KR100509558B1 - 락토바실러스 플란타룸 ｊ9 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플란타룸 J9 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 리스테리아 모노사이토제네스 및 엔테로코커스 패칼리스에 대하여 항균성을 가지며, 광범위의 pH 안정성 및 열 안정성을 나타내는 박테리오신을 생산하는 락토바실러스 플란타룸 J9에 관한 것이다.

Description

락토바실러스 플란타룸 Ｊ9 및 이의 용도{LACTOBACILLUS PLANTARUM J9 AND USE THEREOF}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 신규 유산균 및 이로부터 생산되는 박테리오신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항균활성을 가지며 열 및 pH에 대하여 안정성을 나타내는 박테리오신을 생산하는 락토바실러스 플란타룸 J9 및 이의 용도에 관한 것이다.

[종래기술]

식품의 변질을 막고 저장성을 향상시키기 위한 다양한 방법들이 있다. 그 방법들은 물리적인 방법, 화학적인 방법 및 미생물 발효에 의한 방법등이 있다. 물리적인 방법의 예로는 가열, 동결 및 건조가 대표적이며, 화학적인 방법의 예로는 식품의 산성화, 소금 설탕을 이용한 절임법, 벤조익 산, 소듐 벤조에이트, 소르빅 산, 프로피오네이트, 설피트 및 에폭사이드와 같은 화학합성 방부제 사용이 있다. 그 밖에도 설파메타진, 옥시테트라사이클린, 틸로신, 클로로테트라사이클린과 같은 항생물질을 첨가하는 방법이 있다.

상기 방법 중 물리적인 방법은 그 활용점에 제한이 있어, 화학 보존제를 이용한 방법이 보편적으로 사용되고 있는 실정이다. 그러나, 식품에 첨가하는 각종 화학 보존제는 자체 독성으로 인하여 사용량이 제한되어 있으며, 사용 안전성에 대한 논란이 계속되어오고 있다. 또한 소비자들이 갖는 부정적인 이미지로 인해 사용이 갈수록 제한받고 있는 실정이다.

이에, 화학보존제를 대체해 줄 수 있는 천연항균제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 일환으로 발효식품으로부터 박테리오신을 생산하는 균주를 개발하고자 하는 노력들이 시도되어 오고 있다.

박테리오신은 미생물이 생산하는 천연의 항균물질로서, 주로 단백질 또는 단백질과 탄수화물의 복합체로 구성되어 있는 단백질이다. 박테리오신은 단백질로 구성되어 있기 때문에 인체에 섭취되면 소화기관의 단백질 가수 분해 효소에 의해 쉽게 분해되어 인체에 무독하고 잔류성이 없다는 장점이 있다.

박테리오신을 생산하는 젖산균은 크게 5군으로, 락토바실러스, 락토코커스, 루코노스톡, 페디오코커스 및 카모박테리움으로 나누어 볼 수 있으며, 박테리오신은 분자특성에 따라 하기 표 1과 같이 분류된다.

군	분자특성	대표적인 박테리오신	유전자위치
군I	란티바이오틱스(lanthibiotics)	니신(nisin)	염색체
군II	작음대부분 소수성세포막에 활성을 가짐열에 안정적임	락타신 F락토코신루코신 A페디오신 PA-1카르노박테리오신	에피소말플라스미드플라스미드플라스미드플라스미드/염색체
군III	큰 분자열에 약함	헬베티신 J	염색체
군IV	단백질 복합체	락토신 27	확인 안됨

본 발명은 유해균 저해효과가 우수한 박테리오신을 생산하는 신규 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 열 및 pH에 안정한 박테리오신을 생산하는 신규 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 신규 균주로부터 박테리오신을 최대로 생산할 수 있는 최적조건을 확립하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 신규한 박테리오신을 제공하는 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 리스테리아 모노사이토제네스 및 엔테로코커스 패칼리스에 대하여 항균활성을 나타내는 락토바실러스 플란타룸 J9(KCTC 10508BP)을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 J9, 이의 배양액 및 이로부터 생산되는 박테리오신으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되는 것을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 J9(KCTC 10508BP) 또는 이의 배양액을 포함하는 식품을 제공한다. 바람직하기로는 상기 식품은 김치 제조시 락토바실러스 플란타룸 J9(KCTC 10508BP) 또는 이의 배양액을 첨가하여 제조한 김치이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 신규한 균주인 락토바실러스 플란타룸 J9에 관한 것이다.

