KR20150126251A - 메주로부터 분리된 바실러스 서브틸리스 및 이를 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 메주로부터 분리된 신규한 바실러스 서브틸리스, 상기 균주의 용도, 상기 균주를 포함하는 발효용 스타터, 발효식품용 종균 조성물 및 상기 종균 조성물을 이용하여 제조한 발효식품에 관한 것이다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주는 위해미생물로 식중동 원인균이고, 장류 제조 공정 중 혼입되어 식중독을 유발하는 원인균주인 바실러스 세레우스에 대한 항균활성이 우수하고, 식품독소 생성여부 및 단백 분해 효소에 의한 분해 여부를 통해 확인한 결과 식품독소도 생성하지 아니하고, 상기 위해미생물에 대한 항균활성은 박테리오신에 의한 것으로, 상기 항균활성을 나타내는 단백질성 물질인 박테리오신은 식품의 섭취 과정에서 단백분해효소에 의하여 분해 또는 실활되어서, 식품을 섭취하는 인체에는 영향을 미치지 않고 안전성도 확인되었으므로, 최근 웰빙의 영향에 따라 식품의 열처리에 의한 살균을 대체하고자 하는 식품 또는 의약 산업분야에 있어서, 폭 넓게 사용할 수 있다.

Description

메주로부터 분리된 바실러스 서브틸리스 및 및 이를 포함하는 항균 조성물{BACILLUS SUBTILIS SEPARATED FROM MEJU AND A ANTIBACTERIAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME}
본 발명은 메주로부터 분리된 신규한 바실러스 서브틸리스, 상기 바실러스 서브틸리스의 용도 및 상기 바실러스 서브틸리스를 이용한 발효식품 제조공정에 관한 것이다.
바실러스 세레우스(Bacillus cereus, B. cereus)는 흙, 먼지, 곡류, 야채류, 동물의 털, 침전물 등 자연계에 널리 존재하는 미생물로 대표적인 식중독 원인 세균 중 하나로 알려져 있다. 상기 바실러스 세레우스를 포함한 식중독 세균인 바실러스 세레우스 그룹(B. cereus group)인 바실러스 세레우스, 바실러스 미코이데스(Bacillus mycoides , B. mycoides), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis , B. anthracis) 및 바실러스 터리기엔시스(Bacillus thuringiensis, B. thuringiensis)는 표현형과 유전형이 매우 유사한 세균들로써 열처리 후에도 살아남아 식중독 혹은 식품의 변패를 유발시키는 것으로 알려져 있다.
이 중 대표적인 식중독 원인균인 바실러스 세레우스는 내열성이 높은 내생포자를 생성하고, 포자는 타원형이거나 원통형으로 세포의 중앙 또는 말단에 위치하며, 호기적 조건 및 혐기적 조건 모두에서도 증식가능한 그람양성의 호기성 간균이다. 상기 바실러스 세레우스는 야채와 곡류 등의 농작물 및 식품 원료 내에서는 주로 포자 상태로 존재한다. 상기 바실러스 세레우스의 생육 최적 온도는 28℃ 내지 35℃로, 발육온도는 7℃ 내지 49℃이고, 증식 가능한 pH 범위는 pH 4.9 내지 pH 9.3이며, 포자의 발아 최적온도는 10℃ 내지 49℃이다. 상기 바실러스 세레우스의 균독소 생산은 포자의 발아 말기에 이루어지는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 바실러스 세레우스 균 자체는 63℃에서 30분 또는 100℃에서 2분 이내에 사멸 가능하나, 상기 바실러스 세레우스의 포자는 135℃에서 4시간 가열에도 견딜 수 있는 내열성으로 가지고 있다.
상기 바실러스 세레우스가 식중독 원인균으로 최초로 의심된 것은 1980년대 말로, Hauge에 의하여 1955년에 노르웨이 오슬로에서 상기 바실러스 세레우스가 식중독 원인균임이 처음 보고되었다. 우리나라의 상기 바실러스 세레우스에 의한 식중독 발생현황의 경우에는, 2001년 1건에 20명, 2003년 3건에 198명, 2004년 2건에 84명, 2005년 1건에 24명, 2006년 5건에 54명 및 2007년 1건에 50명이 발생된 것으로 보고되어 있다. 그러나, 이러한 제한적인 발생현황은 청국장이나 된장과 같은 바실러스 속 발효균주에 의한 발효식품을 포함한 여러 발효음식과 가열되지 않은 생야채 등의 식품을 자주 섭취하는 우리나라의 식습관을 고려하면, 상기 바실러스 세레우스에 의한 식중독에 대한 관심 부족과 심층적인 연구의 부족에 의한 것으로 평가되고 있다.
상기 바실러스 세레우스에 의한 식중독의 증상으로 두 가지 즉, 주로 설사가 유발되는 증상인 설사형(Dirrhoeal syndromes, Dirrhoeal type)과 주로 구토가 유발되는 증상인 구토형(Emetic syndromes, Emetic type)으로 구분될 수 있다.
상기 설사가 유발되는 증상인 설사형은 장내에서 바실러스 세레우스의 포자에 의해 형성된 장독소(enterotoxin)에 의해 주로 유발되는 것으로 알려져 있으며, 감염된 단백질이 포함된 식육 제품이나 채소 스프, 소스 또는 푸딩 등의 식품을 섭취한 경우 주로 발생한다. 구체적으로, 상기 바실러스 세레우스의 포자는 장관의 조건에서도 살아남을 수 있으므로, 상기 바실러스 세레우스의 포자가 장관의 상피세포에 부착하여 장독소와 같은 식중독 유발요소를 생성할 경우 설사가 유발되는 증상이 일어나는 것으로 알려져 있다. 상기 설사형의 임상증상은 오염된 식품의 섭취 후 8시간 내지 16시간의 잠복기를 가진 후, 복통, 설사 또는 메스꺼움 등이 일어나는 것으로 보고되고 있다.
한편, 구토가 유발되는 증상인 구토형은 상기 바실러스 세레우스의 영양세포로 성장하거나 포자로 발아하는 동안에 생산된 독소에 의한 것으로, 쌀, 파스타, 국수 등 튀기거나 조리한 전분질 식품에 의해 주로 발병하는 것으로 알려져 있다. 특히, 바실러스 세레우스는 불안전한 조리과정을 거친 식품을 48℃ 이하에서 유지시키는 경우 빠르게 증식하여 식중독을 일으킬 수 있으나, 상기 구토가 유발되는 증상의 경우, 증상이 미약하고, 보통 24시간 이내에 치료가 가능하므로, 실제로 식중독 발생 건수에 비해 보고가 많이 되지 않는 것으로 조사되어 있다.
상기 바실러스 세레우스에 의한 식중독의 증상 분포는 각 나라별로 차이가 있으며, 일 예로 일본의 경우, 매년 6건 내지 24건으로 33명 내지 863명의 환자발생이 기록되고 있으며, 주된 증상으로는 구토형이 설사형보다 10배나 더 빈번하게 발생하는 것으로 보고되고 있는 반면, 유럽과 북미의 서구에서는 설사형이 더 빈번하게 발생하는 것으로 보고되어 있으며, 이는 각 나라별 식습관과 생활습관에 기인한 것으로 예상된다.
그러나, 상기한 바와 같이 실제로 식중독 발생 건수에 비해 보고가 많이 되지 않는다고 하여도, 바실러스 세레우스에 의해 오염된 식품에서 상기 바실러스 세레우스가 생장하는 경우, 식품의 쓴맛이 생겨 제품의 품질을 현저히 저하시킬 뿐만 아니라, 상기 바실러스 세레우스가 생산하는 독소에 의해 오심, 구토 또는 위경련 등의 증상을 갖는 식중독이 문제가 될 수 있고, 이로 인해 폐렴이나 안구 감염 등의 감염증이나 간장의 기능 부전 등의 심각한 건강상의 문제가 발생될 수 있으므로, 이에 대한 대책의 마련이 시급하게 요구되고 있다.
일 예로, 우리나라의 식품의약품안전처(KFDA)는 식품 안전성 확보를 위해 2007년부터 된장, 고추장, 청국장 및 춘장을 포함하는 모든 시판 장류 제품에서 허용되는 바실러스 세레우스 균 수를 1.0×104 CFU/g 이하로 고시하였다. 그러나, 바실러스 세레우스는 자연계에 흔하게 존재할 뿐만 아니라, 포자를 형성하여 열에 잘 견딜 수 있고, 염도가 높은 장류에서도 잘 자라기 때문에, 위해 요소 중점 관리제도(HACCP)가 정착되지 않은 대부분의 장류 제조업체 특히, 전통방식으로 장류를 제조하는 것을 특징으로 하는 전통 장류 제조업체에서는 우리나라의 식품의약품안전처가 고시한 바실러스 세레우스 균수 상한선을 맞추기가 어려운 상황이다. 따라서, 식중독 원인 미생물과 관련한 안전성의 확보란 차원에서 바실러스 세레우스 균으로부터 식품의 안전성을 확보하기 위하여, 바실러스 세레우스의 제어를 위한 항균물질의 연구가 요구된다.
항균물질 중에서 박테리오신(bacteriocin)은 여러 종의 미생물이 생산하는 천연 항균성 단백질(antimicrobial peptide) 또는 단백질계의 물질로서, 일반적으로 상기 박테리오신을 생산하는 미생물과 형태학 또는 계통학적으로 유사한 균에 대하여 살균기작을 갖는 물질을 의미한다.
상기 박테리오신은 인체에 무해하고 잔류성이 없으며 기존의 항생제가 2차 대사산물 것과 달리, 플라스미드(plasmid)나 염색체(chromosome)로부터 직접 생합성되어 생산되는 것이므로, 유전자조작 등에 의한 생물공학적 응용이 쉽다는 장점이 있다. 또한, 상기 박테리오신은 단백질이기 때문에, 인체에 섭취되는 즉시 소화기관의 단백 가수분해효소에 의해 분해되어, 체내에서 부작용과 같은 문제를 발생시키지 않으므로, 식품 등의 새로운 생물학적 보존제(biopreservative) 내지는 발효식품 등의 생물 제어제(bioregulator)로 그 효용이 크게 기대되고 있다.
상기 박테리오신은 정제기술과 분자생물학의 급속한 발전에 따라, 분자적 해명이 부분적으로 이루어지고 있으며, 이를 토대로 분자 및 생리학적 특성에 따라 상기 박테리오신을 4개의 군(class)으로 분류하고 있다. 우선, ClassⅠ은 lantibiotics로 유전자가 단백질로 형질전환(translation)된 이후의 변이에 의하여 생성되는 독특한 아미노산인 lanthionine과 β-methyl lanthionine을 함유하며, 대표적 박테리오신인 니신(nisin)이 여기에 속한다. 대부분의 박테리오신들이 속하는 Class Ⅱ는 lanthionine을 함유하지 않는 박테리오신으로, 분자량이 13 KDa 이하로 작아, 복잡한 3차 구조를 형성하지 않으므로 비교적 열에 안정한 특징이 있다. Class Ⅲ은 분자량이 30 KDa 이상인 것으로, 열에 불안정하며, Class Ⅳ는 박테리오신의 활성부위가 단백질과 탄수화물 또는 지방이 결합된 특징을 갖는 박테리오신이다.
상기 박테리오신의 작용기작은 크게 세 종류로 분류된다. 우선, 상대 균주의 증식만을 억제하는 저해작용(bacteriostatic action), 상대 균주를 사멸시키는 살균작용(bactericidal action) 및 상대 균주의 사멸뿐 아니라 세포벽을 용해시키는 용균작용(bacteriolytic action)등이 있다.
상기 박테리오신과 관련하여, 최근까지 유산균 유래 박테리오신에 관한 연구가 주를 이루고 있다. 상기 유산균은 GRAS 등급의 안전성이 인정된다는 장점이 있으나, 상기 유산균 유래 박테리오신의 경우에는 항균 스펙트럼(spectrum) 즉, 항균활성 범위가 좁기 때문에 실제로 식품보존제 등으로 널리 활용되지 못하고 있다.
한편, 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물은 오랜 세월 동안 식품산업 및 발효산업에 널리 사용되어온 균주로, 이 중 바실러스 서브틸리스 그룹(Bacillus subtilis group) 구체적으로, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus은 European Food Safety Authority (EFSA)에 의해 “Qualified presuaption of safe(QPS)”로 인정되어, 그 안전성이 확보된 균주이다. 상기 균주들은 우리나라의 된장이나 청국장 또는 일본의 낫또(natto)를 비롯하여 극동 아시아나 아프리카 지역의 전통음료나 알칼리 발효식품의 제조에 있어서 매우 중요한 발효미생물로 작용하고 있다.
최근, 수익 증대와 소비 트랜드의 변화로 인하여, 소비자들은 저장기간이 길면서 가공이 최소화된 식품을 선호하는 경향이 두드러지고 있다. 그러므로, 전통 발효식품과 함께 섭취해온 바실러스 속(Bacillus sp.) 속에서 유산균 박테리오신의 한계를 극복할 수 있는, 구체적으로 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 갖는 천연식품 보존제의 개발, 구체적으로 상기 구체적으로 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 갖는 박테리오신을 생산할 수 있는 균주 및 이를 이용한 식품 보존제의 개발에 대한 요구가 급증하고 있다.
10-1131563B 10-1065262B 10-1098624B
본 발명은 전통 발효 식품으로부터 분리되고, 발효식품의 오염과 관련하여 문제가 되는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, B. cereus)에 대한 항균활성을 가지면서도 식품에 적용되는 것이므로 안전성이 확보될 수 있는 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 미생물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 활성성분으로 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, B. cereus)에 대한 항균 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 보존제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 미생물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 활성성분으로 포함하는 발효식품용 종균 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 미생물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축액 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 활성성분으로 포함하는 발효용 스타터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메주로부터 분리되고, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균활성을 가지는 신규한 바실러스 서브틸리스 균주(Bacillus subtilis)를 제공한다.
