ES2639888T3 - Materiales y procedimientos para mejorar la función gastrointestinal - Google Patents

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ES2639888T3 ES11827720.1T ES11827720T ES2639888T3 ES 2639888 T3 ES2639888 T3 ES 2639888T3 ES 11827720 T ES11827720 T ES 11827720T ES 2639888 T3 ES2639888 T3 ES 2639888T3
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Abstract

Una composición terapéutica para su uso en un procedimiento de tratamiento de atrofia de las vellosidades producida por irradiación, quimioterapia o inflamación en el intestino delgado, en la que la composición se formula para administración enteral y comprende lisina, glicina, treonina, valina y tirosina, como aminoácidos libres; y agua; y en la que la composición no comprende glucosa, glutamina y metionina, o, si estos ingredientes están presentes, la glucosa está presente a una concentración inferior a 1 g/l, la glutamina está presente a una concentración inferior a 300 mg/l y la metionina está presente a una concentración inferior a 100 mg/l.

Description

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DESCRIPCION
Materiales y procedimientos para mejorar la funcion gastrointestinal
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. N.° de serie 61/386.317 presentada el 24 de septiembre de 2010, y la solicitud provisional de EE.UU. N.° de serie 61/431.629 presentada el 11 de enero de 2011.
Apoyo del qobierno
La presente invencion re realizo con apoyo de gobierno con la Concesion N.° RC2-AI-087580 otorgada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El gobierno tiene ciertos derechos en la presente invencion.
Antecedentes de la invencion
La radiacion, una terapia comun para tumores malignos en el abdomen y la pelvis, puede causar dano grave al revestimiento del tubo gastrointestinal (Gl), que esta compuesto de celulas epiteliales intestinales que se dividen rapidamente. Los efectos toxicos de la radiacion en el sistema gastrointestinal causan slntomas tales como nauseas, vomitos, diarrea, desequilibrio de electrolitos y deshidratacion, y afectan adversamente la recuperacion del paciente en el transcurso de la terapia del cancer. Incluso a bajas dosis, se observa una perdida continua de las vellosidades y borde en cepillo del intestino delgado en el plazo de dlas despues de la irradiacion. Mientras que las celulas de la cripta pueden repoblar rapidamente la region despues de dosis de leves a moderadas de (irradiacion) IR, se pierden a una tasa logarltmica despues de la irradiacion a dosis altas.
La irradiacion es particularmente destructiva para el epitelio velloso, donde se produce la absorcion de nutrientes y electrolitos. El epitelio velloso experimenta un proceso continuo de perdida y regeneracion celular, en el que un suministro constante de enterocitos inmaduros, que se originan en las celulas progenitoras situadas dentro de los polos inferiores de las criptas de Lieberkuhn, emigran fuera del compartimiento proliferativo en la base de la cripta a la parte superior de la vellosidad. Durante su corta vida, estos enterocitos maduran gradualmente a lo largo del eje de la cripta-vellosidad en celulas de las vellosidades. La radioterapia a la region del abdomen y de la pelvis destruye no solo las celulas de las vellosidades existentes, sino tambien los enterocitos de los que se forman nuevas celulas de las vellosidades, y asl, pueden agotar casi la totalidad del epitelio de las vellosidades incluso a dosis moderadas.
Debido al uso creciente de dosis de radiacion totales altas y agentes citotoxicos, la radioterapia ha sido complicada por su toxicidad GI aguda. El dano al tubo Gl no solo produce una malabsorcion y perdida de nutrientes y llquidos, sino que tambien interrumpe la funcion de la barrera intestinal. El intestino permeable permite una entrada facil de patogenos a traves de la barrera de la mucosa, causando inflamacion, bacteremia y endotoxemia. Por ejemplo, pueden desarrollarse enteritis aguda por radiacion, diarrea y dolor abdominal en el plazo de dlas despues de la irradiacion incluso a dosis de tan solo 5-12 Gy (un ciclo fraccionado convencional de radiacion usa 1,8-2 Gy por fraccion), aunque la toxicidad Gl normalmente se produce a dosis mas altas. La enteritis cronica por radiacion puede desarrollarse entre 18 meses y 6 anos despues de la radioterapia, aunque puede desarrollarse incluso 15 anos despues27-29.
Las opciones de tratamiento para la enteritis por radiacion son limitadas. Los reglmenes de tratamiento convencionales incluyen la administracion de antidiarreicos para prevenir la perdida de llquidos, esmectita como un adsorbente de sales biliares, opioides para aliviar el dolor estomacal o rectal, y esteroides para aliviar la inflamacion. Los ensayos cllnicos tambien han investigado la eficacia de L. acidophilus, esmectita o sucralfato para la profilaxis de la diarrea, pero solo se logro una reduccion moderada de los slntomas Gl agudos30.
Un enfoque comun en la terapia de la enteritis por radiacion es usar nutricion parenteral total (TPN) para proporcionar descanso intestinal. Sin embargo, queda por determinar si la nutricion parenteral satisface las necesidades nutricionales de los pacientes, o tiene realmente efectos terapeuticos en la enteritis por radiacion. Aunque la TPN puede corregir el desequilibrio de la nutricion en ciertos pacientes, todavla puede desarrollarse la enteritis grave por radiacion37. La TPN tambien causa atrofia intestinal, normalmente en el plazo de 48 horas desde la administracion. La TPN tambien debilita las barreras mecanicas e inmunologicas 38
Se cree que los mecanismos biologicos exactos que conducen a la atrofia de la mucosa durante TPN, que no han sido bien establecidos, implican tanto senales de celulas locales sensibles a nutrientes39 como senales humorales, tales como hormonas intestinales4041. Se ha demostrado que la TPN induce una rapida disminucion (<8 h) en la circulacion sangulnea intestinal, que precede a la atrofia de las vellosidades y la supresion de la slntesis de protelnas en 24 h, y la proliferacion y supervivencia celular en 48 h42. A diferencia, la alimentacion oral aumenta rapidamente la circulacion sangulnea intestinal en animales neonatales y maduros43 44. Similarmente, en lechones neonatales, la alimentacion enteral casi inmediatamente (en el plazo de 1-3 horas) aumenta la circulacion sangulnea portal (PBF) hasta el 50 % por encima de los valores en lechones privados de alimentos45. Asl, como se muestra en diversos estudios, la alimentacion enteral es muy superior a la alimentacion parenteral78.
Actualmente, hay una falta de terapia nutricional que puede aliviar eficazmente la enteritis por radiacion. Aunque estudios recientes sugirieron que las dietas elementales o de exclusion especlfica pueden ser beneficiosas en
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casos23132 seleccionados, la eficacia de este enfoque no ha sido confirmada posteriormente. La terapia dietetica actual simplemente ofrece un medio de apoyo nutricional a pacientes desnutridos con enteritis cronica por radiacion.
Los estudios en animales demuestran que la glutamina protege tanto la mucosa del tubo Gl superior como inferior de lesiones causadas por quimioterapia o radioterapia (RT)33’35. Sin embargo, los ensayos cllnicos fallan en demostrar que la alimentacion de glutamina oral puede prevenir o aliviar la diarrea aguda en pacientes que han recibido radioterapia pelvica 36.
El documento US 2009/0238893 A1 describe formulaciones nutricionales para el tratamiento de afecciones inflamatorias del tubo GI que comprenden (a) una fuente de llpidos, (b) una fuente de hidratos de carbono y (c) una fuente de protelnas, en las que la fuente de protelnas comprende aminoacidos libres que comprenden: L-alanina, L- arginina, acido L-aspartico, L-cistina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina, L-carnitina y taurina. La formulacion contiene ademas, por ejemplo, pollmeros de glucosa o maltodextrina, un pollmero que consiste en monomeros de glucosa, como fuente de hidratos de carbono.
El documento US 4.959.350 describe una composicion de dieta enteral, que contiene hidrolizados de protelna que comprenden, entre otros, los aminoacidos metionina y maltodextrina como hidrato de carbono. En el documento US 5.780.451 se describe un producto nutricional enteral que contiene una fuente de protelnas con metionina y sacarosa, es decir, un disacarido que contiene glucosa.
Ademas, el documento US 2006/0247312 A1 describe una composicion para administracion enteral para el tratamiento de la funcion gastrointestinal que comprende aminoacidos, tales como lisina, glicina, treonina, valina y tirosina, sin glutamina anadida pero altos niveles de metionina. En la composicion, puede incluirse una fuente de hidratos de carbono, tal como glucosa o maltodextrina.
Asl, existe una necesidad del desarrollo de composiciones alimenticias mejoradas para el tratamiento de lesiones Gl inducidas por irradiacion. Como sera evidente de las divulgaciones que siguen, estos y otros beneficios son proporcionados por la presente invencion.
Breve sumario
La invencion objeto proporciona composiciones terapeuticas para su uso en un procedimiento de tratamiento de atrofia de las vellosidades producida por irradiacion, quimioterapia o inflamacion en el intestino delgado. La composicion objeto es util para el tratamiento o la mejora de la lesion gastrointestinal asociada a la perdida de celulas epiteliales del intestino delgado, particularmente en la region vellosa y el borde en cepillo, y/o para el tratamiento o la mejora de enfermedades o afecciones asociadas a la alteracion de la capacidad de absorcion en el intestino delgado.
Ventajosamente, la composicion terapeutica objeto puede ser disenada a la medida al estado de absorcion desequilibrado del sistema gastrointestinal, causado por la perdida de celulas epiteliales del intestino delgado y la alteracion de la funcion de la protelna de transporte en el intestino delgado. En una realizacion preferida, la composicion objeto se formula para la administracion por via oral.
La composicion terapeutica se formula para administracion enteral y comprende lisina, glicina, treonina, valina y tirosina como aminoacidos libres, y agua; y opcionalmente, vehlculos, electrolitos, vitaminas, agentes de tamponamiento y aromatizantes terapeuticamente aceptables. La composicion terapeutica se administra a traves de una via enteral. En una realizacion, la osmolaridad total de la composicion es de aproximadamente 230 mosm a 280 mosm, o preferentemente, aproximadamente 250 a 260 mosm. En una realizacion, la composicion tiene un pH de aproximadamente 7,1 a 7,9, preferentemente, aproximadamente 7,4.
Ademas, la composicion de la invencion objeto no comprende glucosa, glutamina y metionina, o, si estos ingredientes estan presentes, la glucosa esta presente a una concentracion inferior a 1 g/l, la glutamina esta presente a una concentracion inferior a 300 mg/l y la metionina esta presente a una concentracion inferior a 100 mg/l.
Preferentemente, la composicion objeto se administra por via oral y llega al intestino del sujeto.
La invencion objeto tambien describe procedimientos de preparacion de la composicion terapeutica, y para cribar nutrientes o electrolitos para la inclusion en la composicion terapeutica/dietetica objeto, seleccionando nutrientes o electrolitos que retienen o adquieren la capacidad de absorcion considerable que sigue a la destruccion de las celulas epiteliales del intestino delgado. Estos procedimientos pueden ser adaptados para su uso en pacientes individuales, facilitando asl el desarrollo de composiciones y procedimientos disenados especlficamente para satisfacer las necesidades de un paciente individual.
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Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra el efecto de la irradiacion (IR) en la secrecion neta de anion (A) y la conductancia (B). (A). Se estudiaron tejidos de IR de 12 Gy en el dia 1, 3 y 4. El aumento maximo en /sc se observo en el dia 2. La flecha representa el momento de tiempo cuando se anadio forskolina. (B). Efecto de las dosis elevadas de IR en la secrecion neta de anion. Todos los tejidos se estudiaron en el dia 6 y n = 12. Los resultados mostraron un aumento en la conductancia dependiente de la dosis de IR.
La Figura 2 muestra el cambio en lsc con el aumento de dosis de irradiacion. Todos los valores se derivan de n = 24 tejidos. Los experimentos se realizaron en el dia 4 post-irradiacion en solucion regular de Ringer en ambos lados de la camara con una osmolaridad total de 296 mosm. Las secciones de histopatologia mostraron dano minimo a las vellosidades y a la cripta a 3 Gy, y un dano extenso a las vellosidades y a la cripta a 7 Gy en comparacion con 0 Gy.
La Figura 3A muestra el cambio en lsc en celulas epiteliales de ratones con el tiempo despues de la irradiacion a 3 Gy. Los valores representan la media ± E.E.M. n = 6 tejidos. El maximo aumento en lsc se observo en el 6° dia despues de la irradiacion. No se observo diferencia significativa entre el 5°, 6° y 7° dias. Con tiempo > 7 dias post-irradiacion, hubo una ligera disminucion en lsc en comparacion con la del dia 5, 6 o 7. Los valores de lsc del dia 5, 6 y 7 fueron similares. La Figura 3B muestra el transporte de iones de una celula epitelial del intestino delgado. La Figura 3C muestra el efecto de la bumetanida en lsc basal y estimulado con AMPc en tejidos no irradiados e irradiados con 3 Gy. La Figura 3D muestra la contribution de HCO3- en la secrecion neta de anion. Esto se determino reemplazando Cl- en la solucion de Ringer con cantidades equimolares de isetionato. La forskolina estimulo un aumento en Isc a 0 Gy (*, p< 0,02), pero no en tejidos a 3 Gy. La Figura 3E muestra el efecto de Na+ del bano en la secrecion de HCO3-. Todos los resultados mostrados en la Figura 3 son de n = 6 tejidos. Las barras de error representan el EEM.
La Figura 4A muestra cambios en el nivel de endotoxina en plasma despues de IR. Los niveles de endotoxina en plasma se midieron en el dia 6, despues de IR. La Figura 4B muestra cambios en la relation de permeabilidad de Cl- y Na+ representada contra cambios en el voltaje de la membrana (potencial de dilution). La irradiacion a 7 Gy causa una perdida completa de selectividad.
La Figura 5 muestra que la irradiacion aumenta los niveles de los mediadores inflamatorios, que incluyen IL- 1P, TNFa y MIP-a.
La Figura 6 muestra cambios en la secrecion de HCO3' debido a irradiacion e inmunotincion para la maquinaria secretora de HCO3". (A) muestra los efectos de la irradiacion en el Na+ del bano en la secrecion de HCO3". Se realizaron experimentos en (A) en soluciones que contienen Cl- con Na+ 140 mM o (B) soluciones que contienen Cl- sin Na+. Los tejidos fueron estimulados con forskolina. Se comparo la secrecion de HCO3" con aquella de ratones irradiados entre 0 Gy y 3 Gy. Se observo secrecion de HCO3" dependiente del Na+ del bano significativamente mayor en ratones irradiados a 0 Gy en comparacion con a 3 Gy (p < 0,001). Los resultados derivan de n = 6 tejidos. Las barras de error representan el E.E.M. (B-E) que muestran la inmunotincion de los tejidos de yeyuno de ratones que recibieron irradiacion a 0 Gy y 3 Gy, usando anticuerpo NBCel a/b.
La Figura 7 muestra cambios dependientes de la dosis de IR en el transporte de glucosa y la cinetica. (A) muestra que la irradiacion produjo una disminucion dependiente de la dosis en la lsc de Na+ estimulada con glucosa medida en la camara de Ussing. (B) muestra la disminucion en la afinidad de SGLT1 por la glucosa a medida que aumento la dosis de irradiacion.
La Figura 8 muestra que la irradiacion redujo la corriente estimulada por glucosa en una manera dependiente de la dosis a partir de irradiacion a 1 Gy. La irradiacion a 7 Gy casi inactivo completamente el transporte de glucosa.
La Figura 9A muestra la corriente de cortocircuito, que muestra la cinetica saturada con aumento en la concentration de glucosa. Particularmente, el transporte de glucosa se satura a una concentration de 4 mM. La Figura 9B muestra un aumento dependiente de la dosis de irradiacion en los valores de Km. El aumento maximo en Km se observo a 7 Gy. Esto indica que la irradiacion causo una disminucion de la afinidad de SGLT- 1 a la glucosa.
La Figura 10 muestra que Vmax disminuyo a medida que aumento la dosis de radiation. La disminucion minima en Vmax se observo a 7 Gy. Esto indica que la irradiacion causa una reduction de SGLT-1 funcional para el transporte de glucosa.
La Figura 11 muestra cambios en Km con el tiempo despues de la irradiacion. Km aumento inmediatamente despues de la irradiacion y volvio a la normalidad (valores de control) aproximadamente 14 dias despues de la irradiacion.
Las Figuras 12A y B muestran resultados de estudios de supervivencia de murinos despues de la irradiacion de 9 Gy y 15,6 Gy. La muerte de ratones tratados con glucosa se produce a partir de los dias 5 y 7, mientras que los ratones de control no murieron hasta 10 dias despues de la irradiacion. En el dia 20, el 30 % de los ratones de control estaban vivos, mientras que ninguno de los ratones tratados con glucosa sobrevivio en el dia 20.
La Figura 13 muestra el analisis de transferencia Western de los niveles de proteina SGLT-1 en lisados de celula completa. Los resultados mostraron que la irradiacion aumento la expresion de SGLT-1.
La Figura 14 muestra el analisis de transferencia Western de los niveles de proteina SGLT-1 en vesiculas de membrana del borde en cepillo y tejidos de yeyuno. La irradiacion aumento los niveles de la proteina SGLT-1 en una manera dependiente de la dosis. No se detecto proteina SGLT-1 en los tejidos colonicos.
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La Figura 15 muestra que la irradiacion causo un aumento dependiente de la dosis en /sc estimulado con glutamina.
La Figura 16 muestra que la irradiacion causo una disminucion dependiente de la dosis en /sc estimulado con lisina.
Las Figuras 17A y B muestran la tasa de supervivencia de ratones despues de la terapia de lisina (A) o glucosa (B) despues de IR. La administration de lisina produjo un aumento de la supervivencia, mientras que la administration de glucosa produjo una disminucion de la supervivencia.
La Figura 18 muestra los analisis de transferencia Western para diversas protelnas de transporte. Analisis de transferencia Western que muestran NKCC1 (A), CFTR (C) y NBCe1-A/B (B) niveles de protelna en el yeyuno de ratones. De izquierda a derecha, los carriles representan 0, 1, 3, 5 y 7 Gy. La irradiacion aumento los niveles de protelnas NKCC1 de 1-5 Gy y tal aumento disminuyo a 7 Gy (A). Los niveles de protelna NBCe1-A/B disminuyeron significativamente despues de la irradiacion. Los niveles de protelna CFTR (C) en tejidos de yeyuno aumentaron significativamente despues de la irradiacion a 3 Gy en comparacion con 0 Gy. El yeyuno tuvo los niveles de protelna NBCe1-A/B mas altos en comparacion a aquellos en el duodeno, Ileon o colon (D). Los tejidos se recogieron para la transferencia western en el dla 6 despues de la irradiacion.
Las Figuras 19A y B son modelos esquematicos para la secretion de anion estimulada con AMPc (A) e inducida por irradiacion (B).
La Figura 20 muestra la lesion a la mucosa del intestino delgado en ratones tratados con 5-fluorouracilo (5-FU) (Fig. 20A) y cisplatina (Fig. 20B). (A) muestra el cambio en Isc en ratones inyectados con 5-FU. (B) muestra el cambio en Isc en ratones inyectados con cisplatino.
La Figura 21 muestra que la administracion de la composition terapeutica de la invention objeto mejora la funcion del intestino delgado de ratones que han recibido 5-FU.
Divulgacion detallada
La invencion objeto proporciona composiciones terapeuticas para su uso segun las reivindicaciones. En particular, la invencion objeto proporciona composiciones terapeuticas para su uso en un procedimiento de tratamiento de atrofia de las vellosidades producida por irradiacion, quimioterapia o inflamacion en el intestino delgado. La composicion se formula para administracion enteral. Las composiciones y procedimientos de la invencion objeto son particularmente utiles para el tratamiento o la mejora de lesion gastrointestinal asociada a la perdida de celulas epiteliales del intestino delgado, particularmente en la region de las vellosidades y borde en cepillo, y/o para el tratamiento de enfermedades o afecciones asociadas a la alteration de la funcion de la protelna de transporte en el epitelio del intestino delgado.
