WO2017023099A1 - 장 내 유산균 증가용 조성물 및 이를 이용한 유산균 생산 방법 - Google Patents

장 내 유산균 증가용 조성물 및 이를 이용한 유산균 생산 방법 Download PDF

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조시영
박찬웅
김주원
조동현
서대방
신송석
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(주)아모레퍼시픽
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    • A61K36/756—Phellodendron, e.g. corktree

Definitions

  • the present specification describes a composition for increasing lactic acid bacteria in the intestine and a method for producing lactic acid bacteria using the same.
  • antibiotics are used for therapeutic purposes. The use of antibiotics can cause side effects that cause resistance of harmful microorganisms.
  • probiotics that increase the intestinal beneficial bacteria by directly ingesting beneficial microorganisms to the human body, but for the commercialization, it is necessary to produce such a beneficial microorganism with a high production yield.
  • microorganisms beneficial to the human body are very difficult to grow in vitro, and thus are often difficult to produce.
  • microorganisms in order to have an effect as a probiotic, microorganisms must survive in processing conditions such as lyophilization or pelletization during the production process, and must survive in gastric juice and bile acids, which are strong acids, and settle in the intestine.
  • probiotics with all of these conditions are rare, so the probiotics we consume actually have very little effect compared to the benefits of the microorganisms.
  • the present invention is to provide a composition that can improve the diarrhea, enteritis, gastrointestinal disorders and the like by inducing proliferation in the intestine of lactic acid bacteria that is difficult to mass-proliferate in vitro.
  • the present invention is to provide a composition that induces the proliferation of lactic acid bacteria in the intestine and at the same time inhibit the proliferation of harmful bacteria in the intestine to improve diarrhea, enteritis, gastrointestinal disorders.
  • the present invention is to provide a method for producing lactic acid bacteria having a high production yield by propagating lactic acid bacteria difficult to grow in vitro in the intestine of mammals.
  • the present invention provides a composition for increasing intestinal lactic acid bacteria comprising a compound of Formula 1, a derivative thereof, or a pharmaceutically or food acceptable salt as an active ingredient.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently a linear or branched C 1 to C 18 alkyl group, C 1 to C 18 alkenyl group, C 1 to C 18 alkynyl group or C 3 to C 6 is a cyclic alkyl group.
  • the present invention provides a method for producing lactic acid bacteria comprising orally administering the composition for increasing intestinal lactic acid to a mammal other than a human, and extracting enteric lactic acid bacteria from feces of the mammal.
  • the present invention can provide a composition that can improve the diarrhea, enteritis, gastrointestinal disorders, etc. of the subject by inducing proliferation in the intestine of lactic acid bacteria that is difficult to grow large in vitro.
  • the present invention may provide a composition that induces lactic acid bacteria growth in the intestine and at the same time inhibits the growth of harmful bacteria in the intestine to improve diarrhea, enteritis, gastrointestinal disorders and the like.
  • the present invention can provide a method for producing lactic acid bacteria having a high production yield by propagating lactic acid bacteria that are difficult to grow in vitro in the intestine of a mammal.
  • 1 is a graph showing the concentration of shiringarenol according to the ginseng fruit extract fractions.
  • Figure 2 is a graph showing the frequency of enterobengal bacteria analyzed in the stool isolated from the large intestine of the rat orally administered the test substance.
  • Figure 3 is a graph showing the frequency of intestinal harmful bacteria analyzed in the stool isolated from the large intestine of the rat orally administered the test substance.
  • Figure 4 shows the effect of the cyringarinol and ginseng fruit extract containing the same on the proliferation of Lactobacillus ruteri.
  • FIG. 5 is a graph showing the improvement effect of ulcerative colitis induced by dextran sulfate sodium (DSS) of rats orally administered with cyringaresinol and ginseng fruit extract containing the same.
  • DSS dextran sulfate sodium
  • the term "derivative” means all compounds that are changed to the same or different substituents at substitutable positions of the compounds. There are no limitations on the kind of such substituents, for example, each independently substituted with a hydroxy group, a phenoxy group, a thienyl group, a furyl group, a pyridyl group, a cyclohexyl group, an alkyl alcohol group, an alkyldialcohol group, or a substituted or unsubstituted phenyl.
  • sugar moiety means a group from which one hydrogen atom has been removed from a polysaccharide molecule, and thus may mean a moiety derived from, for example, a monosaccharide or an oligosaccharide.
  • Hetero as used herein means that the carbon atom is substituted with any one selected from the group consisting of N, O, S and P.
  • pharmaceutically acceptable means the approval of a government or equivalent regulatory body to use in animals, more specifically in humans, by avoiding significant toxic effects when used in conventional medicinal dosages. It can be received, approved, or listed in a pharmacopoeia or recognized as another general pharmacopeia.
  • salt means a salt according to one aspect of the invention that is pharmaceutically or food acceptable and has the desired pharmacological activity or activity as a food of the parent compound. do.
  • the salt is formed of an inorganic acid such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, or the like; Or acetic acid, propionic acid, hexanoic acid, cyclopentanepropionic acid, glycolic acid, pyruvic acid, lactic acid, malonic acid, succinic acid, malic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, 3- (4-hydroxybenzoyl) Benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, 1,2-ethane-disulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, benzenesulf
  • composition for increasing intestinal lactic acid bacteria may include a compound of Formula 1, a derivative thereof, or a pharmaceutically or food acceptable salt as an active ingredient.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently a linear or branched C 1 to C 18 alkyl group, C 1 to C 18 alkenyl group, C 1 to C 18 alkynyl group or C 3 to C 6 is a cyclic alkyl group.
  • the compound of Formula 1 is a lignan compound, and includes, but is not limited to, siringaresinol, syedaresinol, eudesmin, yangambin, or sesamine.
  • the lignan compound includes the compound of Formula 1 or an isomer thereof.
  • the isomers in the above include the optical isomers, specifically the optical isomers represented by the formulas (2) and (3), more specifically (+)-cyringaresinol, (-)-syringaresinol, (+)-oil Desmin, (-)-eudesmin, (+)-yanggambin, (-)-yanggambin, (+)-sesamine or (-)-sesamine.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are the same as defined in Formula 1 above.
  • the lignan-based compound can be obtained through chemical synthesis or extracted from one or more of flaxseed, yellowish white, ogapi, sesame and ginseng fruit.
  • the compound may be obtained by purifying an extract extracted from one or more of flaxseed, yellow white, organza, sesame and ginseng fruit.
  • the flaxseed, yellowish white, ogapi and sesame seeds include all the parts of the plant, for example, the leaves, stems, roots, berries or seeds of each plant, ginseng fruit may include the seed portion, fruit skin or pulp of the ginseng fruit have.
  • the extract is a broad concept including all materials obtained by extracting the components of natural products, regardless of the extraction method, extraction solvent, extracted components or the form of the extract.
  • the extract may be obtained by extracting at least one of flaxseed, yellowish white, organza, sesame and ginseng fruit with at least one selected from the group consisting of water, an organic solvent and a mixture of water and an organic solvent.
  • the organic solvent includes one or more selected from the group consisting of alcohol, acetone, ether, ethyl acetate, diethyl ether, ethyl methyl ketone and chloroform, but is not limited thereto.
  • the alcohol includes a lower alcohol of C1 ⁇ C5
  • the lower alcohol of C1 ⁇ C5 includes one or more selected from the group consisting of methanol, ethanol, isopropyl alcohol, n-propyl alcohol, n-butanol and isobutanol
  • the present invention is not limited thereto.
  • the extract may be an extract of ginseng fruit.
  • Ginseng fruit extract produces alcohol extract of ginseng fruit pulp; Eluting the prepared alcohol extract with a solvent comprising at least one of water and alcohol to obtain a fraction; And the obtained fraction can be prepared by chromatography, for example thin film chromatography (TLC) using an organic solvent as the developing solvent.
  • the organic solvent may include one or more selected from the group consisting of alcohol, acetone, ether, ethyl acetate, diethyl ether, ethyl methyl ketone, and chloroform, and the alcohol may include an alcohol of C1 to C5.
  • the compound of Formula 1 may be syringaresinol of Formula 4 below.
  • the siringaresinol may be (+)-syringaresinol, and specifically, (8S, 8'S)-(-)-ringingresinol of Formula 5 or (8R, 8'R)-( It may be +)-syringaresinol, for example (8R, 8'R)-(+)-ringingresinol.
  • the lactic acid bacteria may include one or more of the genus Lactobacillus strain and Bifidobacterium strain.
  • the lactic acid bacteria may be one or more of Lactobacillus reuteri and Bifidobacterium adolescentis.
