KR20170115824A

KR20170115824A - 항균 활성을 가지는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물

Info

Publication number: KR20170115824A
Application number: KR1020160043515A
Authority: KR
Inventors: 장해춘; 이슬기
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2017-10-18
Also published as: KR101865461B1

Abstract

본 발명은 항균 활성을 가지는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물, 구체적으로 위해미생물로 식중독 원인균이고, 장류 제조 공정 중 혼입되어 식중독을 유발하는 원인균주인 바실러세 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성이 우수하고, 장류 제조 과정에서 변화가능한 온도 및 pH 범위에서 항균 활성이 유지되는 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)가 생산하는 신규한 항균 활성을 가지는 펩타이드, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 조성물, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학적 조성물 또는 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 첨가제에 관한 것이다.

Description

항균 활성을 가지는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물{A ANTIMICROBIAL PEPTIDE AND A ANTIMICROBIAL COMPOSITION CONTAINING THE SAME}

본 발명은 항균 활성을 가지는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물, 구체적으로 특허 균주인 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)가 생산하는 신규한 항균 활성을 가지는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물에 관한 것이다.

지구상의 모든 생물들은 세균이나 곰팡이 및 바이러스와 같은 미생물로부터 자신을 방어 또는 보호할 수 있는 생체 방어기구를 가지고 있는데, 그 중 하나가 항균 펩타이드 등의 항균물질을 이용한 비선택적 면역체계(non-specific immunity)이다.

상기 항균물질 중에서 박테리오신(bacteriocin)은 여러 종의 미생물이 생산하는 천연 항균성 단백질(antimicrobial peptide) 또는 단백질계의 물질로서, 일반적으로 상기 박테리오신을 생산하는 미생물과 형태학 또는 계통학적으로 유사한 균에 대하여 살균기작을 갖는 물질을 의미한다.

상기 항균 펩타이드는 외부 미생물의 공격으로부터 생물 자신을 보호하는데 중요한 역할을 할 수 있다. 또한, 실제로 항균 펩타이드는 기존의 항생제보다 넓은 범위의 미생물에 대하여 강한 항균력을 나타내고 있으며, 항생제 내성을 유발시키는 기존의 항생제와는 다른 활성기작으로 항균 활성을 나타내는 특징을 보임에 따라 항균 활성이 우수한 신규한 항균 펩타이드에 대한 연구가 강하게 대두되고 있다.

현재까지 연구된 결과들에 의하면, 동물 및 식물 등으로부터 약 2,000 종 이상의 많은 항균 펩타이드가 분리되었는데 이들 펩타이드는 발견된 종에 따라 구조가 각기 다르나 항균 활성을 나타내는 작용기작은 유사한 것으로 알려져 있으며, 대표적인 항균 펩타이들로서 세크로핀(cecropin), 머게이닌(magainin), 봄비닌(bombinin), 디펜신(defensin), 타키플레신(tachyplesin) 및 부포린(buforin) 등이 알려져 있다. 이들 항균 펩타이드들은 공통적으로 17개 내지 24개 정도의 짧은 아미노산 서열로 구성되어 있으며, 그람 음성균 및 그람 양성균을 포함한 여러 종류의 위해 미생물뿐만 아니라 원핵생물 또는 곰팡이 등에 대해서도 항진균력을 가지며 일부는 암세포와 바이러스에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

이 중, 상기 박테리오신은 인체에 무해하고 잔류성이 없으며 기존의 항생제가 2차 대사산물 것과 달리, 플라스미드(plasmid)나 염색체(chromosome)로부터 직접 생합성되어 생산되는 것이므로, 유전자조작 등에 의한 생물공학적 응용이 쉽다는 장점이 있다. 또한, 상기 박테리오신은 단백질이기 때문에, 인체에 섭취되는 즉시 소화기관의 단백 가수분해효소에 의해 분해되어, 체내에서 부작용과 같은 문제를 발생시키지 않으므로, 식품 등의 새로운 생물학적 보존제(biopreservative) 내지는 발효식품 등의 생물 제어제(bioregulator)로 그 효용이 크게 기대되고 있다.

상기 박테리오신은 정제기술과 분자생물학의 급속한 발전에 따라, 분자적 해명이 부분적으로 이루어지고 있으며, 이를 토대로 분자 및 생리학적 특성에 따라 상기 박테리오신을 4개의 군(class)으로 분류하고 있다.

우선, ClassⅠ은 lantibiotics로 유전자가 단백질로 형질전환(translation)된 이후의 변이에 의하여 생성되는 독특한 아미노산인 lanthionine과 β-methyl lanthionine을 함유하며, 대표적 박테리오신인 니신(nisin)이 여기에 속한다. 대부분의 박테리오신들이 속하는 Class Ⅱ는 lanthionine을 함유하지 않는 박테리오신으로, 분자량이 13 KDa 이하로 작아, 복잡한 3차 구조를 형성하지 않으므로 비교적 열에 안정한 특징이 있다. Class Ⅲ은 분자량이 30 KDa 이상인 것으로, 열에 불안정하며, Class Ⅳ는 박테리오신의 활성부위가 단백질과 탄수화물 또는 지방이 결합된 특징을 갖는 박테리오신이다.

상기 박테리오신의 작용기작은 크게 세 종류로 분류된다. 우선, 상대 균주의 증식만을 억제하는 저해작용(bacteriostatic action), 상대 균주를 사멸시키는 살균작용(bactericidal action) 및 상대 균주의 사멸뿐 아니라 세포벽을 용해시키는 용균작용(bacteriolytic action)등이 있다.

상기 박테리오신과 관련하여, 최근까지 유산균 유래 박테리오신에 관한 연구가 주를 이루고 있다. 상기 유산균은 GRAS 등급의 안전성이 인정된다는 장점이 있으나, 상기 유산균 유래 박테리오신의 경우에는 항균 스펙트럼(spectrum) 즉, 항균활성 범위가 좁기 때문에 실제로 식품보존제 등으로 널리 활용되지 못하고 있다.

한편, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물은 오랜 세월 동안 식품산업 및 발효산업에 널리 사용되어온 균주로, 이 중 바실러스 서브틸리스 그룹(Bacillus subtilis group) 구체적으로, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus은 European Food Safety Authority (EFSA)에 의해 “Qualified presuaption of safe(QPS)”로 인정되어, 그 안전성이 확보된 균주이다. 상기 균주들은 우리나라의 된장이나 청국장 또는 일본의 낫또(natto)를 비롯하여 극동 아시아나 아프리카 지역의 전통음료나 알칼리 발효식품의 제조에 있어서 매우 중요한 발효미생물로 작용하고 있다.

한편, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, B. cereus)는 흙, 먼지, 곡류, 야채류, 동물의 털, 침전물 등 자연계에 널리 존재하는 미생물로 대표적인 식중독 원인 세균 중 하나로 알려져 있다. 상기 바실러스 세레우스를 포함한 식중독 세균인 바실러스 세레우스 그룹(B. cereus group)인 바실러스 세레우스, 바실러스 미코이데스(Bacillus mycoides, B. mycoides), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis, B. anthracis) 및 바실러스 터리기엔시스(Bacillus thuringiensis, B. thuringiensis)는 표현형과 유전형이 매우 유사한 세균들로써 열처리 후에도 살아남아 식중독 혹은 식품의 변패를 유발시키는 것으로 알려져 있다.

