MXPA01002875A - Metodos para facilitar el crecimiento vascular. - Google Patents

Abstract

Un metodo para facilitar el crecimiento vascular en un sujeto que necesite de dicho tratamiento,que consiste en inhibir la actividad de EMAP 11 en el sujeto mediante una cantidad efectiva para estimular el crecimiento vascular en el sujeto (por ejemplo, en los pulmones del individuo); las formulaciones farmaceuticas usadas para llevar a cabo dichos metodos (por ejemplo, un anticuerpo que se une especificamente a EMAP 11 en un portador farmaceutica mente aceptable) y tambien se describen las tecnicas de seleccion utiles para identificar compuestos adicionales que se pueden usar para llevar a cabo dichos metodos.

Description

MÉTODOS PARA FACILITAR EL CRECIMIENTO VASCULAR Esta invención fue hecha con el apoyo gubernamental conforme a los apoyos económicos números NIH HL-60061. El gobierno de los E.U.A. tiene ciertos derechos sobre esta invención.

SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de las solicitudes provisionales de los Estados Unidos con No. de serie 60/108,435, presentada el 13 de noviembre, 1998, cuya descripción se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para facilitar el crecimiento vascular en un individuo, tal como un individuo en riesgo de lesión por reperfusión isquémica, o un recién nacido afectado con dísplasia broncopulmonar. También se describen métodos para identificar compuestos útiles para los tratamientos anteriormente mencionados también.

ANTECEDENTES DE LA INVECION La patente de E.U.A. No. 5,641 ,867 de D. Stern et al. (asignada a la Universidad de Columbia) describe un polipéptido purificado, que activa a monocitos endoteliales (EMAP) II, anticuerpos que específicamente se unen a EMAP II, y métodos para el tratamiento de tumores mediante la administración de EMAP II a un individuo afectado. U. Knies et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 12322-12327 (oct. 1998), describe la regulación de la liberación del polipéptido II activador de monocitos endoteliales por apoptosis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un primer aspecto de la invención es un método para facilitar el crecimiento vascular en un individuo, así como en un órgano o tejido del individuo, que necesita de dicho tratamiento. El método comprende la inhibición de la actividad de EMAP II en el individuo (v.g.r., en el órgano o tejido antes mencionados) mediante una cantidad efectiva para estimular el crecimiento vascular. Un segundo aspecto de la presente invención es la formulación de un fármaco que comprende: un compuesto activo seleccionado del grupo que consiste de compuestos que específicamente se unen a EMAP II, compuestos que inhiben la expresión de EMAP II, y antagonistas al receptor de EMAP II; y un portador farmacéuticamente aceptable. Un tercer aspecto de la presente invención es un método para seleccionar los compuestos útiles para facilitar el crecimiento vascular en un 5 individuo que lo necesite. El método comprende: poner en contacto un compuesto de prueba (v.g.r., una proteína o péptido) a una sonda molecular, la sonda molecular se selecciona a partir del grupo que consiste de EMAP II y de fragmentos del mismo; y después detectar la presencia o ausencia de unión del compuesto de prueba a la sonda molecular, la presencia de unión 10 indica que el compuesto puede ser útil para facilitar el crecimiento vascular en un individuo. Un cuarto aspecto de la presente invención es un método para seleccionar los compuestos útiles para facilitar el crecimiento vascular en un individuo, que comprende: poner en contacto un compuesto de prueba (v.g.r., 15 un oligonucléotido) a una sonda molecular, la sonda molecular se selecciona a partir del grupo que consiste de ADN que codifica para EMAP II, ARN que codifica para EMAP II, y fragmento de los mismos; y después detectar la presencia o ausencia de unión del compuesto de prueba a la sonda molecular, la presencia de unión indica que el compuesto puede ser útil para facilitar el 20 crecimiento vascular en el individuo. Un quinto aspecto de la presente invención es un método de selección para compuestos útiles para facilitar el crecimiento vascular en un individuo, que comprende: determinar in vitro si el compuesto de prueba -A-üfet-Hál-i-. inhibe la expresión de EMAP II; la inhibición de la expresión de EMAP II indica que el compuesto puede ser útil para facilitar el crecimiento vascular en un individuo. La presente invención se explica con mayor detalle en la serie de 5 especificaciones más adelante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 : Purificación de EMAP II recombinante (r). El REMAP II 10 en un sistema PET28a 6X marcado con histidina fue aislado después de la inducción con IPTG de E.coli. La línea uno en este gel de azul de Coomassie, es la expresión inicial de rEMAP II. La línea dos representa la inducción de rEMAP II con IPTG y la línea tres el rEMAP II purificado. Figura 2: El EMAP II inhibe el desarrollo vascular del pulmón 15 fetal. Los explantes del pulmón fetal transplantados subcutáneamente en ratones inmunocomprometidos tratados intraperitonealmente (IP) con rEMAP II, anticuerpo EMAP II, o el vehículo (PBS o suero de conejo respectivamente) fueron evaluados por su formación de vasos sanguíneos después de 14 días de implantación usando el anticuerpo PECAM-1. Hubo una marcada inhibición 20 de la neovascularización en los transplantes de ratones que recibieron rEMAP II (2B) en comparación con el vehículo solo (2A). Los análisis de la formación • de vasos sanguíneos, evaluados mediante el conteo del número de vasos sanguíneos por HPF (conteo promedio de 10 HPF por implante de pulmón, -af-W-^-a-ál-l-i-i n=20 implantes/grupo llevado a cabo en cuatro ocasiones separadas) mostraron una reducción de 56% en la neovascularización en animales que recibieron rEMAP II en comparación con el control (2D) (p< 0.0001 ). Esto contrasta mucho con aquellos transplantes en animales que recibieron el anticuerpo EMAP II en donde hay un incremento del 50% de dosis dependiente en el conteo de vasos sanguíneos (p< 0.0001 ) (2C) en comparación con el control (2E) (n=10/grupo llevado a cabo en 3 ocasiones separadas). Una reducción en la banda de PECAM-1 y Tie-2 de ARNm mediante RT-PCR en los explantes de pulmón de ratones tratados con EMAP II y un incremento en el ARNm de PECAM-1 y Tie-2 en los animales tratados con el anticuerpo EMAP II confirmaron los resultados ¡nmunohistoquímicos (2F). Los resultados de RT-PCR fueron normalizados usando ß-actina como control interno. Los controles negativos para la amplificación por PCR de los transcritos de PECAM-1 y Tie-2, sin RT, no demostraron la presencia de productos específicos de PCR en cada rxn (datos no mostrados). Barra =500 µm. Figura 3: El exceso de EMAP II lleva a una alteración en la morfogénesis epitelial del pulmón. Los explantes de pulmón en ratones tratados IP con rEMAP II demostraron una marcada displasia pulmonar, definida por la presencia de células epiteliales aplanadas en la región de las vías aéreas centrales (flechas en 3D) y vías aéreas periféricas pobremente formadas (3 E,F). Esto está en agudo contraste con aquellos transplantes en ratones tratados con el vehículo en donde hubo bronquios bien definidos, epitelio, (3A) y espacios distales con epitelio atenuado consistente con los alvéolos (3 B,C). Barra =500 µm en A,B,D,E; Barra=250 µm en C,F. Figura 4: El exceso de EMAP II significativamente altera la diferenciación celular en el desarrollo del pulmón fetal. Los explantes de pulmón fetal llevan a cabo diferenciación celular con la aparición de células alveolares de tipo II que expresan SP-C después de 14 días de implantación en los ratones inmunocomprometidos (4 A,B) en presencia del vehículo solo. Por el contrario, los animales que recibieron un exceso de rEMAP II IP no exhibieron la expresión de SP-C a lo largo de todo el explante incluyendo aquellas áreas que histológicamente aparecen como vías aéreas periféricas displásicas (4 C,D). En contraste, se encontró un exceso de las células de tipo II en los explantes en animales tratados con el anticuerpo que bloquea a EMAP II (4 E,F). Esto es indicativo de un efecto marcado del EMAP II sobre la maduración epitelial del pulmón. Estos hallazgos de hibridación in situ fueron apoyados por la reducción en el ARN de SP-C en los explantes de pulmón de ratones tratados con EMAP II en comparación con el control y un incremento en los animales tratados con el anticuerpo EMAP II (4G). La contribución de marcadores de células alveolares tipo I reveló una ligera elevación en T1 - en explantes tratados con rEMAP II en comparación con el control. También hubo una marcada reducción de T1-a en explantes en animales tratados con el EMAP II bloqueado, la inversa del alto nivel de hibridación in situ de SP-C en las células tipo II (4G). Los resultados del RT-PCR fueron normalizados usando el gen ß-actina de mantenimiento (350 pb). Los controles negativos, no demostraron ninguna banda (datos no mostrados) barra = 500 µm en A, C, E; 250 µm en B, D, F. Figura 5: Efecto del exceso de rEMAP II sobre el glucógeno dentro de los explantes. El glucógeno (denotado como el color magenta en la 5 coloración PAS) está marcadamente elevado en aquellos transplantes de pulmón en los ratones tratados IP con rEMAP II (5 D-F). Por el contrario, los explantes en los ratones tratados con el vehículo contienen una distribución normal del glucógeno, consistente con aquella observada en la etapa sacular tardía (5 A-C). Así, la presencia de exceso de EMAP II parece detener la ío formación del pulmón en la etapa epitelial rica en glucógeno, asociada con el inicio de la etapa canalicular (vascular), justo antes de la diferenciación alveolar de las células epiteliales tipo II. Barra = 500 µm en A, B, D, E; 250 µm en C, F. Figura 6: La hibridación in situ de EMAP II exhibe un patrón de 15 quistes periepiteliales de la expresión de EMAP II (6A) que está confirmada mediante inmunohistoquímica (6B). A diferencia de la producción mínima de EMAP II en el mesenquina distal, las células mesenquimatosas en contacto estrecho con el epitelio exhiben un incremento marcado en EMAP II como está indicado por las flechas en 6B. Por lo tanto, parece que además de la 20 expresión de EMAP II en las células epiteliales y mesenquimatosas, es la interacción célula-célula real entre las células epiteliales y mesenquimatosas la que incrementa la expresión de EMAP II. Barra = 500 µm en A, C; 250 µm en B, D. üMl^ttb lkd .