상기 바실러스 서브틸리스 균주는 pH 2.0 내지 pH 9.0의 pH 조건 및 20℃ 내지 50℃의 범위에서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균활성을 가지는 것인 바실러스 서브틸리스 균주일 수 있다.
또한, 상기 바실러스 서브틸리스 균주는 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 가지고, 메탄올 용매에 의해 용출되는 박테리오신을 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스 균주일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 보존제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 균주, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는 메주 발효용 스타터(Starter)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 균주를 포함하는 발효식품용 종균 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발효용 스타터 또는 상기 발효식품용 종균 조성물을 첨가하여 제조된 것을 특징으로 하는 발효식품을 제공한다. 상기 발효식품은 메주일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 균주를 포함하는 발효식품용 종균 조성물 또는 상기 바실러스 서브틸리스 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 메주 발효용 스타터(Starter)를 이용하여 메주를 제조하는 단계를 포함하는 메주 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 항균 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 구체적으로 그람양성균, 그람음성균, 진균(효모 및 곰팡이)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질 즉, 항세균 및 항진균 효력이 있는 물질을 의미하며, 바람직하게는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, B. cereus)에 대한 항균활성을 갖는 물질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 배양물이란 특정 미생물을 배양배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 상기 배양물은 상기 특정 미생물을 포함하거나 포함하지 아니할 수 있다. 상기 배양물은 그 제형이 한정되지 않고, 일 예로 액체 또는 고체 일 수 있다. 상기 배양배지란 동물세포나 식물세포 또는 세균 따위의 생장에 필요한 영양소가 들어있는 고체 또는 액체를 의미한다.
본 발명에 있어서, 배양액이란 액체배지에 균주를 접종하여 배양하는 것을 의미한다. 상기 배양액은 균주를 포함하는 것 또는 균주를 접종하여 배양한 후, 제균 즉 균주를 제거(cell-free)한 배양여액 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 배양액의 농축액이란 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, 배양액의 건조물이란 상기 배양액의 물기를 없앤 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 보존제란 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상에 사용될 수 있는 것으로, 세균, 곰팡이 및 효모로 이루어지는 군 중에서 선택된 1 종 이상의 위해 미생물 또는 부패미생물의 증식을 억제하거나 살균하여 식품, 사료 의약품을 보존하는 첨가물로서 부패미생물의 발육을 저지하거나 살균할 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 발효용 스타터(stater)란 발효에 관여하는 바실러스 서브틸리스 또는 세균 등을 포함하는 미생물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 상기 발효용 스타터는 발효식품 등의 생산 시 첨가하여 발효식품에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 발효용 스타터를 사용하여 발효식품을 제조하는 경우, 상기 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여 발효식품의 품질을 일정하게 조절하거나, 발효의 속도 또는 단계를 조절할 수 있으며, 특정한 목적을 달성한 발효 식품을 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 종균이란 발효에 이용되는 미생물로서, 발효를 위하여 기질 또는 식품에 접종되는 미생물을 의미하고, 종균 조성물이란 발효를 개시하는데 필요한 하나 이상의 접종균체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하고, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공규, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으며 본 발명에서 발효식품, 기능성 식품 및 가공식품을 포함하는 것을 의미하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 발효식품이란 바실러스 서브틸리스나 효소 등 미생물을 한가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 메주, 젓갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두가 포함된다.
본 발명에 있어서, 메주(Korean-style fermented soybean)란 삶은 콩을 찧어 덩이를 지워서 띄워 말린 것으로, 며주 또는 말장이라고도 불리운다. 상기 메주의 발효 과정에는 리조프스 속(Rhizopus sp.) 곰팡이, 아스퍼질러스 속 곰팡이(Aspergillus sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.) 미생물 등의 미생물이 관여하며, 개량식 메주의 경우에는 황국균(Aspergillus oryzae)를 인공 접종시켜 메주의 품질을 개선하고, 제조기간을 단축시켜 제조한다. 식품공전에 의하면, 한식메주는 대두(95% 이상)를 주원료로 하여 증숙 및 성형하여 발효시킨 것이라 하고, 개량메주는 대두(85% 이상)를 주원료로 하여 곡물 알갱이의 형태를 유지하여 발효시킨 것이라 한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 발명자들은 발효식품 특히, 유산균에 의해 발효되는 유제품과 달리, 바실러스(Bacillus sp.) 속 미생물을 이용하여 콩을 발효하여 제조되는 발효식품에 있어서, 식중독 등 질병의 원인이 될 뿐만 아니라 식품의 가치를 감소시키는 원인균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, B. cereus)에 대한 항균활성을 가져, 세균에 의한 감염의 가능성이 높은 전통식 발효법에 의할 경우에도 바실러스 세레우스에 의한 감염으로 인한 안전성 문제를 제어할 수 있는 미생물을 확보하기 위해 연구하던 중, 우리나라 전통방식으로 제조된 메주로부터 분리된 미생물 중 항균활성을 가진 후보 미생물 100여종에 대해 확인한 결과, 대부분의 미생물이 상기 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, B. cereus)에 대해 항균활성을 갖지 못하거나 아주 약한 항균활성을 지니는 반면, 특정 미생물은 상기 바실러스 세레우스에 대해 강한 항균활성을 가지며, 이러한 항균활성을 갖는 미생물이 European Food Safety Authority (EFSA)에 의해 “Qualified presuaption of safe(QPS)”로 인정되는 바실러스 서브틸리스 그룹에 속할 뿐만 아니라, 해당 바실러스 세레우스에 대한 항균활성이 식품의 보존 또는 메주 등의 발효 식품의 제조 과정에 속하는 온도 및 pH 범위에서 우수하게 유지되는 것을 확인하였고, 추가적으로 해당 항균활성이 항균활성을 나타내는 단백질성 물질에 의해 발휘되는 것이므로, 상기 항균활성을 나타내는 단백질성 물질의 분해 또는 실활에 의해 식품을 섭취하는 인체에는 영향을 미치지 않고 안전하다는 것을 확인하여, 최종적으로 상기 바실러스 세레우스에 대해 항균활성을 가지는 바실러스 서브틸리스 미생물이 식품에 용이하게 사용될 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 메주로부터 분리되고, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균활성을 가지는 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)에 관한 것이다.
상기 메주는 콩, 보리, 밀 및 쌀 등을 익혀 띄워 만드는 장을 담그는 기본 재료로 주로 콩, 구체적으로 대두를 삶아 찧어서 덩이를 만들어 발효시켜 제조된 것일 수 있다.
상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)는 경기도 수원시 권선구 서호로 34, 국립농업과학원에 위치한 농업유전자원센터에 2014년 2월 25일 자로 기탁하여 수탁번호 KACC 91935P를 부여 받았다.
따라서, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주는 메주로부터 분리되고, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균활성을 가지며, 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)일 수 있다.
상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주는 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 가지고, 상기 항균활성은 pH 2.0 내지 pH 9.0의 pH 조건 및 20℃ 내지 50℃의 범위에서 유지되며, 상기 항균활성과 관련하여, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주는 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 가지고, 소수성 컬럼을 이용하여 분리할 경우, 메탄올 용매에 의해 용출되는 박테리오신을 생산할 수 있는 특성을 갖는다.
구체적으로, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주의 배양액을 소수성 컬럼과 아세톤니트릴 및 메탄올을 이용하여 분리할 경우, 메탄올 용매에 의해 용출되는 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성을 가지는 박테리오신을 생산할 수 있는 것인 바실러스 서브틸리스 SN7 균주일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주의 배양액, 구체적으로 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주를 접종하고 배양시킨 배양액을 여과지를 이용하여 제균한 제균된 배양액을 소수성 컬럼과 아세톤니트릴 및 메탄올을 이용하여 분리 또는 정제할 경우, 구체적으로 상기 제균된 배양액을 소수성 컬럼에 투입한 후, 100% 메탄올 용매 및 100% 아세톤니트릴 용매로 용출시킬 경우, 아세톤니트릴 용매로 용출시킨 물질은 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성이 없는 반면, 메탄올 용매에 의해 용출되는 물질은 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성을 가지며, 상기 항균 활성을 가지는 메탄올 용매에 의해 용출되는 물질은 단백분해효소, 일 예로 proteinase K에 의해 항균활성이 소실되는 것으로 확인되어, 박테리오신으로 확인되었으므로, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주는 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주의 배양액을 소수성 컬럼과 아세톤니트릴 및 메탄올을 이용하여 분리할 경우, 메탄올 용매에 의해 용출되는 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성을 가지는 박테리오신을 생산할 수 있는 것인 바실러스 서브틸리스 SN7 균주일 수 있다
이러한 측면에서, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주는 식품의 보존 또는 메주 등의 발효 식품의 제조 과정에 속하는 온도 및 pH 범위에서 바실러스 세레우스에 대한 높은 항균활성이 유지될 뿐만 아니라, 상기 항균 활성은 단백분해효소에 의해 분해되는 단백질성 물질 즉, 박테리오신에 의한 것이므로, 식품의 섭취 과정에서 상기 항균활성을 나타내는 단백질성 물질인 박테리오신이 단백분해효소에 의하여 분해 또는 실활될 것이므로, 이로 인하여 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주의 바실러스 세레우스에 대한 항균활성은 식품을 섭취하는 인체에는 영향을 미치지 않고 안전한 것으로 평가되므로, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주는 바실러스 세레우스에 대한 높은 항균활성과 식품에 적용시에 요구되는 안전성 모두를 가지는 것으로 종래 알려진 기존의 바실러스 서브틸리스 균주에 비하여 현저하게 우수한 효과를 가질 수 있다.
상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)는 도 4에 나타낸 염기서열을 갖는 16S rDNA를 가지고, 상기 16S rDNA 염기서열 분석결과 바실러스 서브틸리스 표준균주인 Bacillus subtilis DSM 10과 99.9%의 상동성을 나타내었다. 따라서, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)는 도 1에 나타낸 염기서열을 갖는 16S rDNA를 가지는 균주 일 수 있다.
상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)는 D-글루코즈(D-glucose), D-프럭토즈(D-fructose), D-만노즈(D-mannose), 이노시톨(Inositol), 만니톨(Mannitol), 소르비톨(Sorbitol), 아미그달린(amygdalin), 알부틴(Arbutine), 에스큘린(Esculine), 살리신(salicine), 셀로비오즈(cellobiose), 사카로스(Saccharose), 트레할로스(trehalose), 아미돈(Amidon) 및 글리코겐(Glycogene)에 대한 당대사능이 있다.
상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)는 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성을 가지고, 메주 제조 시 종균으로 이용하는 경우, 메주에 접종된 바실러스 세레우스의 생육을 효과적으로 억제하며, 상기 항균 활성을 가지는 물질은 단백 분해 효소에 의해 분해 또는 실활 가능한 단백질성 물질인 박테리오신이므로, 식품의 섭취 과정에서 상기 항균활성을 나타내는 단백질성 물질인 박테리오신이 단백분해효소에 의하여 분해 또는 실활될 것이므로, 이로 인하여 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주의 바실러스 세레우스에 대한 항균활성은 식품을 섭취하는 인체에는 영향을 미치지 않고 안전한 것으로 평가되므로, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주는 바실러스 세레우스에 대한 높은 항균활성과 식품에 적용시에 요구되는 안전성 모두를 가지는 것으로 종래 알려진 기존의 바실러스 서브틸리스 균주에 비하여 현저하게 우수한 효과를 가질 수 있다.
따라서, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주로 메주를 제조할 경우, 기존과 같이 콩의 발효를 통한 메주 제조과정을 수행할 수 있으면서도, 바실러스 세레우스에 대한 우수한 항균활성은 메주 제조 과정에서 감염되어 식중독을 일으키는 바실러스 세레우스를 억제하여, 발효식품의 식중독과 관련된 문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 항균활성을 나타내는 박테리오신은 단백분해효소에 의해 분해 또는 실활될 것이므로, 상기 장류 또는 이를 이용하여 제조된 식품을 섭취하는 경우에도 인체에 문제가 발생되지 아니할 것이므로, 메주 제조를 위한 종균으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 확인되었다.
이러한 측면에서, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
상기 항균 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주, 이의 배양물, 배양물의 농축물 또는 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유효성분을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있으며, 상기 항균 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.
상기 항균 조성물은 식중독 원인 위해 미생물, 구체적으로는 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 항균 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용되어 항균 활성을 나타낼 수 있으며, 곡류를 포함한 식품, 화장품 또는 의약에 적용되어 바실러스 세레우스에 의한 제품의 부패를 억제하거나 예방할 수 있으며, 상기 항균 활성을 나타내는 물질인 박테리오신은 단백분해효소에 의해 분해 또는 실활될 것이므로, 상기 항균 조성물을 상기 항균 조성물이 적용 가능한 식품, 화장품 또는 의약에 활용할 경우에도 상기 항균 활성을 나타내는 물질에 의해 2차적인 문제가 발생되지 아니한다는 장점이 있다.
상기 항균 조성물은 상기 유효성분 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다.
상기 당질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.　 상기 단백질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.　 상기 지질은 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.　 상기 비타민류는 특별한 제한은 없으며, 상기 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일예로, 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류 중 어느 것에 대해서도, 조성물의 항균성이 유지되는 한 상기 구체예에 한정되지 않고 다른 성분을 포함할 수 있으며, 각각의 함량은 항균성이 유지되는 한 제한되지 아니하고, 바람직하게는 전체 조성물 대비 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 10 중량%일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 보존제를 제공한다.
