KR20190061122A

KR20190061122A - 락토바실러스 브레비스가 생산하는 천연항균물질 및 유전자의 염기서열

Info

Publication number: KR20190061122A
Application number: KR1020170159149A
Authority: KR
Inventors: 최학종; 임슬기; 오영준; 장자영; 권민성; 김남희
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2019-06-05
Also published as: KR102109195B1

Abstract

본 발명은 신규 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 균주, 이로부터 생산된 박테리오신, 이를 포함하는 기능성 식품, 천연보존제 및 항균제에 관한 것으로, 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 균주로부터 생산된 박테리오신은 기존 젖산균 유래 박테리오신과 서열이 상이하며, 젖산균에 대해 항균성을 가지는 동시에 내산성 및 내열성 모두 우수한 효능이 확보되어 기능성 식품, 천연보존제 및 항균제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

락토바실러스 브레비스가 생산하는 천연항균물질 및 유전자의 염기서열{Natural bacteriocin produced by Lactobacillus brevis and it's gene sequences}

본 발명은 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 및 이로부터 생산된 항균물질(박테리오신)에 관한 것이다.

박테리오신이란 고온에서 활성을 유지하며 광범위한 pH에서 안정하고 무독, 무취, 무색을 나타낸다. 박테리오신들은 항균물질 생산 균주 자신과 계통 혈통학적으로 근접한 균종으로 제한된 좁은 항균 범위를 나타내며, 항생 물질과 유사한 특징을 가지고 있다. 하지만, 항생제는 사람에게 투여시 부작용이 있는 반면 박테리오신은 인체에 섭취되면 소화관의 단백질 가수분해효소에 의해 분해되므로 인체에 무독하고 잔류성이 없다는 이유로 식품 등의 생물학적 보존제(biopreservative) 및 발효식품의 생물제어제(bioregulator)로서 이용이 증대되고 있다.

젖산균(lactic acid bacteria)은 젖산을 생산하는 미생물로 자연계에 널리 분포하는 미생물로 중성 및 알칼리성에서 잘 생육하는 부패성 미생물의 생육을 억제하여 식품의 보존 수단으로 이용되어 왔다. 젖산균은 이들의 대사산물인 여러 종류의 유기산에 의해 pH를 감소시키면서 식품의 보존성을 증진시키는데, 젖산 및 초산과 같은 유기산은 대부분의 미생물에 대해 살균작용이 있기 때문이다. 또한 유기산 이외에 이들이 생산하는 박테리오신이 보존성에 관여하며, 가장 널리 알려진 박테리오신은 나이신(nisin)은 미국 FDA의 승인을 받아 식품 첨가물로 사용되고 있다.

그러나 내산성과 내열성 모두 우수한 박테리오신을 생산하는 젖산균은 아직까지 보고된 바 없다.

국내 특허 공개 제 2016-0107635호

CURRENT MICROBIOLOGY Vol. 34 (1997), pp. 173-179

따라서, 본 발명의 목적은 천연 식품보존제로 사용이 가능한 항균 범위가 넓은 박테리오신을 생산하는 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 및 이로부터 생산된 박테리오신을 제공하는데 있다

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCCM12134P의 락토바실러스 브레비스 WiKim0069(Lactobacillus brevis WiKim0069) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 (수탁번호 KCCM12134P) 균주로부터 생산되는 박테리오신을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 (수탁번호 KCCM12134P) 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물 또는 상기 박테리오신을 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 (수탁번호 KCCM12134P) 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물 또는 상기 박테리오신을 포함하는 식품 첨가제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 (수탁번호 KCCM12134P) 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물 또는 상기 박테리오신을 포함하는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 구성을 상세하게 설명한다.

본 발명은 락토바실러스 브레비스 WiKim0069(Lactobacillus brevis WiKim0069) (수탁번호 KCCM12134P) 균주에 관한 것이다.

본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 (수탁번호 KCCM12134P) 균주는 김치 유래의 락토바실러스 브레비스 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 균주를 김치에서 분리, 동정하기는 하였으나, 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예를 통해 김치로부터 분리한 젖산균에 항균 활성이 우수한 유산균 균주를 미생물 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석한 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 상기 핵산서열은 NCBI GenBank(http://www.ncbi.nin.gov)에서 제공하는 블라스트 서치 프로그램(blast search program)을 통해 상동성(homology)을 확인해 본 결과, 락토바실러스 브레비스 표준균주 ATCC 14869(T)와 98.79% 동일함을 확인할 수 있었다.

따라서, SEQ ID NO: 1의 16S rRNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 ( Lactobacillus brevis WiKim0069)로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2017년 10월 20일자로 기탁하였다(수탁번호 KCCM12134P).

본 발명의 락토바실러스 브레비스 WiKim0069은 그람양성균이며, 호기적 조건에서 성장이 가능하고, 간균의 형태를 취하고 있다. 또한, 젖산균에 대한 항균 활성이 우수하며, 내산성과 내열성이 모두 우수한 것을 확인하였다.