Figura 7: Efecto del EMAP II en las formación de quistes epiteliales en cocultivos. Los cocultivos de células epiteliales y mesenquimatosas expuestos al exceso de rEMAP II tienen un marcado decremento del 71 % en la formación de quistes epiteliales (7B) de manera dosis-dependiente (7D) en comparación con el vehículo solo (7A). Además, en contraste con la formación normal de quistes observado en el inserto de la figura 7A, en donde el quiste está rodeado por poblaciones celulares aplanadas (flechas en el inserto 7A) consistente con la laminina de poblaciones celulares que rodean al quiste, aquellos cocultivos tratados con EMAP II (inserto 7B) o el anticuerpo EMAP II (inserto 7C) carecen de la formación normal de quistes. Por el contrario, el crecimiento de los cocultivos en presencia del anticuerpo a EMAP II refleja un incremento del 54% en la formación de quistes (7C) que también es dosis-dependiente en su naturaleza (7E). Los inventores de la presente especulan que el exceso de EMAP II interfiere con la formación y estabilidad de quistes epiteliales. (n=7/grupo llevado a cabo en 4 ocasiones diferentes) barra = 500 µm en A-C; 250 µm insertos de A-C.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Como se señaló anteriormente, un primer aspecto de la invención es un método para facilitar el crecimiento vascular en un individuo que necesita de dicho tratamiento. El método comprende la inhibición de la actividad de EMAP II en un individuo mediante una cantidad efectiva para estimular el crecimiento vascular. El crecimiento vascular puede ser inhibido en cualquier órgano o tejido adecuado, incluyendo pero no limitado al pulmón, riñon, corazón, aorta, tracto gastrointestinal, cerebro, hígado, etc. La inhibición puede ser específica o general, principalmente influenciada por la manera de administración como se discutió posteriormente. La solicitud de la invención no pretende estar limitada a ninguna teoría particular sobre el crecimiento vascular, y por lo tanto este término pretende ser considerado en términos generales, abarcando cualquier tipo de crecimiento vascular tal como vasculogénesis, angiogénesis, etc. Los sujetos que pueden ser tratados por la presente invención incluyen a cualquier individuo, humano o adulto, en el cual es deseable facilitar el crecimiento vascular. Dichos sujetos incluyen sujetos en riesgo de lesión por reperfusión isquémica en un órgano tal como los descritos anteriormente (v.gr., en el caso de transplante, presión sanguínea baja, arresto cardiaco, etc.), sujetos recién nacidos afectados con displasia broncopulmonar, sujetos afectados por hipertensión pulmonar, sujetos afectados con hipoplasia pulmonar, etc. Aunque los sujetos tratados por la presente invención son principalmente sujetos humanos, la invención también puede ser llevada a cabo en otros sujetos animales como perros, gatos, caballos, etc., para propósitos veterinarios.

El paso de inhibición puede ser llevado a cabo mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, puede ser llevado a cabo mediante la administración de un compuesto que específicamente se una a EMAP II del individuo en una cantidad efectiva para estimular el crecimiento vascular. Dichos compuestos pueden ser anticuerpos (incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos humanizados o quiméricos, etc., que retengan la región de combinación que específicamente se une a EMAP II ). Los anticuerpos pueden ser de cualquier tipo de inmunoglobulinas, incluyendo pero no sin limitarse a inmunoglobulinas IgG e IgM. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen adecuado, tales como pollo, cabra, conejo, caballo, etc; pero son preferiblemente de mamífero y más preferiblemente de humano. El anticuerpo puede ser administrado directamente o a través de un intermediario que exprese al anticuerpo en el individuo. Ejemplos de los anticuerpos a EMAP II son provistos en la patente de E.U.A. No. 5,641 ,867 de Stern et al., cuya descripción está incorporado aquí como referencia. Los ejemplos de las distintas formas de anticuerpos terapéuticos están dadas en la patente de E.U.A. No. 5,622,700, cuya descripción está incorporada aquí como referencia. El paso inhibidor puede ser llevado a cabo por la regulación descendente en la expresión de EMAP II en el individuo mediante una cantidad efectiva para estimular el crecimiento vascular en los pulmones del individuo. Los compuestos útiles para la regulación descendente de la expresión de EMAP II son, en general, oligonucleótidos antisentido que se unen a ARNm de EMAP II y que desorganizan la traducción de la misma, u oligonucleótidos que se unen al ADN de EMAP II y desorganizan la transcripción del mismo. Dichos oligonucleótidos pueden ser naturales o sintéticos (tales como los descritos en la patente de E.U.A. No. 5,665,593 de Kole, cuya descripción es incorporada aquí como referencia en su totalidad), y son típicamente al menos de 4, 6 u 8 nucleótidos en longitud, mayores a la longitud total del ADN o ARNm correspondientes. Dichos oligonucleótidos son seleccionados para unirse al ADN o ARNm mediante el apareamiento de bases Watson-Crick basado en la secuencia conocida del ADN de EMAP II como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,641 ,867 de Stern et al., cuya descripción es incorporada como referencia aquí en su totalidad. Por ejemplo, un oligonucieótido antisentido de la invención puede consistir de 4, 6, 8 o más nucleótidos oligonucleótidos que tienen una secuencia de bases correspondiente a la secuencia de ADN de EMAP II expuesta en Stern et al., anteriormente mencionada , de más de 20, 30 ó 40 nucleótidos de longitud, o incluso la longitud total de la secuencia de ADN. Además, dichos compuestos pueden ser identificados de acuerdo con técnicas conocidas como se describen posteriormente. El paso de inhibición puede ser llevado a cabo al administrar un receptor antagonista de EMAP II al individuo en una cantidad efectiva para estimular el crecimiento vascular en los pulmones del sujeto. Los antagonistas al receptor de EMAP II pueden ser identificados de acuerdo con técnicas conocidas, pero son en general análogos del EMAP II, tales como el EMAP II que tiene tres a cinco aminoácidos deletados en N-terminal y/o C-terminal. Los compuestos activos útiles para realizar los pasos inhibidores anteriormente mencionados pueden ser administrados por cualquier método adecuado, incluyendo la inyección intraperitoneal, subcutánea, intraarteriales, intravenosa, intramuscular, e intratecal. La inyección puede ser a través de una jeringa, a través de una cánula o catéter dentro del vaso sanguíneo deseado u órgano, etc. Los compuestos pueden ser administrados por inhalación dentro de las vías aéreas, y particularmente los alvéolos, de los pulmones, mediante la inhalación de partículas en aerosol respirables (v.gr., partículas con diámetros de 1 a 5 micrones) que comprenden el compuesto activo. Las formulaciones farmacéuticas de la invención típicamente comprenden a un compuesto activo seleccionado a partir de un grupo que consiste de compuestos que específicamente se unen a EMAP II (v.gr., un anticuerpo como el descrito anteriormente), compuestos que inhiben la expresión de EMAP II, y antagonistas al receptor de EMAP II; y a un portador farmacéuticamente aceptable. Se puede emplear cualquier portador farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina estéril, agua estéril, etc. El compuesto activo está incluido en los portadores farmacéuticamente aceptables en cualquier cantidad adecuada, tal como entre .001 , .005 o .01 por ciento por peso a alrededor de 10, 20, o 50 por ciento por peso.