락토바실러스 플란타룸 J9는 각각 김치시료로부터 분리한 것으로, 세포외로 항균물질인 박테리오신을 분비한다. 균주 분리방법은 도 1에 간략하게 언급되어 있다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 J9는 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지에 소재한 유전자은행에 2003년 8월 18일자로 기탁하였고, 기탁번호 KCTC 10508BP를 받았다.

락토바실러스 플란타룸 J9는 특히 리스테리아 모노사이토제네스와 엔테로코커스 패칼리스의 생육을 저해하는 박테리오신을 생산하며, 락토바실러스 플란타룸 J9에서 생산되는 박테리오신은 이하 박테리오신 J9라 기재한다.

박테리오신 J9는 단백질 또는 펩타이드에 작용하는 효소를 제외한 효소에 대해서는 안정성을 가지며, 통상적인 용매 예를 들면 에탄올, 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤 및 클로로포름에 의하여 활성이 저해되지 않는다. 또한 박테리오신 J9은 pH가 3 내지 10 범위에서 안정적이며, 열에도 매우 안정한다. 따라서, 락토바실러스 플란타룸 J9 또는 이로부터 생산되는 박테리오신은 미생물 오염을 방지할 목적으로 사용될 수 있다.

이에, 본 발명에서는 락토바실러스 플란타룸 J9로부터 박테리오신을 최적으로 생산하기 위한 조건을 확립하였다. 박테리오신 J9는 각 균주의 배양시 2시간경부터 생산되기 시작하며, 배양온도 및 배양시간에 따라 박테리오신 생산량은 다소 차이가 난다. 락토바실러스 플란타룸 J9는 25 내지 37 ℃에서 최소 12시간 배양하여 박테리오신 J9를 수득할 수 있으며, 바람직하기로는 37 ℃에서 최소 18시간 배양하는 것이다.

상기 균주로부터 박테리오신을 분리하는 방법은 통상의 박테리오신 분리방법으로 실시할 수 있다. 본 발명에서는 일 실시예로, 이온교환수지크로마토그래피를 실시하여 박테리오신을 분리하거나 또는 그 이후에 역상 HPLC를 추가로 실시하여 박테리오신을 분리하였다.

본 발명의 박테리오신 J9는 식품 보존제로 사용할 수 있으며, 특히 김치제조에 사용하여 김치의 저장성 및 향미를 보다 증가시킬 수 있다.

또한 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 J9, 이의 배양액 및 이로부터 생산되는 박테리오신으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되는 것을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다. 본 발명의 항균용 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 약제일 수 있다.

항균용 조성물을 약제로 사용하는 경우 투여방법은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 바람직하기로는 경구 투여이다. 상기 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 주사제(INJECTIONS), 캅셀제(CAPSULES) 및 환제(PILLS)등으로 제조할 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물은 통상의 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있으며, 상기 희석제 또는 부형제는 항균용 조성물의 사용방법 및 용도에 적절한 것을 채택할 수 있다. 대표적인 희석제 또는 부형제로는 물, 덱스트린 또는 생리식염수가 있다.

또한 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 J9 또는 이의 배양액을 포함하는 식품을 제공한다. 상기 식품은 바람직하기로는 발효식품이고, 대표적인 것으로는 김치가 있다. 락토바실러스 플란타룸 J9 또는 이의 배양액은 김치 제조시 김치에 첨가할 수 있으며 이때 첨가함량은 김치의 종류 및 김치 양념 등의 조건에 따라 적절히 조절할 수 있다. 일예로 배양액은 김치 1 ㎏당 10 내지 500 ㎖ 첨가할 수 있다. 제조된 김치는 무첨가군에 비하여 맛, 색깔 및 냄새가 모두 우수한 장점이 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 신규한 유산균 분리

슈퍼, 대형마트, 재래 시장 등에서 100 여개의 서로 다른 배추김치를 구입하여, 박테리오신을 생산하는 유산균을 분리하고자 하였다.

MRS 고체 배지에 김치시료를 10 배씩 단계적으로 희석(10^-1∼10^-7)한 것을 100 ㎕ 도말하여 30 ℃에서 24 시간 배양하였다. 여기에 리스테리아 모노사이토제네스(ATCC 19111), 스타필로코커스 아우레우스(subsp. aureusv ATCC 25923) 및 락토바실러스 플란타룸(ATCC 14917) 각각의 배양액을 0.7 %상층아가와 혼합하여 도말된 플레이트 위에 5 ㎖ 중층하였고, 24 시간, 30 ℃에서 배양한 다음 저해환을 형성하는 균주를 선별하였다. 김치시료로부터 박테리오신 생산균을 분리하는 방법은 도 1에 간략하게 기재하였다.

