JP4762889B2 - 血管形成及び腫瘍成長を阻止するための核酸化合物 - Google Patents

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Description

血管形成(先在する血管系の内皮からの新しい血管の発生)は、宿主内の固形腫瘍の成長、発達、及び転移において臨界的過程である。生理的に正常な血管形成においては、血管内皮の、周囲の間質成分とのオートクリン、パラクリン及びアンフィクリン相互作用が、空間的及び時間的に厳密に調節されている。加えて、予備血管形成(proangiogenic)及び毛細血管形成(angiostatic)サイトカイン並びに成長因子のレベル及び活性は、不安定に維持される。対照的に、活発な腫瘍成長に必要な病理的な血管形成は、持続的であり、正常な血管系の調節異常を表している。固形及び造血型の腫瘍は、特に、高レベルの異常な血管形成と関係している。
一般に、腫瘍の発達は、攻撃的な成長潜在能力を有する自律的クローンの生成へと導く順次的で相互に関係するステップよりなると考えられている。これらのステップは、持続的成長及び無制限の自己再生を含む。腫瘍中の細胞集団は、一般に、成長シグナルの自己充足性、成長抑制シグナルに対する減少した感度、及びアポトーシスに対する耐性によって特徴付けられる。異所的成長を開始する遺伝学的及び細胞遺伝学的事象は、細胞を、アポトーシスを妨げることによって、延長された「増殖準備された」状態に維持する。
血管形成及び腫瘍成長を阻止するための薬剤及び治療を提供することは、本願開示のゴールである。
ある面において、この開示は、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を減少させる核酸化合物を提供する。ここに示すように、ＥｐｈＢ４及びＥｐｈｒｉｎＢ２は、癌及び望ましくない血管形成又は過度の血管形成と関係する疾患を含む様々な病気と関係している。従って、ここに開示するある種の核酸化合物は、かかる病気を治療するために利用することができる。更なる面において、この開示は、ＥｐｈＢ４及び／又はＥｐｈｒｉｎＢ２が、様々な腫瘍において、しばしば高レベルで発現されるという発見に関係している。それ故、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２をダウンレギュレートする試薬は、腫瘍細胞に対する直接的効果により並びに腫瘍により動員される血管形成過程への間接的効果によって、腫瘍に影響を与えることができよう。ある具体例において、この開示は、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２をダウンレギュレートする薬剤(ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を阻止する薬剤を含む)による治療に特に適した腫瘍型の正体を与える。
ある面において、この開示は、少なくとも、細胞中で、生理的条件下でＥｐｈＢ４転写物とハイブリダイズしてＥｐｈＢ４の発現を減少させる部分を含む単離された核酸化合物を提供する。このＥｐｈＢ４転写物は、任意のスプライシング前の転写物(即ち、イントロンを含む)、スプライシング後の転写物、並びに任意のスプライシング変異体であってよい。ある具体例において、このＥｐｈＢ４転写物は、図６２に示した配列セットを有する。ある面において、この開示は、少なくとも、生理的条件下でＥｐｈｒｉｎＢ２転写物にハイブリダイズして細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を減少させる部分を含む単離された核酸化合物を提供する。このＥｐｈｒｉｎＢ２転写物は、任意のスプライシング前転写物(即ち、イントロンを含む)、スプライシング後転写物、並びに任意のスプライシング変異体であってよい。ある具体例において、このＥｐｈｒｉｎＢ２転写物は、図６４に示した配列セットを有する。核酸化合物のカテゴリーの例には、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ構築物及び触媒性核酸構築物が含まれる。核酸化合物は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。二本鎖化合物には、鎖の一方又は他方が一本鎖であるオーバーハング又は非相補性の領域も含まれうる。一本鎖化合物には、自己相補性の領域が含まれうるが、これは、この化合物が、いわゆる「ヘアピン」又は「ステム−ループ」構造を、二本鎖らせん構造の領域を伴って形成することを意味している。核酸化合物は、１０００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、２５０ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下又は５０ヌクレオチド以下の、図６２及び図６４にそれぞれ示したＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２核酸配列よりなる領域に相補的であるヌクレオチド配列を含むことができる。相補的領域は、好ましくは、少なくとも８ヌクレオチドであり、随意に、少なくとも１０又は少なくとも１５ヌクレオチドである。相補性の領域は、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２転写物のイントロン内、コード配列内、又は非コード配列内であってよく、例えば、図６２及び６４にそれぞれ示した配列のコード配列部分であってよい。
一般に、核酸化合物は、約８〜５００ヌクレオチド又は塩基対の長さを有し、随意に、この長さは、約１４〜５０ヌクレオチドである。核酸は、ＤＮＡ(特に、アンチセンスとしての利用)、ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＤＮＡ雑種分子であってよい。任意の鎖は、ＤＮＡとＲＮＡの混合物、並びにＤＮＡ又はＲＮＡとして容易に分類できない改変型を含んでよい。同様に、二本鎖化合物は、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡであってよく、何れか一方の鎖は、やはり、ＤＮＡとＲＮＡの混合物、並びにＤＮＡ又はＲＮＡに簡単に分類できない改変型を含んでよい。核酸化合物は、任意の様々な改変を含んでよく、主鎖(天然核酸中の糖リン酸部分、ヌクレオチド間結合を含む)に対する改変又は塩基部分(天然核酸のプリン又はピリミジン部分)に対する改変が含まれる。アンチセンス核酸化合物は、好ましくは、約１５〜３０ヌクレオチド長を有し、しばしば、血清中、細胞中又は、化合物が送達されそうな場所(例えば、経口で送達される化合物の場合の胃及び、吸入される化合物についての肺)での安定性など特性を改善する少なくとも一つの改変を含む。種々の効力レベルを有する様々なＥｐｈＢ４及びＥｐｈｒｉｎＢ２アンチセンス及びＲＮＡｉ構築物の例を、表６〜９に与えてある。ＲＮＡｉ構築物の場合には、標的転写物に相補的な鎖は、一般に、ＲＮＡ又はその改変物である。
他の鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又は任意の他の変異物であってよい。好ましくは、二本鎖又は一本鎖の「ヘアピン」ＲＮＡｉ構築物は、１８〜２５ヌクレオチド長の長さを、随意に、約２１〜２３ヌクレオチド長を有するであろう。触媒的又は酵素的核酸は、リボザイム又はＤＮＡ酵素であってよく、改変型を含むこともできる。核酸化合物は、細胞と、生理的条件下で、ナンセンス又はセンス制御が殆ど又は全く効果を有しない濃度で接触させたときに、標的の発現を約５０％、７５％、９０％以上阻止することができる。核酸化合物の効果を試験するのに好適な濃度は、１、５及び１０マイクロモルである。核酸化合物は又、細胞の表現型に対する効果について試験することもできる。ある種の癌の場合には、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２(標的核酸化合物)の投与に際して、細胞死又は発現の減少した割合を測定することができる。好ましくは、細胞発現は、実験的に意味のある核酸の濃度で５０％以上阻止される。
ある面において、この開示は、様々なＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２を標的とする核酸化合物の何れかを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、一般に、製薬上許容しうるキャリアーを含む。医薬組成物は、ＥｐｈＢ４転写物と生理的条件下でハイブリダイズして細胞中のＥｐｈＢ４の発現を減少させる核酸化合物を含むことができる。医薬組成物は又、ＥｐｈｒｉｎＢ２転写物に生理的条件下でハイブリダイズして細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を減少させる核酸化合物をも含むことができる。
ある面において、この開示は、細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を阻止する方法であって、該細胞を、ＥｐｈＢ４転写物に生理的条件下でハイブリダイズしてＥｐｈＢ４の細胞における発現を減少させる化合物の有効量と接触させることを含む当該方法を提供する。開示したＥｐｈＢ４を標的とする核酸化合物の何れでも、かかる方法において利用することができる。ある面において、この開示は、細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を阻止するであって、該細胞を、ＥｐｈｒｉｎＢ２転写物と生理的条件下でハイブリダイズして細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を減少させる核酸化合物の有効量と接触させることを含む当該方法を提供する。開示したＥｐｈｒｉｎＢ２を標的とする核酸化合物の何れでも、かかる方法において利用することができる。
ある面において、この開示は、患者の腫瘍の成長速度を減少させる方法であって、該腫瘍の成長速度を減少させるのに十分な量の核酸化合物を投与することを含む当該方法を提供する。ある面において、この開示は、癌を患っている患者を治療する方法であって、該患者に、核酸分子を投与することを含む当該方法を提供する。その核酸分子は、例えば、(ａ)ＥｐｈＢ４転写物と生理的条件下でハイブリダイズして細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を減少させる核酸化合物；及び(ｂ)ＥｐｈｒｉｎＢ２転写物と生理的条件下でハイブリダイズしてＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞における発現を減少させる核酸化合物よりなる群から選択される。この核酸化合物は、例えば、アンチセンス又はｍＲＮＡｉ核酸化合物であってよく、製薬上許容しうるキャリアーと配合することができる。適宜、腫瘍は、少なくとも一種の、ＥｐｈＢ４及び／又はＥｐｈｒｉｎＢ２を発現する癌細胞を含む。該ＥｐｈＢ４及び／又はＥｐｈｒｉｎＢ２は、比較しうる組織からの細胞と比較して過剰発現されうる。この腫瘍は又、転移性の腫瘍、及び血管形成依存性腫瘍又は血管形成非依存性腫瘍であってもよい。適宜、この腫瘍は、大腸癌、乳癌、中皮腫、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、及び白血病よりなる群から選択される。かかる治療は、該核酸化合物と相加的又は相乗的様式で癌細胞を阻止する少なくとも一の追加の抗癌性化学療法剤と組み合わせることができる。この核酸化合物と追加の抗癌剤は、予め組合せ配合物として配合することもできるし、独立に配合して、組み合わせた効果を達成するような仕方(例えば、タイミング、投薬量)で投与することもできる。
ある面において、この開示は、望ましくない血管形成と関係する病気又は過程に苦しんでいる患者を治療する方法であって、該患者に、血管形成を阻止するのに十分な量の核酸化合物を投与することを含む当該方法を提供する。その核酸分子は、例えば、(ａ)ＥｐｈＢ４転写物に生理的条件下でハイブリダイズして細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を減少させる核酸化合物；及び(ｂ)ＥｐｈｒｉｎＢ２転写物に生理的条件下でハイブリダイズして細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を減少させる核酸化合物よりなる群から選択することができる。この核酸化合物は、例えば、アンチセンス又はＲＮＡｉ核酸化合物であってよく、製薬上許容しうるキャリアーと配合することができる。血管形成と関連する疾患又は過程の例は、血管形成に依存する癌、良性腫瘍、炎症性疾患、慢性関節リウマチ及び乾癬、眼の血管形成性疾患、オスラー−ウェバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管新生、毛細管拡張症、血友病患者関節、血管線維腫、傷肉芽化、傷の治癒、毛細血管拡張性乾癬硬皮症、化膿性肉芽腫、冠状動脈側枝、虚血肢血管形成、ルベオーシス、関節炎及び糖尿病性新血管新生である。かかる治療は、核酸化合物と血管形成を相加又は相乗的様式で阻害する追加の抗血管形成剤と組み合わせることができる。この核酸化合物と追加の薬剤は、予め組み合わせた配合物として配合することができるし、又は独立に配合して、組み合わせた効果を達成するような仕方(例えば、タイミング、投薬量)で投与することもできる。
ある面において、この開示は、核酸化合物の、医薬の製造における利用を提供する。例えば、この開示は、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２を標的とする核酸化合物の、癌の治療又は血管形成と関連する病気若しくは過程の治療のための医薬の製造における利用を提供する。
ある面において、この開示は、癌を患っている患者を治療する方法であって、(ａ)その患者においてＥｐｈＢ４及び／又はＥｐｈｒｉｎＢ２を発現する複数の癌細胞を有する腫瘍を同定し；及び(ｂ)その患者に、適宜、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２を標的とする核酸化合物を投与することを含む当該方法を提供する。例えば、核酸化合物は、(ｉ)ＥｐｈＢ４転写物と生理的条件下でハイブリダイズして細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を減少させる核酸化合物；及び(ii)ＥｐｈｒｉｎＢ２転写物と生理的条件下でハイブリダイズして細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を減少させる核酸化合物よりなる群から選択されうる。方法は、診断部分として、患者において、ＥｐｈＢ４及び／又はＥｐｈｉｒｎＢ２遺伝子の遺伝子増幅を有する複数の癌細胞を有する腫瘍を同定することを含むことができる。遺伝子増幅は、例えば、蛍光イン・シトゥーハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を含む様々な方法で検出することができる。
ある面において、この開示は、ＥｐｈｉｒｎＢ２又はＥｐｈＢ４発現のインヒビターによる治療に適した腫瘍を同定する方法を提供する。方法は、次の特徴の少なくとも一つを有する腫瘍細胞を検出することを含んでよい：(ａ)ＥｐｈＢ４タンパク質及び／又はｍＲＮＡの発現；(ｂ)ＥｐｈｒｉｎＢ２タンパク質及び／又はｍＲＮＡの発現；(ｃ)ＥｐｈＢ４遺伝子の遺伝子増幅；及び(ｄ)ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子の遺伝子増幅。(ａ)〜(ｄ)の特徴の少なくとも一つを有する細胞を含む腫瘍が、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４発現のインヒビターによる治療に感受性であることは、ありそうなことである。ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４を直接発現しない腫瘍もこれらのタンパク質を標的とする治療に感受性でありうる(これらのタンパク質が、血管内皮において発現されること特に腫瘍の成長に役立つ新たな毛細血管の形成において発現されることが知られているので)ということは注意されるべきである。ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４発現のインヒビターは、例えば、(ｉ)ＥｐｈＢ４転写物と生理的条件下でハイブリダイズして細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を減少させる核酸化合物；又は(ii)ＥｐｈｒｉｎＢ２転写物と生理的条件下でハイブリダイズして細胞におけるＥｐｈｉｒｎＢ２の発現を減少させる核酸化合物であってよい。
本開示の一面は、ＥｐｈｒｉｎＢ２及び／又はＥｐｈＢ４を発現する腫瘍の成長速度を低下させる方法を提供する。かかる方法は、ＥｐｈｒｉｎＢ２／ＥｐｈＢ４経路によるシグナリングをブロックするｅｐｈｒｉｎ治療剤の、該腫瘍の成長速度を低下させるのに十分な量を投与することを含む。例えば、このｅｐｈｒｉｎ治療剤は、その阻害効果を、ＥｐｈｒｉｎＢ２とＥｐｈＢ４の間の相互作用を阻害すること、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４の遺伝子発現を阻害すること、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４の活性を阻害すること、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４のクラスタリングを阻害すること、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４のリン酸化を阻害すること、又はＥｐｈｉｒｎＢ２又はＥｐｈＢ４の結合の際の何れかの下流のシグナリング事象を阻害することにより発揮する。典型的腫瘍には、大腸癌、乳癌、中皮腫。前立腺癌(ホルモン無反応性)、扁平細胞癌、カポジ肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限られない。
本開示の他の面は、パッケージ化された医薬を提供する。かかるパッケージ化された医薬は、(ｉ)治療上有効な量のここに開示した核酸化合物；及び(ii)ＥｐｈｒｉｎＢ２及び／又はＥｐｈＢ４を発現する腫瘍を有する患者の治療のための化合物の投与のための指示書及び／又はラベルを含む。
本開示の他の面は、癌を患っている患者を治療する方法を提供する。かかる方法は、(ｉ)該患者からの腫瘍細胞の試料のＥｐｈｒｉｎＢ２及び／又はＥｐｈＢ４の状態を評価すること；及び(ii)該患者を、もし該腫瘍細胞がＥｐｈｒｉｎＢ２及び／又はＥｐｈＢ４を発現するならば、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４を標的とする治療剤によって治療することを含む。典型的な癌には、大腸癌、乳癌、中皮腫、前立腺癌(ホルモン無反応性)、扁平細胞癌、カポジ肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限られない。
図面の簡単な説明
図１は、Ｂ４ＥＣｖ３タンパク質のアミノ酸配列を示している(未開裂のＥｐｈＢ４リーダーペプチドを含む前駆体の予想された配列を示してある)。
図２は、Ｂ４ＥＣｖ３ＮＴタンパク質のアミノ酸配列を示している(未開裂のＥｐｈＢ４リーダーペプチドを含む前駆体の予想された配列を示してある)。
図３は、Ｂ２ＥＣタンパク質のアミノ酸配列を示している(未開裂のＥｐｈｒｉｎＢ２リーダーペプチドを含む前駆体の予想された配列を示してある)。
図４は、Ｂ４ＥＣｖ３−ＦＣタンパク質のアミノ酸配列を示している(未開裂のＥｐｈＢ４リーダーペプチドを含む前駆体の予想された配列を示してある)。
図５は、Ｂ２ＥＣ−ＦＣタンパク質のアミノ酸配列を示している(未開裂のＥｐｈｒｉｎＢ２リーダーペプチドを含む前駆体の予想された配列を示してある)。
図６は、Ｂ４ＥＣ−ＦＣ結合アッセイを示している(プロテインＡ−アガロースベース)。
図７は、Ｂ４ＥＣ−ＦＣ阻害アッセイを示している(溶液中の阻害)。
図８は、Ｂ２ＥＣ−ＦＣ結合アッセイを示している(プロテインＡ−アガロースベースのアッセイ)。
図９は、Ｂ４Ｅｃｖ３に応答してのＨＵＡＥＣの化学走性を示している。
図１０は、Ｂ２ＥＣ−ＦＣに応答してのＨＨＥＣの化学走性を示している。
図１１は、Ｂ２ＥＣに応答してのＨＨＡＥＣの化学走性を示している。
図１２は、ＨＵＡＥＣの細管形成に対するＢ４Ｅｃｖ３の効果を示している。
図１３は、ＨＵＡＥＣの細管形成に対するＢ２ＥＣ−ＦＣの効果を示している。
図１４は、ヒトＥｐｈｒｉｎＢ２構築物の図式表示である。
図１５は、ヒトＥｐｈＢ４構築物の図式表示である。
図１６は、組換え可溶性ＥｐｈＢ４ＥＣタンパク質のドメイン構造を示している。ドメインの呼称は、次の通りである：Ｌ − リーダーペプチド、Ｇ − 球状(リガンド結合ドメイン)、Ｃ − Ｃｙｓリッチドメイン、Ｆ１、Ｆ２ − ＩＩＩ型フィブロネクチンリピート、Ｈ − Ｈｉｓタグ。
図１７は、ＥｐｈＢ４ＥＣタンパク質の精製及びリガンド結合特性を示している。Ａ．精製ＥｐｈＢ４由来の組換え可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＡＧゲル電気泳動(クーマシー染色)。Ｂ．ＥｐｈｒｉｎＢ２−ＡＰ融合物の、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ上に固定化されたＥｐｈＢ４由来の組換えタンパク質への結合。各タンパク質について、３つの独立の実験の結果を示してある。縦軸 − ４２０ｎｍでの光学密度。
図１８は、ＥｐｈＢ４ｖ３が化学走性を阻害することを示している。
図１９は、ＥｐｈＢ４ｖ３が、マトリゲル上での細管形成を阻害することを示している。Ａは、代表的実験におけるＢ４ｖ３による細管形成の強い阻害を示している。Ｂは、Ｂ４ｖ３により得られた管の長さの、濃度増大時の減少並びに接合点数の減少の定量(タンパク質なしの細胞との比較)を示している。結果は、二連のウェルを用いて独立して行った３つの実験からの平均値＿Ｓ.Ｄ.として表してある。
図２０は、可溶性ＥｐｈＢ４が、ＭＴＳアッセイにより評価して、検出可能な細胞傷害性効果を有しないことを示している。
図２１は、Ｂ４ｖ３が、マトリゲルアッセイにおいて、内皮細胞による浸潤及び細管形成を阻害することを示している。(Ａ)全浸潤細胞を検出するために(倍率２０倍で写真撮影し又はマッソン三色染色法を使用)、Ａ Ｂの上段左は、ＧＦを含まないマトリゲルプラグの切片を示しており、Ａの上段右は、ＧＦを含むＢ４ＩｇＧを含む切片を示しており、そして下段左の切片はＧＦを含み、そして下段右は、Ｂ４ｖ３の存在下でのＧＦを示している。内皮細胞の有意の浸潤は、ＧＦ含有マトリゲルでのみ見られる。上段右は、Ｂ４ＩｇＧ(Ｂ４ｖ３の二量体型を意味する)により誘導された多数の浸潤細胞を含む領域を示している。これらの図の上段左部分は、マトリゲルプラグの周辺に形成された細胞層に対応しており、これから細胞が、右下隅の方向に位置するプラグの中央に向かって浸潤する。これらのマトリゲルプラグの切片中の全細胞は、Scion イメージソフトウェアを用いて定量した。二連のプラグを用いた２つの実験から得られた結果を、平均値＿Ｓ.Ｄ.として示してある。
図２２は、ＥｐｈＢ４由来の組換え可溶性タンパク質の存在下又は非存在下での、ＥｐｈｒｉｎＢ２−Ｆｃ融合物による刺激に応答しての、ＰＣ３細胞中のＥｐｈＢ４レセプターのチロシンリン酸化を示している。
図２３は、可溶性ＥｐｈＢ４ＥＣＤの生存力及び細胞周期に対する効果を示している。Ａ）２つのＨＮＳＣＣ細胞株の３日細胞生存力アッセイ。Ｂ）Ａにおけるように処理したＨＮＳＣＣ−１５細胞における細胞周期のＦＡＣＳ分析。これらの細胞の処理は、矢印で示したように、サブＧ０／Ｇ１及びＳ／Ｇ２期における蓄積を生じた。
図２４は、Ｂ４ｖ３が、マウス角膜ハイドロンマイクロポケットアッセイにおける新血管新生応答を阻害することを示している。
図２５は、ｓＢ４ｖ３を同時に注射すると、ＳＣＣ１５．Ｂ１６、及びＭＣＦ−７が、マトリゲル及び成長因子の存在下で、これらの細胞のイン・ビボでの腫瘍成長を阻害することを示している。
図２６は、可溶性ＥｐｈＢ４が、３つの腫瘍型、Ｂ１６メラノーマ、ＳＣＣ１５頭頸部癌、及びＭＣＦ−７乳癌におけるアポトーシス、ネクローシス及び減少した血管形成ことを示している。腫瘍を、成長因子及び可溶性ＥｐｈＢ４を加えたマトリゲルと予備混合して皮下注射した。１０〜１４日後に、これらのマウスに、ｆｉｔｃ−レクチン(緑)を静脈注射して、血管潅流を評価した。対照用ＰＢＳで処理した腫瘍は、大きい腫瘍密度及び強い血管形成応答を示した。ｓＥｐｈＢ４で処理した腫瘍は、生存力のある腫瘍細胞を有する領域内での腫瘍細胞密度の減少及び腫瘍血管形成の顕著な阻止、並びに腫瘍のネクローシス及びアポトーシスを示した。
図２７は、前立腺細胞株におけるＥｐｈＢ４の発現を示している。Ａ）ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体でプローブ検出した様々な前立腺癌細胞株、正常前立腺由来細胞株(ＭＬＣ)及び急性骨髄芽球性リンパ腫細胞(ＡＭＬ)の全細胞溶解物のウエスタンブロット。Ｂ）ウエスタンブロットにより測定したＰＣ−３細胞中のＥｐｈＢ４のリン酸化。
図２８は、前立腺癌組織におけるＥｐｈＢ４の発現を示している。ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体は、代表的な前立腺癌凍結切片(上段左)又はアイソタイプ特異的な対照(下段左)を染色した。隣接するＢＰＨ組織は、ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体により染色された(上段右)。陽性シグナルは、腫瘍細胞における褐色である。間質及び正常上皮は、陰性である。腫瘍組織における染色された膜の位置に注意されたい(ＥｐｈＢ４の膜貫通配置と一致する)。癌試料及び隣接するＢＰＨ組織から発現されたＲＮＡの代表的ＱＲＴ−ＰＣＲ(下段右)。
図２９は、前立腺癌細胞におけるＥｐｈＢ４の、腫瘍サプレッサー及びＲＸＲ発現によるダウンレギュレーションを示している。Ａ）ＰＣ３細胞を、先端を切り詰めたＣＤ４とｐ５３又はＰＴＥＮ又はベクターとで同時トランスフェクトした。２４時間後に、ＣＤ４ソートした細胞を集めて、溶解させて、順次的に、ＥｐｈＢ４及びβ−アクチン(標準化タンパク質)の発現についてのウエスタンブロットにより分析した。Ｂ）様々な安定細胞株のウエスタンブロット(Ａ)。ＬＮＣａＰ−ＦＧＦは、ＦＧＦ−８の安定なトランスフェクションクローンであるが、ＣＷＲ２２Ｒ−ＲＸＲは、ＲＸＲレセプターを安定に発現する。ＢＰＨ−１を、良性の肥厚性前立腺上皮から樹立した。
図３０は、前立腺癌細胞におけるＥｐｈＢ４の、ＥＧＦＲ及びＩＧＦＲ−１によるダウンレギュレーションを示している。Ａ）ＥＧＦＲ特異的インヒビターＡＧ１４７８(１ｎＭ)で３６時間処理した又はしてないＰＣ３細胞のウエスタンブロット。減少したＥｐｈＢ４シグナルが、ＡＧ１４７８処理後に認められる。この膜を条片化して、影響されないβ−アクチンで再プローブ検出した。Ｂ）ＩＧＦＲ−１特異的中和抗体ＭＡＢ３９１(２μｇ／ｍｌ；一晩)で処理した又はしてないＰＣ３細胞の三連の試料のウエスタンブロット。この膜を、順次的に、ＥｐｈＢ４、ＩＧＦＲ−１及びβ−アクチン抗体でプローブ検出した。ＩＧＦＲ−１シグナルは、予想されたＭＡＢ３９１処理によるシグナルの抑制を示している。
図３１は、特異的ＥｐｈＢ４ ＡＳ−ＯＤＮ及びｓｉＲＮＡの、発現及び前立腺細胞機能に対する効果を示している。Ａ）ＥｐｈＢ４完全長構築物を安定に発現している２９３細胞を利用して、ｓｉＲＮＡ４７２のＥｐｈＢ４発現を阻害する能力を評価した。細胞を、リポフェクタミン２０００を利用して、５０ｎＭ ＲＮＡｉでトランスフェクトした。対照用ｓｉＲＮＡ(グリーン蛍光タンパク質；ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ)又はＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ ４７２でのトランスフェクションの４０時間後の細胞溶解物のウエスタンブロットをＥｐｈＢ４モノクローナル抗体でプローブ検出し、細片化して、β−アクチンモノクローナル抗体で再プローブ検出した。Ｂ）ＥｐｈＢ４ ＡＳ−１０の、完全長のＥｐｈＢ４を一時的に発現する２９３における発現に対する効果。細胞を、ＡＳ−１０又はセンスＯＤＮに６時間にわたってさらして、(Ａ)におけるようにウエスタンブロットにより分析した。Ｃ）方法の節で記載したようにｓｉＲＮＡで処理したＰＣ３細胞の、４８時間の生存力アッセイ。示したのは、三連の試料の平均±ｓ.ｅ.ｍ.である。Ｄ）方法において記載したようにＯＤＮで処理したＰＣ３細胞の、５日の生存力アッセイ。示したのは、三連の試料の平均±ｓ.ｅ.ｍ.である。Ｅ）(Ａ)におけるようにトランスフェクトされた５０ｎＭ ｓｉＲＮＡの存在下でのＰＣ３細胞の移動の切屑アッセイ。示したのは、単層において切屑掻爬を行なった直後(０ｈ)及び２０時間の連続培養後に撮影した代表的な２０倍の視野の顕微鏡写真である。多数の細胞が、２０時間後に、対照用ｓｉＲＮＡを用いた場合には切屑中に満ちたが、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ ４７２を用いた場合には満ちなかった。Ｆ）示したのは、ＡＳ−１０又はセンスＯＤＮ(共に、１０μＭ)で処理した細胞についての類似のアッセイである。Ｇ）方法で記載したようにｓｉＲＮＡ又は対照用ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＰＣ３細胞のマトリゲル浸潤アッセイ。下部チャンバー中の５ｍｇ／ｍｌ フィブロネクチンに応答して、マトリゲルでコートされたインサートの下側へ移動する細胞を固定して、ギムザで染色した。示したのは、対照用ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ ４７２で処理した細胞の代表的顕微鏡写真である。細胞数を５つの別個の高倍率の視野で計数して、平均±ｓ.ｅ.ｍ.を図中に示してある(右下)。
図３２は、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ ４７２の、細胞周期及びアポトーシスに対する効果を示している。Ａ）示したようにｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＰＣ３細胞を、トランスフェクションの２４時間後に、細胞周期状態について、方法に記載したようにフローサイトメトリーにより分析した。示したのは、細胞数対ヨウ化プロピジウム蛍光強度のプロットである。ｓｉＲＮＡ ４７２で処理した場合、対照用ｓｉＲＮＡを用いた場合の１％と比較して、細胞集団の７．９％がアポトーシスを起こしている。Ｂ）ＰＣ３細胞のアポトーシスは、方法に記載したように、セル・デス・デテクションＥＬＩＳＡplusキットにより検出される。４０５ｎｍでの吸光度は、無核酸細胞画分中のヒストン及びＤＮＡ−ＰＯＤの量に比例して増加している。示したのは、ｓｉＲＮＡ ４７２及びＧＦＰ ｓｉＲＮＡ(対照)の示した濃度での三連の試料の平均±ｓ.ｅ.ｍ.である。
図３３は、ＥｐｈＢ４及びＥｐｈｒｉｎＢ２が、中皮腫細胞株において発現されることを、ＲＴ−ＰＣＲ(Ａ)及びウエスタンブロット(Ｂ)によって示している。
図３４は、ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４の発現を、中皮腫細胞におけるイン・シトゥーハイブリダイゼーションによって示している。チャンバースライド中で培養されたＮＣＩ Ｈ２８中皮腫細胞株は、ｅｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４に対するアンチセンスプローブとハイブリダイズした(上段)。各ハイブリダイゼーションについての対照は、センスであった(下段)。陽性反応は、紺青色の細胞質染色である。
図３５は、ＥｐｈＢ４及びｅｐｈｒｉｎＢ２の、中皮腫培養における細胞性発現を示している。悪性中皮腫の患者の胸膜浸出液に由来する一次細胞分離株及び細胞株ＮＣＩ Ｈ２８、ＮＣＩ Ｈ２３７３及びＮＣＩ Ｈ２０５２の、ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４についての免疫蛍光染色。緑色は、ＦＩＴＣ標識二次抗体についての陽性シグナルである。免疫蛍光染色の特異性が、一次抗体のないシグナルの欠如(第一段)により示された。細胞核を、すべての細胞の位置を示すためにＤＡＰＩ(青色)により対比染色した。示したのは、ＤＡＰＩとＦＩＴＣ蛍光の組合せたイメージである。元の倍率は、２００倍である。
図３６は、ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４の、中皮腫における発現を示している。悪性中皮腫生検の免疫組織化学。腫瘍の構造を示すためのＨ＆Ｅ染色した切片；左下パネルは、一次抗体を含まないバックグラウンド対照である。ＥｐｈＢ４及びｅｐｈｒｉｎＢ２特異的染色は、褐色である。元の倍率は、２００倍である。
図３７は、ＥＰＨＢ４アンチセンスプローブ(Ａ)及びＥＰＨＢ４ ｓｉＲＮＡ(Ｂ)の、Ｈ２８細胞の成長に対する効果を示している。
図３８は、ＥＰＨＢ４アンチセンスプローブ(Ａ)及びＥＰＨＢ４ ｓｉＲＮＡ(Ｂ)の、細胞移動に対する効果を示している。
図３９は、ＥｐｈＢ４が、ＨＮＳＣＣ一次組織及び転移において発現されることを示している。Ａ）上段：方法で記載したようにＥｐｈＢ４モノクローナル抗体で染色して、腫瘍細胞に局在化されるＤＡＢ(褐色)で可視化した代表的保存用切片の免疫組織化学。濃い紫色の染色は、腫瘍細胞の存在を示している。右側欄は、ＥｐｈＢ４ポリクローナル抗体(右上)で染色してＤＡＢで可視化したリンパ節転移の凍結切片である。対照(中段)を、ヤギの血清とインキュベートし、Ｈ＆Ｅ(下段)は、染色されない間質に囲まれた転移フォーカスの位置を示している。Ｂ）ＥｐｈＢ４(左欄)及びｅｐｈｒｉｎＢ２(右欄)でプローブ検出したＨＮＳＣＣの場合の一連の凍結切片のイン・シトゥーハイブリダイゼーション。ｒｕｎ−ｏｆｆ転写により生成されたＤＩＧ標識されたアンチセンス又はセンスプローブ。ハイブリダイゼーションシグナル(紺青色)が、アルカリホスファターゼ結合体化抗ＤＩＧ抗体を利用して検出され、切片を、ニュークリア・ファースト・レッドで対比染色した。Ｈ＆Ｅで染色された一連の切片を、腫瘍構造を説明するために示してある(左下)。Ｃ）腫瘍(Ｔ)、単純な正常組織(Ｎ)及びリンパ節生検(ＬＮ)よりなる患者試料のタンパク質抽出物のウエスタンブロット。試料を、４〜２０％トリス−グリシンゲル中でのポリアクリルアミドゲル電気泳動及びその後のナイロン膜上へのエレクトロブロットにより分画した。その後、膜を、ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体及びβ−アクチンＭｏＡｂを用いてプローブ検出した。化学発光シグナルを、オートラジオグラフィーフィルム上で検出した。示したのは、１２０ｋＤに移動したＥｐｈＢ４特異的バンド及び４０ｋＤに移動したβ−アクチンである。このβ−アクチンシグナルを利用して、各試料のローディングとトランスファーを制御した。
図４０は、ＥｐｈＢ４が、ＨＮＳＣＣ細胞株で発現され、ＥＧＦにより調節されることを示している：Ａ）ＳＣＣ細胞下部におけるＥｐｈＢ４発現の概観。順次的に、ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体でプローブ検出され、細片化され、そして図３９Ｃにつき記載したように、β−アクチンモノクローナル抗体により再プローブ検出された全細胞溶解物のウエスタンブロット。Ｂ）特異的ＥＧＦＲインヒビターＡＧ１４７８の、ＥｐｈＢ４発現に対する効果：０〜１０００ｎＭ ＡＧ１４７８で２４時間、１０％ ＦＣＳ(左)を補った培地中で２４時間又は１ｍＭ ＡＧ１４７８で４、８、１２若しくは２４時間(右)処理したＳＣＣ１５の粗細胞溶解物のウエスタンブロット。示したのは、順次的に、ＥｐｈＢ４及びβ−アクチンについてプローブ検出した膜である。Ｃ）ＳＣＣ細胞株におけるＥｐｈＢ４発現に対するＥＧＦＲシグナリングの阻害の効果：１０％ ＦＣＳを含む成長培地中に維持した細胞を、２４時間にわたって、１μＭ ＡＧ１４７８で処理し、その後、粗細胞溶解物を、細胞溶解物のウエスタンブロットにより分析し、その後、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＢ４、ｅｐｈｒｉｎＢ２及びβ−アクチン抗体を用いてプローブ検出した。ＥＧＦＲについての特異的シグナルは、１７０ｋＤで、ｅｐｈｒｉｎＢ２は３７ｋＤで、図１Ｃに記載したように、ＥｐｈＢ４及びβ−アクチンに加えて検出された。β−アクチンは、ローディング及びトランスファーコントロールとして役立つ。
図４１は、ＥｐｈＢ４のＥＧＦによる調節の機構を示している：Ａ）ＥＧＦＲシグナリング経路の図式表示(作用部位及び用いた特異的キナーゼインヒビターの名称を赤色で示している)。Ｂ）ＳＣＣ１５細胞は、示したように、ＥＧＦ(１０ｎｇ／ｍｌ)、３μＭ Ｕ７３１２２又は５μＭ ＳＨ−５、５μＭ ＳＰ６００１２５、２５ｎＭ ＬＹ２９４００２、――μＭ ＰＤ０９８０９５又は５μＭ ＳＢ２０３５８０を伴って又は伴わずに、更なる２４インキュベーション前に２４時間にわたって血清飢餓であった。Ｎ／Ａは、等容の希釈剤(ＤＭＳＯ)のみを受けた培養物を示している。細胞溶解物を、ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体を用いるウエスタンブロットにかけた。β−アクチンシグナルは、タンパク質ローディング及びトランスファーの対照として役立つ。
図４２は、特異的ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡが、ＥｐｈＢ４発現、細胞の生存力を阻害して、細胞周期の休止を引き起こすことを示している。Ａ）完全長のＥｐｈＢ４を安定に発現している２９３細胞を、リポフェクタミンＴＭ２０００を利用して、５０ｎＭ ＲＮＡｉによりトランスフェクトした。トランスフェクションの４０時間後に、細胞を収穫し、溶解させて、ウエスタンブロットのために処理した。膜を、ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体を用いてプローブ検出し、細片化して、β−アクチンモノクローナル抗体をタンパク質のローディング及びトランスファーのための対照として用いて再プローブ検出した。負の試薬対照は、ごたまぜにしたグリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)配列に対するＲＮＡｉであり、対照は、リポフェクタミンＴＭ２０００単独でのトランスフェクションである。Ｂ）方法の節で記載したようにｓｉＲＮＡで４８時間処理したＳＣＣ細胞株のＭＴＴ細胞の生存力アッセイ。示したのは、三連の試料の平均＋ｓ.ｅ.ｍ.である。Ｃ）示したようにｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＳＣＣ１５細胞を、トランスフェクションの２４時間後に細胞周期状態についてフローサイトメトリーによって方法に記載したように分析した。示したのは、細胞数対ヨウ化プロピジウム蛍光強度のプロットである。上段及び中段は、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの１６時間後の細胞についてのプロットを示しており、下段は、トランスフェクションの３６時間後の細胞についてのプロットを示している。特異的ｓｉＲＮＡ及び濃度を、各プロットについて示してある。Ｌｉｐｏ＝リポフェクタミンＴＭ２００擬似トランスフェクション。