Ventajosamente, la composicion terapeutica objeto es disenada a la medida al estado de absorcion desequilibrado del sistema gastrointestinal, causado por la perdida de celulas epiteliales del intestino delgado, particularmente, en la region de las vellosidades del intestino delgado y el borde en cepillo, ademas de la alteracion de la funcion de la protelna de transporte. Particularmente, la invencion objeto puede mejorar la curacion de la mucosa del intestino delgado, restaurar la funcion del intestino delgado, potenciar la retention de llquidos, prevenir o aliviar la atrofia del intestino delgado y/o restaurar o potenciar la funcion de la barrera del intestino delgado de un paciente que tiene una lesion en la mucosa del intestino delgado.
La composicion terapeutica comprende lisina, glicina, treonina, valina y tirosina como aminoacidos libres; y opcionalmente, vehlculos, electrolitos, vitaminas, agentes de tamponamiento y aromatizantes terapeuticamente aceptables.
La composicion terapeutica se administra a traves de una via enteral. En una realization, la osmolaridad total de la composicion es de aproximadamente 230 mosm a 280 mosm, o preferentemente, es aproximadamente 250 a 260 mosm. En una realizacion, la composicion tiene un pH de aproximadamente 4,0 a 8,5, preferentemente 5,0 a 8,2, mas preferentemente 6,0 a 8,0, mas preferentemente, 7,1 a 7,9, y mas preferentemente, aproximadamente 7,4.
Ademas, la composicion de la invencion objeto no comprende glucosa, glutamina y metionina, o, si estos ingredientes estan presentes, la glucosa esta presente a una concentration inferior a 1 g/l, la glutamina esta presente a una concentracion inferior a 300 mg/l y la metionina esta presente a una concentracion inferior a 100 mg/l.
Tambien se describen procedimientos para el tratamiento o la mejora de enfermedades o afecciones asociadas a la perdida de celulas epiteliales del intestino delgado, particularmente en la region de las vellosidades y el borde en cepillo, y las enfermedades o las afecciones asociadas a la alteracion de la funcion de la protelna de transporte en el epitelio del intestino delgado. El procedimiento comprende administrar a traves de una via enteral, a un sujeto en necesidad de tal tratamiento, una cantidad eficaz de la composicion de la invencion objeto.
La invencion objeto se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la alimentation enteral a sujetos con solo los nutrientes que retienen o adquieren suficiente capacidad de absorcion despues de la lesion a la mucosa del intestino delgado, mejora la curacion de la mucosa, restaura la funcion del intestino delgado, potencia la retencion de llquidos y alivia una serie de slntomas de enfermedad asociados que incluyen, pero no se limitan a, malabsorcion, diarrea, nauseas, vomitos, desequilibrio de electrolitos y deshidratacion.
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Segun la invencion objeto, se ha determinado que, despues de la radiacion y quimioterapia, se observa una alteracion en la funcion de la protema de transporte con respecto a, por ejemplo, la glucosa, glutamina y lisina, y electrolitos tales como Na+, HCO3' y Cl-. Ademas, la radiacion causa un aumento en la secrecion neta de anion. Las alteraciones de la capacidad de absorcion de nutrientes y electrolitos se producen inmediatamente despues de la radiacion y la quimioterapia, pero es posible recuperar la capacidad de absorcion hacia la normalidad (aproximadamente 8-14 dias despues de la irradiacion en modelos de ratones).
Especificamente, la radiacion causa una disminucion dependiente de la dosis de irradiacion en la absorcion de glucosa debido a la reducida afinidad del sistema de transporte de glucosa dependiente de sodio (SGLT-1) por la glucosa. Estudios funcionales sobre la estimulacion de glucosa mostraron que la radiacion causo una disminucion dependiente de la dosis en la actividad de transporte de glucosa y disminuyo la afinidad de SGLT-1 por la glucosa.
Se sabe que la presencia de nutrientes o solutos no absorbidos en la luz intestinal puede conducir a diarrea osmotica. Segun la invencion objeto, se ha descubierto que la alimentacion oral de un sujeto irradiado con glucosa y/o glutamina causa diarrea osmotica y una disminucion en la supervivencia, mientras que la alimentacion oral de cada uno, o una combinacion de los aminoacidos seleccionados de lisina, glicina, treonina, valina, tirosina, acido aspartico, isoleucina, triptofano, asparagina y/o serina, prolonga la supervivencia.
Composicion terapeutica para mejorar la funcion del intestino delgado
En un aspecto, la invencion objeto proporciona composiciones terapeuticas para su uso en un procedimiento de tratamiento de atrofia de las vellosidades producida por irradiacion, quimioterapia o inflamacion en el intestino delgado La composicion terapeutica comprende lisina, glicina, treonina, valina y tirosina como aminoacidos libres; y opcionalmente, vehiculos, electrolitos, vitaminas, agentes de tamponamiento y aromatizantes terapeuticamente aceptables. En una realizacion, la composicion terapeutica comprende ademas acido aspartico, isoleucina, triptofano, asparagina y/o serina. La composicion terapeutica se administra a traves de una via enteral.
Preferentemente, la composicion es ligeramente alcalina y es hipotonica cuando se compara a la presion osmotica de las celulas epiteliales del intestino delgado (tales como las celulas de las vellosidades y las celulas de la cripta del intestino delgado). La composicion objeto comprende agua. Preferentemente, la composicion se formula como una bebida de rehidratacion oral para mejorar la funcion del intestino delgado que es debilitada debido a la perdida de, o la lesion a, las celulas epiteliales de las vellosidades.
En una realizacion, la osmolaridad total de la composicion es de aproximadamente 230 mosm a 280 mosm, o cualquier valor entre los mismos. Preferentemente, la osmolaridad total es de aproximadamente 250 a 260 mosm. En otra realizacion, la composicion tiene una osmolaridad total que es cualquier valor mas inferior a 280 mosm.
En una realizacion, la composicion tiene un pH de aproximadamente 7,1 a 7,9, o cualquier valor entre los mismos. Preferentemente, la composicion tiene un pH de aproximadamente 7,3 a 7,5, mas preferentemente, aproximadamente 7,4.
En ciertas realizaciones, cada aminoacido libre puede estar presente a una concentracion de 4 mM a 40 mM, o cualquier valor entre los mismos, en las que la osmolaridad total de la composicion es de aproximadamente 230 mosm a 280 mosm. Alternativamente, si la concentracion de aminoacido se calcula basandose en mg/l, cada aminoacido libre puede estar presente a una concentracion de 300 mg/l a 8000 mg/l, o cualquier valor entre los mismos, en las que la osmolaridad total de la composicion es de aproximadamente 240 mosm a 280 mosm.
En ciertas realizaciones especificas, la composicion terapeutica comprende aminoacidos libres presentes a sus concentraciones respectivas de la siguiente manera: lisina a una concentracion de aproximadamente 730 a 6575 mg/l, o cualquier valor entre los mismos; acido aspartico a una concentracion de aproximadamente 532 a 4792 mg/l, o cualquier valor entre los mismos; glicina en una concentracion de aproximadamente 300 a 2703 mg/l, o cualquier valor entre los mismos; isoleucina en una concentracion de aproximadamente 525 a 4722 mg/l, o cualquier valor entre los mismos; treonina en una concentracion de aproximadamente 476 a 4288 mg/l, o cualquier valor entre los mismos; tirosina en una concentracion de aproximadamente 725 a 6523 mg/l, o cualquier valor entre los mismos; valina en una concentracion de aproximadamente 469 a 4217 mg/l, o cualquier valor entre los mismos; triptofano en una concentracion de aproximadamente 817 a 7352 mg/l, o cualquier valor entre los mismos; asparagina en una concentracion de aproximadamente 528 a 4756 mg/l, o cualquier valor entre los mismos; y/o serina en una concentracion de aproximadamente 420 a 3784 mg/l, o cualquier valor entre los mismos; en donde la osmolaridad total de la composicion es de aproximadamente 240 mosm a 280 mosm.
En una realizacion, la invencion objeto proporciona una bebida que comprende los siguientes componentes lisina (11-21 mosm), acido aspartico (3-13 mosm), glicina (19-29 mosm), isoleucina (19-29 mosm), treonina (19-29 mosm), tirosina (0,5 - 5 mosm), valina (19-29 mosm), triptofano (5-20 mosm), asparagina (3-13 mosm) y serina (3-8 mosm), o un subconjunto de estos ingredientes.
Segun la invencion, la composicion comprende lisina, glicina, treonina, valina y tirosina en una forma de aminoacidos libres. En una realizacion especifica, la composicion comprende lisina, glicina, treonina, valina, tirosina, acido aspartico, isoleucina, triptofano, asparagina y serina en una forma de aminoacidos libres.
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En otra realization, la composition comprende uno o mas dipeptidos que estan formados de los mismos aminoacidos o diferentes seleccionados de lisina, de glicina, treonina, valina, tirosina, acido aspartico, isoleucina, triptofano, asparagina o serina.
En una realization, la composition no contiene glutamina y/o metionina; y ningun di-, oligo- o polipeptido o protelnas que pueden ser hidrolizadas en glutamina y/o metionina.
En una realization alternativa, la composition puede comprender el aminoacido libre glutamina, y opcionalmente uno o mas dipeptidos que contienen glutamina, en la que la concentration total del aminoacido libre glutamina y el (los) dipeptido(s) que contiene(n) glutamina es inferior a 300 mg/l, o cualquier concentration inferior a 300 mg/l, tal como 100 mg/l, 50 mg/l, 10 mg/l, 5 mg/l, 1 mg/l, 0,5 mg/l o 0,01 mg/l.
En otra realization alternativa, la composition terapeutica puede comprender el aminoacido libre metionina, y opcionalmente uno o mas dipeptidos que contienen metionina, en la que la concentration total del aminoacido libre metionina y el (los) dipeptido(s) que contiene(n) metionina es inferior a 300 mg/l, o cualquier concentration inferior a que 300 mg/l, tal como 100 mg/l, 50 mg/l, 10 mg/l, 5 mg/l, 1 mg/l, 0,5 mg/l o 0,01 mg/l.
En una realization, la composition terapeutica no contiene ningun sacarido, incluyendo ningun mono-, di-, oligo- polisacarido, ni hidratos de carbono. En una realization especlfica, la composition terapeutica no contiene glucosa, y/o ningun di-, oligo, o polisacarido, ni hidratos de carbono que pueden ser hidrolizados en glucosa. En una realization especlfica, la composition no contiene lactosa. En otra realization especlfica, la composition terapeutica no contiene fructosa y/o galactosa, y/o ningun di-, oligo, polisacarido, ni hidratos de carbono que pueden ser hidrolizados en fructosa y/o galactosa.
En una realization alternativa, la composition terapeutica puede comprender el monosacarido glucosa, y opcionalmente uno o mas disacaridos que contienen glucosa distintos de lactosa, en la que la concentration total del monosacarido glucosa y el (los) disacarido(s) que contiene(n) glucosa es inferior a 1 g/l, o cualquier concentration inferior a 1 g/l, tal como 500 mg/l, 300 mg/l, 100 mg/l, 50 mg/l, 10 mg/l, 5 mg/l, 1 mg/l, 0,5 mg/l o 0,01 mg/l.
En ciertas realizaciones, la composition terapeutica comprende uno o mas electrolitos seleccionados de, por ejemplo, Na+; K+; HCO3-; CO32-; Ca2+; Mg2+; Fe2; Cl'; iones fosfato, tales como H2PO4', HPO42' y PO43'; cinc; yodo; cobre; hierro; selenio; cromo; y molibdeno. En una realization alternativa, la composition no contiene HCO3- ni CO32-. En otra realization alternativa, la composition comprende HCO3- y CO32 a una concentration total inferior a 5 mg/l, o concentraciones inferiores a 5 mg/l.
En otra realization, la composition terapeutica comprende una o mas vitaminas que incluyen, pero no se limitan a, vitamina A, vitamina C, vitamina D (por ejemplo, vitamina D2, D3, D4 y/o D5), vitamina E, vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (por ejemplo, riboflavina), vitamina B3 (por ejemplo, niacina o niacinamida), vitamina B5 (acido pantotenico), vitamina B6 (piridoxina), vitamina B7 (biotina), vitamina B9 (por ejemplo, folato o acido folico), vitamina B12 (cobalamina) y vitamina K (por ejemplo, vitamina K1, K2, K3, K4 y K5), y colina.
En ciertas realizaciones, la composition no contiene uno o mas de los ingredientes seleccionados de oligo-, polisacaridos e hidratos de carbono; oligo-, o polipeptidos o protelnas; llpidos; acidos grasos de cadena pequena, media y/o larga; y/o alimentos que contienen uno o mas de los nutrientes antes mencionados.
En una realization, los iones fosfato tales como H2PO4-, HPO42 y PO43 se usan para tamponar la composition de la invention objeto. En una realization, la composition terapeutica usa HCO3- o CO32 como un tampon. En otra realization, la composition terapeutica no usa HCO3- o CO32 como tampon.
El termino "que consiste esencialmente en", como se usa en el presente documento, limita el ambito de los ingredientes y etapas a los materiales o etapas especificados y aquellos que no afectan materialmente la(s) caracterlstica(s) basica(s) y novedosa(s) de la presente invention, es decir, las composiciones y procedimientos para el tratamiento de lesion al epitelio del intestino delgado, particularmente en la region de las vellosidades y borde en cepillo. Por ejemplo, usando "que consiste esencialmente en", la composition terapeutica no contiene ningun ingrediente no especificado, que incluye, pero no se limita a, aminoacido libres, di-, oligo- o polipeptidos o protelnas; ni mono-, di-, oligo-, polisacaridos e hidratos de carbono que tienen un efecto terapeutico directo beneficioso o adverso en el tratamiento de lesiones al epitelio del intestino delgado, particularmente en la region de las vellosidades y el borde en cepillo. Por tanto, usando el termino "que consiste esencialmente en", la composition puede comprender sustancias que no tienen efectos terapeuticos en el tratamiento de lesion al epitelio del intestino delgado; tales ingredientes incluyen vehlculos, excipientes, adyuvantes, aromatizantes, etc., que no afectan la salud ni la funcion del epitelio del intestino delgado lesionado, particularmente en la region de las vellosidades y el borde en cepillo.
El termino "oligopeptido", como se usa en el presente documento, se refiere a un peptido que consiste en tres a veinte aminoacidos. El termino "oligosacaridos", como se usa en el presente documento, se refiere a un sacarido que consiste en tres a veinte monosacaridos.
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En una realizacion, la composicion de la invencion objeto comprende nutrientes (tales como aminoacidos libres) y/o electrolitos que retienen o adquieren la capacidad de absorcion mejorada en un sujeto que tiene una lesion a las celulas epiteliales del intestino delgado, cuando se compara con la capacidad de absorcion de controles normales que no tienen lesion a las celulas epiteliales del intestino delgado (tales como las celulas de las vellosidades, celulas de la cripta, enterocitos y celulas progenitoras intestinales).
En otra realizacion, la composicion de la invencion objeto no contiene nutrientes (tales como aminoacidos) y/o los electrolitos que no son absorbidos, o que tienen absorcion reducida, en un sujeto que tiene una lesion a las celulas epiteliales del intestino delgado, cuando se compara con la capacidad de absorcion de controles normales que no tienen una lesion a las celulas epiteliales del intestino delgado (tales como las celulas de las vellosidades, celulas de la cripta, enterocitos y celulas progenitoras intestinales). Ventajosamente, las composiciones de la invencion objeto facilitan la absorcion facil de nutrientes por el intestino para reducir el excesivo gasto de energla, proporcionandose as! descanso intestinal en el periodo de tiempo inmediato despues de la lesion de la mucosa.
Procedimiento de tratamiento para mejorar la funcion del intestino delgado
En el presente documento, se describen procedimientos para el tratamiento o la mejora de enfermedades o afecciones asociadas a la perdida de, o lesion a, las celulas epiteliales del intestino delgado, particularmente en la region de las vellosidades y el borde en cepillo. Por ejemplo, la perdida de, o la lesion a, las celulas epiteliales del intestino delgado producen capacidad de absorcion alterada para nutrientes, electrolitos y/o llquidos. Ventajosamente, para pacientes con perdida de, o con lesion a, las celulas epiteliales del intestino delgado, particularmente para pacientes con atrofia de la vellosidad del intestino delgado, el procedimiento mejora la curacion de la mucosa del intestino delgado; mejora la funcion del intestino delgado; potencia la absorcion de nutrientes y la retencion de llquidos en el intestino delgado; previene o alivia la atrofia del intestino delgado; alivia el dolor abdominal; previene y/o trata diarrea; restaura o potencia la funcion de barrera del intestino delgado; y/o reduce la inflamacion de la mucosa del intestino delgado, la bacteremia y/o la endotoxemia.
Por consiguiente, el procedimiento es particularmente beneficioso para mejorar la salud gastrointestinal de sujetos que reciben agentes quimioterapeuticos citotoxicos, radiacion pelvica o abdominal, terapia de protones y cirugla abdominal; sujetos que padecen infeccion o enfermedades autoinmunes asociadas a la inflamacion aguda o cronica en el intestino delgado; sujetos que son rutinaria o accidentalmente expuestos a la radiacion, tales como, por ejemplo, los astronautas y los pilotos que estan expuestos rutinariamente a la radiacion espacial, y sujetos expuestos a la radiacion debido a un accidente nuclear, actos de guerra o terrorismo.
Por ejemplo, el procedimiento comprende administrar, a traves de una via enteral, a un paciente o sujeto en necesidad de tal tratamiento, una cantidad eficaz de una composicion de la invencion. La composicion puede ser administrada a un paciente o sujeto inmediatamente antes, durante y/o despues de la lesion a las celulas epiteliales del intestino delgado, y puede ser administrada una vez o muchas veces cada dla.
El termino "sujeto" o "paciente", como se usa en el presente documento, describe un organismo, que incluye mamlferos tales como primates, a los que puede ser proporcionado el tratamiento con las composiciones segun la presente invencion. Las especies de mamlferos que pueden beneficiarse de los procedimientos desvelados de tratamiento incluyen, pero no se limitan a, simios superiores, chimpances, orangutanes, seres humanos, monos; animales domesticados tales como perros, gatos; ganado vivo tal como caballos, ganado vacuno, cerdos, ovejas, cabras, pollos; y animales tales como ratones, ratas, cobayas y hamsteres.
Por ejemplo, un sujeto en necesidad de tratamiento es un paciente con lesion a las celulas epiteliales de la mucosa del intestino delgado, que incluyen la capa de mucosa del duodeno, yeyuno e Ileon. Particularmente, un sujeto en necesidad de tratamiento es un paciente con lesion a la region de las vellosidades y el borde en cepillo del intestino delgado. Por ejemplo el sujeto en necesidad de tratamiento tiene atrofia de las vellosidades (por ejemplo, desgaste parcial o completo de la region de las vellosidades y borde en cepillo); tiene al menos un 5 % (tal como al menos el 10 %, 20 %, 30 % o 50 %) de reduccion en las celulas de las vellosidades en el intestino delgado; ha perdido al menos el 5 % (tal como al menos el 10 %, 20 %, 30 % o 50 %) de altura de las vellosidades cuando se compara con lo normal; tiene una perdida de la funcion de uno o mas transportadores en la region de las vellosidades y borde en cepillo del intestino delgado, en el que los transportadores incluyen, pero no se limitan a, el transportador de SGLT- 1, el transportador de AE2, el transportador de NHE1 y el transportador de NBCe1-A/B, en el que la perdida de la funcion del transportador es al menos el 5 % (tal como al menos el 10 %, 20 %, 30 % o 50 %); y/o tiene un cambio en la capacidad de absorcion de uno o mas nutrientes en el intestino delgado, en el que los nutrientes estan seleccionados de isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano, valina, histidina, tirosina, alanina, arginina, glutamina, acido aspartico, aspartato, cistelna, glicina, prolina, serina, asparagina, glucosa, fructosa y/o lactosa, en el que el cambio en la capacidad de absorcion es al menos el 5 % (tal como al menos el 10 %, 20 %, 30 % o 50 %).
Los cambios en la capacidad de absorcion del intestino delgado pueden ser determinados, por ejemplo, usando una camara de Ussing, como se ilustra en la seccion de Materiales y procedimientos en el presente documento. Por ejemplo, los cambios en el estado de absorcion pueden ser determinados, por ejemplo, midiendo una combination de Indices que incluyen, por ejemplo, Km, Vmax e Isc. La lesion a las vellosidades y otras regiones del intestino
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delgado puede ser determinada, por ejemplo, por el examen de muestras de biopsia de mucosa del intestino delgado.
