WO2022158641A1 - 신규 리조푸스 올리고스포러스 균주 및 이를 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

신규 리조푸스 올리고스포러스 균주 및 이를 포함하는 항균 조성물 Download PDF

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유형석
권희수
전은정
오지영
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    • C12R2001/845—Rhizopus

Definitions

  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 Rhizopus oligosporus CJCC02-20
  • An antibacterial composition comprising, as an active ingredient, any one or more selected from the group consisting of the strain, the spore of the strain, the culture of the strain, its concentrate, and its dried product; a food composition comprising the antimicrobial composition; feed composition; quasi-drug composition; health functional food composition; Or it relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of microbial infections caused by fungi, bacteria, or a combination thereof, including the antibacterial composition.
  • Fermented food manufactured in a traditional way is always vulnerable to fungi and food poisoning bacteria during the storage, manufacturing and distribution of raw materials. Fungi and food poisoning-causing bacteria are known to survive heat treatment and cause spoilage and spoilage of food or food poisoning.
  • bacteriocin refers to a natural antibacterial protein or protein-based material produced by microorganisms. Since Bacteosin is a protein, it can be decomposed in the human body, and thus its safety has been proven. In contrast to the secondary metabolites of existing antibiotics that cause side effects in the human body, the need for research on bacteriocins is increasing. With respect to the bacteriocin, studies on lactic acid bacteria-derived bacteriocins have been predominant until recently. Lactobacillus-derived bacteriocin has the advantage of being proven safe with a GRAS grade, but it is not widely used because the antibacterial activity range is specific to Gram-positive bacteria.
  • Rhizopus oligosporus In relation to the antibacterial properties of Rhizopus oligosporus, antibiotic peptide (ABP) and Linoleic acid, which are antibacterial substances produced from the culture medium of Rhizopus oligosporus, are known to control the gram-positive genus Straphyloccoccus and Bascillus (Roubos-van den den). Hil et al., 2010). However, only antibacterial activity against specific microorganisms that are gram-positive has been reported, and there is no report on the effect on various strains causing decomposition or food poisoning.
  • Rhizopus oligosporus is a useful bacterium in fermented food, when the bacteriocin is applied to fermented food, it is difficult to see that it exhibits specific activity even in decomposing fungi and food poisoning bacteria, so it is difficult to industrialize and manufacture and distribute fermented food. have.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 newly isolated from tempe has antibacterial activity against fungi as well as Rather, the present application was completed by confirming that there is an antibacterial activity that specifically inhibits only major harmful microorganisms in food such as food poisoning bacteria.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 Rhizopus oligosporus CJCC02-20
  • An antibacterial composition comprising, as an active ingredient, any one or more selected from the group consisting of the strain, the spore of the strain, the culture of the strain, its concentrate, and its dried product; a food composition comprising the antimicrobial composition; feed composition; quasi-drug composition; It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating microbial infections caused by fungi, bacteria, or a combination thereof, comprising a health functional food composition or the antibacterial composition.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain deposited with accession number KCCM12893P.
  • Another object of the present application is to include as an active ingredient any one or more selected from the group consisting of the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain, the spore of the strain, the culture of the strain, its concentrate, and its dried product, To provide an antibacterial composition.
  • Another object of the present application is to provide a food composition comprising the antibacterial composition.
  • Another object of the present application is to provide a feed composition comprising the antibacterial composition.
  • Another object of the present application is to provide a quasi-drug composition comprising the antibacterial composition.
  • Another object of the present application is to provide a health functional food composition comprising the antibacterial composition.
  • Another object of the present application is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating microbial infections caused by fungi, bacteria, or a combination thereof, including the antibacterial composition.
  • the antibacterial composition comprising the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain according to the present application has antibacterial activity against fungi and bacteria, it can be usefully used as food, medicine, quasi-drug, health functional food, etc.
  • one aspect of the present application provides a Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain deposited with accession number KCCM12893P.
  • the present inventors have identified a novel strain belonging to Rhizopus oligosporus having excellent antibacterial activity against fungi and food poisoning-causing bacteria that cause deterioration and contamination of fermented food as follows.
  • Rhizopus oligosporus As a result of isolating various kinds of Rhizopus oligosporus from conventional tempeh and testing for fungi, yeast, etc., and food poisoning bacteria, a strain with excellent antibacterial activity, Rhizopus oligosporus, was selected, and gene sequencing was performed to identify the selected strain. Analysis was performed.
  • the 18S rRNA nucleotide sequence of the selected strain is described in SEQ ID NO: 1
  • the antibiotic peptide (ABP) gene sequence is described in SEQ ID NO: 2
  • Chitinase (Chi2) gene sequence is described in SEQ ID NO: 3.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 Rhizopus oligosporus CJCC02-20, and was sent to the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM), an international depository under the Budapest Treaty, on December 09, 2020. It was deposited on the date and was given accession number KCCM12893P.
  • KCCM Microorganism Conservation Center
  • the newly isolated Rhizopus oligosporus CJCC02-20 has excellent antibacterial activity against fungi and food poisoning-inducing bacteria, and exhibits antibacterial activity capable of simultaneously acting on various fungi and food poisoning-inducing bacteria. (Example 3).
  • the fungi and bacteria may be of the genus Aspergillus , the genus Bacillus , and the genus Escherichia , but is not limited thereto.
  • the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 is a fungus Aspergillus oryzae ), Aspergillus niger ( Aspergillus niger ) or a combination thereof to have antibacterial activity.
  • Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae
  • Aspergillus niger Aspergillus niger
  • a combination thereof to have antibacterial activity.
  • it is not limited to the type of the fungus.
  • the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 may have antibacterial activity against Bacillus cereus , Escherichia coli , or a combination thereof, but depending on the type of bacteria It is not limited.
  • the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 may have specific antibacterial activity against Aspergillus duck material, Aspergillus niger or E. coli, but is not limited thereto.
  • the Aspergillus duck material and Aspergillus niger are known as strains that cause deterioration and contamination of fermented food, and Bacillus cereus and E. coli are known as food poisoning-causing bacteria, and Rhizopus oligospo having excellent antibacterial activity. Russ CJCC02-20 can be used for various purposes.
  • the present application relates to the novel isolated Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain, the spores of the strain, the culture of the strain, its concentrate, its extract, and its dried product. Any one or more selected from the group consisting of; and a carrier.
  • the carrier may be a naturally or non-naturally occurring carrier.
  • the dried product may be a freeze-dried product.
  • composition may further include a cryoprotectant.
  • a cryoprotectant selected from the group consisting of glycerol, trehalose, maltodextrin, powdered skim milk and starch may be further included.
  • the cryoprotectant of the present application may be included in 0.01 wt% to 20 wt%, 0.01 wt% to 10 wt%, based on the total weight of the composition of the present application, specifically, the glycerol of the present application is 5 wt% to 20 wt%, the present application of trehalose is 2 wt% to 10 wt%, maltodextrin of the present application is 2 wt% to 10 wt%, skim milk powder of the present application is 0.5 wt% to 2 wt%, and starch of the present application is 0.1 wt% to 1 wt% % may be included in the composition of the present application.
  • the present application relates to the novel isolated Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain, the spores of the strain, the culture of the strain, its concentrate, its extract, and its dried product It provides an antibacterial composition comprising any one or more selected from the group consisting of as an active ingredient.