図４３は、特異的なＥｐｈＢ４ ＡＳ−ＯＤＮの、ＳＣＣ細胞に対するイン・ビトロの効果を示している。Ａ）ＥｐｈＢ４完全長発現プラスミドで一時的にトランスフェクトした２９３細胞を、トランスフェクションの６時間後に、示したようにアンチセンスＯＤＮで処理した。細胞溶解物を、ＡＳ−ＯＤＮ処理の２４時間後に集めて、ウエスタンブロットにかけた。Ｂ）ＳＣＣ２５細胞を、４８ウェルプレートに、等しい密度で播種して、ＥｐｈＢ４ ＡＳ−ＯＤＮで処理した(２日目及び４日目に、１、５及び１０μＭで)。細胞の生存力を、５日目にＭＴＴアッセイにより測定した。示したのは、三連の試料の平均＋ｓ.ｅ.ｍ.である。ＥｐｈＢ４タンパク質レベルの阻害において活性なＡＳ−ＯＤＮは又、ＳＣＣ１５細胞の生存力の有効なインヒビターでもあったということに留意されたい。Ｃ）ＡＳ−１０で３６時間処理したＳＣＣ１５細胞(下段)の、処理しなかった細胞(上段)と比較しての細胞周期分析。Ｄ）単層中に３ｍｍの幅の中断を作るようにプラスチック製パスツールピペットで切屑掻爬したＳＣＣ１５細胞の集密培養物。これらの細胞の、阻害性ＥｐｈＢ４ ＡＳ−ＯＤＮ(ＡＳ−１０)及び非阻害性のＡＳ−ＯＤＮ(ＡＳ−１)の存在下で移動して傷を閉じる能力を、４８時間後に評価した。ごたまぜにしたＯＤＮは、負の対照用ＯＤＮとして含まれている。未処理と記された培養は、ＯＤＮにさらされなかった。実験の開始時に、すべての培養は、等しい幅の、１μＭ ＥｐｈＢ４ ＡＳ−１０で見られるものに類似の切屑を４８時間後に示した。赤色の角型括弧は、元の切屑の幅を示している。Ｅ）方法で記載した２チャンバーアッセイにおけるＳＣＣ１５細胞の、２０ｍｇ／ｍｌ ＥＧＦに応答しての移動。示したのは、未処理(ＮＴ)、ＡＳ−６及びＡＳ−１０処理した細胞及び１０ｎｇ／ｍｌ タキソール(移動阻害の陽性対照)の代表的顕微鏡写真である。Ｆ）細胞数を、５つの個別の高倍率の視野で計数して、平均＋ｓ.ｅ.ｍ.をグラフに示してある。
図４４は、ＥｐｈＢ４ ＡＳ−ＯＤＮが、腫瘍成長をイン・ビボで阻害することを示している。ＥｐｈＢ４ ＡＳ−１０又は切屑掻爬したＯＤＮ(２０ｍｇ／ｋｇ／日)で処置(５×１０６細胞の移植後に処置開始)したＢａｌｂ／ＣヌードマウスにおけるＳＣＣ１５皮下腫瘍移植片の成長曲線。対照用マウスは、等容積の希釈剤(ＰＢＳ)を受けた。示したのは、６マウス／グループの平均＋ｓ.ｅ.ｍ.である。＊Ｐ＝０．０００１(スチューデントのｔ検定による、切屑掻爬したＯＤＮ処置されたグループとの比較)。
図４５は、ＥｐｈｒｉｎＢ２が、ＫＳ生検組織において発現されるが、ＥｐｈＢ４は発現されないことを示している。(Ａ)ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４に対するアンチセンスプローブ及び腫瘍構造を示すための対応するＨ＆Ｅ染色した切片を用いるイン・シトゥーハイブリダイゼーション。ＩＳＨにおける紺青色は、ｅｐｈｒｉｎＢ２についての陽性反応を示す。ＥｐｈＢ２についてのシグナルは、カポジ肉腫生検において検出されなかった。対照的に、ＥｐｈＢ４についてのＩＳＨシグナルは、扁平細胞癌細胞において強い。ＥｐｈｒｉｎＢ２は又、ＫＳにおいて、ＥｐｈＢ４−ＡＰ融合タンパク質を利用して検出された(左下)。(Ｂ)ｅｐｈｒｉｎＢ２の、ＥｐｈＢ４／Ｆｃ融合タンパク質による検出。隣接する切片を、Ｈ＆Ｅ(左)で染色して、腫瘍構造を示した。黒い矩形は、方法の節に記載したように、ＦＩＴＣ標識された抗ヒトＦｃ抗体により検出されたＥｐｈＢ４／Ｆｃ処理した切片(中断)で示された領域を示している。対照として、隣接切片を、ヒトＦｃ断片で処理した(右)。この切片に結合するＥｐｈＢ４／Ｆｃから生じる特異的シグナルは、腫瘍細胞の領域でのみ見られる。(Ｃ)ｅｐｈｒｉｎＢ２とＨＨＶ８潜在性タンパク質ＬＡＮＡ１の同時発現。二重標識共焦点免疫蛍光顕微鏡及びｅｐｈｒｉｎＢ２(赤色)ＬＡＮＡ１(緑色)又はＥｐｈＢ４(赤色)(凍結ＫＳ生検材料)に対する抗体は、直接、ＬＡＮＡ１及びｅｐｈｒｉｎＢ２のＫＳ生検における同時発現を示す。同時発現は、黄色として見られる。生検の、核のヨウ化プロピジウム染色(赤色)を有する細胞における、ＰＥＣＡＭ−１に対する抗体による二重標識共焦点イメージ(緑色)は、腫瘍の血管の性質を示している。
図４６は、ＨＨＶ−８が、静脈内皮細胞において、動脈マーカーの発現を誘導することを示している。(Ａ)ＨＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣ／ＢＣ−１の培養物の、動脈／静脈マーカー及びウイルスタンパク質についての免疫蛍光。培養物を、チャンバースライド上で生育させて、ｅｐｈｒｉｎＢ２(ａ，ｅ，ｉ)、ＥｐｈＢ４(ｍ，ｑ，ｕ)、ＣＤ１４８(ｊ，ｖ)、及びＨＨＶ−８タンパク質ＬＡＮＡ１(ｂ，ｆ，ｍ)又はＯＲＦ５９(ｒ)の免疫蛍光検出のために、材料と方法に記載したように処理した。同じ視野の組み合わせたイメージ中の黄色は、ｅｐｈｒｉｎＢ２とＬＡＮＡ又はｅｐｈｒｉｎＢ２とＣＤ１４８の同時発現を示している。生存力のある細胞の位置を、ＤＡＰＩ(青色)による核染色により第３欄に示した(ｃ、ｇ、ｋ、ｏ、ｓ、ｗ)。顕微鏡写真は、代表的視野のものである。(Ｂ)ＨＵＶＥＣ及び２つのＨＨＶ−８感染培養物(ＨＵＶＥＣ／ＢＣ−１及びＨＵＶＥＣ／ＢＣ−３)の、ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４についてのＲＴ−ＰＣＲ。ＥｐｈｒｉｎＢ２生成物(２００ｂｐ)は、ＨＵＶＥＣ／ＢＣ−１、ＨＵＶＥＣ／ＢＣ−３に見られ、及びＥｐｈＢ４生成物(４００ｂｐ)は、ＨＵＶＥＣに見られる。見られるのは又、投入ＲＮＡの量及び完全性についての対照としての、β−アクチン ＲＴ−ＰＣＲでもある。
図４７は、ＨＨＶ−８が、カポジ肉腫細胞における動脈マーカーの発現を誘導することを示している。(Ａ)ｅｐｈｒｉｎＢ２の様々な細胞溶解物についてのウエスタンブロット。ＳＬＫ−ｖＧＰＣＲは、ＨＨＶ−８ ｖＧＰＣＲを発現するＳＬＫの安定なクローンであり、ＳＬＫ−ｐＣＥＦＬは、空の発現ベクターでトランスフェクトした対照用の安定なクローンである。ＬＡＮＡ又はＬＡＮＡΔ４４０でトランスフェクトしたＳＬＫ細胞は、それぞれ、ＳＬＫ−ＬＡＮＡ及びＳＬＫ−Δ４４０である。タンパク質のローディング及びトランスファーの量は、これらの膜を、β−アクチンモノクローナル抗体で再プローブ検出することにより測定した。(Ｂ)ＫＳ−ＳＬＫ細胞の、発現ベクターｐｖＧＰＣＲ−ＣＥＦＬによる一時的トランスフェクションは、ＦＩＴＣによる免疫蛍光染色(緑色)により示されたように、ｅｐｈｒｉｎＢ２の発現を生じたが、対照用ベクターｐＣＥＦＬは、何の効果も有しなかった。ＫＳ−ＳＬＫ細胞(０．８×１０５／ウェル)を、リポフェクタミン２０００を利用して、０．８μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。２４時間後に、細胞を固定して、ｅｐｈｒｉｎＢ２ポリクローナル抗体及びＦＩＴＣ結合体化二次抗体で、方法に記載したように染色した。(Ｃ)ＨＵＶＥＣの、ｖＧＰＣＲによる一時的トランスフェクションは、ｅｐｈｒｉｎＢ２ルシフェラーゼ構築物からの転写を誘導する。８×１０３ＨＵＶＥＣ(２４ウェルプレート中)を、スーパーフェクトを利用して、０．８μｇ／ウェルのｅｐｈｒｉｎＢ２プロモーター構築物でトランスフェクトした。該構築物は、翻訳開始部位に関して−２９４１〜−１１の配列、又は２つの５’−欠失を、示したように、８０ｎｇ／ウェルのｐＣＥＦＬ又はｐｖＧＰＣＲ−ＣＥＦＬと共に含んでいる。ルシフェラーゼを、トランスフェクションの４８時間後に測定したが、誘導比率をグラフの右に示してある。ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃは、プロモーターレスのルシフェラーゼの対照用ベクターである。ＧＰＣＲは、同時トランスフェクトされたβ−ガラクトシダーゼの発現を誘導するので、ルシフェラーゼをタンパク質に対して標準化した。グラフ表示したのは、６つの複製物の平均＋ＳＥＭである。示したのは、３つの同様の実験の一つである。
図４８は、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ−Ｃが、ｅｐｈｒｉｎＢ２発現を調節することを示している。Ａ）ｅｐｈｒｉｎＢ２の中和抗体による阻害。細胞を、完全生育培地中で培養して、抗体(１００ｎｇ／ｍｌ)に３６時間さらしてから集めて溶解してウエスタンブロットに供した。Ｂ）ｅｐｈｒｉｎＢ２発現の誘導のために、細胞を、成長因子を欠く５％血清を含むＥＢＭ生育培地中で培養した。個々の成長因子を示したように加えて、これらの細胞を、３６時間後に収穫した。タンパク質ローディング及びトランスファーの量を、これらの膜をβ−アクチンモノクローナル抗体で再プローブ検出することによって測定した。
図４９は、特異的ｓｉＲＮＡによるＥｐｈｒｉｎＢ２ノックダウンが、ＶＥＧＦの存在下で成長したが、ＩＧＦ、ＥＧＦ又はｂＦＧＦの存在下では成長しなかったＫＳ細胞及びＨＵＶＥＣにおける生存力を阻害することを示している。Ａ）ＫＳ−ＳＬＫ細胞を、ｅｐｈｒｉｎＢ２及び対照に対する様々なｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。４８時間後に、これらの細胞を収穫して、粗細胞溶解物を、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分画した。組織内で生成されたｅｐｈｒｉｎＢ２に対するモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロットを行なった。この膜を細片化して、β−アクチンモノクローナル抗体(Sigma)を利用して再プローブ検出して、等しいローディング及びトランスファーを示した。Ｂ）ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡの存在下でのＫＳ−ＳＬＫ培養物の３日細胞生存力アッセイ。１×１０5細胞／ウェル(２４ウェルプレート中)を、グラフに示したように、０、１０及び１００ｎｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡで処理した。培養物の生存力を、ＭＴＴアッセイによって、方法の節に記載したように測定した。示したのは、二連の試料の平均＋標準偏差である。Ｃ）ＨＵＶＥ細胞を、フィブロネクチンでコートした８ウェルチャンバースライドに播種した。これらのＨＵＶＥ細胞を、一晩、すべての生育補足物を含むＥＧＭ−２培地中で生育させた。後日、この培地を、示したように、ＶＥＧＦ(１０ｎｇ／ｍｌ)又はＥＧＦ、ＦＧＦ及びＩＧＦを含む培地と交換した。３７℃で２時間のインキュベーション後に、これらの細胞を、リポフェクタミン２０００(Invitrogen)を利用して、ｅｐｈｒｉｎＢ２、ＥｐｈＢ４又は対照としてのグリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)に対する１０ｎＭのｓｉＲＮＡを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中でトランスフェクトした。これらの細胞を、２時間インキュベートしてから、成長因子又はＶＥＧＦのみを含む新鮮な培地をそれぞれのウェルに加えた。４８時間後に、これらの細胞を、クリスタルバイオレットで染色して、直ちにデジタルカメラで写真を１０倍の倍率で撮影した。
図５０は、可溶性ＥｐｈＢ４が、ＫＳ及びＥＣコード形成及びイン・ビボの血管形成を阻害することを示している。マトリゲルＴＭにおけるＨＵＶＥＣのコード形成アッセイ(上段)。対数増殖期の細胞を、一晩、示した濃度のＥｐｈＢ４細胞外ドメイン(ＥＣＤ)で処理してから、マトリゲルＴＭ上にプレートした。細胞をトリプシン処理して、０．５ｍｌマトリゲルを含む２４ウェルプレートにプレートした(１×１０5細胞／ウェル)。示したのは、示したように試験化合物の連続的存在下で、マトリゲルＴＭ上にプレートしてから８時間後のコード形成の代表的な２０倍の位相差視野である。元の倍率は、２００倍である。ＫＳ−ＳＬＫ細胞を、同様にして、マトリゲルＴＭにおけるコード形成アッセイにおいて処理した(中段)。下段は、イン・ビトロのマトリゲルＴＭアッセイを示している：成長因子及びＥｐｈＢ４ ＥＣＤ又はＰＢＳを含むマトリゲルＴＭプラグを、マウスの腹中領域の皮下に移植した。７日後に、これらのプラグを取り出して、切片化し、Ｈ＆Ｅで染色して、マトリクス中への細胞移動を可視化した。大きい内腔を有する完全な血管が、対照において認められるが、ＥｐｈＢ４ ＥＣＤは、殆ど完全に、細胞のマトリゲル中への移動を阻害した。
図５１は、膀胱癌細胞株におけるＥＰＨＢ４の発現(Ａ)、及びＥＧＦＲシグナリング経路によるＥＰＨＢ４発現の調節(Ｂ)を示している。
図５２は、ｐ５３が、５６３７細胞におけるＥＰＨＢ４の発現を阻害することを示している。
図５３は、ＥＰＨＢ４ ｓｉＲＮＡ４７２による治療の際の膀胱癌細胞株(５６３７)の成長阻害を示している。
図５４は、ＥＰＨＢ４ ｓｉＲＮＡ４７２をトランスフェクトした５６３７細胞のアポトーシス研究における結果を示している。
図５５は、ＥＰＨＢ４アンチセンスプローブの、細胞移動に対する効果を示している。５６３７細胞を、ＥＰＨＢ４ＡＳ１０(１０μＭ)で処理した。
図５６は、ＥＰＨＢ４ ｓｉＲＮＡの、細胞浸潤に対する効果を示している。５６３７細胞を、ｓｉＲＮＡ４７２又は対照用ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。
図５７は、ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体の、Ｇ２５０による及びプルダウンアッセイにおける比較を示している。
図５８は、ＥｐｈＢ４抗体が、ＳＣＣ１５異種移植片腫瘍の成長を阻害することを示している。
図５９は、ＥｐｈＢ４抗体が、ＳＣＣ１５頭頚部癌において、アポトーシス、ネクローシス及び減少した血管形成を引き起こすことを示している。
図６０は、ＥｐｈＢ４抗体の全身投与が、腫瘍の退行へと導くことを示している。
図６１は、ヒトのＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示している。
図６２は、ヒトのＥｐｈＢ４のｃＤＮＡヌクレオチド配列を示している。
図６３は、ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している。
図６４は、ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のｃＤＮＡ配列を示している。
図６５は、ヒトのＥｐｈＢ４のアミノ酸配列を示している。
図６６は、ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のアミノ酸配列を示している。
１．概観
本開示は、部分的に、ｅｐｈｒｉｎ／ｅｐｈｒｉｎレセプター経路によるシグナリングが、腫瘍形成に寄与するという発見に基づいている。出願人は、ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４の腫瘍組織における発現を検出して、ｅｐｈｒｉｎ／ｅｐｈｒｉｎレセプターによるシグナリングをブロックするための抗腫瘍治療剤を開発した。加えて、この開示は、ＥｐｈＢ４及びＥｐｈｒｉｎＢ２の発現のアンチセンス又はＲＮＡｉベースの阻害のための核酸及び方法を提供する。従って、ある面において、この開示は、癌並びに血管形成と関連する病気及び望ましくない血管形成関連過程を治療するために使うことのできる多数の核酸化合物を提供する。
ここで用いる場合、用語Ｅｐｈｒｉｎ及びＥｐｈは、それぞれ、リガンドとレセプターを指すために用いる。それらは、様々な動物(例えば、ヒトを含む哺乳動物／非哺乳動物、脊椎動物／無脊椎動物)の何れかからのものであってよい。この領域の系統名は、急速に変化して、ここで用いる述語は、Eph Nomenclature Committee による仕事の結果として提案されたものである(これらは、以前に使われていた名称と共に、ウェブサイト http://www.eph-nomenclature.com でアクセスすることができる)。
ここに記載した仕事は、例えば、特に、ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４に言及する。しかしながら、本発明は、腫瘍において発現される任意のｅｐｈｒｉｎリガンド及び／又はＥｐｈレセプターを、それらのそれぞれのファミリー内で企図する。これらのｅｐｈｒｉｎ(リガンド)は、２つの構造型のものであり、それらは更に、配列関係に基づいて、及び機能的に、それらが２つの対応するレセプターサブグループに対して示す優先的結合に基づいて細分されうる。構造的に、２種類のｅｐｈｒｉｎ：グリセロホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)により膜に繋留されたもの及び膜貫通ドメインにより繋留されたものがある。慣習的に、これらのリガンドは、Ｅｐｈｒｉｎ−Ａサブクラス(ＧＰＩ結合タンパク質であり、優先的にＥｐｈＡレセプターに結合する)及びＥｐｈｒｉｎ−Ｂサブクラス(膜貫通タンパク質であり、一般に、優先的にＥｐｈＢレセプターに結合する)に分類される。
これらのＥｐｈファミリーレセプターは、エリスロポエチン産生ヒト肝細胞癌細胞株における発現につき命名されたレセプターのＥｐｈと関係するレセプタープロテイン−チロシンキナーゼのファミリーである。それらは、細胞外ドメインの配列の関係及びそれらのＥｐｈｒｉｎ−Ａ又はＥｐｈｒｉｎ−Ｂタンパク質に優先的に結合する能力に基づいて、２つのサブグループに分割される。Ｅｐｈｒｉｎ−Ａタンパク質と優先的に相互作用するレセプターは、ＥｐｈＡレセプターであり、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂタンパク質と優先的に相互作用するものは、ＥｐｈＢレセプターである。
Ｅｐｈレセプターは、リガンド結合性球状ドメイン、システインリッチな領域及びその後の一対のＩＩＩ型フィブロネクチンリピートよりなる細胞外ドメインを有する(例えば、図１６参照)。細胞質ドメインは、２つの保存されたチロシン残基を含む近膜領域；プロテインチロシンキナーゼドメイン；不稔のα−モチーフ(ＳＡＭ)及びＰＤＺドメイン結合モチーフよりなる。ＥｐｈＢ４は、膜結合したリガンドＥｐｈｒｉｎＢ２に特異的である(Sakano, S.等、1996; Brambilla R. 等、1995)。ＥｐｈｒｉｎＢ２は、膜貫通ドメイン及び、５つの保存されたチロシン残基及びＰＤＺドメインを有する細胞質領域を有するＥｐｈリガンドのクラスに属する。Ｅｐｈレセプターは、クラスター化して、膜に結合したｅｐｈｒｉｎの結合により活性化され(Davis S 等、1994)、これは、これらのレセプターを発現している細胞とこれらのリガンドを発現している細胞との接触が、Ｅｐｈ活性化に必要であることを示唆している。
リガンド結合に際して、Ｅｐｈレセプターは、二量体化して、近膜チロシン残基を自己リン酸化して完全な活性化を獲得する(Kalo MS 等、1999, Binns KS, 2000)。Ｅｐｈレセプターによる前方シグナリングに加えて、逆行シグナリングが、ＥｐｈｒｉｎＢによって起こりうる。Ｅｐｈとｅｐｈｒｉｎとの連動は、保存された細胞内チロシンの急速なリン酸化(Bruckner K, 1997)及び多少遅いＰＤＺ結合性タンパク質の動員(Palmer A 2002)を生じる。最近、幾つかの研究が、Ｅｐｈ／ｅｐｈｒｉｎの高発現が、腫瘍成長、腫瘍形成性、及び転移の増大した潜在能力と関係しうることを示した(Easty DJ, 1999; Kiyokawa E, 1994; Tang XX, 1999; Vogt T, 1998; Liu W, 2002; Stephenson SA, 2001; Ssteube KG 1999; Berclaz G, 1996)。
本開示の一つの面は、ＥｐｈｒｉｎＢ２及び／又はＥｐｈＢ４を発現する腫瘍の成長速度を減じる方法を提供する。かかる方法は、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＥｐｈＢ４又は両方の遺伝子発現を阻害する核酸治療剤のある量を投与することを含む。
ＩＩ．核酸治療剤
この開示は、ｅｐｈｒｉｎ及び／又はｅｐｈｒｉｎレセプター(Ｅｐｈ)の遺伝子発現を阻害し又は減少させるための核酸治療剤及び方法に関係している。「阻害する」又は「減少させる」とは、その遺伝子の発現、又はＥｐｈｒｉｎＢ２及び／又はＥｐｈＢ４などの一種以上のタンパク質若しくはタンパク質のサブユニットをコードする核酸若しくは等しい核酸のレベルを、この開示の核酸治療剤の非存在下で認められるものよりも一層低く減じることを意味する。「遺伝子」とは、ＲＮＡ例えばポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む(限定はしない)核酸をコードする核酸を意味する。
ここで用いる場合、用語「核酸治療剤」又は「核酸剤」又は「核酸化合物」は、ヌクレオチドを含んで標的遺伝子に対する所望の効果を有する任意の核酸ベースの化合物を指す。これらの核酸治療剤は、一本鎖、二本鎖又は多数本鎖であってよく、改変又は未改変のヌクレオチド又は非ヌクレオチド又は様々な混合物及びこれらの組合せを含んでよい。この開示の核酸治療剤の例には、アンチセンス核酸、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び酵素的核酸化合物が含まれるが、これらに限られない。
一具体例において、この開示は、ＥｐｈｒｉｎＢ２タンパク質(例えば、Genbank Accession No.: NP_004084)をコードするＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子又はＥｐｈＢ４タンパク質(例えば、Genbank Accession No.:NP_004435)をコードするＥｐｈＢ４レセプター遺伝子の発現を、独立に又は協力して調節する少なくとも一種の核酸治療剤を特徴とする。
Ａ．アンチセンス核酸
ある具体例において、この開示は、アンチセンス核酸に関係する。「アンチセンス核酸」とは、標的核酸に、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ＰＮＡ(タンパク質核酸)相互作用によって結合して、その標的核酸の活性を変化させる非酵素的核酸化合物を意味する(総説としては、Stein and Cheng, 1993 Science 261, 1004及びWoolf等、米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい)。典型的には、アンチセンス分子は、そのアンチセンス分子の一本鎖連続配列に沿って、標的配列に対して相補的である。しかしながら、ある具体例においては、アンチセンス分子は、ループを形成することができ、ループを形成する基質核酸に結合する。従って、アンチセンス分子は、２つ(以上)の非連続的基質配列に対して相補的であってよく、又はアンチセンス分子の２つ(以上)の非連続的配列部分が、標的配列に相補的であってよく、又は両方であってよい。現在のアンチセンスストラテジーの総説としては、Schmajuk等、1999, J.Biol.Chem., 274, 21783-21789, Delihas等、1997, Nature, 15, 751-753, Stein等、1997, Antisense N.A. Drug Dev., 7, 151, Crooke, 2000, Methods Enzymol., 313, 3-45; Crooke, 1998, Biotech.Genet.Eng.Rev., 15, 121-157, Crooke, 1997, Ad.Pharmacol., 40, 1-49を参照されたい。
加えて、アンチセンスＤＮＡは、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用により核酸を標的とし、それにより、二本鎖中の標的核酸を消化するＲＮアーゼＨを活性化するために利用することができる。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸を開裂するためにＲＮアーゼを活性化することのできる少なくとも一のＲＮアーゼＨ活性化領域を含むことができる。アンチセンスＤＮＡは、化学合成することができ、又は一本鎖ＤＮＡ発現ベクター又はその同等物を利用して発現させることもできる。「ＲＮアーゼＨ活性化領域」とは、標的核酸に結合して、細胞性ＲＮアーゼＨ酵素に認識される非共有結合性複合体を形成することのできる核酸化合物の領域(一般に、４〜２５ヌクレオチド長以上であり、好ましくは、５〜１１ヌクレオチド長)を意味する(例えば、Arrow等の、米国特許第５，８４９，９０２号；Arrow等の米国特許第５，９８９，９１２号)。これらのＲＮアーゼＨ酵素は、核酸化合物−標的核酸複合体に結合して、標的核酸配列を開裂する。
このＲＮアーゼＨ活性化領域には、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、５’−チオホスフェート、ホスホルアミデート又はメチルホスホネート主鎖化学、又はこれらの組合せが含まれる。少なくとも一の上記の主鎖化学に加えて、ＲＮアーゼＨ活性化領域は、様々な糖化学をも含むことができる。例えば、このＲＮアーゼＨ活性化領域は、デオキシリボース、アラビノ、フルオロアラビノ又はこれらの組合せ、ヌクレオチド糖化学を含むことができる。当業者は、前述が、非制限的な例であること及びＲＮアーゼＨ酵素の活性を支える核酸のホスフェート、糖及び塩基の化学の任意の組合せが、ＲＮアーゼＨ活性化領域の定義及び本開示の範囲内にあることを認識するであろう。
従って、この開示のアンチセンス核酸は、天然型のオリゴヌクレオチド及び、ホスホロチオエート型、オリゴデオキシリボヌクレオチド、ホスホロジチオエート型オリゴデオキシリボヌクレオチド、メチルホスホネート型オリゴデオキシリボヌクレオチド、ホスホルアミデート型オリゴデオキシリボヌクレオチド、Ｈ−ホスホネート型オリゴデオキシリボヌクレオチド、トリエステル型オリゴデオキシリボヌクレオチド、アルファ−アノマー型オリゴデオキシリボヌクレオチド、ペプチド核酸、他の人工核酸、及び核酸改変された化合物を含む改変型のオリゴヌクレオチドを包含する。
他の改変には、オリゴヌクレオチド分子の内部又は両端にあるものが含まれ、ヌクレオシド間ホスフェート結合の分子への付加物、例えばコレステロール、コレステリル、又はアミノ基及び末端リボース間で変化する炭素残基数のジアミン化合物、デオキシリボース及びホスフェート改変(対抗鎖又はゲノムに結合する関連酵素又は他のタンパク質を開裂し又は架橋する)が含まれる。かかる改変オリゴヌクレオチドの例には、改変塩基及び／又は糖(例えば、リボースの代わりにアラビノース)を有するオリゴヌクレオチド、又はヒドロキシル基以外の(３’位)及びリン酸基以外の化学基(５’位)に３’及び５’位の両方で結合した糖を有する３’、５’置換されたオリゴヌクレオチドが含まれる。
糖に対する改変の他の例は、リボース部分の２’位に対する改変を含み、これは、１〜６の飽和又は不飽和の炭素原子を有する--Ｏ--低級アルキル基によるか、又は２〜６炭素原子を有する--Ｏ-アリール若しくはアリル基による２’−Ｏ−置換であって、かかる--Ｏ-アルキル、アリール又はアリル基が未置換であっても置換されていてもよく(例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチルシアノ、ニトロアシルアシロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルバルコキシル、又はアミノ基による置換)、又はアミノ基、又はハロ基による、当該２’−Ｏ−置換を含むが、これらに限られない。この開示の特に有用なオリゴヌクレオチドの非制限的例は、２’−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドを、それらの３’、５’又は３’及び５’末端に有し、少なくとも４又は５つの連続するヌクレオチドがそのように改変されている。２’−Ｏ−アルキル化原子団は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、及び２’−Ｏ−ブチルを含むが、これらに限られない。
ある場合には、天然型の及び改変型のアンチセンス核酸の合成を、例えば、ABI(Applied Biosystems Inc.)により製造された３８１Ａ ＤＮＡ合成機又は３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて、ホスホルアミダイト法(ABI又はF. Eckstein、Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press (1991)から入手可能な指示を参照)に従って行なうことができる。ホスホルアミダイト法において、核酸関連分子を、改変デオキシリボヌクレオシド又は改変リボヌクレオシドの３’末端と他の改変デオキシリボヌクレオシド、改変リボヌクレオシド、オリゴ−改変デオキシリボヌクレオチド又はオリゴ−改変リボヌクレオチドとの間の、シアノエチル基などの基で保護されたホスホルアミダイトを含む試薬の利用による縮合によって合成することができる。この合成の最後のサイクルが完了すると、糖部分の５’末端でヒドロキシル基に結合された保護基(例えば、ジメトキシトリチル基)を有する生成物を与える。こうして室温で合成したオリゴマーは、支持体から開裂されて、そのヌクレオチド及びホスフェート部分は、脱保護される。この方法において、天然型のオリゴ核酸化合物は、粗形態で得られる。ホスホロチオエート型核酸も又、上記の天然型と類似の方法で、ホスホルアミダイト法によって、ABI製の合成機を用いて合成することができる。この合成の最後のサイクルの後の手順も又、天然型と同じである。
こうして得られた粗核酸(天然型又は改変型)を、通常の方法例えばエタノール沈殿、又は逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーで高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、超臨界流体クロマトグラフィーで精製することができ、それを、更に、電気泳動により精製することができる。逆相クロマトグラフィー用のカートリッジ例えばｔＣ１８−パックトＳｅｐＰａｋ Ｐｌｕｓ(ロングボディー／ＥＮＶ)(Waters)を使用することもできる。天然型及び改変(例えば、ホスホロチオエート型)核酸の純度は、ＨＰＬＣにより分析することができる。
ある具体例において、この開示のアンチセンス核酸を、例えば、細胞内で転写された際に、ｅｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４ポリペプチドをコードする細胞性ｍＲＮＡの少なくとも一つのユニーク部分と相補的なＲＮＡを生成する発現プラスミドとして送達することができる。或は、この構築物は、エキス・ビボで生成され、細胞に導入された際に、ｅｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ及び／又はゲノム配列とハイブリダイズすることにより発現の阻害を引き起こすオリゴヌクレオチドである。かかるオリゴヌクレオチドプローブは、適宜、内因性ヌクレアーゼ例えばエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼに耐性であり、それ故、イン・ビボで安定な改変したオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための典型的な核酸化合物は、ホスホルアミデート、ホスホチオエート及びＤＮＡのメチルホスホネート類似体である(米国特許第５，１７６，９９６号；５，２６４，５６４号及び５，２５６，７７５号も参照されたい)。加えて、核酸治療において有用なオリゴマーを構築するための一般的アプローチは、例えば、van der Krol等(1988)によって総説されている。
Ｂ．ｄｓＲＮＡ及びＲＮＡｉ構築物
ある具体例において、この開示は、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)及びＲＮＡｉ構築物に関係する。用語「ｄｓＲＮＡ」は、ここで用いる場合、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)の可能な二本鎖ＲＮＡ分子を指し、これは、ｓｉＲＮＡ(例えば、Bass, 2001, Nature,411, 428-429; Elbashir等、2001, Nature, 411, 494-498; 及びKreutzer等、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ００／４４８９５；Zernicka-Goetz等、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ０１／３６６４６；Fire, ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９９／３２６１９；Plaetinck等、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ００／０１８４６；Mello及びFire, ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ０１／２９０５８；Deschamps-Depaillette, ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９９／０７４０９；及びLi等、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ００／４４９１４参照)を含む。加えて、ＲＮＡｉは、最初、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)が遺伝子発現を特異的様式及び転写後様式でブロックする植物及び蠕虫において認められた現象に適用された用語である。ＲＮＡｉは、遺伝子発現をイン・ビトロ又はイン・ビボで阻害する有用な方法を提供する。
用語「近距離干渉性ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」又は「近距離干渉性核酸」は、ここで用いる場合、細胞により適当にプロセッシングを受けた場合に、ＲＮＡｉ又は遺伝子サイレンシングを媒介することのできる任意の核酸化合物を指す。例えば、このｓｉＲＮＡは、自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であってよく、ここに、アンチセンス領域は、標的核酸化合物(例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４)に対する相補性を含む。このｓｉＲＮＡは、自己相補性センス及びアンチセンス領域を有する一本鎖ヘアピンポリヌクレオチドであってよく、ここに、アンチセンス領域は、標的核酸化合物に対する相補性を含む。このｓｉＲＮＡは、２つ以上のループ構造並びに自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を含む１つのステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってよく、ここに、アンチセンス領域は、標的核酸化合物に対する相補性を含み、この環状ポリヌクレオチドは、イン・ビボ又はイン・ビトロでプロセッシングを受けて、ＲＮＡｉを媒介することのできる活性なｓｉＲＮＡを生成しうる。このｓｉＲＮＡは又、標的核酸化合物に対する相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドをも含むことができ、この一本鎖ポリヌクレオチドは、更に、末端リン酸基例えば５’−ホスフェート(例えば、Martinez等、2002, Cell., 110, 563-574参照)又は５’，３’−ジホスフェートを含むことができる。
適宜、この開示のｓｉＲＮＡは、細胞の生理的条件下で、阻害すべき遺伝子(「標的」遺伝子)のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。この二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を有するだけ十分に天然ＲＮＡに類似していることのみが必要とされる。従って、この開示は、遺伝子突然変異、系統多型又は進化的相違のためと予想されうる配列変異を許容しうるという利点を有する。標的配列とｓｉＲＮＡ配列との間の許容されるヌクレオチドミスマッチの数は、５塩基対中１個以下、又は１０塩基対中１個以下、又は２０塩基対中１個以下、又は５０塩基対中１個以下である。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心でのミスマッチは最も臨界的であり、本質的に、標的ＲＮＡの開裂を完全に破壊しうる。対照的に、標的ＲＮＡに相補的であるｓｉＲＮＡ鎖の３’末端のヌクレオチドは、標的認識の特異性に有意に寄与しない。配列の正体は、配列比較及び当分野で公知のアラインメントアルゴリズム(Gribskov及びDevereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991、及びその中で引用された参考文献を参照)及びヌクレオチド間の差異のパーセントを例えばBESTFITソフロウェアプログラムでデフォルトパラメーター(例えば、Wisconsin大学、Genetic Computingグループ)を利用して実行するSmith-Watermanアルゴリズムによって計算することにより最適化されうる。ｓｉＲＮＡと標的遺伝子の部分との間の９０％より大きい(又は、１００％の)配列同一性が好ましい。或は、このＲＮＡの二本鎖領域は、標的遺伝子転写物の一部とハイブリダイズすることのできるヌクレオチド配列として機能的に規定することができる(例えば、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で、１２〜１６時間のハイブリダイゼーション；及びその後の洗浄)。
ｄｓＲＮＡの二本鎖構造は、一本鎖自己相補的ＲＮＡ、二本鎖相補的ＲＮＡ、又はＤＮＡ鎖と相補的ＲＮＡ鎖によって形成されうる。適宜、ＲＮＡ二本鎖形成は、細胞の内外で開始されうる。このＲＮＡは、少なくとも細胞当たり１コピーの送達を可能にする量で導入することができる。高投与量の二本鎖物質(例えば、少なくとも、細胞当たり５、１０、１００、５００又は１０００コピー)ほど、一層効果的な阻害を生じうるが、一層低い投与量は、特殊な応用には有用でありうる。阻害は、ＲＮＡの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が、遺伝子阻害の標的である点において配列特異的である。