상기 보존제는 세균, 곰팡이 및 효모 등의 위해 미생물 또는 부패 미생물의 증식을 억제하거나 살균하여, 위해 미생물 또는 부패 미생물, 구체적으로 바실러스 세레우스에 의해 감염되거나 부패될 수 있는 보존대상의 변질, 산패 또는 부패를 방지하고 보존대상의 상태를 유지하기 위하여 사용되는 물질을 의미하며, 바람직하게는 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상에 사용될 수 있는 것을 의미한다. 상기 바실러스 세레우스에 대한 증식 억제 및 살균 활성을 나타내는 물질인 박테리오신은 단백분해효소에 의해 분해 또는 실활될 것이므로, 상기 보존제는 상기 보존제가 사용되는 보존대상인 식품, 화장품 또는 의약에 적용될 경우에도 상기 항균 활성을 나타내는 물질에 의해 2차적인 문제가 발생되지 아니한다는 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 식품가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 건강보조식품, 조미식품, 제빵 및 제과류, 유가공품, 절임식품, 발효식품 또는 음료 등을 포함하며, 상기 사료는 가축 사료를 포함하여 그 용도에 제한되지 아니하고, 고체 또는 액체일 수 있다.
본 발명의 상기 항균 조성물을 포함하는 보존제 조성물은 상기 항균 조성물을 포함하는 것을 제외하고는 보존제에 포함되는 통상의 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 보존제 조성물은 전체 조성물 100 중량부에 대하여 상기 항균 조성물을 0.1 내지 50 중량부 또는 0.5 내지 10 중량부 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 보존제 조성물은 본 발명의 효과를 제한하지 않는 범위 내에서, 종래의 합성 보존제 또는 유기산 혼합물을 함께 사용할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 유효성분으로 포함하는 발효용 스타터(Starter), 바람직하게는 메주 발효용 스타터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주를 포함하는 발효식품용 종균 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발효용 스타터 또는 상기 발효식품용 종균 조성물을 첨가하여 제조된 것을 특징으로 하는 발효식품을 제공한다. 상기 발효식품은 메주일 수 있다.
상기 발효용 스타터를 발효식품의 생산 시 첨가하여 발효식품을 제조하는 경우, 상기 발효용 스타터에 포함된 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7, KACC 91935P), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상에 의하여 발효식품의 품질을 일정하게 조절할 수 있고, 상기 스타터의 첨가량 또는 초기 균수에 의하여 발효의 속도를 조절할 수 있다. 또한, 상기 발효용 스타터를 메주에 사용하는 경우, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7, KACC 91935P)는 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주는 바실러스 세레우스에 대한 높은 항균활성과 식품에 적용시에 요구되는 안전성 모두를 가지는 것, 구체적으로 바실러스 세레우스의 생육을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 상기 균주를 이용하여 메주를 제조하는 경우, 바실러스 세레우스를 효과적으로 억제할 수 있고, 해당 바실러스 세레우스에 대한 항균 효과를 나타내는 물질의 경우 단백 분해 효소에 의해 분해 또는 실활될 수 있는 박테리오신이어서, 식품의 섭취 과정에서 상기 항균활성을 나타내는 단백질성 물질인 박테리오신이 단백분해효소에 의하여 분해 또는 실활될 것이므로, 결과적으로 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주를 이용하여 제조된 메주 또는 이를 이용한 음식을 섭취할 경우 상기 바실러스 세레우스에 대한 항균활성은 식품을 섭취하는 인체에는 영향을 미치지 않고 안전성에서도 문제되지 아니할 것으로 평가되어서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 SN7 균주를 이용하여 제조된 메주 및 상기 메주를 식재료로 사용하는 식품 산업 분야의 발전에 기여할 수 있을 것으로 평가된다.
상기 발효용 스타터에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7, KACC 91935P)를 포함하는 발효식품용 종균 조성물에 관한 것이다.
상기 종균 조성물을 발효식품의 생산 시 첨가하여 발효식품을 제조하는 경우, 상기 종균 조성물에 포함된 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7, KACC 91935P)에 의하여 발효식품의 품질을 일정하게 조절할 수 있고, 상기 종균 조성물의 첨가량 또는 초기 균수에 의하여 발효의 속도를 조절할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 종균 조성물을 메주의 제조에 사용하는 경우, 바실러스 서브틸리스 SN7 균주가 우점종을 형성할 수 있으므로, 바실러스 서브틸리스가 갖는 항균활성에 의하여 오히려 잡균의 번식을 막을 수 있고, 특히 전통방식에 의해 제조되는 장류에서 문제가 되는 식중독균의 감염 특히, 동속 균주여서 대부분의 바실러스 서브틸리스가 항균 활성을 가지지 못하거나 약한 항균 활성만을 가지는 바실러스 세레우스에 대한 감염을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 기존 장류 제조에서 발생될 수 있는 안전성과 관련된 문제가 해결되어, 메주 또는 메주로부터 제조되는 된장이나 간장을 식재료로 사용하는 식품 산업 분야의 발전에 기여할 수 있다.
상기 종균 조성물에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물을 첨가하여 제조된 발효식품에 관한 것이다.
상기 발효식품은 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물에 포함된 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7, KACC 91935P), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상에 의하여 품질을 일정하게 조절될 수 있다.
상기 발효식품은 콩 발효식품일 수 있고, 바람직하게는 메주일 수 있다. 상기 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물을 첨가하여 제조된 콩 발효식품 또는 메주의 경우, 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7, KACC 91935P)에 의하여, 콩 발효식품에서 식품 식중독의 문제를 발생시킬 수 있는 위해미생물인 바실러스 세레우스의 번식이 없어 메주 또는 묵은지의 보존성이 향상될 수 있을 뿐만 아니라, 식품의 안전성이 보장될 수 있다.
상기 발효식품은 상기 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균을 첨가하는 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절하게 선택할 수 있으며, 상기 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물을 첨가하여 제조하는 것 외에는 다른 성분을 첨가하여 제조하는데 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 발효식품에는 상기 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물을 식품 기재를 100 중량부로 0.0001 중량부 내지 20 중량부로 첨가할 수 있다.
상기 발효식품이 콩 발효식품 또는 메주인 경우 콩, 일 예로 1 kg을 기준으로 상기 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물을 초기 균수를 기준으로 1×104 CFU 내지 1×1015 CFU 또는 5×105 CFU 내지 1×1012 CFU로 첨가하여 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 예로, 증자된 콩 350 g 을 기준으로 초기 균수가 6.2 내지 6.3 log CFU/mL이 되도록 조절된 상기 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 메주의 경우 발효과정에서 공기 중의 부유한 미생물을 포함한 다양한 미생물에 노출될 수 있으므로, 인위적인 발효조절과 종균화가 어려운 식품이나, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7, KACC 91935P)를 종균으로 사용하는 경우, 메주에 접종되어 식중독을 발생할 수 있는 바실러스 세레우스의 번식을 제어하여 식품의 안전성을 확보할 수 있고, 보존성을 증가시킬 수 있으므로, 상기 메주를 포함한 콩 발효식품의 안전성 확보에 기여할 수 있어 산업적으로도 큰 의미가 있다.
또한 본 발명은 상기 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물을 이용하여 메주를 제조하는 단계를 포함하는 메주 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 메주 제조방법은 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주를 포함하는 발효식품용 종균 조성물 또는 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 메주 발효용 스타터(Starter)를 이용하여 메주를 제조하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또한 본원 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 콩 발효식품, 구체적으로 메주에 관한 것이다.
상기 제조방법에 의하여 제조된 메주는 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7, KACC 91935P)에 의해 바실러스 세레우스에 의한 오염을 효과적으로 제어할 수 있어, 식품의 안전성도 확보할 뿐만 아니라, 보존성도 증가될 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주는 우리 전통 메주의 발효 균주에 해당하며, 메주와 같은 콩 발효식품을 오염시켜 식중독을 발생시킬 수 있는 위해미생물인 바실러스 세레우스에 대한 항균효과가 우수할 뿐만 아니라, 상기 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성을 갖는 물질은 단백 분해 효소에 의해 효과적으로 분해될 수 있는 박테리오신으로 확인되어, 식품의 섭취 과정에서 상기 항균활성을 나타내는 단백질성 물질인 박테리오신이 단백분해효소에 의하여 분해 또는 실활될 것이므로, 결과적으로 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주가 접종되어 발효된 콩 발효식품을 섭취하는 경우에도 해당 항균 물질은 체내의 소화기관의 단백분해효소에 의해 쉽게 분해 또는 실활되어 결과적으로 식품을 섭취하는 인체에는 영향을 미치지 않고 안전성에서도 문제되지 아니할 것으로 평가되고, 추가적으로 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주에 대해 독소 생성 여부를 확인한 결과 안전성이 확인되었으므로, 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주는 콩 발효식품을 포함한 발효식품의 제조 및 위해미생물로 식중독 원인균에 해당하는 바실러스 세레우스에 대한 항균 효과가 요구되는 식품 및 의약과 관련된 산업분야에 널리 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 세레우스 KCTC 3264에 대해 항균활성을 가지는 메주로부터 분리된 균주를 확인하기 위해, 실시한 직접 분석법(direct assay)을 수행한 결과를 나타내는 고체 배지를 촬영한 사진으로, 도 1의 1은 KL3 균주를 의미하고, 2는 YP6 균주를 의미하며, 3은 SN7 균주를 의미하고, 4는 SY4 균주를 의미한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 가진 균으로 분리된 KL3 균주 및 SN7 균주에 대해, 구체적인 항균활성을 확인하기 위하여, 바실러스 세레우스 KCTC 3264에 대해 항균활성을 여과지원반법(paper disc assay)을 수행한 결과를 나타내는 고체 배지를 촬영한 사진으로, 도 2의 1 내지 3은 KL3 균주의 상징액을 24시간, 40시간 및 48시간 동안 함께 배양한 결과를 나타낸 사진이고, 4 내지 6은 SN7 균주의 상징액을 24시간, 40시간 및 48시간 동안 함께 배양한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 SN7 균주에 대해 관찰 결과를 나타낸 사진으로, 도 3a는 SN7 균주의 그람 염색 결과를 나타낸 사진이고, 도 3b는 SN7 균주의 위상차 현미경 관찰을 통해 포장 형성 여부를 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 SN7 균주의 16S rDNA의 염기서열이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 SN7 균주의 16S rDNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 표이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 SN7 균주의 안전성 여부를 확인하기 위하여 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)법으로 장내독소(enterotoxin) 및 구토제 독소(emetic-toxin) 생성여부를 확인한 전기영동 사진으로, 도 6a는 대조군인 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균주의 균체를 이용하여 장내독소 생성 유전자 여부를 확인한 아가로스 겔의 전기영동 결과를 촬영한 사진이고, 도 6b는 본 발명의 균주인 SN7 균주의 균체를 이용하여 장내독소 생성 유전자 여부를 확인한 아가로스 겔의 전기영동 결과를 촬영한 사진이며, 도 6a 및 도 6b의 M은 마커(1 kb molecular size markers)이고, 1번은 hblA, 2번은 hblB, 3번은 hblC, 4번은 hblD, 5번은 nheA 6번은 nheB, 7번은 nheC, 8번은 cytK, 9번은 bceT, 10번은 entFM 및 11번은 ces의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 SN7 균주의 배양 온도조건 및 생육시기에 따른 생육도 및 항균활성을 확인한 그래프로, 도 7a는 30℃에서 배양한 결과를 나타낸 것이고, 도 7b는 37℃에서 배양한 결과를 나타낸 것이며, 상기 도 7a 및 도 7b의 가로축은 배양시간(시간, hr)을 나타낸 것이고, 좌측의 세로축은 A600에서 흡광도를 측정한 결과이고, 우측의 세로축은 항균활성(AU/mL)을 측정한 결과이며, 그래프의 ■는 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균주에 대한 항균활성을 나타낸 것이고, 그래프의 ○는 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균주에 대한 A600에서 측정한 흡광도(생육도)를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 SN7 균주와 바실러스 세레우스 균의 콜로니(colony)의 형태(morphology)를 촬영한 사진을 촬영한 사진으로, A는 본 발명의 SN7 균주의 콜로니를 촬영한 사진이고, B는 바실러스 세레우스 KCTC 1012(B. cereus KCTC 1012) 균주의 콜로니를 촬영한 사진이며, C는 바실러스 세레우스 KCTC 1013(B. cereus KCTC 1013) 균주의 콜로니를 촬영한 사진이고, D는 바실러스 세레우스 KCTC 1092(B. cereus KCTC 1092) 균주의 콜로니를 촬영한 사진이며, E는 바실러스 세레우스 KCTC 3624(B. cereus KCTC 3624) 균주의 콜로니를 촬영한 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 SN7 균주의 초기 균체량(initial number)에 따른 바실러스 세레우스 균에 대한 항균활성 즉, 생육 저해 활성(Growth inhibition)을 확인한 그래프로, 도 9a는 바실러스 세레우스 KCTC 1012(B. cereus KCTC 1012) 균주에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이며, 도 9b는 바실러스 세레우스 KCTC 1013(B. cereus KCTC 1013) 균주에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이고, 도 9c는 바실러스 세레우스 KCTC 1092(B. cereus KCTC 1092) 균주에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이며, 도 9d는 바실러스 세레우스 KCTC 3624(B. cereus KCTC 3624) 균주에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이다. 