CN117015599A - 新型少孢根霉菌株及包含其的抗微生物组合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种以登录号KCCM12893P保藏的少孢根霉CJCC02‑20菌株及其应用。

Description

新型少孢根霉菌株及包含其的抗微生物组合物
技术领域
本申请涉及一种少孢根霉CJCC02-20菌株，其以登录号KCCM12893P保藏；一种抗微生物组合物，其包含选自由菌株、所述菌株的孢子、所述菌株的培养物、其浓缩物及其干燥产物组成的组中的任何一种或多种作为活性成分；一种食品组合物，其包含所述抗微生物组合物；一种饲料组合物；一种准药物组合物；一种保健功能性食品组合物；或一种用于预防或治疗由真菌、细菌或其组合引起的微生物感染性疾病的药物组合物，其包含所述抗微生物组合物。
背景技术
以传统方式制造的发酵食品在原料储存、制造和流通原材料的过程中总是容易受到真菌和食品中毒细菌的侵害。已知真菌和引起食品中毒的细菌即使在热处理之后也可以存活，导致食品变质和腐败或食品中毒。
为了防止变质和食品中毒细菌的生长，并且为了长期维持食品的品质，人们对抗微生物的物质进行了许多研究。在抗微生物的物质中，对尤其是安全性和经济可行性优异的天然防腐剂的研究的需求日益增加。
作为代表性的天然防腐剂，细菌素是指由微生物产生的天然抗微生物的蛋白质或基于蛋白质的材料。细菌素已被证明是安全的，因为它们是可以在人体内降解的蛋白质。这意味着，与现有抗生素的次级代谢物在人体内引起副作用形成对比，对细菌素的研究需求正在增加。关于细菌素，迄今为止主要对源自乳酸菌的细菌素进行研究。尽管源自乳酸菌的细菌素已被授予GRAS(“通常被认为是安全的”)称号，但由于它们的抗微生物活性范围仅特异于革兰氏阳性细菌，因此未得到广泛使用。
关于少孢根霉的抗微生物性质，抗生素肽(ABP)和亚油酸是由少孢根霉培养肉汤制得的抗微生物物质，已知它们控制属于葡萄球菌属和芽孢杆菌属的革兰氏阳性菌(Roubos-van den Hil等人,2010)。然而，仅报道了针对特定革兰氏阳性微生物的抗微生物活性，并且尚未报道对引起变质或食品中毒的各种菌株的作用。此外，少孢根霉是在发酵食品中可用的细菌，并且因此，当将细菌素应用于发酵食品时，它们可能不表现出针对引起变质的真菌和食品中毒细菌的特异性活性，并且因此难以将发酵食品工业化以进行制造和流通。
发明内容
技术问题
因此，本发明人进行了广泛的努力来开发一种用于抑制各种真菌和细菌，同时保持对人体无害的方法，并且因此，他们已经确认从豆豉(tempeh)分离的新型菌株少孢根霉CJCC02-20不仅具有针对真菌的抗微生物活性，而且还显示仅特异性抑制食品中的主要有害微生物(诸如食品中毒细菌)的抗微生物活性，从而完成了本申请。
技术方案
本申请涉及一种少孢根霉CJCC02-20菌株，其以登录号KCCM12893P保藏；一种抗微生物组合物，其包含选自由菌株、所述菌株的孢子、所述菌株的培养物、其浓缩物及其干燥产物组成的组中的任何一种或多种作为活性成分；一种食品组合物，其包含所述抗微生物组合物；一种饲料组合物；一种准药物组合物；一种保健功能性食品组合物；或一种用于预防或治疗由真菌、细菌或其组合引起的微生物感染性疾病的药物组合物，其包含所述抗微生物组合物。
本申请的一个目的是提供一种少孢根霉CJCC02-20菌株，其以登录号KCCM12893P保藏。
本申请的另一个目的是提供一种抗微生物组合物，其包含选自由以下组成的组中的任何一种或多种作为活性成分：少孢根霉CJCC02-20菌株、所述菌株的孢子、所述菌株的培养物、其浓缩物及其干燥产物。
本申请的又一个目的是提供一种食品组合物，其包含所述抗微生物组合物。
本申请的又一个目的是提供一种饲料组合物，其包含所述抗微生物组合物。
本申请的又一个目的是提供一种准药物组合物，其包含所述抗微生物组合物。
本申请的另一个目的是提供一种保健功能性食品组合物，其包含所述抗微生物组合物。
本申请的又一个目的是提供一种用于预防或治疗由真菌、细菌或其组合引起的微生物感染性疾病的药物组合物，其包含所述抗微生物组合物。
有益效果
根据本申请的包含少孢根霉CJCC02-20菌株的抗微生物组合物具有针对真菌和细菌的抗微生物活性，并且因此可以有效地用于食品、药品、准药物、保健功能性食品等。
附图说明
图1是使用纸盘测定测量少孢根霉CJCC02-20菌株针对米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)和大肠杆菌(Escherichia coli)的抗微生物活性的结果。
具体实施方式
在下文中，将详细地描述本申请。同时，本文所公开的每个解释和示例性实施方案都可以应用于其他解释和示例性实施方案。即，本文所公开的各种因素的所有组合都属于本申请的范围。此外，本申请的范围不应受下文所提供的具体公开的限制。
