WO2020251208A1 - 코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물을 포함하는 위장질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 - Google Patents

코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물을 포함하는 위장질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present application relates to a composition for preventing, treating, or improving gastrointestinal diseases including a strain of the genus Corynebacterium, a culture thereof, and threonine.
  • gastric ulcer occupies the largest incidence rate, and it is common worldwide in all livestock.
  • the incidence rate of gastric ulcers is increasing with the development of the livestock industry, and efforts to prevent gastric ulcers from the aspect of animal welfare are being strengthened as a symptom accompanied by pain along with a decrease in the growth rate due to decreased appetite.
  • Threonine is a major amino acid (Amino acid, AA) that constitutes mucine, a substance protecting the intestinal epithelium.
  • Mucin protein plays an important role in maintaining intestinal health by promoting protein absorption and protecting the digestive system from strong acidic digestive juices such as gastric juice. In fact, it is reported that Thr treatment in feed improves intestinal health by helping mucin synthesis in piglets (Non-Patent Document 1).
  • the production of feed or food Thr is produced by a fermentation method by microorganisms, and the types of microorganisms mainly used at this time include Escherichia coli , E. coli and Corynebacterium glutamicum , C. glutamicum ). Despite producing the same AA, these two strains are classified into Gram-negative and Gram-positive, respectively. Both Gram-negative and Gram-positive bacteria have peptidoglycan (PG) in their cell walls. However, in the case of Gram-negative bacteria, in addition to PG, there is an additional layer of lipopolysaccharide (LPS) composed of lipoprotein and protein.In this LPS layer, Lipid A, a somatic antigen (O antigen), is present.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2
  • Non-Patent Document 3 lactic acid bacteria, which are representative Gram-positive bacteria, are stable in the environment due to strong resistance to acid and heat, and are highly concentrated, so they are easy to handle, and are used as food for beneficial bacteria that have settled in the intestine. It is reported to enhance the strengthening activity (Non-Patent Document 3).
  • Non-Patent Document 1 Law G. (2000) Threonine requirement and the effect of threonine on gut mucin characteristics in piglets receiving intragastric nutrition. Master thesis of university of Alberta. 1-143.
  • Non-Patent Document 2 Miyamoto T., Okono S. and Kasai N (2009) Inactivation of Escherichia coli endotoxin by soft hydrothermal processing. Applied and Environmental Microbiology, 75(15), 5058-5063.
  • Non-Patent Document 3 Lee I.H. (2018) The latest trends surrounding antimicrobial and substitutes for animals. Pig & Consulting, 4, 70-73.
  • the present application provides a feed composition for preventing or improving gastrointestinal diseases, including a strain of Corynebacterium sp., a culture thereof, and threonine.
  • the present application provides a pharmaceutical composition for preventing or treating gastrointestinal diseases, including a strain of Corynebacterium sp., a culture thereof, and threonine.
  • the present application provides a food composition for preventing or improving gastrointestinal diseases, including a strain of Corynebacterium sp., a culture thereof, and threonine.
  • the present application provides a composition for antibacterial against Helicobacter pylori, including a strain of Corynebacterium sp., a culture thereof, and threonine.
  • One aspect may provide a composition for preventing, improving, or treating gastrointestinal diseases, including a strain of Corynebacterium sp., a culture thereof, and threonine.
  • prevention refers to all actions of inhibiting or delaying the onset of a disease by administration of a composition according to an example
  • treatment refers to an individual suspected of and onset of a disease by administration of the composition according to an example
  • improvement means any action of at least reducing the severity of a parameter related to a condition in which a disease is treated, for example, by administration of a composition according to an example. can do.
  • the disease may mean a gastrointestinal disease.
  • One aspect may provide a feed composition for preventing or improving gastrointestinal diseases, including a strain of Corynebacterium sp., a culture thereof, and threonine.
  • Corynebacterium sp., Coryne sp may include all Corynebacterium sp. strains. Strains of the genus Corynebacterium include, for example, Corynebacterium glutamicum , Corynebacterium ammoniagenes , Corynebacterium crudilactis , Corynebacterium Corynebacterium deserti , Corynebacterium efficiens , Corynebacterium callunae , Corynebacterium stationis , Corynebacterium singulare ( Corynebacterium singulare ), Corynebacterium halotolerans , Corynebacterium striatum , Corynebacterium pollutisoli , Corynebacterium imitans , Corynebacterium testudinoris , and/or Corynebacterium flavescens , and more specifically Corynebacterium glutamicum , Coryn
  • the strain of the genus Corynebacterium may be capable of producing threonine.
  • the presence of threonine-producing ability means that when the microorganism is cultured in a medium, it indicates the ability to produce and accumulate threonine in and/or in the microorganism.
  • composition for preventing, improving, or treating gastrointestinal diseases contains Corynebacterium glutamicum
  • Corynebacterium glutamicum other types of Corynebacterium genus strains other than Corynebacterium glutamicum (for example, Corynebacterium ipiciens) (1) prevention, improvement, or treatment effect of gastrointestinal diseases and/or (2) anti-Helicobacter pylori efficacy may be superior to the composition comprising the composition.
  • composition for preventing, improving, or treating gastrointestinal diseases contains Corynebacterium ammoniagenes
  • Corynebacterium ammoniagenes other types of Corynebacterium genus strains other than Corynebacterium ammoniagenes (for example, Corynebacterium ipiciens) (1) prevention, improvement, or treatment effect of gastrointestinal diseases and/or (2) anti-Helicobacter pylori efficacy may be superior to the composition comprising the composition.
  • composition for the prevention, improvement, or treatment of gastrointestinal diseases comprises Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium ammonia gene, Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium ammonia (1) Prevention, improvement, or therapeutic effect of gastrointestinal diseases and/or (2) anti-helicobacter than a composition containing a strain of the genus Corynebacterium other than Ness (for example, Corynebacterium ipciens) The pylori efficacy may be excellent.
  • the composition is excellent in anti-Helicobacter pylori efficacy is that it has excellent antimicrobial activity against the Helicobacter pylori strain or has excellent activity to prevent apoptosis of cells infected by Helicobacter pylori (for example, gastric mucosa cells). It can mean.
  • the strain of the genus Corynebacterium may mean the cells concentrated after removing the culture medium from the culture medium, and may be subjected to centrifugation and/or filtration to recover only the concentrated cells from the culture.
  • the strain of the genus Corynebacterium may be included in the form of dead cells.
  • the term "dead cells” refers to a form in which live cells and metabolites obtained through fermentation are prevented from growing by heat treatment.
  • the dead cells may include cytoplasm, cell wall, antibacterial active substances such as bacteriocin, polysaccharides, and/or organic acids.
  • a composition containing dead cells may have at least one characteristic selected from the group consisting of the following (1) to (6) than a composition containing live cells.
  • the strain of the genus Corynebacterium may be killed by tindel and/or heat treatment.
  • the culture medium obtained by sterilizing the strain of the genus Corynebacterium and the culture thereof includes dead cells of the strain.
  • the heat treatment may be performed for 3 to 30 minutes at a temperature of 60 to 130°C.
  • the heat treatment may be performed by 1 to 10 times of ultra high temperature sterilization, autoclave, and/or hot air drying.
  • the ultra-high temperature sterilization may be performed at a temperature of 110°C to 130°C for 3.0 to 10.0 seconds, for example, twice at 100°C for 1.0 to 10 seconds, and once at 121°C for 1.0 to 10.0 seconds
  • the autoclave may be performed at 120 to 125°C, or 121°C for 10 to 30 minutes, 15 to 25 minutes, or 20 minutes, and the hot air drying is performed at a temperature of 60 to 70°C. It can be done in.
  • the composition containing the dead cells of the strain of the genus Corynebacterium, the culture of the strain of the genus Corynebacterium, and the composition containing threonine are in vitro and/or in vivo (1) preventive or therapeutic effect of gastrointestinal diseases And/or (2) it was confirmed that the anti-helicobacter pylori effect was excellent.
  • composition according to an example comprises 20 to 40 OD (wave length 560 to 565 nm), 25 to 35 OD (wave length 560 to 565 nm), or 30 OD concentration (wave length) for the strain of the genus Corynebacterium (or dead cells of the strain) 560 to 565nm).
  • the composition according to an example comprises 20 to 40 OD (wave length 560 to 565 nm), 25 to 35 OD (wave length 560 to 565 nm), or 30 OD concentration (wave length) for the strain of the genus Corynebacterium (or dead cells of the strain) 560 to 565nm) 1 to 100g/L, 5 to 100g/L, 10 to 100g/L, 15 to 100g/L, 20 to 100g/L, 21 to 100g/L, 1 to 80g/L, 5 to 80g /L, 10 to 80g/L, 15 to 80g/L, 20 to 80g/L, 21 to 80g/L, 1 to 60g/L, 5 to 60g/L, 10 to 60g/L, 15 to 60g/L , 20 to 60g/L, 21 to 60g/L, 1 to 50g/L, 5 to 50g/L, 10 to 50g/L, 15 to 50g/L, 20 to 50g/L, 21 to 50g/L, 1 To 30g
  • the composition according to an example comprises 1 to 100 g/L, 5 to 100 g/L, 10 to 100 g/L, 15 to 100 g/L, 20 to 100 g/L for the strain of the genus Corynebacterium (or dead cells of the strain) , 21 to 100g/L, 1 to 80g/L, 5 to 80g/L, 10 to 80g/L, 15 to 80g/L, 20 to 80g/L, 21 to 80g/L, 1 to 60g/L, 5 To 60g/L, 10 to 60g/L, 15 to 60g/L, 20 to 60g/L, 21 to 60g/L, 1 to 50g/L, 5 to 50g/L, 10 to 50g/L, 15 to 50g /L, 20 to 50g/L, 21 to 50g/L, 1 to 30g/L, 5 to 30g/L, 10 to 30g/L, 15 to 30g/L, 20 to 30g/L, 21 to 30g/L , 1 to 25g/L,
  • composition according to an example comprises 0.1 to 10% by weight, 0.1 to 8% by weight, 0.1 to 5% by weight, 0.1 to 4% by weight, 0.1 to 3.5% by weight, 0.1 to the strain of the genus Corynebacterium (or dead cells of the strain).
  • the strain of the genus Corynebacterium may be included in the culture of the strain.
  • the "culture” refers to a product obtained after culturing the strain of the genus Corynebacterium, and may include a fermentation product In one example, the culture product is obtained by culturing a strain of the genus Corynebacterium in a medium.
  • the "fermented product” refers to a product of enzymatic or metabolic decomposition of organic substances using microorganisms
  • “fermentation” refers to enzymatic or metabolic decomposition of organic substances using microorganisms. It may mean that it is not a decay reaction during any activity or process it contains.
  • the culture may be a whole culture of a strain of the genus Corynebacterium, a dilution thereof, a concentrate, a dried product, a freeze-dried product, a crushed product, and/or a fraction, and the concentrate is the culture product.
  • the lysate may be obtained by physically or ultrasonic treatment of the strain or culture, and the fraction may be obtained by applying the culture or lysate to a method such as centrifugation or chromatography.
  • the culture or fermentation product may be a solid (solid, for example, dry), liquid (liquid), or fluidized phase, but is not limited thereto.
  • the culture may mean a whole medium including a cultured strain obtained by culturing a strain of the genus Corynebacterium for a certain period of time, a metabolite thereof, and/or an extra nutrient.
  • the culture may mean the remaining components excluding the strain (bacterium) and/or threonine in a fermented product obtained by culturing a strain of the genus Corynebacterium in a medium.
  • the culture may be a strain of the genus Corynebacterium has not been removed or removed.
  • the culture may be a culture solution (or culture) obtained by removing the strain from a culture solution obtained by culturing a strain of the genus Corynebacterium in a medium.
  • the culture solution (or culture) from which the strain has been removed may be a cell free culture solution (or culture) or a culture solution containing dead cells.
  • the composition according to an example comprises 1 to 80% by weight, 5 to 80% by weight, 10 to 80% by weight, 15 to 80% by weight, 20 to 80% by weight, 23 to 80% by weight of the culture (or fermented product) , 25 to 80% by weight, 1 to 60% by weight, 5 to 60% by weight, 10 to 60% by weight, 15 to 60% by weight, 20 to 60% by weight, 23 to 60% by weight, 25 to 60% by weight, 1 To 50% by weight, 5 to 50% by weight, 10 to 50% by weight, 15 to 50% by weight, 20 to 50% by weight, 23 to 50% by weight, 25 to 50% by weight, 1 to 40% by weight, 5 to 40 Wt%, 10 to 40 wt%, 15 to 40 wt%, 20 to 40 wt%, 23 to 40 wt%, 25 to 40 wt%, 1 to 30 wt%, 5 to 30 wt%, 10 to 30 wt% , 15 to 30% by weight, 20 to 30% by weight, 23 to 30% by weight, 25 to 30% by weight, 1
  • a composition containing a culture in the above range than a composition containing a culture in an amount outside the above range may have excellent (1) prophylactic or therapeutic effects of gastrointestinal diseases and/or (2) anti-Helicobacter pylori efficacy.
  • the culture may include a strain of the genus Corynebacterium, and the strain of the genus Corynebacterium in the culture is 0.1 to 10% by weight, 0.1 to 8% by weight, 0.1 to 5% by weight, 0.1 to 4% by weight, 0.1 To 3.5 weight, 0.1 to 3 weight, 0.1 to 1 weight, 1 to 10 weight %, 1 to 8 weight %, 1 to 5 weight %, 1 to 4 weight, 1 to 3.5 weight %, 1 to 3 weight, 2 to 10 wt%, 2 to 8 wt%, 2 to 5 wt%, 2 to 4 wt%, 2 to 3.5 wt%, 2 to 3 wt%, 3 to 10 wt%, 3 to 8 wt%, 3 to 5 wt%, It may be included in an amount of 3 to 4 wt%, 3 to 3.5 wt%, 3.5 to 10 wt%, 3.5 to 8 wt%, 3.5 to 5 wt%, or 3.5
  • the strain of the genus Corynebacterium and its culture are heat-treated (or sterilized (for example, autoclave or hot air drying)) of the prepared culture obtained by culturing the strain of the genus Corynebacterium in a medium for a certain period of time.
  • it may be a culture containing the dead cells of the strain of the genus Corynebacterium obtained by.
  • culture refers to a series of actions to grow microorganisms under appropriately artificially controlled environmental conditions.
  • the culture may use any culture conditions and culture methods known in the art.
  • the culture may be performed continuously in a known batch culture method, a continuous culture method, a fed-batch culture method, a batch process or an injection batch or a fed batch or repeated fed batch process.
  • the culture conditions are not particularly limited thereto, but a basic compound (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide, or ammonia) or an acidic compound (eg, phosphoric acid or sulfuric acid) is used to provide an appropriate pH (eg, pH 5 to 9, pH 6). To 8, or pH 6.8).
  • an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester can be used to suppress bubble formation and/or oxygen or an oxygen-containing gas mixture can be introduced into the culture to maintain aerobic conditions.
  • the culture temperature may be 20 to 45°C, 25 to 40°C, 30 to 40°C, 30 to 35°C, or 35 to 40°C
  • the culture conditions are 100 to 500 rpm, 150 to 300 rpm, 150 to 250rpm, or 200rpm may be, and incubation time (period) is 1 to 160 hours, 10 to 100 hours, 12 to 72 hours, 24 to 72 hours, 30 to 60 hours, 40 to 50 hours, 45 to 50 hours, or It can be 48 hours.
  • the incubation period may be continued until useful substances (eg, L-threonine, threonine, threonine, and Threonine) are obtained in a desired production amount.
  • the cultivation may be performed at a cultivation temperature in the above range for a cultivation time in the range.
  • a medium for culturing a strain of the genus Corynebacteria may refer to a known document (eg, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington DC, USA, 1981), but this It is not limited.
  • Carbon sources that can be used in the medium include sugars and carbohydrates (e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molase, starch and cellulose), fats and fats (e.g. , Soybean oil, sunflower seed oil, peanut oil and coconut oil), fatty acids (e.g. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid), alcohols (e.g.
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds (e.g. peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea), or inorganic compounds (e.g. ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and Ammonium nitrate) or the like may be used individually or in combination, but is not limited thereto.
  • Potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and a sodium-containing salt corresponding thereto may be used individually or as a phosphorus source, but are not limited thereto.
  • the culture medium may contain other metal salts required for growth (eg, magnesium sulfate or iron sulfate) and/or may contain essential growth materials such as amino acids and vitamins, but is not limited thereto.
  • the medium may be a medium for threonine production (eg, no. 435 medium), and the strain of the genus Corybacterium, and a culture thereof, are cultured in a medium for producing threonine. It may be one culture, and threonine may be excreted into a culture medium or contained in a cell.
  • a medium for threonine production eg, no. 435 medium
  • the strain of the genus Corybacterium, and a culture thereof are cultured in a medium for producing threonine. It may be one culture, and threonine may be excreted into a culture medium or contained in a cell.
  • the culture of the Corynebacterium genus strain and/or its (the Corynebacterium genus strain) may contain threonine.
  • the strain of the genus Corynebacterium and/or a culture thereof may not contain threonine.
  • Threonine (Thr) and “Threonine” are hydroxy- ⁇ -amino acids and are one of the essential amino acids that are not produced in the body, and the formula HO 2 CCH(NH 2 )CH(OH)CH 3 Means amino acids.
  • the threonine may be an optical isomer L-form (L-Threonine, L-Thr), D-form, or a combination thereof.
  • Threonine is an essential amino acid and constitutes mucine, a substance protecting the intestinal epithelium, and if insufficient, it can cause growth arrest and weight loss.
  • composition according to an example contains 50 to 90% by weight, 50 to 85% by weight, 50 to 80% by weight, 50 to 75% by weight, 50 to 70% by weight, 55 to 90% by weight, 55 to 85% by weight of threonine, 55 to 80% by weight, 55 to 75% by weight, 55 to 70% by weight, 60 to 90% by weight, 60 to 85% by weight, 60 to 80% by weight, 60 to 75% by weight, 60 to 70% by weight, 65 to 90% by weight, 65 to 85% by weight, 65 to 80% by weight, 65 to 75% by weight, 65 to 70% by weight, 70 to 90% by weight, 70 to 85% by weight, 70 to 80% by weight, 70 to 75% by weight %, or 70% by weight.
  • a composition containing threonine in the above range may be superior to a composition containing threonine in an amount outside the above range (1) a prophylactic or therapeutic effect of gastrointestinal diseases and/or (2) an anti-helicobacter pylori efficacy.
  • the threonine may be commercially available or may be produced using an extraction method, a fermentation method, an enzyme method, and/or a synthesis method. For example, it may be obtained by purifying a fermented product containing threonine using a coryneform strain, biosynthesized through a threonine biosynthetic pathway, and/or chemically synthesized.
  • the threonine is included in the composition according to an example (1) the strain of the genus Corynebacterium and/or the culture thereof, or (2) the strain of the genus Corynebacterium and/or the form not included in the culture thereof. It may be further included or (3) a combination thereof (for example, a strain of the genus Corynebacterium and a culture thereof included in the composition includes threonine, and may additionally include threonine).
