KR101190200B1

KR101190200B1 - Ｍｓｘ1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관내피세포의 혈관신생 저해제

Info

Publication number: KR101190200B1
Application number: KR1020090033942A
Authority: KR
Inventors: 이제호; 박경숙; 최규삼
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2008-04-22
Filing date: 2009-04-20
Publication date: 2012-10-12
Also published as: KR20090111776A

Abstract

본 발명은 mTOR (포유동물 라파마이신 표적) 시그널링 경로를 표적으로 하여 혈관내피세포의 혈관신생(angiogenesis)을 저해하기 위한 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산의 새로운 용도에 관한 것이다. 구체적으로, Msx1은 mTOR와의 직접 상호작용을 통해 mTOR를 억제함으로써 혈관신생을 저해한다. 따라서, 본 발명의 Msx1은 당뇨병성 망막증, 관절염과 같은 혈관신생에 기인한 다양한 질병들의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

혈관신생 억제, 호메오 단백질, mTOR, angiogenesis inhibition, homeoprotein

Description

Ｍｓｘ1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관내피세포의 혈관신생 저해제 {An angiogenesis inhibitor of vascular endothelial cell comprising Msx1 protein or coding gene thereof}

본 발명은 mTOR (포유동물 라파마이신 표적) 시그널링 경로를 표적으로 하여 혈관내피세포의 혈관신생(angiogenesis)을 저해하기 위한 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산의 새로운 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 Msx1 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 혈관내피세포들의 혈관신생을 저해하기 위한 조성물에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)은 상처 치유만이 아니라 배아 및 생후 성장과 같은 생리적 과정들에서 중요한 역할을 하는 새로운 혈관(blood vessels)의 형성과정이다. 혈관의 형성은 염증(예컨대, 당뇨병성 망막증, 관절염)을 포함한 병리학적 과정들에 의해 유도된다 (Folkman, 1995). 신생혈관형성(neovascularization)은 정상 세포뿐 아니라 세포외 기질 구성물에서 분비된 혈관형성 성장인자들(angiogenic growth factors)에 의해 조절되고 내피 효소들(endothelial enzymes)의 활성에 의해서도 조절된다 (Hanahan and Folkman, 1996).
본 발명자들은 Msx1가 mTOR (포유동물 라파마이신 표적) 시그널링 경로를 표적으로 하여 정상 혈관내피세포의 혈관신생(angiogenesis)을 저해한다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명의 Msx1은 당뇨병성 망막증, 관절염과 같은 혈관신생에 기인한 다양한 질병들의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

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본 명세서의 배경기술에 개시된 정보는 단지 본 발명의 배경기술을 이해를 향상시키기 위한 것일 뿐, 따라서 명시적으로 그렇지 않다고 개시하지 않는 한, 이러한 정보들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 이미 공지된 형태들로서 지식 또는 제안의 임의의 형태로서 이해되어야 한다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 혈관내피세포의 혈관신생을 효과적으로 저해할 수 있는 Msx1 단백질 및 이를 코딩하는 핵산의 신규한 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 Msx1 단백질 및 이를 코딩하는 핵산를 이용한 당뇨병성 망막증, 관절염과 같은 혈관신생 관련 질병 상태의 치료를 위한 그 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관내피세포의 혈관신생 저해제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Msx1 단백질을 코딩할 수 있는 어떤 유전자도 가능하나, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서, 서열번호 1은 인간 Msx1 단백질의 아미노산 서열, 서열번호 2는 인간 Msx1 유전자의 염기서열이고, 서열번호 3은 마우스 Msx1 단백질의 아미노산 서열, 서열번호 4는 마우스 Msx1 유전자의 염기서열이다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 바람직하게는 혈관신생이 저해되기를 원하는 개체의 조직이나 세포내에서 발현되기 위하여 진핵세포 발현벡터에 삽입되어 있 는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 진핵세포 발현벡터는 동물이나 인간을 포함하는 진핵세포에서 유전자를 발현시킬 수 있는 종래 당업계에 알려진 어떤 발현벡터도 사용될 수 있으며, 예컨대, 아데노바이러스 벡터 또는 플라스미드인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어, 상기 혈관신생 저해는 mTOR과 Msx1의 직접적인 상호작용에 의한 mTOR의 신호전달을 저해하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는 mTOR과 Msx1의 직접적인 상호작용에 의해 mTOR가 저해된다는 것을 증명하였다.

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본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 혈관내피세포의 혈관신생 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다: a) mTOR 및 Msx1을 발현하는 세포를 준비하는 단계; b) 상기 세포에 후보 약제를 처리하는 단계; 및, c) 상기 mTOR 및 Msx1의 상호작용이 촉진되었는지 결정하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 a)단계에서 세포의 준비는 mTOR 또는 Msx1를 발현하는 벡터로 형질전환된 세포를 준비할 수도 있으며, c)단계에서 mTOR 및 Msx1의 상호작용은 실시예와 마찬가지로 면역침전방법(immunoprecipitation)후 면역블로팅 (immunoblotting)방법으로 결정될 수도 있다.