락토바실러스 플란타룸은 MRS 배지에서, 리스테리아 모노사이토제네스는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지에서, 그리고 스타필로코커스 아우레우스는 LB 배지에서 배양하였다. 각 균주 배양액은 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상등액 2 ㎕를 MRS 한천배지에 점적하여 두고 건조한 다음 시킨 후 리스테리아 모노사이토게네스(ATCC19111), 스타필로코커스 아우레우스(subsp. aureusv ATCC 25923) 또는 락토바실러스 플란타룸를 중층하였다. 또한 점적하기 전에 시료들중 하나는 상등액에 프로테이즈K를 처리하여 사용하였다. 중층한 플레이트는 배양기에 두어 균주를 배양시키고, 저해환의 생성유무를 확인하였다.

도 2는 김치로부터 선별한 박테리오신 생산균주가 형성한 저해환을 나타낸 것으로, 1은 선별균주 J9의 배양액이고, 2은 배양액의 상등액이고, 3은 프로테아제 처리된 배양액의 상등액이다. 도 2에서 J9 균주의 배양액 상등액내에는 미생물 생육 억제물질이 존재하는 것으로 확인되었으며, 이 물질은 프로테이즈K 처리에 의하여 역가가 상실되는 것으로 관찰되므로 미생물 생육 억제물질은 단백질인 박테리오신인 것으로 확인하였다.

상기 실험으로 J9 균주를 분리하였다.

실시예 2: 신규 균주의 동정

J9 균주를 동정하였다.

2-1. 일반적인 특징

J9 균주의 형태학적, 생화학적 특성을 조사하였다(Bergey's Manual of Systeratic Bacteriology).

J9는 그람양성, 카탈라제 음성, 비운동성인 막대기형태(bacilli form)으로 관찰되었다.

2-2. 당 이용성

API 50 CHL 키트(bioMeriux)를 사용하여 당 이용성을 조사하였다. 먼저 3 번의 순수분리를 거친 균주 각각을 API 50 CHL 배지에 녹여 2 McFarland로 탁도를 적정하였다. 각각의 균액을 스트립의 튜브에 분주하고 미네랄 오일을 첨가하여 30 ℃에서 혐기적 배양하였다. 24 시간 및 48 시간 후에 각각의 이용성을 확인한 다음(표 2), API LAB PLUS (판독프로그램)으로 해석하였다(Daeschel, M. :Procedures to detect antimicrobial activities of microorganism. In "Food biopreservatives of mocrobial origin B". Ray and Daeschel, M.(eds.) CRC press, Boca Raton, p.57, 1992).

당	J9	당	J9
글리세롤	-	살리신	+
에리트리톨	-	셀로비오스	+
D-아라비노스	-	말토스	+
L-아라비노스	-	락토스	+
리보스	+	멜리빌스	+
D-자일로스	-	사카로스	+
아도니톨	-	트레할로스	+
β-메틸-자일로사이드	-	이눌린	-
갈락토스	-	멜레지토스	+
D-글루코스	+	D-라피노스	-
D-프룩토스	+	아미돈	-
D-만노스	+	글리코겐	-
L-소르보스	+	자일리톨	-
람노스	+	β-제네티오비오스	+
둘시톨	-	D-투라노스	+
이노시톨	-	D-리소스	-
만니톨	-	D-푸코스	-
소르비톨	+	L-푸코스	-
α-메틸-D-마노시드	+	D-아라비톨	-
α-메틸-D-글루코시드	+	L-아라비톨	-
N-아세틸 글루코스아민	-	글루코네이트	-
아미그달린	+	2-세토-글루코네이트	-
아루부틴	+	5-세토-글루코네이트	-
에스큘린	+

J9균주는 락토바실러스 플란타룸과 99.6% 일치하였다.

2-3. 16S rDNA 염기서열

유전자은행(GeneBank) 상에 등록 되어있는 16S rDNA의 염기서열과 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction: PCR)을 16S rDNA 단편을 증폭시킨 수 이의 염기서열을 비교하였다.

바이오닉스(Korea)에서 주문 제작한 서열번호 1의 LAB16s-F 프라이머와 서열번호 2의 LAB16s-R 프라이머를 이용하여, 상기 두 균주의 염색체 DNA로부터 16S rDNA 유전자를 증폭하였으며, 약 600 bp의 PCR 산물을 수득하였다. PCR 산물은 pEZ-T 벡터(RNA Inc, Korea)에 클로닝하여 염기서열을 결정하였다. 염기서열은 NCBI의 블라스트 프로그램에 넣어 유전자은행에 등록되어 있는 다른 16S rDNA 유전자들과 상동성을 비교하였다. 그 결과 J9 균주는 락토바실러스 플란타룸(Accession No-AF515222.1)과 99 % 상동성을 가지는 것으로 확인되었다.