另外，本领域普通技术人员仅使用常规的实验就能够认识到或确认本文所述的本发明的特定方面的许多等同物。此外，这些等同物也旨在包括在本申请中。
为了实现上述目的，本申请的一个方面提供一种少孢根霉CJCC02-20菌株，其以登录号KCCM12893P保藏。
本发明人已经鉴定出一种属于少孢根霉的新型菌株，其对引起发酵食品变质和污染的真菌以及引起食品中毒的细菌具有优异的抗微生物活性，如下所述。
从传统豆豉中分离出了各种类型的少孢根霉，并且针对真菌(诸如霉菌和酵母)和食品中毒细菌进行测试，并且因此选择了抗微生物活性优异的少孢根霉，并且进行基因测序以鉴定所选菌株。所选菌株的18S rRNA核苷酸序列由SEQ ID NO:1表示，ABP(抗生素肽)基因序列由SEQ ID NO:2表示，并且几丁质酶(Chi2)基因序列由SEQ ID NO:3表示。基于基因分析，所述菌株被鉴定为少孢根霉(Rhizopus oligosporus)菌株，命名为少孢根霉CJCC02-20，并且根据布达佩斯条约于2020年12月9日保藏于国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，登录号为KCCM12893P。
根据本申请的一个实施方案，新分离的少孢根霉CJCC02-20对真菌和引起食品中毒的细菌具有优异的抗微生物活性，并且因此表现出可以同时作用于各种真菌和引起食品中毒的细菌的抗微生物活性(实施例3)。
真菌和细菌可以是属于曲霉属、芽孢杆菌属或埃希氏菌属的微生物，但不限于此。
在本申请的一个实施方案中，少孢根霉CJCC02-20可对米曲霉、黑曲霉(两者均为真菌)或其组合具有抗微生物活性，但真菌的类型不限于此。
在本申请的一实施方案中，少孢根霉CJCC02-20可具有针对蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、大肠杆菌或其组合的抗微生物活性，但细菌的类型不限于此。
在本申请的一个实施方案中，少孢根霉CJCC02-20可对米曲霉、黑曲霉或大肠杆菌具有特异性抗微生物活性，但不限于此。
已知米曲霉和黑曲霉是引起发酵食品变质和污染的菌株，并且已知蜡状芽孢杆菌和大肠杆菌是引起食品中毒的细菌，并且因此，可出于各种目的使用对那些微生物具有优异的抗微生物活性的少孢根霉CJCC02-20。
作为实现上述目的的另一方面，本申请提供一种组合物，其包含选自由新分离的少孢根霉CJCC02-20菌株、该菌株的孢子、该菌株的培养物、其浓缩物、其提取物及其干燥产物组成的组中的任何一种或多种以及载体。
具体地，载体可以是天然存在的载体或非天然存在的载体。
在本申请的一个实施方案中，干燥产物可以是冻干产物。
另外，组合物还可以包含冷冻保护剂。例如，组合物还可以包含至少一种选自甘油、海藻糖、麦芽糖糊精、脱脂奶粉和淀粉的冷冻保护剂。基于组合物的总重量，本申请的冷冻保护剂的含量可以为0.01重量％至20重量％和0.01重量％至10重量％。具体地，在组合物中，甘油的含量可以为5重量％至20重量％，海藻糖的含量可以为2重量％至10重量％，麦芽糖糊精的含量可以为2重量％至10重量％，脱脂奶粉的含量可以为0.5重量％至2重量％，并且淀粉的含量可以为0.1重量％至1重量％。
作为实现上述目的的又一方面，本申请提供一种抗微生物组合物，其包含选自由新分离的少孢根霉CJCC02-20菌株、该菌株的孢子、该菌株的培养物、其浓缩物、其提取物及其干燥产物中的任何一种或多种作为活性成分。
具体地，菌株可以处于液体状态或干燥状态，但不限于此。
抗微生物组合物可具有针对真菌、细菌或其组合的抗微生物活性，并且具体地，它可具有针对米曲霉、黑曲霉或大肠杆菌的特异性抗微生物活性，并且可具有针对蜡状芽孢杆菌的增强的抗微生物活性，但不限于此。
如本文所用，术语“孢子”是指细菌的生殖细胞等。出于本申请的目的，孢子意指少孢根霉CJCC02-20菌株的生殖细胞。
在本申请中，少孢根霉CJCC02-20的孢子对真菌和食品中毒细菌表现出抗微生物活性，并且因此可以通过包含在具有抗微生物活性的食品、饲料、药品、准药物和保健功能性食品中来使用。
如本文所用，术语“培养物”是指在培养菌株之后获得的产物，并且可以是含有细胞的未稀释的培养物，或者可以是培养的菌株或者通过去除或浓缩培养物上清液所获得的细胞。培养物的组合物不仅可以还包含常规培养少孢根霉所需的组分，还可以包含协同作用于少孢根霉的生长的组分，并且本领域普通技术人员可以容易地选择所得组合物。
如本文所用，术语“浓缩物”是指通过浓缩培养物获得的物质。
如本文所用，术语“提取物”是指通过从培养物或其浓缩物中提取而获得的物质，并且可以包括全部提取物、通过干燥提取物的稀释液或浓缩物而获得的干燥产物、以及提取物、或其粗产物或纯化产物、或通过将其分馏而获得的级分，只要它是可以对本申请的真菌和细菌表现出特定抗微生物作用的提取物即可。
