WO2024136036A1 - 락토바실러스 브레비스 ku15147을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

락토바실러스 브레비스 ku15147을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2024136036A1
WO2024136036A1 PCT/KR2023/015307 KR2023015307W WO2024136036A1 WO 2024136036 A1 WO2024136036 A1 WO 2024136036A1 KR 2023015307 W KR2023015307 W KR 2023015307W WO 2024136036 A1 WO2024136036 A1 WO 2024136036A1
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strain
arthritis
preventing
lactobacillus brevis
composition
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Application number
PCT/KR2023/015307
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Inventor
이길웅
현준현
Original Assignee
주식회사 지에이치바이오
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating arthritis containing Lactobacillus brevis KU15147.
  • Arthritis is a general term for several diseases that involve damage to joints, and can be broadly divided into osteoarthritis (degenerative arthritis) and rheumatoid arthritis (inflammatory arthritis).
  • Osteoarthritis refers to a disease in which the cartilage layer developed within our body's joints to relieve the shock and friction of direct collision between bones is damaged, causing direct friction between bones, causing pain and making movement difficult. It can mainly occur in one joint, such as the knee, hip joint, hand, foot, or spine, or it can occur in multiple joints simultaneously.
  • Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that causes inflammation by attacking one's joints or parts of the body due to an abnormality in the immune system. Symptoms include pain and swelling in joints such as fingers, hands, feet, wrists, ankles, and knees, as well as muscle, skin, and It refers to a systemic chronic inflammatory disease that can cause abnormalities in various other organs such as the lungs and eyes.
  • Probiotics are defined as something that helps the host's health when consumed in appropriate amounts. Strains such as Lactobacillus , Leuconostoc , Pediococcus, and Bifidobacterium are mainly used as commercial probiotics. These strains are known for their antioxidant, anti-inflammatory, cholesterol-lowering, and anti-diabetic effects, and these functionalities are reported to vary depending on the strain.
  • the present invention was developed in response to the above-mentioned needs, and the present inventors completed the present invention by discovering the arthritis prevention or treatment effect of Lactobacillus brevis KU15147.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating arthritis containing Lactobacillus brevis KU15147 strain as an active ingredient.
  • the strain may have accession number KCCM 12434P.
  • the arthritis may be osteoarthritis or rheumatoid arthritis.
  • the administered dose of the strain may be selected from the group consisting of 1 ⁇ 10 6 CFU/mL to 1 ⁇ 10 10 CFU/mL:
  • the pharmaceutical composition may additionally contain ingredients effective for arthritis.
  • a health functional food composition for preventing or improving arthritis containing Lactobacillus brevis KU15147 strain as an active ingredient is provided.
  • a feed composition for preventing or improving arthritis containing Lactobacillus brevis KU15147 strain as an active ingredient is provided.
  • a method for preventing, improving, or treating arthritis in non-human animals comprising administering Lactobacillus brevis KU15147 strain.
  • the Lactobacillus brevis KU15147 strain deposited under the deposit number KCCM 12434P of the present invention, showed anti-inflammatory, heat and swelling-related arthritis-relieving activities, so it can be usefully used as a pharmaceutical, food or feed composition.
  • Figure 1 shows cell viability for RAW 264.7 cells.
  • NC negative control
  • PC positive control
  • LGG Lactobacillus rhamnosus GG
  • 147 Lactobacillus brevis KU15147
  • 154 Lactobacillus brevis KU15154.
  • Figure 2 shows the ability to inhibit Nitric oxide (NO) (A) and PGE 2 (B) production.
  • NC negative control
  • PC positive control
  • LGG Lactobacillus rhamnosus GG
  • 147 Lactobacillus brevis KU15147
  • 154 Lactobacillus brevis KU15154.
  • Figure 3 shows the effect of suppressing the expression of inflammation-related factors and pro-inflammatory cytokines.
  • A iNOS
  • B COX-2
  • C TNF- ⁇
  • D IL-1 ⁇
  • E IL-6.
  • NC negative control
  • PC positive control
  • LGG Lactobacillus rhamnosus GG
  • 147 Lactobacillus brevis KU15147
  • 154 Lactobacillus brevis KU15154.
  • Figure 4 shows the effect of suppressing the expression of LTB 4 when inflammation is induced.
  • NC negative control
  • PC positive control
  • LGG Lactobacillus rhamnosus GG
  • 147 Lactobacillus brevis KU15147
  • 154 Lactobacillus brevis KU15154.
  • Figure 5 shows the inhibitory effect of protein factors related to the NF- ⁇ B signaling mechanism.
  • A Western-blot analysis results,
  • B p-p65/p65 protein expression level,
  • C IkB- ⁇ /ß-actin protein expression level.
  • LGG Lactobacillus rhamnosus GG; 147, Lactobacillus brevis KU15147; 154, Lactobacillus brevis KU15154; NC, negative control; PC, positive control.
  • Figure 6 shows the inhibitory effect of protein factors related to the AP-1 signaling mechanism.
  • A Western-blot analysis results
  • B protein expression level of c-Jun/ ⁇ -tubulin
  • C protein expression level of pc-Jun/ ⁇ -tubulin.
  • LGG Lactobacillus rhamnosus GG
  • 147 Lactobacillus brevis KU15147
  • 154 Lactobacillus brevis KU15154
  • NC negative control
  • PC positive control.
  • Figure 7 shows changes in knee joint thickness due to ingestion of KU15147.
  • Figure 8 shows the hemolytic activity of Staphlyococcus aureus ATCC 25923 strain and Lactobacillus brevis KU15147 strain.
  • FIG. 9 shows Bile salt deconjugation.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating arthritis containing Lactobacillus brevis KU15147 strain as an active ingredient.
  • prevention means suppressing or delaying the occurrence of a disease from its cause.
  • treatment means stopping the progression of damage by suppressing the progression and/or worsening of symptoms even without complete cure, or improving some or all of the symptoms and leading toward healing.
  • Lactobacillus brevis KU15147 was deposited at the Korea Microbial Conservation Center on January 29, 2019 (KCCM 12434P).
  • the strain can be prepared as live cells, dead cells, or culture filtrate.
  • the administered dose of the strain is preferably 1 ⁇ 10 6 CFU/mL to 1 ⁇ 10 10 CFU/mL, but is not limited thereto. At this time, if the dosage of the strain is less than the above range, it may be difficult to exert a preventive or therapeutic effect on arthritis, and if it exceeds the above range, there may be concerns about toxicity, including cytotoxicity.
  • the arthritis is preferably osteoarthritis or rheumatoid arthritis, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may further include appropriate carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, drug treatment, and biological response regulators for the prevention and treatment of diseases.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods. and may include appropriate carriers, excipients, or diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions for formulation.