본 발명에 따른 박테리오신은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

SEQ ID NO: 2

KKKKKVACTWGNAAAAAASGAVKGILGGPTGALAGAIWGASQCASNNLHGMH

또한, 본 발명은 박테리오신 활성을 갖는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 암호화하여 포함하는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

SEQ ID NO: 3

ATGTATAAAGAATTAACAGTTGATGAATTAGCATTAATTGATGGAGGAAAGAAGAAGAAAAAAGTAGCTTGTACTTGGGGAAATGCAGCAGCAGCCGCTGCTTCTGGTGCAGTTAAGGGTATTCTTGGTGGGCCTACTGGTGCATTGGCTGGAGCTATCTGGGGCGCTTCACAATGCGCATCTAACAACTTACACGGCATGCACTAA

본 발명에 따른 박테리오신은 젖산균에 대해 항균 작용을 갖는 것을 특징으로 한다. 특히, 상기 젖산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 피디오코커스(Pediococcus) 속 및 마이크로코커스(Micrococcus) 속으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함한다.

본 발명에 따른 박테리오신은 젖산균에 대해 항균작용을 갖는 것을 특징으로 한다. 특히, 상기 젖산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 피디오코커스(Pediococcus) 속 및 마이크로코커스(Micrococcus) 속으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함한다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명에 따른 항균 조성물은 농약, 의약, 화장품, 생활용품, 식품 등에서 항균, 살균, 소독, 방부 등의 목적을 달성하기 위해 광범위하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 농업에 있어서는 항균, 살균, 소독의 목적으로, 의약에 있어서는 항생제나 오염방지제와 같은 목적으로, 식품에 있어서는 방부나 항균목적으로, 화장품이나 생활용품에 있어서는 비듬억제용, 무좀방지용, 겨드랑이 채취억제용, 항여드름용 등 미생물과 직접 연관된 제품에 사용되거나 청소용 세정제나 식기세척용 세정제 등에 방부나 항균 또는 살균 목적으로 사용되어 질 수 있으며, 이러한 목적으로만 한정되는 것은 아니다. 이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명의 항균 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 항생제 대체제 또는 항균포장재로 사용되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 (수탁번호 KCCM12134P) 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물 또는 상기 박테리오신을 포함하는 식품 첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에서, 담체로서 사용될 수 있고 올리고사카라이드, 인슐린, 락티톨, 락토수크로오스, 락툴로오스, 피로덱스트린, 효모 및 효모 유도체, 비타민, 특히 비타민 E로부터 선택되는, 영양 물질 및/또는 프리바이오틱(prebiotic) 물질이 사료 및 식품 첨가제에 추가로 함유되는 경우, 본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서와 같이, 사용되는 미생물들의 소화관내 생존 조건이 현저히 개선되고, 사용되는 미생물(들)은 소화관에서 신속하고 신뢰할 만하게 증식할 수 있지만 동시에 병원균의 증식은 경쟁적 배제에 의해 감소하거나 억제됨이 특히 보장된다. 사용되는 영양 물질 및/또는 프리바이오틱 물질로 인해, 병원균이 아니라 사용되는 미생물(들)에 증식 이점이 제공된다.

본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서와 같이 제올라이트, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 트레할로오스, 키토산, 알루미늄 실리케이트, 특히 과립형 벤토나이트, 전분, 탈지 우유 분말, 유청(sweet-whey) 분말, 말토덱스트린, 락토오스, 인슐린, 덱스트로오스, 식물성 오일, 또는 물 또는 생리적 식염수 용액으로부터 선택되는 용매로부터 선택되는 추가의 담체가 함유됨에 따라, 한편으로는 미생물들이 소화관에 균일하게 분포될 수 있게 하고, 다른 한편으로는 경쟁적 배제를 위해 추가로 도움을 제공할 수 있다.

추가의 바람직한 구체예에 따르면, 대장, 소장 등과 같은 요망되는 사용 위치에 따라 미생물의 활성을 정확하고 선택적으로 방출시킬 수 있도록, 본 발명에 따른 사료 및/또는 음용수 첨가제를 현탁된 형태, 분말 형태 또는 캡슐화된 형태로 사용하는 것이 특히 유리한 것으로 판명되었다. 또한, 처리하려는 동물의 전체 소화계에 걸쳐 활성을 보장할 수 있도록, 현탁된 사료 및/또는 식품 첨가제와 캡슐화된 사료 및/또는 식품 첨가제의 혼합 형태를 사용하는 것이 물론 가능하다.

추가의 바람직한 구체예에 따르면, 사료 첨가제 및/또는 식품 첨가제는 1% 내지 99%, 특히 50% 내지 95%의 담체 또는 천연 물질을 추가로 함유한다. 담체 또는 천연 물질이 추가로 함유된다는 사실로 인해, 사용되는 미생물의 증식을 보조하거나 촉진함으로써 소화관으로부터 병원균을 추가로 제거하는 것이 가능해진다.

본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서와 같이 사료가 사료 kg 당 0.01 g 내지 10 g, 특히 사료 kg 당 0.025 g 내지 2.5 g의 양의 사료 첨가제를 수성 현탁액으로서 함유함에 따라, 한편으로는 사료 첨가제가 사료와 함께 동물에 의해 용이하게 섭취되고 다른 한편으로는 사료 섭취 전에 사료의 표면에 이미 존재하는 병원균이 사료 첨가제에 의해 공격을 받거나 제거되거나 분해됨이 보장된다.