如本文所用，术语“干燥产物”是指通过干燥培养物、其浓缩物、其提取物或其级分而获得的产物。干燥方法可以是风干、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥，但不限于此。
本申请的新分离的少孢根霉CJCC02-20可以经由培养少孢根霉菌株的常规方法进行培养，但方法不限于此。作为培养基，可以使用天然培养基或合成培养基。作为培养基的碳源，可以使用例如葡萄糖、蔗糖、糊精、甘油、淀粉等。作为氮源，可以使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、干酵母、大豆、铵盐、硝酸盐和其他有机或无机含氮化合物，但组分不限于此。作为培养基中包含的无机盐，可以使用镁、锰、钙、铁、钾等，但无机盐不限于此。除碳源、氮源和无机盐组分之外，还可以将氨基酸、维生素、核酸和相关化合物添加到培养基中。
抗微生物组合物可以包含在培养少孢根霉CJCC02-20的过程中产生的其他副产物。
作为实现上述目的的又一方面，本申请提供一种食品组合物，其包含所述抗微生物组合物。
食品的类型没有特别限制，并且其可以包括一般意义上的所有食品。可以添加上述材料的食品的非限制性实例包括：包括韩式酱的发酵食品以及咸鱼、肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、蜜饯、比萨饼、方便面、其他面条、口香糖、包括冰淇淋的乳制品、各类汤、饮品、茶、饮料、酒精饮料、复合维生素等。当将组合物用作食品添加剂时，组合物可以按照原状添加或与其他组分一起使用，并且可以根据常规方法适当地使用。
具体地，食品组合物可以是发酵食品，并且具体地是韩式酱或咸鱼，并且更具体地是豆豉，但不限于此。
另外，食品组合物可以是包含豆豉的调味酱汁，但不限于此。
食品组合物可以包含饮食学上可接受的载体。
载体的类型没有特别限制，并且可以使用本领域常用的任何载体。
另外，食品组合物还可以包含可常规用于食品组合物中以改善气味、味道和视觉的额外成分。例如，食品组合物可以包括维生素A、C、D、E、B1、B2、B6和B12、烟酸、生物素、叶酸、泛酸等。另外，食品组合物还可包含矿物质，诸如Zn、Fe、Ca、Cr、Mg、Mn、Cu、Cr等，以及氨基酸，诸如赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸、缬氨酸等。
此外，食品组合物还可以包含食品添加剂，诸如防腐剂(山梨酸钾、苯甲酸钠、水杨酸、脱氢乙酸钠等)、消毒剂(漂白粉、高级漂白粉、次氯酸钠等)、抗氧化剂(丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)等)、着色剂(焦油色等)、显色剂(亚硝酸钠等)、漂白剂(亚硫酸钠)、调味料(谷氨酸单钠(MSG)等)、甜味剂(甜精、环磺酸盐、糖精钠等)、风味剂(香草醛、内酯等)、膨化剂(明矾、D-酒石酸氢钾等)、增强剂、乳化剂、增稠剂(糊状胶粘剂)、成膜剂、胶基剂、消泡剂、溶剂、改良剂、分散剂等。这些食品添加剂可以根据食品的类型进行选择并以适当量使用。
具体地，本发明人确认本申请的新分离的少孢根霉CJCC02-20具有同时抑制米曲霉(韩式酱的发酵真菌)、黑曲霉(食品污染物)、蜡状芽孢杆菌(食品中毒细菌)和大肠杆菌(其为致肠病细菌)的作用(实施例3，图1)。另外，当将抗微生物组合物应用于发酵食品豆豉时，确认了抗微生物组合物可以维持控制食品中毒细菌的作用(实施例4)，同时体现传统的风味，并且因此可以直接用于所有食品中，包括发酵食品。
作为实现上述目的的又一方面，本申请提供一种用于预防或治疗微生物感染性疾病的药物组合物，其包含抗微生物组合物。
如本文所用，术语“预防”可以指通过向受试者施用根据本申请的用于预防或治疗微生物感染性疾病的药物组合物来抑制或延迟微生物感染性疾病的发作的所有行动。
如本文所用，术语“治疗”可以指通过向怀疑患有微生物感染性疾病的受试者施用组合物来减轻或有益地改变微生物感染性疾病的症状的所有行动。
如本文所用，术语“改善”可以指至少降低与待治疗的病状相关的参数(例如，症状的程度)的所有行动。
如本文所用，术语“受试者”可以指目前患有微生物感染性疾病或处于患有微生物感染性疾病的风险中的所有动物，包括人。
具体地，微生物感染性疾病是由微生物感染引起的疾病，并且优选地，其可以是由真菌或细菌感染引起的疾病。
在本申请的一个实施方案中，真菌可以是米曲霉、黑曲霉或其组合，但不限于此。
在本申请的一个实施方案中，细菌可以是蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌或其组合，但不限于此。
