KR20160107635A - 제한된 항균작용을 갖는 박테리오신 생산 락토바실러스 람노서스 cjnu 0519 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 수탁번호 KCTC 12751BP로 기탁된, 박테리오신을 생산하는 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519를 제공한다.
따라서 본 발명은 식중독 균을 포함하는 제한된 세균에 대해서만 항균활성을 보이는 박테리오신을 생산하는 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519를 제공하는 효과가 있다.
따라서 본 발명은 식중독 균을 포함하는 제한된 세균에 대해서만 항균활성을 보이는 박테리오신을 생산하는 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519를 제공하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 제한된 항균작용을 갖는 박테리오신 생산 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 식중독 균을 포함하는 제한된 세균에 대해서만 항균활성을 보이는 박테리오신(람노신 519) 생산 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519 균주에 관한 것이다.
프로바이오틱스는 우리 몸에 유익한 균을 일컫는다. 면역세포의 70%가 들어있는 장을 튼튼하게 해 장 건강은 물론 면역력강화에 도움이 된다. 대표적인 균은 락토바실러스균과 비피더스균이 있으며, 이 중 락토바실러스균은 주로 소장에서 면역과 항균물질 생성, 장내 세균구성 정상화 및 유해균생성 억제 등의 역할을 한다.
대한민국 공개특허공보 제10-2014-0148479호에는 락토바실러스 람노서스 균주를 이용한 바이오프로텍션이 개시되어 있다.
종래의 유산균을 통해 생산되는 박테리오신의 경우 대부분 넓은 범위의 항균작용을 가지고 있어 식중독 균뿐만 아니라 인체 유익균인 유산균도 동시에 억제하는 문제점이 있었다.
본 발명은, 식중독 균을 포함하는 제한된 세균에 대해서만 항균활성을 보이는 박테리오신(람노신 519) 및 이를 생산하는 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519를 제공하는데 목적이 있다.
본 발명은, 수탁번호 KCTC 12751BP로 기탁된, 박테리오신을 생산하는 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519(Lactobacillus rhamnosus CJNU 0519, 수탁번호 KCTC 12751BP; 이하 CJNU 0519)를 제공한다.
상기 CJNU 0519는, 서열번호 1에 기재된 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지며 제한된 항균작용을 갖는 것이 특징이고, 치즈에서 분리되는 것이 특징이며, 리스테리아 모노사이토제네스 KCTC 3569(L. monocytogenes KCTC 3569) 또는 스태필로코커스 아우레우스 ATCC 14458(S. aureus ATCC 14458) 균주에 대해 항균작용을 갖는 것이 특징이다.
본 발명은, 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519로부터 생산되는 박테리오신 람노신 519를 제공한다.
상기 람노신 519는, 리스테리아 모노사이토제네스 KCTC 3569 또는 스태필로코커스 아우레우스 ATCC 14458 균주에 대해 항균작용을 갖는 것이 특징이다.
또한 상기 람노신 519는 부분 정제하여 사용될 수 있다.
본 발명은, CJNU 0519 또는 람노신 519를 포함하는 기능성 식품, 천연보존제 및 항균제를 제공한다.
본 발명은 식중독 균을 포함하는 제한된 세균에 대해서만 항균활성을 보이는 박테리오신을 생산하는 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519를 제공하는 효과가 있다.
도 1은 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519(1)와 부분 정제된 람노신 519(2)의 항균활성을 나타낸 이미지이다.
도 2는 부분 정제된 람노신 519(1), 단백질 분해효소 처리(2), 지질 분해효소 처리(3) 및 전분 분해효소 처리(4)한 spot on the lawn assay 결과를 나타낸 이미지이다.
도 3은 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519 균주로부터 생산된 람노신 519를 부분 정제한 후 식중독 균인 리스테리아 모노사이토제네스가 접종된 펩톤수에 첨가하여 경시적으로 리스테리아 모노사이토제네스의 균수 변화를 관찰한 그래프이다.
