PT2164349E - Fórmula sem proteína - Google Patents
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Description
ΕΡ2164349Β1
DESCRIÇÃO
FÓRMULA SEM PROTEÍNA
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à estimulação da saúde em crianças que recebem uma fórmula à base de aminoácidos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Numa situação preferida, os bebés são amamentados pela mãe. No entanto, muitas vezes, em crianças, após um período inicial de serem amamentadas, o aleitamento materno é interrompido e a dieta infantil compreende principalmente fórmula de leite infantil.
No entanto, num pequeno grupo de crianças o aleitamento materno ou a alimentação de fórmula infantil convencional resulta em reações adversas, tais como dor e reação alérgica. As pessoas que sofrem de uma alergia podem ter dificuldade em digerir ou metabolizar alguns componentes da alimentação, o que, em seguida, leva a reações alérgicas gastrointestinais e sistémicas. As reações alérgicas são dirigidas principalmente à fração de proteína na alimentação. É muitas vezes necessária uma alteração significativa na dieta para reduzir os eventos adversos.
Para evitar reações alérgicas às proteínas, o alimento infantil é constituído por proteínas do leite hidrolisadas, aminoácidos ou proteínas não lácteas, por exemplo, proteínas de soja e outros componentes nutricionais que não provocam reações alérgicas.
Uma nutrição infantil conhecida que compreende aminoácidos como a fonte de azoto é Neocate™ para o uso em pacientes que sofrem de alergia, de queixas 1 ΕΡ2164349Β1 gastrointestinais, de eczema, de má absorção ou de má digestão.
Na tecnologia anterior, o número de diferentes fontes de nutrientes é muitas vezes mantido baixo para impedir a introdução de alérgenos na fórmula pela adição destes ingredientes. No entanto, isto tem a desvantagem de que as crianças também não beneficiam dos efeitos benéficos de tais ingredientes adicionais. 0 documento WO2005039319 divulga a utilização de simbióticos na fórmula infantil, incluindo a proteína na forma hidrolisada, reduzindo assim o risco de alergia (página 11, linhas 35 - 37) . 0 documento WO 2007/054989 descreve culturas de bactérias probióticas antialérgicas. O documento WO2006091103 divulga uma composição nutricional que compreende simbióticos para o tratamento e prevenção de distúrbios do sistema imunológico, incluindo a alergia. É divulgada a utilização de hidrolisado de proteína e/ou de aminoácidos livres para reduzir o risco de alergia. É o objetivo da presente invenção melhorar as fórmulas alimentares para este grupo de pacientes vulneráveis, ao proporcionar benefícios nutricionais adicionais sem a introdução de alérgenos na composição.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os presentes inventores reconheceram que numa fórmula elementar contendo uma variedade de aminoácidos livres sem proteína intacta, é altamente imprevisível como é que a flora intestinal se desenvolve. Em vez da flora dominante de bifidobactérias e lactobacilos em crianças normais que recebem leite materno, muitas outras espécies bacterianas, incluindo espécies potencialmente patogénicas, podem prevalecer no intestino dos bebés que recebem alimentos à base de aminoácidos. 2 ΕΡ2164349Β1 A presente invenção é definida pelas reivindicações e será descrita na parte "descrição detalhada da invenção". O desenvolvimento de uma flora intestinal saudável é particularmente importante em todas as crianças, uma vez que estas crianças muitas vezes já sofrem de uma função imunológica diminuída, resultando em cólicas, congestão, nariz a pingar, pieira, vómitos, diarreia, fezes com sangue, muco nas fezes, prurido, ou eczema.
Os presentes inventores reconheceram que o desenvolvimento de uma flora saudável é de importância muito elevada em crianças que recebem uma dieta que contém principalmente aminoácidos livres como uma fonte de proteína. Sem estar limitado pela teoria, os inventores reconheceram que uma boa flora, ou seja, uma flora rica em Bifidobacteria e Lactobacilli, é especialmente benéfica para a maturação (mucosa) do sistema imunitário. Uma boa flora impede o desenvolvimento de alergias, ou pelo menos reduz a gravidade de alergias em tais crianças. Assim, os presentes inventores reconheceram a importância de um desenvolvimento de flora benéfica nestas crianças.