在本申请的一个实施方案中，微生物感染性疾病可以是选自食品中毒、腹泻、呕吐、肠炎、胃肠炎、便秘、腹痛和腹胀组成的组的任何一种或多种，但不限于此。
在本申请的一个实施方案中，确认了针对蜡状芽孢杆菌(可以引起食品中毒的细菌)的增强的抗微生物活性以及针对致肠病大肠杆菌的特异性抗微生物活性，并且此外，确认了针对米曲霉和黑曲霉的特异性抗真菌活性，并且因此，本申请的抗微生物组合物可以在用于预防或治疗微生物感染性疾病的药物组合物中有效地使用。
根据本申请的用于预防或治疗微生物感染性疾病的药物组合物还可以包含药学上可接受的载体，并且可以与载体一起配制以提供为食品、保健功能性食品、药品、准药物、饲料添加剂、饮用水添加剂等。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”可以指不抑制待施用于生物体的化合物的生物活性或性质而不引起对生物体的刺激的载体或稀释剂。
本申请中可以使用的载体的类型没有特别限制，并且可以使用本领域常用的任何药学上可接受的载体。载体的非限制性实例可包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇等。这些可以单独使用或以其两种或更多种的混合物使用。
另外，还可以按需要添加其他常规添加剂，诸如抗氧化剂、缓冲剂和/或抑菌剂，并且可以通过额外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂等将组合物配制成注射制剂(诸如水溶液、混悬液、乳液等)、片剂、胶囊、颗粒剂或片剂。
根据本申请的用于预防或治疗微生物感染性疾病的组合物的施用模式没有特别限制，并且可以根据本领域常用的方法进行。作为施用模式的非限制性实例，组合物可以经口或肠胃外施用。本申请的用于预防、改善或治疗微生物感染性疾病的组合物可以根据所需的施用模式制备成各种制剂。
作为本申请的抗微生物物质的药物施用形式，它还可以其药学上可接受的盐的形式使用，并且可以单独使用或与其他药学活性化合物组合以及以合适的集合使用。
作为实现上述目的的又一个方面，本申请提供一种用于预防或治疗微生物感染性疾病的方法，其包括将用于预防或治疗微生物感染性疾病的组合物施用于受试者。如本文所用，术语“受试者”可以指目前患有微生物感染性疾病或处于患有微生物感染性疾病的风险中的所有动物，包括人。
具体地，本申请的预防或治疗方法可以包括向当前患有微生物感染性疾病或处于患有微生物感染性疾病的风险中的受试者施用药学有效量的组合物的步骤。
适合于包含提取物的组合物的每日总剂量应由医生根据适当的医学判断来确定，并且组合物可以分剂量施用一次或多次。然而，出于本申请的目的，对于任何特定患者的具体治疗有效剂量可以优选地不同地应用，这取决于各种因素，包括待实现的反应的种类和程度、具体组合物(包括是否偶尔一起使用其他剂)、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、组合物的分泌速率、治疗持续时间、与特定组合物组合或同时使用的其他药物以及医学领域中众所周知的类似因素。
本申请的抗微生物物质可以通过各种途径施用于哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、牲畜、人等。可以预期所有施用模式；例如，组合物可以通过经口、经直肠、静脉内、肌内、皮下、子宫内或脑室内注射施用。
作为实现上述目的的又一方面，本申请提供一种用于预防或改善微生物感染性疾病的保健功能性食品，其包含抗微生物组合物。
具体地，微生物感染性疾病、预防和改善的含义如上所述。
如本文所用，术语“保健功能性食品或营养食品”与特殊保健用食品(food forspecial health use，FOSHU)、功能性食品和保健食品相同，并且是指经过加工，以除了营养供应之外，还有效发挥机体调节功能，因此具有较高的药用和医学作用的食品。因此，食品可以制备成各种形式，诸如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、液体、丸剂等，以获得预防或改善微生物感染性疾病的有用作用。
健康功能性食品可以包含如上所述的饮食学上可接受的载体。
本申请的保健功能食品可以使用本领域常用的方法制备。可以添加本领域常常添加的原材料和成分，以便制备健康功能性食品。另外，保健功能性食品可以被制备成任何被视为保健功能性食品的制剂，但不限于此。本申请的保健功能性食品可以制备成各种剂型，并且因为由于基于食品材料而没有长期摄入药物可能出现的副作用，所以具有优于一般药物的优点。此外，本申请的保健功能性食品具有高便携性，并且因此可以作为促进微生物感染性疾病的预防或缓解作用的辅助剂进行摄取。