도 2는 부분 정제된 람노신 519(1), 단백질 분해효소 처리(2), 지질 분해효소 처리(3) 및 전분 분해효소 처리(4)한 spot on the lawn assay 결과를 나타낸 이미지이다.
도 3은 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519 균주로부터 생산된 람노신 519를 부분 정제한 후 식중독 균인 리스테리아 모노사이토제네스가 접종된 펩톤수에 첨가하여 경시적으로 리스테리아 모노사이토제네스의 균수 변화를 관찰한 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통해 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수 있다. 여서서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위하여 제공되는 것이므로 이하의 실시예에 의하여 본 발명의 권리범위가 제한되어서는 안 된다.
<실시 예 1> CJNU 0519 균주의 동정
상기 CJNU 0519 균주는 자연 치즈로부터 분리하였다. 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 분석법을 사용하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열의 분석은 국내 생명공학회사(마크로젠)에 의뢰하여 수행하였다. CJNU 0519 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 서열번호1에 나타내었다. GenBank 염기서열 데이터베이스를 이용하여 분석된 16S rRNA 염기서열의 상동성(homology)을 분석한 결과 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus NBRC 3425; GenBank accession no. NR 113332.1)와 가장 높은 일치율(상동성 99%)을 보여 CJNU 0519 균주를 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519(Lactobacillus rhamnosus CJNU 0519)로 명명하였고, 이로부터 생산된 박테리오신을 람노신 519(rhamnocin 519)로 명명하였다.
<실시예 2> 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519 균주와 이로부터 생산된 박테리오신(람노신 519)의 항균 활성
락토바실러스 람노서스 CJNU 0519 균주(이하 CJNU 0519 균주)와 배양 상등액의 항균활성을 검증하기 위하여 deferred antagonism assay와 spot on the lawn assay를 수행하였다.
CJNU 0519 균주 배양액 1 ㎕를 MRS agar plate에 점적한 후 37 ℃에서 12 시간 배양하였다. 이후 MRS top agar(0.7 % agar, w/v)에 지시균(락토바실러스 애시도필러스)을 2 % 첨가하여 섞은 후 상기의 MRS agar plate에 점층하고 37 ℃에서 12 시간 배양한 후 콜로니 주변의 생육 저해환(inhibition zone)이 형성되었는지를 관찰하여 도 1에 나타내었다(deferred antagonism assay).
1 M NaOH를 이용하여 CJNU 0519 배양액 pH를 중성으로 조정하고 원심분리 및 여과(0.22 ㎛ 주사필터)한 후 그 여액 회수하였다. 회수된 여액에 아세톤을 1:3 비율로 섞고 영하 20 ℃에서 3 시간 방치 후 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 농축 상등액은 회전증발농축기(rotary evaporator)를 이용하여 얻었으며 농축액 1 ㎕를 상기의 MRS top agar가 점층 된 plate 위에 점적하였다. 이를 37 ℃ 배양기에서 12 시간 배양한 후 점적된 영역 주위에 형성된 생육 저해환을 관찰하였다(spot on the lawn assay). 그 결과 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519 및 그 상등액에서 사용한 지시균에 대하여 항균활성이 나타남을 확인하였고 이는 CJNU 0519 균주가 박테리오신을 생산함을 의미한다.
추가적으로 단백질성의 박테리오신임을 확인하기 위해 분해효소를 처리한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2를 살펴보면, 전분(α-amylase) 및 지질 분해효소(lipase)에 의해서는 활성 소실이 관찰되지 않았으나 단백질 분해효소(protease)에 의해서만 활성이 소실되었다. 이는 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519 균주가 단백질성의 박테리오신을 생산하고 있음을 증명해주는 결과이다.