  • Lactobacillus luteri is a representative enterococci, the most probiotic of lactic acid bacteria. Lactobacillus luteri produces antibiotics luterin during fermentation of glycerol, which has strong antimicrobial activity. Therefore, it shows excellent efficacy in preventing and treating diarrhea, enteritis, allergy, and candidiasis, which commonly occur in infants (Urbanska et al. Eur. J. Pediatr 2014). In addition, by controlling the secretion of inflammatory cytokines in the intestinal mucosa, it helps to reduce diseases of inflammatory bowel disease, irritable bowel syndrome and gastrointestinal disorders (Liu et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010).
  • Lactobacillus lutery is a strain that is difficult to produce in large quantities by cultivation because of growing conditions in vitro.
  • composition according to an embodiment of the present invention by orally administering the composition according to an embodiment of the present invention to the subject by activating the proliferation of the Lactobacillus luterie present in the intestine of the subject to increase the Lactobacillus luterie in the intestine, through which diarrhea, enteritis, gastrointestinal disorders, It can be effective as prebiotics that show improvement, treatment and prophylactic effects of allergy, candidiasis and the like.
  • the compound of Formula 1 as an active ingredient is 0.001% by weight, 0.002% by weight, 0.003% by weight, 0.004% by weight, 0.005% by weight, 0.006% by weight, 0.007% by weight based on the total weight of the composition
  • the composition for increasing intestinal lactic acid bacterium may include the compound of Formula 1 as an extract of at least one of flaxseed, yellowish white, ogapi, sesame and ginseng fruit.
  • the compound of Formula 1 is contained as an extract of at least one of flaxseed, yellowish white, ogapi, sesame and ginseng fruit containing the compound. The description is omitted because it is the same.
  • the flaxseeds, yellowish white, scabbard and sesame seeds include all parts of the plant, for example, the leaves, stems, roots, fruits or seeds of each plant.
  • the ginseng fruit may include the seed portion, fruit skin or pulp of the ginseng fruit, for example, ginseng fruit concentrate may be used to remove the solids from the whole juice except the seed in the ginseng fruit.
  • the extract is a broad concept including all materials obtained by extracting the components of natural products, regardless of the extraction method, extraction solvent, extracted components or the form of the extract.
  • the extract may be obtained by extracting at least one of flaxseed, yellowish white, organza, sesame and ginseng fruit with at least one selected from the group consisting of water, an organic solvent and a mixture of water and an organic solvent.
  • the organic solvent includes one or more selected from the group consisting of alcohol, acetone, ether, ethyl acetate, diethyl ether, ethyl methyl ketone and chloroform, but is not limited thereto.
  • the alcohol includes a lower alcohol of C1 ⁇ C5
  • the lower alcohol of C1 ⁇ C5 includes one or more selected from the group consisting of methanol, ethanol, isopropyl alcohol, n-propyl alcohol, n-butanol and isobutanol
  • the present invention is not limited thereto.
  • the extract may be an extract of ginseng fruit.
  • Ginseng fruit extract produces alcohol extract of ginseng fruit pulp; Eluting the prepared alcohol extract with a solvent comprising at least one of water and alcohol to obtain a fraction; And the obtained fraction can be prepared by chromatography, for example thin film chromatography (TLC) using an organic solvent as the developing solvent.
  • the organic solvent may include one or more selected from the group consisting of alcohol, acetone, ether, ethyl acetate, diethyl ether, ethyl methyl ketone, and chloroform, and the alcohol may include an alcohol of C1 to C5.
  • the extract may include the compound of Formula 1 in an amount of 0.01% to 40% by weight, for example 0.04% to 24% by weight based on the total weight of the extract.
  • the composition for increasing the intestinal lactic acid bacteria as a prebiotic may be a composition administered simultaneously with Lactobacillus reuteri which is a probiotic.
  • compositions according to embodiments of the present invention may be provided in various forms of food additives or functional foods containing the active ingredient. It can be processed into fermented milk, cheese, yogurt, juice, probiotic and health food, including the active ingredient, and can be used in the form of various other food additives.
  • the composition according to the embodiments of the present invention may be a health food composition.
  • the health food composition may be formulated as pills, capsules, tablets, granules, caramels or drinks. In other embodiments, it may be processed in the form of a liquid, powder, granules, tablets or tea bags and the like.
  • composition may be administered by various methods, such as simple drinking, injection, spray or squeeze.
  • the composition may contain other ingredients and the like that can give a synergistic effect to the main effect within a range that does not impair the main effect of the present invention.
  • it may further include additives such as perfumes, pigments, fungicides, antioxidants, preservatives, moisturizers, thickeners, inorganic salts, emulsifiers and synthetic polymer materials to improve physical properties.
  • additives such as perfumes, pigments, fungicides, antioxidants, preservatives, moisturizers, thickeners, inorganic salts, emulsifiers and synthetic polymer materials to improve physical properties.
  • supplementary ingredients such as water soluble vitamins, oil soluble vitamins, polymer peptides, polymer polysaccharides and seaweed extract may be further included.
  • ingredients may be suitably selected and formulated by those skilled in the art according to the dosage form or purpose of use, and the amount thereof may be selected within a range that does not impair the object and effect of the present invention.
  • the addition amount of the components may be 0.01% to 5% by weight, for example 0.01% to 3% by weight based on the total weight of the composition.
  • composition according to the embodiments of the present invention may be a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may be formulated in oral or parenteral dosage forms in various forms, such as solid, semi-solid or liquid, further comprising a commercially available inorganic or inorganic carrier in accordance with conventional methods.
  • the oral dosage form can be, for example, tablets, pills, granules, soft / light capsules, powders, granules, powders, emulsions, syrups, pellets, and the like.
  • Parenteral dosage forms are, for example, injections, drops, and the like.
  • the pharmaceutical composition may further contain preservatives, stabilizers, hydrating or emulsifying accelerators, pharmaceutical auxiliaries such as salts or buffers for controlling osmotic pressure and other therapeutically useful substances.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally, parenteral, topical, transdermal, subcutaneous, rectal, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, and the like.
  • the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of several relevant factors such as the severity of the symptom, the route of administration chosen, the age, sex, weight and health of the subject. Generally, the dosage of the active ingredient is 0.001 mg / kg / day to 2000 mg / kg / day, for example 0.5 mg / kg / day to 1500 mg / kg / day.
  • the improvement, treatment and prevention of conditions including diarrhea, enteritis, gastrointestinal disorders, allergies, candidiasis, etc. of the compound of Formula 1, its derivatives or pharmaceutically or food acceptable salts can be used.
  • a compound of Formula 1, a derivative thereof, or a pharmaceutically or food acceptable one for improving, treating, and preventing conditions including diarrhea, enteritis, gastrointestinal disorder, allergy, candidiasis, and the like. Salts may be provided.
  • a method of increasing intestinal lactic acid bacteria in a subject comprising administering to the subject a compound of Formula 1, a derivative thereof, or a pharmaceutically or food acceptable salt thereof.
  • the method may include administering a composition for increasing intestinal lactic acid bacteria according to embodiments of the present invention.
  • the method may further comprise administering the lactic acid bacteria.
  • diarrhea, enteritis, gastrointestinal disorders, allergy, candidiasis, and the like comprising administering to the subject a compound of Formula 1, a derivative thereof, or a pharmaceutically or food acceptable salt thereof
  • the method may include administering a composition for increasing intestinal lactic acid bacteria according to embodiments of the present invention.
  • the method may further comprise administering the lactic acid bacteria.
  • kits comprising a composition for increasing intestinal lactic acid bacteria and Lactobacillus luuteri ( Lactobacillus reuteri ) according to the embodiments of the present invention.
  • the production method of lactic acid bacteria according to the present embodiment may include orally administering the composition of the embodiments of the present invention to mammals other than humans, and extracting enteric lactic acid bacteria from feces of the mammal.
  • the production method according to the present embodiment is difficult to grow and proliferate in vitro, it is possible to economically mass-produce lactic acid bacteria that is difficult to mass production, it can be provided as probiotics (probiotics) produced in this way.
  • the mammal is not limited to any mammal other than human, and for example, a mammal such as Mus or Rattus may be used in production efficiency and economics.
  • the lactic acid bacteria may include one or more of the genus Lactobacillus strain and Bifidobacterium strain.
  • the lactic acid bacteria may be one or more of Lactobacillus reuteri and Bifidobacterium adolescentis, for example, Lactobacillus reuteri.
  • Decanter was used as a food processing equipment to isolate the fruit, ginseng fruit peel, pectin, and other solids, and concentrated under reduced pressure to prepare a primary concentrate.
  • the prepared ginseng fruit extract solid was purified by reversed-phase (ODS) column chromatography, and the elution solvent used was 100% / 0%, 90% / 10%, 80% / 20 by weight of water / methanol. %, 70% / 30%, 60% / 40%, 50% / 40%, 40% / 60%, 30% / 70%, 20% / 80%, 10% / 90%, 0% / 100% Elution with solvents resulted in fractions of GB-1 to GB-10. The content of (+)-syringaresinol of each fraction is shown in FIG. 1.