  • the carrier, excipient, or diluent includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, not yet determined.
  • lactose dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, not yet determined.
  • These include various compounds or mixtures including quality cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, weighting agents, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration can be prepared by mixing the above strain with at least one excipient, such as starch, calcium bonate, sucrose or lactose, and gelatin.
  • excipients such as starch, calcium bonate, sucrose or lactose, and gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc can also be used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • simple diluents such as water and liquid paraffin, they may contain various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives. .
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous preparations, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • injectable ester such as ethyl oleate.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, Tween 61, cacao, laurel, glycerol gelatin, etc. can be used.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention varies depending on the patient's condition, body weight, degree of disease, drug form, administration route and period, but can be appropriately selected by a person skilled in the art. However, for desirable effects, it can be administered at 0.0001 to 2,000 mg/kg per day, preferably at 0.001 to 2,000 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. However, the scope of the present invention is not limited by the above dosage.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans through various routes. Any mode of administration can be administered, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine intrathecal or intracerebroventricular injection.
  • a health functional food for preventing or improving arthritis containing Lactobacillus brevis KU15147 strain as an active ingredient is provided.
  • the strain is as described above and can be prepared as live cells, dead cells, or culture filtrate.
  • the administered dose of the strain is preferably 1 ⁇ 10 6 CFU/mL to 1 ⁇ 10 10 CFU/mL, but is not limited thereto. At this time, if the dosage of the strain is less than the above range, it may be difficult to exert a preventive or therapeutic effect on arthritis, and if it exceeds the above range, there may be concerns about toxicity, including cytotoxicity.
  • the term “improvement” refers to any action in which obesity is improved or beneficially changed by administration of the composition of the present invention.
  • Fermented foods according to the present invention may vary, such as yogurt, kimchi, and cheese, and the fermented foods may also have a protective effect against arthritis.
  • the strain when used as an additive to a health functional food, it can be added as is or used with other foods or food ingredients, and can be used appropriately according to conventional methods.
  • the amount of active ingredients mixed can be appropriately determined depending on each purpose of use, such as prevention, health, or treatment.
  • the formulation of health functional foods can be in the form of powders, granules, pills, tablets, capsules, as well as general foods or beverages.
  • the strain when producing food or beverages, can be added in an amount of 15 parts by weight or less, preferably 10 parts by weight or less, based on 100 parts by weight of raw materials.
  • the amount may be below the above range.
  • beverages may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like ordinary beverages.
  • the above-mentioned natural carbohydrates may be monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the ratio of the natural carbohydrate may be about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g, per 100 mL of the beverage according to the present invention.
  • the health functional food composition according to the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, May contain glycerin, alcohol, and carbonating agent used in carbonated beverages.
  • the health functional food composition according to the present invention may contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice drinks, and vegetable drinks. These ingredients can be used independently or in combination. The ratio of these additives is not limited, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight based on 100 parts by weight of the health functional food composition according to the present invention.
  • a feed composition for preventing or improving arthritis containing Lactobacillus brevis KU15147 strain as an active ingredient is provided.
  • the term "feed” may mean any natural or artificial diet, meal, etc., or a component of the meal, for or suitable for eating, ingestion, and digestion by animals.
  • the feed composition may include feed additives.
  • the above feed additives correspond to supplementary feed under the Feed Management Act.
  • the type of feed is not particularly limited, and feed commonly used in the art can be used.
  • Non-limiting examples of the feed include plant feeds such as grains, roots and fruits, food processing by-products, algae, fiber, pharmaceutical by-products, oils and fats, starches, cucurbits or grain by-products;
  • Examples include animal feed such as proteins, inorganic substances, fats and oils, minerals, single-cell proteins, zooplankton, or food. These may be used individually or in combination of two or more types.
  • the feed composition according to the present invention can be used by adding it to basic feed at a certain ratio.
  • the basic feed may consist of corn, soybean meal, whey, fish meal, molasses, salt, vitamin premix, mineral premix, etc.
  • the vitamin premix may consist of vitamin A, vitamin D, vitamin E, riboflavin, and niacin
  • the mineral premix may consist of, but is not limited to, manganese, iron, zinc, calcium, copper, cobalt, and selenium. .
  • a method for preventing, improving, or treating arthritis in non-human animals comprising administering Lactobacillus brevis KU15147 strain.
  • mammals including rats and livestock, without limitation, but refers to mammals other than humans.
  • the "administration” means introducing the composition of the present invention into an individual by any appropriate method, and the composition may be administered through various routes such as oral or parenteral. Specifically, for parenteral administration, injection methods such as external injection under the skin or intraperitoneal injection, intrarectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection can be selected. Additionally, the number of administrations of the composition may be single or multiple administrations in amounts effective to the individual, but are not limited thereto.
  • administration route may be administered through any general or special route that can reach the target tissue.
  • Lactobacillus brevis KU15147 strain accession number: KCCM 12434P, see Korean Patent Publication No. 10-2305137
  • Lactobacillus brevis KU15154 Lactobacillus brevis KU15154
  • the culture conditions for live bacteria were cultured in anaerobic conditions at 37°C for 24 hours using lactobacilli MRS medium.
  • the cultured strain was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 5 minutes and washed twice with PBS before use.
  • fetal bovine serum FBS
  • penicillin/streptomycin penicillin/streptomycin
  • MTT assay was performed to confirm the cytotoxicity of lactic acid bacteria strains on RAW264.7 cells.
  • RAW 264.7 cells were seeded in a 96-well plate and cultured for 4 hours, then treated with lactic acid bacteria and cultured for an additional 2 hours. Inflammation was induced by treatment with 1 ⁇ g/mL LPS and cultured for an additional 22 hours. 100 ⁇ L of supernatant was used for NO assay, treated with MTT solution (0.5 mg/mL), and reacted for 40 minutes. Afterwards, 200 ⁇ L of DMSO was added, stirred on a shaker for more than 5 minutes, and absorbance was measured at 570 nm. Based on the positive control group treated with LPS, it was judged that there was no cytotoxicity if the cell viability was 80-85% or higher.
  • a NO assay was performed to measure the amount of NO produced by RAW 264.7 cells. After seeding RAW 264.7 cells in a 96 well-plate, they were cultured for 4 hours, treated with 7 Log CFU/mL of lactic acid bacteria, and cultured for 2 hours. Afterwards, inflammation was induced by treatment with 1 ⁇ g/mL LPS and cultured for an additional 22 hours. 100 ⁇ L of supernatant was reacted with equal amounts of Griess reagent and reacted for 15 minutes in the dark. Absorbance was measured at 540 nm, and NO production was measured using a standard curve diluted with sodium nitrite in DMEM.