ここに記載のように、主題のｓｉＲＮＡは、１９〜３０ヌクレオチド長であり、一層好ましくは、２１〜２３ヌクレオチド長である。これらのｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体をリクルートして、それらの複合体を標的ｍＲＮＡへ、特異的配列への対合により導くと理解されている。その結果、標的ｍＲＮＡは、タンパク質複合体中で、ヌクレアーゼによって分解される。特定の具体例において、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を含む。ある具体例において、ｓｉＲＮＡは、例えば酵素ダイサーの存在下で、一層長い二本鎖ＲＮＡのプロセッシングによって生成されうる。一具体例において、キイロショウジョウバエのイン・ビトロの系を利用する。この具体例において、ｄｓＲＮＡを、キイロショウジョウバエ胚に由来する可溶性抽出物と合わせ、それにより、組合せを生成する。この組合せを、ｄｓＲＮＡがプロセッシングを受けて約２１〜２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子になる条件下に維持する。これらのｓｉＲＮＡ分子を、当業者に公知の多くの技術を利用して精製することができる。例えば、ゲル電気泳動を利用して、ｓｉＲＮＡを精製することができる。或は、非変性法例えば非変性カラムクロマトグラフィーを利用して、ｓｉＲＮＡを精製することができる。加えて、クロマトグラフィー(例えば、サイズ排除クロマトグラフィー)、グリセロール勾配遠心分離、抗体を利用するアフィニティー精製を利用して、ｓｉＲＮＡを精製することができる。
主題のｄｓＲＮＡ(例えば、ｓｉＲＮＡ)の生成は、化学合成法又は組換え核酸技術によって行なうことができる。処理した細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、転写をイン・ビボで媒介することができ、又はクローン化ＲＮＡポリメラーゼは、イン・ビトロでの転写に利用することができる。ここで用いる場合、この開示のｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含む分子に限る必要はなく、更に、化学的に改変したヌクレオチド又は非ヌクレオチドをも包含する。例えば、これらのｄｓＲＮＡは、リン酸−糖主鎖又はヌクレオシドに対する、例えば細胞性ヌクレアーゼに対する感受性を減らし、バイオアベイラビリティーを改善し、配合特性を改善し及び／又は他の薬物動力学的特性を変えるための改変を含むことができる。例示のために、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合を改変して、少なくとも一つの窒素又は硫黄ヘテロ原子を含ませることができる。ＲＮＡ構造の改変は、ｄｓＲＮＡに対する一般的応答を避けながら、特異的遺伝子阻害を可能にするように作ることができる。同様に、塩基を修飾して、アデノシンデアミナーゼの活性をブロックすることができる。これらのｄｓＲＮＡは、酵素的に又は部分的／全体的に有機合成によって生成することができ、任意の改変リボヌクレオチドを、イン・ビトロで、酵素的に又は有機合成によって導入することができる。ＲＮＡ分子を化学的に改変する方法を、ｄｓＲＮＡを改変するために適合させることができる(例えば、Heidenreich等(1997) Nucleic Acids Res, 25:776-780; Wilson等(1994) J Mol Recog 7:89-98; Chen等(1995) Nucleic Acids Res 23:2661-2668; Hirschbein等(1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7:55-61参照)。単に例示のために、ｄｓＲＮＡの主鎖は、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、ホスホジチオエート、キメラメチルホスホネート−ホスホジエステル、ペプチド核酸、５−プロピニル−ピリミジン含有オリゴマー又は糖改変(例えば、２’−置換されたリボヌクレオシド、ａ−コンフィギュレーション)により改変することができる。ある場合には、この開示のｄｓＲＮＡは、２’−ヒドロキシ(２’−ＯＨ)含有ヌクレオチドを欠いている。
特別の具体例において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、１〜６ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有する(２〜４ヌクレオチド長であってもよいが)。一層好ましくは、３’オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド長である。ある具体例において、一方の鎖は３’オーバーハングを有し、他方の鎖は、鈍端であるか又はやはりオーバーハングを有する。これらのオーバーハングの長さは、各鎖につき、同じであっても異なってもよい。ｓｉＲＮＡの安定性を更に増進させるために、３’オーバーハングを分解に対して安定化させることができる。一具体例において、このＲＮＡを、プリンヌクレオチド例えばアデノシン又はグアノシンヌクレオチドを含有させることにより安定化させる。或は、ピリミジンヌクレオチドの、改変類似体による置換例えばウリジンヌクレオチド３’オーバーハングの２’−デオキシチミジンによる置換は、許容されて、ＲＮＡｉの効力に影響を与えない。２’ヒドロキシルの不在は、組織培養培地におけるそのオーバーハングのヌクレアーゼ耐性を有意に増進させて、イン・ビトロにおいて有益でありうる。
他の特別の具体例において、主題のｄｓＲＮＡは、長い二本鎖ＲＮＡの形態であってもよい。例えば、このｄｓＲＮＡは、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００又は４００塩基である。幾つかの場合には、このｄｓＲＮＡは、４００〜８００塩基長である。適宜、これらのｄｓＲＮＡは、細胞内で消化されて、例えば、ｓｉＲＮＡ配列をその細胞中で生成する。しかしながら、長い二本鎖ＲＮＡのイン・ビボでの利用は、恐らく、配列に依存しないｄｓＲＮＡ応答により引き起こされる有害作用の故に、常に実際的という訳ではない。かかる具体例において、インターフェロン又はＰＫＲの影響を減少させる局所送達用のシステム及び／又は薬剤の利用は、好適である。
更なる特別の例において、このｄｓＲＮＡは、ヘアピン構造の形態である(ヘアピンＲＮＡと称する)。これらのヘアピンＲＮＡは、外因的に合成することもできるし又はイン・ビボでＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからの転写によって形成することもできる。かかるヘアピンＲＮＡの生成及び哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシングのための利用は、例えば、Paddison等、Genes Dev, 2002, 14:948-58; McCaffrey等、Nature, 2002, 418:38-9; McManus等、RNA, 2002, 8:842-50; Yu等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2002, 99:6047-52に記載されている。好ましくは、かかるヘアピンＲＮＡは、細胞内で又は動物内で処理されて、所望の遺伝子の持続的で安定な抑制を確実にする。当分野では、ｓｉＲＮＡが細胞内でのヘアピンＲＮＡのプロセッシングによって生成されうるということは公知である。
ＰＣＴ出願ＷＯ０１／７７３５０は、真核細胞において同じ導入遺伝子のセンス及びアンチセンスＲＮＡ転写物の両者を生成するための導入遺伝子の二方向転写のための典型的なベクターを記載している。従って、ある具体例において、本開示は、次のユニークな特性を有する組換えベクターを提供する：それは、反対向きで配置されて且つ関心あるｄｓＲＮＡの導入遺伝子と隣接する２つの重複する転写ユニットを有するウイルス性レプリコンを含み、ここに、これらの２つの重複する転写ユニットは、宿主細胞中で、同じ導入遺伝子断片から、センス及びアンチセンスＲｎＡ転写物の両方を生成する。
Ｃ．酵素的核酸化合物
ある具体例において、この開示は、酵素的核酸化合物に関係する。「酵素的核酸化合物」とは、基質結合領域において、特異的標的遺伝子に対する相補性を有し且つ標的核酸を特異的に開裂することに対して活性な酵素活性をも有する核酸化合物を意味する。この酵素的核酸化合物が分子間で核酸を開裂させることができ、それにより、標的核酸化合物を不活性化させることができるということは理解される。これらの相補性領域は、酵素的核酸化合物の標的核酸への十分なハイブリダイゼーションを可能にし、それ故、開裂を可能にする。１００パーセントの相補性(同一性)が好ましいが、５０〜７５％ほどの低い相補性も、この開示において有用でありうる(例えば、Werner及びUhlenbeck, 1995, Nucleic Acids Research, 23, 2092-2096; Hammann等、1999, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev., 9, 25-31参照)。これらの酵素的核酸は、塩基、糖、及び／又はリン酸基において改変することができる。ここに記載したように、用語「酵素的核酸」は、リボザイム、触媒性ＲＮＡ、酵素的ＲＮＡ、触媒性ＤＮＡ、アプタザイム又はアプタマー結合性リボザイム、調節可能リボザイム、触媒性オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム、レッドザイム、オリゴザイム又はＤＮＡ酵素など語句と交換可能に用いる。これらの用語のすべては、酵素活性を有する核酸化合物を記述する。本願に記載した特定の酵素的核酸化合物は、この開示に限られるものではなく、当業者は、この開示の酵素的核酸化合物において重要であるすべては、それが、少なくとも一つの標的核酸領域に相補的な特異的基質結合部位を有すること及びそれが、その分子に核酸開裂活性及び／又は核酸連結活性を与える該基質結合部位の内部又は周囲にヌクレオチド配列を有することであることを認めるであろう(Cech等、米国特許第４，９８７，０７１号；Cech等、1988, 260 JAMA 3030)。
天然の酵素的核酸の幾つかの変異体が、現在、知られている。各々は、生理的条件下で、核酸のトランスのホスホジエステル結合の加水分解を触媒することができる(それ故、他の核酸化合物を開裂させることができる)。一般に、酵素的核酸は、標的核酸への第一の結合によって作用する。かかる結合は、標的核酸を開裂させるように作用する分子の酵素的部分のすぐ近くに保持された酵素的核酸の標的結合部分を介して起きる。従って、この酵素的核酸は、先ず、標的核酸を相補的塩基対合により認識してから結合し、一度正しい部位に結合されると、酵素的に作用して標的核酸を切断する。かかる標的核酸の戦略的開裂は、そのコードされたタンパク質の合成を指示する能力を破壊する。酵素的核酸が、その標的核酸に結合して開裂した後で、それは、該核酸から遊離して、他の標的を探して、新しい標的への結合及び開裂を繰り返すことができる。
特定の具体例において、主題の酵素的核酸は、ｍＲＮＡ転写物を酵素的に開裂して、ｍＲＮＡの翻訳を防止するためにデザインされたリボザイムである(例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４(1990年10月４日公開)；Sarver等、1990, Science 247:1222-1225；及び米国特許第５，０９３，２４６号参照)。ｍＲＮＡを部位特異的認識配列で開裂するリボザイムを利用して特定のｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッドリボザイムの利用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、ｍＲＮＡを、標的ｍＲＮＡとの相補的塩基対を形成する隣接領域により指図された位置で開裂する。唯一の必要条件は、標的ｍＲＮＡが、２つの塩基５’−ＵＧ−３’よりなる追随配列を有するということである。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び生成は、当分野で周知であり、Haseloff及びGerlach, 1988, Nature, 334:585-591に一層完全に記載されている。本開示のリボザイムは又、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ(以後、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」と呼ぶ)例えばテトラヒメナ・サーモフィラ中に天然で存在するもの(ＩＶＳ又はＬ−１９ＩＶＳＲＮＡとしても知られる)及び多数記載されてきたもの(例えば、Zaug等、1984, Science, 224:574-578；Zaug及びCech, 1986, Science, 231:470-475；Zaug等、1986, Nature, 324:429-433；University Patents Inc.の公開された国際特許出願Ｎｏ．ＷＯ８８／０４３００；Been及びCech, 1986, Cell, 47:207-216参照)をも包含する。
他の特別の具体例において、主題の酵素的核酸は、ＤＮＡ酵素である。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスとリボザイム技術の両方の機構的特徴の幾つかを合体している。ＤＮＡ酵素は、特定の標的核酸配列を、アンチセンスオリゴヌクレオチドのように認識するが、リボザイムのように標的核酸を触媒的に且つ特異的に開裂するようにデザインされている。簡単にいえば、標的核酸を特異的に認識して開裂する理想的ＤＮＡ酵素をデザインするためには、当業者は、ユニークな標的配列を同定しなければならない。好ましくは、このユニークな又は実質的配列は、Ｇ／Ｃリッチな約１８〜２２ヌクレオチドである。高いＧ／Ｃ含量は、ＤＮＡ酵素と標的配列との間の一層強い相互作用を保証するのを助ける。ＤＮＡ酵素を合成する場合には、酵素にそのメッセージを標的とさせるであろう特異的アンチセンス認識配列を、それがＤＮＡ酵素の２つのアームを含み、そしてＤＮＡ酵素ループが、それらの２つの特異的アームの間に位置されるように分割する。ＤＮＡ酵素を作成して投与する方法は、例えば、米国特許第６，１１０，４６２号に見出すことができる。
ある具体例において、この開示の核酸治療剤は、１２〜２００ヌクレオチド長である。一具体例において、本開示の典型的な酵素的核酸化合物は、１５〜５０ヌクレオチド長であり、例えば、２５〜４０ヌクレオチド長を含んでいる(例えば、Jarvis等、1996, Biol.Chem., 271, 29107-29112参照)。他の具体例において、この開示の典型的なアンチセンス分子は、１５〜７５ヌクレオチド長であり、例えば、２０〜３５ヌクレオチド長を含んでいる(例えば、Woolf等、1992, PNAS., 89, 7305-7309; Milner等、1997, Nature Biotechnology, 15, 537-541参照)。他の具体例において、この開示の典型的なｓｉＲＮＡは、２０〜２７ヌクレオチド長であり、例えば、２１〜２３ヌクレオチド長である。当業者は、必要とされるすべては、主題の核酸治療剤が、ここで企図される反応を触媒するのに十分であり且つ適している長さ及びコンホメーションであることであることを認めるであろう。本開示の核酸治療剤の長さは、述べられた一般的限定のうちで限定されない。
ＩＩＩ．標的部位
この開示の有用な核酸化合物(例えば、アンチセンス核酸、ｄｓＲＮＡ及び酵素的核酸化合物)の標的は、Draper等、３０ＷＯ９３／２３５６９；Sullivan等、ＷＯ９３／２３０５７；Thompson等、ＷＯ９４／０２５９５；Draper等、ＷＯ９５／０４８１８；McSwiggen等、米国特許第５，５２５，４６８号に開示されたようにして決定することができる。他の例には、次の病気関連遺伝子の発現の不活性化のＰＣＴ出願：ＷＯ９５／２３２２５、ＷＯ９５／１３３８０、ＷＯ９４／０２５９５が含まれる。ここで、それらの文献中で与えられた案内を繰り返すよりは、下記に、かかる方法の特定の実施例を与える(当分野のものに限られない)。
かかる標的に対する酵素的核酸化合物、ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスは、それらの出願に記載されたようにデザインされ、イン・ビトロ及びイン・ビボで試験するために、やはり記載されたように合成される。例えば、ヒトＥｐｈｒｉｎＢ２及び／又はＥｐｈＢ４ ＲＮＡの配列は、コンピューター折り畳みアルゴリズムを利用して最適核酸標的部位についてスクリーニングされる。潜在的な核酸結合／開裂部位が同定される。例えば、この開示の酵素的核酸化合物について、該核酸化合物は、コンピューター折り畳み(Jaeger等、1989 Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86, 7706)によって個々に分析されて、該配列が適当な二次構造へと折り畳まるかどうかが評価される。望ましくない分子内相互作用例えば結合アームと触媒コアとの間の相互作用を有する核酸化合物は、考察から排除することができる。
主題の核酸(例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、及び／又は酵素的核酸化合物)の結合／開裂部位を同定して、核酸標的(例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２及び／又はＥｐｈＢ４)中の様々な部位にアニールするようにデザインする。この開示の酵素的核酸化合物の結合アームは、上記の標的部位配列と相補的である。アンチセンス及びＲＮＡｉ配列は、核酸標的に対する部分的な又は完全な相補性を有するようにデザインされる。これらの核酸化合物は、化学合成することができる。用いる合成方法は、下記のように及びUsman等、1987, J Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe等、1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433; 及びWincott等、1995 Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684; Caruthers等、1992, Methods in Enzymology 211, 3-19に記載されたように通常のＤＮＡ／ＲＮＡ合成のための手順に従う。
加えて、ＣｐＧモチーフを有する核酸治療剤が、非特異的免疫応答を引き起こす増大した見込みにあるということが予想される。一般に、ＣｐＧモチーフは、５’方向で少なくとも一つのプリンと隣接し且つ３’方向で少なくとも一つのピリミジンと隣接するＣＧ(シトシン−グアノシン)配列を含む。公知のＣｐＧモチーフのリストは、当分野で利用可能である。好適な核酸治療剤は、一般化された免疫応答の引き金を引かずに、標的遺伝子に対する選択的効果を有する(恐らく、他の密接に関係する遺伝子にも影響する)ように選択されよう。核酸治療剤がＣｐＧモチーフを有することを回避することにより、特定の核酸が免疫応答の引き金を引く見込みを減少させることができる。
ＩＶ．核酸治療剤の合成
１００ヌクレオチド長より大きい核酸の合成は、自動化法を利用しては困難であり、かかる分子の治療コストは、非常に高価である。この開示においては、小さい核酸モチーフ(小さいは、約１００ヌクレオチド長未満の、好ましくは約８０ヌクレオチド長未満の、一層好ましくは約５０ヌクレオチド長未満の核酸モチーフ(例えば、アンチセンス、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、及びＲＮＡｉ構築物)を指す)が、外因性送達のために好適に用いられる。これらの分子の単純な構造は、その核酸の、ＲＮＡ構造の標的領域を侵襲する能力を増大させる。
本開示の典型的分子は、化学合成され、他のものも同様に合成することができる。説明のために、オリゴヌクレオチド(例えば、ＤＮＡ)は、Caruthers等、1992, Methods in Enzymology 211, 3-19, Thompson等、国際ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９９／５４４５９、Wincott等、1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684, Wincott等、1997, Methods Mol.Bio., 74, 59, Brennan等、1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45, 及びBrennan, 米国特許第６，００１，３１１号に記載されたように、当分野で公知のプロトコールを利用して合成される。オリゴヌクレオチドの合成は、一般的な核酸保護基及びカップリング基、例えば５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホルアミダイトを利用する。非制限的例において、小規模の合成は、３９４ Applied Biosystems, Inc. シンセサイザーにて、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドは、２．５分のカップリングステップで、２’−デオキシヌクレオチドは、４５秒のカップリングステップで行なう。或は、合成を、９６ウェルプレートシンセサイザー例えばProtogene(カリフォルニア、Palo Alto在)製の機器にて、サイクルに対して最少改変で行なうことができる。
適宜、本開示の核酸化合物は、別々に合成して、合成後に例えば連結により一緒に合わせることができる(Moore等、1992, Science 256, 9923; Draper等、国際ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９３／２３５６９；Shabarova等、1991, Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon等、1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon等、1997, Bioconjugate Chem. 8, 204)。
好ましくは、本開示の核酸化合物は、専ら、ヌクレアーゼ耐性基例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈでの改変により、安定性を増進させるために改変されている(総説としては、Usman及びCedergren, 1992, TIBS 17, 34; Usman等、1994, Nucleic Acids Symp.Ser. 31, 163を参照されたい)。リボザイムは、電気泳動により一般的方法を利用して精製され又は高圧クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ；Wincott等、前出、the totality of which is hereby incorporated herein by reference参照)によって精製されて、水中で再懸濁される。
Ｖ．核酸化合物の活性の最適化
改変を有する核酸化合物(例えば、塩基、糖及び／又はリン酸)は、それらの血清リボヌクレアーゼによる分解を防止することができ、それにより、それらの効能を増すことができる。当分野には、ヌクレアーゼ安定性及び効力の有意の増進を伴って核酸化合物に導入することのできる糖、塩基及びリン酸の改変を記載している幾つかの例がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性基例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基の改変によって、安定性を増進させ及び／又は生物学的活性を増進させるために改変される(総説としては、Usman及びCedergren, 1992, TIBS. 17, 34; Usman等、1994, Nucleic Acids Symp. Ser.31,163; Burgin等、1996, Biochemistry, 35, 14090を参照されたい)。核酸化合物の糖の改変は、当分野では多数記載されてきた(Eckstein等、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９２／０７０６５；Perrault等、Nature, 1990, 344, 565-568； Pieken等、Science, 1991, 253, 314-317; Usman及びCedergren, Trends in Biochem.Sci., 1992, 17, 334-339; Usman等、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９３／１５１８７；Sproat, 米国特許第５，３３４，７１１号及びBeigelman等、1995, J.Biol.Chem., 270, 25702; Beigelman等、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９７／２６２７０；Beigelman等、米国特許第５，７１６，８２４号；Usman等、米国特許第５，６２７、０５３号；Woolf等、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９８／１３５２６；Thompson等、米国特許第６０／０８２，４０４号(１９９８年４月２０日出願)；Karpeisky等、1998, Tetrahedron Lett., 39, 1131; Earnshaw及びGait, 1998, Biopolymers (Nucleic acid Sciences), 48, 39-55; Verma及びEckstein, 1998, Annu.Rev.Biochem., 67, 99-134;及びBurlina等、1997, Bioorg.Med.Chem., 5, 1999-2010参照)。同様の改変を利用して、本開示の核酸化合物を改変することができる。
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の、ホスホロチオエート、ホスホロチオエート及び／又は５’−メチルホスホネート結合の化学的改変は、安定性を改善するが、これらの改変が多すぎると毒性を引き起こしうる。それ故、核酸化合物をデザインする場合には、これらのヌクレオチド間結合の量を評価して適当に最少化すべきである。これらの結合の濃度の減少は、毒性を低下させるはずであり、これらの分子の増大した効力及び一層高い特異性を生じるはずである。
一具体例において、この開示の核酸化合物は、少なくとも一種のＧクランプヌクレオチドを含む。Ｇクランプヌクレオチドは、改変されたシトシン類似体であり、該ヌクレオチドにおいては、これらの改変は、二本鎖中の相補的グアニンのワトソン−クリック及びフーグスティーン面の両方に水素結合する能力を与える(例えば、Lin及びMatteucci, 1998, J.Am.Chem.Soc., 120, 8531-8532を参照されたい)。オリゴヌクレオチド中の単一のＧクランプ類似体置換は、相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした場合に、実質的に増進されたらせん温度安定性及びミスマッチ識別を生じうる。この開示の核酸化合物にかかるヌクレオチドを含むことは、核酸標的に対する増進されたアフィニティー及び特異性の両方を生じる。他の具体例において、この開示の核酸化合物は、少なくとも一つのＬＮＡ(ロックされた核酸)ヌクレオチド例えば２’，４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドを含む(例えば、Wengel等、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ００／６６６０４及びＷＯ９９／１４２２６参照)。
他の具体例において、この開示は、ＥｐｈｒｉｎＢ２及び／又はＥｐｈＢ４を標的とする核酸化合物の結合体及び／又は複合体を特徴とする。かかる結合体及び／又は複合体を利用して、核酸化合物の生物学的系例えば細胞への送達を容易にすることができる。本開示により提供されるこれらの結合体及び複合体は、治療用化合物を細胞膜を横切って運ぶこと、薬物動力学を変えること、及び／又はこの開示の核酸化合物の局在性を調節することによって治療活性を与えることができる。
本開示は、分子の細胞膜を横切る送達のための新規な結合体及び複合体のデザイン及び合成を含んでおり、かかる分子には、小分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負に帯電したポリマー及び他のポリマー例えばタンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、又はポリアミンが含まれるが、これらに限られない。一般に、記載したトランスポーターは、個別的に又は多成分系の部分として用いるために、分解可能なリンカーを有して又は有しないでデザインされる。これらの化合物は、この開示の核酸化合物の、種々の組織に由来する多くの細胞型への送達及び／又は局在性を、血清の存在下又は非存在下で改善することが予想される(Sullenger及びCech, 米国特許第５，８５４，０３８参照)。ここに記載の分子の結合体は、生物学的に活性な分子に、生物分解性のリンカー例えば生物分解性の核酸リンカー分子を介して結合することができる。
用語「生物分解性核酸リンカー分子」は、ここで用いる場合、一の分子を他の分子例えば生物学的に活性な分子に結合するために生物分解性リンカーとしてデザインされた核酸化合物をいう。生物分解性核酸リンカー分子の安定性は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び化学的に改変されたヌクレオチド例えば２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、及び他の２’−改変された又は塩基改変されたヌクレオチドの様々な組合せを利用することにより調節することができる。この生物分解性核酸リンカー分子は、二量体、三量体、四量体、又は一層長い核酸化合物例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであってよく、又はリンベースの結合例えばホスホルアミデート又はホスホジエステル結合を有する単一ヌクレオチドを含むことができる。この生物分解性核酸リンカー分子は又、核酸主鎖、核酸糖、又は核酸塩基の改変をも含むことができる。用語「生物分解性」は、ここで用いる場合、生物学的系における分解例えば酵素的分解又は化学的分解をいう。
治療用核酸化合物例えばここに記載した外因的に送達される分子は、標的ＲＮＡの翻訳が望ましくないタンパク質のレベルを減じるだけ十分長く阻害されるまで、細胞内で最適に安定である。この期間は、病状に応じて数時間〜数日の間で変化する。これらの核酸化合物は、有効な細胞内治療剤として機能するために、ヌクレアーゼに耐性であるべきである。本開示に記載した核酸化合物の化学合成及び当分野における改善は、核酸化合物を改変する能力を、上記のようにそれらのヌクレアーゼ安定性を増進するヌクレオチド改変を導入することによって拡大してきた。
他の面において、これらの核酸化合物は、５’及び／又は３’−キャップ構造を含む。「キャップ構造」とは、オリゴヌクレオチドの何れかの末端に組み込まれた化学的改変を意味する(例えば、Wincott等、ＷＯ９７／２６２７０を参照されたい)。これらの末端改変は、核酸化合物を、エキソヌクレアーゼ分解から防護し、細胞内での送達及び／又は局在化を助成することができる。このキャップは、５’−末端(５’−キャップ)又は３’−末端(３’−マップ)又は両端に存在しうる。非制限的例において、５’−キャップは、逆向き歩行不能残基(部分)、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−(ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル)ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオシド；改変塩基ヌクレオチド；ホスホロチオエート結合；threo−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−secoヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド；３’，３’−逆向きヌクレオチド部分；３’，３’−逆向き歩行不能部分；３’，２’−逆向きヌクレオチド部分；３’，２’−逆向き歩行不能部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；又は架橋若しくは非架橋メチルホスホネート部分(一層詳細には、Wincott等、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９７／２６２７０参照)を含む。他の非制限的例において、３’−キャップは、例えば、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−(ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル)ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；改変塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオペントフラノシヌクレオチド；非環式３’，４’−secoヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド；５’−５’−逆向きヌクレオチド部分；５’−５’−逆向き歩行不能部分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；架橋及び／又は非架橋５’−ホスホルアミデート、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート、架橋又は非架橋メチルホスホネート及び５’−メルカプト部分(一層詳細には、Beaucage及びIyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925参照)を含む。
ＶＩ．治療方法
ある具体例において、本開示は、血管形成を阻止する方法及び血管形成関連疾患を治療する方法を提供する。他の具体例において、本開示は、腫瘍の成長を阻止し又は低減させる方法及び癌を患っている個人を治療する方法を提供する。これらの方法は、その個人への、治療上有効な量の少なくとも一種の上記の核酸治療剤の投与を含む。これらの方法は、動物の特にヒトの治療及び予防処置において、特に目標とされている。
ここに記載のように、血管形成関連疾患には、血管形成に依存する癌(例えば、固形腫瘍、血液から生じる癌例えば白血病、及び腫瘍転移物を含む)；良性腫瘍例えば血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫；炎症性疾患例えば免疫及び非免疫炎症；慢性関節リウマチ及び乾癬；眼の血管形成性疾患例えば糖尿病性網膜症、時期尚早の網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、新血管新生緑内障、水晶体後方線維増殖症、ルベオーシス；オスラー−ウェバー症候群；心筋血管形成；プラーク新血管新生；毛細血管拡張症；血友病関節；血管線維腫；及び外傷肉芽形成及び外傷治癒；毛細血管拡張性乾癬強皮症、化膿性肉芽腫、冠状動脈側枝、虚血肢血管形成、角膜疾患、ルベオーシス、関節炎、糖尿病性新血管新生、骨折、脈管形成、造血が含まれるが、これらに限られない。
この開示の方法及び組成物は又、何れの血管形成非依存性の癌(腫瘍)を治療するためにも有用であるということは理解される。ここで用いる場合、用語「血管形成非依存性癌」は、腫瘍組織において新血管新生が全く又は殆どない癌(腫瘍)をいう。
ここに記載のように、この腫瘍には、個体内の腫瘍、腫瘍移植片、又はイン・ビトロで培養された腫瘍が含まれる。特に、本開示の核酸治療剤は、大腸癌、乳癌、中皮腫、前立腺癌、膀胱癌、頭頸部扁平上皮細胞癌(ＨＮＳＣＣ)、カポジ肉腫及び白血病を含む(これらに限らない)癌(腫瘍)を治療し又は防止するのに有用である。
かかる方法のある具体例において、少なくとも一種の核酸治療剤を、一緒に(同時に)、又は異なる時点で(順次的に)投与することができる。加えて、核酸治療剤は、他の種類の癌を治療し又は血管形成を阻止するための化合物と共に投与することができる。
ある具体例において、この開示の主題の方法は、単独で利用することができる。或は、主題の方法は、増殖性疾患(例えば、腫瘍)の治療又は防止に向けられた他の慣用の抗癌治療アプローチと組み合せて利用することができる。例えば、かかる方法は、予防的な癌の防止、外科手術後の癌の再発及び転移の防止において、並びに他の慣用の癌治療の補助として利用することができる。本開示は、慣用の癌治療(例えば、化学療法、放射線療法、光線療法、免疫療法及び外科手術)の効力を、主題の核酸治療剤の利用により増進できることを認識する。
慣用の化合物の広範な配列は、新生物抵抗性を有することが示されてきた。これらの化合物は、固形癌を収縮させ、転移及び更なる成長を防止し、又は白血病若しくは骨髄悪性疾患における悪性細胞の数を減じるための化学療法における医薬として用いられてきた。化学療法は、様々な種類の悪性疾患の治療において有効であったが、多くの新生物抵抗性化合物は、望ましくない副作用を誘発する。２種類以上の異なる治療剤を合わせた場合、それらの治療剤は、共同的に働いて、各治療剤の投薬量を減じることができ、それにより、一層高い投薬量で各化合物により発揮される有害な副作用を減じることができるということが示されている。他の例において、治療剤に抵抗性の悪性疾患は、２種以上の異なる治療剤の組合せ療法に応答しうる。
本開示の核酸治療剤を他の慣用の抗新生物剤と組み合せて投与した場合(同時に又は順次的に)、かかる治療剤は、抗新生物剤の治療効果を増進すること又はかかる抗新生物剤に対する細胞の耐性を克服することが示される。これは、抗新生物剤の投薬量の減少を可能にし、それにより、望ましくない副作用を減少させ、又は耐性細胞における抗新生物剤の効力を回復させる。
組合せ抗腫瘍治療のために利用することのできる医薬化合物には(単に説明のために)、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カペシタビン、カーボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカーバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエンストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドクソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコーチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ジェムシタビン、ジェニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレサミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレクスト、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビノレルビンが含まれる。