Las enfermedades y los procedimientos terapeuticos que causan la lesion a la mucosa de las celulas epiteliales del intestino delgado, tales como las celulas de las vellosidades del intestino delgado, pueden ser facilmente determinadas por un profesional cllnico experto. Como es sabido en la profesion medica, los pacientes con ciertas enfermedades, tales como enfermedad inflamatoria del intestino (EII), colitis ulcerosa, ulceras duodenales y enfermedad de Crohn, sufren destruccion cronica de la mucosa del intestino delgado. La radiacion, la quimioterapia y la terapia de protones tambien causan lesion a las celulas del intestino delgado.
El termino "tratamiento", o cualquier variacion gramatical del mismo (por ejemplo, tratar, tratando y tratamiento, etc.), como se usa en el presente documento, incluye, pero no se limita a, aliviar un slntoma de una enfermedad o afeccion; y/o reducir, suprimir, inhibir, disminuir o afectar la progresion, gravedad y/o el ambito de una enfermedad o afeccion.
El termino "mejora", o cualquier variacion gramatical del mismo (por ejemplo, mejorar, mejorando y mejora, etc.), como se usa en el presente documento, incluye, pero no es limitado a, retrasar la aparicion, o reducir la gravedad de una enfermedad o afeccion (por ejemplo, diarrea, bacteremia y/o endotoxemia). La mejora, como se usa en el presente documento, no requiere la ausencia completa de los slntomas.
El termino "cantidad eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad que es capaz de tratar o mejorar una enfermedad o afeccion o de otro modo capaz de producir un efecto terapeutico previsto.
Por ejemplo, la invencion objeto describe un procedimiento para promover la salud intestinal de un sujeto con lesion a las celulas epiteliales del intestino delgado, en el que dicho procedimiento comprende: identificar un sujeto con lesion a las celulas epiteliales del intestino delgado, o que esta a punto de ser infligido con una lesion tal, y esta en necesidad de tratamiento o mejora, y administrar, a traves de una via enteral, al sujeto, una cantidad eficaz de una composicion que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en uno o mas aminoacidos libres seleccionados de lisina, glicina, treonina, valina, tirosina, acido aspartico, isoleucina, triptofano, asparagina y serina; agua; y opcionalmente, vehlculos, electrolitos, vitaminas, agentes de tamponamiento y aromatizantes terapeuticamente aceptables, en donde la composicion tiene una osmolaridad total de 240 a 280 mosm y un pH de aproximadamente 7,1 a 7,9.
Por ejemplo, uno o mas de los siguientes nutrientes no es administrado, a traves de una via enteral, a un sujeto con (o a punto de tener) lesion a las celulas epiteliales del intestino delgado, en el que los nutrientes estan seleccionados de glutamina, metionina, y cualquier di-, oligo- o polipeptido o protelna que pueda ser hidrolizado en glutamina y/o metionina; glucosa y cualquier di-, oligo, o polisacarido, e hidrato de carbono que pueda ser hidrolizado a glucosa; y/o alimentos que, con la digestion, requieran la absorcion de cualquiera de los nutrientes anteriormente mencionados en el intestino delgado.
Por ejemplo, para un sujeto con (o a punto de tener) lesion a las celulas epiteliales del intestino delgado, ninguno de los siguientes nutrientes se administra a traves de una via enteral, en el que los nutrientes estan seleccionados de sacaridos, llpidos, acidos grasos y/o alimentos que, con la digestion, requieren la absorcion de cualquiera de los nutrientes anteriormente mencionados en el intestino delgado. Para pacientes que se exponen a la radiacion, o reciben radiacion, quimioterapia y terapia de protones, la lesion a las celulas epiteliales del intestino delgado dura normalmente durante al menos 3, 7, 14, 21, 30 dlas, o cualquier periodo entre 1-30 dlas.
En una realizacion, despues de cualquier periodo entre 1-14 dlas (tal como despues de 3, 7, 14 dlas) desde que el sujeto es expuesto a la radiacion, o recibe radiacion, quimioterapia y/o terapia de protones, la composicion objeto se administra a traves de una via enteral para potenciar la curacion de la mucosa.
En una realizacion especlfica, la composicion objeto se administra por via oral y alcanza el intestino delgado del sujeto. Opcionalmente, el procedimiento comprende ademas administrar, a traves de una via parenteral, nutrientes y electrolitos requeridos que no son administrados en cantidades suficientes a traves de la via enteral.
Por ejemplo, la invencion objeto no se usa para proporcionar cantidades significativas o toda la nutricion esencial a un sujeto, sino que es para mejorar la curacion de la mucosa de intestino delgado, restaurar la funcion del intestino delgado, potenciar la retencion de llquidos, prevenir o aliviar la atrofia de las vellosidades del intestino delgado, prevenir y/o tratar la diarrea, y/o restaurar o potenciar la funcion de la barrera intestinal. En una realizacion especlfica, la composicion de la bebida tambien se basa en la mejora en la funcion de la barrera. La funcion de la barrera puede ser determinada usando multiples tecnicas que incluyen: a) un aumento en las mediciones de la conductancia en los tejidos montados en una camara de Ussing, b) potencial de dilucion usado para medir la permeabilidad relativa de Cl y Na (PCI/PNa) (solo una barrera intacta y funcional puede mantener la selectividad ionica; cuando se pierde la funcion de la barrera, la relacion selectiva del ion es proxima a uno), y c) midiendo los niveles de endotoxina en plasma. Cuando se pierde la funcion de la barrera de la mucosa, las bacterias intestinales comensales pueden encontrar su camino en la circulacion sistemica, resultando niveles elevados de endotoxina en plasma. Los niveles de endotoxina pueden medirse en una muestra de sangre de un paciente. Los niveles de endotoxina en plasma tambien pueden ser usados como un Indice para medir la mejora con el tratamiento.
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Segun la invencion, las composiciones de la invention objeto se usan en un procedimiento de tratamiento de atrofia de las vellosidades producida por irradiation, quimioterapia o inflamacion en el intestino delgado.
Las composiciones de la invencion objeto pueden ser usadas en el tratamiento o la mejora de cualquier enfermedad o afeccion asociada a la perdida, destruction, o reduction de celulas epiteliales del intestino delgado, particularmente la perdida, destruccion o reduccion en la funcion o el numero de celulas de las vellosidades, enterocitos, y/o celulas progenitoras intestinales del intestino delgado. La invencion objeto es particularmente util para el tratamiento o la mejora de cualquier enfermedad o afeccion asociada a la perdida, inactivation o alteration funcional de las protelnas de transporte en las celulas epiteliales del intestino delgado, particularmente las protelnas de transporte en las celulas de las vellosidades del intestino delgado.
Por ejemplo, las composiciones y procedimientos de la invencion objeto pueden usarse en el tratamiento o la mejora de una enfermedad o afeccion que surge de, o asociada a, una afinidad reducida del sistema de transporte de glucosa dependiente de sodio (SGLT-1) por la glucosa; una perdida o actividad reducida de cotransportador Na+- HCO3(-) electrogenico del extremo NH2 (NBCe1-A/B); una perdida o actividad reducida del transportador de intercambio CL-HCO3" apical (AE1); y/o un nivel aumentado o actividad de los sistemas de transportador de CFTR y/o NKCC-1.
In a especlficamente realization preferida, las composiciones de la invencion objeto pueden usarse en el tratamiento o la mejora de lesion al intestino delgado causada por radiation. En una realizacion especlfica, la invencion objeto puede usarse en el tratamiento o la mejora de lesion al intestino delgado causado por radioterapia, particularmente radioterapia pelvica y abdominal. En una realizacion especlfica, la radioterapia es para el tratamiento de cancer.
Ademas, la invencion objeto puede usarse en el tratamiento o la mejora de lesion al intestino delgado causada por exposition rutinaria a la radiacion, tal como exposition a la radiacion espacial en astronautas y pilotos; exposition a la radiacion, tal como por un arma radiactiva y liberation nuclear accidental. Especlficamente, la invencion objeto puede usarse para tratar o mejorar enteritis aguda y/o cronica por radiacion.
En ciertas realizaciones especlficas, las composiciones de la invencion objeto pueden usarse en el tratamiento o la mejora de lesion al intestino delgado, en las que el paciente recibio radiacion a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 Gy. En otra realizacion, el sujeto recibio radiacion a una dosis superior a 20 Gy.
Adicionalmente, la invencion objeto puede usarse en el tratamiento o la mejora de lesion al intestino delgado causada por agentes quimioterapeuticos que incluyen, pero no se limitan a, cisplatino, 5-fluorouracilo (5-FU), hidroxiurea, etoposido, arabinosido, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fludarabina, metotexato, esteroides, y/o una combination de los mismos.
Ademas, la invencion objeto puede usarse en el tratamiento o la mejora de lesion al intestino delgado causada por terapia de protones.
En ciertas realizaciones, la invencion objeto puede usarse en el tratamiento o la mejora de enfermedades que implican lesion al intestino delgado que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), colitis ulcerosa, ulceras duodenales, enfermedad de Crohn y/o enfermedad cellaca (tambien conocida como celiaqula). La invencion objeto puede usarse en el tratamiento o la mejora de lesion al intestino delgado debido a infection patogena, tal como viral, bacteriana, micotica, u otra infection microbiana.
Segun la invencion, la invencion objeto se usa en el tratamiento o la mejora de atrofia de las vellosidades del intestino delgado, es decir, desgaste parcial o completo de la region de las vellosidades y borde en cepillo, ademas de enfermedades y afecciones que surgen de, asociadas a, y/o que son causadas por la atrofia de las vellosidades del intestino delgado.
Por ejemplo, la invencion objeto puede usarse en el tratamiento o la mejora de atrofia focal de las vellosidades y/o atrofia difusa de las vellosidades; atrofia hiperplasica de las vellosidades y/o atrofia hipoplasica de las vellosidades. En ciertas realizaciones, la invencion objeto puede usarse en el tratamiento o la mejora de atrofia de las vellosidades con y sin inflamacion de la mucosa.
Por ejemplo, la invencion objeto puede usarse en el tratamiento o la mejora de atrofia hiperplasica de las vellosidades (con hiperplasia de la cripta) y enfermedades y afecciones asociadas que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad cellaca (con enteropatla sensible al gluten); traumatismo cronico; trasplante de intestino delgado; conductos ileales urinarios; inflamacion de la mucosa intestinal; ulceras intestinales; anastomosis intestinal; glucagonoma; amplias resecciones del intestino delgado; atrofia primaria de las vellosidades ileales; atrofia microscopica de colitis; atrofia de las microvellosidades intestinales; y citopatla mitocondrial (anomalla en la cadena respiratoria mitocondrial).
Por ejemplo, la invencion objeto puede usarse en el tratamiento o la mejora de atrofia hipoplasica de las vellosidades (sin hiperplasia de cripta) y enfermedades y afecciones asociadas que incluyen, pero no se limitan a, tumor maligno; deficiencia de celulas de Paneth, hipopituitarismo, enfermedad cellaca insensible a la dieta sin gluten; esprue tropical; isquemia asociada a la radiacion; atrofia de las vellosidades inducida por farmacos, tal como atrofia de las
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vellosidades inducida por neomicina y azatioprina.
En ciertas realizaciones, la invencion objeto puede usarse en el tratamiento o la mejora de atrofia de las vellosidades con inflamacion de la mucosa, ademas de enfermedades y afecciones asociadas que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad cellaca; intolerancia alimenticia grave; enfermedad congenita de Crohn; enteropatla autoinmune; enterocolitis; y slndromes de inmunodeficiencia.
Por ejemplo, la invencion objeto puede usarse en el tratamiento o la mejora de atrofia de las vellosidades causada por enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, hepatitis; cancer intestinal; linfoma intestinal; diabetes de tipo 1; alergia; gastroenteritis eosinofllica; gastroenteritis viral; y enteropatia autoinmune.
Por ejemplo, la invencion objeto puede usarse en el tratamiento o la mejora de atrofia de las vellosidades asociada a enfermedad cellaca en el intestino delgado, que incluye, pero no se limita a, atrofia de las vellosidades de tipo 3a de Marsh (> 40 linfocitos intraepiteliales por 100 enterocitos; atrofia leve de las vellosidades), atrofia de las vellosidades de tipo 3b de Marsh (> 40 linfocitos intraepiteliales por 100 enterocitos; atrofia marcada de las vellosidades), atrofia de las vellosidades de tipo 3c de Marsh (> 40 linfocitos intraepiteliales por 100 enterocitos; region de las vellosidades ausente o casi ausente), (basado en la clasificacion de Marsh modificada de la enfermedad cellaca y atrofia de las vellosidades intestinales).
La invencion objeto tambien puede usarse para tratar o mejorar slntomas asociadas a lesion al intestino delgado que incluyen, pero no se limitan a, malabsorcion, diarrea, nauseas, vomitos, desequilibrio de electrolitos, malabsorcion y deshidratacion.
Preparacion de la composition terapeutica para mejorar la funcion del intestino delgado
Ademas, se describe un procedimiento de preparacion de la composicion terapeutica de la invencion. Por ejemplo, el procedimiento comprende preparar una composicion para promover la salud intestinal de un sujeto con la perdida de, o lesion a, celulas epiteliales del intestino delgado, en el que la composicion comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una cantidad eficaz de uno o mas ingredientes, en el que los ingredientes son absorbidos por el intestino delgado de un sujeto con una perdida de, o lesion a, las celulas epiteliales del intestino delgado, en el que la composicion tiene una osmolaridad total de 230 mosm a 280 mosm, o cualquier valor entre los mismos (preferentemente aproximadamente 250 mosm a 260 mosm), en el que la composicion tiene un pH de aproximadamente 7,1 a 7,9, o cualquier valor entre los mismos (preferentemente aproximadamente 7,4), y en el que la composicion se formula para la administration enteral.
Por ejemplo, los ingredientes estan seleccionados de aminoacidos libres, dipeptidos, monosacaridos, disacaridos, o una combination de los mismos, y opcionalmente, electrolitos, vitaminas, aromatizantes y/o vehlculos.
Por ejemplo, la invencion objeto describe procedimientos de cribado de nutrientes o electrolitos para inclusion en la composicion terapeutica objeto, seleccionando nutrientes o electrolitos que retienen o adquieren la capacidad de absorcion despues de la destruction de las celulas epiteliales del intestino delgado en las regiones de las vellosidades y de la cripta.
Los procedimientos objeto de cribado pueden usarse para determinar nutrientes y/o electrolitos terapeuticos que pueden usarse en el tratamiento o la mejora de enfermedades o afecciones asociadas a la perdida, destruccion o reduction de celulas epiteliales del intestino delgado, particularmente la perdida, destruccion o reduction de celulas de las vellosidades, enterocitos y/o celulas progenitoras intestinales. Por ejemplo, los procedimientos pueden usarse para disenar composiciones y procedimientos para satisfacer las necesidades de un paciente especlfico o grupo de pacientes. En una realization especlfica, la composicion objeto es util para el tratamiento o la mejora de lesion al intestino delgado despues de radiation, quimioterapia, terapia de protones, o debido a inflamacion aguda o cronica en el intestino delgado.
Por ejemplo, el procedimiento objeto de cribado comprende:
a) Poner en contacto tejido epitelial del intestino delgado que tiene lesion en la mucosa con un nutriente o electrolito candidato;
b) determinar un nivel de capacidad del tejido epitelial del intestino delgado para absorber dicho nutriente o electrolito;
c) comparar dicho nivel con un nivel predeterminado (tal como en tejidos normales); y
d) seleccionar el nutriente o electrolito candidato si la capacidad de absorcion del nutriente o electrolito candidato es al menos, por ejemplo, el 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o el 90 % del nivel predeterminado.
Por ejemplo, el procedimiento objeto de cribado comprende:
a) administrar, a traves de una via enteral, un nutriente o electrolito candidato a un sujeto con lesion a la mucosa del intestino delgado;
b) determinar un nivel de capacidad de absorcion intestinal de dicho nutriente o electrolito;
c) comparar dicho nivel con un nivel predeterminado (tal como en sujetos normales); y
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d) seleccionar el nutriente o electrolito candidato si el nivel de absorcion del nutriente o electrolito candidato es al menos, por ejemplo, el 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o el 90 % del nivel predeterminado.
El nivel de la capacidad de absorcion puede determinarse basandose en una combination de Indices que incluyen, por ejemplo, Km, Vmax e Isc.
El valor de referencia predeterminado puede ser establecido por un experto en la tecnica. Por ejemplo, el valor de referencia predeterminado puede ser establecido midiendo los niveles de la capacidad de absorcion de dicho nutriente o electrolito en los tejidos epiteliales normales del intestino delgado que no tienen lesion a la mucosa (tales como celulas de las vellosidades, celulas de la cripta, enterocitos y celulas progenitoras intestinales). Como otro ejemplo, el valor de referencia predeterminado puede ser establecido midiendo los niveles de la capacidad de absorcion intestinal de dicho nutriente o electrolito en una poblacion normal que no tiene lesion a las celulas epiteliales del intestino delgado (tales como celulas de las vellosidades, celulas de la cripta, enterocitos y celulas progenitoras intestinales).
Por ejemplo, el procedimiento objeto de cribado comprende:
a) determinar la funcion del tejido del intestino delgado que tiene lesion en la mucosa;
b) poner en contacto el nutriente o electrolito candidato con el tejido del intestino delgado;
c) determinar la funcion del tejido del intestino delgado despues de que el tejido del intestino delgado se ponga en contacto con el nutriente o electrolito candidato; y
d) seleccionar el nutriente o electrolito candidato si dicho nutriente o electrolito candidato mejora la funcion del intestino delgado.
En otra realization, el procedimiento objeto de cribado comprende:
a) determinar la funcion del intestino delgado de un sujeto con lesion a la mucosa del intestino delgado;
b) administrar, a traves de una via enteral, un nutriente o electrolito candidato al sujeto;
c) determinar la funcion de intestino delgado del sujeto despues de que se administre el nutriente candidato; y
d) seleccionar el nutriente o electrolito candidato si dicho nutriente o electrolito candidato mejora la funcion del intestino delgado.
Por ejemplo, la funcion del intestino delgado mejora si la administration del nutriente o electrolito candidato disminuye la permeabilidad paracelular, potencia la funcion de barrera del intestino delgado. Por tanto, la funcion del intestino delgado mejora si la administracion enteral del nutriente o electrolito candidato previene o trata la diarrea, y/o prolonga la supervivencia.
Por ejemplo, el nutriente y electrolito que mejora la funcion del intestino delgado de un sujeto con lesion a la mucosa del intestino delgado pueden seleccionarse usando los procedimientos que se ilustran en los ejemplos, especlficamente, los Ejemplos 15-17.
Electrolitos candidato adecuados incluyen, por ejemplo, Na+, K+, HCO3-, Cl-, Mg2+, Ca2+, Fe2+ y/o Zn2+.
Nutrientes candidato adecuados incluyen aminoacidos esenciales y no esenciales seleccionados de, por ejemplo, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano, valina, histidina, tirosina, selenocistelna, alanina, arginina, aspartato, cistelna, glicina, prolina, serina, asparagina y pirrolisina. Los nutrientes candidato adecuados tambien pueden incluir acidos grasos, sacaridos (por ejemplo, monosacaridos, di-sacaridos y oligosacaridos), electrolitos y vitaminas.
Los nutrientes candidato tambien pueden incluir aminoacidos no naturales, tales como, por ejemplo, ornitina, citrulina, hidroxiprolina, homoserina, fenilglicina, taurina, yodotirosina, acido 2,4-diaminobutlrico, acido a- aminoisobutlrico, acido 4-aminobutlrico, acido 2-aminobutlrico, acido Y-aminobutlrico, acido £-aminohexanoico, acido 6-aminohexanoico, acido 2-aminoisobutlrico, acido 3-aminopropionico, norleucina, norvalina, sarcosina, homocitrulina, acido cisteico, T-butilglicina, T-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina y p-alanina.