具体地，食品可以是通过将抗微生物组合物添加到食品材料诸如饮品、茶、风味剂、口香糖、蜜饯等中所制备，或者制备为胶囊、粉剂、悬浮液等的食品，并且例如，其可用于各种食品、饮品、口香糖、茶、复合维生素、保健功能性食品等。
食品可以根据本领域已知的制备方法制备成诸如片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、液体溶液剂和丸剂的剂型，并且可以根据剂型调整根据本申请的组合物的含量。另外，除了包含根据本申请的抗微生物组合物作为活性成分的那些成分之外，对其他成分没有特别限制，并且可以包含各种常见的调味剂或天然碳水化合物作为额外成分。
作为实现上述目的的又一方面，本申请提供一种准药物组合物，其包含所述抗微生物组合物。
如本文所用，术语“准药物(quasi-drug)”可以指：出于治疗、减轻、处理或预防人或动物疾病的目的而使用的对应于选自纺织产品、橡胶产品或其类似物中的任何一种的产品；不为工具、机器或其类似物的对人的影响最小或没有任何影响的产品；以及出于消毒、病虫害防治或其类似用途的目的使用以便预防感染性疾病的制剂，在出于治疗、减轻、处理或预防人或动物疾病的目的而使用的产品中，其不包括那些不是工具、机器或其类似物的那些；并且，在出于对人或动物的结构和功能产生药理作用的产品中，其不包括不是工具、机器或其类似物的那些。另外，准药物可以包括外用皮肤应用和个人卫生产品。准药物组合物的实例可以优选地包括消毒清洁剂、沐浴泡沫、漱口水、湿纸巾、洗涤皂、洗手皂或膏剂，但不限于此。
准药物可以包含如上所述的药学上可接受的载体。
本发明人确认新分离的少孢根霉CJCC02-20对真菌和细菌具有抗微生物作用，并且因此，使用新菌株的抗微生物组合物可以有效地用于准药物中。
作为实现上述目的的又一方面，本申请提供一种饲料组合物，其包含所述抗微生物组合物。
如本文所用，术语“饲料”可以指供动物进食、摄取和消化的任何天然或人工饮食、膳食或食材。
对饲料的类型没有限制，并且可以使用本领域常用的任何饲料。饲料组合物可以包含饲料添加剂。本申请的饲料添加剂对应于牲畜和鱼类饲料管理法(Control ofLivestock and Fish Feed Act)下的辅助饲料，并且可以包含益生菌。饲料的非限制性实例包括：基于植物的饲料，诸如谷物、根茎植物、食品加工副产物、藻类、纤维、药物副产物、脂肪和油、淀粉、粗粉(meals)或谷物副产物；以及基于动物的饲料，诸如蛋白质、无机物质、脂肪和油、矿物质、单细胞蛋白质、浮游生物或食品。这些溶剂可以单独使用或以其两种或更多种的混合物使用。
具体地，包含本申请的抗微生物组合物的饲料组合物还可以包含赋形剂、稀释剂和添加剂。
已确认，本申请的新分离的少孢根霉CJCC02-20具有同时抑制作为真菌的米曲霉和黑曲霉以及食物中毒细菌蜡状芽孢杆菌和大肠杆菌的作用。因此，本申请提供一种具有抗微生物和抗真菌活性的饲料组合物，并且可以预防包括牲畜食物中毒的微生物感染性疾病。
作为实现上述目的的又一方面，本申请提供一种用于制备抗微生物组合物的方法，其包括在培养基中培养新分离的少孢根霉CJCC02-20。
如本文所用，术语“培养”意指本申请的少孢根霉CJCC02-20在适当控制的环境条件下生长。本申请的培养过程可以在本领域已知的合适的培养基和培养条件下进行。本领域技术人员可以根据待选择的菌株容易地调整这样的培养过程以供使用。具体地，培养可以是分批培养、连续培养和/或补料分批培养，但不限于此。
如本文所用，术语“培养基”是指包含培养少孢根霉CJCC02-20所需的营养物质作为主要成分的材料的混合物，并且其提供营养物质和生长因子，以及生存和生长所必需的水。明确地说，用于培养本申请的少孢根霉CJCC02-20的培养基及其他培养条件可以是微生物常规培养中使用的任何培养基，没有特别限制。然而，本申请的少孢根霉CJCC02-20可以在有氧条件下，在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的常规培养基中培养，同时调整温度、pH等。
在本申请中，碳源可以包括碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖(saccharose)、乳糖、果糖、蔗糖(sucrose)、麦芽糖等；糖醇，诸如甘露醇、山梨醇等；有机酸，诸如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；以及氨基酸，诸如谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等。另外，碳源可以包括天然有机营养物质，诸如淀粉水解物、糖蜜、赤糖糊、米糠、木薯、蔗糖蜜、玉米浆等。明确地说，可以使用碳水化合物，诸如葡萄糖和灭菌的预处理糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)，并且此外，可以无限制地使用适当量的各种其他碳源。这些碳源可以单独使用或以其两种或更多种的组合其使用，但不限于此。