  • the state of the strain may be a liquid state or a dry state, but is not limited thereto.
  • the antibacterial composition may have antibacterial activity against fungi, bacteria, or a combination thereof, and specifically, may have specific antibacterial activity against Aspergillus duck material, Aspergillus niger or E. coli, and Bacillus cerebellum. It may have an enhanced antibacterial activity in the mouse, but is not limited thereto.
  • spore refers to a propagation cell such as bacteria, and for the purpose of the present application, the spore refers to a propagation cell of Rhizopus oligosporus CJCC02-20.
  • the spores of the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 exhibit antibacterial activity against fungi and food poisoning bacteria, and thus can be used in foods, feeds, pharmaceuticals, quasi-drugs, and health functional foods having antibacterial activity.
  • the term "culture” refers to a product obtained after culturing the strain, and may be a culture stock solution including cells, or may be cells obtained by removing or concentrating cultured strains and culture supernatant.
  • the composition of the culture may additionally include not only the components necessary for the conventional Rhizopus oligosporus culture, but also a component that acts synergistically on the growth of the Rhizopus oligosporus, and the composition according to the conventional skill in the art. It can be easily selected by those who have it.
  • concentration refers to the concentration of the culture.
  • extract refers to an extract from the culture or its concentrate, and is not limited thereto, as long as it is an extract capable of exhibiting a specific antibacterial effect on fungi and bacteria of the present application, but is not limited thereto. of the diluted or concentrated solution, the dried product obtained by drying the extract, or these crude products or purified products, and all fractions obtained by fractionation thereof.
  • dried product means drying the culture, its concentrate, its extract, and its fraction.
  • the drying method may include, but is not limited to, ventilation drying, natural drying, spray drying and freeze drying.
  • the novel isolated Rhizopus oligosporus CJCC02-20 of the present application may be cultured through a conventional culturing method of the Rhizopus oligosporus strain, but is not limited thereto.
  • the medium a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • a carbon source of the medium for example, glucose, sucrose, dextrin, glycerol, starch, etc. may be used, and as a nitrogen source, peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, soybean, ammonium salt, nitrate and other organic or inorganic Nitrogen containing compounds may be used, but are not limited to these components.
  • As the inorganic salt contained in the medium magnesium, manganese, calcium, iron, phosphorus, etc. may be used, but is not limited thereto.
  • amino acids, vitamins, nucleic acids and related compounds may be added to the medium.
  • the antibacterial composition may include other by-products generated in the process of culturing Rhizopus oligosporus CJCC02-20 together.
  • the present application provides a food composition comprising the antibacterial composition.
  • the type of the food is not particularly limited, and may include all foods in a conventional sense.
  • foods to which the above substances can be added include soy sauce, fermented foods including salted fish, sauces, meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream Dairy products including dairy products, various soups, beverages, teas, drinks, alcoholic beverages, and vitamin complexes are included.
  • the composition may be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the food composition may be a fermented food, specifically soy sauce, salted fish, and more specifically tempe, but is not limited thereto.
  • the food composition may be a sauce containing tempeh, but is not limited thereto.
  • the food composition may include a food pharmaceutically acceptable carrier.
  • the type of the carrier is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art may be used.
  • the food composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve odor, taste, and vision.
  • vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, pantothenic acid, and the like may be included.
  • minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu), chromium (Cr); and amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, and valine.
  • the food composition includes a preservative (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.), a disinfectant (bleaching powder and high bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.), an antioxidant (butylhydroxyanisole (BHA), butyl hydro Loxytoluene (BHT), etc.), coloring agents (tar pigments, etc.), coloring agents (sodium nitrite, sodium nitrite, etc.), bleach (sodium sulfite), seasonings (MSG sodium glutamate, etc.), sweeteners (dulcin, cyclamate, saccharin, etc.) , sodium, etc.), flavorings (vanillin, lactones, etc.), expanding agents (alum, D-potassium hydrogen tartrate, etc.), strengthening agents, emulsifiers, thickeners (flavors), film agents, gum base agents, foam inhibitors, solvents, improving agents, dispersing agents, etc. of food additive
  • the present inventors found that the newly isolated Rhizopus oligosporus CJCC02-20 of the present application is an enteric fermented fungus, Aspergillus duck material, Aspergillus niger, a food contamination source, Bacillus cereus, a food poisoning bacterium, and enteropathogenic bacteria. It was confirmed that there is an effect of simultaneously inhibiting E. coli (Example 3, Fig. 1), and as a result of applying the antibacterial composition to tempeh, a fermented food, it was confirmed that it was possible to maintain the effect of controlling food poisoning bacteria while realizing the traditional flavor ( Example 4), it can be used directly for all foods, including fermented foods.
  • the present application provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a microbial infection, including the antibacterial composition.
  • prevention may refer to any action of inhibiting or delaying the onset of a microbial infection disease by administering the composition for preventing or treating a microbial infection disease according to the present application to an individual.
  • treatment may refer to any act of administering the composition of the present application to a subject suspected of having a microbial infection disease to improve or benefit the symptoms of a microbial infection disease.
  • the term “improvement” may refer to any action that at least reduces a parameter related to the condition being treated, for example, the degree of symptoms.
  • the term “individual” may refer to any animal, including humans, that has or is likely to develop a microbial infection disease.
  • the microbial infection disease may be a disease caused by infection by a microorganism, preferably a disease caused by infection by a fungus or bacteria.
  • the fungus may be Aspergillus duck material, Aspergillus niger, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the bacteria may be Bacillus cereus, E. coli, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the microbial infection disease may be any one or more selected from the group consisting of food poisoning, diarrhea, vomiting, enteritis, gastroenteritis, constipation, abdominal pain and abdominal distension, but is not limited thereto.
  • the enhanced antibacterial activity against Bacillus cereus, a bacterium that can cause food poisoning, and specific antibacterial activity against enteropathogenic E. coli were confirmed, and the fungi Aspergillus duckjae and Aspergillus As the specific antifungal activity against Niger was confirmed, the antibacterial composition of the present application can be effectively used in a pharmaceutical composition for preventing or treating microbial infectious diseases.
  • composition for preventing or treating a microbial infection may further include a pharmaceutically acceptable carrier, and is formulated with the carrier to provide food, health functional food, pharmaceuticals, quasi-drugs, feed additives and drinking water additives, etc. can be provided as
  • the term “pharmaceutically acceptable carrier” may refer to a carrier or diluent that does not inhibit the biological activity and properties of an administered compound while not irritating to an organism.
  • the type of carrier usable in the present application is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art and pharmaceutically acceptable may be used.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and the like. These may be used alone or may be used in combination of two or more.
  • antioxidants such as antioxidants, buffers and/or bacteriostats may be added and used, and diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants, etc. It can be used by formulating it into a dosage form, pill, capsule, granule, or tablet.
  • the method of administering the composition for preventing or treating a microbial infection according to the present application is not particularly limited, and may follow a method commonly used in the art.
  • the composition may be administered by oral administration or parenteral administration.
  • the composition for preventing, improving, or treating the microbial infectious disease of the present application may be prepared in various formulations according to the desired administration method.
  • the pharmaceutical dosage form of the antimicrobial substance of the present application may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt thereof, and may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds as well as in an appropriate group.
  • the present application provides a method for preventing or treating a microbial infectious disease comprising administering to an individual a composition for preventing or treating the microbial infectious disease.
