WO2020027456A1 - 신규한 세리포리아 라세라타-k1 균주 및 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

신규한 세리포리아 라세라타-k1 균주 및 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2020027456A1
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strain
mycelium
novel
racerata
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김병천
박진규
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김병천
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention is a novel Ceriporia racerata -K1 ( Ceriporia lacerata -K1) strain, a method for culturing thereof, and a composition for preventing or treating diabetes, comprising a culture cultured therefrom as an active ingredient.
  • Mushrooms are rich in carbohydrates, proteins, lipids, minerals, vitamins, etc., and have been used as food and medicine for a long time because they contain a large amount of physiologically active substances including ⁇ -glucan (Wani, BA, et al., 2010; Yu, HE, et al., 2006).
  • Edible and medicinal mushrooms include anticancer (Kidd, PM, 2000; Lee, YS, et al., 2006), cholesterol lowering (Caz, V., et al., 2015; Khatun, K. et al., 2007), blood sugar It has been reported to be effective in lowering (Khatun, K.
  • Mushrooms can be classified into mycellium and fruit body.
  • Fruiting bodies are the nutrients that make spores and are often called mushrooms.
  • Mycelium is formed by intertwining mycelium as the mycelium continues to extend to receive nutrients.
  • Mushroom mycelium contains a number of useful materials as well as fruiting bodies, in particular unlike mushroom fruiting body has the advantage that it is possible to stably short-term culture and production in the container.
  • Liquid culture of the mushroom mycelium is to propagate the mycelia, the nutrient generation in the mushroom life cycle, by the liquid culture method.
  • the liquid medium for mycelial culture contains carbon sources, such as glucose and starch, microorganisms of various inorganic forms, complex nitrogen sources, organic salts, trace elements, vitamins, etc., in which the mycelium can grow. Since mushroom mycelium has different culture characteristics depending on the medium composition, culture conditions, or mushroom mycelium, appropriate culture conditions for each mushroom should be determined to improve the liquid culture efficiency of the mycelium.
  • liquid cultures containing mushroom mycelium can be obtained a variety of metabolites with anticancer and antioxidant activity, depending on the nutritional composition and culture conditions of the medium (Lee Wi-young, et al., 2008).
  • Ceriporia lacerata is a mushroom of the Polyporales colored fungi (Phanerochaetaceae), first discovered in Japan in 2003 (Shin, EJ, et al., 2016). Ceriphoria racerata is a white fungus that grows on oak or red pine, and breaks down cellulose, hemicellulose, and lignin from wood, and extracts Ceriporia racerata extract or Cerifolia racerata mycelium culture extract.
  • anticancer Korean Patent No. 1721836
  • antidiabetic Shin, EJ, et al., 2015; Shin, EJ, et al., 2016
  • liver function improvement Korean Patent Publication No. 2016-0008425
  • the strains obtained in the region with low habitat temperature have good quality but slow growth rate, weak to contamination of bacteria, and low yield.
  • the strain obtained in the high temperature region was low in character, but it was confirmed that the growth rate is fast, resistant to contamination of various germs, and has good water quality.
  • there are many differences in the characteristics and component content depending on the growth region which causes a large difference in the medicinal efficacy.
  • the mycelium culture is easily contaminated with various bacteria, the success rate of culture is lowered to 50% or less, which makes it difficult to industrialize with high economic efficiency.
  • the present inventors are resistant to various bacteria in the process of developing new strains using breeding techniques to solve the above-mentioned problems of Ceriporia racerata, and the content of the active ingredient of Ceriporia racerata An increased novel Seriphoria racerata-K1 strain was obtained and its optimal culture conditions established.
  • 5-dihydroergosterol and DMC (2 ′, 4′-dihydroxy-6′-methoxy-3) reported that the novel Seriphoria racerata-K1 strain has excellent glycemic control efficacy.
  • Korean Patent No. 1031605 discloses the extract of Ceriporia racerata mycelium culture solution obtained from Ontario, Canada, and its diabetic treatment effect, and Korean Patent Publication No. 2015-0103690 separates and collects the oak reimbursement.
  • Korean Patent Publication No. 2017-0114559 describes the therapeutic effect of diabetes mellitus of Seriphoria laccerata mycelium culture is similar to the configuration of the present invention, The composition is different from the novel Seriporia racerata-K1 strain obtained through the breeding of the present invention.
  • An object of the present invention is a novel Ceriporia racerata -K1 ( Ceriporia). lacerata- K1) strains and mycelia and fruiting bodies derived therefrom.
  • the present invention also provides a method for culturing the novel Seriphoria racerata-K1 strain and a composition for preventing or treating diabetes comprising the culture cultured therefrom as an active ingredient.
  • the present invention is a novel Ceriporia racerata -K1 ( Ceriporia lacerata -K1, Accession No. KACC83018BP) strain.
  • the novel Ceriporia racerata-K1 strain can produce 5-dihydroergosterol.
  • the novel Seriphoria racerata-K1 strain may have a 6 to 40-fold increase in DMC (2 ′, 4′-dihydroxy-6′-methoxy-3 ′, 5′-dimethylchalcone) production compared to the parent strain. have.
  • the present invention also relates to mycelium or fruiting bodies derived from the novel Seriphoria racerata-K1 strain.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes or a dietary supplement for improvement comprising the mycelium culture derived from the novel Seriphoria racerata-K1 strain as an active ingredient.
  • the mycelium culture can be obtained by liquid culture of mycelium derived from the novel Seriphoria racerata-K1 strain.
  • the present invention is a novel Ceriporia racerata -K1 ( Ceriporia lacerata- K1, Accession No. KACC 83018BP) strain and mycelia or fruiting bodies derived therefrom.
  • the novel Seriphoria racerata-K1 strain was obtained by using a breeding method using the previously collected Seriphoria racerata strains as a parent strain, the inventors of the present invention directly collected in Korea It is obtained by breeding and breeding the seriphoria racerata strains CL-KU and CL-KS as parent strains.
  • the breeding breeding method is not limited, and various breeding methods known in the summer and in the art may be used.
  • the mono-mono hybridization method replaces two different hybrid mononuclear myceliums at a distance of 2 to 3 cm, and allows the mycelia grown on both sides to cross each other, where they cross each other.
  • Hybridization is performed, and the di-mono hybridization method is a method in which the mononuclear mycelium and the mononuclear mycelium of another strain are replaced with each other and cultured, such that the mononuclear mycelium moves into the binuclear mycelial cell and hybridizes.
  • the parent strain CL-KU was collected from Sogwang-ri, Geumgang-myeon, Uljin-gun, Gyeongsangbuk-do on July 24, 2013. The fruiting body is yellowish red.
  • the parent strain CL-KS was collected from Sogok-ri, Hadong-myeon, Sangju-si, Gyeongsangbuk-do on September 15, 2010, and the fruiting body has a reddish white color.
  • the novel Seriphoria racerata-K1 strain has improved the growth rate of mycelium more than 30% compared to the parent strain, and the aging rate is more than two times slow.
  • the contamination of various strains in the culture of strains to overcome the low cultivation success rate due to contamination by the various bacteria appearing in the culture of the existing Seriphoria racerata strain may be a high economic feasibility industrialization.
  • the novel Seriphoria racerata-K1 strain produces 5-dihydroergosterol which is not produced in CL-KU and CL-KS used as parent strains.
  • the 5-dihydroergosterol is a sterol-based compound, and is known to be very effective in preventing and treating diabetic diseases through excellent inhibitory activity against aldose reductase and inhibition of accumulation of glycation end products. (Lee, SH, et al., 2006). These 5-dihydroergosterols are reported to be present in the Ganoderma applanatum (Ripperger, H., et al., 1975), but are not present in the seriporia racerata mycelium and its culture. Ingredient.
  • novel Seriphoria racerata-K1 strain may be an increased amount of DMC (2 ', 4'-dihydroxy-6'-methoxy-3', 5'-dimethylchalcone).
  • novel Seriphoria racerata-K1 strain has an increased DMC production of 6-40 times that of the parent strain.
  • the DMC is accepted ( Cleistocalyx operculatus , Syzygium nervosum ) is known to have neuroprotective, antidiabetic, spasmolytic, anticancer and anti-inflammatory effects as a major component of buds (Yu, WG, et al., 2011).
  • the mycelium (mycellium) is formed by entangled with the mycelium in the process of mycelium continues to extend to intake nutrients, and contains a variety of useful substances.
  • Mycelium derived from the novel Seriphoria racerata-K1 strain of the present invention is thick and dense without showing floating strains at the mycelial growth stage.
  • the fruit body is a nutrient for making spores, commonly referred to as a mushroom
  • fruiting body derived from the novel Seriphoria racerata-K1 strain of the present invention is dark yellow
  • the novel of the present invention There is a distinct difference in color and form from the red-white fruiting body of CL-KS and the yellow-red fruiting body of CL-KU, which were used in breeding of Seriphoria racerata-K1 breeding.
  • the present invention also relates to a composition
  • a composition comprising a mycelium culture derived from the novel Seriphoria racerata-K1 strain.
  • the mycelium culture can be obtained by liquid culture of the mycelium derived from the novel Seriphora racerata-K1 strain.
  • the culture may include all of the mycelium and the culture medium, or the mycelium and the culture liquid medium may be separated from the culture. Preferably both mycelium and culture medium are included.
  • the culture medium is at least one solvent selected from the group consisting of a liquid culture medium, a culture medium powder powdered culture medium, the culture medium powder water, C1 ⁇ C4 lower alcohol, acetone, n-hexane, dichloromethane and ethyl acetate It may be an extract extracted by adding.
  • the culture medium and culture medium powder are at least one solvent selected from the group consisting of a liquid culture medium, a culture medium powder powdered culture medium, the culture medium powder water, C1 ⁇ C4 lower alcohol, acetone, n-hexane, dichloromethane and ethyl acetate It may be an extract extracted by adding.
  • the culture medium and culture medium powder Preferably, the culture medium and culture medium powder.
  • the culture medium powder may be powdered liquid culture medium using a common drying method. Preferably lyophilized to powder.
  • the lower alcohol of C1 ⁇ C4 may be methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol and the like, but is not limited thereto.
  • Extraction method of the extract may be selected from any one of hot water extraction method, cold extraction method, reflux cooling extraction method, solvent extraction method, steam distillation method, ultrasonic extraction method, elution method, compression method.
  • the desired extract may further be subjected to a conventional fractionation process, and may be purified using conventional purification methods.
  • Components of the liquid medium in the liquid culture may affect the growth of the strain and the production of the active ingredient. Therefore, it is necessary to establish the components and content conditions of the liquid medium optimized for culturing the novel Seriphoria racerata-K1 strain of the present invention.
  • the liquid medium may include one or more selected from the group consisting of sucrose, glucose, lactose, fructose and galactose as a carbon source, but is not limited thereto. Do not.
  • sucrose and glucose more preferably 3-5% (w / v) sucrose and 2-3% (w / v) glucose based on the liquid medium. Most preferably it comprises 3% (w / v) sucrose and 2% (w / v) glucose based on the liquid medium.
  • the liquid medium is a nitrogen source of tryptone, yeast extract, soy flour, L-glutamic acid, peptone, malt extract and ammonium ( ammonium) may include one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • soybean powder is included, and more preferably soybean powder 2 to 4% (w / v) based on the liquid medium. Most preferably it comprises 4% (w / v) soy flour based on the liquid medium.
  • the liquid medium may include one or more selected from the group consisting of KH 2 PO 4 , ZnSO 4 , MgSO 4 , CuSO 4 , FeSO 4, and CaCl 2 as trace elements, but is not limited thereto.
  • KH 2 PO 4 and MgSO 4 more preferably 0.01 to 0.25% (w / v) KH 2 PO 4 and 0.01 to 0.25% (w / v) MgSO 4 based on the liquid medium do.
  • the liquid medium may have a pH of 5-6. Preferably pH 5.5. pH may affect the protein's morphology and activity by changing the charge of the amine group or carboxyl group of amino acids, which are units of enzyme proteins important for cellular metabolism. In addition, the change in pH in the external environment may affect the ionization of microbial nutrients, which may affect the microbial intake of nutrients. Accordingly, when the pH of the liquid medium is less than 5, aerobic algae or archae are easy to breed, and when the pH exceeds 6, alkaline actinomyces and mold fungi breed. It is easy to do it, and it is not preferable.