これらの化学療法用抗腫瘍化合物は、それらの作用機構によって、例えば次のグループに類別することができる：抗代謝産物／抗癌剤例えばピリミジン類似体(５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ジェムシタビン及びシタラビン)及びプリン類似体、フォレートアンタゴニスト及び関連インヒビター(メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン及び２−クロロデオキシアデノシン(クラドリビン))；ビンカアルカロイド(ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン)などの天然産物を含む抗増殖性／抗有糸分裂剤、タキサン(パクリタキセル、ドセタキセル)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポシロン及びナベルビンなどの微小管分断剤、エピジポドフィロトキシン(エトポシド、テニポシド)、ＤＮＡ損傷剤(アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カーボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イフォスファミド、メルファラン、メルクロレタミン、マイトマイシン、マイトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバシン、タキソール、タキソテレ、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド及びエトポシド(ＶＰ１６))；抗生物質例えばダクチノマイシン(アクチノマイシン Ｄ)、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、イダルビシン、アントラサイクリン、マイトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)及びマイトマイシン；酵素(Ｌ−アスパラギンを全身で代謝して、自身でアスパラギンを合成する能力を有しない細胞を涸渇させるＬ−アスパラギナーゼ)；抗血小板剤；抗増殖性／抗有糸分裂性アルキル化剤例えばナイトロジェンマスタード(メクロレタミン、シクロホスファミド及び類似体、メルファラン、クロラムブシル)、エチレンイミン及びメチルメラミン(ヘキサメチルメラミン及びチオテパ)、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア(カルムスチン(ＢＣＮＵ)及び類似体、ストレプトゾシン)、トラゼンス−ダカルバジニン(ＤＴＩＣ)；抗増殖性／抗有糸分裂性代謝拮抗剤例えば葉酸類似体(メトトレキセート)；白金配位複合体(シスプラチン、カルボプラチン)、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、マイトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体(エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド)及びアロマターゼインヒビター(レトロゾール、アナストロゾール)；抗凝固剤(ヘパリン、合成ヘパリン塩及び他のトロンビンインヒビター)；線維素溶解薬剤(例えば組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ)、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗移動剤；抗分泌剤(ブレベルジン)；免疫抑制剤(シクロスポリン、タクロリムス(ＦＫ−５０６)、シロリムス(ラパマイシン)、アザチオップリン、ミコフェノレート・モフェチル)；抗血管形成性化合物(ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン)及び成長因子インヒビター(血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)インヒビター、繊維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)インヒビター)；アンギオテンシンレセプターブロッカー；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体(トラスツヅマブ)；細胞周期インヒビター及び分化誘導剤(トレチノイン)；ｍＴＯＲインヒビター、トポイソメラーゼインヒビター(ドキソルビシン(アドリアマイシン)、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン及びミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン)、コルチコステロイド(コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルペドニゾロン、プレドニゾン及びプレニゾロン)；成長因子シグナル変換キナーゼインヒビター；ミトコンドリア機能不全誘発剤及びカスパーゼアクチベーター；及びクロマチン分断剤。
ある具体例において、組合せ抗血管形成療法に用いることのできる医薬化合物は、(１)「血管形成性分子」例えばｂＦＧＦ(塩基性繊維芽細胞成長因子)の放出のインヒビター；(２)血管形成性分子の中和剤例えば抗βｂＦＧＦ抗体；及び(３)血管形成刺激に対する内皮細胞応答のインヒビター(コラゲナーゼインヒビター、基底膜ターンオーバーインヒビター、血友病ステロイド、カビ由来の血管形成インヒビター、血小板因子４、トロンボスポンジン、関節炎用の薬例えばＤ−ペニシラミン及びチオリンゴ酸金、ビタミンＤ3、類似体、アルファ−インターフェロンなど)を含む。血管形成の追加の提案されたインヒビターについては、Blood等、Bioch.Biophys.Acta., 1032:89-118(1990), Moses等、Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber等、Lab.Invest, 59:44-51 (1988)及び米国特許第５，０９２，８８５号、５，１１２，９４６号、５，１９２，７４４号、５，２０２，３５２号及び第６５７３２５６号を参照されたい。加えて、血管形成の阻害に利用することのできる広範な化合物例えばＶＥＧＦ媒介の血管形成経路をブロックするペプチド又は薬剤、エンドスタチンタンパク質又は誘導体、アンギオスタチンのリジン結合性断片、メラニン又はメラニン促進性化合物、プラスミノーゲン断片(例えば、プラスミノーゲンのクリングル１−３)、トロポインサブユニット、ビトロネクチンαvβ3のアンタゴニスト、サポシンＢに由来するペプチド、抗生物質又は類似体(例えば、テトラサイクリン又はネオマイシン)、ジエノジェスト含有組成物、ペプチドに結合されたＭｅｔＡＰ−２阻害性コア、化合物ＥＭ−１３８、カルコン及びその類似体、並びにナーラダーゼインヒビターを含む化合物がある。例えば、米国特許第６，３９５，７１８号、６，４６２，０７５号、６，４６５，４３１号、６，４７５，７８４号、６，４８２，８０２号、６，５００，４３１号、６，５００，９２４号、６，５１８，２９８号、６，５２１，４３９号、６，５２５，０１９号、６，５３８，１０３号、６，５４４，７５８号、６，５４４，９４７号、６，５４８，４７７号、６，５５９，１２６号、及び６，５６９，８４５号を参照されたい。
この組合せ療法の性質に依存して、この開示の核酸治療剤の投与は、他の治療を施与しながら及び／又は施与後に続けることができる。これらの核酸治療剤の投与は、単一投与量で行なうことも、多数回の投与量で行なうこともできる。幾つかの場合には、これらの核酸治療剤の投与は、慣用の治療の少なくとも数日前に開始するが、他の場合には、投与を、慣用の治療の施与の直前又は施与時に開始する。
ＶＩＩ．投与方法及び医薬組成物
これらの主題の核酸化合物の送達方法は、当分野で公知である(例えば、Akhtar等、1992, Trends Cell Bio., 2, 139; 及びDelivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, Akhtar編、1995; Sullivan等、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９４／０２５９５参照)。これらのプロトコールは、事実上任意の核酸化合物の送達のために利用することができる。核酸化合物は、当業者に公知の様々な方法によって細胞に投与することができ、該方法には、イオン導入法によるリポソームへの封入、又は他のビヒクル例えばヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル及び生体付着性ミクロスフェアへの組込みが含まれるが、これらに限られない。或は、この核酸／ビヒクルの組合せは、直接的注射により又は点滴ポンプの利用によって局所的に送達される。送達の他の経路には、経口投与(錠剤又は丸薬形態)及び／又は髄腔内送達(Gold, 1997, Neuroscience, 76, 1153-1158)が含まれるが、これらに限られない。他のアプローチには、様々な輸送及びキャリアーシステムの利用例えば結合体及び生物分解性ポリマーの利用によるものが含まれる。薬物送達ストラテジーについての分かり易い総説としては、Ho等、1999, Curr.Opin.Mol.Ther., 1, 336-343及びJain, Drug Delivery Systems: Technologies and Commercial Opportunities, Decision Resources, 1998及びGroothuis等、1997, J.Neuro Virol., 3, 387-400を参照されたい。核酸送達及び投与の一層詳細な説明は、Sullivan等、前出、Draper等、ＰＣＴＷＯ９３／２３５６９、Beigelman等、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９９／０５０９４、及びKlimuk等、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９９／０４８１９に与えられている。
ある具体例において、本開示の主題の核酸(例えば、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ構築物、及び酵素的核酸)を、製薬上許容しうるキャリアーと配合する。かかる治療剤は、単独で投与することができ、又は、医薬配合物(組成物)の成分として投与することができる。これらの化合物は、投与のために、ヒト又は獣医学用薬剤における利用のための任意の便利な方法で配合することができる。湿潤剤、膨潤剤及び潤滑剤例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム並びに着色剤、剥離剤、被覆剤、甘味剤、調味剤及び芳香剤、防腐剤及び抗酸化剤も又、これらの組成物中に存在してよい。
これらの主題の核酸の配合物には、経口投与／鼻投与、局所投与、非経口投与、直腸投与及び／又は膣内投与に適したものが含まれる。これらの配合物は、単位投薬形態中に、便利に存在してよいし、製薬分野で周知の任意の方法により調製することができる。単一投薬形態を生成するためにキャリアー材料と合わせることのできる活性成分の量は、治療される宿主、特定の投与様式に依って変化する。単一投薬形態を生成するためにキャリアー材料と合わせることのできる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる化合物の量である。
ある具体例において、これらの配合物又は組成物を調製する方法には、他の種類の抗腫瘍性治療剤又は抗血管形成剤及びキャリアー及び適宜少なくとも一種の付随的成分と合わせることが含まれる。一般に、これらの配合物は、液体キャリアー若しくは微粉固体キャリアー又はこれら両方を利用して調製し、要すれば、生成物を型成形することができる。
経口投与のための配合物は、カプセル、カシェ、丸薬、錠剤、飴錠剤(調味ベース、通常ショ糖及びアラビアゴム又はトラガカントゴム使用)、粉末、顆粒、又は溶液若しくは懸濁液(水性又は非水性液体中)、又は水中油若しくは油中水乳濁液、又はエリキシル若しくはシロップ、又は香錠(不活性ベース例えばゼラチン及びグリセリン又はショ糖及びアラビアゴム使用)及び／又はうがい薬などの形態であってよい(各々は、予め決めた量の主題の核酸治療剤を活性成分として含む)。
経口投与のための固体投薬形態(カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、顆粒など)において、本開示の少なくとも一種の核酸治療剤を、少なくとも一種の製薬上許容しうるキャリアー例えばクエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウムと混合することができ、及び／又は次の何れかと混合することができる：(１)充填剤又は増量剤例えば澱粉、ラクトース、シュークロース、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸；(２)結合剤例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、シュークロース及び／又はアラリアゴム；(３)湿潤剤例えばグリセロール；(４)崩壊剤例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム；(５)溶解遅延剤例えばパラフィン；(６)吸収促進剤例えば四級アンモニウム化合物；(７)湿潤剤例えばセチルアルコール及びグリセロールモノステアレート；(８)吸着剤例えばカオリン及びベントナイト粘土；(９)潤滑剤例えばタルク、カルシウムステアレート、マグネシウムステアレート、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物；並びに(１０)着色剤。カプセル、錠剤及び丸薬の場合に、これらの医薬組成物は、緩衝剤をも含むことができる。同種の固体組成物は又、ラクトース即ち乳糖並びに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を利用する軟質及び硬質充填ゼラチンカプセルにおいて、充填剤としても利用することができる。
経口投与のための液体投薬形態には、製薬上許容しうるエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが含まれる。活性成分に加えて、これらの液体投薬形態は、当分野で一般的に用いられている不活性希釈剤例えば水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油(特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、小麦油、オリーブ油、ひまし油、及び胡麻油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物を含むことができる。不活性希釈剤の他に、これらの経口投与組成物は、補助剤例えば湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味剤、調味剤、着色剤、芳香剤、及び防腐剤をも含むことができる。
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁化剤例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカントゴム、及びこれらの混合物を含むことができる。
特に、この開示の方法は、皮膚又は粘膜例えば子宮頸部及び膣粘膜に、局所的に施与することができる。これは、副作用を誘発する可能性を最少にして、腫瘍への直接的送達の最大の機会を提供する。これらの局所用配合物は、更に、皮膚又は角質層の浸透性増進剤として有効であることが知られている広範囲の薬剤の少なくとも一種を含むことができる。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセタミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチル又はイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、及びアゾンである。更なる薬剤を含有させて、この配合物を、化粧品として許容しうるものとすることができる。これらの例は、脂肪、ワックス、油、染料、芳香剤、防腐剤、安定剤、及び界面活性剤である。当分野で知られているような角質溶解剤も又、含有させることができる。例は、サリチル酸及び硫黄である。
局所的又は経皮的投与のための投薬形態には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、絆創膏、及び吸入が含まれる。主題の核酸は、無菌条件下で、製薬上許容しうるキャリアー及び、任意の防腐剤、緩衝剤、又は噴射剤(必要な場合)と混合することができる。これらの軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、主題の核酸分子に加えて、賦形剤例えば動物性及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物を含むことができる。
粉末及びスプレーは、主題の核酸治療剤に加えて、賦形剤例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、及びポリアミドパウダー、又はこれらの物質の混合物を含むことができる。スプレーは、追加的に、通例の噴射剤例えばクロロフルオロ炭化水素及び揮発性の不飽和炭化水素例えばブタン及びプロパンを含むことができる。
非経口投与に適した医薬組成物は、少なくとも一種の核酸治療剤を、製薬上許容しうる無菌の等張の水性若しくは非水性溶液、分散、懸濁液若しくはエマルジョン、又は使用直前に再構成して無菌の注射溶液若しくは分散とすることのできる無菌の粉末(抗酸化剤、緩衝剤、意図する受容者の血液と等張の配合物を与える溶質又は懸濁化剤又は増粘剤を含んでよい)と組み合わせて含むことができる。この開示の医薬組成物において利用しうる適当な水性又は非水性のキャリアーの例は、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、及びこれらの適当な混合物、植物油例えばオリーブ油、及び注射可能な有機酸エステル例えばエチルオレエートを包含する。適当な流動性は、例えば、被覆剤例えばレシチンの利用により(分散の場合の必要な粒子サイズの維持による)、及び界面活性剤の利用によって維持することができる。
これらの組成物は又、補助剤例えば防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤をも含むことができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗カビ剤例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有により、確実にすることができる。これらの組成物に、等張剤例えば糖類、塩化ナトリウムなどを含むことも又、望ましい。加えて、注射可能な医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤例えばアルミニウムモノステアレート及びゼラチンの含有によりもたらしうる。
注射可能な蓄積形態を、少なくとも一種の核酸治療剤の生物分解性ポリマー例えばポリラクチド−ポリグリコリド中のマイクロカプセルマトリクスを形成することによって生成することができる。薬物のポリマーに対する比、及び用いる特定のポリマーの性質に依って、薬物放出速度を制御することができる。他の生物分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)及びポリ(無水物)が含まれる。蓄積注射用配合物は又、薬物を、身体組織と適合性のリポソーム又はミクロエマルジョン中に封じ込めることによっても調製される。
膣内又は直腸内投与のための配合物は、坐薬として与えることができ、それは、この開示の少なくとも一種の化合物を少なくとも一種の適当な非刺激性賦形剤又はキャリアー(例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックス又はサリチレートを含み、室温では固体であるが、体温では液体であり、それ故、直腸又は膣内腔では溶融して、活性化合物を放出する)と混合することにより製造することができる。
ある具体例において、本開示の核酸は、本開示の核酸化合物の、それらの望まれる活性に最も適した物理的局在化における効果的な分布を与える製薬上許容しうる薬剤と配合される。かかる製薬上許容しうる薬剤の非制限的な例には、ＰＥＧ、リン脂質、ホスホロチオエート、様々な組織へ薬物が入ることを増進させるＰ−糖タンパク質インヒビター(例えばプルロニックＰ８５)、移植後の持続的放出送達のための生物分解性ポリマー例えばポリ(ＤＬ−ラクチド−コグリコリド)ミクロスフェア(Emerich, DF等、1999, Cell Transplant, 8, 47-58)及び薬物を血液脳関門を横切って送達することができて、ニューロンの取込み機構を変えることのできる充填ナノパーティクル例えばポリブチルシアノアクリレートから作られたもの(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999)が含まれる。
他の具体例において、本開示の核酸化合物のあるものは、細胞内で、真核生物プロモーターから発現させることができる(例えば、Izant及びWeintraub, 1985, Science, 229, 345; McGarry及びLindquist, 1986, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 399; Scanlon等、1991, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88, 10591-5; Kashani-Sabet等、1992, Antisense Res. Dev.,2, 3-15; Dropulic等、1992, J.Viol., 66, 1432-41; Weerasinghe等、1991, J.Virol., 65, 5531-4; Ojwang等、1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89, 10802-6; Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Sarver等、1990 Science, 247, 1222-1225; Thompson等、1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Good等、1997, Gene Therapy, 4, 45)。当業者は、任意の核酸が、真核細胞において適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現されうることを十分に理解している。かかる核酸の活性は、酵素的核酸による一次転写物からのそれらの放出によって増加させることができる(Draper等、ＰＣＴＷＯ９３／２３５６９、及びSullivan等、ＰＣＴＷＯ９４／０２５９５；Ohkawa等、1992, Nucleic Acids Symp.Ser., 27, 15-6; Taira等、1991, Nucleic Acids Res., 19, 5125-30; Ventura等、1993, Nucleic Acids Res., 21, 3249-55; Chowrira等、1994, J.Biol.Chem., 269, 25856; これらの参考文献のすべてを全体として参考として本明細書中に援用する)。ＣＮＳに特異的な遺伝子治療アプローチは、Blesch等、2000, Drug News Perspect., 13, 269-280; Peterson等、2000, Cent.Nerv.Syst.Dis., 485-508; Peel 及びKlein, 2000, J.Neurosci.Methods, 98, 95-104; Hagihara等、2000, Gene Ther. 7, 759-763; 及びHerrlinger等、2000, Methods Mol.Med., 35, 287-312によって記載されている。ＡＡＶ媒介による核酸の神経系への送達は、更に、Kaplitt等、米国特許第６，１８０，６１３号によって記載されている。
この開示の他の面において、本開示のＲＮＡ分子が、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写ユニット(例えば、Couture等、1996, TIG., 12, 510参照)から発現される。これらの組換えベクターは、好ましくは、ＤＮＡプラスミド又はウイルス性ベクターである。リボザイム発現ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス又はアルファウイルスに基づいて構築することができるが、これらに限られない。好ましくは、これらの核酸化合物を発現することのできる組換えベクターは、上記のように送達されて、標的細胞中に存続される。或は、核酸化合物の一時的発現を与えるウイルスベクターを利用することができる。かかるベクターは、必要なときに繰り返し投与することができる。一度発現されれば、この核酸化合物は、標的ｍＲＮＡに結合する。核酸化合物を発現するベクターの送達は、静脈内投与又は筋肉内投与、患者から外植され、その後その患者に再導入される標的細胞への投与、又は所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段などによる全身性の送達であってよい(総説としては、Couture等、1996, TIG., 12, 510を参照されたい)。
一面において、この開示は、本開示の核酸化合物の少なくとも一つをコードする核酸配列を含む発現ベクターを企図する。その核酸配列は、この開示の核酸化合物の発現を可能にする仕方で操作可能に結合される。例えば、この開示は、次を含む発現ベクターを特徴とする：ａ）転写開始領域(例えば、真核生物のｐｏｌ Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ開始領域)；ｂ）転写終結領域(例えば、真核生物のｐｏｌ Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ終結領域)；ｃ）本開示の核酸触媒の少なくとも一つをコードする核酸配列；ここに、該配列は、該開始領域及び該終結領域に、該化合物の発現及び／又は送達を可能にする仕方で操作可能に結合されている。このベクターは、適宜、この開示の核酸触媒をコードする配列の５’側又は３’側に操作可能に結合されたタンパク質のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)；及び／又はイントロン(介在配列)を含むことができる。
この開示は、今や、一般的に記載されており、下記の実施例を参照することにより、一層容易に理解されよう。これらの実施例は、単に、本開示のある面及び具体例の説明の目的のために含まれるものであり、この開示を制限することを意図するものではない。
実施例１．ヒトＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈ４タンパク質の細胞外ドメインの可溶性誘導体
ヒトＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外ドメインの可溶性誘導体は、ＥｐｈｒｉｎＢ２の切り詰められた完全長の予想される細胞外ドメイン(Ｂ４ＥＣｖ３、Ｂ２ＥＣ)又は、ヒト免疫グロブリンの定常領域(ＩｇＧ１ Ｆｃ断片)との翻訳融合物例えばＢ２ＥＣ−ＦＣ、Ｂ４ＥＣｖ２−ＦＣ及びＢ４ＥＣｖ３−ＦＣを表している。代表的なヒトＥｐｈｒｉｎＢ２構築物及びヒトＥｐｈＢ４構築物を、図１４及び１５に示してある。
これらの組換えタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片を、哺乳動物用発現ベクター中にサブクローン化して、一時的に又は安定にトランスフェクトした哺乳動物細胞株中で発現させ、材料及び方法の節(下記参照)に記載されたように、均質にまで精製した。これらのタンパク質の予想されるアミノ酸配列を、図１〜５に示してある。単離されたタンパク質の高い純度及び、それらの、対応する抗ＥｐｈｒｉｎＢ２及び抗ＥｐｈＢ４モノクローナル又はポリクローナル抗体による認識が確認された。これらの組換えタンパク質は、予想される高い親和性結合、結合競争及びそれらの対応する結合パートナーとの特異性を示す(生化学的アッセイにより確認された)(例えば、図６〜８参照)。
かかる可溶性の誘導体タンパク質のヒトＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４は、血管形成又は抗癌活性を測定する幾つかの細胞ベースのアッセイ及びイン・ビトロアッセイにおいて強力な生物学的活性を示し、それ故、抗血管形成及び抗癌治療のための前途薬物候補である。Ｂ４ＥＣｖ３並びにＢ２ＥＣ及びＢ２ＥＣ−ＦＣタンパク質は、ヒト内皮細胞の化学走性をブロックした(臍帯及び肝臓ＡＥＣ又はＶＥＣで試験して)。これは、細胞外マトリクス、マトリゲルの分解の減少及び成長因子刺激に応答しての移動の減少を伴った(図９〜１１)。Ｂ４ＥＣｖ３及びＢ２ＥＣ−ＦＣタンパク質は、それらの内皮細胞管形成の阻害により示されるように、強力な抗血管形成効果を有している(図１２〜１３)。
材料及び方法
１）ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４の組換え可溶性誘導体を生成するための哺乳動物用発現ベクター
ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４の組換え可溶性誘導体を発現させるためのプラスミドベクターは、ｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)、ｐＩＧ(Novagen)又はｐＲＫ５に基づくものであった。ｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯは、ヒトの伸長因子１ａ’エンハンサー／プロモーター及びブラスチシジン耐性マーカーを含む。ｐＩＧベクターは、ＣＭＶプロモーターの制御下でのヒトＩｇＧ１のＦｃ部分とのタンパク質融合物の高レベル発現のためにデザインされ、ｐＲＫ５は、一般的目的のＣＭＶプロモーター含有哺乳動物用発現ベクターである。プラスミド構築物ｐＥＦ６−Ｂ４ＥＣ−ＮＴを生成するために、ヒトＥｐｈＢ４のｃＤＮＡ断片を、オリゴプライマー 5'-GGATCCGCC ATGGAGCTC CGGGTGCTGCT-3'及び5'-TGGATCCCT GCTCCCGC CAGCCCTCG CTCTCATCCA-3'を利用するＰＣＲによって増幅して、ｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター中にＴＯＰＯ−クローン化した。ｐＥＦ６−ｈＢ４ＥＣｖ３を、ｐＥＦ６−Ｂ４ＥＣＮＴから、プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＶ及びＢｓｔＢＩで消化して、両端をクレノー酵素を用いて充填してベクターに再連結することによって誘導した。ｐＥＦ６−Ｂ４ＥＣ−ＮＴによりコードされる組換えＥｐｈＢ４誘導体は、エピトープ又は精製タグを含まないが、ｐＥＦ６−ｈＢ４ＥＣｖ３によりコードされる類似のＢ４ＥＣｖ３タンパク質は、調整培地からの精製を容易にするＶ５エピトープタグ及び６×ＨｉｓタグをそのＣ末端に含む。プラスミド構築物ｐＥＦ６−ｈＢ２ＥＣを、オリゴプライマー5'-TGGATCCAC CATGGCTGT GAGAAGGGAC-3'及び5'-ATTAATGGTGATGGT GAT GATGACTAC CCACTTCGG AACCGAGGATGTTGTTC-3'を利用するＥｐｈｒｉｎＢ２ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅及びｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター中へのＴＯＰＯクローニングにより生成した。プラスミド構築物ｐＩＧ−ｈＢ２ＥＣ−ＦＣを、オリゴプライマー5'-TAAAGCTTCCGCCATGG CTGTGAGAAGGGAC-3'及び5'-TAGGATCCACTTCGGA ACCGAGGATGTTGTT CCC-3'を利用するＥｐｈｒｉｎＢ２ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、とその後のＴＯＰＯクローニング及びその結果生成したＰＣＲ断片を配列決定し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＩＧｈＩｇＧ１ Ｆｃ融合ベクター中に連続サブクローン化することにより生成した。同様に、ｐＩＧ−ｈＢ２ＥＣ及びｐＩＧ−ｈＢ４ＥＣｖ３を、ＥｐｈＢ４ ＥＣＤ ｃＤＮＡの部分を、オリゴプライマー5'-ATAAGCTTCC GCCATGGAGC TCCGGGTGCTG-3'及び5'-TTGGATCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGC TCTCATC-3'を利用してＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＩＧ ｈＩｇＧ１ Ｆｃ融合発現ベクター中に連続サブクローニングすることにより生成した。上記のベクターによりコードされたタンパク質の予想される配列を、図１〜５に示してある。
２）哺乳動物細胞培養及びトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ(ヒト胎児腎臓系統)細胞を、１０％透析済ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗体を含むＤＭＥＭ中に維持した。細胞を、５％ＣＯ2／９５％空気の加湿した大気中で３７℃に維持した。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００試薬(Invitrogen)を利用して、製造業者のプロトコールに従って行なった。トランスフェクションの一日前に、２９３Ｔ細胞を、トランスフェクション時に８０％集密に達するように高密度で播種した。１：３の比のプラスミドＤＮＡとリポフェクタミン試薬を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ低下血清培地(Invitrogen)中で、５分間希釈して、一緒に混合してＤＮＡ：リポフェクタミン複合体を形成した。各１０ｃｍ培養皿に、１０μｇのプラスミドＤＮＡを使用した。２０分後に、上記複合体を、培養培地中の細胞に直接加えた。トランスフェクションの１６時間後に、培地を吸引して、無血清ＤＭＥＭで一回洗い、無血清ＤＭＥＭで置き換えた。分泌されたタンパク質を、４８時間後に、調整培地を集めることにより収穫した。調整培地を、１０，０００ｇで２０分間の遠心分離により清澄化して、０．２μｍフィルターにより濾過して、精製用に利用した。
３）安定な細胞株の生成
ＥｐｈＢ４ＥＣｖ３及びＥｐｈＢ４ＥＣｎｔを産生する安定な細胞株を生成するために、ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐＥＦ６−Ｂ４ＥＣｖ３又はｐＥＦ６−Ｂ４ＥＣ−ＮＴプラスミド構築物で上記のようにトランスフェクトして、抗生物質ブラスチシジンを利用して選択した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を低密度で播種した。翌日、細胞を１０μｇ／ｍｌのブラスチシジンで処理した。薬物選択の２週間後に、生存細胞をプールして、更に、単一細胞クローン拡大のために選択した。安定な細胞を樹立した後で、それらを、４μｇ／ｍｌブラスチシジンにて維持した。調整培地を試験して、各組換えタンパク質の発現及び分泌を確認した。発現の特異性を、ウエスタンブロットにより、抗Ｂ４モノ及びポリクローナル抗体及びＢ２ＥＣ−ＡＰ試薬結合及び競合アッセイを利用して確認した。
４）タンパク質の精製
ＨＥＫ２９３細胞を、分泌型のＥｐｈＢ４エクトドメイン(Ｂ４ＥＣｖ３)をコードするプラスミドを利用して一時的にトランスフェクトした。調整培地を収穫して、１０ｍＭ イミダゾール、０．３Ｍ ＮａＣｌを補い、２０，０００ｇで３０分間遠心分離して細胞残骸及び不溶性粒子を除去した。８０ｍｌの得られた上清を、１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ−アガロース(Qiagen)を含む前平衡化カラムに、１０ｍｌ／時の流量で加えた。このカラムを１０ｍｌの５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ イミダゾール(ｐＨ８)で洗った後、残留タンパク質を、３ｍｌの０．２５Ｍ イミダゾールを利用して溶出させた。溶出されたタンパク質を、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ(ｐＨ８)に対して一晩透析した。Ｂ４ＥＣｖ３の純度及び同定を、ＰＡＧＥ／クーマシーＧ−２５０及びウエスタンブロットにより、抗Ｅｐｈ．Ｂ４抗体を利用して確認した。最後に、Ｂ４ＥＣｖ３の濃度を測定して、該タンパク質のアリコートを採って、−７０℃に貯蔵した。
Ｂ４ＥＣ−ＦＣタンパク質及びＢ２ＥＣ−ＦＣタンパク質を、同様にして精製した。
５）生化学的アッセイ
Ａ．結合アッセイ
１０μｌのＮｉ−ＮＴＡ−アガロースを、小型遠心分離機用チューブ内で、５０μｌの、結合緩衝液ＢＢ(２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ウシ血清アルブミンｐＨ８)で希釈した示した量のＢ４ＥＣｖ３と共にインキュベートした。振盪プラットフォーム上での３０分間のインキュベーション後に、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを、１．４ｍｌのＢＢで２回洗い、その後、５０μｌのＢ２−ＡＰを終濃度５０ｎＭで加えた。結合を、３０分間にわたって振盪プラットフォーム上で行なってから、チューブを遠心分離して、１．４ｍｌのＢＢで一回洗った。沈殿したＡＰの量を、ＰＮＰＰの添加後に、比色法により測定した。
Ｂ．阻害アッセイ
溶液中での阻害。５０μｌのＢＢで希釈した種々の量のＢ４ＥＣｖ３を、５０μｌの５ｎＭ Ｂ２ＥＣ−ＡＰ試薬(ＥｐｈｒｉｎＢ２エクトドメインの胎盤アルカリホスファターゼとのタンパク質融合物)と予備インキュベートした。１時間のインキュベーション後に、未結合のＢ２ＥＣ−ＡＰを、膜と結合した完全長ＥｐｈＢ４を発現する５，０００のＨＥＫ２９３細胞で２０分間沈殿させた。結合反応を、１．２ｍｌのＢＢでの希釈とその後の１０分間の遠心分離により停止させた。上清を捨てて、集めた細胞と結合したアルカリホスファターゼ活性を、パラニトロフェニルホスフェート(ＰＮＰＰ)基質を加えることにより測定した。