  • RAW264.7 cells An experiment was conducted using an ELISA Kit to measure the amount of pro-inflammatory cytokines and PGE 2 produced by RAW264.7 cells. After seeding RAW 264.7 cells in a 12 well-plate, they were cultured for 4 hours, treated with 7 Log CFU/mL of lactic acid bacteria, and cultured for 2 hours. Afterwards, inflammation was induced by treatment with 1 ⁇ g/mL LPS and cultured for an additional 22 hours. The experiment was conducted according to the kit manual using appropriately diluted supernatant.
  • Inflammation was induced under the same anti-inflammatory conditions as shown in Example 5, and then cultured for an additional 6 hours.
  • the experiment was conducted according to the kit manual using appropriately diluted supernatant.
  • RT-PCR was performed to confirm the mRNA expression levels of iNOS, COX-2, and pro-inflammatory cytokines produced by RAW 264.7 cells.
  • RAW 264.7 cells were cultured in a 6 well-plate for 24 hours, then treated with lactic acid bacteria 7 Log CFU/mL and cultured for 2 hours. Afterwards, inflammation was induced by treatment with 1 ⁇ g/mL LPS and cultured for an additional 22 hours. After washing twice with PBS, RNA was extracted using the RNeasy Mini Kit and cDNA samples were prepared using the cDNA synthesis kit. Afterwards, cDNA, PCR master mix, and primers were mixed and RT-PCR was performed under conditions referenced in previous studies (see Korea Registration No. 10-2234569, Korea Publication No. 10-2016-0059088, etc.)
  • Cells were cultured in a 60 mm cell culture dish for one day, then treated with lactic acid bacteria 7 Log CFU/mL and cultured for 2 hours. Afterwards, inflammation was induced by treatment with 1 ⁇ g/mL LPS, and then cell lysis was performed under appropriate time conditions. Afterwards, the same amount of protein was subjected to electrophoresis and transfer. After reacting the primary and secondary anti-bodies, protein bands (p-p65, p65, I ⁇ B- ⁇ , c-Jun, The expression level of p-c-Jun) was confirmed.
  • MIA monosodium iodoacetate
  • AIN 93G diet, commercial diet, lab chow, etc. were used.
  • the added concentration of the test substance differed depending on the level of activity of the substance.
  • the method of ingestion of the test substance was administered by forced oral administration.
  • arthritis is induced by administering MIA.
  • MIA monosodium iodoacetate
  • test substances are administered orally
  • Antibiotic resistance was confirmed using broth microdilution plate. 50 ⁇ L of the strain was inoculated into each well at a concentration of 1 ⁇ 10 9 CFU/mL. A medium suitable for the test strain was selected and sterilized, and then 50 ⁇ L was dispensed into each well plate. The concentration of the antibiotic solution was doubled from that of no solution (control group) and added to each well containing the liquid medium. The 96 well plate was cultured for 24 hours under anaerobic conditions at 37°C, and the MIC was confirmed by visual comparison with the control group without antibiotics.
  • HT-29 cell line (10 4 cells) was inoculated into 100 ⁇ L of the prepared DMEM cell medium, the inoculated cell medium was transferred to each well of a 96 well plate, and cultured at 37°C in 5% CO 2 for 24 hours. After culturing, the medium was removed, washed twice with PBS containing 1% BSA, and 100 ⁇ L of new cell medium was added. Test strains (10 7 -10 9 CFU) were inoculated into each well and cultured for 24 hours at 37°C with 5% CO 2 . Positive control (lysate solution addition - surfactant) and negative control (No lysate solution, No bacterial cell addition) were prepared as comparison groups. Cytotoxicity was confirmed using the LDH assay kit.
  • the supernatant was obtained after culturing the strain at 37°C for 24 hours. Expressed using D-lactic acid production kit. Dispense 50 ⁇ L of the prepared culture supernatant into each well of a 96 well plate, then dispense 50 ⁇ L of reaction mix (46 ⁇ L of D-lactate assay buffer, 2 ⁇ L of D-lactate assay substrate, 2 ⁇ L of D-lactate enzyme mix). , incubated at room temperature for 30 minutes. After measuring absorbance at 450 nm, the amount of D-lactate was measured according to the formula.
  • RT-PCR was performed to confirm the amount of iNOS, COX-2, and cytokines expressed when inflammation is induced.
  • LPS low-density polymerase chain reaction
  • the expression level of all inflammation-related factors increased, while in the experimental group treated with L. brevis KU15147, the expression level of inflammation-related factors was confirmed to decrease compared to LGG ( Figure 3).
  • the AP-1 mechanism of action is known to be related to autoimmune diseases.
  • the tendency to reduce c-Jun and c-Jun phosphorylation was found to be higher in L. brevis KU15147 than in LGG and L. brevis KU15154. ( Figure 6).
  • L. brevis KU15147 was found to have an anti-inflammatory effect by participating in the AP-1 mechanism of action.
  • Figure 1 shows that the knee thickness increased in the joints of MIA model mice compared to normal mice.
  • IMC IMC
  • KU15147 it was confirmed that the thickness of both knees decreased compared to the untreated sample (PC).
  • L. brevis KU15147 strain Antibiotic resistance of L. brevis KU15147 strain was verified by broth microdilution assay according to the guidelines of the Ministry of Food and Drug Safety. The standards were presented in accordance with Lactobacillus heterofermentative strains. L. brevis KU15147 strain was able to obtain suitable results for all nine antibiotic criteria (Table 2).
  • the hemolytic activity of the L. brevis KU15147 strain was confirmed using blood agar medium according to the guidelines of the Ministry of Food and Drug Safety. Hemolysin causes hemolysis of red blood cells and does not create a clear zone on blood agar, so the L. brevis KU15147 strain does not cause hemolysis and is therefore safe (Figure 8). ⁇ -Hemolysis (green colony formation) and ⁇ -hemolysis (transparent zone formation) were not observed, and ⁇ -hemolysis (hemolysis was not confirmed) was confirmed, indicating no hemolytic activity.
  • the L. brevis KU15147 strain showed cytotoxicity within 2 at 10 7 CFU/mL to 10 9 CFU/mL.
  • high cytotoxicity of 2.55% to 16.52% was observed.
  • the results of cytotoxicity by LDH assay for toxin production confirmed that it was safe.
  • the L. brevis KU15147 strain showed a cell survival rate of more than 98% at 10 7 to 10 9 CFU/mL.
  • a low cell survival rate of 25.61% was observed.
  • a higher cell survival rate was confirmed compared to the comparative strain.
  • the results of the MTT assay for toxin production confirmed that it was safe.