이상의 결과로, JP 균주는 락토바실러스 플란타룸 J9로 명명하였다.

2-4. 플라스미드 비교

락토바실러스 플란타룸 J9를 기존에 실험실에서 보유하고 있는 엔테로코커스 속. A1(사람 장내 유래), 락토코커스 락티스 B2(5), 루코노스톡 파라메센테로이데스 B4, 락토바실러스 플라타룸 B8, 루코노스톡 메센테로이드 C7, 락토코커스 락티스 섭. 락티스(ATCC 7962) 및 락토바실러스 플란타룸(ATCC 14917)과의 차별성을 확인하고자 하였다.

각 균주들은 MRS 5 ㎖에 하룻밤 배양한 다음 플라스미드를 분리하여 아가로즈 젤 상에 전기영동하여 플라스미드 프로파일을 비교하였다.

그 결과, 락토바실러스 플란타룸 J9는 플라스미드를 포함하고 있지 않는 것으로 확인되었다.

상기와 같은 동정의 결과들로부터, 본 발명에서 분리한 락토바실러스 플란타룸 J9는 기존의 박테리오신 생산균들과는 다른 새로운 균임을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 박테리오신 생산

3-1. 박테리오신의 저해 스펙트럼 조사

락토바실러스 플란타룸 J9를 MRS 액체배지에 배양하고, 배양액을 원심분리하여 상징액 2 ㎕를 MRS 고체배지에 점적한 다음 여러 가지 균주들을 각각 중층하여 24 시간 배양한 다음 저해 여부를 관찰하였다(표 3).

균주	저해환 크기
	J9
Sal. typhimurium	-
Lb. casei YIT 9018	-
Lb. acidophillus	-
Lb. plantarumATCC 14917	-
Lb. delbrueakiisubsp. lactis ATCC 4797	-
Lb. helveticus KFRI 00347	-
Leu. mesenteroides ATCC 10830	-
Leu. mesenteroides NRRL B-512	-
Leu. mesenteroides ATCC 9135	-
Listeria monocytogenes ATCC 19111	+++
Sta. aureus subsp. aureus ATCC 25923	-
Streptococcus mutans ATCC 25175	-
Bacillus coaqulans ATCC 7050	-
Enterococcus fecalis ATCC 29212	+++
Enterococcus faecium ATCC 19953	-
Pseudomonas fluorescens ATCC 21541	-
Pseudomonas aeruginosaATCC 7700	-
Pediococcus pentosaceus NRRL B-14009	-
Aeromonas hydrophia ATCC 7966	-
E.coli O157:H7 ATCC 43894	-
E. coli K-12	-
Sta.carnosum	-
Lb.pentosus KFRI 481	-
Leu.mesenteroides KFRI 666	-

그람 양성균과 음성균 총 25 균주를 대상으로 저해 여부를 조사하였다. 락토바실러스 플란타룸 J9는 리스테리아 모노사이토제네스(ATCC 19111)과 엔테로코커스 패칼리스(ATCC 29212)의 생육을 저해하였으며, 그 외 그람 음성균은 저해하지 못하였는데, 이는 유산균 박테리오신들에 공통된 특징이다.

락토바실러스 플란타룸 J9가 생산하는 박테리오신들은 이상 결과에서 보는 것처럼 니신과 같이 저해 범위가 넓은 박테리오신이 아니라 저해범위가 좁은 것을 알 수 있다. 그리고 리스테리아를 뚜렷하게 저해하는 것으로 보아, 박테리오신들 중에서 분류상으로 ClassⅡ-a 에 속하는 신규 박테리오신들로 추정된다(Klaenhammer, T. R. 1993. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 2 ; 39-86).

락토바실러스 플란타룸 J9로부터 생산되는 박테리오신은 리스테리아에 대한 저해 효과가 우수하므로, 열 저항성 및 pH 안정성이 확인되는 경우 리스테리아 오염이 문제되는 육류제품이나 유제품 저장에 유용하다.

3-2. 박테리오신의 안정성 측정

락토바실러스 플란타룸 J9로부터 생산되는 박테리오신의 열, 효소 및 pH 안정성을 측정하였다.

여러 효소 처리, 열처리 및 유기용매 처리에 대한 J9 박테리오신의 안정성을 조사한 결과는 하기 표 4에 나타낸다.