  • a composition for preventing or treating the microbial infectious disease comprising administering to an individual a composition for preventing or treating the microbial infectious disease.
  • the term “individual” may refer to any animal, including humans, that has or is likely to develop a microbial infection disease.
  • the prevention or treatment method of the present application may include administering the composition in a pharmaceutically effective amount to an individual who has or is at risk of developing a microbial infection disease.
  • a suitable total daily amount of the composition containing the extract may be determined by the treating physician within the scope of correct medical judgment, and may be administered once or divided into several doses.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular patient depends on the type and extent of the response to be achieved, the specific composition, including whether other agents are used in some cases, the patient's age, weight, general health, It is preferable to apply differently depending on various factors including sex and diet, administration time, administration route and secretion rate of the composition, treatment period, drugs used together with or concurrently with a specific composition, and similar factors well known in the pharmaceutical field.
  • the antimicrobial substance of the present application may be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans by various routes. Any mode of administration can be envisaged, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the present application provides a health functional food for the prevention or improvement of microbial infectious diseases comprising the antibacterial composition.
  • health functional food is the same term as food for specific health, functional food, and health food, and is a medical, medical, It means a food with a high effect, and the food may be prepared in various forms such as tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. in order to obtain a useful effect in preventing or improving microbial infections.
  • the health functional food may include a food pharmaceutically acceptable carrier, which is as described above.
  • the health functional food of the present application can be manufactured by a method commonly used in the art, and at the time of manufacture, it can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the art.
  • the dosage form of the health functional food may also be manufactured without limitation as long as it is a dosage form recognized as a health functional food.
  • the health functional food of the present application can be manufactured in various types of dosage forms, and unlike general drugs, it has the advantage of not having side effects that may occur during long-term administration of the drug using food as a raw material, and has excellent portability. health functional food can be consumed as an adjuvant to enhance the prevention or improvement effect of microbial-infected diseases.
  • the food is a food prepared by adding the antimicrobial composition to food materials such as beverages, teas, spices, gum, and confectionery, or encapsulating, powdering, suspension, etc., for example, various foods, beverages, gum , tea, vitamin complex, health functional food, etc.
  • the food can be prepared in dosage forms such as tablets, granules, powders, capsules, liquid solutions and pills according to known manufacturing methods, and the content of the composition according to the present application can be adjusted according to the dosage form.
  • dosage forms such as tablets, granules, powders, capsules, liquid solutions and pills according to known manufacturing methods, and the content of the composition according to the present application can be adjusted according to the dosage form.
  • ingredients other than containing the antimicrobial composition according to the present application as an active ingredient, and various conventional flavoring agents or natural carbohydrates may be included as additional ingredients.
  • the present application provides a quasi-drug composition comprising the antibacterial composition.
  • the term "quasi-drug” refers to fibers, rubber products, or the like, which are used for the purpose of treating, alleviating, treating or preventing diseases of humans or animals, have weak action on the human body, or do not directly act on the human body.
  • non-machines and the like as an article corresponding to one of the preparations used for sterilization, insecticide and similar purposes for the prevention of infection type, for the purpose of diagnosing, treating, alleviating, treating or preventing diseases of humans or animals. It can refer to items other than instruments, machines, or devices, and items used for the purpose of pharmacologically affecting the structure and function of humans or animals, other than those that are not instruments, machines, or devices.
  • the quasi-drugs may include external preparations for skin and personal care products. Preferably, it may be a disinfectant cleaner, shower foam, gargrin, wet tissue, detergent soap, hand wash, or ointment, but is not limited thereto.
  • the quasi-drug composition may include a pharmaceutically acceptable carrier, as described above.
  • the present inventors have confirmed that the newly isolated Rhizopus oligosporus CJCC02-20 has an antibacterial effect on the fungi and bacteria, and the antibacterial composition using the novel strain can be effectively used for quasi-drugs.
  • the present application provides a feed composition comprising the antibacterial composition.
  • feed may refer to any natural or artificial diet, one meal, etc., or a component of the one meal meal, for or suitable for the animal to eat, ingest, and digest.
  • the type of feed is not particularly limited, and feed commonly used in the art may be used.
  • the composition for feed may include a feed additive.
  • the feed additive of the present application corresponds to an auxiliary feed under the Feed Management Act, and may include probiotics.
  • Non-limiting examples of the feed include plant feeds such as grains, root fruits, food processing by-products, algae, fibers, pharmaceutical by-products, oils and fats, starches, gourds or grain by-products; and animal feeds such as proteins, inorganic materials, oils and fats, minerals, oils and fats, single cell proteins, zooplankton, or food. These may be used alone or may be used in combination of two or more.
  • the feed composition including the antimicrobial composition of the present application may further include an excipient, a diluent, and an additive.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 of the present application has an effect of simultaneously inhibiting the fungi Aspergillus duckjae, Aspergillus niger, and food poisoning bacteria Bacillus cereus and Escherichia coli.
  • the present application provides a feed composition having antibacterial and antifungal activity, thereby preventing microbial infection diseases including food poisoning of livestock.
  • the present application provides a method for preparing an antibacterial composition, comprising the step of culturing the newly isolated Rhizopus oligosporus CJCC02-20 in a medium.
  • the term "cultivation” means growing the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 of the present application under moderately controlled environmental conditions.
  • the culture process of the present application may be performed according to a suitable medium and culture conditions known in the art. Such a culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain. Specifically, the culture may be a batch, continuous and/or fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” refers to a material in which nutrients required for culturing Rhizopus oligosporus CJCC02-20 of the present application are mixed as a main component, and nutrients including water essential for survival and development and growth factors.
  • the medium and other culture conditions used for the culture of Rhizopus oligosporus CJCC02-20 of the present application may be used without any particular limitation as long as the medium used for culturing conventional microorganisms, but the Rhizopus oligo of the present application Sporus CJCC02-20 can be cultured under aerobic conditions while controlling temperature, pH, etc. in a conventional medium containing an appropriate carbon source, nitrogen source, phosphorus, inorganic compound, amino acid and/or vitamin.
  • the carbon source includes carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose, and the like; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, and the like may be included.
  • natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sugar cane offal and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pre-treated molasses (i.e., converted to reducing sugar). molasses) may be used, and other appropriate amounts of carbon sources may be variously used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, and organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its degradation products, defatted soybean cake or its degradation products, etc. can be used These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine
  • organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract
  • the phosphorus may include potassium first potassium phosphate, second potassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • potassium first potassium phosphate potassium phosphate
  • second potassium phosphate or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. may be used, and in addition, amino acids, vitamins and/or suitable precursors may be included. These components or precursors may be added to the medium either batchwise or continuously. However, the present invention is not limited thereto.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 of the present application compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. may be added to the medium in an appropriate manner to adjust the pH of the medium.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester may be used to suppress bubble formation.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the medium, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without or without gas to maintain anaerobic and microaerobic conditions, it is not
  • the culture temperature may be maintained at 20 to 45 °C, specifically, 25 to 40 °C, and may be cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the method for preparing the antimicrobial composition of the present application includes the steps of preparing the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain of the present application, preparing a medium for culturing the strain, or a combination thereof (regardless of the order, in any order), for example, before the culturing step, may further include.