본 명세서에 개시된 본 발명이 충분히 이해되기 위하여, 이하 더욱 상세한 설명을 기술한다.

본 발명은 당뇨병성 망막증, 관절염과 같은 혈관신생에 기인한 질병들에서 혈관신생을 효과적으로 조절할 수 있는 치료법을 제공하려는 노력으로 완성되었다. 본 발명은 대상에서 혈관신생을 저해하고 관련 질병을 치료하기 위한 Msx1 단백질 및 이를 코딩하는 핵산의 신규한 용도에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 Msx1 또는 이를 코딩하는 핵산을 이용하는 혈관신생을 조절하기 위한 조성물 및 혈관신생 관련 질병 상태의 치료를 위한 그 용도에 관한 것이다.

또한 본 발명은 치료를 필요로 하는 포유동물에서 혈관신생을 저해하거나, 또는 포유동물에서 혈관신생-매개 질병 또는 이상을 치료하기 위해 Msx1을 투여함으로써 혈관신생의 저해 방법을 제안한다. 더욱 바람직하게는, 상기 Msx1 단백질의 발현을 위해 서열번호 1을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터 또는 플라스미드로 투여될 수 있다.

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하나의 구현예에서, Msx1은 mTOR과 상호작용하여 mTOR의 시그널링(signaling)을 저해한다. mTOR 시그널링 저해 결과는 항혈관신생에 명백하게 관련이 있는, VEGF 생성의 감소를 초래한다.

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특별히 한정하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적인 기술의 하나로 통상적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학 용어의 통상적으로 이해되는 정의들은, 예를 들어, Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991; and Lewin, Genes VIII, Oxford University Press: New York, 2004에서 찾을 수 있다.

본 발명자들은 혈관신생(angiogenesis)에 대한 Msx1의 역할을 연구하였다. 인간 배꼽 혈관 내피세포(human umbilical vascular endothelial cells, HUVECs)에서 Msx1의 과발현은 튜브 형성(tube formation), 이동(migration) 및 침윤(invasion)을 억제함으로써 혈관신생을 저해할 뿐만 아니라 생체외 혈관 가지생성(vessel sprouting) 및 생체내 혈관 형성(vessel formation)을 저해한다. 또한, siRNA에 의한 Msx1의 발현억제(silencing)는 그것의 항-혈관신생 효과를 없앤다.

본 발명은 혈관신생을 저해하기 위한 Msx1의 신규한 용도의 발견에 기초한다. Msx1을 발현하기 위한 유전자/핵산 발현 벡터들 또는 그 기능적으로 동등한 임의의 변이체는, 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 방법들로 제조될 수 있다.

또한, Msx1 또는 이를 코딩하는 유전자는 인간 또는 마우스의 공지 서열들에서 선택될 수 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 “유전자(gene)"는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있으며 단일 단백질(single protein) 또는 폴리펩티드를 특징으로 하는 핵산 서열을 나타낸다. 본 발명의 핵산 서열은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 다수의 키트 중 임의의 하나에 편입될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

또한 유전자 코드(genetic code)의 퇴화(degeneracy)로 인한 퇴화와 같은 아미노산을 변화시키지 않은 핵산 수준에서 돌연변이가 본 발명에 포함된다.

본 발명에 있어서 Msx1 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 게노믹 DNA(genomic DNA), cDNA, 및 합성 또는 재조합으로 생성된 DNA를 포함하는데, 이들 모두는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 게노믹 DNA는 Msx1 단백질을 발현하는 세포들로부터 추출될 수 있으며, 이는 플라스미드, 파지(phage), 코스미드(cosmid), BAC 및 PAC와 같은 벡터들을 사용하여 게노믹 라이브러리의 구성에 사용되고, 이어서 상기 벡터에 따라 콜로니 혼성화(colony hybridization) 또는 플라크 혼성화(plaque hybridization)하여 본 발명의 Msx1 유전자에 특이적인 서열을 가진 프로브를 사용하여 Msx1 게노믹 DNA를 스크리닝하게 된다. cDNA의 제조에 있어서, Msx1 단백질을 발현하는 세포들로부터 추출된 mRNA는 역전사(reverse-transcription)에 의해 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하는데 사용되고 이어서 그 Msx1 단백질을 코딩하는 cDNA의 증폭을 위해 본 발명의 Msx1에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한다.