  • the liquid medium comprises 3% (w / v) sucrose, 2% (w / v) glucose, 4% (w / v) soybean powder, 0.2% (w / v) KH 2 PO 4 based on the liquid medium and MgSO 4 0.15% (w / v), with a pH of 5.5 being most preferred.
  • the mineral complex may be Ca, P, Na, K, Cl, Cu, I, Mn, Co, F, Mo, Se, Cr, Si, V, Sn and the like, but is not limited thereto.
  • the total amount of the mineral complex may additionally include 0.02 to 0.01 wt% of the total amount of the mineral complex, preferably 0.01 wt% of the liquid complex.
  • 0.0001 to 0.002% by weight may be additionally included for each mineral.
  • the mineral should be adjusted so as not to change the pH of the medium.
  • the culture may use a stirred bioreactor, the growth of the strain may be affected by the air supply, the stirring speed, the dissolved oxygen amount, the culture temperature and the incubation time, the novel Ceriporia racerata- of the present invention It is important to establish optimal culture conditions for the K1 strain.
  • the air supply may be 0.02 ⁇ 1vvm, preferably 0.1 ⁇ 0.5vvm, more preferably 0.2vvm.
  • the stirring speed may be 25 ⁇ 125rpm, preferably 50 ⁇ 125rpm, more preferably 75prm.
  • the amount of dissolved oxygen may be 5 to 40%, preferably 10 to 40%, more preferably 20%.
  • the culture temperature may be 22 ⁇ 25 °C, preferably 23 °C. If the temperature is less than 22 °C, the activity of the mycelium is slowed down, the incubation period is long, the productivity is lowered, and the production cost is rapidly increased. If the temperature is higher than 25 °C, the mycelium grows rapidly, the mycelial mass increases rapidly, but the production of the active ingredient is extremely high. It is lowered, which is not preferable.
  • the incubation time may be 6 to 10, and preferably 7 days, which is the first time point when the carbon source consumption included in the medium is reduced. If the incubation time is less than 6 days, the content of the active ingredient is low, if more than 10 days is not preferable because the content of the active ingredient is rapidly reduced.
  • the culture of the novel Seriphoria racerata-K1 mycelium has a ⁇ -glucan content of 42.48 mg / g or more, an extracellular polysaccharide content of 51.9% / g or more, and CL- used as a parent strain for breeding crosses.
  • the ⁇ -glucan content was increased by 31% and the extracellular polysaccharide content by 19% compared to 39.11 mg / g of KU, 47.35% / g, and 25.74 mg / g of CL-KS, 40.16% / g.
  • the culture of the novel Ceriporia racerata-K1 mycelium contains 5-dihydroergosterol which is not produced in CL-KU and CL-KS used as parent strains when breeding.
  • novel Ceriporia racerata-K1 mycelium culture comprises DMC.
  • composition containing the novel Seriphoria racerata-K1 mycelium culture of the present invention as an active ingredient may be a pharmaceutical composition for preventing and treating diabetes.
  • novel Ceriporia racerata-K1 mycelium cultures have increased ⁇ -glucan and extracellular polysaccharide components, which are known to have a therapeutic effect on diabetes, and thus have a hypoglycemic effect than the existing Ceriporia racerata mycelium cultures. great.
  • novel Ceriporia racerata-K1 mycelium culture contains 5-dihydroergosterol, which is known to have excellent glycemic control effect in mild diabetic patients by inhibiting aldose reductase and inhibiting accumulation of the end product of glycation. It is included as an active ingredient, fasting blood sugar can be effective in improving the blood sugar of mild diabetes patients between 110 ⁇ 150mg / dl.
  • the pharmaceutical composition may comprise the novel Ceriporia racerata-K1 mycelium culture and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the novel Ceriporia racerata-K1 mycelium culture is preferably 0.001 to 50% by weight, more preferably 0.001 to 40% by weight, most preferably 0.001 to 30% by weight based on the total weight of the total pharmaceutical composition. It can be added as.
  • compositions may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, suppositories, and sterile injectable solutions according to conventional methods.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , Methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient in the novel Ceriporia racerata-K1 mycelium culture of the present invention, e.g. For example, it is prepared by mixing starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween-61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention will vary depending on the age, sex, weight of the subject to be treated, the specific disease or pathology to be treated, the severity of the disease or pathology, the route of administration and the judgment of the prescriber. Dosage determination based on these factors is within the level of those skilled in the art and generally the dosage ranges from about 0.1-2000 mg / day. More preferred dosage is 0.1-1000 mg / day. Administration may be once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intraperitoneal, muscle, subcutaneous, intrauterine dural or cerebrovascular injections.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a composition derived from natural products, there is almost no toxicity and side effects, and thus it is a drug that can be used with confidence even for long-term use for prophylactic purposes.
  • composition containing the novel Ceriporia racerata-K1 mycelium culture as an active ingredient may be a dietary supplement for diabetic improvement.
  • the dietary supplement may comprise the novel Ceriporia racerata-K1 mycelium culture and a food acceptable additive.
  • the novel Ceriporia racerata-K1 mycelium culture is preferably 0.001 to 90% by weight, more preferably 0.001 to 70% by weight, most preferably 0.001 to 50% by weight relative to the total weight of the health food. It may be added in%.
  • the intake of the novel Ceriporia racerata-K1 mycelium culture in the dietary supplement may be 2000 mg or less per day, 6000 mg or less per day. Most preferably, the intake of 1000mg once 3-4 times a day.
  • the health functional food of the present invention includes the form of tablets, capsules, pills or liquids, and foods to which the culture of the present invention can be added include, for example, various foods, beverages, gums, teas, vitamins, and the like. Complex, health functional food, and the like.
  • the present invention is a novel Ceriporia racerata -K1 ( Ceriporia lacerata -K1) strain, a method for culturing thereof, and a composition for preventing or treating diabetes comprising the culture cultured therefrom as an active ingredient, and contamination of various bacteria during liquid culture of a novel Seriphoria racerata -K1 strain It was confirmed that the content of 5-dihydroergosterol and DMC in the culture was increased. In addition, it was confirmed that these cultures have an excellent hypoglycemic effect.
  • novel Ceriporia racerata-K1 strain and its culture may be usefully used for the development of medicines for preventing or treating diabetes-related diseases, and improving functional foods.
  • Figure 1 shows the growth of a novel Seriphoria racerata-K1 (CL-K1) mycelium
  • (A) is the six parent strains (CL-KU, CL-KS used for CL-K1 breeding) , CL-C, CL-J, KACC-43351 and KACC-43352) and the mycelial growth rate and shape of CL-K1 of the present invention were compared
  • (B) CL-KU which is the parent strain of CL-K1
  • FIG. 2 shows the fruiting bodies of the novel Ceriporia racerata-K1 (CL-K1) derived fruiting bodies and parent strains CL-KS and CL-KU.
  • Figure 3 shows the molecular evolutionary relationship of the novel Ceriporia racerata-K1 (CL-K1).
  • Figure 4 shows the results of confirming the blood glucose inhibitory effect of the novel Ceriporia racerata-K1 (CL-K1) mycelia culture.
  • Example 1-1 Selection and breeding method for breeding strains
  • the mononuclear-mononuclear hybridization method involves replacing two different hybrid mononuclear mycelia in a potato agar medium (potato dextrose agar, PDA) 2 to 3 cm apart, and when one trait receives the other nucleus Is done.
  • a potato agar medium potato dextrose agar, PDA
  • PDA potato dextrose agar
  • Binary-mononuclear hybridization is a useful method for breeding new strains with specific traits of the parent strain, because one of the two nuclei in the nucleus mycelium transfers into the cells of the mononuclear mycelium via cramped connections. This is useful if you don't get it.
  • Substituting the heteronuclear mycelium with another mononuclear mycelium on a plate medium composed of potato agar medium and incubating at 23 ° C. for 15 days the binuclear mycelium collides with the mononuclear mycelium, and the mycelium of the binuclear mycelium invades the mononuclear mycelium side and grows. This was continued so that breeding was carried out to secure mycelia.
  • the hybridization of mycelia was judged by the mycelial growth after growth of the mycelia.
  • a total of 300 mycelia were obtained by 50 each by the mononuclear-mononuclear hybridization method and the binuclear-mononuclear hybridization method, and the obtained mycelia were cultured at 23 ° C. for 50 days on a plate medium composed of potato agar medium for 5 nuclei.
  • Mycelia (three in mononuclear-monocross hybridization and two in mycelium-mononuclear hybridization) were obtained.
  • Example 1-2 With the parent strain Property comparison
  • the growth rate and aging rate of CL-K1 was confirmed by comparing and incubating CL-K1 and its parent strain five times, and the degree of contamination of various bacteria was compared in culture.
  • the growth rate was measured in solid medium and liquid medium, respectively.
  • solid medium each strain was incubated at 23 ° C. for 10 days on a 86 mm diameter medium composed of potato agar medium, and the radial extent was measured by metric method.
  • purified water was 98% and sucrose. After culturing at 23 ° C. in a medium containing 1%, 0.3% glucose, 0.2% starch, and 0.5% soybean powder, the density (weight, g) of the mycelia was measured on the 7th day of culture.
  • Aging rate measurement was calculated by comparing the days of first browning or woody growth after continuous incubation at 23 ° C. on a 86 mm diameter medium composed of potato agar medium.
  • the mycelial growth rate of the novel CL-K1 strain of the present invention was improved by 30% or more compared with the parent strain, it was confirmed that the aging rate is more than two times slow.
  • the novel CL-K1 strain compared to the parent strain, the number of fruiting bodies contaminated with various germs during cultivation was confirmed, and the production of genuine products was confirmed that it was confirmed that it was resistant to contamination by various germs.
  • Example 1-2 80 ml of sucrose, 40 g of glucose, and skim in 4 L distilled water were respectively used for the novel CL-Kl strain secured in Example 1-2 and six strains used as parent strains of Example 1-1 on 5 L bioincubator. Inoculated into 30 g of soybean powder and incubated for 10 days while maintaining pH 5.0-6.0, air volume 0.2vvm, stirring speed 75rpm, temperature 23 °C, mycelium growth, mycelial mass, extracellular polysaccharide (exopolysaccharide, EPS) , ⁇ -glucan, 5-dihydroergosterol (5-dihydroergosterol) and DMC (2 ', 4'-dihydroxy-6'-methoxy-3', 5'-dimethylchalcone) content analysis and the results are shown in the following table 1 is shown.
  • EPS extracellular polysaccharide
  • EPS extracellular polysaccharide
  • EPS extracellular polysaccharide
  • EPS
  • the mycelial mass was analyzed by measuring the total weight after removing the moisture of the culture medium of 3L using a vacuum filter.
  • the content analysis of the ⁇ -glucan was carried out based on the test method of the health functional foods using 20g of the culture medium freeze-dried, the content was calculated according to the formula of the following formula 1.
  • ⁇ -glucan content (mg / g) C ⁇ a / S ⁇ 10 ⁇ 1 / 1,000 ⁇ 0.9
  • C is the glucose concentration in the test solution ( ⁇ g / ml)
  • a is the total amount of the test solution (ml)
  • 10 is the dilution factor
  • S is the sampling rate (g)
  • 1 / 1,000 is the unit conversion factor
  • the growth stagnation start date was 7 days, and it was confirmed that the growth rate was faster than that of the strains of the parent strain, and such a rapid growth rate indicates the possibility of contamination by various bacteria during the culture period. It can be reduced.
  • extracellular polysaccharide and ⁇ -glucan content in the CL-K1 mycelium culture was 19% extracellular polysaccharide and 19% ⁇ -glucan compared to the average content in the cultures of the parent strains, CL-KU and CL-KS. It increased by about 31%.
  • CL-K1 mycelium culture produced 5-dihydroergosterol, an active ingredient that was not produced in the culture of the parent strain, and 5-dihydroergosterol was produced in the culture of the novel CL-K1 strain.
  • 2 kg of fruiting body derived from the CL-K1 strain was pulverized and powdered.
  • 5 L of methanol was added thereto, the mixture was filtered by heating at 50 ° C. for 1 hour, and then concentrated under reduced pressure at 50 ° C.