  • the method for producing the antimicrobial composition of the present application may further include recovering the antimicrobial material from the culture medium (cultured medium) or the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain of the present application.
  • the recovering step may be further included after the culturing step.
  • the antibacterial material is included without limitation as long as it is a material having antibacterial activity produced by the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain, and in one embodiment may be crude extracts or a compound, but is not limited thereto.
  • the recovery may be to collect the desired antibacterial material using a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present application, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method.
  • a suitable method known in the art for example, centrifugation, filtration, treatment with a crystallized protein precipitating agent (salting out method), extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity
  • chromatography such as island chromatography, HPLC, or a combination thereof may be used, and a desired antimicrobial substance may be recovered from the medium or microorganism using a suitable method known in the art.
  • the method for preparing the antimicrobial composition of the present application may additionally include a purification step.
  • the purification may be performed using a suitable method known in the art.
  • the recovery step and the purification step are performed concurrently (or continuously) regardless of the order, or simultaneously or in one step It may be integrated and performed, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application provides a method for producing a fermented product, comprising the step of culturing and fermenting the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain in a medium.
  • Another aspect of the present application provides a fermented product prepared by the above method.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain is as described above, and the step of culturing the microorganism in the medium is also the same as described above.
  • the term “fermented product” refers to a composition obtained by culturing the microorganism of the present application.
  • the fermented product may include a composition in liquid or powder form obtained after culturing the microorganism and then undergoing an appropriate post-treatment process.
  • an appropriate post-treatment process may include, for example, a culturing process of the microorganism, a cell removal process, a concentration process, a filtration process, and a carrier mixing process, and may further include a drying process.
  • the post-treatment process may not include a purification process.
  • the “fermented product” includes the composition obtained by culturing the microorganism of the present application, a material obtained by a non-fermentation process and/or another material obtained by a non-natural process is additionally mixed. do not exclude
  • the present application provides a food composition comprising the novel isolated Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain or a fermented product using the strain.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 and food are as described above.
  • the fermented product may refer to a medium obtained by inoculating and culturing the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain in a medium containing the main raw material of the food or a culture containing microorganisms cultured with the medium.
  • the fermented product may be a culture obtained by inoculating and culturing the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain in the food raw material.
  • the food raw material may be grains, but is not limited thereto.
  • the grains may be rice, barley, wheat, corn, and the like, and specifically, may be wheat, wheat bran, or rice, but is not limited thereto.
  • the fermented product may be comprehensively interpreted as including all of the filtrate, diluent, concentrate thereof, preparation thereof, purified product, dried product, pulverized product, and the like of the medium or culture, but is not limited thereto.
  • the present application provides a method for producing a food comprising the step of inoculating the newly isolated strain Rhizopus oligosporus CJCC02-20.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 and food are as described above.
  • the food manufacturing method may be a manufacturing method of a fermented food comprising the step of inoculating and culturing the grains with the Rhizopus oligosporus CJCC02-20.
  • the fermented food obtained by inoculating and culturing the strain may specifically be soy sauce and salted fish, and more specifically, may be tempeh or sauces containing tempeh, but is not limited thereto.
  • the present application provides a feed composition comprising the novel isolated strain Rhizopus oligosporus CJCC02-20.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 and feed are the same as described above.
  • the present application relates to the novel isolated strain Rhizopus oligosporus CJCC02-20, the spores of the strain, the culture of the strain, the ferment, the concentrate thereof, the extract thereof, And it provides an antibacterial use of a composition comprising any one or more selected from the group consisting of a dried product.
  • the nucleotide sequences of 18S rRNA, ABP (ABP1) and Chitinase (Chi2) genes of the strains selected by the above process were analyzed.
  • the nucleotide sequence was compared with the GenBank database and each nucleotide sequence of the selected strain (18S rRNA: SEQ ID NO: 1, ABP1: SEQ ID NO: 2, Chi2: SEQ ID NO: 3) using NCBI BLAST.
  • primers SEQ ID NOs: 4 and 5 were synthesized based on the nucleotide sequence of the ABP1 gene
  • primers SEQ ID NOs: 6 and 7 were synthesized based on the nucleotide sequence of the Chi2 gene to confirm each nucleotide sequence through PCR.
  • the nucleotide sequence of this strain showed 100% homology to Rhizopus oligosporus 18S rRNA, 99.9% to ABP Gene, and 100% homology to Chitinase Gene.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 The strain obtained in the present application from the above results was identified as a Rhizopus oligosporus strain and named as Rhizopus oligosporus CJCC02-20, and was transferred to the Korea Center for Conservation of Microorganisms (KCCM), an international depository under the Budapest Treaty, in December 2020. It was deposited on the 09th and was given an accession number KCCM12893P.
  • KCCM Korea Center for Conservation of Microorganisms
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain 10-15 g of the strain was inoculated into wheat bran, and then cultured at 30°C for 5 days and at 35°C for 1 day. The culture was diluted 50 times by weight of distilled water and then extracted at 30° C. and 150 rpm for 60 minutes. The crude extracts were filtered under reduced pressure with 5.0 ⁇ m filter paper using diatomaceous earth. The filtrate was freeze-dried at -20°C for 48 hours and purified as a dry product.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 In order to check whether the newly isolated strain of Rhizopus oligosporus CJCC02-20 has an inhibitory effect on fungi and food poisoning-causing bacteria, the following antibacterial activity test was conducted.
  • Aspergillus oryzae a paste fermenting mold, and Aspergillus niger, a food contaminant, were cultured in PDA (Potato dextrose agar) medium.
  • PDA Pantotato dextrose agar
  • the pathogenic yeast Candida albicans and the food contaminant Zygosaccharomyces bailii were cultured in YPD medium (Yeast extract peptone dextrose agar).
  • food poisoning-causing bacteria Bacillus cereus, enteropathogenic Escherichia coli, enteric fermentation bacteria Bacillus subtilis, Bacillus velezensis (Bacillus velezensis) are TSA (Tryptic soy agar) Cultured in medium.
  • a paper disk of 8 mm diameter is placed on the plate medium on which the indicator strain is smeared, and 30 ⁇ l of the antibacterial material is constantly added thereto at 30° C. for 24 to 48 hours.
  • '-' in Table 1 is a case in which growth is not inhibited, in the case of '+', the diameter of the growth-stopping ring is 3 mm to 5 mm or less, and in the case of '++', the diameter of the growth-stopping ring is 6 mm to 10 mm. And, in the case of '+++', the diameter of the growth-stopping ring is 10 mm or more.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain 4 strains of Rhizopus oligosporus, a strain isolated from a conventional tempeh (tempe prepared in a traditional way in Indonesia and Vietnam), were tested for antibacterial activity in Comparative Examples 1 to 4. compared.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 Rhizopus oligosporus Comparative Example 1 Rhizopus oligosporus (Comparative Example 2) Rhizopus oligosporus (Comparative Example 3) Rhizopus oligosporus (Comparative Example 4) Aspergillus oryzae +++ - - - - Aspergillus niger +++ - - - - Escherichia coli +++ - - - - - Bacillus cereus ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Bacillus subtilis + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Bacillus velezensis + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Candida albicans
  • the purified material obtained from the Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain did not have antibacterial activity in yeast, but Aspergillus duck material and Aspergillus, which are difficult to inhibit in soy sauce or general food, It showed excellent antifungal activity to selectively control snigger mold.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 identified in Example 1, 15-20 g of Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain was inoculated into wheat rice, and then at 30°C. Incubated for 6 days at 40°C for 1 day. The culture was made into a powder using a grinder.