이 중 대표적인 식중독 원인균인 바실러스 세레우스는 내열성이 높은 내생포자를 생성하고, 포자는 타원형이거나 원통형으로 세포의 중앙 또는 말단에 위치하며, 호기적 조건 및 혐기적 조건 모두에서도 증식가능한 그람양성의 호기성 간균이다. 상기 바실러스 세레우스는 야채와 곡류 등의 농작물 및 식품 원료 내에서는 주로 포자상태로 존재한다. 상기 바실러스 세레우스의 생육 최적 온도는 28℃ 내지 35℃로, 발육온도는 7℃ 내지 49℃이고, 증식 가능한 pH 범위는 pH 4.9 내지 pH 9.3이며, 포자의 발아 최적온도는 10℃ 내지 49℃이다. 상기 바실러스 세레우스의 균독소 생산은 포자의 발아 말기에 이루어지는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 바실러스 세레우스 균 자체는 63℃에서 30분 또는 100℃에서 2분 이내에 사멸 가능하나, 상기 바실러스 세레우스의 포자는 135℃에서 4시간 가열에도 견딜 수 있는 내열성으로 가지고 있다.

상기 바실러스 세레우스가 식중독 원인균으로 최초로 의심된 것은 1980년대 말로, Hauge에 의하여 1955년에 노르웨이 오슬로에서 상기 바실러스 세레우스가 식중독 원인균임이 처음 보고되었다. 우리나라의 상기 바실러스 세레우스에 의한 식중독 발생현황의 경우에는, 2001년 1건에 20명, 2003년 3건에 198명, 2004년 2건에 84명, 2005년 1건에 24명, 2006년 5건에 54명 및 2007년 1건에 50명이 발생된 것으로 보고되어 있다. 그러나, 이러한 제한적인 발생현황은 청국장이나 된장과 같은 바실러스 속 발효균주에 의한 발효식품을 포함한 여러 발효음식과 가열되지 않은 생야채 등의 식품을 자주 섭취하는 우리나라의 식습관을 고려하면, 상기 바실러스 세레우스에 의한 식중독에 대한 관심 부족과 심층적인 연구의 부족에 의한 것으로 평가되고 있다.

상기 바실러스 세레우스에 의한 식중독의 증상으로 두 가지 즉, 주로 설사가 유발되는 증상인 설사형(Dirrhoeal syndromes, Dirrhoeal type)과 주로 구토가 유발되는 증상인 구토형(Emetic syndromes, Emetic type)으로 구분될 수 있다.

상기 설사가 유발되는 증상인 설사형은 장내에서 바실러스 세레우스의 포자에 의해 형성된 장독소(enterotoxin)에 의해 주로 유발되는 것으로 알려져 있으며, 감염된 단백질이 포함된 식육 제품이나 채소 스프, 소스 또는 푸딩 등의 식품을 섭취한 경우 주로 발생한다. 구체적으로, 상기 바실러스 세레우스의 포자는 장관의 조건에서도 살아남을 수 있으므로, 상기 바실러스 세레우스의 포자가 장관의 상피세포에 부착하여 장독소와 같은 식중독 유발요소를 생성할 경우 설사가 유발되는 증상이 일어나는 것으로 알려져 있다. 상기 설사형의 임상증상은 오염된 식품의 섭취 후 8시간 내지 16시간의 잠복기를 가진 후, 복통, 설사 또는 메스꺼움 등이 일어나는 것으로 보고되고 있다.

한편, 구토가 유발되는 증상인 구토형은 상기 바실러스 세레우스의 영양세포로 성장하거나 포자로 발아하는 동안에 생산된 독소에 의한 것으로, 쌀, 파스타, 국수 등 튀기거나 조리한 전분질 식품에 의해 주로 발병하는 것으로 알려져 있다. 특히, 바실러스 세레우스는 불안전한 조리과정을 거친 식품을 48℃ 이하에서 유지시키는 경우 빠르게 증식하여 식중독을 일으킬 수 있으나, 상기 구토가 유발되는 증상의 경우, 증상이 미약하고, 보통 24시간 이내에 치료가 가능하므로, 실제로 식중독 발생 건수에 비해 보고가 많이 되지 않는 것으로 조사되어 있다.

상기 바실러스 세레우스에 의한 식중독의 증상 분포는 각 나라별로 차이가 있으며, 일 예로 일본의 경우, 매년 6건 내지 24건으로 33명 내지 863명의 환자발생이 기록되고 있으며, 주된 증상으로는 구토형이 설사형보다 10배나 더 빈번하게 발생하는 것으로 보고되고 있는 반면, 유럽과 북미의 서구에서는 설사형이 더 빈번하게 발생하는 것으로 보고되어 있으며, 이는 각 나라별 식습관과 생활습관에 기인한 것으로 예상된다.

그러나, 상기한 바와 같이 실제로 식중독 발생 건수에 비해 보고가 많이 되지 않는다고 하여도, 바실러스 세레우스에 의해 오염된 식품에서 상기 바실러스 세레우스가 생장하는 경우, 식품의 쓴맛이 생겨 제품의 품질을 현저히 저하시킬 뿐만 아니라, 상기 바실러스 세레우스가 생산하는 독소에 의해 오심, 구토 또는 위경련 등의 증상을 갖는 식중독이 문제가 될 수 있고, 이로 인해 폐렴이나 안구 감염 등의 감염증이나 간장의 기능 부전 등의 심각한 건강상의 문제가 발생될 수 있으므로, 이에 대한 대책의 마련이 시급하게 요구되고 있다.

일 예로, 우리나라의 식품의약품안전처(KFDA)는 식품 안전성 확보를 위해 2007년부터 된장, 고추장, 청국장 및 춘장을 포함하는 모든 시판 장류 제품에서 허용되는 바실러스 세레우스 균 수를 1.0×10⁴ CFU/g 이하로 고시하였다. 그러나, 바실러스 세레우스는 자연계에 흔하게 존재할 뿐만 아니라, 포자를 형성하여 열에 잘 견딜 수 있고, 염도가 높은 장류에서도 잘 자라기 때문에, 위해 요소 중점 관리제도(HACCP)가 정착되지 않은 대부분의 장류 제조업체 특히, 전통방식으로 장류를 제조하는 것을 특징으로 하는 전통 장류 제조업체에서는 우리나라의 식품의약품안전처가 고시한 바실러스 세레우스 균수 상한선을 맞추기가 어려운 상황이다. 따라서, 식중독 원인 미생물과 관련한 안전성의 확보란 차원에서 바실러스 세레우스 균으로부터 식품의 안전성을 확보하기 위하여, 바실러스 세레우스의 제어를 위한 항균물질의 연구가 요구된다.

최근, 수익 증대와 소비 트랜드의 변화로 인하여, 소비자들은 저장기간이 길면서 가공이 최소화된 식품을 선호하는 경향이 두드러지고 있다. 그러므로, 전통 발효식품과 함께 섭취해온 바실러스 속(Bacillus sp.)을 활용하여 유산균 박테리오신의 한계를 극복할 수 있는, 구체적으로 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 갖는 천연식품 보존제의 개발나 식품 보존제의 개발에 대한 요구가 증가하고 있다.

KR10-1575878B KR10-1583025B KR10-1471975B

본 발명의 목적은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명은 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성을 갖는 신규한 항균 펩타이드와 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항균 활성을 가지는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이들의 산 부가염일 수 있다.

상기 펩타이드는 위해 미생물에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.