Por ejemplo, la selection de nutrientes y electrolitos tambien depende de, al menos en parte, las dosis de IR recibidas por el sujeto, fuentes de radiation, la parte del cuerpo que es irradiada, y/o el tiempo que ha transcurrido despues de la radiacion; el tipo de agentes quimioterapeuticos, la dosis, y/o el tiempo que ha transcurrido despues de la quimioterapia; y las dosis de terapia de protones recibida por el sujeto, y/o el tiempo que ha transcurrido despues de la terapia de protones.
Los ensayos de cribado objeto pueden realizarse utilizando una combinacion de tecnicas bien conocidas en la tecnica, que incluyen, pero no se limitan a, estudios de camara de Ussing, citologla, inmunohistoqulmica, transferencias Western, enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA), reaction en cadena de la polimerasa (PCR), experimentos de flujo de iones, inmunoprecipitacion, inmunofluorescencia, radioinmunoensayo e inmunocitoqulmica.
Especlficamente, los ingredientes pueden elegirse basandose en su capacidad para ser absorbidos por la mucosa del intestino delgado del paciente, como se ha determinado por preparaciones de intestino in situ o aisladas, usando
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tecnologlas tales como las camaras de Ussing para medir la capacidad de absorcion del intestino delgado para tal ingrediente.
Formulaciones y administracion
La invencion objeto describe composiciones terapeuticas o farmaceuticas que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de la composition objeto y, opcionalmente, un vehlculo farmaceuticamente aceptable. Tales vehlculos farmaceuticos pueden ser llquidos esteriles, tales como agua. La composicion terapeutica tambien puede comprender excipientes, adyuvantes, aromatizantes, etc., que no afectan la salud o funcion del epitelio del intestino delgado lesionado, particularmente en la region de las vellosidades y el borde en cepillo. En una realization, la composicion terapeutica y todos los ingredientes contenidos en la misma son esteriles.
El termino “soporte” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehlculo con el que se administra el compuesto. Ejemplos de vehlculos farmaceuticos adecuados se describen en “Remington's Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin. Tales composiciones contienen una cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion terapeutica, junto con una cantidad adecuada de vehlculo de manera que se proporcione la forma para la administracion apropiada al paciente. La formulation debe adaptarse al modo enteral de administracion.
La invencion tambien describe un paquete o kit farmaceutico que comprende uno o mas recipientes llenos de uno o mas de los ingredientes, por ejemplo, compuesto, vehlculo, o las composiciones farmaceuticas de la invencion.
Por ejemplo, el paquete o kit farmaceutico comprende ademas instrucciones para la administracion, por ejemplo, con respecto a dosis terapeuticas eficaces, y/o el momento de la administracion con referencia a, por ejemplo, el tiempo transcurrido desde la exposition a la radiation, quimioterapia o terapia de protones. En una realizacion, la dosis terapeutica de la composicion se determina basandose en el grado de lesion a la mucosa del intestino delgado. Por ejemplo, con respecto a los sujetos que reciben, o estan a punto de recibir radiacion, la dosis terapeutica de la composicion se determina basandose en las fuentes de radiacion, la parte del cuerpo que se irradia, y/o el tiempo que ha transcurrido despues de la radiacion. Con respecto a sujetos que reciben, o estan a punto de recibir quimioterapia, la dosis terapeutica de la composicion se determina basandose en el tipo de agentes quimioterapeuticos, la dosis de agente quimioterapeutico y/o el tiempo que ha transcurrido despues de la quimioterapia. Con respecto a los sujetos que reciben, o estan a punto de recibir terapia de protones, la dosis terapeutica de la composicion se determina basandose en la dosis de terapia de protones recibida por el sujeto, y/o el tiempo que ha transcurrido despues de la terapia de protones.
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
Animates experimentales
Para estudiar la secretion de HCO3' activo, ratones BALB/c macho de 8 semanas de edad, no irradiados e irradiados, se obtuvieron del Instituto Nacional del Cancer. Los ratones se dividieron al azar en grupos, y se irradiaron los abdomenes segun el modelo del slndrome agudo gastrointestinal por radiacion (SAR GI) con un Shepherd Mark-I, usando una fuente de 137Cs que suministra irradiation y a 1,84 Gy/min. La radiacion se administro como una fraction unica. El modelo de SAR GI lograra dano maximo por radiacion a tejidos intestinales, e imitara la lesion intestinal durante la radioterapia de tumores pelvicos o abdominales.
Se examinaron los cambios en la corriente de cortocircuito (/sc), tanto en funcion del tiempo despues de la radiacion como con dosis crecientes de radiacion, para determinar el momento mas pronto y la dosis de radiacion minima requerida para producir cambios significativos en lsc. Estos estudios fueron aprobados por el Comite de Cuidado y Uso Animal de la Universidad de Rochester.
Estudios de flujo de iones
Despues del desangramiento, se obtuvo el segmento yeyunal excluyendo los 12 cm distales del intestino delgado adyacentes al ciego. Este segmento se lavo y se limpio en solution de Ringer fria en hielo antes de que la mucosa se desprendiera de las capas musculares subyacentes (Zhang, Ameen y col., 2007). La mucosa se monto entre las 2 mitades de una camara de Ussing tipo Lucite con un area de 0,30 cm2 (P2304, Physiologic instruments, San Diego, CA 92128, EE.UU.), y se registraron los parametros electricos usando un dispositivo de pinza de voltaje/corriente (VCC MC-8, Physiologic instruments, San Diego, CA 92128 EE.UU.) (Vidyasagar y col., 2005; Vidyasagar y col., 2004; Zhang y col., 2007; Vidyasagar y Ramakrishna 2002). Se banaron bilateralmente las preparaciones intestinales en solucion regular de Ringer (Tabla 1), que contenia 8 mM de glutamina y gaseada con una mezcla de 95 % de oxigeno (O2) y 5 % de bioxido de carbono (CO2).
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Tabla 1. Composiciones de las soluciones
Composicion ionica
Ringer regular Libre de HCOa' Solucion libre de Na+ Solucion libre de Cl" Libre de HCO3- (UB) Libre de HCO3- y Cl- (UB)
Na+
140 140 - 140 140 140
Cl-
119,8 119,8 119,8 - 119,8 -
K+
5,2 5,2 5,2 5,2 5,2 5,2
HCOa-
25 - 25 25 - -
HPO4-
2,4 2,4 2,4 2,4 - -
H2PO4-
0,4 0,4 0,4 0,4 - -
Ca2+
1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2
Mg2+
1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2
SO42-
- - - 1,2 2,4 2,4
Gluconato
- - - - - -
Ciclamida
- - - 1,2 0,4 5,2
Isetionato
- 25 - 115 25 140
NMDG
- - 140 - - -
HEPES
- - - - 0,1 0,1
Nota: Los valores estan en mM. Se usaron soluciones ionicas para experimentos de sustitucion de ion. El pH de todas las soluciones estuvo a 7,4. Se uso H2SO4 para ajustar el pH a 7,4 en solucion libre de Cl- y en todas las otras se uso HCI.
Abreviaturas: UB, solucion sin tampon.
Medicion de movimiento de HCO3-
Se uso Bi-burette TIM 856 (Radiometer Analytical SAS, Villeurbanne, Francia) fue utilizada para medir la secrecion de HCO3- en hojas yeyunales desprendidas (Vidyasagar y col., 2005; Vidyasagar y col., 2004; Zhang y col., 2007). Bombas automaticas mantuvieron un pH constante para la solucion luminal por la adicion de 0,01 gl de acido sulfurico 0,025 M (H2SO4). Se establecio la calibracion de pH estandar con respecto a stat anadiendo una cantidad conocida de H2SO4 a una solucion de tampon debil, que contiene una concentration creciente de HCO3- para producir una curva de valoracion lineal.
Se expusieron tejidos yeyunales a una solucion tamponada en el lado del bano (lado serosal), mientras que el lado luminal se expuso a una solucion libre de HCO3- de bajo tamponamiento (tampon HEPES 0,1 mM (acido 4-(2- hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonico), pH 7,4). La secrecion de HCO3- fue equivalente a la cantidad de acido anadido a la solucion luminal para mantener el pH a 7,4 (o el pH stat). Todos los experimentos se realizaron bajo condiciones de pinza de voltaje. Se gaseo la solucion libre de HCO3" con 100 % de O2 y la solucion que contenla HCO3" se gaseo con 95 % de O2 y 5 % de CO2. La secrecion de HCO3" se expreso como geq ■ h-1 ■ cm-2 (Vidyasagar y col., 2005; Vidyasagar y col., 2004; Zhang y col., 2007).
Despues de que se montara el tejido, las secreciones de HCO3" estuvieron inicialmente presentes en ausencia de HCO3" del bano, pero cayeron rapidamente hacia 0 en el plazo de 20-30 minutos. Si no estuvo presente HCO3" del bano durante la valoracion, la secrecion de HCO3" permanecio proxima a 0. La presencia de HCO3" en la solucion de bano produjo un rapido aumento en las secreciones de HCO3", que siguio constante durante al menos 2 horas (Vidyasagar y col., 2005; Vidyasagar y col., 2004; Zhang y col., 2007). Cuando se anadieron inhibidores a la solucion de la mucosa, se ajusto el pH y se dejo equilibrar durante 30 minutos, hasta que se observo una velocidad estacionaria de secrecion de HCO3". Cuando se anadio el inhibidor al lado del bano, el tejido tambien se equilibro durante 30 minutos para lograr una velocidad estacionaria de secrecion de HCO3" (vease la Tabla 3).
Todos los experimentos se realizaron durante el periodo de estado estacionario inicial de 1 hora. Se utilizo 1 tejido de cada animal para cada experimento; solo se estudio 1 condition experimental con cada muestra de tejido. Todos los experimentos se repitieron durante al menos 4 veces.
Inmunohistoqufmica
Se tineron por inmunofluorescencia rebanadas de tejido congeladas de ratones tanto no irradiados como irradiados usando un anticuerpo anti-NBCe1-A/B (Bevensee, Schmitt y col., 2000). NBCe1-A/B es un anticuerpo policlonal producido contra el extremo carboxi, comun a ambos cotransportadores de bicarbonato sodico (NBCe1-A y NBCe1- B). El procedimiento de inmunotincion se hizo el dla 6 despues de la irradiation. Se lavaron tejidos aislados en solucion regular de Ringer frla en hielo, se incorporaron en medio de incorporation de secciones congeladas y se pusieron en nitrogeno llquido; se hicieron secciones de 6 gm en criotomo.
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Estudios de transferencia Western
Se prepararon lisados yeyunales a partir de raspados de mucosa de ratones no irradiados e irradiados. Los tejidos se analizaron para NKCC1 (Santa Cruz CA, EE.UU.), NBCe1-A/B (Mark Daniel Parker, Case Western Reserve University Medical School, Cleveland, OH) y expresion de la protelna del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qulstica (CFTR) (Santa Cruz CA, USA) por transferencias Western (Bevensee y col. 2000).
Se lisaron los raspados de mucosa en un tampon de triacilglicerol hidrolasa que contenla HEPES 25 mM; 10 % de glicerol; y 1 % de Triton X-100 (p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil eter de polietilenglicol) que contenla una mezcla de inhibidor de proteasa (yodoacetamida 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y 2 pg.ml-1 de leupeptina) a pH 7,4 (Todas las sustancias qulmicas se obtuvieron de Sigma-Aldrich Co., EE.UU., a menos que se establezca de otro modo). La concentracion de protelna se determino usando el ensayo de Bradford. Se analizaron cargas equivalentes de protelnas de muestras irradiadas y no irradiadas usando electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio- poliacrilamida (SDS-PAGE). Se detectaron las protelnas NKCC1, NBCe1-A/B y CFTR usando anticuerpos policlonales de afinidad purificada.
Estadfstica
Los resultados se presentan como media ± error estandar de la media. El analisis estadlstico se realizo en 2 etapas: 1) se probo la diferencia general usando analisis de la varianza (ANOVA) (o su equivalente no parametrico Kruskal- Wallis); y 2) se calcularon valores de P ajustados por Bonferroni para todas las comparaciones por pares.
Ejemplos
Lo siguiente son ejemplos que ilustran los procedimientos para la practica de la invencion. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de disolventes son en volumen, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1 - LA IRRADIACION AUMENTA LA SECRECION NETA DE ANION
Este ejemplo muestra que la irradiacion aumenta la secrecion neta de anion, y causa mayor perdida de celulas epiteliales de las vellosidades en comparacion con celulas de la cripta. Especlficamente, se obtuvieron tejidos epiteliales del intestino delgado de ratones que recibieron irradiacion de 12 Gy y se examino la secrecion del anion usando estudios de camara de Ussing. Se midio la Isc transepitelial, un indicador de la secrecion del anion, en el dla 1, 2, 3 y 4.
Como se muestra en la Figura 1A, el maximo aumento en el lsc transepitelial se observo 48 h despues de la irradiacion, en comparacion con tejidos no expuestos a IR y los tejidos expuestos a IR 24 y 72 h despues de la irradiacion (Fig. 1A). Este aumento significativo en Isc al final de las 48 h indica que la irradiacion interrumpe el equilibrio fino entre la absorcion y la secrecion. En comparacion, Isc registrada al final de las 48 h y 72 h es inferior al de tejidos de ratones no IR.
Las secciones de histopatologla tambien mostraron una perdida mas grande de las celulas epiteliales de las vellosidades en comparacion con las celulas de la cripta debido a la irradiacion. Mientras que las secciones de histopatologla tomadas antes de 48 h mostraran dano mlnimo a las vellosidades y poco o ningun dano a las celulas de la cripta, las secciones de histopatologla tomadas en el dla 3 y 4 mostraron un amplio dano en las celulas de la cripta y de las vellosidades. Particularmente, las celulas de las vellosidades casi se agotaron completamente despues del dla 3. Tambien se observo perdida de celulas de la cripta, como se demuestra por un fallo para estimular la secrecion de anion en respuesta a un estlmulo secretor a las 72 y 96 h despues de IR (Fig. 1A). A altas dosis de IR, hay celulas madre de la cripta insuficientes, que maduran y se diferencian para formar celulas epiteliales de las vellosidades.
La Figura 1B muestra que la irradiacion aumento la conductancia transepitelial (Fig. 1B). La conductancia transepitelial (S), un compuesto de la conductancia transcelular y paracelular, se midio por experimentos de camara de Ussing.
Basandose en la ley de Ohm 1/S = R, el aumento en la conductancia transepitelial indica una reduccion en la resistencia transepitelial (TER o R). El intestino delgado de ratones tiene baja resistencia epitelial. La resistencia electrica de la via paracelular es mucho mas baja que la resistencia transcelular65-67. La via paracelular y la via transcelular estan en paralelo como se muestra por 1/TER=(1/Rtranscelular)+(1/Rparacelular); por lo tanto, la TER medida refleja en gran medida la resistencia paracelular.
Ejemplo 2 - LA IRRADIACION CAUSA UN AUMENTO DEPENDIENTE DE LA DOSIS EN LA CORRIENTE DE CORTOCIRCUITO (/sc)
Este ejemplo revela que la irradiacion causa un aumento dependiente de la dosis en la corriente de cortocircuito, que indica un aumento en la secrecion de anion electrogenica. Brevemente, los ratones que recibieron 0, 1, 3, 5, 7, 9 o
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12 Gy de irradiacion se sacrificaron en el dla 4. La Figura 2 mostro aumento significativo en Isc en tejidos de ratones irradiados a 3, 5 y 7 Gy, en comparacion con el de aquellos irradiados a 0 y 1 Gy (*p< 0,001). En comparacion con los ratones irradiados a 3, 5 y 7 Gy, se observo una disminucion de lsc en tejidos de ratones irradiados a 9 y 12 Gy (**p< 0,01, Fig. 2). La irradiacion a entre 1 y 3 Gy produjo el aumento mas alto en Isc y cambios histopatologicos mlnimos.
Ademas, la irradiacion causa cambios en lsc con el tiempo. De los ratones sacrificados en los dlas 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7, el aumento mas alto en Isc se observo en el dla 5 y 6 despues de IR (Fig. 3A). Para determinar el maximo aumento en Isc en funcion del tiempo, los ratones se irradiaron a 3 Gy y se sacrificaron en los dlas 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 y 14 para registrar los parametros electricos. Kruskal-Wallis (P < 0,001). El analisis a posteriori mostro el maximo aumento en Isc en el dla 6 despues de la irradiacion.
Como se muestra en la Figura 3A, Isc registrada en los dlas 1 y 2 despues de la irradiacion mostro pocas diferencias estadlsticas. Sin embargo, Isc registrada en el tiempo >2 dlas despues de la irradiacion mostro diferencias significativas cuando se compara con el dla 0 (*P < 0,01). Entre Isc registrada en los dlas 4, 5, 6 y 7, se observo poca diferencia significativa. Isc registrada en los dlas 9 y 10 despues de la irradiacion tampoco fue significativamente diferente de la registrada en el dla 7 despues de la irradiacion (**P = ns). Aunque Isc mostro una disminucion significativa mas alla del dla 6, continuo estando en un nivel elevado en el dla 14 e incluso 2 anos despues de la irradiacion en ratones que recibieron IR a 3 Gy (4,8 ± 0,5 peq.h-1.cm-2). La Figura 3A muestra que el aumento maximo en Isc ocurrio en el dla 6 en los ratones irradiados a 3 Gy.
El aumento observado en lsc despues de la irradiacion se debe en gran medida a un aumento neto en la secrecion de anion electrogenica. Hay tres posibles mecanismos para el aumento de Isc: 1) aumento de la secrecion de anion electrogenica (por ejemplo, Cl- y/o HCO3-); 2) aumento de la absorcion de Na+ electrogenica; o 3) aumento de la absorcion de K+ electrogenica. Es poco probable que la irradiacion cause un aumento de proceso de absorcion de Na+ electrogenica en el intestino delgado de raton. Ademas, como la irradiacion causa diarrea, que produce perdida de K+ y no absorcion de K+, el aumento en Isc no puede ser debido al aumento de la absorcion de K+.
Ejemplo 3 - DISMINUCION EN LA ABSORCION DE Na+ Y Cl-
Este ejemplo muestra que la irradiacion disminuye la absorcion de Na+ y Cl-. Como se muestra en la Tabla 2, los estudios de flujo en la camara de Ussing usando sustitucion de 22Na revelaron que hay una absorcion neta de Na+ en ratones no IR (0 Gy) (Tabla 2), a medida que el flujo mucosal a serosal (Jms) supera al flujo de serosa a mucosa (Jsm). La irradiacion disminuye Jms de una manera dependiente de la dosis, y produce una disminucion de la absorcion neta de Na+ (JNetoNa). Jsm supera por mucho Jms a dosis de 7 y 9 Gy, causando secrecion neta. Ademas, muestras de heces de ratones se volvieron sueltas o mal formadas a dosis altas de irradiacion, evidenciando ademas la disminucion de la absorcion y el aumento de la secrecion de electrolitos. Similarmente, la absorcion neta de Cl- tambien disminuyo a medida que aumento la dosis de IR. Se observo secrecion neta de Cl- a 9 Gy. La disminucion en la absorcion de Cl- fue debida a la disminucion en JmsCl-.
Tabla 2 Flujo unidireccional y neto de Na+ y Cl- (JNeto = Jms-Jsm)
Flujo de Na
IR
Gy
Jms Jsm Jneto
0
16,4 ± 0,9 7,1 ± 0,8 9,8 ± 0,8
1
15,6 ± 1 7,1 ± 1,1 8,6 ± 0,9
3
6,8 ± 0,7 3,5 ± 0,3 2,6 ± 0,5
5
5,2 ± 0,6 4,8 ± 0,4 0,4 ± 0,2
7
4,8 ± 0,4 5,4 ± 0,4 -0,6 ± 0,3
9
4,3 ± 0,7 4,7 ± 0,6 -0,4 ± 0,2
Flujo de Cl
IR
Gy
Jms Jsm Jneto
0
17,3 ± 1,1 7,1 ± 0,6 10,2 ± 0,8
1
12,8 ± 0,9 7,6 ± 1,3 5,2 ± 0,9
3
16,8 ± 0,7 9,3 ± 0,8 7,5 ± 0,8
5
14,2 ± 1,2 10,3 ± 0,9 3,9 ± 0,7
7
7,1 ± 0,5 6,9 ± 0,3 0,3 ± 0,2
9
-9,2 ± 0,8 0,1 ± 0,1 -9,3 ± 0,9
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Ejemplo 4 - LA IRRADIACION CAUSA PERMEABILIDAD PARACELULAR ELEVADA
Este ejemplo muestra que la irradiacion produce la perdida de mucosa del revestimiento del intestino delgado, conduciendo a funcion alterada de la barrera del intestino delgado. Este aumento de la permeabilidad del intestino delgado da a las bacterias comensales intestinales, peptidos y toxinas acceso mas facil a los compartimentos sistemicos, causando as! la endotoxemia. Como se muestra en la Figura 4A, la irradiacion aumenta los niveles de endotoxina en plasma como se mide por el kit de lisado de amebocito de Tachypleus.
