JP2002529066A

JP2002529066A - 結合組織成長因子（ｃｔｇｆ）および使用方法

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Publication number: JP2002529066A
Application number: JP2000581045A
Authority: JP
Inventors: シュミッド，ブリアン，フレデリック; アレン，マーガレット，レア; セバードルップ，フラン; カーマイケル，ダビッド，エフ．
Original assignee: ファイブローゲン、インコーポレーテッド
Priority date: 1998-11-06
Filing date: 1999-11-05
Publication date: 2002-09-10
Anticipated expiration: 2019-11-05
Also published as: JP4698837B2; US6348329B1; HK1039342A1; US6358741B1; KR20010102943A; US20020115156A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ラット結合組織成長因子（CTGF）、CTGFを製造するための方法、ならびにCTGF若しくはその誘導体の使用に関する治療方法を提供する。さらに本発明は、CTGFの活性を調節する方法ならびにCTGFに関係がある細胞増殖性障害を改善する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は一般的に成長因子の分野に関し、さらに特定すると結合組織成長因子
（CTGF）およびCTGFの活性を調節する方法に関する。

【０００２】発明の背景成長因子とは、広い意味で、個体発生ならびに組織の形態および機能の維持の
両方を制御する、多機能性、局所作用性、細胞内シグナル伝達性のポリペプチド
として定義することができる。多くの癌原遺伝子のタンパク質産物が成長因子お
よび成長因子受容体として同定されている。哺乳動物中で最初に発見された多く
の癌遺伝子の正常変異体も、酵母、ショウジョウバエおよびカエルなどの異種の
生物体のゲノム中に存在し、胚発生中に機能する。

【０００３】成長因子はターゲット細胞を刺激して、発生中の組織中で増殖、分化および組
織化する。成長因子の作用は、細胞内でのシグナル伝達事象を刺激する特定の受
容体への結合に依存する。成長因子の例として、血小板由来成長因子（PDGF）、
インスリン様成長因子（IGF-I、IGF-II）、トランスフォーミング成長因子ベー
タ（TGF-β）、トランスフォーミング成長因子アルファ（TGF-α）、表皮成長因
子（EGF）、酸性および塩基性線維芽細胞成長因子（aFGF、bFGF）および結合組
織成長因子（CTGF）が含まれ、これらは細胞を刺激して増殖させることが知られ
ている。

【０００４】 PDGFは循環血小板のアルファ顆粒中に発見されたカチオン性の熱安定性タンパ
ク質であり、線維芽細胞および平滑筋細胞などの結合組織細胞に関するマイトジ
ェンおよび走化性作用剤として知られている。この分子の活性によって、PDGFは
創傷の正常な癒合に関与する主要な因子であり、またアテローム性動脈硬化症お
よび線維形成性症状などの症状に病理学的に寄与するものと信じられている。PD
GFはαおよび／またはβ鎖の組合せで構成される二量体分子である。この鎖はヘ
テロ二量体またはホモ二量体を形成し、今日まで単離されたすべての組合せが生
物学的に活性である。

【０００５】組織の再生および修復における各種の成長因子の役割の研究から、PDGF様タン
パク質の発見がもたらされた。これらのタンパク質は免疫学的および生物学的活
性の両方においてPDGFと共通しており、PDGFに特異的な抗体によってブロックす
ることができる。

【０００６】ポリペプチド成長因子およびサイトカインは母体子宮と発生中の胚若しくは胎
児間の成長シグナル伝達経路を形成するらしい重要なクラスの子宮タンパク質と
して明らかになってきている。多様な種における研究から、EGF、結合組織EGF様
成長因子（HB-EGF）、IGF-I、IGF-II、aFGF、bFGF、プレイトロフィン（PTN）、
白血病抑制因子、コロニー刺激因子-1（CSF-1）およびTGF-αがこれらのプロセ
スに関与する子宮成長調節性分子の中に入るらしいことが示唆された。

【０００７】 CTGFはM38,000のシステインに富むモノマー性ペプチドで、結合組織細胞に関
するマイトジェンおよび走化性活性を持つ成長因子である。CTGFは細胞で分泌さ
れ、特異的な細胞表面受容体との相互作用に対して作用する。CTGFはPDGFのα若
しくはβ鎖遺伝子には無関係な遺伝子の産物である。これは成長調節因子のファ
ミリーのメンバーで、これとしてマウス（fisp-12若しくはβIG-M2としても知ら
れている）およびヒトCTGF、Cyr61（マウス）、Cef10（ニワトリ）、ならびにNo
v（ニワトリ）が含まれる。配列の比較に基づいて、このファミリーのメンバー
はすべて、(1)結合に関わるインスリン様成長因子ドメイン、(2)複合体形成に関
わるvon Willebrand因子ドメイン、(3)おそらくマトリックス分子の結合に関わ
るトロンボスポンジンI型反復、および(4)マトリックスタンパク質中にみられ、
受容体の結合に関わると仮定されるC-末端モジュール、で構成される、モジュー
ル型構造を持っていることが示唆された。

【０００８】ヒトCTGF（hCTGF）のためのcDNAの配列は1047ヌクレオチドのオープンリーデ
ィングフレームを含み、位置130に開始部位、および位置1177にTGA終止部位を持
ち、349アミノ酸のペプチドをコードする。CTGF cDNAとPDGFのα若しくはβ鎖の
いずれかのcDNA間には40％の配列相同性しかない。

【０００９】 hCTGFオープンリーディングフレームは39個のシステイン残基を含むポリペプ
チドをコードし、複数の細胞内ジスルフィド結合を持つタンパク質であることを
意味している。このペプチドのアミノ末端は分泌されるタンパク質を示す疎水性
シグナル配列を含み、アミノ酸配列中のアスパラギン残基28および225に２つのN
-結合グリコシル化部位がある。CTGFポリペプチドとCEF-10 mRNA転写物によって
コードされるポリペプチド間には全体で45％の配列相同性があり、推定上の選択
的スプライシング領域を欠失させると、相同性は52％に達する。

【００１０】ペプチド配列相同性はあるとしてもごくわずかであるが、CTGFはPDGFに抗原性
について関連がある。抗PDGF抗体はPDGF若しくはCTGFの非還元型に対して高親和
性で、生物学的活性を欠如したこれらのペプチドの還元型に対しては10倍親和性
が少ない。このことは、PDGF異性体とCTGF分子間には共通する三次構造の領域が
あって、その結果共通の抗原エピトープがあることを示唆している。

【００１１】 CTGFの合成および分泌は、TGF-β、BMP-2およびおそらくTGF-βスーパーファ
ミリーのタンパク質のその他のメンバーによって選択的に誘導される。TGF-βは
ソフトアガー中で正常な線維芽細胞の成長を刺激することができるが、CTGFのみ
では線維芽細胞中でこの特性を誘導することができない。しかし、CTGFの合成お
よび作用は、TGF-βにとって足場非依存性線維芽細胞の増殖を刺激するのに不可
欠であることが示されている。

【００１２】 CTGFまたはその断片が創傷の癒合における成長因子として機能するものと見ら
れる。病理学的には、全身性硬化症、癌、線維形成性症状およびアテローム性動
脈硬化症などの結合組織細胞の過剰増殖がある症状にCTGFが関与するものと仮定
されてきた。

【００１３】 CTGFポリペプチドの主要な生物学的活性はその分裂原性、またはターゲット細
胞を刺激して増殖させる能力、および細胞外マトリックスの合成におけるその役
割である。このin vivoでのマイトジェン活性の最終的な結果はターゲット組織
の成長である。CTGFは走化性活性をも所有している。これは特定の分子との相互
作用の結果として化学的に誘導される細胞の運動である。

【００１４】発明の概要本発明はラット結合組織成長因子（CTGF）として同定されたポリヌクレオチド
およびそれによりコードされるポリペプチドを提供する。本発明の１態様によれ
ば、新規な組換えCTGF、ならびにその活性な断片、類似体および誘導体が提供さ
れる。

【００１５】本発明の別の態様によれば、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNAを含む、本発明のCT
GFをコードする単離された核酸分子、ならびにそのタンパク質の活性な類似体お
よび断片が提供される。

【００１６】さらに別の態様において、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸配
列を含有する組換え原核および／または真核宿主細胞を、このタンパク質の発現
およびその後のこのタンパク質の回収を促進するような条件下で培養することを
含む、組換え技術によるCTGFポリペプチドの製造方法を提供する。本発明のさら
なる態様において、CTGFに結合する抗体が提供される。

【００１７】別の態様において、本発明は細胞中のCTGFターゲット核酸配列に相補的な連続
ヌクレオチド配列を含む、細胞中でのCTGFの発現を抑制するためのポリヌクレオ
チドを提供するが、この場合、該ポリヌクレオチドはCTGFターゲット核酸配列に
ハイブリダイズすることによって、細胞中で抑制されないCTGFの発現レベルに比
較して、CTGFの発現を抑制する。

【００１８】さらに本発明は、細胞中のCTGFターゲット核酸配列に相補的な連続ヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチドと細胞を接触させることを含む、細胞中でのCTGF
の発現を抑制するための方法を提供するが、この場合、該ポリヌクレオチドは細
胞中でCTGFの発現を抑制する。

【００１９】さらに別の本発明の態様によれば、細胞中のCTGFターゲット核酸配列に相補的
な連続ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを被験体に投与することを
含む、被験体中でのCTGFの発現を抑制するための方法を提供するが、この場合、
該ポリヌクレオチドは被験体中でCTGFの発現を抑制するのに十分なレベルで発現
される。

【００２０】別の実施形態において、本発明はCTGFに関係がある障害の治療用の医薬組成物
を提供する。この医薬組成物は製薬上許容される担体とCTGF核酸に結合するオリ
ゴヌクレオチドの治療上有効な量を含む。

【００２１】図面の簡単な説明（図面の簡単な説明については下記参照。）以下の図面は本発明の実施形態を説明するためのものであって、特許請求の範
囲によって包括される本発明の範囲を限定するつもりではない。

【００２２】本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかにな
るであろう。しかし、詳細な説明および特定の実施例は本発明の好ましい実施形
態を示すものではあるが、単に説明のために掲載するものである。なぜならば、
この詳細な説明から、本発明の精神および範囲内の各種の変更および改変が当業
者に明らかになるはずだからである。

【００２３】発明の詳細な説明本発明はラット結合組織成長因子（CTGF）の核酸配列およびそれにコードされ
るタンパク質を開示する。このタンパク質は哺乳動物組織の正常な発生、成長お
よび修復において重要な役割を持つらしい。CTGFの生物学的活性はPDGFのものと
類似しているが、CTGFはPDGFのα若しくはβ鎖遺伝子には無関係な遺伝子の産物
である。CTGFは内皮および線維芽細胞によって産生され、これら両者は創傷の部
位に存在するので、おそらくCTGFは創傷の癒合における成長因子として機能する
ものと見られる。病理学的には、CTGFは癌、線維形成性疾患およびアテローム性
動脈硬化症などの結合組織細胞の過剰増殖がある疾患に関与するらしい。CTGFポ
リペプチドは皮膚の創傷の癒合障害があるか、または正常な癒合機構を強化する
必要がある場合に、治療剤として有用になり得る。治療上は、CTGFが組織の過剰
増殖を誘導している疾患において、CTGFの生物学的活性を中和するために、抗体
または抗体分子の断片を使用することもできる。

【００２４】 CTGFポリペプチドの主要な生物学的活性の１つはその分裂原性、またはターゲ
ット細胞を刺激して増殖させる能力である。このin vivoでのマイトジェン活性
の最終的な結果はターゲット組織の成長である。CTGFポリペプチドの第２の活性
は、このポリペプチドまたはその断片がコラーゲンの蓄積（ECM）を含む細胞外
マトリックスの創出および発生において果たす役割に関係する。CTGFは走化性活
性をも有している。これは特定の分子との相互作用の結果として化学的に誘導さ
れる細胞の運動である。好ましくは、本発明のCTGFは結合組織細胞について分裂
原性および化学走性であるが、その他の細胞タイプも同様にCTGFポリペプチド応
答性であり得る。

【００２５】本明細書で使用する用語「実質的に純粋な」とは、天然で関係する別のタンパ
ク質、脂質、炭水化物またはその他の物質を実質的に含まないCTGFを意味する。
実質的に純粋なCTGFポリペプチドは非還元ポリアミドゲル上で単一の主要バンド
を生成するはずである。CTGFの純度はアミノ末端アミノ酸配列分析によって判定
することもできる。本明細書で定義するCTGFにはCTGFの生物学的活性（例えば、
当分野で普通の、および本明細書中で教示する標準的なアッセイを使用して判定
したときに、線維芽細胞中で生物学的応答を誘導すること）が維持されている限
り、このポリペプチドの機能的な断片も含まれる。CTGFの生物学的活性を含有し
ているさらに小さいポリペプチドが本発明に含まれる。その他、例えばCTGFポリ
ペプチドcDNAの部位特異的突然変異誘発によって産生される、さらに効果的なCT
GFが含まれる。「組換え」CTGFとは、組換えDNA技術によって製造される、すな
わち所望のCTGFポリペプチドをコードする外因性DNA構築物によって形質転換さ
れた細胞から産生されるCTGFポリペプチドを意味する。「合成」CTGFは化学合成
によって調製されるものである。特定のCTGFポリペプチド「の配列をコードする
」DNAまたは「をコードするヌクレオチド配列」とは、適切な調節配列の制御下
に置かれたときに、転写されてCTGFポリペプチドに翻訳されるDNA配列である。