상기 위해 미생물은 바실러스 세레우스, 포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 마이크로코커스 류테우스(Micrococus luteus)로 이루어진 군 중에서 선택된1종 이상인 것일 수 있다.

상기 펩타이드는 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)가 생산하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스, 황색포도상구균 또는 마이크로코커스 류테우스에 대한 항균용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스, 황색포도상구균 또는 마이크로코커스 류테우스에 대한 항균용 식품 첨가제을 제공한다.

본 발명의 항균 활성을 갖는 펩타이드는 위해 미생물 특히, 식중독 원인균이고, 장류 제조 공정 중 혼입되어 장류 섭취시 식중독을 유발하는 원인균주인 바실러세 세레우스에 대한 항균 활성이 우수하고, 장류 제조 과정에서 변화가능한 온도 및 pH 범위에서 항균 활성이 유지되어, 상기 펩타이드를 포함하는 조성물은 탁월한 항균활성을 나타내고, 단백분해효소에 의해 효과적으로 분해되어 항균 활성이 쉽사리 제거되는 박테리오신이므로, 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 세레우스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)가 생산하는 항균 물질의 정제 및 분리과정을 나타낸 것으로, C18 Sep-pak 컬럼의 메탄올 용매로 용출한 용출물 및 아세톤니트릴 용매로 용출한 용출물에 대해 1차 HPLC(prep-HPLC)를 수행하여 분리한 6개 분획(A)의 Bacillus cereus KCTC 3624 균주에 대한 항균활성(a), 상기 1차 HPLC의 두 번째 분획에 대해 2차 HPLC(prep-HPLC)를 수행하여 분리한 3개 분획(B)의 Bacillus cereus KCTC 3624 균주에 대한 항균활성(b) 및 상기 2차 HPLC의 두 번째 분획에 대해 3차 HPLC(prep-HPLC)를 수행하여 분리한 3개 분획(C)의 Bacillus cereus KCTC 3624 균주에 대한 항균활성(c)을 확인한 그래프 및 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 세레우스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)가 생산하는 항균 물질의 정제물이 단일 물질임을 확인한 것으로, 각각의 분리 및 정제 단계에서 항균활성이 있는 것으로 확인된 분획물 또는 정제물에 대해 함께 HPLC 정제(Analytical HPLC)를 수행하여, 해당 각 분획의 항균 물질이 동일한 단일 물질임을 확인한 그래프 및 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, HPLC 정제(Analytical HPLC)를 수행하여 획득한 분획으로부터 추출한 펩타이드를 LC/MS system 및 X-Caliber software v.2.0.7를 사용하여 분자량 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 상기 분자량을 확인한 항균 활성을 갖는 펩타이드의 아미노산 서열을 N' 말단 아미노산 서열 분석법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5 및 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 상기 분자량을 확인한 항균 활성을 갖는 펩타이드의 아미노산 서열과 기존 연구에서 발표된 항균물질의 서열을 비교한 결과를 나타낸 것으로, 구체적으로 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov, 도 5)와 Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW(http://www.genome.jp/tools/clustalw, 도 6)에서 분석한 결과이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본 발명은 항균 활성을 가지는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 관한 것이다. 상기 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이들의 산 부가염일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 보존제에 관한 것이다. 상기 보존제는 방부용 조성물일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스, 황색포도상구균 또는 마이크로코커스 류테우스에 대한 항균용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스, 황색포도상구균 또는 마이크로코커스 류테우스에 대한 항균용 식품 첨가제에 관한 것이다.

본 발명의 발명자들은 발효식품 특히, 유산균에 의해 발효되는 유제품과 달리, 바실러스(Bacillus sp.) 속 미생물을 이용하여 콩을 발효하여 제조되는 발효식품에 있어서, 식중독 등 질병의 원인이 될 뿐만 아니라 식품의 가치를 감소시키는 원인균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, B. cereus)에 대한 항균활성을 가져, 세균에 의한 감염의 가능성이 높은 전통식 발효법에 의할 경우에도 바실러스 세레우스에 의한 감염으로 인한 안전성 문제를 제어할 수 있는 방법에 대해 연구하던 중, 상기 바실러스 세레우스에 대해 강한 항균활성을 가지며, 이러한 항균활성을 갖는 미생물이 European Food Safety Authority (EFSA)에 의해 “Qualified presuaption of safe(QPS)”로 인정되는 바실러스 서브틸리스 그룹에 속할 뿐만 아니라, 해당 바실러스 세레우스에 대한 항균활성이 식품의 보존 또는 메주 등의 발효 식품의 제조 과정에 속하는 온도 및 pH 범위에서 우수하게 유지되는 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)를 확인하여, 이를 근거로 특허를 확보하였고, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주의 항균활성을 나타내는 물질이 단백질성 물질인 박테리오신에 해당될 수 있다는 것을 확인하여 이로부터 추가적인 연구를 진행하여, 상기 바실러스 세레우스에 대해 항균활성을 가지는 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주 유래 단백질성 물질을 확인하여, 항균 활성을 갖는 펩타이드를 분리하고, 이의 서열을 확인하였으며, 해당 분리된 물질의 항균 활성과 스펙트럼을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에 있어서, 개체(subject) 또는 실험동물이란 이종 조직 또는 기관의 이식에 의한 면역반응을 수행할 수 있는 모든 동물이 포함될 수 있는 개념으로 특별히 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 토끼, 마우스 등의 척추동물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 영장류일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 인간을 제외한 영장류일 수 있다.

본 발명에 있어서, 항균 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 ?같은 의미일 수 있고, 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 구체적으로 그람양성균, 그람음성균, 진균(효모 및 곰팡이)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질 즉, 항세균 및 항진균 효력이 있는 물질을 의미하며, 바람직하게는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, B. cereus)에 대한 항균활성을 갖는 물질일 수 있다.

본 발명에 있어서, 배양물이란 특정 미생물을 배양배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 상기 배양물은 상기 특정 미생물을 포함하거나 포함하지 아니할 수 있다. 상기 배양물은 그 제형이 한정되지 않고, 일 예로 액체 또는 고체 일 수 있다. 상기 배양배지란 동물세포나 식물세포 또는 세균 따위의 생장에 필요한 영양소가 들어있는 고체 또는 액체를 의미한다. 상기 배양액이란 액체배지에 균주를 접종하여 배양하는 것을 의미한다. 상기 배양액은 균주를 포함하는 것 또는 균주를 접종하여 배양한 후, 제균 즉 균주를 제거(cell-free)한 배양여액 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 보존제란 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상에 사용될 수 있는 것으로, 세균, 곰팡이 및 효모로 이루어지는 군 중에서 선택된 1 종 이상의 위해 미생물 또는 부패미생물의 증식을 억제하거나 살균하여 식품, 사료 의약품을 보존하는 첨가물로서 부패미생물의 발육을 저지하거나 살균할 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하고, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 식품가공품, 수산가공식품, 유가공식품, 어육제품, 발효식품, 절임식품, 두부류를 포함한 두류식품, 묵류, 곡류식품, 조미식품, 미생물발효식품, 제과 및 제빵류, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으며 본 발명에서 발효식품, 기능성 식품, 건강보조식품 및 가공식품을 포함하는 것을 의미하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 발효식품이란 바실러스 서브틸리스나 효소 등 미생물을 한가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 메주, 젓갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두가 포함된다.