Apesar das limitações na formulação da fórmula dietética para tais crianças vulneráveis, os presentes inventores descobriram que uma seleção específica de oligossacáridos dietéticos, de preferência frutanos e/ou produtos de degradação da pectina, pode ser adicionada beneficamente à fórmula elementar para estimular o desenvolvimento da flora sem causar quaisquer efeitos secundários alérgicos. Não podem ser usados produtos derivados do leite na presente fórmula elementar, uma vez que isto pode levar à adição de alérgenos do leite ao produto. Por conseguinte, as fibras prebióticas de acordo com esta invenção são cuidadosamente selecionadas de entre as fibras prebióticas conhecidas, a fim de evitar a adição de proteínas de leite ou de outras proteínas intactas e potenciais alergénicas 3 ΕΡ2164349Β1 que estão presentes nas fibras da composição não alérgica.
Os inventores verificaram surpreendentemente num modelo de alergia reconhecido internacionalmente, que quando as fibras prebióticas são combinadas com bacterianas probióticas, nomeadamente Bifidobacteria, estava presente um efeito sinérgico na prevenção de reações alérgicas. Este efeito sinérgico é potencialmente muito benéfico para as crianças, mas também pode ser benéfico para adultos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra a resposta alérgica de várias composições testadas em conformidade com um modelo de vacina em ratinho internacionalmente reconhecido. A figura 2 demonstra o efeito sinérgico de TD1 (Bifidobacterium breve) e fibras dietéticas (OS) num modelo de alergia a caseína em ratinho.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Uma realização preferida de acordo com a invenção compreende a utilização de uma composição que compreende aminoácidos livres como uma fonte única de proteína, uma fonte de ácidos gordos que compreende ácidos gordos poli-insaturados de cadeia longa, uma fonte de hidratos de carbono que compreende hidratos de carbono digeríveis e não digeríveis, e Bifidobacteria livre de proteína do leite, para o fabrico de uma composição para o tratamento de uma pessoa que sofre de a. cólica, congestão, nariz a pingar, pieira, vómitos, diarreia, fezes com sangue, muco nas fezes, prurido, eczema, refluxo gastroesofágico, esofagite 4 ΕΡ2164349Β1 eosinofílica ou asma; b. alergia ao leite de vaca e/ou intolerância alimentar a proteína; e/ou c. infeções, em que o hidrato de carbono não digerível é selecionado a partir de uma fonte livre de proteína de leite, e a composição total é essencialmente livre de proteínas intactas. 0 termo "fonte única de proteína", tal como aqui usado, significa que a composição da presente invenção (de preferência) contém pelo menos 99 % em peso de aminoácidos com base na proteína total, de preferência pelo menos 99,5, mais preferencialmente pelo menos 99,9 % em peso. A invenção proporciona ainda uma composição que compreende um componente proteico, um componente de gordura, um componente de hidrato de carbono digerível, um hidrato de carbono não digerível e bifidobactérias livres de proteína de leite em que: a) o componente de proteína compreende mais do que 99 % em peso de aminoácidos livres com base na proteína total, e compreende, pelo menos, os seguintes aminoácidos livres: alanina, arginina, ácido aspártico, cisteína, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina e glutamina; b) o componente de hidratos de carbono digeríveis contém menos do que 2 % em peso de lactose com base nos hidratos de carbono digeríveis totais; c) o hidrato de carbono não digerível compreende frutano solúvel com um DP médio entre 2 e 200, e um ácido galacturónico solúvel com um DP médio entre 2 e 200; e d) o componente de gordura compreende entre 0,1 e 5 % em peso de LCPUFA com base no teor total de ácido 5 ΕΡ2164349Β1 gordo .
Tal como é mostrado na figura 1, a combinação de frutanos de cadeia longa solúveis (LFOS) com um oligossacárido de ácido (AOS), que era neste caso hidrolisado de pectina, funciona tão bem como as bifidobactérias, quando testado no modelo de ratinho. Contudo, é evidente que se os oligossacáridos são combinados com a Bifidobacteria os efeitos são fortemente melhorados. A composição nutricional compreende ambas as fibras não digeríveis e a Bifidobacteria, uma vez que esta composição dá os melhores resultados no modelo de alergia em ratinho. (Veja-se a figura 1.) De preferência é usada Bifidobacteria breve.