사료에 대해 그리고 동물의 소화관에서 사료 첨가제의 특히 양호한 효과를 달성하기 위해, 사료는 바람직하게는 사료 첨가제를 20 g/t 내지 20 kg/t, 특히 100 g/t 내지 2.5 kg/t의 양으로 함유함으로써, 한편으로는 충분한 양의 미생물을 제공하고 다른 한편으로는 위장관 환경으로부터의 병원균의 안전한 분해 또는 제거를 보장한다.

적합한 동물 사료의 예는 청초(green fodder), 저장 목초(silage), 건초(dried green fodder), 뿌리, 덩이줄기, 다육질 과일, 곡물 및 종자, 양조용 곡물, 찌꺼기(pomace), 양조용 효모, 증류 잔사, 제분 부산물, 당 및 전분 생산 및 오일생산의 부산물 및 각종 음식물 쓰레기이다. 개량을 위해 상기 유형의 사료를 특정한 사료 첨가물(예를 들어, 항산화제)또는 각종 물질(예를 들어, 미네랄 혼합물, 비타민 혼합물)과 혼합할 수 있다. 특수한 가축 사료는 또한 특정 종 및 이들의 발달 단계에 적합화된다. 이는 예를 들어, 새끼돼지 사육에 있어서 그렇다. 프리스타터 및 스타터 사료가 사용된다.

본 발명의 생산물을, 동물의 사료에 직접 첨가하거나 그밖에 다른 사료 첨가물과 혼합하거나 또는 실제의 사료에 예비혼합을 통해 첨가할 수 있다. 본 생산물을 먹이와 건식 혼합하거나 추가의 가공(예: 압출) 전에 첨가하거나 혼합물에 계량하여 분산시킬 수 있다. 생산물의 개개의 성분을 별도로 사료의 개개의 성분에 첨가하는 것이 또한 가능하다. 상기 목적을 위해 생산물의 농도를 0.25 내지 7.5중량% (먹이를 기준으로), 바람직하게는 0.75 내지 4.0 중량%로 사용하는 것이 편리하다.

본 발명에 따른 조성물의 활성성분(예, 박테리아 세포)은 투여되는 종의 조직과 생리학적으로 적합한(즉, 인간 소비(consumption) 또는 동물 소비에 적합한) 담체와 배합된다. 본 발명의 이러한 일면에 따른 담체는 정제, 캡슐 또는 분말 형태로의 제형화를 위한 고체-기제의 건조 물질일 수 있다. 또한, 담체는 액체 또는 겔 형태로의 제형화를 위한 액체 또는 겔-기제 물질일 수 있다. 담체의 특정 형태 및 최종 제형은 일부 선택되는 투여경로에 따라 달라진다.

건조 제형에 전형적인 담체로는 트레할로스, 말토-덱스트린, 쌀가루, 미결정성 셀룰로오스(MCC), 마그네슘 스테아레이트, 이노시톨, 플룩토 올리고사카라이드(FOS), 글루코--올리고사카라이드(GOS), 덱스트로오스, 수크로오스 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 조성물이 건성이고 조성물을 케이크화(cake)(즉, 구성성분 포자, 염, 분말 및 오일의 부착)시킬 수 있는 증발유를 포함하는 경우, 구성성분을 분포시키고 케이크화를 방지하는 건조 충진제(dry filler)를 포함하는 것이 바람직하다. 예시적인 안티케이크화제(anti-caking agent)로는 MCC, 탈크, 규조토, 비정질 실리카, 젤라틴, 사카로오스, 탈지분유 분말, 전분 등이 포함되며, 이들은 전형적으로 대략 1 내지 95 중량%의 양으로 첨가된다. 이후 재수화되거나(예, 액제) 건조 상태로 제시되는(예, 츄어블 웨이퍼(chewable wafer), 펠렛 또는 정제) 건조 제형이 최초 수화된 제형보다 바람직하다는 것이 이해될 것이다. 건조제형(예, 분말)은 상업적으로 입수가능한 식품(예, 액제, 정제 식품 또는 음료수)을 보충하는데 사용될 수 있다. 적합한 액체 또는 겔-기제 담체로는 물 및 생리식염수; 우레아; 알콜 및 유도체(예, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올); 글리콜(예, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등)이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게도, 수-기제 담체는 중성의 pH 값(즉, pH 7.0)을 갖는다. 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤질 알콜 및 에틸렌디아민 테트라아세테이트 염을 비롯한 방부제가 또한 담체내에 포함될 수있다. 본 발명의 조성물은 또한 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜(MW=800 내지 20,000의 바람직한 분자량을 가짐)과 같은 가소제를 포함할 수 있다. 담체의 조성은 활성성분의 약리활성 또는 본 발명에 따른 박테리아 균주의 생육성을 유의적으로 방해하지 않는한 변화될 수 있다. 본 발명의 이러한 일면에 따라 사용될 수 있는 담체의 다른 형태가 이후에 기술된다.