본 발명에 있어서, 메주(Korean-style fermented soybean)란 삶은 콩을 찧어 덩이를 지워서 띄워 말린 것으로, 며주 또는 말장이라고도 불리운다. 상기 메주의 발효 과정에는 리조프스 속(Rhizopus sp.) 곰팡이, 아스퍼질러스 속 곰팡이(Aspergillus sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 등의 미생물이 관여하며, 개량식 메주의 경우에는 황국균(Aspergillus oryzae)를 인공 접종시켜 메주의 품질을 개선하고, 제조기간을 단축시켜 제조한다. 식품공전에 의하면, 한식메주는 대두(95% 이상)를 주원료로 하여 증숙 및 성형하여 발효시킨 것이라 하고, 개량메주는 대두(85% 이상)를 주원료로 하여 곡물 알갱이의 형태를 유지하여 발효시킨 것이라 한다.

본 발명은 항균 활성을 가지는 펩타이드에 관한 것이다.

상기 항균 활성을 가지는 펩타이드는 바실러스 서브틸리스 균주에서 생산되는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다. 상기 항균 활성을 가지는 펩타이드는 본 발명의 발명자가 연구하여 특허받은 특허 균주인 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)가 생산하는 박테리오신에 관한 것일 수 있다.

이러한 측면에서, 상기 펩타이드는 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)가 생산하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 항균 활성을 가지는 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이들의 산 부가염, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이들의 산 부가염에 관한 것일 수 있다.

상기 펩타이드는 분리된(isolated) 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재하는 것일 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로부터 유도되는 물질일 수 있다.

상기 산 부가염이란 제약상 허용되는 산 부가염일 수 있고, 상기 제약상 허용되는 산 부가염이란 상기 펩타이드의 생물학적 활성을 유지하고 원하지 않는 독소 효과 등의 부작용을 최소화하는 염을 의미한다. 상기 산 부가염은 제약상 허용되는 무기산 부가염 또는 유기산 부가염일 수 있고, 일 예로 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 아세트산염, 벤조산염, 말레인산염, 푸말산염, 호박산염, 주석산염, 구연산염, 옥살산염, 메탄술폰산염, 톨루엔술폰산염, 아스파라긴산염 또는 글루타민산염 등을 포함할 수 있다.

상기 펩타이드는 위해 미생물, 구체적으로 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항균활성을 갖는 것이 바람직하고, 보다 구체적으로 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주, 스테필로코커스 속(Staphylococcus sp.) 균주 및 마이크로코커스 속(Micrococus sp.) 균주로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 균주에 대한 항균 활성을 갖는 것, 더더욱 구체적으로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 마이크로코커스 류테우스(Micrococus luteus) 로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 균주에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 단백분해효소에 의해 항균 활성이 소실되는 것으로 인체에 안전한 것 즉, 인체에 안전한 박테리오신일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 암호화(coding)하는 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 뉴클레오티드는 분리된 뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터의 종류는 상기 벡터를 이용하여 형질전환을 수행할 대상 숙주(host)와 발현 조건에 따라서 변화될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드를 포함하고 있으면, 다른 조건은 제한되지 아니한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이들의 산 부가염, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 마이크로코커스 류테우스(Micrococus luteus)에 대한 항균 활성, 구체적으로 바실러스 세레우스에 대한 우수한 항균활성을 나타내고, 25℃ 내지 70℃에서 열 안정성을 가지고, 다양한 pH에 대한 pH 안정성을 가지므로, 항균 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

이러한 측면에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 식품의 보존 또는 메주 등의 발효 식품의 제조 과정에 속하는 온도 및 pH 범위에서 바실러스 세레우스에 대한 높은 항균활성이 유지될 뿐만 아니라, 상기 항균 활성은 단백분해효소에 의해 분해되는 단백질성 물질 즉, 박테리오신에 해당하는 상기 펩타이드에 의한 것이므로, 상기 펩타이드에 대한 항균활성은 식품을 섭취하는 인체에는 영향을 미치지 않고 안전한 것으로 평가되어서, 상기 펩타이드는 바실러스 세레우스에 대한 높은 항균활성과 식품에 적용시에 요구되는 안전성 모두를 가지는 것으로 현저하게 우수한 효과를 가질 수 있다.

상기 펩타이드는 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)의 배양액을 소수성 컬럼을 이용하여 분리할 경우, 메탄올 용매에 의해 용출되는 용출물로부터 분리될 수 있다. 구체적으로, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주의 배양액을 소수성 컬럼과 아세톤니트릴 및 메탄올을 이용하여 분리할 경우, 메탄올 용매에 의해 용출되는 용출물로부터 분리될 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주의 배양액, 상세하게는 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주를 접종하고 배양시킨 배양액을 여과지를 이용하여 제균한 제균된 배양액을 소수성 컬럼과 아세톤니트릴 및 메탄올을 이용하여 분리 또는 정제할 경우, 구체적으로 상기 제균된 배양액을 소수성 컬럼에 투입한 후, 메탄올 용매에 의해 용출되는 용출물로부터 분리될 수 있다.

상기 항균 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 펩타이드 또는 이들의 산 부가염의 유효성분을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있으며, 상기 항균 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

상기 항균 조성물은 식중독 원인 위해 미생물, 구체적으로는 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 항균 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용되어 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 곡류를 포함한 식품, 화장품 또는 의약에 적용되어 바실러스 세레우스에 의한 제품의 부패를 억제하거나 예방할 수 있으며, 상기 항균 활성을 나타내는 물질인 박테리오신은 열처리나 단백분해효소에 의해 분해 또는 실활될 것이므로, 상기 항균 조성물을 상기 항균 조성물이 적용 가능한 식품, 화장품 또는 의약에 활용할 경우에도 상기 항균 활성을 나타내는 물질에 의해 2차적인 문제가 발생되지 아니한다는 장점이 있다.

상기 항균 조성물은 상기 유효성분 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다.

상기 당질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.　 상기 단백질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.　 상기 지질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.　 상기 비타민류는 특별한 제한은 없으며, 상기 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류 중 어느 것에 대해서도, 조성물의 항균성이 유지되는 한 상기 구체예에 한정되지 않고 다른 성분을 포함할 수 있으며, 각각의 함량은 항균성이 유지되는 한 제한되지 아니하고, 바람직하게는 전체 조성물 대비 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 10 중량%일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이들의 산 부가염, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 보존제에 관한 것이다. 상기 보존제는 방부용 조성물일 수 있다.

상기 보존제는 세균, 곰팡이 및 효모 등의 위해 미생물 또는 부패 미생물의 증식을 억제하거나 살균하여, 위해 미생물 또는 부패 미생물, 구체적으로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 마이크로코커스 류테우스(Micrococus luteus)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 것, 더 구체적으로 바실러스 세레우스에 의해 감염되거나 부패될 수 있는 보존대상의 변질, 산패 또는 부패를 방지하고 보존대상의 상태를 유지하기 위하여 사용되는 물질을 의미하며, 바람직하게는 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상에 사용될 수 있는 것일 수 있다. 상기 사료는 가축 사료를 포함하여 그 용도에 제한되지 아니하고, 고체 또는 액체일 수 있다.

상기 위해 미생물 또는 부패 미생물 구체적으로 바실러스 세레우스, 포도상구균 및 마이크로코커스 류테우스로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 것, 더 구체적으로 바실러스 세레우스에 대한 증식 억제 및 살균 활성을 나타내는 물질인 박테리오신은 열처리나 단백분해효소에 의해 분해 또는 실활될 것이므로, 상기 보존제는 상기 보존제가 사용되는 보존대상인 식품, 사료, 화장품 또는 의약에 적용될 경우에도 상기 항균 활성을 나타내는 물질에 의해 2차적인 문제가 발생되지 아니한다는 장점이 있다.

