそのノンパラメトリックな同等物であるクラスカル・ワリス)を用いて、全体的な差異を調べ;2)すべてのペアワイズ比較に関して、ボンフェローニ補正をしたP値を計算した。
以下は、本発明を実践するための手順を例示する実施例である。これらの実施例は、限定的なものとして解釈すべきではない。別段の注記の無い限り、パーセンテージはすべて重量に基づき、溶媒の混合比率はすべて体積に基づく。
実施例1 放射線照射は、正味の陰イオン分泌を増加させる
本実施例は、放射線照射が正味の陰イオン分泌を増加させ、陰窩細胞と比べて大幅な絨毛上皮細胞の減少を引き起こすことを示す。具体的には、12Gy放射線照射を受けたマウスから小腸上皮組織を取得し、Ussingチャンバー試験によって陰イオン分泌を検査した。1日目、2日目、3日目、および4日目に、陰イオン分泌の指標である経上皮Iscを測定した。
図1Aに示すように、IR非被爆組織ならびに放射線照射後24時間目および72時間目のIR被爆組織と比べて、経上皮Iscの最大の増加は、放射線照射後48時間目に観察された(図1A)。48時間経過時点のIscのこの有意な増加は、放射線照射によって、吸収と分泌の間の良いバランスが乱されることを示唆する。比較すると、48時間経過時点および72時間経過時点に記録されたIscは、非IRマウス組織のIscより小さい。
組織病理切片もまた、放射線照射に起因する、陰窩細胞と比べて大幅な絨毛上皮細胞の減少を示した。48時間より前に採取された組織病理切片は、最小限の絨毛障害を示し、陰窩細胞障害はほとんどまたは全く示さなかったのに対し、3日目および4日目に採取された組織病理切片は、陰窩細胞および絨毛細胞の大規模な障害を示した。特に、絨毛細胞は、3日目の後、ほとんど完全に枯渇した。IR後72時間目および96時間目に、分泌刺激薬に応答して陰イオン分泌を促進しないことによって証明されるように、陰窩細胞の消失もまた観察された(図1A)。高線量のIRを与えた場合、成熟し分化して絨毛上皮細胞を形成する陰窩幹細胞が不足する。
図1Bは、放射線照射によって経上皮コンダクタンスが増加したことを示す(図1B)。経細胞コンダクタンスおよび傍細胞コンダクタンスを合わせた値(composite)である経上皮コンダクタンス(S)をUssingチャンバー実験によって測定した。
オームの法則1/S=Rに基づくと、経上皮コンダクタンスの増加は、経上皮抵抗(TERまたはR)の減少を示す。マウス小腸の上皮抵抗は小さい。傍細胞経路の電気抵抗は、経細胞抵抗のものよりはるかに小さい65〜67。傍細胞経路および経細胞経路は、1/TER=(1/R経細胞)+(1/R傍細胞)によって示されるように並列であり;したがって、測定されるTERは、傍細胞抵抗を主に反映する。
実施例2 放射線照射は、短絡電流(ISC)の線量依存的な増加を引き起こす
本実施例は、放射線照射が、起電性の陰イオン分泌の増加を示す短絡電流の線量依存的な増加を引き起こすことを明らかにする。簡単に説明すると、0Gy、1Gy、3Gy、5Gy、7Gy、9Gy、または12Gyの放射線照射を受けたマウスを4日目に屠殺した。図2は、0Gyおよび1Gyの放射線照射を受けたマウス組織のIscと比べた、3Gy、5Gy、および7Gyの放射線照射を受けたマウス組織におけるIscの有意な増加を示した(* p<0.001)。3Gy、5Gy、および7Gyの放射線照射を受けたマウスと比べて、9Gyおよび12Gyの放射線照射を受けたマウス組織では、Iscの減少が観察された(** p<0.01、図2)。1Gyの放射線照射と3Gyの放射線照射との間でIscは最も大幅に増加し、組織病理学的変化は最小限であった。
さらに、放射線照射は、経時的なIsc変化も引き起こす。0日目、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、または7日目に屠殺したマウスの内で、Iscの最も大幅な増加は、IR後5日目および6日目に観察された(図3A)。時間の関数としてIscの最大の増加を測定するために、マウスに3Gyの放射線を照射し、0日目、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、7日目、9日目、11日目、および14日目に屠殺して、電気的パラメーターを記録した。クラスカル・ワリス(P<0.001)。事後解析により、放射線照射後6日目にIscの増加が最大であることが示された。
図3Aに示すように、放射線照射後1日目および2日目に記録されたIscは、統計学的な差をほとんど示さなかった。しかしながら、放射線照射後2日目より後の時間に記録されたIscは、0日目と比較した場合、有意な差を示した(* P<0.01)。4日目、5日目、6日目、および7日目に記録されたIscの間では、有意な差はほとんど観察されなかった。放射線照射後9日目および10日目に記録されたIscもまた、放射線照射後7日目に記録された値と有意な差はなかった(** P=NS(有意差なし))。6日目を過ぎてIscは有意な減少を示したが、3GyのIRを受けたマウスにおいては、放射線照射後14日目および2年後でさえ、Iscは高いレベルでとどまり続けた(4.8±0.5μeq.h-1.cm-2)。図3Aは、3Gyの放射線照射を受けたマウスにおいて、Iscの最大の増加が6日目に起こったことを示す。
放射線照射後に観察されたIscの増加は、起電性陰イオン分泌の正味の増加に主に起因する。Isc増加には、考え得るメカニズムが3つ存在する:1)起電性陰イオン分泌(例えば、Cl-および/もしくはHCO3 -)の増加;2)起電性Na+吸収の増加;または3)起電性K+吸収の増加。放射線照射がマウス小腸において起電性Na+吸収プロセスの活発化(increased)を引き起こす見込みは少ない。さらに、放射線照射は下痢を引き起こし、その結果、K+は減少しK+は吸収されないため、Isc増加はK+吸収の増加によるはずがない。
実施例3 Na+およびCl-の吸収の減少
本実施例は、放射線照射によってNa+およびCl-の吸収が減少することを示す。表2に示すように、22Na置換を用いるUssingチャンバー流束試験によって、粘膜から漿膜への流束(Jms)の方が漿膜から粘膜への流束(Jsm)より優位であるため、非IR(0Gy)マウスにおけるNa+の正味の吸収の存在が明らかにされた(表2)。放射線照射により、Jmsは線量依存的に減少し、その結果、正味のNa+吸収(JNetNa)が減少する。線量が7Gyおよび9Gyの場合、JsmはJmsを大きく上回って、正味の分泌を引き起こす。さらに、マウスの便試料は、高線量の放射線照射をした際には緩くなるか、または十分に形成されなかったことから、電解質の吸収減少および分泌増加がさらに証明された。同様に、正味のCl-吸収も、IR線量が増加するにつれて減少した。9Gyの際に、正味のCl-分泌が観察された。Cl-吸収の減少は、JmsCl-の減少に起因した。
（表２）Na+およびCl-の一方向性の流束および正味の流束(JNet=Jms-Jsm)
Figure 0006425356
実施例4 放射線照射は、傍細胞透過性の増大を引き起こす
本実施例は、放射線照射の結果、小腸内壁粘膜が損失して、小腸バリア機能が損なわれることを示す。小腸透過性のこの増大により、腸内共生細菌、ペプチド、および毒素が全身区画に接近しやすくなり、それによって、内毒素血症が引き起こされる。図4Aに示すように、放射線照射によって、カブトガニ属のアメーバ様細胞ライセートキットを用いて測定される血漿エンドトキシンレベルは上昇する。
Ussingチャンバー試験において測定された希釈電位の変化によって示されるように、放射線照射は、Cl-およびNa+(PCl/PNa)透過性も増大させた。膜透過性の指標としての希釈電位の使用は、以下の原理に基づいている。具体的には、小腸粘膜のような無傷の半透膜は、粘膜側および漿膜側を異なるイオン強度の溶液を浸すことによって人工的に生じさせた電気化学的電位勾配を維持する。しかしながら、膜を通過する容易な拡散を可能にする漏出性の膜では、膜の電気化学的電位は減少している。したがって、膜透過性が高いほど、電位勾配は小さい。自由に透過できる膜のCl-およびNa+の透過性の比(PCl/PNa)は1であり、選択性が完全に失われていることが示される。
非IRマウスでは、膜選択性は保持され、膜を通過する透過性はNa+の方がCl-より高い。放射線照射により、膜の希釈電位が減少した。特に、7Gyの場合にNa+およびCl-の膜透過性が等しくなったことから、選択性の顕著な喪失が示唆された(図4B)。放射線照射に起因する電解質透過性の増大は、図4Aに示す血漿エンドトキシンレベルの上昇と一致している。膜透過性の変化のモニタリングは、本発明の経口的放射線治療食(oral radiation diet)による粘膜バリア機能の改善をモニターするための感度の高い手段として使用され得る。
実施例5 放射線照射に起因する炎症メディエーターレベルの上昇
LUMINEXマルチプレックスビーズアレイ技術を用いて、IR被爆マウスおよび非IR被爆マウスの炎症メディエーターレベルを測定した。図5に示すように、放射線照射によって、IL1-β、TNF-α、およびMIP-αの産生が増大した(図5)。
実施例6 放射線照射に起因する陰イオン分泌減少は、NKCC1依存的かつCFTR依存的である
本実施例は、放射線照射下の陰イオン分泌がNKCC1依存的かつCFTR依存的であることを示す。基礎レベルの(basal)Iscに対するNKCC1の寄与を測定するために、100μMブメタニド(Sigma-Aldrich Co., USA)を浴溶液に添加した。図3Cは、放射線照射を受けた組織ではブメタニドによって電流が抑制され得る(5.5±0.5μeq.h-1.cm-2対0.6±0.1μeq.h-1.cm-2)が、0Gyマウスではそうではない(1.6±0.2μeq.h-1.cm-2対0.9±0.1μeq.h-1.cm-2)ことを示す。さらに、cAMP刺激により、0Gyマウス(1.6±0.2μeq.h-1.cm-2対6.9±0.6μeq.h-1.cm-2、P<0.001)と3Gyの放射線照射を受けたマウス(5.5±0.5μeq.h-1.cm-2対7.3±0.5μeq.h-1.cm-2、P<0.05)の両方でIscが増加した。