예를 들어, 본 발명의 목적을 위해, NCBI accession no. AAH21285일 수 있으나, 이에 한정되지 않는, Msx1 단백질 서열 또는 GenBank accession no. BC021285일 수 있으나, 이에 한정되지 않는, Msx1 단백질 서열을 코딩하는 유전자가 사용될 수 있다.

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 세포에서 혈관신생을 효과적으로 저해할 수 있다.

따라서 Msx1 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 혈관신생과 관련된 질병상태(disease condition)에 걸린 세포 또는 조직을 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 질병상태는 당뇨병성 망막증, 관절염 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 방법 및 조성물을 위한 Msx1의 발현에 있어서, Msx1 유전자 또는 본 명세서에 개시된 그 기능적 변이체는 벡터에 작동가능하게 연결된다. 상기 벡터의 선택은, 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있으며, 단백질 발현의 요구 수준(desired level)에 달려있다. 본 발명에 의해 고려된 벡터는 세포, 바람직하게는 진핵세포에서 적어도 벡터에 포함된 유전자의 복제 및 발현을 나타낼 수 있다.

이러한 진핵세포 발현 벡터들은 바이러스 및 비-바이러스 벡터들을 포함하며, 당업계의 일반적인 기술 중 하나로 잘 알려져 있다. 비-바이러스 벡터 시스템에 있어서, Ausebel, et al., in Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York (1993) 및 Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)의 예들을 참조한다. 또한, 벡터들은 몇몇 소스들로부터 상업적으로 입수가능하다. 이러한 벡터들의 전형은 pCDNA 3 또는 4, pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), pSVL, 및 pKSV-10 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)이다.

Msx1의 발현용 바이러스 발현 벡터들은 목적하는 단백질을 발현하기 위해 조작되고 표적 조직들의 감염이 허용된 특징을 갖는 재조합 DNA 바이러스들 및 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 벡터들과 같은 감염성 벡터들을 포함하는데, 예를 들어, 바이러스 코트(viral coat)로 캡슐화된 이러한 바이러스 벡터들이 사용되며, 이는 당업계의 일반적인 기술 중 하나로 잘 알려져 있다 (Logan et al., 1984; Mackett et al., 1982; Cone et al., 1984 참조). 또한, 레트로바이러스/아데노바이러스 발현 시스템은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시를 위해 용이하게 적용될 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터들에 대한 Karavanas et al. (1998), 및 아데노바이러스 발현 시스템에 대한 Gene Expression Systems ed., Fernandez and Hoeffler, Academic Press, San Diego, USA (1990)을 참조한다. 하나의 구현예에서, Msx1은 Park et al.(2005)에 개시된 바와 같은 아데노바이러스 발현 시스템을 사용하여 발현된다.

다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 약학적 조성물의 사용방법을 제공하는데, 그것을 필요로 하는 포유동물에서 혈관신생-매개 질병 또는 이상(conditions)을 치료한다. 더욱 바람직하게는, 상기 Msx1 단백질은 서열번호 1을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 Msx1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 또는 플라스미드로 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된, 용어 “치료학적 유효한(therapeutically effective)”양은 조직 또는 대상(subject)에서 혈관신생의 측정 가능한 조절, 바람직하게는 저해를 유도하는데 충분한, Msx1 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 양을 의미한다. 상기 대상(subject)은 치료받는 환자이며, 상기 환자는 인간뿐만 아니라 동물 환자(veterinary patient)이다.

본 발명의 상기 Msx1 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물은 투여 제형(dosage formulation)과 양립하는 방식, 및 치료학적으로 유효한 양으로, 예를 들어 정맥내로(intravenously), 복강내로(intraperitoneally), 근육내로(intramuscularly) 및 피내(intradermally)로 투여된다. 또한 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 임의의 다른 다수의 기술들에 의해 투여될 수 있는데, 예를 들어 the latest edition of Remington's Pharmaceutical Science를 참조하며, 이러한 모든 기술들은 본 명세서에 참조로서 편입된다.

예를 들어, 주사(injections)에 있어서, 본 발명의 Msx1 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 행크액(Hank’s solution), 링거액(Ringer’s solution), 또는 생리식염수(physiological saline buffer)와 같은 생리학적으로 적절한 버퍼들을 포함하나 이에 한정되지 않는 적절한 용액에서 제형화될 수 있다. 상기 용액들은 현탁제(suspending), 안정화제(stabilizing) 또는 분산제와 같은 제형화 약제들을 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 상기 Msx1 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 사용 전, 적당한 비이클(vehicle), 예컨대 발열물질 무함유 멸균수(sterile pyrogen-free water)와 조합하기 위한 분말 형태일 수 있다.

나아가, 본 발명의 조성물은 그 자체로 투여되거나 또는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제(excipients)와 함께 적당한 제형으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 리포좀(liposomes) 및 에멀전(emulsions)과 같은 다른 약학적 전달시스템, 및 치료제를 포함하는 고체 중합체(solid polymers)의 반-투과 매트릭스(semi-permeable matrices)와 같은 서방형 시스템(sustained-release system)들이 사용될 수 있다. 여러 서방형 물질들이 입증되어 있으며 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있다.