  • Threonine contained in the composition according to an example is a composition according to an example
  • (1) is included in the strain of the genus Corynebacterium, a culture thereof, or both (strain and culture);
  • the addition of threonine may mean that purified threonine is additionally added in addition to the threonine contained in the strain and/or culture.
  • the threonine may be a powder and/or granule in its form. In the case of granular threonine, it may have a particle size of 100 to 1000 ⁇ m or 200 to 1000 ⁇ m.
  • the composition according to an example may include 0.1 to 5 parts by weight of the strain of the genus Corynebacterium, 10 to 90 parts by weight of the culture, and 10 to 80 parts by weight of the threonine. Specifically, 0.2 to 5 parts by weight of strain, 12 to 88 parts by weight of culture and 10.5 to 78 parts by weight of threonine, 0.3 to 5 parts by weight of strain, 13 to 87 parts by weight of culture and 11 to 77 parts by weight of threonine, strain 0.4 to 5 parts by weight, 14 to 86 parts by weight of culture and 11.5 to 76 parts by weight of threonine, 0.5 to 5 parts by weight of strain, 15 to 85 parts by weight of culture and 12 to 75 parts by weight of threonine, 0.6 to 5 parts by weight of strain, culture 16 to 84 parts by weight and 12.5 to 74 parts by weight of threonine, 0.7 to 5 parts by weight of strain, 17 to 83 parts by weight of culture and 13 to 73 parts by weight
  • the weight ratio of the strain and its culture and threonine is 1:0.1 to 1:10, 1:0.1 to 1:5, 1:0.1 to 1:3, 1:0.2 to 1:10, 1:0.2 to 1:5, 1:0.2 to 1:3, 1:0.5 to 1:10, 1:0.5 to 1:5, 1:0.5 to 1: 3, 1:1 to 1:10, 1:1 to 1:5, 1:1 to 1:3, 1:3 to 1:10, 1:3 to 1:5, or 1:3.
  • composition according to an example may further include lignin sulfonate.
  • lignin sulfonate (1) a prophylactic or therapeutic effect of gastrointestinal diseases and/or (2) anti-helicobacter pylori efficacy may be excellent.
  • the composition according to an example may further include calcium lignosulfonate in order to adjust the threonine content contained in the composition.
  • the composition contains 0.1 to 50% by weight of calcium lignin sulfonate, 0.1 to 30% by weight, 0.1 to 25% by weight, 0.1 to 20% by weight, 0.1 to 15% by weight, 0.1 to 10% by weight, 0.1 to 7 Wt%, 1 to 50 wt%, 1 to 30 wt%, 1 to 25 wt%, 1 to 20 wt%, 1 to 15 wt%, 1 to 10 wt%, 1 to 7 wt%, 3 to 50 wt% , 3 to 30% by weight, 3 to 25% by weight, 3 to 20% by weight, 3 to 15% by weight, 3 to 10% by weight, 3 to 7% by weight, 5 to 50% by weight, 5 to 30% by weight, 5 To 25% by weight, 5 to 20% by weight, 5 to 15% by weight, 5 to 10% by weight, 5 to 7% by weight, 6.5 to 50% by weight,
  • the composition may include the strain of the genus Corynebacterium, and a culture thereof, in a dried form (for example, a dried product of the genus Corynebacterium strain and a culture thereof).
  • the dried product may be prepared by drying a strain of the genus Corynebacterium and a culture thereof, and the dried product may contain threonine.
  • the drying may be performed by one or more methods selected from the group consisting of vacuum drying, hot air drying, freeze drying, room temperature ventilation drying, thin film drying, and/or vacuum drying.
  • the composition comprises the strain of the genus Corynebacterium, a culture thereof, and threonine in a dried form (for example, a dried product of the'Corynebacterium genus strain and a culture thereof' containing threonine) can do.
  • a dried form for example, a dried product of the'Corynebacterium genus strain and a culture thereof' containing threonine
  • compositions may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet, capsule, or gel (eg, hydrogel), and may be in the form of a dispersant or a stable agent. Topics may additionally be included.
  • the composition according to an embodiment may be prepared by drying a strain of the genus Corynebacterium and a culture (fermented product) thereof, and the composition includes threonine and a strain of the genus Corynebacterium (for example, in the form of dead cells). Strain), and threonine and components of culture other than the strain.
  • the composition according to an example prepared by drying a strain of the genus Corynebacterium and a culture thereof may be in a granular form, which is more effective than (1) a gastrointestinal disease prevention or treatment effect and/or a purified powdered threonine.
  • the anti-helicobacter pylori efficacy may be excellent.
  • granule refers to a state in which powder is agglomerated to form 30 to 150 times larger particles
  • “granulation” refers to inducing by processing a process or the like so that the raw material becomes granular. can do.
  • the composition including the strain of the genus Corynebacterium, a culture thereof, and/or threonine, the composition may have a granular form.
  • the gastrointestinal disease may be caused by Helicobacter pylori infection.
  • the gastrointestinal disease may be one or more selected from the group consisting of gastritis, gastric ulcer, duodenal ulcer, peptic ulcer, and gastric cancer.
  • the gastritis refers to a state in which inflammation of the inner wall of the stomach has occurred, and the gastric ulcer may occur when the balance between a defense factor protecting the mucous membrane in the stomach and an attack factor causing damage to the mucous membrane is broken.
  • the attack factors that can be seen as the cause of gastric ulcer include stomach acid, various digestive enzymes, bile, drugs taken, alcohol, infection with Helicobacter pylori , nonsteroidal anti-inflammatory drugs, and smoking.
  • composition according to an example When used as a feed composition, it may be prepared in the form of a feed composition in which the composition according to an example is added to a commercial feed composition.
  • the feed in which the composition according to an example can be used is preferably a powder or pellet formulation, or a liquid formulation, but is not limited thereto.
  • the amount of the composition of the present application added to the feed does not require any particular limitation.
  • feed may mean any natural or artificial diet, one meal meal, etc., or a component of the one meal meal for animals to eat, ingest, and digest.
  • the kind of feed is not particularly limited, and feed commonly used in the art may be used.
  • Non-limiting examples of the feed include vegetable feeds such as grains, root fruits, food processing by-products, algae, fiber, pharmaceutical by-products, oils and fats, starches, meals or grain by-products; Animal feeds such as proteins, inorganic logistics, oils and fats, minerals, oils and fats, single-cell proteins, zooplanktons or foods. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the individual (animal) capable of feeding the feed containing the composition according to an example is not particularly limited, but may be mammals, fish, crustaceans and/or shellfish, for example, pigs, cows, horses, goats, deer, It can be sheep, chicken, duck, goose, turkey, dog, cat, rabbit, or fish.
  • the feed composition may further include excipients, diluents, and additives.
  • the feed composition includes ingredients that are effective for promoting animal growth, nutrients, nutritional supplements, ingredients that increase storage stability, coating ingredients, amino acids for disease prevention, vitamins, enzymes, non-protein nitrogen compounds.
  • the feed composition may additionally contain other nutrients within a range expected by a person skilled in the art.
  • Another aspect may provide a pharmaceutical composition for preventing or treating gastrointestinal diseases, including a strain of Corynebacterium sp., a culture thereof, and threonine.
  • Corynebacterium strains, cultures thereof, threonine, and/or gastrointestinal diseases included in the pharmaceutical composition for preventing or treating according to an example are as described for the feed composition for preventing or improving gastrointestinal diseases.
  • the pharmaceutical composition according to an example may further include an appropriate carrier, excipient, or diluent commonly used in the manufacture of a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical compositions are formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to a conventional method, respectively. Can be used.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oils.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders (powders), granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient in the composition such as starch, calcium carbonate, It is prepared by mixing sucrose, lactose, or gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include various excipients, such as humectants, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used for suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, etc. I can.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like may be used.
  • the pharmaceutical composition according to an example may be administered in a pharmaceutically effective amount, and in the present application, "a pharmaceutically effective amount” refers to treating or preventing a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or prevention
  • the effective dose level means the severity of the disease, the activity of the drug, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to the drug, the time of administration of the composition of the present application used, the route of administration and the rate of excretion. It can be determined according to the duration of treatment, factors including drugs used in combination or concurrent with the composition of the present application used, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to an example may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with another therapeutic agent, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent. And can be administered single or multiple. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to an example may be administered to a mammal at about 0.0001 to 100 mg/kg, specifically 0.001 to 10 mg/kg for a day.
  • the frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present application is not particularly limited thereto, but may be administered once a day or divided into several doses. The above dosage does not limit the scope of the present application in any way.
  • the pharmaceutical composition according to an example is not limited in the method of administration as long as it can reach the target tissue.
  • intraarticular injection, oral administration, arterial injection, intravenous injection or transdermal injection, and the like are included.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device capable of moving the active substance to target cells.
  • Another aspect may provide a food composition for preventing or improving gastrointestinal diseases, including a strain of Corynebacterium sp., a culture thereof, and threonine.
  • the strains of the genus Corynebacterium contained in the food composition for preventing or improving gastrointestinal diseases, cultures thereof, threonine, and/or gastrointestinal diseases are as described in the feed composition for preventing or improving gastrointestinal diseases.
  • the above foods are meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, vitamin complexes, health functions (Sex) There are foods and health foods, and all foods in the usual sense are included.
  • the health function is the same term as food for special health use (FoSHU).
  • the term “functional food” refers to medicine that is processed so that the bioregulatory function is effectively displayed.
  • the term “function (sex)” means obtaining useful effects for health purposes such as controlling nutrients or physiological effects on the structure and function of the human body.
  • the food product of the present application can be prepared by a method commonly used in the art, and during the production, raw materials and ingredients commonly added in the art may be added to prepare it.
  • the formulation of the food may be prepared without limitation as long as it is a formulation recognized as a food.
  • the food composition of the present application can be prepared in various forms, and unlike general drugs, it has the advantage of not having side effects that may occur when taking the drug for a long time using food as a raw material, and is excellent in portability. Food can be consumed as an adjuvant to improve the effect of preventing or improving gastric ulcers.
  • the health food refers to a food having an active health maintenance or promotion effect compared to a general food
  • a health supplement food refers to a food for health supplement purposes.
  • terms of health functional food, health food, and health supplement food may be used interchangeably.
  • the health functional food is a food prepared by adding a composition according to an egg example to food materials such as beverages, teas, spices, chewing gum, confectionery, or encapsulated, powdered, or suspension. It means bringing a specific effect, but unlike general drugs, it has the advantage of having no side effects that may occur when taking the drug for a long time using food as a raw material.
  • the food composition according to an example can be very usefully used because it is possible to ingest it on a daily basis, and thus high effects can be expected for the prevention or improvement of gastrointestinal diseases.
  • the food composition may further include a physiologically acceptable carrier, and the kind of carrier is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art may be used.
  • the food composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve smell, taste, vision, and the like.
  • vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, panthotenic acid, and the like may be included.
  • minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu), and chromium (Cr) may be included.
  • amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, and valine may be included.
  • the food composition includes preservatives (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.), disinfectants (bleaching and highly bleaching, sodium hypochlorite, etc.), antioxidants (butylhydroxyanisole (BHA), butylhydride, etc.) Oxytoleuene (BHT), etc.), coloring agent (tar color, etc.), coloring agent (sodium nitrite, sodium nitrite, etc.), bleach (sodium sulfite), seasoning (MSG sodium glutamate, etc.), sweetener (dulsin, cyclamate, saccharin, etc.) , Sodium, etc.), flavorings (vanillin, lactones, etc.), expanding agents (alum, D-potassium hydrogen stannate, etc.), reinforcing agents, emulsifying agents, thickening agents (thickening agents), coating agents, gum base agents, foam inhibitors, solvents, improving agents, etc. It
  • the composition according to an example may be added as it is or may be used with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the food composition of the present application may be added in an amount of 50 parts by weight or less, specifically 20 parts by weight or less, based on the food or beverage.
  • the content below the above range may be included, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • the food composition it may be used as a health drink composition, and in this case, it may contain various flavoring agents or natural carbohydrates, etc. as an additional component, like a normal beverage.
  • the natural carbohydrates described above include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; Polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin; It may be a sugar alcohol such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • Sweeteners include natural sweeteners such as taumatin and stevia extract; Synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the ratio of the natural carbohydrate may be generally about 0.01 to 0.04 g, specifically about 0.02 to 0.03 g per 100 mL of the health beverage composition of the present application.
  • health beverage compositions include various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, colorants, pectic acid, salts of pectic acid, alginic acid, salts of alginic acid, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, It may contain alcohol or a carbonation agent. In addition, it may contain flesh for the manufacture of natural fruit juice, fruit juice beverage, or vegetable beverage. These ingredients may be used independently or in combination. The ratio of these additives is not very important, but it is generally selected from 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the health beverage composition of the present application.
  • the food composition according to an example may include various weight percent if it can exhibit a preventive or improved effect of gastrointestinal diseases, but for example, the composition according to an example is 0.00001 to 100 weight percent, 0.01 to the total weight of the food composition. To 80% by weight, or 10 to 50% by weight, but is not limited thereto.
  • Genus Corynebacterium according to an example (Corynebacterium sp.) Strain, the culture thereof, and compositions comprising a threonine is a Helicobacter pylori, inflammation, oxidation induced by (Helicobacter pylori, H. pylori) growth inhibition, Helicobacter pylori It may be to prevent, treat, or ameliorate gastrointestinal diseases (eg, gastric ulcer) by inhibiting stress, blood vessel growth, and/or apoptosis.
  • gastrointestinal diseases eg, gastric ulcer
  • Corynebacterium sp. strain according to an example, a culture thereof, and a composition containing threonine promote mucus synthesis and secretion, promote tissue regeneration, inhibit gastric mucosa damage, promote tissue regeneration, inhibit oxidative stress, It may be to prevent, treat, or ameliorate gastrointestinal diseases by inhibiting gastric mucosal cell apoptosis and/or inflammation.
  • the strain of the genus Corynebacterium is contained in the composition according to an example; Whether the strain of the genus Corynebacterium is included as dead cells; Types of strains of the genus Corynebacterium; With or without culture; With or without threonine; And/or the strain of the genus Corynebacterium, it was confirmed that there is a difference in the prevention or treatment effect of (1) gastrointestinal diseases and/or (2) the efficacy of anti-helicobacter pylori, depending on whether or not a culture thereof and threonine are combined. It was confirmed that the composition according to the above showed the most excellent effect.
  • Another aspect provides a method for preventing, improving or treating gastrointestinal diseases comprising administering a composition (feed composition, food composition, or pharmaceutical composition) for the prevention, improvement, or treatment of the gastrointestinal disease to an individual (patient) can do.
  • Feed composition, food composition, pharmaceutical composition, and gastrointestinal diseases are as described above.
  • the method of preventing, improving, or treating gastrointestinal diseases further includes a step of identifying (selecting) an individual (patient) in need of prevention, improvement, or treatment of the gastrointestinal disease before the administering step.
  • “individual” may mean all animals including humans who have or are likely to develop gastrointestinal diseases.
  • the object subject to which the method for preventing or treating gastrointestinal diseases is applied may be mammals, including humans who have or may develop gastrointestinal diseases, for example, pigs, cows, horses, goats, deer, sheep, chickens , Duck, goose, turkey, dog, cat, and/or.
  • administration refers to introducing a composition for preventing, improving, or treating gastrointestinal diseases to a target individual by any suitable method, and the route of administration is oral or parenteral as long as it can reach the target tissue ( For example, intravenous, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal or topical application).
  • the prevention, improvement, or treatment method may be administering a feed composition, a food composition, or a pharmaceutical composition according to an example in a (pharmaceutically) effective amount.
  • the appropriate total daily use amount can be determined by treatment within the range of correct medical judgment, and can be administered once or divided into several times.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular individual (patient) is the specific composition, including the type and extent of the reaction to be achieved, whether other agents are used in some cases, the age, weight, general health status of the individual (patient), It can be applied differently depending on various factors including sex and diet, administration time, administration route and secretion rate of the composition, treatment period, drugs used with or concurrently with the specific composition, and similar factors well known in the medical field.
  • Another aspect may provide a composition for antibacterial against Helicobacter pylori , including a strain of Corynebacterium sp., a culture thereof, and threonine.
  • the strain of the genus Corynebacterium contained in the composition for antibacterial against Helicobacter pylori , a culture thereof, threonine, and/or gastrointestinal diseases are as described in the pharmaceutical composition for preventing or treating gastrointestinal diseases.
  • the antimicrobial effect against Helicobacter pylori may be synergistically excellent.
  • Another aspect can provide a composition for the prevention, improvement, or treatment of gastrointestinal diseases, including a strain of Corynebacterium sp., and a culture thereof, and the strain and culture include threonine It can be.
  • Another aspect may provide a composition for preparing an active ingredient for preventing, improving, or treating gastrointestinal diseases, including a strain of Corynebacterium sp. and a culture (fermented product) thereof, and the Corynebacterium
  • the genus strain or the culture (fermented product) may contain or contain threonine.
  • the composition for preparing an active ingredient for preventing or treating gastrointestinal diseases includes 0.1 to 5 parts by weight of the strain of Corynebacterium genus, 10 to 90 parts by weight of the fermentation product, and 10 to 80 parts by weight of the threonine based on the total weight of the composition. I can.
  • the composition for preparing an active ingredient for preventing or treating gastrointestinal diseases may further include calcium lignosulfonate in order to adjust the threonine content.
  • the calcium lignin sulfonate is 0.1 to 50% by weight, 0.1 to 30% by weight, 0.1 to 25% by weight, 0.1 to 20% by weight, 0.1 to 15% by weight, 0.1 to 10% by weight, 0.1 to 7 wt%, 1 to 50 wt%, 1 to 30 wt%, 1 to 25 wt%, 1 to 20 wt%, 1 to 15 wt%, 1 to 10 wt%, 1 to 7 wt%, 3 to 50 wt% %, 3 to 30% by weight, 3 to 25% by weight, 3 to 20% by weight, 3 to 15% by weight, 3 to 10% by weight, 3 to 7% by weight, 5 to 50% by weight, 5 to 30% by weight, 5 to 25 wt%, 5 to 20 wt%, 5 to 15 wt%, 5 to 10 wt%, 5 to
  • Another aspect may provide a pharmaceutical composition for preventing or treating gastrointestinal diseases including a composition for preparing an active ingredient for preventing or treating gastrointestinal diseases.
  • Another aspect may provide a food composition for preventing or improving gastrointestinal diseases, including a composition for preparing an active ingredient for preventing or treating gastrointestinal diseases.
  • Another aspect may provide a feed composition for preventing or improving gastrointestinal diseases, including a composition for preparing an active ingredient for preventing or treating gastrointestinal diseases.
  • Another aspect is a formulation for the treatment of gastrointestinal diseases comprising a composition for preparing an active ingredient for preventing or treating gastrointestinal diseases, including the granular Corynebacterium sp. strain and a culture (fermented product) thereof, as an active ingredient Provides.
  • the strain of the genus Corynebacterium and its fermentation products, gastrointestinal diseases, prevention, improvement, and treatment are as described above.
  • the term "formulation” is convenient for preparation, preservation or use, and has a therapeutic effect mainly by physical manipulation, such as grinding, mixing, kneading, leaching (worrying) or evaporation, without changing the nature of the drug. It refers to processing so that it can be fully exerted, and the products made by this are also called medicinal preparations (Chemical Daejeon, 2001. 5. 20., Sehwa Editorial Department).