細胞ベースの阻害。Ｂ４ＥＣｖ３を、２０ｍＭ トリスＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ８にて連続希釈して、膜結合した完全長のＥｐｈｒｉｎＢ２を発現する５，０００のＨＥＫ２９３細胞と混合した。１時間のインキュベーション後に、５０μｌの５ｎＭ Ｂ４ＥＣ−ＡＰ試薬(ＥｐｈＢ４エクトドメインの臍帯アルカリホスファターゼとのタンパク質融合物)を各チューブに３０分間にわたって加えて、占められていないＥｐｈｒｉｎＢ２結合部位を検出した。結合反応を、１．２ｍｌのＢＢでの希釈及び遠心分離により停止した。細胞沈殿されたＡＰの比色反応を、ＰＮＰＰ基質を利用して発生させた。
Ｃ．Ｂ４ＥＣ−ＦＣ結合アッセイ
プロテインＡ−アガロースベースのアッセイ。１０μｌのプロテインＡ−アガロースを、５０μｌの、結合緩衝液ＢＢ(２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ ｐＨ８)にて希釈した示した量のＢ４ＥＣ−ＦＣを含むエッペンドルフチューブ中でインキュベートした。振盪プラットフォーム上での３０分間のインキュベーション後に、プロテインＡアガロースビーズを、１．４ｍｌのＢＢで２回洗ってから、５０μｌのＢ２ＥＣＡＰ試薬を終濃度５０ｎＭで加えた。結合を、３０分間にわたって振盪プラットフォーム上で行なってから、チューブを遠心分離して、１．４ｍｌのＢＢで一回洗った。沈殿したＡＰの比色反応を、ＰＮＰＰの添加後に測定した(図６)。
ニトロセルロースベースのアッセイ。Ｂ４ＥＣ−ＦＣを、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ８にて連続希釈した。各画分の２μｌを、ニトロセルロース細片に塗布して、スポットを３分間乾燥させた。ニトロセルロース細片を、５％脱脂乳で３０分間ブロックしてから、５ｎＭ Ｂ２ＥＣ−ＡＰ試薬とインキュベートした。結合のための４５分間のインキュベーション後に、ニトロセルロースを、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ８で２回洗って、色を、アルカリホスファターゼの基質のSigma Fast(Sigma)の添加により発色させた。
Ｄ．Ｂ４ＥＣ−ＦＣ阻害アッセイ
溶液における阻害。Ｂ４ＥＣｖ３については、上記を参照されたい。結果を、図７に示した。
細胞ベースの阻害。Ｂ４ＥＣｖ３については、上記を参照されたい。
Ｅ．Ｂ２ＥＣ−ＦＣ結合アッセイ
プロテインＡ−アガロースベースのアッセイ。Ｂ４ＥＣ−ＦＣについては、上記を参照されたい。結果を、図８に示した。
ニトロセルロースベースのアッセイ。Ｂ４ＥＣ−ＦＣについては、上記を参照されたい。
６）細胞ベースのアッセイ
Ａ．成長阻害アッセイ
ヒトの臍帯静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)(１．５×１０３)を、９６ウェルプレート中で、１００μｌのＥＢＭ−２(Clonetic # CC3162)中にプレートする。２４時間後に(０日目)、試験組換えタンパク質(１００μｌ)を、各ウェルに、ＥＢＭ−２培地中にて、２×所望濃度(５〜７濃縮レベル)で加える。０日目に、１枚のプレートを、０．５％クリスタルバイオレット(２０％メタノール中)を用いて１０分間染色し、水ですすぎ、風乾する。残りのプレートを、７２時間にわたって、３７℃でインキュベートする。７２時間後に、プレートを、０．５％クリスタルバイオレット(２０％メタノール中)で染色し、水ですすぎ、風乾する。この染色を、エタノール：０．１Ｍ クエン酸ナトリウムの１：１溶液を用いて溶出させ(０日目のプレート)、吸光度を５４０ｎｍで、ＥＬＩＳＡリーダー(Dynatech Laboratories)を用いて測定する。０日目の吸光度を、７２時間のプレートから減算し、データを対照用増殖(ビヒクルで処理した細胞)のパーセンテージとしてプロットする。ＩＣ５０(５０％阻害を引き起こす薬物濃度)を、このプロットデータから計算する。
Ｂ．コード形成アッセイ(内皮細胞管形成アッセイ)
マトリゲル(１０ｍｇ／ｍｌの６０μｌ；Collaborative Lab # 35423)を、氷冷した９６ウェルプレートの各ウェル内に置く。このプレートを、室温に１５分間置いてから、３７℃で３０分間インキュベートして、このマトリゲルを重合させる。その間に、ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ−２(Clonetic # CC3162)中で、２×１０5細胞／ｍｌの濃度で準備する。この試験化合物を、２×所望濃度(５濃縮レベル)で、同じ培地中で準備する。細胞(５００μｌ)と２×薬物(５００μｌ)を混合して、２００μｌのこの懸濁液を、二連で、重合させたマトリゲル上に置く。２４時間のインキュベーション後に、各濃度につき三連で写真を撮る(Bioquant製、イメージ・アナリシス・システム使用)。薬物の効果(ＩＣ５０)を、未処理の対照に対して、形成されたコードの長さ及び接合数を測定することにより評価する。
Ｃ．細胞移動アッセイ
移動を、４８ウェルＢｏｙｄｅｎチャンバー及び８μｍ細孔寸法のコラーゲン被覆した(１０μｇ／ｍｌのラット尾のコラーゲン；Collaborative Laboratories)ポリカーボネートフィルター(Osmonics, Inc.)を利用して評価する。底部チャンバーのウェルに、２７〜２９μｌのＤＭＥＭ培地のみ(基線)又は化学誘引剤(ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ又はＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞調整培地)を含む培地を加える。頂部チャンバーには、４５μｌの、ＤＭＥＭ＋１％ＢＳＡにて調製したＨＵＶＥＣ細胞懸濁液(１×１０6細胞／ｍｌ)を加える(試験化合物を伴うか又は伴わない)。５時間３７℃でのインキュベーション後に、膜を、ＰＢＳ中ですすぎ、固定して、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ溶液にて染色する。このフィルターを、移動した細胞を有するスライド硝子上に表を下にして置き、頂部の細胞をキムワイプを用いて除去する。試験を、４〜６レプリカにて行い、各ウェルから５つの視野を計数する。陰性の未刺激の対照値を、刺激された対照及び薬物処理した値から減算し、データを平均移動細胞±Ｓ.Ｄ.としてプロットする。ＩＣ５０を、プロットしたデータから計算する。
実施例２．ＥｐｈＢ４レセプターの細胞外ドメイン断片は、血管形成及び腫瘍成長を阻止する。
Ａ．ＥｐｈＢ４の球状ドメインは、内皮管形成アッセイにおいて、ＥｐｈｒｉｎＢ２の結合及びＥｐｈＢ４由来の可溶性タンパク質の活性に必要である。
レセプターの可溶性組換え誘導体の抗血管形成活性に必要且つ十分であるＥｐｈＢ４の異所的部分のサブドメインを同定するために、ＥｐｈＢ４ＥＣの４つの組換え欠失変異体を生成して試験した(図１６)。ＥｐｈＢ４の細胞外部分は、ＥｐｈＢ及びＥｐｈＡレセプターファミリーの他のメンバーと同様に、Ｎ末端リガンド結合性球状ドメイン及びその後ろのシステインリッチなドメイン及び２つのＩＩＩ型フィブロネクチン反復(ＦＮＩＩＩ)を含む。ＥｐｈＢ４の完全な異所的部分を含む組換えＢ４−ＧＣＦ２タンパク質に加えて、我々は、球状ドメイン及びＣｙｓ−リッチドメイン(Ｂ４−ＧＣ)；球状、Ｃｙｓ−リッチ及び第一のＦＮＩＩＩドメイン(ＧＣＦ１)並びに球状ドメインの欠失したＥＣＤバージョン(ＣＦ２)を含むＥｐｈＢ４ＥＣの３つの欠失変異体を構築した。球状ドメインのみを含む切り詰められたＥｐｈＢ４ＥＣタンパク質の幾つかのバージョンを生成する我々の試みは、３つのすべての構築物から発現されたタンパク質の分泌の欠如及び細胞内で発現された組換えタンパク質によるリガンド結合の不在のために成功しなかった。加えて、Ｂ４−ＧＣＦ２のタグなしバージョン(ＧＣＦ２−Ｆと呼ばれる)(追加の融合アミノ酸を含まないＥｐｈＢ４の完全な細胞外ドメインを含む)を、発現させ、精製し、ここに記載した実験の幾つかで利用した。
Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを付けた４つの組換えタンパク質のすべては、一時的にトランスフェクトされた培養哺乳動物細胞において予備的に発現されて、調整用成長培地から、Ｎｉ2+キレート樹脂上のクロマトグラフィーを利用して均質にアフィニティー精製された(図１７)。明らかに、これらのタンパク質は、それらのグリコシル化のために、ＳＤＳ−ＰＡＡＧ上で、それらの予想された分子量３４．７ｋＤａ(ＧＣ)、４１．５(ＣＦ２)、４５．６ｋＤａ(ＧＣＦ１)及び５７．８ｋＤａ(ＧＣＦ２)により示唆されるよりも幾らか速く移動する。ヒトＥｐｈＢ４の細胞外ドメインの配列は、Ｃｙｓ−リッチドメイン中、第一のＩＩＩ型フィブロネクチン反復中及び第一と第二のフィブロネクチン反復との間に局在する３つの予想されるＮ−グリコシル化部位(ＮＸＳ／Ｔ)を含んでいる。
これらの精製組換えタンパク質のＥｐｈｒｉｎＢ２に結合する能力を確認するために、それらを、イン・ビトロ結合アッセイで試験した。予想されるように、ＧＣ、ＧＣＦ１及びＧＣＦ２は、ＥｐｈｒｉｎＢ２−アルカリホスファターゼ(ＥｐｈｒｉｎＢ２−ＡＰ)融合タンパク質と、Ｎｉ2+樹脂上又はニトロセルロース膜上に固定化されたＢ４タンパク質との間の相互作用により確認されるように、同起源のリガンドＥｐｈｒｉｎＢ２に結合するが、ＣＦ２は結合しない(図１７)。
４つのタンパク質すべてを、ＰＣ３細胞におけるＥｐｈＢ４レセプターキナーゼのリガンド依存性二量体形成及び活性化をブロックする能力についても試験した。ＰＣ３(ヒト前立腺癌細胞株)は、上昇したレベルのヒトＥｐｈＢ４を発現することが知られている。ＰＣ３細胞の、ＥｐｈｒｉｎＢ２ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質による刺激は、レセプターのチロシンリン酸化の迅速な誘導へと導く。しかしながら、リガンドの、ＧＣＦ２、ＧＣＦ１又はＧＣとの予備インキュベーションは、その後のＥｐｈＢ４の自己リン酸化を抑制するが、ＣＦ２タンパク質との予備インキュベーションは抑制しない。ＰＣ３細胞へのこれらのタンパク質のみの添加又はこれらの細胞をこれらのタンパク質と予備インキュベーションした後に培地を変えて該リガンドを添加することは、ＥｐｈＢ４のリン酸化状態に影響を与えない。
更に、我々は、ＥｐｈＢ４の球状ドメインが、内皮管形成アッセイにおけるＥｐｈＢ４由来の可溶性タンパク質の活性に必要であることを見出した。
Ｂ．可溶性ＥｐｈＢ４のＨＵＶ／ＡＥＣに対するイン・ビトロでの効果
初期の実験は、可溶性ＥｐｈＢ４が、血管形成経路の３つの主なステージに影響を与えるかどうかを確認するために行なわれた。これらは、可溶性ＥｐｈＢ４の、ＨＵＶ／ＡＥＣによるイン・ビトロでの移動／浸潤、増殖及び管形成に対する効果を確立することにより行われた。可溶性ＥｐｈＢ４にさらすことは、ＢｏｙｄｅｎチャンバーアッセイにおけるｂＦＧＦ及びＶＥＧＦ誘導される移動の両方を、投与量依存様式で有意に阻害した(ｎＭで有意性を達成)(図１８)。マトリゲルで被覆されたウェル上のＨＵＶ／ＡＥＣＳによる管形成は、可溶性ＥｐｈＢ４によって、投与量依存様式で、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦの存在下と非存在下において、有意に阻害された(図１９)。我々は又、イン・ビトロで、ｎＭの可溶性ＥｐｈＢ４が、ＨＵＶＥＣＳに対して細胞傷害性であるかどうかを評価した。可溶性ＥｐｈＢ４は、ＭＴＳアッセイにより評価して、これらの投与量では、検出可能な細胞傷害効果を有しないことが見出された(図２０)。
Ｃ．可溶性ＥｐｈＢ４レセプターは、イン・ビボで、マトリゲルプラグの血管新生を阻害する
可溶性ＥｐｈＢ４が、血管形成をイン・ビボで直接阻害することができることを示すために、我々は、マウスマトリゲルプラグ実験を行なった。ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦを補ったマトリゲルを、可溶性ＥｐｈＢ４を伴って又は伴わないで、Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに皮下注射して、６日間にわたって半固体プラグを形成した。成長因子を有しないプラグは、事実上、血管形成を有さず又は６日後に血管構造を有しなかった(図２１)。対照的に、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦを補ったプラグは、広範囲の血管新生を有し及びプラグ中に血管を有した。μｇの可溶性ＥｐｈＢ４で処理したマウスから採取したプラグは、顕著に減少したプラグの血管新生を有し、成長因子を有しないプラグに匹敵した(図２１)。更に、プラグの組織学的検査は、減少した血管の染色を示した(図２１)。０μｇ／投与量での処理は、マトリゲルプラグにおける浸潤の量を、対照と比較して有意に阻害した(図２１)。
我々は、ＨＵＶＥＣにおけるＥｐｈＢ４レセプターのリン酸化を、可溶性ＥｐｈＢ４処理した細胞の溶解物及びホスホルチロシンに対する抗体を利用するウエスタンブロット分析によって試験した。我々は、血清欠乏ＨＵＶＥＣの可溶性ＥｐｈＢ４処理が、リン酸化ＥｐｈＢ４レベルの迅速且つ一過性の減少を、ＥｐｈｒｉｎＢ２Ｆｃ、ＥｐｈＢ４リガンド二量体の存在下で刺激することを見出した。可溶性ＥｐｈＢ４タンパク質を有しないＥｐｈｒｉｎＢ２Ｆｃは、ＥｐｈＢ４レセプターのリン酸化を誘導した(図２２)。
Ｄ．可溶性ＥｐｈＢ４の腫瘍成長に対するイン・ビトロでの効果
我々は、可溶性ＥｐｈＢ４が、Ｂａｌｂ／Ｃ Ｎｕ／Ｎｕマウスで成長したＳＣＣ１５腫瘍の成長を阻害することを見出した(図２３)。
Ｅ．可溶性ＥｐｈＢ４は、角膜の新血管新生を阻害した
可溶性ＥｐｈＢ４のイン・ビボでの抗血管形成活性を更に調べるために、我々は、可溶性ＥｐｈＢ４の投与の、マウスの角膜におけるｂＦＧＦにより誘導される新血管新生に対する阻害効果を研究した。角膜のマイクロポケットに移植されたハイドロンペレットは、血管形成を、典型的に無血管野で成長因子の存在下で誘導することができた。このマウスの角膜における血管形成応答は中位であり、血管蕾の出現は遅延し、そして新しい毛細血管は希薄でゆっくり成長した。移植７日目で、対照群と比較して、マウスの角膜でｂＦＧＦにより誘導された新血管新生は、可溶性ＥｐｈＢ４処理した群において顕著に阻害された(図２４)。
Ｆ．可溶性ＥｐｈＢ４の腫瘍成長に対するイン・ビボでの効果
同じモデルを利用して、可溶性ＥｐｈＢ４のイン・ビボでの効果を測定した。ＳＣＣ１５腫瘍を皮下に移植し、成長因子を伴い又は伴わないで、マトリゲルと共に予備インキュベートし、並びに単独で皮下に移植し、そしてマウスを毎日、１〜５μｇの可溶性ＥｐｈＢ４で処理した(皮下又は腹腔内投与)。
対照群の腫瘍は、処理期間中、着実に成長し続けて、ｍｍ３の最終的な腫瘍容積に達した。しかしながら、可溶性ＥｐｈＢ４を注射されたマウスは、有意に(ｐ＜０．０１)減少した成長速度を示し、ｍｍ３だけの最終的な腫瘍容積に達した(図２５)。類似の結果が、かかる腫瘍を有するマウスの更なる２集団において得られた。可溶性ＥｐｈＢ４の投与は、イン・ビボで十分許容されるようであり、これらの動物の体重又は一般的安寧に対する有意の影響はなかった(嗜眠、断続的うずくまり、震え又は乱れた呼吸パターンの不在により測定して)。
Ｇ．可溶性ＥｐｈＢ４の腫瘍組織学に対する効果
組織学的分析は、全ＳＣＣ１５腫瘍におけるネクローシスの中心領域の存在を示したが、それは、通常、生存力のある腫瘍細胞の縁に囲まれている。これらの中心ネクローシス領域は、しばしば、大きく、集密的であり、細胞の細部の喪失を示した。腫瘍部分領域のパーセンテージとして評価して、ネクローシスは、有意に(ｐ＜０．０２)、可溶性ＥｐｈＢ４処理群において、一層広範囲であった(処理群におけるネクローシス％対対照群)。可溶性ＥｐｈＢ４処理した腫瘍の減少した容積が、このタンパク質の、腫瘍血管供給に対する効果のためであるのかどうかを測定するために、血管内の内皮細胞を、腫瘍部分で、抗血小板細胞接着性分子(ＰＥＣＡＭ−１；ＣＤ３１)抗体を利用する免疫染色(図２６)を利用して同定し及び微細血管の密度を評価した。微細血管密度は、対照及び可溶性ＥｐｈＢ４処理した腫瘍において、腫瘍細胞の外側の生存力のある縁(十分規定された核を有する腫瘍周縁部に隣接する細胞の均質な層)におけるものと類似していた。微細血管密度は、有意に、可溶性ＥｐｈＢ４処理した腫瘍において(対照用腫瘍より)、ネクローシスの中心領域と隣接する腫瘍細胞の一層低い生存力の内方領域であった。フィブリン沈着は(マッソン三色染色法により同定して)、可溶性ＥｐｈＢ４処理した腫瘍において(対照用腫瘍より)、内方の生存力のある縁及び中心のネクローシスコアの血管の内部及び周辺で増大した。可溶性ＥｐｈＢ４処理した腫瘍の外側の生存力のある縁において、血管内腔は、開放性を保持して赤血球細胞を含有したが、フィブリン沈着は、多くの血管において明白であった。可溶性ＥｐｈＢ４は、試験した正常組織(肺、肝臓及び腎臓)の内皮に対してかかる効果を有しないことが見出された。
Ｈ．材料及び方法
１）発現用構築物
可溶性の６×Ｈｉｓタグ付きＥｐｈＢ４−ＥＣＤ変異体を生成するための発現ベクターを構築するために、クローン化した完全長のヒトＥｐｈＢ４ｃＤＮＡを、次のオリゴプライマーを利用するＰＣＲによって増幅した：TACTAGTCCGCCATGGAGCTCCGGGTGCTGCT(一般的なＥｐｈＢ４ Ｎ末端プライマー)及びGCGGCCGCTTAATGGTGATGGTGA TGATGAGCCGAAGGAGGGGTGGTGCA(Ｂ４−ＧＣ)、AGCGGCCGCTTAATGGTGATGGTGAT GATGGACATTGACAGGCTCAAATGGGA(Ｂ４−ＧＣＦ１)又はTGCGGCCGCTTAATGGTGATGGTGATGATGCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTCTCAT(Ｂ４−ＧＣＦ２)。その結果生成したＰＣＲ断片を、哺乳動物用発現ベクターｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ(Invitrogen)中に、ＥＦ−１αプロモーターの制御下にＴＡクローン化した。発現された組換えタンパク質は、ヒトＥｐｈＢ４の成熟細胞外部分の次の断片をコードしている：アミノ酸１〜５２２位(ＧＣＦ２)、１〜４１２位(ＧＣＦ１)及び１〜３１２位(ＧＣ)。ｐＥＦ６クローニングのためのＢ４−ＣＦ２欠失(δアミノ酸１３〜１８３)ＰＣＲ断片を生成するために、ＥｐｈＢ４ｃＤＮＡを、オリゴプライマーTACTAGTCCGCCATGGAGCTCCGGGTGCTGCT、CAGCTGAGTTTCCAATTTTGTGTTC、GAACACAAAATTGGAAACTCAGCTGACTGTGAACCTGAC及びGCGGCCGCCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTを利用する２ステップの重複ＰＣＲによって増幅した。
分泌されるヒトＥｐｈｒｉｎＢ２−アルカリホスファターゼ(Ｂ２−ＡＰ)試薬を生成するためのベクターを、プライマーTAAAGCTTCCGCCATGGCTGTGAGAAGGGAC及びTAGGATCCTTCGGAACCGAGGATGTTGTTCCCを利用するヒトＥｐｈｒｉｎＢ２ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により構築して、その結果生成した断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化して、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ消化したｐＡＰＴａｇ２ベクター(GenHunter, Inc.)中にクローニングした。それぞれの場合において、発現ベクター中の挿入物を、完全な配列決定により確認した。
２）抗体及び他の試薬
抗ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体ｍＡＢ７９及びｍＡＢ２３を、成熟ヒトＥｐｈＢ４のアミノ酸１〜５２２を含むＧＣＦ２タンパク質に対してマウスにおいて生成して、ハイブリドーマ上清からプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０を、ＵＢＩ(ニューヨーク、Lake Placid)から得た。プロテインＧ−ＨＲＰ結合体をBio-Radから購入した。
３）ＥｐｈＢ４由来の組換えタンパク質の発現及び精製
ＥｐｈＢ４−ＥＣＤ可溶性タンパク質を生成するために、培養ヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３Ｔを、対応するプラスミド構築物で、標準的なリン酸カルシウム法又はリポフェクタミン２０００試薬(Invitrogen)プロトコールを利用してトランスフェクトした。トランスフェクションの１２〜１６時間後に、成長培地(ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清)を吸引して、細胞を無血清ＤＭＥＭで一回洗い、無血清ＤＭＥＭで置き換えた。分泌されたタンパク質を含む調整培地を７２〜９６時間後に収穫し、遠心分離により清澄化して、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース(Qiagen)を利用するＨｉｓタグ付きタンパク質の精製に利用した。これらの組換えタンパク質の純度及び量を、ＳＤＳ−ＰＡＡＧ電気泳動及びクーマシーブルー又は銀染色、ウエスタンブロッティング及びＵＶ分光法により試験した。精製されたタンパク質を、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８に対して透析して、−７０℃に保存した。
これらのタンパク質のリガンド結合特性を試験するために、１０μｇのＮｉ−ＮＴＡ−アガロース(Qiagen)を、小型遠心分離器用チューブ内で、０．５ｍｌの結合用緩衝液ＢＢ(２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ８)中で希釈したＢ４−ＥＣＤタンパク質の１０〜５００ｎｇの試料とインキュベートした。振盪プラットフォーム上での３０分間のインキュベーションの後に、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを、１．４ｍｌのＢＢで２回洗い、その後、Ｂ２−ＡＰ融合タンパク質を、５０ｎＭの濃度で加えた。結合を、３０分間、振盪プラットフォーム上で行なった。チューブを遠心分離して、１．４ｍｌのＢＢで一回洗った。沈殿したＡＰの量を、ｐ−ニトロフェニルホスフェート(ＰＮＰＰ)の添加及び５〜３０分のインキュベーションの後に、比色法で、４２０ｎｍにて測定した。
４）免疫沈降法
すべての溶解物を、４℃で処理した。細胞を、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ(ｐＨ７．４)、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ フッ化ナトリウム、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ オルトバナジン酸、１％(ｖ／ｖ)ＮＰ−４０、０．５％(ｗ／ｖ)デオキシコール酸ナトリウム、1ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド(新たに添加)及び１００Ｕ トラシロールを含む１ｍｌの緩衝液中で溶解させた。溶解物を、掻きとってエッペンドルフチューブに入れ、５０μｌのバイオレッド、ホルマリンで固定したスタフィロコッカス・オーレウス(San Diego在、Calbiochem製)を加えた。３０分間の混合の後に、これらの溶解物を、５分間、小型遠心分離機で、２５，０００ｇで遠心分離し、上清を、適当な抗体を含む新しいチューブに移した。溶解物を、抗体と１時間混合し、その後、５０μｌのプロテインＡ−セファロースビーズを加えて、これらのチューブの内容物を、１時間にわたって混合して、免疫沈降物を集めた。プロテインＡビーズを、２５，０００ｇで３０分間の遠心分離により集めた。これらの上清を捨てて、ビーズを１ｍｌの溶解用緩衝液(デオキシコール酸を除いたもの)で３回洗った。
５）細胞ベースのＥｐｈＢ４チロシンキナーゼアッセイ
ヒトの前立腺癌細胞株ＰＣ３細胞を、１０％透析済ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン抗生物質混合物を含むＲＰＭＩ培地中に維持した。細胞を、５％ＣＯ2／９５％空気の加湿大気中で３７℃で維持した。典型的には、細部を、６０ｍｍ皿中で、集密になるまで成長させて、ＥｐｈＢ４レセプターを活性化するためのマウスＥｐｈｒｉｎＢ２−Ｆｃ融合物(ＲＰＭＩ中の１μｇ／ｍｌ)で１０分間処理するか又は対照としての単純培地で処理した。可溶性ＥｐｈＢ４ ＥＣＤタンパク質の種々の誘導体のＥｐｈＢ４レセプターの活性化に対する効果を研究するために、細胞の３つのセットを利用した。第一のセットにおいて、細胞を、様々なタンパク質(５種類のタンパク質；ＧＣ、ＧＣＦ１、ＧＣＦ２、ＧＣＦ２−Ｆ、ＣＦ２)により、５μｇ／ｍｌで２０分間処理した。細胞の第二のセットにおいて、添加前に、タンパク質をｅｐｈｒｉｎＢ２−Ｆｃと１：５モル比(ＥｐｈＢ４タンパク質：Ｂ２−Ｆｃ)で予備混合して、２０分間インキュベートし、細胞に１０分間適用した。第三の細胞のセットにおいて、細胞を、先ず、これらのタンパク質で、２０分間、５μｇ／ｍｌで処理し、培地を、１μｇ／ｍｌのＥｐｈｒｉｎＢ２−Ｆｃを含む新鮮な培地で置き換えて、更に１０分間インキュベートした。
この刺激の後に、細胞を、直ちに、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．４)、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％(ｖ／ｖ)トリトンＸ１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭバナジン酸ナトリウムを含むタンパク質抽出用緩衝液を利用して収穫した。タンパク質抽出物を、１４，０００ｒｐｍ、２０分間の、４℃での遠心分離により清澄化した。清澄化したタンパク質試料を、一晩、抗ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体を予めコートしてあるプロテインＡ／Ｇ結合したアガロースビーズとインキュベートした。これらのＩＰ複合体を、０．１％トリトンＸ１００を含む同じ抽出用緩衝液で２回洗った。免疫沈降されたタンパク質を、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料ローディング用緩衝液中にて可溶化して、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した。ＥｐｈＢ４レセプター活性化研究のために、エレクトロブロットした膜を、抗ｐＴｙｒ特異的抗体４Ｇ１０(１：１０００希釈)を利用し、その後、プロテインＧ−ＨＲＰ結合体(１：５０００希釈)を利用してプローブ検出した。
６）細胞培養
正常ＨＵＶＥＣを、Cambrex(BioWhittaker)から得て、０．１ｍｇ／ｍｌ 内皮成長補助剤(ウシの脳の粗抽出物)、ペニシリン(５０Ｕ／ｍｌ)、ストレプトマイシン(５０Ｕ／ｍｌ)、２ｍモル／ｌ グルタミン及び０．１ｍｇ／ｍｌヘパリンナトリウムを補ったＥＢＭ２培地中に維持した。細胞のアリコートを、１〜３継代凍結保存した。すべての実験について、ＨＵＶＥＣを、４継代以下で利用して、集密の皿から集めた。
７）内皮細胞管形成アッセイ
マトリゲル(１０ｍｇ／ｍｌの６０μｌ；Collaborative Lab, Cat. No. 35423)を、氷冷９６ウェルプレートの各ウェル中に置いた。このプレートを、室温に１５分間置いてから、３７℃に３０分間インキュベートして、マトリゲルを重合させた。その間、ヒトの臍帯静脈の内皮細胞を、ＥＧＭ−２(Clonetic, Cat. No. CC3162)にて、２×１０5細胞／ｍｌの濃度で調製した。この試験タンパク質を、２×所望濃度(５濃縮レベル)で、同培地中にて調製した。細胞(５００μｌ)と２×タンパク質(５００μｌ)を混合し、２００μｌのこの懸濁液を、二連で、重合したマトリゲル上に置いた。２４時間のインキュベーション後に、各濃度につき三連の写真を、バイオクウォント・イメージ・アナリシス・システムを利用して撮った。タンパク質添加効果(ＩＣ50)を、未処理対照と比較して、形成されたコードの長さ及び接合数を測定することにより評価した。
８）細胞移動アッセイ
ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦへの化学走性を、改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバー(直径６．５ｍｍ、細孔寸法８μｍ、厚さ１０μｍのマトリゲルでコートされたポリカーボネート膜(BD Biosciences)、２４ウェルプレート中のウェル貫通膜フィルターインサート)を利用して評価した。２００μｌのＥＢＭ中のＨＵＶＥＣの細胞懸濁液(２×１０5細胞／ｍｌ)を、上部チャンバー中に播種して、可溶性ＥｐｈＢ４タンパク質を、刺激剤(ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ)と同時に、チャンバーの下部コンパートメントに加え、それらの、ポリカーボネートフィルターを、１００ｎＭ〜１μＭの試験化合物を伴う又は伴わない２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦに応答して横切る移動を研究した。４〜２４時間の３７℃でのインキュベーション後に、このフィルターの上面を、綿棒で掻きとり、フィルターを固定してDiffQuickで染色した。１０のランダムな視野(倍率２００倍)を計数して、結果を、視野当たりの平均値として表した。負の未刺激対照の値を、刺激された対照及びタンパク質処理した試料の値から減算して、データを、平均移動細胞±Ｓ.Ｄ.としてプロットした。ＩＣ50を、プロットしたデータから計算した。
９）成長阻害アッセイ
ＨＵＶＥＣ(１．５×１０3細胞)を、９６ウェルプレート中で、１００μｌのＥＢＭ−２(Clonetic, Cat. No. CC3162)中にプレートした。２４時間後(０日目)に、試験組換えタンパク質(１００μｌ)を、各ウェルに、２×所望濃度(５〜７濃縮レベル)で加えた(ＥＢＭ−２中)。０日目に、一枚のプレートを、０．５％クリスタルバイオレット(２０％メタノール中)で１０分間染色し、水ですすいで、風乾した。残りのプレートを、７２時間にわたって、３７℃に維持した。７２時間後に、プレートを、０．５％クリスタルバイオレット(２０％メタノール中)で染色し、水ですすいで、風乾した。この染色を、１：１のエタノール:０．１Ｍクエン酸ナトリウムの溶液で溶出させて(０日目のプレートを含む)、吸光度を５４０ｎｍで、ＥＬＩＳＡリーダー(Dynatech Laboratories)を用いて測定した。０日目の吸光度を、７２時間のプレートから減算して、データを、対照用増殖(ビヒクルで処理した細胞)のパーセンテージとしてプロットする。ＩＣ50値を、プロットしたデータから計算した。
１０）マウスマトリゲルプラグ血管形成アッセイ
イン・ビボの血管形成を、マウスにおいて、皮下組織から、試験試料を含むマトリゲルプラグ内への血管の成長としてアッセイした。マトリゲルは、因子を捕捉して、ゆっくりした放出及び周囲の組織への延長された曝露を可能にする固体ゲルを、身体温度で急速に形成する。４℃で液体形態のマトリゲル(８．１３ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｌ)を、内皮細胞成長補助剤(ＥＣＧＳ)、試験タンパク質＋ＥＣＧＳ又はマトリゲル＋ビヒクル単独(０．２５％ＢＳＡを含むＰＢＳ)と混合した。マトリゲル(０．５ｍｌ)を、雌のｎｕ／ｎｕマウス(６週齢)の腹部皮下組織に、正中線に沿って注射した。各群には、３匹のマウスがいた。これらの動物を、施設の及びＮＩＨのガイドラインに従って世話した。６日目に、マウスを犠牲にして、プラグを回収し、組織学のために処理した。典型的には、上に重なる皮膚を取り除き、支持のための腹腔の裏打ちを保持することによりゲルを切り出して、ＰＢＳ中の１０％の緩衝されたホルマリンで固定して、パラフィン中に包埋した。３μｍの切片を切って、Ｈ＆Ｅ又はマッソン三色染色法で染色して、光学顕微鏡下で調べた。
１１）マウス角膜マイクロポケットアッセイ
マウスの角膜のマイクロポケットアッセイを、Kenyon等、1996により詳述されたものに従って行なった。簡単にいえば、９０ｎｇのｂＦＧＦ(R&D)又は１８０ｎｇのＶＥＧＦ(R&D Systems, 米国、ミネソタ、Minneapolis在)及び４０μｇのシュークロースアルミニウムサルフェート(Sigma)を含むハイドロンペレット(ポリヒドロキシエチルメタクリレート[ポリＨＥＭＡ]、Interferon Sciences, New Brunswick, 米国、ニュージャージー)を製造した。手術用顕微鏡を利用して、間質線状角膜切開術を外科用ナイフ(Bard-Parker no.15)を用いて、外側腹直筋の挿入と並行して麻酔した動物において行なった。基質内マイクロポケットを、改変したvon Graefeナイフ(２”３０ｍｍ)を用いて切開した。単一ペレットを、移植して、角膜の縁へ向かって進ませた(ｂＦＧＦペレットにつき０±７±１±０ｍｍ、ＶＥＧＦペレットにつき０±５ｍｍ)。各成長因子についてのペレット位置の差異は、このモデルにおけるＶＥＧＦの比較的弱い血管形成刺激を仮定すると、必要であると決定された。次いで、抗生物質軟膏(エリスロマイシン)を、手術した眼に加えて、感染を防止し且つ表面の不規則を減少させた。その後の血管応答を、肢の血管系からペレットに向かって広がるのを測定して、新血管新生データの連続的周囲域及び提示した臨床写真をペレット移植の６日目に得たが、その日は、最大血管形成応答の日であることが見出された。
１２）イン・ビトロ浸潤アッセイ
「マトリゲル」マトリクスで被覆された９ｍｍの細胞培養インサート(細孔寸法８μｍ；Becton Dickinson, ニュージャージー、Franklin Lakes在)を、２４ウェルプレート中にセットした。ＨＵＶＥＣ細胞を、５×１０3細胞／ウェルの密度で、培養インサートの上層に播種して、無血清ＥＢＭで、ＥｐｈＢ４ ＥＣＤの存在下で２４時間培養した。対照群を同じ培地でＥｐｈＢ４を含まずに培養した。その後、０．５ｍｌのヒトＳＣＣ１５細胞株調整培地をこの培養インサートの下層に化学誘因剤として充填した。これらの細胞を、２４時間にわたってインキュベートしてから、上層の残りの細胞を、綿棒でかき出し、下層の貫通した細胞を５％グルタルアルデヒドで固定してDiffQuickで染色した。マトリゲルマトリクス及び培養インサートの各８μｍの細孔を通過した細胞の総数を、光学顕微鏡観察を利用して計数して、浸潤インデックス(細胞数／領域)として示した。
１３）マウスにおけるＳＣＣ１５腫瘍の成長
対数増殖期のＳＣＣ１５頭頚部扁平上皮細胞癌細胞株(５×１０6細胞密度)を；ＥｐｈＢ４ ＥＣＤを伴って又は伴わないで、ヒトｂＦＧＦの存在下又は非存在下で、無胸腺のＢａｌｂ／ｃマウスに、マトリゲル(BD Bioscience)合成基底膜(１：１ ｖ／ｖ)と共に、皮下注射して、２週間以内に腫瘍を検査する。ＥｐｈＢ４ ＥＣＤ群における腫瘍容積は、移植後に、成長因子の存在下又は非存在下で、ビヒクル群のものより３倍小さかった。これらの群の間で、体重に差異はなかった。切除した腫瘍の切片の免疫組織化学的試験及びＴＵＮＥＬ陽性アポトーシス又はネクローシス、ＣＤ３４免疫染色、及びＢｒｄＵ増殖速度を、パラフィン除去、再水和及び内因性ペルオキシダーゼ活性の消滅後、及びプロテイナーゼＫによる１０分間の易透化の後に行なう。血管密度の定量的評価も又、行なう。ＥｐｈＢ４ ＥＣＤの局所的腫瘍内送達又はＩＶ送達も又、週に２回行なう。
３０匹の無胸腺のヌードマウス、ＢＡＬＢ／ｃ(ｎｕ／ｎｕ)の各々に、０．１ｍｌマトリゲルと混ぜた０．１ｍｌ ＰＢＳと共に１×１０6のＢ１６メラノーマ細胞を注射し、又は２００μｌのＤＭＥＭ無血清培地に懸濁させた１．５×１０6のＳＣＣ１５細胞を注射し、０日目に、マウスの右肩領域の皮下に注射した。タンパク質を、静脈注射し又は皮下注射した(腫瘍の周囲で)。該注射を、１日目にローディング投与量４μｇ／ｍｌで、週に２μｇ／ｍｇの注射(１０μｇ／ｇ、５０μｇ／ｋｇ／日)で、接種の２週間後に開始した。マウスを、１４日目に犠牲にする。対照用マウスは、毎日、５０μｌのＰＢＳを受けた。
１４）ヌードマウスにおける腫瘍形成
すべての動物を、施設の動物保護委員会により承認されたプロトコールにて処理した。癌細胞(５×１０6)を、ヌードマウスの背中の皮下に接種した。腫瘍が約１００ｍｍ3の寸法まで成長したとき(通常、１２日を要する)、ｓＥｐｈＢ４を、一日一回、腹腔内又は皮下に注射し、腫瘍形成を２週間にわたってモニターした。腫瘍容積を、式ａ2ｘｂ(式中、ａ及びｂは、それぞれ、最小及び最大直径である)に従って計算した。スチューデントのｔ検定を利用して、腫瘍容積を比較した(Ｐ＜０．５を有意とみなした)。
１５）微細血管密度の定量
腫瘍を、４％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、５μｍに切片化して、ヘマトキシリンエオシンで染色した。血管密度を、コンピューターベースのイメージアナライザーを利用して、半定量した(各群の３匹のマウスからの切片当たり５視野)。
実施例３．ＥｐｈＢ４は、前立腺癌において、アップレギュレートされて成長に有利な条件を付与する
Ａ．ＥｐｈＢ４の前立腺癌細胞株における発現
我々は、先ず、様々な前立腺癌細胞株におけるＥｐｈＢ４タンパク質の発現をウエスタンブロットにより試験した。我々は、前立腺癌細胞株が、１２０ｋＤのＥｐｈＢ４の豊富さにおいて顕著な変動を示すことを見出した。これらのレベルは、ＰＣ３において比較的高く、ＰＣ３Ｍ(ＰＣ３の転移性クローン)において一層高くさえあったが、正常な前立腺由来の細胞株(ＭＬＣ)は、ＥｐｈＢ４の低い発現を示し又は発現を示さなかった(図２７Ａ)。我々は、次に、ＰＣ３細胞におけるＥｐｈＢ４の活性化状態を、リン酸化研究により調べた。我々は、正常培養条件下でさえ、ＥｐｈＢ４が、そのリガンドｅｐｈｒｉｎＢ２によって更に誘導されえても、リン酸化されることを見出した(図２７Ｂ)。
Ｂ．ＥｐｈＢ４の臨床的前立腺癌試料における発現
ＥｐｈＢ４が臨床的前立腺試料において発現されるかどうかを測定するために、前立腺癌の外科手術による標本からの腫瘍組織と隣接正常組織を試験した。これらの前立腺標本中のＥｐｈＢ４の組織学的分布を、免疫組織化学により測定した。明らかに、ＥｐｈＢ４発現は、新生上皮に限られており(図２８、左上)、間質及び正常前立腺上皮には存在しない(図２８、右上)。前立腺組織の配列において、検査した３２の前立腺癌の内の２４が、陽性であった。我々は、ＥｐｈＢ４ｍＲＮＡが、臨床試料の正常及び腫瘍組織の両方で発現されることを、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって見出した。しかしながら、腫瘍のＥｐｈＢ４ｍＲＮＡレベルは、この例において、少なくとも正常の３倍高かった(図２８、右下)。