  • Lactic acid has two optical isomers, L-form and D-form.
  • L-lactic acid can be metabolized, but its isomer, D-lactic acid, cannot be metabolized in the human body.
  • Probiotic strains contain DL-lactate racemase, an enzyme that converts L-lactate to D-lactate, so if the enzyme activity is strong, D-lactate accumulates in newborns, children, and patients with short bowel syndrome, causing acidosis. It can be done. Accordingly, WHO recommended the daily intake of D-lactic acid to be less than 100 mg/kg body mass.
  • L. delbrueckii , L. lactis , L. bulgaricus and others produce only D-form lactic acid
  • L. casei L. salivarius and others produce only L-form lactic acid
  • L. plantarum , L. brevis , L. fermentum , L. acidophilus produces both D-form and L-form lactic acid.
  • L. acidophilus is generally known to produce D-form and L-form lactic acid in a 50:50 ratio.
  • D-Lactate production was tested using a 96 well plate and D-lactate kit. As a result of the experiment, D-lactate production was confirmed to be 1.80 g/L and 2.27 g/L for L. rhamnosus GG strain and L. brevis KU15147 strain, respectively. L-Lactate produced 2.20 g/L and 1.63 g/L, respectively.
  • Bile salt deconjugation was confirmed by plating on MRS agar medium supplemented with 0.5% taurodeoxycholic acid (TDCA; bile acid, Sigma). As a result, when compared to the no additive group and the 0.5% TDCA group, no white colonies were formed ( Figure 9). The safety of L. brevis KU15147 strain was confirmed as no toxic metabolites were produced when decomposing bile acid.
  • TDCA taurodeoxycholic acid
  • L. brevis KU15147 increases NO, PGE2 , iNOS, COX-2, TNF- ⁇ , TNF- ⁇ , and IL-1 ⁇ upon inflammation. showed a decrease in IL-6. They were confirmed to inhibit phosphorylation of NF- ⁇ B and AP-1, which are known to be arthritis-related mechanisms of action.
  • the safety of L. brevis KU15147 has been confirmed in accordance with the guidelines of the Ministry of Food and Drug Safety.
  • tablets were manufactured by tableting according to a conventional tablet manufacturing method.
  • a capsule was prepared by filling a gelatin capsule according to a typical capsule preparation method.
  • Vitamin A acetate 70 ⁇ g
  • Vitamin B6 0.5 mg
  • Vitamin B12 0.2 ⁇ g
  • composition ratio of the above vitamin and mineral mixture is a mixture of ingredients relatively suitable for health functional foods in a preferred embodiment, but the mixing ratio may be modified arbitrarily, and the above ingredients are mixed according to a normal health functional food manufacturing method. Then, granules can be manufactured and used to manufacture health functional foods according to conventional methods.
  • Vitamin A 0.2 g
  • Vitamin B1 0.25 g
  • Vitamin B2 0.3g
  • composition ratio is a preferred embodiment of mixing ingredients that are relatively suitable for beverages of preference, but the mixing ratio may be arbitrarily modified depending on regional or ethnic preferences such as demand class, country of demand, and intended use.

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Abstract

락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

락토바실러스 브레비스 KU15147을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 락토바실러스 브레비스 KU15147을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
관절염이란 관절의 손상을 수반하는 여러 질환을 통칭하는 것으로 크게 골관절염 (퇴행성관절염, Osteoarthritis)과 류마티스 관절염 (염증성 관절염, Rheumatoid Arthritis)으로 나눌 수 있다.
골관절염은 뼈와 뼈가 직접 부딪히는 충격과 마찰을 완화하기 위해 우리 몸의 관절 안에 발달한 연골층이 손상되어 뼈와 뼈가 직접 마찰하면서 통증이 발생하고 이에 따라 움직이기 어려워지는 질환을 말하는데, 이러한 골관절염은 주로 무릎, 고관절, 손, 발, 척추 등 하나의 관절에서부터 발생할 수 있고, 여러 관절에서 동시에 발생할 수 있다. 류마티스 관절염은 면역체계의 이상에 의해 자신의 관절이나 몸의 일부를 공격하여 염증을 일으키는 자가 면역질환으로써 손가락, 손, 발, 손목, 발목, 무릎 등 관절이 아프고 붓는 증세가 나타나며, 근육, 피부, 폐, 눈 등 여러 다른 장기에도 이상을 초래할 수 있는 전신적인 만성 염증성 질환을 말한다.
관절염 환자는 심한 통증을 유발하므로 반드시 항염증제 등을 복용하여야 하는데, 이러한 화학적 요법 약제는 약제의 장기간 사용을 방해하는 부작용, 항염증 효과의 결핍 및 이미 발생한 관절염에 대한 효능의 부족과 같은 결점을 가지고 있어 이러한 문제에 대한 해결책으로서 효과적인 관절염 치료제의 개발에 대한 요구가 지속되고 있다.
프로바이오틱스는 적절한 양을 섭취시, 숙주의 건강에 도움을 주는 것으로 정의되고 있다. 상업용 프로바이오틱스로 Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Bifidobacterium 등의 균주들이 주로 사용되고 있다. 이들 균주들은 항산화능, 항염증능, 콜레스테롤 저하능, 항당뇨 효능들이 알려져 있으며, 이러한 기능성은 균주마다 차이가 있는 것으로 보고된다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 락토바실러스 브레비스 KU15147의 관절염 예방 또는 치료 효과를 발견함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 균주는 기탁번호 KCCM 12434P인 것일 수 있다.
상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것일 수 있다.
상기 균주의 투여용량은 1×106 CFU/mL 내지 1×1010 CFU/mL으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다:
상기 약학 조성물은 관절염에 효과가 있는 성분을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예로, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주를 투여하는 단계를 포함하는 비인간동물에서 관절염 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 기탁번호 KCCM 12434P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주가 항염증, 열감 및 붓기와 관련된 관절염 완화 활성을 보였으므로, 약학, 식품 또는 사료조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 RAW 264.7 cells에 대한 세포 생존율을 나타낸다. NC, negative control; PC, positive control; LGG, Lactobacillus rhamnosus GG; 147, Lactobacillus brevis KU15147; 154, Lactobacillus brevis KU15154.
도 2는 Nitric oxide (NO) (A) 및 PGE2 (B) 생산 저해능을 나타낸다. NC, negative control; PC, positive control; LGG, Lactobacillus rhamnosus GG; 147, Lactobacillus brevis KU15147; 154, Lactobacillus brevis KU15154.