Hidrato de carbono não digerível
Os frutanos são oligossacáridos neutros com base em frutose (> 50 % das unidades de monose são frutose), preferencialmente inulina, frutano e/ou frutooligossacáridos, mais preferencialmente uma mistura de frutooligossacáridos de cadeia longa (IcFOS) com um DP médio entre 10 - 60 e frutooligossacáridos de cadeia curta (scFOS) com um DP médio entre 3 e 10. A realização preferida compreende uma mistura de IcFOS e scFOS numa razão de 1:9, uma vez que esta razão se aproxima da composição de oligossacáridos do leite materno, e tem sido provada estimular eficazmente o crescimento de bifidobactérias em crianças. O presente método compreende preferencialmente a administração de uma dose que compreende entre 0,05 e 25 gramas de sacárido não digerível, de preferência entre 0,1 e 5 gramas. O presente método compreende preferencialmente a administração de uma dose que compreende entre 0,05 e 25 6 ΕΡ2164349Β1 gramas de scFOS, preferencialmente entre 0,1 e 5 gramas de scFOS. O presente método compreende preferencialmente a administração de 0,05 a 25 gramas de sacárido não digerível por dia, de preferência entre 0,1 e 5 gramas por dia.
Produto de degradação da pectina A pectina está dividida em duas categorias principais: pectina altamente metoxilada, que se caracteriza por um grau de metoxilação acima de 50 %, e pectina pouco metoxilada que tem um grau de metoxilação abaixo de 50 %. Tal como é aqui utilizado, "grau de metoxilação" (também referido como DE ou "grau de esterificação") destina-se a significar a extensão na qual os grupos de ácido carboxílico livres contidos na cadeia de ácido poligalacturónico foram esterifiçados (por exemplo, por metilação). A presente pectina é preferivelmente preparada a partir de pectina altamente metoxilada. A pectina é de preferência caracterizada por um grau de metoxilação acima de 20 %, de preferência acima de 30 %, ainda mais preferencialmente acima de 50 %. A pectina tal como é utilizada no presente método tem um grau de polimerização (DP) médio entre 2 e 500, preferencialmente entre 10 e 250, e mais preferencialmente entre 20 e 50. Quando é usada uma mistura de pectinas com diferentes graus de polimerização, o DP médio da mistura de oligossacáridos de ácido é preferencialmente entre 3 e 1000, mais preferencialmente entre 3 e 250, ainda mais preferencialmente entre 3 e 50. Verificou-se que um DP mais baixo dos oligossacáridos melhora a palatabilidade e resulta num produto de viscosidade reduzida, se o oligossacárido ácido é administrado sob a forma líquida. A pectina é administrada de preferência numa 7 ΕΡ2164349Β1 quantidade entre 0,1 e 100 gramas por dia, de preferência entre 0,4 e 50 gramas por dia, ainda mais preferencialmente entre 1 e 20 gramas por dia.
Uma realização preferida compreende frutanos e produtos de degradação da pectina numa razão de 50:50 -95:5. De preferência, a razão é de 85:15, uma vez que esta é a razão entre oligossacáridos neutros e oligossacáridos ácidos tal como presentes no leite da mãe.
Bactérias probióticas
As bactérias probióticas que são adequadas para a utilização na invenção devem ter preferencialmente, pelo menos, um efeito positivo no modelo de alergia em ratinho, tal como descrito nos exemplos que se seguem. Os probióticos devem ainda ser recolhido na ausência substancial de alérgenos alimentares. Isto requer procedimentos especiais ou meios de cultura sem proteínas intactas para a preparação das bactérias probióticas. A presente invenção requer bactérias probióticas na ausência substancial de proteínas do leite.
As bactérias probióticas são bifidobactérias. Ainda mais preferida a bactéria probiótica é a Bifidobacterium breve. As Bifidobactérias tem o efeito de indução de tolerância mais forte nos modelos de ratinho utilizados e, por conseguinte, são as preferidas. Em particular a Bifidobacterium breve é altamente eficaz.
Numa outra realização preferida, as Bifidobactérias são não viáveis. Isto tem a vantagem de que a vida de prateleira do produto se torna mais longa, e que a atividade imunomoduladora das bactérias torna-se independente do número de bifidobactérias vivas. As experiências têm mostrado que os efeitos estimuladores imunitários de bactérias não viáveis é semelhante e, por vezes, ainda melhor do que a atividade de bifidobactérias 8 ΕΡ2164349Β1 vivas . A presente composição compreende preferencialmente de 102 a 1013 unidades formadoras de colónias (ufc) de bifidobactérias por grama de peso seco da presente composição, preferencialmente de 102 a 1012 ufc, mais preferencialmente de 105 a IO10 ufc, mais preferencialmente de 104 a 5 x 109 ufc.