상기 그래프의 가로축은 배양시간(시간, hr)을 나타낸 것이고, 세로축은 살아있는 세포수(Log NO. of viable cells(CFU /mL))를 나타낸 것이며, 상기 그래프의 ×는 바실러스 세레우스와 함께 배양할 때, SN7 균주의 생육도를 나타낸 것이고, ▲는 초기 바실러스 세레우스 균의 최종 농도가 4.2 내지 4.3 log CFU/mL인 경우의 바실러스 세레우스 균의 생균수를 나타낸 것이며, □는 초기 바실러스 세레우스 균의 최종 농도가 5.2 내지 5.3 log CFU/mL인 경우의 바실러스 세레우스 균의 생균수를 나타낸 것이고, ●는 초기 바실러스 세레우스 균의 최종 농도가 6.2 내지 6.3 log CFU/mL인 경우의 바실러스 세레우스 균의 생균수를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 SN7 균주의 조항균 물질의 초기 균체량(initial number)에 따른 바실러스 세레우스 KCTC 3624에 대한 항균활성을 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 가로축은 배양시간(시간, hr)을 나타낸 것이고, 세로축은 살아있는 세포수(Log NO. of viable cells(CFU /mL))를 나타낸 것이며, 상기 그래프의 ◆는 초기 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균의 최종 농도가 3 log CFU/mL인 경우의 바실러스 세레우스 균의 생균수를 나타낸 것이고, □는 초기 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균의 최종 농도가 4 log CFU/mL인 경우의 바실러스 세레우스 균의 생균수를 나타낸 것이며, ●는 초기 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균의 최종 농도가 5 log CFU/mL인 경우의 바실러스 세레우스 균의 생균수를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 SN7 균주의 조항균 물질 처리에 따른 바실러스 세레우스 KCTC 3624에 대한 항균활성을 SEM(Scanning Electron Microorganism)으로 확인한 결과를 나타낸 사진으로, 도 11a는 대조군인 바실러스 세레우스 KCTC 3624 배양액을 확인한 것이고, 도 11b 및 도 11c는 SN7 균주의 조항균 물질 처리한 결과를 확인한 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 SN7 균주를 이용한 청국장 제조 과정에서, 바실러스 세레우스 KCTC 3624에 대한 항균활성을 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 가로축은 배양시간(시간, Month(월))을 나타낸 것이고, 세로축은 살아있는 세포수(Log NO. of viable cells(CFU /mL))를 나타낸 것이며, 상기 그래프의 ◇는 상기 바실러스 세레우스 KCTC 3624 없이 배양된 상기 SN7 균주의 생균수를 나타낸 것이고, ●는 상기 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균주와 함께 배양된 상기 SN7 균주의 생균수를 나타낸 것이며, ▲는 상기 SN7 균주 없이 배양된 상기 균주상기 바실러스 세레우스 KCTC 3624의 생균수를 나타낸 것이고, □는 상기 SN7 균주와 함께 배양된 상기 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균주의 생균수를 나타낸 것이며, 도 12a는 Bacillus cereus KCTC 3624 균주의 최종농도가 3.2 내지 3.3 log CFU/mL인 경우이고, 도 12b는 Bacillus cereus KCTC 3624 균주의 최종농도가 4.2 내지 4.3 log CFU/mL인 경우이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 SN7 균주와 Bacillus cereus KCTC 3624 균주를 접종한 청국장 희석액을 PEMBA 배지에 배양한 후, 염색한 결과를 나타낸 사진으로, A는 상기 Bacillus cereus KCTC 3624 균주만을 접종하여 제조한 청국장의 희석액을 배양하여 나타낸 사진이고, B는 최종농도가 6 log CFU/mL인 상기 SN7 균주만을 접종하여 제조한 청국장의 희석액을 배양하여 나타낸 사진이며, C는 최종농도가 3.2 내지 3.3 log CFU/mL인 Bacillus cereus KCTC 3624 균주와 최종농도가 6 log CFU/mL인 상기 SN7 균주를 접종하여 제조한 청국장의 희석액을 배양하여 나타낸 사진이고, D는 최종농도가 4.2 내지 4.3 log CFU/mL인 Bacillus cereus KCTC 3624 균주와 최종농도가 6 log CFU/mL인 상기 SN7 균주를 접종하여 제조한 청국장의 희석액을 배양하여 나타낸 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 SN7 균주의 조항균 물질의 정제를 통하여 항균활성을 확인한 것으로, 도 14a는 C18 Sep-pak 컬럼의 메탄올 용매로 용출한 용출물(A) 및 아세톤니트릴 용매로 용출한 용출물(B)의 Bacillus cereus KCTC 3624 균주에 대한 항균활성을 확인한 사진이고, 도 14b 및 도 14c는 상기 조항균 물질의 C18 Sep-pak 컬럼을 이용한 메탄올 용매로 용출한 용출물에 대해 1차 HPLC(prep-HPLC)를 수행한 결과를 나타낸 것으로, 도 14b는 상기 1차 HPLC(prep-HPLC)를 수행한 과정 및 1차 HPLC에 따라 분리된 6개의 분획을 구분한 그래프를 나타낸 것이고, 도 14c는 상기 1차 HPLC에 따라 분리된 6개의 분획의 Bacillus cereus KCTC 3624 균주에 대한 항균활성을 확인한 사진이며, 도 14d 및 도 14e는 상기 1차 HPLC의 두 번째 분획에 대해 2차 HPLC(prep-HPLC)를 수행한 과정 및 2차 HPLC에 따라 분리된 3개의 분획을 구분한 그래프를 나타낸 것이고, 도 14e는 상기 2차 HPLC에 따라 분리된 3개의 분획의 Bacillus cereus KCTC 3624 균주에 대한 항균활성을 확인한 사진이며, 도 14f 및 도 14g는 상기 2차 HPLC의 두 번째 분획 중 가운데 분획에 대해 3차 HPLC(recycling HPLC)를 수행한 과정 및 3차 HPLC에 따라 1개의 물질로 확인된 상기 두 번째 분획 중 가운데 분획 및 상기 분획의 proteinase K에 대한 처리물에 대하여 Bacillus cereus KCTC 3624 균주에 대한 항균활성을 확인한 사진이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
< 실시예 1> 항균활성을 가진 균주의 분리 및 동정
1-1. 항균활성을 가진 균주의 분리
광주광역시 및 전라남도 지역의 가정에서 제조된 여러 종류의 재래형 메주로부터 분리하여 발명자가 보유하고 있는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 102종에 대해 항균물질 생성능을 검토하여, 활성이 뛰어난 균주를 선별하였다.
우선, 항균 대상 균주인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 균인 바실러스 세레우스 KCTC 3624(B. cereus KCTC 3624)을 감수성 균으로 하여, 직접 분석법(direct assay)으로 생육억제능이 강한 균주를 확인하였다. 구체적으로, 상기 직접분석법은 상기 102종 바실러스 속 균주를 배양한 균주배양액을 감수성 균주인 바실러스 세레우스 KCTC 3624가 약 1.0×106 CFU/mL로 도말된 TSB 평판배지에 멸균된 이쑤시개로 그어준 후, 37℃에서 16시간 동안 배양한 후, 저해환 형성 여부를 확인하여 균인 바실러스 세레우스 KCTC 3624에 대한 항균력을 확인하는 방법으로 수행하였다. 상기 수행한 결과를 도 1에 나타내었다.
상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 바실러스 세레우스 KCTC 3624에 대한 직접 분석법 수행 결과, 102종의 미생물 중에서 저해환이 가장 크고 명확하게 나타난 4종의 균주인 KL3, YP6, SN7 및 SY4를 구분하였고, 이 중 1번 및 3번에 해당하는 KL3 및 SN7 균주를 선별하였다.
상기 1차 선별된 2종의 균주에 대해 2차로 항균활성을 확인하였다. 구체적으로, 5 mL TSB 배지(Tryptic soy broth, Bacton Dickinson and Company, 프랑스)에 상기 1차 선별된 2종의 균주인 KL3 균주 및 SN7 균주를 TSB 배지(Tryptic soy broth, Bacton Dickinson and Company, 프랑스)에 배양한 배양액을 1%(v/v)로 접종하고, 37℃에서 24시간, 40시간 및 48시간 동안 구분하여 진탕배양한 후, 배양액을 9,950 × g 및 4℃의 조건으로 15분 동안 원심분리하고, 0.20 μm membrane filter로 제균하였다. 상기 제균한 배양 상징액을 조항균물질로 사용하여, 여과지원반법(paper disc assay)으로 생육억제능을 확인하였다.
상기 여과지원반법의 경우, 감수성 균인 바실러스 세레우스 KCTC 3624가 약 1.0×106 CFU/mL로 도말된 TSB 평판배지에 상기 제균한 배양 상징액 즉, 조 항균 물질을 점적한 여과지 원반(paper disc, diameter 8.00 mm, Advantec, 일본)을 올려놓은 후, 37℃에서 24시간, 40시간 및 48시간 동안 각각 구분하여 배양하고, 저해환 형성 여부 및 저해환의 크기를 확인하여 식중동균인 상기 바실러스 세레우스 KCTC 3624에 대한 항균력을 확인하는 방법으로 수행하였다. 상기 수행한 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 24시간이 경과한 시점에서는 KL3 균주(도 2의 1) 및 SN7 균주(도 2의 4) 모두 우수한 항균활성을 나타낸 반면, 상기 KL3 균주는 40시간 및 48시간 동안 함께 배양한 결과(도 2의 2 및 3)에서도 항균활성이 유효하게 확인된 반면, SN7 균주는 40시간 및 48시간 동안 함께 배양한 경우에 항균활성이 나타나지 아니하였다(도 2의 5 및 6). 특정 균에 대한 항균물질이 단백질성 물질인 경우, 일정 시간이 경과되면 상기 특정 균에서 이에 대한 보호작용으로 인하여, 포자가 형성되고, 자가분해 효소에 의해 세포 내 단백 분해 효소가 방출되어 항균활성이 소실되게 되는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 상기 SN7 균주의 항균활성과 관련된 결과로부터, 상기 SN7 균주의 바실러스 세레우스 KCTC 3624에 대한 항균활성은 상기 SN7 균주가 생산하는 단백질성 물질 즉, 박테리오신일 것으로 예상되었다. 상기 항균활성이 박테리오신에 의한 경우에는 상기 박테리오신이 식품에 적용되는 경우에도 식품의 섭취 과정에서 상기 항균활성을 나타내는 단백질성 물질인 박테리오신이 단백분해효소에 의하여 분해 또는 실활될 것이므로, 최종적으로 식품을 섭취한 인간을 포함한 동물의 소화기관 내의 단백분해효소에 의해 분해 또는 실활되어서, 인체를 포함한 동물에 다른 영향을 미치지 못하여 안전하므로, 상기 SN7 균주 또는 상기 SN7 균주가 생산한 조항균 물질의 식품 적용이 가능할 것이므로, 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 갖는 균주로 최종적으로 SN7 균주를 선별하였다.
1-2. 항균활성을 가진 균주의 동정
상기 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 갖는 박테리오신을 생산하는 것으로 추정되어 최종적으로 선별된 SN7 균주의 동정을 위하여, 일차적으로 형태학적, 생화학적 조사를 수행하였고, 최종적인 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 동정하였다.
상기 형태학적 조사는 그람 염색(Gram stain kit, BD, USA) 여부와 현미경을 이용하여 균의 형태 및 포자형성 과정을 관찰하였으며, 생화학적 조사는 API 50 CHB system(BioMerieux, Marcy IEtoile, France)을 이용하여 당 발효능을 조사한 후에 균주동정 프로그램(http://apiweb.biomerieux.com)을 이용하여 수행하였다.
상기 그람 염색 여부 및 현미경 관찰의 경우, 상기 SN7 균주를 TSB 액체배지에 접종하여 8시간 동안 진탱배양한 후, 그람 염색을 하여 관한 현미경으로 관찰하고, 포자 염색을 하여 위상차 현미경으로 관찰하는 방식으로 수행하였으며, 그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.
상기 도 3a에 나타낸 바와 같이, 상기 SN7 균주는 그람양성의 간균이었고, 콜로니는 진한 아이보리색(dark ivory)의 둥근 원형으로, 표면이 날카롭고(sharp), 투명(clarity)한 것으로 확인되었다. 또한, 상기 도 3a에 나타낸 바와 같이, 상기 SN7 균주는 포자염색 결과 내생포자를 형성하는 것으로 확인되었다.
또한, API 50 CHB system을 이용하여 37℃에서 48시간 동안 반응시켜 당 발효능을 조사하여 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1에서 '+'는 당대사능이 있는 것을 의미하고, '-'는 당대사능이 없는 것을 의미한다.
상기 표 1에서 확인된 당대사능 결과를 이용하여 간이동정한 결과, Bacillus subtilis와 Bacillus amyloliquefaciens와 99%의 상동성을 갖는 것으로 확인되어, 상기 SN7 균주는 바실러스 서브틸리스또는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스에 속하는 균주로 추정되었다.
당 종류 대사능여부 당 종류 대사능여부
control - Esculine +
Glycerol - Salicine +
Erythritol - Cellobiose +
D-Arabinose - Maltose +
L-Arabinose - Lactose -
Ribose - Melibiose -
D-Xylose - Saccharose +
L-Xylose - Trehalose +
Adonitol - Inuline -
β-Methyl-xyloside - Melezitose -
Galactose - D-Raffinose -
D-Glucose + Amidon +
D-Fructose + Glycogene +
D-Mannose + Xylitol -
L-Sorbose - β-Gentiobiose +
Rhamnose - D-Turanose -
Dulcitol - D-Lyxose -
Inositol + D-Tagatose -
Mannitol + D-Fucose -
Sorbitol + L-Fucose -
α- Methyl-D-mannoside - D-Arabitol -
α-Methyl-D-Glucoside + L-Arabitol -
N-Acetyl glucosamine - Gluconate -
Amygdaline + 2 keto-gluconate -
Arbutine + 5 keto-gluconate -
보다 정확한 동정을 위하여, 상기 SN7 균주의 16S rDNA 염기서열을 결정하고, 이를 GenBank에 등록된 다른 균주들의 염기서열과 비교하여 16S rDNA 염기서열 분석을 수행하여, 계통 발생론적 관계를 확인하였다.
상기 분리균주의 16S rRNA의 염기서열은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.
우선, 상기 SN7 균주의 genomic DNA를 Genome DNA kit (Q-Biogene, USA)을 사용하여 추출한 후에, PCR 증폭을 수행하고, ABI PRISM 3730 DNA analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.)를 이용하여 염기서열을 분석하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 분석된 염기서열을 이용하여, BLAST 프로그램을 사용하여 GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록된 표준균주(type strain)와 비교하였으며, 상동성은 Clustal X와 Mega 2 program을 이용하여 비교분석하였고, 그 결과 다른 세균과의 계통발생론적 관계를 도 5에 나타내었다.