도 3은 염증 관련 인자 및 염증 유발 사이토카인의 발현 억제 효과를 나타낸다. (A) iNOS, (B) COX-2, (C) TNF-α, (D) IL-1β, (E) IL-6. NC, negative control; PC, positive control; LGG, Lactobacillus rhamnosus GG; 147, Lactobacillus brevis KU15147; 154, Lactobacillus brevis KU15154.
도 4는 염증 유발시 LTB4의 발현 억제 효과를 나타낸다. NC, negative control; PC, positive control; LGG, Lactobacillus rhamnosus GG; 147, Lactobacillus brevis KU15147; 154, Lactobacillus brevis KU15154.
도 5는 NF-κB 신호기작과 관련된 단백질 인자의 저해효과를 나타낸다. (A) western-blot 분석 결과, (B) p-p65/p65의 단백질 발현량, (C) IkB-α/ß-actin 단백질 발현량. -, without lactic acid bacteria; LGG, Lactobacillus rhamnosus GG; 147, Lactobacillus brevis KU15147; 154, Lactobacillus brevis KU15154; NC, negative control; PC, positive control.
도 6은 AP-1 신호기작과 관련된 단백질 인자의 저해효과를 나타낸다. (A) western-blot 분석 결과, (B) c-Jun/α-tubulin의 단백질 발현량, (C) p-c-Jun/α-tubulin단백질 발현량. -, without lactic acid bacteria; LGG, Lactobacillus rhamnosus GG; 147, Lactobacillus brevis KU15147; 154, Lactobacillus brevis KU15154; NC, negative control; PC, positive control.
도 7은 KU15147 섭취에 의한 무릎관절두께 변화를 나타낸다. (A) 오른쪽, (B) 왼쪽
도 8은 Staphlyococcus aureus ATCC 25923 균주와 Lactobacillus brevis KU15147 균주의 용혈활성을 나타낸다.
도 9는 Bile salt deconjugation을 나타낸다.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "예방"이라 함은 질환의 원인으로부터 발생을 억제하거나 지연시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서, "치료"라 함은 완전히 치유하지 않아도 증상의 진전 및/또는 악화를 억제하여 손상의 진행을 멈추거나, 또는 증상의 일부 혹은 전부를 개선하여 치유의 방향으로 유도하는 것을 의미한다.
락토바실루스 브레비스 KU15147(Lactobacillus brevis KU15147)는 2019년 01월 29일 한국미생물보존센터에 기탁되었다(KCCM 12434P). 상기 균주는 생균체, 사균체 또는 배양여액으로 제조될 수 있다.
상기 균주의 투여용량은 1×106 CFU/mL 내지 1×1010 CFU/mL인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 균주의 투여용량이 상기 범위 미만인 경우, 관절염에 대한 예방 또는 치료 효과를 발휘하기 어려운 문제점이 있고, 상기 범위를 초과하는 경우, 세포독성을 포함한 독성의 우려사항이 있을 수 있다.
상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 균주에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
또한, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 균주에 대해서는 전술한 바와 같으며, 생균체, 사균체 또는 배양여액으로 제조될 수 있다.
상기 균주의 투여용량은 1×106 CFU/mL 내지 1×1010 CFU/mL인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 균주의 투여용량이 상기 범위 미만인 경우, 관절염에 대한 예방 또는 치료 효과를 발휘하기 어려운 문제점이 있고, 상기 범위를 초과하는 경우, 세포독성을 포함한 독성의 우려사항이 있을 수 있다.
본 발명에서 용어 “개선”은 본 발명의 조성물의 투여로 비만이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 발효식품은 요거트, 김치, 치즈 등 다양할 수 있는데, 상기 발효식품 역시 관절염에 대한 보호 효과를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 균주를 건강기능식품의 첨가물로 사용하는 경우 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 균주는 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 다른 구현예로, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 사료 조성물은 기초사료에 일정 비율로 첨가하여 사용할 수 있다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레늄 등으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주를 투여하는 단계를 포함하는 비인간동물에서 관절염 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서의 용어, "개체"란 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물 등을 제한 없이 포함할 수 있으나, 인간을 제외한 포유동물에 해당한다.
상기 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 조성물의 투여 경로는 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥 내 주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 등의 주입방식을 선택할 수 있다. 또한, 조성물의 투여횟수는 개체에서 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "투여 경로"는 목적 조직에 도달 할 수 있는 어떠한 일반적 또는 특수한 경로를 통하여도 투여될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 관절염 관련 in vitro 실험
(1) 균주의 배양 조건
관절염 후보 균주는 선행 연구를 통한 항염증 균주를 기준으로 두 균주(Lactobacillus brevis KU15147(균주 기탁번호: KCCM 12434P, 국내 등록특허공보 제10-2305137호 참조), Lactobacillus brevis KU15154)를 사용하였고, Lactobacillus rhamnosus GG는 대조군으로 사용하였음. 생균의 배양조건은 lactobacilli MRS 배지를 이용하여 37℃의 혐기조건에서 24시간 배양하여 사용하였음. 배양한 균주를 10,000×g 5분간 원심분리하여 PBS 2회 수세 후 사용하였음.
(2) 세포주 배양
RAW264.7 cells을 이용하여 세포주 배양 조건으로 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin을 첨가하여, 5% CO2 incubator, 37℃에서 배양하였고 monolayer가 형성된 후 계대 배양하여 사용하였음.
(3) MTT assay를 이용한 세포독성
RAW264.7 cells에 유산균 균주가 미치는 세포 독성을 확인하기 위해 MTT assay를 진행하였음. 96-well plate에 RAW 264.7 cell을 seeding한 후 4시간을 배양하고, 이후 유산균을 처리하여 2시간 더 배양하였음. 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 염증을 유발한 후 22시간 추가 배양하였음. 100 μL의 상등액은 NO assay를 위해 사용하고 MTT solution(0.5 mg/mL)을 처리 한 후 40분 동안 반응시켰음. 이후 200 μL의 DMSO를 처리하여 shaker에서 5분 이상 교반한 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였음. LPS를 처리한 양성대조군을 기준으로 Cell viability가 80-85% 이상인 경우 세포 독성이 없다고 판단하였음.
(4) NO 생산능
RAW 264.7 cell이 생산한 NO의 양을 측정하기 위하여 NO assay를 진행하였음. 96 well-plate에 RAW 264.7 cell을 seeding한 후 4시간 배양하고, 유산균 7 Log CFU/mL을 처리하여 2시간 배양하였음. 이후 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 염증을 유발한 후 22시간 추가 배양하였음. 상등액 100 μL와 Griess reagent를 동량 반응시켜 암실에서 15분간 반응시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하여 DMEM에 sodium nitrite를 희석한 standard curve를 통해 NO 생성량을 측정하였음.