氮源可以包括无机氮源，诸如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等；氨基酸，诸如谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺等；以及有机氮源，诸如蛋白胨、NZ-胺、肉浸膏、酵母浸膏、麦芽浸膏、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产物等。这些氮源可以单独使用或以其两种或更多种的组合其使用，但不限于此。
磷源可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或对应的含钠盐等。无机化合物的实例可以包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。另外，可以包含氨基酸、维生素和/或适当的前体。这些构成成分或前体可以分批培养或连续方式添加到培养基中，但不限于此这些磷源。
另外，在培养少孢根霉CJCC02-20期间，可以通过以适当的方式向培养基中添加化合物诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸等来调节培养基的pH。另外，在培养期间，可以添加消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯以防止泡沫产生。另外，可以向培养基中注入氧气或含氧气体，以维持培养基的有氧状态；可以不注入气体，或者注入氮气、氢气或二氧化碳气体，以维持培养基的厌氧或微需氧状态，但气体不限于此。
培养基温度的范围可以为20℃至45℃，并且具体而言，25℃至40℃，但不限于此。培养可以进行约10至160小时，但不限于此。
用于制备本申请的抗微生物组合物的方法可以还包括制备本申请的少孢根霉CJCC02-20菌株的步骤、制备用于培养菌株的培养基的步骤或其组合(无论顺序如何，以任何顺序)，例如在培养步骤之前进行。
本申请的抗微生物组合物的制备方法还可以包括从培养基(培养物在培养基中生长)或本申请的少孢根霉CJCC02-20菌株中回收抗微生物物质的步骤。培养步骤之后还可以包括回收步骤。
具体地，包括任何抗微生物物质而没有限制，只要它们具有由少孢根霉CJCC02-20菌株产生的抗微生物活性即可，并且可以是例如粗提物或化合物，但不限于此。
在回收步骤中，可以使用培养本申请的微生物的方法，例如，使用本领域已知的合适方法，根据分批培养、连续培养或补料分批培养方法来收集所需的抗微生物物质。例如，诸如离心、过滤、用蛋白质结晶沉淀剂处理(盐析法)、提取、超声波破碎、超滤、渗析、各种类型的色谱法诸如分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等以及HPLC的方法可以单独或组合使用，并且可以使用本领域已知的合适方法从培养基或微生物中回收所需的抗微生物物质。
此外，用于制备本申请的抗微生物组合物的方法可以还包括纯化过程，其可以使用本领域中已知的适当方法进行。在一个实例中，当用于制备本申请的抗微生物组合物的方法包括回收步骤和纯化步骤时，回收步骤和纯化步骤可以间歇(或连续)进行，而不管次序如何，或者同时进行，或者可以整合成一个步骤，但是方法不限于此。
作为实现上述目的的又一方面，本申请提供一种用于生产发酵产品的方法，其包括在培养基中培养少孢根霉CJCC02-20菌株，之后进行发酵。
作为实现上述目的的又一方面，本申请提供一种通过上述方法生产的发酵产品。
少孢根霉CJCC02-20菌株如上所述，并且在培养基中培养微生物的步骤也如上所述。
如本文所用，术语“发酵产品”是指通过培养本申请的微生物获得的组合物。
此外，发酵产品可以包括在培养微生物，之后进行合适的后处理之后获得的液体或粉末形式的组合物。具体地，合适的后处理过程可以包括例如培养微生物的过程、去除细菌细胞的过程、浓缩过程、过滤过程和混合载体的过程，并且还可以包括干燥过程。在一些情况下，后处理过程可以不包括纯化过程。
此外，“发酵组合物”不排除其中进一步混合有通过非发酵过程获得的物质和/或通过非天然过程获得的另一种物质的情况，只要通过培养本申请的微生物的组合物包含在内即可。
作为实现上述目的的又一方面，本申请提供一种饲料组合物，其包含少孢根霉CJCC02-20或使用该菌株的发酵产品。
少孢根霉CJCC02-20和食品如上所述。