  • Additives used when formulating to prepare the formulation that is, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, diluents or excipients are as described above, and solid formulations for oral administration and additives contained therein, oral Liquid formulations for administration and additives contained therein or formulations for parenteral administration and additives added thereto are as described above.
  • the formulation may be a solid formulation, a liquid formulation, or a fluid formulation, but is not limited thereto, and any formulation exhibiting an effect of preventing, treating and improving gastric ulcers may be applied without limitation.
  • the formulation is as described above.
  • Another aspect includes the step of drying a strain of Corynebacterium sp. and a culture thereof, (1) preventing, improving, or treating gastrointestinal diseases; And/or (2) Helicobacter pylori ( Helicobacter pylori ) It can provide a method for producing an active ingredient having an antibacterial effect.
  • the strain of the genus Corynebacterium and the culture thereof are as described above.
  • the drying may be performed by one or more methods selected from the group consisting of vacuum drying, hot air drying, freeze drying, room temperature ventilation drying, thin film drying, and/or vacuum drying.
  • the drying may be drying a composition in which threonine is separately added to a strain of the genus Corynebacterium and a culture thereof.
  • the method for preparing the active ingredient may further include adding threonine to the dried product prepared after the drying step.
  • composition according to the present application has been confirmed to be excellent in anti-Helicobacter pylori efficacy in cell experiments, gastric ulcer improvement efficacy in animal experiments, and gastric mucus synthesis efficacy, etc., as a pharmaceutical composition for preventing and treating gastrointestinal diseases, food or feed for gastrointestinal disease improvement It can be applied as a composition.
  • FIGS. 2A to 2C show the results of measuring the expression of inflammatory mediators when groups 1 to 8 are treated with RGM1 cells infected with 100 MOI for 6 hours using H. pylori strain.
  • Figure 2a shows the changes in the expression of Cox-2 mRNA in RGM1 cells infected with H. pylori strain according to the treatment of groups 1 to 8
  • Figure 2b is iNOS according to the treatment of groups 1 to 8 in RGM1 cells infected with the H. pylori strain.
  • 2C shows changes in the expression of phosphorylated NF- ⁇ B p65 proteins according to groups 1 to 8 treatment in RGM1 cells infected with H. pylori strain.
  • GAPDH and ⁇ -actin were used as internal controls for mRNA and protein, respectively.
  • N first row from left
  • Hp second column from left
  • Group 1 To 8 show the results in cells treated with the compositions of groups 1 to 8 to H. pylori infected RGM1 cells.
  • FIG. 3A shows changes in the expression of oxidative stress-related protein (HIF-1a) according to groups 1 to 8 treatment in RGM1 cells infected with H. pylori strain.
  • ⁇ -actin was used as an internal control.
  • Figure 3b shows the results of measuring the change in the concentration of active oxygen in the cells according to the treatment of groups 1 to 8 in RGM1 cells infected with H. pylori strain (DCF increase or decrease result).
  • Figure 4a shows the changes in the expression of HO-1 mRNA according to the treatment of groups 1 to 8 in RGM1 cells infected with H. pylori strain
  • Figure 4b is GST according to the treatment of groups 1 to 8 in RGM1 cells infected with H. pylori strain ( pi) and HO-1 protein expression changes. GAPDH and ⁇ -actin were used as internal controls.
  • 5A and 5B show the efficacy of inhibiting apoptosis according to groups 1 to 8 treatment in RGM1 cells infected with H. pylori strain.
  • Figure 5a shows the expression changes of Bax and Bcl-2 proteins according to groups 1 to 8 treatment in RGM1 cells infected with H. pylori strain, and ⁇ -actin was used as an internal control.
  • 5B shows changes in apoptosis (TUNEL staining results) according to groups 1 to 8 treatment in RGM1 cells infected with H. pylori strain.
  • FIGS. 6A and 6B show the results of changes in angiogenesis and mucosal proliferation growth factors according to groups 1 to 8 treatment in RGM1 cells infected with H. pylori strain.
  • Figure 6a shows the expression changes of TGF- ⁇ and VEGF proteins according to groups 1 to 8 treatment in RGM1 cells infected with H. pylori strain, and ⁇ -actin was used as an internal control.
  • 6B shows the change in expression of ⁇ -catenin protein according to groups 1 to 8 treatment in RGM1 cells infected with H. pylori strain, and Lamin B was used as an internal control.
  • groups 1-4 refer to animal experimental groups 1-4 in Table 5.
  • FIG. 7A and 7B show the efficacy of improving stress-related mucosal disease (SRMD) by administration of a composition according to an example in a WIRS model animal experimental group.
  • FIG. 7A shows a pathological picture of the stomach of each experimental group, and the pictures in the right two columns are displayed at x40 magnification.
  • FIG. 7B shows (A) gross lesion index (top left graph), (B) inflammation by administration of a composition according to an example in a WIRS model animal experimental group; Inflammation (pathologic score: upper right graph), (C) ulcer/erosion; Pathologic score (Ulcer/erosin; pathologic score: lower left graph), (D) regeneration; Regeneration (pathologic score: lower right graph) is shown.
  • SRMD stress-related mucosal disease
  • FIG. 8A to 8D show changes in inflammation, angiogenesis, and signal transduction by administration of a composition according to an example in a WIRS model animal test group.
  • Figure 8a shows the change in the expression of iNOS, TNF- ⁇ and IFN- ⁇ mRNA in the animal experimental group 1-4
  • Figure 8b shows the change in the expression of PDGF mRNA in the animal experimental group 1-4
  • Figure 8c is the animal experimental group 1-4 shows the protein expression change of p-I ⁇ B ⁇
  • FIG. 8D shows the protein change of p-ERK and p-JNK in the animal test group 1-4.
  • GAPDH and ⁇ -actin were used as internal controls for mRNA and protein, respectively.
  • FIG. 9A to 9C are results showing apoptosis and cell cycle changes by administration of a composition according to an example in a WIRS model animal test group.
  • FIG. 9A is a TUNEL analysis result showing the level of apoptosis in the SRMD region of the gastric mucosa in the animal experiment group 1-4
  • FIG. 9B is PARP-1, Bcl-2, Bax, Cleaved caspase-8, and Cleaved caspase- 3 shows the change in protein expression
  • FIG. 9C shows the change in protein expression of CDK4 and Cyclin D1.
  • ⁇ -actin was used as an internal control.
  • Figure 10 shows the mucin (Mucin) content in the gastric tissue of the animal experiment group 1-4.
  • FIG. 11 shows a pathological picture of the stomach of WIRS rats to which samples containing various weight percent threonine were administered.
  • the composition and content of Samples 1 to 5 of FIG. 11 are shown in Table 4.
  • Example 1 Composition and cell infection containing strains of the genus Corynebacterium
  • Example 1-1 Preparation of composition containing strains of the genus Corynebacterium
  • Corynebacterium sp. Anti-helicobacter, apoptosis inhibition and cytoprotective efficacy of the strain composition containing and the genus Corynebacterium Compositions of groups 1 to 8 were prepared in order to verify the difference in efficacy between strains.
  • Corynebacterium glutamicum C. glutamicum
  • Corynebacterium ammoniagenes C. ammoniagenes
  • Corynebacterium efficiens were used by CJ CheilJedang BIO R&D Center ( Blossom park), and the strains were each inoculated into threonine-producing broth, and cultured at 200 rpm for 48 hours at 35°C.
  • the components and contents of the broth for threonine production are shown in Table 1 below.
  • glucose 70g KH 2 PO 4 1g (NH 4 ) 2 SO 4 30g MgSO 4 7H 2 O 1g FeSO 4 7H 2 O 200mg MnSO 4 4H 2 O 100mg Biotin 1mg Yeast extract 2.5g Calcium-pantothenic acid 1mg Thiamine hydrochloride 1mg Gallium carbonate 30g pH 6.8
  • Group 1 contains the supernatant of fermentation broth prepared by culturing Corynebacterium glutamicum under the above conditions to remove cells by centrifugation
  • Group 2 is a buffer containing threonine at a concentration of 100 g/L ( Tris-HCl).
  • Groups 3 to 5 were prepared by centrifuging the fermentation broth prepared by culturing the strain under the above conditions to collect the cells, and suspending the collected cells in a buffer (Tris-HCl).
  • Groups 6 to 8 are fermentation broths obtained by culturing each strain under the above conditions, and includes each strain and a culture obtained by culturing each strain in the medium (in Table 2, it is described as'the supernatant of fermentation broth').
  • the compositions of groups 3 to 8 contain each strain at a concentration of 30 OD (wave length 562 nm), and include strains in the form of dead cells through an autoclave.
  • Groups 1 to 8 all contain threonine, and since there is a group containing threonine in each strain (including in the form of dead cells) or culture, the threonine content in the strain and/or culture was measured in groups 1 to 8 In addition, threonine (threonine produced through CJ BIO strain; purity >99%) was added so that the final threonine concentration of was 100 g/L.
  • Table 2 Components of each group are listed in Table 2 below.
  • the'supernatant of fermentation broth' of groups 1 and 6 means that the cells are removed from the culture prepared by culturing the'C. glutamicum strain' under the above conditions, and the supernatant of the fermentation broth of groups 7 and 8 is ' C. ammoniagenes strain' and'C . efficiens strain' means removing the cells from the culture prepared by culturing under the above conditions.
  • Groups 1-8 described in Examples 2 to 7 and FIGS. 1 to 6B refer to groups 1-8 of Table 2.
  • Example 1-2 Rat stomach mucosal cell line culture
  • RGM1 cells the gastric mucosa cell line of normal rats, were cultured in a mixed medium containing 10% fetal bovine serum, DMEM (Dulbecco's modified essential medium) and Ham F12 in a 37°C cell incubator (95% air, 5% CO 2 ).
  • the RGM1 cell line was established by Professor Matsui of Tsukuba University in Japan, and was used after consent.
  • Example 1-3 H. pylori Strain and cell infection
  • H. pylori Helicobacter pylori
  • H. pylori strain cytotoxin-associated gene A [CagA] + strain, NCTC 11637
  • ATCC American Type Culture Collection
  • RGM1 cells were infected with H. pylori strain for 6 hours at a multiplicity of infection (MOI) of 100:1 (hereinafter, 100 MOI).
  • Example 2 in vitro Anti-helicobacter efficacy assay of the strain composition containing Corynebacterium genus in
  • Agar diffusion assay was used to measure the growth inhibitory effect of H. pylori , that is, anti-helicobacter efficacy, in blood agar plates. Specifically, TSA (Trypticase Soy Agar) 40g/L was dissolved in purified water and then autoclaved (121°C, 20min). After cooling to about 50°C, 5% sheep blood was added, followed by addition of antibiotics ⁇ trimethoprim(5mg/L), polymyxin B(2500U/L), vancomycin(10mg/L) ⁇ . 20 to 25 ml of the medium was dispensed on a sterilized plate and stored at 4°C.
  • TSA Trapticase Soy Agar
  • Example 3 Assay for changes in inflammation mediator and NF- ⁇ B transcribing it by composition containing strains of the genus Corynebacterium
  • Example 1-3 RGM1 cells infected with H. pylori (100 MOI) were treated with 40 ⁇ l of the compositions of groups 1 to 8 diluted to 1/40 concentration for 6 hours, respectively. Thereafter, in the RGM1 cells treated with the composition, the expression level of Cox-2 mRNA, an inflammation mediator, was confirmed through RT-PCT (Reverse transcription PCR) analysis, and the results are shown in FIG. 2A.
  • RT-PCT Reverse transcription PCR
  • the base sequence of each primer used in the PCR analysis is shown in Table 3 below, and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an internal standard.
  • cell lysis buffer cell lysis buffer, 150mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 50mM tris-HCl, pH 7.4, 25
  • Protein lysate was prepared by dissolving with mM NaF, 20mM ethyleneglycol-bis ( ⁇ N'-tetraacetic acid, 1mM dithiothreitol, 1mM Na 3 VO 4 , Protease Inhibitor Cocktail tablet [Boehringer, Manneim, Germany]).
  • the developed protein was transferred to a PVDF membrane (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI), and each of the primary and secondary antibodies was carried out. After reacting with, it was analyzed using a chemoluminescence system.
  • the mRNA of Cox-2 was significantly increased in RGM1 cells ( Hp ) infected with H. pylori compared to normal RGM1 cells (N), and the mRNA expression of Cox-2 was increased by H. pylori infection. It was most significantly reduced by the addition of the composition of this group 6.
  • Example 4 in vitro Efficacy of attenuating oxidative stress by the strain composition containing Corynebacterium in
  • Example 3 In the same manner as in Example 1-3, RGM1 cells infected with H. pylori (100 MOI) were treated with 40 ⁇ l of the compositions of groups 1 to 8 diluted to 1/40 concentration for 6 hours, respectively. Thereafter, Western blot was performed in a manner similar to that of Example 3, and the change in the expression level of HIF-1 ⁇ related to oxidative stress was measured, and the results are shown in FIG. 3A.
  • HIF-1a was significantly increased by Helicobacter pylori infection, and HIF-1a expression was significantly decreased in groups 6 and 7.
  • DCF-DA (2',7'-dichlorofluorescein diacetate), which is a non-fluorescent substance, is oxidized by ROS to produce green fluorescence in the presence of peroxides in the cell. The amount of can be directly quantified.
  • RGM-1 cells H. pylori- free RGM1 cells; or H.
  • RGM1 cells (Example 1-3) in 5 ⁇ 10 5 cells/well in a 24-well plate) ) was dispensed and cultured overnight in a 37° C. cell incubator (95% air, 5% CO 2 ), and then the compositions of groups 1 to 8 were treated for a certain time. After washing the cells with DMEM, 10 ⁇ g/ml DCF-DA (2',7'-dichlorofluorescein diacetate, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO) was added to the medium, followed by incubation in an incubator for 30 minutes. After incubation, cells washed with PBS at 4° C. were observed and photographed under a fluorescence microscope, and the results are shown in FIG. 3B.
  • DCF-DA 2',7'-dichlorofluorescein diacetate
  • the fluorescence intensity of DCF-DA increased after Helicobacter pylori infection was statistically significantly decreased in groups 1, 3, 6, and 8 treatment groups (P ⁇ 0.05), and that in the group 6 treatment group. It was confirmed that the degree of reduction was the greatest (P ⁇ 0.01). From the above results, it was found that the composition according to an example could immediately cope with oxidative stress or hypoxia response caused by the Helicobacter strain.
  • Example 5 in vitro Helicobacter pylori-related antioxidant-mediated cytoprotective efficacy assay by strain composition containing Corynebacterium genus in
  • Example 1-3 RGM1 cells infected with H. pylori (100 MOI) were treated with 40 ⁇ l of the compositions of groups 1 to 8 diluted to 1/40 concentration for 6 hours, respectively. Thereafter, the expression change of HO-1 mRNA of antioxidant function, which is a representative cytoprotective factor, was analyzed by the method (PCR) according to Example 3 and is shown in FIG. 4A, and HO-1 and GST (glutathione-s- Transferase (pi)) protein expression changes were analyzed similarly to the method according to Example 3 (Western blot analysis) and shown in FIG. 4B.
  • composition according to an example exhibits an antioxidant activity and cell protection effect mainly based on the HO-1 response to the Helicobacter strain.
  • Example 6 in vitro Inhibitory efficacy of Helicobacter pylori-associated apoptosis by strain composition containing Corynebacterium genus in
  • Example 1-3 RGM1 cells infected with H. pylori (100 MOI) were treated with 40 ⁇ l of the compositions of groups 1 to 8 diluted to 1/40 concentration for 6 hours, respectively. Thereafter, similar to the method of Example 3, the expression levels of Bcl-2 and Bax were confirmed through Western blot, and the results are shown in FIG. 5A, and apoptosis (cell death) was analyzed by TUNEL staining, and the results are shown in FIG. 5B. Shown in. Specifically, for TUNEL staining, cells were dispensed into a Lab-Tek chamber slide at 1 ⁇ 10 5 cells/chamber, and then cultured in a 37°C cell incubator (95% air, 5% CO 2 ).
  • each reagent was treated for a certain period of time, and then an apoptosis detection kit (Oncogene Research Products, Cambridge, MA) was used to perform the experiment according to the manufacturer's experimental method.
  • the culture medium was removed, washed three times with a PBS solution, and then 4% paraformaldehyde (PFA) was added and fixed at room temperature for 20 minutes.
  • PFA paraformaldehyde
  • 0.1% Triton X-100 was treated at 4°C for 5 minutes, and TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) and nucleotide mixture were mixed for 60 minutes after light blocking at 37°C. Reacted. After washing with PBS, apoptosis was observed under a fluorescence microscope.
  • Helicobacter pylori infection is known to cause mucosal damage and ulcers due to a significant increase in apoptosis, and statistically significant increase in apoptosis was observed by Helicobacter pylori infection in TUNEL staining results as shown in FIG. 5B. (P ⁇ 0.01), however, apoptosis was remarkably reduced in groups 6 to 8, and among them, apoptosis was most decreased in the group 6 treatment group.
  • Example 7 In vitro assay for changes in Helicobacter pylori-associated cell growth, blood vessel growth, and proliferation factors by the composition of the strains containing Corynebacterium genus
  • Example 1-3 RGM1 cells infected with H. pylori (100 MOI) were treated with 40 ⁇ l of the compositions of groups 1 to 8 diluted to 1/40 concentration for 6 hours, respectively. Thereafter, similar to the method of Example 3, changes in TGF- ⁇ and VEGF were analyzed by Western blot, and the results are shown in FIG. 6A.
  • nuclear transfer of ⁇ -catenin was confirmed by Western blot using the nuclear fraction in cells infected with Helicobacter pylori, and the results are shown in FIG. 6B. As shown in FIG. 6B, it was confirmed that the nuclear transfer of ⁇ -catenin increased by infection with Helicobacter pylori can be significantly inhibited by treatment of group 6.
  • Sample 1 Fermentation broth prepared by inoculating C. glutamicum wild-type strain (CJ CheilJedang BIO R&D Center (Blossom park)) in threonine production broth (Table 1) and culturing for 48 hours at 35°C and 200 rpm was purified and crystallized to prepare Sample 1. Sample 1 contained at least 99% by weight of purified threonine in powder form.
  • Sample 2 was prepared by directly drying the fermentation broth (including C. glutamicum ) obtained by culturing C. glutamicum in a medium for threonine production (hot air drying at 60 to 70° C.).
  • C. glutamicum a medium for threonine production
  • calcium-lignosulfonate Alkadin industrial Co., Shanghai, Chana
  • C. glutamicum included was dried (hot air drying at 60 to 70°C)
  • samples 3 to 5 were prepared.
  • Samples 2 to 5 contained C. glutamicum in the form of dead cells through hot air drying.
  • Samples 2 to 5 were prepared in the form of granules having a particle size of about 200 to 1000 ⁇ m. Components and contents of Samples 1 to 5 are listed in Table 4. In Table 4, Thr (% by weight), lignin calcium sulfonate (% by weight), and the remaining fermented product components (including C. glutamicum cells) (% by weight) mean the weight% in the dried product prepared by drying the fermentation broth. And, the fermented product of the dried product includes the C. glutamicum strain. In addition, the content of the C. glutamicum strain contained in the fermentation is shown in Table 4.