Aminoácidos
Os aminoácidos podem ser utilizados na fórmula nutricional para bebés e crianças. No entanto, a composição dos aminoácidos na fórmula compreende, preferencialmente, todos os aminoácidos essenciais, exceto para os pacientes com fenilcetonúria (PKU) e erros do metabolismo não PKU inatos, e é preferivelmente otimizada para comida para bebé ou nutrição infantil. Os inventores descobriram depois que a composição de aminoácidos mais ideal deve ser tão próxima quanto possível da composição de aminoácidos da fração de proteina do leite de mães. Isto resulta numa composição de aminoácidos preferida, tal como representado na tabela 1 (veja-se infra).
Numa realização preferida, a composição compreende menos do que 1 % em peso de péptidos com base na proteína total, e mais do que 99 % em peso de aminoácidos livres com base na proteína total, compreendendo, pelo menos, os seguintes aminoácidos livres: alanina, arginina, ácido aspártico, cisteína, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina e glutamina. Fórmula A fórmula de acordo com a invenção compreende aminoácidos livres como fonte de azoto, gordura, incluindo uma mistura de gorduras que compreende LCPUFA e hidratos de carbono. São adicionados vitaminas e minerais de acordo 9 ΕΡ2164349Β1 com os requisitos da legislação. A presente composição fornece preferencialmente nutrição à criança, e compreende um componente lipidico, um componente proteico e um componente de hidratos de carbono. 0 componente lipidico fornece de preferência de 5 a 50 % das calorias totais, o componente proteico proporciona de preferência de 5 a 50 % das calorias totais, e o componente de hidrato de carbono fornece
preferencialmente de 15 a 90 % das calorias totais. A presente composição é utilizada preferencialmente como uma fórmula para crianças, em que o componente lipidico fornece de 35 a 50 % das calorias totais, o componente proteico proporciona de 7,5 a 12,5 % das calorias totais, e o componente de hidratos de carbono proporciona de 40 a 55 % das calorias totais. Para o cálculo da % de calorias totais para o componente proteico, deve ser tomado o total de energia fornecida pelos aminoácidos.
LCPUFA O teor de LC-PUFA com 20 e 22 átomos de carbono na presente composição não excede de preferência 15 % em peso do teor de gordura total, de preferência não excede 10 % em peso, ainda mais preferivelmente não excede 5 % em peso do teor de gordura total. Preferencialmente, a presente composição compreende pelo menos 0,1 % em peso, preferencialmente pelo menos 0,25 em peso, mais preferencialmente pelo menos 0,5 % em peso, ainda mais preferencialmente pelo menos 0,75 % em peso de LC-PUFA com 20 e 22 átomos de carbono do teor total de gorduras. O teor de ácido docosahexanóico (DHA) não excede preferencialmente 5 % em peso, mais preferencialmente não excede 1 % em peso, mas é pelo menos 0,1 % em peso da gordura total. Uma vez que o ácido araquidónico (AA) foi encontrado ser particularmente eficaz na redução da 10 ΕΡ2164349Β1 permeabilidade das estruturas celulares apertadas, a presente composição compreende quantidades relativamente altas, preferencialmente pelo menos 0,1 % em peso, ainda mais preferencialmente pelo menos 0,25 % em peso, mais preferencialmente pelo menos 0,5 % em peso da gordura total. 0 teor de AA não excede preferencialmente 5 % em peso, mais preferencialmente não excede 1 % em peso da gordura total. O excesso de metabolitos de AA pode causar inflamação. Assim, a presente composição compreende de preferência AA e D HA, em que a razão de peso AA / DHA é preferencialmente acima de 0,25, de preferência acima de 0,5, ainda mais preferencialmente acima de 1. A razão é de preferência abaixo de 25.
Os LC-PUFA são preferencialmente óleos de célula única derivados de não peixes, por exemplo, disponíveis a partir de Martek.