상기 도 4에 나타낸 바와 같이, SN7 균주는 총 1,371 bp 크기의 16S rRNA을 가지고 있으며, 상기 염기서열을 이용한 상동성 분석결과 상기 도 5에 나타낸 바와 같이, SN7 균주는 바실러스 서브틸리스 표준균주인 Bacillus subtilis DSM 10과 99.9%의 높은 상동성을 나타내어, 상기 SN7 균주는 최종적으로 바실러스 서브틸리스 균주로 동종되어, 바실러스 서브틸리스 SN7(Bacillus subtilis SN7)로 명명하였다.
< 실시예 2> 분리균주의 안전성 확인
상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주의 식품 등에 대한 활용과 관련하여, 해당 균주에 대한 안전성 여부를 독소 생성여부, 구체적으로 엔테로톡신 즉, 장내독소(enterotoxin) 및 구토제 독소(emetic-toxin) 생성여부로 확인하였다.
2-1. PCR 을 이용한 분리균주의 독소 생성여부 확인
상기 장내독소(enterotoxin) 및 구토제 독소(emetic-toxin) 생성여부를 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)법으로 분석하였다.
구체적으로, 바실러스 속의 위해균주인 바실러스 세레우스가 생산하는 5종의 장내독소(enterotoxin)와 11종의 구토제 독소(emetic-toxin)에 관한 유전자 보유 여부를 PCR을 이용하여 확인하였다.
우선, SN7 균주와 독소 생성 대조군인 상기 바실러스 세레우스 KCTC 3624균주를 각각 5 mL TSB 액체배지에 1%(v/v) 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 배양한 후, 상기 배양액을 9,950 × g 및 4℃의 조건으로 5분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 상기 회수한 각각의 균체로부터 DNeasy® Blood & Tissue kit (Qiagen Gmph, 독일)을 이용하여 Chromosomal DNA를 수득하였다. 상기 수득된 Chromosomal DNA를 PCR 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다.
상기 PCR 수행을 위한 프라이머로, 장내독소 생산과 관련된 유전자로, HBl 독소 단백질 복합체를 암호화(encoding)하는 hblA, hblB, hblC, hblD의 4개의 유전자와 Nhe 독소 단백질 복합체를 암호화하는 3개의 유전자인 nheA, nheB, nheC 및 단일 단백질로 이루어진 장내 독소를 암호화하는 3종의 유전자인 cytK, bceT, entFM와 구토제 독소(emetic-toxin) 생산과 관련된 유전자인 ces의 총 11개 유전자를 검출할 수 있는 프라이머를 사용하였다. 상기 프라이머의 염기서열은 하기 표 2에 기재된 바와 같다. 하기 표 2의 F는 forward primer를 의미하고, R은 reverse primer를 의미한다.
상기 PCR 수행을 위한 프라이머 반응액은 Takara TaqTM polymerase(5 unit/μL) 1 μL, 10X PCR buffer(Mg2 + free) 5 μL, 25 mM MgCl2 3 μL, dNTP Mixture(2.5 mM each) 5 μL, 상기 PCR 주형(template DNA)으로 사용한 Chromosomal DNA(100 ng) 5 μL, 하기 표 2의 프라이머(forward 및 reverse 10 pM each) 2 μL을 혼합한 후, 멸균 증류수(sterilized distilled water) 29 μL를 첨가하여, 최종 부피가 50 μL가 되도록 제조하였으며, 상기 PCR 반응액을 이용하여 Palmcycler(Corbett Research, 오스트리아)를 사용하여 하기 표 3의 반응조건으로 PCR 반응을 수행하였다.
프라이머
종류 		유전자
종류 		증폭산물
크기( bp ) 		서열 (5’ → 3’)
HA F hblA 1,154 AAGCAATGGAATACAATGGG
HA R AGAATCTAAATCATGCCACTGC
HB F hblB 2,684 AAGCAATGGAATACAATGGG
HB R AATATGTCCCAGTACACCCG
HC F hblC 740 GATACTCAATGTGGCAACTGC
HC R TTGAGACTGCTCGTCTAGTTG
HD F hblD 829 ACCGGTAACACTATTCATGC
HD R GAGTCCATATGCTTAGATGC
NA F nheA 755 GTTAGGATCACAATCACCGC
NA R ACGAATGTAATTTGAGTCGC
NB F nheB 743 TTTAGTAGTGGATCTGTACGC
NB R TTAATGTTCGTTAATCCTGC
NC F nheC 683 TGGATTCCAAGATGTAACG
NC R ATTACGACTTCTGCTTGTGC
BCET1 F bceT 661 CGTATCGGTCGTTCACTCGG
BCET3 R GTTGATTTTCCGTAGCCTGGG
FM F entFM 596 AAAGAAATTAATGGACAAACTCAAAACTCA
FM R GTATGTAGCTGGGCCTGTACGT
CK F cytK 505 GTAACTTTCATTGATGTCC
CK R GAATACTAAATAATTGGTTTCC
CES F ces 1271 GGTGACACATTATCATATAAGGTG
CES R GTAAGCGAACCTGTCTGTAACAACA
유전자 및 프라이머 종류 반응조건
HA(hblA), NA(nheA)
 변성 단계(Denaturation); 94℃에서 2분간 반응
중합 단계(Annealing 및 extension); 94℃에서 60초 반응 → 56℃에서 60초 반응 → 72℃에서 120초 반응을 총 35회 실시
종결 단계; 72℃에서 5분 반응
HB(hblB), HC(hblC), HD(hblD) 변성 단계(Denaturation); 94℃에서 2분간 반응
중합 단계(Annealing 및 extension); 94℃에서 60초 반응 → 58℃에서 60초 반응 → 72℃에서 120초 반응을 총 35회 실시
종결 단계; 72℃에서 5분 반응
NB(nheB), NC(nheC) 변성 단계(Denaturation); 94℃에서 2분간 반응
중합 단계(Annealing 및 extension); 94℃에서 60초 반응 → 54℃에서 60초 반응 → 72℃에서 120초 반응을 총 35회 실시
종결 단계; 72℃에서 5분 반응
BCET1(bceT) 변성 단계(Denaturation); 94℃에서 2분간 반응
중합 단계(Annealing 및 extension); 94℃에서 60초 반응 → 55℃에서 60초 반응 → 72℃에서 120초 반응을 총 35회 실시
종결 단계; 72℃에서 5분 반응
FM(entFM) 변성 단계(Denaturation); 94℃에서 3분간 반응
중합 단계(Annealing 및 extension); 95℃에서 30초 반응 → 60℃에서 30초 반응 → 72℃에서 60초 반응을 총 35회 실시
종결 단계; 72℃에서 5분 반응
CK(cytK), CES(ces) 변성 단계(Denaturation); 95℃에서 1분간 반응
중합 단계(Annealing 및 extension); 95℃에서 60초 반응 → 48℃에서 60초 반응 → 72℃에서 60초 반응을 총 30회 실시
종결 단계; 72℃에서 7분 반응
상기 표 2의 프라이머를 이용하여 상기 표 3의 반응조건으로 PCR 반응을 수행한 PCR 산물은 Tris-Acetate-EDTA 완충액(TAE buffer)에 1%(w/v) Seaken LE agarose gel(Cambrex Bio Science Rockland, Rockland, USA)을 사용하여 100 V의 조건에서 20분 동안 전기영동하였다. 그 후, 상기 전기영동한 아가로스 겔(agarose gel)을 0.5 μg/mL 농도의 ethidium bromide solution(EtBr, Sigma, USA)에서 10초간 염색하고, 멸균 증류수를 이용하여 1시간 동안 destaining한 후, UV transilluminator(Gel Doc, Uvitec, 프랑스)로 해당 겔을 확인하였다.
상기 확인한 결과를 도 6에 나타내었다.
상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군인 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균주에서는 기존 연구 결과 해당 유전자가 없는 것으로 알려져 있는 구토제 독소 생산과 관련된 유전자인 ces를 제외한 총 10개의 장내독소 생산과 관련된 유전자, 즉, hblA, hblB, hblC, hblD, nheA, nheB, nheC, cytK, bceT 및 entFM에 대한 프라이머로 PCR 반응을 수행한 결과, PCR 반응 생성물에서 해당 유전자의 크기에 해당하는 밴드 위치에 밴드가 확인되어, 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균주가 장내독소 생산 관련 유전자를 보유하고 있는 것으로 확인된 반면, 본 발명의 균주인 SN7 균주의 경우에는 구토제 독소 및 장내독소의 독소 생산과 관련된 유전자의 크기에 해당하는 밴드 위치에 어떠한 밴드도 확인되지 아니하여, 상기 SN7 균주는 장내독소 및 구토제 독소의 생산 관련 어떠한 유전자도 보유하고 있지 않는 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터 본 발명의 균주인 SN7 균주는 독소 생산과 관련하여 안전한 것으로 확인되었다.
2-2. 면역학적 분석법을 이용한 분리균주의 독소 생성여부 확인
상기 PCR 분석법을 통하여 장내독소(enterotoxin) 및 구토제 독소(emetic-toxin) 생성을 하지 않는 것으로 확인된 본 발명의 SN7 균주의 안전성을 보다 확인하기 위하여 면역학적 분석법을 통한 장내독소 생성여부를 추가로 확인하였다. 구체적으로, Reverse Passive Latex Agglutination(RPLA)를 이용하여 Hbl 독소 생성여부를 확인하였고, Bacillus diarrhoeal enterotoxin visual immunoassay (BDE-VIA)를 이용하여 Nhe 독소 생성여부를 확인하였다.
구체적으로, RPLA를 이용한 Hbl 독소 생성 확인은 hemolysin BL의 L2 subunit를 검출하기 위해, 항혈청이 그 항원(응집원)의 부유역과 반응하여 덩어리로 응결시키는 항원항체반응의 하나인 라텍스(latex) 입자에 항원을 흡착시켜 행하는 수신응집반응을 수행하는 Bacillus cereus enterotoxin reversed passive latex agglutination kit(BCET-RPLA kit, Oxoid, 영국)를 이용하여 수행하였다. 이러한 반응은 상기 라텍스가 장내독소와 응집할 수 있기 때문에, 시각적으로 각 well에 격자 무늬의 응집 여부를 확인할 수 있어 검토가 가능하다. 상기 BCET-RPLA kit는 장내독소인 Hbl 독소를 16 ng/mL 내지 128 ng/mL의 범위에서 검출할 수 있으며, 민감도는 2 ng/mL인 것으로 보고되고 있다.
우선, 상기 Hbl 독소 생성 확인을 위해, SN7 균주를 각각 5 mL TSB 액체배지에 1%(v/v) 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 전배양한 후, 상기 전배양액 1%를 TSB 액체배지 5 mL에 접종하여 24시간 배양하였다. 상기 배양된 배양액을 9,950 × g 및 4℃의 조건으로 5분 동안 원심분리한 후, 상등액을 분리하고, 상기 분리된 상등액을 0.20 μm membrane filter로 여과하였고, 제균된 여과액을 enterotoxin 분석에 사용하였다. 상기 실험에 사용된 Latex reagent(Oxoid, 영국)는 사용하기 전에 잘 흔들어 균질화시켜 사용하였다.
상기 SN7 균주 배양액으로부터 수득한 제균된 여과액과 독소 생성 대조군인 상기 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균주의 독소(Oxoid, 영국)에 0.5 mL diluent(Oxoid, 영국)를 가하여 흔들어 완전히 녹인 독소 희석액을 96 well tissue culture plate(Corning Costar, USA)의 각각 8개의 웰(well)에 두 줄에 부여하였다. 구체적으로, 첫 번째 well을 제외한 두 줄의 각 well에 25 μL의 희석액(diluents)을 분주한 후, 두 줄의 첫 번째 및 두 번째 well에 각각 제균된 여과액과 상기 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균주의 독소(Oxoid, 영국)를 분주하고, 각 줄의 두 번째 well에서 시작해서 일곱 번째 well까지 두 배씩 단계 희석하는 방법을 수행하였다. 이 후, 첫 번째 줄의 각 well에 25 μL의 sensitized latex(Oxoid, 영국)를 분주하고 두 번째 줄의 각 well에는 25 μL의 latex control(Oxoid, 영국)을 분주하였다. 이 후, 상기 플레이트(plate)를 잘 흔들어 섞은 후 뚜껑을 덮고 10℃ 내지 20℃의 조건에서 방치하고, 24시간 후에 응집여부를 관찰하였다. 상기 응집여부의 관찰은 각 well에서 응집여부를 육안으로 확인하는 방법으로 수행하였고, 상기 응집여부에 따라 양성 또는 음성으로 판정하여, 역가를 결정하였다.
또한, Bacillus diarrhoeal enterotoxin visual immunoassay(BDE-VIA)를 이용한 Nhe 독소 생성여부는 Bacillus diarrhoeal enterotoxin visual immunoassay kit(BDE-VIA kit, Tecra International Pty Ltd., 오스트리아)을 사용하여 제조사의 사용설명서에 따라 단계별로 면역학적 분석법(immunoassay)을 수행하였다.
구체적으로, 우선, 상기 Nhe 독소 생성 확인을 위해, SN7 균주와 상기 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균주를 각각 5 mL TSB 액체배지에 1%(v/v) 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 전배양한 후, 상기 전배양액 1%를 TSB 액체배지 5 mL에 접종하여 24시간 배양하였다. 상기 배양된 배양액을 9,950 × g 및 4℃의 조건으로 5분 동안 원심분리한 후, 상등액을 분리하고, 상기 분리된 상등액을 0.20 μm membrane filter로 여과하였다. 각각의 제균된 여과액 5 mL에 50 μL sample additive(Tecra International Pty Ltd., 오스트리아)를 추가하여, pH를 pH 7 내지 pH 8로 조정한 후, 시료로 사용하였다.
상기 면역학적 분석법은 kit에서 제공된 양성 대조군(positive control), 음성 대조군(negative control), 상기 SN7 균주 및 상기 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균주의 제균된 여과액을 well에 부여한 후, 각각의 well에 10분 동안 wash solution (Tecra International Pty Ltd., 오스트리아)을 첨가하였고, 상기 wash solution을 버린 후, sample solution(Tecra International Pty Ltd., 오스트리아) 200 μL를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 다시 wash solution으로 4회 세척하고, conjugate solution(Tecra International Pty Ltd., 오스트리아) 200 Μl를 첨가한 후, 25℃에서 1시간 반응시키고, wash solution으로 5회 세척하였다.