  • the extract of GB-1 fraction shown in Figure 1 was used as ginseng fruit extract in the following test example.
  • the extract fraction GB-1 of Preparation Example 1 was concentrated and Sephadex LH-20 column choromatography was performed using 50% aqueous methanol. From the obtained fractions, the fractions with high SIRT1 activity and the content of siringarecinol were selected and concentrated, followed by preparative silica gel TLC using chloroform: methanol (10: 1) as a developing solvent. The active fraction of value 0.67 was purified.
  • NMR spectroscopy and database search were performed to identify the isolated and purified active compounds as syringaresinol.
  • mass spectrometry was performed. ESI-mass was measured in positive mode, and [M + Na] + was observed at m / z 440.9 and [2M + na] + at m / z 858.9. I could see that.
  • NMR spectroscopy was performed to obtain the same result as Chemical Formula 6. Accordingly, it was confirmed that the separated purified compound was syringaresinol.
  • mice purchased 28-week-old C57BL / 6 male mice from a central laboratory animal, were acclimated for two months in an animal laboratory environment of Pacific pharmaceuticals, and were tested from 36 weeks of age.
  • the sterilized feeder D12450B, Research Diets, New Brunswick, NJ, USA
  • Humidity was induced to 50 ⁇ 10%, and lighting was automatically adjusted day and night at 12 hour intervals Animal care was handled according to the pharmaceutical IACUC (IACUC14-014).
  • (+)-sirringarecinol low concentration group (10 mg / kg; siringaresinol 10), (+)-syringalecinol high concentration group (50 mg / kg) Cyringa resinol 50), ginseng fruit low concentration group (100mg / kg; ginseng fruit 100), ginseng fruit high concentration group (500mg / kg; ginseng fruit 500).
  • Concentration units represent mg of sample per kg of rat weight.
  • (+)-Syringar Resinol was dissolved in methylcellulose (Methylcellulose), and each sample was administered orally once a day for 10 weeks at the above concentration per dose.
  • Lactobacillus ruteri KCTC 3594 was distributed from Korea Bio Resource Center (KCTC).
  • the number of generated colonies was measured, and the number of viable cells per ml of culture medium was calculated by multiplying the average colony number by the dilution factor.
  • To the 5ml MRS broth (Dipcosa, USA) was added sterilized by adding (+)-syringalesinol or ginseng fruit extract at a concentration of 0 ⁇ 200 ⁇ g / ml, respectively.
  • 100 ⁇ l was inoculated and then cultured at 37 ° C. for 6 hours and 24 hours.
  • mice were purchased from 28-week-old C57BL / 6 male mice from a central laboratory animal, and adapted for two months in a pathogen-free facility animal room environment of the Pacific, and were tested from 42 weeks of age.
  • the sterilized feeder D12450B, Research Diets, New Brunswick, NJ, USA
  • Humidity was induced to 50 ⁇ 10%, and lighting was automatically adjusted day and night at 12 hour intervals Animal care was handled according to the pharmaceutical IACUC (IACUC14-014).
  • Drinking water containing 3% (W / V) DSS is fed for 8 days to induce ulcerative colitis.
  • 10 animals were separated from each group, and each group was orally added to DSS group (saline administration), siringaresinol 50mg / kg (syringaresinol 50) and ginseng fruit 500mg / kg (ginseng fruit 500) once a day for 8 days Administered.
  • DAI was measured with lesions such as blood and diarrhea.
  • rats fed a high concentration of (+)-shiringarecinol improved ulcerative colitis by about 50% compared to the DSS group.
  • Ginseng fruit extract also improved ulcerative colitis by 20% in rats fed high concentrations.
  • the stool of the mice fed silingaresinol was placed in MRS liquid medium containing 0.02% sodium azide and incubated at 37 ° C. for 24 hours. After incubation, the culture solution was taken using 10 ⁇ l platinum, and then plated on a plate of MLS agar containing 0.02% sodium azide again and incubated for 48 hours at 37 ° C. to isolate the colonies, and sequence analysis was performed by bacterial pi on the cloth wrap. It was confirmed to be Lactobacillus ruteri by request.
  • Tablets were prepared by mixing 100 mg of (+)-syringaresinol, 400 mg of lactose, 400 mg of corn starch, and 2 mg of magnesium stearate, followed by tableting according to a conventional method for preparing tablets.
  • a capsule was prepared by mixing 100 mg of (+)-syringarecinol, 400 mg of lactose, 400 mg of corn starch, and 2 mg of magnesium stearate, and then filling the gelatin capsule according to a conventional method for preparing a capsule.
  • (+)-syringareresinol 50 mg were mixed, molded into granules using a fluid bed granulator, and filled into fabric.
  • ginseng fruit extract containing (+)-syringalecinol 50 mg of ginseng fruit extract containing (+)-syringalecinol, 10 g of glucose, 0.6 g of citric acid, and 25 g of liquid oligosaccharides are mixed, and 300 ml of purified water is added to each bottle for 200 ml. After filling the bottle sterilized for 4-5 seconds at 130 °C to prepare a drink.
  • (+)-syringarecinol 1.8 g corn syrup, 0.5 g skim milk, 0.5 g soy lecithin, 0.6 g butter, 0.4 g vegetable hardened milk, 1.4 g sugar, 0.58 g margarine, and 20 mg salt Caramel molded by mixing.
  • Vitamin A Acetate 70 ⁇ g Vitamin E 1.0 mg Vitamin B1 0.13 mg Vitamin B2 0.15 mg Vitamin B6 0.5 mg Vitamin B12 0.2 ⁇ g Vitamin c 10 mg Biotin 10 ⁇ g Nicotinic acid amide 1.7 mg Folic acid 50 ⁇ g Calcium Pantothenate 0.5 mg Mineral mixture Ferrous sulfate 1.75 mg Zinc oxide 0.82 mg Magnesium carbonate 25.3 mg Potassium phosphate monobasic 15 mg Dicalcium Phosphate 55 mg Potassium citrate 90 mg Calcium carbonate 100 mg Magnesium chloride 24.8 mg
  • composition ratio of the vitamin and inorganic mixture is a composition that is relatively suitable for health foods, for example, the composition ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional health food manufacturing method, and then granules are prepared. And it can be used for manufacturing a health food composition according to a conventional method.
  • the remaining amount of purified water was added to a total volume of 900 ml, and the above ingredients were mixed according to a conventional healthy beverage manufacturing method, and then stirred and heated at 85 ° C. for about 1 hour. Acquired in a sterilized 2 L container, sealed and sterilized, and then refrigerated and used to prepare a healthy beverage composition.

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Abstract

본 명세서는 화학식 1의 화합물, 그 유도체 또는 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 장내 유산균 증가용 조성물에 관한 것으로, 장내 유산균의 증식을 유도하고, 장내 유해균의 증식을 억제하여 설사, 장염, 위장장애 등을 개선할 수 있다.

Description

장 내 유산균 증가용 조성물 및 이를 이용한 유산균 생산 방법
본 명세서는 장 내 유산균 증가용 조성물 및 이를 이용한 유산균 생산 방법에 관하여 기술한다.
인체의 장내에는 다양한 미생물 집단이 군집을 이루고 있고, 미생물 군집의 조성에 따라 다양한 측면에서 건강에 영향을 미친다. 이러한 미생물 군집의 균형이 스트레스, 노화, 식이, 유해세균의 감염 등에 의해서 파괴되는 경우, 유해 미생물의 급격한 성장으로 이어져 대사성 질환, 염증질환 등을 일으켜 건강을 악화시킬 수 있다. 이 경우 치료목적으로 항생제를 사용하는데, 항생제의 사용은 유해 미생물들의 내성을 유발하는 부작용을 일으킬 수 있다.
이에 대한 대안으로 인체에 유익한 미생물을 직접 섭취하여 장내 유익균을 증가시키는 프로바이오틱스를 이용할 수 있으나, 제품화를 위해서는 이와 같은 유익한 미생물을 생산 수율이 높게 생산할 필요가 있다. 그러나 인체에 유익한 미생물들은 in vitro에서의 성장 조건이 매우 까다롭고, 이에 따라 생산이 어려운 경우가 많다. 또한, 프로바이오틱스로서 효과를 나타내기 위해서는 제품화 과정 중에 동결건조나 펠렛화 등의 가공 조건에서 미생물이 살아남아야 하며, 강산인 위액과 담즙산으로부터 살아남아 장에 정착을 해야만 한다. 그러나, 이러한 조건을 모두 갖춘 프로바이오틱스는 드물기 때문에 실제로 우리가 섭취하는 프로바이오틱스는 그 효과가 원래 그 미생물이 가지는 효능에 비해 매우 미미하다.