  • the crude extract obtained by concentration was suspended in 1.5 L distilled water, and the fraction obtained by adding twice the fractions by adding 1.5 L of hexane was analyzed in the same manner as the 5-dihydroergosterol content analysis method. It was confirmed that 21.87 ⁇ g / g of 5-dihydroergosterol was also produced in the derived fruiting body.
  • DMC Another active ingredient, DMC, was found to contain about 5.32 ⁇ g / g of the parent strain CL-KU mycelium culture, while it contained about 39.87 ⁇ g / g of the CL-K1 mycelium culture. This is about 15-fold increase in production compared to the average content of DMC in the culture of CL-KU and CL-KS, the parent strain mycelium of CL-K1.
  • DMC content was checked in the fruiting body in the same manner as the method of checking the fruiting body content of the 5-dihydroergosterol, it was confirmed that the content of about 6.21 ⁇ g / g was contained.
  • the content of the extracellular polysaccharide, ⁇ -glucan, 5-dihydroergosterol and DMC in the mycelium culture and fruiting body was increased in the culture of the mycelium than in the fruiting body induction.
  • the liquid medium is composed of Ca, P, Na, K, Cl, Cu, I, Mn, Co, F, Mo, Se, Cr, Si, V, Sn, etc.
  • the content of 5-dihydroercholesterol was 903.7 ⁇ g / g, when compared to 12.92 ⁇ g / g of Table 1 when cultured under the same culture conditions as described above. It was confirmed that about 70 times increased.
  • the fruiting body When the fruiting body was induced, the bottle cultivation method and pine sawdust were used, but the fruiting body could not be induced, and even when the nitrogen source was excessively supplied to the carbon source, the fruiting body was hardly induced. Therefore, the fruit was obtained through bag cultivation after the medium was composed mainly of oak sawdust and carbon source.
  • the medium was put 1 kg oak sawdust, 150 g of corn powder, 50 g of soybean powder, 100 g of glucose and 100 ml of water to make the water content 65%.
  • the mushroom mycelium In general, in order to mass-produce a product using the functional components of the mushroom mycelium, it is most effective to use the culture produced by the mycelium liquid culture method.
  • the mushroom mycelium may vary in culture characteristics depending on the medium composition and culture conditions, and suitable culture conditions should be established to enhance the liquid culture efficiency of the mycelia.
  • a medium containing 80 g of sucrose and 40 g of glucose in 4 L of distilled water on a 5 L bio-incubator was used as a basic medium composition.
  • 30g each of the nitrogen source is sterilized, and then inoculated with 80ml of spawn, incubated for 10 days while maintaining pH 5.0-6.0, air volume 0.2vvm, stirring speed 75rpm, temperature 23 °C, and measuring the mycelial mass and extracellular polysaccharide content. It was.
  • the measurement method was carried out in the same manner as described in 2) Mycelium culture component and content comparison of Example 1-2, the results are shown in Table 3 below.
  • a medium containing 80 g of sucrose, 40 g of glucose, and 30 g of skim soybean powder in 4 L of distilled water on a 5 L biological incubator is used as a basic medium composition.
  • a medium containing 80 g of sucrose, 40 g of glucose, and 30 g of skim soybean powder in 4 L of distilled water on a 5 L biological incubator is used as a basic medium composition.
  • the content of extracellular polysaccharide was measured.
  • the measurement method was carried out in the same manner as described in 2) Mycelium culture component and content comparison of Example 1-2, the results are shown in Table 4 below.
  • the CL-K1 mycelium is low in the amount of mycelium, the amount of dry matter, extracellular polysaccharide and ⁇ -glucan when incubated at a low stirring speed of less than 25rpm, while stirring at 25-125rpm
  • a low stirring speed of less than 25rpm When cultured at a rate it was confirmed that the amount of mycelium, extracellular polysaccharide and ⁇ -glucan content increased.
  • a high stirring speed of 150rpm it was confirmed that the amount of mycelium, extracellular polysaccharide and ⁇ -glucan significantly decreased.
  • the growth stagnation time appeared at a low stirring speed of 25rpm, but the amount of mycelia, dry matter, extracellular polysaccharides and ⁇ -glucan contained in the dry matter was high compared to the incubation period, 50-125rpm At the stirring speed, the growth stagnation time tended to last up to 7 days or more, but when the incubation period was considered, the efficiency was lower than the low stirring speed.
  • the novel CL-K1 strain of the present invention was cultured in the same manner as the culture condition check according to the stirring speed of the incubator. At this time, the agitation speed was 75rpm under the culture conditions, the growth and mycelial weight of the mycelia, and the extracellular polysaccharide and ⁇ -glucan content contained in the culture medium while maintaining the culture from the beginning to the completion point of the culture in the air supply of Table 6 below To analyze the results are shown in Table 6 below.
  • the CL-K1 strain was not cultured when air was not supplied, and the amount of growth retention period and mycelium, dry matter, and extracellular polysaccharides were similar until ⁇ - 1vvm.
  • the content of glucan was found to contain about 28.1 ⁇ 42.1mg / g, the case of air supply of 0.1 ⁇ 0.5vvm did not show a significant difference in the content of ⁇ - glucan according to the air supply.
  • the air supply amount is 2vvm or more it was confirmed that the amount of the mycelium, the extracellular polysaccharide and the content of ⁇ -glucan is significantly reduced. Accordingly, it was found that the appropriate air supply amount in the stirred bioreactor was 0.02 to 1vvm, more preferably 0.1 to 0.5vvm, and most preferably 0.2vvm.
  • the novel CL-K1 strain of the present invention was cultured in the same manner as the culture condition check according to the stirring speed of the incubator. At this time, the agitation speed is 75rpm under the culture conditions, the air supply amount is 0.2vvm while the growth and mycelial weight of the mycelia according to the dissolved oxygen amount in Table 7, the extracellular polysaccharide and ⁇ -glucan content contained in the culture medium, etc. The results are shown in Table 7 below.
  • Example 2-1 and Example 2-2 preferred culture conditions of the novel Seriphoria racerata-K1 (CL-K1) strain of the present invention, the number of bacteria for inoculation compared to the culture solution is 2 ⁇ 4%, medium is 1.5-3% (w / v) sucrose, 0.5-1.5% (w / v) glucose, 0.2-0.5% (w / v) soybean powder, 0.01-0.20% (KH 2 PO 4 ) w / v), MgSO 4 0.005 ⁇ 0.01%, pH is 5.0 ⁇ 5.5, the culture conditions are 0.1 ⁇ 0.5vvm of air is supplied into the bioreactor, the stirring speed is 25 ⁇ 100rpm, temperature is 22 ⁇ 25 °C could know.
  • the incubation period is the first time point at which the consumption of carbon source dissolved in the culture solution is rapidly decreased. It was found that it is desirable to incubate for 7 days.
  • ⁇ -glucan extracellular polysaccharide, protein, and 5- which are indicator components of the mycelia culture contained in the culture cultured under the optimal culture conditions of the novel Seriphoria racerata-K1 strain identified in Example 2 above.
  • the properties and contents for dihydroergosterol were analyzed.
  • Example 3-1 ⁇ -glucan content analysis
  • Example 3-2 Polysaccharides, proteins and 5- Dehydroergosterol Content analysis
  • the sugar content of the mycelia and the polysaccharides of the culture was analyzed using the phenol-sulfuric acid method. After adding 25 ml of 80% phenol to 1 ml of the mycelium and culture sample diluted at various concentrations, 2.5 ml of 98% sulfuric acid was added, cooled at room temperature for 30 minutes, and absorbance was measured at 465 nm. The results are shown in Table 9 below.
  • BSA bovine serum albumin
  • the polysaccharide content is high in the culture medium, the content of protein and 5-dihydroergosterol content in the mycelium It confirmed high.
  • the culture medium was higher than the mycelium.
  • the carbon source used as a nutrient source of the mycelium contained a large amount of polysaccharide, and in addition to the polysaccharide produced by the mycelium, the non-consumed polysaccharide used as the culture source was intact. It is expected because it exists.
  • the extracellular polysaccharide is separated from the culture cultured by the optimal culture method according to the method described in 2) Mycelia culture and the content comparison of Example 1-2, and the separated extracellular polysaccharide is subjected to gel permeation chromatography (Molecular weight was measured using gel permeation chromatography (GPC).
  • the isolated extracellular polysaccharide was added to a solution consisting of 0.1 M Na 2 SO 4 and 0.05 M NaN 3 . After dissolving to 1% (w / v), the supernatant obtained by centrifugation was filtered with a 0.45 ⁇ m syringe filter and used for analysis.
  • the analysis conditions were used for the refractive index (RI) as a detector, GPC using OHpak SB 805 HQ (Shodex, Japan), the solution consisting of 0.1M Na 2 SO 4 and 0.05M NaN 3 as a mobile phase And the flow rate was flowed at a rate of 1.0 ml / min.
  • the standard curve was analyzed the molecular weight of the extracellular polysaccharide contained in the CL-K1 mycelium culture using dextran having a different molecular weight (130, 400, 770, 1,200kDa), respectively.
  • the molecular weight of the extracellular polysaccharides contained in the CL-K1 mycelium culture was about 126 kDa, which is slightly higher than the extracellular polysaccharide of the parent strain mycelium culture.
  • mice Seven-week-old male db / db mice, 35-40 g in weight and 150 mg / d before and after blood sugar, were fed through a central laboratory animal. After three days of adaptation, body weight and blood glucose were measured by measuring weight and blood sugar. Mice with similar numbers were selected for the experiment and classified into diabetic and sample treatment groups. At this time, mice with normal leptin receptors to control appetite were used as a normal group. Feeding was provided to limit the commercial experimental animal feed to 5g per day to maintain blood sugar, and water was freely ingested.
  • Example 2 In order to confirm the anti-diabetic effect, 40% glucose was orally administered to the remaining groups except the normal group to 2 g / kg, and the sample treatment group contained the novel seriporia racerata-K1 mycelium identified in Example 2.
  • 300 mg / kg of metformin (METformin, MET) was treated as a positive control group in the same manner as the above sample treatment. It was measured once every three days using.
  • Table 10 shows the result of blood glucose measurement
  • FIG. 4 shows the result of comparing the blood glucose increase rate of each day with 100% of the blood sugar on day 0.
  • the blood sugar level between all groups showed a similar level before and after 150 mg / dL, but in the diabetic group administered only glucose, the blood glucose level rapidly increased. It was confirmed that the increase continued.
  • the CL-KU treated group the CL-K1 treated group and the metformin-treated positive control group
  • the blood glucose level was lower than that of the diabetic group even when glucose was administered.
  • the CL-K1 treated group was positive.
  • the blood sugar level was similar to the control group.
  • it was confirmed that the blood glucose level does not increase any more and is kept constant when CL-K1 is continuously administered continuously.
  • novel Seriphoria racerata-K1 (CL-K1) mycelium culture of the present invention continuously blocks the progression of diabetes to improve or treat diabetes, thereby exhibiting an excellent anti-diabetic effect. .
  • Formulation example 2-1 Manufacturing of dietary supplements
  • a vitamin mixture proper amount 70 ⁇ g of vitamin A acetate, 1.0 mg of vitamin E, 0.13 mg of vitamin B1, 0.15 mg of vitamin B2, 0.5 mg of vitamin B6, 0.2 ⁇ g of vitamin B12, 10 mg of vitamin C , 10 ⁇ g biotin, 1.7 mg nicotinic acid amide, folate 50 ⁇ g, calcium pantothenate 0.5 mg, mineral mixture appropriate amount, ferrous sulfate 1.75 mg, zinc oxide 0.82 mg, magnesium carbonate 25.3 mg, potassium monophosphate 15 mg, diphosphate 55 mg of calcium, 90 mg of potassium citrate, 100 mg of calcium carbonate, and 24.8 mg of magnesium chloride were mixed to prepare granules, but they may be prepared by modifying the formulation into various formulations. In addition, the composition ratio of the above-mentioned vitamin and mineral mixture may be arbitrarily modified, and it may be prepared by mixing the above components according to a conventional health functional food manufacturing method.
  • CL-K1 mycelium culture of the present invention 3g, citric acid 0.1g, fructooligosaccharide 30g, purified water 300ml was mixed, stirred, heated, filtered, sterilized and refrigerated according to the conventional beverage production method to prepare a beverage.