<실시 예 3> 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519 균주 및 부분 정제된 람노신 519의 항균 스펙트럼
락토바실러스 람노서스 CJNU 0519 균주 및 부분 정제된 람노신 519의 항균 스펙트럼을 확인하기 위하여 상기의 deferred antagonism assay와 spot on the lawn assay 방법으로 그람양성세균(Lactobacillus reuteri KCTC 3679, Lactobacillus casei CJNU 0588, Lactobacillus acidophilus NCDO 955, Leuconostoc mesenteroides CJNU 0147, Pediococcus acidilactici K10, Enterococcus faecium MK3, Bacillus licheniformis 1-B-12, Listeria monocytogenes KCTC 3569, Staphylococcus aureus ATCC 14458), 그람음성세균(Escherichia coli DH5α) 및 효모(Saccharomyces cerevisiae ATCC 24858) 균주에 대해 항균활성을 측정하여 표 1에 나타내었다. 그 결과 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519를 배양한 경우 5균주(L. acidophilus NCDO 955, P. acidilactici K10, B. licheniformis 1-B-12, L. monocytogenes KCTC 3569, S. aureus ATCC 14458)에 대하여 항균활성을 보였으나 부분 정제된 람노신 519의 경우 3균주(L. acidophilus NCDO 955, L. monocytogenes KCTC 3569, S. aureus ATCC 14458)에 대해서만 항균활성을 보였다. 차이가 나는 두 균주(P. acidilactici K10, B. licheniformis 1-B-12)는 CJNU 0519 세포가 증식하면서 생성된 산(acid)에 의해 저해를 받은 것이라고 할 수 있다. 부분 정제된 람노신 519의 경우 유해균 중에서도 식중독 세균인 L. monocytogenes KCTC 3569와 S. aureus ATCC 14458에 대해서만 항균활성을 보이고 있어 제한된 항균작용을 가지는 박테리오신임을 알 수 있다.
<실시 예 4> 부분 정제된 람노신 519의 활성 모드
상기 실시예 3에서 람노신 519가 생육을 억제하는 것으로 확인된 리스테리아 모노사이토제네스 균주(L. monocytogenes KCTC 3569)에 대한 활성 모드 실험을 수행하여 도 3에 나타내었다. 펩톤수(0.1 %, w/v)에 리스테리아 모노사이토제네스 균주를 접종하고 37 ℃에서 3 시간 배양 한 후 부분 정제된 람노신 519를 각각 150, 300 AU/mL 농도로 첨가한 후 경시적으로 리스테리아 모노사이토제네스의 균수를 MRS agar plate 상에서 측정하였다. 그 결과 람노신 519를 첨가하지 않은 경우 초기 균수(5.75 Log CFU/mL)와 실험 종료 시점(21 시간; 5.08 Log CFU/mL)의 균수에 큰 차이가 발생하지 않은 반면 150 AU/mL 첨가한 군에서는 초기 균수가 6.06 Log CFU/mL로 나타났으나 3 시간째(람노신 519 첨가 시점)에는 0.33 Log CFU/mL로 급격히 줄어들었고 9 시간째에는 검출되지 않았다. 또한 300 AU/mL를 첨가한 경우에는 3 시간째부터 검출되지 않았다. 이 결과는 리스테리아 모노사이토제네스 균주에 대하여 람노신 519가 아주 강한 항균작용을 가지고 있음을 의미한다.