이러한 측면에서, 상기 보존제는 식품 방부제, 사료 방부제, 화장품 방부제 또는 의약 방부제일 수 있다. 상기 식품 방부제, 사료 방부제, 화장품 보존제 또는 의약 방부제는 식품이나 사료, 화장품 또는 의약의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물일 수 있다.

상기 보존제는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다는 측면에서, 상기 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이들의 산 부가염, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이들의 산 부가염은 상기 보존제의 유효성분으로 바람직하다.

상기 보존제는 상기 유효성분 외에 통상의 보존제에 포함되는 성분 또는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 보존제 조성물은 전체 조성물 100 중량부에 대하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 0.1 내지 50 중량부 또는 0.5 내지 10 중량부 포함하는 것일 수 있다.

상기 보존제는 추가로 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 할 수 있는 살균제, 산화방지제 또는 항생제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 보존제 조성물은 본 발명의 효과를 제한하지 않는 범위 내에서, 종래의 합성 보존제 또는 유기산 혼합물을 함께 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이들의 산 부가염, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스, 황색포도상구균 또는 마이크로코커스 류테우스에 대한 항균용 약학적 조성물에 관한 것이다.

상기 펩타이드는 임상투여시 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제재의 형태로 사용될 수 있다.

구체적으로, 상기 펩타이드는 실제 경구 또는 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 ?수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

상기 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁 용제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다.

상기 비수용성 용제 또는 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지 또는 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 황산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 사용될 수 있다.

상기 유효성분은 전체 조성물 대비 0.01 내지 100 mg/kg 또는 0.1 내지는 10 mg/kg의 함량으로 포함될 수 있고, 하루 1 회 내지 3 회 투여될 수 있으나, 이는 본 발명의 권리범위를 제한하는 것이 아니다.

상기 약학적 조성물에서 상기 펩타이드의 투여는 총 투여량 기준으로 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다.

상기 유효성분의 함량 또는 환자에 대한 투여량은 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 결정되는 것이므로, 상기 약학적 조성물의 용도에 따른 상기 유효성분의 함량 또는 투여량은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상적인 지식을 가진 자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 항균용 식품 첨가제는 항균력에 의해 위해 미생물의 번식을 억제하여, 첨가된 식품에 식품 보존 효과 및 위해 미생물에 의한 감염 질환을 예방 또는 개선하기 위한 효과를 발휘하는 용도라면, 첨가되는 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 식품 첨가제를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

상기 식품 첨가제는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 식품 첨가제에 포함되는 유효 성분의 첨가량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 상기 항균용 식품 첨가제의 유효성분 즉, 상기 펩타이드의 함량은 전체 식품 첨가제 중량 대비 0.01 내지 99 중량% 또는 0.05 내지 90 중량% 또는 0.1 내지 50 중량%일 수 있다.

< 실험예 . 바실러스 서브틸리스 SN7 균주 유래 항균 물질의 분리 및 확인>

본 발명의 발명자가 기존 연구에서 확인한 장류 발효 균주인 바실러스 서브틸리스에 속하면서도, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 뛰어난 항균 활성을 갖는 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)가 생산하는 조항균 물질로부터 바실러스 세레우스에 대한 항균 물질, 구체적으로 단백질성 항균 물질을 분리하여, 해당 항균 물질에 대한 특성을 확인하는 실험을 수행하였다.

실험예 1. 바실러스 서브틸리스 SN7 균주의 분리 및 정제

상기한 바와 같이, 상기 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)가 생산하는 항균 물질의 C₁₈ Sep-Pak 과 HPLC를 이용한 분리 및 정제를 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

우선, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주의 바실러스 세레우스에 대한 항균물질(항 B. cereus 물질)을 분리하기 위하여, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주를 5 mL TSB(Tryptic Soy Broth; Difco, Sparks, MD, USA) 액체배지에 1%(v/v) 접종하여 37℃에서 12시간 동안 전배양한 후, 상기 전배양액 1%(v/v)를 50 mL TSB 액체배지에 접종하여 37℃에서 24시간동안 본배양하였다.

상기 본 배양한 배양액을 9,950 × g 및 4℃의 조건으로 15분 동안 원심분리하여 회수한 상징액을 0.20 μm 제균 여과막(membrane filter)로 제균하였다. 상기 제균된 상징액을 100% 메탄올(HPLC-grade, Fisher, USA)과 3차 증류수로 미리 soaking된 소수성 컬럼(column)인 C₁₈ Sep-Pak cartridge(Waters Co., U.S.A.)에 통과시켜 소수성 물질을 흡착시킨 후, 3차 증류수로 수세하고 100% 메탄올 10 mL(HPLC-grade, Fisher, USA)로 용출하였다.

상기 100% 메탄올로 용출한 용출 분획은 Speed Vac Concentrator(Centra-Vac VS-802, Vision, 대한민국)를 이용하여 용매를 제거한 후, 항균활성 측정과 다음 정제 단계를 수행하기 위한 정제 단계 시료로 사용하였다.

상기 항균활성 측정은 용매를 제거한 용출 분획을 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액에 녹여 spot-on-the-lawn법(spot-on-the-lawn method)으로 수행하였다. 상기 항균활성을 확인하기 위한 감수성 균주로, 바실러스 세레우스 KCTC 3624(B. cereus, KCTC 3624)를 사용하였으며, 항균활성을 확인하였다(5.12 x 10⁵ AU).

상기 항균 물질의 정제는 상기 C₁₈ Sep-Pak 컬럼에서 100% 메탄올로 용출한 용출 분획(정제물)의 용매를 제거하여 제조된 정제 시료를 50% 아세트로니트릴 수용액(50% aqueous acetonitrile, HPLC-grade, Fisher, USA)에 녹인 후, 0.20 μm syringe filter로 여과시킨 다음, preparative LC 9104 HPLC system(Japan Analytical Industry, 일본)을 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 수행해 분리하였다.

상기 1차 HPLC(preparative HPLC) 수행에 있어서, 컬럼(Column)은 JAIGEL-W252 gel perneation chromatography column(W252, 20 x 500 mm, Japan Analytical Industry, 일본)을 사용하였고, 검출기(detector)는 3702 UV detector(Japan Analytical Industry, 일본)을 사용하였다. 상기 HPLC 정제 조건으로 용매는 50% 아세트로니트릴 수용액을 사용하여, flow rate는 5 mL/min이었고, 검출기의 UV파장은 210 nm의 조건으로 수행하였다.

상기 HPLC 정제 조건으로 정제된 각 분획은 Speed Vac Concentrator(Centra-Vac VS-802, Vision, 대한민국)를 이용하여 용매를 제거한 후, 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액에 녹여 spot-on-the-lawn법(spot-on-the-lawn method)으로 바실러스 세레우스 KCTC 3624(B. cereus, KCTC 3624)에 대한 항균활성을 측정하였다. 상기 측정결과를 도 1(A, a)에 나타내었다.

상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 6개의 1차 HPLC 분획(preparative HPLC) 중에서 항균활성이 확인된 분획이 2번째 분획(1-2, 6.40 x 10⁴ AU)인 것으로 확인되었다.