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Abstract

본 발명은 신규한 세리포리아 라세라타-K1(Ceriporia lacerata-K1) 균주(수탁번호 KACC 83018BP), 이의 배양 방법 및 이로부터 배양된 배양물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주의 액체 배양 시 잡균의 오염에 강하고, 생장 속도가 빠르며, 배양된 배양물 내 5-디하이드로에르고스테롤 및 DMC의 함량이 증가되었음을 확인하였다. 또한, 이러한 배양물이 혈당 강하 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주 및 이의 배양물을 당뇨 관련 질환 예방 또는 치료용 의약품, 개선용 건강기능식품 개발에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주 및 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 신규한 세리포리아 라세라타-K1(Ceriporia lacerata-K1) 균주, 이의 배양 방법 및 이로부터 배양된 배양물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
버섯은 탄수화물, 단백질, 지질, 무기질, 비타민 등이 풍부하고, β-글루칸(β-glucan)을 포함하는 생리 활성 물질이 다량으로 함유되어 있어 오랫동안 식용 및 약용 소재로 이용되고 있다(Wani, B.A., et al., 2010; Yu, H.E., et al., 2006). 식용 및 약용 버섯은 항암(Kidd, P.M., 2000; Lee, Y.S., et al., 2006), 콜레스테롤 저하(Caz, V., et al., 2015; Khatun, K. et al., 2007), 혈당 강하(Khatun, K. et al., 2007), 감염 예방(Padmavathy, M., et al., 2014) 등의 효능이 보고되어 다양한 기능성 소재로 활용되고 있으며, 최근 경제발전에 의한 식생활 형태 변화, 환경오염 및 스트레스 증가 등에 의한 만성 질환이 증가하고, 이에 따른 인간의 삶의 질 향상에 대한 욕구 증가로 버섯류 또한 중요한 건강식품 또는 약용식품으로서 선호도가 증가하고 있다.
현재에는 버섯의 성분 및 생리활성 기작에 대한 규명으로 상당 부분이 과학적으로 증명되고 있어 버섯의 인공재배 방법 개발, 대량 증식법 개발, 신규 버섯 발굴, 기능성 탐색 등의 연구가 필요시 되고 있다. 또한, 약용버섯의 경우 대다수가 단단한 목질형 버섯으로, 목질형 버섯은 성장속도가 느려 성체가 되기까지 오랜 시간이 소요된다. 따라서 목질형의 버섯은 배양과 재배기술을 확보하는데 많은 노력과 기술이 필요하며, 특히, 특정 기능성 성분만을 선택적으로 증감시키기 위해서는 고도의 유도 배양기술과 수많은 반복 실험이 필요하다.
버섯은 균사체(mycellium)와 자실체(fruit body)로 분류할 수 있다. 자실체는 포자를 만드는 영양체를 말하며, 흔히 버섯이라고 부르는 부분이다. 균사체는 균사가 영양분을 섭취하기 위해 계속 뻗어나가는 과정에서 균사들끼리 얽혀서 형성된다. 버섯의 균사체는 자실체와 마찬가지로 여러 가지 유용한 물질을 함유하고 있으며, 특히 버섯 자실체와는 달리 안정적으로 용기 내 단기배양 및 생산이 가능하다는 장점이 있다.
최근 대부분의 버섯 종균은 액체 배지에 함유된 영양성분을 이용한 생물 전환을 통해 다양한 생리활성물질을 포함하는 균사체 배양이 가능하게 되었다(Tang, Y.J., et al., 2007). 버섯 균사체의 액체 배양은 버섯 생활환 중 영양세대인 균사체를 액체 배양 방법으로 증식시키는 것이다. 균사체 배양용 액체 배지는 배지 내에 균사체가 생장할 수 있는 포도당, 전분 등의 탄소원과 각종 무기질 형태의 질소원, 유기질 형태의 복합질소원과 무기염류 및 미량원소, 비타민 등을 함유하고 있다. 버섯 균사체는 배지 조성, 배양 조건 또는 버섯 균사체 종류에 따라 그 배양 특성이 다르므로 균사체의 액체 배양 효율을 증진시키기 위해서는 버섯별로 적합한 배양 조건이 구명되어야 한다. 또한, 버섯 균사체를 포함한 액체 배양물은 배지의 영양 성분 조성과 배양 조건에 따라 항암 및 항산화 등의 활성을 가지는 다양한 대사산물을 얻을 수 있다(이위영, et al., 2008).
세리포리아 라세라타(Ceriporia lacerata)는 구멍장이버섯목(Polyporales) 유색고약버섯과(Phanerochaetaceae)의 버섯으로 2003년에 일본에서 처음으로 발견하였다(Shin, E.J., et al., 2016). 세리포리아 라세라타는 참나무나 적송에 부생하는 백색 부후균의 일종으로, 목재의 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 리그닌 등을 분해하며, 세리포리아 라세라타 추출물 또는 세리포리아 라세라타 균사체 배양액 추출물의 경우에는 항암(한국등록특허 제1721836호), 항당뇨(Shin, E.J., et al., 2015; Shin, E.J., et al., 2016), 간기능 개선(한국공개특허 제2016-0008425호), 지질 대사 개선(한국공개특허 제2016-0008431호) 등의 질병 치료에 효과가 있다고 보고되고 있다.
그러나 세리포리아 라세라타 버섯의 자생지별 특성을 비교 실험한 결과, 공통적으로 서식지 온도가 낮은 지역에서 획득한 균주는 품성은 좋지만 생장 속도가 느리고, 잡균의 오염에 약하며, 수량성이 낮은 단점이 있고, 온도가 높은 지역에서 획득한 균주는 품성은 낮지만 생장 속도가 빠르고 잡균의 오염에 강하며, 수량성이 우수한 특성을 지니는 것을 확인하였다. 또한, 생장 지역에 따라 특성과 성분 함량에 많은 차이가 있고, 이로 인해 의약적 효능에도 많은 차이가 발생한다. 나아가 균사체 배양시에는 잡균에 쉽게 오염되어 배양 성공률이 50% 이하로 낮아 경제성이 높은 산업화가 곤란한 실정이다.
이에, 본 발명인은 상기에서 지적된 세리포리아 라세라타의 문제점을 해결하기 위해 육종 기술을 이용하여 새로운 균종을 개발하는 과정에서, 잡균의 오염에 강하고, 세리포리아 라세라타의 유효성분의 함량이 증가된 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주를 확보하였고, 이의 최적의 배양 조건을 확립하였다. 또한, 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주가 혈당 조절 효능이 우수하다고 보고된 5-디하이드로에르고스테롤(5-dihydroergosterol) 및 DMC(2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcone)를 많이 생성하는 것을 확인하였고, 5-디하이드로에르고스테롤의 생성량을 증가시키는 조건을 추가로 확인하였으며, 이러한 조건으로 배양한 배양물이 혈당 강하 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래 선행기술로서 한국등록특허 제1031605호에는 캐나다 온타리오주에서 채취한 세리포리아 라세라타 균사체 배양액 추출물 및 이의 당뇨 치료 효과가, 한국공개특허 제2015-0103690호에는 참나무 변제부 속에서 분리, 채취한 세리포리아 라세라타 균사체 배양액 추출물 및 이의 당뇨 치료 효과가, 한국공개특허 제2017-0114559호에는 세리포리아 락세라타 균사체 배양물의 당뇨병 치료 효과가 기재되어 있어 본 발명의 구성과 유사하나, 본 발명의 육종을 통해 얻은 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주와는 그 구성이 차이가 있다.
본 발명의 목적은 신규한 세리포리아 라세라타-K1(Ceriporia lacerata-K1) 균주 및 이로부터 유래된 균사체 및 자실체를 제공하는데 있다.
또한, 상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주의 배양 방법 및 이로부터 배양된 배양물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 신규한 세리포리아 라세라타-K1(Ceriporia lacerata-K1, 수탁번호 KACC83018BP) 균주에 관한 것이다.
상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주는 5-디하이드로에르고스테롤(5-dihydroergosterol)을 생산할 수 있다.
상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주는 DMC(2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcone) 생성량이 모균주와 대비 6~40배 증가된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주로부터 유래된 균사체 또는 자실체에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주로부터 유래된 균사체 배양물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
상기 균사체 배양물은 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주로부터 유래된 균사체를 액체 배양하여 얻을 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 신규한 세리포리아 라세라타-K1(Ceriporia lacerata-K1, 수탁번호 KACC 83018BP) 균주 및 이로부터 유래된 균사체 또는 자실체에 관한 것이다.
상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주는 기존에 채집되어 있던 세리포리아 라세라타 균주들을 모균주로 이용하여 교배 육종 방법을 이용하여 얻은 것으로, 본 발명의 발명자가 국내에서 직접 채집한 세리포리아 라세라타 균주인 CL-KU 및 CL-KS를 모균주로 하여 교배 육종하여 얻은 것이다.
상기 교배 육종 방법은 제한되지 않으며, 하계 및 당업계에 공지된 다양한 교배법을 이용할 수 있다. 바람직하게는 단핵-단핵 교배법 및 이핵-단핵 교배법이다. 상기 단핵-단핵(mono-mono) 교배법은 2개의 상이한 교잡용 단핵 균사를 2~3㎝ 정도 떨어진 상태로 대치시켜 놓고, 양쪽에서 자란 균사가 서로 교배가 이루어지도록 하는 방법으로, 서로 부딪힌 곳에서 교잡이 이루어지며, 상기 이핵-단핵(di-mono) 교배법은 이핵 균사와 또 다른 균주의 단핵 균사를 서로 대치시키고 배양하여, 단핵 균사가 이핵 균사 세포 내로 이동하여 교배가 이루어지도록 하는 방법이다.
상기 모균주인 CL-KU는 2013년 7월 24일에 경북 울진군 금강송면 소광리에서 채집한 것으로, 자실체는 황적색을 띠고 있다.
상기 모균주인 CL-KS는 2010년 9월 15일에 경북 상주시 하동면 소곡리에서 채집한 것으로, 자실체는 홍백색을 띠고 있다.
상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주는 균사체의 생장 속도가 모균주에 비해 30% 이상 향상되었으며, 노화 속도가 2배 이상 느리다. 또한, 균주 배양 시 잡균의 오염에 강하여 기존의 세리포리아 라세라타 균주의 배양 시 나타나는 잡균에 의한 오염으로 인한 낮은 배양 성공률을 극복함으로써 경제성이 높은 산업화가 가능할 수 있다.
상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주는 모균주로 이용한 CL-KU 및 CL-KS에서 생성되지 않는 5-디하이드로에르고스테롤을 생성한다.
상기 5-디하이드로에르고스테롤은 스테롤(sterol)계 화합물로서, 알도스 환원효소(aldose reductase)에 대한 우수한 억제 활성 및 당화 최종 산물의 축적 저해를 통해 당뇨병 질환의 예방 및 치료에 매우 효과적이라고 알려져 있다(Lee, S.H., et al., 2006). 이러한 5-디하이드로에르고스테롤이 잔나비걸상버섯(Ganoderma applanatum)에 존재하는 것으로 보고되어 있으나(Ripperger, H., et al., 1975), 세리포리아 라세라타 균사체 및 이의 배양물에는 존재하지 않는 성분이다.
또한, 상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주는 DMC(2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcone)의 생성량이 증가된 것일 수 있다. 보다 자세하게는 상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주는 DMC 생성량이 모균주 대비 6~40배가 증가된 것이다.
상기 DMC는 수용(Cleistocalyx operculatus , Syzygium nervosum)의 싹(bud)의 주요 성분으로 신경보호, 항당뇨, 진경성(spasmolytic), 항암 및 항염증 효과가 있음이 알려져 있다(Yu, W.G., et al., 2011).
상기 균사체(mycellium)는 균사가 영양분을 섭취하기 위해 계속 뻗어나가는 과정에서 균사들끼리 얽혀서 형성된 것으로, 여러 가지 유용한 물질을 함유하고 있다. 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주로부터 유래된 균사체는 균사 성장 단계에서 부상균주가 나타나지 않고, 굵고 조밀하다.
상기 자실체(fruit body)는 포자를 만드는 영양체로 흔히 버섯이라고 부르는 부분으로, 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주로부터 유래된 자실체는 짙은 황색을 나타내고 있어, 상기 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 육종 교배시 이용한 모균주인 CL-KS의 홍백색 자실체 및 CL-KU의 황적색 자실체와는 색상과 형태에서 뚜렷한 차이가 있다.