  • WIRS Water immersion-restraint stress model preparation for stress-related mucosal disease
  • a total of 110 SD rats were purchased from Charles River (Osaka, Japan) and stored in animal facilities. Experimental animals were handled in accredited animal facilities according to AAALAC International Animal Care Policies. Animals were fasted 24 hours before exposure to WIRS, and water was allowed free intake. Ten rats from each group were placed in a cage for WIRS and soaked in water for 6 hours.
  • samples 1 to 5 prepared in Example 8 were orally administered to rats so that the same threonine was administered (0.15 wt%/diet), and after applying WIRS for 6 hours, the animals were sacrificed and the stomach was removed. And, by removing the incision and the contents, a picture of the inner surface of the stomach was taken, and this is shown in FIG. 11. As shown in FIG. 11, as a result of visually examining the stomach tissue of the rat, gastric bleeding occurred in the WIRS-induced group (the second row in FIG. 11), and the degree of gastric bleeding in the order of Sample 1 ⁇ Sample 5 ⁇ Sample 4 ⁇ Sample 3 or Sample 2 It was confirmed that was decreased (excellent gastric ulcer treatment effect).
  • Animal experimental groups 1-4 described in Examples 10 to 12 below refer to animal experimental groups 1-4 in Table 5, and groups 1-4 in Figs. 7A to 10 refer to animal experimental groups 1-4 in Table 5. it means.
  • the stomach of the rat sacrificed in Example 9 was incised, opened according to a larger curvature, and then washed with a cold PBS solution. After determining the number and size of erosions or ulcers through enlarged photographs, half were dissected for anatomical observation.
  • the excised stomach was spread over a plastic sheet, fixed in 10% buffered formalin for 4 hours, used to make a paraffin tissue slide, and the other half was stored in a liquid nitrogen tank for molecular biology observation.
  • mucosal homogenate was mixed and stored in the same animal test group.
  • FIG. 7a Observing the sample with the naked eye using a microscope (Fig. 7a), lesion scores, inflammation in the control group and each experimental group (animal experiment group 1-4); Pathologic score, ulcer/erosion; Pathological score, regeneration; The pathological score was calculated and shown in FIG. 7B.
  • FIG. 7A significant occurrence of SRMD such as erosion, bleeding, and ulcer was observed in rats of all animal test group 2, but SRMD was significantly improved in animal test group 3 or animal test group 4.
  • Fig. 7A significant occurrence of SRMD such as erosion, bleeding, and ulcer was observed in rats of all animal test group 2, but SRMD was significantly improved in animal test group 3 or animal test group 4.
  • pathologic score 7B gross lesion index, inflammation; Inflammation (pathologic score), ulcer/erosion; Pathologic score (Ulcer/erosin; pathologic score), regeneration;
  • the pathologic score (Regeneration; pathologic score) was significantly improved (p ⁇ 0.05) in the animal experimental groups 3 and 4, and in particular, the lesion score in the animal experimental group 4 was significantly lower than that in the animal experimental group 3, and regeneration; The pathological score was significantly improved compared to the animal test group 3.
  • SRMD is pathophysiologically associated with ischemic-reperfusion injury
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • dNTP deoxynucleotide triphosphate
  • protein levels of p-I ⁇ B ⁇ , p-ERK, and p-JNK were measured in each of the animal experimental groups 1-4, and are shown in FIGS. 8C and 8D.
  • the collected gastric mucosa was 2mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.5mM EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid), 300mM sucrose and 2mM. It was homogenized with a tissue homogenator in ice-cold 20mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF).
  • PVDF polyvinylidene
  • ECL detection kit (ECL detection kit, Amersham Biosciences Korea, Seoul, Korea) was used to detect immune complexes, and the X-ray film was irradiated automatically.
  • Antibodies used for Western blot are as follows. ⁇ -actin, iNOS (nitric oxide synthase), COX-2 (cyclooxygenase), P-JNK (phosphor-JNK), P-ERK (phosphor-ERK), Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), Bax (B -cell lymphoma-2-associated X-protein), and cyclin D1 antibody were purchased from Santa Cruz Biotechnolgy (Santa Cruz, CA).
  • p-I ⁇ B ⁇ phosphorylated inhibitor of kappa B alpha
  • p-STAT3 phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3
  • PARP poly(ADP-ribose) polymerase
  • CDK4 cyclin-dependent kinase 4
  • CDK2 cyclin dependent kinase 2
  • mRNA expression of iNOS, TNF- ⁇ , and interferon gamma was significantly increased in Animal Experimental Group 2 (WIRS-induced SRMD), but increased inflammation mediators (iNOS, TNF- ⁇ ) , IFN- ⁇ ) was significantly decreased in the animal experimental group 3 or the animal experimental group 4 (P ⁇ 0.01 or P ⁇ 0.05, Fig.8a), and the expression of TNF- ⁇ and iFN- ⁇ was especially in the animal experimental group 4 It was significantly decreased than 3 (P ⁇ 0.05, Fig. 8A).
  • the expression of PDGF an angiogenic growth factor, was significantly increased in the animal test group 2, but decreased significantly in the animal test group 3 or 4 (P ⁇ 0.01, FIG. 8b), especially in the animal test group 4 The degree of reduction was higher at.
  • Fig. 8c As shown in Fig. 8c, as a result of measuring the expression level of p-I ⁇ B ⁇ at the protein level, the expression of p-I ⁇ B ⁇ was significantly reduced by WIRS in Animal Experiment Group 2, and the expression of p-I ⁇ B ⁇ was decreased by NF- ⁇ B. It is associated with transcriptional activation. On the other hand, the expression of p-I ⁇ B ⁇ decreased significantly in the animal test group 4 (P ⁇ 0.01, Fig. 8c), and the expression of p-I ⁇ B ⁇ significantly increased in the animal test group 3 (P ⁇ 0.01, Fig. 8c), Increasing the expression of p-I ⁇ B ⁇ causes redox inhibition of NF-kB.
  • SRMD causing erosion or ulceration shows increased apoptosis, that is, apoptosis in the corresponding region, so apoptosis on the gastric mucosa according to the animal test group was measured.
  • apoptosis was visualized using the TdT FragEL DNA fragmentation detection kit (TdT FragEL DNA fragmentation detection kit, Oncogene Research Products, Cambridge, MA) and the TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling) method.
  • TUNEL-immunostained section terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL)-immunostained section
  • AI apoptosis index
  • apoptosis (apoptosis) was significantly increased in the animal test group 2 than in the animal test group 1, and the increased level of apoptosis was significantly decreased in the animal test group 3 and the animal test group 4 compared to the animal test group 2 ( P ⁇ 0.01, Fig. 9a), was observed at a significantly lower level in the animal test group 4 compared to the animal test group 3 (P ⁇ 0.01, Fig. 9a).
  • the activities of the cell cycle-related genes CDK4 and Cyclin D1 were confirmed at the protein level by the method according to Example 11, and the results are shown in FIG. 9C.
  • the expression of CDK4 and Cyclin D1 was significantly increased in the animal test group 2 (P ⁇ 0.01), and the increased expression of CDK4 and Cyclin D1 was significantly decreased in the animal test groups 3 and 4.
  • the expression of CDK4 and Cyclin D1 was significantly lower in the animal test group 4 than in the animal test group 3 (Fig. 9c, P ⁇ 0.01 ⁇ 0.05).
  • Examples 8 to 11 are expressed as mean ⁇ SD. Data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA), and statistical significance between groups was determined by Duncan's multiple range test. Statistical significance converged to P ⁇ 0.05.

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Abstract

본 출원은 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는 위장질환 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 출원에 따른 조성물은 세포실험에서 항 헬리코박터 파일로리 효능 및 동물실험에서 위장질환 개선 효능, 위 점액 합성 효능 등이 우수한 것으로 확인된 바, 위장질환 예방, 또는 치료용 약학 조성물, 위궤양 예방 또는 개선용 식품, 또는 사료용 조성물로 적용될 수 있다.

Description

코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물을 포함하는 위장질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물
본 출원은 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는 위장질환 예방, 치료, 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
위병변에 있어 위궤양은 가장 큰 발병률을 차지하고 있으며, 전 축종에서 세계공통적으로 발병하고 있다. 위궤양의 발병률은 축산산업의 발달과 함께 증가하고 있으며, 식욕감소에 따른 성장률 하락과 함께, 고통을 동반한 증상으로 동물복지적인 측면에서 위궤양 발생 방지에 대한 노력이 강화되고 있다.
트레오닌(Threonine, Thr)은 장상피 보호 물질인 뮤신(mucine)을 구성하는 주요 아미노산(Amino acid, AA)이다. 뮤신 단백질은 단백질의 흡수를 촉진함과 동시에, 위액과 같은 강산성의 소화액으로부터 소화기관을 보호하여 장 건강유지를 위해 중요한 역할을 한다. 실제 사료내 Thr 처리가 새끼 돼지(piglet)에 있어 뮤신 합성을 도와 장 건강을 개선시키는 것으로 보고되고 있다(비특허문헌 1).
사료 또는 식품용 Thr의 생산은 미생물에 의한 발효방법에 의해 생산되며, 이때 주로 사용되는 미생물의 종류로는 대장균(Escherichia coli, E. coli)과 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum, C. glutamicum) 등이 있다. 동일한 AA를 생산함에도 불구하고, 이 두 균주는 각각 그람음성균과 그람양성균으로 구분된다. 그람음성균과 그람양성균 모두 세포벽은 펩티도글리칸(peptidoglycan, PG)으로 이루어져 있다. 하지만 그람음성균의 경우 PG 이외에 지방단백질(lipoprotein), 단백질(protein)로 이뤄진 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)층이 추가로 존재하는데, 이 LPS층에는 체성항원(O항원)인 Lipid A가 있어 독성을 나타내는 특성이 있다. 따라서, 제약업계에서는 발열성(pyrogenicity), 치명적(lethality), 슈워츠먼 반응성(Schwartzman reactivity), 보조제 활성도(adjuvant activity) 및 대식세포 활성(macrophage activation)과 같은 유해한 생물학적 활성으로 비경구제에서 내독소를 제거하는 것이 필수적이다(비특허문헌 2).
최근 사료첨가물의 경제적인 효용성에 의한 고도정제과정의 단순화(또는 생략)에 의한 과립형(granule type)의 사료용 아미노산의 생산은 필연적으로 발효에 사용된 박테리아가 사균(死菌, heat killed) 형태로 제품에 혼입된다. 몇몇 연구는 대표적인 그람양성균인 유산균(Lactic acid bacteria) 사균체가 산과 열에 대한 강한 내성으로 환경에 안정적이며, 고도 농축이 가능하여 취급 용이한 점 그리고 장내 정착한 유익균의 먹이로 이용되어 유산균 특유의 면역강화 활성을 증강시키는 것으로 보고되고 있다(비특허문헌 3).
이러한 배경 하에, 본 출원자들은 위장질환의 예방 및 치료에 효과가 있는 약학적 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는 조성물이 위장질환의 예방, 치료 및 개선에 효과가 있음을 확인하고 본 출원을 완성하였다.
(비특허문헌 1) Law G. (2000) Threonine requirement and the effect of threonine on gut mucin characteristics in piglets receiving intragastric nutrition. Master thesis of university of Alberta. 1-143.
(비특허문헌 2) Miyamoto T., Okono S. and Kasai N (2009) Inactivation of Escherichia coli endotoxin by soft hydrothermal processing. Applied and Environmental Microbiology, 75(15), 5058-5063.
(비특허문헌 3) Lee I.H. (2018) 동물용 항균제와 대체제를 둘러싼 최신동향. Pig & Consulting, 4, 70-73.
본 출원은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는, 위장질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 출원은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는, 위장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 출원은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는, 위장질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 출원은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는, 헬리코박터 파일로리에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
일 양상은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는, 위장질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 출원에서, "예방"이란 일 예에 따른 조성물의 투여에 의해 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 일 예에 따른 조성물의 투여에 의해 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란, 일 예에 따른 조성물의 투여로 질환이 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 상기 질환은 위장 질환을 의미할 수 있다.
일 양상은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는, 위장질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공할 수 있다.
본 출원에서, "코리네박테리움 속(Corynebacterium sp., Coryne sp.) 균주"는 모든 코리네박테리움 속 균주를 포함할 수 있다. 코리네박테리움 속 균주는 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris), 및/또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스, 또는 이의 조합(코리네박테리움 글루타미쿰 및 코리네박테리움 암모니아게네스)일 수 있다.
일 예에서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 트레오닌 생산능이 있는 것일 수 있다. 본 출원에서, 트레오닌 생산능이 있다는 것은 해당 미생물이 배지에서 배양될 때 미생물 내 및/또는 상기 배지에 트레오닌을 생산 및 축적하는 능력을 나타내는 것을 의미한다.
일 예에 따른 위장질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물이 코리네박테리움 글루타미쿰을 포함하는 경우, 코리네박테리움 글루타미쿰 외의 다른 종류의 코리네박테리움 속 균주(예를 들면, 코리네박테리움 이피시엔스)를 포함하는 조성물 보다 (1) 위장질환의 예방, 개선, 또는 치료 효과 및/또는 (2) 항헬리코박터 파일로리 효능이 우수할 수 있다.
일 예에 따른 위장질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물이 코리네박테리움 암모니아게네스를 포함하는 경우, 코리네박테리움 암모니아게네스 외의 다른 종류의 코리네박테리움 속 균주(예를 들면, 코리네박테리움 이피시엔스)를 포함하는 조성물 보다 (1) 위장질환의 예방, 개선, 또는 치료 효과 및/또는 (2) 항헬리코박터 파일로리 효능이 우수할 수 있다.
일 예에 따른 위장질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물이 코리네박테리움 글루타미쿰 및 코리네박테리움 암모니아게네스를 포함하는 경우, 코리네박테리움 글루타미쿰 및 코리네박테리움 암모니아게네스 외의 다른 종류의 코리네박테리움 속 균주(예를 들면, 코리네박테리움 이피시엔스)를 포함하는 조성물 보다 (1) 위장질환의 예방, 개선, 또는 치료 효과 및/또는 (2) 항헬리코박터 파일로리 효능이 우수할 수 있다.
일 예에서, 상기 조성물이 항헬리코박터 파일로리 효능이 우수하다는 것은 헬리코박터 파일로리 균주에 대해 항균 활성이 우수하거나 헬리코박터 파일로리에 의해 감염된 세포(예를 들면, 위 점막 세포)의 세포사멸을 방지하는 활성이 우수한 것을 의미할 수 있다.
상기 코리네박테리움 속 균주는 배양액 중에 배양 배지를 제거하고 농축된 균체를 의미할 수 있으며, 배양물로부터 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 및/또는 여과과정을 거칠 수 있다.
일 예에서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 사균체의 형태로 포함될 수 있다. 본 출원에서, "사균체"란 생균의 반대되는 개념으로서 발효를 통해 얻어진 생균과 대사산물들을 열처리 등에 의해 균의 성장이 일어나지 못하도록 한 형태를 의미한다. 사균체는 세포질(cytoplasm), 세포벽(cell wall), 박테리오신(bacteriocin) 등의 항균활성 물질, 다당류(polysaccharide), 및/또는 유기산 등을 포함할 수 있다.
일 예에 따라 사균체를 포함하는 조성물은 생균을 포함하는 조성물 보다 하기의 (1) 내지 (6)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 특징을 가질 수 있다.
(1) 내산성 우수;
(2) 내열성 우수;
(2) 고농도로 농축이 가능;
(4) 안정성 우수;
(5) 취급 및 보관 용이; 및
(6) 장내 유익균의 먹이로 이용 가능.
상기 코리네박테리움 속 균주는 틴들 및/또는 열처리에 의하여 사균화될 수 있다. 일 예에서 상기 코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물을 멸균한 배양액은 균주의 사균체를 포함한다. 예를 들면, 상기 열처리는 60 내지 130℃의 온도에서 3 내지 30분 동안 진행되는 것일 수 있다. 또한, 상기 열처리는 1 회 내지 10 회의 초고온살균(ultra high temperature sterilization) 오토클레이브(autoclave), 및/또는 열풍건조로 진행될 수 있다. 상기 초고온살균은 110℃ 내지 130℃의 온도에서 3.0 내지 10.0초 동안 진행되는 것일 수 있으며, 예를 들면, 100℃에서 1.0초 내지 10초 동안 2 회, 121℃에서 1.0 내지 10.0초 동안 1 회 진행되는 것일 수 있고, 상기 오토클레이브는 120 내지 125℃, 또는 121℃에서 10분 내지 30분, 15분 내지 25분, 또는 20분 동안 수행하는 것일 수 있으며, 상기 열풍건조는 60 내지 70℃의 온도에서 수행되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 코리네박테리움 속 균주의 사균체, 코리네박테리움 속 균주의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는 조성물이 인비트로 및/또는 인비보 상에서 (1) 위장질환의 예방 또는 치료 효과 및/또는 (2) 항헬리코박터 파일로리 효과가 우수한 것을 확인하였다.
일 예에 따른 조성물은 상기 코리네박테리움 속 균주(또는 균주의 사균체)를 20 내지 40 OD(wave length 560 내지 565nm), 25 내지 35OD(wave length 560 내지 565nm), 또는 30OD 농도(wave length 560 내지 565nm)로 포함할 수 있다.
일 예에 따른 조성물은 상기 코리네박테리움 속 균주(또는 균주의 사균체)를 20 내지 40 OD(wave length 560 내지 565nm), 25 내지 35OD(wave length 560 내지 565nm), 또는 30OD 농도(wave length 560 내지 565nm)로 1 내지 100g/L, 5 내지 100g/L, 10 내지 100g/L, 15 내지 100g/L, 20 내지 100g/L, 21 내지 100g/L, 1 내지 80g/L, 5 내지 80g/L, 10 내지 80g/L, 15 내지 80g/L, 20 내지 80g/L, 21 내지 80g/L, 1 내지 60g/L, 5 내지 60g/L, 10 내지 60g/L, 15 내지 60g/L, 20 내지 60g/L, 21 내지 60g/L, 1 내지 50g/L, 5 내지 50g/L, 10 내지 50g/L, 15 내지 50g/L, 20 내지 50g/L, 21 내지 50g/L, 1 내지 30g/L, 5 내지 30g/L, 10 내지 30g/L, 15 내지 30g/L, 20 내지 30g/L, 21 내지 30g/L, 1 내지 25g/L, 5 내지 25g/L, 10 내지 25g/L, 15 내지 25g/L, 20 내지 25g/L, 또는 21 내지 25g/L씩 포함할 수 있다.
일 예에 따른 조성물은 상기 코리네박테리움 속 균주(또는 균주의 사균체)를 1 내지 100g/L, 5 내지 100g/L, 10 내지 100g/L, 15 내지 100g/L, 20 내지 100g/L, 21 내지 100g/L, 1 내지 80g/L, 5 내지 80g/L, 10 내지 80g/L, 15 내지 80g/L, 20 내지 80g/L, 21 내지 80g/L, 1 내지 60g/L, 5 내지 60g/L, 10 내지 60g/L, 15 내지 60g/L, 20 내지 60g/L, 21 내지 60g/L, 1 내지 50g/L, 5 내지 50g/L, 10 내지 50g/L, 15 내지 50g/L, 20 내지 50g/L, 21 내지 50g/L, 1 내지 30g/L, 5 내지 30g/L, 10 내지 30g/L, 15 내지 30g/L, 20 내지 30g/L, 21 내지 30g/L, 1 내지 25g/L, 5 내지 25g/L, 10 내지 25g/L, 15 내지 25g/L, 20 내지 25g/L, 또는 21 내지 25g/L 농도로 포함할 수 있다.