さらに、ホルスコリン(Sigma-Aldrich Co., USA)によって刺激された場合のIscは、3Gyの場合はブメタニドによって電流が弱められたが(7.3±0.5μeq.h-1.cm-2対0.4±0.1μeq.h-1.cm-2)が、0Gyの場合はそうではなかった(6.9±0.6μeq.h-1.cm-2対1.3±0.2μeq.h-1.cm-2)。このことから、放射線照射のない場合の方が、NKCC1に非依存的な陰イオン分泌が多いことが示される(P<0.05)。
また、これらの結果から、放射線照射下の陰イオン分泌がCFTR依存的であることも示された。Iscのブメタニド非感受性部分が頂端膜陰イオンチャネルを介して起こるかどうかを判定するために、非特異的陰イオンチャネル遮断薬である5-ニトロ-2-(3-フェニルプロピルアミノ)安息香酸(Sigma-Aldrich Co., USA)(10μM NPPB)および特異的な嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)遮断薬(100μMグリベンクラミド、Sigma-Aldrich Co., USA)を添加した。0Gyマウスのブメタニド非感受性Iscは、非特異的陰イオンチャネル遮断薬(NPPB)(0.1±0.01μeq.h-1.cm-2)およびグリベンクラミド(0.1±0.01μeq.h-1.cm-2)の粘膜添加によって無効になった。このことから、陰イオン分泌が陰イオンチャネルまたはCFTRを介して発生することが示される(図3B)。
実施例7 放射線照射に起因するHCO3 -分泌の減少
コレラのような感染性の下痢は、便中のHCO3 -に富む液体の減少をもたらし、代謝性アシドーシスをまねく。本実施例は、感染性の下痢とは異なり、IRによってCl-分泌の増加およびHCO3 -分泌の減少が誘発されたことを示す。
正味の陰イオン分泌に対するCl-の寄与を測定するために、細胞中へのCl-取込みの遮断薬(Na-K-2Cl共輸送遮断薬)を使用した。10μMブメタニドの添加により、IRに関連するIscのほぼすべてが無効になったことから、IRによって誘発される陰イオン分泌がCl-分泌増大に主に起因し、このような増大はNKCC1依存的であることが示唆された(図3A〜C)。
pHスタット実験により、IRによってHCO3 -分泌が減少することを確認した(表3)。漿膜浴溶液(浴)中のNa+を不透過性陽イオンNMDGと交換した場合にHCO3 -分泌が止まったことから、側底膜における細胞中へのHCO3 -の輸送が浴中のNa+に依存していることが示された。5GyのIR後6日目のマウスにおいて、同様の実験を繰り返した。浴中Na+の存在下では、HCO3 -分泌が有意に少なかった。
NBCe1a/b抗体を用いて、非IRマウスとIRマウスの両方から得た凍結組織薄片の免疫蛍光染色を実施した(図6B〜E)。NBCe1a/b抗体に特異的な染色により、NBCe1a/bが絨毛上皮細胞では発現されるが陰窩細胞では発現されないことが示された。IRマウス由来の組織の免疫染色により、絨毛においても陰窩においてもNBCe1a/b抗体は認識されないことが示された。3Gyを放射線照射された(IR)マウス由来の組織は、絨毛においても陰窩においてもNBCe1-A/B特異的な染色パターンを示さなかった。高線量IRにおけるHCO3 -分泌機能の低下は、絨毛上皮細胞の消失に起因する。Na+分泌およびHCO3 -分泌の変化のモニタリングは、本発明の経口的放射線治療食による粘膜バリア機能の改善をモニターするための感度の高い手段となり得る。
放射線照射下のHCO3 -分泌はNKCC1に依存しない
HCO3 -が陰イオン分泌に寄与するかを判定するために、浴中Cl-の非存在下で実験を実施した。放射線照射またはホルスコリン刺激の後に起こるIscの増加は、HCO3 -が一因となっているとみなされた。これらの結果から、放射線照射下のHCO3 -分泌が浴中Cl-に依存的ではないことが示された;したがって、放射線照射下では、HCO3 -分泌は、頂端膜中のCl--HCO3輸送体(AE1)を使用しない。Cl-を含まない溶液において、基礎レベルのIsc(1.0±0.2μeq.h-1.cm-2対0.3±0.1μeq.h-1.cm-2;P=ns(有意差なし))およびホルスコリン刺激した場合のIsc(1.7±0.2μeq.h-1.cm-2対0.3±0.1μeq.h-1.cm-2;P<0.001)は、3Gyの放射線照射を受けたマウスにおいての方が低かった(図3D)。ホルスコリン刺激した場合のIscは、3Gyの場合よりも0Gyの場合の方が高かったことから(P<0.001)、放射線照射に起因するHCO3 -分泌減少が示された。
NKCC1が基礎条件下およびホルスコリン刺激条件下でのHCO3 -移動を媒介したかを確認するために、Cl-を含まない溶液を両側に入れて平衡化した組織の浴槽側にブメタニドを添加した。これらの結果から、ブメタニドは、Iscの基礎レベルおよびホルスコリン刺激による増加を阻害しないことが示された;このように阻害がないことから、側底膜におけるHCO3 -取込みのためのメカニズムがNKCC1に依存しないことが示される。
放射線照射下のHCO3 -分泌は管腔中Cl-に依存しない
放射線照射を受けたマウスにおけるHCO3 -分泌の直接的測定により、放射線照射を受けていないマウスと比べてHCO3 -分泌が減少していることが示された(0.8±0.2μeq.h-1.cm-2対6.7±0.2μeq.h-1.cm-2)。放射線照射を受けたマウスにおけるHCO3 -分泌は、管腔中Cl-を除去しても変わらなかった(表3)。NPPB(0.2±0.01μeq.h-1.cm-2)およびグリベンクラミド(0.11±0.1μeq.h-1.cm-2)を粘膜添加しDIDSは添加しなかったところ、放射線照射を受けたマウスのHCO3 -分泌が止まった。このことから、HCO3 -分泌が、Cl--HCO3 -交換を介してではなく、陰イオンチャネル(CFTRチャネル)によって媒介されていることが示唆される(図19B)。
比較すると、放射線照射を受けていないマウスにおけるHCO3 -分泌は、管腔中Cl-依存的でもありCl-非依存的でもある。経上皮電気測定により、起電性HCO3 -分泌が示唆された;しかしながら、これは、HCO3 -分泌がチャネルによるか、かつ/または電気的中性なCl--HCO3 -交換によるかは示さない。
管腔中Cl-の非存在下でpHスタット実験を実施して、放射線照射を受けていないマウスにおけるCl--HCO3 -交換を調査した。管腔中Cl-を含まない溶液において、HCO3 -分泌は少なかった(4.5±0.1μeq.h-1.cm-2、P<0.01)。このことから、放射線照射を受けていないマウスにおける基礎レベルのHCO3 -分泌が、ある程度管腔中Cl-依存的であり、ある程度Cl-非依存的であることが示される(表3)。100μM 4,4-ジイソチオシアノ-2,2′-スチルベンジスルホン酸(DIDS)(Sigma-Aldrich Co., USA)を添加すると、HCO3 -分泌がある程度阻害され(P<0.001)、このような阻害は、管腔中Cl-除去に伴って観察されたものと同様であった。
ホルスコリンは、管腔中Cl-に依存しないHCO3 -分泌を刺激した
0Gyマウスの場合、浴溶液へのホルスコリン添加により、基礎レベルのHCO3 -分泌の有意な増加が示され(P<0.001)、この増加は管腔中Cl-を除去しても変化しなかった(8.4±0.4μeq.h-1.cm-2対8.7±0.4μeq.h-1.cm-2;n=6)。NPPBにより、ホルスコリンによって刺激されたHCO3 -分泌は無効になった(0.2±0.01μeq.h-1.cm-2;n=6);このことから、cAMPによって刺激されるHCO3 -分泌における陰イオンチャネルの役割が示唆された。
cAMPによって刺激されるHCO3 -分泌はNKCC1に依存しない
cAMPによって刺激されるHCO3 -分泌が頂端のCFTRチャネルを必要とするかを判定するために、グリベンクラミドを管腔側に添加した。グリベンクラミドはHCO3 -分泌を阻害した(0.1±0.1μeq.h-1.cm-2)(表3および図19A)ことから、cAMPは、正味のHCO3 -分泌の基礎的なCl--HCO3 -交換構成要素を阻害するだけでなく、頂端の陰イオンチャネルを介したHCO3 -分泌も誘発することが示された。放射線照射を受けたマウスにおけるホルスコリン刺激は、基礎レベルのHCO3 -分泌と比べてほとんど増加を示さなかった(0.6±0.2μeq.h-1.cm-2対0.78±0.2μeq.h-1.cm-2)。このこともまた、管腔中Cl-に依存しないHCO3 -分泌またはCl--HCO3 -交換の阻害を示す。
経上皮電気的測定値から、HCO3 -移動の減少もまたNKCC1に依存しないことが示された。HCO3 -分泌は、基礎条件下およびホルスコリン刺激条件下のどちらでも、放射線照射を受けたマウスにおいて最小限であり、ブメタニド添加の影響を受けなかった(表3)。同様に、放射線照射を受けていないマウスにおいても、ホルスコリンによって刺激されたHCO3 -分泌はブメタニドによって変化しなかったことから、cAMPによって刺激されたHCO3 -分泌はNKCC1に依存しないことが示唆された(8.4±0.4μeq.h-1.cm-2対8.6±0.4μeq.h-1.cm-2)(表3および図3B)。
HCO3 -分泌は浴中Cl-に依存しない
側底のHCO3 -取込みのために浴中Cl-を必要とする輸送プロセスを図3Bに示す。これらの結果から、ブメタニドは、cAMPによって刺激されたHCO3 -分泌を変化させないことが示された。このことから、Cl--HCO3 -交換(AE2)輸送体が放射線照射下で阻害されていることが示された。浴中Cl-の除去によっても、NKCC1およびAE2と関連したHCO3 -取込みを阻害することができる(表3)。浴溶液からCl-を除去しても、HCO3 -分泌は変化しなかった(6.7±0.3μeq.h-1.cm-2対7.1±0.6μeq.h-1.cm-2)。