发酵产品可以指通过将少孢根霉CJCC02-20菌株接种并培养在包含食品主要原料的培养基中而获得的培养基，或者包含用所述培养基培养的微生物的培养物。
另外，发酵产品可以是通过将少孢根霉CJCC02-20菌株接种并培养在食品材料中而获得的培养物。食品材料可以是谷物，但不限于此。
在本申请的一个实施方案中，谷物可以是稻米、大麦、小麦、玉米等，并且具体而言为小麦、麦麸或稻米，但不限于此。
发酵产品可以综合地解释为包括其滤液、稀释溶液、浓缩溶液、粗产物、纯化产物、干燥产物、粉碎产物等的全部，但不限于此。
作为实现上述目的的又一方面，本申请提供一种用于制备食品的方法，其包括接种新分离的少孢根霉CJCC02-20菌株。
少孢根霉CJCC02-20菌株和食品如上所述。
在本申请的一个实施方案中，用于制备食品的方法可以是用于制备发酵食品的方法，其包括在谷物中接种并培养少孢根霉CJCC02-20。通过接种并培养菌株而获得的发酵食品具体而言可以是韩式酱或咸鱼，并且更具体地可以是豆豉或含有豆豉的调味酱汁，但不限于此。
作为实现上述目的的又一方面，本申请提供一种饲料组合物，其包含新分离的少孢根霉CJCC02-20菌株。
少孢根霉CJCC02-20菌株和饲料如上所述。
作为实现上述目的的另一方面，本申请提供组合物的抗微生物用途，所述组合物包含选自由新分离的少孢根霉CJCC02-20菌株、该菌株的孢子、该菌株的培养物、该菌株的发酵产品、其浓缩物、其提取物及其干燥产物组成的组中的任何一种或多种。
实施例
在下文中，将通过实施例描述本申请的构成和作用。然而，提供这些实施例仅出于说明性目的，并且本发明的范围不旨在受这些实施例限制。
实施例1.生产抗微生物物质的菌株的分离和鉴定
为了选择具有抗微生物活性的菌株，将传统的豆豉在PDA(马铃薯右旋糖琼脂)培养基中在30℃下培养5天，然后使用根霉属的形态特征初步选择菌株。通过在含有1,000ppm5％卡那霉素的PDA培养基中在30℃下培养5天来分离所选菌株。
对通过上文过程选择的菌株的18S rRNA、ABP(ABP1)和几丁质酶(Chi2)基因的核苷酸序列进行分析。使用NCBI的BLAST将所选菌株的每个核苷酸序列(18S rRNA：SEQ IDNO:1；ABP1：SEQ ID NO:2；Chi2：SEQ ID NO:3)与GenBank数据库中的核苷酸序列进行比较。
具体而言，基于ABP1基因的核苷酸序列合成引物SEQ ID NO:4和5，并且基于Chi2基因的核苷酸序列合成引物SEQ ID NO:6和7，并且每个核苷酸序列都通过PCR确认。因此，本发明菌株的核苷酸序列显示与少孢根霉18S rRNA具有100％同源性，与ABP基因具有99.9％同源性，并且与几丁质酶基因具有100％同源性。
由上述结果获得的菌株被鉴定为少孢根霉菌株，命名为少孢根霉CJCC02-20，并且根据布达佩斯条约于2020年12月9日保藏于国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，登录号为KCCM12893P。
实施例2.抗微生物物质的分离和纯化
为了分离由新分离的少孢根霉CJCC02-20菌株所产生的抗微生物物质，将菌株接种到10g至15g麦麸中，之后在30℃下培养5天并且在35℃下培养1天。将培养物用50倍重量的蒸馏水稀释，并且在30℃和150rpm下提取60分钟。使用硅藻土，用5.0μm滤纸减压过滤粗提取物。将滤液在-20℃下冷冻干燥48小时，并且纯化为干燥产物。
实施例3.针对真菌和引起食品中毒的细菌的抗微生物活性测试
为了确认新分离的少孢根霉CJCC02-20菌株对真菌和引起食品中毒的细菌是否具有抑制作用，进行了以下抗微生物活性实验。
在PDA(马铃薯右旋糖琼脂)培养基中培养米曲霉(韩式酱的发酵真菌)和黑曲霉(食品污染物)。
在YPD培养基(酵母提取物蛋白胨右旋糖琼脂)中培养作为致病性酵母的白假丝酵母菌(Candida albicans)和作为食品污染物的拜氏接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)。
另外，在TSA(胰酶大豆琼脂)培养基中培养蜡状芽孢杆菌(引起食品中毒的细菌)、致肠病大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)(韩式酱的发酵细菌)。
在将实施例2中干燥的抗微生物物质溶解于蒸馏水中之后，将8mm直径的纸盘放置于涂覆有指定菌株的平板培养基上，并且不断添加30μL抗微生物物质，并且在30℃下培养24至48小时，以观察是否由分离的菌株所产生的抗微生物物质产生生长抑制区，并且结果示出于表1和图1中。如表1所示，“-”表示生长不受抑制的情况，“+”表示生长抑制区的直径为3mm至5mm或以下的情况，“++”表示生长抑制区的直径为6mm至10mm的情况，并且“+++”表示生长抑制区的直径为10mm或以上的情况。