본 발명의 조성물의 영양 보충제 성분은 비타민, 미네랄, 필수 또는 비필수 아미노산, 카보하이드레이트, 지질, 식료품, 건강보조식품 등을 포함하는 당업계에 널리 알려진 각종 영양제 중 어느 것을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 섬유질, 효소 및 다른 영양소를 포함할 수 있다. 바람직한 섬유질로는 차전초, 쌀 겨, 귀리겨, 옥수수 겨, 밀 겨, 과일 섬유질 등이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 락타아제, 아밀라아제, 글루카나아제, 카탈라아제 등과 같은 건강보조 또는 보충 효소가 또한 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 비타민으로는 비타민 B, C, D, E, 엽산, K, 니아신 등이 포함된다. 일일 소비하도록 권장된 일일권장량(RDA)의 것들이 전형적인 비타민이다.

본 발명의 조성물은 의도한 용도에 따라 제형화된다. 통상적인 제형화 기술의 재고는 문헌["The Theory and Practice of Industrial Pharmacy" (Ed. Lachman L. et al, 1986) or Laulund (1994)]에서 찾아볼 수 있다. 임의의 경우에, 적합한 투여 경로로는 예를 들어 경막내, 직접 내실내, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안내 주사뿐만 아니라 근육내, 피하 및 골수 주사를 포함하여 국소, 질내, 경요도, 경구, 직장, 경점막, 특히 경비, 장관내 또는 비경구 전달이 포함될 수 있다. 주사용의 경우, 본 발명의 활성 성분은 수성 용액, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액, 이를테면 핸크 용액(Hank's solution), 링거액, 또는 생리학적 염 완충액으로 제형화될 수 있다. 경점막 투여의 경우, 장벽을 침투하기에 적합한 침투제가 제형화에 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 경구 투여의 경우, 활성성분을 당업계에 잘 알려진 약제학적으로 허용가능한 담체와 배합함으로써 쉽게 제형화될 수 있다. 적합한 담체는 환자의 경구 섭취를 위해 본 발명의 화합물을 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔, 시럽제, 슬러리, 현탁제 등으로서 제형화할 수 있게 한다. 경구 사용을 위한 약리학적 제제는 고형 부형제를 사용하고 생성된 혼합물을 임의로 분쇄하고, 필요에 따라 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물을 처리하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 특히 충진제(filler), 예컨대 락토오스, 수크로오스, 만니톨 또는 솔비톨을 비롯한 당; 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트리가칸트 검, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 소듐 카보메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 생리학적으로 허용가능한 폴리머이다. 필요에 따라, 붕괴제, 이를테면 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 소듐 알기네이트와 같은 그의 염이 첨가될 수 있다. 적합한 코팅에 의해 당의정 코어가 제공된다. 이를 위해, 임의로 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티탄, 래커(lacquer) 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축 당 용액이 사용될 수 있다. 식별을 위해 또는 활성 화합물 용량이 상이한 배합물임을 특징화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 염료 또는 안료가 첨가될 수 있다. 경구적으로 사용될 수 있는 약학 조성물로는 젤라틴과 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 가소제로 제조된 연성 밀봉 캡슐뿐만 아니라 젤라틴으로 제조된 압입형 캡슐제(push-fit capsule)가 포함된다. 압입형 캡슐제는 락토오스와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 및 임의로 안정화제와의 혼합물로 활성성분을 포함할 수 있다. 연성 캡슐제의 경우, 활성성분은 적합한 액체, 예컨대 지방유, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 선택되는 투여 경로에 적합한 용량이어야 한다.

본 발명의 조성물이 경장적으로-코팅된(enterically-coated) 서방성 캡슐 또는 정제로 캡슐화될 수 있음이 이해될 것이다. 경장적 코팅은, 위장관을 통과하기 때문에 소장에 도달할 때까지 캡슐/정제가 완전하게(즉, 용해되지 않게) 유지되게 한다. 구강 투여의 경우, 조성물은 통상의 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다. 비강내 흡인에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 활성성분은 적합한 분사제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 사용함으로써 가압팩 또는 분무기로부터 통상 에어로졸 분무제의 형태로 전달된다. 가압형 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하도록 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다(미국특허 제 6,448,224호 참조). 디스펜서로 사용하기 위해 락토오스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제와 화합물의 분말 혼합물을 함유하는 예를 들어 젤라틴의 캡슐제 및 카트리지로 제형화될 수 있다.