【００２６】本発明は、CTGFタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。これら
のポリヌクレオチドとして、結合組織成長因子をコードするDNA、cDNAおよびRNA
配列が含まれる。CTGFの分裂原性ECMおよび／または走化性活性を有するポリペ
プチドをコードする限り、CTGFの全部または一部をコードするすべてのポリヌク
レオチドも本発明に含まれるものと理解されたい。こうしたポリヌクレオチドと
して、天然のポリヌクレオチド、および意図的に操作されたポリヌクレオチドの
両方が含まれる。例えば、CTGFポリヌクレオチドに部位特異的突然変異を誘発す
ることができる。本発明のポリヌクレオチドとして遺伝コードの結果として縮重
した配列が含まれる。天然のアミノ酸はわずかに20種であり、その大部分は２以
上のコドンによって特定される。したがって、CTGFのアミノ酸配列が機能的に変
化しない限り、すべての縮重ヌクレオチド配列が本発明に含まれる。

【００２７】ラットCTGFのためのcDNA配列（図１）は位置212に開始部位と位置1353にTAA終
止部位を持つ2350ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含み、346個
のアミノ酸のペプチドをコードする。

【００２８】「単離された核酸」とは、由来源の生物の天然に生起するゲノム中に存在する
場合に正常では直接連続している5'および3'隣接配列と、直接連続していない核
酸、例えばDNAまたはRNA分子を意味する。したがって、この用語は、例えばプラ
スミド若しくはウイルスベクターなどのベクター中に組み込まれた核酸、異種細
胞のゲノム（若しくは同種細胞のゲノムであるが天然に生起するものとは異なる
部位にあるもの）中に組み込まれた核酸、ならびに別個の分子として存在する核
酸、例えばPCR増幅若しくは制限酵素消化によって製造されたDNA断片、またはin
vitro転写によって製造されたRNA分子、を示す。この用語は、例えば融合タン
パク質の製造において使用することができる、追加のポリペプチドをコードする
ハイブリッド遺伝子の部分を形成する、組換え核酸をも示す。

【００２９】本発明の核酸分子を、CTGF遺伝子産物（例えばCTGF RNAおよびCTGFポリペプチ
ド）の製造のための標準的な方法における鋳型として使用することができる。そ
の上、CTGFポリペプチドをコードする核酸分子（およびその断片）、さらに(1)
当分野で既知の非ラットCTGFをコードする配列以外の、CTGFポリペプチドをコー
ドする核酸に相補的であるか、これらとハイブリダイズする配列を含有する核酸
、またはその断片（例えば少なくとも10、12、15、20、若しくは25ヌクレオチド
）ならびに(2)当分野で既知の非ラットCTGFをコードする配列以外の、CTGFポリ
ペプチドをコードする核酸に相補的な配列とハイブリダイズする配列を含有する
核酸、またはその断片（例えば少なくとも10、12、15、20、若しくは25ヌクレオ
チド)、などの関連核酸を、それらのハイブリダイズ特性に着目した方法におい
て使用することができる。例えば、以下にさらに詳細に記載するように、こうし
た核酸分子を以下の方法において使用することができる：CTGF核酸を合成するた
めのPCR法、サンプル中のCTGF核酸の存在を検出するための方法、新規なCTGFフ
ァミリーメンバーをコードする核酸を同定するためのスクリーニング法。スクリ
ーニング法のために有用なオリゴヌクレオチドプローブは長さが10から約150ヌ
クレオチドである。さらにこうしたプローブは好ましくは長さが10から約100ヌ
クレオチドであり、さらに好ましくは長さが10から約50ヌクレオチドである。

【００３０】本発明には、配列番号１の他にCTGFポリペプチドファミリーのメンバーをコー
ドする核酸分子を同定するための方法も含まれる。これらの方法において、CTGF
ポリペプチドをコードする核酸を含有するサンプル、例えばラットcDNAライブラ
リーなどの核酸ライブラリーをCTGF特異的プローブ、例えばCTGF特異的核酸プロ
ーブでスクリーニングする。CTGF特異的核酸プローブはCTGFポリペプチドをコー
ドする核酸またはそれに相補的な配列に特異的にハイブリダイズする核酸分子（
例えば、DNA若しくはRNAヌクレオチド、またはそれらの組合せ若しくは改変体を
含む分子）である。本発明のこの方法に関係した用語「CTGF特異的プローブ」は
、ラットCTGFポリペプチドをコードする核酸またはそれに相補的な配列に、その
他のタンパク質をコードする核酸またはそれに相補的な配列に対するよりも検出
し得る程度に多く結合するプローブを称する。

【００３１】本発明はCTGF特異的核酸プローブの製造を容易にする。こうしたプローブを取
得するための方法は、図１に示すアミノ酸配列に基づいて設計することができる
。少なくとも10、例えば15、25、35、50、100若しくは150ヌクレオチドを含有す
るプローブをいくつかの標準的な方法（例えばAusubelら、上記、参照）のいず
れかを使用して製造することができる。例えば、好ましくはPCR増幅法を使用し
て、プローブを作成する。これらの方法において、CTGF特異的アミノ酸を含むCT
GF保存配列（図１参照）に対応するプライマーを設計し、生成するPCR産物をプ
ローブとして使用して、cDNAライブラリーなどの核酸ライブラリーをスクリーニ
ングする。

【００３２】本発明の全長遺伝子の断片をcDNA若しくはゲノムライブラリーのためのハイブ
リダイゼーションプローブとして使用して、全長DNAを単離し、またこの遺伝子
に高度な配列類似性または同様の生物学的活性を持つ別のDNAを単離することが
できる。このタイプのプローブは少なくとも10、好ましくは少なくとも15、およ
びさらに好ましくは少なくとも30塩基を持ち、また例えば少なくとも50若しくは
それ以上の塩基を含んでいてもよい。このプローブを使用して、全長転写物に対
応するDNAクローン、さらに調節およびプロモーター領域、エキソンならびにイ
ントロンを含む完全遺伝子を含有するゲノムクローンまたはクローン群を同定す
ることができる。

【００３３】本発明は、図１に開示するラットCTGFをコードする単離された核酸分子（配列
番号１）の他に、実質的に同様の配列をも提供する。単離された核酸配列は、(i
)以下に記載するストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズする
ことができるか、または(ii)配列番号１と縮重性であるDNA配列をコードし、こ
うした単離された核酸配列が既知の形態のCTGF（例えばヒトCTGF）をコードしな
いならば、実質的に同様である。縮重性DNA配列は配列番号２のアミノ酸配列を
コードするが、ヌクレオチドコード配列中に変異を持つ。本明細書で使用する「
実質的に同様の」とは、本発明の配列と同様の同一性を持つ配列を称する。実質
的に同様のヌクレオチド配列はハイブリダイゼーションまたは配列の比較によっ
て同定することができる。実質的に同様のタンパク質配列は以下の１以上によっ
て同定することができる：タンパク質分解消化、ゲル電気泳動および／またはマ
イクロシークエンシング。CTGFタンパク質をコードする核酸分子を単離するため
の１手段は、天然の、または当分野で認められた操作法を使用して人工的に設計
したプローブで、ゲノム遺伝子ライブラリーをプローブするものである（例えば
、Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel F.M.ら(編)Green Publish
ing Company Assoc. and John Wiley Interscience,New York,1989,1992,参照)
。配列番号１、または（少なくとも10連続ヌクレオチドを含み、ターゲット配列
に少なくとも70％相補的な）その断片が特に有用なプローブであることは、当業
者が認識し得るものである。この目的のために特に有用なその他のプローブは、
配列番号１の配列にハイブリダイズし得る（すなわち、少なくとも10連続ヌクレ
オチドを含み、ターゲット配列に少なくとも70％相補的な）断片である。

【００３４】適切なプローブが利用し得るならば、核酸ハイブリダイゼーションに依拠する
スクリーニング操作によって、任意の生物体から任意の遺伝子配列を単離するこ
とが可能になる。例えば、問題のタンパク質をコードする配列の一部に相当する
オリゴヌクレオチドプローブを化学的に合成することができる。このためには、
アミノ酸配列の短いオリゴペプチド区間が知られている必要がある。そのタンパ
ク質をコードするDNA配列は遺伝コードから推定することができるが、コードの
縮重性を考慮にいれなければならない。配列が縮重する場合は、混合添加反応を
実施することが可能である。これには、変性二本鎖DNAの異種混合物が含まれる
。こうしたスクリーニングのためには、ハイブリダイゼーションを一本鎖DNAま
たは変性二本鎖DNA上で実施するのが好ましい。ハイブリダイゼーションは、目
的のポリペプチドに関係するmRNAが非常に少量存在する取得源に由来するcDNAク
ローンの検出において、特に有用である。換言すれば、非特異的結合を回避する
目的で、選択的ハイブリダイゼーション条件を使用し、例えば、混合物中で完全
に相補的な単一のプローブに対するターゲットDNAのハイブリダイゼーションに
よって、特異的cDNAクローンをオートラジオグラフィーで可視化させることが可
能である（Wallaceら、Nucleic Acid Research,9:879,1981）。こうした選択的
ハイブリダイゼーションプローブは、プローブの同定を容易にするために、分析
において検出可能な試薬で標識することもでき、またそれが好ましいものと認め
られる。有用な試薬として、限定するわけではないが、放射能、蛍光染料、また
は検出し得る産物の形成を触媒することができる酵素が含まれる。このように、
選択的ハイブリダイゼーションプローブは、別の起源からのDNAの相補的コピー
を単離するため、または関係する配列のためのこうした起源をスクリーニングす
るために、有用である。

【００３５】本明細書に開示する特定の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列に関して、
ハイブリダイゼーションを、低ストリンジェンシー、中程度ストリンジェンシー
条件、またはストリンジェント条件下でも実施することができる。オリゴヌクレ
オチドのハイブリダイゼーションの１例として、固定化された変性核酸を含有す
るポリマー膜を最初に、0.9 M NaCl、50 mM NaH２PO４,pH7.0、5.0 mM Na２EDTA
、0.5％SDS、10Ｘ Denhardtおよび0.5 mg/mLポリリボアデニル酸で構成される溶
液中で、45℃で30分、予備ハイブリダイズする。次にこの溶液に、^３２P 末端標
識したオリゴヌクレオチドプローブを約2Ｘ10^７ cpm（比活性 4ｘ10^８ cpm/μg
）添加する。12〜16時間のインキュベート後、オリゴヌクレオチドプローブにつ
いて、0.5％SDSを含有する1ＸSET（150 mM NaCl、20 mM Tris塩酸塩,pH7.8、1 m
M Na２EDTA）中で、室温で30分、その後新たな1ＸSETで、Tm-10℃で30分、膜を
洗浄する。次に、ハイブリダイゼーションシグナルの検出のために、膜をオー
トラジオグラフフィルムに露出する。

【００３６】核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシ
ーを達成するために使用する条件は、ハイブリダイズする核酸の性質に応じて変
わるはずである。ハイブリダイゼーション条件を選択するにあたって、例えば、
核酸のハイブリダイズ領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成（例
えばGC対AT含量）および核酸の型（例えばRNA対DNA）を考慮することができる。
もう一つの考慮点は、核酸の一方が例えばフィルター上に固定されているかどう
かである。

【００３７】漸次高度化するストリンジェンシー条件は以下のとおりである：室温付近で2
ｘSSC／0.1％SDS（ハイブリダイゼーション条件)；室温付近で0.2ｘSSC／0.1％S
DS（低ストリンジェンシー条件)；42℃付近で0.2ｘSSC／0.1％SDS（中程度スト
リンジェンシー条件)；および68℃付近で0.1ｘSSC（高ストリンジェンシー条件)
。洗浄はこれらの条件の１つだけ、例えば高ストリンジェンシー条件を使用して
実施するか、または各条件を上掲の順番で例えばそれぞれ10〜15分ずつ実施し、
上記のステップのいずれかまたは全部を反復することができる。しかし、上に示
したように、最適条件は関与する特定のハイブリダイズ反応に応じて異なるはず
であり、経験的に決定することができる。

【００３８】本明細書で使用する「選択的ハイブリダイゼーション」は、発生させるハイブ
リダイゼーションの近傍でのヌクレオチド配列間の同一性の程度に基づいて、関
連性がないCTGFと関連性があるものを識別する、中程度ストリンジェントまたは
高ストリンジェント生理学的条件下でのハイブリダイゼーションを称する（J.Sa
mbrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labor
atory(Current Edition)参照、この全部を参照により、本明細書中に組み入れる
）。また、長さが95 bpsである100 bpsの配列の断片は、これが取得された100 b
ps配列と95％の同一性を持つものと理解すべきである。本明細書で使用する場合
、互いに適正に整列させた場合、例えばBLASTNによって整列したとき、第１配列
の塩基と別の配列の塩基間で少なくとも70％、および好ましくは少なくとも80％
若しくは90％の同一性がある場合は、第１DNA（RNA）配列は別のDNA（RNA）配列
に対して、それぞれ少なくとも70％、および好ましくは少なくとも80％の同一性
がある。