일 예에 따른 조성물은 상기 코리네박테리움 속 균주(또는 균주의 사균체)를 0.1 내지 10중량%, 0.1 내지 8중량%, 0.1 내지 5중량%, 0.1 내지 4중량, 0.1 내지 3.5중량, 0.1 내지 3중량, 0.1 내지 1중량, 1 내지 10중량%, 1 내지 8중량%, 1 내지 5중량%, 1 내지 4중량, 1 내지 3.5중량%, 1 내지 3중량, 2 내지 10중량%, 2 내지 8중량%, 2 내지 5중량%, 2 내지 4중량, 2 내지 3.5 중량%, 2 내지 3중량, 3 내지 10중량%, 3 내지 8중량%, 3 내지 5중량%, 3 내지 4중량, 3 내지 3.5 중량%, 3.5 내지 10중량%, 3.5 내지 8중량%, 3.5 내지 5중량%, 또는 3.5 내지 4중량%의 함량으로 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 상기 균주의 배양물에 포함된 것일 수 있다.
상기 "배양물'은 상기 코리네박테리움 속 균주를 배양한 다음 수득한 산물을 의미하고, 발효물을 포함할 수 있다. 일 예에서 상기 배양물은 코리네박테리움 속 균주를 배지에서 배양한 발효물일 수 있다. 상기 "발효물"은 미생물을 이용한 유기물질의 효소적 또는 대사적 분해의 결과물을 의미한다. 본 출원에서, "발효"는 미생물을 이용한 유기물질의 효소적 또는 대사적 분해를 포함하는 모든 활성 또는 과정 중 부패 반응이 아닌 것을 의미할 수 있다.
상기 배양물(또는 발효물)은 코리네박테리움 속 균주의 전체 배양물, 이의 희석액, 농축물, 건조물, 동결건조물, 파쇄물, 및/또는 분획물 등이 될 수 있으며, 상기 농축물은 상기 배양물을 원심분리 또는 증발시켜 수득할 수 있으며, 상기 건조물을 상기 배양물을 건조기 등을 이용하여 건조하여 수득할 수 있으며, 상기 동결건조물은 상기 배양물을 동결건조기 등을 이용하여 동결건조하여 수득할 수 있으며, 파쇄물은 상기 균주 또는 배양물을 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득할 수 있으며, 상기 분획물은 상기 배양물, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득할 수 있다.
상기 배양물 또는 발효물은 고상(고체, 예를 들면 건조물), 액상(액체), 또는 유동상일 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 배양물은 코리네박테리움 속 균주를 일정기간 배양하여 얻은 배양된 균주, 이의 대사물, 및/또는 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다.
일 예에서, 상기 배양물은 코리네박테리움 속 균주를 배지에서 배양한 발효물에서 균주(균체) 및/또는 트레오닌을 제외한 나머지 성분을 의미하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 배양물은 코리네박테리움 속 균주가 제거 또는 제거되지 않은 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 배양물은 코리네박테리움 속 균주를 배지에서 배양한 배양액에서 균주를 제거한 배양액(또는 배양물)일 수 있다. 상기 균주를 제거한 배양액(또는 배양물)은 무세포(cell free) 배양액(또는 배양물)이거나 사균체를 포함하는 배양액일 수 있고 예를 들면, 여과, 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액), 및/또는 사균체를 포함하는 배양액(또는 배양액의 건조물)일 수 있다.
일 예에 따른 조성물은 상기 배양물(또는 발효물)을 1 내지 80중량%, 5 내지 80중량%, 10 내지 80중량%, 15 내지 80중량%, 20 내지 80중량%, 23 내지 80중량%, 25 내지 80중량%, 1 내지 60중량%, 5 내지 60중량%, 10 내지 60중량%, 15 내지 60중량%, 20 내지 60중량%, 23 내지 60중량%, 25 내지 60중량%, 1 내지 50중량%, 5 내지 50중량%, 10 내지 50중량%, 15 내지 50중량%, 20 내지 50중량%, 23 내지 50중량%, 25 내지 50중량%, 1 내지 40중량%, 5 내지 40중량%, 10 내지 40중량%, 15 내지 40중량%, 20 내지 40중량%, 23 내지 40중량%, 25 내지 40중량%, 1 내지 30중량%, 5 내지 30중량%, 10 내지 30중량%, 15 내지 30중량%, 20 내지 30중량%, 23 내지 30중량%, 25 내지 30중량%, 1 내지 25중량%, 5 내지 25중량%, 10 내지 25중량%, 15 내지 25중량%, 20 내지 25중량%, 또는 23 내지 25중량%로 포함할 수 있다. 일 예에 따르면, 상기 범위 외의 함량으로 배양물을 포함하는 조성물 보다 상기 범위로 배양물을 포함하는 조성물은 (1) 위장질환의 예방 또는 치료 효과 및/또는 (2) 항헬리코박터 파일로리 효능이 우수할 수 있다.
상기 배양물은 코리네박테리움 속 균주를 포함할 수 있고, 배양물 내의 코리네박테리움 속 균주를 0.1 내지 10중량%, 0.1 내지 8중량%, 0.1 내지 5중량%, 0.1내지 4중량, 0.1 내지 3.5중량, 0.1 내지 3중량, 0.1 내지 1중량, 1 내지 10중량%, 1 내지 8중량%, 1 내지 5중량%, 1 내지 4중량, 1 내지 3.5중량%, 1 내지 3중량, 2 내지 10중량%, 2 내지 8중량%, 2 내지 5중량%, 2 내지 4중량, 2 내지 3.5 중량%, 2 내지 3중량, 3 내지 10중량%, 3 내지 8중량%, 3 내지 5중량%, 3 내지 4중량, 3 내지3.5 중량%, 3.5 내지 10중량%, 3.5 내지 8중량%, 3.5 내지 5중량%, 또는 3.5 내지 4중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
일 예에서, 코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물은 코리네박테리움 속 균주를 배지에서 일정기간 배양하여 얻은 제조한 배양물을 열처리(또는 멸균(예를 들면, 오토클레이브 또는 열풍건조))하거나 하여 수득된 코리네박테리움 속 균주의 사균체가 포함된 배양물일 수 있다.
본 출원에서, "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일련의 행위를 의미한다. 상기 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 배양은 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 수행할 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, pH 6 내지 8, 또는 pH 6.8)를 조절할 수 있다. 일 예에서, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고/있거나, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다
일 예에서, 배양 온도는 20 내지 45℃, 25 내지 40℃, 30 내지 40℃, 30 내지 35℃, 또는 35 내지 40℃일 수 있고, 배양 조건은 100 내지 500 rpm, 150 내지 300rpm, 150 내지 250rpm, 또는 200rpm일 수 있으며, 배양 시간(기간)은 1 내지 160 시간, 10 내지 100시간, 12 내지 72 시간, 24 내지 72시간, 30 내지 60시간, 40 내지 50시간, 45 내지 50시간, 또는 48시간일 수 있다. 배양기간은 유용물질(예를 들면, L-트레오닌, 쓰레오닌, 트레오닌, Threonine)이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있다. 일 예에서 배양은 상기 범위의 배양 온도에서 상기 범위의 배양 시간 동안 수행될 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며 당업자는 공지된 내용에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 일 예에 따르면, 코리네박테리아 속 균주를 배양하기 위한 배지는 공지된 문헌(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981)을 참조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 코리네박테리움 속 균주를 배양하기 위하여는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 생존요건을 충족시킬 수 있다. 상기 배지에서 사용될 수 있는 탄소원으로는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예를 들면, 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예를 들면, 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예를 들면, 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예를 들면, 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 기타 금속염(예를 들면, 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있고/있거나 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 배지는 트레오닌 생산용 배지(예를 들면, no. 435 배지)일 수 있고, 상기 코리박테리움 속 균주, 및 이의 배양물은 코리네박테리움 속 균주를 트레오닌 생산용 배지에서 배양한 배양물일 수 있고, 트레오닌은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
일 예에서, 상기 코리네박테리움 속 균주 및/또는 이의(상기 코리네박테리움 속 균주) 배양물은 트레오닌을 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 코리네박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물은 트레오닌을 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 출원에서, "트레오닌(Threonine, Thr)", "쓰레오닌"은 하이드록시-α-아미노산으로 체내에서 생성되지 않는 필수 아미노산의 하나로 화학식 HO2CCH(NH2)CH(OH)CH3인 아미노산을 의미한다. 상기 트레오닌은 광학이성질체 L형(L-형 트레오닌(L-Threonine, L-Thr)), D형, 또는 이의 조합일 수 있다. 트레오닌은 필수 아미노산으로 장상피 보호 물질인 뮤신(mucine)을 구성하며, 부족하면 성장정지, 체중감소를 일으킬 수 있다.
일 예에 따라, 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 및/또는 트레오닌을 혼합하였을 경우에 상승적으로 우수한 (1) 위장질환의 예방 또는 치료 효과 및/또는 (2) 항헬리코박터 파일로리 효능이 나타날 수 있다.
일 예에 따른 조성물은 트레오닌을 50 내지 90중량%, 50 내지 85중량%, 50 내지 80중량%, 50 내지 75 중량%, 50 내지 70중량%, 55 내지 90중량%, 55 내지 85중량%, 55 내지 80중량%, 55 내지 75 중량%, 55 내지 70중량%, 60 내지 90중량%, 60 내지 85중량%, 60 내지 80중량%, 60 내지 75 중량%, 60 내지 70중량%, 65 내지 90중량%, 65 내지 85중량%, 65 내지 80중량%, 65 내지 75 중량%, 65 내지 70중량%, 70 내지 90중량%, 70 내지 85중량%, 70 내지 80중량%, 70 내지 75 중량%, 또는 70중량%로 포함할 수 있다. 상기 범위 외의 함량으로 트레오닌을 포함하는 조성물 보다 상기 범위로 트레오닌을 포함하는 조성물은 (1) 위장질환의 예방 또는 치료 효과 및/또는 (2) 항헬리코박터 파일로리 효능이 우수할 수 있다.
상기 트레오닌은 상업적으로 이용 가능한 것이거나 추출법, 발효법, 효소법, 및/또는 합성법 등을 사용하여 생산된 것일 수 있다. 예를 들면, 코리네형 균주를 이용하여 트레오닌이 포함된 발효물을 얻은 후 정제하여 수득하거나, 트레오닌 생합성 경로를 통해 생합성되거나, 및/또는 화학적으로 합성된 것일 수 있다.
상기 트레오닌은 일 예에 따른 조성물에 (1) 상기 코리네박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물에 포함되거나 (2) 상기 코리네박테리움 속 균주 및/또는 이의 배양물에 포함되지 않은 형태로 추가로 포함되거나 또는 (3) 이의 조합(예를 들면, 조성물에 포함되는 코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물이 트레오닌을 포함하고, 그 외에 추가적으로 트레오닌을 포함)일 수 있다.
일 예에 따른 조성물에 포함되는 트레오닌은,
(1) 상기 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 또는 이들 모두(균주 및 배양물)에 포함되거나;
(2) 별도로 첨가되거나;
(3) 상기 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 또는 이들 모두(균주 및 배양물)에 포함되고, 여기에 추가로(별도로) 첨가된 것일 수 있다.
상기에서 트레오닌이 별도로 첨가된 것은 균주 및/또는 배양물에 포함된 트레오닌 외에 정제된 트레오닌을 추가로 첨가한 것을 의미할 수 있다.
상기 트레오닌은 그 형태가 분말 및/또는 과립일 수 있다. 과립형 트레오닌인 경우 100 내지 1000㎛ 또는 200 내지 1000㎛의 입도를 가질 수 있다.
일 예에 따른 조성물은 상기 코리네박테리움 속 균주 0.1 내지 5 중량부, 상기 배양물 10 내지 90 중량부 및 상기 트레오닌 10 내지 80 중량부를 포함할 수 있다. 구체적으로, 균주 0.2 내지 5 중량부, 배양물 12 내지 88 중량부 및 트레오닌 10.5 내지 78 중량부, 균주 0.3 내지 5 중량부, 배양물 13 내지 87 중량부 및 트레오닌 11 내지 77 중량부, 균주 0.4 내지 5 중량부, 배양물 14 내지 86 중량부 및 트레오닌 11.5 내지 76 중량부, 균주 0.5 내지 5 중량부, 배양물 15 내지 85 중량부 및 트레오닌 12 내지 75 중량부, 균주 0.6 내지 5 중량부, 배양물 16 내지 84 중량부 및 트레오닌 12.5 내지 74 중량부, 균주 0.7 내지 5 중량부, 배양물 17 내지 83 중량부 및 트레오닌 13 내지 73 중량부, 균주 0.8 내지 5 중량부, 배양물 18 내지 82 중량부 및 트레오닌 13.5 내지 72 중량부, 균주 0.9 내지 5 중량부, 배양물 19 내지 81 중량부 및 트레오닌 14 내지 71 중량부, 균주 0.9 내지 4 중량부, 배양물 20 내지 80 중량부 및 트레오닌 14 내지 70 중량부, 균주 1 내지 4 중량부, 배양물 21 내지 79 중량부 및 트레오닌 14 내지 69 중량부, 균주 1 내지 3 중량부, 배양물 22 내지 78 중량부 및 트레오닌 14 내지 68 중량부로 포함될 수 있다.
일 예에 따른 조성물에서, 상기 균주 및 이의 배양물과 트레오닌의 중량비(균주 및 이의 배양물의 중량 : 트레오닌의 중량)는 1:0.1 내지 1:10, 1:0.1 내지 1:5, 1:0.1 내지 1:3, 1:0.2 내지 1:10, 1:0.2 내지 1:5, 1:0.2 내지 1:3, 1:0.5 내지 1:10, 1:0.5 내지 1:5, 1:0.5 내지 1:3, 1:1 내지 1:10, 1:1 내지 1:5, 1:1 내지 1:3, 1:3 내지 1:10, 1:3 내지 1:5, 또는 1:3일 수 있다.
일 예에 따른 조성물은 리그닌설폰산염을 추가로 포함할 수 있다. 일 예에 따른 조성물이 리그닌설폰산염을 추가로 포함하면, (1) 위장질환의 예방 또는 치료 효과 및/또는 (2) 항헬리코박터 파일로리 효능이 우수해질 수 있다.
일 예에 따른 조성물은 조성물에 포함되는 트레오닌 함량을 조절하기 위해, 리그닌설폰산칼슘(Calcium lignosulfonate)을 추가로 포함할 수 있다. 일 예에 따르면 조성물은 리그닌설폰산칼슘을 0.1 내지 50중량%, 0.1 내지 30중량%, 0.1 내지 25중량%, 0.1 내지 20중량%, 0.1 내지 15중량%, 0.1 내지 10중량%, 0.1 내지 7중량%, 1 내지 50중량%, 1 내지 30중량%, 1 내지 25중량%, 1 내지 20중량%, 1 내지 15중량%, 1 내지 10중량%, 1 내지 7중량%, 3 내지 50중량%, 3 내지 30중량%, 3 내지 25중량%, 3 내지 20중량%, 3 내지 15중량%, 3 내지 10중량%, 3 내지 7중량%, 5내지 50중량%, 5 내지 30중량%, 5 내지 25중량%, 5 내지 20중량%, 5 내지 15중량%, 5 내지 10중량%, 5 내지 7중량%, 6.5 내지 50중량%, 6.5 내지 30중량%, 6.5 내지 25중량%, 6.5 내지 20중량%, 6.5 내지 15중량%, 6.5 내지 10중량%, 또는 6.5 내지 7중량%로 포함할 수 있다.
일 예에서, 조성물은 상기 코리네박테리움 속 균주, 및 이의 배양물을 건조된 형태(예를 들면, '코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물'의 건조물)로 포함할 수 있다. 상기 건조물은 코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물을 건조하여 제조할 수 있고, 상기 건조물은 트레오닌을 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 건조는 진공 건조, 열풍 건조, 동결 건조, 상온 통풍 건조, 박막건조, 및/또는 진공건조로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
일 예에서, 조성물은 상기 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 건조된 형태(예를 들면, 트레오닌을 포함하는 '코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물'의 건조물)로 포함할 수 있다.
일 예에 따른 조성물의 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예를 들면, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물(발효물)을 건조시켜 제조할 수 있고, 이 조성물에는 트레오닌, 코리네박테리움 속 균주(예를 들면, 사균체의 형태의 균주), 및 트레오닌과 균주 외의 배양물의 성분을 포함할 수 있다. 일 예에서 코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물을 건조시켜 제조한 일 예에 따른 조성물은 과립형일 수 있고, 이는 정제된 분말형의 트레오닌 보다 (1) 위장질환의 예방 또는 치료 효과 및/또는 (2) 항헬리코박터 파일로리 효능이 우수한 것일 수 있다.
본 출원에서, "과립(granule)"이란 분말이 응집되어 30~150배의 큰 입자를 형성한 상태를 의미하며, "과립화"란 원료가 과립 상태가 되도록 공정 등을 처리하여 유도하는 것을 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 및/또는 트레오닌을 포함하는 조성물을 건조하는 과정에서 조성물이 과립 형태를 나타낼 수 있다.
일 예에서, 상기 위장질환은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염에 의한 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 위장질환은 위염, 위궤양, 십이지장궤양, 소화성 궤양, 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 위염은 위 내벽의 염증이 발생한 상태를 의미하고, 상기 위궤양은 위장에서 점막을 보호하는 방어인자와 점막 손상을 유발하는 공격인자의 균형이 깨지면서 발생할 수 있다. 위궤양의 원인이라고 볼 수 있는 상기 공격인자는 위산, 각종 소화효소, 담즙, 복용한 약물, 알코올, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 감염, 비스테로이드소염제 복용, 흡연 등이 있다.
일 예에 따른 조성물을 사료 조성물로 사용하는 경우, 시판되는 사료 조성물에 일 예에 따른 조성물을 첨가한 형태의 사료 조성물의 형태로서 제조될 수 있다. 일 예에 따른 조성물이 사용될 수 있는 사료는 분말 또는 펠렛 제형, 또는 액상 제형인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것을 아니다. 또한, 사료에 첨가되는 본 출원의 조성물의 첨가량은 특별한 제한을 요하는 것은 아니다.
본 출원에서, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
일 예에 따른 조성물을 포함하는 사료를 급여할 수 있는 개체(동물)는 특별히 제한은 없으나 포유류, 어류, 갑각류 및/또는 패각류일 수 있고, 예를 들면, 돼지, 소, 말, 염소, 사슴, 양, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 개, 고양이, 토끼, 물고기일 수 있다.