Ｃ．ｐ５３及びＰＴＥＮは、ＰＣ３細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を阻害した
ＰＣ３細胞は、ＰＴＥＮ発現を欠くこと(Davis等、1994, Science. 266:816-819)及び野生型ｐ５３機能を欠くこと(Gale等、1997, Cell Tissue Res. 290:227-241)が知られている。我々は、ＥｐｈＢ４の比較的高い発現がｐ５３及び／又はＰＴＥＮと関係するかどうかを、野生型ｐ５３及び／又はＰＴＥＮをＰＣ３細胞に再導入することによって研究した。トランスフェクション効率及び希釈効果を補正するために、トランスフェクトされた細胞を、同時トランスフェクトした切り詰められたＣＤ４マーカーにつきソートした。我々は、ＰＣ３細胞におけるＥｐｈＢ４の発現が、野生型ｐ５３又はＰＴＥＮの再導入によって減少することを見出した。ｐ５３とＰＴＥＮの同時トランスフェクションは、ＥｐｈＢ４の発現を更に阻害することはなかった(図２９Ａ)。
Ｄ．レチノイドＸレセプター(ＲＸＲα)は、ＥｐｈＢ４の発現を調節する
我々は、以前に、前立腺癌細胞株において、ＲＸＲαがダウンレギュレートされることを見出した(Zhong等、2003, Cancer Biol Ther. 2:179-184)が、我々は、ここに、「正常な」前立腺(ＭＬＣ)、前立腺癌(ＰＣ３)、及び転移性前立腺癌(ＰＣ３Ｍ)を見た場合に、ＥｐｈＢ４発現が、逆発現パターンを有することを見出した(図２７Ａ)。我々は、ＲＸＲαがＥｐｈＢ４の発現を調節するかどうかを考えた。この関係を確認するために、ＥｐｈＢ４の発現を、ＣＷＲ２２ＲとＣＷＲ２２Ｒ−ＲＸＲα(ＲＸＲαを構成的に発現する)との間で比較した。我々は、ＲＸＲα過剰発現細胞株においてＥｐｈＢ４発現の控え目の減少を見出したが、ＦＧＦ８は、ＥｐｈＢ４発現に何の効果も有しない。初期の結果と一致して、ＥｐｈＢ４は、「正常な」良性前立腺肥大細胞株ＢＰＨ−１においては、見出されなかった(図２９Ｂ)。
Ｅ．ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒの成長因子シグナリング経路は、ＥｐｈＢ４発現を調節する
ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒは、共に、ＰＣ３細胞成長に対してオートクリン及びパラクリン作用を有することが示されている。我々は、ＥｐｈＢ４発現が一層侵略的な細胞株において一層高いということを見出したので、ＥｐｈＢ４発現が、これらのプロ生存成長因子と相関しうるということを仮定した。我々は、この関係を、ＥＧＦＲ及びＩＧＦ−１Ｒシグナリングを独立にブロックすることによって試験した。ＥｐｈＢ４は、ＥＧＦＲシグナリングをＥＧＦＲキナーゼインヒビターＡＧ１４７８を利用してブロックした後に(図３０Ａ)又は、ＩＧＦ−１Ｒ中和抗体を利用してＩＧＦ−１Ｒシグナリング経路を遮断した後に(図３０Ｂ)、ダウンレギュレートされた。
Ｆ．ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスＯＤＮは、ＰＣ３細胞の生存力を阻害する
我々の前立腺癌モデルにおけるこのＥｐｈＢ４の過剰発現の意義を規定するために、我々は、ＥｐｈＢ４の比較的高い発現を有するＰＣ３細胞に研究を集中した。ＥｐｈＢ４発現を減少させるための２つのアプローチは、ｓｉＲＮＡ及びＡＳ−ＯＤＮであった。多くのＥｐｈＢ４コード領域の異なるセグメントに相補的な種々のホスホロチオエート改変されたＡＳ−ＯＤＮを、ＥｐｈＢ４阻害の特異性及び効力につき試験した。完全長のＥｐｈＢ４発現ベクターＡＳ−１０で一時的にトランスフェクトした２９３細胞を利用することは、最も効果的であることが見出された(図３１Ｂ)。類似のアプローチを、特異的ｓｉＲＮＡの選択に適用した。ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ ４７２は、効果的に、ＥｐｈＢ４タンパク質発現をノックダウンした(図３１Ａ)。ｓｉＲＮＡ４７２及びアンチセンスＡＳ−１０ＯＤＮは、共に、ＰＣ３細胞の生存力を、投与量依存様式で減少させた(図３１Ｃ、Ｄ)。無関係のｓｉＲＮＡ又はセンスオリゴヌクレオチドは、生存力に何の効果も有しなかった。
Ｇ．ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスＯＤＮは、ＰＣ３細胞の移動性を阻害する
ＰＣ３細胞は、マウスに同所注射した場合、局所的に侵略的に成長して、リンパ節転移を形成することができる。ＰＣ３細胞のイン・ビトロの移動に対するＥｐｈＢ４の役割を研究する努力において、我々は、創傷治癒アッセイを行なった。ＰＣ３細胞の単層に傷を導入した場合、次の２０時間の経過において、細胞は、透明領域に移動した。しかしながら、細胞をｓｉＲＮＡ４７２でトランスフェクトして傷を導入した場合には、この移動は、有意に阻害された(図３１Ｅ)。ＰＣ３細胞の、１０μＭ ＥｐｈＢ４ ＡＳ−１０による１２時間の予備処理は、同じ効果を生じた(図３１Ｆ)。加えて、ＰＣ３細胞におけるＥｐｈＢ４発現のｓｉＲＮＡ４７２によるノックダウンは、二重チャンバー侵襲アッセイにより評価して、これらの細胞の、マトリゲルに浸潤する能力を、対照用ｓｉＲＮＡと比較して多いに減じた(図３１Ｇ)。
Ｈ．ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡは、細胞周期の停止及びアポトーシスをＰＣ３細胞において誘導する
ＥｐｈＢ４のノックダウンは、減少した細胞生存力を生じた(図３１Ｃ)ので、我々は、これが、細胞周期に対する効果のためであるのかどうかを決定することを探求した。対照用ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞と比較して、ｓｉＲＮＡ４７２は、サブＧ０及びＳ期フラクションの細胞の蓄積を生じた。このサブＧ０フラクションは、対照用ｓｉＲＮＡ処理した細胞と比較して、ｓｉＲＮＡ４７２処理した細胞において、１％〜７．９％増加し、Ｓ期フラクションは、１４．９〜２０．８％増加した(図３２Ａ)。細胞周期のサブＧ０及びＧ２での停止は、アポトーシスを示している。ＥｐｈＢ４ノックダウンの結果としてのアポトーシスは、ＥＬＩＳＡアッセイにより確認された。アポトーシスの投与量依存性の増加が、ＰＣ３細胞をｓｉＲＮＡ４７２でトランスフェクトした場合に認められたが、対照用ｓｉＲＮＡでは認められなかった(図３２Ｂ)。１００ｎＭでは、ｓｉＲＮＡ４７２でのトランスフェクトにおいて、対照用ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＰＣ３細胞の１５倍のアポトーシスがあった。
Ｉ．材料及び方法
１）試薬
中和用ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、R&D Systems(ミネソタ、Minneapolis在)から得た。抗ＩＧＦ−１Ｒ(β)、抗ＥＧＦＲ、抗ＥｐｈＢ４(Ｃ−１６)は、Santa Cruz Biotech(カリフォルニア、Santa Cruz在)から得た。β−アクチンモノクローナル抗体は、Sigma Chemicals Co.(ミズーリ、St Louis在)から購入した。培地及びウシ胎児血清(ＦＢＳ)は、Invitrogen(カリフォルニア、Carlsbad在)から得た。ＡＧ１４７８(４−(３’−クロロアニリノ)−６，７−ジメトキシ−キナゾリン)は、Calbiochem(カリフォルニア、San Diego在)から得た。
２）アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド及びＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ
ＥｐｈＢ４特異的アンチセンスホスホロチオエート改変オリゴデオキシヌクレオチド(ＯＤＮ)及びセンスＯＤＮを合成して、Qiagen(カリフォルニア、Alameda在)により精製した。これらの配列は：センス、5'-TCC-TGC-AAG-GAG-ACC-TTC-AC-3'；ＡＳ１：5'-GTG-CAG-GGA-TAG-CAG-GGC-CAT-3'；ＡＳ１０：5'-ATG-GAG-GCC-TCG-CTC-AGA-AA-3'である。ｓｉＲＮＡを、USC/Norris Comprehensive Cancer Center Microchemical Core laboratoryにて合成した。ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡの配列は、ｓｉＲＮＡ４７２ 5'-GGU-GAA-UGU-CAA-GAC-GCU-GUU-3'及びｓｉＲＮＡ ２３０３ 5'-cuc-uuc-cga-ucc-cac-cua-cuu-3'である。ごたまぜのＧＡＰＤＨに対する負の対照用ｓｉＲＮＡは、Ambion(テキサス、Austin在)から得た。
３）細胞株及び培養物
前立腺癌細胞株、ＰＣ３、ＰＣ３Ｍ、ＤＵ１４５、ＡＬＶＡ３１、ＬＡＰＣ−４、ＬＮＣａＰ、ＣＷＲ２２Ｒ及び成人ヒト正常前立腺上皮細胞株ＭＬＣ ＳＶ４０、及びＢＰＨ−１を前記(７)のように得て培養した。安定な細胞株ＣＷＲ２２Ｒ−ＲＸＲ、ＬＮＣａＰ−ＦＧＦ８が樹立され、前記のように培養した(７、３３)。
４）ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体の生成
ＥｐｈＢ４の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１中にクローン化して、ＧＳＴ融合ＥＣＤ(ＧＳＴ−ＥＣＤ)を生成した。ＢＬ２１大腸菌内にＧＳＴ融合タンパク質として発現されたＥｐｈＢ４ＥＣＤを、アフィニティークロマトグラフィーにより精製して、ＧＳＴドメインをトロンビンにより開裂させた。モノクローナル抗体を生成して、そのモノクローナル抗体の感度及び特異性を、ＥｐｈＢ４で安定にトランスフェクトされた２９３細胞の全細胞溶解物を用いるウエスタンブロットにより再確認した。
５）一ステップＲＴ−ＰＣＲ及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０(Tel-Test, Inc.製、テキサス、Friendswood在)を利用して、前立腺癌標本及び隣接する正常標本から抽出した。定量的ＲＴ−ＰＣＲのために、第一鎖ｃＤＮＡを、５μｇの全ＲＮＡからSuperScriptIII(Invitrogen, カリフォルニア、Carlsbad在)を利用して合成した。定量的ＲＴ−ＰＣＲを、Stratagene MX3000P Systm(Stratagene, カリフォルニア、La Jolla在)にて、ＳＹＢＲ グリーンＩブリリアントマスターミックス(Stratagene)を製造業者の指示に従って利用して行なった。ＥｐｈＢ４及びβ−アクチン(標準化遺伝子として利用)についての最適化反応物は、各１５０ｎＭのフォワードプライマー(β−アクチン、5'-GGA-CCT-GAC-TGA-CTA-CCT-A-3'；ＥｐｈＢ４、5'-AAG-GAG-ACC-TTC-ACC-GTC-TT-3')及びリバースプライマー(β−アクチン、5'-TTG-AAG-GTA-GTT-TCG-TGG-AT-3'；5'-TCG-AGT-CAG-GTT-CAC-AGT-CA-3')であり、９５℃で１０分間のＤＮＡポリメラーゼの変性／活性化後に、９５℃で３０分、６０℃で１分、７２℃で１分を４０サイクル行なった。遺伝子特異的増幅の特異性を、単一の分離ピークの存在により確認した。すべての反応を、三連で、ＲＴを利用して及び負の対照用テンプレートを用いずに行なった。
６）免疫組織化学
ＯＣＴ包埋組織を、５μｍに切片化して、リン酸緩衝した４％パラホルムアルデヒド中で固定した。切片を３×５分間ＰＢＳ中で洗って、内因性ペルオキシダーゼを、ＰＢＳ中の０．３％Ｈ2Ｏ2中での室温で１０分間のインキュベーションによってブロックした。切片を、Ｅｐｈ４(Ｃ−１６)抗体(１：５０)と１時間室温でインキュベートしてから、ＰＢＳ中で３回洗って、ロバの抗ヤギ二次抗体(Santa Cruz Biotech.)と１時間室温でインキュベートした。ＰＢＳ中で３回洗った後に、ペルオキシダーゼ活性は、ＤＡＢ基質溶液(Vector Laboratory, Inc. カリフォルニア、Burlingame在)中での室温で１０分間のインキュベーションにより局在化された。切片を、ヘマトキシリンで２０秒間対比染色し、脱水して、マウントした。染色の負の対照は、一次抗体についての正常ヤギ血清の代用であった。前立腺配列に対する免疫組織化学染色(BioMeda, カリフォルニア、Foster City在)を、ヤギＡＢＣ染色システム(Santa Cruz Biotech.)を製造業者の指示に従って利用して行なった。
７）ウエスタンブロット
全細胞溶解物を、別途指示しない限り、前立腺インヒビターカクテル(Pierce, イリノイ、Rockford在)を補ったセル・リシス・バッファー(GeneHunter, テネシー、Basgvukke在)を利用して調製した。全タンパク質を、ＤＣ試薬システム(Bio-Rad, カリフォルニア、Hercules在)を利用して測定した。典型的には、２０μｇの全細胞溶解物を、４〜２０％のトリス−グリシン勾配ゲル上で流した。これらの試料を、ＰＶＤＦ膜にエレクトロトランスファーして、非特異的結合を、５％脱脂乳を含むＴＢＳＴ緩衝液(０．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、４５ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン−２０、ｐＨ７．４)中でブロックした。膜を、先ず、一次抗体で一晩プローブ検出し、リストア(商標)ウエスタンブロットストリッピングバッファー(Pierce, イリノイ、Rockford在)を用いて細片化して、β−アクチンで再プローブ検出して、タンパク質の等量のローディング及びトランスファーを確認した。シグナルを、スーパーシグナルウエストフェムトマキシマムセンシティビティーサブストレート(Pierce)を利用して検出した。
８）リン酸化分析
６０ｍｍ皿で成長中の細胞を、血清飢餓にし(１％ＦＢＳを補ったＲＰＭＩ１６４０、２４時間)又は正常条件下(１０％ＦＢＳ)にて培養してから、１μｇ／ｍｌのマウスＥｐｈｒｉｎＢ２／Ｆｃを伴って又は伴わないで１０分間処理して、ＥｐｈＢ４レセプターを活性化した。透明化した細胞溶解物を、ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体と一晩４℃でインキュベートした。抗原−抗体複合体を、１００μｌのプロテインＧ−セファロース(２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中)の添加及び４℃で一晩のインキュベーションによって免疫沈降させた。免疫沈降物を、ｐＴｙｒ特異的抗体(Upstate, クローン４Ｇ１０)を１：１０００の希釈で利用し、その後、プロテインＧ−ＨＲＰ(Bio-Rad)と１：５０００希釈でインキュベートするウエスタンブロットにより分析した。免疫沈降効率をモニターするために、二連の膜を、ＥｐｈＢ４特異的モノクローナル抗体でプローブ検出した。
９）一時的トランスフェクション及びトランスフェクトされた細胞のソーティング
ＰＣ３細胞を、ＣＤ４及び野生型ｐ５３(ｐＣ５３−ＳＮ３)又はＰＴＥＮベクター又は両方をコードするｐＭＡＣＳ４．１で、リポフェクタミン２０００(Invitrogen)を製造業者の指示に従って利用して同時トランスフェクトした。ＣＤ４のｐ５３又はＰＴＥＮ又はベクターに対するモル比は、１：３であり、全プラスミドは、９０％集密の１０ｃｍ2皿に対して２４μｇであった(６０μｇのリポフェクタミン２０００使用)。トランスフェクションの２４時間後に、単一細胞懸濁を生成して、製造業者のプロトコール(Miltenyi Biotec, ドイツ国)に従って切り詰めたＣＤ４を表面マーカーとして利用してソートした。貯蔵した細胞を、１×ＳＤＳサンプリング用緩衝液中で溶解させて、ウエスタンブロットにより分析した。
１０）ＥｐｈＢ４の発現におけるＩＧＦ及びＥＧＦシグナリング経路の研究
ＰＣ３細胞を６ウェルプレートに播種し、８０％集密になるまで培養して、２μｇ／ｍｌの中和ＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体ＭＡＢ３９１(Hailey等、2002, Mol Cancer Ther. 1:1349-1353)又は１ｎＭ ＡＧ１４７８、強力なＥＧＦＲインヒビター(Liu等、1999, J Cell Sci. 112(Pt 14):2409-2417)で２４時間処理した。粗細胞溶解物を、ウエスタンブロットにより分析した。バンド密度を、Bio-Rad QuantityOne System ソフトウェアを用いて定量した。
１１）細胞生存力アッセイ
ＰＣ３細胞を、４８ウェルプレートに、約１×１０4細胞／ウェルの密度で播種した(総容積２００ｍｌ)。培地を、細胞が付着した後に交換して、それらの細胞を様々な濃度(１〜１０μＭ)のＥｐｈＢ４アンチセンスＯＤＮ又はセンスＯＤＮ(対照)で処理した。３日後に、培地を換えて、新鮮なＯＤＮを加えた。更なる４８時間のインキュベーション後に、細胞生存力を、ＭＴＴにより前に記載されたように(３６)評価した。ＥｐｈＢ４ｓｉＲＮＡ(１０〜１００ｎＭ)を、２×１０4ＰＣ３細胞／ウェル(４８ウェルプレート)に、２μｌのリポフェクタミン(商標)２０００を利用して製造業者の指示に従って導入した。トランスフェクションの４時間後に、これらの細胞を、成長培地(１０％ＦＢＳを補ったＲＰＭＩ１６４０)に戻した。生存力を、トランスフェクションの４８時間後に、ＭＴＴにより評価した。
１２）創傷治癒移動アッセイ
ＰＣ３細胞を、６ウェルプレートに播種して、集密になるまで培養した。１０μＭのＡＳ−１０又はセンスＯＤＮ(対照)を、これらのウェルに、生存力アッセイについて記載されたように、単層に無菌のピペットチップで引っ掻くことにより傷を付ける１２時間前に導入した。培地を、５％ＦＢＳ及び新鮮なＯＤＮを補ったＲＰＭＩ１６４０に交換した。創傷の１２時間前に５０ｎＭ ｓｉＲＮＡ４７２又はＧＡＰＤＨ陰性対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした集密培養物も又、検査した。治癒過程を、動的に調べて、顕微鏡アダプターを付けたNikon Coolpix 5000デジタルカメラを用いて記録した。
１３）浸潤アッセイ
ＰＣ３細胞を、リポフェクタミン(商標)２０００を利用して、ｓｉＲＮＡ４７２又は対照用ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、６時間後に、０．５×１０５細胞を８μｍマトリゲル予備被覆したインサート(BD Bioscience, カリフォルニア、Palo Alto在)にトランスフェクトした。これらのインサートを、５％ＦＢＳ及び５μｇ／ｍｌフィブロネクチンを補った(化学走性誘因剤として)ＲＰＭＩを含むコンパニオンウェル中に置いた。２２時間のインキュベーション後に、これらのインサートを取り出して、上面上の非浸潤性細胞を綿棒でかき出すことにより除去した。この膜の下面上の細胞を、１００％メタノール中で１５分間固定し、風乾して、２分間のギムザ染色により染色した。これらの細胞を、５つの別個の強力な分野において、光学顕微鏡下で計数した。アッセイを、各処理群につき、三連で、行なった。
１４）細胞周期分析
ＰＣ３細胞の６ウェルプレート中での８０％集密培養物を、ｓｉＲＮＡ４７２(１００ｎＭ)で、リポフェクタミン(商標)２０００を利用して処理した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を、トリプシン処理して、ＰＢＳ中で洗い、そして１時間にわたって、５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム、０．１％クエン酸ナトリウム、０．１トリトンＸ−１００及び２０μｇ／ｍｌのＤｎａｓｅを含まないＲｎａｓｅＡを含む１ｍｌの低張溶液中で４℃でインキュベートした。細胞を、ＵＳＣフローサイトメトリーファシリティーにて線形モードで分析した。結果を、細胞周期の異なる位相即ちサブＧ０ピーク(アポトーシス)、Ｇ０／Ｇ１(ＤＮＡ合成なし)、Ｓ(活性なＤＮＡ合成)、Ｇ２(予備有糸分裂)及びＭ(有糸分裂)で検出されたエレメントのパーセンテージとして示した。
１５）アポトーシスＥＬＩＳＡ
アポトーシスを、細胞死検出用ＥＬＩＳＡプラスキット(Roche, ニュージャージー、Piscataway在)を製造業者の指示に従って利用して研究した。簡単にいえば、２４ウェルプレート中のＰＣ３の８０％集密培養物を、リポフェクタミン(商標)２０００を利用して、様々な濃度(０〜１００ｎＭ)のｓｉＲＮＡ４７２又は１００ｎＭの対照用ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。１６時間後に、細胞を剥離させて、１×１０4細胞を、２００μｌ溶解用緩衝液中でインキュベートした。核を遠心分離によりペレット化して、モノ又はオリゴヌクレオソームを含む２０μｌの上清をＥＬＩＳＡ分析用に採取した。簡単にいえば、その上清を、抗ヒストン−ビオチン及び抗ＤＮＡ−ＰＯＤと、ストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート中で２時間室温でインキュベートした。その色を、ＡＢＳＴで発色させて、４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Devices, カリフォルニア、Sunnyvale在)にて読んだ。
実施例４．治療のための候補の標的の中皮腫におけるＥＰＨＢ４の発現
悪性中皮腫(ＭＭ)は、最もしばしば胸膜及び腹膜腔の漿液性表面から生じる稀な新生物である。胸膜腔は、最も頻繁に冒される部位(＞９０％)であり、次が腹膜(６〜１０％)である(Carbone等、2002, Semin Oncol. 29:2-17)。アスベスト曝露との強い関連があり、悪性中皮腫症例の約８０％は、アスベストを摂取又は吸引した個人に起きている。この腫瘍は、特に、現在の治療に耐性であり、今日まで、これらの患者の予後は、劇的に悪い(Lee等、2000, Curr Opin Pulm Med. 6:267-74)。
悪性中皮腫の診断及び治療に関する幾つかの臨床的問題は、未解決のままである。胸膜液又は腹水から中皮腫の診断を行なうことが困難なことはよく知られており、しばしば、胸腔鏡検査又は直視下生検及びある種のマーカー例えばこの腫瘍で優先的に発現されるメオステリンについての免疫組織化学的染色を必要とする。現在まで、攻撃的な化学療法的養生法及び長期の放射線療法にもかかわらず、治癒力のあることが分かった介入はない。殆どの症例において、生存中央値は、診断後、１２〜１８ヵ月である。
今や新規な診断及び治療アプローチで利用するための診断マーカー及び標的を同定するために、我々は、ＥＰＨＢ４及びそのリガンドのＥｐｈｒｉｎＢ２の中皮腫細胞株及び臨床的試料における発現を評価した。
Ａ．ＥＰＨＢ４及びＥｐｈｒｉｎＢ２は、中皮腫細胞株において発現される
悪性中皮腫細胞株におけるＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４の発現は、様々な方法によて、ＲＮＡ及びタンパク質レベルで測定された。ＲＴ−ＰＣＲは、４つの細胞株のすべてがＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥＰＨＢ４を発現することを示した(図３３Ａ)。これらの細胞株において、タンパク質発現を、ウエスタンブロットにより測定した。ＥｐｈＢ４の特異的バンドが、１２０ｋＤで見られた。加えて、ＥｐｈｒｉｎＢ２は、試験したすべての細胞株において、３７ｋＤのバンドとしてウエスタンブロットにおいて検出された(図３３Ｂ)。ＥｐｈｒｉｎＢ２についての特異的バンドは、２９３ヒト胎児腎臓細胞において認められなかった(負の対照として含まれる)。
中皮腫細胞におけるＥｐｈＢ４の転写の存在を確認するために、イン・シトゥーハイブリダイゼーションを、チャンバースライド上で培養したＮＣＩ Ｈ２８細胞株において行なった。ＥｐｈＢ４についての特異的シグナルを、アンチセンスプローブＥｐｈｒｉｎＢ２転写物を利用して検出した(該転写物は、同細胞株においても検出された)。ＥｐｈＢ４及びＥｐｈｒｉｎＢ２の両方に対するセンスプローブは、負の対照として役立ったが、それらの細胞にハイブリダイズしなかった(図３４)。ＥｐｈＢ４及びＥｐｈｒｉｎＢ２タンパク質の発現は、細胞株において、免疫蛍光分析により確認された(図３５)。３つの細胞株は、ＥｐｈＢ４の強い発現を示したが、ＥｐｈｒｉｎＢ２の発現は、Ｈ２８及びＨ２０５２に存在し、Ｈ２３７３においては弱く検出可能であった。
Ｂ．ＥＰＨＢ４及びＥｐｈｒｉｎＢ２の臨床試料における発現の証拠
胸膜の悪性中皮腫と診断された患者の胸膜滲出液から培養された腫瘍細胞を単離して、ＥｐｈＢ４及びＥｐｈｒｉｎＢ２の両者(１回継代)の陽性染色を示した(図３５、下段)。これらの結果は、ＥｐｈＢ４及びＥｐｈｒｉｎＢ２の中皮腫細胞株における同時発現を確認する。腫瘍細胞株において見られたこれらの結果が この病気状態における発現の真の反映であるかどうかを決定するために、腫瘍生検試料を、ＥｐｈＢ４及びＥｐｈｒｉｎＢ２についての免疫組織化学的染色にかけた。両タンパク質に対する抗体は、これらの腫瘍細胞において陽性染色を示した。代表的データを、図３６に示す。
Ｃ．ＥＰＨＢ４は、細胞の成長及び中皮腫の移動に関与する
細胞増殖におけるＥｐｈＢ４の役割を、ＥＰＨＢ４特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡを利用して試験した。培養Ｈ２８のＥＰＨＢ４アンチセンスでの処理は、細胞の生存力を減じた。ＥｐｈＢ４発現の最も活性なインヒビターの一つは、ＥＰＨＢ４ＡＳ−１０である(図３７Ａ)。ＥＰＨＢ４ｓｉＲＮＡ４７２のトランスフェクションは、同じ効果を生じた(図３７Ｂ)。
ＭＭは、局所的に進行する病気であって、頻繁に隣接する生体構造例えば胸壁、心臓及び食道へ拡大及び成長する。イン・ビトロでこの過程を研究する努力において、我々は、前述の技術(３：３６)を利用して、創傷治癒アッセイを行なった。準集密のＨ２８細胞に傷を導入した場合、次の２８時間の過程において、細胞は、該傷領域に進行的に移動する。しかしながら、細胞をＥＰＨＢ４ＡＳ−１０で２４時間にわたって予備処理して、傷を導入した場合には、この移動は、事実上完全に防止された(図３８Ａ)。このBoydenチャンバーアッセイとＥＰＨＢ４ｓｉＲＮＡを用いた移動研究は、細胞移動が、ＥＰＨＢ４発現の阻害によって多いに阻害されることを示した(図３８Ｂ)。
Ｄ．材料及び方法
１）細胞株及び試薬
ＮＣＩ Ｈ２８、ＮＣＩ Ｈ２０５２、ＮＣＩ Ｈ２３７３、ＭＳＴＯ ２１１Ｈ中皮腫細胞株及び２９３ヒト胎児腎臓細胞を、ＡＴＣＣ(バージニア、Manassas在)から得た。細胞を、１０％の心臓不活性化ウシ胎児血清(ＦＢＳ；Life Technologies, メリーランド、Gaithersburg在)及び抗体を補ったＲＰＭＩ１６４０中に維持した。一次細胞を、中皮腫の患者の胸膜浸出液から得た。多数のＥＰＨＢ４ホスホロチオエート改変アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。同様に、多くのＥｐｈＢ４特異的なｓｉＲＮＡを生成させた。ＥＰＨＢ４に対して生成されたモノクローナル抗体を、ウエスタンブロットに利用した。ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥＰＨＢ４に対するポリクローナル抗体(Ｃ−１６)(免疫組織化学的染色用)を、Santa Cruzから得た。
２）ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ランダムヘキサマー(Invitrogen)を利用することにより、逆転写した。ＥｐｈＢ４及びＥｐｈｒｉｎＢ２のためのプライマーを、プライマー３ソフトウェアを用いてデザインした。すべてのプライマーの配列は、次の通りである：ＥＰＨＢ４フォワードプライマー及びＥＰＨＢ４リバースプライマー(例えば、実施例２参照)；ＥｐｈｒｉｎＢ２フォワードプライマー及びＥｐｈｒｉｎＢ２リバースプライマー(例えば、実施例６参照)；Ｇ３ＰＤＨフォワードプライマー、5'-GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3'；Ｇ３ＰＤＨリバースプライマー、5'-GGCATTGCTGCAAAGAAAGAG-3'；CloneticsキットをＰＣＲのために利用した。ＰＣＲを、ＡＢＩ ＰＣＲシステム２７００(Applied Biosystem)を用いて行なった。これらのＰＣＲ条件は、９５℃で５分間とその後の、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で１分間の３５サイクルであった。
３）ジゴキシゲニン標識したＲＮＡプローブの調製
ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４ ＰＣＲ生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙシステム(Promega, ウィスコンシン、Madison在)を製造業者の記載に従って利用してクローン化した。これらのプライマー及びＰＣＲ生成物は、ｅｐｈｒｉｎＢ２については、5'-tccgtgtggaagtactgctg-3'(フォワード)、5'-tctggtttggcacagttgag-3'(リバース)であったが、これらは、２９６ｂｐの生成物を生じ、ＥｐｈＢ４については、5'-ctttggaagagaccctgctg-3'(フォワード)、5'-agacggtgaaggtctccttg-3'であったが、これらは、２９７ｂｐの生成物を生じた。確実性及びインサートの向きを、ＤＮＡ配列決定により確認した。
ヒトｅｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４遺伝子のＰＣＲ生成物を含むｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙプラスミドを、ＳｐｅＩ又はＮｃｏＩで線状化した。アンチセンス又はセンスジゴキシゲニン(ＤＩＧ)標識したＲＮＡプローブを、Ｔ７又はＳＰ６プロモーターから、ＤＩＧＲＮＡ標識キット(Roche, インジアナ、Indianapolis在)を利用するラン−オフ転写により転写した。ＲＮＡプローブを、ＤＩＧＲＮＡ標識キットの指示書に記載されたスポットアッセイにより定量した。
４）イン・シトゥーハイブリダイゼーション
細胞を、Labtech II ４ウェルチャンバースライド(Nalge Nunc International, イリノイ、Naperville在)で培養した。細胞をＰＢＳ(３７℃)中で洗ってから、３０分間、２５℃で、４％(ｗ／ｖ)ホルムアルデヒド、５％(ｖ／ｖ)酢酸、及び０．９％(ｗ／ｖ)ＮａＣｌ溶液中で固定した。固定後、スライドを、ＰＢＳですすいで、７０％エタノール中に４℃で、更なる使用まで保存した。イン・シトゥーハイブリダイゼーション前に、細胞を脱水し、１００％キシレン中で洗って残留脂質を除き、次いで、最後にＰＢＳ中で再水和した。細胞を、３７℃で、０．１Ｎ ＨＣｌ中の０．１％(ｗ／ｖ)ペプシンと２０分間インキュベートし、１％ホルムアルデヒド中で１０分間後固定することにより透過性にした。予備ハイブリダイゼーションを、３０分間、３７℃で、５０％(ｖ／ｖ)脱イオンホルムアミドを含む４×ＳＳＣ溶液中で行なった。スライドを、一晩、４２℃で、２５ｎｇのアンチセンス又はセンスＲＮＡプローブと、４０％脱イオンホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、１×デンハート溶液、４×ＳＳＣ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌ酵母ｔ−ＲＮＡ及び１ｍｇ／ｍｌ変性して剪断したサケ精子ＤＮＡ中(全容４０μｌ)でハイブリダイズさせた。次いで、スライドを、３７℃で、次のように洗った：２×ＳＳＣで２×１５分、１×ＳＳＣで２×１５分、０．５×ＳＳＣで２×１５分、及び０．２×ＳＳＣで２×３０分。ハイブリダイゼーションシグナルを、アルカリホスファターゼ結合体化抗ＤＩＧ抗体(Roche)を製造業者の指示に従って利用して検出した。発色を、０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ８．０)中で１０分間、２回洗うことにより停止した。細胞を、Nuclear Fast Red(Vector Laboratories, カリフォルニア、Burlingame在)による核酸の対比染色により可視化して、スライドを、ＩＭＭＵ−ＭＯＵＮＴ(Shandon, 英国、Astmoor在)にマウントした。
５）ウエスタンブロット
粗細胞溶解物を、細胞溶解緩衝液(１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール)中でのインキュベーションにより調製した。溶解物を、１０，０００×ｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。総タンパク質を、Bradfordアッセイ(Bio-Rad)により測定した。試料(２０μｇタンパク質)を、４〜２０％トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル上で分画して、ポリビニリデンジフルオリド(ＰＶＤＴ)膜(Bio-Rad)にエレクトロブロッティングにより移した。膜を、５％脱脂乳によりブロックしてから、ＥｐｈＢ４に対する抗体(１：５０００希釈)と４℃で１６時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した二次抗体(１：１００，０００希釈)を、１時間、２５℃で加えた。これらの膜を、SuperSignal West Femto Maximum sensitivity 化学発光基質(Pierce, イリノイ、Rockford在)を製造業者の指示に従って利用して発色させた。
６）免疫組織化学
ホルマリン固定した組織切片を、パラフィン除去して、１０％ヤギ血清と共に−７０℃で１０分間インキュベートし、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４に対する一次ウサギ抗体(Santa Cruz Biotechnologies; １：１００)と共に４℃で一晩インキュベートした。イソタイプ特異的ウサギＩｇＧを、対照として利用した。これらのレセプターに対する免疫反応性を、Vector Laboratoriesのアビジン−ビオチンキットを利用して示した。ペルオキシダーゼ活性を、ジアミノベンジジン(Sigma)細胞化学反応により示した。次いで、これらのスライドを、Ｈ＆Ｅで対比染色した。
７）免疫蛍光研究
細胞を、Labtech II４ウェルチャンバースライドで培養して、ダルベッコリン酸緩衝塩溶液ｐＨ７．４(ＰＢＳ)中で４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。これらのスライドを、ＰＢＳ中で２回すすぎ、ブロッキング緩衝液(ＰＢＳ中の０．２％トリトン−Ｘ１００、１％ＢＳＡ)にて２０分間予備インキュベートした。次いで、これらのスライドを、ＥｐｈＢ４又はｅｐｈｒｉｎＢ２に対する抗体(ＰＢＳ中で１：１００希釈)と、ブロッキング緩衝液中で、４℃で１６時間インキュベートした。３回洗った後、これらのスライドを、適当なフルオレセイン結合体化二次抗体(Sigma-Aldrich, ミズーリ、St.Louis在)とインキュベートした。核を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリドヒドレート(ＤＡＰＩ)で対比染色し、多数回ＰＢＳで洗浄し、Vectasheild 抗退色マウント溶液(Vector Laboratories)を用いてマウントした。イメージを、OlympusAX70蛍光顕微鏡及びSpot v2.2.2(Diagnostic Instruments Inc., ミシガン、Sterling Heights在)デジタルイメージングシステムを利用して得た。
８）細胞生存力アッセイ
細胞を、５×１０3／ウェルの密度で、４８ウェルプレートに、０日目に、２％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)を含む適当な成長培地中に播種した。翌日、該培地を交換して、細胞を、様々な濃度(１〜１０μＭ)のＥｐｈＢ４アンチセンスで処理した。４日目に、生存力を、３−(４，５−ジメチルチアゾール−２−イル)−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(ＭＴＴ)を終濃度０．５ｍｇ／ｍｌで利用して評価した。細胞を、２時間インキュベートし、培地を吸引して、細胞を、酸性イソプロパノール(９０％イソプロパノール、０．５％ＳＤＳ及び４０ｍＭ ＨＣｌ)中に溶解させた。光学密度を、ＥＬＩＳＡリーダーで４９０ｎｍでイソプロパノールをブランクとして利用して読んだ(Molecular Devices, カリフォルニア)。
９）細胞移動
イン・ビトロの創傷治癒アッセイを採用した。簡単にいえば、細胞を、６ｃｍプレート上に、完全培養培地に２４時間播種してから、５％ＦＢＳを含む培地に切り替えた。ＥＰＨＢ４アンチセンス１０(１０μＭ)も又、処理したウェルに加えた。２４時間後に、ｐ−２００ピペットマンチップを利用して傷を造り；プレートの中央に線を引いた。そのプレートを、０、１２、２４時間の時点で写真撮影した。この実験を、３回繰り返した。
実施例５．ＥｐｈＢ４は、頭頚部の扁平上皮細胞癌において発現される：
上皮成長因子シグナリング経路による調節及び成長に有利な要因
頭頚部の扁平上皮細胞癌(ＨＮＳＣＣ)は、世界で６番目に多い癌であり、毎年９００，０００症例が診断されると見積もられている。それは、幾つかの開発途上国におけるすべての悪性疾患の約５０％を構成する。米国においては、毎年、新規の５０，０００症例と８，０００人の死亡が報告されている。煙草の発癌物質がこの病気の第一の病因論的因子であり、アルコール消費、加齢、性及び人種的背景が寄与因子であると考えられている。
上部気道消化管の正常な上皮とその組織から生じる癌細胞との間の差異は、特定の遺伝子の突然変異及びそれらの発現の変化である。これらの遺伝子は、ＤＮＡの修復、増殖、不滅化、アポトーシス、浸潤及び血管形成を制御する。頭頚部癌に関しては、３つのシグナリング経路の変化が十分な頻度で起き、この病気の臨界的形質転換事象と考えられるかかる劇的な表現型の変化を生成する。これらの変化は、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の変異、上皮成長因子レセプター(ＥＧＦＲ)の過剰発現、及びサイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ１６の不活性化を含む。他の変化例えばＲｂの変異、ｒａｓの活性化、サイクリンＤの増幅、及びｍｙｃの過剰発現は、ＨＮＳＣＣでは、頻度は一層低い。
ＥｐｈＢ４の高発現は、血液学的悪性疾患、乳癌、子宮内膜癌、及び大腸癌において報告されているが、ＥｐｈＢ４のタンパク質レベルのデータは限られており、このタンパク質のＨＮＳＣＣなどの腫瘍生物学における生物学的意義についてのデータは、完全に欠如している。