【００３９】本明細書で使用する用語としての「同一性」は、参照ポリヌクレオチド（配列
番号１）とある割合の同一の塩基を含むポリヌクレオチド配列を称する。例えば
、参照ポリヌクレオチドと少なくとも90％同一であるポリヌクレオチドは、参照
ポリヌクレオチドを形成する塩基の90％と同一であるポリヌクレオチド塩基を持
ち（すなわち、該配列を、当業者には普通の標準的な整列および相同性調整(例
えばNetBlastまたはGRAIL)を使用して互いに適正に整列した場合）、そのポリヌ
クレオチド配列を含む塩基の10％について別の塩基を持つ。

【００４０】本発明は、変化がサイレント変化である、例えば変化がそのポリヌクレオチド
によってコードされるアミノ酸配列を変更しないような、参照ポリヌクレオチド
との差異があるポリヌクレオチドにも関する。本発明は、参照ポリヌクレオチド
（配列番号１）にコードされるタンパク質においてアミノ酸の置換、付加、欠失
、融合および末端切断をもたらすヌクレオチドの変化にも関する。本発明の好ま
しい態様において、これらのタンパク質は参照ポリヌクレオチドにコードされる
タンパク質と同一の生物学的活性を保持している。

【００４１】こうしたプローブは、プローブの同定を容易にするために、分析によって検出
し得る試薬で標識することができ、またそれが好ましいものと認められる。有用
な試薬として、限定するわけではないが、放射能、蛍光染料、または検出し得る
産物の形成を触媒することができるタンパク質が含まれる。このように、該プロ
ーブは、別の動物起源からのDNAの相補的コピーを単離するため、または関連す
る配列についてこうした起源をスクリーニングするために、有用である。

【００４２】本発明は、少なくとも１つのCTGF特異的活性またはエピトープを保持している
ラットCTGFポリペプチドの断片をも含む。例として、CTGF特異的抗体の製造にお
ける免疫原として、例えば少なくとも8〜10アミノ酸を含むCTGFポリペプチド断
片を使用することができる。この断片には、例えばCTGF中で保存されているアミ
ノ酸配列を含ませることができる。ペプチド免疫原としてのその使用の他に、サ
ンプル中のCTGF特異的抗体の存在を検出するために、上記のCTGF断片をELISAな
どのイムノアッセイにおいて使用することができる。

【００４３】本発明のCTGFポリペプチドはいくつかの標準的方法のいずれかを使用して取得
することができる。CTGFポリペプチドを、例えば、標準的組換え発現系で製造す
るか（下記参照）、化学的に合成するか（この手法は小さなCTGFペプチド断片に
限定されうる）、またはこれらを天然に発現する生物体から精製することができ
る。

【００４４】図１の成熟タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号１）と
して、限定するものではないが、以下のものが含まれる：成熟タンパク質のコー
ド配列のみ；成熟タンパク質のコード配列およびリーダー配列若しくはプロタン
パク質配列などの追加のコード配列；成熟タンパク質のコード配列（および場合
によっては追加のコード配列）ならびにイントロンなどの非コード配列または成
熟タンパク質のコード配列の5'および／もしくは3'非コード配列。

【００４５】図１のタンパク質の断片、誘導体または類似体は、(i)１つ以上のアミノ酸残
基が保存的若しくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で
置換されたもので、その置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによってコードさ
れたものであってもコードされないものでもよい、あるいは(ii)１つ以上のアミ
ノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは(iii)成熟タンパク質がタンパク質の半
減期を増大する化合物（例えばポリエチレングリコール）などの別の化合物と融
合したもの、あるいは(iv)リーダー配列若しくは分泌性配列、または成熟タンパ
ク質配列若しくはプロタンパク質配列の精製のために使用する配列などの追加の
アミノ酸が成熟タンパク質と融合したもの、でありうる。こうした断片、誘導体
および類似体は、本明細書の教示から当業者が行いうる範囲内であるものとみな
される。

【００４６】このように、「１タンパク質をコードするポリヌクレオチド」という用語は、
そのタンパク質のコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに追加のコー
ド配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。したが
って、単離された核酸配列およびその他のタンパク質を、本発明のタンパク質に
特徴的な生物学的活性の保持について、例えば酵素的CTGF活性を検出するための
アッセイにおいて、測定することができる。こうしたタンパク質としては、CTGF
の末端切断型、ならびに欠失および挿入変異体などの変異体が含まれる。

【００４７】本発明のポリヌクレオチドはDNAの形態であってよく、そのDNAにはcDNA、ゲノ
ムDNA および合成DNAが含まれる。DNAは二本鎖であっても一本鎖であってもよく
、一本鎖の場合には、コード鎖であっても非コード（アンチセンス）鎖であって
もよい。成熟タンパク質をコードするコード配列は、図１〜６に示すコード配列
と同一であってもよく、または異なるコード配列であって、そのコード配列が、
遺伝暗号の重複若しくは縮重の結果として、図１のDNA（例えば配列番号１）と
同一の成熟タンパク質をコードする配列であってもよい。

【００４８】本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列（例えば配列番号２）を有するタン
パク質の断片、類似体および誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変
異体に関する。このポリヌクレオチドの変異体は天然に存在する該ポリヌクレオ
チドの対立遺伝子変異体であってもよいし、または該ポリヌクレオチドの天然に
は存在しない変異体であってもよい。

【００４９】このように、本発明には、図１に示すものと同一の成熟タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド、ならびにこうしたポリヌクレオチドの変異体であって、そ
の変異体が図１のタンパク質の断片、誘導体若しくは類似体をコードするものが
含まれる。こうしたヌクレオチド変異体としては、欠失変異体、置換変異体なら
びに付加若しくは挿入変異体が含まれる。

【００５０】上述したように、上記ポリヌクレオチドは図１に示すコード配列（配列番号１
）の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を有していてもよい。当
分野で知られているように、対立遺伝子変異体はコードされたタンパク質の機能
を実質的に変更しない、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失若しくは付加を有
しうる、ポリヌクレオチド配列の改変形態である。

【００５１】本発明には、成熟タンパク質のコード配列が、宿主細胞からのタンパク質の発
現および分泌を促進するポリヌクレオチド配列、例えば該細胞からのタンパク質
輸送を制御する機能を有するリーダー配列に、同一のリーディングフレーム内で
融合しうるポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するタンパク質はプ
レタンパク質であり、そのリーダー配列が宿主細胞によって切断されてタンパク
質の成熟形態を形成しうる。ポリヌクレオチドは成熟タンパク質と追加の5'アミ
ノ酸残基からなるプロタンパク質をもコードしてもよい。プロ配列を有する成熟
タンパク質がプロタンパク質であり、かつそのタンパク質の不活性形態である。
プロ配列が切断された後は、活性な成熟タンパク質が残る。

【００５２】本発明はさらに、配列間で少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、およ
びさらに好ましくは少なくとも95％の同一性がある場合に、上記の配列にハイブ
リダイズするポリヌクレオチドであって、その配列が当技術分野では以前に知ら
れていなかったポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、上記のポリヌクレオ
チドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書で使用する「ストリンジェントな条件」という用語は、配列間で少
なくとも95％、好ましくは少なくとも97％の同一性がある場合にのみハイブリダ
イゼーションが生じることを意味する。好ましい実施形態において、上記のポリ
ヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のDNAがコードす
る成熟タンパク質と実質的に同一の生物学的機能または活性のいずれかを保持し
ているタンパク質をコードする。

【００５３】あるいは、上記ポリヌクレオチドは、上記のように本発明のポリヌクレオチド
にハイブリダイズし、同一性を有する、少なくとも15塩基、好ましくは少なくと
も30塩基、さらに好ましくは少なくとも50塩基を有するもので、これは活性を保
持していてもよいし保持していなくてもよい。例えば、こうしたポリヌクレオチ
ドを、例えばポリヌクレオチドの回収のために、またはPCRプライマーとして、
配列番号１のポリヌクレオチドのプローブとして、使用してもよい。

【００５４】CTGFポリペプチドの発現 CTGFポリペプチドをコードするDNA配列は、適切な宿主細胞中へのDNA導入によ
ってin vitroで発現させることができる。「宿主細胞」は本発明のベクター（例
えば、クローニングベクターもしくは発現ベクターとすることができる）によっ
て遺伝子操作された細胞(形質導入または形質転換もしくはトランスフェクトさ
れた細胞)である。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファー
ジなどの形態をとることができる。操作された宿主細胞は、従来の栄養培地をプ
ロモーターの活性化、形質転換体の選択、もしくは本発明の遺伝子の増幅に適す
るように改変した培地中で培養することができる。温度、pH、およびその他の培
養条件は、その発現のために選択した宿主細胞に以前から用いられているもので
あり、当業者であれば明らかであろう。その宿主細胞と言う用語には対象の宿主
細胞の子孫をも含んでいる。子孫は複製の過程で生ずる突然変異が存在する可能
性があるため全てが親の細胞と同一のものではないことは理解されよう。しかし
そのような子孫は、「宿主細胞」という用語を用いる場合には含まれるものであ
る。構築物の宿主細胞への導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE
−デキストランで媒介されるトランスフェクション、エレクトロポレーション、
もしくはその他の当業界の方法で行うことができる(Davis, L.ら, Basic Method
s in Molecular Biology(現行版))。

【００５５】本発明の核酸は、組換え技法によってCTGFを産生するために用いることができ
る。したがって例えば、上記ポリヌクレオチドをCTGFポリペプチドを発現させる
ための種々の発現ベクターのうちの任意の１つに導入することができる。そのよ
うなベクターとしては、染色体DNA、非染色体DNA、および合成DNA配列、例えばS
V40誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミ
ド；プラスミドとファージDNAの組み合わせから誘導したベクター、ワクシニア
、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病などのウイルスDNAが挙げら
れる。しかし、その他のベクターもそれが宿主中で複製かつ生存可能なものであ
る限りは用いることができる。

【００５６】適切なDNA配列を種々の方法でベクター中に挿入することができる。通常は、
そのDNA配列は当業界で既知の方法によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位
へ挿入される。そのような方法およびその他の方法は当業者であれば理解しうる
範囲内にあるものと見なされる。CTGFをコードするDNA配列は、原核生物もしく
は真核生物のいずれかでin vivoにて発現させることができる。真核生物のコー
ド配列を有するDNA配列を原核生物中で発現させる方法は当業界ではよく知られ
ている。宿主としては微生物、酵母、および哺乳動物の生物が含まれる。

【００５７】 CTGFをコードするDNA配列は適切な宿主細胞中へのDNA導入によってin vitroで
発現させることができる。「宿主細胞」とはベクターがその中で増殖しそのDNA
が発現される細胞である。この用語はまた、対象とした宿主細胞のいかなる子孫
をも含んでいる。子孫は複製の過程で生ずる突然変異を有する可能性があるので
全てが親の細胞と同一のものではないことは理解されよう。しかしそのような子
孫は、「宿主細胞」という用語を用いる場合には含まれるものである。

【００５８】 CTGFをコードするDNA配列は、原核生物もしくは真核生物のいずれかでin vivo
にて発現させることができる。真核生物のコード配列を有するDNA配列を原核生
物中で発現させる方法は当業界ではよく知られている。宿主としては微生物、酵
母、および哺乳動物の生物が含まれる。

【００５９】 λgt11などのcDNA発現ライブラリーは、少なくとも1個のエピトープを有するC
TGFペプチドを、CTGFに対し特異的な抗体もしくはPDGFに対する抗体（CTGFと交
差反応する）を用いて間接的にスクリーニングすることができる。そのような抗
体はポリクローナルで誘導したもの、もしくはモノクローナルで誘導したものの
いずれでもよく、CTGF cDNAの存在を示す発現産物を検出するために用いること
ができる。

【００６０】宿主中で発現および複製を行うことのできる、生物学的に機能的なウイルスベ
クターおよびプラスミドDNAベクターは当業界では既知である。そのようなベク
ターは本発明のDNA配列を組み込むために用いられる。通常は、挿入された真核
生物の遺伝的配列の効率的な転写を促進するようなプロモーター配列を含む発現
ベクターを宿主と関連させて用いる。発現ベクターは典型的には、複製起点、プ
ロモーターおよびターミネーター、ならびに形質転換された細胞を表現型に関し
て選択できるようにする特異的な遺伝子を含んでいる。

【００６１】 RNAポリメラーゼが2つのコード配列を単一のmRNAに転写する場合には、1つの
コード配列は、もう1つのコード配列と「機能しうる形で連結」され、次いでそ
れが翻訳されて双方のコード配列に由来するアミノ酸を有する単一のポリペプチ
ドとなる。それらのコード配列は、発現された配列が最終的に所望のタンパク質
を産生するようにプロセシングを受ける限りは、互いが隣接している必要はない
。