HCO3 -分泌は浴中Na+依存的である
Na+と連動した(coupled)側底のHCO3 -移行のための輸送プロセスを図3Bに示す。図3Cおよび3Dは、NKCC1がHCO3 -分泌に影響を及ぼさないことを示した。1mM 3-メチルスルホニル-4-ピペリジノベンゾイル、塩酸グアニジン(HOE694)を浴槽側に添加したところ、Cl--HCO3 -交換と連動したNHE1を介したHCO3 -取込みがなくなった。また、Counillon, Scholz et al. (1993)は、1mM 3-メチルスルホニル-4-ピペリジノベンゾイル、塩酸グアニジン(HOE694)がNa+-H+交換(NHE1)を阻害し得ることを説明した。
HOE694は、cAMPによって刺激されたHCO3 -分泌を阻害しなかった(8.4±0.4μeq.h-1.cm-2対7.2±0.9μeq.h-1.cm-2)。浴中Na+をN-メチル-D-グルカミン(NMDG)と交換すると、放射線照射を受けていないマウスにおいて、ホルスコリンによって刺激されたHCO3 -分泌が止まった(8.4±0.4μeq.h-1.cm-2対0.3±0.01μeq.h-1.cm-2)ことから、Na+と連動したHCO3 -共輸送(NBC)が示唆される(図3E)。
（表３）放射線照射されていない(0Gy)マウスおよび放射線照射された(3Gy)マウスの空腸で測定されたHCO3 -分泌
Figure 0006425356
注意:値は平均値±SEMを表す。n=6個の組織。*p<0.001、0Gy群と3Gy群の比較。‡p<0.001、存在群間の比較
放射線照射を受けていないマウスでのブメタニド実験において、10mMホルスコリンで組織を処理した。
略語:ns、群間で有意性はない; 4,4-ジイソチオシアノ-2,2'-スチルベンジスルホン酸、DIDS
頂端膜における活性なHCO3 -分泌のためには、側底からの取込みが必要である。側底膜におけるHCO3 -移動に直接的または間接的に関与している4つの公知の交換メカニズムは次のものである:1)HCO3 -の存在し得る輸送体としてのNa+-K+-2Cl-共輸送(Na+-K+-2HCO3 -);2)NKCC1を介して細胞中へ取り込まれたCl-は、側底部でのCl--HCO3 -交換(AE2)によって再利用されて、側底膜における正味のHCO3 -取込みをもたらす;3)細胞間隙に水素イオンを追い出すNa+-H+交換の結果、細胞内HCO3 -濃度が低下し、次いでこれにより、頂端の電気的中性なCl--HCO3 -交換が促進される;および4)Na+と連動したHCO3 -の共輸送。これらの輸送体は、Na+1分子当たりの輸送されるHCO3 -分子数に応じて、電気的中性または起電性として機能し得る(図3B)。
放射線照射を受けていないマウスにおいて、HCO3 -取込みは、側底面に位置するNa+と連動したHCO3 -共輸送体(NBCe1-A/B)を介して起こる。頂端からの退出(exit)は、Na+-H+交換と連動している電気的中性なCl-/HCO3 -交換およびCFTR(起電性の陰イオン分泌)を介して起こる。ホルスコリン添加によって実現される細胞内cAMPの増加の結果、Cl-およびHCO3 -の分泌が増加し、同時に、電気的中性なNa+およびCl-の吸収が阻害される(Cl--HCO3 -交換と連動したNa+-H+交換)。Cl-取込みはNKCC1を介して起こり、HCO3 -取込みはNBCe1-A/Bを介して起こる;Cl-およびHCO3 -の両方とも、頂端面のCFTRを介して出て行く。
本発明により、放射線照射が電気的中性なNa+およびCl-吸収を阻害することが発見された。また、放射線照射はNBCe1-A/Bも阻害し、このような阻害は、側底膜におけるHCO3 -取込み、および最終的には頂端膜におけるその退出の減少をもたらす。したがって、放射線照射の結果、電気的中性なHCO3 -分泌および起電性のHCO3 -分泌の両方の選択的阻害と共に、起電性のCl-分泌が起こる(図19B)。
放射線照射により、小腸上皮組織におけるNKCC-1タンパク質発現は増加し、NBCe1-A/B発現は減少した。また、放射線照射は、頂端のCl--HCO3 -交換輸送体(AE1)も阻害する。放射線による下痢におけるHCO3 -分泌はNa+依存的であるが、管腔中Cl-非依存的かつNKCC-1非依存的である。放射線照射下のCl-輸送は、Cl--HCO3 -交換輸送体(AE1)の代わりに、側底のNKCC-1輸送体を使用する。
図19Bに示すように、放射線照射はまた、胃腸管における電解質(HCO3 -およびCl-など)輸送も変化させる。放射線照射を受けたマウスは、主としてCl-分泌を示し、最小限のHCO3 -分泌を示した。放射線照射に起因する最小限のHCO3 -分泌は、HCO3 -吸収の阻害によって引き起こされると仮定されている。一方、分泌促進物質によって誘発された下痢では、Cl-分泌ならびにHCO3 -分泌は活発である。
実施例8 放射線照射は、グルコース吸収の減少を引き起こす
本実施例は、IR誘発性腸炎において、線量依存的なグルコース吸収減少が認められることを示す。さらに、腸管内腔中の未吸収グルコースの存在は、浸透圧性下痢を招いて、IRに関連した下痢状態をさらに悪化させ得る。図7Aは、放射線照射が、Iscの線量依存的な減少を引き起こすことを示す。図7Bは、放射線照射により、グルコース輸送時のKmが線量依存的に増加することを示す。
SGLT1は、汎用性のある輸送体である。SGLT1は、コレラのような感染性下痢においてその機能を保持する。感染性下痢におけるSGLT1機能の保存は、Na+吸収のための経口補液療法において使用されている。
放射線照射後のグルコース吸収に対するSGLT-1の機能およびその効果を調査するために、0Gy、1Gy、3Gy、5Gy、または7GyのIR被爆後6日目に、Swissマウスの小腸粘膜を得た。グルコースによって刺激された短絡電流(Isc)をUssingチャンバー中で測定して、SGLT1の輸送機能を調査した。9Gy TBIマウスおよび15.6 -sub-TBIマウスにおいて、生存調査を実施した。
具体的には、National Institutes of Health(NIH)から得た8週齢のBalb/cマウスを137Csのほぼ全身的放射線照射(Sub-TBI)(1本の足を放射線照射から保護した)および全身放射線照射(TBI)に供した。
動物生存試験において、マウスを9Gy TBIおよび15.6Gy Sub-TBIの2群に分けた。対照マウスに生理食塩水を処置し、他のマウスに5%グルコースを処置した。実験中は胃管栄養法を用い、処置は、放射線照射後最初の5日間および放射線照射後10日目まで1日おきに行った。
マルチチャネルの電圧/電流固定器(Physiological Instruments, San Diego,CA)をUssingチャンバー試験において使用した。取り付けのために使用するマウス空腸切片は、改変した通常のリンガー溶液中に浸し、95%O2および5%CO2を供給して、短絡Iscを測定した。放射線照射後後6日目に、マウスをすべて屠殺した。
SGLT-1動態を調査するために、基質(グルコース)濃度を0.05mMから開始し、10mMで終了させた。0.05mMから始まる割合でグルコースを添加し、0.1mM、0.5mM、および1mMへと進めた。Origin 8ソフトウェア(OriginLab Corp., Northhampton, MA)を用いて、結果を解析した。IscをY軸にプロットし、グルコース濃度をX軸にプロットした。この曲線をヒルの式にあてはめた。
空腸の全細胞溶解物を調製するために、正常マウスおよび放射線照射を受けたマウスの粘膜擦過標本を、25mM HEPES、10%グリセロール、1%トリトンX-100、ならびにプロテアーゼインヒビター混合物(10mMヨードアクタミド、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、および2μg ml-1ロイペプチン、pH7.4)を含有するトリアシルグリセロールヒドロラーゼ緩衝液中に溶解した。
刷子縁膜小胞溶解物を調製するために、正常マウスおよび放射線照射を受けたマウスの粘膜擦過標本を、2mM Tris-HCl(pH 7.1)/50mM KCl/1M PMSF溶液中でホモジナイズした。これらの試料を8000RPMで、および13,000RPMでもう一度、それぞれ遠心分離することによって遠心沈殿させ、次いで、ツベルクリン注射器(27Gの針)およびTEFLONホモジナイザーを用いてもう一度ホモジナイズした。次いで、これらの試料を4,000RPMで、および15,000RPMでもう一度遠心分離した。この試料を、通常のリンガー溶液を含むプロテアーゼインヒビター混合物(10mM ヨードアクタミド、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、および2μg ml-1ロイペプチン、pH7.4)を用いて再懸濁した。
空腸全細胞溶解物および刷子縁膜小胞の両方のタンパク質濃度をSGLT-1タンパク質についてウェスタンブロットによって解析した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を用いて、放射線照射を受けた試料および対照試料に由来する同等のロード量のタンパク質を解析した。タンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜上に移し、アフィニティー精製したポリクローナル抗体を用いて、SGLT-1タンパク質を検出した。
図8〜14に示すように、これらの結果から次のことが実証される:1)放射線照射により、グルコースによって刺激されたIscが線量依存的に減少する;2)グルコースに対するKm値は、0Gy、1Gy、3Gy、5Gy、および7Gyにおいてそれぞれ0.38±0.04、0.49±0.06、1.76±0.16、1.91±0.3、2.32±0.4(mM)であった;3)グルコースに対するVmax値は、0Gy、1Gy、3Gy、5Gy、および7Gyにおいてそれぞれ387.4±16.2、306.6±16.4、273.2±14.9、212.9±9.14、188.1±9.12であった;4)Km値およびVmax値は、IR後およそ14日目に正常レベルに戻った;5)放射線照射後、最初の10日間のグルコース摂取を差し控えると、生存が増加した;6)SGLT-1刷子縁膜のウェスタンブロット解析により、IR線量が増加するにつれてSGLT-1タンパク質レベルが上昇することが示された。