Las dosis de los compuestos activos dependerán de la actividad particular del compuesto, la vía de administración, el trastorno particular a ser tratado, la edad, el peso, y condición del sujeto, etc. Por ejemplo, para oligonucleótidos antisentido, la dosis es preferiblemente una que produce concentraciones intracelulares del oligonucleótido de alrededor de 0.05 a 50 µM. Típicamente la dosis para un humano será de alrededor de 0.01 , 0.1 o 1 mg/Kg hasta 50, 100, o 150 mg/Kg. En un ejemplo adicional, para los anticuerpos, la dosis es típicamente 0.01 , 0.05 o 0.1 hasta 20, 40 o 60 mg/Kg. Los compuestos activos que son nucleótidos o proteínas (v.gr., anticuerpos) pueden ser administrados ya sea directamente como se describió anteriormente o a través de un vector intermediario que exprese al mismo en el individuo. Dichos vectores usados para portar la presente invención son, en general, vectores de virus de ARN o ADN, tales como los vectores lentivirus, vectores papovavirus (v.gr., vectores SV40 y vectores polioma), vectores adenovirus y vectores de virus adeno-asociados. Ver generalmente T. Friedmann, Science 244, 1275 16 (junio 1989). Los ejemplos de los vectores lentivirus que pueden ser usados para portar la presente invención incluyen a los vectores del virus de la leucemia murina Moloney, tales como aquéllos descritos en la patente de E.U.A. No. 5,707,865 de Kohn. Se puede usar cualquier vector de adenovirus para portar la presente invención. Ver, v.gr., patente de E.U.A. No. 5,518,913, patente de E.U.A. No. 5,670,488, patente de E.U.A. No. 5,589,377, patente de E.U.A. No. 5,616,326; patente de E.U.A. No. 5,436,146; y patente de E.U.A. No. 5,585,362. El adenovirus puede ser modificado para alterar o dilatar el tropismo natural del mismo, como se describe en S. Woo, Adenovirus redirected, Nature Biotechnology 14, 1538 (nov. 1996). Cualquier vector viral adeno-asociado (o vector AAV) también puede ser usado para portar la presente invención. Ver, v.gr., patente de E.U.A. No. 5,681 ,731 ; patente de E.U.A. No. 5,677,158; patente de E.U.A. No. 5,658,776; patente de E.U.A. No. 5,658,776; patente de E.U.A. No. 5,622,856; patente de E.U.A. No. 5,604,090; patente de E.U.A. No. 5,589,377; patente de E.U.A. No. 5,587,308; patente de E.U.A. No. 5,474,935; patente de E.U.A. No. 5,436,146; patente de E.U.A. No. 5,354,678; patente de E.U.A. No. 5,252,479; patente de E.U.A. No. 5,173,414; patente de E.U.A. No. 5,139,941 ; y patente de E.U.A. No. 4,797,368. Las secuencias reguladoras, o las secuencias de control transcripcional y traduccional, en los vectores pueden ser de cualquier fuente apropiada, mientras afecten la expresión del ácido nucleico heterólogo en las células blanco. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados son el promotor LacZ, y los promotores derivados de polioma, Adenovirus 2, y virus 40 de simio (SV40). Ver, v.gr., patente de E.U.A. No. 4,599,308. El ácido nucleico heterólogo puede codificar para cualquier producto que inhiba la expresión del gen EMAP II en la células infectadas por el vector, tal como un oligonucleótido antisentido que específicamente se una al ARNm de EMAP II para desorganizar o inhibir la traducción del mismo, una ribozima que específicamente se una al ARNm de EMAP II para desorganizar o inhibir la traducción del mismo, o un ácido nucleico triplex que específicamente se una a un ADN dúplex de EMAP II y desorganice o inhiba la transcripción del mismo. Todos estos pueden ser portados de acuerdo con técnicas conocidas, como (por ejemplo) las descritas en las patentes E.U.A. Nos. 5,650,316; 5,176,996, o 5,650,316 para los compuestos triplex, en las patentes E.U.A. Nos. 5,811 ,537; 5,801 ,154, y 5,734,039 para los compuestos antisentido, y las patentes E.U.A. Nos. 5,817,635; 5,811 ,300; 5,773,260; 5,766,942; 5,747,335, y 5,646,020 para ribozimas (cuya descripción está incorporada aquí como referencia en su totalidad). La longitud del ácido nucleico heterólogo no es crítica siempre y cuando se logre la función deseada, pero el ácido nucleico heterólogo es típicamente de 5, 8, 10 o 20 ácidos nucleicos de longitud hasta más de 20, 30, 40 o 50 ácidos nucleicos de longitud, mayor a la longitud igual de la longitud total del gen EMAP II. Una vez preparado, el vector recombinante puede ser reproducido mediante (a) la propagación del vector en un cultivo celular, el cultivo celular comprende células que permiten el crecimiento y reproducción del vector mismo; y entonces (b) colectar el vector recombinante del cultivo celular, todo de acuerdo con técnicas conocidas. Los vectores virales recolectados del cultivo se pueden separar del medio de cultivo de acuerdo con técnicas conocidas, y combinarse con un portador farmacéutico adecuado para su administración al individuo. Dichos portadores farmacéuticos incluyen, pero no están limitados a, agua estéril libre de pirógenos o solución salina libre de pirógenos. Si se desea, los vectores pueden ser empaquetados en liposomas para su administración de acuerdo con técnicas conocidas.