이 후, 상기 항균활성 측정 결과 확인된 1차 HPLC 분획 중 2번째 분획에 대해 2단계 HPLC(preparative HPLC 정제)를 추가로 수행하였다. 구체적으로, 상기 항균활성이 확인된 preparative HPLC로 정제된 정제물의 용매를 제거하여 제조된 정제 시료를 50% 아세트로니트릴 수용액(50% aqueous acetonitrile, HPLC-grade, Fisher, USA)에 녹인 후, 0.20 μm syringe filter로 여과시킨 다음, HPLC 정제(Recycling preparative HPLC)를 수행해 2차 정제하였다. 상기 HPLC 수행에 있어서, 컬럼(Column)은 JAIGEL-W252 gel perneation chromatography column(W252, 20 x 500 mm, Japan Analytical Industry, 일본)을 사용하였고, 검출기(detector)는 3702 UV detector(Japan Analytical Industry, 일본)을 사용하였다. 상기 HPLC 정제 조건으로 용매는 50% 아세트로니트릴 수용액을 사용하여, flow rate는 5 mL/min이었고, 검출기의 UV파장은 210 nm의 조건으로 수행하였다.

상기 HPLC 정제 조건으로 정제된 각 분획은 Speed Vac Concentrator(Centra-Vac VS-802, Vision, 대한민국)를 이용하여 용매를 제거한 후, 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액에 녹여 spot-on-the-lawn법(spot-on-the-lawn method)으로 바실러스 세레우스 KCTC 3624(B. cereus, KCTC 3624)에 대한 항균활성을 측정하였다. 상기 측정결과를 도 1(B, B)에 나타내었다.

상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 3개의 2차 HPLC 분획(preparative HPLC) 중에서 항균활성이 확인된 분획이 2번째 분획(2-2, 6.40 x 10³ AU)인 것으로 확인되었다.

이 후, 상기 항균활성 측정 결과 확인된 2차 HPLC 분획 중 2번째 분획에 대해 3단계 HPLC(Recycling preparative HPLC)를 추가로 수행하였다. 구체적으로, 상기 항균활성이 확인된 2차 HPLC로 정제된 정제물의 용매를 제거하여 제조된 정제 시료를 50% 아세트로니트릴 수용액(50% aqueous acetonitrile, HPLC-grade, Fisher, USA)에 녹인 후, 0.20 μm syringe filter로 여과시킨 다음, 10번의 recycling을 진행하여 3차의 HPLC 정제(Recycling preparative HPLC)를 수행해 3구간의 정제물을 수득하였다.

상기 HPLC 수행에 있어서, 컬럼(Column)은 JAIGEL-W252 gel perneation chromatography column(W252, 20 x 500 mm, Japan Analytical Industry, 일본)을 사용하였고, 검출기(detector)는 3702 UV detector(Japan Analytical Industry, 일본)을 사용하였다. 상기 HPLC 정제 조건으로 용매는 45% 아세트로니트릴 수용액을 사용하여, flow rate는 2.5 mL/min이었고, 검출기의 UV파장은 210 nm의 조건으로 수행하였다.

상기 HPLC 정제 조건으로 정제된 각 분획은 Speed Vac Concentrator(Centra-Vac VS-802, Vision, 대한민국)를 이용하여 용매를 제거한 후, 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액에 녹여 spot-on-the-lawn법(spot-on-the-lawn method)으로 바실러스 세레우스 KCTC 3624(B. cereus, KCTC 3624)에 대한 항균활성을 측정하였다. 상기 측정결과를 도 1(C, c)에 나타내었다.

상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 3개의 3차 HPLC 분획(preparative HPLC) 중에서 바실러스 세레우스에 대한 항균활성이 가장 강한 분획이 3번째 분획(3-3, 4.00 x 10² AU)인 것으로 확인되었다. 상기 항균활성을 기준으로 1-2분획 대비 3-3분획의 회수율이 0.0313%로 확인되었다.

상기 도 1에서 확인된 결과를 하기 표 1에 정리하여 나타내었다.

정제 단계	부피 (mL)	부피 대비 항균활성 (AU/mL)	총 항균활성 (AU)	회수율 (Recovery, %)
Culture supernatant	800	1,600	1.28 x 10⁵	100
C₁₈ Sep-Pak	80	6,400	5.12 x 10⁵	40
1^st HPLC	20	3,200	6.40 x 10⁴	5
2^nd HPLC	4	1,600	6.40 x 10³	0.5
3^rd HPLC	1	400	4.00 x 10²	0.313

상기 3차의 HPLC 정제(Recycling preparative HPLC)를 수행해 3구간 중 항균활성이 확인된 3종류의 분획인 정제 시료에 대해 Analytical HPLC 정제를 수행하였다. 상기 Analytical HPLC 수행에 있어서, 컬럼(Column)은 LUNA 5 μ C18(2) column(4.6x250 mm, Phenomenex, Torrance, USA)을 사용하였고, 검출기(detector)는 UV detector(UV730D, 영진, 대한민국)을 사용하였다. 상기 HPLC 정제 조건으로 용매는 45% 아세트로니트릴 수용액을 사용하였고, 검출기의 UV파장은 210 nm의 조건으로 수행하였다.

상기 Analytical HPLC 정제를 수행한 정제 분획은 Speed Vac Concentrator(Centra-Vac VS-802, Vision, 대한민국)를 이용하여 용매를 제거한 후, 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액에 녹여 spot-on-the-lawn법(spot-on-the-lawn method)으로 바실러스 세레우스 KCTC 3624(B. cereus, KCTC 3624)에 대한 항균활성을 측정하였다. 상기 측정한 결과를 도 2에 나타내었다. 상기 측정한 결과, 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성을 가진 물질은 HPLC로 분리 및 정제한 결과 1개 분획의 단일물질로 확인되었다.

실험예 2. 분자량 측정 및 구조 분석

상기 실험예 1에서 확인된 Analytical HPLC 정제를 수행한 정제 분획에 대해 LC/MS 분석을 이용한 분자량 측정과 N' 말단 아미노산 서열 분석을 이용한 구조 분석을 수행하였다.

우선, 상기 실험예 1에서 확인된 Analytical HPLC 정제를 수행한 정제 분획인 바실러스 세레우스에 대한 항균 물질의 질량 분석을 LC/MS system(LCQ, Thermo finnigan, USA)을 이용하여 수행하였다. 상기 질량 분석을 위한 시료를 0.1% TFA가 포함된 45% 아세트로니트릴 수용액(45% aqueous acetonitrile, HPLC-grade, Fisher, USA)에 녹인 후, 분석하였고, 상기 분석 결과는 X-Caliber software v.2.0.7(Thermo fisher scientific, USA)를 사용하여 분석하였다. 상기 분석 결과를 도 3에 나타내었다.

상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주가 생산한 바실러스 세레우스에 대한 항균 물질의 분자량은 3401.55 Da인 것으로 확인되었다.

상기 분자량이 확인된 물질은 사전 연구에서 단백질성 물질인 박테리오신으로 추정되었으므로, N' 말단 아미노산 서열 분석법으로 구조를 분석하였다.