(5) ELISA assay를 이용한 Pro-inflammatory cytokine(TNF-α, IL-1β, IL-6)과 PGE2의 변화
RAW264.7 cells이 생산한 pro-inflammatory cytokine과 PGE2의 발생량을 측정하기 위해 ELISA Kit를 활용하여 실험을 진행하였음. 12 well-plate에 RAW 264.7 cell을 seeding한 후 4시간 배양하고, 유산균 7 Log CFU/mL을 처리하여 2시간 배양하였음. 이후 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 염증을 유발한 후 22시간 추가 배양하였음. 적절히 희석한 상등액을 사용하여 Kit의 매뉴얼에 따라 실험하였음.
(6) ELISA assay를 이용한 LTB4의 변화
실시예 5에 제시된 항염 조건을 동일하게 염증을 유발한 후 6시간 추가 배양하였음. 적절히 희석한 상등액을 사용하여 Kit의 매뉴얼에 따라 실험하였음.
(7) RT-PCR을 이용한 iNOS, COX-2 및 pro-inflammatory cytokine의 mRNA 발현량
RAW 264.7 cells이 생산한 iNOS, COX-2 그리고 pro-inflammatory cytokine의 mRNA 수준의 발현량을 확인하기 위해 RT-PCR을 진행하였음. 6 well-plate에 RAW 264.7 cell을 24시간 배양한 후 유산균 7 Log CFU/mL을 처리하여 2시간 배양하였음. 이후 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 염증을 유발한 후 22시간 추가 배양하였음. PBS로 2회 수세한 후 RNeasy Mini Kit를 사용하여 RNA를 추출하고 cDNA 합성 Kit를 사용하여 cDNA sample을 제조하였음. 이후 cDNA, PCR master mix 그리고 primer를 혼합하여 선행 연구에서 참고한 조건으로 RT-PCR을 진행하였음(한국등록 제10-2234569호, 한국공개 제10-2016-0059088호 등 참조)
(8) NF-kB 및 AP-1 signaling을 분석을 통한 메커니즘 검증
60 mm cell culture dish에 세포를 하루 배양한 후 유산균 7 Log CFU/mL을 처리하여 2시간 배양하였음. 이후 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 염증을 유발한 후 적절한 시간 조건에 맞추어 cell lysis를 진행하였음. 이후 같은 양의 단백질을 전기영동하여 transfer하는 과정을 거쳐 1차와 2차 anti-body를 반응시킨 후 X-ray film을 이용하여 단백질 band(p-p65, p65, IκB-α, c-Jun, p-c-Jun)의 발현량을 확인하였음.
<실시예 2> MIA (monosodium iodoacetate) 유도 동물모델
(1) 실험식이 준비
AIN 93G 식이, commercial diet, lab chow 등을 사용하였음. 시험물질의 첨가 농도는 물질의 활성 정도에 따라 차이가 있었음. 시험물질의 섭취방법은 강제경구투여로 진행하며 투여하였음.
(2) 실험동물 준비
7주령의 수컷 SD rat을 이용하여 군당 10 마리 내외로 하였음. 동물사육실은 온도 23±1℃, 습도 53±2% 내외로 유지시켰으며, lighting cycle은 12시간 주기로 일정하게 하였음. 1주일간 고형배합사료로 적응시킨 후에 실험에 사용하였음.
(3) 1주일 적응기간 이후, MIA를 투여 관절염 유도
Zoletile과 Rumpun을 3:1 비율로 희석하여 복강주사를 통해 실험동물을 마취시켰음. 무릎 주변을 제모한 후, 실험 0, 5일차에 오른쪽 무릎 관절강 내에 monosodium iodoacetate(MIA) 50 μL (60 mg/mL) 총 2회 투여하였음.
MIA 투여 후, 무릎두께, 열감, 붓는 정도, 걷는 정도, 통증 등 육안적 관찰하였음. 실험동물을 안정시킨 후, 캘리퍼를 이용하여 측정하였음. 캘리퍼로 무릎부위의 직경 측정시, 일정한 부위를 총 3회 이상 측정하였음.
(4) 그룹화한 후, 시험물질을 경구투여
식이와 물을 24시간 동안 자유급식(ad libitum)으로 공급하고 4주간 사육하였음.
그룹 식이조성 경구투여
(0-4주)		 MIA 주사
ND 정상식이군


AIN 93G diet
(10% kcal fat)		 증류수 -
PC (대조군) 골관절염군 증류수
경구투여
10일 후
3일간격
2회 주사
(50 ul of 60 mg/mL)
IMC 골관절염군 +
Indomethacin		 3 mg/kg BW/d
15147-L 골관절염군 +
KU15147 저농도		 1X108 CFU/d
15147-H 골관절염군 +
KU15147 고농도		 1X109 CFU/d
<실시예 3> 후보균주의 안전성 검증
(1) 항생제 내성 (Broth microdilution assay)
항생제 용액은 EFSA에서 규정된 항생제에 맞는 용매 선정하고, 항생제 별 Stock solution 제조하였음. Syringe Filtration(0.2 μm filter)을 통한 항생제 용액의 멸균하였음.
Broth microdilution plate를 이용하여 항생제 내성을 확인하였음. 균주는 1×109 CFU/mL의 농도로 50 μL를 각 well에 접종하였음.시험 균주에 적합한 배지 선정하고 멸균 후, 96 well plate에 50 μL씩 분주하였음. 항생제 용액을 무첨가(대조군)로부터 농도를 두배씩 증가시켜 액체 배지가 담긴 well에 각각 첨가하였음. 96 well plate는 37°C의 혐기조건에서 24시간 배양하고, MIC는 항생제를 넣지 않은 대조군과 육안으로 비교하여 확인하였음.
(2) 용혈활성
식품의약품안전처 가이드라인에 맞춰 혈액 한천 배지(TSA Blood agar) 제조하였음. 균주를 혈액 한천배지에 streaking 하고 hemolysis 결과를 분석하였음. 기준은 α-hemolysis : 적혈구 헤모글로빈의 Methemoglobin을 감소시켜 녹색 콜로니 형성; β-hemolysis : 적혈구를 파괴하여 투명한 콜로니 형성; γ-hemolysis : 용혈(hemolysis)현상이 확인되지 않음으로 나타내었음.
(3) 독소 생성
(3-1) LDH assay
HT-29 cell line (104 cells)을 100 μL의 준비된 DMEM 세포 배지에 접종하고, 96 well plate의 각 well에 접종된 세포 배지를 옮긴 후 5% CO2 37°C에서 24시간 배양하였음. 배양 후 배지 제거 후 1% BSA가 포함된 PBS로 2회 washing 후 새로운 세포 배지 100 μL 첨가하였음. 각 well에 시험균주(107-109 CFU)를 접종하고 5% CO2 37°C에서 24시간 배양하였음. 비교군으로서 Positive control (Lysate 용액 첨가-계면활성제) 및 Negative control (No lysate solution, No bacterial cell addition) 준비하였음. LDH assay kit를 이용하여 세포독성을 확인하였음.