Cualquier vía de administración adecuada puede usarse para portar la presente invención, dependiendo de la condición particular a ser tratada. Las rutas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, inyección intravenosa, ¡ntraarterial, intratecal, intraperitoneal, intramuscular, e intralesional. La inyección intralesional se prefiere actualmente. La dosis del vector recombinante administrado dependerá de factores tales como el trastorno particular, el vector particular elegido, la formulación del vector, la condición del paciente, la vía de administración, etc., y puede ser optimizado para situaciones específicas. En general, la dosis es de alrededor de 107, 108, o 109 hasta 1011, 1012, o 1013 unidades formadoras de placas (pfu). Además de su uso farmacéutico o veterinario, los vectores recombinantes de la presente invención (algunas veces referidos aquí como "agentes activos") son útiles in vitro para distinguir células en cultivo basándose en su respuesta a los agentes activos, para inducir apoptosis, etc. Dichas técnicas son útiles tanto para llevar a cabo procedimientos de cultivo celular como para propósitos de selección de fármacos. Los métodos in vitro de selección de compuestos por su eficacia en el acarreamiento de los métodos de tratamiento descritos anteriormente también son descritos aquí. En general, en una modalidad, dichos métodos comprenden el determinar si el compuesto in vivo inhibe la expresión de EMAP II (preferiblemente el gen de mamífero, y más preferiblemente el gen de humano). La inhibición de la expresión de EMAP II indica que el compuesto es útil en los métodos de tratamiento descritos anteriormente. Numerosos métodos para dicha selección son adecuados. Los métodos pueden ser llevados a cabo en una célula o células, o pueden ser llevados a cabo en preparaciones esencialmente libres de células. El método puede ser llevado a cabo mediante la selección de compuestos que específicamente desorganicen ya sea la transcripción o la traducción del EMAP II. El compuesto a ser seleccionado puede ser un miembro de una librería de compuestos (el término "compuesto" como se usó a este respecto se refiere a compuestos orgánicos pequeños y a otros agentes terapéuticos tales como vectores virales). El método puede ser llevado a cabo como un ensayo único, o puede ser ¡mplementado en la forma de una selección de alto rendimiento de acuerdo con una variedad de técnicas conocidas. En otra modalidad, el método de selección de compuestos comprende la determinación in vitro en donde dicho compuesto específicamente se une a EMAP II (incluyendo a sus fragmentos) (preferiblemente productos génicos de mamíferos; más preferiblemente productos génicos humanos). El paso determinante puede ser llevado a cabo mediante la selección para la unión de un compuesto de prueba o sonda molecular al producto génico EMAP II de longitud total, o a un fragmento peptídico del mismo (v.gr. un fragmento de 5 ó 10 aminoácidos de longitud hasta la longitud total de EMAP II). La unión del compuesto EMAP II indica que el compuesto es útil en los métodos de tratamiento descritos aquí. Dichas técnicas pueden ser llevadas a cabo mediante contactar un compuesto sonda al EMAP II o a fragmentos del mismo con cualquiera de la variedad de las técnicas químicas de combinación conocidas (incluyendo pero no limitado a las técnicas de grupo fusionado, las técnicas basadas en la fragmentación y las técnicas basadas en la sujeción). Cualquier soporte sólido adecuado puede ser usado para inmovilizar EMAP II o fragmentos del mismo para encontrar patrones de unión específica a ellos (o inmovilizar los miembros de la librería en contra del cual EMAP II o los fragmentos del mismo serán contactados para encontrar patrones de unión específicos al mismo), y numerosos soportes sólidos diferentes son bien conocidos por los expertos. Los ejemplos para los materiales adecuados a partir de los cuales el soporte sólido puede ser formado incluyen celulosa, vidrio poroso, gel de sílice, poliestireno, poliestireno particularmente entrecruzado con divinilbenceno, copolímeros implantados tales como el polietilenglicol/poliestireno, poliacrilamida, látex, dimetilacrilamida, particularmente entrecruzada con N,N'bis-acriloliletilendiamina y que comprende al N-t-butoxicarbonil-beta-alanil-N'-acrilolilhexametilendiamina, compuestos tales como el vidrio cubierto con polímeros hidrofóbicos tales como el poliestireno entrecruzado o un polímero etilenfluorado, en el cual es implantado un poliestireno lineal, y los similares. Así el término "soporte sólido" incluye a materiales convencionalmente considerados para ser soportes semisólidos. La revisiones generales de los soportes útiles que incluyen a un reactivo funcional unido covalentemente se puede encontrar en Atherton et al, Prospectives in Peptide Chemistry, Karger, 101-117 (1981 ); Amamath et al, Chem. Rev. 77: 183 (1977); y Fridkin, The Peptides, Vol. 2, Chapter 3, Academic Press, Inc., pp 333-363 (1979). El soporte sólido puede tomar cualquier forma deseable, tal como un glóbulo o micropartícula, un tubo, una placa, un pozo de placa para microtitulación, un cubreobjetos de cristal para microscopio, etc. La presente invención se puede usar con sondas moleculares, o librerías (en donde diferentes grupos de sondas moleculares son empleados), de cualquier tipo. En general, dichas sonda moleculares son compuestos orgánicos, que incluyen pero no se limitan a los que pueden ser usados para llevar a cabo la presente, oligómeros, no oligómeros, o combinaciones de los mismos. Los no oligómeros incluyen una amplia variedad de moléculas orgánicas, tales como los heterocíclicos, aromáticos, alicíclicos, alifáticos y combinaciones de los mismos, que comprenden esteroides, antibióticos, enzimas inhibidoras, ligandos, hormonas, fármacos, alcaloides, opioides, benzodiazepinas, terpenos, profirinas, toxinas, catalizadores, así como combinaciones de los mismos. Los oligómeros incluyen péptidos (esto es, oligopéptidos) y proteínas, oligonucleótidos (el término oligonucleótido también se refiere simplemente como "nucleótído", aquí), tales como los ADN y ARN, oligosacáridos, polilípidos, poliésteres, poliamidas, poliuretanos, poliureas, poliéteres, poli(derivados de fósforo) tales como los fosfato, fosfonatos, fosforamidas, fosfonamidas, fosfitos, fosfinamidas, etc. poli(derivados del azufre) tales como las sulfonas, sulfanatos, sulfitos, sulfanamidas, sulfenamidas, etc., en donde los derivados del fósforo y del azufre indican heteroátomos que para la mayoría estarán unidos a C, H, N, O ó S y combinaciones de los mismos. Numerosos métodos de síntesis o aplicación tales como las sondas moleculares sobre soportes sólidos (en donde la sonda molecular puede estar unida al soporte sólido ya sea covalente o no covalentemente) son conocidas, y dichas sondas moleculares pueden ser hechas de acuerdo con los procedimientos conocidos por aquellos expertos en el área. Ver, v.gr., patente de E.U.A. No. 5,565,324 de Still et al, patente de E.U.A. No. 5,284,514 de Ellman et al., patente de E.U.A. No. 5,445,934, de Fodor et al. (la exposición de todas la patentes de Estados Unidos citadas aquí serán incorporadas como referencia en su totalidad). Los compuestos de prueba