SGLT-1のKmの増加は、放射線照射が原因でグルコースに対するSGLT-1親和性が低下したことを示唆する。Vmaxの減少は、組織病理学的検査によっても証明されるように、放射線照射が原因で絨毛上皮細胞が消失したことを示す。ウェスタンブロット解析によって示されるように、IR処置したマウス組織におけるタンパク質レベルの上昇は、SGLT1輸送体が発現されるが機能的ではないことを示唆する。
これらの結果は、グルコースの経口栄養の結果、グルコースおよび電解質が吸収不良になり、浸透圧性下痢を招き、したがって、IRによって誘発されるGI毒性を増大させることも実証する。一方、IR後の最初の14日間、経口栄養に由来するグルコースを抑えると、下痢が予防されるか、または下痢の症状が緩和され、全生存率が増加する。
実施例9 放射線照射は、グルタミン輸送の減少を引き起こす
グルタミンは非必須アミノ酸であるが、腸細胞の主要な栄養素であり、血漿中(26%)および骨格筋中(75%)に高濃度で存在する。グルタミンレベルは、術後の患者、外傷患者、または危篤患者においてグルタミンに対する身体の要求が増大するにつれて、低下する。したがって、グルタミンは、消化系、腎臓系、免疫系、および神経系が正常に機能する上で重要とみなされている。
本実施例は、放射線照射が、細胞中へのグルタミン輸送の線量依存的な減少を引き起こすことを示す。IR≧7Gyの場合、グルタミンは腸管内腔に主として存在するようになり、それによって、浸透圧性下痢を招く。グルタミン輸送体の飽和動態が、KmのIR線量依存的増加を示した(図15)ことから、グルタミンに対するグルタミン輸送体の親和性の低下が示唆された。
実施例10 放射線照射は、リジン輸送の線量依存的な増加を引き起こす
小腸管腔側にリジンを添加すると、Iscの増加を引き起こすことから、リジンの起電性輸送が示唆される(図16)。非IRマウス由来の組織は、1.16±0.04mMのKmを示したのに対し、3GyのIRを受けた組織のKmは0.27±0.01mMであった。グルコースおよびグルタミンとは異なり、これらの結果から、放射線照射がリジンに対するリジン輸送体の親和性を上昇させ、したがって、リジン吸収を増加させることが示された。
実施例11 リジンの経口栄養がマウスの生存に与える影響
本実施例は、経口栄養によって吸収されない栄養素を抑えつつ、吸収される栄養素を選択的に供給することにより、放射線照射後の下痢が予防または軽減され、生存が延長されることを示す。
実験の最初のシリーズにおいて、グルコース(5日間、その後、隔日毎に10mM i/m)をIRマウスに経口投与した。これらの結果から、グルコース投与が全生存率を低下させたことが示される(図17B)。比較して、リジン(20mg/マウス/日)を5日間、その後、1日おきにIRマウスに胃洗浄として経口投与した。リジンで処置したマウスは、対照群と比べた場合に生存率の上昇を示した(図17A)。したがって、リジンのような吸収される栄養素の経口摂取を増加させると共に、グルコースのような吸収されない栄養素の経口摂取を減少させるかまたは制限することにより、放射線照射された患者の生存を延長することができる。
実施例12 放射線照射に起因する、イオン輸送タンパク質の発現レベルの変化
本実施例は、放射線照射に起因する、輸送タンパク質の発現レベルの変化を例示する。
具体的には、放射線照射後6日目に、ウェスタンブロットのために組織を採取した。図18に示したように、回腸組織のウェスタンブロットにおいて、1〜5Gyの放射線照射はNKCC1タンパク質レベルの上昇をもたらしたのに対し、7GyのIRを受けた組織では、1〜5GyのIRを受けた組織と比べた場合、NKCC1発現のそのような上昇は低下することが明らかになった(A)。
NBCe1-A/Bタンパク質レベルは、1Gyという低さの線量でさえ、放射線照射後に有意に低下した(B)。空腸組織中のCFTRタンパク質レベルは、0Gy空腸組織と比べた場合、3Gy放射線照射後に有意に上昇した(C)。NBCe1-A/B特異的抗体は、放射線照射を受けていないマウスの十二指腸、回腸、および結腸と比べて、空腸において、発現レベルの上昇を示した(D)。空腸組織のNBCe1-A/Bタンパク質レベルは、十二指腸、回腸または結腸でのレベルと比べて最も高かった(D)。輸送タンパク質レベルの変化は、IR後に観察された機能変化に対応する。非IR組織のものと比べた放射線照射後の輸送タンパク質の発現パターンは、経口的放射線治療食の有効性をモニターするために使用することができる。
実施例13 小腸粘膜が損傷しているマウスにおける栄養素および電解質の吸収能力の変化
放射線で治療されたC57BL/6マウス、化学療法で治療されたC57BL/6マウス、および小腸の炎症を患っているC57BL/6マウスにおいて、小腸吸収能力の同様の改変パターンが観察されている。放射線モデルは、実施例1〜12において説明したようにして構築する。
化学療法モデルでは、すべてのマウスに5-FUまたはシスプラチンを1回注射する。一部のマウスでは、最初の注射後3日目に2回目の5-FUまたはシスプラチンを注射する。各注射後、Ussingチャンバーを用いて、正味の陰イオン分泌の指標である経上皮Iscを図20に示す時点に測定する。各測定のために、最低32個の組織を検査する。
これらの結果から、シスプラチン(図20B)または5-FU(図20A)を1回注射したマウスにおいて3日目に正味の陰イオン分泌が有意に増加していることが示される。また、2回目の化学療法薬を注射したマウスは、1回投与されたマウスよりも有意に多い、正味の陰イオン分泌の増加を示す。
クローン病モデルでは、マウスに抗CD3 mAbを注射する(クローン病の病態を再現するための急性炎症モデル)。また、正味の陰イオン分泌(傍細胞コンダクタンスに基づいて確認される)および小腸の傍細胞透過性の有意な増大も認められる。また、栄養素および電解質の吸収能力の改変が観察される。
栄養素の吸収能力の改変は、小腸粘膜が損傷している疾患モデル、すなわち、放射線モデル、化学療法モデル、およびクローン病モデルを用いて判定する。具体的には、候補栄養素を、対照マウスならびに放射線照射、化学療法、および抗CD3 mAbをそれぞれ施されたマウスに経口投与する。さらに、候補栄養素の様々な組合せを含む組成物を経口投与する。
候補栄養素は、リジン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、システイン、チロシン、アルギニン、イソロイシン、トレオニン、グリシン、アラニン、メチオニン、トリプトファン、プロリン、セリン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびグルコースより選択される。
各栄養素の吸収能力を測定するために、Ussingチャンバーを用いて生体電気測定を実施する。測定には、次のものが含まれる:a)ナトリウムと連動したアミノ酸の電流(Isc)およびコンダクタンスの変化、b)各栄養素の飽和動態の変化および各栄養素の投与後のIscの変化;ならびにc)特定の候補栄養素の存在下および非存在下で同位体フラックス試験を用いた、電解質吸収試験。これらの結果から、放射線モデル、化学療法モデル、およびクローン病モデルにおいて、調査した全アミノ酸およびグルコースに対する吸収能力の類似した改変パターンが認められることが示される。具体的には、これらの結果から、リジン、グリシン、トレオニン、バリン、チロシン、アスパラギン酸、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、およびセリンより選択される以下の各アミノ酸を経口投与すると、小腸治癒が改善され、傍細胞コンダクタンスが減少し(それによって、小腸粘膜バリアメカニズムが改善され)、電解質の吸収が増加し、かつ/または動物の生存が改善することが示される。また、これらの結果から、グルコースおよび/またはグルタミンを経口投与すると、小腸粘膜バリアに障害が生じ、放射線モデル、化学療法モデル、およびクローン病モデルのマウスの生存に悪影響を与えることも示される。
実施例14 化学療法を施されたマウスにおける小腸機能の改善
本実施例は、本発明の治療用組成物が、化学療法を施されたマウスの小腸治癒を改善することを示す。研究したすべての化学療法の内で、5-FUが小腸に最大の毒性を示す。したがって、5-FUは、化学療法モデルにおける電解質および栄養素の輸送の改変を特徴付けるために使用される。
NIH Swissマウスに5-FUを注射した。注射後5日目または6日目に、マウスの腸組織を単離し、リンガー溶液または本発明の治療用組成物のいずれかに曝露して、Ussingチャンバー中で試験した。治療用組成物は、リジン、グリシン、トレオニン、バリン、チロシン、アスパラギン酸、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、およびセリン;水;ならびに治療的に許容される担体、電解質、および緩衝剤を含む。治療用組成物は、わずかにアルカリ性である(pH7.4)。治療用組成物は、グルコースも、グルタミンも、メチオニンも含まない。
これらの結果から、治療用組成物が、5-FUを与えられたマウスの小腸機能を顕著に改善することが示される。具体的には、治療用組成物は、経上皮Isc(図21A)の病理学的増加および5-FUを注射したマウスの小腸の経上皮コンダクタンスを有意に減少させる。
実施例15 放射線照射に起因するGI機能変化の測定
主要なGI機能は、栄養素、電解質、および水の吸収を含み、このような吸収は、十分に分化し成熟した絨毛上皮細胞において起こる。液体および電解質の吸収の80%は小腸で起こる。本明細書において例示するように、IRの結果、IR線量に応じて絨毛および/または陰窩が選択的に消失し、それによって、Na+、Cl-および栄養素の吸収が減少する。本実施例は、様々な線量の長期に渡るIRに起因するGI機能の改変を測定するための実験設計を例示する。