본원에 기술된 제제는 비경구 투여를 위해 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 제형화될 수 있다. 살아있는 박테리아 세포의 비경구 투여에 대한 다수의 예가 당업계에 공지되어 있다[참조예, Tjuvajev (2001) J. Control Release 74 (1-3): 313-5. Rosenberg (2002) J. Immunother. 25: 218-25; Sheil (2004) Gut 53(5): 694-700; 및 Matsuzaki (2000) Immunol. Cell Biol. 78(1): 67-73]. 본 발명의 박테리아 세포가 또한 면역반응을 조절하도록 약독화된 형태(attenuated form)로 투여될 수 있음이 이해될 것이다[Matsuzaki (2000) Immunol. Cell Biol. 78 (1): 67-73]. 주사용 제형은 임의로 첨가되는 방부제와 함께 단위 투여형, 예를 들어 앰풀(ampoule) 또는 다중투여(multidose) 용기로 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클의 현탁제, 용액제 또는 에멀젼일 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화 제제(formulatory agent)를 함유할 수 있다. 비경구 투여용 약학조성물은 활성제제의 수용액을 수-가용성 형태로 포함한다. 또한, 활성성분의 현탁제는 적합한 유성 또는 수성 기제 오일 주사 현탁제로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클로는 참깨유와 같은 지방유, 또는 에틸 올레에이트, 트리글리세리드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르가 포함된다. 수성 주사 현탁제는 현탁제의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 솔비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁제는 또한 적합한 안정화제 또는 활성성분의 용해도를 증가시켜 고농도의 용액제를 제조가능케 하는 제제를 함유할 수 있다. 또한, 활성성분은 사용하기 전에 적합한 비히클, 예를 들어 발열원이 없는 멸균수 기제 용액과 함께 구성하기 위해 분말 형태일 수 있다.

본 발명의 제제는 또한 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상의 좌제 기제를 사용하여 좌제 또는 정체 관장제와 같은 직장형 조성물로 제형화될 수 있다. 생식기 적용에 적합한 제형으로는 크림, 연고, 로션, 젤리, 용액제, 유제, 스프레이 또는 포말 제형이 포함된다.

본 발명의 약학 조성물은 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정화, 분말화, 유화, 캡슐화, 인트래핑(entrapping) 또는 동결건조 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 균주 및/또는 조성물은 상술한 바와 같은 특정 장애를 치료하기 위해 확인된 제품에 포함될 수 있다. 전형적으로, 제품은 박테리아 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 함유하는 패키지(package)의 형태로 또는 포장재와 결합된 형태이다. 포장재는 박테리아의 생육성을 유지하도록 선택되며, 예를 들어 패키지 성분의 용도에 대한 라벨 또는 설명서를 포함한다. 설명서는 본 발명의 방법 또는 조성물에 대해 본 명세서에 설명된 바와 같은 패키지 성분의 용도, 내용물(예, 속, 종, 균주명), 보존기간 말기에 생육가능한 박테리아의 최소 수, 적합한 저장 조건 및 소비자 정보를 위한 상세한 회사 연락처를 표시한다. 라벨은 또한 제품의 신선도와 관련된 정보를 제공할 수 있다. 이 정보는 제조일, "판매 유효 기한(sell by date)" 또는 "품질 유지 기한(best before date)"을 포함할 수 있다. 제품이 상인 또는 소비자에 의해 처리되어야할 때 "품질 유지" 기한이 명시된다. 대안적으로 또는 추가적으로 "액티브 라벨링(active labeling)"이 사용될 수 있다. 예를들어, 미국특허 제4,292,916, 5,053,339, 5,446,705 및 5,633,835 호에는 부패하기 쉬운 제품의 보존기간을 모니터링하기 위한 변색 디바이스(color changing device)가 설명되어 있다. 이들 디바이스는 반응이 시작되도록 반응층과 물리적으로 접촉시킴으로써 개시되며, 이 행위는 통상적으로 포장시에만 수행될 수 있다. 이 접근법은 모든 유통망 도처에서 신선도를 떨어뜨리는 식료품의 부패를 모니터링하는데 적합하다. 미국특허 제 5,555,223호에는 타이머 시계를 정확한 생산시간으로 설정하는 단계를 포함하여 포장에 타이밍 표시기(timing indicator)를 부착하는 방법이 개시되어 있다.

본 발명의 신규한 김치 유래 락토바실러스 브레비스 WiKim0069는 김치의 산패를 유도하는 락토바실러스 플란타룸과 다양한 유해 미생물을 억제하는 강한 항균 활성과 내산성, 내열성이 우수한 특징을 가지고 있다. 따라서 락토바실러스 브레비스 WiKim0069는 식품이나 사료, 의약, 화장품 등 다양한 분야에 첨가제로 활용될 수 있다.

도 1은 락토바실러스 브레비스 WiKim0069의 항균 활성을 나타낸 이미지이다. (a-f) 1/2 serial dilution.
도 2는 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 균주로부터 생산된 항균물질을 부분 정제한 후 Tris-Tricine SDS-PAGE와 직접검출(direct detection) 방법을 이용하여 항균물질의 분자량을 측정한 결과를 나타낸 이미지이다. (A) Tris-Tricine SDS-PAGE, (B) direct detection, Lane M, Ultra-low range molecular weight marker.
도 3은 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 균주로부터 생산된 항균물질의 염기서열(A)과 기존에 알려진 항균물질의 아미노산 서열을 비교한 결과이다 (B).