As caracteristicas preferidas para as composições de acordo com a invenção estão definidas nas tabelas 1-3. 11 ΕΡ2164349Β1
Tabela 1. Teor de aminoácido da composição de acordo com a invenção
Aminoácido Unidades Teor de AA como percentagem do total de AA Intervalo Criança 0 (g / 100 g) - 1 ano Criança 1 - 10 anos Ala gm 3, 95 4,01 3,12 3, 03 Arg gm 6, 99 7, 02 14,24 13, 91 Asp gm 6,54 6,57 5,73 5,59 Cys gm 2,59 2,58 1,85 2,91 Ácido Glu gm 0,00 0,00 0,00 Gly gm 6, 15 6, 12 5, 11 5, 01 His gm 4,02 3, 99 3,71 3, 61 ISO gm 6,15 6, 12 5, 11 5, 01 Leu gm 10,56 10,51 8,54 8,32 Lys gm 7,19 7, 19 6,25 6,11 Meth gm 1,68 1, 69 4,02 3, 90 Phe gm 7,51 7,47 7,10 6, 93 Pro gm 4,73 4,72 5, 97 5, 82 Ser gm 4,60 4, 61 3, 71 3, 61 thr gm 5, 18 5, 17 4,29 4,19 Try gm 2,07 2, 08 1,72 1,69 tyr gm 4,73 4,72 1,44 1,40 Vai gm 6, 74 6, 74 5, 42 5, 30 Car gm 0,06 0, 06 0, 10 0,12 tau gm 0,19 0,20 0, 17 0,17 Glu gm 8,42 8,43 12,35 13, 39 total gm 100 100 99, 97 100
Perfil nutricional da fórmula para crianças de acordo com a invenção (pó) Unidades Nível / 100 g Nível / 100 kcal Equivalente proteico gm 13 2,9 Energia kcals 455 100 Nitrogénio gm 2,1 Hidrato de carbono gm 49 10,8 Gordura (total) gm 23 5,1 (MCT) o. 0 33 (LCT) o. 0 67
Tabela 2. Fórmula nutricional infantil para crianças _alérgicas 12 ΕΡ2164349Β1 ΕΡ2164349Β1 Tabela 3. Intervalos na composição de ácidos gordos poli-insaturados de cadeia longa (LCP)_ % de ácidos gordos Preferida Intervalo de +/- 25 % Ácido araquidónico 0,35 0,26 0,44 Ácido docosahexanóico 0,20 0,15 0,25 LCP total 0,55 0,41 0,69
Os intervalos preferidos na composição de oligossacáridos são 0,4 - 1,2 g / 100 ml, em que 85 % em peso é scFOS e IcFOS, e 15 % em peso é hidrolisado de pectina. De preferência, a razão scFOS para IcFOS é entre 2 e 20, ainda mais preferivelmente a razão é de 9.
Uma realização preferida de formulação em pó nutricionalmente completa, livre de proteína do leite e alérgeno de acordo com a invenção, que é adequada para diluição com água para formar uma alimentação entérica compreende:
Componente
Por 100 g de pó
Equivalente proteico (g) 13
Aminoácidos totais (g) 15,5
Gordura total (g) 23 Óleo de girassol (g) 4 Óleo de coco fracionado (g) 7 Óleo de canola (g) 4 Óleo de girassol de oleico elevado (g) 6,6 Óleo de ARASCO™ (g) 0,21 Óleo de DHASCO™ (g) 0,11
Hidrato de carbono: maltodextrina (g) 49
Prebiótico (g) 5,33
ScFOS (g) 4,1
IcFOS (g) 0, 43 AOS (g) 0, 8
Probiótico: B breve (unidades formadoras de colónias; UFC) 1 x 1010
Outras vitaminas / minerais / oligoelementos Equilíbrio A formulação anterior fornece aproximadamente 455 kcal de energia por 100 g de pó. A formulação pode ser diluída com água fervida, arrefecida, para proporcionar uma concentração recomendada 13 ΕΡ2164349Β1 de 15 % p/v.
Usos
De preferência a composição é utilizada para o tratamento de uma criança (em particular com uma constituição atópica) que sofre de a. cólica, congestão, nariz a pingar, pieira, vómitos, diarreia, fezes com sangue, muco nas fezes, prurido, eczema, refluxo gastroesofágico, esofagite eosinofilica ou asma; b. alergia ao leite de vaca e/ou intolerância alimentar a proteína; e/ou c. infeções. A composição também pode ser utilizada de preferência para melhorar as características das fezes das crianças que sofrem dos sintomas mencionados anteriormente. A composição é concebida especificamente para crianças entre 0 e 3 anos. Com algumas adaptações no perfil de aminoácidos (veja-se a tabela 1) a composição também é adequada para crianças entre 3 e 10 anos de idade. As crianças alérgicas muitas vezes sofrem de diarreia, mas a obstipação também ocorre. Pode ser utilizada uma composição preferida para prevenir e tratar estes sintomas que compreende fibras de acordo com a composição do leite materno, em que a razão scFOS / lcFOS é de 9:1 e, adicionalmente, está presente hidrolisado de pectina.
EXEMPLOS A fim de determinar os efeitos imunoestimulantes de oligossacáridos e de probiótico Bifidobacterium breve foram realizados testes (TD1) num modelo de vacina em 14 ΕΡ2164349Β1 ratinho internacionalmente reconhecido (figura 1) e num modelo de alergia (figura 2) .