方法
NCIから入手したC57BL/6マウス(8週齢、オス)を使用する。身体観察、細胞診、免疫組織化学的検査、ウェスタン解析、血漿代替えマーカー、および機能研究を、IRによって誘発されるGI毒性に関する具体的指数として確認する。マウスを無作為にいくつかの群に分け、腹部に1.84Gy/分の線量率でIRを送達するCs供給源を用いてShepherd Mark-Iによって、腹部に放射線照射した。マウスを0Gy、1Gy、3Gy、5Gy、7Gy、および9GyのIRに供する。各群の10匹のマウスを用いて、グルコースおよびアミノ酸の輸送の変化を0日目、1日目、2日目、4日目、6日目、8日目、10日目、12日目、14日目、16日目、18日目、20日目、25日目、および30日目に検査する。組織を回収する前に、血漿試料を採取する。回腸組織および空腸組織を組織病理学的検査、ウェスタンブロット、免疫組織化学的検査、およびUssingチャンバー試験のために回収する(個別評価に供される)。
A)電解質(Na+、Cl-、およびHCO3 -)の機能改変の測定
本実施例は、IR後の電解質吸収に関連する輸送タンパク質機能の改変を測定するための実験設計を例示する。したがって、電解質輸送機能の改変と、血漿マーカー、細胞診、ならびに日常活動、体重、便形成、および便潜血などの身体観察との相互関係を明らかにする。細胞診検査は、陰窩アッセイ法、H&E染色、BrdU染色、免疫組織化学的検査、およびウェスタンブロット解析を用いて実施する。
最初に、Na+およびCl-の経上皮流束をUssingチャンバーにおいて検査して、IR後の電解質吸収を評価する。マウスを屠殺し、非IRマウスおよび様々な線量のIRで処置したマウスにおける基礎的イオン輸送の変化を検査する。Na+およびCl-の吸収は、正常な上皮においては電気的に中性である。
本実施例では、同位体(22Naおよび36Cl)置換研究を実施して、Na+およびCl-の基礎的移動を測定する。手短に言えば、22Naおよび36Clを粘膜側または漿膜側のいずれかに添加する。30分が経過する毎に非放射性側から試料0.5mlを採取する。標準式を用いて、一方向性流束を算出し、μmol.h-1.cm-2として表す。正味の流束(JNet)は、組織のペアを通過するJms流束とJsm流束の差として算出する。実験は、短絡条件下で実施する。
さらに、pHスタット技術を用いて、HCO3 -分泌の変化を測定する。本明細書において例示するように、IRによって空腸中のHCO3 -分泌は減少した。HCO3 -分泌は、消化管の上部区域における酸塩基バランスおよび酸中和のために不可欠である72〜74。これらの実験から、HCO3 -分泌の考え得るメカニズムが示唆され、正常マウスおよび放射線照射を受けたマウスにおける1)管腔中Cl依存的なHCO3 -分泌および2)管腔中Cl-非依存的なHCO3 -分泌が示される。重炭酸イオン分泌は以下のように表される:
Figure 0006425356
式中、D2およびD1は、2つの時点の間に添加される酸総量の差であり、0.025は添加される酸の規定度を表し、2はH2SO4の価数を表し、60は、1時間当たりの分泌を最終的に表すための時間(単位:分)を表す。1.13は、Ussingチャンバー中で使用される組織の表面積であり、tは時間である。pHスタット技術を用いて調査したHCO3 -分泌は、Na+およびCl-の経上皮流束測定値の補足となる。
イオン流束実験、pHスタット試験、および経上皮電気測定値から、非IRマウスおよびIRマウスにおける輸送プロセスを解明することができる。
B)放射線照射に起因する栄養素吸収の機能改変の測定
栄養素の腸吸収不良は、IR後の栄養状態に影響を及ぼす。本明細書において例示するように、栄養素の選択的吸収がIR後に起こる。消化管中に未吸収栄養素が存在すると、浸透圧性下痢が生じ、これは放射線照射によって引き起こされる損傷をさらに複雑にする。本実施例は、IR後に腸から吸収される栄養素を測定するための実験設計を例示する。
容易に吸収される栄養素を本発明の治療的/食事性組成物中に含めて、経時的なグルコース吸収に対する様々なIR線量の影響を検査することができる。
具体的には、IR後のグルコース輸送の変化をUssingチャンバーにおいて測定する。また、グルコース輸送タンパク質が正常機能(非IRレベル)に戻るのに必要とされる時間も調査する。製剤(ORD)は、マウスが経口グルコースを許容する能力に基づいて得る。グルコース輸送が改善し始めるまで、補助的な経口治療計画ではグルコースを与えないでおく。
さらに、IR後のアミノ酸(a.a)輸送の変化を検査する。起電性アミノ酸輸送は、アミノ酸が輸送される場合に起こる正味電荷の移動としてUssingチャンバーにおいて検出することができる。電気的中性アミノ酸に関連する電荷移動はなく、したがって、これらの輸送は刷子縁膜小胞試験(BBMV)において試験する。様々な実験方法を比較するために、起電性アミノ酸および電気的中性アミノ酸の両方をBBMVにおいて試験する。
具体的には、非IRマウスおよびIRマウスに由来する刷子縁膜小胞(BBMV)における代表的アミノ酸L-ロイシン(中性アミノ酸)、L-プロリン(IMINO酸)、L-グルタミン酸(酸性アミノ酸)、およびL-システイン(硫化アミノ酸)の取込みを検査することによって、4つの主要なタイプのアミノ酸輸送系を試験する。
IRに起因する起電性アミノ酸輸送の変化
アミノ酸は、中性、陽イオン性、および陰イオン性に大まかに分類され、それらの輸送特徴は主として電荷に基づく(表4)。起電性アミノ酸輸送は、B0/+(中性アミノ酸および陽イオン性アミノ酸)またはX- AGを介して発生し得る。Naと連動したアミノ酸輸送およびNa非依存的アミノ酸輸送は、管腔中Na+の存在下および非存在での実験によって測定する。さらに、電気的中性アミノ酸輸送は、14Cで標識したアミノ酸を用いてBBMVにおいて試験する。
（表４）小腸の刷子縁膜におけるアミノ酸輸送系
Figure 0006425356
アミノ酸輸送を試験するためのBBMVの調製およびウェスタンブロット
マグネシウム沈殿法を用いてBBMVを単離する75。ブラッドフォード法を用いて、BBMVのタンパク質合計含有量を測定する76。小胞を液体N2中または-80℃で保存する。
BBMVによるアミノ酸取込みの評価
BBMVによるアミノ酸取込みを、Hopfer et al.75によって説明されている急速ろ過技術を少し修正して用いて、25℃で実施する。1mmol/lの非標識アミノ酸、25μCi/mlの放射性標識された基質L-[U-14C]ロイシン、L-[U-14C]プロリン、L-[U-14C]グルタミン酸、またはL-[35S]システイン、100mmol/l NaSCNまたはKSCN、100mmol/lマンニトール、0.1mmol/l MgSO4、および10mmol/l HEPES(pH7.4)を含むインキュベーション媒体(45μl)にBBMV懸濁液(5μl)を添加する。アミノ酸取込みの経時変化をNa+勾配の存在下(NaSCNを含む媒体を使用)およびNa+勾配の非存在下(KSCNを含む媒体)で測定する。特定の時間間隔で、150mmol/l KSCNおよび10mmol/l Tris-HEPES(pH7.4)を含む氷冷停止液5mlを添加することによって、取込みプロセスを終了させる。予め濡らしたMilliporeフィルター上に懸濁液を直ちに注ぎ、そのフィルターを氷冷停止液3mlで3回洗浄し、シンチレーターHisafe3液(LKB Products, Bromma, Sweden)5ml中に浸す。次に、フィルターを液体シンチレーションカウンター中で計数する。フィルターへの非特異的結合は前もって測定し、取込み総量から引く。タンパク質1ミリグラム当たりのアミノ酸取込み量(単位ピコモル)として結果を表す。
C)IRに起因する傍細胞透過性変化の測定
傍細胞透過性の改変を、次の技術を用いて測定する:i)希釈電位;ii)TEER;iii)様々なサイズの大型非イオン性溶質;FITC結合デキストランおよびローダミンBイソチオン酸-デキストランの透過。
IR後の低減を伴う希釈電位の変化
希釈電位測定は、ネルンストの式を用いてNa+とCl-の透過性比の変化を確認するために使用する。これらの実験の結果を非IRマウス群とIRマウス群とで比較する。傍細胞透過性試験および血漿エンドトキシン試験の結果と電気生理学データおよび生存データとの相互関係を明らかにする。
様々な濃度のNa+を含むリンガー溶液を粘膜に灌流させることによって希釈電位を誘導し、マンニトールを用いて全体のモル浸透圧濃度を調整して、各実験のモル浸透圧濃度が等しくなるように維持する。コンダクタンスへの他のイオンの寄与は、5%未満であると推定し、したがって無視する。AgCl-AgCl電極およびマルチ-メーター(VCC MC8、Physiologic instruments Inc.)を用いて、膜内外の(across the membrane)電位差を測定する。希釈電位に、接合部電位の変化(通常、1mV未満)に対する補正を施す。これらの実験により、以下の式を用いて、傍細胞経路のクロリドおよびナトリウムのコンダクタンスを計算することが可能になる。
Figure 0006425356
傍細胞空間を通る非イオン性溶質透過のIR後の変化
様々なサイズの水溶性非荷電性溶質に対する傍細胞透過性を、FITC結合デキストランおよびローダミンBイソチオン酸-デキストラン(Sigma)を用いて、Ussingチャンバーに取り付けた小腸組織において試験する。これらの試験により、IRに起因する傍細胞透過性変化の測定が可能になる。
タイトジャンクションによって形成される細胞間バリアは、高度に調節され、サイズ選択的かつイオン選択的である。したがって、この細胞間バリアは、半透性拡散バリアである。通常の上皮および放射線にさらされた上皮の両方について、基礎的条件下で、Ussingチャンバーに取り付けた回腸組織または空腸組織における様々なサイズの水溶性非荷電性溶質に対する傍細胞透過性を測定するために実験を設計する。