【００６２】ある特定のタンパク質のDNA「コード配列」もしくはある特定のタンパク質を
「コードするヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に配置された場合
に転写され、タンパク質に翻訳されるDNA配列である。「プロモーター配列」は
細胞中でRNAポリメラーゼと結合し下流(3'方向)の０コード配列の転写を開始さ
せることのできるDNA調節領域である。プロモーターはDNA配列の一部である。こ
の配列領域はその3'末端に開始コドンを有する。プロモーター配列は、バックグ
ラウンドより高い検出可能なレベルで転写を開始するために必要なエレメントの
ある、最小限の数の塩基を含んでいる。しかし、RNAポリメラーゼがその配列に
結合されると、その後に転写が開始コドン(プロモーターのある3'末端)で開始し
、転写は下流の3'方向へと進行する。プロモーター配列内には転写開始部位(ヌ
クレアーゼS1を用いたマッピングで都合よく明確に定められる)ならびにRNAポリ
メラーゼの結合に関わるタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)が認められ
る。

【００６３】発現ベクターとして当業界で既知の細菌、酵母、および哺乳動物の発現系に加
えてバキュロウイルスベクターも用いることができる。外来遺伝子をこの無脊椎
動物のウイルス発現ベクターを用いて発現させることの1つの利点は、組換えタ
ンパク質を高レベルで発現することができ、そのタンパク質の抗原性および機能
がそのタンパク質の天然のものと同様であることである。バキュロウイルスベク
ターおよびそのベクターと組み合わせて用いられる適切な昆虫宿主細胞は当業者
には既知である。本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞の単離と精製は、例
えば分離用クロマトグラフィーによる分離法、およびモノクローナル抗体もしく
はポリクローナル抗体を用いることを含む免疫学的分離法などの慣例的な方法に
よって行いうる。

【００６４】組換えDNAを用いる宿主細胞の形質転換は当業者には既知の慣例法で行うこと
ができる。宿主が大腸菌(E.coli)などの原核生物の場合には、DNAを取り込むこ
とのできるコンピテント細胞を、当業界では既知の方法を用いて対数増殖期後に
回収し、続いてCaCl_２法で処理した細胞から調製することができる。あるいはま
た、MgCl_２もしくはRbClを用いてもよい。

【００６５】用いる宿主が真核生物の場合には、DNA導入の種々の方法を用いることができ
る。そのような方法としてはリン酸カルシウム沈降法、マイクロインジェクショ
ンなどの慣例的な機械的手法、リポゾーム封入プラスミドの挿入、またはウイル
スベクターの使用などのDNAのトランスフェクションが挙げられる。

【００６６】真核生物宿主細胞としては酵母も含まれる。例えば、DNAを適切な発現ベクタ
ー中に挿入し、その産物を宿主細胞中に導入することによって酵母中でDNAを発
現させることができる。酵母中での外来遺伝子の発現のための種々のシャトルベ
クターが報告されている(Heinemann, J.ら, Nature, 340:205, 1989; Rose, M.
ら, Gene, 60:237, 1987)。

【００６７】CTGFに対する抗体本発明はCTGFポリペプチドもしくはその断片と特異的に反応する抗体を提供す
る。このポリペプチドはPDGFもしくはCTGFに対する抗体と交差反応しうるとはい
え、CTGFに対する抗体の全てがPDGFと反応するわけではなく、また、CTGFに対す
る抗体の全てがCTGF類と反応するわけでもない。異なるエピトープ特異性を有す
るモノクローナル抗体をプールしたものから本質的に構成される抗体、ならびに
別個のモノクローナル抗体調製品が提供される。モノクローナル抗体は該タンパ
ク質の断片を含む抗原を用いて当業界でよく知られた方法で作製される(Kohler
ら, Nature, 256:495, 1975; Current Protocols in Molecular Biology, Ausub
elら編, 1989)。本発明のCTGFに対するポリクローナル抗体には、当業者にとっ
ては一般的な方法を用いて作製したものが含まれる(HarlowおよびLane, 1988, A
ntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,
現行版を参照せよ)。CTGFに対し特異的なモノクローナル抗体は、例えば、CTGF
ポリペプチドとは反応するがPDGFとは反応しないハイブリドーマ培養上清をスク
リーニングすることによって選択することができる。本発明によってCTGFに対し
て作製された抗体は、該ポリペプチドの動物への直接注射、または該ポリペプチ
ドの動物、好ましくはヒト以外の動物への投与によって得ることができる。その
ようにして得られた抗体は該ポリペプチド自体と結合する。このような方法では
、該ポリペプチドの断片のみをコードする配列であっても、もとのポリペプチド
と結合する抗体を作製するために用いることができる。そのような抗体を、該ポ
リペプチドを発現している細胞からそのポリペプチドを単離するために用いるこ
とができる。

【００６８】モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系培養物によって産生される抗体を
提供するいかなる技法も用いることができる。ヒトモノクローナル抗体の産生の
ための方法の例としては、ハイブリドーマ技法(Kohlerら, Nature, 256:495, 19
75)、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法(Kozborら, 1983, Immuno
logy Today 4:72)、およびEBV-ハイブリドーマ技法が挙げられる(Coleら, 1985,
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp77-96)。

【００６９】一本鎖抗体の産生のための記載されている技法(米国特許第4,946,778号)は本
発明の免疫原性ペプチド産物に対する一本鎖抗体産生に適用することができる。
さらに、本発明の範囲に含まれるのものは、CTGFポリペプチドもしくはその断片
に対する「ヒト」抗体および「ヒト化」抗体の双方の診断的および治療的用途で
用いるための産生および使用である。ヒト化抗体は親の抗体(すなわち典型的に
はマウス起源のもの)と同じ結合特異性を有するがヒト抗体の性質が増大してい
る抗体もしくは抗体断片である。ヒト化抗体は、チェーン・シャフリングにより
、またはファージディスプレイ技術を用いて得ることができる。例えば、CTGFに
対して特異的な非ヒト抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含むポリペプチド
をヒトの相補的な(軽もしくは重)鎖可変ドメインのレパートリーと結合させる。
対象とする抗原に対し特異的なハイブリッド対合が選択される。選択された対合
からのヒト鎖は、次いでヒトの相補的な可変ドメイン(軽もしくは重)のレパート
リーと結合させ、ヒト化抗体ポリペプチド二量体をある抗原に対する結合特異性
に関して選択することができる。そのような技法は米国特許第5,565,332号に記
載されており、または市販品を入手することもできる(Scotgene, Scotlandまた
はOxford Molecular, Palo Alto, 米国カリフォルニア州)。さらに、トランスジ
ェニックマウスにおける「ヒト」抗体(すなわち、ヒト定常領域配列を有する新
規の抗体)の産生について記載されている技法(米国特許第5,545,806号および米
国特許第5,569,825号)も「ヒト」CTGF抗体もしくは抗体断片の産生に適用するこ
とができるし、または商業的な契約によって得てもよい(GenPharm Internationa
l, Inc., Mountain View, 米国カリフォルニア州)。

【００７０】本発明のポリペプチドに対して作製された抗体をその他の生物およびサンプル
から得た類似のCTGFポリペプチドのスクリーニングに用いることができる。その
ようなスクリーニング技法は当業界では既知である。

【００７１】治療方法本発明はまた、細胞増殖性障害を特徴とする疾患を、その疾患の部位を有効量
のCTGF反応性作用剤を用いて治療することによって改善するための方法を開示す
る。「改善する」という用語は、治療を受けている患者において、疾患が誘発す
る応答の有害な影響を減少させることを意味する。その疾患が細胞の過剰増殖に
起因する場合には、CTGFポリペプチドのアンタゴニストは細胞上のCTGF特異的受
容体と結合できる成長因子の量を低減させることに有効である。そのようなアン
タゴニストは、CTGF特異的抗体もしくはその機能的な断片(例えば、Fab、F(ab') _２ )とすることができる。この治療法には、そのアンタゴニストを疾患部位に接
触させることが必要である。細胞増殖障害が細胞増殖の量の減少に起因する場合
には、刺激性のCTGF反応性作用剤を疾患部位と接触させる。例えば、TGF-βはそ
のような反応性作用剤の1つである。その他の作用剤は当業者には既知である。

【００７２】本明細書で用いている「治療する」「治療」および類似の用語は、所望の薬理
学的および/もしくは生理学的効果が得られることを意味する。その効果は、障
害またはその徴候もしくは症状を、完全にまたは部分的に防止するという点で予
防的であり、ならびに/あるいは、障害および/またはその障害に帰することので
きる有害作用を部分的にまたは完全に治癒させるという点で治療的でありうる。
本明細書で用いている「治療する」とは、哺乳動物の障害のいかなる治療をも包
含するものであり、次のものを含む： (a) ある障害の素因を有している可能性があるがその障害を有するとの診断は
まだ受けていない被験体においてその障害が生ずることを予防すること； (b) ある障害を妨げること、すなわちその発症を阻止すること；または (c) その障害を軽減もしくは改善すること、例えばその障害を退縮させること
。

【００７３】「細胞増殖性障害」という用語は、異常な数の細胞を特徴とする状態を意味す
る。そのような状態としては、過形成性(細胞の連続的増殖がある組織内におけ
る細胞集団の過剰増殖をもたらすこと)および低形成性(ある組織内の細胞の欠損
もしくは欠乏)の細胞増殖または細胞から体のある領域への過剰な流入もしくは
移動が挙げられる。その細胞集団は必ずしも形質転換された細胞である必要はな
く、腫瘍原性、もしくは悪性腫瘍細胞である必要もないが、正常細胞をも含める
ことができる。例えば、CTGFは動脈壁の内膜層に増殖性病変を誘発させることに
よって病態に関与し、動脈硬化をもたらす。その状態のに対する危険因子を低減
することを試みること、例えば血圧を下げる、もしくは高コレステロールレベル
を下げることなどの代わりに、本発明のCTGFポリペプチドインヒビターもしくは
アンタゴニストは、動脈硬化に伴うCTGFのin vivoでの活性を妨害することに有
用であろう。CTGFポリペプチドアンタゴニストはまた、その他の結合組織の過剰
増殖に関連する障害、例えば強皮症、関節炎、および肝硬変を含む種々の線維症
の症状などの障害の治療にも有用である。

【００７４】 CTGFが関連する疾患、障害、および症状としては、限定はされないが、手術も
しくは放射線療法を含む急性もしくは反復性外傷から生ずる過度の瘢痕化；強皮
症、ケロイド、および過形成性瘢痕を含む、腎臓、肺、肝臓、眼球、心臓、およ
び皮膚などの臓器の線維症が挙げられる。CTGFの異常な発現は、一般的な組織瘢
痕化、皮膚の腫瘍様増殖、および血管の持続的瘢痕化に伴ってみられ、それは血
液運搬能の悪化、高血圧症、肥大などを導く。また、CTGFは血管内皮細胞増殖も
しくは移動によって生ずる種々の疾患、例えば皮膚線維腫を含む癌、内皮細胞異
常発現に関連する症状、乳癌線維形成性腫（desmosplasis）、血管脂肪腫、およ
び血管平滑筋腫にも関連する。その他の関連する症状としては、アテローム性動
脈硬化症および全身性硬化症（アテローム硬化性斑、炎症性腸疾患、クローン病
、新脈管形成および動脈硬化に中心的な役割を果たすその他の増殖過程など）、
関節炎、癌、およびその他の疾患症状、緑内障に関与する新生血管形成、疾患も
しくは傷害による炎症（関節の炎症など）、腫瘍増殖転移、間質性疾患、皮膚疾
患、関節炎（慢性関節リウマチなど）、動脈硬化症、糖尿病（糖尿病性神経障害
など）、高血圧症およびその他の腎障害、ならびに化学療法、放射線療法、透析
、同種移植および移植片拒絶反応に起因する線維症が挙げられる。

【００７５】細胞増殖性障害としてはまた、線維増殖性障害も挙げることができ、それは例
えば細胞外マトリクスの過剰産生が関与する。そのような症状としては限定はさ
れないが、肝線維症、腎線維症、アテローム性動脈硬化症、心線維症、癒着およ
び手術瘢痕が挙げられる。

【００７６】 CTGFによってモジュレートされるこれらの疾患、障害、もしくは軽度の疾病に
は、関節炎、骨粗鬆症、およびその他の骨格障害を含む外傷性損傷もしくは症状
ならびに火傷の後の組織修復が含まれる。これらの問題が生ずるのは、損傷部位
の線維芽細胞、幹細胞、軟骨細胞、骨芽細胞もしくは線維芽細胞の増殖応答が不
十分であることに起因し、これらの細胞の増殖を刺激するかもしくは誘発する活
性な生物薬剤の添加は有益である。本明細書で用いている「誘発する」もしくは
「誘発」という用語は、本明細書に記載する組織の形成、修復過程、もしくは発
達のいずれかに関して必要な細胞機構もしくは過程の活性化、刺激、増強、開始
および/もしくは維持を意味する。

【００７７】本明細書で用いられている「モジュレートする」という用語は、現存の症状も
しくは生物学的状態のモジュレーションを意味する。本明細書では、ある症状の
モジュレーションとは現存の状態に影響を及ぼす決定因子の増加もしくは減少の
双方を含む。例えば、CTGFの投与は増加させるために用いうる。