처리		활성(AU/㎖)
대조군		128,000
효소	β-아밀레이즈	128,000
	라이소자임	128,000
	프로테이즈 K	0
	펩신	0
	RNaseA	128,000
	트립신	0
	카탈라제	128,000
	프로테이즈	0
용매	에탄올	128,000
	메탄올	128,000
	아세토니트릴	128,000
	아세톤	128,000
	클로로포름	128,000
pH	pH 3-10	128,000
열 처리	60 ℃, 10분	128,000
	60 ℃, 30분	128,000
	60 ℃, 60분	128,000
	80 ℃, 10분	128,000
	80 ℃, 30분	128,000
	80 ℃, 60분	128,000
	100 ℃, 60분	128,000
	100 ℃, 30분	128,000
	100 ℃, 60분	128,000
	121 ℃, 15분	128,000

균주에서 생산되는 박테리오신은 베타-아밀레이즈, 라이소자임, RNase 및 카탈라제 효소처리시 활성에 변화가 없었으나, 프로테이즈K, 펩신, 트립신 또는 프로테이즈 처리시 불활성화되어 박테리오신 활성을 상실하였다.

유기용매처리에서는, 박테리오신은 에탄올, 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤 또는 클로로포름에 의하여 그 활성이 변화되지 않았으며, pH가 3 내지 10 사이에서도 안정된 박테리오신 역가를 나타내었다. 이는 니신이 산성 pH에서만 안정한 것에 비하여 보다 광범위한 pH에서도 안정한 것으로 확인된 바, 여러 식품들에 첨가되는 식품보존제로 사용하는데 있어서 큰 장점이 될 수 있다.

열 처리에서, 박테리오신은 모두 열에 안정적이었다.

이상 결과들은 락토바실러스 플란타룸 J9로부터 생산되는 박테리오신들은 열안정성, pH 안정성을 함께 지니고 있어, 식품들에 첨가제로 사용하기에 매우 적합하다.

3-3. 배양조건에 따른 박테리오신 생산율 측정

락토바실러스 플란타룸 J9의 배양조건에 따른 박테리오신 생산율을 조사하였다.

각 균주는 MRS 배지에서 미리 계대 배양한 다음 새로운 MRS 배지에 1 %로 접종하고, 25 ℃, 30 ℃ 및 37 ℃에서 각각 배양하면서 2 시간 단위로 균수 변화를 측정하였다. 또한 박테리오신 생산량의 변화는 2 시간별로 시료를 채취해 spot-on-the lawn 방법을 이용해 조사하였다.

도 3a 내지 3c는 락토바실러스 플란타룸 J9의 배양온도에 따른 생육정도(■) 및 박테리오신 생산율(◆)을 나타낸 것이다. 도 3a는 배양온도 25 ℃에서, 3b는 배양온도 30 ℃에서, 4c는 배양온도 37 ℃에서의 생육정도 및 박테리오신 생산율을 나타내고 있다.

락토바실러스 플란타룸 J9는 배양 2 시간경부터 박테리오신을 생산하기 시작하였으며, 25 ℃로 배양한 경우 12 시간부터 48 시간까지, 30 ℃로 배앙한 경우 배양 14 시간부터 48 시간까지 각각 8,000 AU/㎖의 역가를 나타내었으며, 37 ℃에서 배양한 경우 18 시간부터 48 시간 사이의 역가가 16,000 AU/㎖ 로 박테리오신 역가가 가장 높게 측정되었다. 따라서 락토바실러스 플란타룸 J9로부터 박테리오신 생산하기 위한 최적조건은 37 ℃에서 18 시간 이상 배양하는 것이다.

이하 락토바실러스 플란타룸 J9에서 생산되는 박테리오신은 박테리오신 J9라 기재한다.

실시예 4: 박테리오신 정제

4-1. 이온교환 크로마토그래피

박테리오신 J9를 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 하기의 방법으로 정제하였다.

락토바실러스 플란타룸 J9를 MRS 액체배지에서 30 ℃, 24 시간 배양한 다음 원심분리하여 상등액을 수득하였고, 멤브레인 필터(0.22 ㎛)를 사용하여 여과하였다. 여과액은 이온교환 크로마토그래피(SP-Sepharose Fast Flow: Pharmacia Biotech, France)에 통과시켜 박테리오신을 이온교환수지에 결합시킨 다음 50 mM 인산완충액(pH 8.0)으로 세척한 다음 NaCl 농도구배를 0에서 1 M로 설정하여 용출을 실시하였다. 분획별로 흡광도(OD₂₈₀)를 측정하였고, 동시에 박테리오신에 민감한 지표균주를 사용하여 박테리오신 역가를 측정하였다.