상기 N' 말단 아미노산 서열 분석을 위하여 Analytical HPLC 정제를 수행한 정제 분획의 용매를 제거하여 제조된 정제 시료를 45% 아세트로니트릴 수용액(45% aqueous acetonitrile, HPLC-grade, Fisher, USA)에 녹인 후, 아미노산 분석기로 분석하였다. 상기 분석기기는 Procise 491 HT protein sequencer(Applied biosystems, USA)를 이용하여 수행하였고, 컬럼(Column)은 PTH analysis column(2.1 x 220 mm)을 사용하였다. 상기 N' 말단 아미노산 서열 분석 정제 용매는 3.5% THF 수용액(A, 3.5% THF in water) 및 12% 이소프로판올 아세트로니트릴 용액(B, 12% isopropanol in acetonitrile)을 사용하였고, 농도구배 조건은 0 min 8% B, 0.2 min 11% B, 0.4 min 14% B, 18 min 46% B, 18.5 min 90% B로 용출하였으며, 용출속도는 325 μL/min를 유지하였다.

상기 N' 말단 아미노산 서열 분석을 수행한 결과는 도 4에 나타내었다.

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)가 생산한 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성을 갖는 펩타이드는 총 30개 아미노산 서열을 갖는 것으로 확인되었다.

상기 30개 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 신규한지 여부와 관련하여, 상기 서열을 갖는 펩타이드와 기존 연구에서 발표된 항균물질과의 상동성을 비교하기 위하여, NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)와 Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW(http://www.genome.jp/tools/clustalw)에서 아미노산 서열 분석(protein blast, Query coverage)을 수행하였다. 상기 수행한 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)가 생산한 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성을 갖는 펩타이드는 기존 보고된 분자량 4,000 Da인 Subtilosin A와 83%의 상동성이 있음을 확인하였고, 상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 43개의 아미노산 중, 상동서열이 있는 부분을 비교한 결과 73.33%의 아미노산 서열의 상동성이 있음을 확인하였다. 상기 결과로부터, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 SN7 균주가 생산한 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성을 갖는 펩타이드는 신규한 물질임이 확인되었다.

실험예 3. 항균물질의 항균 특성

상기 실험예 2에서 서열이 확인된 도 4의 30개 아미노산 서열을 갖는 항균 활성을 가진 펩타이드 즉 박테리오신의 항균 특성, 구체적으로 식중독균 및 부패균에 대한 항균 스펙트럼과 항균 활성의 안정성을 확인하였다.

상기 항균 스펙트럼과 항균 활성의 안정성을 확인하기 위한 항균활성 측정은 spot-on-the-lawn법(spot-on-the-lawn method)으로 수행하였다. 구체적으로, 상기 항균활성 측정은 상기 식중독균 및 부패균을 평판배지에 1.0x10⁴ 내지 1.0x10⁶ CFU/mL로 도말한 후, 준비된 상기 박테리오신(항균물질) 10 μL를 배지 위에 spotting하여 30 내지 37℃에서 15 내지 24시간 배양하여 항균활성을 측정하였다.

상기 측정한 항균활성을 나타내기 위한 항균활성 역가는 항균물질을 순차적으로 2배씩 희석하여 저해환을 형성하는 최대 희석배수의 역을 취하고, 이 값에 1 mL에 대해서 환산해주는 환산계수를 곱하여 AU/mL로 나타내었으며, 상기 항균활성 역가는 상기 동일한 실험을 3회 반복한 후 평균 값을 사용하였다.

상기 항균 스펙트럼을 확인하기 위한 상기 식중독균 및 부패균은 바실러스 세레우스 균(B. cereus KCTC 3624), 화농성질환을 일으키는 포도상구균(S. aureus ATCC 29213), 식품부패균주로 알려진 미구균(M. luteus ATCC 13513)을 포함한 하기 표 2의 세균을 이용하였고, 상기 항균활성을 측정한 spot-on-the-lawn법에 의해 항균 활성을 측정한 후, 상기와 같은 방법으로 항균활성 역가를 확인하였다.

대상 균주(식중독균 및 부패균)	항균활성(AU/mL)
Salmonella enterica serovar. Typhi(ATCC 19430)	0
Staphylococcus aureus(ATCC 29213)	200
Bacillus cereus(KCTC 3624)	6,400
E. coli O157:H7(ATCC 43895)	0
Vibrio parahaemolyticus(ATCC 17802)	0
Pseudomonas aeruginosa(ATCC 27853)	0
Micrococcus luteus(ATCC 13513)	800

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항균 활성을 가진 펩타이드는 바실러스 세레우스에 대한 특이적인 항균 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 또한, 항균활성의 스펙트럼과 관련하여, 대장균 등에 대한 항균활성은 확인되지 않았으나, 식중독균 및 부패균 중 바실러스 세레우스 균, 포도상구균 및 미구균에 대해서는 항균활성이 인정되는 것으로 확인되었다.

상기 본 발명의 항균 활성을 가진 펩타이드의 항균활성이 특이적으로 높은 바실러스 세레우스 균을 대상으로 본 발명의 펩타이드의 항균활성의 안정성을 확인하였다.

상기 안정성은 pH 안정성, 온도 안정성, 효소 안정성, 염 안정성 및 용매 안정성의 측면에서 확인하였다. 항균 안정성을 확인하기 위한 항균활성의 확인은 상기한 바와 같이, spot-on-the-lawn법에 의해 항균 활성을 측정한 후, 상기 방법으로 항균활성 역가를 확인하는 방법으로 수행하였다

보다 구체적으로, pH에 대한 영향의 조사는 상기 본 발명의 항균 활성을 가진 펩타이드를 5N HCl과 5N NaOH를 사용하여 pH 3.0 내지 pH 10.0으로 pH를 조정한 후, 4℃에서 4시간 동안 처리한 다음, 항균활성을 측정하는 방법으로 수행하였다. 대조구로는 상기 항균 펩타이드를 4℃에서 4시간 동안 처리한 것을 사용하였다. 상기 처리한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

또한, 온도에 의한 영향의 조사는 상기 본 발명의 항균 활성을 가진 펩타이드를 25℃, 30℃, 37℃, 50℃, 70℃, 100℃ 및 121℃에서 각각 열처리한 후, 항균활성을 측정하는 방법으로 수행하였다. 상기 25℃, 30℃, 37℃, 50℃ 및 70℃ 온도에서는 24시간 동안 처리하였고, 100℃에서는 30분 동안 처리하였으며, 121℃에서는 15분 동안 처리하였다. 대조구로는 상기 항균 펩타이드를 4℃에서 24시간 동안 처리한 것을 사용하였다. 상기 처리한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

또한, 각종 효소에 대한 영향의 조사는 상기 본 발명의 항균 활성을 가진 펩타이드를 효소 즉, proteinase K(EC 3.4.21.6, P6556, Sigma Co., U.S.A.), protease(type I, P4630 Sigma Co., U.S.A.), α-chymotrypsin(EC 3.4.21.1, type I-S, Sigma Co., U.S.A.), pepsin(EC 3.4.23.1, P6887, Sigma Co., U.S.A.), trypsin(type I, EC 3.4.21.4, T8003, Sigma Co., U.S.A.), α-amylase(EC 3.2.1.1, Type VIII-A, A2771, Sigma Co., U.S.A.), lipase(EC 3.1.1.3, type VII, Sigma Co., U.S.A.)로 처리한 후, 항균활성을 측정하는 방법으로 수행하였다.