Materiais e método do modelo de vacina
Ratinhos
Foram obtidos ratinhos fêmeas C57BI/6JOIaHsd com 6 e 8 semanas de idade a partir de Harlan (Horst, Holanda), e foram mantidos em condições normais com um ciclo de 12 h de luz e escuro, e livre acesso a comida e água. Todas as experiências foram aprovadas por uma comissão independente de experiências com animais (DEC Consult, Bilthoven, Holanda).
Dietas e preparações de oligossacáridos
Todos os animais receberam dietas à base de AIN-93G semipurifiçada (Research Diet Services, Wijk bij Duurstede, Holanda). Todos os produtos de oligossacáridos suplementados foram trocados pela mesma quantidade de hidratos de carbono totais, para manter este parâmetro igual. Para além disso, esta abordagem resultou numa composição de hidratos de carbono global comparável em dietas diferentes, para assegurar que a flora intestinal foi influenciada minimamente por diferenças entre dietas de controlo e de teste nos parâmetros tais como o tempo de passagem pelo intestino e retenção de liquidos. Os oligossacáridos foram misturados na dieta AIN-93G e prensado em grânulos.
Protocolo de vacinação e resposta de DTH
As experiências de vacinação foram realizadas utilizando Influvac (Solvay Pharmaceuticals, Weesp,
Holanda) da temporada 2002 / 2003. É uma vacina do vírus 15 ΕΡ2164349Β1 da gripe inativado com base em hemaglutinina (HA) e antigénios de neuraminidase isolados de três estirpes de influenza mixovirus, numa dose eguivalente a 30 pg/ml de HA por estirpe (90 pg/ml de HA no total). Foi utilizado um adjuvante de óleo em todas as vacinações (Stimune, conhecido anteriormente como Specol; Cedi-diagnostics, Lelystad, Holanda). Os ratinhos receberam uma vacinação primária e uma vacinação de reforço, que consiste de uma injeção via subcutânea (sc) de uma mistura 1:1 de vacina e adjuvante num volume total de 100 μΐ. A vacinação de reforço foi dada 21 dias após a vacinação primária. As experiências terminaram 10 dias após a vacinação de reforço. Foram recolhidas amostras de sangue (por punção retro-orbital) antes da vacinação primária e secundária e, no fim da experiência. Os grupos de controlo negativos que foram incluídos em todas as experiências (indicados por grupo "sham") receberam injeções com uma mistura 1:1 de PBS e adjuvante num volume total de 100 μΐ. Os grupos "sham" nunca foram usados para comparações estatísticas para grupos suplementados, mas serviram apenas para demonstrar a especificidade das respostas induzidas pela vacina. As reações DTH foram induzidas 9 dias após a vacinação de reforço, por injeção subcutânea de 25 μΐ de Influvac no pavilhão auricular de ambas as orelhas. A espessura da orelha foi medida em duplicado antes do desafio da vacina, e depois de 24 h, usando um micrómetro digital (Mitutoyo Digimatic 293561, Veenendaal, Holanda). A resposta DTH foi calculada subtraindo a espessura basal da orelha a partir do valor às 24 h após o desafio. 16 ΕΡ2164349Β1
Material e métodos do modelo de alergia à proteína do leite de vaca
Produtos químicos A caseína e o soro de leite são obtidos a partir de DMV internacional, Veghel, Holanda. A toxina da cólera é adquirida de Quadratech Diagnostics, Epsom, Reino Unido. 0 PBS é comprado de Cambrex Bio Science, Verviers, Bélgica. 0 tampão de revestimento de Elisa é obtido a partir de Sigma, Alphen aan den Rijn, Holanda. A IgE de rato antirratinho marcada com biotina é comprada de BD Biosciences, Alphen aan den Rijn, Holanda. Todos os outros produtos químicos são obtidos a partir de Sigma-Aldrich-Chemie, Zwijndrecht, Holanda.