투여되는 양(quantity) 및 시기(timing)는 제형, 투여 경로, 및 치료받는 조직 또는 대상, 예컨대, 환자의 나이, 체중, 전반적인 건강상태 및 기타 요소들에 따른 범위 내에서 변경될 수 있다. 핵산 서열에 있어서, 투여되는 양은 발현 벡터의 특성, 치료받는 조직, 및 그와 유사한 것에 달려 있다. 적당한 양은 사용된 벡터의 양, 또는 예상된 발현된 단백질의 양에 의해 측정될 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량(dose)은 환자의 상태 (투여량 및 투여 일정에 대한, 예컨대 latest editions of Remington's Pharmaceutical Science, Mark Publishing Co., Easton, Pa.; and Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press를 참조)를 관찰 중인 의사(individual physician)에 의해 선택될 수 있다.

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바람직하게는 본 발명의 상기 Msx1 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 투여량(doasge)은 조직 또는 대상에서 혈관신생의 저해를 유도하는데 충분하지만, 독성이 없거나 거의 없는 효과적인 투여량(dose)을 포함하는 농도의 범위내가 된다. 투여되는 상기 Msx1 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 단일 투여량(single dose)은 전형적으로 환자 체중에 대하여 약 0.05 내지 10 mg/kg의 범위일 것이다. 본 발명의 상기 Msx1 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 약 0.001 내지 100 mg/ml의 농도에서 적당한 제형으로 제형화될 경우 최종 투여량은 환자 체중에 대하여 약 0.05 내지 10 mg/kg이다. 바이러스 벡터들에 있어서, 이러한 바이러스 벡터들을 포함하는 재조합 바이러스는 전형적으로 체중에 대하여 kg당 약 10⁸-10¹² pfu/kg 범위일 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 다양한 발현 벡터들의 구축

이전에 개시된 바와 같이 (Park et al., Cancer Res. 65: 749-757, 2005; Hwang et al., Int. J. Gynecol. Cancer 8: 27-36, 1998) Msx1 전장을 포함하는 다양한 바이러스 및 비-바이러스 벡터들을 구축하여, 본 발명의 Msx1의 항-혈관신생 활성을 조사하기 위해 사용하였다.

아데노바이러스 벡터들

이전에 개시된 프로토콜(Park et al., 2005)에 따라 Msx1을 발현하는 아데노바이러스 벡터(Ad-Msx1)를 구성하였다. 간단히 설명하면, 고-정확도 중합효소 연쇄반응(PCR)-증폭된 전장 마우스 Msx1 cDNA 단편(서열번호 4)을 아데노바이러스 플라스미드 셔틀 벡터인, pΔACMVp(A) 벡터의 HindIII/XhoI 사이트에 클로닝하였다. 클로닝된 마우스 Msx1 cDNA의 서열은 DNA 서열 분석에 의해 확인되었다. 이전에 개시된 바와 같이 (Park et al., 2003), 아데노바이러스 생산을 위해 최종 아데노바이러스 벡터를 인간 배아 신장 293 세포(human embryonic kidney 293 cells)에 트랜스펙션시켰다. 2개의 연속된 염화세슘 구배(two consecutive cesium chloride gradients)를 통한 원심분리에 의해 대용량 배치(large batches)의 재조합 아데노바이러스를 정제하였다. 빈 셔틀 벡터를 포함하는 아데노바이러스는 대조군으로 사용되었다. 복제를 유도하기 위하여, 결핍 아데노바이러스(deficient adenoviruses), 상기 개시된 바와 같은 아데노바이러스 구성체(adenoviral constructs) 및 아데노바이러스 게노믹 DNA를 운반하는 pJM17 (F. Graham, McMaster University, Ontario, Canada)을 HEK 293 세포에 함께 트랜스펙션시키고 CsCl 구배 원심분리(CsCl gradient centrifugation)에 이어 10% 글리세롤 및 1 mmol/L MgCl₂가 보충된 PBS(Phosphate Buffered Saline)에서 광범위 투석(extensive dialysis)을 수행하여 정제하였다. HEK 293 세포를 이용한 플라크 분석(plaque assay)에 의해 각 아데노바이러스의 타이터(titer)를 측정하여 pfu(Plaque Forming Unit)로 나타내었다.

도 8은 상기 Ad-CMV-Msx1의 구성체를 나타내는 벡터 맵이다. 발현 클론 pΔA-Msx1 및 pJM17을 293 세포에 함께 트랜스펙션시킨 다음, 재조합 Ad-CMV-Msx1을 상동재조합(homologous recombination)을 통해 생성하였다.

