JPH08505765A - Ｅｃｋ受容体リガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ｅｃｋ受容体に結合するリガンドを開示する。より特定的には、ｅｃｋ受容体に特異的に結合するポリペプチド、ｅｃｋ受容体結合タンパク質、即ちＥＢＰ、及び前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を開示する。ｅｃｋ受容体リガンド及び可溶性ｅｃｋ受容体を使用する治療方法、並びに前記リガンド及び受容体を含む医薬組成物も開示する。未精製試料中で受容体結合活性を検出するための迅速且つ高感度の方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＥＣＫ受容体リガンド 本発明は、一般的にはｅｃｋ受容体のリガンドに関し、特定的にはｅｃｋ受容 体結合タンパク質（ＥＢＰ）と称するポリペプチドリガンドに関する。本発明は 、ｅｃｋ受容体リガンド及び可溶性ｅｃｋ受容体を用いる治療方法と、これらの 物質を含む医薬組成物とをも包含する。未精製試料中の受容体結合活性を検出す るための迅速且つ高感度の方法も開示する。発明の背景 ペプチド増殖因子及び分化因子は、細胞表面の受容体との特異的相互作用によ り、標的細胞内で応答を誘起する。 増殖因子受容体は典型的には、明瞭に区別された細胞外領域、トランスメンブラ ン領域及び細胞内領域を有する膜糖タンパク質である。これらの領域の構造的分 離は機能に対応する（Ｕｌｔｒｉｃｈら，Ｃｅｌｌ ６１，２０３（１９９０） ）。即ち、細胞外領域はリガンド結合とリガンド仲介受容体二量体化とに関与す ると思われ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，８２１（１９ ９１）；Ｌｅｖら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１ ０８６６（１９９２））、該受容体の細胞内領域又は補助エレメント（ａｃｃｅ ｓｓｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）の細胞内領域（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２５７，３７９（１９９２））はシグナル形質導入に関与する。増殖因 子活性の特異性の大部分は、同系受容体の細胞外領域上の結合部位との相互作用 によって決定される。ある受容体の細胞外領域と別の受容体の細胞内領域とを含 むように作られたキメラ受容体は、細胞外成分のリガンド特異性を保持する（Ｌ ｅｈｖａｓｌａｉｈｏら，ＥＭＢＯ Ｊ．８，１５９（１９８９））。このよう なキメラ受容体によって活性化される下流シグナリング経路は、細胞内成分によ って活性化される経路に対応する。多くの場合、細胞外成分のみからなる可溶性 形態の受容体がリガンド結合活性を保持する（Ｌｅｖら，前出文献；Ｄｕｂａｎ ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，４１３（１９９１））。切頭受容体が、 血清中（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ ＦＡＳＥＢ Ｊ．５，２５６７（ １９９１））、細胞培養上清中（Ｚａｂｒｅｃｋｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ．２６６，１７１６（１９９１））で同定され、組換え技術を介して産生された （Ｌｅｖら、前出文献、Ｄｕｂａｎら、前 出文献）。 最近の核酸配列決定及び増幅技術の進歩により、それまで同定されていなかっ た増殖因子受容体をコードする遺伝子が益々多く同定されるようになった（Ｗｉ ｌｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ３６，１６０３（１ ９８９）；Ｌａｉら，Ｎｅｕｒｏｎ ６，６９１（１９９１））。その結果、孤 立受容体（ｏｒｐｈａｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）の生物学的役割を決定できる方法、 例えばこれらの受容体のリガンドを同定できる方法を開発する必要がでてきた（ ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，１９０６（１９９２））。受 容体親和性技術はこの問題を解決する方法の一つである。この技術は、新規の増 殖因子を単離するための既存の方法を強化し得る。なぜなら、生物学的応答が希 薄又は不明確な時にリガンドの検出を可能にするからである。 最近の報告では、受容体の細胞外領域を増殖因子特異的親和性試薬として利用 できることが示唆された。Ｂａｉｌｏｎらは（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５ ，１１９５（１９８７））、ＩＬ−２受容体αサブユニットの細胞外領域をクロ マトグラフィー媒体上に固定化して、組換えＩ Ｌ−２の精製に使用できることを明らかにした。また、ｋｉｔ細胞外領域とアル カリホスファターゼ酵素タグとの遺伝子的融合が、受容体の細胞結合リガンドの 同定を可能にした（Ｆｌａｎａｇａｎら、Ｃｅｌｌ ６３、１８５（１９９０） ）。Ｌｕｐｕら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、２２ ８７（１９９２））は、ｅｒｂＢ−２遺伝子産物の固定化細胞外領域に結合する 活性物質のアフィニティ精製を報告している。 