이를 극복하기 위한 방법으로 인체 내에 존재하는 유익한 미생물의 성장을 선택적으로 활성화하여 건강을 개선하게 하는 프리바이오틱스가 제시되어 많은 연구개발이 이루어지고 있다.
일 측면에서, 본 발명은 in vitro에서 대량 증식이 어려운 유산균의 장 내에서의 증식을 유도하여 대상자의 설사, 장염, 위장장애 등을 개선시킬 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 장 내에서의 유산균 증식을 유도하는 동시에 장 내 유해균의 증식을 억제하여 설사, 장염, 위장장애 등을 개선시키는 조성물을 제공하고자 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 in vitro에서 대량 증식이 어려운 유산균을 포유류의 장 내에서 증식시켜 생산 수율이 높은 유산균의 생산 방법을 제공하고자 한다.
본 발명 일 관점에서, 하기 화학식 1의 화합물, 그 유도체 또는 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 장내 유산균 증가용 조성물을 제공한다.
<화학식 1>
Figure PCTKR2016008518-appb-I000001
상기 식에서, R1, R2, R3, 및 R4 는 각각 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄인 C1 내지 C18의 알킬기, C1 내지 C18의 알케닐기, C1 내지 C18의 알키닐기 또는 C3 내지 C6의 사이클릭 알킬기이다.
본 발명 다른 관점에서, 상기 장내 유산균 증가용 조성물을 인간 이외의 포유류에 경구 투여하고, 상기 포유류의 배설물로부터 장내 유산균을 추출하는 것을 포함하는 유산균의 생산 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 in vitro에서 대량 증식이 어려운 유산균의 장 내에서의 증식을 유도하여 대상자의 설사, 장염, 위장장애 등을 개선시킬 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 장 내에서의 유산균 증식을 유도하는 동시에 장 내 유해균의 증식을 억제하여 설사, 장염, 위장장애 등을 개선시키는 조성물을 제공할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 in vitro에서 대량 증식이 어려운 유산균을 포유류의 장 내에서 증식시켜 생산 수율이 높은 유산균의 생산 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 인삼열매 추출물 분획에 따른 시링가레놀의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실험 물질을 경구 투여한 쥐의 대장에서 분리한 변에서 분석한 장내 유익균의 빈도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험 물질을 경구 투여한 쥐의 대장에서 분리한 변에서 분석한 장내 유해균의 빈도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 시링가레시놀과 이를 포함한 인삼열매 추출물이 락토바실러스 루테리의 증식에 미치는 효과를 나타낸다.
도 5는 시링가레시놀과 이를 포함한 인삼열매 추출물을 경구 투여한 쥐의 dextran sulfate sodium (DSS)에 의해 유도된 궤양성 대장염이 개선 효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 출원의 실시예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 출원에 개시된 기술은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 출원의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 출원의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다.
본 명세서에서, “유도체”란 화합물들의 치환 가능한 위치에서 동일 또는 상이한 치환기로 변경되는 모든 화합물을 의미한다. 이러한 치환기의 종류에는 제한이 없으며, 예컨대 각각 독립적으로 히드록시기, 페녹시기, 티에닐기, 푸릴기, 피리딜기, 시클로헥실기, 알킬알코올기, 알킬디알코올기, 또는 치환 또는 비치환된 페닐로 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20의비사이클릭 탄화수소기; 히드록시기, 히드록시메틸기, 메틸기, 또는 아미노기로 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 사이클릭 탄화수소기; 또는 당 잔기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "당 잔기"란 다당류 분자로부터 1개의 수소 원자가 제거된 기를 의미하며, 따라서 예를 들어 단당류 또는 올리고당으로부터 유래된 잔기를 의미할 수 있다.
본 명세서에서, “치환된”은 별도의 정의가 없는 한, 작용기 중 하나 이상의 수소 원자가 할로겐(F, Cl, Br 또는 I), 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 이미노기(=NH, =NR, R은 C1 내지 C10의 알킬기이다), 아미노기(-NH2,-NH(R'), -N(R")(R"'), R',R",R"'은 각각 독립적으로 탄소수 C1 내지 C10의 알킬기이다), 아미디노기, 히드라진기, 히드라존기, 카르복시산기, C1 내지 C20의 알킬기, C6 내지 C30의 아릴기, C3 내지 C30의 시클로알킬기, C3 내지 C30의 헤테로아릴기, 또는 C2 내지 C30의 헤테로시클로알킬기로 치환되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "헤테로"는 탄소 원자가 N, O, S 및 P로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 원자로 치환된 것을 의미한다.
본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능"이란 통상의 의약적 복용량(medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기구의 승인을 받을 수 있거나, 승인 받거나, 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전으로 인지되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염"은 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능하고 모 화합물(parent compound)의 바람직한 약리 활성 또는 식품으로서의 활성을 갖는 본 발명의 일측면에 따른 염을 의미한다. 상기 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다. 아울러, 본 명세서에 따른 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물, 용매화물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명 일 실시예에 따른 장내 유산균 증가용 조성물은 하기 화학식 1의 화합물, 그 유도체 또는 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함할 수 있다.
<화학식 1>
Figure PCTKR2016008518-appb-I000002
상기 식에서, R1, R2, R3, 및 R4 는 각각 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄인 C1 내지 C18의 알킬기, C1 내지 C18의 알케닐기, C1 내지 C18의 알키닐기 또는 C3 내지 C6의 사이클릭 알킬기이다.
상기 화학식 1의 화합물은 리그난계 화합물로, 시링가레시놀(syringaresinol), 유데스민(eudesmin), 양감빈(yangambin) 또는 세사민(sesamin)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체예에서, 상기 리그난 화합물은 상기 화학식 1의 화합물 또는 그 이성질체를 포함한다. 상기에서 이성질체는 광학 이성질체, 구체적으로 화학식 2 및 화학식 3으로 나타낼 수 있는 광학 이성질체를 포함하며, 더 구체적으로 (+)-시링가레시놀, (-)-시링가레시놀, (+)-유데스민, (-)-유데스민, (+)-양감빈, (-)-양감빈, (+)-세사민 또는 (-)-세사민을 포함한다.
<화학식 2>
Figure PCTKR2016008518-appb-I000003
<화학식 3>
Figure PCTKR2016008518-appb-I000004
상기 화학식 2 및 화학식 3에서, R1, R2, R3, 및 R4 는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.
구체예에서, 상기 리그난계 화합물은 화학 합성을 통해 얻거나, 아마씨, 황백, 오가피, 참깨 및 인삼 열매 중 하나 이상으로부터 추출하여 얻을 수 있다.
구체예에서, 상기 화합물은 아마씨, 황백, 오가피, 참깨 및 인삼 열매 중 하나 이상으로부터 추출된 추출물을 정제하여 얻을 수 있다.
상기 아마씨, 황백, 오가피 및 참깨는 각 식물의 잎, 줄기, 뿌리, 열매 또는 씨를 예로 들 수 있는 식물의 각 부위를 모두 포함하며, 인삼 열매는 인삼 열매의 종자부, 과피 또는 과육을 포함할 수 있다.
상기 추출물은 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고, 천연물의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 모두 포함하는 광범위한 개념이다.
예를 들어 상기 추출물은 아마씨, 황백, 오가피, 참깨 및 인삼 열매 중 하나 이상을 물, 유기 용매 및 물과 유기 용매의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 추출하여 수득할 수 있다. 상기 유기 용매는 알코올, 아세톤, 에테르, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 에틸메틸케톤 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 알코올은 C1~C5의 저급 알코올을 포함하며, C1~C5의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, n-프로필알코올, n-부탄올 및 이소부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체예에서, 상기 추출물은 인삼 열매의 추출물일 수 있다. 인삼 열매 추출물은 인삼 열매 과육의 알코올 추출물을 제조하고; 제조한 알코올 추출물을 물과 알코올 중 하나 이상을 포함하는 용매로 용출시켜 분획을 수득하고; 그리고 수득한 분획에 대해 유기 용매를 전개 용매로 사용하여 크로마토그래피, 예를 들어 얇은 막 크로마토그래피(TLC)를 수행하여 제조할 수 있다. 상기에서 유기 용매는 알코올, 아세톤, 에테르, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 에틸메틸케톤 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 알코올은 C1~C5의 알코올을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 4의 시링가레시놀(syringaresinol)일 수 있다.
<화학식 4>
Figure PCTKR2016008518-appb-I000005
상기 시링가레시놀은 (+)-시링가레시놀일 수 있으며, 구체적으로 하기 화학식 5의 (8S,8'S)-(-)-시링가레시놀 또는 화학식 6의 (8R,8'R)-(+)-시링가레시놀일 수 있으며, 예를 들어 (8R,8'R)-(+)-시링가레시놀일 수 있다.
<화학식 5>
Figure PCTKR2016008518-appb-I000006
<화학식 6>
Figure PCTKR2016008518-appb-I000007
상기 유산균은 락토바실러스속 균주 및 비피도박테리움속 균주 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 유산균은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 및 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 중 하나 이상일 수 있다.