リンガー溶液中に濃度3mg/mlで溶解したFITC結合デキストランおよびローダミンBイソチオン酸-デキストラン(Sigma)をUssingチャンバーの粘膜側に添加し、37℃で60分間維持する。側底の浴溶液中の溶液を試料採取して、蛍光標識したデキストランを定量する。FITC-デキストラン:Exc485nmおよびEm:544nm、ならびにローダミンBイソチオン酸-デキストラン:Exc520nmおよびEm590nm。Ussingチャンバーに取り付けたマウスの回腸組織または空腸組織から検量線を作成して、時間経過に伴う透過性の任意の変化を調べる。次いで、これらの値をIRマウス由来組織および非IRマウス由来組織と比較する。
D)放射線照射の影響の測定
Ussingチャンバー試験およびpHスタット試験のために屠殺したマウスの組織をH&E染色、BrdU、便形成、潜血、体重、免疫組織化学的検査、およびウェスタン解析のために使用する。次いで、これらの結果を非IRマウスおよびIRマウスにおける電解質透過性、栄養素透過性、および傍細胞透過性の変化の機能的改変と比較する。
陰窩アッセイ法、H&E、BrdU染色による病理学的解析
a)陰窩アッセイ法/微小コロニー生存アッセイ法
多細胞構造体中のクローン原性(「構造体を救う」)細胞がポアソン統計学に従って挙動すると想定する細胞死滅モデルを用いて、目的の曲線をデータにフィッティングさせた。平均して、構造体1つ当たりの生存細胞が3個未満になるまで、構造体は無傷のままであること;細胞の生存は、分析される線量の範囲全体に渡って指数関数的であること;および構造体は1つまたは複数の生存細胞から再成長できることが想定される。各上皮フォーカスは、再生性陰窩を生じることができる1つまたは複数のクローン原性幹細胞の生存を示すと考えられている。
陰窩微小コロニーアッセイ法のために、IR後3.5日目にマウスを屠殺する。この間隔は、IR後の陰窩における有糸分裂回復のピーク時であるか、またはピーク時に近い。これは、IRの急激な影響を研究するために使用される。
放射線に対する生物学的応答に関して、D0値およびD10値を算出する。研究により、D0値間に統計学的有意差はないにもかかわらず、D0の分散は、基準点当たりのマウスおよび切片の数に大きく依存することが示された。切片の数を2個より多く、かつマウスの数を4匹より多くに増やすことによって、変動係数の値の減少(約5%)を実現することはできなかった。したがって、これらの研究は、マウス1匹当たり3つの切片および基準点1つ当たり6匹のマウスを用いて設計した。
b)IR後の有糸分裂活動を検出するためのBrdU染色
マウスにBrdU(30mg/kg体重)を注射し、これらの動物を12時間目、24時間目、48時間目、または72時間目に屠殺し、その際、機能研究のために組織も採取する。注射後24時間を超えてBrdU標識試験を継続する場合、24時間毎に1回、BrdU注射を繰り返す。BrdU標識後、マウス小腸のパラフィン切片を調製し、抗BrdU抗体(Ab)で染色する。陰窩および絨毛の構成単位全体ごとに、細胞を採点した。マウス1匹当たり少なくとも60個の陰窩および対応する絨毛を解析した。BrdU標識した細胞を、陰窩または絨毛当たりの全細胞数に対して正規化した。次いで、得られた百分率を導入時間に対してプロットする。これらの試験により、陰窩前駆細胞が有糸分裂後の絨毛区画中に移行する速度、陰窩における細胞分裂速度に対する直接的相関関係、および遊走する陰窩細胞の動態を確認することが可能になる77。
IRに伴う身体的パラメーターの変化
マウスの体重、便形成、および便潜血を調査して、IRに伴う動物の栄養状態の変化を検出する。日常活動および疾病の徴候に関して、全マウスを1日1回、下痢、毛づくろいの未実施、乱れた体毛、飲食習性の減退、無気力などについて観察し、注意深く記録する。
これらの研究の調査結果を、代替えマーカーの血漿解析、病理学的観察、ウェスタンブロット、免疫組織化学的検査、および機能研究と比較する。
電解質および栄養素の輸送に関与している輸送プロセスの分子的改変を確認するためのウェスタンブロット解析
電解質および栄養素の吸収に直接的にまたは間接的に関与している以下の輸送タンパク質の活性の変化を検査する。これらの輸送タンパク質には、CFTR活性(起電性Cl-分泌と相関関係がある)、NHE3活性(Na+吸収と相関関係がある)、絨毛におけるNBCe1-A/B活性(HCO3 -分泌と相関関係がある)、NKCC1(細胞中へのNa+、K+、およびCl-の側底側取込み)、SGLT-1(グルコース吸収)、B0、B0/+、b0/+、PAT(プロトン共役起電性輸送系)、ならびにX- AGが含まれる(表2)。これらの研究を、非IR、IRおよびORD処置後の機能データと比較する。
輸送タンパク質、陰窩細胞マーカー、および絨毛細胞マーカーの発現パターンの変化を検出するための免疫組織化学
機能研究のため、および様々な輸送体(CFTR、NHE3、NKCC、NBCe1-A/B、SGLT、B0 、B0/+、b0/+、PAT1、およびX- AG)に特異的である様々な抗体を用いた免疫染色のために、動物を屠殺する際に凍結切片を作製する。さらに、細胞表面マーカーの発現パターンを検査して、陰窩細胞と絨毛細胞の比率に関する見識を得る。これらの研究によって、IR処置およびORD処置に伴う輸送体発現パターンの改変を確認することが可能になる。
E)放射線の影響に関する代替えマーカーの同定
GI毒性の始まりを確認するために、放射線量および照射後の時間を測定する代替えマーカーを同定しようとする研究がいくつかあるが、これらの研究はほとんど不成功であった。本実施例は、GI毒性の始まりを予測するための代替えマーカーの同定を可能にする実験設計を例示する。この代替えマーカーは、複数の器官が関与している場合(scenario)にも有用となる可能性がある。
具体的には、機能評価のために(Ussingチャンバー)、動物を屠殺する際に血漿を採取する。0Gy、1Gy、3Gy、5Gy、7Gy、または9GyのIR線量に曝露させた後、1日目、2日目、3日目、6日目、または9日目にマウスを屠殺する。代替えマーカーを同定するために、消化管ペプチド、サイトカイン、およびエンドトキシンを調査する。
エンドトキシンに関する血漿解析
血漿エンドトキシンレベルを測定する。血漿エンドトキシンレベルの変化と、傍細胞透過性、血漿消化管ペプチドレベル、疾病、および生存率の変化との相互関係を明らかにする。
サイトカインに関する血漿解析
LUMINEXマルチプレックスビーズアレイ技術を用いて、IRマウスおよび非IRマウスの血漿サイトカインレベルの変化を検査する。
消化管ペプチドに関する血漿解析
インスリン、グルカゴン、セクレチン、コレシストキニン、シトルリン、ソマトスタチン、ペプチドYY、グレリン、NPY、およびGLP-2を含む、消化管特異的ペプチドを調査する。消化管ペプチドキットはすべて、Phoenix Pharmaceuticals, Inc.(CA, USA)から購入した。製造業者の取扱い説明書に従って、実験を実施する。
統計学的解析
正常組織とIR組織の機能の差を比較する。分散分析(ANOVA)を用いて統計学的有意性を算出する。各アッセイ法のデータを比較する。相関係数(R)を解析して、最も優れた機能マーカーを決定する。統計学的解析はすべて、Windows向けのSAS System((著作権)2002-2003 SAS Institute Inc.,Cary, NC, USA.)のバージョン9.1を用いて実施する。特定の統計学的手順に付随する分布仮定に反する(violated)場合、適切な変換またはノンパラメトリックな代案を使用する。受信者動作特性(ROC)曲線を作成し、DeLong et al.(1988)のノンパラメトリックな方法を用いて、様々な機能試験のROC曲線下面積(AUC)を比較する。多重比較のためのテューキーの方法を用いて、ファミリーごとの第1種の過誤率を0.05で制御する。ピアソン相関係数ならびに関連するp値および95%信頼区間を報告する。
実施例16 IRによって誘発される胃腸管損傷を治療するための理想的な経口治療計画の立案
本実施例は、放射線によって誘発されるGI毒性の治療または回復のための経口治療用組成物を開発するための実験的設計を例示する。また、経口補水食(ORD)を開始すべき時間および様々な線量のIRへの被爆後に組成物を投与すべき期間も決定する。ORDを与える必要がある期間は、Kmが基礎レベルに戻るのに必要とされる時間に依存する。
方法
NCIから入手したC57BL/6マウス(8週齢、オス)を使用する。輸送体の親和性を測定するために、濃度を上昇させた各栄養素を用いることによって飽和動態を算出する。予備研究により、一部のアミノ酸は吸収が増加したのに対し、一部は吸収の減少を示し、IR後のKmおよびVmaxの変化を伴うことが示された。腸または空腸(個別に評価にかけられる)に添加されるアミノ酸の濃度を上昇させると、Iscの増加を誘発する。Iscに対して公知の濃度のアミノ酸をプロットすることにより、飽和動態を測定することが可能になる。IR後に選択的に吸収されたアミノ酸を胃洗浄によって投与すると、マウスの生存が増加する。各群の10匹のマウスを用いて、0Gy、1Gy、3Gy、5Gy、7Gy、または9GyのIRを受けたマウスにおける栄養素のKmおよびVmaxを0日目、1日目、2日目、4日目、6日目、8日目、10日目、12日目、14日目、16日目、18日目、20日目、25日目、および30日目に測定する。
A)理想的な経口的放射線治療食(ORD)を開発するための、必須アミノ酸およびグルコースのKmおよびVmaxの測定
本明細書において例示するように、放射線照射が栄養素の輸送動態の変化を引き起こすことから、各輸送体に対する親和性の改変が示唆される。この技術を用いて測定されるグルコース輸送体に対する親和性は、有意な低下を示し、基礎レベルに戻るのに約2週間を要した。腸管内腔に未吸収のグルコースまたは栄養素が存在すると下痢が引き起こされることが公知である。栄養素のKmおよびVmaxは、様々な線量のIRに被爆したマウスにおいて測定し、IR後最長で30日の期間、追跡調査する。これらの研究は、時間および放射線量に応じた吸収パターンに基づいてORDを製剤化するために有用である。さらに、IR後に吸収の増加を示す栄養素は、身体に対するエネルギーの代替供給源として使用され得る。次いで、製剤(ORD)を生存研究において使用する。