【００７８】本発明はまた、治療上有効な量のCTGF反応性作用剤を用いて細胞増殖性障害を
特徴とする症状を治療することによって該症状を治療するための方法も開示する
。「治療する」という用語は、その反応性作用剤の投与を受ける被験体において
該症状の有害な影響を減少させることを意味する。その症状が細胞の過剰増殖に
起因する場合には、CTGFのアンタゴニストは細胞上のCTGF特異的受容体と結合で
きる成長因子の量を低減させることに治療上有効である。そのようなアンタゴニ
ストはCTGF特異的抗体もしくはその機能的な断片(例えば、Fab、F(ab)_２)とする
ことができる。この治療法はそのCTGFポリペプチドのアンタゴニストをその症状
部位に接触させるかもしくは送達することが必要である。細胞増殖性障害が細胞
増殖の量の減少に起因する場合には、刺激性のCTGF反応性作用剤を該症状部位と
接触させるかもしくはそこへ送達する。例えば、TGF-β(もしくはTGF-βスーパ
ーファミリーの別のメンバー)は、そのような反応性作用剤の1つである。その他
の生物薬剤は当業者には既知である。

【００７９】本発明の方法に有用な治療用作用剤は、注射もしくは時間をかけて徐々に灌流
することにより非経口的に投与することができる。投与は静脈内、腹腔内、筋肉
内、皮下、腔内、もしくは経皮的に行うことができる。

【００８０】非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液もしくは非水溶液、懸濁剤、お
よび乳剤が挙げられる。非水性溶剤の例としてはプロピレングリコール、ポリエ
チレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注
射可能な有機エステルが挙げられる。水性担体としては、食塩液および緩衝化培
地を含む、水、アルコール性水溶液、乳剤もしくは懸濁剤が挙げられる。非経口
用のビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、デキストロースリンゲル液、デキ
ストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲルが挙げられ、静注用ビヒクルには、
流体および栄養素の補液、電解質補液(デキストロースリンゲル液をベースにし
たものなど)などが挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、およ
び不活性気体などの保存剤およびその他の添加剤も加えることができる。

【００８１】本発明の範囲内に包含される別の治療的アプローチは、本発明のCTGFを含む試
薬もしくは組成物を、慣例的な投与手法(例えば、限定はされないが、局所注射
、吸入、もしくは全身投与)のいずれかによって、繊維性、硬化性、もしくは細
胞増殖性障害、アテローム性動脈硬化症を患う被験体に対して直接的に投与する
ことである。上述のとおり、CTGFの投与は、創傷治癒を促進し、組織修復もしく
は再生の形成、または子宮内膜の増殖と発達を誘発することができる。CTGFをコ
ードする遺伝子を送達し、ターゲティングし、発現させるための方法として本明
細書に記載の方法もしくは当業界で既知の方法のいずれの方法を用いても、試薬
、製剤、もしくは組成物を特定の細胞もしくは受容体にターゲティングさせるこ
とができる。線維症障害、硬化症障害、細胞増殖性障害、アテローム性動脈硬化
症、もしくは創傷治癒をモジュレートする試薬、製剤、もしくは組成物の実際の
投与量は、生物の大きさおよび健康状態を含む多数の因子によって変わる。しか
し、当業者であれば、臨床的投与量決定のための、または用いるべき適切な投与
量を定めるための方法および技法を記載した下記の教示を用いることができる(S
pilker, B., Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven Pr
ess Books, Ltd., New York, 1984, pp.7-13, 54-60; Spilker, B., Guide to C
linical Trials, Raven Press Ltd., New York, 1991, pp.93-101; Craig, C.お
よびR. Stitzel編, Modern Pharmacology, 第2版, Little, Brown and Co., Bos
ton, 1986, pp.127-33; T. Speight編, Avery's Drug Treatment: Principles a
nd Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 第3版, Williams a
nd Wilkins, Baltimore, 1987, pp.50-56; R. Tallarida, R. Raffa, およびP.
McGonigle, Principles in General Pharmacology, Springer-Verlag, New York
, 1988, pp.18-20)；しかし通常は、約0.5μg/mL〜500μg/mLの範囲であり、こ
れは任意の製薬上許容しうる担体中に含有させて成人1日あたりに投与されるも
のの最終濃度である。

【００８２】治療用途のポリヌクレオチド別の1実施形態においては、被験体中でのCTGF発現を阻害する方法は、そのよ
うな発現を阻害する治療上有効な量のポリヌクレオチドを投与することを含む。
「被験体」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。細胞増殖性障
害がCTGFの発現に関連する場合には、CTGFのRNAへの転写もしくはCTGF mRNAのタ
ンパク質への翻訳を直接妨害する治療的アプローチが可能である。本明細書で用
いている「CTGFターゲット核酸配列」とは、CTGFタンパク質をコードする核酸も
しくはその断片のいかなるものも包含する。例えば、CTGF転写体RNAと結合する
、もしくはそれを開裂させるアンチセンス核酸もしくはリボザイムも本発明の範
囲内に含まれる。アンチセンスRNAもしくはDNA分子は、ターゲットとなる遺伝子
のRNAメッセージと特異的に結合し、その遺伝子のタンパク質産物の発現を遮断
する。そのアンチセンスは転写体RNAと結合して、その細胞では翻訳し得ない二
本鎖分子を形成する。約15〜25個のヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチ
ドは、容易に合成することができ、アンチセンスRNA分子とほぼ同じ阻害作用を
有するので好ましい。さらに、鉄が連結したエチレンジアミン四酢酸(EDTA-Fe)
などの化学的反応基をアンチセンスポリヌクレオチドに結合させてハイブリダイ
ゼーションの部位でのそのRNAの開裂を起こさせることができる。遺伝子のin vi
voでの翻訳を阻害する方法のためのこれらおよびその他のアンチセンス法の使用
については当業界ではよく知られている(例えば、De Mesmaekerら, 1995, Backb
one modifications in polynucleotides and peptide nucleic acid systems. C
urr. Opin. Struct. Biol. 5:343-355; Gewirtz, A. M.ら, 1996b, Facilitatin
g delivery of antisense oligodeoxynucleotides: Helping antisense deliver
on its promise; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:3161-3163; Stein, C.A.
A discussion of G-tetrads, 1996, Exploiting the potential of antisense: beyond phospho
rothioate oligodeoxynucleotides. Chem. and Biol. 3:319-323)。

【００８３】本明細書で用いている「転写体RNA」とは、あるタンパク質産物をコードする
ヌクレオチド配列を含むRNAである。好ましくは、その転写体RNAはメッセンジャ
ーRNA（mRNA）である。本明細書で用いている「mRNA」は、1つ以上のポリペプチ
ド鎖のアミノ酸配列を特定する一本鎖RNA分子である。さらに、転写体RNAはヘテ
ロ核RNA(hnRNA)もしくはマスクされた(masked)RNAとすることができる。本明細
書で用いている「hnRNA」という用語は、RNAポリメラーゼIIの一次転写産物を意
味し、スプライシングによってイントロンが除去される全mRNAの前駆体が含まれ
る。hnRNAは大規模にプロセシングを受けて、タンパク質合成が行われる細胞質
に運び出されるmRNAをもたらす。このプロセシングには、5'末端での5'に連結さ
れた7-メチル-グアニル酸「キャップ」の追加および3'末端でのアデニル酸基の
配列（ポリA「テイル」）の付加、ならびに全てのイントロンの除去、およびス
プライシングしてエクソンをまとめることが含まれうる。本明細書で用いている
「マスクされたRNA」とは、不活性な形で存在するいかなる形態のmRNAをも意味
する。より具体的に述べれば、マスクされたRNAは形態形成の初期段階の間にマ
スクを除去される(脱抑制される)タンパク質合成のための母方の情報の記憶を指
令するものである。

【００８４】アンチセンス核酸は、特定の転写体RNA分子の少なくとも1部分に対して相補的
なDNAもしくはRNA分子である(Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990)
。細胞内でそのアンチセンス核酸は対応する転写体RNAとハイブリダイズして二
本鎖分子を形成する。例えば、その細胞は二本鎖となったmRNAを翻訳しないので
、そのアンチセンス核酸はmRNAの翻訳を妨害することになる。このアンチセンス
アプローチによる治療法において関与する機構としては、例えば、ハイブリダイ
ゼーション抑止機構(Millerら, Anti-Cancer Drug Design 2:117-128, 1987)も
しくはハイブリダイズしたRNAの細胞内酵素であるリボヌクレアーゼH(RNase H)
による開裂(Walder, R.ら, PNAS USA 85:5011-5015, 1988、およびSteinら, Nuc
leic Acids Research 16:3209-3221, 1988)を挙げることができる。アンチセン
スオリゴマーとしては約15個のヌクレオチドからなるものが好ましいが、それは
容易に合成され、より大きな分子よりも問題を生ずる可能性が低いためである。
遺伝子のin vitroでの翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用については当
業界ではよく知られている(Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988)。

【００８５】転写を止めるためのポリヌクレオチドの使用は、トリプレックス手法として知
られており、それはそのオリゴマーが2重らせんDNAのまわりに巻き付き3重鎖ら
せんを形成するからである。従って、これらのトリプレックス化合物は、ある選
択した遺伝子の特有部位を認識するために設計することができる(Maherら, Anti
sense Res. and Dev., 1(3):227,1991; Helene, C., Anticancer Drug Design,
6(6):569, 1991)。

【００８６】リボザイムはRNA分子であって、他の1重鎖RNAを、DNA制限エンドヌクレアーゼ
と類似のやり方で特異的に開裂させる能力を有している。これらのRNAをコード
するヌクレオチド配列を改変することによって、あるRNA分子の特定のヌクレオ
チド配列を認識してそれを開裂させる分子を操作することができるようになる(C
ech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1988)。このアプローチの主たる利点は
それらが配列特異的であるので特定の配列を有するmRNAのみが不活化されること
である。

【００８７】リボザイムには2種の基本的なタイプがあり、それらはテトラヒメナタイプ(Ha
sselhoff, Nature, 334:585, 1988)およびハンマーヘッドタイプである。テトラ
ヒメナタイプのリボザイムは塩基4個の長さの配列を認識するのに対し、ハンマ
ーヘッドタイプのリボザイムは塩基11〜18個の長さの塩基配列を認識する。認識
する配列の長さが長くなるほど、ターゲットmRNA種の中でその配列が他にはない
ものである可能性が高くなる。その結果、特定のmRNA種を不活化するためにはテ
トラヒメナタイプよりハンマーヘッドタイプのリボザイムの方が好ましく、18個
の塩基の認識配列がより短い認識配列よりも好ましい。

【００８８】遺伝子のin vivoでの翻訳を阻害するこれらのおよびその他のアンチセンス法
については当業界ではよく知られている(例えば、De Mesmaekerら, 1995, Backb
one modifications in polynucleotides and peptide nucleic acid systems, C
urr. Opin. Struct. Biol. 5:343-355; Gewirtz, A.M.ら, 1996b, Facilitating
delivery of antisense oligodeoxynucleotides: Helping antisense deliver
on its promise; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:3161-3163; Stein, C.A.
A discussion of G-tetrads 1996, Exploiting the potential of antisense: b
eyond phosphorothioate oligodeoxynucleotides, Chem. and Biol. 3:319-323)
。

【００８９】 CTGFの発現を阻害するために有用なアンチセンスポリヌクレオチドの配列は、
例えば、オルソロガス(orthologous)な遺伝子、もしくはオルソロガスな遺伝子
の転写産物の配列を比較し、そのオルソロガスな配列内の高度の保存された領域
を同定することによって得ることができる。ラット、ヒト、およびマウスCTGFを
コードする核酸配列中に含まれる高度に保存された領域を同定したものを用いて
、CTGF発現の阻害のために有用なポリヌクレオチドのデザインできる。本明細書
で用いている「オルソロガスな配列」とは、その配列内で配列の相同性が種の間
で保持もしくは保存されているものをいう。2種の異なる生物体からの2つの遺伝
子配列は、それら2種の生物体に最も近縁の祖先の同一の遺伝子から由来するも
のである場合にオルソロガスである。例えば、脊椎動物のグロビン遺伝子は全て
相同であり、それはそれらの遺伝子が初期の無脊椎動物の単一のグロビン遺伝子
から由来したものである。この結果、ヒトおよびウマのα-グロビン遺伝子、お
よびそれからコードされる転写物はオルソロガスであるが、それはそれらが共通
の祖先を持ち、著しい配列相同性を共有しているからである。従って、ポリヌク
レオチドはそれらが、例えば、オルソロガス配列から同定された保存されている
配列に対して完全にまたは部分的に相補的な核酸配列を含むようにデザインする
ことができる。

【００９０】本発明の方法で有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては次のもの
が挙げられる： S10839 5'-tga cct cag cua gua ccu guc uuu c-3' (配列番号7); S10840 tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g (配列番号8); S10841 ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u (配列番号9); S10842 tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c (配列番号10); S10843 tca ctc agg uua cag uuu cca cug c (配列番号11);および S10844 ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a (配列番号12)。

【００９１】典型的なアンチセンスオリゴマーは、本明細書の実施例で示すとおり、検出可能
なCTGF mRNAレベルを約50〜100%、65〜100%、70〜100%、もしくは80〜100%の範
囲で阻害する。