플라스미드 벡터들

전장 인간 Msx1을 코딩하는 pCB6/Msx1인, 플라스미드 벡터들은 이전에 개시되었다 (Zhang et al., Mol. Cell Biol. 17: 2920-2932, 1997). Flag 펩티드로 태그된(tagged) 전장 인간 Msx1을 코딩하는 Flag-Msx1은 PCR 증폭된 전장 Msx1 DNA를 HindIII-BamHI 분해된 p3XFLAG-CMV™-14 발현 벡터 (Sigma)에 서브클로닝함으로써 제조되었다. 도 9는 상기 Flag-Msx1을 포함하는 벡터맵을 나타낸다.

본 발명을 위해 구성되고 사용된 각 플라스미드의 클로닝된 서열의 정확도(correctness)는 구성체들의 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. siRNA (small interfering RNA)는 Msx1의 발현을 넉다운(knock down)시키는데 사용되었다. 인간 Msx1 서열에서 뉴클레오티드 199 내지 217에 대응하는 Msx1을 표적화하는 siRNA는 Dharmacon (Chicago, IL)에서 합성되었으며 제조사의 설명서(Qiagen)에 따라 세포내로 트랜스펙션되었다. 배양된 포유동물 세포들은 Ad-Msx1 단독 또는 Msx1에 특이적인 siRNA를 트렌스펙션하였다. 잔기 수(residue numbers)는 NCBI accession no. AAH21285의 인간 Msx1 서열로부터 제공된다.

실시예 2. 세포 배양 및 트랜스펙션

인간 제대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cell: HUVEC, Clontech, San Diego, CA, USA), 인간 난소 암 세포주 2774 (human ovarian cancer cell line 2774, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA), 자궁경부암 세포주 HeLa (Cervical cancer cell line HeLa, American Type Culture Collection, USA), 인간 폐암 세포주 H1299 (Human lung cancer cell line H1299, American Type Culture Collection, USA), 및 HEK 293(Clontech Laboratories, San Diego, CA, USA)은 ATCC 설명서 및 (Park et al, ibid)에 개시된 바에 따라 유지하였다. 간단히 설명하면, 2774, HeLa, H1299 및 HEK 293 세포들은 각각 10% FBS 및 항생물질(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)이 보충된 DMEM (Dulbecco's Modification of Eagles Medium) 및 EMEM (Eagles Minimum Essential Medium)에서 각각 배양되었다. HUVECs는 EGM-2 키트 (Clontech Laboratories)를 이용하여 0.3% 젤라틴(gelatin)으로 코팅된 플레이트 상에 성장시켰다. 상기 세포들은 5% CO₂/95% 대기 37℃에서 배양되었다. 상기 각 세포주들로의 DNA 트랜스펙션 및 아데노바이러스 감염은 Lee et al., Oncogene (2001) 20:6700-6776; Lee et al., Cancer Res (2005) 65, 137, Park et al., ibid에 개시된 바와 같이 수행되었다.

실시예 3. Msx1은 시험관내 내피세포 이동, 침윤 및 튜브 형성을 저해한다.

시험관내에서 내피세포 이동, 침윤 및 튜브 형성에 대한 Msx1의 효과를 조사하기 위하여, HUVEC 세포를 공벡터(empty vector)를 포함하는 아데노바이러스 또는 Msx1을 발현하는 아데노바이러스(Ad-Msx1)로 감염시키고, 이어서 Msx1을 표적화하는 siRNA로 트랜스펙션시켰다. 이동 분석에 있어서, 트랜스웰 이동 분석(transwell migration assay)은 Lee et al., Cancer Res, 2005, 65, 137에 개시된 바와 같이 수행되었다 (8 μm pore size, Costar, Cambrige, MA). 필터의 하부표면(lower surface)은 10 μg의 젤라틴으로 코팅하였다. 하부웰들은 VEGF(25 ng/ml)가 있는 1% FBS를 포함하는 M199(Life Technologies)로 채웠다. 감염 18 시간 후, 세포들은 10 ng/ml의 VEGF (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)로 24시간 동안 처리되었으며, 그 후 세포들을 고정시키고 H&E(hematoxylin and Eosin, BioRad, Hercules, CA, USA)로 염색하였다. 필터의 상부표면(upper surface)에 남은 이동하지 않은 세포들은 면봉으로 세포들을 문질러 제거하였다. 필터의 하부측면(lower side)으로 이동한 세포들의 수는 광학현미경 하에서 카운트하여, 8개 필드의 평균값을 계산하였다. 인간 Msx1 서열의 뉴클레오티드 199-217에 대응하는 Msx1을 표적화하는 siRNA 올리고뉴클레오티드 서열은 Dharmacon에서 합성한 후, 100 nM의 Msx1 siRNA 를 제조사의 설명서에 따라 올리고펙타민 시약(Oligofectamin reagent; Invitrogen, San Diego, CA)를 사용하여 Msx1의 발현을 넉다운시키는데 사용하였다.