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 미생물의 분리 및 항균물질 생산균주의 선발

본 발명에 사용된 시료는 대중음식점으로부터 수집한 김치, 시중에서 판매되는 김치 및 가정에서 전통적인 방법으로 제조한 김치를 4℃에 보존하면서 사용하였다. 김치 시료를 멸균 생리적 식염수에 현탁하여 김치 부유물이 침전되도록 5분간 방치한 뒤 생리적 식염수에 순차적으로 희석하여 MRS 한천배지에 도말하고 30℃에서 1-2일간 배양하였다. 형성된 군락은 새로운 1.5% MRS agar에 접종하여 30℃에서 군락이 형성될 때까지 배양한 후 지시균으로 김치의 산패 미생물로 알려진 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이 함유된 0.7% MRS agar 5 ml을 중층하고 lawn이 형성될 때까지 배양하여 군락주위에 저해환의 생성여부를 검토하였다. 저해환이 나타난 균주에 대하여는 박테리오신 생산균주로 1차 선발하고, 1차 선발된 균주들은 액체배지에서의 활성 여부를 관찰하여 2차 선발하였다. 1차 선발균주들을 MRS 액체배지에 접종하여 16~20시간 정치배양한 후 원심분리하여 균체를 제거하고, 상등액만을 취하여 0.22㎛ sylinge filter로 잔존 균체를 완전히 제거한 후 1.5% MRS agar 위에 지시균락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이 함유되어있는 0.7% MRS agar 5 ml을 중층하여 준비한 뒤 상등액 20 ㎕를 점적하고, 30℃에서 배양하여 저해환의 형성을 검토한 결과 그 중에서 저해환이 가장 큰 WiKim0069를 선발하였다.

실시예 2: 선발 미생물의 동정

선발된 미생물 WiKim0069에 대한 형태적, 생리적, 생화학적 실험을 통하여 관찰을 실시하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 같다. 보다 더 정확한 동정을 위하여 16S 리보좀 RNA(ribosomal RNA) 분석을 실시하였다. 16S rRNA 유전자(gene) 염기서열[SEQ ID NO: 1]을 GenBenk의 BLAST 데이터와 비교한 결과에 따라 선발미생물은 락토바실러스 브레비스와 가장 가까운 유연관계를 나타내었다. 따라서, 선발미생물을 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 동정하였고, 락토바실러스 브레비스 WiKim0069(Lactobacillus brevis WiKim0069)로 명명하고, 2017.10.20자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호 KCCM12134P).

락토바실러스 브레비스 WiKim0069의 형태적, 생리적, 생화학적 특성

특성	락토바실러스 브레비스WiKim0069
형태	간균
그람 염색	그람 양성
카탈라아제(Catalase)생성	생성 안함
포자 형성	형성 안함
글루코스로부터 가스 생성	생성함
호기조건에서의 생장	생장함

SEQ ID NO: 1

AGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTTGCGAAGTCGTGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGAGATAACCTTCGGGAGTCAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA

실시예 3: 선발 미생물의 항균 활성 확인

선발된 미생물이 생산하는 항균물질의 항균 활성 확인은 spot-on-lawn 방법을 사용하여 수행하였다.

항균물질을 생산하는 락토바실러스 브레비스 WiKim0069를 MRS 액체배지 20 ml에 1%가 되게 접종하여 30℃에서 16시간 배양한 후 배양액을 8,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고, 상등액만을 취하여 0.22㎛ sylinge filter로 잔존 균체를 완전히 제거한 후 1.5% MRS agar 위에 지시균 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이 함유되어있는 0.7% MRS agar 5 ml을 중층하여 준비한 고체배지에 점적한 후 상등액이 확산되도록 상온에서 약 30분간 건조시킨 후 30℃에서 16시간 배양하였다(도 1).

실시예 4: 항균 물질의 항균 스팩트럼 조사

선발된 미생물 락토바실러스 브레비스 WiKim0069가 생산하는 항균물질(박테리오신)의 항균 범위는 여러 종류의 젖산균에 대하여 웰-확산(well-diffusion)방법으로 실시하였으며, 항균 효과는 하기 표 2에 나타내었다.

본 항균 물질(박테리오신)은 락토바실러스(Lactobacillus), 류코노스톡(Leuconostoc), 피디오코커스(Pediococcus) 및 마이크로코커스(Micrococcus) 속을 포함한 모든 젖산균종들에 대하여 광범위한 항균 활성을 나타내었다.

락토바실러스 브레비스 WiKim0069가 생산한 항균물질의 항균 스펙트럼

지시균	Origin	저해환 ( 직경 , mm)
락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)	ATCC 8014	9
락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis)	ATCC 14869	17
락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sake)	ATCC 15521	8
류코노스톡 메센테로이드 (Leuconostoc mesenteroides)	ATCC 9135	1
류코노스톡 파라메센테로이드 (Leuconostoc paramesenteroides)	KCCM4 0114	10.5
피디오코커스 애시디락티시 (Pediococcus acidilactici)	ATCC 8081	10
피디오코거스 파블루스 (Pediococcus parvulus)	ATCC 19371	12
마이크로코커스 류테어스 (Micrococcus luteus)	ATCC 10240	1

실시예 5: 항균물질의 효소에 대한 영향 및 온도 안정성

선발된 미생물 락토바실러스 브레비스 WiKim0069의 부분 정제액을 가지고 본 실험을 수행하였다.