usados para llevar a cabo la presente invención pueden ser de cualquier tipo, incluyendo tanto oligómeros o no oligómeros de los tipos descritos anteriormente en conexión con las sondas moleculares antes mencionadas. De nuevo, dichos compuestos de prueba son conocidos y pueden ser preparados de acuerdo con técnicas conocidas. En donde es deseable que las múltiples sondas moleculares diferentes sean probadas, un substrato de selección útil para la selección de alto rendimiento de las interacciones moleculares, tales como en las técnicas químicas de combinación basadas en la fragmentación y en la sujeción, puede ser preparado de acuerdo con las técnicas conocidas. Todos pueden ser preparados de acuerdo con técnicas conocidas. Ver, v.gr. E.U.A. patente No. 5,445,934 de Fodor et al, E.U.A. patente No. 5,288,514 de Ellman, y E.U.A. patente No. 5,624,711 de Sundberg et al. Alternativamente, la selección de librerías de sondas moleculares puede ser llevada a cabo con mezclas de soporte sólidos así como con técnicas de química combinatoria de agregación. Dichas mezclas pueden ser preparadas de acuerdo con procedimientos conocidos en el campo, y los componentes de marcado pueden ser añadidos a los soportes sólidos discretos de acuerdo con procedimientos conocidos en el área. Ver, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,565,324 de Still et al. La presente invención se explica en mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 El EMAP II inhibe la neovascularización pulmonar, la morfogénesis epitelial y las interacciones epitelio-mesénquima La neovascularización es crucial para el desarrollo del pulmón y es mediada a través de una variedad de factores angiogénicos y antiangiogénicos. Aquí, se muestra que el exceso de polipéptido activador de los monocitos endoteliales (EMAP) II, una proteína antiangiogénica, no solamente inhibe la neovascularización del pulmón fetal, sino que también altera significativamente la morgénesis epitelial del pulmón. En un modelo de explantes murino para la neovascularización y morfogénesis pulmonar, los pulmones embrionarios transplantados bajo la piel de ratones inmunocomprometidos que recibieron intraperitonealmente EMAP II, tuvieron una reducción del 56% en la densidad de vasos sanguíneos (p<0.0001 ) comparado con el control. Los transplantes de pulmón tratados con EMAP II exhibieron una marcada alteración en la morfogénesis del pulmón, incluyendo la pérdida de la formación de células alveolares tipo II. Por el contrario, los implantes pulmonares en animales que recibieron un anticuerpo que bloqueaba al EMAP II tuvieron un incremento en la densidad de vasos sanguíneos de 50% (p<0.0001 ) y las células epiteliales más distales expresaron la proteína C tensioactiva. Los cocultivos de células epiteliales y mesenquimáticas embrionarias mostraron que la expresión de EMAP II está localizada a la región de los quistes periepiteliales. La exposición de estos cocultivos a un exceso de EMAP II inhibió la formación de quistes epiteliales en un 71% (p<0.0001); mientras que, a la inversa, el anticuerpo para EMAP II incrementó la formación de quistes en un 54% (p<0.0001 ). Hubo una inducción dependiente de tiempo de la apoptosis por EMAP II limitada a las células epiteliales en el sistema de cocultivo que fue confirmada mediante la inducción de apoptosis en las células epiteliales del modelo de explante. Estos estudios demuestran que el EMAP II modula el crecimiento de los vasos sanguíneos en el pulmón en desarrollo, la inhibición del crecimiento de los vasos sanguíneos, resulta en la morfogénesis alterada del pulmón, y afecta las interacciones epitelio-mesenquima en donde, en ausencia de crecimiento vascular se induce apoptosis. Por lo tanto, el EMAP II modula negativamente la neovascularización del pulmón y lleva al arresto de la morfogénesis epitelial pulmonar y a la apoptósis. 1. Procedimiento experimental Síntesis de EMAP II (r ) recombinante de E. Coli y generación de un anticuerpo peptídico. El ADNc de EMAP II de humano maduro fue clonado de los productos de RT-PCR de ARN total de células U937 basándose en iniciadores obtenidos del banco génico (acceso #10119) dentro de un vector TA (Invitrogen). La confirmación de las clonas fue provista por el análisis de secuencia, después del cual el ADNc fue insertado dentro del plásmido PET28a, que contenía 6X marcado con histidina. E.coli. (DE3) llevó a cabo transformación con el plásmido EMAP ll/PET28a y fue inducida con 1-4 mM IPTG. Después de 3-4 horas de inducción, las células fueron concentradas, usadas y las proteínas EMAP II fueron purificadas a través del uso de una columna de níquel conforme al protocolo (Qiagen) con todos los procedimientos llevados a cabo a 4°C. Brevemente, las células concentradas fueron usadas con 50 mM NaH2PO4 pH 8.0, 300 mM NaCI y 10 mM de imidazol en presencia de lisozima 1 mg/ml. Posteriormente a la sonicación el residuo celular fue removido mediante centrifugación antes de cargar sobre la suspensión de Ni-NTA. Posterior a los lavados de la columna, el rEMAP II se eluyó con 8M de urea, 0.1 M NaH2PO4, y 0.01 M Tris Cl pH 5.9. El rEMAP II purificado se dializó a 4°C en contra de PBS tres veces antes de formarse en alícuotas y congelarse a -80°C. Cuando una alícuota de rEMAP II fue descongelada, esta fue usada inmediatamente para los experimentos (no fue volvió a congelar ni a usar para otros estudios posteriores). Esto es esencial para mantener la actividad de rEMAP II. Una secuencia peptídica de trece residuos de aminoácidos localizada dentro de una región homologa de las formas humanas y murinas del EMAP II maduro se usaron para generar un anticuerpo. Este péptido fue sintetizado y el anticuerpo se produjo mediante Zymed Laboratories Inc. conforme al protocolo y se usó para inmunohistoquímica y Western blot. El anticuerpo es específico para identificar EMAP II mediante la producción de una sola banda en Western blot que fue bloqueada después de ser incubada con un exceso de EMAP II (datos no mostrados). Aislamiento de células epiteliales y mesenquimatosas para cocultivo. Los cultivos organotípicos de pulmón murino fueron llevados a cabo siguiendo el protocolo de Schuger et al. [Schuger, Development 110, 1091-9 (1990); Schuger, J. Cell. b/o/.139, 553-62 (1997); Schuger, Int. J. Dev.BiolA2, 217-220 (1998)]. En resumen, embriones de una edad gestacional de 15d fueron disectados a partir de ratones Swiss-Webster (Simonsen, Morgan Hill CA), los pulmones fueron aislados, se llevó a cabo digestión en PBS que contenía 0.3% de tripsina y 0.1% EDTA durante 10 minutos a 37°C antes de ser filtrados a través de una malla de 100 µm de poro. Las células epíteliales-mesenquimatosas mezcladas fueron resuspendidas en medio mínimo esencial (MEM:Gibco-BRL) con aminoácidos no esenciales y centrifugado a una concentración de 2-2.5X106 células/ml en cámaras de cultivo de 8 pozos. Los experimentos se llevaron a cabo en la presencia del vehículo, rEMAP II maduro 0.8-3.2 µg/ml), el anticuerpo peptídico EMAP II (3-6 µg/ml), e IgG de conejo (control). La formación de quistes epiteliales fue evaluada al contar el número de quistes epiteliales por campo de alta resolución (HPF), los inventores de la presente analizaron 10 campos por condición y los promediaron.