  • the culture solution powder and the commercially available Rhizopus oligosporus strain are added to steamed soybean, steamed soybean and rice, steamed soybean and wheat flour, and steamed wheat flour.
  • Rhizopus oligosporus strain was added to steamed soybean, steamed soybean and rice, steamed soybean and wheat flour, and steamed wheat flour.
  • Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain is a tempe fermented strain and has an excellent effect in controlling food poisoning bacteria while implementing traditional flavor.
  • the antibacterial composition comprising the novel Rhizopus oligosporus CJCC02-20 strain of the present application, the spores of the strain, the culture of the strain, its concentrate and its dried product, etc. has excellent antibacterial effect against fungi and food poisoning bacteria. It can be effectively used for food, quasi-drugs, and pharmaceuticals containing it.

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Abstract

본 출원은 기탁번호 KCCM12893P로 기탁된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 (Rhizopus oligosporus CJCC02-20) 균주 및 이의 이용에 관한 것이다.

Description

신규 리조푸스 올리고스포러스 균주 및 이를 포함하는 항균 조성물
본 출원은 기탁번호 KCCM12893P로 기탁된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 (Rhizopus oligosporus CJCC02-20) 균주; 상기 균주, 균주의 포자, 균주의 배양물, 그의 농축물 및 그의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 항균 조성물; 상기 항균 조성물을 포함하는 식품 조성물; 사료 조성물; 의약외품 조성물; 건강기능식품 조성물; 또는 상기 항균 조성물을 포함하는, 진균, 세균 또는 이들의 조합으로 인한 미생물 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
전통 방식으로 제조된 발효식품은 원료 보관, 제조 및 유통 과정에서 항시 진균류와 식중독 균에 취약하다. 진균류 및 식중독 유발 세균은 열처리 후에도 살아남아 식품의 변패 및 부패 혹은 식중독을 유발시키는 것으로 알려져 있다.
변패 및 식중독균 증식을 방지하여, 상기 식품의 품질을 오랫동안 유지하기 위해 항균물질에 관한 연구가 많이 진행되어 왔다. 항균물질 중에서 특히 안전성과 경제성이 우수한 천연 보존제에 대한 연구의 필요성이 증대되고 있는 실정이다.
대표적인 천연보존제로 박테리오신은 미생물이 생산하는 천연 항균성 단백질 또는 단백질계의 물질을 의미한다. 박테이오신은 단백질이기에 인체에서 분해가 가능하여 안전성이 입증된 물질이다. 이는 기존 항생제의 2차 대사산물로 인체에 부작용을 발생시키는 것과 대조되어 박테리오신에 대한 연구의 필요성이 증대되고 있는 실정이다. 상기 박테리오신과 관련하여, 최근까지 유산균 유래 박테리오신에 관한 연구가 주를 이루고 있다. 유산균 유래 박테리오신은 GRAS 등급으로 안전성이 입증됐다는 장점이 있으나, 항균 활성 범위가 그람 양성균로 특이적이기 때문에 널리 활용되지 못하고 있다.
리조푸스 올리고스포러스의 항균성과 관련하여 리조푸스 올리고스포러스 배양액으로부터 생성된 항균 물질 Antibiotic peptide (ABP) 과 Linoleic acid 등은 그람 양성균인 Straphyloccoccus 속 및 Bascillus 속을 제어하는 것으로 알려져 있다(Roubos-van den Hil et al., 2010). 그러나 그람 양성인 특정 미생물에 대한 항균 활성만이 보고되고 있을 뿐, 변패 또는 식중독을 유발하는 다양한 균주에 대해 효과에 대해서는 보고된 바가 없다. 나아가, 리조푸스 올리고스포러스는 발효 음식에서 유용한 세균이므로, 상기 박테리오신을 발효식품에 적용할 경우 변패 유발 진균류 및 식중독 세균류에도 특정한 활성을 보인다고 보기 어려워서 발효 식품을 산업화하여 제조 및 유통하기에 어려운 문제가 있다.
이에 본 발명자들은, 인체에 무해하면서 다양한 진균류 및 세균류를 억제하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 템페(tempe)로부터 신규 분리한 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20가 진균에 대한 항균 활성을 가질 뿐만 아니라, 식중독 세균 등 식품의 주요 위해 미생물만을 특이적으로 억제하는 항균 활성이 있음을 확인하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원은 기탁번호 KCCM12893P로 기탁된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 (Rhizopus oligosporus CJCC02-20) 균주; 상기 균주, 균주의 포자, 균주의 배양물, 그의 농축물 및 그의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 항균 조성물; 상기 항균 조성물을 포함하는 식품 조성물; 사료 조성물; 의약외품 조성물; 건강기능식품 조성물 또는 상기 항균 조성물을 포함하는, 진균, 세균 또는 이들의 조합으로 인한 미생물 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 출원의 하나의 목적은 기탁번호 KCCM12893P로 기탁된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 (Rhizopus oligosporus CJCC02-20) 균주를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 균주, 균주의 포자, 균주의 배양물, 그의 농축물 및 그의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 항균 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 항균 조성물을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 항균 조성물을 포함하는 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 항균 조성물을 포함하는 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 항균 조성물을 포함하는 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 항균 조성물을 포함하는, 진균, 세균 또는 이들의 조합으로 인한 미생물 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원에 따른 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20균주를 포함하는 항균 조성물은 진균 및 세균에 대하여 항균 활성을 지니는 특성을 가지므로 식품, 의약품, 의약외품, 건강기능식품 등으로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 디스크여지법 (paper disk assay)을 이용하여 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20균주의 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 나이거 및 대장균에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다.
이하에서는, 본 출원을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 출원의 하나의 양태는 기탁번호 KCCM12893P로 기탁된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 (Rhizopus oligosporus CJCC02-20) 균주를 제공한다.
본 발명자들은 발효식품의 품질저하 및 오염을 유발시키는 진균 및 식중독 유발 세균에 뛰어난 항균 활성을 가지는 리조푸스 올리고스포러스에 속하는 신규한 균주를 하기와 같이 규명하였다.
재래식 템페로부터 다종의 리조푸스 올리고스포러스를 분리하여 곰팡이, 효모 등 진균류 및 식중독 세균류에 대해 검정한 결과 항균 활성이 우수한 균주 리조푸스 올리고스포러스를 선별하고, 선별된 균주를 동정하기 위하여 유전자 염기서열 분석을 수행하였다. 상기 선별된 균주의 18S rRNA 염기서열은 서열번호 1로 기재하였으며, ABP(antibiotic peptide) 유전자 서열은 서열번호 2에 기재하였고, Chitinase(Chi2) 유전자 서열은 서열번호 3에 기재하였다. 상기 유전자 분석을 기초하여 상기 균주를 리조푸스 올리고스포러스 균주로 동정하고, 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20로 명명하였으며, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2020년 12월 09일자로 기탁하고 수탁번호 KCCM12893P를 부여 받았다.
본 출원의 일 구체예에 의하면, 상기 신규 분리된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20는 진균 및 식중독 유발 세균에 대한 항균활성이 우수하여, 다양한 진균류 및 식중독 유발세균에 동시에 작용할 수 있는 항균활성을 나타낸다(실시예 3).