도 4는 락토바실러스 플란타룸 J9 배양액의 이온교환 크로마토그래프를 나타낸 것이다. 락토바실러스 플란타룸 J9의 경우, 박테리오신 역가는 38-50 번 분획에서 관찰되었고, 이중 역가가 50,000(AU/㎖) 인 45-47 번 분획을 모아서 HPLC 정제를 위한 시료로 사용하였다.

박테리오신 역가를 보이는 분획들은 별도로 모아 -70 ℃에 저장하였다.

4-2. 박테리오신 역가를 나타내는 분획의 SDS-PAGE

상기에서 수득한 분획들은 SDS-PAGE를 수행하여 박테리오신 밴드 크기를 확인하였다.

박테리오신은 분자량이 작기 때문에 일반적으로 사용되는 SDS-PAGE 방법인 Laemmli's system(Laemmli, U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685 (1970))으로는 정확한 분자량을 산출하기 어렵다. 그래서, 트리스-트리신 SDS 완충액 시스템(Daba, H., H. Pandian, J. F. Gosselin, R. E. Simard, J. Huang, and C. Lacroix. Detection and activity of a bacteriocin produced by Leuconostoc mesenteroides. Appl. Environ Microbiol. 57:3450-3455(1991))으로 SDS-PAGE를 실시하였다.

도 5는 이온교환 크로마토그래피에서 수득한 분획물의 분자크기를 확인한 것으로, A 패널은 코마시 블루 염색한 SDS-PAGE이고, B는 지표균주 리스테리아 모노사이토제네스(ATCC19111)로 중층한 겔을 나타낸 것이다. A 패널에서 1은 사이즈 마커이고(molecular weight standards, broad range, BIO-RAD # 161-0317), 2는 사이즈 마커이고(poly peptide SDS-PAGE standards, BIO-RAD #161-0326), 3은 락토바실러스 플란타룸 J9 배양액을 이온교환 크로마토그래피를 실시하여 수득한 분획물이다. 도 5에서, 박테리오신 J9는 약 6,500 Da 이하에서 밴드가 검출되었다. 일반적인 클라스 Ⅱ-a 박테리오신의 분자량은 12 kDa 이하인 것으로 알려져 있고, 리스테리아를 강하게 저해한다는 사실과 연관시켜 볼 때 박테리오신 J9는 클라스 Ⅱ-a 그룹에 속하는 박테리오신일 것으로 추정된다.

4-3. HPLC

박테리오신 역가를 보이는 분획들은 C₁₈-역상 HPLC 컬럼(μondapak C₁₈ equilibrated with ddH₂O)을 통과시켰다. 0.1 % 트리플루오로아세트산를 완충액으로 사용하였고, 농도구배는 아세토니트릴로 0에서 60 %까지 설정하였다. 유속은 1 ㎖/min으로 하여 1 ㎖씩 분획하여 수집하였다. 분획물내 단백질 함량 측정은 시판되는 키트(BioRad)를 사용하였고, SDS-PAGE후 단백질 염색은 코마시 블루를 이용하거나 또는 실버 염색 키트를 사용하였다. 박테리오신 시료 농축시에는 센트리콘(Amicon, MWCO: 1,000)을 사용하였다. 박테리오신의 특이활성은 ㎎ 단백질 당 박테리오신 유닛(units)으로 나타내었다.

도 6은 박테리오신 J9의 역상 HPLC 차트 및 박테리오신 활성을 나타낸 것이다. 도 6에서 두 번째 큰 피크에서 박테리오신 활성이 나타났다. 박테리오신 활성을 나타낸 분획은 SDS-PAGE를 실시하였고, 은 염색하였다.

도 7은 박테리오신 J9 의 역상 HPLC 분획을 SDS-PAGE한 다음 은 염색한 것으로, 1은 박테리오신 J9이고, 2는 사이즈 마커(poly peptide SDS-PAGE standards, BIO-RAD)이고, 3은 사이즈 마커(molecular weight standards, low range, BIO-RAD)이다. 도 7에서 은 염색으로 단백질의 양이 적어 밴드가 검출되지 않았다. 그러나, 여전히 우수한 리스테리아 생육 저해효과를 나타내었다. 상기한 결과로, 박테리오신 J9는 매우 소량으로도 현저히 우수한 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

4-4. 박테리오신 J9의 서열분석

HPLC 방법을 통해서 박테리오신 J9를 더욱 정제하였고, 단일 밴드로 분리한 다음 이를 PVDF 막에 이동시켜 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다.