본 발명은 또한, 상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주로부터 유래된 균사체 배양물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
상기 균사체 배양물은 상기 신규한 세리포라아 라세라타-K1 균주로부터 유래된 균사체를 액체 배양하여 얻을 수 있다.
상기 배양물은 균사체 및 배양 배지가 모두 포함된 것이거나, 배양액에서 균사체 및 배양 액체 배지를 각각 분리한 것일 수 있다. 바람직하게는 균사체 및 배양 배지가 모두 포함된 것이다.
상기 배양물은 액체 배양한 배양액, 배양액을 분말화한 배양액 분말, 배양액 분말을 물, C1~C4의 저급 알코올, 아세톤, n-헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매를 가하여 추출한 추출물 일 수 있다. 바람직하게는 배양액 및 배양액 분말이다.
상기 배양액 분말은 상기 액체 배양한 배양액을 통상의 건조 방법을 이용하여 분말화 할 수 있다. 바람직하게는 동결건조하여 분말화 한다.
상기 C1~C4의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 추출물의 추출방법은 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
상기 액체 배양시의 액체 배지의 성분은 균주의 생장 및 유효성분의 생성에 영향을 줄 수 있다. 따라서 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주 배양에 최적화된 액체 배지의 성분 및 함량 조건을 구축하는 것이 필요하다.
상기 액체 배지는 탄소원으로 수크로스(sucrose), 글루코스(glucose), 락토스(lactose), 프룩토스(fructose) 및 갈락토스(galactose)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 수크로스 및 글루코스를 포함하며, 더 바람직하게는 액체 배지를 기준으로 수크로스 3~5%(w/v) 및 글루코스 2~3%(w/v)를 포함한다. 가장 바람직하게는 액체 배지를 기준으로 수크로스 3%(w/v) 및 글루코스 2%(w/v)를 포함한다.
상기 액체 배지는 질소원으로 트립톤(tryptone), 효모 추출물(yeast extract), 대두분말(soy flour), L-글루탐산(L-glutamic acid), 펩톤(peptone), 맥아 추출물(malt extract) 및 암모늄(ammonium)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 대두분말을 포함하며, 더 바람직하게는 액체 배지를 기준으로 대두분말 2~4%(w/v)를 포함한다. 가장 바람직하게는 액체 배지를 기준으로 대두분말 4%(w/v)를 포함한다.
상기 액체 배지는 미량원소로 KH2PO4, ZnSO4, MgSO4, CuSO4, FeSO4 및 CaCl2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 KH2PO4 및 MgSO4를 포함하며, 더 바람직하게는 액체 배지를 기준으로 0.01~0.25%(w/v) KH2PO4 및 0.01~0.25%(w/v) MgSO4를 포함한다. 가장 바람직하게는 액체 배지를 기준으로 0.2%(w/v) KH2PO4 및 0.15%(w/v) MgSO4를 포함한다.
상기 액체 배지는 pH가 5~6일 수 있다. 바람직하게는 pH 5.5이다. pH는 세포 대사에 중요한 효소 단백질의 단위체인 아미노산의 아민 그룹(amino group)이나 카르복실 그룹(carboxyl group)의 전하를 변화시켜 단백질의 형태 및 활성에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 외부 환경에서 pH의 변화는 미생물 영양분의 이온화에 영향을 주어 미생물이 영양분을 섭취하는 데 영향을 줄 수 있다. 이에, 상기 액체 배지의 pH가 5 미만이면 호기성이며 산성계인 조류(algae)나 고균(archaea)이 번식하기 쉬우며, pH가 6을 초과하면 알칼리계 방선균(actinomyces)과 사상균(mold fungi)이 번식하기 쉬워 바람직하지 못하다.
상기 액체 배지는 액체 배지를 기준으로 수크로스 3%(w/v), 글루코스 2%(w/v), 대두분말 4%(w/v), KH2PO4 0.2%(w/v) 및 MgSO4 0.15%(w/v)를 포함하며, pH가 5.5인 것이 가장 바람직하다.
상기 액체 배지에 미네랄 복합제를 추가할 경우에는 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주 배양시 생성되는 유효성분인 5-디하이드로에르고스테롤의 생성량을 증가시킬 수 있다.
상기 미네랄 복합제는 Ca, P, Na, K, Cl, Cu, I, Mn, Co, F, Mo, Se, Cr, Si, V, Sn 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 미네랄 복합제는 미네랄 복합제 총량이 액체 배지 대비 0.02~0.01중량%가 추가적으로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 액체 배지 대비 0.01중량%가 추가적으로 포함된다. 이때, 상기 미네랄 각각의 경우에는, 미네랄 별로 0.0001~0.002중량%가 추가적으로 포함될 수 있다.
또한, 상기 미네랄은 배지의 pH를 변화시키지 않도록 조절해야 한다.
상기 배양은 교반형 생물반응기를 이용할 수 있으며, 공기 공급량, 교반 속도, 용존 산소량, 배양 온도 및 배양 시간에 따라 균주의 생장이 영향을 받을 수 있어, 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주의 최적의 배양 조건을 확립하는 것이 중요하다.
상기 공기 공급량은 0.02~1vvm일 수 있고, 바람직하게는 0.1~0.5vvm이며, 더 바람직하게는 0.2vvm이다.
상기 교반 속도는 25~125rpm일 수 있고, 바람직하게는 50~125rpm이며, 더 바람직하게는 75prm이다.
상기 용존 산소량은 5~40%일 수 있고, 바람직하게는 10~40%이며, 더 바람직하게는 20%이다.
상기 배양 온도는 22~25℃일 수 있고, 바람직하게는 23℃이다. 온도가 22℃ 미만일 경우에는 균사체의 활성이 둔화되어 배양 기간이 길어져 생산성이 낮아지고 생산비가 급상승하게 되며, 25℃ 초과일 경우에는 균사체가 비대생장하여 균사체양은 급속도로 증가하지만 유효성분의 생성이 극도로 낮아져 바람직하지 못하다.
상기 배양 시간은 6~10일 수 있으며, 배지에 포함되어 있는 탄소원 소비량이 감소하는 최초 시점인 7일이 바람직하다. 배양 시간이 6일 미만일 경우에는 유효성분의 함량이 낮으며, 10일 초과일 경우에는 유효성분의 함량이 급격히 감소되므로 바람직하지 못하다.
상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체의 배양물은 β-글루칸의 함량이 42.48㎎/g 이상이며, 세포외 다당체 함량이 51.9%/g 이상으로, 육종 교배 시 모균주로 이용한 CL-KU의 39.11㎎/g, 47.35%/g 및 CL-KS의 25.74㎎/g, 40.16%/g에 비해 β-글루칸의 함량은 31%, 세포외 다당체 함량은 19%가 증가되었다.
상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체의 배양물은 육종 교배시 모균주로 이용한 CL-KU 및 CL-KS에서 생성되지 않은 5-디하이드로에르고스테롤을 포함하고 있다.
또한, 상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체 배양물은 DMC를 포함하고 있다.
또한, 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물일 수 있다.
상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체 배양물에는 당뇨 치료 효과가 있다고 알려진 β-글루칸과 세포외 다당체 성분이 증가되어 있어, 기존의 세리포리아 라세라타 균사체 배양물보다 혈당 강하 효과가 우수하다. 또한, 상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체 배양물에는 알도즈 환원효소 억제 및 당화의 최종 산물의 축적을 저해하여 경증 당뇨병 환자의 혈당 조절 효능이 우수하다고 알려진 5-디하이드로에르고스테롤을 유효성분으로 포함하고 있어, 공복 혈당이 110~150㎎/㎗ 사이인 경증 당뇨병 환자들의 혈당 개선에 효과적일 수 있다.
상기 약학 조성물은 상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체 배양물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다.
상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체 배양물은 전체 약학 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~50중량%, 더 바람직하게는 0.001~40중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체 배양물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 약 0.1~2000㎎/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1~1000㎎/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 복강, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 천연물 유래의 조성물이기 때문에, 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 당뇨병 개선용 건강기능식품일 수 있다.
상기 건강기능식품은 상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체 배양물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체 배양물은 전체 건강기능식품 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~90중량%, 더 바람직하게는 0.001~70중량%, 가장 바람직하게는 0.001~50중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 건강기능식품 내 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체 배양물의 섭취량은 1회 2000㎎ 이하, 1일 6000㎎ 이하일 수 있다. 가장 바람직하게는 1회 1000㎎으로 1일 3~4회 섭취하는 것이다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 배양물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명은 신규한 세리포리아 라세라타-K1(Ceriporia lacerata-K1) 균주, 이의 배양 방법 및 이로부터 배양된 배양물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주의 액체 배양 시 잡균의 오염에 강하고, 배양된 배양물 내 5-디하이드로에르고스테롤 및 DMC의 함량이 증가되었음을 확인하였다. 또한, 이러한 배양물이 혈당 강하 효과가 우수함을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주 및 이의 배양물을 당뇨 관련 질환 예방 또는 치료용 의약품, 개선용 건강기능식품 개발에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 신규한 세리포리아 라세라타-K1(CL-K1) 균사체의 생장을 확인한 결과로, (A)는 CL-K1 육종을 위해 사용한 6종의 모균주(CL-KU, CL-KS, CL-C, CL-J, KACC-43351 및 KACC-43352) 및 본 발명의 CL-K1의 균사체 생장 속도 및 형상을 비교한 결과를, (B)는 CL-K1의 모균주인 CL-KU 및 CL-KS와 CL-K1의 균사체 생장 및 노화를 비교한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 신규한 세리포리아 라세라타-K1(CL-K1) 유래 자실체 및 모균주인 CL-KS 및 CL-KU의 자실체를 보여주고 있다.
도 3은 신규한 세리포리아 라세라타-K1(CL-K1)의 분자진화학적 관계도를 보여주고 있다.
도 4는 신규한 세리포리아 라세라타-K1(CL-K1) 균사체 배양물의 혈당 억제 효과를 확인한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
< 실시예 1. 신규한 세리포리아 라세라타 -K1 균주의 교배 육종>
실시예 1-1. 교배용 균주 선발 및 교배 방법
본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주의 육종을 위해서 교배용 품종으로 농촌진흥청에서 분양받은 2개의 세리포리아 라세라타 균종(KACC-43351, KACC-43352), 본 발명의 발명자가 직접 채집한 국내산 세리포리아 라세라타 2종(CL-KU, CL-KS), 캐나다산 세리포리아 라세라타 1종(CL-C) 및 일본산 세리포리아 라세라타 1종(CL-J)을 모균주로 사용하였다. 교배 방법은 단핵-단핵(mono-mono) 교배법과 이핵-단핵(di-mono) 교배법을 병행하였다.
단핵-단핵 교배법은 감자한천배지(potato dextrose agar, PDA)에 2개의 상이한 교잡용 단핵 균사를 2~3㎝ 정도 떨어진 상태로 대치시켜 놓고 배양하면 한쪽 형질이 다른 쪽 핵을 수용할 때 교배가 이루어진다. 두 개의 단핵 균사가 교배를 달성하면 이핵 균사가 되어 꺽쇠(clamp)가 형성되고, 현미경을 통해 꺽쇠 부분을 관찰하여 교배의 성공 유무를 확인할 수 있다. 상기 6종의 모균주를 이용하여 감자한천배지로 조성된 평판 배지에 각각 상이한 교잡용 단핵 균사 2개를 대치시키고, 23℃에서 15일간 배양하고, 교배가 이루어져 생성된 꺽쇠 부분에서 균사를 확보하였다.
이핵-단핵 교배법은 꺽쇠 연결을 통해 이핵 균사에 있는 두 개의 핵 중에 하나가 단핵 균사의 세포 내로 그대로 이동하기 때문에 모균주의 특정한 형질을 가진 새로운 균주의 육종에 유용한 방법이며, 표본 전부의 단핵을 얻지 못한 경우에 유용하게 사용된다. 감자한천배지로 조성된 평판 배지에 이핵 균사와 또 다른 균주의 단핵 균사를 서로 대치시키고 23℃에서 15일간 배양하여 이핵 균사체가 단핵 균사와 충돌 후, 이핵 균사의 균사체가 단핵 균사 쪽을 침범하고 성장이 지속되도록 하여 교배가 이루어지도록 하여 균사를 확보하였다.