La irradiacion tambien aumento la permeabilidad de Cl- y Na+ (PCl/PNa), como se indica por los cambios del potencial de dilucion determinado en estudios de la camara de Ussing. El uso del potencial de dilucion como el indicador de la permeabilidad de membrana se basa en los siguientes principios. Especlficamente, una membrana semipermeable intacta, tal como la mucosa del intestino delgado, mantiene el gradiente del potencial electroqulmico artificialmente generado por bano de las soluciones del lado mucosal y serosal con fuerza ionica diferente. Una membrana permeable que permite la facil difusion a traves de la membrana, sin embargo, tiene un potencial electroqulmico de membrana disminuido. Asl, cuanto mas alta sea la permeabilidad a traves de la membrana, mas bajo es el gradiente de potencial. Una membrana libremente permeable tiene una permeabilidad relativa de Cl- y Na+ (PCl/PNa) a 1, que indica una perdida completa de selectividad.
En ratones no IR, se conserva la selectividad de la membrana y el Na+ es mas permeable que el Cl- a traves de la membrana. La irradiacion disminuyo el potencial de dilucion de la membrana. Particularmente, el Na+ y el Cl- se volvieron igual de permeables a traves de la membrana a 7 Gy, que indica una perdida significativa de selectividad (Fig. 4B). El aumento en la permeabilidad de electrolito debido a irradiacion esta de acuerdo con el aumento en los niveles de endotoxina en plasma mostrados en la Fig. 4A. Puede usarse la monitorizacion de los cambios en la permeabilidad de membrana como herramienta sensible para monitorizar la mejora en la funcion de la barrera de la mucosa por la dieta de radiacion oral objeto.
Ejemplo 5 - AUMENTO EN LOS NIVELES DE MEDIADORES INFLAMATORIOS DEBIDO A IRRADIACION
Se midieron los niveles de mediadores inflamatorios en ratones expuestos a IR y no expuestos a IR usando tecnicas de matrices de perlas LUMINEX multiplex. Como se muestra en la Figura 5, la irradiacion aumento la produccion de IL1-P, TNF-a y MIP-a (Fig. 5).
Ejemplo 6 - LA DISMINUCION EN LA SECRECION DE ANION DEBIDO A LA IRRADIACION ES DEPENDIENTE DE NKCC1 Y DEPENDIENTE DE CFTR
Este ejemplo muestra que la secrecion de anion bajo irradiacion es dependiente de NKCC1 y dependiente de CFTR. Para determinar la contribucion de NKCC1 a lsc, basal, se anadio bumetanida 100 pM (Sigma-Aldrich Co., EE.UU.) a la solucion de bano. La Figura 3C mostro una corriente inhibitoria de bumetanida en tejidos irradiados (5,5 ± 0,5 peq.h-1.cm-2 frente a 0,6 ± 0,1 peq.h-1.cm-2), pero no en ratones a 0 Gy (1,6 ± 0,2 peq.h-1.cm-2 frente a 0,9 ± 0,1 peq.h-1.cm-2). Ademas, la estimulacion con AMPc causo un aumento en Isc en tanto ratones irradiados a 0 Gy (1,6 ± 0,2 peq.h-1.cm-2 frente a 6,9 ± 0,6 peq.h-1.cm-2, P < 0,001) como a 3 Gy (5,5 ± 0,5 peq.h-1.cm-2 frente a 7,3 ± 0,5 (peq.h-1cm-2, P < 0,05).
Ademas, la lsc estimulada con forskolina (Sigma-Aldrich Co., EE.UU.) se redujo por bumetanida en 3 Gy (7,3 ± 0,5 peq.h-1.cm-2 frente a 0,4 ± 0,1 peq.h-1.cm-2), pero no en 0 Gy (6,9 ± 0,6 peq.h-1.cm-2 frente a 1,3 ± 0,2 peq.h-1.cm-2). Esto indica mayor secrecion de anion independiente de NKCC1 sin irradiacion (P < 0,05).
Los resultados tambien mostraron que la secrecion de anion bajo irradiacion es dependiente de CFTR. Para determinar si la porcion insensible a bumetanida de Isc ocurre a traves de un canal de anion de membrana apical, se aplicaron un bloqueante de canales de aniones no especlfico, acido 5-nitro-2-(3-fenilpropilamino)-benzoico (Sigma- Aldrich Co., EE.UU.) (NPPB 10 pM) y un bloqueante del regulador de la conductancia transmembrana especifico de fibrosis qulstica (CFTR) (glibenclamida 100 pM, Sigma-Aldrich Co., EE.UU.). Se suprimio la lsc insensible a bumetanida en ratones a 0 Gy por la adicion a la mucosa de un bloqueante de canales de aniones no especlfico (NPPB) (0,1 ± 0,01 peq.h-1.cm-2) y glibenclamida (0,1 ± 0,01 peq.h-1.cm-2). Esto indica que la secrecion de anion ocurre a traves de un canal de anion o CFTR (Fig. 3B).
Ejemplo 7 - DISMINUCION EN LA SECRECION DE HCO3- DEBIDO A IRRADIACION
La diarrea infecciosa, tal como el colera, produce la perdida de llquido rico en HCO3- en heces y conduce a acidosis metabolica. Este ejemplo muestra que, a diferencia de la diarrea infecciosa, la IR indujo un aumento de la secrecion de Cl- y disminucion de la secrecion de HCO3-.
Para determinar la contribucion de Cl- a la secrecion neta de anion, se empleo un bloqueante para la captacion de Cl- en la celula (bloqueante del cotransporte de Na-K-2Cl). La adicion de bumetanida 10 pM suprimio casi toda la Isc asociada a IR, sugiriendo que la secrecion de anion inducida por IR es principalmente debido al aumento de la secrecion de Cl- y tal aumento es dependiente de NKCC1 (Fig. 3A-C).
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Los experimentos de pH stat confirmaron que la IR redujo la secrecion de HCO3' (Tabla 3). La secrecion de HCO3' se suprimio cuando el Na+ en la solucion de bano serosal (bano) se sustituyo con un cation impermeable NMDG, que indica que el transporte de HCO3' en la celula en la membrana basolateral es dependiente del Na+ del bano. Se repitieron experimentos similares en ratones a 5 Gy, dla 6 despues de IR. En presencia de Na+ del bano, la secrecion de HCO3' fue significativamente mas baja.
Se realizo la tincion de inmunofluorescencia de rebanadas de tejidos congelados obtenidos de tanto ratones IR como no IR usando anticuerpos NBCe1a/b (Figs. 6B-E). La tincion especlfica de anticuerpos NBCe1a/b mostro que NBCe1a/b se expreso en las celulas epiteliales de las vellosidades, pero no en las celulas de la cripta. La inmunotincion de tejidos de ratones IR mostro que los anticuerpos NBCe1a/b no fueron reconocidos ni en las vellosidades ni en la cripta. Los tejidos de ratones irradiados con 3 Gy (IR) dejaron de expresar el patron de tincion especlfico de NBCe1-A/B tanto en las vellosidades como en la cripta. La disminucion de la funcion secretora de HCO3- a altas dosis de IR es debido a la perdida de celulas epiteliales de las vellosidades. El monitorizar los cambios en la secrecion de Na+ y HCO3- puede ser una herramienta sensible para monitorizar la mejora de la funcion de barrera de la mucosa por la dieta de radiacion oral del sujeto.
La secrecion de HCO3- bajo irradiacion es independiente de NKCC
Para determinar si HCO3- contribuyo a la secrecion de anion, se realizaron experimentos en ausencia de Cl- del bano. Se considero que un aumento en Isc secundario a la irradiacion o estimulacion con forskolina era contribuido por HCO3-. Los resultados mostraron que la secrecion de HCO3- bajo irradiacion no es dependiente del Cl- del bano; por tanto, bajo irradiacion, la secrecion de HCO3- no implica al transportador de intercambio CL-HCO3 (AE1) en la membrana apical. En solucion libre de Cl-, la Isc basal (1,0 ± 0,2 peq.h-1.cm-2 frente a 0,3 ± 0,1 peq.h-1.cm-2; P = ns) y estimulada con forskolina (1,7 ± 0,2 peq.h-1.cm-2 frente a 0,3 ± 0,1 peq.h-1.cm-2; P < 0,001) fue mas baja en ratones irradiados con 3 Gy (Fig. 3D). La Isc estimulada con forskolina fue mas alta en 0 Gy que en 3 Gy (P < 0,001), que indica una disminucion en la secrecion de HCO3- debido a irradiacion.
Para determinar si NKCC1 medio en el movimiento de HCO3- bajo condiciones basales y estimuladas por forskolina, se anadio bumetanida al lado del bano de tejidos equilibrados en solucion libre de Cl- en ambos lados. Los resultados mostraron que la bumetanida no inhibio el aumento basal y estimulado por forskolina en Isc; esta ausencia de inhibicion indica un mecanismo independiente de NKCC1 para la captacion de HCO3- en la membrana basolateral.
La secrecion de HCO3- bajo irradiacion es independiente del Cl- de la luz
La medicion directa de la secrecion de HCO3- en ratones irradiados mostro la secrecion de HCO3- reducida en comparacion con ratones no irradiados (0,8 ± 0,2 peq.h-1.cm-2 frente a 6,7 ± 0,2 peq.h-1.cm-2). La secrecion de HCO3- en ratones irradiados no se altero por la eliminacion de Cl- de la luz (Tabla 3). La adicion a la mucosa de NPPB (0,2 ± 0,01 peq.h-1.cm-2) y glibenclamida (0,11 ± 0,1 peq.h-1.cm-2), pero no DIDS, termino la secrecion de HCO3- en ratones irradiados. Esto indica que la secrecion de HCO3- esta mediada por un canal de aniones (canal CFTR), no a traves del intercambio Cl--HCO3- (Fig. 19B).
En comparacion, la secrecion de HCO3- en ratones no irradiados es tanto dependiente del Cl- como independiente del Cl- de la luz. Mediciones electricas transepiteliales indicaron la secrecion de HCO3- electrogenica; sin embargo, esto no indica si la secrecion de HCO3- estaba mediada por canal y/o a traves de Cl--HCO3- electroneutro.
Se realizaron experimentos de pH stat en ausencia de Cl- de la luz para estudiar el intercambio Cl--HCO3- en ratones no irradiados. En una solucion libre de Cl- de la luz, las secreciones de HCO3- fueron mas bajas (4,5 ± 0,1 peq.h- 1.cm-2, P < 0,01). Esto indica que la secrecion de HCO3- basal en ratones no irradiados es parcialmente dependiente del Cl- y parcialmente independiente del Cl- de la luz (Tabla 3). La adicion de acido 4,4-diisotiociano-2,2'- estilbenodisulfonico (DIDS) 100 pM (Sigma-Aldrich Co., EE.UU.) inhibio parcialmente la secrecion de HCO3- (P < 0,001), y tal inhibicion fue similar a la observada con la eliminacion de Cl- de la luz.
Secrecion de HCO3- independiente de Cl- de la luz estimulada con forskolina
Para ratones a 0 Gy, la adicion de forskolina a la solucion de bano mostro aumentos significativos en la secrecion de HCO3- basal (P < 0,001) que no se altero por la eliminacion de Cl- de la luz (8,4 ± 0,4 peq.h-1.cm-2 frente a 8,7 ± 0,4 peq.h-1.cm-2; n = 6). NPPB suprimio la secrecion de HCO3- estimulada por forskolina (0,2 ± 0,01 peq.h-1.cm-2; n = 6); esto indico una funcion para un canal de aniones en secrecion de HCO3- estimulada por AMPc.
La secrecion de HCO3- estimulada por AMPc es independiente de NKCC1
Para determinar si la secrecion de HCO3- estimulada por AMPc requirio un canal CFTR apical, se anadio glibenclamida al lado luminal. La glibenclamida inhibio (0,1 ± 0,1 peq.h-1.cm-2) la secrecion de HCO3- (Tabla 3 y Fig. 19A), que indica que AMPc no solo inhibe el componente de intercambio Cl--HCO3- basal de la secrecion de HCO3- neta, sino que tambien induce una secrecion de HCO3- mediada por canal de aniones apical. La estimulacion con forskolina en ratones irradiados mostro poco aumento en comparacion con la secrecion de HCO3- basal (0,6 ± 0,2 peq.h-1.cm-2 frente a 0,78 ± 0,2 peq.h-1.cm-2). Esto tambien indica una secrecion de HCO3- independiente del Cl- de
la luz o la inhibicion del intercambio Cl--HCO3-.
Las mediciones electricas transepiteliales mostraron que la disminucion en el movimiento de HCO3 fue independiente de NKCC1. La secrecion de HCO3-, que fue minima en ratones irradiados bajo tanto condiciones basales como estimuladas con forskolina, no se vio afectada por la adicion de bumetanida (Tabla 3). Similarmente, 5 en ratones no irradiados, la bumetanida no altero la secrecion de HCO3- estimulada con forskolina, que indica que la secrecion de HCO3- estimulada con AMPc es independiente de NKCC1 (8,4 ± 0,4 peq.h-1.cm-2 frente a 8,6 ± 0,4 peq.h-1.cm-2) (Tabla 3 y Fig. 3B).
La secrecion de HCO3- es independiente del Cl- del bano
Los procesos de transporte que requieren el Cl- del bano para la captacion de HCO3- basolateral se muestran en la 10 Figura 3B. Los resultados mostraron que la bumetanida no altero la secrecion de HCO3- estimulada por AMPc. Esto indico que el transportador de intercambio de Cl--HCO3- (AE2) se inhibe bajo irradiacion. La eliminacion del Cl- del bano tambien puede inhibir NKCC1 y la captacion de HCO3- asociada a AE2 (Tabla 3). La eliminacion de Cl- de la solucion de bano no altero la secrecion de HCO3- (6,7 ± 0,3 peq.h-1.cm-2 frente a 7,1 ± 0,6 peq.h-1.cm-2).
La secrecion de HCO3- es dependiente del Na+ del bano
15 Los procesos de transporte para la entrada de HCO3- basolateral acoplado a Na+ se muestran en la Figura 3B. Las Figuras 3C y 3D indicaron que NKCC1 no afecta la secrecion de HCO3-. La adicion de 3-metilsulfonil-4- piperidinobenzollo, clorhidrato de guanidina (HOE694) 1 mM al lado del bano elimino la captacion de HCO3- a traves del NHE1 acoplado al intercambio Cl--HCO3-. Counillon, Scholz y col., (1993) tambien describieron que 3- metilsulfonil-4-piperidinobenzoilo, clorhidrato de guanidina (HOE694) 1 mM podrla inhibir el intercambio Na+-H+ 20 (NHE1).
HOE694 no inhibio la secrecion de HCO3- estimulada por AMPc (8,4 ± 0,4 peq.h-1.cm-2 frente a 7,2 ± 0,9 peq.h-1.cm- 2). La sustitucion del Na+ del bano con N-metil-D-glucamina (NMDG) suprimio la secrecion de HCO3- estimulada con forskolina (8,4 ± 0,4 peq.h-1cm-2 frente a 0,3 ± 0,01 peq.h-1.cm-2) en ratones no irradiados, que indica un cotransporte de HCO3- acoplado a Na+ (NBC) (Fig. 3E).
25 Tabla 3. Secrecion de HCO3' medida en el yeyuno de ratones no irradiados (0 Gy) e irradiados (3 Gy).
Solucion de la luz
Que contiene Cl- Libre de Cl- DIDS 100 pM Glibenclamida 100 pM
0 Gy
6,7 ± 0,3 4,5 ± 0,1* 4,4 ± 0,1* 0,5 ± 0,1
3 Gy
0,8 ± 0,2* 0,6 ± 0,1*ns 0,9 ± 0,2 *ns 0,1 ± 0,1ns
0 Gy + forskolina
8,4 ± 0,4 8,7 ±0,4 - 0,1 ± 0,1
3 Gy + forskolina
0,6 ± 0,2 0,9 ±0,2 - -
0 Gy + bumetanida
8,6 ± 0,4 8,4 ± 0,4 7,7 ± 0,4 0,5 ± 0,1
3 Gy + bumetanida
0,8 ± 0,14* 0,8 ± 0,1 ns 0,7 ± 0,12ns 0,2 ± 0,1ns
Nota: Los valores representan la media ± EEM n = 6 tejidos. *p < 0,001, comparacion entre el grupo de 0 Gy y 3 Gy. *p < 0,001 comparacion entre los grupos de presencia. En los experimentos de bumetanida en ratones no irradiados, los tejidos se trataron con forskolina 10 mM.
Abreviaturas: ns, sin significancia entre los grupos; acido 4,4-diisotiociano-2,2'-estilbenodisulfonico, DIDS
Para la secrecion de HCO3- activa en la membrana apical, existe la necesidad de su captacion basolateral. Cuatro mecanismos de intercambio conocidos directa o indirectamente implicados con el movimiento de HCO3- en la membrana basolateral son: 1) co-transporte de Na+-K+-2Cl- (Na+-K+-2HCO3-) como un posible transportador de 30 HCO3-; 2) la captacion de Cl- en la celula a traves de NKCC1 se recircula mediante el intercambio de Cl--HCO3-
basolateral (AE2), que produce la captacion de HCO3- neta en la membrana basolateral; 3) intercambio de Na+-H+ que extruye protones en el espacio intercelular, produciendo concentracion de HCO3- intracelular reducida, que entonces estimula el intercambio Cl--HCO3- electroneutro apical; y 4) co-transporte de HCO3- acoplado a Na+. Estos transportadores pueden funcionar como electroneutros o electrogenicos, dependiendo del numero de moleculas de 35 HCO3- transportadas por molecula de Na+ (Fig. 3B).
En ratones no irradiados, la captacion de HCO3- se produce mediante un cotransportador de HCO3- acoplado a Na+ (NBCe1-A/B) situado en la superficie basolateral. La salida apical se produce mediante un intercambio CL/HCO3- electroneutro que se acopla a un intercambio Na+-H+ y mediante CFTR (secrecion de anion electrogenica). Un aumento en el AMPc intracelular, logrado mediante la adicion de forskolina, produce elevada secrecion de Cl- y de 40 HCO3- con inhibicion simultanea de la absorcion de Na+ y Cl- electroneutro (intercambio Na+-H+ acoplado a
intercambio Cl--HCO3-). La captacion de Cl- se produce mediante NKCC1, y la captacion de HCO3- se produce mediante NBCe1-A/B; tanto el Cl- como el HCO3- salen mediante CFTR en la superficie apical.
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Segun la invencion objeto, se ha descubierto que la irradiacion inhibe la absorcion de Na+ y Cl' electroneutro. La irradiacion tambien inhibe NBCe1-A/B, y tal inhibicion produce la disminucion de la captacion de HCO3' en la membrana basolateral y finalmente su salida en la membrana apical. Asl, la irradiacion produce la secrecion de Cl- electrogenica con inhibicion selectiva de tanto la secrecion de HCO3- electroneutra como electrogenica (Fig. 19B).
La irradiacion causo un aumento en la expresion de la protelna NKCC-1 y una disminucion de la expresion de NBCe1-A/B en los tejidos epiteliales del intestino delgado. La irradiacion tambien inhibe el transportador de intercambio de Cl--HCO3- apical (AE1). La secrecion de HCO3- en la diarrea por radiacion es dependiente de Na+, pero independiente del Cl- de la luz e independiente de NKCC-1. El transporte de Cl- bajo irradiacion implica al transportador NKCC-1 basolateral, en lugar de un transportador de intercambio de Cl--HCO3- (AE1).