【００９２】本発明で同定されるアンチセンスオリゴマーによって認識されるターゲット配
列の例としては次のものが挙げられる： 3'-acu gga guc gau cau gga cag aaa g-5' (配列番号13); agg acu gag ggc ugg uca cag uga c (配列番号14); gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a (配列番号15); aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g (配列番号16); agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g (配列番号17);および gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u (配列番号18)。

【００９３】配列番号7〜12に関しては、ターゲット配列がDNAまたはRNA配列である場合に
は、u(ウラシル)をt(チミン)と置換することができることは理解されよう。さら
に、配列番号13〜18に関しては、ターゲット配列がDNA配列である場合にはtをu
と置換することができることは理解されよう。さらに、典型的なターゲットは、
そのターゲットと結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本明細書の実施
例で示すとおり、検出可能なCTGF mRNAレベルを約50〜100%、65〜100%、70〜100
%、もしくは80〜100%の範囲で阻害するものである限りは、より短いものまたは
より長いものであってもよいことは理解されよう。核酸配列中の類似性は、当業
界でよく知られた方法とアルゴリズムによって決定することができる。そのよう
な方法およびアルゴリズムとしては、例えば、BLASTプログラム(National Cente
r for Biological InformationにあるBasic Local Alignment Search Tool)、AL
IGN、AMAS(Analysis of Multiply Aligned Sequences)、AMPS(Protein Multiple
Sequence Alignment)、ASSET(Aligned Segment Statistical Evaluation Tool)
、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN(Biological Sequence Comparative Analysis Node
)、BLIMPS(Blocks IMProved Searcher)、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLU
STAL V、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Watermanアル
ゴリズム、DARWIN、Las Vegasアルゴリズム、FNAT(Forced Nucleotide Alignmen
t Tool)、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP(Fristensky Seque
nce Analysis Package)、GAP(Global Alignment Program)、GENAL、GIBBS、GenQ
uest、ISSC(Sensitive Sequence Comparison)、LALIGN(Local Sequence Alignme
nt)、LCP(Local Content Program)、MACAW(Multiple Alignment Construction &
Analysis Workbench)、MAP(Multiple Alignment Program)、MBLKP、MBLKN、PIM
A(Pattern-Induced Multi-sequence Alignment)、SAGA(Sequence Alignment by
Genetic ALgorithm)、およびWHAT-IFが挙げられる。

【００９４】ある与えられたポリヌクレオチドの好ましい長さの選択においては、最も好ま
しい特徴を持つようにするために種々の因子を考慮すべきである。1態様におい
ては、本発明のポリヌクレオチドは少なくとも長さが15bpであり、好ましくは約
15〜約100bpの長さである。より好ましくは、そのポリヌクレオチドは長さが約1
5bp〜約80bpであり、より一層好ましくは本発明のポリヌクレオチドは約15〜約6
0bpの長さである。10〜15個merよりも短いものなどのより短いポリヌクレオチド
は、細胞への浸透性はより高いが、遺伝子特異性はより低い。これに対して、よ
り長い20〜30個の塩基のポリヌクレオチドはより良い特異性を示すが、それらは
細胞中への取り込み速度が減少する。Steinら, 「Oligodeoxy-nucleotides: Ant
isense Inhibitors of Gene Expression」, Cohen編, McMillan Press, London(
1988)を参照せよ。転写体RNAターゲット配列に対する到達性も重要であり、従っ
て、ターゲットとするRNA中のループ形成領域およびオルソロガス配列が有望な
ターゲットを提供する。本開示において、「ポリヌクレオチド」という用語は、
天然に見出される核酸と結合することができる、天然に見出されるタイプのオリ
ゴマーの核酸部分（例えばDNAおよびRNAのデオキシリボヌクレオチド構造および
リボヌクレオチド構造など）、および人工の類似体を包含する。本質的には本発
明のポリヌクレオチドは、所望の特性、例えば細胞の取り込みの増加、ターゲッ
ト配列へのアフィニティーの増加、およびヌクレアーゼの存在下でのオリゴヌク
レオチドの安定性の増加などの特性を増強する、天然に生ずるオリゴヌクレオチ
ドおよび該オリゴヌクレオチドを改変もしくは置換した形のいかなるものも含ま
れる。

【００９５】本発明のポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結された、またはメ
チルホスホネート、ホスホロチオエート、またはその他の結合で連結された類似
体によって連結されたリボヌクレオチドモノマーもしくはデオキシリボヌクレオ
チドモノマーに基づくものとすることができる。本発明のポリヌクレオチドはま
た、改変された塩基構造またはその他の改変を有し、なお天然に生ずる転写体RN
A構造に結合する能力を保持しているモノマー部分を含み得る。そのようなポリ
ヌクレオチドは当業界でよく知られた方法、例えば、Perkin-Elmer/Applied Bio
systems(Foster City, 米国カリフォルニア州)から入手可能なものなどの市販の
機器及び試薬を用いて、調製することができる。例えば、ターゲットの転写産物
に対して特異的なポリヌクレオチドは標準的な方法に従って合成することができ
る。ホスホロチオエートで改変したDNAポリヌクレオチドは典型的には、種々の
製造者から入手可能な自動化DNA合成機で合成される。これらの機器はナノモル
量のポリヌクレオチドを100ヌクレオチドの長さまで合成することができる。さ
らに精製を行うことなく用いるには、最新の機器で合成されたより短いポリヌク
レオチドが好ましい場合が多い。必要であれば、ポリヌクレオチドをポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動または逆相クロマトグラフィーによって精製することがで
きる。Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2巻, 第11章,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)を参照
せよ。

【００９６】ホスホジエステル結合で連結されたポリヌクレオチドは血清中または細胞内部
でヌクレアーゼの作用を特に受けやすく、従って、好ましい実施形態においては
、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性であると判明している、ホ
スホロチオエートまたはメチルホスホネートで連結された類似体である。当業者
であれば本発明に用いうるその他の連結法を容易に選択できるであろう。またこ
れらの改変を、そのポリヌクレオチドの細胞への取り込みおよび安定性を改良す
るためにデザインすることもできる。

【００９７】ターゲット細胞もしくは組織中のその配列の存在を豊富にするための、ポリヌ
クレオチドの投与用の適切な担体としては、例えば、ベクター、抗体、薬理学的
組成物、結合性もしくはホーミングタンパク質、またはウイルス送達系などが挙
げられる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、内皮細胞または腫瘍細胞を認
識する結合タンパク質と結合させることができる。投与後、本発明のポリヌクレ
オチドは、例えば、サイトカイン、転写因子、G-タンパク質結合受容体、腫瘍抑
制タンパク質およびアポトーシス開始タンパク質の発現が強く起こるように、レ
シピエントの細胞もしくは組織をターゲットとすることができる。

【００９８】アンチセンス、トリプレックス薬剤、リボザイム、競合阻害剤などの送達は、
キメラウイルスなどの組換え発現ベクターもしくはコロイド分散系を用いて行う
ことができる。本明細書に述べているような、遺伝子治療用に用いることのでき
る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワク
シニア、または好ましくは、レトロウイルスなどのRNAウイルスが挙げられる。
好ましくは、レトロウイルスベクターはマウスもしくはトリのレトロウイルスの
誘導体である。単一の外来遺伝子を挿入しうるレトロウイルスベクターの例とし
ては、限定はされないが、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、ハーヴェイ
マウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳癌ウイルス(MuMTV)、およびラウス肉腫
ウイルス(RSV)が挙げられる。さらに別の多数のレトロウイルスベクターが複数
の遺伝子を組み入れることができる。これらのベクターの全てが、形質導入され
る細胞を同定し作製できるように、選択可能なマーカーの遺伝子を導入または組
み込むことができる。対象のポリヌクレオチド配列をウイルスベクター中へ、例
えばある特定のターゲット細胞上のある受容体に対するリガンドをコードする別
の遺伝子と、共に挿入することによって、そのベクターはターゲット特異的なも
のとなる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質
をコードするポリヌクレオチドを挿入することによってターゲット特異的とする
ことができる。そのレトロウイルスベクターをターゲットとする抗体を用いるこ
とによって好ましいターゲティングが成し遂げられる。当業者であれば、レトロ
ウイルスゲノム中に挿入できてアンチセンスポリヌクレオチドを含有するレトロ
ウイルスベクターのターゲット特異的送達を可能とする特定のポリヌクレオチド
配列を知り得るか、または過度な実験を行うことなく容易に確認できるであろう
。

【００９９】組換えレトロウイルスには欠損があるため、感染性のあるベクター粒子を産生
するためには助力を必要とする。この助力は、例えば、LTR内の調節配列の制御
下にあるレトロウイルスの構造遺伝子全てをコードするプラスミドを含有するヘ
ルパー細胞系を用いることによって提供することができる。これらのプラスミド
は、カプシド化のためのRNA転写産物をパッケージングメカニズムが認識できる
ようにするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルを欠損して
いるヘルパー細胞系としては、2種に限定はされないが、例えばPA317およびPA12
を挙げることができる。これらの細胞系はゲノムがパッケージされないので空の
ウイルス粒子を産生する。レトロウイルスベクターが、パッケージングシグナル
がインタクトである細胞中に導入されれば、構造遺伝子が対象とする他の遺伝子
と置換されているが、そのベクターはパッケージ化されベクターウイルス粒子が
産生される。

【０１００】あるいはまた、NIH 3T3もしくはその他の組織培養細胞はレトロウイルス構造
遺伝子のgag、pol、およびenvをコードするプラスミドを用いて従来法のリン酸
カルシウムトランスフェクションによって直接的にトランスフェクトすることが
できる。次いでこれらの細胞を対象の遺伝子を含有するベクタープラスミドでト
ランスフェクトする。この結果得られた細胞は培地中にレトロウイルスベクター
を放出する。

【０１０１】アンチセンスポリヌクレオチドの別のターゲット送達システムはコロイド分散
系である。コロイド分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロ
スフェアー、ビーズ、および水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソ
ームを含む脂質ベースの系が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系はリポソ
ームである。リポソームは人工膜の小胞で、in vitroおよびin vivoでの送達ビ
ヒクルとして有用である。大きな単層の小胞(LUV)、それはサイズが0.2〜4.0μm
の範囲であるが、その小胞は大きな巨大分子を含有している水性バッファーの相
当のパーセンテージをカプセル化することができることが示されている。RNA、D
NA、およびインタクトなウイルス粒子を水性の内部の中にカプセル化することが
でき、生物学的に活性な形で細胞へ送達させることができる(Fraleyら, Trends
Biochem. Sci., 6:77, 1981)。哺乳動物細胞に加えて、植物細胞、酵母細胞、お
よび細菌細胞中へポリヌクレオチドを送達させるためにリポソームは用いられて
きた。リポソームを効率的な遺伝子移送ビヒクルとするためには下記の特徴があ
るべきである：(1) 対象の遺伝子のカプセル化がその生物学的活性を損なうこと
なく高効率で行われること；(2) 非ターゲット細胞に対しての結合と比較してタ
ーゲット細胞への結合が優先的かつ十分に行われること；(3) ターゲット細胞の
細胞質への小胞の水溶性内容物の送達が高効率で行われること；および(4) 遺伝
情報の正確かつ効果的な発現が行われること(Manninoら, Biotechniques, 6:682
, 1988)。

【０１０２】本明細書で用いている「有効量」または「治療上有効な量」という用語は、所
望の生理学的効果、例えば障害の治療を得るために十分な量を意味する。例えば
本発明のポリヌクレオチドを発現しているベクターの有効量は通常は各症例にお
いて担当医師によって決定され、それは通常は当業者が適切な用量を決定するた
めに考慮する因子に基づいて行われ、そのような因子としては、年令、性別、お
よび治療被験者の体重、治療しようとする状態、および治療しようとする医学的
状態の重症度が上げられる。

【０１０３】ポリヌクレオチドの被験者への投与は、裸の合成ポリヌクレオチドとして、も
しくは発現ベクターの一部としてのいずれかで一般的な経路(経口、経鼻、バッ
カル、経直腸、経膣、もしくは局所)のいかなるものを経由させても行うことが
でき、または皮下、筋肉内、腹腔内、もしくは静脈注射によって行うことができ
る。しかし、本発明の医薬組成物は、注射可能な組成物の形での投与が有利であ
る。そのような目的のための典型的な組成物は製薬上許容しうる溶媒または希釈
剤およびその他の適切で生理学的な化合物を含む。例えば、その組成物は、ポリ
ヌクレオチド、およびNaCl含有リン酸バッファー１mLあたり約10mgのヒト血清ア
ルブミンを含有し得る。700mgまでのポリヌクレオチドを、毒性の徴候を示すこ
となく10日間のコースで１人の患者に静脈内投与することができる(すなわち0.0
5mg/kg/hour)(Sterling, 「Systemic Antisense Treatment Reported, Genetic
Engineering News」 12:1, 28(1992))。

【０１０４】リポソームの組成は通常はリン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質の組み合
わせで、通常はステロイド、特にコレステロールと組み合わせる。その他のリン
脂質またはその他の脂質も用いることができる。リポソームの物理的特性はpH、
イオン強度、および2価の陽イオンの存在の如何による。