균사의 교배 여부는 균사체를 재배양 한 후 균사체의 생장 특성을 보고 판단하였다.
상기 단핵-단핵 교배법 및 이핵-단핵 교배법으로 각각 50개씩 총 300개의 균사를 확보하고, 확보한 균사를 감자한천배지로 조성된 평판 배지 상에서 23℃에서 50일간 배양하여 교배가 이루어진 5개의 이핵 균사(단핵-단핵 교배법에서 3개, 이핵-단핵 교배법에서 2개의 균사)를 확보하였다.
실시예 1-2. 모균주와의 특성 비교
1) 균사체의 생장 특성 비교
상기 실시예 1-1에서 확보한 5개의 이핵 균사를 배양하면서 균사의 생장속도, 형상 및 노화 속도를 관찰한 결과, 곰팡이와 잡균에 강하고, 균사가 굵고, 성장이 빠르며, 적정 배양 일수를 2배 이상 초과하더라도 갈변이 되지 않은 본 발명의 목적에 가장 근접한 균사 1개를 최종적으로 선별하였다. 선별한 균사가 30회의 계대 배양을 반복한 후에도 균사체의 특성이 변하지 않는 것을 확인하였으며, 이를 세리포리아 라세라타-K1(Ceriporia lacerata-K1; CL-K1)으로 명명하였고, 모균주와 CL-K1의 균사체 생장을 비교한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보듯이, CL-K1 균주의 경우, 상기 실시예 1-1에서 사용한 6종의 모균주와 비교 배양시 균사 성장 단계에서 부상 균주가 나타나지 않았고, 균사체가 굵고 조밀하며, 배양 기간이 짧은 것을 확인하였다(도 1(A) 및 1(B)). 또한, 조기 노화 현상(갈변 및 노랑물 형성)이 발생하지 않으며, CL-K1의 모균주인 CL-KU과 달리 적정 배양 일수를 2배 이상 초과하더라도 갈변이 되지 않는 것을 확인하였다(도 1(B)).
또한, CL-K1와 이의 모균주를 5회 비교 배양하여 CL-K1의 생장속도 및 노화 속도를 확인하였고, 배양시 잡균의 오염 정도를 비교 확인하였다. 생장 속도의 측정은 고체 배지 및 액체 배지에서 각각 수행하였다. 고체 배지의 경우에는 각각의 균주를 감자한천배지로 조성된 직경 86㎜ 배지 상에서 23℃에서 10일간 배양한 후 방사상으로 뻗어나간 정도를 미터법으로 측정하였고, 액체 배지의 경우에는 정제수 98%, 수크로스 1%, 글루코스 0.3%, 전분 0.2%, 대두분말 0.5%가 포함된 배지에서 23℃에서 배양한 후, 배양 7일 차에 균사체의 밀도(중량, g)를 측정하여 산출하였다.
노화 속도 측정은 감자한천배지로 조성된 직경 86㎜ 배지 상에서 23℃로 연속 배양 후 갈변 또는 목질화가 최초로 발생한 날을 비교하여 산출하였다.
균주 배양시 잡균의 오염률은 20개의 자실체 재배용 톱밥배지에 CL-K1 및 이의 모균주를 각각 20개씩 접종한 후, 표고버섯 봉지 배지 재배사에서 90일간 배양하여 잡균에 영향을 받지 않고 성장한 자실체 수를 비교하여 산출하였다.
그 결과, 본 발명의 신규한 CL-K1 균주의 균사체 생장 속도가 모균주에 비해 30% 이상 향상되었으며, 노화 속도가 2배 이상 느리다는 것을 확인하였다. 또한, 신규한 CL-K1 균주의 경우, 모균주에 비해 재배 시 잡균에 오염된 자실체의 수가 적고 정품의 생산량이 증가하는 것을 확인함으로써 잡균에 의한 오염에 강하다는 것을 확인하였다.
2) 균사체 배양물 성분 및 함량 비교
상기 실시예 1-2에서 확보한 신규한 CL-Kl 균주 및 상기 실시예 1-1의 모균주로 이용한 6개의 균주 80㎖를 각각 5ℓ용 생물배양기 상에서 4ℓ 증류수에 수크로스 80g, 글루코스 40g, 탈지대두분말 30g이 포함된 액체 배지에 접종하고, pH 5.0~6.0, 공기량 0.2vvm, 교반 속도 75rpm, 온도 23℃를 유지하면서 10일간 배양하면서 균사체의 생장, 균사체량, 세포외 다당체(exopolysaccharide, EPS), β-글루칸, 5-디하이드로에르고스테롤(5-dihydroergosterol) 및 DMC(2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcone) 함량 등을 분석하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
상기 균사체량은 3ℓ의 배양액을 진공여과기를 이용해 수분을 제거한 후, 총 무게를 측정하여 분석하였다.
상기 세포외 다당체의 함량을 분석하기 위해서 배양액 동결건조물 20g을 400㎖ 증류수와 혼합하고 15,000rpm으로 20분간 원심 분리하여 상등액을 분리하였다. 분리한 상등액에 상등액의 4배에 해당되는 부피의 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)을 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 방치한 후, 15,000rpm으로 20분간 원심 분리하여 침전물을 회수하였다. 회수한 침전물을 동결 건조하여 크루드한(crude) 세포외 다당체의 무게를 측정하였다.
상기 β-글루칸의 함량 분석은 배양액 동결건조물 20g을 이용하여 건강기능식품 공전의 시험방법에 의거하여 실시하였고, 함량 계산은 하기 식 1의 공식에 따라 산출하였다.
[식 1]
β-글루칸 함량(㎎/g) = C×a/S×10×1/1,000×0.9
이때, C는 시험 용액중의 글루코스 농도(㎍/㎖)이고, a는 시험용액의 전량(㎖), 10은 희석배수, S는 시료 채취량(g), 1/1,000은 단위 환산 계수이며, 0.9는 β-글루칸 전환 계수(162/180)이다.
상기 5-디하이드로에르고스테롤 또는 DMC의 함량 분석을 위해서 배양액 동결건조물 5g에 에틸아세테이트 400㎖을 첨가하여 30℃에서 2시간 동안 초음파 처리하여 분획 후, 1㎛의 구멍이 있는 여과지를 이용하여 여과한 여액을 감압 농축하여 농축물을 확보하였다. 확보한 농축물을 메탄올로 녹여 10㎖이 되도록 한 후, 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC)(YL9100 Plus HPLC system)를 이용하여 5-디하이드로에르고스테롤 또는 DMC의 함량을 각각 분석하였다.
균주 생장 정체 시작일 생장 정체 시작일의 균사체량 (g/ℓ) β-글루칸 (㎎/g) 5-디하이드로에르고스테롤 (㎍/g) DMC (㎍/g) 세포외 다당체 (%/g)
KACC-43351 11 13.62 26.86 - - 41.23
KACC-43352 9 13.44 27.32 - - 39.48
CL-KU 6.5 15.78 39.11 - 5.32 47.35
CL-KS 10 13.15 25.74 - - 40.16
CL-C 9 14.37 38.74 - - 42.33
CL-J 9 14.54 28.05 - 2.12 46.72
CL-K1 7 14.96 42.48 12.92 39.87 51.90
상기 표 1에서 보듯이, CL-K1 균주의 경우, 생장 정체 시작일이 7일로, 모균주의 균주들에 비해 생장 속도가 빠른 것을 확인하였고, 이러한 빠른 생장 속도는 배양 기간 동안에 잡균에 의한 오염 가능성을 줄일 수 있음을 시사한다.
또한, CL-K1 균사체 배양물 내의 세포외 다당체 및 β-글루칸의 함량이 모균주 균사체인 CL-KU 및 CL-KS의 배양물 내 평균 함량과 대비하여 세포외 다당체는 19%, β-글루칸은 31% 정도 증가한 것을 확인하였다.
한편, CL-K1 균사체 배양물에는 모균주 배양 시 생성되지 않았던 유효성분인 5-디하이드로에르고스테롤이 생성되는 것을 확인하였으며, 신규한 CL-K1 균주의 배양물 내 5-디하이드로에르고스테롤이 생성되는 원인을 확인하기 위해 CL-K1 균주로부터 유도한 자실체 2㎏을 세절하여 분말화 한 후, 메탄올 5ℓ를 가하여 50℃에서 1시간 동안 온침하여 여과하고, 다시 50℃로 감압 농축하였다. 농축으로 얻어진 조추출물을 1.5ℓ 증류수에 현탁하고, 헥산 1.5ℓ를 가하여 분획하는 것을 2회 반복하여 수득한 분획물을 상기 5-디하이드로에르고스테롤 함량 분석 방법과 동일한 방법으로 분석한 결과, CL-K1 유래 자실체에도 21.87㎍/g의 5-디하이드로에르고스테롤이 생성됨을 확인하였다.
또 다른 유효성분인 DMC의 경우에는 모균주인 CL-KU 균사체 배양물에는 5.32㎍/g 정도 함유되어 있는 반면에, CL-K1 균사체 배양물에는 약 39.87㎍/g이 함유되어 있는 것을 확인하였고, 이는, CL-K1의 모균주 균사체인 CL-KU 및 CL-KS의 배양물 내 DMC 평균 함량과 대비하여 약 15배 정도 생성량이 증가한 것이다. 또한, 상기의 5-디하이드로에르고스테롤의 자실체 내 함량을 확인한 방법과 동일한 방법으로 자실체 내의 DMC 함량을 확인한 결과 6.21㎍/g 정도가 함유되어 있는 것을 확인하였다.
따라서 상기 CL-K1의 DMC 생성량의 경우, 모균주 각각에 대비하여 약 6~40배 정도 증가하는 것을 확인하였다.
상기 균사체 배양물과 자실체 내의 세포외 다당체, β-글루칸, 5-디하이드로에르고스테롤 및 DMC의 함량은 자실체 유도 시보다 균사체 배양시 그 함량이 증가됨을 확인하였다.
또한, 상기 신규한 CL-K1 균주의 배양 시, 액체 배지에 Ca, P, Na, K, Cl, Cu, I, Mn, Co, F, Mo, Se, Cr, Si, V, Sn 등으로 조성된 미네랄 복합제가 액체 배지 대비 0.01%가 함유된 경우, 상기와 같은 동일한 배양 조건으로 배양하면 5-디하이드로에르코스테롤의 함량이 903.7㎍/g으로, 상기 표 1의 12.92㎍/g에 비해 약 70배 정도가 증가되는 것을 확인하였다.
한편, 상기 5-디하이드로에르고스테롤이 함유되어 있다고 알려진 잔나비걸상버섯의 균주와 본 발명의 신규한 CL-K1 균주를 배양한 배양물의 5-디하이드로에르고스테롤 함량을 확인한 결과, 잔나비걸상버섯 균주의 배양물에는 21㎍/g이 함유되어 있는 반면에, 신규한 CL-K1 균주의 배양물에는 903.7㎍/g이 함유되어 있어, 본 발명의 신규한 CL-K1이 현저히 많은 5-디하이드로에르고스테롤을 생성함을 확인하였다.
3) 신규한 세리포리아 라세라타 -K1의 자실체 유도 및 비교
상기 실시예 1-2에서 확보한 신규한 CL-Kl 균주를 이용하여 자실체를 유도하였다.
자실체 유도 시, 병 재배 방법과 소나무 톱밥을 이용하였으나 자실체를 유도할 수 없었으며, 탄소원 대비 질소원을 과량 공급할 경우에도 자실체 유도가 거의 이루어지지 않았다. 따라서 참나무 톱밥과 탄소원 위주로 배지를 구성한 후 봉지 재배를 통해 자실체를 획득하였다. 배지는 참나무 톱밥 1㎏, 옥수수 분말 150g, 대두분말 50g, 포도당 100g에 물 100㎖을 넣고 함수율을 65%가 되도록 하였다. 비닐봉지에 상기 배지를 넣은 후, 봉지를 묶고 접종구로 10구를 천공한 다음 살균기에서 121℃로 1시간 동안 살균한 후, 무균작업대에서 24시간 동안 자연 냉각하여 23℃까지 냉각시키고, 천공한 1구 당 5㎖의 CL-K1 균주를 접종하였다. 접종 후 23℃, 습도 65%를 유지시키면서 이산화탄소량은 500~1,200ppm 사이에서 변화를 주며 배양하여 자실체를 유도하였다. 그 결과 배양 35일째에 자실체가 핀을 형성하였고, 90일째에 도 2의 자실체 성체를 획득하였다.