Como se muestra en la Figura 19B, la irradiacion tambien altera el transporte de electrolitos (tales como HCO3- y Cl-) en el tubo gastrointestinal. Los ratones irradiados presentaron principalmente secrecion de Cl-, y minima secrecion de HCO3-. Se propone que la minima secrecion de HCO3- debida a irradiacion se produce por la inhibicion de la absorcion de HCO3-. A diferencia, hay Cl- activo, ademas de la secrecion de HCO3- en la diarrea inducida por secretagogo.
Ejemplo 8 - LA IRRADIACION CAUSA ABSORCION DE GLUCOSA REDUCIDA
Este ejemplo muestra que en enteritis inducida por IR, hay una disminucion dependiente de la dosis en la absorcion de glucosa. Ademas, la presencia de glucosa no absorbida en la luz intestinal puede conducir a diarrea osmotica, deteriorando ademas las condiciones diarreicas asociadas a IR. La Figura 7A muestra que la irradiacion causa una disminucion dependiente de la dosis en Isc. La Figura 7B muestra que la irradiacion aumenta Km en el transporte de glucosa en una manera dependiente de la dosis.
SGLT1 es un transportador versatil. SGLT1 mantiene su funcion en la diarrea infecciosa, tal como el colera. Se ha usado la conservacion de la funcion de SGLT1 en la diarrea infecciosa en la terapia de rehidratacion oral para absorcion de Na+.
Para investigar la funcion de SGLT-1 y su efecto sobre la absorcion de glucosa despues de la irradiacion, se obtuvo mucosa de intestino delgado de ratones Swiss en el dia 6 despues de la exposicion IR a 0, 1, 3, 5 o 7 Gy. Se midio la corriente de cortocircuito estimulada por glucosa (Isc) en una camara de Ussing para estudiar la funcion de transporte de SGLT1. Se llevaron a cabo estudios de supervivencia en ratones TBI a 9 Gy y sub-TBI a 15,6.
Especificamente, se sometieron ratones Balb/c de 8 semanas de edad obtenidos de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) a irradiacion subtotal del cuerpo a 137Cs (sub-TBI) (se protegio una pata de la irradiacion) e irradiacion total del cuerpo (TBI).
En estudios de supervivencia de animales, se separaron ratones en 2 grupos: TBI de 9 Gy y sub-TBI de 15,6 Gy. Los ratones de control se trataron con solucion salina normal; otros se trataron con 5 % de glucosa. Se uso sonda nasogastrica durante el experimento, y los tratamientos se administraron en los primeros 5 dias despues de la irradiacion y cada dos dias hasta 10 dias despues de la irradiacion.
Se empleo una pinza de voltaje/corriente multicanal (Physiological Instruments, San Diego, CA) en el estudio de la camara de Ussing. Se banaron secciones yeyunales de ratones, que se usaron para el montaje, en solucion de Ringer regular modificada, y se gasearon con 95 % de O2 y 5 % de CO2 para medir la Isc de corto. Todos los ratones se sacrificaron 6 dias despues de la irradiacion.
Para investigar la cinetica de SGLT-1, la concentration de sustrato (glucosa) empezo a 0,05 mM y termino a 10 mM. La glucosa se anadio a una tasa a partir de 0,05 mM y progreso a 0,1 mM, 0,5 mM y 1 mM. Los resultados se analizaron con el software Origin 8 (OriginLab Corp., Northhampton, MA). La Isc se represento en el eje y, y la concentracion de glucosa se represento en el eje x. La curva se ajusto en la ecuacion de Hill.
Para preparar lisados de celulas completas yeyunales, se lisaron raspados de la mucosa de ratones normales e irradiados en tampon triacilglicerol hidrolasa que contenia HEPES 25 mM, 10 % de glicerol, 1 % de Triton X-100, y una mezcla de inhibidor de proteasa (yodoacetamida 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y 2 gg ml-1 de leupeptina, pH 7,4).
Para preparar lisados de vesiculas de membrana del borde en cepillo, se homogeneizaron raspados de la mucosa de ratones normales e irradiados en una solucion de Tris-HCl 2 mM (pH 7,1) / KCl 50 mM / PMSF 1 M. Las muestras se centrifugaron con una centrifuga a 8000 rpm y otra vez a 13.000 rpm, respectivamente, y entonces se homogeneizaron otra vez con una jeringa de turberculina (aguja 27G) y homogeneizador de TEFLON. Las muestras se centrifugaron entonces a 4.000 rpm y otra vez a 15.000 rpm. La muestra se resuspendio con una mezcla de inhibidor de la proteasa (yodoacetamida 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y 2 gg ml-1 de leupeptina, pH 7,4) que contenia la solucion de Ringer regular.
Se analizaron ambas concentraciones de proteina de los lisados de celulas completas yeyunales y vesiculas de membrana del borde en cepillo para proteina SGLT-1 por transferencias Western. Se analizaron cargas equivalentes
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de protelna de muestras irradiadas y de control por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE). Las protelnas se transfirieron sobre membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF), y se detectaron protelnas SGLT-1 usando anticuerpos policlonales purificados por afinidad.
Los resultados, como se muestra en las Figuras 8-14, demuestran que: 1) la irradiacion reduce la lsc estimulada por glucosa de una manera dependiente de la dosis; 2) los valores de Km para glucosa fueron (mM) 0,38 ± 0,04, 0,49 ± 0,06, 1,76 ± 0,16, 1,91 ± 0,3, 2,32 ± 0,4 en 0, 1, 3, 5 y 7 Gy, respectivamente; 3) los valores de Vmax para glucosa fueron 387,4 ± 16,2, 306,6 ± 16,4, 273,2 ± 14,9, 212,9 ± 9,14, 188,1 ± 9,12 en 0, 1, 3, 5 y 7 Gy, respectivamente; 4) los valores de Km y Vmax volvieron a los niveles normales aproximadamente 14 dlas despues de IR; 5) el retener la captacion de glucosa durante los primeros 10 dlas despues de la irradiacion aumento la supervivencia; 6) el analisis de transferencia Western de la membrana de borde en cepillo de SGLT-1 mostro elevados niveles de protelna SGLT-1 a medida que aumento la dosis de IR.
El aumento en Km de SGLT-1 indica una disminucion en la afinidad de SGLT-1 por la glucosa debido a la irradiacion. La disminucion en Vmax indica la perdida de celulas epiteliales de las vellosidades debido a la irradiacion, como tambien se demuestra por los examenes histopatologicos. El aumento en los niveles de protelna en tejidos de ratones tratados con IR, como se muestra en el analisis de transferencia Western, indica que los transportadores de SGLT1 se expresan pero no son funcionales.
Los resultados tambien demuestran que la alimentacion oral de glucosa produce malabsorcion de glucosa y electrolitos, que conduce a diarrea osmotica y, asl, aumenta la toxicidad Gl inducida por IR. A diferencia, el retener la glucosa de la alimentacion oral durante los primeros 14 dlas despues de IR previene o mitiga los slntomas de la diarrea y aumenta la supervivencia global.
Ejemplo 9 - LA IRRADIACION CAUSA TRANSPORTE DE GLUTAMINA REDUCIDO
Aunque la glutamina es un aminoacido no esencial, es el nutriente primario de los enterocitos, y esta presente en altas concentraciones en plasma (26 %) y en musculo esqueletico (75 %). Los niveles de glutamina disminuyen en el traumatismo posoperatorio, o pacientes crlticos a medida que aumenta la demanda del cuerpo para glutamina. Asl, la glutamina ha sido considerada como importante en el funcionamiento normal de los sistemas digestivo, renal, inmunitario y neuronal.
Este ejemplo muestra que la irradiacion causa una disminucion dependiente de la dosis en el transporte de glutamina en las celulas. A IR > 7 Gy, la glutamina llega a estar presente en gran parte en la luz intestinal, conduciendo asl a diarrea osmotica. La cinetica de saturacion del transportador de glutamina mostro un aumento dependiente de la dosis de IR en Km (Fig. 15), sugiriendo una disminucion de la afinidad de transportadores de glutamina por glutamina.
Ejemplo 10 - LA IRRADIACION CAUSA UN AUMENTO DEPENDIENTE DE LA DOSIS EN EL TRANSPORTE DE LISINA
La adicion de lisina al lado de la luz del intestino delgado causa un aumento en /sc, sugiriendo el transporte electrogenico de lisina (Fig. 16). Los tejidos de ratones no IR mostraron una Km de 1,16 ± 0,04 mM, mientras que los tejidos de 3 Gy de IR tuvieron una Km de 0,27 ± 0,01 mM. A diferencia de la glucosa y la glutamina, los resultados mostraron que la irradiacion aumento la afinidad del transportador de lisina por lisina, y asl aumento la absorcion de lisina.
Ejemplo 11 - EFECTO DE LA ALIMENTACION ORAL DE LISINA SOBRE LA SUPERVIVENCIA DE RATONES
Este ejemplo muestra que retener nutrientes no absorbidos de la alimentacion oral mientras se absorben selectivamente nutrientes de la alimentacion previene o mitiga la diarrea y aumenta la supervivencia despues de la irradiacion.
En la primera serie de experimentos, se administro por via oral glucosa (10 mM i/m durante 5 dlas y luego cada dla alterno) a ratones de IR. Los resultados muestran que la administracion de glucosa disminuyo la supervivencia global (Fig. 17B). En comparacion, se administro por via oral lisina (20 mg/ratones/dla) a ratones de IR durante 5 dlas y a partir de aqul cada dos dlas como lavado gastrico. Los ratones tratados con lisina mostraron un aumento de la supervivencia cuando se comparo con grupos de control (Fig. 17A). Asl, el reducir o limitar la ingesta oral de nutrientes no absorbidos tales como glucosa con un aumento de la ingesta oral de nutrientes absorbidos tales como lisina puede prolongar la supervivencia en pacientes irradiados.
Ejemplo 12 - CAMBIOS EN LOS NIVELES DE EXPRESION DE PROTEINA DE TRANSPORTE DE IONES DEBIDO A IRRADIACION
Este ejemplo ilustra cambios en los niveles de expresion de la protelna de transporte debido a irradiacion.
Especlficamente, se recogieron tejidos para transferencia Western en el dla 6 despues de la irradiacion. La transferencia Western de tejidos ileales, como se muestra en la Figura 18, revelo que la irradiacion de 1-5 Gy
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produjo elevados niveles de protelna NKCC1; mientras que tal aumento en la expresion de NKCC1 disminuyo en tejidos que recibieron 7 Gy de IR, en comparacion con tejidos que recibieron 1-5 Gy de IR (A).
Los niveles de protelna NBCe1-A/B disminuyeron apreciablemente despues de la irradiacion, incluso a una dosis de tan solo 1 Gy (B). Los niveles de protelna CFTR en tejidos de yeyuno aumentaron significativamente despues de 3 Gy de irradiacion, en comparacion con tejidos de yeyuno a 0 Gy (C). Los anticuerpos especlficos NBCe1-A/B mostraron elevados niveles de expresion en el yeyuno en comparacion con el duodeno, Ileon y colon en ratones no irradiados (D). Los tejidos de yeyuno tuvieron los niveles de protelna NBCe1-A/B mas altos, en comparacion con aquellos en duodeno, Ileon o colon (D). Los cambios en los niveles de protelna de transporte se corresponden con los cambios funcionales observados despues de IR. El patron de expresion de las protelnas de transporte despues de la irradiacion, en comparacion con el de tejidos no IR, puede usarse para monitorizar la eficacia de la dieta oral de radiacion.
Ejemplo 13 - CAMBIOS EN LA CAPACIDAD DE ABSORCION DE NUTRIENTES Y ELECTROLITOS EN RATONES CON LESION A LA MUCOSA DEL INTESTINO DELGADO
Se observa un patron similar de alteraciones en la capacidad de absorcion del intestino delgado en ratones C57BL/6 tratados con radiacion, quimioterapia, y que padecen inflamacion en el intestino delgado. El modelo de radiacion se construye como se describe en los Ejemplos 1-12.
En un modelo de quimioterapia, todos los ratones se inyectan con una dosis unica de 5-FU o cisplatino. En algunos ratones, tres dlas despues de la primera inyeccion, se inyecta una segunda dosis de 5-FU o cisplatino Despues de cada inyeccion, se mide la lsc transepitelial, un indicador de secrecion neta de anion, usando una camara de Ussing, en momentos de tiempo como se indica en la Figura 20. Para cada medicion, se examina un mlnimo de 32 tejidos.
Los resultados muestran que hay un aumento significativo en la secrecion neta de anion en el dla 3 en ratones inyectados con una dosis unica de cisplatino (Fig. 20B) o 5-FU (Fig. 20A). Por tanto, ratones inyectados con una segunda dosis del agente quimioterapeutico presentan un aumento significativamente mas alto en la secrecion neta de anion que la de ratones que reciben una dosis unica.
En un modelo de la enfermedad de Crohn, los ratones se inyectan con mAb anti-CD3 (modelo inflamatorio agudo para imitar las condiciones de la enfermedad de Crohn). Tambien hay un aumento significativo en la secrecion neta de anion (determinado basandose en la conductancia paracelular) y la permeabilidad paracelular del intestino delgado. Por tanto, se observan alteraciones en la capacidad de absorcion de nutrientes y electrolitos.
Las alteraciones de la capacidad de absorcion de nutrientes se determinan usando modelos de enfermedad con lesion a la mucosa del intestino delgado, es decir, el modelo de radiacion, modelo de quimioterapia y modelo de enfermedad de Crohn. Especlficamente, se administra por via oral un nutriente candidato para controlar ratones y ratones que recibieron irradiacion, quimioterapia y mAb anti-CD3, respectivamente. Ademas, se administran por via oral composiciones que contienen diversas combinaciones de los nutrientes candidatos.
Los nutrientes candidato estan seleccionados de lisina, histidina, valina, leucina, fenilalanina, cistelna, tirosina, arginina, isoleucina, treonina, glicina, alanina, metionina, triptofano, prolina, serina, asparagina, glutamina, acido aspartico, acido glutamico y glucosa.
Para determinar la capacidad de absorcion de cada nutriente, se realizan mediciones bioelectricas usando una camara de Ussing. Las mediciones incluyen: a) la corriente de aminoacido acoplado a sodio (Isc) y cambios en la conductancia, b) cambios en la cinetica de saturacion de cada nutriente y cambios en la Isc despues de la administracion de cada nutriente; y c) los estudios de absorcion de electrolito usando estudios de flujo de isotopo en presencia y ausencia del nutriente candidato especlfico. Los resultados muestran que, en el modelo de radiacion, modelo de quimioterapia y modelo de enfermedad de Crohn, hay un patron similar de alteraciones en la capacidad de absorcion para todos los aminoacidos investigados y la glucosa. Especlficamente, los resultados muestran que la administracion por via oral de cada uno de los siguientes aminoacidos seleccionados de lisina, glicina, treonina, valina, tirosina, acido aspartico, isoleucina, triptofano, asparagina y serina mejora la curacion del intestino delgado, reduce la conductancia paracelular (mejorandose as! el mecanismo de barrera de la mucosa del intestino delgado), aumenta la absorcion de electrolitos y/o mejora la supervivencia en animales. Los resultados tambien muestran que la administracion por via oral de glucosa y/o glutamina altera la barrera de mucosa del intestino delgado, y tiene efectos adversos sobre la supervivencia de los ratones en el modelo de radiacion, modelo de quimioterapia y modelo de enfermedad de Crohn.
Ejemplo 14 - MEJORA DE LA FUNCION DEL INTESTINO DELGADO EN RATONES QUE HAN RECIBIDO QUIMIOTERAPIA
Este ejemplo muestra que la composicion terapeutica de la invencion objeto mejora la curacion del intestino delgado de ratones que han recibido quimioterapia. De todos los farmacos de quimioterapia estudiados, el 5-FU muestra la maxima toxicidad al intestino delgado. Por tanto, se usa el 5-FU para caracterizar las alteraciones del transporte de electrolitos y nutrientes en el modelo de quimioterapia.
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Se inyectaron ratones NIH Swiss con 5-FU. Cinco o seis dlas despues de la inyeccion, se aislaron los tejidos intestinales de los ratones y se estudiaron en una camara de Ussing, exponiendo a tanto soluciones de Ringer como a la composition terapeutica de la invention objeto. La composition terapeutica contiene lisina, glicina, treonina, valina, tirosina, acido aspartico, isoleucina, triptofano, asparagina y serina; agua; y vehlculos, electrolitos y agentes de tamponamiento terapeuticamente aceptables. La composicion terapeutica es ligeramente alcalina (pH 7,4). La composicion terapeutica no contiene glucosa, glutamina o metionina.
Los resultados muestran que la composicion terapeutica mejora significativamente la funcion del intestino delgado de ratones que han recibido 5-FU. Especlficamente, la composicion terapeutica reduce significativamente el aumento patologico en la Isc transepitelial (Fig. 21A) y la conductancia transepitelial en el intestino delgado de los ratones inyectados con 5-FU.
Ejemplo 15 - DETERMINACION DE LOS CAMBIOS EN LA FUNCION GI DEBIDO A IRRADIACION
La funcion Gl principal incluye la absorcion de nutrientes, electrolitos y agua, y tal absorcion ocurre en celulas epiteliales de las vellosidades bien diferenciadas y maduras. El 80 % de la absorcion de llquido y electrolito ocurre en el intestino delgado. Como se ilustra en el presente documento, la IR produce la perdida selectiva de vellosidades y/ o cripta dependiendo de la dosis de IR, y as! conduce a reducir la absorcion de Na+, Cl- y nutrientes. Este ejemplo ilustra disenos experimentales para determinar alteraciones en la funcion Gl causadas por varias dosis de IR con el tiempo.
Procedimientos
Se usan ratones C57BL/6 (8 semanas de edad, macho) de NCI. Se determinan observaciones flsicas, citologla, inmunohistoqulmica, analisis Western, marcadores sustitutos de plasma y estudios funcionales como Indices especlficos para la toxicidad GI inducida por IR. Los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos y el abdomen se irradio con un Shepherd Mark-I usando una fuente de Cs que suministra IR a la tasa de dosis de 1,84 Gy/min al abdomen. Los ratones se someten a IR a 0, 1, 3, 5, 7 y 9 Gy. Se examinan los cambios en el transporte de glucosa y aminoacido en el dla 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 y 30 con 10 ratones en cada grupo. Se recogen muestras de plasma antes de la recogida del tejido. Se recogen tejidos del Ileon y yeyuno por histopatologla, transferencia Western, inmunohistoqulmica y estudios de camara de Ussing (sometidos a evaluation por separado).
A) Determination de alteraciones funcionales en electrolitos (Na+, Cl- y HCO3")
Este ejemplo ilustra disenos experimentales para determinar la alteration en la funcion de la protelna de transporte asociada a la absorcion de electrolito despues de IR. Las alteraciones en la funcion de transporte de electrolito se correlacionan entonces con los marcadores de plasma, citologla y observaciones flsicas tales como actividad diaria, peso corporal, formation de heces formation y sangre oculta fecal. Se realizan examenes de citologla usando ensayos de la cripta, tincion de H y E, tincion de BrdU, inmunohistoqulmica y analisis de transferencia Western.
Primero, se examina el flujo transepitelial de Na+ y Cl- en una camara de Ussing para evaluar la absorcion de electrolito despues de IR. Se sacrifican los ratones, y se examinan los cambios en el transporte de ion basal en los ratones no IR y ratones tratados con IR a diversas dosis. La absorcion de Na+ y Cl- es electroneutra en el epitelio regular.
En este ejemplo, se realizan estudios de sustitucion de isotopos (22Na y 36Cl) para determinar el movimiento de Na+ y Cl- basal. Brevemente, se anaden 22Na y 36Cl tanto al lado mucosal como al lado serosal. Se recogen muestras de 0,5 ml del lado frlo al final de cada 30 minutos. Se calculan los flujos unidireccionales usando la formula estandar, y se expresa como pmol.h-1.cm-2. Se calcula el flujo neto (JNeto) como la diferencia entre los flujos Jms y Jsm a traves de pares de tejido. Los experimentos se realizan bajo condiciones de cortocircuito.