상기 사료 조성물은 부형제, 희석제, 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 상기 구성 성분 외에도 동물의 성장 촉진에 유효한 성분, 영양 성분, 영양 보조 성분, 보존 안정성을 높이는 성분, 피복제 성분, 질병 예방 등을 위한 아미노산제, 비타민제, 효소제, 비단백질태질소화합물, 규산염제, 완충제, 추출제, 생균제; 아밀라아제, 리파아제 등의 효소; L-아스코르브산, 염화콜린, 이노시톨 등의 비타민; 염화칼륨, 시트르산철, 산화마그네슘, 인산염류 등의 미네랄; 리신, 알라닌, 메티오닌 등의 아미노산; 푸마르산, 부티르산, 락트산 등의 유기산 또는 이의 염; 비타민 C, 비타민 E 등의 항산화제, 프로피온산칼슘 등의 곰팡이 방지제; 레시틴, 글리세린 지방산 에스테르 등의 유화제; 및/또는 색소 등을 포함할 수 있다. 상기에 기술되지 않았더라도 일 예에 사료 조성물은 통상의 기술자가 예상할 수 있는 범위 내의 다른 기타 영양성분을 추가로 포함할 수 있다.
다른 양상은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는, 위장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 일 예에 따른 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 포함되는 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 트레오닌, 및/또는 위장질환에 대해서는 상기 위장질환 예방 또는 개선용 사료 조성물에 대해 설명한 바와 같다.
일 예에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고상 제제에는 정제, 환제, 산제(분말제), 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고상 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
일 예에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있고, 본 출원에서, "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 출원 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 출원의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 예에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
일 예에 따른 약학 조성물의 투여량은 예를 들면, 포유동물에 하루 동안 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 구체적으로 0.001 내지 10 mg/kg으로 투여할 수 있다. 본 출원의 약학 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 출원의 범위를 제한하는 것은 아니다.
일 예에 따른 약학적 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 투여 방법에는 제한이 없다. 예를 들면, 관절강 내 주사, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사 또는 경피 주사 등이 포함된다. 또한, 상기 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
다른 양상은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는, 위장질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공할 수 있다. 위장질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 포함되는 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 트레오닌, 및/또는 위장질환에 대해서는 위장질환 예방 또는 개선용 사료 조성물에서 설명한 바와 같다.
상기 식품은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능(성) 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 출원의 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 출원의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 출원의 식품은 위궤양의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 알 예에 따른 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져 오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
일 예에 따른 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 위장 질환의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
일 예에 따른 조성물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 출원의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 출원의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 출원의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
일 예에 따른 식품 조성물은 위장 질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 예를 들면, 일 예에 따른 조성물을 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량%, 0.01 내지 80 중량%, 또는 10 내지 50 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에 따른 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는 조성물은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori, H. pylori) 증식 억제, 헬리코박터 파일로리에 의해 유도된, 염증, 산화 스트레스, 혈관성장, 및/또는 세포자가사멸을 억제함으로써 위장 질환(예를 들면, 위궤양)을 예방, 치료, 또는 개선하는 것일 수 있다.
일 예에 따른 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는 조성물은 점액 합성 및 분비 촉진, 조직재생 촉진, 위점막 손상 억제, 조직재생 촉진, 산화스트레스 억제, 위점막 세포 세포자가사멸 억제, 및/또는 염증 억제함으로써 위장질환을 예방, 치료, 또는 개선하는 것일 수 있다.
일 예에 따른 조성물에서 코리네박테리움 속 균주 함유 유무; 코리네박테리움 속 균주가 사균체로 포함되는지 여부; 코리네박테리움 속 균주의 종류; 배양물 포함 유무; 트레오닌 포함 유무; 및/또는 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물과 트레오닌의 조합 여부 등에 따라 (1) 위장질환의 예방 또는 치료 효과 및/또는 (2) 항헬리코박터 파일로리 효능에 차이가 있음을 확인하였으며, 일 예에 따른 조성물이 가장 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
다른 양상은 상기 위장질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물(사료 조성물, 식품 조성물, 또는 약학적 조성물)을 개체(환자)에 투여하는 단계를 포함하는 위장질환의 예방, 개선 또는 치료방법을 제공할 수 있다. 사료 조성물, 식품 조성물, 약학적 조성물, 및 위장질환에 관한 것은 전술한 바와 같다.
일 예에 따르면, 상기 위장질환의 예방, 개선, 또는 치료방법은 투여하는 단계 이전에 상기 위장질환의 예방, 개선, 또는 치료를 필요로 하는 개체(환자)를 확인(선별)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원에서, "개체"란, 위장질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다.
상기 위장질환의 예방 또는 치료방법이 적용되는 대상 개체는 위장질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있고, 예를 들면, 돼지, 소, 말, 염소, 사슴, 양, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 개, 고양이, 및/또는 일 수 있다.
본 출원에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상 개체에게 상기 위장질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구(예를 들면 정맥 내, 피하, 근육, 복강 내 또는 국소 적용)의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 예방, 개선, 또는 치료방법은 일 예에 따른 사료 조성물, 식품 조성물,또는 약학 조성물을 (약학적) 유효량으로 투여하는 것일 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 특정 개체(환자)에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체(환자)의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용할 수 있다.
다른 양상은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)에 대한 항균용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)에 대한 항균용 조성물에 포함되는 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 트레오닌, 및/또는 위장질환에 대해서는 위장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에서 설명한 바와 같다.
일 예에 따라 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 조합하면, 헬리코박터 파일로리에 대한 항균효과가 상승적으로 우수해질 수 있다.
다른 양상은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 및 이의 배양물, 을 포함하는, 위장질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있고, 상기 균주 및 배양물은 트레오닌을 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주 및 이의 배양물(발효물)을 포함하는 위장질환 예방, 개선, 또는 치료를 위한 유효성분 제조용 조성물을 제공할 수 있고, 상기 코리네박테리움 속 균주 또는 상기 배양물(발효물)은 트레오닌을 포함 또는 함유하는 것일 수 있다.
상기 위장질환 예방 또는 치료를 위한 유효성분 제조용 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여, 상기 코리네박테리움 속 균주 0.1 내지 5 중량부, 상기 발효물 10 내지 90 중량부 및 상기 트레오닌 10 내지 80 중량부를 포함할 수 있다. 구체적으로, 조성물 전체 중량에 대하여 균주 0.2 내지 5 중량부, 발효물 12 내지 88 중량부 및 트레오닌 10.5 내지 78 중량부, 균주 0.3 내지 5 중량부, 발효물 13 내지 87 중량부 및 트레오닌 11 내지 77 중량부, 균주 0.4 내지 5 중량부, 발효물 14 내지 86 중량부 및 트레오닌 11.5 내지 76 중량부, 균주 0.5 내지 5 중량부, 발효물 15 내지 85 중량부 및 트레오닌 12 내지 75 중량부, 균주 0.6 내지 5 중량부, 발효물 16 내지 84 중량부 및 트레오닌 12.5 내지 74 중량부, 균주 0.7 내지 5 중량부, 발효물 17 내지 83 중량부 및 트레오닌 13 내지 73 중량부, 균주 0.8 내지 5 중량부, 발효물 18 내지 82 중량부 및 트레오닌 13.5 내지 72 중량부, 균주 0.9 내지 5 중량부, 발효물 19 내지 81 중량부 및 트레오닌 14 내지 71 중량부, 균주 0.9 내지 4 중량부, 발효물 20 내지 80 중량부 및 트레오닌 14 내지 70 중량부, 균주 1 내지 4 중량부, 발효물 21 내지 79 중량부 및 트레오닌 14 내지 69 중량부, 균주 1 내지 3 중량부, 발효물 22 내지 78 중량부 및 트레오닌 14 내지 68 중량부로 포함될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
상기 위장질환 예방 또는 치료를 위한 유효성분 제조용 조성물은 상기 트레오닌 함량을 조절하기 위해, 리그닌설폰산칼슘(Calcium lignosulfonate)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 리그닌설폰산칼슘은 상기 조성물 전체 중량에 대하여 0.1 내지 50중량%, 0.1 내지 30중량%, 0.1 내지 25중량%, 0.1 내지 20중량%, 0.1 내지 15중량%, 0.1 내지 10중량%, 0.1 내지 7중량%, 1 내지 50중량%, 1 내지 30중량%, 1 내지 25중량%, 1 내지 20중량%, 1 내지 15중량%, 1 내지 10중량%, 1 내지 7중량%, 3 내지 50중량%, 3 내지 30중량%, 3 내지 25중량%, 3 내지 20중량%, 3 내지 15중량%, 3 내지 10중량%, 3 내지 7중량%, 5 내지 50중량%, 5 내지 30중량%, 5 내지 25중량%, 5 내지 20중량%, 5 내지 15중량%, 5 내지 10중량%, 5 내지 7중량%, 6.5 내지 50중량%, 6.5 내지 30중량%, 6.5 내지 25중량%, 6.5 내지 20중량%, 6.5 내지 15중량%, 6.5 내지 10중량%, 6.5 내지 7중량%, 0.1 내지 18 중량%, 0.1 내지 16 중량%, 0.1 내지 14 중량%, 0.1 내지 13 중량%, 0.1 내지 12 중량%, 0.1 내지 11 중량%, 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8 중량%, 또는 0.1 내지 7 중량%로 포함될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니며, 조성물 내 트레오닌이 목적하는 함량에 도달하도록 제한없이 첨가할 수 있다.
다른 양상은 상기 위장질환 예방 또는 치료를 위한 유효성분 제조용 조성물을 포함하는 위장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.
다른 양상은 위장질환 예방 또는 치료를 위한 유효성분 제조용 조성물을 포함하는 위장질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공할 수 있다.
다른 양상은 위장질환 예방 또는 치료를 위한 유효성분 제조용 조성물을 포함하는 위장질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공할 수 있다.
다른 양상은 상기 과립형인 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주 및 이의 배양물(발효물)을 포함하는 위장질환 예방 또는 치료를 위한 유효성분 제조용 조성물을 유효성분으로 포함하는 위장질환 치료용 제제를 제공한다.
상기 코리네박테리움 속 균주 및 이의 발효물, 위장질환, 예방, 개선, 및 치료에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서, "제제"란 의약품의 본질에 변화를 미치지 않고 주로 물리적 조작, 예를 들면 분쇄, 혼합, 반죽, 침출(우려냄) 또는 증발 등에 의해 조제, 보존 또는 사용에 편리하고 또 치료 효과를 충분히 발휘하도록 가공하는 것을 말하는데, 또한 이것에 의해 만들어진 제품도 제제(medicinal preparation)라고 칭하고 있다(화학대사전, 2001. 5. 20., 세화 편집부).
상기 제제를 제조하기 위해 제제화할 경우 사용하는 첨가제, 즉, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 희석제 또는 부형제에 대해서는 전술한 바와 같으며, 경구 투여를 위한 고상 제제 및 이에 포함되는 첨가제, 경구 투여를 위한 액상 제제 및 이에 포함되는 첨가제 또는 비경구 투여를 위한 제제 및 이에 첨가되는 첨가제에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 제제는 고상 제형, 액상 제형 또는 유동상 제형일 수 있으나, 이로 제한되지 않으며 위궤양의 예방, 치료 및 개선 효과를 나타내는 제형이라면 제한없이 적용할 수 있다.
상기 제형에 대해서는 전술한 바와 같다.
다른 양상은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주 및 이의 배양물을 건조하는 단계를 포함하는, (1) 위장질환의 예방, 개선, 또는 치료 효과; 및/또는 (2) 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)에 대한 항균 효과를 갖는 유효성분의 제조 방법을 제공할 수 있다.
상기 코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 예에서, 상기 건조하는 단계는 진공 건조, 열풍 건조, 동결 건조, 상온 통풍 건조, 박막건조, 및/또는 진공건조로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 건조하는 단계는 코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물에 트레오닌을 별도로 첨가한 조성물을 건조하는 것일 수 있다.
일 예에서 상기 유효성분의 제조 방법은 상기 건조하는 단계 후에 제조된 건조물에 트레오닌을 별도로 추가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원에 따른 조성물은 세포실험에서 항 헬리코박터 파일로리 효능 및 동물실험에서 위궤양 개선 효능, 위 점액 합성 효능 등이 우수한 것으로 확인된 바, 위장질환의 예방 및 치료용 약학 조성물, 위장질환 개선용 식품 또는 사료용 조성물로 적용할 수 있다.
도 1은 그룹 1 내지 8 의 H. pylori 균주에 대한 항균 활성을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2c는 H. pylori 균주를 이용하여 6시간 동안 100 MOI로 감염시킨 RGM1 세포에 그룹 1 내지 8 을 처리시 염증 매개인자의 발현을 측정한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 2a는 H. pylori 균주로 감염된 RGM1세포에서 그룹 1 내지 8 처리에 따른 Cox-2 mRNA 발현 변화를 나타내고 도 2b는 H. pylori 균주로 감염된 RGM1세포에서 그룹 1 내지 8 처리에 따른 iNOS의 단백질 발현 변화를 나타내며, 도 2c는 H. pylori 균주로 감염된 RGM1세포에서 그룹 1 내지 8 처리에 따른 인산화된 NF-κB p65 단백질 발현 변화를 나타낸다. GAPDH 및 β-actin은 각각 mRNA 및 단백질의 내부 대조군(internal control)으로 사용되었다.
도 2a 내지 도 6b에서 N(좌측으로부터 첫번째 열)은 음성대조군(H. pylori 무처리 RGM1 세포)을 나타내고, H.p(좌측으로부터 두번째 열)은 양성대조군(H. pylori 감염된 RGM1 세포)을 나타내고 Group 1 내지 8은 H. pylori 감염된 RGM1 세포에 그룹 1 내지 8의 조성물이 처리된 세포에서의 결과를 나타낸다.
도 3a는 H. pylori 균주로 감염된 RGM1세포에서 그룹 1 내지 8 처리에 따른 산화 스트레스 관련 단백질(HIF-1a)의 발현 변화를 나타낸다. β-actin은 내부 대조군으로 사용되었다. 도 3b는 H. pylori 균주로 감염된 RGM1세포에서 그룹 1 내지 8 처리에 따른 세포 내 활성산소의 농도변화를 측정한 결과(DCF 증감 결과)를 나타낸다.
도 4a는 H. pylori 균주로 감염된 RGM1세포에서 그룹 1 내지 8 처리에 따른 HO-1 mRNA의 발현 변화를 나타내고, 도 4b는 H. pylori 균주로 감염된 RGM1세포에서 그룹 1 내지 8 처리에 따른 GST(pi) 및 HO-1 단백질 발현 변화를 나타낸다. GAPDH 및 β-actin은 내부 대조군으로 사용되었다.
도 5a 및 도 5b는 H. pylori 균주로 감염된 RGM1 세포에서 그룹 1 내지 8 처리에 따른 세포자가사멸 저해 효능을 나타낸다. 구체적으로 도 5a는 H. pylori 균주로 감염된 RGM1세포에서 그룹 1 내지 8 처리에 따른 Bax, 및 Bcl-2 단백질의 발현 변화를 나타내고, β-actin은 내부 대조군으로 사용되었다. 도 5b 는 H. pylori 균주로 감염된 RGM1세포에서 그룹 1 내지 8 처리에 따른 아폽토시스 변화(TUNEL 염색 결과)를 나타낸다.
도 6a 및 도 6b은 H. pylori 균주로 감염된 RGM1 세포에서 그룹 1 내지 8 처리에 따른 혈관생성 및 점막증식 성장인자의 변화 결과를 나타낸다. 도 6a는 H. pylori 균주로 감염된 RGM1세포에서 그룹 1 내지 8 처리에 따른 TGF-β 및 VEGF 단백질의 발현 변화를 나타내고, β-actin은 내부 대조군으로 사용되었다. 도 6b는 H. pylori 균주로 감염된 RGM1세포에서 그룹 1 내지 8 처리에 따른 β-catenin 단백질의 발현 변화를 나타내고, Lamin B는 내부 대조군으로 사용되었다.
도 7a 내지 도 10에서 그룹(group) 1-4는 표 5의 동물실험군 1-4를 의미한다.
도 7a 및 도 7b는 WIRS 모델 동물 실험군에서 일 예에 따른 조성물의 투여에 의한 SRMD(stress-related mucosal disease) 개선 효능을 나타낸다. 구체적으로, 도 7a는 각 실험군의 위에 대한 병리학적 사진을 나타내고 우측 두 열의 사진은 x40 배율로 표시되었다. 도 7b는 WIRS 모델 동물 실험군에서 일 예에 따른 조성물의 투여에의한 (A) 병변 점수(gross lesion index: 좌측 상단 그래프), (B) 염증; 병리적 점수(Inflammation; pathologic score: 우측 상단 그래프), (C) 궤양/침식; 병리적 점수(Ulcer/erosin; pathologic score: 좌측 하단 그래프), (D) 재생; 병리적 점수(Regeneration; pathologic score: 우측 하단 그래프)를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8d는 WIRS 모델 동물실험군에서 일 예에 따른 조성물의 투여에 의한 염증, 혈관 신생 및 신호전달의 변화를 나타낸다. (A) 도 8a는 동물실험군 1-4에서 iNOS, TNF-α 및 IFN-γ mRNA의 발현 변화를 나타내고, 도 8b는 동물실험군 1-4에서 PDGF mRNA의 발현 변화를 나타내며, 도 8c는 동물실험군 1-4에서 p-IκBα의 단백질 발현 변화를 나타내고, 도 8d는 동물실험군 1-4에서 p-ERK 및 p-JNK의 단백질 변화를 나타낸다. GAPDH 및 β-actin은 각각 mRNA 및 단백질의 내부 대조군으로 사용되었다.
도 9a 내지 도 9c는 WIRS 모델 동물실험군에서 일 예에 따른 조성물의 투여에 의한 세포자가사멸, 세포주기의 변화를 나타내는 결과이다. 구체적으로, 도 9a는 동물실험군 1-4 에서 위 점막의 SRMD 영역에서 세포자가사멸 수준을 나타내는 TUNEL 분석 결과이고, 도 9b는 PARP-1, Bcl-2, Bax, Cleaved caspase-8 및 Cleaved caspase-3의 단백질 발현 변화를 나타내며, 도 9c는 CDK4 및 Cyclin D1의 단백질 발현 변화를 나타낸다. β-actin은 내부 대조군으로 사용되었다.
도 10은 동물실험군1-4의 위 조직에서의 뮤신(Mucin) 함량을 나타낸다.
도 11은 다양한 중량%의 트레오닌을 포함하는 샘플을 투여한 WIRS 랫트의 위에 대한 병리학적 사진을 나타낸다. 도 11의 샘플 1 내지 5의 조성 및 함량은 표 4에 기재하였다.
이하, 본 출원의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 출원의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 출원의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 출원의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 출원을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 코리네박테리움 속 균주 함유 조성물 및 세포 감염
실시예 1-1. 코리네박테리움 속 균주 함유 조성물 제조
코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주를 함유하는 균주 조성물의 항헬리코박터, 세포자가사멸 억제 및 세포보호 효능과 코리네박테리움 속 균주 간의 효능 차이를 검증하기 위하여 그룹 1 내지 그룹 8의 조성물을 제조하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(C. ammoniagenes), 및 코리네박테리움 이피시엔스(C. efficiens)의 야생형 균주를 CJ제일제당 BIO R&D Center(Blossom park)에서 제공받아 사용하였으며, 상기 균주를 각각 트레오닌 생산용 브로스(broth)에 접종하여 35℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 배양하였다. 트레오닌 생산용 브로스의 성분 및 함량은 하기 표 1에 기재하였다.