침윤 분석에 있어서, 필터의 하부 및 상부표면은 각각 10 μg의 젤라틴 및 10 μg의 매트리겔(Matrigel; BD Biosciences, Bedford, MA)로 코팅하였다. 상부웰들에는 감염되지 않은 HUVECs로 평판배양하고 HUVECs는 Ad, Ad-Msx1 및 Ad-Msx1+siRNAMsx1로 트랜스펙션 시킨 후 30시간 동안 배양하였다. 다음으로, 세포들을 고정시키고 염색한 후, 상기와 같이 정량하였다. 이동 및 침윤은 세포들을 Ad-Msx1로 처리함으로써 현저하게 감소되었다. 반대로, siRNA에 의한 Msx1의 넉다운은 이동 및 침윤을 저지하였는데, 이는 내피세포의 이러한 저해 효과들이 실제로 Msx1에 의한 것임을 명백하게 증명하는 것이다. 또한 Msx1은 튜브 형성을 저해하는데 튜브 형성에 대한 Msx1의 이러한 저해효과는 siRNA Msx1 트랜스펙션 후 없어졌다. 이러한 결과들은 본 발명의 Msx1이 혈관신생에 중요한 튜브 형성을 효과적으로 저해하는데 사용될 수 있음을 명백하게 증명한다.

도 1a에서, HUVECs는 감염되지 않거나(Un) Ad, Ad-Msx1, 또는 Msx1 작은 간섭 RNA를 가진 ad-Msx1(Ad-Msx1+Msx1 siRNA)로 18시간 동안 감염된 후 VEGF(10 ng/ml)로 24시간 동안 처리되었다. 도입된 ³[H]-티미딘(thymidine)은 액체섬광계수(liquid scintillation counting)에 의해 측정되었다. 작은 간섭 RNA(siRNA)는 HUVECs에서 Msx1의 억제를 매개하였다.

도 1b 및 1c에서, 감염되지 않은 HUVECs 및 지시된 아데노바이러스-감염된 HUVECs를 이동 분석을 위한 트랜스웰(B) 또는 침윤 분석을 위한 매트리겔-코팅된 트랜스웰(C)에 씨딩한 다음, VEGF (25 ng/ml)로 각각 24시간 또는 30시간 동안 자극하였다. 이동되거나 침윤된 세포들의 수를 광학현미경 하에서 카운트하고 평균값을 계산하였다. 독립된 실험을 3번 반복하였으며 에러 바(error bars)는 95% 신뢰구간에 상응한다. *P < .05는 VEGF 없이 감염되지 않은 세포들과 비교하였다.

도 1d에서, 감염되지 않은 HUVECs 및 아데노바이러스-감염된 HUVECs는 성장인자-감소된 매트리겔 상에서 평판배양된 후 VEGF (10 ng/ml)가 있거나 없이 48시간 동안 처리되었다. 튜브 구조의 형성은 도립현미경(inverted microscope)에 의해 확인되었다. 스케일 바(Scale bar): 100 마이크로 미터. 튜브 길이는 측정되었으며 에러 바는 95% 신뢰구간에 상응한다. *P < .05는 감염되지 않은 대조군과 비교하였다.

실시예 4. Ad-Msx1는 VEGF 프로모터 활성을 억제한다.

인간 VEGF 프로모터 루시페라아제 리포터 구조체(human VEGF promoter luciferase reporter constructs)는 이전에 개시되었다 (Lopez-Ocejo, O. et al., (2000). Oncogenes and tumor angiogenesis: Oncogene 19, 4611-4620). 70% 컨플루언시(confluency)에서 HUVEC 세포들은 VEGF 리포터 구조체 및 Ad-Msx1으로 일시적으로 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 효율의 변화를 교정하기 위한 내부대조 군(internal control)으로서, 20 ng의 pRL-TK (Promega, Madison, WI)가 함께 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션은 제조사의 설명서에 따라 Effectene transfection reagent (Qiagen)를 사용하여 수행되었다. 루시페라아제 활성은 제조사의 설명서에 따라 dual luciferase reporter assay system (Promega)를 사용하여 측정되었으며, 이는 레닐라 루시페라아제(Renilla luciferase) 활성을 표준화하여 트랜스펙션 효율의 변화를 교정하였다.

도 2에서, HUVEC 세포들은 pGL3VEGF-Luc reporter로 트랜스펙션된 후 Ad-mock 또는 Ad-Msx1로 24시간 동안 감염되었다. 루시페라아제 활성은 제조사의 프로토콜(Promega)에 따라 루시페라아제 분석시스템(luciferase assay system)을 사용하여 측정되었다. 여기에 나타난 활성들은 Ad-mock 처리된 루시페라아제의 활성에 비교한 루시페라아제 발현에 해당한다.