【０１０５】リポソームの産生に有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、
ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミ
ンなどのホスファチジル化合物、スフィンゴリピッド、セレブロシド、およびガ
ングリオシドが挙げられる。特に有用なものはジアシルホスファチジルグリセロ
ールでその脂質部分が14〜18個の炭素原子、特に16〜18個の炭素原子を含むもの
で、飽和されているものである。リン脂質の実例としては卵のホスファチジルコ
リン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチ
ジルコリンが挙げられる。

【０１０６】リポソームのターゲティングは解剖学的および機械学的因子に基づいて分類さ
れる。解剖学的分類は選択性のレベル、例えば、臓器特異的、細胞特異的、およ
び細胞内小器官特異的のレベルに基づいて行われる。機械的ターゲティングはそ
れが受動的なものかまたは能動的なものかに基づいて区別される。受動的ターゲ
ティングは、リポソームが洞様毛細血管を含んでいる臓器中の網内系(RES)の細
胞に分布されるという自然な傾向を利用している。他方、能動的ターゲティング
は、天然に生ずる局在部位以外の臓器および細胞タイプをターゲットとしうるよ
うにするために、リポソームを特定のリガンド（例えばモノクローナル抗体、糖
、糖脂質、もしくはタンパク質）と結合させることによる、またはリポソームの
組成もしくはサイズを変更することによるリポソームの改変を含んでいる。

【０１０７】ターゲットとする送達系の表面は種々の方法で改変することができる。リポソ
ームのターゲット送達系の場合には、ターゲットを狙うリガンドをリポソームの
2重層と安定に会合させておくために脂質基はリポソームの脂質2重層中に取り込
むことができる。脂質鎖をターゲットを狙うリガンドと結合させるために種々の
連結基を用いることができる。通常は、ターゲット送達システムの表面に結合さ
せた化合物はリガンドまたは受容体でであり、それらはターゲット送達システム
が所望の細胞を見つけ「目的地に着く(home in)」ことを可能と得るものである
。リガンドは、受容体などの別の化合物と結合するような対象の化合物のいかな
るものであってもよい。

【０１０８】研究および診断への使用本発明のオリゴヌクレオチドはまた研究および診断の道具として用いることも
できる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えばSambrookら, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198
9, 第2巻, p10-59、これは本明細書に参照により組み入れることとするが、ここ
に記載のとおり、5'末端の位置でポリヌクレオチドキナーゼを用いて^３２P 標識
を行うことによって調製した放射能標識オリゴヌクレオチドを用いて細胞もしく
は組織サンプル中のCTGFタンパク質特異的核酸の存在を検出するために用いるこ
とができる。その放射能標識オリゴヌクレオチドを、CTGFメッセンジャーRNAを
含んでいるのではないかと考えられる細胞もしくは組織サンプルと接触させ、CT
GFタンパク質およびサンプルを洗って未結合のオリゴヌクレオチドを除去する。
サンプル中に残存する放射活性は結合したオリゴヌクレオチドの存在を示し、そ
れは次いでそのオリゴヌクレオチドに対して相補的な核酸の存在を示す。そのよ
うな核酸はシンチレーションカウンター又はその他のルーティンに使用している
方法を用いて定量することができる。これらのタンパク質をコードしている核酸
の発現がこのようにして検出される。

【０１０９】本発明の放射能標識オリゴヌクレオチドはまた、研究、診断、もしくは治療目
的でCTGFタンパク質の局在、分布、および定量のための組織のオートラジオグラ
フィーを行うために用いることもできる。そのような研究では、組織切片を放射
能標識オリゴヌクレオチドで処理し上述のとおり洗い、次いでルーティンのオー
トラジオグラフィー法に従って写真乳液へ暴露させる。この乳剤は、現像したと
き、CTGFタンパク質遺伝子が発現している領域に銀粒子の像を作る。この銀粒子
を定量することによってこれらのタンパク質をコードするmRNA分子の発現の検出
ができることとなり、それらの領域へのオリゴヌクレオチドのターゲティングを
可能とする。

【０１１０】放射能標識の代わりにフルオレセインもしくはその他の蛍光タグをコンジュゲ
ートさせた本発明のオリゴヌクレオチドを用いてCTGFタンパク質核酸の発現の蛍
光による検出と類似のアッセイ法を開発することができる。そのようなコンジュ
ゲーションは蛍光標識アミダイト（amidites）もしくはCPG(controlled pore gl
ass)カラムを用いた固相合成の間にルーティンに行うことができる。オリゴヌク
レオチドを標識する他の方法も当業界では既知である。例えばRuth, Methods in
Molecular Biology, 第26巻, 第6章: Protocols for Oligonucleotide Conjuga
tes, Agrawal編, Human Press Inc., Totowa, 米国ニュージャージー州, 1994,
pp.167-185を参照せよ。

【０１１１】本発明の材料はキットの調製に申し分なく適している。そのようなキットはバ
イアル、試験管、および類似のものなどの1つ以上の容器手段を容れるように区
分けされたキャリアー手段を含んでいてもよく、その各容器手段はその方法で用
いられる別々のエレメントのうちの1つを含んでいる。

【０１１２】例えば、容器手段の1つには検出し得るように標識することができるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。第2の容器は、もしそれがあると
するならば、ハイブリダイゼーションバッファーを含んでいてもよい。またこの
キットには、標識されていてもいなくてもよいターゲット核酸配列の増幅のため
のヌクレオチドが含まれていてもよく、および/またはある容器にはレポーター
手段、例えば酵素的、蛍光、もしくは放射性核種などのレポーター分子と結合さ
せたアビジンもしくはストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質などを
含んでいる。

【０１１３】そのようなキットには適切な遺伝子、すなわちCTGFタンパク質をコードする遺
伝子をターゲットとするオリゴヌクレオチドが含まれる。適切なキットと例えば
「サンドイッチ」アッセイ法などのアッセイフォーマットは当業界ではよく知ら
れており、本発明のオリゴヌクレオチドで用いるために容易に適用することがで
きる。本発明のオリゴヌクレオチドとCTGFタンパク質をコードする核酸とのハイ
ブリダイゼーションは、例えばそのオリゴヌクレオチドへの酵素のコンジュゲー
ション、オリゴヌクレオチドの放射能標識、もしくはその他の適合する検出シス
テムを含む、当業界で既知の方法によって検出することができる。

【０１１４】下記の実施例は当業者に本発明のCTGFの作製および使用法の完全な開示および
説明を提供するために示すものであり、本発明者らが本発明の内容とみなしてい
ることの範囲を限定することを意図したものではなくまたそのように考えられる
べきではない。ここに用いた数値(例えば、量、時間、温度その他)に関して正確
性を確保しようとの努力は払ってきたが、いくつかの実験誤差および偏差は斟酌
されるべきである。特に述べない限りは、比率は重量比、分子量は重量平均分子
量、温度は摂氏、および圧力は大気圧もしくはその近傍である。

【０１１５】実施例1 ラットCTGFクローンをポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によってクローン化する
ことを方策とした。4種類のオリゴヌクレオチド、センス(F1およびF2)2種とアン
チセンス(R1およびR2)2種をマウスとヒトCTGFの間の相同な領域に基づいてデザ
インした。F2オリゴヌクレオチドの配列は5'-GAGTGGGTGTGTGACGAGCCCAAGG-3'(配
列番号5)である。R1オリゴヌクレオチドの配列は5'-ATGTCTCCGTACATCTTCCTGTAGT
-3'(配列番号6)である。これらのオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、NR
Kライブラリー(正常ラット腎臓線維芽細胞)からラットCTGFの領域を増幅するた
めにPCRを行った。PCR産物を分析し、F2/R1およびF2/R2のプライマーの組み合わ
せからの産物をpCRベクター(InVitrogen)中に使用説明書に従ってクローン化し
た。F2/R1反応からの2つのクローンの配列を調べ、それらはヒトCTGFおよびfisp
12との相同性を示した。完全長のcDNAをオリジナルのNRKライブラリーから限定
希釈によってクローン化した。プレートのライセートはNRKライブラリーの1/50,
000希釈から作製した。これらのプレートのライセートのうちの2つはF2/R1 PCR
陽性で、それらは#2および#4であった。これらのライセートをプレートし、10個
のプラークの10個のプールを取りF2/R1 PCRによりスクリーニングした。ライセ
ート #2からの2つのプールは陽性であり、それらは#2と#4であった。プール2-2
とプール2-4をプレートし、単一のプラークを取り、F2/R1 PCRでスクリーニング
した。単一のプラーク2-4-7がPCR陽性で、それを製造者(Stratagene)の使用説明
書に従ってプラスミド中に入れ換えた。DNAを調製し配列を調べたものが図1であ
る。クローン2-4-7の配列はヒトCTGFおよびマウスCTGF(fisp 12)と相同であった
ことを図2に示す。

【０１１６】実施例2 アンチセンスオリゴマーのデザイン CTGFをターゲットとするアンチセンスオリゴマーは、バイオインフォーマティ
ックスプログラムを用いてデザインしてアクセス可能な部位を定める。オリゴマ
ーにはロット番号を割り当てたがそれらはS10839(配列番号7)、S10840(配列番号
8)、S10841(配列番号9)、S10842(配列番号10)、S10843(配列番号11)、およびS10
844(配列番号12)である。

【０１１７】アンチセンスCTGFオリゴマーを用いたNRK細胞のトランスフェクショントランスフェクションの前日に、NRK細胞を6ウエルのプレートに1ウエルあた
り120Kの密度で蒔いた(60mmのディッシュで1プレートあたり36万個の細胞)。翌
日、蛍光オリゴマー(S10532)を用いて細胞をトランスフェクトした。NRK細胞を
オリゴフェクチンG(2.5μg/mL)およびアンチセンスオリゴマー40nMの存在下で4
時間トランスフェクトさせた。10XのオリゴフェクチンG溶液(12.5μLのオリゴフ
ェクチンGストック溶液を1mLのOpti-MEM(無血清培地)中に希釈して10X 溶液とし
た)を調製した。さらに、オリゴマーの10X 溶液を調製した(4μLオリゴマーを1m
LのOpti-MEM中に含有させて終濃度を400nMとした)。10X オリゴフェクチンG溶液
および10Xオリゴマー溶液の等量を混合し、室温で15分間静置して複合体化させ
た。この結果得られた混合液は5Xである。次いで60mmディッシュの培地を2mLの
完全増殖培地(DMEM、高濃度のブドウ糖と5%FBSおよび2mM L-グルタミンを含む)
と置換した。次いでオリゴマー/オリゴフェクチン複合体を細胞に添加し(プレー
トの各ウエルに5Xのオリゴマー/オリゴフェクチンG複合体を0.5mL)、プレートを
37℃で4時間インキュベートした。細胞をTGF-βで刺激した。完全増殖培地中に2
X TGF-β(50 ng/mL)を含有するもの2.5mLを各プレートに添加し、細胞を37℃で1
晩インキュベートした。TGF-βの添加によって脂質およびオリゴマーの濃度は50
%減少した。

【０１１８】トランスフェクションの効率は蛍光顕微鏡でモニターした。蛍光オリゴマーで
のトランスフェクションを陽性対照として含めた。トランスフェクション後、細
胞の生存率を調べるためにエチジウムホモダイマー1で染色した。エチジウムホ
モダイマーは死細胞には蓄積されるが生細胞では排除される赤色の蛍光色素であ
る。トランスフェクションは細胞の約90%で行われており、オリゴマーは核に濃
縮され、全体としての細胞の生存率は約95%であった。

【０１１９】アンチセンスオリゴマーでトランスフェクトされた細胞中のCTGFのノーザンブロット分析 CTGF特異的プローブ断片をベクターからXhoIおよびEcoRIを用いて制限酵素消
化によって切り出した。次いでその断片をゲルで精製し、ランダムプライミング
によって^３２P-dCTPで標識した。ランダムプライミングはStartageneのPrime-It
を製造者の仕様書に従って用いて行った。次いで標識されたプローブをNRK細胞
の全RNAのノーザンブロットとハイブリダイズさせた。細胞からの全RNAはAmbion
のRNAqueousキットを製造者の仕様書に従って用いて調製した。

【０１２０】図3はアンチセンスオリゴマーで処理した後のCTGF発現のノーザンブロット分
析結果を示す。全RNAはアンチセンスオリゴマーでトランスフェクションした24
時間後にNRK細胞から調製した。ノーザンブロットは、1%変性アガロースゲル上
で各処理からの全RNAの5μgを電気泳動させることによって調製した。電気泳動
後、そのRNAを陽性に荷電した膜に移し、膜と架橋させ、放射性標識されたCTGF
およびGAPDH(内部対照品)プローブで探索した。その結果はCTGFをターゲットと
した6種のアンチセンスオリゴマーの6種ともターゲットmRNAの開裂をもたらした
ことを示している。CTGFの安定な5'開裂断片(矢印)がブロット上に明瞭に見てと
れる(図3、パネルA)。ローディングおよび導入効率の内部対照として、そのブロ
ットを放射性標識マウスGAPDH断片で探索した。ごくわずかなGAPDH発現の変化が
観察されたのみであった(図3、パネルB)。CTGFの発現とGAPDHの発現との比較に
基づけば、アンチセンスオリゴマーS10843(配列番号11)が最も有効であると思わ
れる(完全長のメッセージの80-85%の低減)。