Ademas, se usan tecnicas de pH stat para medir cambios en la secretion de HCO3". Como se ilustra en el presente documento, la IR disminuyo la secrecion de HCO3" en yeyuno. La secrecion de HCO3" es crltica para el equilibrio acido-base y la neutralization de acido en los segmentos superiores del intestino72-74. Estos experimentos sugieren el posible mecanismo de secrecion de HCO3- e indican 1) secrecion de HCO3- dependiente del Cl- de la luz y 2) secrecion de HCO3- independiente del Cl- de la luz en ratones normales y en ratones irradiados. La secrecion de bicarbonato se expresa del siguiente modo:
o w (D2 - D1) x 0,025 x 2 x 60
Secrecion de bicarbonato total (|meq / cm ) =------------------------------------
1,13 x (t)
donde D2 y D1 son la diferencia entre el acido total anadido entre dos momentos de tiempo, 0,025 representa la normalidad del acido anadido, 2 la valencia de H2SO4 y 60 representa el tiempo en minutos para expresar finalmente la secrecion por hora. 1,13 representa el area superficial del tejido usado en la camara de Ussing y t el tiempo. La secrecion de HCO3- estudiada usando la tecnica de pH stat complementara las mediciones de flujo de Na+ y Cl- transepitelial.
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Los experimentos de flujo ionico, estudios de pH stat y mediciones electricas transepiteliales pueden aclarar el proceso de transporte en los ratones no de IR y de IR.
B) Determinacion de alteraciones funcionales en la absorcion de nutriente debido a irradiacion
La malabsorcion intestinal de nutrientes afecta al estado nutricional despues de IR. Como se ilustra en el presente documento, la absorcion selectiva de nutrientes se produce despues de IR. La presencia de nutrientes no absorbidos en el intestino conduce a diarrea osmotica, que complica ademas la lesion causada por la irradiacion. Este ejemplo ilustra el diseno experimental para determinar los nutrientes que son absorbidos del intestino despues de IR.
Los nutrientes facilmente absorbidos pueden ser incluidos en la composition terapeutica/dietetica de la invention objeto para examinar el efecto de varias dosis de IR sobre la absorcion de glucosa con el tiempo.
Especlficamente, se determinan cambios en el transporte de glucosa en camaras de Ussing despues de IR. Tambien se investiga el tiempo requerido para que las protelnas de transporte de glucosa vuelvan a su funcion normal (niveles de no IR). La formulation (ORD) se deriva segun la capacidad de los ratones para tolerar la glucosa oral. La glucosa es retenida del regimen de soporte oral hasta que el transporte de glucosa empieza a mejorar.
Ademas, se examinan cambios en el transporte de aminoacidos (a.a) despues de IR. Puede detectarse el transporte de aminoacidos electrogenico en una camara de Ussing como el movimiento neto de carga que ocurre cuando el aminoacido es transportado. No hay movimiento de carga asociado a a.a electroneutro y, por tanto, estos transportes son estudiados en los estudios de veslculas de membrana del borde en cepillo (BBMV). Tanto el a.a electrogenico como el electroneutro son estudiados en BBMV para la comparacion entre diferentes procedimientos experimentales.
Especlficamente, se estudian los cuatro tipos principales de sistemas de transporte de aminoacidos probando la captation de aminoacidos representativos L-leucina (aminoacido neutro), L-prolina (IMINO acido), acido L-glutamico (aminoacido acido) y L-cistelna (aminoacido de sulfurato) en veslculas de membrana del borde en cepillo (BBMV) de ratones no IR e IR.
Cambios en el transporte de a.a electrogenicos debido a IR
Los aminoacidos se clasifican ampliamente en neutros, cationicos y anionicos, ya que sus caracterlsticas de transporte se basan en gran medida en la carga (Tabla 4). El transporte de a.a. electrogenico puede ocurrir mediante B0/+ (a.a neutro y cationico) o X-ag. El transporte de a.a acoplado a Na e independiente de Na se determina por experimentos en presencia y ausencia de Na+ de la luz. Ademas, el transporte de a.a electroneutro se estudia en BBMV usando aminoacidos marcados con 14C.
Tabla 4 Sistema de transporte de aminoacidos en la membrana del borde en cepillo del intestino delgado
Sistema de transporte
Identidad molecular Identidad alterna Sustratos Dependencia de Na Participacion de otros iones
B0
B0AT1 SLG6A19 a.a neutros SI No
B0/+
AT1B0/+ SLC6A14 a.a neutros, a.a cationicos SI Cl-
b0/+
b0/+AT SLC7A9 a.a neutros, aa cationicos, cistina No No
rBAT SLC3A1 Ninguna funcion de transporte de su propiedad, influyen en los parametros cineticos de la funcion de transporte de b0/+AT
PAT
PAT1 SLC26A6 a.a neutros de cadena corta (glicina, alanina y prolina) No H+
X'ag
EAAT3 SLC1A1 a.a anionicos (aspartato, glutamato) SI K+, H+
Preparacion de BBMV para estudiar el transporte de a.a y transferencia Western
Se alslan BBMV usando el procedimiento de precipitation de magnesio75. El contenido de protelna total de BBMV se determina usando el procedimiento de Bradford76. Las veslculas se almacenan en N2 llquido o a -80 °C.
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Evaluation de la captation de aminoacidos por BBMV
La captation de aminoacidos por las BBMV se realiza a 25 °C usando la tecnica de filtration rapida descrita por Hopfer y col.75 con ligeras modificaciones. Se anaden suspensiones de BBMV (5 gl) al medio de incubation (45 gl) que contiene 1 mmol/l de aminoacido sin marcar, 25 gCi/ml de sustrato radiomarcado L-[U-14C]leucina, L-[U- 14C]prolina, acido L-[U-14C]glutamico o L-[35S]cistelna, 100 mmol/l de NaSCN o KSCN, 100 mmol/l de manitol, 0,1 mmol/l de MgSO4 y 10 mmol/l de HEPES (pH 7,4). Se miden los transcursos de tiempo de la captacion de aminoacidos en presencia de gradiente de Na+ (usando medio que contenla NaSCN) y en ausencia de gradiente de Na+ (medio que contenla KSCN). A intervalos de tiempo especlficos, el proceso de captacion termina anadiendo 5 ml de solution de parada frla en hielo que contenla 150 mmol/l de KSCN y 10 mmol/l de Tris-HEPES (pH 7,4). La suspension se vierte inmediatamente sobre un filtro Millipore pre-humedecido que se lava tres veces con 3 ml de solucion de parada frla en hielo y se sumerge en 5 ml de centelleante Hisafe 3 fluid (LKB Products, Bromma, Suecia). El filtro se cuenta entonces en un contador de centelleo llquido. La union no especlfica al filtro se mide previamente y se resta de la captacion total. Los resultados se expresan como picomoles de captacion de aminoacido por miligramo de protelna.
C) Determination de cambios en la permeabilidad paracelular debido a IR
Se determinan alteraciones en la permeabilidad paracelular usando las siguientes tecnicas. i) potencial de dilution; ii) TEER; iii) permeation de solutos no ionicos grandes de tamanos diferentes; dextrano conjugado con FITC e isetionato de rodamina B-dextrano.
Cambios en el potential de dilution con mitigation despues de IR
Se usan mediciones del potencial de dilucion para determinar los cambios en la relation de permeabilidad entre el Na+ y el Cl- usando la ecuacion de Nernst. Los resultados de estos experimentos se comparan entre grupos de ratones no IR e IR. Los resultados de los estudios de la permeabilidad paracelular y de endotoxina en plasma se correlacionan con los datos de la electrofisiologla y los datos de supervivencia.
Se inducen potenciales de dilucion por perfusion en la mucosa con soluciones de Ringer que contienen varias concentraciones de Na+ y se ajusta la osmolaridad total con manitol para mantener la osmolaridad igual entre los experimentos. Se estima que la contribution de otros iones a la conductancia es inferior al 5 % y, por tanto, se desprecia. Se mide la diferencia de potencial a traves de la membrana usando electrodos de AgCI-AgCI y un multimetro (VCC MC8, Physiological Instruments Inc.). Se corrigen los potenciales de dilucion para cambios en el potencial de empalme (normalmente inferior a 1 mV). Estos experimentos permiten el calculo de la conductancia de cloruro y de sodio de la via paracelular usando la siguiente formula.
Em = RT/F*2,303log{Pna[Na]o + PCI[CI]i/Pna[Na]i + PCI[CI]o}
R = 8,314472 (J/K/mol); F = 96,48531(KJ/mol); Relacion de permeabilidad (P) = PC/ PNa; T = 310 (Kelvin)
Cambios en la permeacion de soluto no ionico a traves de especies paracelulares despues de IR
Se estudia la permeabilidad paracelular a solutos sin carga solubles en agua de varios tamanos en tejidos de intestino delgado montados en una camara de Ussing usando dextrano conjugado con FITC e isetionato de rodamina B-dextrano (Sigma). Estos estudios permiten la determinacion de cambios de la permeabilidad paracelular debido a IR.
La barrera intercelular formada por uniones ajustadas esta altamente regulada y es selectiva en tamano y en ion. Por tanto, esta barrera intercelular representa una barrera de difusion semipermeable. Se disenan experimentos para determinar la permeabilidad paracelular a solutos sin carga solubles en agua de diversos tamanos en tejidos ileales o yeyunales montados en la camara de Ussing bajo condiciones basales en tanto epitelio regular como epitelio expuesto a radiation.
Se anade dextrano conjugado con FITC e isetionato de rodamina B-dextrano (Sigma) a una concentration de 3 mg/ml disuelto en solucion de Ringer al lado mucosal de la camara de Ussing y se mantiene a 37 °C durante 60 min. Se muestrea la solucion en la solucion de bano basolateral para cuantificar el dextrano fluorescentemente marcado. FITC-dextrano: Exc 485 nm y Em: 544 nm e isetionato de rodamina B-dextrano: Exc 520 nm y Em 590 nm. Se obtienen curvas patron de tejido ileal o yeyunal de ratones montado en camara de Ussing para comprobar cualquier cambio en la permeabilidad con el tiempo. Entonces, estos valores se comparan con tejidos de ratones de IR y no de IR.
D) Determinacion de los efectos de la irradiation
Se usan tejidos de ratones sacrificados para una camara de Ussing y estudios de pH stat para tincion de H y E, BrdU, formation de heces, sangre oculta, peso corporal, inmunohistoqulmica y analisis Western. Estos resultados se comparan entonces con alteraciones funcionales en cambios de la permeabilidad de electrolitos, nutrientes y paracelular en ratones no de IR e IR.
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Analisis patologico por el ensayo de criptas, tincion de H y E, BrdU
a) Ensayo de criptas / ensayo de supervivencia de microcolonias
Se ajustaron curvas objetivas a los datos, usando un modelo para la destruccion de celula, que supone que las celulas clonogenicas ('rescate de estructura') en una estructura pluricelular se comportan segun la estadlstica de Poisson. Se supone que la estructura permanece intacta hasta que, en promedio, sobreviven menos de tres celulas por estructura; que la supervivencia de celulas es exponencial durante el intervalo de dosis que se analiza; y que la estructura puede volver a crecer a partir de una o mas celulas supervivientes. Se cree que cada foco epitelial representa la supervivencia de una o mas celulas madre clonogenicas capaces de dar lugar a la cripta regeneradora.
Se sacrifican ratones 3,5 dlas despues de IR para el ensayo de microcolonias de la cripta. Este intervalo esta en o cerca del pico de recuperacion mitotica en las criptas despues de IR. Se usa para estudiar los efectos agudos de la IR.
Para la respuesta biologica a la radiacion, se calculan los valores de Do y D10. Los estudios han mostrado que a pesar de la falta de diferencias estadlsticamente significativas entre los valores de Do, la varianza de aproximadamente Do dependio enormemente del numero de ratones y secciones por punto de dato. No pudieron obtenerse valores reducidos del coeficiente de varianza (~5 %) aumentando el numero de secciones por encima de dos y el numero de ratones por encima de cuatro. Asl, los estudios se disenaron con 3 secciones por raton y seis ratones por punto de dato.
b) Tincion de BrdU para detectar la actividad mitotica despues de IR
Se inyectan ratones con BrdU (30 mg/kg de peso corporal) y los animales se sacrifican en las horas 12, 24, 48 o 72, cuando los tejidos tambien se recogen para estudios funcionales. Se repiten inyecciones de BrdU una vez cada 24 h, cuando los estudios de marcado de BrdU continuaron mas alla de 24 h despues de su inyeccion. Despues del marcado con BrdU, se preparan secciones de parafina de intestinos delgados de raton y se tinen con anticuerpo (Ab) anti-BrdU. Las celulas se puntuaron por unidad entera de la cripta y de las vellosidades. Se analizaron al menos 60 criptas y vellos correspondientes por raton. Las celulas marcadas con BrdU se normalizaron al numero total de celulas por cripta o vellosidades. El porcentaje resultante se representa entonces contra el tiempo de induction. Estos estudios permiten la determination de la tasa a la que las celulas progenitoras de la cripta atraviesan el compartimiento postmitotico de las vellosidades, una correlation directa a la tasa de division de celula en la cripta y la cinetica de las celulas de la cripta migratorias77.
Cambios en parametros ffsicos con IR
Se estudian el peso corporal, formation de heces y sangre oculta fecal en ratones para detectar los cambios en el estado nutricional de los animales con IR. Para la actividad y signos diarios de la enfermedad, todos los ratones se observan una vez al dla para diarrea, falta de acicalado, pelo erizado, disminucion en los habitos de comer y beber, letargo, etc., y se registraron cuidadosamente.
Los hallazgos de estos estudios se comparan con el analisis de plasma para marcadores sustitutos, observaciones patologicas, transferencias Western, estudios de inmunohistoqulmica y de funciones.
Analisis de transferencia Western para determinar alteraciones moleculares de los procesos de transporte implicados en el transporte de electrolitos y nutrientes
Se examinan cambios en las actividades de las siguientes protelnas de transporte, que estan directa o indirectamente implicadas en la absorcion de electrolitos y nutrientes. Las protelnas de transporte incluyen la actividad de CFTR (que se correlaciona con la secretion de Cl- electrogenica), actividad de NHE3 (se correlaciona con la absorcion de Na+), actividad de NBCe1-A/B en las vellosidades (se correlaciona con secrecion de HCO3-), NKCC1 (captation basolateral a Na+, K+ y Cl- dentro de la celula), SGLT-1 (absorcion de glucosa), B0, B0/+, b0/+, PAT (sistema de transporte electrogenico acoplado a proton) y X-ag (Tabla 2). Estos estudios se comparan con datos funcionales en no IR, IR y despues de tratar con ORD.
Inmunohistoqulmica para la deteccion de cambios en el patron de expresion de protelnas de transporte, marcadores de celulas de la cripta y de las vellosidades
Se preparan secciones congeladas cuando los animales se sacrifican para estudios funcionales y para inmunotincion usando diversos anticuerpos que son especlficos para diversos transportadores (CFTR, NHE3, NKCC, NBCe1-A/B, SGLT, B0, B0/+, b0/+, PaT1 y X-ag). Ademas, se examinan patrones de expresion de marcadores superficiales de la celula para proporcionar perception para la relation de celulas de la cripta y de las vellosidades. Estos estudios permiten la determinacion de la alteration en el patron de expresion de transportadores con IR y tratamiento de ORD.
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E) Identification de marcador(es) sustituto(s) para efectos de la radiation
Aunque hay varios estudios que intentan identificar marcador(es) sustituto(s) para determinar la dosis de radiation y el tiempo desde la radiation para determinar la aparicion de toxicidad GI, estos estudios no han sido satisfactorios en gran medida. Este ejemplo ilustra disenos experimentales que permiten la identification de marcador(es) sustituto(s) para predecir la aparicion de toxicidad GI, que puede tambien resultar util en escenarios donde participan multiples organos.
Especlficamente, se recoge plasma cuando los animales se sacrifican para la evaluation funcional (camaras de Ussing). Despues de la exposition a una dosis de IR de 0, 1, 3, 5, 7 o 9 Gy, los ratones se sacrifican en el dla 1, 2, 3, 6 o 9. Con el fin de identificar marcadores sustitutos, se estudian peptidos intestinales, citocinas y endotoxina.
Analisis de plasma para endotoxinas
Se miden los niveles de endotoxina en plasma. Se correlacionan cambios en los niveles de endotoxina en plasma con cambios en la permeabilidad paracelular, niveles de peptido intestinal en plasma, enfermedad y tasa de supervivencia.
Analisis de plasma para citocinas
Se examinan cambios en los niveles de citocinas en plasma usando la tecnica de matrices de perlas LUMINEX multiplex en ratones IR y no IR.
Analisis de plasma para peptidos intestinales
Se investigan los peptidos especlficos del intestino, que incluyen insulina, glucagon, secretina, colecistokinina, citrulina, somatostatina, peptido YY, grelina, NPY y GLP-2. Todos los kits de peptidos intestinales se compraron de Phoenix Pharmaceuticals, Inc. (CA, EE.UU.). Los experimentos se realizan segun la instruction del fabricante.
Analisis estadfstico
Se compara la diferencia funcional entre los tejidos normales y de IR. Se calcula la signification estadlstica usando el analisis de la varianza (ANOVA). Los datos se comparan entre los ensayos. Se analiza el coeficiente de correlation (R) para determinar el mejor marcador funcional. Todos los analisis estadlsticos se realizan usando la version 9.1 del sistema SAS para Windows (Derechos de Autor© 2002-2003 SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.). Si se violan las suposiciones de distribution asociadas a un procedimiento estadlstico particular, se usan transformaciones apropiadas o alternativas no parametricas. Se construyen curvas de eficacia (ROC) y se comparan las areas bajo las curvas de ROC (ABC) entre las diversas pruebas funcionales usando el procedimiento no parametrico de DeLong y col. (1988). La tasa de error de tipo 1 por familia se controla a 0,05 usando el procedimiento de Tukey para comparaciones multiples. Se informan coeficientes de la correlation de Pearson con valor de p asociado e intervalo de confianza del 95 %.
Ejemplo 16 - DESARROLLO DE REGIMENES ORALES IDEALES PARA EL TRATAMIENTO DE LESION GASTROINTESTINAL INDUCIDA POR IR
Este ejemplo ilustra disenos experimentales para desarrollar composiciones terapeuticas orales para el tratamiento o la mejora de la toxicidad Gl inducida por la radiation. Tambien se determina el momento cuando debe empezar la dieta de rehidratacion oral (ORD) y cuanto tiempo debe administrarse la composition despues de la exposition a diversas dosis de IR. El tiempo durante el que la ORD necesita administrarse depende del tiempo necesario para que Km vuelva a los niveles basales.
Procedimientos
Se usan ratones C57BL/6 (8 semanas de edad, macho) de NCI. Para determinar la afinidad del transportador, se calcula la cinetica de saturation usando concentration creciente de los nutrientes respectivos. Estudios preliminares han mostrado que algunos a.a. tienen absorcion elevada, mientras que algunos mostraron absorcion reducida, con cambios en Km y Vmax despues de IR. Se anade concentration creciente de los a.a al Ileon o yeyuno (sometidas a evaluation por separado), provocan un aumento en Isc. El representar la concentration conocida de a.a. frente a Isc permite la determination de la cinetica de saturation. El administrar los a.a. selectivamente absorbidos despues de IR mediante lavado gastrico aumenta la supervivencia de los ratones. Se determinan Km y Vmax para los nutrientes en ratones IR con 0, 1, 3, 5, 7 o 9 Gy a los 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 y 30 dlas con 10 ratones en cada grupo.
A) Determination de Km y Vmax de aminoacidos esenciales y glucosa para el desarrollo de dieta oral de radiation (ORD) ideal
Como se ilustra en el presente documento, la irradiation causa cambios en la cinetica de transporte de los nutrientes, que indica afinidad alterada hacia los respectivos transportadores. La afinidad por el transportador de glucosa determinado usando esta tecnica mostro disminucion significativa y duro aproximadamente dos semanas
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hasta el retorno al nivel de base. Se sabe que la presencia de glucosa o nutrientes no absorbidos en la luz intestinal produce diarrea. Se determinan Km y Vmax para los nutrientes en ratones expuestos a diferentes dosis de IR y seguido de un periodo de hasta 30 dlas despues de IR. Estos estudios son utiles para formular una ORD basada en su patron de absorcion con el tiempo y la dosis de radiacion. Ademas, pueden utilizarse nutrientes que muestran elevada absorcion despues de IR como fuentes alternas de energla para el sistema. La formulacion (ORD) se usara entonces en estudios de supervivencia.