성분 농도 (리터당)
포도당 70g
KH2PO4 1g
(NH4)2SO4 30g
MgSO4·7H2O 1g
FeSO4·7H2O 200mg
MnSO4·4H2O 100mg
바이오틴 1mg
효모액기스 2.5g
칼슘-판토텐산 1mg
티아민 염산염 1mg
탄산갈슘 30g
pH 6.8
그룹 1은 코리네박테리움 글루타미쿰을 상기 조건으로 배양하여 제조한 발효 브로스를 원심분리하여 균체를 제거한 발효 브로스의 상등액을 포함하고, 그룹 2는 트레오닌을 100g/L의 농도로 포함하는 버퍼(Tris-HCl)이다. 그룹 3 내지 5는 상기 조건으로 균주를 배양하여 제조한 발효 브로스를 원심분리하여 균체를 수집하고, 수집한 균체를 버퍼(Tris-HCl)에 현탁하여 제조하였다. 그룹 6 내지 8은 상기 조건으로 각 균주를 배양한 발효 브로스로서, 각 균주 및 각 균주를 상기 배지에서 배양한 배양물(표 2에서는 '발효 브로스의 상등액'으로 기재함)을 포함한다. 그룹 3 내지 8의 조성물은 각 균주를30 OD(wave length 562 nm) 농도로 포함하고, 오토클레이브(autoclave)를 통해 사균체 형태로 균주를 포함한다.
그룹 1 내지 8은 모두 트레오닌을 포함하며, 각 균주(사균체 형태로 포함) 또는 배양물 내에 트레오닌을 포함하는 그룹이 존재하므로, 균주 및/또는 배양물 내의 트레오닌 함량을 측정하여 그룹 1 내지 8에서의 최종 트레오닌 농도가 100g/L이 되도록 추가로 트레오닌(CJ BIO 균주를 통해 생산된 트레오닌; 순도 >99%)을 첨가하였다.
각 그룹의 성분은 하기 표 2에 기재하였다. 표 2에서 그룹 1 및 그룹 6의 '발효 브로스의 상등액'은 'C. glutamicum 균주'를 상기 조건으로 배양하여 제조한 배양물에서 균체를 제거한 것을 의미하고, 그룹 7 및 8의 발효 브로스의 상등액은 각각 'C. ammoniagenes 균주' 및 'C. efficiens 균주'를 상기 조건으로 배양하여 제조한 배양물에서 균체를 제거한 것을 의미한다.
그룹 조성물 내 성분
그룹 1 트레오닌 + 발효 브로스의 상등액
그룹 2 트레오닌
그룹 3 트레오닌 + C. glutamicum
그룹 4 트레오닌 + C. ammoniagenes
그룹 5 트레오닌 + C. efficiens
그룹 6 트레오닌 + C. glutamicum + 발효 브로스의 상등액
그룹 7 트레오닌 + C. ammoniagenes + 발효 브로스의 상등액
그룹 8 트레오닌 + C. efficiens + 발효 브로스의 상등액
하기 실시예 2 내지 7 및 도 1 내지 도 6b에 기재된 그룹 1-8(group 1-8)는 상기 표 2의 그룹 1-8을 의미한다.
실시예 1-2. 랫트 위 점막 세포주 배양
정상 랫트의 위 점막 세포주인 RGM1 세포는 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified essential medium)과 Ham F12 혼합배지에서 37℃ 세포배양기(95% air, 5% CO2)로 배양하였다. 상기 RGM1 세포주는 일본 Tsukuba 대학의 Matsui 교수에 의하여 수립되었고, 동의(consent) 후에 사용되었다.
실시예 1-3. H. pylori 균주 및 세포감염
헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori; H. pylori) 균주(cytotoxin-associated gene A [CagA]+strain, NCTC 11637)는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD)으로부터 구입하였다. H. pylori 균주는 5% 우아혈청(bovine calf serum)과 항생제가 첨가된 브루셀라 액체배지(Brucella broth)에서 1Х108CFU/㎖(OD 600=1)가 될 때까지 10% CO2 조건에서 진탕배양하였다.
100:1의 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)(이하, 100 MOI)로 RGM1 세포를 H.pylori 균주로 6시간 동안 감염시켰다.
실시예 2. in vitro 에서 코리네박테리움 속 함유 균주 조성물의 항헬리코박터 효능 검정
한천 확산법(Disc diffusion assay)을 사용하여 혈액 한천 플레이트(blood agar plate)에서 H. pylori의 성장 억제효능, 즉 항헬리코박터 효능을 측정하였다. 구체적으로，정제된 물에　TSA(Trypticase쪠 Soy Agar) 40g/L을 녹인 후 오토클레이브(121℃,　20min) 하였다. 약 50℃ 정도로 식힌 다음 5%　양 혈액(sheep blood)을 첨가한 후 항생제{trimethoprim(5mg/L), polymyxin B(2500U/L), vancomycin(10mg/L)}를 첨가하였다. 멸균된 플레이트에 상기 배지를 20 내지 25㎖씩　분주한 후　４℃에서　보관하였다．
제조한 혈액 한천 플레이트에 H. pylori 균주액 200㎕을 분주하여 도말한 다음 멸균된 디스크 페이퍼를 올리고, 상기 실시예 1-1 에서 제조한 그룹 1 내지 8의 조성물 40㎕씩을 각각 디스크 페이퍼에 흡수시키고, 37℃의 CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 배양한 다음 디스크 주위의 생육 저지환의 지름을 측정하여 도 1에 나타내었다. (그룹 1의 결과는 그래프에 표시하지 않음) 도 1에서 'Non-treated'는 H.pylori 에 감염되지 않은 RGM1 세포를 의미한다.
도 1에 나타난 바와 같이, 그룹 6 및 7에서 생육 저지환의 지름 수치가 무처리군 대비 유의적으로 높아 그룹 6 및 7이 유의한 항헬리코박터 활성을 갖는 것을 확인하였다.
또한, 추후 실험에 사용할 그룹 1-8의 적정 농도를 도출하고자 하였다.
상기 실시예 1-1에서 제조한 그룹 1 내지 8의 조성물을1/4, 1/40, 또는 1/100로 희석한 희석액을 각각 40㎕씩 H.pylori 에 처리하고, 세포 생존율을 측정하였다. 1/4의 희석농도에서는 다수의 그룹에서 0.5 이하의 생존율을 나타내었고, 1/100의 희석 농도에서는 그룹들 간의 뚜렷한 결과 차이가 없었으므로, 그룹 1 대비 유의적인 결과 차이가 나타나는 1/40의 희석액을 추후 실험에 사용하였다.
실시예 3. 코리네박테리움 속 균주 함유 조성물에 의한 염증 매개인자(mediator)와 이를 전사하는 NF-κB의 변화 검정
상기 실시예 1-3의 방법과 같이 H. pylori 로 감염된(100 MOI) RGM1 세포를 6시간 동안 1/40 농도로 희석한 그룹 1 내지 8의 조성물 40㎕로 각각 처리하였다. 이후, 상기 조성물이 처리된 RGM1 세포에서, 염증 매개인자인 Cox-2 mRNA의 발현양을 RT-PCT(Reverse transcription PCR) 분석을 통해 확인하고, 그 결과를 도 2a에 나타내었다.
구체적으로, RNA는 TRIzol(Gibco BRL, Rockville, MD)을 이용하여 추출하였으며, 추출된 RNA는 moloney murine leukemia virus 역전사효소(Perkin Elmer, Morrisville, NC) 를 이용하여 cDNA로 합성하였다. PCR 분석에 사용된 각각의 프라이머의 염기서열은 하기 표 3에 나타내었으며, 내부 표준(internal standard)으로서 글리세르알데히드-3-인산디히드로게나아제(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)을 사용하였다.
Gene Forward Primer(5' →3') Reverse Primer(5' →3')
IL-1β CAG GCT CCG AGA TGA ACA ACA AA(서열번호 1) TGG GGA ACT CTG CAG ACT CA(서열번호 2)
IL-8 CAG ACA GTG GCA GGG ATT CA(서열번호 3) TTG GGG ACA CCC TTT AGC AT(서열번호 4)
Cox-2 GAA ATG GCT GCA GAG TTG AA(서열번호 5) TCA TCT AGT CTG GAG TGG GA(서열번호 6)
iNOS CTC ACT GGG ACT GCA CAG AA(서열번호 7) TGT TGA AGG GTG TCG TGA AA(서열번호 8)
HO-1 GAC AGC ATG TCC CAG GAT TT(서열번호 9) GGT TCT GCT TGT TTC GCT CT(서열번호 10)
HSP70 GAG TTG AGC GGC ATC CCG CC(서열번호 11) GTC CTA GAT TCA CAC CTG GAG(서열번호 12)
Gapdh GGT GCT GAG TAT GTC GTG GA(서열번호 13) TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT(서열번호 14)
또한, 상기 조성물이 처리된 RGM1 세포에서, iNOS 단백질의 발현양 및 이를 전사하는 NF-κB p65 인산화의 증감 여부를 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하고, 그 결과를 도 2b 및 도 2c에 나타내었다.
구체적으로, 조성물이 처리되어 배양된 세포를 PBS(phosphate buffered saline) 용액으로 세척한 후, 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer, 150mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 50mM tris-HCl, pH 7.4, 25 mM NaF, 20mM ethyleneglycol-bis(βN'-tetraacetic acid, 1mM dithiothreitol, 1mM Na3VO4, Protease Inhibitor Cocktail tablet [Boehringer, Manneim, Germany])로 용해시켜 단백질 용해물(protein lysate)을 만들었다. 이것을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 전기 영동한 후 전개시킨 단백질을 PVDF 멤브레인(Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)에 옮겨 각각의 1차 항체(primary antibody)와 2차 항체(secondary antibody)로 반응시킨 후, 화학발광 시스템(chemoluminescence system)을 이용하여 분석하였다.
도 2a 에 나타난 바와 같이, 정상 RGM1 세포(N) 대비 H. pylori 로 감염된 RGM1 세포(H.p)에서Cox-2의 mRNA는 유의하게 증가되었고, H. pylori 감염에 의해 증가된 Cox-2의 mRNA 발현이 그룹 6의 조성물 첨가에 의해 가장 유의하게 감소되었다.
도 2b 및 도 2c에 나타난 바와 같이, H. pylori 감염에 의하여 iNOS 단백질 발현 및 이를 전사하는 NF-κB p65의 인산화는 유의하게 증가되었으나, H. pylori 감염에 의해 증가된 iNOS 단백질의 발현 및 NF-κB p65의 인산화가 그룹 6의 조성물 첨가에 의해 가장 유의하게 감소되었다. 상기 결과로부터 일 예에 따른 조성물이 헬리코박터 균주에 의한 염증 매개 경로를 조절하는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. in vitro 에서 코리네박테리움 속 함유 균주 조성물에 의한 산화 스트레스(oxidative stress) 약화 효능 검정
상기 실시예 1-3의 방법과 같이 H. pylori 로 감염된(100 MOI) RGM1 세포를 1/40 농도로 희석한 그룹 1 내지 8의 조성물 40㎕로 각각 6시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 실시예 3과 유사한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여, 산화 스트레스와 연관된 HIF-1α의 발현양 변화를 측정하여 그 결과를 도 3a에 나타내었다.
도 3a에 나타난 바와 같이, 헬리코박터 파일로리 감염에 의하여 유의하게 HIF-1a 증가되었고, 그룹 6 및 7에서 HIF-1a 발현이 현저히 감소되었다.
또한, 세포 내 활성산소의 농도변화를 측정하기 위하여 DCF-DA 프로브를 활용한 DCF 증강 반응을 공초점 영상기(confocal imager)로 분석하였다. 비형광물질인 DCF-DA(2',7'-dichlorofluorescein diacetate)는 세포 내 과산화물(peroxides) 존재 시 활성산소종(ROS)에 의해 산화되어 녹색의 형광을 띄게 되므로 특정 파장에서 형광 세기 정도로서 활성 산소종의 양을 직접 정량할 수 있다. 구체적으로, 24 웰 플레이트(24 well plate)에 5x105 개/웰에 RGM-1 세포(H. pylori 무처리 RGM1 세포; 또는 H. pylori 로 감염된(100 MOI) RGM1 세포(실시예 1-3))를 분주하고 37℃ 세포배양기(95% air, 5% CO2)에서 밤새 배양 후 그룹 1 내지 8의 조성물을 각각 일정 시간 처리하였다. DMEM으로 세포를 세척한 후 10㎍/㎖ DCF-DA(2',7'-dichlorofluorescein diacetate, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO)를 배지에 첨가하여 인큐베이터에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후 4℃의 PBS로 세척한 세포를 형광 현미경으로 관찰 및 촬영하여 그 결과를 도 3b에 나타내었다.
도 3b에 나타난 바와 같이, 헬리코박터 파일로리 감염 후 증가된 DCF-DA의 형광세기는 그룹 1, 3, 6, 및 8처리군에서 통계적으로 유의하게 감소되었고(P<0.05), 그룹 6처리군에서 그 감소 정도가 가장 큰 것(P<0.01)을 확인하였다. 상기 결과로부터 일 예에 따른 조성물에 의해 헬리코박터 균주에 의한 산화 스트레스나 hypoxia response를 즉각적으로 대처할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. in vitro 에서 코리네박테리움 속 함유 균주 조성물에 의한 헬리코박터 파일로리 연관 항산화 매개 세포보호 효능 검정
상기 실시예 1-3의 방법과 같이 H. pylori 로 감염된(100 MOI) RGM1 세포에 6시간 동안 1/40 농도로 희석한 그룹 1 내지 8의 조성물 40㎕을 각각 처리하였다. 이후, 대표적인 세포보호인자(cytoprotective factor)인 항산화 기능의 HO-1 mRNA의 발현 변화를 실시예 3에 따른 방법(PCR)으로 분석하여 도 4a에 나타내었고, HO-1 및 GST(glutathione-s-transferase(pi)) 단백질 발현 변화를 실시예 3에 따른 방법(웨스턴 블롯 분석)과 유사하게 분석하여 도 4b에 나타내었다.
그 결과, 도 4a 및 도 4b와 같이 대조군에서는 헬리코박터 파일로리 감염 후 HO-1 mRNA 및 단백질 발현의 유의한 감소가 관찰되었고, 그룹 6 내지 8 처리군에서 감소된 HO-1 발현이 현저히 증가되었으며 그 중에서도 그룹 6 처리군에서 HO-1의 발현이 가장 현저하게 증가되었다. 또한 도 4b에 나타난 바와 같이, 그룹 6 및 7에서 GST(pi) 발현이 현저히 감소되었고, 그 중에서도 그룹 6 처리군에서 GST(pi) 발현이 가장 유의하게 감소되었다.
상기 결과로부터 일 예에 따른 조성물은 헬리코박터 균주에 대해 HO-1 반응에 주로 기반하는 항산화 작용 및 세포 보호 효능을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실시예 6. in vitro 에서 코리네박테리움 속 함유 균주 조성물에 의한 헬리코박터 파일로리 연관 세포자가사멸 저해 효능 검정
상기 실시예 1-3의 방법과 같이 H. pylori 로 감염된(100 MOI) RGM1 세포를 6시간 동안 1/40 농도로 희석한 그룹 1 내지 8의 조성물 40㎕로 각각 처리하였다. 이후, 실시예 3의 방법과 유사하게, 웨스턴 블롯을 통해 Bcl-2 및 Bax의 발현양을 확인하여 그 결과를 도 5a에 나타내고, TUNEL 염색으로 아폽토시스(세포사멸)를 분석하여 그 결과를 도 5b에 나타내었다. 구체적으로, TUNEL 염색은 세포를 Lab-Tek chamber slide에 1x105개/chamber로 분주한 다음 37℃ 세포배양기(95% air, 5% CO2)로 배양하였다. 이후 각각의 시약을 일정 시간 처리한 후 아폽토시스 검출 키트(apoptosis detection kit, Oncogene Research Products, Cambridge, MA)를 사용하여 제조회사의 실험방법대로 수행하였다. 배양액을 제거하고 PBS 용액으로 3회 세척 후 4% PFA(paraformaldehyde)를 첨가하여 상온에서 20분간 고정하였다. PBS로 다시 2 회 세척 후 0.1% Triton X-100을 4℃에서 5분간 처치하고 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)와 뉴클레오타이드 혼합물(nucleotide mixture)을 혼합하여 만든 용액으로 37℃에서 빛 차단한 후 60 분 간 반응시켰다. PBS로 세척하고 난 후, 형광 현미경으로 세포자멸사를 관찰하였다.
도 5a에 나타난 바와 같이 H. pylori 로 감염된 세포(H.p)에서 Bcl-2의 발현 감소와 Bax의 발현 증가를 관찰할 수 있었고, 그룹 6 내지 8 처리군에서 현저히 증가된 Bax 발현이 감소하고, 감소된 Bcl-2의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었고, 그 중에서도 그룹 6 처리군에서 효과가 가장 우수하였다.
헬리코박터 파일로리 감염은 세포사멸의 유의한 증가에 의하여 점막 손상 및 궤양을 유발하는 것으로 알려져 있고, 도 5b에 나타난 바와 같이 TUNEL 염색 결과에서도 헬리코박터 파일로리 감염에 의해 통계적으로 유의한 아폽토시스(apoptosis)의 증가가 관찰되었으나(P<0.01), 그룹 6 내지 8 처리군에서 현저하게 아폽토시스가 감소되었고, 그 중에서도 그룹 6 처리군에서 가장 아폽토시스가 감소되었다.
실시예 7. in vitro에서 코리네박테리움 속 함유 균주 조성물에 의한 헬리코박터 파일로리 연관 세포성장, 혈관성장, 그리고 증식인자의 변화 검정
상기 실시예 1-3의 방법과 같이 H. pylori 로 감염된(100 MOI) RGM1 세포를 6시간 동안 1/40 농도로 희석한 그룹 1 내지 8의 조성물 40㎕로 각각 처리하였다. 이후, 실시예 3의 방법과 유사하게, 웨스턴 블롯으로 TGF-β 및 VEGF의 변화를 분석하여 그 결과를 도 6a에 나타내었다.
그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이 헬리코박터 감염 후 증가된 TGF-β 및 VEGF 는 무분별한 점막 증식이나 암성 염증을 조장하게 되는데 반하여 그룹 6 내지 8 처리군에서 TGF-β 및 VEGF의 발현을 유의미하게 감소시켰고, 특히 그룹 6 처리군에서 가장 TGF-β 및 VEGF의 발현이 감소되었다. 이로부터 일 예에 따른 조성물은 헬리코박터 파일로리 감염에 의한 제반 염증이나 암화를 완화시킬 수 있는 결과를 보여주었다.
또한, 헬리코박터 파일로리가 감염된 세포에서 nuclear fraction을 활용하여 β-catenin의 핵 이입(nuclear transfer)을 웨스턴 블롯으로 확인하고 그 결과를 도 6b에 나타내었다. 도 6b에 나타난 바와 같이, 헬리코박터 파일로리의 감염에 의해 증가된 β-catenin의 핵 이입(nuclear transfer)을 그룹 6의 처리에 의하여 현저히 저해시킬 수 있는 것을 확인하였다.