락토바실러스 루테리는 대표적인 장내 유용균으로서, 유산균업체에서 가장 주목하는 프로바이틱스이다. 락토바실러스 루테리는 글리세롤을 발효하면서 항생제 루테린을 생성하는데, 이 때문에 강력한 항균 활성(antimicrobial activity)을 가진다. 따라서, 영유아에서 흔히 발생하는 설사, 장염, 알러지, 칸디다증을 예방하고, 치료하는데 탁월한 효능을 보인다 (Urbanska et al. Eur. J. Pediatr 2014). 또한, 장점막의 염증성 사이토카인의 분비를 조절하여 염증성 장질환, 과민성 장증군, 위장장애의 질환을 줄이는데 도움이 된다(Liu et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010) 그 밖에도 인슐린 저항성을 개선하여 당뇨병과 지방간 개선에 효능을 가지고 (Hsieh et al. Nutrition & Metabolism 2013), 노화에 의한 테스토스테론의 감소를 억제하여 남성 성기능을 개선하며 (Poutahidis et al. Plos One 2014)), 뇌의 인지기능 발달에도 기여한다 (PCT/EP2012/074023).
이와 같은 락토바실러스 루테리는 in vitro에서의 생육 조건이 매우 까다롭기 때문에 배양에 의하여 다량으로 생산이 어려운 균주이다.
이에, 본 발명 일 실시예에 따른 조성물을 대상자에게 경구 투여하여 대상자의 장 내에 존재하는 락토바실러스 루테리의 증식을 활성화시킴으로써 장 내에서의 락토바실러스 루테리를 증가시키고, 이를 통하여 설사, 장염, 위장장애, 알러지, 칸디다증 등의 개선, 치료 및 예방 효과를 나타내는 프리바이오틱스(prebiotics)로서 효과를 나타낼 수 있다.
구체예에서, 유효성분인 상기 화학식 1의 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 이상, 0.002 중량% 이상, 0.003 중량% 이상, 0.004 중량% 이상, 0.005 중량% 이상, 0.006 중량% 이상, 0.007 중량% 이상, 0.008 중량% 이상, 0.009 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.02 중량% 이상, 0.03 중량% 이상, 0.04 중량% 이상, 0.05 중량% 이상, 0.06 중량% 이상, 0.07 중량% 이상, 0.08 중량% 이상, 0.09 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 0.2 중량% 이상, 0.3 중량% 이상, 0.4 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 0.6 중량% 이상, 0.7 중량% 이상, 0.8 중량% 이상, 0.9 중량% 이상, 1 중량% 이상, 2 중량% 이상, 3 중량% 이상, 4 중량% 이상, 5 중량% 이상, 6 중량% 이상, 7 중량% 이상, 8 중량% 이상, 9 중량% 이상, 또는 10 중량% 이상이고, 80 중량% 이하, 79 중량% 이하, 78 중량% 이하, 77 중량% 이하, 76 중량% 이하, 75 중량% 이하, 74 중량% 이하, 73 중량% 이하, 72 중량% 이하, 71 중량% 이하, 70 중량% 이하, 69 중량% 이하, 68 중량% 이하, 67 중량% 이하, 66 중량% 이하, 65 중량% 이하, 64 중량% 이하, 63 중량% 이하, 62 중량% 이하, 61 중량% 이하, 60 중량% 이하, 59 중량% 이하, 58 중량% 이하, 57 중량% 이하, 56 중량% 이하, 55 중량% 이하, 54 중량% 이하, 53 중량% 이하, 52 중량% 이하, 51 중량% 이하, 50 중량% 이하, 49 중량% 이하, 48 중량% 이하, 47 중량% 이하, 46 중량% 이하, 45 중량% 이하, 44 중량% 이하, 43 중량% 이하, 42 중량% 이하, 41 중량% 이하, 40 중량% 이하, 39 중량% 이하, 38 중량% 이하, 37 중량% 이하, 36 중량% 이하, 35 중량% 이하, 34 중량% 이하, 33 중량% 이하, 32 중량% 이하, 31 중량% 이하, 30 중량% 이하, 29 중량% 이하, 28 중량% 이하, 27 중량% 이하, 26 중량% 이하, 25 중량% 이하, 24 중량% 이하, 23 중량% 이하, 22 중량% 이하, 21 중량% 이하, 20 중량% 이하로 포함될 수 있으며, 예를 들어 0.001 중량% 내지 80 중량%, 구체적으로 0.005 중량% 내지 60 중량%, 더 구체적으로 0.01 중량% 내지 30 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서 의도한 효과를 나타내기에 효과적으로 나타낼 수 있으며, 조성물의 안정성 및 제형 안전성을 모두 만족할 수 있고, 비용 대비 효과의 측면에서도 우수할 수 있다. 상기 범위 내에서 충분한 위 및 장질환 개선 효과를 나타낼 수 있으며, 유효성분이 과량 함유되는 경우의 독성 등의 안전성 및 제형 안정성 문제를 방지할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 장내 유산균 증가용 조성물은 상기 화학식 1의 화합물을 아마씨, 황백, 오가피, 참깨 및 인삼 열매 중 하나 이상의 추출물로서 포함할 수 있다. 상기 화학식 1의 화합물 자체가 아닌 상기 화합물을 포함하는 아마씨, 황백, 오가피, 참깨 및 인삼 열매 중 하나 이상의 추출물로서 함유하는 것을 제외하고는 상기 본 발명 일 실시예에 따른 장내 유산균 증가용 조성물에서 설명한 바와 동일하므로 기술을 생략한다.
본 실시예에서, 상기 아마씨, 황백, 오가피 및 참깨는 각 식물의 잎, 줄기, 뿌리, 열매 또는 씨를 예로 들 수 있는 식물의 각 부위를 모두 포함한다. 상기 인삼 열매는 인삼 열매의 종자부, 과피 또는 과육을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 인삼 열매에서 종자를 제외한 전체의 착즙액에서 고형분을 제거한 인삼 열매 농축액을 사용할 수 있다.
상기 추출물은 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고, 천연물의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 모두 포함하는 광범위한 개념이다.
예를 들어 상기 추출물은 아마씨, 황백, 오가피, 참깨 및 인삼 열매 중 하나 이상을 물, 유기 용매 및 물과 유기 용매의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 추출하여 수득할 수 있다. 상기 유기 용매는 알코올, 아세톤, 에테르, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 에틸메틸케톤 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 알코올은 C1~C5의 저급 알코올을 포함하며, C1~C5의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, n-프로필알코올, n-부탄올 및 이소부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체예에서, 상기 추출물은 인삼 열매의 추출물일 수 있다. 인삼 열매 추출물은 인삼 열매 과육의 알코올 추출물을 제조하고; 제조한 알코올 추출물을 물과 알코올 중 하나 이상을 포함하는 용매로 용출시켜 분획을 수득하고; 그리고 수득한 분획에 대해 유기 용매를 전개 용매로 사용하여 크로마토그래피, 예를 들어 얇은 막 크로마토그래피(TLC)를 수행하여 제조할 수 있다. 상기에서 유기 용매는 알코올, 아세톤, 에테르, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 에틸메틸케톤 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 알코올은 C1~C5의 알코올을 포함할 수 있다.
상기 추출물은 상기 화학식 1의 화합물을 추출물 총 중량에 대하여 0.01중량% 내지 40중량%, 예를 들어 0.04중량% 내지 24중량%로 포함할 수 있다.
본 발명 다른 실시예에 있어서, 프리바이오틱스로서의 장 내 유산균 증가용 조성물은 프로바이오틱스인 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)와 동시에 투여되는 조성물일 수 있다.
본 발명 실시예들에 따른 조성물은 상기 유효성분을 포함하는 다양한 형태의 식품 첨가제 또는 기능성 식품으로 제공될 수 있다. 상기 유효성분을 포함하는 발효유, 치즈, 요구르트, 주스, 생균제제 및 건강식품 등으로 가공될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 조성물은 건강 식품 조성물일 수 있다. 상기 건강 식품 조성물은 환제, 캅셀제, 정제, 과립제, 캬라멜제 또는 드링크제 등으로 제형화할 수 있다. 다른 구체예에서, 액제, 분말, 과립, 정제 또는 티백 등의 형태로 가공될 수도 있다.
상기 조성물은 단순 음용, 주사 투여, 스프레이 방식 또는 스퀴즈 방식 등의 다양한 방법으로 투여될 수 있다.
상기 조성물은 본 발명의 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은, 조성물 전체 중량을 기준으로, 0.01중량% 내지 5 중량%, 예를 들어 0.01중량% 내지 3중량% 일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 조성물은 약학 조성물일 수 있다.