WiKim0069의 부분 정제액은 MRS 액체배지 100 ml에 1%가 되게 접종하여 30℃에서 16시간 배양한 후 8,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거한 상등액에 황산암모늄을 45% 포화농도로 첨가한 후 4℃에서 하룻밤 방치하고, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 침전물만을 회수하여 50 mM sodium acetate buffer (pH5.0)에 현탁한 후 투석을 실시하였다. 투석은 molecular weight cutoff이 1 kDa인 투석막을 사용하여 12시간 마다 새로운 50 mM sodium acetate buffer (pH5.0)로 교환하면서 부분정제하여 -20℃에서 보존하면서 실험에 사용하였다. 항균 활성의 정량적인 측정을 위해서는 상등액을 새로운 살균 액체배지를 이용하여 순차적으로 2배씩 희석하여 고체배지에 점적한 후 항균활성을 측정하였고, 활성단위(activity unit, AU)는 1 ml 당 항균활성을 나타내는 최대 희석 배수의 역수로 나타내었다. 이렇게 제조된 항균물질 부분 정제액에 단백질 가수분해 효소인 pepsin, Trypsin, pronase E, Proteinase K, α,β-chymotrypsin와 당분해효소인 α-amylase 및 지질분해효소인 Lipase를 최종농도 1 mg/ml이 되게 첨가하여 37℃에서 2시간 배양하여 반응시킨 후 잔존활력을 측정한 결과 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 Lipase에 의해 부분적으로 활성이 소실되었고, 단백질 분해효소 trypsin, pepsin, Proteinase K, α,β-chymotrypsin과 bacterial 단백질 분해효소 pronase E 및 당분해효소 α-amylase에 의하여는 활성이 거의 소실되었다. 또한, 부분정제된 항균물질 용액을 pH 3.0, 5.0 및 7.0에서 열처리를 하여 잔존활력을 측정한 결과는 <표 4>와 같다. 100℃에서 20분간 열처리를 하였을 때 pH 3.0과 5.0에서는 활성이 부분적으로 소실된 반면, pH 7.0에서는 활성이 거의 소실됨을 알 수 있었다. 121℃에서 15분간 열처리를 하였을 때도 pH 3.0과 5.0에서 활성이 부분적으로 소실되었으며, pH 7.0에서는 활성이 거의 소실되었다. 위 같은 결과로 미루어 볼 때 본 항균물질은 산성인 조건에서 열에 대하여 안정한 것으로 판단되었다.

분해효소 처리에 의한 항균 물질의 잔존 활성

효소처리	잔존활성(AU/ml)
대조구	8192
Pepsin	64
Trypsin (Type II-S)	<8
Pronase E	<8
Proteinase K	<8
α-chymotrypsin	64
β-chymotrypsin	64
α-amylase (type VII-A)	64
Lipase (type VII)	256

열 처리에 의한 항균물질의 잔존 활성

pH 조건	대조구	열처리 후 잔존 활성(AU/ml)
pH 조건	대조구	100℃, 20분	121℃, 15분
3.0	32768	16384	16384
5.0	131072	16384	4096
7.0	8192	128	<8

실시예 6: 항균 물질의 분자량 측정

실시예 5에 나타낸 바와 같이, 항균물질 WiKim0069의 부분 정제액은 MRS 액체배지 1 L에 1%가 되게 접종하여 30℃에서 16시간 배양한 후 8,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거한 상등액에 황산암모늄을 45% 포화농도로 첨가한 후 4℃에서 하룻밤 방치하고, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 침전물만을 회수하여 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0)에 현탁한 후 투석을 실시하였다. 투석은 molecular weight cutoff이 1 kDa인 투석막을 사용하여 12시간 마다 새로운 50 mM sodium acetate buffer (pH5.0)로 교환하면서 부분 정제하여 -20℃에서 보존하면서 실험에 사용하였다. 부분 정제한 항균 물질의 분자량을 측정하기 위해 트리스-트라이신 SDS-PAGE를 실시하였고, 항균 물질 유무를 확인하기 위해 직접 검출(direct detection) 방법을 수행하였다. 부분 정제한 항균물질의 전기영동과 직접 검출(direct detection)을 수행한 결과, 항균활성을 나타내는 투명환이 형성된 밴드가 약 16.4 kDa에서 확인되었고, 밴드 주위로 투명환이 형성됨을 확인하였다 (도 2). 이는 도 3에서 나타내는 항균물질의 분자량(5kDa)과 큰 차이를 보이는데, 실시예 5에서 수행되어진 분해효소 처리에 의한 영향을 고려했을 때, 당과 지방이 결합되어있는 형태를 나타내어 분자량의 차이가 나는 것으로 사료된다.