이 후, Substrate(Tecra International Pty Ltd., 오스트리아) 200 μL를 첨가하고, 25℃에서 30분간 반응시킨 후, 20 μL stop solution(Tecra International Pty Ltd., 오스트리아)을 넣어 모든 반응을 종료시켰다. 반응을 종료시킨 후, 흡광도를 측정하여 판정하였다. 상기 흡광도 측정에 의한 판단은 96 well plate reader(UV scanning ELISA reader, BioTek, USA)를 이용하여 410 nm에서 흡광도를 판독하여, 0.2 이하의 수치에 대해서는 음성, 그 이상의 경우는 양성으로 판정하였다.
상기 Reverse Passive Latex Agglutination(RPLA)를 이용하여 Hbl 독소 생성여부를 확인한 결과 및 Bacillus diarrhoeal enterotoxin visual immunoassay (BDE-VIA)를 이용하여 Nhe 독소 생성여부를 확인한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
Hb1 장내독소 Nhe 장내독소
본 발명의 SN7 균주 0 0
B. cereus KCTC 3624 균주(대조군) 128 5
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 기존의 장내독소를 생성하는 것으로 알려진 위해 미생물 즉, 식중독 유발 미생물인 바실러스 서브틸리스 KCTC 3624 균주의 경우, BCET-RPLA 키트를 통하여 확인한 Hb1 장내독소(hemolysin BL의 L2 subunit)와 BDE-VIA 키트를 통하여 확인한 Nhe 장내독소(nonhemolytic enterotoxin의 A subunit) 강한 응집반응이 확인되어, 양성반응을 나타내었다. 구체적으로, BDE-VIA 키트를 통하여 확인한 Nhe 장내독소의 경우, 410 nm에서 흡광도를 측정한 결과 0.681의 높은 수치를 나타내었다. 한편, 본 발명의 SN7 균주는 BCET-RPLA 키트를 통하여 확인한 Hb1 장내독소와 BDE-VIA 키트를 통하여 확인한 Nhe 장내독소 즉, 2가지 장내독소 모두에 대해 응집반응을 일으키지 않는 음성 반응을 나타내었고, 구체적으로 BDE-VIA 키트를 통하여 확인한 Nhe 장내독소의 경우, 410 nm에서 흡광도를 측정한 결과 0.2보다 훨씬 낮은 0. 271의 낮은 수치를 나타내어, 장내독소를 생성하지 않아, 안전한 것으로 확인되었다.
< 실시예 3> 분리균주의 항균활성 확인
3-1. 조항균 물질의 준비
본 발명의 SN7 균주의 항균활성을 확인하기 위하여, 조항균 물질을 준비하였다.
구체적으로, 상기 본 발명의 SN7 균주를 5 mL TSB 액체배지에 1%(v/v) 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 전배양한 후, 상기 전배양액 1%를 TSB 액체배지 50 mL에 접종하여 37℃에서 24시간 본배양하였다. 상기 본배양된 배양액을 9,950 × g 및 4℃의 조건으로 5분 동안 원심분리한 후, 상등액을 분리하고, 상기 분리된 상등액을 0.20 μm membrane filter로 여과하였고, 제균된 여과액을 항세균 활성 측정을 위한 시료인 조항균 물질로 사용하였다.
3-2. 생육시기에 따른 항균활성
본 발명의 SN7 균주의 생육시기에 따른 항균활성을 조사하기 위하여, 30℃ 및 37℃에서 0 시간 내지 120시간 동안 진탕배양하면서, 0시간부터 36시간까지는 매 4시간 마다, 36시간부터 72시간까지는 매 12시간 마다, 72시간부터 120시간까지는 24시간마다 흡광도 측정기(Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, 스웨덴)를 이용하여 A600에서 흡광도를 측정하여 생육곡선을 그리고, 이때 생육시기에 따른 항균활성을 측정하였다.
상기 항균활성 측정을 위한 시료는 실시예 3-1에 기재된 방법으로 각 배양시간에 따라 얻은 배양액에 대해 원심분리 및 여과에 의한 제균을 수행하여 제조하였고, 바실러스 세레우스 균에 대한 항균활성 측정을 위한 감수성 균으로 바실러스 세레우스 KCTC 3624 균주를 사용하였다. 상기 감수성 균주을 이용한 항균활성 측정용 플레이트는 항균 실험을 위해, TSB 평판배지에 약 1.0×106 CFU/mL로 도말하여 제조하였다. 또한, 상기 항균활성 측정은 상기 실시예 3-1의 조항균 물질에 대해 spot on lawn assay을 실시하는 방법으로 수행하였다. 상기 항균활성 측정의 결과는 동일한 실험을 3회 반복하여 얻은 결과값의 평균값으로 계산하여, 도 7에 나타내었다.
상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 30℃에서 배양한 경우(도 7a), 본 발명의 SN7 균주의 생육도는 0시간부터 24시간까지 균체수가 대수적으로 증가하였고, 24시간에 대수기에 접어들어, 24시간부터 36시간에서 생육도가 최대가 되었으며, 이후에는 사멸기로 들어가는 것이 확인되었고, 상기 SN7 균주의 항균활성은 0시간부터 24시간까지 항균활성이 증가하다, 24시간부터 36시간에서 800 AU/mL의 최대 활성을 나타내었으며, 이후에는 항균활성이 감소하여, 120시간이 경과된 때에는 항균활성이 소실된 것으로 확인되었다. 또한, 37℃ 에서 배양한 경우(도 7b), 상기 SN7 균주의 생육도는 0시간부터 20시간까지 균체수가 대수적으로 증가하였고, 28시간부터 32시간에서 생육도가 최대가 되었으며, 이후에는 사멸기로 들어가는 것이 확인되었고, 상기 SN7 균주의 항균활성은 0시간부터 24시간까지 항균활성이 증가하다, 24시간부터 48시간에서 최대 활성(1,600 AU/mL)을 나타내었으며, 이후에는 항균활성이 조금씩 감소하여, 120시간이 경과된 때에는 최대 항균활성의 약 25%(400 AU/mL) 정도로 소실된 것이 확인되었다.
3-3. 항균활성의 안정성
본 발명의 SN7 균주의 조항균 물질의 항균활성의 안정성을 확인하기 위하여, pH, 온도 및 각종 효소처리에 대한 안정성을 조사하였다. 본 발명의 SN7 균주의 조항균 물질의 항균활성의 안정성을 확인하기 위한 항균활성은 spot on lawn assay을 실시하는 방법으로 수행하였다. 상기 항균활성 측정의 결과는 동일한 실험을 3회 반복하여 얻은 결과값의 평균값으로 계산하여, 하기 표 5 내지 표 7에 나타내었다.
보다 구체적으로, pH에 대한 영향의 조사는 상기 실시예 3-1에서 준비된 SN7 균주의 조항균 물질을 5N HCl과 5N NaOH를 사용하여 pH 3.0 내지 pH 11.0으로 pH를 조정한 후, 4℃에서 4시간 동안 처리한 다음, 항균활성을 측정하는 방법으로 수행하였다. 대조구로는 상기 SN7 균주의 조항균 물질을 4℃에서 4시간 동안 처리한 것을 사용하였다. 상기 처리한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
또한, 온도에 의한 영향의 조사는 상기 실시예 3-1에서 준비된 SN7 균주의 조항균 물질을 25℃, 30℃, 37℃, 50℃, 70℃, 100℃ 및 121℃에서 열처리한 후, 항균활성을 측정하는 방법으로 수행하였다. 상기 25℃, 30℃, 37℃, 50℃ 및 70℃ 온도에서는 24시간 동안 처리하였고, 100℃에서는 30분 동안 처리하였으며, 121℃에서는 15분 동안 처리하였다. 대조구로는 상기 SN7 균주의 조항균 물질을 4℃에서 24시간 동안 처리한 것을 사용하였다. 상기 처리한 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
또한, 각종 효소에 대한 영향의 조사는 상기 실시예 3-1에서 준비된 SN7 균주의 조항균 물질을 효소 즉, proteinase K(EC 3.4.21.6, P6556, Sigma Co., U.S.A.), protease(type I, P4630 Sigma Co., U.S.A.), trypsin(type I, EC 3.4.21.4, T8003, Sigma Co., U.S.A.), lysozyme(L6876, Sigma Co., U.S.A.), α-chymotrypsin(EC 3.4.21.1, type I-S, Sigma Co., U.S.A.), pepsin(EC 3.4.23.1, P6887, Sigma Co., U.S.A.), lipase(EC 3.1.1.3, type VII, Sigma Co., U.S.A.), α-amylase(EC 3.2.1.1, Type VIII-A, A2771, Sigma Co., U.S.A.)으로 처리한 후, 항균활성을 측정하는 방법으로 수행하였다.
상기 효소처리를 위한 효소반응액은 상기 proteinase K, 상기 protease, 상기 trypsin, 상기 lysozyme은 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 상기 각각의 효소를 첨가하여, 20 mg/mL가 되도록 제조하였고, 상기 α-chymotrypsin은 50 mM Tris-HCl /10 mM CaCl2 완충용액(pH 7.5)에 상기 효소를 첨가하여, 20 mg/mL가 되도록 제조하였으며, 상기 pepsin은 50 mM Citrate완충용액(pH 2.0)에 상기 효소를 첨가하여, 20 mg/mL가 되도록 제조하였고, 상기 lipase는 50 mM Tris-HCl / 10 mM CaCl2 완충용액(pH 7.0) 에 상기 효소를 첨가하여, 20 mg/mL가 되도록 제조하였으며, 상기 α-amylase는 50 mM sodium phosphate / 10 mM NaCl 완충용액(pH 7.0)에 상기 효소를 첨가하여, 20 mg/mL가 되도록 제조하였다.
또한, 상기 효소에 의한 영향의 조사는 상기 실시예 3-1에서 준비된 SN7 균주의 조항균 물질에 상기 제조된 각각의 효소반응액을 2 mg/mL의 농도로 첨가한 후, 상기 trypsin 효소의 경우 25℃에서 6시간 동안 처리하였고, 상기 α-chymotrypsin 효소의 경우 25℃에서 1시간 동안 처리하였으며, 상기 proteinase K 효소의 경우 37℃에서 1시간 동안 처리하였고, 상기 protease 효소의 경우 37℃에서 7시간 동안 처리하였으며, 나머지 효소들은 37℃에서 6시간 동안 처리하고, 항균활성을 측정하는 방법으로 수행하였다. 대조구로는 상기 SN7 균주의 조항균 물질에 효소를 첨가하지 않은 채, 상기 각각의 효소를 처리한 온도 및 시간동안 처리한 것을 사용하였다. 상기 처리한 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
구분 항균활성(AU/mL)
대조군 1600
pH 2 1600
pH 3 1600
pH 4 1600
pH 5 1600
pH 6 1600
pH 7 1600
pH 8 1600
pH 9 1600
pH 10 800
구분 항균활성(AU/mL)
Control 1600
25℃, 24 hr 1600
37℃, 24 hr 1600
50℃, 24 hr 800
70℃, 24 hr 0
100℃, 30 min 0
121℃, 15 min 0
구분 항균활성(AU/mL)
Control 1600
Proteinase K 0
Protease 0
α-Chymotrypsin 0
Pepsin 1600
Trypsin 1600
Lysozyme 1600
α-Amylase 1600
Lipase 1600
상기 표 5에 나타내 바와 같이, pH에 대한 안정성 실험에서 본 발명의 SN7 균주의 조항균 물질의 항균활성은 pH 2.0 내지 pH 9.0 구간에서 대조군과 동일한 항균활성이 측정되었고, pH 10.0에서는 대조군의 항균활성의 반으로 줄어들었으므로, 상기 pH 조건 즉, pH 2.0 내지 pH 9.0 구간에서 항균활성이 안정한 것으로 확인되어, 본 발명의 SN7 균주의 조항균 물질의 항균활성은 산성에서부터 약알칼리까지 pH 구간에서 안정함이 확인되었다.
또한, 상기 표 6에 나타내 바와 같이 온도에 대한 안정성 실험에서 본 발명의 SN7 균주의 조항균 물질의 항균활성은 37℃까지 대조군과 동일한 항균활성이 측정되었고, 50℃에서 24시간 처리 시, 대조군의 항균활성의 반(800 AU/mL)으로 줄어들었으며, 70℃에서 24시간 처리 시, 역가가 완전히 소실된 것으로 확인되어, 본 발명의 SN7 균주의 조항균 물질의 항균활성은 25℃ 내지 37℃에서 안정함이 확인되었고, 50℃ 이상의 온도에서는 안정성이 없는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 표 7에 나타내 바와 같이 각종 효소에 대한 안정성 실험에서 본 발명의 SN7 균주의 조항균 물질의 항균활성은 pepsin, trypsin, lysozyme, α-amylase 및 lipase의 처리에는 영향을 받지 않았으나, proteinase K 및 α-chymotrypsin의 처리에는 처리 1시간 만에 불활성화되어 항균활성을 상실하였고, protease는 처리 7시간 만에 불활성화되어 항균활성을 상실하였다. 상기 결과로부터, 본 발명의 SN7 균주의 조항균 물질은 일부 단백 분해 효소에 의해 활성이 실활되거나 영향을 받아, 단백질성 물질임을 추측할 수 있었다.