실시예 5: 박테리오신 생산균을 첨가한 김치제조

5-1. 김치제조

락토바실러스 플란타룸 J9와 락토바실러스 파라플란타룸 C7(박테리오신을 생산하는 김치에서 분리한 균주로 실험실 보관균주)을 김치 제조시 첨가하여 김치 숙성중 품질에 미치는 영향을 조사하고자 하였다.

상기 균주 각각을 MRS 배지에서 미리 배양하고, 5,000 xg에서 20분간 원심분리하여 세포만을 회수한 다음 이를 다시 멸균 증류수에 현탁(OD₆₀₀ 0.8)한 다음 삼성 에버랜드사의 표준 요리법에 따라 담근 김치 10 ㎏에 50 ㎖씩 첨가하였다. 김치는 10 ℃에서 30 일간 숙성시키면서 5일 간격으로 시료를 취하여 아래 항목들을 조사하였다.

5-2. 김치발효 중 pH 및 산도의 변화

김치 150 g와 김치국물 150 ㎖을 취하여 마쇄한 다음 여과천을 사용 여과하여 얻어지는 여액의 pH와 적정산도를 측정하였다. 산도는 10 ㎖의 김치액을 중화시키는데 소요되는 0.1N NaOH의 용량을 락테이트 함량으로 표시하였다.

도 8은 락토바실러스 플란타룸 J9을 첨가한 김치의 시간에 따른 pH 및 산도변화를 나타낸 그래프이다.

도 8에서, 락토바실러스 플란타룸 J9을 첨가한 김치와 대조구(시판 김치, 종갓집김치)의 pH는 발효 5 일 째에 각각 5와 4.7이였고, 발효 15 일에는 각각 4와 3.8까지 낮아지는 것을 관찰할 수 있었다. 락토바실러스 플란타룸 J9 첨가 김치의 pH가 대조구에 비해 약간 더 높게 유지됨을 보여주며, 이는 김치의 신맛을 줄이는데 기여할 것으로 예상된다. 일반적으로 김치가 숙성중 pH가 4 이하로 떨어지면 신맛이 강해져서 상품성이 떨어진다.

산도비교에서는, 락토바실러스 플란타룸 J9 첨가구와 대조구의 산도는 발효 5일(0.4와 0.45)에서 10일(0.9와 1,1) 사이에는 대조구가 더 높았으나, 발효 15 일째에는 1.2와 1.1로 J9 첨가구가 약간 더 높게 나타났다. 상기한 결과로, 김치에 락토바실러스 플란타룸 J9을 첨가하는 경우 대조구에 비하여 발효 초기 2주간 산도가 낮고 pH가 높음을 확인할 수 있었으며, 이는 락토바실러스 플란타룸 J9가 김치내 유산균들의 산 생성을 억제하는 것으로 추정된다(Kang, S. M., Yang, W. S., Kim, Y. C., Joung, E. Y., Yong-Gu Han. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 23:461-471(1995); Park, S. S .,Jang, M. S. and K. H. Lee. J. Korean Soc. Food Nutr. 24(5): 752-757(1995)).

5-3. 총 균수 측정

상기 제조한 김치로부터 김치국물을 취하여 이를 단계별로 희석 (10⁵- 10⁷)한 다음 MRS 배지에 희석액 100 ㎕씩 도말하여 30 ℃에서 24시간 배양하였다. 이후 콜로니수를 계수하여 총 균수를 측정하였으며, 이때 총 균수는 3회 반복하여 평균을 취하였다.

도 9는 락토바실러스 플란타룸 J9을 첨가한 김치의 시간에 따른 유산균 증식정도를 나타낸 그래프이다. 도 12에서, 총 균수는 발효 5 일째 10⁹ 로 증가하였으나 10 일 이후에는 다시 10⁸ 이하로 감소하는 것으로 관찰되었으며 이는 대조구와 현저한 차이가 없었다.

5-4. 관능평가

남녀 학생 10인을 대항으로 관능평가를 실시하였다.

락토바실러스 플란타룸 J9을 첨가한 김치 및 대조구(시판되는 종가집 김치)를 발효일별로 시식하여 풋내맛, 풋내냄새, 신내맛, 신내 냄새, 군덕내 맛 및 군덕내 냄새별로 항목을 나누어 5점척도법으로 실시하였다.