IR後のUssingチャンバーにおけるグルコース輸送に関するKmおよびVmaxの変化
グルコース輸送を研究する。具体的には、グルコースに対するKmおよびVmaxを研究する。Ussingチャンバー実験において、漸増濃度のグルコースを管腔側に添加し、Iscの増加を記録する。グルコース輸送が改善し始めるまで、補助的な経口治療計画ではグルコースを与えないでおく。製剤は、マウスが経口グルコースを許容する能力に基づいている。
IR後のアミノ酸(a.a)輸送に関するKmおよびVmaxの変化
各アミノ酸に関するKmおよびVmaxを測定することによって、IR線量およびIR後の時間に基づくアミノ酸の動態学的パターンを研究する。前述のUssingチャンバー設定で、起電性アミノ酸の動態学的指標を測定する。手短に言えば、管腔溶液に添加するアミノ酸の濃度を上昇させると、Isc応答が増大し、特定のアミノ酸濃度で飽和する。KmおよびVmaxは、飽和曲線から算出する。
BBMVを用いて、電気的中性アミノ酸を研究する。BBMVによるアミノ酸取込みは、0.025〜7mmol/lの様々な濃度の基質の存在下、3秒という既定の輸送時間で実施する(19)。各アッセイ法は、各実験群に由来するBBMVの集団(n=12)を用いて、3つ組で実施する。最大速度(Vmax)は、3秒間におけるタンパク質1ミリグラム当たりの基質のピコモル数として表され、輸送体親和性定数(Km)は、1リットル当たりのミリモルとして表される。
GI毒性を軽減し、生存状況を改善するためにORD療法を最適化する
20mg/マウス/日の用量範囲のリジンがマウスの生存を増加させ得ることが発見されている。適切な投与用量、頻度、および間隔を選択することによってORD治療計画を最適化するために、7日目時点の生存、便形成、潜血、および体重に対するORDの影響の解析を実施する。各アミノ酸またはグルコースのKm値から決定した線量範囲の致死線量のIR(15.6Gy=1.2×LD50/7値)後、早くも3時間後にORDを開始する。胃洗浄のために使用するグルコースまたはアミノ酸の濃度は、グルコースおよび必須アミノ酸に関して現在使用されている成人向けの1日当たりの推奨量に基づいてKmから算出する。ヒトの場合からマウスの場合への用量の変換は、Km因子に基づく78。したがって、Kmと栄養素の1日量の間には反比例の関係が成り立つ。IRによってKmが増加した(輸送体に対する親和性の低下を示唆する)場合、各栄養素の1日量は、それに比例して減少する。複数種の用量、すなわち計算した用量の3倍の用量および3分の1の用量を含む、さらに2種のORDを製剤化する。最適なORD投薬量を生存研究に基づいて決定する。
胃洗浄を毎日1回、7日間繰り返す。生存研究の結果によって、ORD胃洗浄の投与頻度および間隔は変更される。GI毒性は、IR後2〜3日目ごろにピークとなり、その後、ORDが有効である場合には7日目までに徐々に回復する。IR後最長7日目までマウスを毎日観察して、生存をモニターする。
通常の飼料を与えられているマウスはすべて、IR後7日以内に死亡するか、または屠殺される(瀕死;20%の体重減少、毛づくろいできない状態、活動低下、および探求心の低下の組合せとして定義される)。ORD治療を受けているマウスがIRによって誘発される致死性から保護される場合、追加のマウス10匹/群に同じ治療を用いて生存実験を繰り返して、結果が再現可能であることを確かめる。生存データをフィッシャーの正確確率検定によって解析する。
1群当たり動物10匹という標本サイズは、全体のα水準が確実に5%となるように(0.05/3にほとんど等しい0.017に調整したα水準で実施した対比較において)ビヒクル群の場合の0%に近い生存率と各介入治療の場合の60%またはそれ以上の生存率との差を検出するために十分に高い検出力(>80%)を確保する。統計学的有意差が観察されないか、またはORD治療によって不十分な緩和しか達成されない場合には、先に説明したように、治療計画最適化を新たに1回行って、IRによって誘発される致死性に対する低減効力が最大になるよう徹底する。最適用量を選択した後、放射線のより大幅な低減およびより迅速な陰窩回復を実現するために、より頻繁な(毎日2回)ORD胃洗浄が必要であるかどうかを評価する。
IR後の治療法のためのORDのDMFおよび有効性の空白期間の確認
線量変更係数(DMF)は、放射線低減物質(radiation mitigator)の有効性を測定するための最重要パラメーターの内の1つであり、DMF=LDT 50/LDC 50(TはORD治療群であり、Cは通常の食事を与えられた対照群を示す)によって定義される51。IRによって誘起される致死性を低減するにあたってのORD治療の有効性を判定するために、平均10匹のC57BL/6マウスからなる群(マウス10〜20匹/群、IR線量によって変動する)を、以前の実験に基づいて定めた最適治療計画を用いてビヒクルまたはORDで処置する。ビヒクルで処置したマウスを、0.5〜1Gy刻みで増やした11Gy〜13GyのIRに被爆させる。IR後7日間の観察期間、これらのマウスの生存状況を記録する。観察期間の最後またはマウスが瀕死になった場合に、マウスを安楽死させる。
安楽死後、小腸および血漿を採取する。血液試料は消化管ペプチド解析のために使用し、小腸組織標本は、IRによって誘発される腸障害を調査するために使用する。LD50/7値は、IRによって誘発されるGI毒性の好適な指標である。
ビヒクルで処置したマウスに対するLD50/7は、本発明者らの研究室での以前の知見に基づくと13Gyに近い。ORD治療群を、0.5〜1Gy刻みで増やした14.5〜16.5Gy IRの範囲のIRに被爆させ、観察し、ビヒクルで処置したマウスに関して前述したようにして検査する。ORD治療群の相当数のマウスが、16.5Gyに被爆した後でさえ生存している場合、その後の研究では、より高いIR線量をマウスに与える。生存曲線に基づいて、ORD治療動物に対するLD50/7値を算出し、次いで、ORDに対するDMFを算出する。ORD治療マウスのLD50/7に関するDMFは、1.2より大きい。
IR後どれくらいすぐにORD治療を施すべきかを決定するため、5つの動物群にIR後0時間目、1時間目、3時間目、5時間目、7時間目、9時間目、12時間目、および24時間目にORDを投与し、スケジュール化したORD治療を引き続き行い、陽性対照(IR処理後3時間)および陰性対照(生理食塩水ビヒクル)と共に7日間観察する。7日目の時点の生存状況に基づいて、動物の生存状況を比較する。
このモデルでは、いくつかのロジスティック回帰モデル(結果変数が7日目時点の死亡/生存)およびIR後にORDを投与された8群の様々な経時動向を考察する。線形モデル(治療の遅延が大きくなるにつれ、生存率が減少する可能性が高い)および非線形モデル(指数関数的な生存率減少)の両方を考察する。
フィッシャーの正確確率検定を用いて2つ1組で、IR後3時間目の投与およびビヒクルに対する比較を実施する。対比較(時期の異なる群対IR後3時間目、ORD群対ビヒクル)を行い、個々の試験のα水準を0.005(0.05/10にほとんど等しい)に維持する。
a)生存率:
ORDの治療効果の主要指標は、生存率を決定することである。1日に2回記録し、生存曲線を作成する。
b)日常活動または疾病の徴候
下痢、毛づくろいの未実施、乱れた体毛、飲食習性の減退、無気力などの疾病の徴候について全マウスを1日1回観察し、注意深く記録する。
c)体重、便形成、および潜血
ORDによって、IRによって誘発されるGI毒性に起因する影響の一部を元に戻すことができるかを判定するために、本明細書において説明する機能研究のために動物を屠殺する際、結腸を摘出し、便形成を写真に撮り、糞便の潜血を解析する。これらの研究により、裸眼で見えるGI粘膜の完全性およびそれらの機能を低減剤によって維持できるかを判定することが可能になる。
d)免疫組織化学
空腸または回腸のH&E染色切片を用いて、固有層への炎症細胞浸潤を解析する。注意して、リンパ濾胞の分布頻度を測定する。
急性GI毒性に対するORDの最適用量、開始時間、およびスケジュールを順に決定する。IR被爆後に、様々な用量のORD製剤でマウスを治療する。最適用量は、目的変数としての7日を過ぎての生存(生存対死亡)および説明変数としての用量レベルを確認することによりロジスティック回帰モデルにおいて決定する。用量反応曲線は不確実であるため、妥当と思われるいくつかの用量反応モデルを提唱する。用量反応のモデルを決定した後、最小有効量(MED)を算出する。治療法の開始時間および最適な継続期間は、ANOVAモデルにおいて概算の平均応答および分散を用いた同等性検定によって答えを見つける。
実施例17 GI機能の機能改善の測定
本実施例では、電気生理学的実験を実施して、IRによって損傷した消化管粘膜を修復して電解質および栄養素を吸収するのをORDがどのように助けるかを確認する。機能変化と血漿代替えマーカー、細胞診、および身体的な知見、例えば日常活動、体重、および便形成などとの相互関係を明らかにする。便潜血、陰窩アッセイ法のような細胞診、H&E染色、BrdU染色、免疫組織化学的検査、およびウェスタンブロット解析。これらの研究により、GI機能に対するORDの保護効果を分子レベル、細胞レベル、および機能レベルで確認することが可能になる。
方法
NCIから入手したC57BL/6マウス(8週齢、オス)を使用する。機能研究、身体的知見、細胞診、免疫組織化学的検査、ウェスタン解析を実施し、IRによって誘発されるGI毒性の具体的な指標として、血漿代替えマーカーを使用する。マウスを無作為にいくつかの群に分け、1.84Gy/分の線量率でIRを送達するCs供給源を用いてShepherd Mark-Iによって、腹部に放射線照射した。1Gy、3Gy、5Gy、7Gy、または9Gyでマウスに放射線照射し、次いで、ORDを投与する。マウスをORDで治療する。6日目にマウスを屠殺し、機能検査、組織病理学的検査、ウェスタンブロット、および免疫組織化学的検査のために組織を使用する。