此外，除少孢根霉CJCC02-20菌株之外，还在比较实施例1至4中比较了从传统豆豉(通过印度尼西亚和越南的传统方法制成的豆豉)分离的四种少孢根霉菌株的抗微生物活性。
[表1]
如表1和图1中可以看到的那样，获自少孢根霉CJCC02-20菌株的纯化材料显示对酵母没有抗微生物活性，但显示优异的抗真菌活性，可以选择性地控制在韩式酱或一般食品中难以抑制的米曲霉和黑曲霉。
此外，获自少孢根霉CJCC02-20菌株的纯化材料显示了针对致肠病大肠杆菌的选择性抗微生物活性，并且确认了，与其他少孢根霉菌株相比，获自少孢根霉CJCC02-20菌株的纯化材料显示针对食品中毒细菌蜡状芽孢杆菌的优异的抗微生物活性。
实施例4.在发酵产品豆豉中控制食品中毒细菌的作用的确认
为了确认通过实施例1所鉴定的少孢根霉CJCC02-20在发酵产品中控制食品中毒细菌的作用，将15g至20g少孢根霉CJCC02-20菌株接种到麦米中，然后在30℃下培养6天并且在40℃下培养1天。使用研磨机将培养物制成粉末。
为了根据每年变化的消费趋势开发出谷物多样的发酵产品，将4％的培养液粉末和可商购获得的少孢根霉菌株(Ragi Tempe Raprima，Bandung Inc.，Indonesia)接种到蒸过的大豆、蒸过的大豆和大米、蒸过的大豆和小麦粉、以及蒸过的小麦粉并混合，然后通过将湿度调节到60％，在30℃的温度下培养1-2天，以制成发酵产品豆豉。
将由此培养的豆豉和可商购获得的传统豆豉在添加有TSA(胰蛋白酶大豆琼脂)、多粘菌素B和甲氧苄啶的蜡状芽孢杆菌选择性培养基中，在30℃下培养1天。确认了，在接种有实施例1中分离的少孢根霉CJCC02-20菌株的豆豉中，未检测出作为引起食品中毒的细菌蜡状芽孢杆菌和致肠病大肠杆菌，而在接种有可商购获得的菌株的豆豉和传统豆豉中则检测出了蜡状芽孢杆菌(参见表2)。
[表2]
*ND：未检测到
根据上文结果，确认了作为豆豉发酵菌株的少孢根霉CJCC02-20菌株具有控制食品中毒细菌的优异效果，同时体现传统风味。
因此，包含本申请的新型少孢根霉CJCC02-20菌株、该菌株的孢子、该菌株的培养物、其浓缩物及其干燥产物的抗微生物组合物对真菌和食品中毒细菌具有优异的抗微生物效果，并且因此可以有效地用于食品、准药物、药品等。
本领域的普通技术人员将认识到，本申请可以在不背离其精神或基本特征的情况下以其他特定形式实施。所描述的实施方案在所有方面应被视为仅为说明性的而不是限制性的。本申请的范围因此是由所附权利要求而不是由前述描述来指示。在权利要求的等效意义和范围内的所有改变都应涵盖在本申请的范围内。
保藏号
保藏单位：韩国微生物保藏中心
登录号：KCCM12893P
保藏日期：2020年12月09日。

Claims (14)

1.一种少孢根霉CJCC02-20菌株，其以登录号KCCM12893P保藏。
2.如权利要求1所述的菌株，其中所述菌株具有针对真菌、细菌或其组合的抗微生物活性。
3.如权利要求2所述的菌株，其中所述真菌是米曲霉、黑曲霉或其组合。
4.如权利要求2所述的菌株，其中所述细菌是蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌或其组合。
5.如权利要求1所述的菌株，其中所述菌株具有针对米曲霉、黑曲霉或大肠杆菌的特异性抗微生物活性。
6.一种抗微生物组合物，其包含选自由以下组成的组中的任何一种或多种作为活性成分：如权利要求1至5中任一项所述的少孢根霉CJCC02-20菌株、所述菌株的孢子、所述菌株的培养物、其浓缩物及其干燥产物。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述组合物具有针对真菌、细菌或其组合的抗微生物活性。
8.一种食品组合物，其包含如权利要求6所述的抗微生物组合物。
9.如权利要求8所述的食品组合物，其中所述食品包括豆豉或包含豆豉的调味酱汁。
10.一种饲料组合物，其包含如权利要求6所述的抗微生物组合物。
11.一种用于预防或治疗由真菌、细菌或其组合引起的微生物感染性疾病的药物组合物，其包含如权利要求6所述的抗微生物组合物。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述微生物感染性疾病为选自由以下组成的组中的任何一种或多种：食品中毒、腹泻、呕吐、肠炎、胃肠炎、便秘、腹痛和腹胀。
13.一种保健功能性食品组合物，其用于预防或改善由真菌、细菌或其组合引起的微生物感染性疾病，所述食品组合物包含如权利要求6所述的抗微生物组合物。
14.一种准药物组合物，其包含如权利要求6所述的抗微生物组合物。
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