Modelo de transplante de explantes de pulmón. Ratones hembras Swiss Webster preñadas del día gestacional 12 (basándose en la aparición del tapón vaginal=día 0) fueron obtenidas, alojadas, y manejadas de acuerdo al protocolo aprobado por el comité de cuidado de animales en CHLARI (Childrens Hospital of Los Angeles Research Institute). Al día 14.5 la madres fueron sacrificadas y los embriones removidos. Los pulmones y el corazón fueron retirados como un bloque de microdisección y colocados en PBS enfriado con hielo. El corazón entonces fue removido y un pulmón fue colocado en la parte superior de un disco de filtro Millipore 0.80 µM (Millipore) e implantado dentro de una cámara del pliegue cutáneo dorsal de un ratón desnudo usando técnicas estériles. La piel fue cerrada con grapas para piel. El otro pulmón fue usado para análisis histológico y se utilizó como comparación del pulmón implantado. Los ratones desnudos fueron entonces inyectados ¡ntraperitonealmente por vía intraperitoneal diariamente ya sea con el vehículo (regulador de pH de fosfato salino-PBS y albúmina), EMAP II; (1 µg/día), de conejo IgG o anticuerpo EMAP II (25 ó 50 µg/cada tres días).

RT-PCR de transplantes de pulmón Después de los 14 días los explantes de pulmón fueron removidos de los ratones que habían sido tratados con rEMAP II, anticuerpo a EMAP II, o el vehículo, separados de la piel del ratón portador, el ARN total fue extraído mediante RNA STAT-60 (Tel-Test "B", Inc., Friendswood, TX) y el ARN de los pulmones transplantados fueron transcritos inversamente mediante superscript II ARNasa H - transcriptasa reversa (GIBCO-BRL) usando 3 mcg de ARN total como molde, 4 µl de regulador de pH 5 X RT, 2 µl de 0.1 M DTT, 0.5 µg del iniciador de 3' específico para genes blanco en un volumen de reacción total de 18 µl. La mezcla de reacción fue incubada a 70°C durante 10 minutos y seguida por la incubación en hielo durante 2 minutos. Se añadió 1 µl de 10 mM dNTP, 1 µl de superscript II ARNasa H -transcriptasa reversa. La mezcla fue incubada a 49°C durante 1 hora y 30 minutos seguido de 70°C durante 10 minutos. La primera hebra de ADNc así sintetizada fue usada directamente para la amplificación en PCR del ADNc blanco. Los iniciadores del ADNc blanco fueron: 1) iniciador 5'PECAM-1 de murino-5' GTC ATG GCC ATG GTC GAG TA 3' (SEQ ID NO: 1 ) y el iniciador 3'-5' CTC CTC GGC ATC TTG CTG AA 3" (SEQ ID NO:2), 2) iniciador 5' de tie-2 murino-5' TTG AAG TGA CGA ATG AGA T 3' (SEQ ID NO:3) y el iniciador 3'-5'ATT TAG AGC TGT CTG GCT T 3' (SEQ ID NO:4), 3) el iniciador 5' SP-C -5'-CAT ACT GAG ATG GTC CTT GAG-3" (SEQ ID NO: 5), y el iniciador 3'- 5'-TCT GGA GCC ATC TTC ATG ATG-3'(SEQ ID NO:6) y 4) el iniciador 5' T1 -a de murino -5' GAA CAT GAG AGT ACG ACC ACT GTC AAA 3' (SEQ ID NO: 7) y el iniciador 3'-5' TTA GGG CGA GAA CCT TCC AGA AAT CTT 3' (SEQ ID NO:8). La ß actina, usada como el gen de mantenimiento, fue utilizada en todas las muestra usando los iniciadores: inciador 5' -5' GTA TGG AAT CCT GTG GCA TCC 3' (SEQ ID NO:9) y el ¡nciador 3'-5' TAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC 3' (SEQ ID NO: 10). Además, los controles se llevaron a cabo en todas las secuencias de ADNc evaluados usando pares de iniciadores sin la presencia de la primera hebra de ADNc como molde. Los segmentos de ADNc blanco se amplificaron usando un décimo del molde del ADNc de primera hebra anteriormente citado, 10 µl de regulador de pH 10 X, 0.5 µl de 10 mM dNTP, 300 ng de cada uno de los iniciadores específicos 5' y 3', y una unidad de polímerasa taq (Stratagene) en 50 µl de reacción. El programa de PCR fue 94°C 1 minuto., 62°C 30 seg., y 72°C 30 seg, durante 30 ciclos. Cantidades ¡guales de todos los fragmentos de amplificación de ADNc fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa, fotografiados, y analizados.

Hibridación in situ y construcción de las sondas de ADNc. El ARN total fue extraído de tejido pulmonar de ratones de 15 días de gestación mediante ARN STAT-60 (Tel-Test "B", Inc., Friendswood, TX). El ARN (3 µg) fue incubado con iniciador oligo(dT) durante 10 minutos a 70°C. La síntesis de la primera hebra de ADNc se llevó a cabo de acuerdo con instrucciones del fabricante (GIBCO BRL, Grand Island, NY). Después de la síntesis de la primera hebra, el ADNc fue generado mediante amplificación con PCR con 10 pmol de iniciadores específicos por 30 ciclos de amplificación (94°C V, 62°C 1 ', 72°C 1 '). Los iniciadores usados fueron los siguientes: SP-C, sentido, 5'-CAT ACT GAG ATG GTC CTT GAG-3') (SEQ ID NO: 11 ), y antisentido, 5'-TCT GGA GCC ATC TTC ATG ATG-3'(SEQ ID NO: 12). La sonda de ARN para EMAP II fue de 456 pb de tamaño y fue obtenida a partir de la región que tiene homología mínima con otras proteínas conocidas. El producto de PCR SP-C generado fue subclonado dentro del vector TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) para la transcripción in vitro de ARN.

Marcado de la sonda de ARN digoxigenina mediante transcripción in vitro. El ADN de la subclona SP-C en buena orientación para la transcripción in vitro del ARN antisentido medíante ARN polimerasa T7, fue linearizado mediante digestión con Hind lll y usado como molde para el marcado de la sonda. La sonda de ARN antisentido marcado con digoxigenina- UTP mediante transcripción in vitro con ARN polimerasa T7 fue llevada a cabo conforme a las instrucciones del fabricante (DIG RNA labeling kit, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN).

Hibridación in situ del ARN (RISH) usando sondas de ARNc marcadas-DIG El pulmón control de embriones murinos de 14 e.g. y los transplantes murinos, 14 e.g. + 3.5, 14 e.g. + 7, 14 e.g + 10.5, y 14 e.g. + 14 fueron obtenidos mediante hibridación in situ. Las sondas de ARN Dig antisentido y sentido (control) se hicieron usando el equipo de marcado de ARN Dig (SP6/T7) de Boehringer Mannheim, (Indianapolis, IN). El RISH fue llevado a cabo sobre secciones de material embebido en parafina de 5-mm de acuerdo con el manual de aplicación de hibridizaciones in situ no radioactivas (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Usando equipo y soluciones tratadas con DEPC, los especímenes embebidos en parafina fueron seccionados, rehidratados e incubados en una solución de proteinasa K 5 µg/ml precalentada. Las secciones fueron sumergidas en 4% PFA, tratadas con 0.25% de anhídrido acético y deshidratadas. Las secciones fueron expuestas a una solución de hibridación que contenía 50% formamida, 10% dextrán sulfato, 1 mg/ml ARNt, 1 X solución de Denhardt, 4 X SSC, 50 mM Tris y 5 mM EDTA que contenía 150-300 ng/ml de sonda de ARN marcada-dig a 50°C durante toda la noche. Las secciones fueron lavadas a 55°C en 2 X SSC/50% formamida, 1 X SSC y 0.1 SSC durante 30 minutos antes de ser incubadas con ARNasa A (20 µg/ml) durante 30 minutos a 37°C. Después de ser enjuagadas con 2X SSC la detección de ácidos nucleicos Dig se llevó a cabo usando el equipo Genius 3 de Boehringer Mannheim. Brevemente, los portaobjetos fueron incubados en 0.1 M de ácido maleico/0.15M NaCI pH 7.5 durante 5 minutos después del cual fueron bloqueados con 1 % de agente bloqueador. Siguiendo al bloqueo, los portaobjetos fueron incubados con anti-Dig-AP conjugado a 4°C durante toda la noche, enjuagados, e incubados con una solución diluida de NBT/BCIP durante 3 horas a temperatura ambiente. Los portaobjetos fueron entonces contrateñidos con 0.02% de solución verde rápido durante dos minutos, enjuagados en agua, secados al aire y montados. La hibridación con sondas sentido o sin sondas fue llevada a cabo como control negativo y nunca mostraron señalización. Todas las secciones fueron examinadas y fotografiadas bajo microscopía de luz.

Análisis histológico e inmunohistoguímico de los trasplantes de pulmón murinos Después de 14 días, los explantes de pulmón fueron removidos de los ratones que dueron tratados con rEMAP II, anticuerpo de bloqueo a EMAP II, o el vehículo, separados de la piel de ratón portador, fijados en 4% de paraformaldehído, deshidratados, y embebidos en parafina (durante todo el procedimiento, se trabajó con agua-DEPC y se tomaron precauciones en contra de ARNasas). El tejido fijado fue seccionado en intervalos de 5 micrones. Los transplantes de pulmón fueron teñidos con H & E para su análisis estructural. Para inmunolocalización de antígenos PECAM-1 (Pharmigen, San Diego, CA), se empleó un anticuerpo PECAM-1 de rata anti-murino (4 µg/ml). Los tejidos fueron deparafinizados y se enfriaron con peróxido. Usando un equipo de Zymed (San Francisco, CA), después del enfriamiento, las secciones fueron expuestas al anticuerpo primario durante toda la noche a 4°C. Entonces las secciones fueron incubadas con un anticuerpo secundario biotinilado de acuerdo al protocolo de los fabricantes. Una incubación breve con un sistema conjugado estreptavidina-HRP (Zymed) fue llevado a cabo mediante le uso de substrato cromógeno aminoetilcarbazol. La coloración de ácido peryódico de Schiff (PAS) se llevó a cabo usando un equipo de Sigma (St. Louis, MO) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Análisis TÚNEL de cocultivos fetales de células epiteliales-mesinquimatosas La inducción espacial de apoptosis se analizó en los cocultivos de células epiteliales-mesenquimatosas o en explantes de pulmón usando el equipo de detección de muerte in situ de Boehringer Mannheim. En resumen, las células cocultivadas fueron expuestas al vehículo, EMAP II (3.2 µG/ML), anticuerpo EMAP II (6 µg/ml) o IgG de conejo. Las células fueron evaluadas en los días uno al tres para su apoptosis. Las células fueron fijadas en 4% paraformaldehído, permeabilizadas con 0.1% Tritón-X y expuestas a la reacción TÚNEL (que contenía a la deoxinucleotiltransferasa terminal y una mezcla nucleotídica en un amortiguador de reacción). Después del cual, las células fueron expuestas a un anticuerpo fluorescente, contrateñidas con yoduro de propidio (0.05 µg/ml), montadas con PBS/glicerol, y observadas bajo un microscopio fluorescente (Olympus). Los explantes de pulmón fueron fijados en 4% paraformaldehído, deshidratados y embebidos en parafina.