실시예 7: 항균물질의 염기서열 및 유사 항균물질의 아미노산 서열 비교

락토바실러스 브레비스 WiKim0069가 생산하는 항균물질의 유전정보는 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 게놈정보를 활용하여 마이닝(mining)하였다. 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 게놈 DNA 서열을 BAGEL2(http://bagel2.molgenrug.nl/index.php)에 입력하여 항균물질의 구조유전자 및 항균물질 생산관련 유전자 클러스터를 수집하였다. 도 3의 (A)는 락토바실러스 브레비스 WiKim0069가 생산하는 항균 물질의 DNA　염기서열 정보이며, 도 3의 (B)는 락토바실러스 브레비스 WiKim0069가 생산하는 항균 물질과 기존에 알려져 있는 락토바실러스 브레비스 925A에서 분리된 항균물질 Brevicin 925A와 락토바실러스 플랜타룸에서 분리된 항균물질 Plantaricin 1.25 beta의 아미노산 서열을 비교한 결과이다. 3개의 항균물질의 아미노산 서열을 비교한 결과 bacteriocin leader sequence인 GG motif 다음의 서열 중 각각 3개, 4개의 아미노산 서열이 다름을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 락토바실러스 브레비스 WiKim0069의 항균물질은 기존에 밝혀진 항균물질과 다른 신규한 항균물질로 사료된다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12134

20171020

<110> Korea Food Research Institute <120> Lactobacillus brevis WiKim0069 <130> P17R10C1376 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1492 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus brevis WiKim0069 <400> 1 cgcgaataca tgaaagtgga acgagcttcc gtgtaatgac gtgcttgaac tgatttcaac 60 aatgaagcga gtggcgaact gtggagtaac acgtggggaa tctgcccaga agcaggggat 120 aacacttgga aacaggtgct aataccgtat aacaacaaaa tccgcatgga ttttgtttga 180 aaggtggctt cggctatcac ttctggatga tcccgcggcg tattagttag ttggtgaggt 240 aaaggcccac caagacgatg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc cacattggga 300 ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga 360 aagtctgatg gagcaatgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa aactctgttg 420 ttaaagaaga acacctttga gagtaactgt tcaagggttg acggtattta accagaaagc 480 cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt 540 tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cttcggctta 600 accggagaag tgcatcggaa actgggagac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca 660 tgtgtagcgg tggaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtcta 720 gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga acaggattag ataccctggt 780 agtccatgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca 840 gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat 900 tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc 960 ttaccaggtc ttgacatctt ctgccaatct tagagataag acgttccctt cggggacaga 1020 atgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1080 aacgagcgca acccttatta tcagttgcca gcattcagtt gggcactctg gtgagactgc 1140 cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 1200 gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa cgagttgcga agtcgtgagg ctaagctaat 1260 ctcttaaagc cgttctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagttggaat 1320 cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380 cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc aaagccggtg agataacctt cgggagtcag 1440 ccgtctaagg tgggacagat gattagggtg aagtcgtaac aaggtagccg ta 1492 <210> 2 <211> 52 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> bacteriocin WiKim0069 <400> 2 Lys Lys Lys Lys Lys Val Ala Cys Thr Trp Gly Asn Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ser Gly Ala Val Lys Gly Ile Leu Gly Gly Pro Thr Gly Ala 20 25 30 Leu Ala Gly Ala Ile Trp Gly Ala Ser Gln Cys Ala Ser Asn Asn Leu 35 40 45 His Gly Met His 50 <210> 3 <211> 207 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> bacteriocin WiKim0069 <400> 3 atgtataaag aattaacagt tgatgaatta gcattaattg atggaggaaa gaagaagaaa 60 aaagtagctt gtacttgggg aaatgcagca gcagccgctg cttctggtgc agttaagggt 120 attcttggtg ggcctactgg tgcattggct ggagctatct ggggcgcttc acaatgcgca 180 tctaacaact tacacggcat gcactaa 207

Claims

수탁번호 KCCM12134P의 락토바실러스 브레비스 WiKim0069(Lactobacillus brevis WiKim0069) 균주.
제 1 항에 있어서,
항균작용을 갖는 박테리오신을 생산하는 균주.
제 1 항에 있어서,
SEQ ID NO: 1로 표시되는 16s rRNA를 포함하는 균주.
제 1 항에 있어서,
김치로부터 유래하는 것인 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 젖산균에 대해 항균작용을 갖는 균주.
제 1 항에 있어서,
내산성이 우수한 것을 특징으로 하는 균주
제 1 항에 있어서,
내열성이 우수한 것을 특징으로 하는 균주
청구항 1의 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 (수탁번호 KCCM12134P) 균주로부터 생산되는 박테리오신.
제 8 항에 있어서,
SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 박테리오신.
박테리오신 활성을 갖는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 암호화하여 포함하고 있는 것으로, SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드
청구항 1의 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 (수탁번호 KCCM12134P) 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물 또는 청구항 8의 박테리오신을 포함하는 항균 조성물.
제 11항에 있어서
상기 조성물은 식품 또는 식품 첨가제인 항균 조성물.
청구항 1의 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 (수탁번호 KCCM12134P) 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물 또는 청구항 8의 박테리오신을 포함하는 식품 첨가제 조성물.
청구항 1의 락토바실러스 브레비스 WiKim0069 (수탁번호 KCCM12134P) 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물 또는 청구항 8의 박테리오신을 포함하는 사료 첨가제 조성물.