상기 진균 및 세균은 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 에스케리아(Escherichia) 속일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
본 출원의 일 구체예로서, 상기 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20는 진균인 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 또는 이들의 조합에 대하여 항균활성을 가지는 것일 수 있으나, 상기 진균의 종류에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 일 구체예로서, 상기 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 대장균(Escherichia coli) 또는 이들의 조합에 대하여 항균활성을 가지는 것일 수 있으나, 상기 세균의 종류에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 일 구체예로서, 상기 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20는 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 나이거 또는 대장균에 특이적 항균활성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 나이거는 발효식품의 품질 저하 및 오염 유발 균주로 알려져 있으며, 바실러스 세레우스 및 대장균은 식중독의 유발 균으로 알려져 있는 바, 이에 뛰어난 항균활성을 가지는 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20는 다양한 용도로 사용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 출원은 상기 신규 분리된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 균주, 상기 균주의 포자, 상기 균주의 배양물, 그의 농축물, 그의 추출물, 및 그의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상; 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
이때, 상기 담체는 자연적 또는 비자연적으로 발생하는(non-naturally occurring) 담체일 수 있다.
본 출원의 일 구체예로, 상기 건조물은 동결건조물일 수 있다.
또한 상기 조성물은 동결보호제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 글리세롤, 트레할로스, 말토덱스트린, 탈지분유 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동결보호제를 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 동결보호제는 본 출원의 조성물 총 중량에 대하여 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량% 포함될 수 있고, 구체적으로 본 출원의 글리세롤은 5 중량% 내지 20 중량%, 본 출원의 트레할로스는 2 중량% 내지 10 중량%, 본 출원의 말토덱스트린은 2 중량% 내지 10 중량%, 본 출원의 탈지분유는 0.5 중량% 내지 2 중량%, 본 출원의 전분은 0.1 중량% 내지 1 중량%로 본 출원의 조성물에 포함될 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 출원은 상기 신규 분리된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 균주, 상기 균주의 포자, 상기 균주의 배양물, 그의 농축물, 그의 추출물, 및 그의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
이때, 균주의 상태는 액상상태 또는 건조상태일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항균 조성물은 진균, 세균 또는 이들의 조합에 대한 항균활성을 가지는 것일 수 있으며, 구체적으로, 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 나이거 또는 대장균에 특이적 항균활성을 가지는 것일 수 있으며, 바실러스 세레우스에 증진된 항균활성능을 가지는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "포자"는 세균 등의 번식 세포를 말하며, 본 출원의 목적상 상기 포자는 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20의 번식 세포를 의미한다.
본 출원에서 상기 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20의 포자는 진균 및 식중독 세균에 대한 항균 활성을 나타내어 항균 활성이 있는 식품, 사료, 의약품, 의약외품, 건강기능식품에 포함되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "배양물"은 상기 균주를 배양한 다음 수득한 산물을 의미하며, 균체를 포함한 배양 원액일 수 있으며, 또한 배양 균주, 배양 상등액을 제거하거나 농축한 균체일 수 있다. 상기 배양물의 조성은 통상의 리조푸스 올리고스포러스 배양에 필요한 성분뿐 아니라, 리조푸스 올리고스포러스의 생장에 상승적으로 작용하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.
본 출원에서 용어, "농축물"은 상기 배양물을 농축한 것을 의미한다.
본 출원에서 용어, "추출물"은 상기 배양물 또는 그의 농축물로부터 추출한 것을 의미하며, 본 출원의 진균류 및 세균에 특이적 항균 효과를 나타낼 수 있는 추출물인 한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 모두 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어, "건조물"은 상기 배양물, 그의 농축물, 그의 추출물, 및 그의 분획물을 건조한 것을 의미한다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 신규 분리한 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20는 통상적인 리조푸스 올리고스포러스 균주의 배양방법을 통해 배양할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소 함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다. 배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 칼슘, 철, 인 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.
상기 항균 조성물은 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20를 배양하는 과정에서 생성되는 기타 부산물을 함께 포함할 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 출원은 상기 항균조성물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 장류, 젓갈류를 포함하는 발효식품, 소스류, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다. 상기 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 식품 조성물은 발효식품 일 수 있으며, 구체적으로 장류, 젓갈류 일 수 있으며, 보다 구체적으로 템페일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 식품 조성물은 템페를 포함하는 소스류일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
상기 식품 조성물은 식품학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제, 분산제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별하고 적절한 양으로 사용할 수 있다.
특히, 본 발명자들은 본 출원의 신규 분리된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20가 장류 발효 곰팡이인 아스퍼질러스 오리재와 식품 오염원인 아스퍼질러스 나이거 및 식중독 세균인 바실러스 세레우스, 장관병원성 세균인 대장균을 동시에 억제할 수 있는 효과가 있음을 확인하였으며(실시예 3, 도 1), 상기 항균 조성물을 발효식품인 템페에 적용한 결과 전통풍미는 구현하면서도 식중독균 방제효과를 유지할 수 있음을 확인하였는 바(실시예 4), 발효식품을 포함한 모든 식품에 직접적으로 사용할 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 출원은 상기 항균 조성물을 포함하는, 미생물 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 출원에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 출원에 따른 미생물 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하여 미생물 감염 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 출원의 상기 조성물을 미생물 감염 질환 발병 의심 개체에 투여하여 미생물 감염 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어, "개체"란, 미생물 감염 질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다.
이 때, 미생물 감염 질환은 미생물에 의하여 감염되어 발생하는 질환으로, 바람직하게는 진균 또는 세균에 의해 감염되어 발생하는 질환일 수 있다.
본 출원의 일 구체예로서, 상기 진균은 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 나이거 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
본 출원의 일 구체예로서, 상기 세균은 바실러스 세레우스, 대장균 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 일 구체예로서, 상기 미생물 감염 질환은 식중독, 설사, 구토, 장염, 위장관염, 변비, 복통 및 복부팽만으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 일 실시예에서는 식중독을 유발시킬 수 있는 세균인 바실러스 세레우스에 대하여 증진된 항균활성 및 장관병원성 대장균에 관하여 특이적 항균활성을 확인하였으며, 곰팡이균인 아스퍼질러스 오리재 및 아스퍼질러스 나이거에 대한 특이적 항진균 활성을 확인하였는 바, 본 출원의 항균 조성물은 미생물 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 출원에 따른 미생물 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 건강기능식품, 의약품, 의약외품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다.
본 출원에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 출원에 따른 미생물 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 출원의 상기 미생물 감염 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.
본 출원의 항균물질의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 출원은 상기 미생물 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 미생물 감염 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 출원에서 사용되는 용어, "개체"란, 미생물 감염 질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다.
본 출원의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 미생물 감염 질환이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 추출물을 포함하는 조성물의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 출원의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 출원의 항균물질은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 출원은 상기 항균 조성물을 포함하는 미생물 감염 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
이 때, 미생물 감염 질환, 예방, 및 개선의 의미는 상기한 바와 같다.
본 출원의 용어, "건강기능식품 (Health functional food 또는 nutraceutical)"은, 특정보건용 식품, 기능성 식품, 건강식품과 동일한 용어로, 양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 미생물 감염 질환의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
상기 건강기능식품은 식품학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이는 전술한 바와 같다.