구체예에서, 상기 약학 조성물은, 통상적인 방법에 따라 상용되는 무기 또는 무기의 담체를 더 포함하여 고체, 반고체 또는 액상 등 다양한 형태로 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.
상기 경구 투여형 제재는 예를 들어 정제, 환제, 과립제, 연/경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제, 시럽제, 펠렛제 등일 수 있으며, 비경구 투여형 제재는 예를 들어 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 등일 수 있다. 상기 약학 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제 등의 약학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 국소, 경피, 피하, 직장, 정맥 내, 근육 내, 복강 내 등으로 투여될 수 있다.
유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로 유효성분의 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 2000mg/kg/일, 예를 들어 0.5mg/kg/일 내지 1500mg/kg/일이다.
본 발명 일 실시예에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물, 그 유도체 또는 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염의 장내 유산균 증가 용도를 제공할 수 있다.
본 발명 일 실시예에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물, 그 유도체 또는 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염의 설사, 장염, 위장장애, 알러지, 칸디다증 등을 포함하는 증상(condition)의 개선, 치료 및 예방 용도를 제공할 수 있다.
본 발명 일 실시예에 있어서, 장내 유산균 증가용인 상기 화학식 1의 화합물, 그 유도체 또는 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 제공할 수 있다.
본 발명 일 실시예에 있어서, 설사, 장염, 위장장애, 알러지, 칸디다증 등을 포함하는 증상(condition)의 개선, 치료 및 예방용인 상기 화학식 1의 화합물, 그 유도체 또는 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 제공할 수 있다.
본 발명 일 실시예에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물, 그 유도체 또는 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 장내 유산균 증가 방법을 제공할 수 있다. 일예에서, 상기 방법은 본 발명 실시예들에 따른 장내 유산균 증가용 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일예에서, 상기 방법은 유산균을 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명 일 실시예에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물, 그 유도체 또는 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 설사, 장염, 위장장애, 알러지, 칸디다증 등을 포함하는 증상(condition)의 개선, 치료 및 예방 방법을 제공할 수 있다. 일예에서, 상기 방법은 본 발명 실시예들에 따른 장내 유산균 증가용 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일예에서, 상기 방법은 유산균을 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명 실시예들에 따른 장내 유산균 증가용 조성물 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)를 포함하는 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 유산균의 생산 방법을 제공할 수 있다. 본 실시예에 따른 유산균의 생산 방법은 상기 본 발명 실시예들의 조성물을 인간 이외의 포유류에 경구 투여하고, 상기 포유류의 배설물로부터 장내 유산균을 추출하는 것을 포함할 수 있다. 본 실시예에 따른 생산 방법에 따르면 in vitro에서 생육 및 증식 조건이 까다로워 대량 생산이 어려운 유산균을 경제적으로 대량생산이 가능하며, 이와 같이 생산된 유산균을 프로바이오틱스(probiotics)로서 제공할 수 있다.
상기 포유류는 인간 이외의 포유류라면 한정되지 않으며, 예를 들어 생산 효율 및 경제성 면에서 쥐, 예를 들어 Mus 속 또는 Rattus 속의 포유류를 이용할 수 있다.
상기 유산균은 락토바실러스속 균주 및 비피도박테리움속 균주 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 유산균은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 및 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 중 하나 이상, 예를 들어 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)일 수 있다.
이하, 실시예, 비교예 및 시험예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 실시예, 비교예 및 시험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.
[제조예 1] 인삼 열매 추출물의 제조
4년 생 이상의 인삼으로부터 열매를 100 kg를 세척하고, 종자분리기에 세척한 인삼열매 및 인삼열매 부피의 3~10배의 정제수를 첨가하여 인삼열매의 종자를 그 외 부위(과육, 과피 및 과즙)로부터 분리한다. 인삼의 종자 약 75kg를 회수하고, 인삼열매의 과피, 과육, 과즙이 함유된 착즙액을 얻었다.
Decanter를 이용하여 착즙액으로부터 식품가공기기로서 인삼열매의 과피, 펙틴질을 비롯한 고형물을 분리하고, 감압농축하여 1차 농축액을 제조하였다.
상기 1차 농축액에 인삼열매농축액에 15배 부피의 에탄올을 첨가하고 약 85℃에서 환류추출을 실시한다. 결과물을 여과한후 감압 농축하여 인삼 열매 추출물을 제조하였다.
제조된 인삼 열매 추출물 고형물을 역상 컬럼 크로마토그래피(reversed-phase (ODS) column chromatography)로 정제하였으며, 이때 사용한 용출 용매는 물/메탄올 중량비 100%/0%, 90%/10%, 80%/20%, 70%/30%, 60%/40%, 50%/40%, 40%/60%, 30%/70%, 20%/80%, 10%/90%, 0%/100%의 용매로 용출하여 결과로 GB-1~GB-10의 분획물을 수득하였다. 각 분획물의 (+)-시링가레시놀의 함량을 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 GB-1 분획의 추출물을 이하 시험예에서 인삼열매 추출물로서사용하였다.
[제조예 2] (+)-시링가레시놀의 제조
(1) 4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤즈알데히드(4-(benzyloxy)-3,5-dimethoxybenzaldehyde)(화합물 8)의 제조
질소 분위기에서 시링가알데히드(syringaldehyde)(화합물 7)(3 g, 16.47 mmol)와 탄산 칼륨(potassium carbonate)(6.83 g, 49.4 mmol)을 DMF(16 mL)에 녹인 후, 벤질 브로마이드(benzyl bromide)(2.94 mL, 24.7 mmol)를 넣고 상온에서 밤새 교반한다. TLC로 반응 종결을 확인한 후 반응 용액을 물과 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출한 유기 층을 물로 3회 씻어 주고, 무수 MgSO4로 탈수한 다음 필터로 여과한다. 여과액을 농축하고 컬럼 크로마토그래피(5:1 헥산/EtOAc)로 정제하여 흰색 고체의 화합물 8(4.45 g, 99.2 %)을 수득하였다. 화합물 8의 NMR 데이터는 아래와 같다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3.90 (s, 6H), 5.13 (s, 2H), 7.11 (s, 2H), 7.29-7.48 (m, 5H), 9.86 (s, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 56.2, 75.0, 106.7, 128.1, 128.2, 128.4, 128.6, 131.9, 137.2, 191.1.
(2) 1-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시페닐)프로프-2-엔-1-올(1-(4-(benzyloxy)-3,5-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-ol)(화합물 9)의 제조
질소 분위기에서 위에서 수득한 화합물 8(4.04 g, 14.8 mmol)을 무수 THF(30 mL)에 녹인 후, -78℃로 온도를 낮춘다. 비닐마그네슘 브로마이드(vinylmagnesium bromide)(17.8 mL의 1M THF 용액)를 넣고 -78℃에서 10분간 교반한 후 0℃로 온도를 올리고 다시 2시간 동안 교반한다. TLC로 반응 종결을 확인한 후 반응 용액을 포화 NH4Cl 수용액으로 퀀칭(quenching)하고, 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출한 유기층을 물로 3회 씻어 주고, 무수 MgSO4로 탈수한 다음 필터로 여과한다. 여과액을 농축하여 컬럼 크로마토그래피(4:1 헥산/EtOAc)로 정제하여 옅은 노랑색 고체의 화합물 9(3.97 g, 89.1%)을 수득하였다. 화합물 9의 NMR 데이터는 아래와 같다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3.83 (s, 6H), 4.99 (s, 2H), 5.14 (m, 1H), 5.22 (ddd, J = 10.5, 1.2, 1.2 Hz, 1H), 5.37 (ddd, J = 16.8, 1.8, 1.8 Hz, 1H), 6.05 (ddd, J = 16.5, 10.5, 6.0 Hz, 1H), 6.60 (s, 2H), 7.28-7.51 (m, 5H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 56.1, 75.0, 75.4, 102.5, 103.4, 115.3, 127.8, 128.1, 128.4, 137.9, 138.3, 140.0, 153.6.
(3) (R)-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시페닐)((R)-옥시란-2-일)메탄올((R)-(4-(benzyloxy)-3,5-dimethoxyphenyl)((R)-oxiran-2-yl)methanol)(화합물 10)의 제조
질소 분위기에서 dried powdered 4Å 몰레큘라시브(molecular sieve)(10.5 g)에 무수 염화 메틸렌(anhydrous methylene chloride)(45 mL)을 넣고 -20℃로 온도를 낮춘다. 이에 (-)-DIPT(diisopropyltryptamine)(1.18 mL, 5.99 mmol)를 넣은 다음 티타늄 이소프로폭사이드(titanium isopropoxide)(1.48 mL, 4.99 mmol)를 천천히 넣고 30분간 교반한다. 30분 후 쿠멘 하이드록사이드(cumene hydroxide)(1.85 mL, 80%, 5.99 mmol)를 넣고 30분 동안 교반한다. 그 다음 무수 염화 메틸렌(10 mL)에 녹인 화합물 21(3 g, 9.99 mmol)을 천천히 한 방울씩 첨가(dropwise addition)한다. -20℃에서 5시간 동안 교반한 후 0℃로 온도를 올리고 밤새 교반한다. TLC로 반응을 확인한 후 10% NaOH 용액(30 mL, in 포화 NaCl 용액)을 넣고 3시간 동안 교반한 다음, 필터로 여과한다. 여과액을 염화 메틸렌으로 추출하여 브라인(brine) 용액으로 씻어준다. 무수 Na2SO4로 탈수하고 필터로 여과한 다음 여과액을 농축하여 컬럼 크로마토그래피(3:1 헥산/EtOAc)로 정제하여 화합물 10을 얻었다. 화합물 10의 NMR 데이터는 아래와 같다.