Cambios en Km y Vmax para el transporte de glucosa en las camaras de Ussing despues de IR
Se estudia el transporte de glucosa. Especlficamente, se estudian Km y Vmax para glucosa. Se anaden concentraciones crecientes de glucosa al lado de la luz en los experimentos de camara de Ussing y se registra el aumento en Isc. La glucosa es retenida del regimen de soporte oral hasta que el transporte de glucosa empiece a mejorar. La formulacion se basa en la capacidad de los ratones para tolerar la glucosa oral.
Cambios en Km y Vmax para el transporte de aminoacidos (a.a.) despues de IR
Se estudia el patron cinetico de los aminoacidos basandose en la dosis de IR y se estudia el tiempo despues de IR determinando Km y Vmax para cada a.a. Se determinan los Indices cineticos de a.a electrogenicos en la configuracion de camara de Ussing como se ha descrito. Brevemente, el aumento en la concentracion de a.a. anadido a la solucion de luz produce el aumento de la respuesta de Isc, con saturation a una concentracion particular de a.a. Se calculan Km y Vmax a partir de la curva de saturacion.
Se estudian a.a. electroneutros usando BBMV. La captation del aminoacido por BBMV se realiza en presencia de diferentes concentraciones de sustrato, de 0,025 a 7 mmol/l, a un tiempo de transporte fijo de 3 s (19). Cada ensayo se realiza por triplicado usando el conjunto de BBMV (n = 12) de cada grupo experimental. La velocidad maxima (Vmax) se expresa como picomoles de sustrato por miligramo de protelna en 3 s, y la constante de afinidad de transportador (Km) se expresa como milimoles por litro.
Optimizacion de la terapia de ORD para mitigar la toxicidad GI y mejorar la supervivencia
Se descubre que la lisina a un intervalo de dosis de 20 mg/ratones/dla puede aumentar la supervivencia en ratones. Para optimizar el regimen de tratamiento de ORD seleccionando una dosis, frecuencia e intervalo de administration apropiado, se realiza el analisis de los efectos de ORD sobre la supervivencia a los 7 dlas, formation de heces, sangre oculta y peso corporal. La ORD se inicia tan pronto como 3 horas despues de una dosis letal de IR (valor de 15,6 Gy = 1,2x DL50/7 ) a un intervalo de dosis determinado de valores Km de a.a. respectivos o glucosa. La concentracion de glucosa o a.a. usados para el lavado gastrico se calcula a partir de Km basandose en las cantidades diariamente recomendadas actualmente en uso para glucosa y aminoacidos esenciales en seres humanos adultos. La traduction de dosis de humano a ratones se basa en los factores de Km78. Asl, existe una relation inversa entre Km y la dosis diaria para los nutrientes. Si IR aumento la Km (que sugiere una disminucion de la afinidad por el transportador), entonces hay una disminucion proporcional en la dosis diaria para el nutriente respectivo. Se formulan dos ORD adicionales con dosis, es decir, 3 veces por encima y por debajo de la dosis calculada. La mejor dosificacion de ORD se determina basandose en los estudios de supervivencia.
El lavado gastrico se repite una vez al dla durante 7 dlas. La frecuencia de la dosis y el intervalo de lavado gastrico de ORD se someten a cambio segun los resultados de los estudios de supervivencia. La toxicidad Gl alcanza el maximo aproximadamente el dla 2-3 despues de IR y entonces se recupera gradualmente 7 dlas si la ORD es eficaz. Los ratones se observan diariamente hasta 7 dlas despues de IR para monitorizar su supervivencia.
Todos los ratones que reciben dieta regular mueren o son sacrificados (moribundo; definido como una combination de 20 % de perdida de peso, dejan de acicalarse, actividad reducida y curiosidad disminuida) en el plazo de 7 dlas despues de IR. Si los ratones que reciben tratamiento de ORD se protegen de la letalidad inducida por IR, entonces se repetira el experimento de supervivencia con 10 ratones/grupo adicionales con el mismo tratamiento para garantizar que los resultados sean reproducibles. Los datos de supervivencia se analizaran por la prueba exacta de Fisher.
El tamano de muestra de 10 animales por grupo garantiza potencia suficientemente alta (>80 %) para detectar diferencias de supervivencia entre cerca del 0 % para el grupo de vehlculo y el 60 % o mas alto para cada intervention (en una comparacion por pares llevada a cabo al nivel alfa ajustado de 0,017 = 0,05/3) para garantizar un nivel alfa global del 5 %. En el supuesto caso de que no se observe una diferencia estadlsticamente significativa o solo se logre mitigation parcial por el tratamiento de ORD, se realizara un nuevo ciclo de optimizacion del regimen como se describe anteriormente para garantizar la maxima eficacia de mitigacion contra la letalidad inducida por IR. Despues de la selection de una dosis optima, se evalua si se requiere o no lavado gastrico de ORD mas frecuente (dos veces al dla) para lograr mayor mitigacion de la radiacion y recuperation de la cripta mas rapida.
Determinacion de DMF y la ventana de eficacia de ORD para terapia despues de IR
El factor de modification de dosis (DMF) es uno de los parametros mas importantes para medir la eficacia de un mitigador de la radiacion, que se define por DMF = DLT50 / DLC50 donde T es el grupo de tratamiento de ORD y C
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indica el grupo de control con la dieta regular51. Para determinar la eficacia de tratamiento de ORD en mitigar la letalidad inducida por IR, se tratan grupos de 10 ratones C57BL/6 en promedio (10-20 ratones/grupo que varian con la dosis de IR) con vehiculo u ORD usando el regimen optimo definido por los experimentos previos. Los ratones tratados con vehiculo se exponen a 11 Gy a 13 Gy de IR usando incrementos de 0,5 a 1 Gy. La supervivencia de estos ratones se registra durante un periodo de observation de 7 dias despues de IR. Los ratones se sacrifican al final del periodo de observacion o cuando lleguen a ser moribundos.
Se recogen intestino delgado y plasma despues de la eutanasia. Se usan muestras de sangre para el analisis de peptidos intestinales, mientras que se usan especimenes de tejido de intestino delgado para investigar el dano intestinal inducido por IR. El valor de DL50/7 es un buen indicador de la toxicidad GI inducida por IR.
La DL50/7 para los ratones tratados con vehiculo es proxima a 13 Gy, basandose en la observacion previa en el laboratorio de los presentes inventores. Los grupos tratados con ORD se exponen a IR que oscila de 14,5 a 16,5 Gy de IR con incrementos de 0,5 a 1 Gy, se observan y se examinan como se ha descrito anteriormente para los ratones tratados con vehiculo. Si numeros sustanciales de ratones en grupos de tratamiento con ORD sobreviven incluso despues de exponerse a 16,5 Gy, se administran dosis de IR mas altas a los ratones en un estudio posterior. El valor de DL50/7 se calcula para los animales tratados con ORD basandose en sus curvas de supervivencia y entonces se calcula el DMF para ORD. Los ratones tratados con ORD tienen una DMF para LD50/7 superior a 1,2.
Para determinar cuando debe administrarse el tratamiento de ORD despues de IR, se administran cinco grupos de animales con ORD 0, 1, 3, 5, 7, 9, 12 y 24 horas despues de IR y se siguen con tratamiento de ORD programado y se observan durante 7 dias, junto con un control positivo (3 h despues del tratamiento de IR) y un control negativo (vehiculo de solution salina). La supervivencia de los animales se compara basandose en la supervivencia en el momento de tiempo de 7 dias.
En este modelo, se consideran varios modelos de regresion logistica (resultado variable muerto/vivo a los 7 dias) y diversas tendencias de tiempo en los ocho grupos administrados con ORD despues de IR. Se consideran tanto modelos lineales (lo mas probablemente disminuyendo la supervivencia a medida que aumenta la demora del tratamiento) como no lineales (disminuciones de la supervivencia exponenciales).
Se realizan comparaciones frente a 3 h despues de la administration de IR y el vehiculo en un modo por pares usando la prueba exacta de Fisher. Hay una comparacion por pares (diferentes grupos de coordination frente a las 3 h despues de IR, grupo de ORD y frente a vehiculo) y el nivel alfa de la prueba individual se mantendra a 0,005 (=0,05/10).
a) Tasa de supervivencia:
Un indice importante para el efecto de tratamiento de ORD es determinar la tasa de supervivencia. Se registra dos veces al dia y se crea una curva de supervivencia.
b) Actividad diaria o signos de enfermedad
Todos los ratones se observan una vez al dia para los signos de enfermedad, tales como diarrea, falta de acicalado, pelo erizado, habitos disminuidos de comer y beber, letargo, etc., y se registran cuidadosamente.
c) Peso corporal, formation de heces y sangre oculta
Para determinar si la ORD podria invertir algunos de los efectos de la toxicidad Gl inducida por IR, se extraera el colon y se fotografiara para la formacion de heces y las heces se analizaran para sangre oculta, cuando aquellos animales se sacrifican para estudios funcionales como se describe en el presente documento. Estos estudios permiten determinar si los agentes de mitigation son capaces de mantener la integridad de la mucosa GI y su funcion que son visibles a simple vista.
d) Inmunohistoquimica
Se analiza la infiltration de celulas inflamatorias en la lamina propia usando secciones tenidas de H y E de yeyuno o ileon. Se tendra cuidado para determinar la frecuencia de distribution de foliculos linfoides.
La dosis optima, tiempo de comienzo y programa de ORD para la toxicidad GI aguda se determinan en una secuencia. Los ratones se tratan con formulation de dosis diferente de ORD despues de la exposition a IR. La dosis optima se determina en modelos de regresion logistica determinando la supervivencia durante 7 dias (si frente a no) como la variable de respuesta y el nivel de dosis como la variable explicativa. Debido a la incertidumbre de la curva de dosis-respuesta, se proponen varios modelos de dosis-respuesta plausibles. Despues de determinar el modelo de dosis-respuesta, se calcula la minima dosis eficaz (MED). El tiempo de comienzo y la duration optima de la terapia son contestados por pruebas de equivalencia usando las respuestas medias estimadas y la varianza en el modelo de ANOVA.
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Ejemplo 17 - DETERMINACION DE LA MEJORA FUNCIONAL EN LA FUNCION GI
En este ejemplo, se realizan experimentos de electrofisiologla para determinar como la ORD ayuda a restaurar la mucosa intestinal lesionada por IR para absorber electrolitos y nutrientes. Se correlacionan cambios funcionales con el (los) marcador(es) sustituto(s) de plasma, citologla y observaciones flsicas tales como actividad diaria, peso corporal y formacion de heces. Sangre oculta fecal, citologla tal como ensayo de criptas, tincion de H y E, tincion de BrdU, inmunohistoqulmica y analisis de transferencia Western. Estos estudios permiten la determinacion de los efectos protectores de ORD sobre la funcion GI al nivel molecular, celular y funcional.
Procedimientos
Se usan ratones C57BL/6 (8 semanas de edad, macho) de NCI. Se realizan estudios funcionales, observaciones flsicas, citologla, inmunohistoqulmica, analisis Western y se usan marcadores sustitutos de plasma como Indices especlficos de toxicidad GI inducida por IR. Los ratones se dividieron al azar en grupos y se irradio el abdomen con un Shepherd Mark-I usando una fuente de Cs que administra IR a la tasa de dosis de 1,84 Gy/min. Los ratones se irradian con 1, 3, 5, 7 o 9 Gy y entonces se administran con ORD. Los ratones se tratan con ORD. Los ratones se sacrifican en el dla 6 y se usan los tejidos para funcional, histopatologla, transferencia Western e inmunohistoqulmica.
A) Correlacion de efectos de ORD con la mejora funcional en la absorcion de electrolitos y nutrientes
Se usa un conjunto de Indices para evaluar el efecto del tratamiento: 1) los ratones se pesan diariamente y se observan detenidamente para cualquier signo de enfermedad; 2) se analizan muestras de sangre y parametros flsicos cuando los animales se sacrifican para los estudios funcionales (absorcion de electrolitos y nutrientes), ensayo de la cripta, analisis de inmunohistoqulmica y de transferencia Western. Se usan muestras de sangre para medir la endotoxina en plasma (un Indice para la disfuncion de la barrera intestinal), citocinas, peptidos intestinales (insulina, glucagon, secretina, colecistokinina, citrulina, somatostatina, peptido YY, grelina, NPY y GLP2), citrulina, glucosa e insulina.
Determinacion del flujo transepitelial de Na+ y Cl- en estudios de camaras de Ussing
Para investigar la mejora funcional de ORD, se montaron hojas de yeyuno e Ileon (sometidas a evaluacion por separado) de ratones en camara de Ussing y se realizan experimentos como se describe en el Ejemplo 15. Se comparan la absorcion de Na+ y Cl- entre grupos de ratones no IR, IR y tratados con ORD.
Determinacion de la secrecion de HCO3- usando tecnicas de pH stat
Se realizan experimentos como se describe en el Ejemplo 15. La restauracion de la secrecion de HCO3- con tratamiento de ORD sugiere mejora funcional. La secrecion de HCO3- se compara entre grupos de ratones no IR, IR y tratados con ORD.
Determinacion de la absorcion de nutrientes en camara de Ussing y estudios de vesfcula
Como se describe en el Ejemplo 15, se determina la glucosa, a.a. electrogenico y absorcion de a.a. electroneutro. Los resultados de estos estudios se comparan entre grupos de ratones no IR, IR y tratados con ORD.
Determinacion de cambios en la permeabilidad paracelular con mitigacion despues de IR
Una disminucion en la permeabilidad paracelular con tratamiento de ORD sugiere una mejora en la integridad epitelial. Estos cambios indicaran mejora concomitante en el nivel de endotoxina en plasma.
Correlacion de efectos de ORD con ensayo de la cripta, tincion de H y E, BrdU, formacion de heces, sangre oculta, peso corporal, inmunohistoqulmica y analisis de de Western
Los estudios seran similares a los descritos anteriormente en el Ejemplo 15 y los resultados se compararan entre grupos de ratones no IR, IR y tratados con ORD.
Analisis histopatologico para determinar la mejora anatomica
Se procesaran especlmenes para tincion de H y E y analisis patologicos, que incluyen el ensayo de criptas, tincion de BrdU como se describe en Ejemplo 15. Brevemente, se fijaran los tejidos en formalina, se procesaran en bloques de parafina y se teniran con H y E.
Inmunohistoqulmica para detectar cambios en el patron de expresion de protelnas de transporte, marcador de celulas de la cripta y de las vellosidades
Se usaran los tejidos recogidos para inmunotincion usando diversos anticuerpos que son especlficos para diversos transportadores (NHE3, NBCe1-A/B, SGLT, B0/+, b0/+, X-ag) y marcadores de la superficie celular (Lgr5, EphB2 y EphB3). El procedimiento sera similar al descrito en el Ejemplo 15. Estos estudios ayudaran a determinar el grado
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Analisis de transferencia Western para estudiar alteraciones moleculares de procesos de transporte implicados en el transporte de electrolitos y nutrientes
El procedimiento sera similar al descrito en el Ejemplo 15. Se examinara la actividad de CFTR (que se correlaciona con secrecion de Cl- electrogenica), actividad de NHE3 (se correlaciona con absorcion de Na+ ), actividad de NBCel- A/B en las vellosidades (se correlaciona con secrecion de HCO3-), SGLT-1, B0/+, b0/+ o X-ag.
Correlacion de efectos de ORD usando analisis en plasma de marcador(es) sustituto(s)
Estudios preliminares han mostrado cambios en los peptidos intestinales despues de IR en ratones. Se examinan cambios en los niveles de marcador sustituto hacia niveles basales y los resultados indicaran la mejora sistemica con tratamiento de ORD.
Analisis estadfstico
Se calculan la media y desviacion estandar de los datos sin procesar y se aplicaran tecnicas graficas tales como el diagrama de barras. El principal enfoque para comparar estos dos grupos (tratamiento frente a vehlculo) utiliza modelos de efectos mixtos (lineales o no lineales) basados en datos longitudinales.
Los terminos "un" y "una" y "el" y "la", y referentes similares, como se usan en el contexto de la descripcion de la invencion, deben interpretarse como que cubren tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto.
La mencion de las escalas de valores en el presente documento estan simplemente previstas para servir de procedimiento abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se citara individualmente en el presente documento. A menos que se establezca de otro modo, todos los valores exactos proporcionados en el presente documento son representativos de valores aproximados correspondientes (por ejemplo, puede considerarse que todos los valores exactos a modo de ejemplo proporcionados con respecto a un factor particular o medicion tambien proporcionan una medicion aproximada correspondiente, modificada por "aproximadamente", cuando corresponda).
El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje a modo de ejemplo (por ejemplo, "tal como"), proporcionado en el presente documento, esta previsto simplemente para iluminar mejor la invencion y no plantea una limitation al ambito de la invencion, a menos que se indique lo contrario. Ningun lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como que indique que cualquier elemento sea esencial para la practica de la invencion, a menos que se establezca expllcitamente como tal.
La descripcion en el presente documento de cualquier aspecto o realization de la invencion usando terminos tales como "que comprende", "que tiene", "que incluye" o "que contiene" con referencia a un elemento o elementos pretende proporcionar soporte para un aspecto o realizacion similar de la invencion que "consiste en", "consiste esencialmente en", o "comprende sustancialmente" ese elemento o elementos particulares, a menos que se establezca de otro modo o se contradiga claramente por el contexto (por ejemplo, una composition descrita en el presente documento que comprende un elemento particular debe entenderse como que tambien describe una composicion que consiste en ese elemento, a menos que se establezca de otro modo o se contradiga claramente por el contexto).
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Claims (13)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion terapeutica para su uso en un procedimiento de tratamiento de atrofia de las vellosidades producida por irradiacion, quimioterapia o inflamacion en el intestino delgado, en la que la composicion se formula para administracion enteral y comprende lisina, glicina, treonina, valina y tirosina, como aminoacidos libres; y agua; y en la que la composicion no comprende glucosa, glutamina y metionina, o, si estos ingredientes estan presentes, la glucosa esta presente a una concentracion inferior a 1 g/l, la glutamina esta presente a una concentracion inferior a 300 mg/l y la metionina esta presente a una concentracion inferior a 100 mg/l.
  2. 2. La composicion para su uso segun la reivindicacion 1, en la que la composicion tiene una osmolaridad total de 230 mosm a 280 mosm.
  3. 3. La composicion para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, que comprende ademas acido aspartico, isoleucina, triptofano, asparagina y/o serina.
  4. 4. La composicion para su uso segun la reivindicacion 1 a 3, en la que la composicion no comprende glucosa, glutamina o metionina.
  5. 5. La composicion, para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composicion comprende ademas electrolitos, vitaminas, minerales y/o agentes aromatizantes.
  6. 6. La composicion, para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es esteril.
  7. 7. La composicion para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende administrar la
    composicion a un sujeto, que es preferentemente un ser humano, mediante administracion enteral.
  8. 8. La composicion para su uso segun la reivindicacion 7, en la que el sujeto tiene al menos una reduccion del 10 % en el numero total de celulas epiteliales intestinales pequenas en la region de las vellosidades, cuando se compara con lo normal.
  9. 9. La composicion para su uso segun las reivindicaciones 7 u 8, en la que el sujeto tiene al menos una perdida del
    10 % en la altura de las vellosidades en el intestino delgado, cuando se compara con lo normal.
  10. 10. La composicion para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que la composicion se administra durante un periodo de 1 a 14 dlas despues de que el sujeto reciba radiacion, quimioterapia, terapia de protones, o un agente citotoxico.
  11. 11. La composicion para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, usada para tratar enteritis por radiacion.
  12. 12. La composicion para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, usada para tratar lesion del intestino delgado producida por quimioterapia o por agentes citotoxicos seleccionados de cisplatino, 5-fluorouracilo (5-FU), hidroxiurea, etoposido, arabinosido, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fludarabina, metotexato, esteroides, o una combinacion de los mismos.
  13. 13. La composicion para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, usada para tratar enfermedad inflamatoria del intestino (EII), colitis ulcerosa, ulceras duodenales o enfermedades de Crohn.
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