A)ORDの効果と電解質および栄養素の吸収の機能改善との相関
1組の指標を用いて、治療効果を評価する:1)マウスの体重を毎日測定し、何らかの疾病の徴候がないかしっかりと観察する;2)機能研究(電解質および栄養素の吸収)、陰窩アッセイ法、免疫組織化学的検査、およびウェスタンブロット解析のために動物を屠殺する際、血液試料および身体的パラメーターを解析する。血漿エンドトキシン(消化管バリア機能障害の指標)、サイトカイン、消化管ペプチド(インスリン、グルカゴン、セクレチン、コレシストキニン、シトルリン、ソマトスタチン、ペプチドYY、グレリン、NPY、およびGLP2)、シトルリン、グルコース、ならびにインスリンを測定するために血液試料を使用する。
Ussingチャンバー試験におけるNa+およびCl-の経上皮流束の測定
ORDの機能改善を調査するために、マウスから得た空腸および回腸の薄層(個別の評価に供される)をUssingチャンバーに取り付け、実施例15で説明したようにして実験を実施する。非IRマウス群、IRマウス群、およびORD治療マウス群のNa+およびCl-の吸収を比較する。
pHスタット技術によるpf HCO3 -分泌の測定
実施例15で説明したようにして実験を実施する。ORD治療によってHCO3 -分泌が修復されることから、機能改善が示唆される。非IRマウス群、IRマウス群、およびORD治療マウス群のHCO3 -分泌を比較する。
Ussingチャンバー試験および小胞試験における栄養素吸収の測定
実施例15で説明したようにして、グルコース、起電性アミノ酸、および電気的中性アミノ酸の吸収を測定する。非IRマウス群、IRマウス群、およびORD治療マウス群のこれらの研究の結果を比較する。
IR後の低減を伴う傍細胞透過性の変化の確認
ORD治療によって傍細胞透過性が低下することから、上皮完全性の改善が示唆される。これらの変化は、血漿エンドトキシンレベルの改善が同時に起こっていることを示す。
ORDの効果と陰窩アッセイ法、H&E染色、BrdU、便形成、潜血、体重、免疫組織化学的検査、およびウェスタン解析との相互関係を明らかにする
これらの研究は、実施例15で先に説明したものと同様であり、非IRマウス群、IRマウス群、およびORD治療マウス群の結果を比較する。
解剖学的改善を確認するための組織病理学的解析
実施例15で説明したように、H&E染色、および陰窩アッセイ法を含む病理学的解析、BrdU染色のために標本を加工する。簡単に説明すると、組織をホルマリン中で固定し、パラフィンブロックに加工し、H&Eで染色する。
輸送タンパク質、陰窩細胞マーカー、および絨毛細胞マーカーの発現パターンの変化を検出するための免疫組織化学
採取した組織を、様々な輸送体(NHE3、NBCe1-A/B、SGLT、B0/+、b0/+、X- AG)および細胞表面マーカー(Lgr5、EphB2、およびEphB3)に特異的な様々な抗体を用いた免疫染色のために使用する。この方法は、実施例15で説明した方法と同様である。これらの研究は、ORD治療後の絨毛細胞および陰窩細胞の形成の程度を確認する助けとなる。
電解質および栄養素の輸送に関与している輸送プロセスの分子的改変を調査するためのウェスタンブロット解析
この方法は、実施例15で説明した方法と同様である。CFTR活性(起電性Cl-分泌と相関関係がある)、NHE3活性(Na+吸収と相関関係がある)、絨毛におけるNBCe1-A/B活性(HCO3 -分泌と相関関係がある)、SGLT-1、B0/+、b0/+、またはX- AGを検査する。
代替えマーカーの血漿解析を用いてORDの効果の相互関係を明らかにする
予備研究により、IR後のマウスにおける消化管ペプチドの変化が示された。代替えマーカーレベルが基礎レベルに近づく変化を検査し、これらの結果は、ORD治療による全身的改善を示す。
統計学的解析
生データの平均値および標準偏差を算出し、棒グラフのようなグラフ技術を適用する。これらの2群(治療群およびビヒクル群)の比較に対する主なアプローチは、長期的データに基づいた混合効果モデル(線形または非線形)を使用する。
本明細書に引用される、刊行物、特許出願、および特許を含む参考文献はすべて、各参考文献が参照により組み入れられることが個別かつ具体的に示され、その全体が本明細書において説明された場合と同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明を説明する文脈において使用される用語「1つの(a)」および「1つの(an)」ならびに「その(the)」ならびに同様の指示物は、本明細書において別段の定めもなく、文脈に明らかに矛盾もしない限り、単数形と複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。
本明細書における値の範囲の詳述は、本明細書において別段の定めが無い限り、その範囲に含まれる別々の各値に個別に言及する省略した方法となることが意図されるにすぎず、別々の各値は、本明細書に個別に引用されるかのように、明細書中に組み入れられる。別段の定めが無い限り、本明細書において提供される厳密な値はすべて、対応する近似値を代表する(例えば、特定の係数(factor)または測定値に関して提供される例示的な厳密な値はすべて、必要に応じて「約」で修飾される対応する近似測定値も提供するとみなすことができる)。
本明細書において提供される任意およびすべての例、または例示的な言い回し(例えば、「などの(such as)」)の使用は、本発明をよりうまく明らかにすることを意図するにすぎず、別段の定めが無い限り、本発明の範囲に制限を与えない。本明細書中のいかなる言い回しも、それだけ明示的に述べられない限り、いずれかの要素が本発明の実践に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
1つの要素または複数の要素に関して「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」、または「含む(containing)」などの用語を用いた、本発明の任意の局面または態様に関する本明細書における説明は、別段の定めもなく、文脈に明らかに矛盾もしない限り、その特定の1つの要素または複数の要素「からなる(consists of)」、「から本質的になる(consists essentially of)」、または「を実質的に含む(substantially comprises)」本発明の同様の局面または態様に裏付けを提供すると意図される(例えば、特定の要素を含むとして本明細書において説明される組成物は、別段の定めもなく、文脈に明らかに矛盾もしない限り、その要素からなる組成物も説明すると理解されるべきである)。
本明細書において説明される実施例および態様は、例示するためのものにすぎないこと、ならびにそれらを踏まえた様々な修正または変更が当業者に示唆され、かつそれらが本出願の精神および範囲内に含まれ得ることが理解されるべきである。
参考文献
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Claims (11)

  1. 小腸の健康状態を改善するための治療用組成物であって、経腸投与用に製剤化され、かつ遊離アミノ酸として、リジン、グリシン、トレオニン、バリン、アスパラギン酸、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリンおよびチロシンのうち２以上;ならびに水を含み、
    遊離アミノ酸グルタミンないしグルタミン含有ジペプチドを含まないか、含む場合にはそれらの合計濃度が50mg/l 未満であり、
    グルコースを含まないか、含む場合にはその濃度が1g/l 未満であり、かつ、
    遊離アミノ酸メチオニンないしメチオニン含有ジペプチドを含まないか、含む場合にはそれらの合計濃度が100mg/l 未満であり、
    絨毛萎縮を有する対象において、放射線腸炎、炎症性腸疾患(IBD)、潰瘍性大腸炎、十二指腸潰瘍、またはクローン病を治療するために使用される、前記治療用組成物。
  2. グルコースか、グルタミンか、メチオニンを含まない、請求項1記載の治療用組成物。
  3. 電解質、ビタミン、ミネラル、および香味剤からなる群から選ばれる一以上の成分をさらに含む、請求項1記載の治療用組成物。
  4. 対象がヒトである、請求項１記載の治療用組成物。
  5. 正常状態と比べた場合に、対象の絨毛領域の小腸上皮細胞の総数が少なくとも10%減少している、請求項１記載の治療用組成物。
  6. 正常状態と比べた場合に、対象の小腸の絨毛の高さが少なくとも10%減少している、請求項１記載の治療用組成物。
  7. グルコース、グルタミン、またはメチオニンより選択される1種または複数種の成分を含まない、請求項１記載の治療用組成物。
  8. 遊離アミノ酸、ジペプチド、単糖、二糖、またはそれらの組合せより選択される1種または複数種の成分を混合する段階を含む、絨毛萎縮を有する対象の腸の健康を増進するための請求項１記載の治療用組成物を調製するための方法であって、
    各成分が、正常状態と比べた場合に、絨毛萎縮を有する対象の小腸において少なくとも50%の吸収能力を保持するように決定されている、前記方法。
  9. 水を含み、かつモル浸透圧濃度が230mosm〜280mosmである、請求項1記載の組成物。
  10. 水と混合した場合に請求項1記載の組成物を生じる、絨毛萎縮を有する対象において、放射線腸炎、炎症性腸疾患(IBD)、潰瘍性大腸炎、十二指腸潰瘍、またはクローン病を治療するために使用される、粉末形態の組成物。
  11. 請求項1記載の組成物か、または水と混合した場合に請求項1記載の組成物を生じる粉末を含むパッケージであって、絨毛萎縮を有する対象において、放射線腸炎、炎症性腸疾患(IBD)、潰瘍性大腸炎、十二指腸潰瘍、またはクローン病を治療するために使用される、前記パッケージ。
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