본 출원의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 출원의 건강기능식품은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 출원의 건강기능식품은 미생물 감염 질환의 예방 또는 개선효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
구체적으로, 상기 식품은 상기 항균조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등으로 사용될 수 있다.
상기 식품은 공지의 제조방법에 따라 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 본 출원에 따른 조성물의 함량은 제형에 따라 조절할 수 있다. 본 출원에 의한 항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 출원은 상기 항균 조성물을 포함하는 의약외품 조성물을 제공한다.
본 출원에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적을 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미할 수 있다. 또한 상기 의약외품은 피부외용제 및 개인위생용품을 포함할 수 있다. 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 또는 연고제일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
상기 의약외품 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이는 전술한 바와 같다.
본 발명자들은 신규 분리된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20는 상기 진균 및 세균에 대한 항균효과를 가짐을 확인하였는바, 상기 신규 균주를 이용한 항균 조성물은 의약외품에 효과적으로 사용될 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 출원은 상기 항균조성물을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
본 출원에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료용 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 출원의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 생균제를 포함할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
이때, 본 출원의 항균조성물을 포함하는 사료 조성물은 부형제, 희석제, 첨가제를 더 포함할 수 있다.
본 출원의 신규 분리된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20가 곰팡이 균인 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 나이거 및 식중독 세균인 바실러스 세레우스, 대장균을 동시에 억제할 수 있는 효과가 있음을 확인하였는바, 본 출원은 항균 및 항진균 활성이 있는 사료 조성물을 제공하여, 가축의 식중독을 포함한 미생물 감염 질환을 예방할 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 출원은 상기 신규 분리된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 항균 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 항균조성물의 제조방법은, 본 출원의 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 균주를 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 항균조성물의 제조방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 본 출원의 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 균주로부터 항균물질을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
이때, 상기 항균물질은 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 균주가 생산하는 항균활성을 가지는 물질이면 제한 없이 모두 포함되며, 일 구체예로 추출액(crude extracts), 화합물 일 수 있으나 이에 제한 되는 것은 아니다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 항균물질을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 항균물질을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 항균조성물의 제조방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 항균조성물 제조방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 이시적(또는 연속적)으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 균주를 배지에서 배양하여 발효하는 단계를 포함하는, 발효물의 제조 방법을 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 방법에 의해 제조된 발효물을 제공한다.
상기 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 균주는 앞서 설명한 바와 같으며, 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계 역시 앞서 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "발효물"은, 본 출원의 미생물을 배양하여 수득된 조성물을 의미한다.
나아가, 상기 발효물은 상기 미생물을 배양한 후, 적절한 후처리 공정을 거친 후 수득된 액상 또는 분말 형태의 조성물을 포함할 수 있다. 이 때, 적절한 후처리공정은, 예를 들어, 상기 미생물의 배양 공정, 균체 제거 공정, 농축 공정, 여과 공정, 및 담체 혼합 공정을 포함할 수 있으며, 추가적으로 건조 공정을 더 포함할 수도 있다. 경우에 따라서, 상기 후처리 공정은 정제 공정을 포함하지 않을 수 있다.
나아가, "상기 발효물"은 본 출원의 미생물을 배양하여 수득된 조성물을 포함하기만 한다면, 비발효 공정으로 수득된 물질 및/또는 비천연 공정으로 수득된 또 다른 물질을 추가로 혼합한 경우를 배제하지 않는다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 출원은 상기 신규 분리된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 균주 또는 상기 균주를 이용한 발효물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
상기 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 및 식품은 전술된 바와 같다.
상기 발효물은 식품의 주원료를 함유하고 있는 배지에 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 균주를 접종 및 배양하여 수득한 배지 또는 상기 배지와 함께 배양한 미생물을 포함하는 배양물을 의미할 수 있다.
또한 상기 발효물은 식품 원료에 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 균주를 접종 및 배양하여 수득한 배양물일 수 있다. 상기 식품 원료는 곡물류일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 일 구체예로 상기 곡물류는 쌀, 보리, 밀, 옥수수 등일 수 있으며, 구체적으로, 밀, 밀브랜, 쌀 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발효물은 상기 배지 또는 배양물의 여과액, 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물, 건조물, 분쇄물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 출원은 상기 신규 분리된 균주 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20을 접종하는 단계를 포함하는 식품의 제조방법을 제공한다.
상기 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 및 식품은 전술된 바와 같다.
본 출원의 일 구체예로, 상기 식품 제조방법은 상기 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20을 곡물에 접종 및 배양하는 단계를 포함하는 발효식품의 제조방법일 수 있다. 상기 균주를 접종 및 배양하여 수득한 발효식품은 구체적으로 장류, 젓갈류 일 수 있으며, 보다 구체적으로 템페 또는 템페를 포함하는 소스류일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 출원은 상기 신규 분리된 균주 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
상기 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 및 사료는 전술된 바와 같다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 출원은 상기 신규 분리된 균주 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20, 상기 균주의 포자, 상기 균주의 배양물, 발효물, 그의 농축물, 그의 추출물, 및 그의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물의 항균 용도를 제공한다.
이하, 실시예를 통해 본 출원의 구성 및 효과를 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 출원의 예시적인 기재일 뿐, 본 출원의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 항균 물질을 생산하는 균주의 분리 및 동정
항균 활성이 있는 균주의 선별을 위하여, 재래식 템페들을 PDA (Potato Dextrose Agar) 배지에서 30℃ 5일 배양한 후 리조푸스 속 형태적 특징을 이용하여 1차 선별하고, 선별된 균주는 5% Kanamycin 1,000ppm을 넣은 PDA 배지에 30℃ 5일 간 배양하여 분리하였다.
상기와 같은 공정에 의해 선별된 균주의 18S rRNA, ABP (ABP1) 및 Chitinase (Chi2) 유전자의 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 NCBI의 BLAST를 이용하여 GenBank 데이터베이스와 선별된 균주의 각각의 염기서열(18S rRNA: 서열 번호 1, ABP1: 서열 번호 2, Chi2: 서열 번호 3)을 비교하였다.
구체적으로, ABP1 유전자의 염기서열에 근거하여 프라이머 서열번호 4 및 5를 합성하였으며, Chi2 유전자의 염기서열에 근거하여 프라이머 서열번호 6 및 7을 합성하여 PCR을 통해 각각의 염기서열을 확인하였다. 그 결과, 본 균주의 염기서열은 리조푸스 올리고스포러스 18S rRNA에 대해 100%, ABP Gene에 대해 99.9%, Chitinase Gene에 대해 100% 상동성을 보였다.
상기의 결과로부터 본 출원에서 수득된 균주는 리조푸스 올리고스포러스 균주로 동정하고 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20로 명명하였으며, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2020년 12월 09일자로 기탁하고 수탁번호 KCCM12893P를 부여 받았다.
실시예 2. 항균 물질의 분리 및 정제
신규 분리된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20균주가 생산하는 항균물질을 분리하고자, 상기 균주를 10-15 g 밀브랜에 접종한 다음, 30℃ 5일, 35℃ 1일간 배양하였다. 상기 배양물을 증류수 중량 50배 희석 후 60분간 30℃ 150 rpm 조건으로 추출하였다. 추출액(crude extracts)은 규조토를 이용하여 5.0 μm Filter paper로 감압 여과를 행하였다. 여과액은 -20℃ 48시간 동결 건조하여 건조물로 정제하였다.