상기 효소처리를 위한 효소반응액은 상기 proteinase K, 상기 protease, 상기 trypsin은 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 상기 각각의 효소를 첨가하여, 20 mg/mL가 되도록 제조하였고, 상기 pepsin은 50 mM Citrate완충용액(pH 2.0)에 상기 효소를 첨가하여, 20 mg/mL가 되도록 제조하였으며, 상기 α-chymotrypsin은 50 mM Tris-HCl /10 mM CaCl₂ 완충용액(pH 7.5)에 상기 효소를 첨가하여, 20 mg/mL가 되도록 제조하였고, 상기 lipase는 50 mM Tris-HCl / 10 mM CaCl₂ 완충용액(pH 7.0) 에 상기 효소를 첨가하여, 20 mg/mL가 되도록 제조하였으며, 상기 α-amylase는 50 mM sodium phosphate / 10 mM NaCl 완충용액(pH 7.0)에 상기 효소를 첨가하여, 20 mg/mL가 되도록 제조하였다.

또한, 상기 효소에 의한 영향의 조사는 본 발명의 항균 활성을 가진 펩타이드에 상기 제조된 각각의 효소반응액을 2 mg/mL의 농도로 첨가한 후, 상기 trypsin 효소와 α-chymotrypsin 효소의 경우 25℃에서 6시간 동안 처리하였고, 나머지 효소들은 37℃에서 6시간 동안 처리하였다. 대조구로는 상기 항균 펩타이드에 효소를 첨가하지 않은 채, 상기 각각의 효소를 처리한 온도 및 시간동안 처리한 것을 사용하였다. 상기 처리한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

염 안정성 조사는 상기 본 발명의 항균 활성을 가진 펩타이드를 3%, 7% 및 15% NaCl 용액으로 25℃에서 1시간 처리한 후, 상기와 같이 Speed Vac Concentrator를 이용하여 용매를 완전히 제거한 후, 항균활성을 측정하는 방법으로 수행하였다. 대조구로는 상기 항균 펩타이드를 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액에 녹여 처리한 것을 사용하였다. 상기 처리한 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

용매 안정성 조사는 항균 펩타이드의 활성에 대한 용매의 영향을 알아보기 위한 것으로, 상기 본 발명의 항균 활성을 가진 펩타이드를 메탄올(Methanol, Fisher, USA), 에탄올(Ethanol, Merck, 독일), 아세트로니트릴(CAN, Fisher, USA) 및 아세톤(Acetone, Merck, 독일)에 25℃에서 1시간 처리한 후, 상기와 같이 Speed Vac Concentrator를 이용하여 용매를 완전히 제거한 후, 항균활성을 측정하는 방법으로 수행하였다. 대조구로는 상기 항균 펩타이드를 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액에 녹여 처리한 것을 사용하였다. 상기 처리한 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

구분	항균활성(AU/mL)
대조구	6,400
pH 2	6,400
pH 3	6,400
pH 4	6,400
pH 5	6,400
pH 6	6,400
pH 7	6,400
pH 8	6,400
pH 9	6,400
pH 10	6,400

구분	항균활성(AU/mL)
대조구	6,400
25℃, 24 hr	6,400
37℃, 24 hr	6,400
50℃, 24 hr	6,400
70℃, 24 hr	3,200
100℃, 30 min	3,200
121℃, 15 min	1,600

구분	항균활성(AU/mL)
대조구	6,400
Proteinase K	0
Protease	0
α-Chymotrypsin	0
Pepsin	800
Trypsin	6,400
α-Amylase	6,400
Lipase	6,400

구분	항균활성(AU/mL)
대조구	6,400
3% NaCl	6,400
7% NaCl	6,400
15% NaCl	6,400

구분	항균활성(AU/mL)
메탄올	6,400
에탄올	6,400
아세트로니트릴	6,400
아세톤	6,400

상기 표 3에 나타내 바와 같이, pH에 대한 안정성 실험에서 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 항균활성은 pH 2.0 내지 pH 10.0 구간에서 대조군과 동일한 항균활성이 측정되었으므로, 상기 pH 조건 즉, pH 2.0 내지 pH 10.0 구간에서 항균활성이 안정한 것으로 확인되어, 상기 본 발명의 펩타이드의 항균활성은 산성에서부터 알칼리까지 pH 구간에서 안정함이 확인되었다.

또한, 상기 표 4에 나타내 바와 같이 온도에 대한 안정성 실험에서 상기 본 발명의 펩타이드의 항균활성은 50℃까지 대조군과 동일한 항균활성이 측정되었고, 70℃ 처리 및 100℃ 처리 시, 대조군의 항균활성의 반(3,200 AU/mL)으로 줄어들었으며, 121℃에서 처리 시, 대조군의 항균활성의 25%(1,600 AU/mL)로 역가가 감소되는 것이 확인되어, 열에 불안정한 물질이나, 일반적으로 메주가 제조되는 제조과정의 온도 범위에서는 대체적으로 열에 대한 안정성이 확보된 것으로 확인되었다.

또한, 상기 표 5에 나타내 바와 같이 각종 효소에 대한 안정성 실험에서 상기 본 발명의 펩타이드의 항균활성은 proteinase K, protease 및 α-chymotrypsin의 처리에는 불활성화되어 항균활성을 상실되었다. 한편, trypsin, α-amylase 및 lipase의 처리에는 영향을 받지 않았으며, pepsin 처리의 경우, 역가가 99.8% 감소되는 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터 본 발명의 펩타이드의 항균활성은 단백 분해 효소에 의해 활성이 실활되거나 영향을 받는 단백질성 물질인 박테리오신에 해당하여, 해당 펩타이드의 섭취가 인체에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 표 6에 나타내 바와 같이, 염 농도에도 불구하고, 15% NaCl 농도에서도 펩타이드의 항균활성이 대조군과 동일한 항균활성이 측정되어 상당히 안정한 것으로 확인되었고, 상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 다양한 용매에서도 대조군과 동일한 항균활성이 확인되어, 상기 본 발명의 펩타이드의 항균활성은 염농도 및 용매 종류에 대한 안정성이 우수한 것으로 확인되었다.

상기 실험결과로부터, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 넓은 pH 범위, 염 농도 및 용매 종류에서 안정성이 인정되고, 단백 분해 효소를 제외한 효소에 대해서도 안정성이 인정되는 단백질성 항균물질로, 여러 단백 분해 효소에 의해 실활되어 식품 등에 사용되는 경우 체내의 소화효소에 의해 분해되어 인체에 위해효과를 미치지 않는 펩타이드로 이루어진 박테리오신(bacteriocin) 또는 박테리오신 유사 물질이므로, 메주를 포함한 두류 발효식품 관련 산업에 널리 활용될 수 있을 것으로 판단되었다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

<110> Industry University Cooperation Foundation Chosun University <120> A ANTIMICROBIAL PEPTIDE AND A ANTIMICROBIAL COMPOSITION CONTAINING THE SAME <130> CDP20160101 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Bacillus subtilis SN7 <400> 1 Leu Gly Pro Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ala Thr Cys Ser Ile Gly Ala 1 5 10 15 Ala Cys Leu Val Asp Gly Pro Ile Pro Asp Glu Ile Ala Gly 20 25 30

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이들의 산 부가염.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 위해 미생물에 대한 항균 활성을 갖는 것인 펩타이드 또는 이들의 산 부가염.
제2항에 있어서,
상기 위해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 마이크로코커스 류테우스(Micrococus luteus)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 이들의 산 부가염.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)가 생산하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 이들의 산 부가염.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드.
제5항의 뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제1항의 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물.
제1항의 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 보존제.
제1항의 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스, 황색포도상구균 또는 마이크로코커스 류테우스에 대한 항균용 약학적 조성물.
제1항의 펩타이드 또는 이들의 산 부가염을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스, 황색포도상구균 또는 마이크로코커스 류테우스에 대한 항균용 식품 첨가제.