<110> Korea National University of Transportation
<120> LACTOBACILLUS RHAMNOSUS CJNU 0519 PRODUCING BACTERIOCIN HAVING A
NARROW ANTIMICROBIAL SPECTRUM AND USE THEREOF
<130> P15-0022
<160> 1
<170> KoPatentIn
<210> 1
<211> 1531
<212> DNA
<213> Lactobacillus rhamnosus
<400> 1
gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gagttctgat tattgaaagg 60
tgcttgcatc ttgatttaat tttgaacgag tggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac 120
ctgcccttaa gtgggggata acatttggaa acagatgcta ataccgcata aatccaagaa 180
ccgcatggtt cttggctgaa agatggcgta agctatcgct tttggatgga cccgcggcgt 240
attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcaatga tacgtagccg aactgagagg 300
ttgatcggcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg 360
aatcttccac aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggctttc 420
gggtcgtaaa actctgttgt tggagaagaa tggtcggcag agtaactgtt gtcggcgtga 480
cggtatccaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 540
ggcaagcgtt atccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga 600
tgtgaaagcc ctcggcttaa ccgaggaagt gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga 660
agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag 720
tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa 780
caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga atgctaggtg ttggagggtt 840
tccgcccttc agtgccgcag ctaacgcatt aagcattccg cctggggagt acgaccgcaa 900
ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 960
cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcttt tgatcacctg agagatcagg 1020
tttccccttc gggggcaaaa tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatgac tagttgccag catttagttg 1140
ggcactctag taagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 1200
catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac gagttgcgag 1260
accgcgaggt caagctaatc tcttaaagcc attctcagtt cggactgtag gctgcaactc 1320
gcctacacga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggg tgaatacgtt 1380
ccccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgaaaag tttgtaacac ccgaagccgg 1440
tggcgtaacc ctttttaggg agcgagccgt ctaaagtggg acaaatgatt aaggtgatta 1500
cagagaagga ccgcgaaaga acaaaaaaaa a 1531
Claims (9)
- 수탁번호 KCTC 12751BP로 기탁된, 박테리오신을 생산하는 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519.
- 청구항 1에 있어서,
서열번호 1에 기재된 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지며 제한된 항균작용을 갖는 박테리오신을 생산하는 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519.
- 청구항 1에 있어서,
치즈에서 분리되는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519.
- 청구항 1에 있어서,
상기 CJNU 0519는,
리스테리아 모노사이토제네스 KCTC 3569 또는 스태필로코커스 아우레우스 ATCC 14458 균주에 대해 항균작용을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519.
- 락토바실러스 람노서스 CJNU 0519로부터 생산되는 박테리오신 람노신 519.
- 청구항 4에 있어서,
상기 람노신 519는,
리스테리아 모노사이토제네스 KCTC 3569 또는 스태필로코커스 아우레우스 ATCC 14458 균주에 대해 항균작용을 갖는 것을 특징으로 하는 람노신 519.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 CJNU 0519 또는, 청구항 5 또는 6 중 어느 한 항의 람노신 519를 포함하는 기능성 식품.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 CJNU 0519 또는, 청구항 5 또는 6 중 어느 한 항의 람노신 519를 포함하는 천연보존제.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 CJNU 0519 또는, 청구항 5 또는 6 중 어느 한 항의 람노신 519를 포함하는 항균제.
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|---|---|---|---|---|
| CN108148789A (zh) * | 2018-03-06 | 2018-06-12 | 河南科技学院 | 一种鼠李糖乳杆菌及其在制备细菌素中的应用 |
| CN109266568A (zh) * | 2018-08-19 | 2019-01-25 | 东北农业大学 | 一种具有高产细菌素的益生功能鼠李糖乳杆菌及其应用 |
| KR20190061122A (ko) | 2017-11-27 | 2019-06-05 | 한국식품연구원 | 락토바실러스 브레비스가 생산하는 천연항균물질 및 유전자의 염기서열 |
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| KR20140148479A (ko) | 2012-04-09 | 2014-12-31 | 시에이치알. 한센 에이/에스 | 락토바실러스 람노서스 균주를 이용한 바이오프로텍션 |
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| CN108148789B (zh) * | 2018-03-06 | 2021-05-25 | 河南科技学院 | 一种鼠李糖乳杆菌及其在制备细菌素中的应用 |
| CN109266568A (zh) * | 2018-08-19 | 2019-01-25 | 东北农业大学 | 一种具有高产细菌素的益生功能鼠李糖乳杆菌及其应用 |
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