- ---- —*• Secciones de 5 mieras fueron cortadas, rehidratadas y expuestas a la reacción TÚNEL. Las células apoptóticas fueron reveladas usando fosfatasa alcalina y observadas bajo microscopía de luz.

Estadísticas: El análisis estadístico fue llevado a cabo usando una prueba-t de student en el programa de computadora Statview.

II RESULTADOS Purificación del EMAP II recombinante. Con el objeto de determinar la función del EMAP II en el desarrollo del pulmón, fue importante desarrollar un sistema de producción fácil y reproducible de EMAP II recombinante. Nosotros usamos un sistema PET28a 6X marcado con histidina para aislar rápido y eficientemente rEMAP II maduro bajo condiciones nativas. El EMAp II recombinante (r) fue expresado en E. coli (mostrado en el gel de azul Coomassie, primera columna Fig. 1 ), inducido con 1-4mM IPTG y las E. coli fueron centrifugadas después de 3-4 horas de inducción (2a. columna Fig. 1) La forma madura recombinante purificada de EMAP II (columna 3, Fig. 1) tuvo una MR de 23kDa (con el marcado con histidina 6X) en ambos SDS-PAGE reducido y no reducido. La actividad de rEMAP II, medida por la inducción de TNF-a y migración de monocitos [Kao, 1994 #44], se encontró que era cercanamente análoga a aquélla previamente observada con el derivado de EMAP II meth A. Los niveles de LPS fueron de < 15 pg/ml conforme a su medida con el equipo LAL (Biowhittaker QCL-1000). El EMAP II tratado con calor fue inactivo en estos ensayos. El anticuerpo péptidico generado en un conejo, es específico para EMAP II, identificado mediante la producción de una sola banda en análisis de Western que es bloqueado después de ser incubado con un exceso de EMAP II (datos no mostrados).

Inhibición de EMAP II en el desarrollo vascular del pulmón fetal Para definir mejor el papel del EMAP II en la neovascularización pulmonar embrionaria, los pulmones murinos obtenidos en la etapa gestacional de 14.5 días, fueron implantados subcutáneamente dentro de ratones desnudos. Los ratones entonces recibieron ya sea el vehículo o el rEMAP II (1 µg/día) IP cada día durante 14 días. Un grupo separado de ratones fueron tratados ya sea con el anticuerpo bloqueador de EMAP II (25 o 50 µg) o IgG de conejo cada 3 días durante 14 días. Los transplantes de pulmón fueron entonces extraídos y evaluados para su desarrollo estructural y vascular usando PECAM-1 y tinción de hematoxilina-eosina respectivamente. En comparación con los explantes de pulmón implantados en los ratones tratados solamente con el vehículo, los implantes en los ratones que recibieron la proteína EMAP II antiangiogénica exhibieron una reducción notable del 56% en la formación de vasos sanguíneos. Las diferencias entre la formación de vasos sanguíneos (evaluadas mediante el conteo del número de vasos sanguíneos identificados por campo de alto poder (HPF) con anticuerpo PECAM-1 ) en los animales control (Fig. 2A) y los tratados con EMAP II (Fig. 2B, D) fueron estadísticamente significativos mediante la prueba de t de Student (p<0.0001 ). Por el contrario, los animales que recibieron los anticuerpos bloqueadores de EMAP II tuvieron un incremento significativo dosis-dependiente del 50% (p< 0.0001 ) en el conteo de vasos sanguíneos por HPF (Fig. 2C, E) (n=10/grupo, llevado a cabo en 3 ocasiones separadas). Consistente con estos hallazgos histológicos, el ARNm cosechado de explante de pulmón de animales tratados con rEMAP II demuestra una reducción en PECAM-1 y Tie-2 mediante RT-PCR en comparación con el control. Los resultados inversos, un incremento en los productos de PECAM-1 y Tie-2 PCR fueron obtenidos de los explantes de animales tratados con el bloqueador de anticuerpo EMAP II (Fig. 2F). Los controles negativos para la amplificación mediante PCR de los transcritos de PECAM-1 y Tie-2, demostraron que no había producto especifico de RT, en cada PCR (datos no mostrados).

El EMAP II inhibe la maduración epitelial Se postuló que la vascularización pulmonar puede influir en la diferenciación de las células epiteliales. Después de la administración de rEMAP II, el análisis histológico de los explantes de pulmón en estos ratones mostró una marcada inhibición en la maduración estructural (Fig. 3D-F) en comparación con los animales tratados con vehículo (Fig. 3A-C). Esto se demostó por la ausencia de bronquios bien definidos con epitelio característico (Fig. 3A), o de vías aéreas dístales con epitelio atenuado consistente con el epitelio, alveolar, como se comparó con aquellos explantes en donde el ratón recibió sólo el vehículo (Fig. 3B,C). Además, los explantes de pulmón en los ratones tratados con EMAP II tuvieron células epiteliales alveolares que parecían displásicas (Fig. 3E,F) y una estasis aparente en la formación del ducto respiratorio (Fig. 3D, flechas) en comparación con aquellos transplantes en los cuales el ratón recibió sólo el vehículo (3A). Para discernir si la progresión morfológica actualmente ocurrió, nosotros evaluamos los explantes para marcadores de morfogénesis pulmonar distal. Los explantes de pulmón en los ratones que recibieron el vehículo solamente llevaron a cabo diferenciación celular alveolar del tipo II evidente por la expresión de SP-C (Fig. 4A,B). En contraste, los explantes de pulmón en los animales que recibieron EMAP II tuvieron una marcada reducción en la expresión de SP-C a lo largo del transplante de pulmón, incluso en las vías aéreas más periféricas (Fig. 4C,D). Para mayor apoyo de nuestros hallazgos, los animales que recibieron el anticuerpo bloqueador EMAP II tuvieron un incremento notable en el número de células tipo II, con esencialmente cada célula epitelial distal expresando SP-C (Fig. 4E,F). Por lo tanto, parece que el exceso de EMAP II lleva a una inhibición profunda de la morfogénesis y diferenciación del epitelio pulmonar periférico. Consistentemente con los hallazgos de hibridación el ARNm cosechado de los explantes de pulmón de animales tratados con rEMAP II demostraron una reducción en SP-C mediante RT-PCR en comparación con los controles. En contraste, los animales tratados con el anticuerpo bloqueador EMAP II exhibieron un incremento en el amplicón de SP-C que confirma los resultados in situ (Figura 4G). Interesantemente, el T1-a marcador de células epiteliales alveolares tipo I, fue ligeramente elevado en el tratamiento de explantes con rEMAP II, en donde una reducción marcada en el T1-a se encontró en los pulmones tratados con anticuerpo bloqueador EMAP II, el inverso del alto nivel de expresión de SP-C, un marcador de células tipo II (Figura 4C). Los controles negativos para la amplificación de PCR de los transcritos a SP-C y T1-a, sin RT, demuestra que no existe un producto de PCR específico en cada rxn (datos no mostrados). Nosotros también evaluamos la producción de glucógeno en los explantes de pulmón. Los explantes obtenidos a partir de ratones tratados con rEMAP II demostraron un exceso en la producción de glucógeno (denotado por el color magenta) (Figura 5D-F) en comparación con el vehículo solo (Figura 5A-C), apoyando el concepto de que el EMAP II inhibió la diferenciación epitelial.