Sensibilização oral e desafio de ratinhos
Foram adquiridos ratinhos fêmea C3H/He0uJ livres de patógenos específicos de três a 5 semanas de idade (n = 4 - 6 por grupo) de Charles River Laboratories (Maastricht, Holanda), mantidos com ração de ratinho livre de proteína do leite de vaca (Special Diets Services, Witham, Essex, Reino Unido), e alojados no biotério da Universidade de Utrecht. Os cuidados com os animais e o seu uso foram realizados de acordo com as diretrizes do Comité Holandês de Experimentação Animal. Os ratinhos foram sensibilizados por via intra gástrica (ig) com 0,5 ml de caseína homogeneizada (40 mg/ml de PBS) com toxina da cólera (CT, 20 μΐ/ml de PBS) na forma de um adjuvante, utilizando uma agulha romba. Os ratinhos de controlo receberam CT sozinha ou PBS. Os ratinhos foram reforçados por semana durante um período de 6 semanas, uma semana após a última sensibilização os ratinhos foram desafiados com 100 mg ig de caseína. 17 ΕΡ2164349Β1
Foram recolhidas amostras de sangue e foram depois centrifugadas (15 minutos a 13.500 rpm). Os soros foram armazenados a - 70 °C. Os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical, meia hora depois do desafio ig.
Resposta específica da pele a alérgeno A resposta aguda específica da pele a alergéno foi medida após a injeção da proteína especifica no pavilhão auricular. Antes do desafio ig (t = 0) , o controlo, os ratinhos sensibilizados com caseína foram injetados por via intra dérmica (id) na orelha esquerda com 20 μΐ de caseína homogeneizada (0,5 mg/ml em PBS), respetivamente. Na orelha direita foram injetados 20 μΐ de PBS como um controlo do veículo. Para além disso, os ratinhos de CT e PBS receberam um desafio de ouvido de caseína usando injeções de PBS como controlo. A espessura da orelha foi medida em duplicado utilizando um micrómetro digital (Mitutoyo, Veenendaal, Holanda), a 0, 1, 4 e 24 horas após o desafio. 0 inchaço da orelha especifico do alérgeno foi calculado subtraindo-se a espessura basal (Oh) e a de controlo (orelha direita) a partir do valor medido nos três pontos de tempo diferentes (1, 4 e 24 h).
Medição dos níveis de imunoglobulina no soro e de protease-1 de mastócitos de ratinho
Foram determinadas por meio de ELISA as concentrações dos níveis de IgE total e de caseína ou de IgE, IgGl e IgG2a específicas de soro de leite no soro de ratinhos sacrificados. As placas Microlon (Greiner, Alphen aan den Rijn, Holanda) foram revestidas com caseína em tampão de revestimento ou com IgE de rato antirratinho (1 pg/ml) em PBS durante 18 horas a 4 °C. As placas foram lavadas e foram bloqueadas durante 1 hora com 5 % de BSA. As 18 ΕΡ2164349Β1 amostras de soro foram aplicadas em várias diluições e foram incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas 5 vezes e foram incubadas com 1 pg de IgE de rato antirratinho marcada com biotina durante uma hora e meia hora à temperatura ambiente. Depois de lavadas, as placas foram incubadas com peroxidase de rábano (HRP) durante uma hora, foram lavadas e foram reveladas com o-fenilenodiamina (OPD). A reação foi parada com 4 M de H2S04 e a absorvância foi medida a 490 nm num leitor de microplacas Benchmark (Biorad, Califórnia, EUA) . As concentrações no soro da protease-1 de mastócitos de ratinho (mMCP-1) foram determinadas tal como descrito anteriormente, utilizando um kit de ELISA disponível comercialmente (Moredun Scientific Ltd., Midlothian, Reino Unido).
Os resultados do modelo de vacina em ratinho são mostrados na figura 1, a partir da qual é evidente que a combinação de TD1 (= Bifidobacterium breve) proporciona o efeito mais forte sobre a resposta de DTH, e é significativamente melhor do que TD1 sozinho ou qualquer outra combinação testada.
Os resultados do modelo de alergia a caserna em ratinho são mostrados na figura 2, e demonstram que a combinação de fibra dietética e TD1 inibe sinergicamente a resposta "alergénica" DTH a caseina. 19 ΕΡ2164349Β1
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • WO 2005039319 A [0007] • WO 2007054989 A [0007] • WO 2006091103 A [0007]
Lisboa, 1 de Dezembro de 2014 20
Claims (16)
- ΕΡ2164349Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma composição que compreende mais do que 99 % em peso de aminoácidos livres com base na proteina total, uma fonte de ácidos gordos que compreende ácidos gordos poli-insaturados de cadeia longa, uma fonte de hidratos de carbono que compreende hidratos de carbono digeríveis e não digeríveis, e Bifidobacteria livre de proteina do leite, para o fabrico de uma composição para o tratamento de uma pessoa que sofre de a. cólica, congestão, nariz a pingar, pieira, vómitos, diarreia, fezes com sangue, muco nas fezes, prurido, eczema, refluxo gastroesofágico, esofagite eosinofílica ou asma; b. alergia ao leite de vaca e/ou intolerância alimentar a proteína; e/ou c. infeções, em que o hidrato de carbono não digerível é selecionado a partir de uma fonte livre de proteína de leite, e a composição total é essencialmente livre de proteínas intactas.