(3-2) MTT assay
HT-29 cell line (104 cells)을 100 μL의 준비된 DMEM 세포 배지에 접종하고, 96 well plate의 각 well에 접종된 세포 배지를 옮긴 후 5% CO2 37°C에서 24시간 배양하였음. 배양 후 배지 제거 후 1% BSA가 포함된 PBS로 2회 washing 후 새로운 세포 배지 100 μL 첨가하였음. 각 well에 시험균주(107-109 CFU)를 접종하고 5% CO2 37°C에서 24시간 배양하였음. 비교군으로서 Positive control (Lysate 용액 첨가-계면활성제) 및 Negative control (No lysate solution, No bacterial cell addition) 준비하였음. MTT assay kit를 이용하여 세포독성을 확인하였음.
(4) 대사적 특성
(4-1) D-lactate production 방법
균주를 37℃에서 24시간 배양 후 상층액을 확보하였음. D-lactic acid production kit를 사용하여 나타내었음. 준비된 배양 상등액 50 μL을 96 well plate의 각 well에 분주한 후 50 μL의 reaction mix (D-lactate assay buffer 46 μL, D-lactate assay substrate 2 μL, D-lactate enzyme mix 2 μL)를 분주한 후, 상온에서 30분 간 배양하였음. 450 nm에서 흡광도 측정 후 공식에 따라 D-lactate 양을 측정하였음.
(4-2) Bile salt deconjugation 방법
0.5%의 taurodeoxycholic acid (TDCA; bile acid, Sigma)가 첨가된 MRS 한천배지에 streaking 후 혐기조건에서 37℃에서 2일 간 배양하였음. BSH (Bile salt hydrolase) 활성이 있는 균주의 경우 콜로니 주변에 불투명한 하얀색 콜로니가 형성됨.
<실험예 1> 관절염 관련 in vitro 실험
(1) RAW264.7 cells에 대한 MTT assay를 이용한 세포 생존율
7 Log CFU/mL 의 생균을 처리한 결과, LPS 양성대조군과 비교하였을 때 모두 85% 이상의 세포 생존율을 나타내었음. 7 Log CFU/mL의 유산균 농도가 세포에 영향을 미치지 않음을 확인하였음(도 1).
(2) NO와 PGE2 생산능
7 Log CFU/mL의 생균을 처리시, RAW264.7 cells의 염증(면역)반응에서 중요한 생산물인 NO와 PGE2의 발생량을 확인하였음. 양성대조군에서 그 발생량이 증가한 것과 비교하였을 때, L. brevis KU15147 균주는 NO와 PGE2의 발현을 감소하는 것으로 확인되었음(도 2).
(3) RT-PCR assay를 통한 사이토카인 변화
iNOS, COX-2, 그리고 염증 유발시 발현되는 cytokine의 발생량을 확인하기 위해 RT-PCR을 진행하였음. LPS를 처리하였을 때, 염증과 관련된 모든 인자에서 그 발현량이 증가하는 반면, L. brevis KU15147을 처리한 실험군의 경우 LGG보다 염증 관련 인자들의 발현량이 감소하는 것을 확인되었음(도 3).
(4) LTB4의 생산능
관절염 완화 효과와 관련하여 통증과 관련된 인자인 LTB4의 발생량을 측정하기 위해 ELISA를 진행하였음. LPS를 처리한 양성대조군의 경우 유의미하게 그 발생량이 증가시키는 반면, L. brevis KU15147 균주를 처리한 처리군에서는 그 발생량이 감소한 것을 확인할 수 있었음(도 4).
(5) NF-κB 작용기전의 저해 효과
NF-κB 작용기전에 관여하는 p-p65, p65, IκB-α의 발현을 확인하였음. 특히 p65 인산화를 감소시키는 경향이 L. brevis KU15147에서 LGG와 L. brevis KU15154보다 높게 나타났음. IκB-α의 경우에는 LPS 처리시 감소가 확인되었으나, L. brevis KU15147에서 negative control보다는 다소 약하지만, 증가가 확인되어 NF-κB 작용기전에 작용함을 확인할 수 있었음(도 5). 이러한 작용기전을 통해 친염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6를 유의적으로 억제하는 것이 확인되었음.
(6) AP-1 작용기전의 저해 효과
AP-1 작용기전은 자가면역질환과 관련있는 기전으로 알려져 있음. AP-1 작용기전에 관여하는 p-c-Jun과 c-Jun의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, c-Jun과 c-Jun 인산화를 감소시키는 경향이 L. brevis KU15147에서 LGG와 L. brevis KU15154보다 높게 나타났음(도 6). L. brevis KU15147는 AP-1 작용기전에 관여하여 항염효과를 나타나는 것으로 확인되었음.
<실험예 2> MIA (monosodium iodoacetate) 유도 동물모델
도 1은 정상 마우스에 비해 MIA 모델 마우스의 관절에서 무릎 두께가 증가함을 확인할 수 있었음. IMC, KU15147 처리시, 양쪽 무릎의 두께가 시료 무처리군(PC)에 비해 감소됨이 확인되었음.
왼쪽 무릎의 경우에는 시료 처리군에 있어서는 정상군(NC)과 거의 유의한 두께가 확인되었음.
<실험예 3> 후보균주의 안전성 검증
(1) 항생제 내성 (Broth microdilution assay)
L. brevis KU15147 균주의 항생제 내성은 식품의약품안전처 가이드라인에 따라 Broth microdilution assay에 의해 검증함. 기준은 Lactobacillus heterofermentative 균주에 맞춰 제시하였음. L. brevis KU15147 균주는 9가지 항생제 기준 모두에 대해서는 적합한 결과를 얻을 수 있었음 (표 2).
Antibiotics 기준(mg/L) 결과(mg/L) 판정
Ampicillin 2 0.5 적합
Vancomycin n.r. n.r. 적합
Gentamycin 16 4 적합
Kanamycin 64 64 적합
Streptomycin 64 64 적합
Erythromycin 1 0.5 적합
Clindamycin 2 0.047 적합
Tetracycline 32 3 적합
Chloramphenicol 8 3 적합
*적합, Cut-off value 이하; 부적합, Cut-off value 초과
(2) 용혈활성
L. brevis KU15147 균주에 대해서 식품의약품안전처 가이드라인에 따라 용혈성 여부를 혈액 한천 배지를 이용하여 용혈활성을 확인하였음. Hemolysin에 의해 적혈구의 용혈을 일으켜 blood agar 상에서 clear zone이 생성되지 않아 L. brevis KU15147 균주는 용혈을 일으키지 않았으므로 안전함(도 8). α-Hemolysis(녹색 콜로니 형성), β-hemolysis(투명존 형성)이 나타내지 않았으며, γ-hemolysis(용혈 현상이 확인되지 않음)이 확인되어 용혈활성을 나타내지 않았음. 대조군인 Staphylococcus aureus ATCC 25923의 균은 투명존을 보였고 β-hemolysis를 나타내었음.