【０１２１】図3に示したデータは、CTGFをターゲットとした6種のオリゴマー(配列番号7-1
2)の6種ともターゲットRNAの顕著な阻害をもたらすことを示している。NRK細胞
集団の約90%がトランスフェクトされ、CTGFメッセージはノーザンブロット分析
で容易に検出可能であった。典型的には、あるトランスフェクト可能な細胞タイ
プ中の1つのメッセージ内の3-6個のオリゴマーターゲット部位をスクリーニング
することによって66-90%の阻害が得られる。前述のとおり、アンチセンスを用い
ない対照のトランスフェクションと比較して、CTGFに対してデザインされた6種
のアンチセンスオリゴマー(配列番号7-12)のうちの6種ともトランスフェクショ
ン24時間後の時点でCTGF mRNAの発現を阻害した(図3)。ターゲット遺伝子の最適
な阻害はアンチセンスオリゴヌクレオチドS10843(配列番号11)で認められた(約8
0%)。注目すべきことに、RNaseHでメディエートされたRNA開裂断片はノーザンブ
ロット上で可視性であった(通常は開裂断片は細胞内の酵素で分解される)。この
開裂断片が観察されたことはアンチセンス(RNaseH)機構を確認するものである。

【０１２２】さらに、下記の表1に示したデータは、CTGFをコードする核酸をターゲットと
した同じオリゴマーの細胞中への導入が細胞増殖の検出可能な増殖阻害を起こす
ことを示している。

【０１２３】

【表１】当業者であれば、本発明の化合物と方法に種々の改変および変更を行いうるこ
とは明白であろう。従って、本発明はそのような改変および変更を、それらが特
許請求の範囲およびそれと同等のものの範囲内にあるものであるならば、包含す
ることを意図している。すなわち、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定さ
れるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ラットCTGFクローン2-4-7の核酸配列およびその核酸配列によってコードされ
るアミノ酸配列を示す。

【図２】ラット（rCTGF)(配列番号２)、ヒト(Hctgf)(配列番号３)およびマウス(Mctgf)
(配列番号４)CTGFポリペプチドのアミノ酸配列の比較を示す。

【図３】アンチセンスオリゴマーで処理した後のCTGF mRNA発現のノーザンブロット分
析を示す。ノーザンブロットの結果は、CTGFをターゲットとした6アンチセンス
オリゴマーの6個がターゲットmRNAを切断する結果となったことを示している。C
TFGの安定な5'切断断片（矢印）がブロット上で明確に見られる（図３、パネル
Ａ)。負荷および泳動効率の内部対照用に、ブロットを放射性標識マウスGAPDH断
片でプローブした（図３、パネルＢ）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/10 １０１Ａ６１Ｐ 13/12 ４Ｃ０８６ 13/12 17/00 ４Ｃ０８７ 17/00 19/02 ４Ｈ０４５ 19/02 41/00 41/00 43/00 １０５ 43/00 １０５Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ０７Ｋ 14/475 16/22 16/22 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 35/74 ＢＣ１２Ｑ 1/68 35/76 // Ａ６１Ｋ 35/74 Ｃ１２Ｐ 21/08 35/76 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者セバードルップ，フランアメリカ合衆国 02067 マサチューセッツ州シャーロン，ビーチストリート 73 (72)発明者カーマイケル，ダビッド，エフ．アメリカ合衆国 94044 カルフォルニア州パシフィカ，レイナデルマー 795 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA01 BA44 CA01 CA09 DA03 EA02 EA04 GA11 GA18 HA12 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ42 QQ53 QR32 QR48 QR55 QR59 QS24 QS34 QX02 4B064 AG13 AG26 AG27 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA13 MA65 NA14 ZA36 ZA45 ZA75 ZA81 ZA89 ZA96 ZB21 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZA45 ZA75 ZA81 ZA89 ZA96 ZB21 4C087 AA01 AA02 BC34 BC83 MA66 NA14 ZA36 ZA45 ZA75 ZA81 ZA89 ZA96 ZB21 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 BA50 CA40 DA01 EA28 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２に示すアミノ酸配列を持つ、実質的に純粋なCTGF
ポリペプチド、またはその機能性断片。
【請求項２】請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリ
ヌクレオチド配列。
【請求項３】 a) 配列番号１； b) TがUであってもよい、配列番号１； c) a)およびb)に相補的な核酸配列；ならびに d) 長さが少なくとも15塩基で、配列番号１のアミノ酸配列をコードするDNAに
中程度から高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、a)、b)また
はc)の断片；からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】ベクターがプラスミドである、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】ベクターがウイルス由来である、請求項４に記載のベクター
。
【請求項７】請求項４に記載のベクターで安定的に形質転換した宿主細胞
。
【請求項８】細胞が原核細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】細胞が真核細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１０】配列番号２に示すポリペプチドまたはその断片に結合する
抗体。
【請求項１１】抗体がポリクローナルである、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】抗体がモノクローナルである、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１３】抗体が検出し得るように標識されている、請求項１０に記
載の抗体。
【請求項１４】検出し得る標識が、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発
光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素からなる群から選択され
る、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】 a) 請求項７に記載の宿主細胞を培養し； b) 請求項７に記載の宿主細胞からの該当するDNAによってコードされるポリペ
プチドを発現させ；および c) 該ポリペプチドを単離する、ことを含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１６】細胞内でCTGFの発現を抑制するためのポリヌクレオチドで
あって、ポリヌクレオチドが細胞内のCTGFターゲット核酸配列に相補的な連続し
たヌクレオチド配列を含み、そしてこのポリヌクレオチドがCTGFターゲット核酸
配列とハイブリダイズし、それによって、細胞内での非抑制レベルのCTGF発現に
比較して、CTGFの発現を抑制する、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】 CTGFターゲット核酸配列がCTGF遺伝子である、請求項１６
に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１６に記載のポリ
ヌクレオチド。
【請求項１９】ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１６に記載のポリ
ヌクレオチド。
【請求項２０】ポリヌクレオチドの長さが少なくとも15ヌクレオチドであ
る、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】ポリヌクレオチドの長さが約15ヌクレオチド〜100ヌクレ
オチドである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】ポリヌクレオチドの長さが約15ヌクレオチド〜80ヌクレオ
チドである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】ポリヌクレオチドの長さが約15ヌクレオチド〜60ヌクレオ
チドである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】ポリヌクレオチドが、 tga cct cag cua gua ccu guc uuu c （配列番号７）； tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g （配列番号８）； ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u （配列番号９）； tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c （配列番号１０）； tca ctc agg uua cag uuu cca cug c （配列番号１１）；および ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a （配列番号１２）からなる群から選択される、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】 CTGFターゲット核酸配列がCTGF転写物RNAである、請求項
１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】 CTGFターゲット核酸が、 acu gga guc gau cau gga cag aaa g （配列番号１３）； agg acu gag ggc ugg uca cag uga c （配列番号１４）； gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a （配列番号１５）； aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g （配列番号１６）； agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g （配列番号１７）；および gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u （配列番号１８）からなる群から選択される、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】細胞内でターゲット核酸に結合する請求項１６に記載のポ
リヌクレオチドと細胞を接触させることを含む、細胞内でのCTGFの発現を抑制す
るための方法であって、ポリヌクレオチドが細胞内でのCTGFの発現を抑制する方
法。
【請求項２８】細胞が真核細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の方法
。
【請求項３０】哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項２９に記載の方法
。
【請求項３１】ターゲット核酸が、 acu gga guc gau cau gga cag aaa g （配列番号１３）； agg acu gag ggc ugg uca cag uga c （配列番号１４）； gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a （配列番号１５）； aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g （配列番号１６）； agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g （配列番号１７）；および gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u （配列番号１８）からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】接触がin vivoである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】 CTGFに関係がある細胞増殖性障害を改善するための方法で
あって、該障害を有する被験体を、障害部位において、細胞内のターゲット核酸
に結合する請求項１６に記載のポリヌクレオチドで処置し、それによってCTGF活
性をレギュレートして該障害を改善することを含む方法。
【請求項３４】細胞増殖性障害が細胞の過剰増殖に起因する、請求項３３
に記載の方法。
【請求項３５】細胞増殖性障害が結合組織細胞の過剰増殖に起因する、請
求項３３に記載の方法。
【請求項３６】 CTGF活性のレギュレートがダウンレギュレートである、請
求項３３に記載の方法。
【請求項３７】ターゲット核酸が、 acu gga guc gau cau gga cag aaa g （配列番号１３）； agg acu gag ggc ugg uca cag uga c （配列番号１４）； gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a （配列番号１５）； aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g （配列番号１６）； agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g （配列番号１７）；および gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u （配列番号１８）からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】ポリヌクレオチドがアンチセンスポリヌクレオチドである
、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】アンチセンスポリヌクレオチドが、 tga cct cag cua gua ccu guc uuu c （配列番号７）； tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g （配列番号８）； ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u （配列番号９）； tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c （配列番号１０）； tca ctc agg uua cag uuu cca cug c （配列番号１１）；および ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a （配列番号１２）からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】障害が、強皮症、関節炎、硬変症、肝線維症、腎線維症、
アテローム性動脈硬化症、心線維症、癒着および手術瘢痕からなる群から選択さ
れる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】 CTGFに関係がある細胞増殖性障害を改善するための方法で
あって、該障害を有する被験体を、治療上有効な量のCTGFに対するアンチセンス
ポリヌクレオチドを含有する組成物で処置し、それによってCTGFの産生を抑制す
ることを含む方法。
【請求項４２】細胞増殖性障害が細胞の過剰増殖に起因する、請求項４１
に記載の方法。
【請求項４３】細胞増殖性障害が結合組織細胞の過剰増殖に起因する、請
求項４１に記載の方法。
【請求項４４】アンチセンスポリヌクレオチドが発現ベクターから発現さ
れる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】ベクターがプラスミドである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】ベクターがウイルスベクターである、請求項４４に記載の
方法。
【請求項４７】障害が、強皮症、関節炎、硬変症、肝線維症、腎線維症、
アテローム性動脈硬化症、心線維症、癒着および手術瘢痕からなる群から選択さ
れる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】製薬上許容される担体；および核酸に結合し、それによってCTGFの発現を抑制するオリゴヌクレオチドの治療上
有効な量、を含む、CTGFに関係がある障害の治療用の医薬組成物。
【請求項４９】オリゴヌクレオチドが結合する核酸が、 acu gga guc gau cau gga cag aaa g （配列番号１３）； agg acu gag ggc ugg uca cag uga c （配列番号１４）； gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a （配列番号１５）； aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g （配列番号１６）； agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g （配列番号１７）；および gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u （配列番号１８）からなる群から選択される、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】オリゴヌクレオチドが、 tga cct cag cua gua ccu guc uuu c （配列番号７）； tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g （配列番号８）； ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u （配列番号９）； tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c （配列番号１０）； tca ctc agg uua cag uuu cca cug c （配列番号１１）；および ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a （配列番号１２）、またはこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される核酸配列を含む、請
求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５１】障害が、強皮症、関節炎、硬変症、肝線維症、腎線維症、
アテローム性動脈硬化症、心線維症、癒着および手術瘢痕からなる群から選択さ
れる、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５２】障害が細胞の過剰増殖に起因する、請求項４８に記載の方
法。
【請求項５３】障害が結合組織細胞の過剰増殖に起因する、請求項４８に
記載の方法。
【請求項５４】１以上の容器を収容し得るように区画された運搬手段を有
し、少なくとも１容器がCTGFに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド１種以
上を含んでいる、CTGF発現の検出用キット。
【請求項５５】オリゴヌクレオチドが結合する核酸が、 acu gga guc gau cau gga cag aaa g （配列番号１３）； agg acu gag ggc ugg uca cag uga c （配列番号１４）； gaa cgg ugu ucg aca ggu cag auu a （配列番号１５）； aga ccg aac aau ggc cgu uua agu g （配列番号１６）； agu gag ucc aau guc aaa ggu gac g （配列番号１７）；および gac ugg uca aug gga cuc guu cgg u （配列番号１８）からなる群から選択される、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】オリゴヌクレオチドが、 tga cct cag cua gua ccu guc uuu c （配列番号７）； tcc tga ctc ccg acc agu guc acu g （配列番号８）； ctt gcc aca agc ugu cca guc uaa u （配列番号９）； tct ggc ttg uua ccg gca aau uca c （配列番号１０）； tca ctc agg uua cag uuu cca cug c （配列番号１１）；および ctg acc agt uac ccu gag caa gcc a （配列番号１２）、またはこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される核酸配列を含む、請
求項５４に記載のキット。
【請求項５７】 CTGFをコードする核酸に結合するオリゴヌクレオチドに、
CTGFを発現すると推定されるサンプルを接触させ、オリゴヌクレオチドの核酸と
の結合を検出することを含む、サンプル中のCTGFの発現を検出するための方法。
【請求項５８】オリゴヌクレオチドが検出し得るように標識されている、
請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】オリゴヌクレオチドとの結合の前にCTGF核酸が増幅される
、請求項５７に記載の方法。