- 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a pessoa é uma criança na idade entre 0 e 36 meses.
- 3. Utilização de uma composição que compreende aminoácidos livres como fonte única de aminoácidos, uma fonte de ácidos gordos que compreende ácidos gordos poli-insaturados de cadeia longa, uma fonte de hidratos de carbono que compreende hidratos de carbono digeríveis e não digeríveis, e Bifidobacteria livre de proteína de leite, para o fabrico de uma composição para estimular a maturação do sistema imune numa criança com uma constituição atópica, em que o hidrato de carbono não 1 ΕΡ2164349Β1 digerível é selecionado a partir de uma fonte livre de proteína de leite e a composição total é essencialmente livre de proteínas intactas.
- 4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que os aminoácidos livres com base na proteína total, compreendem pelo menos os seguintes aminoácidos livres: alanina, arginina, ácido aspártico, cisteína, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina e glutamina.
- 5. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que os aminoácidos compreendem entre 5 - 16 % de energia da composição total, entre 30 - 60 % de energia de gordura, da qual entre 0,1 -5 % de energia de LCPUFA e entre 25 - 75 % de energia de hidratos de carbono digeríveis.
- 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que LCPUFA compreende entre 0,2 - 1 % de energia da composição total.
- 7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, em que os hidratos de carbono não digeríveis compreendem (i) frutano solúvel com um grau médio de polimerização entre 3 e 200 e (ii) um ácido galacturónico solúvel com um grau médio de polimerização entre 3 e 200.
- 8. Composição que compreende um componente proteico, um componente de gordura, um componente de hidrato de carbono digerível, um hidrato de carbono não digerível e bifidobactérias livres de proteína de leite em que: 2 ΕΡ2164349Β1 (a) o componente de proteína compreende mais do que 99 % em peso de aminoácidos livres com base na proteína total, e compreende, pelo menos, os seguintes aminoácidos livres: alanina, arginina, ácido aspártico, cisteína, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina e glutamina; (b) o componente de hidratos de carbono digeríveis contém menos do que 2 % em peso de lactose com base nos hidratos de carbono digeríveis totais; (c) o hidrato de carbono não digerível compreende frutano solúvel com um DP médio entre 2 e 200, e um ácido galacturónico solúvel com um DP médio entre 2 e 200; e (d) o componente de gordura compreende entre 0,1 e 5 % em peso de LCPUFA com base no teor total de ácido gordo.
- 9. Composição de acordo com a reivindicação 8, em que: o componente de gordura compreende entre 0,2 e 1 % em peso de LCPUFA com base no teor total de ácidos gordos.
- 10. Composição de acordo com a reivindicação 8 ou 9, que compreende frutano não digerível, solúvel, com um DP médio entre 2 e 200, e um ácido galacturónico não digerível, solúvel com um DP médio entre 2 e 200.
- 11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 10, que compreende Bifidobacterium breve.
- 12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 11, que compreende ácido 3 ΕΡ2164349Β1 araquidónico e/ou ácido docosahexanóico.
- 13. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 12, em que o hidrato de carbono não digerível consiste de FOS de cadeia longa e de FOS de cadeia curta.
- 14. Composição de acordo com a reivindicação 13, em que o FOS de cadeia longa tem um DP médio entre 10 - 60 e o FOS de cadeia curta tem um DP médio entre 3 e 10.
- 15. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 14 em que o produto é um pó ou um líquido.
- 16. Uma composição que compreende aminoácidos livres como uma fonte única de proteína, uma fonte de ácidos gordos que compreende ácidos gordos poli-insaturados de cadeia longa, uma fonte de hidratos de carbono que compreende hidratos de carbono digeríveis e não digeríveis, e Bifidobacteria livre de proteína do leite, em que o hidrato de carbono não digerível é selecionado a partir de uma fonte livre de proteína de leite, e a composição total é essencialmente livre de proteínas intactas para a utilização no tratamento de uma pessoa que sofre de (a) cólica, congestão, nariz a pingar, pieira, vómitos, diarreia, fezes com sangue, muco nas fezes, prurido, eczema, refluxo gastroesofágico, esofagite eosinofílica ou asma; (b) alergia ao leite de vaca e/ou intolerância alimentar a proteína; (c) e/ou infeções. Lisboa, 1 de Dezembro de 2014 4
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