그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

		J9		시판김치		C7		대조군(종균미첨가)
		맛	냄새	맛	냄새	맛	냄새	맛	냄새
5일	풋내	2.8	3.3			1.8	2.6	2.7	2.8
	신내	3.3	3.4			3.6	3.2	3	3.4
	군덕내	4.1	4.5			3.7	3.7	3.7	3.7
10일	풋내	3.2	3.7	3.6	4.1	4	3.7	2.8	3.1
	신내	3.7	3.7	2.5	3	3.3	3.4	3.69	3.4
	군덕내	3.4	4.1	4	4.4	4.2	4.1	3.7	3.9
15일	풋내	3.4	3.7	3.3	3.1	3.7	3.8	3.7	3.5
	신내	2.2	2.6	2.8	2.9	3.1	3.2	3.1	3.5
	군덕내	3.4	3.1	3.6	4.1	4.1	3.6	3.4	3
20일	풋내	4	4.2	3.6	3.9	4.3	4.3	4	4.1
	신내	2.5	3	3.3	3.8	2.6	2.9	2.8	3.2
	군덕내	3.3	3.7	3.8	4	3.1	4.1	3.3	4.1
25일	풋내	4.5	4.6	4.6	4.8	4.4	4.8	4.9	4.7
	신내	3.3	3.3	2.6	2.9	1.9	1.9	2.5	2.7
	군덕내	3.1	3.8	3	3.1	3.4	3.6	4	4.8
30일	풋내	4.2	4.3	4.1	3.8	4.7	4.8	4.7	4.7
	신내	2.7	3.1	3.1	3.2	1.6	1.8	2.3	2.5
	군덕내	3.2	4.4	3.6	3.4	3	3.3	4.4	3.3

도 10a 내지 10f는 락토바실러스 플란타룸 J9을 첨가한 김치의 관능검사결과를 나타낸 것으로, a는 김치 발효 5일후 관능검사결과이고, b는 발효 10일후, c는 발효 15일후, d는 발효 20일후, e는 발효 25일후, f는 발효 30일 후 실시한 관능검사결과이다.

관능검사에서, 락토바실러스 플란타룸 J9을 첨가한 김치는 무첨가구에 비하여 보다 우수한 향미 및 풍미를 나타내었다. 또한 시판되는 김치인 대조구와 비교하였을 경우에도, 맛, 색깔 및 냄새에 있어 모두 우수하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 리스테리아 모노사이토제네스 및 엔테로코커스 패칼리스에 대하여 항균성을 가지며, 광범위의 pH 안정성 및 열 안정성을 갖는 박테리오신 생산균주 락토바실러스 플란타룸 J9를 제공하여, 상기 균주 또는 이로부터 생산되는 박테리오신을 항균제 또는 식품보존제로 사용할 수 있다.

도 1은 김치시료로부터 박테리오신 생산균을 분리하는 방법을 간략하게 도시한 것이고,

도 2는 김치로부터 선별한 박테리오신 생산균주가 형성한 저해환을 나타낸 것이고,

도 3a 내지 4c는 락토바실러스 플란타룸 J9의 배양온도에 따른 생육정도(■) 및 박테리오신 생산율(◆)을 나타낸 것이고,

도 4는 락토바실러스 플란타룸 J9 배양액의 이온교환 크로마토그래프를 나타낸 것이고,

도 5는 이온교환 크로마토그래피에서 수득한 분획물의 분자크기를 확인한 것이고,

도 6은 박테리오신 J9의 역상 HPLC 차트 및 박테리오신 활성을 나타낸 것이고,

도 7은 박테리오신 J9 의 역상 HPLC 분획을 SDS-PAGE한 다음 은 염색한 것이고,

도 8은 락토바실러스 플란타룸 J9을 첨가한 김치의 시간에 따른 pH 및 산도변화를 나타낸 그래프이고,

도 9는 락토바실러스 플란타룸 J9을 첨가한 김치의 시간에 따른 유산균 증식정도를 나타낸 그래프이고,

도 10a 내지 10f는 락토바실러스 플란타룸 J9을 첨가한 김치의 관능검사결과를 나타낸 것이다.

<110> SAMSUNG EVERLAND INC. <120> LACTOBACILLUS PLANTARUM J9 AND USE THEREOF <130> dpp20031630kr <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAB16s-F primer <400> 1 tgccagcakc cgcggtaata c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAB16s-R primer <400> 2 aactcgrcac gagctgacga c 21

Claims (3)

1. 리스테리아 모노사이토제네스 및 엔테로코커스 패칼리스에 대하여 항균활성을 나타내는 락토바실러스 플란타룸 J9(KCTC 10508BP).
2. 제 1항의 락토바실러스 플란타룸 J9 및 이의 배양액으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되는 것을 포함하는 항균용 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 조성물은 식품, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제인 것인 항균용 조성물.