상기 실험결과로부터, 본 발명의 SN7 균주의 조항균 물질은 넓은 pH 범위에서 안정성이 인정되고, 단백 분해 효소를 제외한 효소에 대해서도 안정성이 인정되는 단백질성 항균물질로, 여러 단백 분해 효소에 의해 실활되어 식품 등에 사용되는 경우 체내의 소화효소에 의해 분해되어 인체에 위해효과를 미치지 않는 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 박테리오신(bacteriocin) 또는 박테리오신 유사 물질인 것으로 확인되었다. 상기 조항균물질이 박테리오신인 또는 박테리오신 유사 물질이므로, 식품의 섭취 과정에서 상기 항균활성을 나타내는 단백질성 물질인 박테리오신이 단백분해효소에 의하여 분해 또는 실활될 수 있어서, 결과적으로 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주가 접종되어 발효된 콩 발효식품을 섭취하는 경우에도 상기 조항균물질은 식품의 섭취 및 소화 과정에서 체내의 소화기관의 단백분해효소에 의해 쉽게 분해되어 결과적으로 식품을 섭취하는 인체에는 영향을 미치지 않고 안전성에서도 문제되지 아니할 것으로 예상되었다.
< 실시예 4> 분리균주의 바실러스 서브틸리스 생육 저해 활성
4-1. 분리균주의 항균활성
본 발명의 SN7 균주 및 조항균 물질의 바실러스 세레우스에 대한 항균활성을 확인하기 위하여, 여러 종류의 바실러스 세레우스에 대한 항균력을 측정하였다.
우선, 상기 SN7 균주가 4종의 바실러스 세레우스 균, 구체적으로, Bacillus cereus KCTC 1012, Bacillus cereus KCTC 1013, Bacillus cereus KCTC 1092, Bacillus cereus KCTC 3624에 대한 항균활성과 상기 조항균 물질 즉, SN7 균주의 배양액의 상등액이 상기 4종의 바실러세 세레우스 균에 대한 항균활성을 측정하였다.
구체적으로, 상기 SN7 균주의 항균활성 측정 여부는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 상기 SN7 균주와 상기 4종의 바실러스 세레우스 균을 50 mL TSB 액체배지에 각각 1%(v/v) 접종하고, 37℃에서 15시간 내지 24시간 동안 진탕배양한 후, 상기 배양액을 9,950 × g 및 4℃의 조건으로 15분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 상기 회수한 각각의 균체를 TSB 액체배지에 재현탁하였다. 상기 SN7 균주는 최종 농도가 6.2 내지 6.3 log CFU/mL가 되도록 TSB 액체배지에 재현탁하였고, 상기 4종의 바실러스 세레우스 균은 최종 농도가 4.2 내지 4.3 log CFU/mL, 5.2 내지 5.3 log CFU/mL 및 6.2 내지 6.3 log CFU/mL이 되도록 각각 TSB 액체배지에 재현탁하였다.
상기 각각의 농도로 희석하여 재현탁한 상기 SN7 균주와 상기 각각의 4종의 바실러스 세레우스 균 1종의 현탁액을 1:1의 부피비로 TSB 액체배지 50 mL에 접종하여, 접종 직후 혼합 균체 농도가 최종 5.2 내지 5.3 log CFU/mL, 5.7 내지 5.8 log CFU/mL, 6.2 내지 6.3 log CFU/mL가 되도록 제조하였다. 상기 혼합 균체 농도를 조절한 배양액을 37℃에서 24시간 동안 진탕배양한 후, 배양액을 취하고, 이를 희석한 희석액을 TSB 평판배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한 다음, 상기 평판배지에서 상기 SN7 균주와 상기 각각의 4종의 바실러스 세레우스 균의 생균수를 측정하여, 도 8 및 도 9에 나타내었다.
상기 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 균주를 배양한 평판배지에서 상기 SN7 균주와 상기 4종의 바실러스 세레우스 균의 콜로니(colony)를 명확하게 구분될 수 있었다. 구체적으로, 상기 SN7 균주(도 8의 A)는 점질물을 포함한 뾰족한 동그라미 모양의 콜로니(colony)를 형성하는 것이 확인되어, 상기 4종의 바실러스 세레우스 균과 구분이 가능한 것이 확인되었다.
또한, 상기 도 9에 나타낸 바와 같이, 상기 SN7 균주와 상기 4종의 바실러스 세레우스 균을 함께 배양한 경우, 상기 바실러스 세레우스 균의 초기 접종 균수에 따라 생육 억제 정도가 다르게 나타났다.
구체적으로, Bacillus cereus KCTC 1012 균주의 경우(도 9a), 초기 균주수가 4.2 내지 4.3 log CFU/mL일 때 5시간에 제어할 수 있는 것으로 확인되었고, 5.2 내지 5.3 log CFU/mL일 때 6시간에 생육이 제었되었으며, 6.2 내지 6.3 log CFU/mL일 때는 24시간이 경과된 경우에도 제어되지 못하는 것으로 확인되었고, Bacillus cereus KCTC 1013 균주의 경우(도 9b), 초기 균주수가 4.2 내지 4.3 log CFU/mL일 때 4시간에 생육이 억제되며, 5.2 내지 5.3 log CFU/mL일 때 5시간에 제어할 수 있는 것으로 확인되었고, 6.2 내지 6.3 log CFU/mL일 때는 6시간내에 생육이 억제되었으며, Bacillus cereus KCTC 1092 균주의 경우(도 9c), 초기 균주수가 4.2 내지 4.3 log CFU/mL일 때 4시간에 제어할 수 있는 것으로 확인되었고, 5.2 내지 5.3 log CFU/mL일 때 5시간 경과 시점에 생육이 억제되었으며, 6.2 내지 6.3 log CFU/mL일 때는 24시간이 경과되고 제어되는 것이 확인되었고, Bacillus cereus KCTC 3624 균주의 경우(도 9d), 초기 균주수가 4.2 내지 4.3 log CFU/mL일 때 5시간 경과 시점에 생육이 억제되었으며, 5.2 내지 5.3 log CFU/mL일 때 6시간에 제어할 수 있는 것으로 확인되었고, 6.2 내지 6.3 log CFU/mL일 때는 24시간이 경과 시점에도 생육이 억제되지 못하는 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터 상기 SN7 균주는 여러 종류의 바실러스 세레우스 균에 대한 항균활성을 갖는 것으로 확인되었으며, 항균활성과 관련하여 균주의 종류 및 초기 위해 균주의 농도에 따라 차이가 있으나, 상기 SN7 균주는 바실러스 세레우스는 모두 각각의 독소 유전자 등이 다른 4종의 바실러스 세레우스 균주와 함께 배양하는 경우 상기 바실러스 세레우스 균주를 제어할 수 있는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 SN7 균주의 조항균 물질의 바실러세 세레우스 균 중 Bacillus cereus KCTC 3624에 대한 항균활성을 측정하였다. 구체적으로, 상기 조항균 물질은 상기 실시예 3-1과 같이, 상기 본 발명의 SN7 균주를 50 mL TSB 액체배지에 1%(v/v) 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 진탕배양한 후, 상기 배양된 배양액을 9,950 × g 및 4℃의 조건으로 15분 동안 원심분리한 다음, 상등액을 분리하고, 상기 분리된 상등액을 0.20 μm membrane filter로 여과하여 제조하였다.
또한, 상기 SN7 균주의 조항균 물질의 항균활성 측정은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. Bacillus cereus KCTC 3624는 TSB 액체배지 50 mL에 1% (v/v) 접종하고, 37℃에서 15시간 동안 진탕배양한 후, 상기 배양된 배양액을 9,950 × g 및 4℃의 조건으로 15분 동안 원심분리한 다음, 균체를 회수하였다. 상기 회수한 각각의 균체를 상기 SN7 균주의 조항균 물질이 첨가된 TSB 액체배지에 재현탁하였다. 상기 Bacillus cereus KCTC 3624의 재현탁은 최종 농도가 3.2 내지 3.3 log CFU/mL, 4.2 내지 4.3 log CFU/mL 및 5.2 내지 5.3 log CFU/mL이 되도록 각각 TSB 액체배지에 재현탁하였다. 상기 혼합 균체 농도를 조절한 배양액을 37℃에서 24시간 동안 진탕배양한 후, 배양액을 취하고, 이를 희석한 희석액을 TSB 평판배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한 다음, 상기 평판배지에서 상기 Bacillus cereus KCTC 3624의 생균수를 측정하여, 도 10에 나타내었다.
상기 도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 SN7 균주의 조항균 물질은 상기 Bacillus cereus KCTC 3624 균주의 초기 균주수가 3.2 내지 3.3 log CFU/mL일 때 13시간내에 상기 Bacillus cereus KCTC 3624 균주를 제어할 수 있는 것으로 확인되었고, 4.2 내지 4.3 log CFU/mL일 때 20시간내에 상기 Bacillus cereus KCTC 3624 균주의 생육을 억제할 수 있는 것으로 확인되었으며, 5.2 내지 5.3 log CFU/mL일 때는 22시간내에 상기 Bacillus cereus KCTC 3624 균주를 제어할 수 있는 것으로 확인되었다.
4-2. 분리균주의 생육 저해 기작 확인
상기 실시예 4-1에서 확인된 상기 SN7 균주 및 상기 SN7 균주가 생산하는 조항균 물질의 생육 저해 기작을 확인하기 위하여, SEM(Scanning Electron Microscopy)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 4-1에서 SN7 균주의 조항균 물질에 의해 생육이 억제된 Bacillus cereus KCTC 3624 균주의 배양액을 PBS로 3회 세척한 후, 2.5%(v/v) glutaraldehyde(pH 7.4)로 4시간 동안 전고정시켰다. 상기 전고정된 균주를 0.1 M sodium cacodylate buffer(pH 7.4)로 15분씩 3회 세척한 후, 1%(v/v) OsO4(Sigma, USA)를 넣어 2시간동안 후고정하였다. 이 후, 0.1M sodium cacodylate buffer(pH7.4)로 15분씩 3회 세척하고, 50%(v/v), 60%(v/v), 70%(v/v), 80%(v/v), 90%(v/v) 및 95%(v/v) 농도를 갖는 에탄올 수용액을 이용하여, 순차적으로 높여 탈수과정을 각 15분씩 거친 다음, 최종 100% 에탄올을 이용하여 3번의 탈수과정을 수행하쳤다. 이 후, Tert-butanol(Sigma, USA)을 20분씩 3번 치환하여 이온 코팅기(E-1030 Ion sputter, Hitachi, 일본)로 시료를 백금으로 코팅한 후, FE-SEM(field emission scanning eletron microscope S-4700, Hitachi, 일본)으로 관찰하였다. 상기 대조구로 SN7 균주 또는 상기 SN7 균주의 조항균 물질을 처리하지 않고, 배양한 Bacillus cereus KCTC 3624 균주의 배양액에 대해 상기와 동일한 실험을 수행하였다. 상기 측정결과를 도 11에 나타내었다.
상기 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 SN7 균주의 조항균 물질이 상기 Bacillus cereus KCTC 3624 균주에 미치는 영향을 확인한 결과(도 11b 및 도 11c), 상기 바실러스 세레우스 균주의 세포가 터지거나 세포껍질만 있는 형태(ghost)인 것이 확인되었고, 균주의 세포가 곳곳이 비거나 축 늘어진 상태 또는 일그러져 상태가 관찰되었다. 상기 결과로부터, 상기 SN7 균주의 조항균 물질은 바실러스 세레우스의 증식막을 억제하는 것이 아니라, 바실러스 세레우스를 사멸시키는 살균작용(bactericidal action)이 있는 것이 확인되었으며, 상기 살균작용은 바실러스 세레우스의 형태를 유지시키지 않는 것으로 확인되어, 세포막 구조에 직접적으로 작용하거나, 세포막 합성이나 대사에 영향을 주는 것으로 예측되었다.
< 실시예 5> 청국장에서 분리균주의 바실러스 세레우스 생육 저해 활성 확인
본 발명의 SN7 균주는 청국장 발효에 작용하는 바실러스 서브틸리스에 속하는 것이므로, 상기 SN7 균주가 청국장 발효 중에서 위해미생물인 바실러스 세레우스의 생육을 저해하는 항균활성을 유지할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 우선 상기 SN7 균주를 접종하여 청국장을 제조하였다.
구체적으로, 상기 SN7 균주 및 상기 실시예 4에서 SN7 균주와 공동배양을 진행한 4종의 Bacillus cereus 균주 중에서 모든 독소 유전자를 포함한 가장 강한 독성을 지닌 균주인 Bacillus cereus KCTC 3624 균주의 준비는 각 균주를 5 mL TSB 액체배지에 1%(v/v) 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 전배양한 후, 상기 전배양액 1%를 TSB 액체배지 50 mL에 접종하여 37℃에서 24시간 본배양하는 방법으로 수행하였다. 상기 본배양된 배양액을 9,950 × g 및 4℃의 조건으로 15분 동안 원심분리하여 균체를 회수한 후, 상기 회수된 균체를 멸균된 3차 증류수를 이용하여 2회 수세하였다.
상기 청국장의 제조는 정선한 콩 1 kg을 20℃의 물에서 15시간 동안 침지한 후, 121℃에서 30분간 증자하였다. 상기 증자 후 40℃로 냉각시킨 다음, 미리 준비해둔 삶은 콩 350 g에 균체수가 6.2 내지 6.3 log CFU가 될 때까지 배양한 상기 SN7 균주를 접종하고, Bacillus cereus KCTC 3624 균주가 최종 농도가 3.2 내지 3.3 log CFU 또는 4.2 내지 4.3 log CFU가 되도록 준비된 배양액을 부피비를 기준으로 상기 SN7 균주 접종액과 동량의 배양액을 접종하거나, 상기 SN7 균주 또는 상기 Bacillus cereus KCTC 3624 균주만을 접종하였다. 상기 접종 후, 균주가 접종된 삶은 콩을 39℃ 내지 50℃에서 24시간동안 배양하여 청국장을 제조하였다. 상기 청국장과 비교하기 위한 비교예로, 상기 SN7 균주만 접종한 경우와 Bacillus cereus KCTC 3624 균주만 접종한 경우를 사용하였다.