실시예 3. 진균류 및 식중독 유발 세균에 대한 항균 활성 시험
신규 분리된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20균주가 진균류 및 식중독 유발 세균에 대하여 억제하는 효과가 있는지 확인하기 위하여 아래와 같은 항균 활성 실험을 진행하였다.
장류 발효 곰팡이인 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae)와 식품 오염원 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger)는 PDA (Potato dextrose agar) 배지에 배양하였다.
병원성 효모균 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 식품 오염원 자이고사카로마이세스 바일리(Zygosaccharomyces bailii) 들은 YPD 배지(Yeast extract peptone dextrose agar)에 배양하였다.
또한, 식중독 유발 세균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 장관병원성 대장균(Escherichia coli), 장류 발효 세균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) 들은 TSA(Tryptic soy agar) 배지에 배양하였다.
상기 실시예 2에서 건조한 항균 물질을 증류수에 녹인 후, 상기 지시 균주가 도말된 평판배지 위에 8 mm 직경의 종이 디스크를 놓고 상기 항균 물질을 30 μl씩 일정하게 가한 후에 30℃에서 24 내지 48시간 동안 배양하여 분리 균주가 생산하는 항균 물질에 의한 생육 저지환 생성 여부를 관찰하였으며, 그 결과를 표 1및 도 1에 나타내었다. 상기 표 1의 '-'는 생육을 저지하지 못한 경우이고, '+'의 경우 생육 저지환의 직경이 3mm 내지 5 mm이하인 경우이고, '++'의 경우 생육 저지환의 직경이 6mm 내지 10mm인 경우이며, '+++'의 경우 생육 저지환의 직경이 10 mm 이상인 경우이다.
또한, 상기 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20균주 외에 재래식 템페(인도네시아 및 베트남에서 전통방식으로 제조한 템페)에서 분리한 균주인 리조푸스 올리고스포러스 균주 4종을 비교예 1 내지 4로 항균활성을 비교하였다.
미생물 항균활성　
Rhizopus oligosporus CJCC02-20 Rhizopus oligosporus (비교예 1) Rhizopus oligosporus (비교예 2) Rhizopus oligosporus (비교예3) Rhizopus oligosporus (비교예4)
Aspergillus oryzae +++ - - - -
Aspergillus niger +++ - - - -
Escherichia coli +++ - - - -
Bacillus cereus ++ + + + +
Bacillus subtilis + + + + +
Bacillus velezensis + + + + +
Candida albicans - - - - -
Zygosaccharmyces bailii - - - - -
상기 표 1 및 도 1에서 확인할 수 있듯이, 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20균주로부터 수득한 정제 물질은 효모에는 항균 활성이 없었으나, 장류 또는 일반 식품에서 저해하기 어려운 아스퍼질러스 오리재와 아스퍼질러스 나이거 곰팡이 균을 선택적으로 제어할 수 있는 우수한 항진균 활성을 보였다.
또한, 장관병원성 대장균에 선택적 항균 활성을 보였으며, 타 리조푸스 올리고스포러스 균주 대비 식중독균인 바실러스 세레우스에 대한 항균활성이 뛰어남을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 발효제품 템페에서 식중독균 방제 효과 확인
실시예 1에 의해 동정된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20의 발효제품에서 의 식중독균 방제효과를 확인하기 위하여, 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20균주를 15-20 g 밀쌀에 접종한 다음, 30℃ 6일, 40℃ 1일간 배양하였다. 상기 배양물은 분쇄기를 이용하여 분말로 만들었다.
해마다 바뀌는 소비 트렌드에 따라 곡물을 다양화한 발효 제품을 개발하기 위해 증자한 대두, 증자한 대두와 쌀, 증자한 대두와 소맥분, 증자한 소맥분에 상기 배양액 분말과 시중 판매되는 리조푸스 올리고스포러스 균주(Ragi Tempe Raprima, Bandung社, Indonesia)를 4% 접종 및 혼합한 다음, 습도를 60%로 조절하여 온도 30℃에서 1-2일간 배양하여 발효 제품인 템페를 만들었다.
배양한 템페들과 시중 판매되는 재래식 템페를 TSA(Tryptic soy agar)와 Polymyxin B 및 Trimethoprim을 첨가한 Bacillus cereus 선택 배지에 30℃ 1일간 배양하였다. 실시예 1에서 분리한 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20균주를 접종한 템페들에서는 식중독 유발 세균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 장관병원성 대장균(Escherichia coli)이 검출되지 않은 반면, 시중 판매되는 균주를 접종한 템페와 재래식 템페에서는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)가 검출됨을 확인하였다(표 2 참조).
항목 재래식 템페 시판 균주 활용 템페 분리 균주 활용 템페
대두 대두+소맥분 대두+쌀 소맥분 대두 대두+소맥분 대두+쌀 소맥분
Protease activity
(unit/g)		 300 82 103 83 118 114 134 113 145
Bacillus cereus(CFU/g) 100,000 30,000 10,500 10,200 40,000 ND ND ND ND
Escherichia coli(CFU/g) 10 ND ND ND ND ND ND ND ND
* ND: Not Detected
상기의 결과로서, 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20균주는 템페 발효 균주로서 전통 풍미를 구현하면서 식중독 균을 제어할 수 있는 효과가 뛰어남을 확인하였다.
따라서, 본 출원의 신규 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20균주, 상기 균주의 포자, 상기 균주의 배양물, 그의 농축물 및 그의 건조물 등을 포함하는 항균조성물은 진균 및 식중독균에 대한 항균효과가 뛰어나므로 이를 포함하는 식품, 의약외품, 의약품 등에 효과적으로 사용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터
수탁번호 : KCCM12893P
수탁일자 : 20201209
Figure PCTKR2021003829-appb-I000001

Claims (14)

  1. 기탁번호 KCCM12893P로 기탁된 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 (Rhizopus oligosporus CJCC02-20) 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 진균, 세균 또는 이들의 조합에 대한 항균활성을 가지는 것인, 균주.
  3. 제2항에 있어서, 상기 진균은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 또는 이들의 조합인 것인, 균주.
  4. 제2항에 있어서, 상기 세균은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 대장균(Escherichia coli) 또는 이들의 조합인 것인, 균주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 균주는 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 나이거 또는 대장균에 특이적 항균활성을 가지는 것인, 균주.
  6. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 리조푸스 올리고스포러스 CJCC02-20 균주, 상기 균주의 포자, 상기 균주의 배양물, 그의 농축물 및 그의 건조물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 항균 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 진균, 세균 또는 이들의 조합에 대한 항균활성을 가지는 것인, 조성물.
  8. 제6항에 따른 항균 조성물을 포함하는, 식품 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식품은 템페 또는 템페를 포함하는 소스인 것인, 식품 조성물.
  10. 제6항에 따른 항균 조성물을 포함하는, 사료 조성물.
  11. 제6항에 따른 항균 조성물을 포함하는, 진균, 세균 또는 이들의 조합으로 인한 미생물 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 미생물 감염질환은 식중독, 설사, 구토, 장염, 위장관염, 변비, 복통 및 복부팽만으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학 조성물.
  13. 제6항에 따른 항균 조성물을 포함하는, 진균, 세균 또는 이들의 조합으로 인한 미생물 감염 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  14. 제6항에 따른 항균 조성물을 포함하는, 의약외품 조성물.
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