[α]D -47.5o (c 1.0, CHCl3); 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.32 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 2.79 (dd, J = 4.8, 3.9 Hz, 1H), 2.94 (dd, J = 4.8, 2.7 Hz, 1H), 3.22 (q, J = 3.3 Hz, 1H), 3.84 (s, 6H), 4.82 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 6.61 (s, 2H), 7.29-7.51 (m, 5H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 43.73, 54.98, 56.14, 71.11, 74.99, 76.57, 77.00, 77.42, 103.39, 127.78, 128.11, 128.41, 135.20, 136.84, 137.78, 153.69.
(4) 2-(4-((R)-(((E)-3-(4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시페닐)알릴)옥시)((R)-옥시란-2-일)메틸)-2,6-디메톡시페녹시)테트라하이드로-2H-피란(2-(4-((R)-(((E)-3-(4-(benzyloxy)-3,5-dimethoxyphenyl)allyl)oxy)((R)-oxiran-2-yl)methyl)-2,6-dimethoxyphenoxy)tetrahydro-2H-pyran)(화합물 12)의 제조
질소 분위기에서 NaH(0.633 g, 60% 분산, 15.82 mmol)에 dried THF/DMSO (10:1)(20 mL)를 넣고 0℃로 온도를 낮춘다. THF(10 mL)에 녹인 화합물 23(0.5 g, 1.58 mmol)을 부가하고 교반한다. 그리고 THF(10 mL)에 녹인 신나밀 브로마이드(cinnamyl bromide)(화합물 11)(1.15 g, 3.16 mmol)를 넣고 0℃에서 30분 동안 교반한 다음 상온으로 온도를 올리고 밤새 교반한다. TLC로 반응 종결을 확인한 후 반응 용액을 물로 퀀칭하고 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출한 유기층을 물로 3회 씻어 주고, 무수 MgSO4로 탈수한 다음 필터로 여과한다. 여과액을 농축하여 컬럼 크로마토그래피(3:1 헥산/EtOAc)로 정제하여 옅은 노란색 오일의 화합물 12(760 mg, 80.27%)를 수득하였다. 화합물 12의 NMR 데이터는 아래와 같다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.82 (m, 2H), 3.19 (dt, J = 2.7, 3.9 Hz, 1H), 3.83 (s, 6H), 3.84 (s, 6H), 4.12 (m, 2H), 4.32 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 5.01 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 6.18 (dt, J = 15.9, 6.0 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 17.1 Hz, 1H) 6.59 (d, J = 4.8 Hz, 4H), 7.28-7.52 (m, 10H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 45.3, 54.4, 56.1, 56.2, 69.7, 75.0, 75.1, 80.1, 103.7, 104.4, 125.1, 127.8, 128.1, 128.4, 128.5, 132.3, 132.8, 134.0, 137.9, 153.6, 156.7.
(5) 화합물 13의 제조
질소 분위기에서 활성 아연 가루(activated zinc dust)(0.146 g, 4.44 mmol)가 들어있는 플라스크에 THF(20 mL)에 녹인 Cp2TiCl2(0.182 g, 1.463 mmol)를 넣고 1시간 동안 교반하여 Cp2TiCl(녹색 용액)를 제조한다. 다른 플라스크에서 화합물 25(0.19 g, 0.635 mmol)를 THF(16 mL)에 녹인 후 60℃로 맞춘 다음 앞서 제조한 Cp2TiCl 용액을 카눌라(cannula)를 이용하여 20분 동안 가한다. 20분 동안 교반한 후 THF(4 mL)에 녹인 I2(0.105 g, 0.825 mmol)를 부가하고 반응 용액을 1시간 동안 교반한다. TLC로 반응 종결을 확인한 후 반응 용액에 포화 NH4Cl 수용액을 넣어 반응을 종결시키고 디에틸 에테르로 추출한다. 추출한 유기층을 3회 10% Na2S2O3 용액 및 브라인 용액으로 씻어 주고, 무수 Na2SO4로 탈수한 다음 필터로 여과한다. 여과액을 농축하여 컬럼 크로마토그래피 (3:1 헥산/EtOAc)로 정제하여 옅은 붉은색 오일의 화합물 13을 수득하였다. 화합물 13의 NMR 데이터는 아래와 같다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3.11 (m, 2H), 3.84 (s, 12H), 3.93 (dd, J = 9.4, 3.6 Hz, 2H), 4.31 (dd, J = 9.3, 7.2 Hz, 2H), 4.75 (d, J = 3.9 Hz, 2H), 4.99 (s, 4H), 6.57 (s, 4H), 7.28-7.51 (m, 10H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 54.3, 56.2, 72.0, 75.0, 86.0, 103.0, 127.8, 128.1, 128.4, 136.8, 137.8, 153.7.
(6) (+)-시링가레시놀(화학식 6)의 제조
화합물 13을 에탄올/THF (1:1)(9 mL)에 녹인 후 온도를 65℃로 맞춘다. 여기에 레이니 니켈(Raney nickel)(0.15 g)을 넣고 65℃에서 1시간 동안 교반한다. TLC로 반응 종결을 확인한 후 반응 용액을 아세톤과 셀라이트(celite)를 이용하여 여과한 다음, 여과액을 농축하고 컬럼 크로마토그래피(1:1 헥산/EtOAc)로 정제하여 옅은 노란색 고체의 화합물을 수득하였다. 제조한 화합물이 (8R, 8'R)-(+)-시링가레시놀임은 아래와 같은 NMR 데이터 및 [α]D 값이 +40.9o (c 0.1, CHCl3)인 것으로부터 확인할 수 있다. 이하의 시험예에서 상기 제조된 (+)-시링가레시놀을 사용하였다.
[α]D +40.9o (c 0.1, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.10 (m, 2H), 3.90 (s, 12H), 3.90 (m, 2H), 4.28 (dd, J = 8.8, 6.8 Hz, 2H), 4.73 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 5.48 (s, 2H), 6.59 (s, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 54.4, 56.4, 71.8, 86.1, 102.7, 132.1, 134.3, 147.1.
[제조예 3] (+)-시링가레시놀의 분리
상기 제조예 1의 추출물 분획 GB-1을 농축하고 50% 수용성 메탄올을 이용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 column choromatography)를 수행하였다. 얻어진 분획물 중 SIRT1 활성 및 시링가레시놀의 함량이 높은 분획을 선별하여 농축한 후, 클로로포름:메탄올(10:1)을 전개 용매로 하여 예비 실리카겔(preparative silica gel) TLC를 수행하였고, 그 결과 Rf 값 0.67의 활성 분획을 정제하였다.
NMR 분광 분석과 데이터베이스 검색을 수행하여 분리 및 정제한 활성 화합물을 시링가레시놀(syringaresinol)로 동정할 수 있었다. 이를 재확인하기 위하여 질량 분석을 수행하였으며, ESI-mass를 positive mode로 측정한 결과 [M+Na]+가 m/z 440.9에서, [2M+na]+가 m/z 858.9에서 관찰되어 분자량이 418임을 알 수 있었다. 또한 NMR 분광 분석을 수행한 결과 화학식 6와 같은 결과를 얻었다. 이에 따라, 상기 분리 정제된 화합물이 시링가레시놀(syringaresinol)임을 확인하였다.
[시험예 1] 시링가레시놀 및 인삼열매 추출물의 장내 미생물의 증식에 미치는 효과
1. 실험 동물
생쥐는 28주령의 C57BL/6 수컷 생쥐를 중앙실험동물에서 구입한 후, 태평양 제약의 동물실 환경에서 두달간 적응시킨 후, 36주령부터 실험하였다. 사육기간 동안 멸균된 fiter-top cage에 사육하여 멸균된 사료 (a normal chow diet (D12450B, Research Diets, New Brunswick,NJ, USA) 와 물을 자유롭게 먹도록 하였다. 동물실의 환경은 온도 20 ± 2°C, 습도 50 ± 10% 가 유도되도록 하였으며 조명은 12시간 간격으로 주야를 자동으로 조절하였다. 동물관리는 제약 IACUC (IACUC14-014)에 따라 취급하였다.