실시예 5. Msx1은 생체외 및 시험관내 혈관신생에서 혈관 가지생성(vessel sprouting)을 저해한다.

생체외(ex vivo) 혈관신생에 대한 Msx1의 저해효과는 (Jang et al., Molecular Therapy, 2004, 9, 464)에 기술된 바와 같이 매트리겔 상에서 골격근(skeletal muscle)의 생체외 배양(ex vivo explant culture)을 이용하여 조사되었다. 간단히 설명하면, 6주령 Balb/c 마우스를 마취시키고, 다리를 면도한 후 플라스미드 벡터 단독 또는 Msx1-발현하는 플라스미드를 전기이동(electrophorese)시 켰다. 전경골근(tibialis anterior muscle)을 떼어내고 PBS(phosphate buffered saline)로 3번 세척하였다. 그 후 근육을 매트리겔을 포함하는 24-웰 플레이트에 위치시키고, 이어서 37℃에서 30분간 중합반응(polymerization)시켰다. 10 ng/ml의 VEGF가 있거나 없는 1% FBS를 포함하는 M199 배지를 첨가하여 상기 플레이트를 배양하였다. 6일 후, 모세혈관-유사 구조(capillary-like structures)의 생성(outgrowth)이 관찰되었고 이 때 혈관 가지생성(vascular sprouting)을 광학 이미징 기술(optical imaging technique) 및 ImageLab imaging software를 사용하여 정량하였다.

도 3a에서, 마우스 전경골근의 횡단면(cross-section)을 VEGF가 있거나 없는 성장인자-감소된 매트리겔에 끼워 넣은 다음 벡터 단독 또는 Msx1 발현 플라스미드로 처리하였다. 모세혈관-유사 구조의 생성은 도립현미경으로 관찰하였다. (Original magnifications: X12.5 (upper); X40 (lower). 혈관 가지생성의 평균 범위를 정량하였으며 에러 바는 95% 신뢰구간에 해당한다. *P<.005는 VEGF로 감염되지 않은 대조군과 비교하였다. Msx1 과발현에 의한 튜브 형성 및 혈관 가지생성에 대한 유사한 저해 효과는 각각 3번에 걸친 독립된 실험에서 관찰되었다.

도 3b에서, Ad-Msx1은 생체내 혈관신생을 저해한다. 닭 10일령 수정란의 장융모막 (CAM: chorionic amniotic membrane)을 DMSO 또는 DMSO에 녹인 재조합 Msx1 중 하나로 처리되었다. 72시간 후, CAM에 분포한 혈관 밀도를 현미경으로 측정하였다. 혈관신생은 제공된 범위의 혈관에서 발생한 가지점(branch points)의 수를 카 운트함으로써 정량되었다. 측정은 2개의 개별적인 실험으로부터 DMSO 또는 재조합 Msx1로 처리된 6개의 샘플에서 수행되었다. 통계학적인 유의성은 paired t test를 사용하여 측정되었다.

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실시예 8. Msx1은 mTOR과 상호작용하여 mTOR 시그널링을 억제한다.

도 6a에서, Msx1은 mTOR 발현 및 활성을 억제한다. A. HEK 293 세포를 Flag- tagged 대조군 벡터(control vector) 또는 Flag-tagged 전장 Msx1 발현 구조체(expression construct)로 일시적으로 트렌스펙션시킨 후 전체 세포 융해물(cell lysates)을 mTOR (Cell signaling사) 및 Msx1 항체를 사용하여 면역블로팅 분석에 사용하였다. B. 내인성(endogenous) Msx1 발현의 넉다운 (앞에서 언급된 Msx1에 특이적인 올리고펙타민을 사용하여 Msx1-특이적 siRNA를 트렌스펙션하여 Msx1 의 발현을 넉다운 시켰음)시키는 경우 mTOR 하향조절 및 mTOR 표적, p70S6K1을 저해하지 못하였다. 스크램블(scrambled) 또는 Msx1-특이적 siRNA를 올리고펙타민(Oligofectamin)을 HEK 293 세포내로 트랜스펙션한 다음 전체 세포 추출물을 지시된 항체로 면역블로팅하였다.

도 7a에서, Msx1은 mTOR과 상조작용한다. HEK 293 세포를 Flag-vector 또는 Flag-Msx1로 트랜스펙션한 다음 전체 세포 융해물을 mTOR로 면역침전(immunoprecipitate)시키고 이어서 Msx1에 대한 항-Flag 항체 및 항-mTOR 항체로 면역블로팅(immunoblotting)하였다. Msx1의 발현은 항-Msx1 항체로 면역블로팅함으로써 확인하였다.