상기 각각 제조한 청국장에서 상기 SN7 균주의 항균 효과를 확인하기 위하여, 청국장 제조직후부터 4℃에서 6개월 동안 보관할 때까지 미생물 균총을 확인하였다. 상기 미생물 균총의 확인은 상기 각각의 청국장 청국장 시료 1 g을 멸균 증류수 9 mL에 희석하여 균질화시킨 후, 멸균 거즈로 여과한 다음 순차적으로 희석하여 10배 희석한 다음, TSB 평판배지 또는 PEMBA 평판배지에 도말하고, 37℃에서 24시간 배양하여 SN7 균주와 Bacillus cereus KCTC 3624 균주의 생균수를 측정하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.
상기 도 12에 나타낸 바와 같이, Bacillus cereus KCTC 3624 균주만을 처리한 경우에서는 청국장 제조직후부터 1개월, 2개월, 3개월 및 6개월 모두에서 높은 수준의 생균수가 확인된 반면, 본 발명의 SN7 균주와 함께 배양한 경우에서는 청국장 제조 후 1개월이 경과된 시점부터 접종한 2개의 최종농도 모두에서 Bacillus cereus KCTC 3624 균주가 확인되지 아니하였다. 한편, 본 발명의 SN7 균주는 Bacillus cereus KCTC 3624 균주와 함께 배양하였는지 여부에 관계없이, 약 8.3 내지 8.7 log CFU/Ml 높은 생균수가 확인되었다.
또한, PEMBA 평판배지에 배양한 결과를 나타낸 상기 도 13에서 확인된 바와 같이, Bacillus cereus KCTC 3624 균주만을 처리한 경우에서는 mannitol-negative 및 lecitinase-positive인 당대사능 특성에 의해 흰색 침전물로 둘러싸인 푸른색 집락이 확인되어, Bacillus cereus KCTC 3624 균주가 확인된 반면, 본 발명의 SN7 균주 단독 또는 본 발명의 SN7 균주와 Bacillus cereus KCTC 3624 균주를 함께 접종한 청국장에서는 상기 흰색 침전물로 둘러싸인 푸른색 집락이 전혀 확인되지 아니하여, 본 발명의 SN7 균주에 의해 본 발명의 SN7 균주가 접종된 청국장에서는 바실러스 세레우스 균의 생육이 저해됨이 확인되었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 SN7 균주를 청국장 제조용 종균으로 사용하는 경우에는 효과적으로 식중독의 원인이 되는 위해 미생물인 바실러스 세레우스의 오염을 제어할 수 있을 것으로 평가되었다.
< 실시예 6> 분리균주의 항균 물질의 확인
6-1. 항균 물질의 정제
본 발명의 SN7 균주의 바실러스 세레우스에 대한 항균물질의 정제는 C18 Sep-pak cartridge를 이용하여 다음과 같은 방법으로 수행하였다.
우선, 상기 SN7 균주의 바실러스 세레우스에 대한 항균물질을 분리하기 위하여, 상기 SN7 균주를 5 mL TSB 액체배지에 1%(v/v) 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 전배양한 후, 상기 전배양액 1%를 TSB 액체배지 50 mL에 접종하여 37℃에서 24시간 본배양하였다. 상기 본배양된 배양액을 9,950 × g 및 4℃의 조건으로 15분 동안 원심분리하여 회수한 상징액을 0.2 μm membrane filter로 제균하였다. 상기 제균된 상징액을 100% 메탄올과 3차 증류수로 미리 soaking된 소수성 컬럼(column)인 C18 Sep-Pak cartridge(Waters Co., U.S.A.)에 통과시켜 소수성 물질을 흡착시킨 후, 3차 증류수로 수세하고 100% 메탄올 5 mL(HPLC-grade, Fisher, USA) 및 100% 아세톤니트릴(acetonitrile)로 용출하였다. 메탄올에 녹아있는 용출 분획은 Speed Vac Concentrator(Centra-Vac VS-802, Vision, 대한민국)를 이용하여 용매를 제거한 후, 정제 시료로 사용하였다. 상기 정제 시료를 멸균수에 녹여 항균활성을 여과지원반법(paper disc assay)으로 측정하였다. 상기 항균활성을 확인하기 위한 감수성 균주로, Bacillus cereus KCTC 3624를 사용하였고, 생육저해환의 측정은 digimatic caliper(CD-15cpx, Mitutoyo, 일본)을 사용하여 지름을 측정하는 방법으로 수행하였다. 상기 측정결과를 도 14a에 나타내었다.
상기 도 14a에 나타낸 바와 같이, 상기 SN7 균주의 배양액의 상등액인 조항균 물질의 부분정제물 즉, C18 Sep-pak 컬럼에 흡착시킨 후, 100% 메탄올(A) 및 100% 아세톤니트릴(B) 용매로 용출시킨 용출물에 대해 여과지원반법(paper disc assay)으로 항균활성을 확인한 결과, 100% 메탄올(A)로 용출시킨 경우, Bacillus cereus KCTC 3624에 대하여 15.87 mm의 생육 억제환을 나타내어, 우수한 항균활성이 확인된 반면, 100% 아세톤니트릴(B)로 용출시킨 경우, 생육 억제환이 형성되지 아니하여 항균활성이 거의 나타나지 아니하였다.
상기 100% 메탄올(A)로 용출시킨 용출물의 용매를 제거하여 제조된 정제 시료를 50% 아세트로니트릴 수용액(50% aqueous acetonitrile, HPLC-grade, Fisher, USA)에 녹인 후, 0.20 μm syringe filter로 여과시킨 다음, preparative LC 9104 HPLC system(Japan Analytical Industry, 일본)을 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 수행해 분리하였다. 상기 HPLC 수행에 있어서, 컬럼(Column)은 JAIGEL-W252 gel perneation chromatography column(W252, 20×500 mm, Japan Analytical Industry, 일본)을 사용하였고, 검출기(detector)는 3702 UV detector(Japan Analytical Industry, 일본)을 사용하였다. 상기 HPLC 정제 조건으로 용매는 50% 아세트로니트릴 수용액을 사용하여, flow rate는 5 mL/min이었고, 검출기의 UV파장은 210 nm의 조건으로 수행하였다.
상기 분리 및 정제 과정을 거쳐 13개의 분획을 수득하였으며, 상기 13개의 분획에 대해 6구간으로 구분하여, Speed Vac Concentrator(Centra-Vac VS-802, Vision, 대한민국)를 이용하여 용매를 제거한 후, 정제 시료로 사용하였다. 상기 정제 시료를 멸균수에 녹여 spot on lawn assay법으로 항균활성을 측정하였다. 상기 항균활성을 확인하기 위한 감수성 균주로, Bacillus cereus KCTC 3624를 사용하였고, 항균활성을 가진 시료는 상기 정제 시료를 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충액에 녹여 사용 하였다. 상기 측정결과를 도 14b 및 도 14c에 나타내었다.
상기 도 14b 및 도 14c에 나타낸 바와 같이, 6구간 중 Bacillus cereus에 대한 항균활성을 확인한 결과, 2번 구간에서 Bacillus cereus KCTC 3624에 대한 가장 강한 항균활성을 나타내는 것으로 확인된 반면, 다른 구간에서는 생육 억제환이 형성되지 아니하여 항균활성이 거의 나타나지 아니된 것으로 확인되었다.
상기 1차 HPLC(pre-HPLC)을 수행한 결과, 상기에서 항균활성이 확인된 2번 구간의 분획물의 용매를 제거하여 제조된 정제 시료를 50% 아세트로니트릴 수용액(50% aqueous acetonitrile, HPLC-grade, Fisher, USA)에 녹인 후, 0.20 μm syringe filter로 여과시킨 다음, preparative LC 9104 HPLC system(Japan Analytical Industry, 일본)을 이용하여 2차 HPLC(preparative HPLC, pre-HPLC)를 수행해 분리하였다. 상기 2차 HPLC 수행에 있어서, 컬럼(Column)과 검출기(detector)는 1차 HPLC와 동일한 것을 사용하였고, HPLC 정제 조건으로 용매는 50% 아세트로니트릴 수용액을 사용하여, flow rate는 3 mL/min이었고, 검출기의 UV파장은 210 nm의 조건으로 수행하였다.
상기 분리 및 정제 과정을 거쳐 3개의 분획을 수득하였으며, 상기 3개의 분획에 대해 Speed Vac Concentrator(Centra-Vac VS-802, Vision, 대한민국)를 이용하여 용매를 제거한 후, 정제 시료로 사용하였다. 상기 정제 시료를 멸균수에 녹여 spot on lawn assay법으로 Bacillus cereus KCTC 3624에 대한 항균활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 14d 및 도 14e에 나타내었다.
상기 도 14d 및 도 14e에 나타낸 바와 같이, 3개의 분획 중 Bacillus cereus에 대한 항균활성을 확인한 결과, 2번 분획에서 Bacillus cereus KCTC 3624에 대한 가장 강한 항균활성을 나타내는 것으로 확인된 반면, 다른 분획에서는 생육 억제환이 형성되지 아니하여 항균활성이 거의 나타나지 아니된 것으로 확인되었다.
상기 2차 HPLC(pre-HPLC)을 수행한 결과, 상기에서 항균활성이 확인된 2번 분획의 용매를 제거하여 제조된 정제 시료를 50% 아세트로니트릴 수용액(50% aqueous acetonitrile, HPLC-grade, Fisher, USA)에 녹인 후, 0.20 μm syringe filter로 여과시킨 다음, recycling preparative HPLC을 수행하였다. 상기 recycling preparative HPLC는 상기 1차 HPLC(pre-HPLC) 및 2차 HPLC(pre-HPLC)와 동일한 컬럼(Column)과 검출기(detector)를 이용하고, 동일한 조건으로 HPLC를 수행하였다. 상기 분획을 수행한 결과를 도 14f에 나타내었다. 상기 도 14f에 나타낸 바와 같이, 상기에서 항균활성이 확인된 2번 분획은 하나의 분획으로 확인되었다.
상기 하나의 분획으로 확인된 2번 분획에 대해서 항균활성을 확인하여, 단백분해 효소인 proteinase K로 처리한 후의 안정성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 2번 분획에 대한 효소 처리는 상기 분획에 10 mM Tris-HCl 완충액(10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5)에 proteinase K를 2 mg/mL의 농도로 첨가한 후, 37℃ 1시간 처리하였다. 상기 proteinase K를 처리한 효소 처리물과 효소를 처리하지 않은 2번 분획물을 멸균수에 녹여 spot on lawn assay법으로 Bacillus cereus KCTC 3624에 대한 항균활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 14g에 나타내었다.
상기 도 14g에 나타낸 바와 같이, Bacillus cereus에 대한 항균활성을 확인한 결과, 상기 2번 분획(2번)에서는 Bacillus cereus KCTC 3624에 대한 항균활성을 나타내는 것으로 확인된 반면, 상기 2번 분획에 대해 proteinase K를 처리한 효소 처리물의 경우 생육 억제환이 형성되지 아니하여 항균활성이 거의 나타나지 아니된 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, 상기 proteinase K를 1시간 동안 처리함으로써 상기 2번 분획이 가지는 항균활성이 소실되는 것으로 확인되어, 상기 2번 분획은 단백질성 물질로 확인되었다.
상기한 결과로부터, 본 발명의 SN7 균주의 항균 물질은 바실러세 세레우스에 대한 우수한 항균 활성을 갖는 단백질성 물질로 소수성 컬럼(C18 Sep-Pak column)에서 메탄올 용매에 의해 용출되는 박테리오신으로 확인되어, 상기 SN7 균주를 이용하여 청국장을 제조할 경우 위해미생물인 바실러스 세레우스의 생육을 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 확인되었으며, 상기 SN7 균주는 청국장 생산 균주 즉, 청국장 발효 균주 중 하나인 바실러스 서브틸리스로 동정되었을 뿐만 아니라 독소 생성 등을 통한 안전성 실험에서도 안전성이 확인되었고, 상기 바실러스 세레우스에 대한 우수한 항균활성을 나타내는 물질인 박테리오신은 식품의 섭취 과정에서 상기 항균활성을 나타내는 단백질성 물질인 박테리오신이 단백분해효소에 의하여 분해 또는 실활될 것이므로, 결과적으로 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주가 접종되어 발효된 콩 발효식품을 섭취하는 경우에도 해당 항균 물질은 식품의 섭취 및 소화 과정에서 체내의 소화기관의 단백분해효소에 의해 쉽게 분해되어 결과적으로 식품을 섭취하는 인체에는 영향을 미치지 않아서 안전성에서도 문제되지 아니할 것으로 확인되었으므로, 본 발명의 SN7 균주는 장류산업에 있어 화학합성저해제 첨가 없이, 최소한의 공정처리로 식중독 균주의 문제점을 해결할 수 있을 뿐만 아니라, 식품 및 의약품에서 활용할 수 있을 것으로 예상된다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
농업생명공학연구원 KACC91935 20140225

Claims (9)

  1. 메주로부터 분리되고, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균활성을 가지며, 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주는 pH 2.0 내지 pH 9.0의 pH 조건 및 20℃ 내지 50℃의 범위에서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균활성을 가지는 것인 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주는 상기 바실러스 서브틸리스 SN7 균주의 배양액을 소수성 컬럼과 아세톤니트릴 및 메탄올을 이용하여 분리할 경우, 메탄올 용매에 의해 용출되는 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성을 가지는 박테리오신을 생산할 수 있는 것인 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7).
  4. 제1항의 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물.
  5. 제1항의 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발효용 스타터(Starter).
  6. 제1항의 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)를 포함하는 발효식품용 종균 조성물.
  7. 제5항의 발효용 스타터 또는 제6항의 발효식품용 종균 조성물을 첨가하여 제조된 것을 특징으로 하는 발효식품.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 발효식품은 메주인 것인 발효식품.
  9. 메주로부터 분리되고, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균활성을 가지며, 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7)를 포함하는 발효식품용 종균 조성물; 또는 메주로부터 분리되고, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균활성을 가지며, 기탁번호 KACC 91935P를 갖는 신규한 바실러스 서브틸리스 SN7 균주(Bacillus subtilis SN7), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 메주 발효용 스타터(Starter);
    를 이용하여 메주를 제조하는 단계를 포함하는 메주 제조방법.
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