Ａ．ＨＮＳＣＣ腫瘍は、ＥｐｈＢ４を発現する
我々は、ＥｐｈＢ４のヒト腫瘍組織における発現を、免疫組織化学により、イン・シトゥーハイブリダイゼーション及びウエスタンブロットによって研究した。先見の明により集められた２０の腫瘍組織(ＩＲＢ承認)を、ＥｐｈＢの他のメンバー及びＥｐｈＡファミリーとは反応しない特異的なＥｐｈＢ４モノクローナル抗体を用いて評価した。ＥｐｈＢ４発現は、すべての症例において認められる(染色強度は、変動する)。図３９Ａ(左上)は、代表的症例を示しており、ＥｐｈＢ４が、Ｈ＆Ｅ腫瘍構造によって示されるように、腫瘍領域のみで発現されることを示している(図３９Ａ左下)。間質においてはＥｐｈＢ４の染色がないことに注意されたい。第二に、リンパ節内の転移腫瘍部位は、陽性染色を示しているが、リンパ節の残りは、陰性である(図３９、右上)。
腫瘍組織におけるＥｐｈＢ４転写物の存在及び局在性を測定するためにイン・シトゥーハイブリダイゼーションを行なった。ＥｐｈＢ４特異的なアンチセンスプローブの強いシグナルが検出され、これは、転写物の存在を示している(図３９Ｂ、左上)。腫瘍構造を示すためのＨ＆Ｅ染色(図３９Ｂ、左下)との比較は、このシグナルが、腫瘍細胞に局在化されて、間質領域には存在しなかったことを示している。ＥｐｈｒｉｎＢ２転写物も又、腫瘍試料において、ＥｐｈＢ４のように、検出され、そのシグナルは、腫瘍細胞に局在化されていた(図３９Ｂ、右上)。ＥｐｈＢ４も、ｅｐｈｒｉｎＢ２センスプローブも、これらの部分にハイブリダイズしなかったが、これは、これらのシグナルの特異性を証明している。
Ｂ．ＨＮＳＣＣの原発部位及び転移部位におけるＥｐｈＢ４の高発現
原発性腫瘍、リンパ節転移物及び無関係の組織に由来する組織のウエスタンブロットを行なって、これらの部位におけるＥｐｈＢ４発現の相対的レベルを測定した。腫瘍及び正常隣接組織を、２０症例につき集めたが、腫瘍につき陽性のリンパ節は、これら２０症例中の９症例から収穫された。代表的症例を、図３９Ｃに示す。ＥｐｈＢ４発現は、これらの腫瘍試料の各々において認められた。同様に、すべての腫瘍陽性のリンパ節は、原発腫瘍以上にＥｐｈＢ４発現を示している。正常な隣接組織においては、発現は全く認められないか又は最少の発現が認められた。
Ｃ．ＨＮＳＣＣ細胞株におけるＥｐｈＢ４発現及びＥＧＦＲ活性による調節
腫瘍細胞に限られたＥｐｈＢ４の発現を示したが、我々は、次に、ＨＮＳＣＣにおけるＥｐｈＢ４発現のイン・ビトロモデルがあるかどうかを測定することを探求した。６つのＨＮＳＣＣ細胞株を、ＥｐｈＢ４タンパク質の発現についてウエスタンブロットにより調べた(図４０Ａ)。これらの大部分は、強いＥｐｈＢ４発現を示し、それ故、その後の研究の基礎が確立された。ＥＧＦＲはＨＮＳＣＣに強く関連しているので、我々は、ＥｐｈＢ４発現がＥＧＦＲの活性化と関係するのかどうかを尋ねた。ＥＧＦＲ陽性の細胞株であるＳＣＣ−１５での予備実験は、ＥｐｈＢ４の発現を阻害するための２４時間の最適時間及び１ｍＭの特異的ＥＧＦＲキナーゼインヒビターＡＧ１４７８の濃度を確立した。これらの細胞株のすべてを研究したとき、我々は、ＳＣＣ−４では、ＥＧＦＲ発現が検出可能であるが強くはなく、それ以外のすべての株において、強いＥＧＦＲの発現に気付いた(図４０Ｃ、上段)。ＥＧＦＲインヒビターＡＧ１４７８(図４０Ｂ)に応答して、ＥｐｈＢ４の全量の顕著な喪失が、ある種の細胞株(ＳＣＣ−１５及びＳＣＣ−２５)において認められたが、他の株(ＳＣＣ−９、−１２、−１３及び−７１)においては認められなかった。従って、ＳＣＣ−１５及び−２５は、ＥＧＦＲ活性により調節されるＥｐｈＢ４のモデルとして役立つが、ＳＣＣ−９、−１２、−１３及び−７１は、ＨＮＳＣＣにおけるＥＧＦＲ活性と無関係のＥｐｈＢ４調節のモデルであり、他の因子例えばｐ５３、ＰＴＥＮ、ＩＬ−６などからのインプットがありうる。我々は又、試験したすべての細胞株において、ＥｐｈＢ４のリガンド即ちｅｐｈｒｉｎＢ２の発現にも注意した。ＥｐｈＢ４のように、幾つかの株において、ｅｐｈｒｉｎＢ２発現は、ＥＧＦＲ活性により調節されているようであるが、それは、他の細胞株において独立している。
明らかに、構成的ＥＧＦＲシグナリングの阻害は、ＳＣＣ１５細胞におけるＥｐｈＢ４レベルを抑制した。次に、我々は、ＥＧＦがＥｐｈＢ４を誘導できるかどうかを研究した。我々は、ＥｐｈＢ４レベルが、図４１Ｂ(レーン１及び２)に示したように、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦでの２４時間の処理の前に２４時間の血清飢餓にされたＳＣＣ１５細胞において誘導されることを見出した。図４１Ａに示されたＥＧＦＲ活性化について知られたこれらの下流のシグナリング経路(総説としては、Yarden及びSlikowski 2001参照)を、次いで、ＥｐｈＢ４のＥＧＦ媒介による誘導へのそれらのインプットについて研究した。ＰＬＣｇ、ＡＫＴ及びＪＮＫのリン酸化を特異的キナーゼインヒビターＵ７３１２２、ＳＨ−５及びＳＰ６００１２５でブロックすることは、それぞれ、ＥｐｈＢ４の基底レベルを下げて、そのＥＧＦ刺激された誘導をブロックした(図４１Ｂ、レーン３〜８)。対照的に、ＥＲＫ１／２のＰＤ０９８０９５での阻害及びＰＩ３−ＫのＬＹ２９４００２又はWortmanninによる阻害は、ＥｐｈＢ４レベルのＥＧＦ誘導に対する識別できる効果を有しなかった。しかしながら、ＥｐｈＢ４の基底レベルは、ＥＲＫ１／２リン酸化を阻害した場合に低下した。興味深いことに、ＳＢ２０３５８０によるｐ３８ＭＡＰＫ活性化は、ＥｐｈＢ４の基底レベルを増大させたが、ＥＧＦ誘導されたＥｐｈＢ４レベルを増大させなかった。同様の結果が、ＳＣＣ２５細胞株においても見られた(データは示さない)。
Ｄ．ＥｐｈＢ４の高発現細胞株における阻害は、減少した生存力を生じて、細胞周期の停止を引き起こす
次に、我々は、ｓｉＲＮＡ又はＡＳ−ＯＤＮ法を利用して発現を除去することの効果を研究することによって、ＨＮＳＣＣにおけるＥｐｈＢ４発現の役割に関心を向けた。図４２Ａに示したように変化する程度にＥｐｈＢ４発現をノックダウンするＥｐｈＢ４配列に対する幾つかのｓｉＲＮＡを開発した(表１)。生存力は、ＥｐｈＢ４発現のブロックにおいて最も有効であるｓｉＲＮＡ５０及び４７２でトランスフェクトされたＳＣＣ−１５、−２５及び−７１細胞株において減少した(図４２Ｂ)。ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ１５６２及び２３０２又はｅｐｈｒｉｎＢ２ ｓｉＲＮＡ２５４では、生存力に対する効果は殆ど見られなかった。ＥｐｈＢ４を発現しないＳＣＣ−４(図４０Ａ参照)においては、細胞性依存力の減少はなかったことに注意されたい。このｓｉＲＮＡ５０及び４７２処理で見られた減少した細胞生存力は、細胞のサブＧ０における蓄積に帰することができ、アポトーシスを示すものである。この効果は、時間と投与量の両方に依存した(図４２Ｃ及び表２)。対照的に、ＥｐｈＢ４レベルの減少に有効でなく生存力に僅かな効果しか有しないｓｉＲＮＡ２３０２は、擬似的リポフェクタミン(商標)２０００トランスフェクションと比較して、細胞周期に如何なる変化も生じなかった。
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加えて、ヒトＥｐｈＢ４コード配列に相補的な５０より多くのホスホロチオエートＡＳ−ＯＤＮを合成して、それらの、完全長のＥｐｈＢ４発現プラスミドでトランスフェクトされた２９３細胞におけるＥｐｈＢ４発現を阻害する能力について試験した。図４３Ａは、これらのＡＳ−ＯＤＮの幾つかのＥｐｈＢ４発現に対する効果の代表的試料を示している。ＡＳ−１０によって発現が全体的に排除されているが、ＡＳ−１１は、少しの効果しか有しないことに注意されたい。ＳＣＣ１５細胞における細胞生存力に対する効果は、図４３Ｂに示したように、ＥｐｈＢ４発現の阻害に最も効果的であるＡＳ−ＯＤＮを用いた場合に最も顕著であった。ＡＳ−１０のＩＣ50は、約１μＭであったが、ＡＳ−１１は、１０μＭでさえ、生存力の５０％減少を達成するのに十分でなかった。ＡＳ−１０が細胞周期に対して有する効果を研究したときに、未処理細胞と比較して、サブＧ０画分が、１．９％から１０．５％に増加することが見出され、アポトーシスを示している(図４３Ｃ)。
Ｅ．ＥｐｈＢ４は、細胞移動を調節する
次に、我々は、ＥｐｈＢ４が、ＨＮＳＣＣの移動に関与するかどうかを測定することを望んだ。移動にかかわることは、成長及び転移に関連を有しうる。移動を、創傷−治癒／掻き取りアッセイを利用して評価した。集密のＳＣＣ１５及びＳＣＣ２５培養物に、無菌のプラスチック製パスツールピペットを用いた単一の引っ掻きにより傷を付け、境界の明確な３ｍｍのバンドが残った。試験化合物の存在下における、細胞の透明な領域への移動を評価して、２４、４８及び７２時間後に定量した。細胞移動は、ＥｐｈＢ４発現をブロックするＡＳ−１０に応答して、顕著に減少したが、不活性化合物、ＡＳ−１及びごたまぜにしたＯＤＮは、図４３Ｄに示したように、殆ど又は全く効果を有しなかった。ＡＳ−１０による移動の阻害は、Boydenダブルチャンバーアッセイを利用しても示された(図４３Ｅ)。
Ｆ．ＥｐｈＢ４ ＡＳ−１０イン・ビボ抗腫瘍活性
細胞の生存力及び運動性を低下させるＥｐｈＢ４ ＡＳ−１０の効果を、Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウス中のＳＣＣ１５腫瘍異種移植片において測定した。マウスの、２０ｍｇ／ｋｇ ＡＳ−１０、センスＯＤＮ又は等容のＰＢＳの腹腔内注射による日々の治療を、腫瘍細胞移植の翌日に開始した。ＡＳ−１０を受けたマウスにおける腫瘍の成長は、センスＯＤＮ又はＰＢＳ希釈剤のみを受けたマウスと比較して、有意に遅延された(図４４)。ＯＤＮに帰することのできる非特異的効果は、センスＯＤＮ処理群とＰＢＳ処理群との間で差異がなかったので、認められなかった。
Ｇ．材料と方法
１）細胞株及び試薬
ＨＮＳＣＣ−４、−９、−１２、−１３、−１５、−２５及び−７１、並びに２９３ヒト胎児腎臓細胞は、ＡＴＣＣ(バージニア、Manassas在)から得た。細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清(ＦＢＳ；Invitrogen, カリフォルニア、Carlsbad在)及び抗生物質を補ったＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。ＥＧＦＲ、ＥｐｈＢ４(Ｃ−１６)ポリクローナル抗体は、Santa Cruz Biotech(カリフォルニア、Santa Cruz在)から得た。β−アクチンモノクローナル抗体は、Sigma Chemical Co.(ミズーリ、St.Louis)から購入した。ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４ポリクローナル抗体及びそれらの対応するブロッキングペプチドは、Santa Cruz Biotechnology(カリフォルニア、Santa Cruz在)から得た。ＡＧ１４７８(４−(３’−クロロアニリノ)−６，７−ジメトキシ−キナゾリン)は、Calbiochem(カリフォルニア、San Diego在)から得た。キナーゼインヒビターＳＨ−５及びＳＰ６００１２５は、A.G. Scientific(カリフォルニア、San Diego在)から得た。ＰＤ９８０９５、Ｕ７３１２２、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ２９４００２及びWortmanninは、Sigma社より得た。
２）ジゴキシゲニン標識したＲＮＡプローブの調製
上記(例えば、実施例３)を参照されたい。
３）イン・シトゥーハイブリダイゼーション
上記(例えば、実施例３)を参照されたい。
４）免疫組織化学
ホルマリン固定した組織切片をパラフィン除去して、１０％ヤギ血清と−７０℃で１０分間インキュベートして、ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体と４℃で一晩インキュベートした。イソタイプ特異的なウサギＩｇＧを対照として利用した。これらのレセプターについての免疫反応性を、Vector Laboratoriesのアビジン−ビオチンキットを利用して示した。ペルオキシダーゼ活性を、ジアミノベンジジン(Sigma)細胞化学反応により示した。次いで、これらのスライドを、０．１２％メチレンブルー又はＨ＆Ｅにより対比染色した。凍結切片について、ＯＣＴ包埋組織を、５μｍで切片化して、リン酸緩衝４％パラホルムアルデヒドにて固定した。切片を、３×５分間ＰＢＳ中で洗い、内因性ペルオキシダーゼを、ＰＢＳ中の０．３％Ｈ2Ｏ2中での室温で１０分間のインキュベーションによりブロックした。切片を、Ｅｐｈ４(Ｃ−１６)抗体(１：５０)と１時間室温でインキュベートした後、ＰＢＳ中で３回洗い、ロバ抗ヤギ二次抗体(Santa Cruz Biotech.)との一時間室温でのインキュベーションを行なった。ＰＢＳ中での３回の洗浄後に、ペルオキシダーゼ活性は、ＤＡＢ基質溶液(Vector Laboratories, Inc. カリフォルニア、Burlingame在)中での１０分間室温でのインキュベーションにより局在化した。切片を、ヘマトキシリンで、２０秒間対比染色し、脱水して、マウントした。染色についての負の対照は、正常ヤギ血清の、一次抗体の代用であった。前立腺配列(BioMeda, カリフォルニア、Foster City在)に対する免疫組織化学染色を、ヤギＡＢＣ染色システム(Santa Cruz Biotech.)を製造業者の指示に従って利用して行なった。
５）ウエスタンブロット
上記(例えば、実施例３)を参照されたい。
６）ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡのイン・ビトロ転写による合成
Silencer(商標)ｓｉＲＮＡ構築用キット(Ambion, テキサス、Austin 在)を利用して、ＥｐｈＢ４に対するｓｉＲＮＡを合成した。簡単にいえば、GenBankデータベース中の他の配列に対する有意の相同性を示さない、５’−ＡＡジヌクレオチドの下流に１９ｂｐを含む２１ｂｐの標的配列を同定した。センス及びアンチセンスのｓｉＲＮＡの２９量体のＤＮＡオリゴヌクレオチドテンプレートを、USC Norris Microchemical Core Facilityにて合成した。アンチセンステンプレートは、標的配列に対応し、該配列の後ろには８ｂｐの追加(5'-CCTGTCTC-3')が３’末端に続き、これは、Silencer(商標)ｓｉＲＮＡ構築用キットにより提供されたＴ７プロモータープライマーに対して相補的であった。センステンプレートは、５’−ＡＡを含んだが、その後ろには、標的の１９ｂｐの相補配列が続き、その後ろには上記のようにＴ７の８ｂｐの配列が続いた。
別々の反応において、これら２つのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドテンプレートは、Ｔ７プロモータープライマーにハイブリダイズした。これらのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの３’末端を、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片により伸長させて、二本鎖ｓｉＲＮＡ転写テンプレートを造った。これらのセンス及びアンチセンスｓｉＲＮＡテンプレートは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより転写され、その結果生成したＲＮＡ転写物は、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを造った。リーダー配列は、ｄｓＲＮＡを一本鎖特異的リボヌクレアーゼにより消化することにより除去されて、オーバーハングのＵＵジヌクレオチドが残った。ＤＮＡテンプレートを、同時に、ＲＮアーゼを含まないデオキシリボヌクレアーゼによる処理によって除去した。その結果生成したｓｉＲＮＡを、硝子繊維フィルター(反応物中の過剰のヌクレオチド、短いオリゴマー、タンパク質及び塩類を除去するために結合)により精製した。最終生成物(表３に示した)は、細胞にトランスフェクトされたときに標的ｍＲＮＡの発現を効果的に低下させることのできる３’末端ウリジンを有する二本鎖の２１量体ｓｉＲＮＡであった。
幾つかのホスホロチオエートＡＳ−ＯＤＮも又、合成して(Operon, カリフォルニア、Valencia在)、ＥｐｈＢ４発現の阻害について試験した(表３)。
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７）細胞生存力アッセイ
細胞を、５×１０3／ウェルの密度で、４８ウェルプレートに、２％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)を含む適当な成長培地中に、０日目に播種した。細胞を、様々な濃度(１〜１０μｇ／ｍｌ)のＯＤＮで、２日目及び４日目に処理した。５日目に、生存力を、３−(４，５−ジメチルチアゾール−２−イル)−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(ＭＴＴ)を利用して、以前に記載された(Masood等、'03)ように評価した。ｓｉＲＮＡを伴う生存力について、２×１０4細胞／ウェルのＳＣＣ−４、−１５、−２５又は−７１(４８ウェルプレート中)を、２μｌのリポフェクタミン(商標)２０００を製造業者の指示に従って利用して、ｓｉＲＮＡ(１０〜１００ｎＭ)でトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に、これらの細胞を、成長培地(１０％ＦＢＳを補ったＲＰＭＩ１６４０)に戻した。生存力を、トランスフェクションの４８時間後に、ＭＴＴによって評価した。
８）細胞周期分析
６ウェルプレート中のＳＣＣ１５細胞の８０％集密培養物を、リポフェクタミン(商標)２０００を利用して、ｓｉＲＮＡ４７２(１００ｎＭ)でトランスフェクトした。トランスフェクションの１６又は３６時間後に、細胞をトリプシン処理して、ＰＢＳ中で洗って、５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム、０．１％クエン酸ナトリウム、０．１トリトンＸ−１００及び２０μｇ／ｍｌ ＤＮアーゼフリーのＲＮアーゼを含む１ｍｌの低張溶液中で１時間４℃でインキュベートした。細胞を、リニアーモードで、ＵＳＣフローサイトメトリー施設で分析した。結果を、細胞周期の異なる相即ちサブＧ０ピーク(アポトーシス)、Ｇ０／Ｇ１(ＤＮＡ合成なし)、Ｓ(活性なＤＮＡ合成)、Ｇ２(有糸分裂前)及びＭ(有糸分裂)で検出されたエレメントのパーセンテージとして標示した。ＡＳ−ＯＤＮ実験のために、これらの細胞を、５μＭ ＯＤＮに、処理前に、３６時間さらした。
９）創傷治癒移動アッセイ
ＳＣＣ１５細胞を、６ウェルプレートに播種して、集密になるまで培養した。１０μＭのＡＳ−１、ＡＳ−１０、又はセンスＯＤＮ(対照)を、これらのウェルに、生存力アッセイについて記載したように、単層を無菌のピペットチップで引っ掻くことにより傷付ける１２時間前に導入した。培地を、５％ＦＢＳ及び新鮮なＯＤＮを補ったＲＰＭＩ１６４０に換えた。治癒過程を、動的に試験して、顕微鏡アダプター付きのNikon Coolpix 5000デジタルカメラを用いて記録した。
１０）移動のBoydenチャンバーアッセイ
細胞移動アッセイを、以前に記載されたように(Masood ANUP 論文‘99)行なったが、但し、１μＭのＡＳ−１０又はＡＳ−６を、上側チャンバーに加えた。ＥＧＦ(２０ｎｇ／ｍｌ)を、下側チャンバーの化学誘因剤として利用した。１０ｎｇ／ｍｌのタキソールを負の対照として利用した。
１１）イン・ビボ研究
ＳＣＣ１５(５×１０6細胞)を、５週齢の雄のＢａｌｂ／Ｃ Ｎｕ+／ｎｕ+無胸腺マウスの背中の下部に皮下注射した。ＯＤＮ(２０ｍｇ／ｋｇ、総容積１００μｌ)又は希釈剤(ＰＢＳ)の日々の腹腔内注射よりなる処理を、腫瘍細胞移植の翌日に開始して、２週間続けた。マウスにおける腫瘍の成長を、以前に記載されたように(Masood CCR '01)して測定した。研究の終りに、マウスを犠牲にした。すべてのマウスを、研究所のマウスの世話を管理する南カリフォルニア大学動物保護及び利用委員会のガイドラインに従って維持した。
実施例６．カポジ肉腫におけるＥｐｒｉｎＢ２発現は、ヒトの８型ヘルペスウイルスにより誘導される：静脈から動脈内皮への表現型の切り替え
カポジ肉腫(ＫＳ)は、皮膚及び粘膜の最も一般的な多病巣性の血管増殖性疾患として現れ、その後、内臓に広がり(１)、この病気の顕著な特徴は、血管形成、浮腫、リンパ単核細胞の浸潤及び紡錘形状の腫瘍細胞の成長である。病理学的に、確立された病変は、広範なスリット様空間の血管ネットワークを示す。このＫＳの血管ネットワークは、基底膜の欠如及びこれらの血管を裏打ちする異常な紡錘形状の内皮細胞(腫瘍細胞)において、正常な血管と区別される。不完全な血管系は、アルブミン、赤血球及び単核細胞を含む血液成分の病変への蓄積を生じる(１)。このＫＳ腫瘍は、内皮起源であり；該腫瘍細胞は、Ulex europeaus アグルチニン−１(ＵＥＡ−１)のためのレクチン結合部位、ＣＤ３４、ＥＮ−４、ＰＡＬ−Ｅ(２)及び内皮細胞特異的なチロシンキナーゼレセプター、ＶＥＧＦＲ−１(Ｆｌｔ−１)、ＶＥＧＦＲ−２(Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ)、ＶＥＧＦＲ−３(Ｆｌｔ−４)、Ｔｉｅ−１及びＴｉｅ−２(３、ＲＭ及びＰＳＧ未公開データ)を含む多くの内皮マーカーを発現する。ＫＳ細胞は、ＬＹＶＥ及びポドプラニンを含むリンパ細胞関連タンパク質を同時発現する(４)。
ヘルペスウイルスＨＨＶ−８は、この病気に対する原因因子と考えられている。１９９４年に、この新しいヘルペスウイルスの配列が、ＫＳ腫瘍組織において同定され(５)その後の分子疫学研究は、殆どすべてのＫＳ腫瘍がウイルスゲノムを含むことを示した。血清疫学研究は、ＫＳを有するＨＩＶ感染患者は、ＨＨＶ−８の最高の罹患率を有することを示し、第二に、ＨＩＶに感染しているがＫＳではない者は、ＨＨＶ−８について血清反応陽性であるならば、ＫＳ発生の増大した危険を有することを示している(６)。ＫＳにおけるＨＨＶ−８の役割についての直接的証拠は、ＨＨＶ−８感染後の骨髄内皮細胞のトランスフォーメーションである(７)。幾つかのＨＨＶ−８にコードされた遺伝子は、細胞のトランスフォーメーションに寄与することができた(８に総説されている)。しかしながら、殆どの証拠は、この役割におけるＧタンパク質共役型レセプター(ｖＧＰＣＲ)に関して蓄積した(９)。
我々は、ＫＳ腫瘍細胞が、動脈内皮又は静脈内皮に由来するのかどうかを研究した。加えて、我々は、ＨＨＶ−８が、ＫＳのモデルにおいて動脈又は静脈マーカーの発現に効果を有するかどうかを研究した。ＫＳ腫瘍細胞は、ｅｐｈｒｉｎＢ２動脈マーカーを発現することが見出された。更に、ｅｐｈｒｉｎＢ２発現は、ＫＳ及び内皮細胞株において、ＨＨＶ−８ｖＧＰＣＲによって誘導された。ＥｐｈｒｉｎＢ２は、ｅｐｈｒｉｎＢ２発現又はシグナリングの阻害はＫＳ細胞の生存力及び機能に有害であるので、ＫＳの治療のための潜在的な標的である。
Ａ．ＫＳ腫瘍は、ＥｐｈｒｉｎＢ２を発現するが、ＥｐｈＢ４を発現しない
ＫＳ病変の高度に血管的性質及びこれらの腫瘍細胞の可能な内皮細胞起源は、それぞれ静脈及び動脈内皮細胞のマーカーであるＥｐｈＢ４及びｅｐｈｒｉｎＢ２の発現の研究を促進した。ＥｐｈｒｉｎＢ２転写物は、ＫＳ生検の腫瘍細胞においてイン・シトゥーハイブリダイゼーションによって検出されたが、ＥｐｈＢ４は検出されなかった(図４５Ａ)。ｅｐｈｒｉｎＢ２アンチセンスプローブによる陽性シグナルとＨ＆Ｅ染色により示された腫瘍細胞との比較は、ｅｐｈｒｉｎＢ２発現が、腫瘍細胞を含む生検の領域に限られていることを示す。ＥｐｈＢ４アンチセンスプローブを用いた場合のＫＳにおけるシグナルの欠如は、プローブの欠陥によるものではない。何故なら、それは、我々が、このタンパク質を発現することを示した扁平上皮細胞癌において転写物を検出したからである(１８)。ＫＳ腫瘍組織におけるｅｐｈｒｉｎＢ２の発現の更なる証拠は、ＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＦｃ抗体により検出されるＥｐｈＢ４／Ｆｃシグナルの腫瘍細胞への局在化によって与えられる。ｅｐｈｒｉｎＢ２は、ＥｐｈＢ４の唯一のリガンドであるので、この試薬は、ｅｐｈｒｉｎＢ２の発現に特異的である(図４５Ｂ、左)。二次試薬だけで処理した隣接切片は、特異的シグナルを示していない。二色共焦点顕微鏡観察は、ｅｐｈｒｉｎＢ２陽性細胞におけるＨＨＶ−８の潜在性タンパク質、ＬＡＮＡ１の存在を示し(図４５Ｃ、左)、これは、それがこの動脈マーカーを発現している腫瘍細胞であって、腫瘍血管ではないことを示している。腫瘍生検のＰＥＣＡＭ−１抗体での染色は、この腫瘍の高い血管性状を示した(図４５Ｃ、右)。ＫＳ生検におけるｅｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４発現のこのパターンの普及率の予備的研究は、ＲＴ−ＰＣＲ分析により行われた。６つの試料のすべては、ｅｐｈｒｉｎＢ２について陽性であったが、２つだけは、ＥｐｈＢ４について弱い陽性であった(データは、示さない)。
Ｂ．静脈内皮細胞のＨＨＶ−８感染は、表現型の動脈マーカーへの切り替えを引き起こす
我々は、次に、ＨＨＶ−８(ＫＳの原因因子と思われる)が、内皮細胞で、ｅｐｈｒｉｎＢ２の発現を誘導して、ＥｐｈＢ４の発現を抑制することができるかどうかを尋ねた。生産的にＨＨＶ−８が感染するＨＵＶＥＣとＢＣ−１リンパ腫細胞の共存培養は、内皮細胞の有効な感染を生じる(１６)。多数回の洗浄後に残っている内皮細胞の付着した単層を、ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４について、ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫蛍光によって調べた。ＨＵＶＥＣは、ＥｐｈＢ４静脈マーカーをＲＮＡレベルで強く発現するが、ｅｐｈｒｉｎＢ２を発現しない(図４６Ｂ)。対照的に、ＨＨＶ−８感染した培養物(ＨＵＶＥＣ／ＢＣ−１及びＨＵＶＥＣ／ＢＣ−３)は、ｅｐｈｒｉｎＢ２を発現するが、ＥｐｈＢ４転写物は殆ど存在しない。
ＨＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣ／ＨＨＶ−８培養物の、動脈／静脈マーカー及びウイルスタンパク質についての免疫蛍光分析が、タンパク質発現の変化が、ＲＮＡで見られたことを反映するかどうかを測定するために企てられた。加えて、これらのタンパク質の細胞内局在性を測定することができた。ＲＴ−ＰＣＲのデータと一致して、ＨＵＶＥＣは、ｅｐｈｒｉｎＢ２陰性で、ＥｐｈＢ４陽性である(図４６Ａ(ａ及びｍ))。予想されるように、それらは、如何なるＨＨＶ−８の潜在的関連核抗原(ＬＡＮＡ１)も発現しない(図４６Ａ(ｂ、ｎ))。生産的にＨＨＶ−８が感染するＢＣ−１細胞の共存培養は、ウイルスタンパク質ＬＡＮＡ１及びＯＲＦ５９の存在により示されるように、ＨＵＶＥＣの感染を生じた(図４６Ａ(ｆ、ｒ))。ＨＨＶ−８感染したＨＵＶＥＣは、今や、ｅｐｈｒｉｎＢ２を発現するが、ＥｐｈＢ４を発現しない(それぞれ、図４６Ａ(ｅ、ｑ、ｕ))。ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＬＡＮＡ１コクラスターの発現は、組み合わせたイメージ中の黄色のシグナルにより示される(図４６Ａ(ｈ))。ｅｐｈｒｉｎＢ２陽性でＥｐｈＢ４陰性のＨＨＶ−８感染したＨＵＶＥＣは、動脈マーカーＣＤ１４８をも発現する(１９)(図４６Ａ(ｊ、ｖ))。ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＣＤ１４８コクラスターの発現は、組み合わせたイメージ中の黄色のシグナルにより示される(図４６Ａ(ｌ))。ＥｐｈＢ４を発現する未感染ＨＵＶＥＣは、ＣＤ１４８について陰性であった(示してない)。
Ｃ．ＨＨＶ−８ｖＧＰＣＲは、ｅｐｈｒｉｎＢ２発現を誘導する
個々のウイルスタンパク質が、全ウイルスで見られるｅｐｈｒｉｎＢ２の発現を誘導することができるかどうかを試験するために、ＫＳ−ＳＬＫ細胞を、ＨＨＶ−８ ＬＡＮＡ又はＬＡＮＡΔ４４０又はｖＧＰＣＲで安定にトランスフェクトした。安定なクローンのウエスタンブロットは、ｖＧＰＣＲでトランスフェクトしたＫＳ−ＳＬＫにおいて、ＳＬＫ−ＬＡＮＡ又はＳＬＫ−ＬＡＮＡΔ４４０と比較して、ｅｐｈｒｉｎＢ２の５倍の誘導を示した(図４７Ａ)。ベクターのみ(ｐＣＥＦＬ)をトランスフェクトしたＳＬＫを、対照として利用した。ＳＬＫ−ｖＧＰＣＲ及びＳＬＫ−ｐＣＥＦＬ細胞も、ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４発現について、一時的にトランスフェクトされたＫＳ−ＳＬＫ細胞において免疫蛍光によって試験した。図４７Ｂは、ＳＬＫ−ｖＧＰＣＲ細胞におけるｅｐｈｒｉｎＢ２の、ＳＬＫ−ｐＣＥＦＬと比べて一層高い発現を示している。ＳＬＫ−ｖＧＰＣＲにおけるＥｐｈＢ４の変化は、ＳＬＫ−ｐＣＥＦＬと比べて認められなかった。これは、明らかに、ＳＬＫ−ｖＧＰＣＲ細胞が、ｅｐｈｒｉｎＢ２を、ＳＬＫ−ｐＣＥＦＬ細胞と比較して一層高レベルで発現したことを示している。これは、ＨＨＶ−８のｖＧＰＣＲがＫＳにおけるＥｐｈｒｉｎＢ２の誘導及び動脈表現型切替えに直接関与することを示唆している。我々は、ＨＨＶ−８がＨＵＶＥＣにおいてｅｐｈｒｉｎＢ２の発現を誘導することを示して以来、次に、これが転写効果により媒介されうるものであるかどうかを尋ねた。ＥｐｈｒｉｎＢ２ ５’−隣接ＤＮＡ−ルシフェラーゼレポータープラスミドを、材料と方法に記載したように構築して、ＨＵＶＥＣ中に一時的にトランスフェクトした。ＥｐｈｒｉｎＢ２ ５’−隣接ＤＮＡ配列−２４９１／−１１は、ＨＵＶＥＣ細胞において、最少活性を有する(図４７Ｃ)。これは、ｅｐｈｒｉｎＢ２が動脈性であって静脈マーカーではないことと一致する。しかしながら、我々は、培養したＨＵＶＥＣは、ＲＮＡレベルで幾らかのｅｐｈｒｉｎＢ２を発現しないことに注意した。ＨＨＶ−８ｖＧＰＣＲの同時トランスフェクションは、対照用発現ベクターｐＣＥＦＬと比べて約１０倍、ｅｐｈｒｉｎＢ２転写を誘導する。大体同じ誘導が、ｅｐｈｒｉｎＢ２配列−２４９１／−１１、−１２４２／−１１、又は−５７７／−１１を用いて見られ、これは、−１２４２／−１１ルシフェラーゼ構築物により最大の活性が見られたけれども、−５７７と−１１の間のエレメントがｖＧＰＣＲへの応答を媒介するのに十分であることを示している。
Ｄ．ＥｐｈｒｉｎＢ２の発現は、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ−Ｃにより調節される
我々は、次に、公知のＫＳ成長因子が、ｅｐｈｒｉｎＢ２発現のｖＧＰＣＲ媒介の誘導に関与しうるかどうかを尋ねた。ＳＬＫ−ｖＧＰＣＲ細胞を、オンコスタチン−Ｍ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｃに対する中和抗体で３６時間処理した。図４８Ａは、ＶＥＧＦの中和が、ｅｐｈｒｉｎＢ２のＳＬＫ−ｖＧＰＣＲ細胞における発現を完全にブロックしたことを示している。ｅｐｈｒｉｎＢ２の僅かであるが有意の減少が、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＩＬ−８の中和で見られた。オンコスタチン−Ｍ又はＩＬ−６の中和では、認められる効果は見られなかった。ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ−Ｃが、ｅｐｈｒｉｎＢ２発現の誘導に対して完全であることを確認するために、我々は、ＨＵＶＥＣを、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ又はＥＧＦで処理した。ＨＵＶＥＣは、２つの異なる濃度の個々の成長因子(１０ｎｇ、１００ｎｇ／ｍｌ)を有する５％ＦＢＳを含むＥＢＭ−２培地において４８時間成長させた。ＶＥＧＦ−Ａ又はＶＥＧＦ−Ｃのみが、ｅｐｈｒｉｎＢ２発現を投与量依存様式で誘導した(図４８Ｂ)。対照的に、ＥＧＦは、ｅｐｈｒｉｎＢ２の発現に何の効果も有しなかった。
Ｅ．ＥｐｈｒｉｎＢ２ ｓｉＲＮＡは、ＫＳにおけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を阻害する
３つのｅｐｈｒｉｎＢ２ｓｉＲＮＡを、方法の節に記載したようにして合成した。ＫＳ−ＳＬＫ細胞を、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトして、４８時間後にｅｐｈｒｉｎＢ２発現をウエスタンブロットにより測定した。ＥｐｈｒｉｎＢ２ ｓｉＲＮＡ１３７又は２５４は、ｅｐｈｒｉｎＢ２発現の約７０％を阻害した(ｓｉＲＮＡ ＥｐｈＢ４ ５０又はｓｉＲＮＡ ＧＦＰなどの対照用ｓｉＲＮＡと比較して)。ＥｐｈｒｉｎＢ２ ６３ｓｉＲＮＡは、上記の２つのｓｉＲＮＡ ＥｐｈｒｉｎＢ２より一層効果が弱かった(図４９Ａ)。
Ｆ．ＥｐｈｒｉｎＢ２は、完全なＫＳ及びＥＣ生存力、コード形成及びイン・ビボの血管形成活性に必要である
その後、最も効果的なｅｐｈｒｉｎＢ２ ｓｉＲＮＡ(２５４)を利用して、ｅｐｈｒｉｎＢ２の発現を阻止することが、ＫＳ−ＳＬＫ又はＨＵＶＥＣ細胞の成長に対して何らかの効果を有するかどうかを測定した。ＫＳ−ＳＬＫ細胞の生存力は、ｅｐｈｒｉｎＢ２タンパク質レベルを阻害したのと同じｓｉＲＮＡによって減少した(図４９Ｂ)。ＫＳ−ＳＬＫは、高レベルのｅｐｈｒｉｎＢ２を発現し、この結果は、ｅｐｈｒｉｎＢ２発現の維持がこの状況において細胞生存力に絶対必要であることを示している。ＨＵＶＥＣは、図４８Ｂに示したように、ＶＥＧＦにより刺激された場合を除いて、ｅｐｈｒｉｎＢ２を発現しない。ＥｐｈｒｉｎＢ２ ｓｉＲＮＡ２６４は、単独の成長因子としてのＶＥＧＦと共に培養されたＨＵＶＥＣの成長を、劇的に低下させる。対照的に、ＨＵＶＥＣをＩＧＦ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦと培養した場合には、有意の効果は見られなかった。対照として、ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ ５０は、何れかの培養条件においてＨＵＶＥＣに対して有害な効果を有しなかった(図４９Ｃ)。ＫＳ及び一次内皮細胞の生存力の阻害に加えて、ＥｐｈＢ４−ＥＣＤは、ＨＵＶＥＣ及びＫＳ−ＳＬＫにおけるコード形成並びにマトリゲル(商標)プラグアッセイにおけるイン・ビボの血管形成を阻害する(図５０)。
Ｇ．方法及び材料
１）細胞株及び試薬
ヒトの血管内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)を、Clonetics(カリフォルニア、San Diego在)から得て、ＥＧＭ−２及びＥＧＭ−２ＭＶ培地(Clonetics)中にそれぞれ維持した。Ｔ１ヒト繊維芽細胞株を、Peter Jones博士(USC)から得た。ＢＣ−１及びＢＣ−３ヒト胸膜浸出液リンパ腫細胞株並びにＬＡＮＡ１及びＯＲＦ５９に対するモノクローナル抗体は、Dharam Ablashi博士(Advanced Biotechnologies Inc., メリーランド、Columbia在)の好意的寄贈であった。ＫＳ−ＳＬＫを、古典的カポジ肉腫患者から分離した(１５)。ＥｐｈＢ４，ｅｐｈｒｉｎＢ２、ＣＤ１４８、ＰＥＣＡＭ−１に対するポリクローナル抗体を、Santa Cruz Biotechnology(カリフォルニア、Santa Cruz在)から得た。マウスＥｐｈＢ４／Ｆｃ’及びヒトの血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)、ＶＥＧＦ−Ｃ、インターロイキン(ＩＬ−)６、ＩＬ−８及びオンコスタチン−Ｍに対するモノクローナル抗体を、R&D Systems(ミネソタ、Minneapolis在)から購入した。発現ベクターｐＫＳｖＧＰＣＲ−ＣＥＦＬ及びｐＣＥＦＬは、Enrique Mesri博士(コーネル大学、ニューヨーク、New York在)の好意的寄贈であった。ＨＨＶ−８潜在的関連核抗原(ＬＡＮＡ)のための発現ベクターは、Matthew Rettig博士(Administration Greater Los Angeles Healthcare Systemのベテラン)から親切に提供された。
２）ヒトの組織の収集及び準備
ヒトの皮膚のカポジ肉腫生検材料を、局所麻酔下で、同意した患者から、LAC/USC Medical Centerで、ＩＲＢ承認された同意書式を使用して得た。生検を、全ＲＮＡ、パラフィンブロック又は凍結組織ブロック(ＯＣＴ中)のために処理した。全ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート中でのホモジェナイゼーションにより抽出した(ＲＮＡｚｏｌ：Tel-Test, Inc., テキサス、Frendswoods在)。ｃＤＮＡを、ランダムヘキサマープライマーを利用する逆転写によって合成した(Superscript II; Invitrogen, カリフォルニア、Carlsbad在)。
３）ジゴキシゲニン標識したＲＮＡプローブの調製
イン・シトゥーハイブリダイゼーションのための表４に示したプライマーからのＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４ ＰＣＲ生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔイージーシステム(Promega, ウィスコンシン、Madison在)を製造業者の使用説明に従って利用してクローン化した。その信頼性及び挿入向きを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ヒトのｅｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４遺伝子のＰＣＲ生成物を含むｐＧＥＭ−Ｔイージープラスミドを、ＳｐｅＩ又はＮｃｏＩにより線状化した。アンチセンス又はセンスジゴキシゲニン(ＤＩＧ)標識したＲＮＡプローブを、Ｔ７又はＳＰ６プロモーターから、ＤＩＧ ＲＮＡ標識用キット(Roche, インジアナ、Indianapolis在)を利用するrun-off転写により転写した。ＲＮＡプローブを、スポットアッセイにより、ＤＩＧ ＲＮＡ標識用キットの指示書に記載されたようにして定量した。
Figure 0004762889
４）ｉｎ・シトゥーハイブリダイゼーション
上記(例えば、実施例３)を参照されたい。
５）ＨＵＶＥＣ及びＢＣ−１の共存培養
ＨＵＶＥＣ細胞を、５０〜７０％集密まで、ゼラチンコートされたLabtech II ４ウェルチャンバースライド(Nalge Nunc International, イリノイ、Naperville在)上でＥＧＭ−２中で成長させた。ＢＣ−１又はＢＣ−３との共存培養は、Sakurada及び共同研究者(１６)により記載されたように必須であった。簡単にいえば、ＢＣ−１又はＢＣ−３細胞を、ＴＰＡ(２０ｎｇ／ｍｌ)で予備処理して、４８時間にわたってウイルスを誘導してから、ＨＵＶＥＣ培養物に、１０：１の比で、２日間共存培養のために加えた。これらのＨＵＶＥＣをＰＢＳで何回も洗って、付着したＢＣ−１又はＢＣ−３細胞を除去した。
６）ｃＤＮＡ及びＲＴ−ＰＣＲの準備