(3) 독소 생성
(3-1) LDH assay
LDH assay의 결과, L. brevis KU15147 균주에서는 107 CFU/mL ~ 109 CFU/mL에서는 2 이내의 세포독성을 나타내었음. 병원성균인 Staphylococcus aureus을 처리하였을 때, 2.55%~16.52%의 높은 세포독성을 나타났음. 독소 생성에 대한 LDH assay에 의한 세포독성의 결과는 안전함을 확인할 수 있었음.
Strain Cytotoxicity(%)
107 CFU/mL 108 CFU/mL 109 CFU/mL
Staphylococcus aureus ATCC 25923 2.55±0.18 6.95±0.89 16.52±0.26
Lactobacillus brevis KU15147 1.09±0.47 0 0
(3-2) MTT assay
MTT assay의 결과, L. brevis KU15147 균주는 107~109 CFU/mL에서 98% 이상의 세포 생존율을 나타내었음. 병원성균인 Staphylococcus aureus의 상등액을 처리하였을 때, 25.61%의 낮은 세포 생존율을 나타내었음. 비교균주 대비 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었음. 독소 생성에 대한 MTT assay의 결과는 안전함을 확인할 수 있었음.
Strain 세포생존율(%)
107 CFU/mL 108 CFU/mL 109 CFU/mL
Staphylococcus aureus ATCC 25923 25.61±0.75
Lactobacillus brevis KU15147 99.82±5.80 98.17±6.45 114.36±4.96
(4) 대사적 특성
(4-1) D-lactate와 L-lactate 생산
Lactic acid는 L-form과 D-form 2종의 광학이성질체가 있음. 인체의 경우 L-lactic acid는 대사가 가능하지만, 이성질체인 D-lactic acid는 인체 내에서 대사가 불가능함. 프로바이오틱스 균주의 경우 L-lactate를 D-lactate로 전환시키는 효소인 DL-lactate racemase를 가지고 있어서 효소활성이 강한 경우에는 신생아나 어린이 및 short bowel syndrome 환자에게 D-lactate가 축적되어 산독증(acidosis)을 유발시킬 수 있음. 이에 WHO는 D-lactic acid의 일일 섭취량을 100 mg/kg body mass 이하로 권장한 바 있음.
유산균 중 L. delbrueckii, L. lactis, L. bulgaricus 등은 D-form lactic acid만을 생산하는 반면, L. casei, L. salivarius 등은 L-form lactic acid만을 생산함. 한편 L. plantarum, L. brevis, L. fermentum, L. acidophilus 등은 D-form과 L-form lactic acid를 모두 생산함. L. acidophilus는 일반적으로 D-form과 L-form lactic acid를 50:50 비율로 생산한다고 알려져 있음.
D-Lactate 생산은 96 well plate와 D-lactate kit를 이용하여 실험하였음. 실험 결과, D-lactate 생산은 L. rhamnosus GG 균주, L. brevis KU15147 균주는 각각 1.80 g/L, 2.27 g/L의 생산을 확인할 수 있었음. L-Lactate는 각각 2.20 g/L, 1.63 g/L를 생산하였음.
Strain D-Lactate production L-Lactate production
Lactobacillus rhamnosus GG 1.80±0.23 g/L 2.20±0.10 g/L
Lactobacillus brevis KU15147 2.27±0.14 g/L 1.63±0.06 g/L
(4-2) Bile salt deconjugation
Bile salt deconjugation은 0.5% taurodeoxycholic acid(TDCA; bile acid, Sigma)가 첨가된 MRS 한천배지에 도말하여 확인하였음. 그 결과 무첨가군과 0.5% TDCA군과 비교 시, 하얀색 콜로니가 형성되지 않았음(도 9). L. brevis KU15147 균주는 담즙산 분해에 있어 독성 대사산물이 생성되지 않아 안전성이 확인되었음.
결론적으로, L. brevis KU15147은 염증 유발시 증가하는 NO, PGE2, iNOS, COX-2, TNF-α, TNF-α, IL-1β. IL-6 감소를 나타내었음. 이들은 관절염 관련 작용기전으로 알려진 NF-κB와 AP-1의 인산화를 억제하는 것으로 확인되었음. 또한, L. brevis KU15147은 식품의약품안전처 가이드라인에 따라 그 안전성이 확인되었음.
하기에 본 발명의 균주를 유효성분으로 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1: 산제의 제조
Lactobacillus brevis KU15147 균주 20 mg
유당수화물 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2: 정제의 제조
Lactobacillus brevis KU15147 균주 10 mg
*옥수수전분 100 mg
유당수화물 100 mg
스테아르산마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예 3: 캅셀제의 제조
Lactobacillus brevis KU15147 균주 10 mg
미결정셀룰로오스 3 mg
유당수화물 14.8 mg
스테아르산마그네슘 0.2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조하였다.
제제예 4: 주사제의 제조
Lactobacillus brevis KU15147 균주 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
인산일수소나트륨 26 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플당(2 mL) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
제제예 5: 액제의 제조
Lactobacillus brevis KU15147 균주 10 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
레몬향 적량
상기의 성분을 통상의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 멸균시켜 갈색병에 충진하여 액제를 제조한다.
제제예 6: 건강기능식품의 제조
Lactobacillus brevis KU15147 균주 10 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7: 건강음료의 제조
Lactobacillus brevis KU15147 균주 10 mg
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
정제수 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

  1. 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCCM 12434P인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물
  3. 제1항에 있어서, 상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주의 투여용량은 1×106 CFU/mL 내지 1×1010 CFU/mL으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물
  5. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 관절염에 효과가 있는 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물
  6. 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물
  7. 제6항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCCM 12434P인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물
  8. 제6항에 있어서, 상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물
  9. 제6항에 있어서, 상기 균주의 투여용량은 1×106 CFU/mL 내지 1×1010 CFU/mL으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물
  10. 제6항에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물은 관절염에 효과가 있는 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물
  11. 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 개선용 사료 조성물
  12. 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KU15147 균주를 투여하는 단계를 포함하는 비인간동물에서 관절염 예방, 개선 또는 치료하는 방법
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