Desarreglo de la ¡nterfase epitelio-mesénquima por el EMAP II Para examinar el papel de la proteína antiangiogénica EMAP II en la morfogénesis del pulmón, la localización del EMAP II en los cocultívos epitelio-mesénquima fue definida. La evaluación de los cocultivos de pulmón epitelio-mesénquima después de 3 días de incubación revelaron que la expresión de EMAP II fue predominantemente en la región de los quistes periepiteliales ya sea mediante hibridación in situ (Figura 6A) así como mediante inmunohistoquímíca (Figura 6B) consistente con aquellos resultados vistos en el tejido de pulmón fetal (Schwarz, Am J. Physiol. 276, L365-75 (1999)). De manera interesante, aunque el EMAP II es expresado en las células epiteliales y mesénquimatosas, su mayor expresión se observa en las uniones epitelio-mesénquima como se puede observar por las flechas en la figura 6A. Para determinar el efecto del EMAP II sobre la formación de quistes epiteliales, los cocultivos epitelio-mesénquima fueron expuestos a concentraciones increméntales de rEMAP II, anticuerpo bloqueador de EMAP II, o vehículo (PBS o IgG de conejo respectivamente). La formación de quistes epitelilales fue analizada como el número total de quistes formados por campo de alto poder (HPF). Hubo una inhibición dosis-dependiente del 71 % (p<0.0001 ) de la formación de quistes epiteliales y una alteración en la estructura en los cocultivos expuestos a EMAP II (Figura 7B, D) en comparación con el control (Figura 7A las flechas indican la formación de quistes epiteliales normales con las células epiteliales siendo rodeadas por células aplanadas positivas a la laminina). Contrariamente, en presencia del anticuerpo bloqueador de EMAP II (Figura 7C, E) hubo un incremento de 54% (p<0.01) en la formación de quistes que también fue dosis-dependiente. Debido a que nosotros recientemente los inventores de la presente observaron que el EMAP II induce la apoptosis en células endoteliales en crecimiento y división [Schwarz, Journal, of Experimental, Medicine 290 (1999)], emplearon el ensayo TÚNEL para determinar si la inducción de apoptosis debida al EMAP II fue responsable del decremento en el número de quistes epiteliales. Nosotros encontramos una inducción tiempo-dependiente de apoptosis, empezando en la región de quistes periféricos y progresando para incluir los quistes epiteliales completos en los cocultivos tratados con rEMAP II en comparación con el control (datos no mostrados). La apoptosis fue también marcadamente disminuida en aquellos cultivos expuestos al anticuerpo bloqueador de EMPA II en comparación con el control (datos no observados). Consistentemente con nuestros hallazgos in vitro, los explantes de pulmón en los animales tratados con EMAP II tuvieron un incremento marcado en apoptosis que se localizó en las células epiteliales (datos no mostrados). Lo anterior es ilustrativo de la presente invención, y no ha sido considerado como limitante de lo mismo. La invención está definida por las siguientes reivindicaciones, con equivalentes de las reivindicaciones a ser incluidos aquí.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Schwarz, Margaret A. Zhang, Fangrong Gebb, Sarah A. <120> Métodos para facilitar el crecimiento vascular <130> EMAP II y Vascularización <140> <141 > <150> 60/108,435 >151 > 1998-11-13 <16O> 12 <170> Patente En Ver 2.0 <210> 1 <211 > 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 1 gtcatggcca tggtcgagta <210> 2 <211 > 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 2 ctcctcggca tcttgctgaa <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 2 ctcctcggca tcttgctgaa <210>3 <211> 19 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 3 ttgaagtgac gaatgagat <210>4 <211> 19 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 4 atttagagct gtctggctt <210>5 <211>21 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 5 catactgaga tggtccttga g <210>6 <211> 21 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 5 catactgaga tggtccttga g <210> 6 <211 > 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 6 10 tctggagcca tcttcatgat g <210> 7 <211 > 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador 15 <400> 7 gaacatgaga gtacgaccac tgtcaaa <210> 8 * <211 > 27 ' <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador 20 <213> Secuencia Artificial <400> 8 ttagggcgag aaccttccag aaatctt <210>9 <211> 21 <212>ADN <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 9 gtatggaatc ctgtggcatc c <210> 10 <211> 21 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 10 tacgcagctc agtaacagtc c <210> 11 <211> 21 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 11 catactgaga tggtccttga g <210> 12 <211> 21 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador <400> 12 tctggagcca tcttcatgat g

Claims (7)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un compuesto activo seleccionado del grupo que consiste de compuestos que específicamente se unen a EMAP II, compuestos que inhiben la actividad de EMAP II, y receptores antagonistas a EMAP II para la fanricación de un medicamento para facilitar el crecimiento vascular en un sujeto mediante la inhibición de la actividad de EMAP II en dicho sujeto.

2.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho sujeto está en riesgo de lesión de reperfusión isquémica a los pulmones, en donde dicha inhibición se lleva a cabo para inhibir la lesión de reperfusión isquémica en dicho individuo.

3.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho individuo es un individuo recién nacido, y dicha inhibición se lleva a cabo para inhibir la displasia bronquipulmonar en dicho individuo.

4.- Un método para seleccionar compuestos útiles para facilitar el crecimiento vascular en un individuo que lo necesite, que consiste en: poner en contacto un compuesto de prueba a una sonda molecular, dicha sonda molecular siendo seleccionada del grupo que consiste del EMAP II y sus fragmentos; y después detectar la presencia o ausencia de unión de dicho compuesto de prueba a la sonda molecular seleccionada, la presencia de la unión indicando que dicho compuesto puede ser útil para facilitar el crecimiento vascular en un individuo.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho compuesto de prueba es un miembro de 5 una librería combinatorial.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho compuesto es una proteína o un péptido. 1.- Un método para seleccionar compuestos útiles para facilitar el crecimiento vascular en un sujeto, que consiste en: poner en contacto un ío compuesto de prueba a una sonda molecular, dicha sonda molecular siendo seleccionada a partir del grupo que consiste del ADN que codifica para EMAP II, ARN que codifica para EMAP II, y los fragmentos de los mismos; y después detectar la presencia o ausencia de unión de dicho compuesto de prueba y dicha sonda molecular, la presencia de unión indicando que dicho compuesto 15 puede ser útil para facilitar el crecimiento vascular en un individuo. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, • caracterizado además porque dicho compuesto de prueba es miembro de una librería combinatoria. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 7, 20 caracterizado además porque dicho compuesto de prueba es un oligonucleótido. 10.- Un método para seleccionar compuesto útiles para facilitar el crecimiento vascular en un individuo, que consiste en: determinar in vitro si un compuesto de prueba inhibe la expresión de EMAP II; la inhibición de la expresión de EMAP II indicando que dicho compuesto puede ser útil para facilitar el crecimiento vascular en un individuo. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho paso determinante se lleva a cabo en la célula. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho paso determinante consiste en determinar sí dicho compuesto inhibe la transcripción de EMAP II. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho paso determinante consiste en determinar si dicho compuesto inhibe la traducción de EMAP II. 14.- Un método para una formulación farmacéutica que consiste en: un compuesto activo seleccionado de un grupo que comprende compuestos que específicamente se unen a EMAP II, compuestos que inhiben la expresión de EMAP II, y un receptor antagonista de EMAP II; y un portador farmacéuticamente aceptable. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho portador farmacéuticamente aceptable es una solución salina estéril. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho compuesto activo está incluido en las soluciones portadoras farmacéuticamente aceptables mencionadas en una cantidad entre .001 y 50 por ciento en peso. 1

7.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho compuesto activo es un anticuerpo que 5 específicamente se une a EMAP II. t