TITANIUM(商標)１ステップＲＴ−ＰＣＲ用キット(Clontech, カリフォルニア、Palo Alto在)を、１×１０5細胞からのＲＴ−ＰＣＲのために利用した。ＥｐｈＢ４、ｅｐｈｒｉｎＢ２及びβ−アクチンの増幅のためのプライマー対を、表４に示す。各ＰＣＲサイクルは、９４℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のプライマーアニーリング及び７２℃で３０秒の伸長よりなった。これらの試料を、３０サイクルにて増幅した。ＰＣＲ生成物を、１．５％アガロースゲル上で分離して、エチジウムブロミドで染色した。
７）細胞生存力アッセイ
ＫＳ−ＳＬＫ細胞を、１×１０4／ウェルの密度で、４８ウェルプレート中に、０日目に、２％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)を含む適当な成長培地中に播種した。翌日に、これらの培地を交換して、細胞を、０、１０又は１００ｎＭ ｓｉＲＮＡで処理した。３日目に、生存力を、３−(４，５−ジメチルチアゾール−２−イル)−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(ＭＴＴ)を利用して以前に記載されたようにして(１７)評価した。
８）免疫蛍光研究
Labtech II ４ウェルチャンバースライド上で培養した細胞またはＫＳ生検材料の凍結切片を、ダルベッコリン酸緩衝塩溶液(ｐＨ７．４)(ＰＢＳ)中の４％パラホルムアルデヒド中で３０分間固定した。これらのスライドを、ＰＢＳ中で２回すすぎ、ブロッキング緩衝液(ＰＢＳ中の０．２％トリトン−Ｘ１００、１％ＢＳＡ)と２０分間予備インキュベートし、その後、ブロッキング緩衝液中で、ＥｐｈＢ４、ｅｐｈｒｉｎＢ２、ＣＤ１４８、ＬＡＮＡ１又はＯＲＦ５９に対する抗体(ＰＢＳ中で、１：１００希釈)とのインキュベーションを４℃で１６時間行なった。３回洗った後で、これらのスライドを、適当なフルオレセイン又はローダミン結合体化した二次抗体(Sigma-Aldrich, ミズーリ、St.Louis在)とインキュベートした。核を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリドヒドレート(ＤＡＰＩ)で対比染色し、ＰＢＳで何回も洗い、Vectasheild抗退色性マウント用溶液(Vector Laboratories, カリフォルニア、Burlingame在)を用いてマウントした。イメージを、Olympus AX70蛍光顕微鏡及びSpot v2.2.2(Diagnostic Instruments Inc., ミシガン、Sterling Heights在)デジタルイメージングシステムを利用して得た。
ＥｐｈｒｉｎＢ２のＥＰＨＢ４−Ｆｃを用いる免疫蛍光検出を、次のように行なった。４％パラホルムアルデヒド中で固定して２０％ＦＢＳ中でブロックした凍結切片を、５μｇ／ｍｌのＥｐｈＢ４／Ｆｃ(R&D Systems)と１時間室温でインキュベートした。次いで、切片を、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ(Jackson ImmunoResearch Laboratories ペンシルベニア、West Grove在)と室温で１時間インキュベートした。核を、ＤＡＰＩで対比染色して、切片を、上記のようにマウントした。ヒトＦｃ(Jackson ImmunoResearch)を負の対照として利用した。
９）ウエスタンブロット
粗細胞溶解物を、以前に記載されたように(１７)調製し、定量し、分画して、膜にトランスファーした。膜を、ｅｐｈｒｉｎＢ２に対する抗体(１：５０００希釈)との４℃１６時間のインキュベーション前に、５％脱脂乳でブロックした。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化した二次抗体(１：１００，０００希釈)を、１時間２５℃で加えた。これらの膜を、SuperSignal West Femto Maximumセンシティビティー化学発光基質(Pierce, イリノイ、Rockford在)を製造業者の指示に従って利用して発色させた。膜を、Restore(商標)ウエスタンブロットストリッピングバッファー(Pierce)を利用して細片化し、ＥｐｈＢ４又はβ−アクチンを用いて再プローブ検出した。
１０）コード形成アッセイ
マトリゲル(商標)基底膜マトリクス(BD Biosciences Discovery Labware, マサチューセッツ、Bedford在)を、氷上で成長培地と混合して(３：１)、０．５ｍｌの液体を、２４ウェルプレート中に置いた。プレートの３７℃で１５分間のインキュベーションは、マトリゲル(商標)の重合を引き起こした。対数増殖期のＨＵＶＥＣ又はＫＳ−ＳＬＫを、２又は８μｇ／ｍｌのＥｐｈＢ４−ＥＣＤ又はＰＢＳ(対照)で１６時間処理してから、トリプシン処理してマトリゲル(商標)上にプレートした。マトリゲル(商標)上での培養を、組換え融合タンパク質の存在下で６時間続けた。培養物を、４％パラホルムアルデヒド中で３０分間固定し、倒立位相差顕微鏡観察により評価した。
１１）ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡのイン・ビトロ転写による合成
Silencer(商標)ｓｉＲＮＡ構築用キット(Ambion, テキサス、Austin在)を利用して、ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４に対するｓｉＲＮＡを合成した。簡単にいえば、５’−ＡＡジヌクレオチドの下流に１９ｂｐを含む３つの２１ｂｐの標的配列を、ｅｐｈｒｉｎＢ２ｃＤＮＡ(受入れ番号ＮＭ＿００４０９３)中に同定したが、これは、GenBankデータベース中の他の配列に対する有意の相同性を示さなかった。センス及びアンチセンスｓｉＲＮＡの２９量体のＤＮＡオリゴヌクレオチドテンプレートを、USC Norris Microchemical Core Facilityにて合成した。アンチセンステンプレートは標的配列に対応し、その３’末端には８ｂｐの追加(5'-CCTGTCTC-3')が続き、これは、Silencer ＳｉＲＮＡ構築用キットにより提供されたＴ７プロモータープライマーに対して相補的であった。センステンプレートは、５’−ＡＡを含んだが、その後ろには、標的の１９ｂｐの相補配列が続き、その後ろには上記のようにＴ７の８ｂｐの配列が続いた。別々の反応において、これら２つのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドテンプレートは、Ｔ７プロモータープライマーにハイブリダイズした。これらのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの３’末端を、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片により伸長させて、二本鎖ｓｉＲＮＡ転写テンプレートを造った。これらのセンス及びアンチセンスｓｉＲＮＡテンプレートは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより転写され、その結果生成したＲＮＡ転写物は、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを造った。このｄｓＲＮＡは、５’末端一本鎖リーダー配列、１９ｎｔの特異的標的ｄｓＲＮＡ及び３’末端ＵＵよりなった。これらのリーダー配列を、該ｄｓＲＮＡを一本鎖特異的リボヌクレアーゼで消化することにより除去した。ＤＮＡテンプレートを、ＲＮアーゼフリーのデオキシリボヌクレアーゼで処理することにより同時に除去した。
その結果生成したｓｉＲＮＡを、反応物中の過剰のヌクレオチド、短いオリゴマー、タンパク質及び塩類を除去するための硝子繊維フィルター結合により精製した。最終生成物の二本鎖２１量体ｓｉＲＮＡを表５に示す。同様に、ＥｐｈＢ４及びグリーン蛍光タンパク質(ＧＦＰ)ｓｉＲＮＡを合成した。
Figure 0004762889
１２）ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
ＨＵＶＥＣを、フィブロネクチンでコートした８ウェルチャンバースライド上に播種して、一晩、ＥＧＭ−２(Cambrex, メリーランド、Walkersville在)中で成長させた。１６時間後に、培地を、５％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)及びＥＧＭ−２BulletKit 補助剤ｂＦＧＦ、ｈＥＧＦ及びＲ3−ＩＧＦ−Ｉを製造者により与えられた濃度で補ったＥＢＭ−２又は５％ＦＣＳ及び１０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＶＥＧＦ(R&D Systems)を補ったＥＢＭ−２と交換した。３７℃で２時間のインキュベーション後に、これらの細胞を、リポフェクタミン２０００(１μｇ／ｍｌ；Invitrogen)及び Opti-MEM-1 無血清培地(Invitrogen)中の１０ｎＭの特異的ｓｉＲＮＡを利用してトランスフェクトした。２時間の Opti-MEM-1 中でのトランスフェクションの後に、上記のように補足された培地を、適当なウェル中で置き換えた。４８時間後に、これらの細胞を、クリスタルバイオレットで染色して、直ちに、１０倍の倍率で写真を撮影した。
１３）ｅｐｈｒｉｎＢ２レポータープラスミドの構築
ヒトのｅｐｈｒｉｎＢ２の５’隣接ＤＮＡ(−２４９１〜−１１)を、翻訳開始部位に関して、ＢＡＣＰＡＣクローンＲＰ１１−２９７１６(BacPac Resources, Children's Hospital, カリフォルニア、Oakland在)から、標的領域内の広域のＧＣリッチ配列を克服するために、Advantage GC Genomic PCR キット(Clontech カリフォルニア、Palo Alto在)を利用して増幅した。プライマーを、クローニングのためのＭｌｕＩ部位を含むようにデザインした。増幅した生成物を、ＭｌｕＩで消化し、ゲル精製して、ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃ(Promega, ウィスコンシン、Madison在)のマルチクローニング部位内のＭｌｕＩ部位に連結した。その結果生成したクローンの向きを、制限消化分析により確認した。正しいクローンを、ｐＥＦＮＢ２-2491/-11ｌｕｃと命名した。このクローンのＫｐｎＩ又はＳａｃＩによる消化とその後の再環状化は、それぞれ、ｐＥＦＮＢ２-1242/-11ｌｕｃ及びｐＥＦＮＢ２-577/-11ｌｕｃを生じた。一時的トランスフェクションに用いるプラスミドＤＮＡを、Mega Prepキット(QIAGEN, カリフォルニア、Valencia在)を利用して精製した。
１４）一時的トランスフェクション
ＥＧＭ−２培地中に維持したＨＵＶＥＣ細胞(０．８×１０4細胞／ウェル、２４ウェル中)を、０．５μｇ／ウェルのｅｐｈｒｉｎＢ２プロモーター−ルシフェラーゼ構築物及び５０ｎｇ／ウェルのｐＣＥＦＬ又はｐＫＳｖＧＰＣＲ−ＣＥＦＬで、Superfect 試薬(QIAGEN)を製造業者の指示に従って利用して、一時的に、同時トランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に収穫して、ルシフェラーゼ細胞溶解緩衝液(Promega)により溶解させた。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を製造業者の指示に従って利用してアッセイした。ｐＣＥＦＬ−ｖＧＰＣＲは、ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ−βｇａｌ(Invitrogen)からβ−ガラクトシダーゼの発現を誘導するので、ルシフェラーゼをタンパク質に対して標準化した。
１５）ＥｐｈＢ４細胞外ドメイン(ＥＣＤ)タンパク質の構築及び精製
上記(例えば、実施例１)を参照されたい。
実施例７．ＥｐｈＢ４の膀胱癌における発現：治療のための標的候補
図５１は、ＥＰＨＢ４の膀胱癌細胞株における発現(Ａ)及びＥＰＨＢ４発現のＥＧＦＲシグナリング経路による調節(Ｂ)を示している。
図５２は、ｐ５３のトランスフェクションが、５６３７細胞におけるＥＰＨＢ４の発現を阻害することを示している。
図５３は、ＥＰＨＢ４ ｓｉＲＮＡ４７２での処理における膀胱癌細胞株(５６３７)の成長阻害を示している。
図５４は、ＥＰＨＢ４ ｓｉＲＮＡ４７２でトランスフェクトされた５６３７細胞のアポトーシス研究における結果を示している。
図５５は、ＥＰＨＢ４アンチセンスプローブの細胞移動に対する効果を示している。５６３７細胞は、ＥＰＨＢ４ＡＳ１０(１０μＭ)で処理された。
図５６は、ＥＰＨＢ４ ｓｉＲＮＡの細胞浸潤に対する効果を示している。５６３７細胞は、ｓｉＲＮＡ４７２又は対照用ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた。
実施例８．ＥｐｈＢ４遺伝子発現の、ＥｐｈＢ４アンチセンスプローブ及びＲＮＡｉプローブによる阻害
ＥｐｈＢ４を発現する細胞株を、合成ホスホロチオエート改変オリゴヌクレオチドで処理して、２４時間後に収穫した。細胞溶解物を調製して、ＥｐｈＢ４の未処理対照細胞と比較した相対的量について、ウエスタンブロット分析によりプローブ検出した。
細胞増殖の阻害についての研究を、ＥｐｈＢ４を発現することが特性表示されているＨＮＳＣＣ細胞株において行なった。細胞をイン・ビトロで処理して、４８ウェルプレート中で培養(ウェル当たり１０，０００細胞を播種)した。試験化合物を加えて、細胞生存力を３日目に試験した。ＥｐｈＢ４アンチセンスプローブについての結果を、下記の表６にまとめた。ＥｐｈＢ４ ＲＮＡｉプローブについての結果は、下記の表７にまとめた。
Figure 0004762889
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実施例９．ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子発現の、ＥｐｈｒｉｎＢ２アンチセンスプローブ及びＲＮＡｉプローブによる阻害
ＫＳ ＳＬＫ、内因性の高レベルのｅｐｈｒｉｎＢ２を発現する細胞株。細胞生存力を、固定した投与量の各オリゴヌクレオチド(５ＵＭ)を利用して試験した。遺伝子発現のダウンレギュレーションを、完全長のｅｐｈｒｉｎＢ２を安定に発現するように遺伝子工学処理された細胞株２９３を利用して行なった。ＥｐｈｒｉｎＢ２を発現するＫＳ ＫＬＫを利用して、５０ｎＭの固定した投与量で試験したＲＮＡｉプローブに応答しての生存力をも試験した。タンパク質発現レベルを、完全長ＥｐｈｒｉｎＢ２を安定に発現する２９３細胞を利用して、固定した５０ｎＭのＲＮＡｉプローブでの２４時間の処理の後に細胞溶解物において測定した。
ＥｐｈｒｉｎＢ２アンチセンスプローブについての結果を、下記の表８にまとめた。ＥｐｈｒｉｎＢ２ ＲＮＡｉプローブについての結果は、下記の表９にまとめた。
Figure 0004762889
Figure 0004762889
Figure 0004762889
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実施例１０．ＥｐｈＢ４抗体は、腫瘍の成長を阻害する
図５７は、ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体のＧ２５０による及びプルダウンアッセイにおける比較の結果を示している。
図５８は、ＥｐｈＢ４抗体が、マトリゲル及び成長因子の存在下で、ＳＣＣ１５細胞のイン・ビボでの腫瘍成長を阻害することを示している。
ＢａｌｂＣヌードマウスに、２．５×１０6の生存力のある腫瘍細胞ＳＣＣ１５(頭頚部扁平上皮細胞癌株)を皮下注射した。腫瘍を、マトリゲル及び成長因子と予備混合した２．５×１０6の細胞をｎｕ／ｎｕマウスに注射することにより開始し、開始した腫瘍異種移植片に抗体を皮下注射した。注射後１４日で、マウスを切開した。ＳＣＣ１５は、頭頚部扁平上皮細胞癌株であり、Ｂ１６は、メラノーマ細胞株であり、ＭＣＦ−７は、乳癌細胞株である。これらの処理に対する腫瘍の応答を、ＰＢＳ注射を受けた対照処理マウスと比較した。動物を、毎日、腫瘍成長について観察し、皮下の腫瘍を、カリパスを利用して２日ごとに測定した。抗体＃１及び＃２３は、ＳＣＣ１５腫瘍サイズの、対照と比較して有意の退縮を示した(特に、更なる成長因子を加えなかった場合に)。
図５９は、ＥｐｈＢ４抗体が、ＳＣＣ１５頭頚部扁平上皮癌腫瘍型において、アポトーシス、ネクローシス及び減少した血管形成を引き起こすことを示している。
血管形成を、ＣＤ−３１免疫組織化学によって評価した。処理したマウス及び未処理のマウスに由来する腫瘍組織の切片を、ＣＤ３１について染色した。アポトーシスを、免疫組織化学ＴＵＮＮＥＬによって評価し、増殖を、ＢｒｄＵアッセイによって評価した。外科的切除後に、腫瘍を、直ちに、２ｍｍの連続切片にスライスして、標準的手順を利用してパラフィンに包埋した。パラフィン包埋した組織を５μｍに切片化し、ワックスを除去して、組織を再水和した。再水和した組織を、抗原回復溶液中で、マイクロ波照射した。スライドを、ＰＢＳ及び、ＴＵＮＮＥＬ反応混合液(ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びフルオレセイン標識ヌクレオチド溶液)中ですすぎ、ＢｒｄＵを完全に光を遮蔽した加湿チャンバー中で加えた。次いで、このＴＵＮＮＥＬ及びＢｒｄＵ反応混合液を除去して、スライドをすすぎ、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗フルオレセイン抗体を加えた。インキュベーション及びすすぎの後に、３，３’ジアミノベンジジンを加えた。マッソン三色染色及びヘマトキシリン及びエオシンも使用して、これらのスライドを染色して、形態を可視化した。マッソン三色染色は、ネクローシス及び繊維形成を可視化することを可能にした。この腫瘍は、血液の供給を腫瘍／皮膚、筋肉境界から得ている。腫瘍が成長するにつれて、内側の領域は、栄養が涸渇する。これは、ネクローシス(細胞死)へと(好ましくは、腫瘍の中心で)導く。細胞が死んだ後で、(腫瘍)組織は、繊維芽細胞組織で置換される。スライドを、２０倍の倍率の下で、得られたデジタルイメージにより可視化した。投与した各抗体により、ＳＣＣ腫瘍の種々の形態が得られた。Ａｂ＃１は、ネクローシス及び繊維形成の増大を示したが、アポトーシスを示さなかった。Ａｂ＃２３は、アポトーシス、ネクローシス及び繊維形成の増大並びに血管の炎症の減少を示した。Ａｂ＃３５は、ネクローシス及び繊維形成の増大並びにアポトーシスの少しの増加並びに血管の炎症の減少を示した。Ａｂ＃７９は、アポトーシス並びに、ネクローシス及び繊維形成の大幅な増大を示した。Ａｂ＃９１は、アポトーシスの変化を示さなかったが、増殖の増大を示した。そして、Ａｂ＃１３８は、アポトーシス、ネクローシス、繊維形成の増大並びに増殖及び血管の炎症の減少を示した。対照用ＰＢＳで処理した腫瘍は、過大な腫瘍密度及び強い血管形成応答を示した。ＥｐｈＢ４抗体で処理した腫瘍は、腫瘍細胞密度の減少及び生存可能な腫瘍細胞を含む領域での腫瘍血管形成の顕著な阻害並びに腫瘍のネクローシス及びアポトーシスを示した。
図６０は、異種移植片に対する交代の全身投与が、ＳＣＣ１５腫瘍異種移植片において、腫瘍の退縮へと導くことを示している。
隔日のＥｐｈＢ４モノクローナル抗体又は対照としての等容のＰＢＳによる治療を、腫瘍が確立された後、４日目に開始して、１４日間続けた。全身投与を、有意の差異のないＩＰ又はＳＣで行なった。すべての実験を、二重盲検様式で行なって、研究者による偏りを排除した。２週間の治療期間の終りにマウスを犠牲にした。死後直ちに腫瘍を収穫して固定し、免疫組織化学のために処理した。体重１ｋｇ当たり４０ｍｇのＥｐｈＢ４抗体を投与した。ＥｐｈＢ４抗体による治療は、ヒトのＳＣＣ腫瘍の成長を、対照で処理したマウスと比較して有意に阻害した(ｐ＜０．０５)。ＥｐｈＢ４抗体での治療は、腫瘍重量を、対照で処理したマウスと比較して有意に阻害した(ｐ＜０．０５)。
参考文献の援用
本明細書中で言及したすべての刊行物及び特許は、各刊行物又は特許が、特に、個別的に援用されることが示されたかのように、参考として、そっくりそのまま、援用する。
主題の開示の特定の具体例を論じてきたが、上記の明細書は、説明のためのものであって、限定するものではない。この開示の多くの変形が、この明細書及び下記の請求の範囲を見た当業者には、明らかとなろう。この開示の全範囲は、同等物の全範囲を伴う請求の範囲及びかかる変形を伴う明細書を参照して決められるべきである。
Ｂ４ＥＣｖ３タンパク質のアミノ酸配列を示している図である。 Ｂ４ＥＣｖ３ＮＴタンパク質のアミノ酸配列を示している図である。 Ｂ２ＥＣタンパク質のアミノ酸配列を示している図である。 Ｂ４ＥＣｖ３−ＦＣタンパク質のアミノ酸配列を示している図である。 Ｂ２ＥＣ−ＦＣタンパク質のアミノ酸配列を示している図である。 Ｂ４ＥＣ−ＦＣ結合アッセイを示している図である。 Ｂ４ＥＣ−ＦＣ阻害アッセイを示している図である。 Ｂ２ＥＣ−ＦＣ結合アッセイを示している図である。 Ｂ４Ｅｃｖ３に応答してのＨＵＡＥＣの化学走性を示している図である。 Ｂ２ＥＣ−ＦＣに応答してのＨＨＥＣの化学走性を示している図である。 Ｂ２ＥＣに応答してのＨＨＡＥＣの化学走性を示している図である。 ＨＵＡＥＣの細管形成に対するＢ４Ｅｃｖ３の効果を示している図である。 ＨＵＡＥＣの細管形成に対するＢ２ＥＣ−ＦＣの効果を示している図である。 ヒトＥｐｈｒｉｎＢ２構築物の図式表示である。 ヒトＥｐｈＢ４構築物の図式表示である。 組換え可溶性ＥｐｈＢ４ＥＣタンパク質のドメイン構造を示している図である。 ＥｐｈＢ４ＥＣタンパク質の精製及びリガンド結合特性を示している図である。 ＥｐｈＢ４ＥＣタンパク質の精製及びリガンド結合特性を示している図である。 ＥｐｈＢ４ｖ３が化学走性を阻害することを示している図である。 ＥｐｈＢ４ｖ３が、マトリゲル上での細管形成を阻害することを示している図である。 可溶性ＥｐｈＢ４が、ＭＴＳアッセイにより評価して、検出可能な細胞傷害性効果を有しないことを示している図である。 Ｂ４ｖ３が、マトリゲルアッセイにおいて、内皮細胞による浸潤及び細管形成を阻害することを示している図である。 ＥｐｈＢ４由来の組換え可溶性タンパク質の存在下又は非存在下での、ＥｐｈｒｉｎＢ２−Ｆｃ融合物による刺激に応答しての、ＰＣ３細胞中のＥｐｈＢ４レセプターのチロシンリン酸化を示している図である。 可溶性ＥｐｈＢ４ＥＣＤの生存力及び細胞周期に対する効果を示している図である。 Ｂ４ｖ３が、マウス角膜ハイドロンマイクロポケットアッセイにおける新血管新生応答を阻害することを示している図である。 ｓＢ４ｖ３を同時に注射すると、ＳＣＣ１５．Ｂ１６、及びＭＣＦ−７が、マトリゲル及び成長因子の存在下で、これらの細胞のイン・ビボでの腫瘍成長を阻害することを示している図である。 可溶性ＥｐｈＢ４が、３つの腫瘍型、Ｂ１６メラノーマ、ＳＣＣ１５頭頸部癌、及びＭＣＦ−７乳癌におけるアポトーシス、ネクローシス及び減少した血管形成ことを示している図である。 前立腺細胞株におけるＥｐｈＢ４の発現を示している図である。 前立腺癌組織におけるＥｐｈＢ４の発現を示している図である。 前立腺癌細胞におけるＥｐｈＢ４の、腫瘍サプレッサー及びＲＸＲ発現によるダウンレギュレーションを示している図である。 前立腺癌細胞におけるＥｐｈＢ４の、ＥＧＦＲ及びＩＧＦＲ−１によるダウンレギュレーションを示している図である。 特異的ＥｐｈＢ４ ＡＳ−ＯＤＮ及びｓｉＲＮＡの、発現及び前立腺細胞機能に対する効果を示している図である。 ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡ ４７２の、細胞周期及びアポトーシスに対する効果を示している図である。 ＥｐｈＢ４及びＥｐｈｒｉｎＢ２が、中皮腫細胞株において発現されることを、ＲＴ−ＰＣＲ(Ａ)及びウエスタンブロット(Ｂ)によって示している図である。 ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４の発現を、中皮腫細胞におけるイン・シトゥーハイブリダイゼーションによって示している図である。 ＥｐｈＢ４及びｅｐｈｒｉｎＢ２の、中皮腫培養における細胞性発現を示している図である。 ｅｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４の、中皮腫における発現を示している図である。 ＥＰＨＢ４アンチセンスプローブ(Ａ)及びＥＰＨＢ４ ｓｉＲＮＡ(Ｂ)の、Ｈ２８細胞の成長に対する効果を示している図である。 ＥＰＨＢ４アンチセンスプローブ(Ａ)及びＥＰＨＢ４ ｓｉＲＮＡ(Ｂ)の、細胞移動に対する効果を示している図である。 ＥｐｈＢ４が、ＨＮＳＣＣ一次組織及び転移において発現されることを示している図である。 ＥｐｈＢ４が、ＨＮＳＣＣ細胞株で発現され、ＥＧＦにより調節されることを示している図である。 ＥｐｈＢ４のＥＧＦによる調節の機構を示している図である。 特異的ＥｐｈＢ４ ｓｉＲＮＡが、ＥｐｈＢ４発現、細胞の生存力を阻害して、細胞周期の休止を引き起こすことを示している図である。 特異的なＥｐｈＢ４ ＡＳ−ＯＤＮの、ＳＣＣ細胞に対するイン・ビトロの効果を示している図である。 ＥｐｈＢ４ ＡＳ−ＯＤＮが、腫瘍成長をイン・ビボで阻害することを示している図である。 ＥｐｈｒｉｎＢ２が、ＫＳ生検組織において発現されるが、ＥｐｈＢ４は発現されないことを示している図である。 ＨＨＶ−８が、静脈内皮細胞において、動脈マーカーの発現を誘導することを示している図である。 ＨＨＶ−８が、カポジ肉腫細胞における動脈マーカーの発現を誘導することを示している図である。 ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ−Ｃが、ｅｐｈｒｉｎＢ２発現を調節することを示している図である。 特異的ｓｉＲＮＡによるＥｐｈｒｉｎＢ２ノックダウンが、ＶＥＧＦの存在下で成長したが、ＩＧＦ、ＥＧＦ又はｂＦＧＦの存在下では成長しなかったＫＳ細胞及びＨＵＶＥＣにおける生存力を阻害することを示している図である。 可溶性ＥｐｈＢ４が、ＫＳ及びＥＣコード形成及びイン・ビボの血管形成を阻害することを示している図である。 膀胱癌細胞株におけるＥＰＨＢ４の発現(Ａ)、及びＥＧＦＲシグナリング経路によるＥＰＨＢ４発現の調節(Ｂ)を示している図である。 ｐ５３が、５６３７細胞におけるＥＰＨＢ４の発現を阻害することを示している図である。 ＥＰＨＢ４ ｓｉＲＮＡ４７２による治療の際の膀胱癌細胞株(５６３７)の成長阻害を示している図である。 ＥＰＨＢ４ ｓｉＲＮＡ４７２をトランスフェクトした５６３７細胞のアポトーシス研究における結果を示している図である。 ＥＰＨＢ４アンチセンスプローブの、細胞移動に対する効果を示している図である。 ＥＰＨＢ４ ｓｉＲＮＡの、細胞浸潤に対する効果を示している図である。 ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体の、Ｇ２５０による及びプルダウンアッセイにおける比較を示している図である。 ＥｐｈＢ４抗体が、ＳＣＣ１５異種移植片腫瘍の成長を阻害することを示している図である。 ＥｐｈＢ４抗体が、ＳＣＣ１５頭頚部癌において、アポトーシス、ネクローシス及び減少した血管形成を引き起こすことを示している図である。 ＥｐｈＢ４抗体の全身投与が、腫瘍の退行へと導くことを示している図である。 ヒトのＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈＢ４のｃＤＮＡヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈＢ４のｃＤＮＡヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のｃＤＮＡ配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のｃＤＮＡ配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈＢ４のアミノ酸配列を示している図である。 ヒトのＥｐｈｒｉｎＢ２のアミノ酸配列を示している図である。

Claims (37)

  1. 単離されたＲＮＡｉ構築物であって、ＥｐｈＢ４転写物に生理的条件下でハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を低下させる配列番号２８６及び２８７から選択される配列を有するＲＮＡ鎖を含む、当該単離されたＲＮＡｉ構築物。
  2. 生理的条件下で細胞と５マイクロモルの濃度で接触させた場合に、該細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を、５０％以上阻害する、請求項１に記載の単離されたＲＮＡｉ構築物。
  3. 単離されたＲＮＡｉ構築物であって、生理的条件下でＥｐｈｒｉｎＢ２転写物にハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を低下させる配列番号３８３及び３８５から選択される配列を有するＲＮＡ鎖を含む当該単離されたＲＮＡｉ構築物。
  4. ２１〜５０ヌクレオチド長である、請求項１又は３に記載の単離されたＲＮＡｉ構築物。
  5. 一本鎖である、請求項１又は３に記載の単離されたＲＮＡｉ構築物。
  6. 二本鎖である、請求項１又は３に記載の単離されたＲＮＡｉ構築物。
  7. ＲＮＡｉ構築物が少なくとも一つの改変された主鎖又は塩基部分を含む、請求項１又は３に記載の単離されたＲＮＡｉ構築物。
  8. ＲＮＡｉ構築物が、ｄｓＲＮＡである請求項１又は３に記載の単離されたＲＮＡｉ構築物。
  9. ＲＮＡｉ構築物が、ヘアピンＲＮＡである請求項１又は３に記載の単離されたＲＮＡｉ構築物。
  10. ＲＮＡｉ構築物の二本鎖部分が、２１〜２３ヌクレオチド長である、請求項１又は３に記載の単離されたＲＮＡｉ構築物。
  11. 改変されたＲＮＡｉ構築物が、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシルメチルエステル、カーボネート、及びホスフェートトリエステルよりなる群から選択する少なくとも一つのヌクレオチド間結合を有する、請求項７に記載の単離されたＲＮＡｉ構築物。
  12. 改変されたＲＮＡｉ構築物が、少なくとも一つの２’−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドを含む、請求項７に記載の単離されたＲＮＡｉ構築物。
  13. 酵素的核酸である、請求項１又は３に記載の単離されたＲＮＡｉ構築物。
  14. 酵素的核酸が、リボザイムである、請求項１３に記載の単離されたＲＮＡｉ構築物。
  15. 生理的条件下で細胞と５マイクロモルの濃度で接触させた場合に、該細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を、５０％以上阻害する、請求項１又は３に記載の単離されたＲＮＡｉ構築物。
  16. ＲＮＡｉ構築物及び製薬上許容しうるキャリアーを含む医薬組成物であって、該ＲＮＡｉ構築物を、下記よりなる群から選択する、当該医薬組成物：
    (ａ)配列番号２８６及び２８７から選択される配列を含むＲＮＡ鎖を含み、生理的条件下でＥｐｈＢ４転写物にハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を低下させるＲＮＡｉ構築物；及び
    (ｂ)配列番号３８３及び３８５から選択される配列を含むＲＮＡ鎖を含み、生理的条件下でＥｐｈｒｉｎＢ２転写物にハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を低下させるＲＮＡｉ構築物。
  17. 下記の方法において使用する医薬を製造するためのＲＮＡｉ構築物の利用：
    細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を阻害する方法であって、該細胞を、有効量の請求項１に記載のＲＮＡｉ構築物と接触させることを含む当該方法。
  18. 下記の方法において使用する医薬を製造するためのＲＮＡｉ構築物の利用：
    細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を阻害する方法であって、該細胞を、有効量の請求項３に記載のＲＮＡｉ構築物と接触させることを含む当該方法。
  19. 下記の方法において使用する医薬を製造するためのＲＮＡｉ構築物の利用：
    患者における腫瘍の成長速度を低下させる方法であって、該腫瘍の成長速度を低下させるのに十分な量のＲＮＡｉ構築物を投与することを含み、該ＲＮＡｉ構築物を、下記よりなる群から選択する、当該方法：
    (ａ)配列番号２８６及び２８７から選択される配列を有するＲＮＡ鎖を含み、生理的条件下でＥｐｈＢ４転写物にハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を低下させるＲＮＡｉ構築物；及び
    (ｂ)配列番号３８３及び３８５から選択される配列を有するＲＮＡ鎖を含み、生理的条件下でＥｐｈｒｉｎＢ２転写物にハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を低下させるＲＮＡｉ構築物。
  20. 腫瘍が、ＥｐｈＢ４及び／又はＥｐｈｒｉｎＢ２を発現する少なくとも一つの癌細胞を含む、請求項１９に記載の利用。
  21. 下記の方法において使用する医薬を製造するためのＲＮＡｉ構築物の利用：
    癌を患っている患者を治療する方法であって、該患者に、下記よりなる群から選択するＲＮＡｉ構築物を投与することを含む当該方法：
    (ａ)配列番号２８６及び２８７から選択される配列を有するＲＮＡ鎖を含み、生理的条件下でＥｐｈＢ４転写物にハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を低下させるＲＮＡｉ構築物；及び
    (ｂ)配列番号３８３及び３８５から選択される配列を有するＲＮＡ鎖を含み、生理的条件下でＥｐｈｒｉｎＢ２転写物にハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を低下させるＲＮＡｉ構築物。
  22. ＲＮＡｉ構築物を、製薬上許容しうるキャリアーと配合する、請求項２１に記載の利用。
  23. 癌細胞が、匹敵する組織からの非癌性細胞と比較して一層高レベルのＥｐｈＢ４を発現する、請求項２１に記載の利用。
  24. 癌細胞が、匹敵する組織からの非癌性細胞と比較して一層高レベルのＥｐｈｒｉｎＢ２を発現する、請求項２１に記載の利用。
  25. 腫瘍が、転移性腫瘍である、請求項２１に記載の利用。
  26. 腫瘍を、大腸癌、乳癌、中皮腫、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、及び白血病よりなる群から選択する、請求項２１に記載の利用。
  27. 腫瘍が、血管形成依存性腫瘍である、請求項２１に記載の利用。
  28. 腫瘍が、血管形成非依存性腫瘍である、請求項２１に記載の利用。
  29. ＲＮＡｉ構築物と相加的又は相乗的様式で癌細胞を阻害する少なくとも一種の追加の抗癌化学療法剤を更に含んでいる、請求項２１に記載の利用。
  30. 下記の方法において使用する医薬を製造するためのＲＮＡｉ構築物の利用：
    血管形成関連疾患を患っている患者を治療する方法であって、該患者に、血管形成を阻害するのに十分な量のＲＮＡｉ構築物を投与することを含み、該ＲＮＡｉ構築物を下記よりなる群から選択する当該方法：
    (ａ)配列番号２８６及び２８７から選択される配列を有するＲＮＡ鎖を含み、生理的条件下でＥｐｈＢ４転写物にハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を低下させるＲＮＡｉ構築物；及び
    (ｂ)配列番号３８３及び３８５から選択される配列を有するＲＮＡ鎖を含み、生理的条件下でＥｐｈｒｉｎＢ２転写物にハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を低下させるＲＮＡｉ構築物。
  31. ＲＮＡｉ構築物を、製薬上許容しうるキャリアーと配合する、請求項３０に記載の利用。
  32. 血管形成関連疾患を、血管形成依存性の癌、良性腫瘍、炎症性疾患、慢性関節リウマチ、乾癬、眼の血管形成性疾患、オスラー−ウェバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管新生、毛細管拡張症、血友病患者関節、血管線維腫、傷肉芽化、傷の治癒、毛細血管拡張性乾癬硬皮症、化膿性肉芽腫、冠状動脈側枝、虚血肢血管形成、ルベオーシス、関節炎、糖尿病性新血管新生、骨折、脈管形成、及び造血よりなる群から選択する、請求項３０に記載の利用。
  33. ＲＮＡｉ構築物と相加的又は相乗的様式で血管形成を阻害する少なくとも一種の追加の抗血管形成剤を使用するための、請求項３０に記載の利用。
  34. 癌を治療するための医薬の製造における、請求項１又は３に記載のＲＮＡｉ構築物の利用。
  35. 血管形成関連疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１又は３に記載のＲＮＡｉ構築物の利用。
  36. 下記の方法において使用する医薬を製造するためのＲＮＡｉ構築物の利用：
    癌を患っている患者を治療する方法であって、下記を含む当該方法：
    (ａ)ＥｐｈＢ４及び／又はＥｐｈｒｉｎＢ２を発現する複数の癌細胞を有する腫瘍を患者において同定し；そして
    (ｂ)該患者に、下記よりなる群から選択するＲＮＡｉ構築物を投与する：
    (ｉ)配列番号２８６及び２８７から選択される配列を有するＲＮＡ鎖を含み、生理的条件下でＥｐｈＢ４転写物にハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を低下させるＲＮＡｉ構築物；及び
    (ｉｉ)配列番号３８３及び３８５から選択される配列を有するＲＮＡ鎖を含み、生理的条件下でＥｐｈｒｉｎＢ２転写物にハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を低下させるＲＮＡｉ構築物。
  37. 下記の方法において使用する医薬を製造するためのＲＮＡｉ構築物の利用：
    癌を患っている患者を治療する方法であって、下記を含む当該方法：
    (ａ)ＥｐｈＢ４及び／又はＥｐｈｒｉｎＢ２の遺伝子の遺伝子増幅を有する複数の癌細胞を有する腫瘍を患者において同定し；そして
    (ｂ)該患者に、下記よりなる群から選択するＲＮＡｉ構築物を投与する：
    (ｉ)配列番号２８６及び２８７から選択される配列を含むＲＮＡ鎖を含み、生理的条件下でＥｐｈＢ４転写物にハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈＢ４の発現を低下させるＲＮＡｉ構築物；及び
    (ｉｉ)配列番号３８３及び３８５から選択される配列を含むＲＮＡ鎖を含み、生理的条件下でＥｐｈｒｉｎＢ２転写物にハイブリダイズして、細胞におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の発現を低下させるＲＮＡｉ構築物。
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