2. 시링가레시놀 및 인삼열매 추출물 식이
각 군당 10마리씩 분리 하여, 대조군 (식염수 투여), (+)-시링가레시놀 저농도군 (10 mg/kg; 시링가레시놀10), (+)-시링가레시놀 고농도군 (50mg/kg; 시링가레시놀50), 인삼열매 저농도군(100mg/kg; 인삼열매100), 인삼열매 고농도군(500mg/kg; 인삼열매500)으로 나누었다. 농도 단위는 쥐 무게 1kg 당 시료 mg을 나타낸 것이다. (+)-시링가레시놀은 메틸셀룰로스(Methylcellulose)에 녹여서 사용하였으며, 각 시료를 상기 1회 당 상기 농도로 하루에 한번 10주 동안 경구 투여하였다.
3. 대장의 분변에서 균총 분석
46주째에 경추탈골에 의해 희생시킨 후, 대장에서 변만을 채취하여 드라이상태로 천랩(ChunLab)에 분석을 의뢰하여 분변으로부터 DNA를 분리하여, 16rRNA 유전자를 PCR에 의해 증폭하고 이를 pyrosequencing을 한후, EzTaxon-e 데이터 베이스와 pairwiase global sequence alignment을 이용한 BALSTN검색을 통해 각 미생물을 동정하였다. 결과를 도 2 및 3에 나타낸다.
도 2의 결과에서, 시링가레시놀 고농도군과 인삼열매 고농도군의 경우, 대조군인 정상식이군에 비해, 각 락토바실러스 속 균주는 17배, 7배, 비피도박테리움 속 균주는 시링가레시놀 고농도군에서 5배정도 증식이 증가하였다.
도 3의 결과에서, 유해균인 스태필로코커스 속, 디설포비브리오 속, 클로스트리디움 속과 유박테리움 속 균주가 대조군에 비교하여, (+)-시링가레시놀 고농도군과 인삼열매 고농도군에서 통계적으로 유의하게 감소된 것을 확인할 수 있다.
상기 결과에서 (+)-시링가레시놀 및 인삼열매 추출물의 경구 투여에 의하여 장 내에서의 락토바실러스속 및 비피도박테리움속의 유산균 증식이 현저하게 증가하며, 유해균 증식을 현저하게 억제하는 것을 확인할 수 있다.
[시험예 2] 시링가레시놀 및 인삼열매의 락토바실러스 루테리의 증식에 대한 효과
1. 사용균주
락토바실러스 루테리 KCTC 3594는 한국생물자원센터 (KCTC)에서 분양 받아 사용하였다.
2. 락토바실러스 루테리 증식 측정
생성된 집락수를 계측하고, 그 평균 집락수에 희석배수를 곱하여 배양액 ml당 생균수를 산출하였다. 5ml MRS 브로스 (디프코사, 미국)에 (+)-시링가레시놀 또는 인삼열매 추출물을 0~200㎍/ml 농도로 각각 첨가한 후 멸균하여 사용하였다. 멸균한 5 ml MRS 브로스 배지에 락토바실러스 루테리를 660nm 흡광도값이 0.3이 되도록 균 농도를 조절하여 100 ㎕를 접종한 후 37 °C에서 6, 24시간 배양 후 균수를 측정하였다.
도 4의 결과에서, 시링가레시놀과 인삼열매 추출물은 농도의존적으로 락토바실러스 루테리의 증식을 촉진하였다.
[시험예 3] (+)-시링가레시놀 및 인삼열매의 궤양성 대장염 개선 효과
1. 실험동물
생쥐는 28주령의 C57BL/6 수컷 생쥐를 중앙실험동물에서 구입한 후, 태평양 제약의 pathogen-free facility 동물실 환경에서 두달간 적응시킨후, 42주령부터 실험하였다. 사육기간 동안 멸균된 fiter-top cage에 사육하여 멸균된 사료 (a normal chow diet (D12450B, Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) 와 물을 자유롭게 먹도록 하였다. 동물실의 환경은 온도 20 ± 2°C, 습도 50 ± 10% 가 유도되도록 하였으며 조명은 12시간 간격으로 주야를 자동으로 조절하였다. 동물관리는 제약 IACUC (IACUC14-014)에 따라 취급하였다.
2. DSS를 이용한 궤양성 대장염 유도와 시링가레시놀 및 인삼열매 추출물 식이
3% (W/V) DSS를 포함한 식수를 8 일동안 먹여서 궤양성 대장염을 유도한다. 이 때 군당 10마리씩 분리를 하여, 각각 DSS군 (식염수 투여), 시링가레시놀 50mg/kg (시링가레시놀50), 인삼열매 500mg/kg (인삼열매500)를 하루에 한번 8일 동안 경구투여 하였다.
3. disease activity index (DAI) 측정
DAI는 혈변과 설사 같은 병변으로 측정하였다.
도 5에서 볼 수 있듯이, (+)-시링가레시놀 고농도를 먹인 쥐는 DSS군에 비교하여 50% 정도 궤양성 대장염이 개선되었다. 인삼열매 추출물도 고농도를 먹인 쥐의 경우 20% 정도 궤양성 대장염이 개선되어짐을 확인하였다.
[실험예 4] (+)-시링가레시놀을 먹인 쥐의 대장속 변에서 락토바실러스 루테리 분리 방법
발명에 따른 균주를 분리하기 위하여 시링가레시놀을 먹인 쥐의 변을 0.02% 소디움 아지드(sodium azide)가 포함된 엠알에스(MRS) 액체 배지에 넣고 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 10㎕ 백금이를 사용하여 배양액을 취하여 다시 0.02% 소디움 아지드가 포함된 엠알에스 한천 평판배지에 도말하고 37℃에서 48시간동안 배양하여 콜로리를 분리, 천랩에 박테리아 파이로 염기서열분석을 의뢰하여 락토바실러스 루테리임을 확인하였다.
[제형예 1] 정제
(+)-시링가레시놀 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
[제형예 2] 캡슐제
(+)-시링가레시놀 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
[제형예 3] 과립제
(+)-시링가레시놀 50mg, 무수결정 포도당 250mg 및 전분 550mg을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하였다.
[제형예 4] 드링크제
(+)-시링가레시놀을 포함하는 인삼 열매 추출물 50mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 올리고당 25g을 혼합한 후 정제수 300ml를 가하여 각 병에 200ml씩 충진한다. 병에 충진한 후 130℃ 에서 4~5 초간 살균하여 드링크제를 제조하였다.
[제형예 5] 캬라멜 제형
(+)-시링가레시놀 50mg, 옥수수 시럽(corn syrup) 1.8g, 탈지우유 0.5g, 대두 레시틴 0.5g, 버터 0.6g, 식물성 경화유 0.4g, 설탕 1.4g, 마가린 0.58g, 및 식염 20mg을 혼합하여 캬라멜 성형 하였다.
[제형예 6] 건강 식품
성분 함량
(+)-시링가레시놀 1000 ㎎
비타민 혼합물
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기 비타민 및 무기질 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
[제형예 7] 건강 음료
성분 함량
(+)-시링가레시놀 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수 잔량
총 부피 900 ㎖
상기 표 2와 같이 총 부피 900㎖가 되도록 잔량의 정제수를 첨가하여 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 건강음료 조성물 제조에 사용할 수 있다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 1의 화합물, 그 유도체 또는 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 장내 유산균 증가용 조성물:
    <화학식 1>
    Figure PCTKR2016008518-appb-I000008
    상기 식에서, R1, R2, R3, 및 R4 는 각각 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄인 C1 내지 C18의 알킬기, C1 내지 C18의 알케닐기, C1 내지 C18의 알키닐기 또는 C3 내지 C6의 사이클릭 알킬기이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스속 균주 및 비피도박테리움속 균주 중 하나 이상을 포함하는 장내 유산균 증가용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 및 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 중 하나 이상을 포함하는 장내 유산균 증가용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은 (+)-시링가레시놀(syringaresinol)인 장내 유산균 증가용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (+)-시링가레시놀은 아마씨, 황백, 오가피, 참깨 및 인삼열매 중에서 선택되는 1종 이상의 추출물에 포함된 형태인 장내 유산균 증가용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 설사, 장염 또는 위장장애 개선용인 장내 유산균 증가용 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 장내 유산균 증가용 조성물은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)와 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 장내 유산균 증가용 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 건강식품 조성물인, 장내 유산균 증가용 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물인, 장내 유산균 증가용 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 장내 유산균 증가용 조성물 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)를 포함하는 키트.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 인간 이외의 포유류에 경구 투여하고, 상기 포유류의 배설물로부터 장내 유산균을 추출하는 것을 포함하는 유산균의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 인간 이외의 포유류는 쥐인 유산균의 생산 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)인 장내 유산균의 생산 방법.
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