도 2에서 보듯이, CL-K1의 자실체는 짙은 황색을 나타내는 것을 확인하였고, 이는 CL-K1의 모균주인 CL-KU의 황적색 자실체 또는 CL-KS의 홍백색 자실체와 차이가 있음을 알 수 있었다.
4) 유전자 분석을 통한 신규 균주 동정
상기 실시예 1-2의 신규한 CL-K1 균주와 이의 모균주인 CL-KS 및 CL-KU 균주를 한국미생물보존센터(Korea culture center of microorganisms, KCCM)에 보내 동정을 의뢰한 결과, DNA 상에서 모균주와 유전적 차이가 있음을 확인하였고, 도 3의 분자진화학적 관계도에서도 기존의 균주와 차이가 있음을 확인함으로써, 본 발명의 CL-K1이 신규 균종임을 확인하였다.
또한, 상기 신규한 CL-K1 균주를 30회의 계대를 실시한 결과, 신규한 CL-K1 균주의 특성이 변하지 않아 돌연변이 품종도 아님을 추가적으로 확인하였다.
따라서 상기에서 교배 육종한 신규한 균주를 세리포리아 라세라타-K1(Ceriporia lacerata-K1)으로, 이의 자실체의 한국명을 "불로장수구멍버섯"으로 최종 명명하였고, 국립농업과학원 미생물은행에 2018년 5월 18일자로 수탁번호 KACC 83018BP로 기탁하였다.
< 실시예 2. 신규한 세리포리아 라세라타 -K1 균주의 대량 생산을 위한 균사체 최적 배양 방법 확인>
일반적으로 버섯 균사체의 기능성 성분을 활용한 제품을 양산하기 위해서는 균사체 액체 배양법으로 생산한 배양물을 활용하는 것이 가장 효과적이다. 그러나 버섯 균사체는 배지 조성, 배양 조건에 따라 그 배양 특성이 달라질 수 있어, 균사체의 액체 배양 효율을 증진시키기 위해서는 적합한 배양 조건이 확립되어야 한다.
이에, 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주의 최적의 배양 조건을 확인하기 위해 배지 조건 및 배양 조건에 따른 배양액 내의 균사체 및 세포외 다당체의 함량을 확인하였다.
실시예 2-1. 배양 배지 조건 확인
1) 탄소원에 따른 균사체 양 및 세포외 다당체 생성량 확인
본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1(CL-K1) 균주 배양시, 탄소원에 따른 균사체 생장능을 비교하기 위해 5ℓ의 생물 배양기 상에서 증류수 4ℓ에 탈지대두분말 30g이 포함되어 있는 배지를 기본배지 조성으로 하고, 하기 표 2의 탄소원을 각각 120g씩 혼합하여 멸균 후, 종균 80㎖을 접종하고, pH 5.0~6.0, 공기량 0.2vvm, 교반 속도 75rpm, 온도 23℃를 유지하면서 10일간 배양하여 균사체량과 세포외 다당체의 함량을 측정하였다. 측정방법은 상기 실시예 1-2의 2) 균사체 배양물 성분 및 함량 비교에 기재된 방법과 동일한 방법으로 실시하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
탄소원 분석 항목
균사체(g/ℓ) 세포외 다당체(g/ℓ)
락토스(lactose) 1.3 0.44
수크로스(sucrose) 1.5 0.55
글루코스(glucose) 2.1 0.78
프룩토스(fructose) 1.4 0.50
갈락토스(galactose) 1.3 0.43
2) 질소원에 따른 균사체 양 및 세포외 다당체 생성량 확인
본 발명의 신규한 CL-K1 균주의 질소원에 따른 균사체 생장능을 비교하기 위해 5ℓ의 생물 배양기 상에서 증류수 4ℓ에 수크로스 80g, 글루코스 40g이 포함되어 있는 배지를 기본배지 조성으로 하고, 하기 표 3의 질소원을 각각 30g씩 혼합하여 멸균 후, 종균 80㎖을 접종하고, pH 5.0~6.0, 공기량 0.2vvm, 교반 속도 75rpm, 온도 23℃를 유지하면서 10일간 배양하여 균사체량과 세포외 다당체의 함량을 측정하였다. 측정방법은 상기 실시예 1-2의 2) 균사체 배양물 성분 및 함량 비교에 기재된 방법과 동일한 방법으로 실시하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
질소원 분석 항목
균사체(g/ℓ) 세포외 다당체(g/ℓ)
트립톤(tryptone) 1.72 0.83
효모 추출물(yeast extract) 1.70 0.87
대두분말(soy flour) 1.95 0.90
L-글루탐산(L-glutamic acid) 1.55 0.84
펩톤(peptone) 1.62 0.80
맥아 추출물(malt extract) 1.59 0.82
암모늄(ammonium) 1.56 0.65
3) 미량원소에 따른 균사체 양 및 세포외 다당체 생성량 확인
본 발명의 신규한 CL-K1의 미량원소에 따른 균사체 성장능을 비교하기 위해 5ℓ의 생물 배양기 상에서 증류수 4ℓ에 수크로스 80g, 글루코스 40g, 탈지대두분말 30g이 포함되어 있는 배지를 기본배지 조성으로 하고, 하기 표 4의 미량원소를 각각 0.5g씩 혼합하여 멸균 후, 종균 80㎖을 접종하고, pH 5.0~6.0, 공기량 0.2vvm, 교반 속도 75rpm, 온도 23℃를 유지하면서 10일간 배양하여 균사체량과 세포외 다당체의 함량을 측정하였다. 측정방법은 상기 실시예 1-2의 2) 균사체 배양물 성분 및 함량 비교에 기재된 방법과 동일한 방법으로 실시하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
미량원소 분석 항목
균사체(g/ℓ) 세포외 다당체(g/ℓ)
KH2PO4 7.0 0.98
ZnSO4 8.3 1.54
MgSO4 9.0 1.62
CuSO4 12.0 1.35
FeSO4 10.5 1.22
CaCl2 8.5 0.95
상기 표 2 내지 표 4의 결과를 바탕으로, 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1(CL-K1) 균주가 가장 잘 성장할 수 있는 조건이 수크로스 2%(w/v), 글루코스 1%(w/v), 대두분말 0.75%(w/v), KH2PO4 0.02%(w/v), MgSO4 0.015%(w/v), pH 5.5임을 확인하였다.
실시예 2-2. 배양 조건 확인
1) 배양기의 교반 속도에 따른 배양 조건 확인
본 발명의 신규한 CL-K1 균주의 최적의 배양 조건을 확인하기 위해 상기 실시예 2-1에서 확인된 수크로스 2%(w/v), 글루코스 1%(w/v), 대두분말 0.75%(w/v), KH2PO4 0.02%(w/v), MgSO4 0.015%, pH 5.5인 배지에 CL-K1 균주를 접종하고, 공기량은 0.2vvm으로 유지하면서 23℃에서 10일간 배양하였다. 이때, 배양기의 교반 속도를 하기 표 5의 교반 속도를 유지하면서 각각 배양하고, 균사의 생장 및 균사체량, 배양액에 포함되어 있는 세포외 다당체 및 β-글루칸 함량 등을 상기 실시예 1-2의 2) 균사체 배양물의 성분 및 함량 비교에 기재된 방법과 동일한 방법으로 분석하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
교반 속도(rpm) 분석 항목
생육 정체기(일) 균사체(g/ℓ) 건조물의 양(g/ℓ) 세포외 다당체(%/g) β-글루칸 (㎎/g)
0 4 4.7 15.9 26.42 14.33
25 5 6.7 26.5 43.78 38.21
50 7 7.9 34.9 51.92 42.41
75 9 8.8 30.2 42.01 39.46
100 10 8.5 27.0 38.97 38.57
125 8 8.3 25.7 29.95 32.28
150 5 5.9 12.8 26.72 28.62
상기 표 5에서 보듯이, CL-K1 균사는 25rpm 미만의 낮은 교반 속도에서 배양한 경우에는 균사체의 양, 건조물의 양, 세포외 다당체 및 β-글루칸의 함량이 낮은 반면에, 25~125rpm의 교반 속도로 배양한 경우에는 균사체의 양, 세포외 다당체 및 β-글루칸의 함량이 높아지는 것을 확인하였다. 한편, 150rpm의 높은 교반 속도에서는 균사체의 양, 세포외 다당체 및 β-글루칸의 양이 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 나아가, 25rpm의 낮은 교반 속도에서 생육 정체 시기가 빠르게 나타났지만, 배양 기간 대비 균사체의 양, 건조물의 양, 건조물에 포함되어 있는 세포외 다당체 및 β-글루칸의 함량이 높게 조사되었으며, 50~125rpm의 교반 속도에서는 생육 정체 시점이 7일 이상으로 배양 후기까지 지속되는 경향을 보이지만, 배양 기간을 고려한 경우 낮은 교반 속도에 비해 효율성이 낮음을 확인하였다.
따라서 교반기의 날개 면적과 날개의 수가 동일한 조건이라면 초기에는 낮은 교반 속도로 시작하여 점차 교반 속도를 높이는 경우에 균사체의 배양성이 향상됨을 알 수 있었다.
2) 공기 공급량(aeration)에 따른 배양 조건 확인
상기 1) 배양기의 교반속도에 따른 배양 조건 확인과 동일한 방법으로 본 발명의 신규한 CL-K1 균주를 배양하였다. 이때, 배양 조건으로 교반 속도는 75rpm으로 하고, 하기 표 6의 공기 공급량으로 배양 초기부터 완료 시점까지 유지하면서 배양하면서 균사의 생장 및 균사체량, 배양액에 포함되어 있는 세포외 다당체 및 β-글루칸 함량 등을 분석하여 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
공기 공급량 (vvm) 분석 항목
생육 정체기 (일) 균사체(g/ℓ) 건조물의 양(g/ℓ) 세포외 다당체(%/g) β-글루칸 (㎎/g)
0 2 1.9 5.4 1.12 5.2
0.02 10 8.6 30.8 4.89 28.8
0.05 10 8.5 31.1 5.02 29.1
0.1 10 8.5 30.9 5.01 39.0
0.2 10 8.6 31.4 5.10 42.1
0.5 10 8.4 30.6 4.98 39.4
1 9 8.4 30.8 5.01 28.1
2 3 3.7 8.9 1.89 9.5
상기 표 6에서 보듯이, CL-K1 균주는 공기가 공급되지 않은 경우에는 배양이 이루어지지 않았으며, 공기 공급량이 0.02~1vvm까지는 생육 정체기 및 균사체량, 건조물, 세포외 다당체의 양은 비슷하고, β-글루칸 함량의 경우에는 28.1~42.1㎎/g 정도를 함유하고 있는 것을 확인하였으며, 공기 공급량이 0.1~0.5vvm의 경우에는 공기 공급량에 따른 β-글루칸의 함량에도 큰 차이가 나타나지 않았다. 반면에, 공기 공급량이 2vvm 이상일 경우에는 균사체의 양, 세포외 다당체 및 β-글루칸의 함량이 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 이에 따라, 교반형 생물반응기에서 적정 공기 공급량이 0.02~1vvm이며, 더 바람직하게는 0.1~0.5vvm이며, 가장 바람직하게는 0.2vvm임을 알 수 있었다.