상기 실시예 1 내지 7의 모든 실험값은 T-test를 통한 방법으로 통계 검증하였고, p<0.05 이상일 경우를 통계적으로 유의하다고 정의하였다.
실시예 8. 트레오닌을 포함하는 샘플의 제조
C. glutamicum 야생형 균주(CJ제일제당 BIO R&D Center(Blossom park))를 트레오닌 생산용 브로스(표 1)에 접종하여, 35℃, 200 rpm조건에서 48시간 동안 배양하여 제조한 발효 브로스(Fermentation broth)를 정제 및 결정화하여 샘플 1을 제조하였다. 샘플 1은 분말 형태의 정제된 트레오닌을 99중량% 이상 포함하였다.
C. glutamicum 을 트레오닌 생산용 배지에서 배양하여 수득한 발효 브로스(C. glutamicum 포함)를 직접 건조(60 내지 70℃에서 열풍 건조)하여 샘플 2를 제조하였다. 또한 C. glutamicum 를 상기 조건으로 배양하여 수득한 발효 브로스에 다양한 함량으로 리그닌설폰산칼슘(calcium-lignosulfonate, Aladdin industrial Co., Shanghai, Chana)을 첨가하고, 리그닌설폰산칼슘이 첨가된 발효 브로스(C. glutamicum 포함)를 건조하여(60 내지 70℃에서 열풍 건조), 샘플 3 내지 5를 제조하였다. 샘플 2내지 5는 열풍 건조를 통해 C. glutamicum를 사균체의 형태로 포함하였다.
샘플 2 내지 5는 약 200 내지 1000㎛의 입도를 갖는 과립 형태로 제조되었다. 샘플 1 내지 5의 구성성분 및 함량은 표 4에 기재하였다. 표 4에서, Thr(중량%), 리그닌설폰산칼슘(중량%), 및 나머지 발효물 성분(C. glutamicum 균체 포함)(중량%)은 상기 발효 브로스를 건조하여 제조된 건조물 내의 중량%를 의미하고, 건조물 중 발효물은C. glutamicum 균주를 포함한다. 또한, 발효물 내 포함되는 C. glutamicum 균주의 함량을 표 4에 기재하였다.
Thr(중량%) 발효물 (중량%) 발효물 내 C. glutamicum (중량%)1 리그닌설폰산칼슘(중량%)
샘플 1 100.0 - - -
샘플 2 75 25.0 4.0 0.0
샘플 3 70 23.3 3.8 6.7
샘플 4 65 21.7 3.5 13.3
샘플 5 60 20.0 3.2 20.0
1 발효물 내 균체 함량을 건조하였을 때로 환산한 값
실시예 9. SRMD(stress-related mucosal disease)를 위한 WIRS(Water immersion-restraint stress) 모델 준비
총 110 마리의 SD 랫트를 Charles River(Osaka, Japan)에서 구입하여 동물시설에 보관하였다. 실험동물은 AAALAC International Animal Care Policies에 따라 공인 동물시설에서 취급되었다. 동물들은 WIRS 노출되기 24시간 전에 절식시켰으며, 물은 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다. 각 그룹의 10 마리의 쥐를 WIRS용 케이지에 넣고 6시간 동안 물에 담갔다.
WIRS 처리 8시간 전에 상기 실시예 8에서 제조된 샘플 1 내지 샘플 5를 동일한 트레오닌이 투여(0.15 중량%/diet)되도록 랫트에 경구 투여하고, WIRS를 6시간 동안 적용 후 동물을 희생시키고 위를 적출하고, 절개 및 내용물을 제거하여, 위장 내면의 사진을 찍고 이를 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타난 바와 같이, 랫트의 위조직을 육안으로 살펴본 결과 WIRS 유발군(도 11에서 두번째 행)에서 위출혈이 발생하였고, 샘플1 < 샘플5 < 샘플4 < 샘플3 또는 샘플2 순으로 위출혈 정도가 감소한 것(위궤양 치료효과 우수한 것)을 확인할 수 있었다.
한편, 추후 실험은 하기 표 5에 표시된 바와 같이 4개 동물실험군으로 나누어 실시하였다. 식염수의 경구투여 이후 아무 처리를 하지 않은 무처리군(양성대조군, 동물실험군 1), 6시간 동안 WIRS를 적용한 WIRS 그룹(음성대조군, 동물실험군 2), WIRS처리 8시간 이전에 샘플 1(실시예 8에서 제조)이 0.15 중량% 함유된 사료(동물실험군 3)와 샘플 3(실시예 8에서 제조)이 0.21 중량% 함유된 사료(동물실험군 4)를 각각 30 mg/kg body으로 경구 처리한 동물실험군으로 나누었다. 동물실험군 3과 4의 사료 내 L-Thr(L형-트레오닌) 함유량은 0.15 중량%/diet로 동일하게 설정하였다.
동물실험군 실험동물 WIRS유발 시험물질(WIRS 처리 8시간 전 공급) 투여용량(중량%/diet) 동물수
1 랫트(Rat) 없음 양성대조구(No-stress, No-Thr) 0 10
2 6시간 동안 WIRS 유발 음성대조구(No-Thr) 0 20
3 샘플 1(실시예 8; L-Thr) 0.15 10
4 샘플 3(실시예 8; L-Thr + C. glutamicum 발효물(균체 포함)) 0.21 10
모든 실험동물(랫트)은 WIRS 6시간 후 높은 복용량의 마취제(thiopental sodium, 50 mg/kg)로 희생되었다.
하기 실시예 10 내지 12에 기재된 동물실험군 1-4는 상기 표 5의 동물실험군 1-4를 의미하고, 도 7a 내지 도 10에서 그룹(group) 1-4는 표 5의 동물실험군 1-4를 의미한다.
실시예 10. SRMD(Stress-related　mucosal disease) 개선 효능 검정
상기 실시예 9에서 희생된 랫트의 위를 절개하여 더 큰 곡률(curvature)을 따라 개방한 다음 차가운 PBS 용액으로 세척하였다. 확대사진을 통해 침식(erosions)또는 궤양(ulcers)의 수와 크기를 결정한 후 해부학적 관찰을 위해 절반을 해부했다. 절제된 위는 플라스틱 시트 위로 펴고 10% 완충 포르말린에 4시간 동안 고정시키고 파라핀 티슈 슬라이드 제작에 사용되었고, 나머지 반은 분자생물학적 관찰을 위해 액체 질소 탱크에 보관했다. 또한 점막의 균질액(mucosal homogenate)은 동일 동물실험군을 혼합하여 보관하였다.
현미경을 이용하여 육안으로 위 시료를 관찰하고(도 7a), 대조군 및 각 실험군(동물실험군 1-4)에서 병변 점수, 염증; 병리적 점수, 궤양/침식; 병리적 점수, 재생; 병리적 점수를 계산하여 도 7b에 나타내었다. 도 7a에 나타난 바와 같이, 침식, 출혈 및 궤양과 같은 SRMD의 유의한 발생이 모든 동물실험군 2의 랫트에서 나타났으나, 동물실험군 3 또는 동물실험군 4에서 SRMD가 유의하게 개선되었다. 도 7b에 나타난 바와 같이, 병변 점수(gross lesion index), 염증; 병리적 점수(Inflammation; pathologic score), 궤양/침식; 병리적 점수(Ulcer/erosin; pathologic score), 재생; 병리적 점수(Regeneration; pathologic score)는 동물실험군 3 및 4에서 유의하게(p <0.05) 개선되었고, 특히 동물실험군 4의 병변점수는 동물실험군 3에 비해 유의하게 낮았으며, 재생; 병리적 점수는 동물실험군 3보다 유의하게 개선되었다.
실시예 11. 항염증 효능 검정
SRMD는 허혈-재관류(ischemic-reperfusion) 손상과 병리 생리학적으로 연관되어 있기 때문에 동물실험군 1 내지 4에서 PDGF(platelet-derived growth factor)를 포함한 혈관신생(angiogenisis) 성장인자의 mRNA 발현과 염증 매개인자인 iNOS, TNF-α, IFN-γ, 및 PDGF의 mRNA 발현을 측정하고 그 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타내었다.
구체적으로, 총 RNA는 RNeasy Mini 키트(Qiagen Korea, Seoul, Korea)를 사용하여 추출하였다. 염증성 사이토카인 및 매개인자의 발현 측정에 사용된 프라이머를 하기 표 6에 나타내었다. 증폭은 Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2400을 사용하여 10x 반응 완충액(Promega Korea, Seoul, Korea), 1.5mM/L MgCl2, 200mM/L 데옥시뉴클레오티드트리포스페이트(dNTP), 각 프라이머 1mM/L 및 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase, Promega) 2.5 unit을 이용하여 분석하였다. 각 사이클은 95℃에서 1분간 변성, 55℃에서 45분간 어닐링(annealing), 72℃에서 45초 동안 증폭으로 구성되었다.
Gene Forward Primer(5'→ 3') Reverse Primer(5'→ 3')
IL-8 CACTCCCAGCATCGTAGAGC(서열번호 15) CAGTGTACTTGTGGCGTGGA(서열번호 16)
iNos TTTTCCCAGGCAACCAGACG(서열번호 17) GTAGCGGGGTTCAGAATGG(서열번호 18)
IFN-γ ATCCATGAGTGCTACACGCC(서열번호 19) TCTGTGGGTTGTTCACCTCG(서열번호 20)
HIF-1α TATCACTGGACTTCGGCAGC(서열번호 21) GCTGCCGAAGTCCAGTGATA(서열번호 22)
PDGF AGGAAGCCATTCCCGCAGTT(서열번호 23) CTAACCTCACCTGGACCTCT(서열번호 24)
VEGF CAATGATGAAGCCCTGGAGT(서열번호 25) GATTTCTTGCGCTTTCGTTT(서열번호 26)
TNF-α CCCTCACACTCAGATCATCTTCTCAA(서열번호 29) TCTAAGGTACTTGGGCAGGTTGACCTC(서열번호 30)
GAPDH GGTGCTGAGTATGTCGTGGA(서열번호 27) TTCAGCTCTGGGATGACCTT(서열번호 28)
또한 각 동물실험군 1-4에서 p-IκBα, p-ERK 및 p-JNK 의 단백질 수준을 측정하여 도 8c 및 도 8d에 나타내었다. 구체적으로, 단백질 수준을 측정하기 위한 웨스턴 블롯을 수행하기 위해, 채집된 위 점막(Gastric mucosa)을 2mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 0.5mM EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid), 300mM 슈크로스(sucrose) 및 2mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 함유하는 ice-cold 20mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5)에서 조직 균질기(tissue homogenator)로 균질화시켰다. 30㎍의 단백질을 8% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 겔에서 전기영동한 후, 세미드라이 트렌스퍼 시스템(Semidry transfer system, Hoefer, Holliston, MA, USA)을 사용하여 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막에 옮겼다. 비특이적 결합은 5% 탈지분유(non-fat dry milk)로 배양하여 막았다. 막을 4℃에서 1 차 항체의 500배 희석액과 함께 하룻밤 동안 항온 배양한 후, 1:1000으로 희석한 HRP(horseradish peroxidase) 결합-2차 항체로 배양하였다. ECL 검출 키트(ECL detection kit, Amersham Biosciences Korea, Seoul, Korea)를 이용하여 면역 복합체를 검출하고 X-ray 필름에 자동 방사선 조사하였다. 웨스턴 블롯에 사용한 항체는 다음과 같다. β-actin, iNOS(nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase), P-JNK(phosphor-JNK), P-ERK(phosphor-ERK), Bcl-2(B-cell lymphoma 2), Bax(B-cell lymphoma-2-associated X-protein), 및 cyclin D1 항체는 Santa Cruz Biotechnolgy(Santa Cruz, CA)로부터 구입하였다. p-IκBα(phosphorylated inhibitor of kappa B alpha), p-STAT3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3), PARP(poly(ADP-ribose) polymerase), CDK4(cyclin-dependent kinase 4), 및 CDK2(cyclin dependent kinase 2)는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA)로부터 구입하였다. HO-1(A heme oxygenase-1) 항체는 Enzo life Sciences(Farmingdale, NY)로부터 구입하였다.
도 8a에 나타난 바와 같이, 동물실험군 2(WIRS 유도된 SRMD)에서 iNOS, TNF-α, 인터페론 감마(IFN-γ)의 mRNA 발현이 유의하게 증가하였으나, 증가된 염증 매개인자(iNOS, TNF-α, IFN-γ)의 발현은 동물실험군 3 또는 동물실험군 4에서 유의하게 감소하였고(P <0.01 또는 P <0.05, 도 8a), TNF-α 및 iFN-γ의 발현은 특히 동물실험군 4에서 동물실험군 3 보다 유의적으로 감소하였다(P <0.05, 도 8a).
도 8b에 나타난 바와 같이, 혈관신생 성장인자인 PDGF의 발현은 동물실험군 2에서 유의하게 증가하였으나, 동물실험군 3 또는 동물실험군 4에서 유의하게 감소했고(P<0.01, 도 8b), 특히 동물실험군 4에서 그 감소 정도가 더 높았다.
도 8c에 나타난 바와 같이, p-IκBα의 발현양을 단백질 수준에서 측정한 결과, 동물실험군 2에서 WIRS에 의해 p-IκBα의 발현이 유의하게 감소하고, p-IκBα의 발현 감소는 NF-κB의 전사적 활성화와 연관되어 있다. 반면, 동물실험군 4에서 감소된 p-IκBα의 발현이 유의하게 증가하였고(P<0.01, 도 8c), 동물실험군 3 보다 p-IκBα의 발현이 유의하게 증가하였으며(P<0.01, 도 8c), p-IκBα의 발현이 증가는 NF-kB의 레독스 저해(redox inhibition)를 유발한다.
한편, 국소빈혈 및 염증과 관련된 신호전달과 관련하여 도 8d에 나타난 바와 같이, 동물실험군 2에서, p-ERK 및 p-JNK 활성화가 나타났으며, 동물실험군 4에서 상기 신호전달은 전부 비활성화 되었으나, 동물실험군 3에서 부분적으로 비활성화되었다(P<0.01).
실시예 12. 위점막 보호 효능 검정
침식 또는 궤양을 일으키는 SRMD는 해당 영역에서 증가된 아폽토시스, 즉 세포자가사멸을 나타내므로, 동물실험군에 따른 위점막 상의 아폽토시스를 측정하였다. 구체적으로, TdT FragEL DNA 분열 검출 키트(TdT FragEL DNA fragmentation detection kit, Oncogene Research Products, Cambridge, MA) 및 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling) 방법을 이용하여 세포자가사멸을 시각화하였다. 각 실험군에서 아폽토시스가 대량 발생하는 영역(apoptotic hot spot)을 찾아 AI(apoptotic index)를 측정하기 위하여, TUNEL-면역 염색 부분(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling(TUNEL)-immunostained section)을 100 배 확대하여 스캔 하였다. 그런 다음, 400 필드에서 TUNEL-양성 세포의 수를 계수하여 AI를 기록하였다. 부식성 또는 궤양성 병변을 포함하는 절편에서 적어도 5 개의 핫스팟을 무작위로 선택하여 평균 계수를 결정하였고, 도 9a에 그 결과를 나타내었으며 결과는 총 세포 수의 평균 백분율로 표시되었다. 도 9a에 나타난 바와 같이, 아폽토시스(세포자가사멸)는 동물실험군 2에서 동물실험군 1보다 유의적으로 증가되었고, 증가된 아폽토시스 수준이 동물실험군 2 대비 동물실험군 3과 동물실험군 4에서 유의하게 감소되었으며(P<0.01, 도 9a), 동물실험군 3대비 동물실험군 4에서 유의적으로 낮은 수준으로 관찰되었다(P<0.01, 도 9a).
TUNEL 결과를 검증하기 위해, 세포자가사멸 방지 단백질인Bcl-2 및 세포자가사멸을 유도하는 cleaved PARP, Bax, cleaved caspase-8, cleaved caspase-3 발현에 대해 상기 실시예 11의 방법과 같이 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 그 결과를 도 9b에 나타내었다.
도 9b에 나타난 바와 같이, 동물실험군 2에서 PARP 분열, Bax, cleaved caspase-8, 및 cleaved caspase-3 발현은 유의하게 증가하였고, 증가된 PARP 분열, Bax, cleaved caspase-8, 및cleaved caspase-3 발현이 동물실험군 3 및 4에서 유의하게 감소하였고, 동물실험군 3에 비해 특히 동물실험군 4에서 유의적으로 낮은 수준으로 관찰되었다. 한편, 세포자가사멸 방지 단백질인 Bcl-2 발현은 동물실험군 4에서 유의하게 증가하였다(도 9b).
세포주기(cell cycle) 관련 유전자인 CDK4, Cyclin D1 의 활성을 실시예 11에 따른 방법으로 단백질 수준에서 확인하여 그 결과를 도 9c에 나타내었다. 도 9c에 나타난 바와 같이, CDK4 및 Cyclin D1의 발현은 동물실험군 2에서 유의하게 증가되었고(P <0.01), 증가된 CDK4 및 Cyclin D1의 발현은 동물실험군 3 및 4에서 유의하게 감소되었다. 특히, 동물실험군 3 보다 동물실험군 4에서 CDK4와 Cyclin D1의 발현이 유의적으로 낮았다(도 9c, P<0.01 ~ 0.05).
동물실험군 1 내지 4의 위 조직에서 PAS 염색을 통해 뮤신(Mucin) 함량을 확인하여 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이, 동물실험군2에서 유의하게 낮은 수준의 위 점액(gastric mucin)이 관찰되었으며(P <0.01), 위 점액의 발현은 동물실험군 3 및 4에서 유의하게 보존되었고, 동물실험군 3 보다 4에서 점액 발현이 유의적으로 높았다(P<0.01).
상기와 같은 결과로부터 WIRS는 점막 완정성(mucosal integrity)를 위협하였으나 일 예에 따른 조성물(샘플)의 전처리로 인해 이러한 위협이 완화되는 것을 알 수 있었다.
상기 실시예 8 내지 11의 결과는 평균±SD로 표현된다. 데이터는 일원 분산 분석(ANOVA)에 의해 분석되었고, 그룹간의 통계적 유의성은 Duncan의 다중 범위 테스트에 의해 결정되었다. 통계적 유의성은 P<0.05로 수렴하였다.
이상의 설명으로부터, 본원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는, 위장질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 또는 이의 조합인, 사료 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 사균체인, 사료 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배양물은 코리네박테리움 속 균주를 배지에서 배양한 발효물인, 사료 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 배지는 트레오닌 생산용 배지인, 사료 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 트레오닌을 60 내지 80중량%로 포함하는, 사료 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주 및 이의 배양물은 건조된 형태로 포함되는, 사료 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 위장질환은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염에 의한 것인, 사료 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 위장질환은 위염, 위궤양, 십이지장궤양, 소화성 궤양, 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 사료 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레오닌은,
    (1) 상기 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 또는 이들 모두에 포함되거나;
    (2) 별도로 첨가되거나;
    (3) 상기 코리네박테리움 속 균주, 이의 배양물, 또는 이들 모두에 포함되고, 여기에 추가로 첨가된 것인,
    사료 조성물.
  11. 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는, 위장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는, 위장질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  13. 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주, 이의 배양물, 및 트레오닌을 포함하는, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)에 대한 항균용 조성물.
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