도 7b에서, Msx1은 mTOR의 키나아제 도메인(kinase domain)과 상호작용한다. Msx1-상호작용하는 mTOR 도메인을 맵핑하기 위해, HEK 293 세포들을 대조군 myc-vector 또는 지시된 myc-mTOR 발현 구조체로 트랜스펙션시킨 다음 (mTOR domain structure is shown), 전체 세포 융해물을 항-myc 비드(anti-myc beads)로 면역침전시키고 이어서 항-Flag 항체로 면역블로팅하였다. 또한 트랜스펙션된 전체 세포 융해물은 항-myc 항체로 면역블롯 분석하여 지시된 mTOR 도메인의 발현을 확인하는 데 사용되었다.

도 7c에서, Msx1과 mTOR의 상호작용이 Msx1에 의한 신생혈관생성에 중요한지를 규명하기 위하여 전장의 Msx1을 발현하는 구조체와 앞서 보여준 mTOR과 상호작용하는 부위가 결손된 ΔC Msx1 구조체를 인체내피세포 (HUVEC)에 트렌스펙션한 후 내피세포에 의한 관형성 (tube formation)을 비교한 결과, ΔC Msx1 구조체에서는 신생혈관생성이 억제되지 않았다.

도 7d 에서, Msx1은 mTOR 시그널링을 억제한다. HEK 293 세포들을 Flag-대조군 벡터 또는 Flag-Msx1 발현 구조체로 트랜스펙션시킨 다음, 동량의 β-액틴을 포함하는 전체 세포 융해물을 공지의 mTOR 상류 및 하류 시그널링(mTOR upstream and downstream signaling)에 대한 지시된 항체로 면역블로팅하였다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에서는 Msx1가 mTOR와의 직접 상호작용을 통해 mTOR를 억제함으로써 혈관내피세포의 혈관신생을 저해한다는 것을 증명하였다. 따라서, 본 발명의 Msx1은 당뇨병성 망막증, 관절염과 같은 혈관신생에 기인한 다양한 질병들의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

[참고문헌]

도 1a 내지 1d는 Msx1이 시험관내 내피세포 이동, 침윤 및 튜브 형성을 저해함을 도시한다.

도 2는 Msx1이 VEGF 프로모터 활성을 억제함을 보여준다.

도 3a 및 3b는 Msx1이 생체외 혈관 가지생성 및 생체내 혈관신생을 저해함을 설명한다.

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도 6a 및 6b는 Msx1이 mTOR 및 mTOR 표적들을 하향조절함을 보여준다.

도 7a 내지 7d는 Msx1이 mTOR 키나아제 도메인과 상호작용하여 mTOR 시그널링을 저해함을 보여준다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> An angiogenesis inhibitor of tumor comprising Msx1 protein or coding gene thereof <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 297 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Ser Leu Pro Leu Gly Val Lys Val Glu Asp Ser Ala Phe Gly 1 5 10 15 Lys Pro Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gln Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Thr Ala Ala Ala Met Gly Ala Asp Glu Glu Gly Ala Lys Pro Lys Val 35 40 45 Ser Pro Ser Leu Leu Pro Phe Ser Val Glu Ala Leu Met Ala Asp His 50 55 60 Arg Lys Pro Gly Ala Lys Glu Ser Ala Leu Ala Pro Ser Glu Gly Val 65 70 75 80 Gln Ala Ala Gly Gly Ser Ala Gln Pro Leu Gly Val Pro Pro Gly Ser 85 90 95 Leu Gly Ala Pro Asp Ala Pro Ser Ser Pro Arg Pro Leu Gly His Phe 100 105 110 Ser Val Gly Gly Leu Leu Lys Leu Pro Glu Asp Ala Leu Val Lys Ala 115 120 125 Glu Ser Pro Glu Lys Pro Glu Arg Thr Pro Trp Met Gln Ser Pro Arg 130 135 140 Phe Ser Pro Pro Pro Ala Arg Arg Leu Ser Pro Pro Ala Cys Thr Leu 145 150 155 160 Arg Lys 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Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Msx1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 당뇨병성 망막증 또는 관절염 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막증 또는 관절염 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 유전자는 진핵세포 발현벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막증 또는 관절염 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 진핵세포 발현벡터는 아데노바이러스 벡터 또는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 당뇨병성 망막증 또는 관절염 치료용 약학적 조성물.
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다음 단계들을 포함하는 당뇨병성 망막증 또는 관절염 치료제의 스크리닝 방법:

a) mTOR 및 Msx1을 발현하는 세포를 준비하는 단계;

b) 상기 세포에 후보 약제를 처리하는 단계; 및

c) 상기 mTOR 및 Msx1의 상호작용이 촉진 또는 억제되었는지 결정하는 단계.