3) 용존 산소량(dissolved oxygen, DO)에 따른 배양 조건 확인
상기 1) 배양기의 교반 속도에 따른 배양 조건 확인과 동일한 방법으로 본 발명의 신규한 CL-K1 균주를 배양하였다. 이때, 배양 조건으로 교반 속도는 75rpm으로 하고, 공기 공급량은 0.2vvm으로 배양하면서 하기 표 7의 용존 산소량에 따른 균사의 생장 및 균사체량, 배양액에 포함되어 있는 세포외 다당체 및 β-글루칸 함량 등을 분석하여 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
용존 산소량(%) 분석 항목
생육 정체기(일) 균사체 (g/ℓ) 건조물의 양(g/ℓ) 세포외 다당체(㎎/g) β-글루칸 (㎎/g)
5 11 12.5 39.2 6.90 39.2
10 9 12.6 40.1 7.14 39.5
20 7 15.3 45.5 8.45 46.2
30 7 13.5 41.0 7.44 42.1
40 7 13.3 41.2 7.25 40.2
50 6 8.8 30.2 5.24 31.1
70 6 6.5 25.3 4.10 23.1
상기 표 7에서 보듯이, 용존 산소량이 20%일 경우에 균사체의 양, 세포외 다당체 및 β-글루칸의 함량이 가장 높은 것을 확인하였다. 상기 실시예 2-1 및 실시예 2-2의 결과를 통해, 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1(CL-K1) 균주의 바람직한 배양 조건이, 배양 용액 대비 접종용 균수는 2~4%, 배지는 수크로스 1.5~3%(w/v), 글루코스 0.5~1.5%(w/v), 대두분말 0.2~0.5%(w/v), KH2PO4 0.01~0.20%(w/v), MgSO4 0.005~0.01%, pH는 5.0~5.5이고, 배양 조건은 0.1~0.5vvm의 공기를 생물 반응기 내부로 공급하고, 교반 속도는 25~100rpm, 온도는 22~25℃임을 알 수 있었다. 또한, 미네랄 성분을 선택적으로 첨가할 경우, 배양물 내 유효성분인 5-디하이드로에르고스테롤의 함량이 큰 폭으로 증가되며, 배양 기간은 배양액 속에 용해되어 있는 탄소원 소비량이 급격히 감소하는 최초 시점인 만 7일 동안 배양하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 3. 신규한 세리포리아 라세라타 -K1 균사체 배양물의 성분 분석>
상기 실시예 2에서 확인된 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주의 최적의 배양 조건으로 배양한 배양물에 포함되어 있는 균사체 배양물의 지표 성분인 β-글루칸, 세포외 다당체, 단백질 및 5-디하이드로에르고스테롤에 대한 특성 및 함량을 분석하였다.
실시예 3-1. β-글루칸 함량 분석
CL-K1 균사체 배양물의 β-글루칸 함량은 상기 실시예 1-2의 2) 균사체 배양물의 성분 및 함량 비교에 기재된 방법과 동일한 방법으로 확인하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
배양물 β-글루칸 함량 (㎎/g)
CL-K1 균주
#1 #2 #3
1차 42.25 41.72 43.46
2차 42.12 41.91 41.87
3차 43.01 42.89 43.11
평균 42.46 42.17 42.81
전체 평균 42.48
상기 표 8에서 보듯이, CL-K1 균사체 배양물에는 β-글루칸이 평균적으로 42㎎/g 이상이 함유되어 있는 것을 확인하였다.
실시예 3-2. 다당체, 단백질 및 5- 디하이드로에르고스테롤 함량 분석
상기의 최적의 배양 방법으로 배양한 CL-K1 균사체 및 배양물에 있어서, 다당체, 단백질 및 유효성분인 5-디하이드로에르고스테롤의 함량을 분석하였다. 이때, CL-K1 균사체 배양액 100㎖을 진공여과기를 이용해 균사체와 배양액으로 분리하여 시료로 이용하였다.
균사체 및 배양물의 다당체의 당 함량은 페놀-황산법(phenol-sulfuric acid)을 이용하여 분석하였다. 상기의 균사체 및 배양액 시료를 여러 농도별로 희석한 시료 1㎖에 80% 페놀 25㎖을 첨가한 후, 98% 황산 2.5㎖을 첨가하고 30분 동안 실온에서 냉각하고 465㎚에서 흡광도를 측정하여 계산하였고, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
단백질 함량은 표준물질로 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 이용하였고, BCA(bicinchoninic acid) 방법을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
5-디하이드로에르고스테롤 함량은 상기 실시예 1-2의 2) 균사체 배양물의 성분 및 함량 비교에 기재된 방법과 동일한 방법으로 확인하였고, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
분석 항목
수율(%) 총 다당체(%) 총 단백질(%) 5-디하이드로에르고스테롤(㎍/g, 건조물)
배양액 1.22 58.49 24.17 4.6
균사체 0.28 35.32 33.50 7.9
상기 표 9에서 보듯이, 신규한 CL-K1 균주의 최적의 배양 방법으로 배양한 배양물의 성분을 확인한 결과, 다당체 함량은 배양액이 높고, 단백질 및 5-디하이드로에르고스테롤의 함량은 균사체 내 함량이 높은 것을 확인하였다. 다당체 함량에 있어서 배양액이 균사체 보다 높게 나타나는 것은 배양시 균사체의 영양원으로 이용되는 탄소원 속에는 많은 양의 다당체가 함유되어 있고, 배양액에는 균사체에 의해 생성된 다당체 외에도 배양원으로 이용되는 소모되지 않은 다당체가 그대로 존재하기 때문으로 예측된다. 따라서 상기 표 9의 결과를 통해, 균사체가 가진 고유의 특성을 확인하였으며, 균사체 배양물을 이용하여 식품이나 의약품의 소재를 개발하기 위해서는 배지 조성과 배양 환경의 최적화를 찾기에 앞서 우량한 균주의 확보가 가장 중요하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3-3. 세포외 다당체의 분자량 측정
상기의 최적의 배양 방법으로 배양한 배양물로부터 상기 실시예 1-2의 2) 균사체 배양물의 성분 및 함량 비교에 기재된 방법으로 세포외 다당체를 분리하고, 분리한 세포외 다당체를 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC)를 이용하여 분자량을 측정하였다.
분리된 세포외 다당체를 0.1M Na2SO4 및 0.05M NaN3으로 이루어진 용액에 1%(w/v)가 되도록 녹인 다음, 원심 분리하여 얻은 상층액을 0.45㎛ 주사기 필터(syringe filter)로 여과하여 분석에 이용하였다.
분석 조건은 검출기로 굴절지수(refraction index, RI)를 이용하였으며, GPC는 OHpak SB 805 HQ(Shodex 사, 일본)를 이용하여, 0.1M Na2SO4 및 0.05M NaN3으로 이루어진 용액을 이동상으로 하고 유속은 1.0㎖/분의 속도로 흘려주었다. 이때, 표준곡선은 각각 다른 분자량(130, 400, 770, 1,200kDa)을 가진 덱스트란을 이용하여 상기 CL-K1 균사체 배양물에 포함된 세포외 다당체의 분자량을 분석하였다.
분석 결과, CL-K1 균사체 배양물에 포함되어 있는 세포외 다당체의 분자량이 모균주 균사체 배양물의 세포외 다당체에 비해 약간 높은 분자량인 126kDa 정도인 것으로 확인되었다.
< 실시예 4. 신규한 세리포리아 라세라타 -K1 균사체 배양물의 항당뇨 효과 확인>
본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1(CL-K1) 균사체 배양물의 항당뇨 효과를 확인하였고, 이때, 항당뇨 효과를 확인하기 위해 렙틴(leptin) 수용체의 돌연변이로 인해 제2형 당뇨병의 임상적 특징을 나타내는 db/db 마우스를 이용하였다.
체중 35~40g, 혈당 150㎎/㎗ 전 후의 7주령 수컷 db/db 마우스를 중앙실험동물(주)를 통해 공급받았으며, 3일 동안의 적응기간을 거친 후, 체중과 혈당을 측정하여 체중과 혈당 수치가 비슷한, 실험에 적합한 마우스를 선별하여 당뇨군과 시료 처리군으로 분류하였다. 이때, 식욕을 조절하는 렙틴 수용체가 정상인 마우스를 정상군으로 이용하였다. 먹이는 시판용 실험동물 사료를 혈당 유지가 가능하도록 1일 5g으로 제한하여 제공하였고, 물은 자유로이 섭취할 수 있도록 하였다. 항당뇨 효과를 확인하기 위해, 정상군을 제외한 나머지 군에 40% 포도당을 2g/㎏이 되도록 경구투여 하였고, 시료 처리군에는 상기 실시예 2에서 확인된 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균사체의 최적의 배양 방법으로 배양한 배양물(CL-K1 처리군)과 상기 실시예 1-1의 CL-KU 균사체 배양물(CL-KU 처리군)을 각각 300㎎/㎏씩 1일 1회로 동일한 시간에 경구 투여하였다. 또한, 양성대조군으로 혈당강하제인 메트포르민(metformin, MET) 300㎎/㎏을 상기 시료 처리와 동일한 방법으로 처리하였고, 혈당 변화를 측정하기 위해 12시간 공복 시 혈당을 혈당측정기(아큐첵 Guide, 한국)를 사용하여 3일 간격으로 매 1회 측정하였다. 하기 표 10에는 혈당 측정 결과를 나타내었고, 도 4에는 0일차의 혈당을 100%로 하고, 각 일차별 혈당 증가율을 비교한 결과를 보여주고 있다.
시험군 혈당량
0일차 3일차 6일차 9일차 12일차 15일차
정상군 151 151 150 152 149 153
당뇨군 150 170 200 216 237 250
CL-KU 처리군 151 158 168 185 200 230
CL-K1 처리군 151 155 160 178 189 198
MET(양성대조군) 150 157 165 170 183 192
상기 표 10 및 도 4에서 보듯이, 시료 처리 전에는 모든 그룹간의 혈당 수치가 150㎎/㎗ 전, 후로 비슷한 수준을 나타내지만, 포도당만을 투여한 당뇨군의 경우에는 혈당 수치가 급격히 증가하고, 이러한 혈당 증가가 지속되는 것을 확인하였다. 반면에, CL-KU 처리군, CL-K1 처리군 및 메트포르민을 처리한 양성대조군의 경우에는 포도당을 투여하더라도 혈당 수치가 당뇨군에 비해 낮게 나타났으며, 특히나 CL-K1 처리군의 경우에는 양성대조군과 유사한 정도의 낮은 혈당 수치를 보여주었다. 추가적으로, CL-K1을 지속적으로 꾸준히 투여한 경우에는 혈당 수치가 더 이상 증가하지 않고 일정하게 유지되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 신규한 세리포리아 라세라타-K1(CL-K1) 균사체 배양물이 지속적으로 당뇨병의 진행을 차단하여 당뇨병을 개선 또는 치료함으로써, 우수한 항당뇨 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
< 제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
본 발명의 CL-K1 균사체 배양물 200g을 락토즈 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄하여 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
제제예 1-2. 주사액제의 제조
본 발명의 CL-K1 균사체 배양물 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
< 제제예 2. 건강기능식품의 제조>
제제예 2-1. 건강기능식품의 제조
본 발명의 CL-K1 균사체 배양물 20g, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산 마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8㎎을 섞어 과립으로 제조하였으나, 용도에 따라 다양한 제형으로 변형시켜 제조할 수 있다. 또한, 상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 제조할 수 있다.
제제예 2-2. 건강기능성 음료의 제조
본 발명의 CL-K1 균사체 배양물 3g, 구연산 0.1g, 프락토올리고당 30g, 정제수 300㎖을 섞어 통상의 음료 제조방법에 따라 교반, 가열, 여과, 살균, 냉장하여 음료를 제조하였다.
Figure PCTKR2019008376-appb-I000001

Claims (9)

  1. 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주(Ceriporia lacerata-K1, 수탁번호 KACC 83018BP).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주는 5-디하이드로에르고스테롤(5-dihydroergosterol)을 생산하는 것을 특징으로 하는 세리포리아 라세라타-K1 균주(Ceriporia lacerata-K1, 수탁번호 KACC 83018BP).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주는 DMC(2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcone) 생성량이 모균주 대비 6~40배 증가된 것을 특징으로 하는 세리포리아 라세라타-K1 균주(Ceriporia lacerata-K1, 수탁번호 KACC 83018BP).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주로부터 유래된 균사체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주로부터 유래된 자실체.
  6. 제4항의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주로부터 유래된 균사체 배양물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 균사체 배양물은 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주로부터 유래된 균사체를 액체 배양하여 얻은 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제4항의 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주로부터 유래된 균사체 배양물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 개선용 건강기능식품.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 균사체 배양물은 신규한 세리포리아 라세라타-K1 균주로부터 유래된 균사체를 액체 배양하여 얻은 것을 특징으로 하는 당뇨병 개선용 건강기능식품.
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