最初にヒト上皮細胞ライブラリーからのｃＤＮＡクローニングによって同定さ れたｅｃｋ遺伝子は、１３０ｋＤａ受容体様タンパク質−チロシンキナーゼ（ｐ １３０^eck）をコードする（Ｌｉｎｄｂｅｒｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ ．１０，６３１６（１９９０））。組織及び細胞系の免疫組織化学的及びｍＲＮ Ａスクリーニングは、ｅｃｋ発現が上皮由来細胞内で最大であることを示唆して いる。別の受容体様タンパク質−チロシンキナーゼをコードする遺伝子との類似 性から、ｅｃｋは原腫瘍形成遺伝子であり得、従って発癌において何らかの役割 を有し得る。ｅｃｋのこのような潜在的役割は、ヒトの癌に上皮細胞が頻繁に関 与していることを考えれば、より確実なことである。受 容体タンパク質キナーゼは通常、一つ以上のリガンドとの相互作用を介して活性 化される。しかしながら、ｐ１３０^eckを活性化することができるリガンドは未 だ報告されていない。このようなリガンドの同定は、ある種のヒトの癌の発生に おけるｐ１３０^eckの役割を決定する上で重要であり得る。 そこで本発明は、ｐ１３０^eckのリガンドを一つ以上同定することを目的とす る。上皮細胞から癌状態への形質変化（トランスホーメーション）でｐ１３０^{ec k} が役割を果たすという可能性は、受容体の活性化に関与するリガンドの同定が 、ある種の上皮細胞由来悪性腫瘍の治療に寄与し得ることを示唆するものである 。 発明の概要 本発明は、一般的にはｅｃｋ受容体リガンドに関する。より特定的には、本明 細書でｅｃｋ受容体結合タンパク質（ＥＢＰ）と称する、ｅｃｋ受容体に特異的 に結合するポリペプチドを開示する。ＥＢＰは、固定化細胞外ｅｃｋ受容体を用 いるアフィニティクロマトグラフィーによって同定され単離された。本発明のＥ ＢＰはまた、結合の際に受容体のリン酸化を誘起し得、その結果標的細胞の生理 機能、 例えば細胞の増殖及び／又は分化の変化が始まり得る。ＥＢＰは、配列番号１に 示すものと実質的に同じアミノ酸配列を有する。好ましい実施態様では、ＥＢＰ は配列番号１のアミノ酸配列の一部を有する。例えば、ＥＢＰは位置１５０で終 結するアミノ酸配列を有する。 ｅｃｋ受容体に特異的に結合するポリペプチドであって、配列番号１に示すも のと実質的に同じアミノ酸配列を有し且つ位置−１にメチオニン残基を有するポ リペプチドも本発明に包含される。該ポリペプチドは例えば［Ｍｅｔ^-1］ＥＢＰ^1-150 又は［Ｍｅｔ^-1］ＥＢＰ^1-159である。本発明では該ポリペプチドをコード するＤＮＡ配列も提供する。ＥＢＰは、配列番号１のアミノ酸配列の一部を有す る類似体でもあり得る。この種の類似体の具体例としては、位置１６７、１７１ ７又は１８０で終結するＥＢＰが挙げられる。 本発明は、外来ＤＮＡ配列の原核生物又は真核生物発現産物としてのＥＢＰも 提供する。即ち、ｅｃｋ受容体結合タンパク質を組換えＤＮＡ法で誘導する。 受容体の固定化リガンド結合領域への結合をモニターすることにより、未精製 試料中の受容体結合活性を検出する 方法も本発明に包含される。 治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドを含む医薬組成物も開示する。ある種の 癌、特に上皮細胞の増殖を特徴とする癌の治療におけるｅｃｋ受容体リガンドの 使用も本発明に包含される。ｅｃｋ受容体リガンドは、治癒を促進するための創 傷の治療、造血機能の向上、並びに肝細胞及び結腸腺（ｃｏｌｏｎ ｃｒｙｐｔ ）細胞の増殖剌激にも使用し得る。 ｅｃｋ受容体リガンドの生物学的作用を調節するための治療上有効量のリガン ドアンタゴニスト又は可溶性ｅｃｋ受容体の使用も本発明に包含される。このよ うな治療方法は、癌の治療及び炎症の抑制に有用である。 図面の簡単な説明 第１図Ａは、固定化ｅｃｋ−ｘアフィニティクロマトグラフィーのＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ分析の説明図である。ＨＣＴ−８細胞由来のならし培地を濃縮し、透析濾 過し（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）、固定化ｅｃｋ−ｘの１ｍｌカラム（ゲル１ｍ 当たり１ｍｇのｅｃｋ−ｘ）に充填した。必要であれば０．０２％ＳＤＳの存在 下で試料を濃縮した。等価の元の量を括弧内に示す。レーン１、カラムロード（ ２ ０ｍｌ）。レーン２、非結合画分（２０ｍｌ）。レーン３、ＰＢＳ洗浄（５０ｍ ｌ）。レーン４、ｐＨ４．０溶離、画分１（２００ｍｌ）。レーン５、ｐＨ４． ０溶離、画分２（２００ｍｌ）。レーン６、ｐＨ４．０溶離、画分３（２００ｍ ｌ）。 第１図Ｂは、固定化ｅｃｋ−ｘアフィニティクロマトグラフィーのＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ分析の説明図である。ＥＢＰ遺伝子をトランスフェクションしたＣＨＯ細 胞に由来する細胞上清を第１図Ａの説明文に記載のように処理し分析した。 第２図は、ＨＣＴ−８細胞系由来の精製ＥＢＰのゲル濾過分析の説明図である 。固定化ｅｃｋ−ｘ受容体アフィニティクロマトグラフィーで精製したＥＢＰを ５０ｐｇ／ｍｌ ＢＳＡで検量し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムに注入した。 画分をＢＩＡｃｏｒｅによりｅｃｋ−ｘ結合活性について検査した。 第３図は、ＥＢＰ ｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞に由来す るＥＢＰのＱ−セファロースクロマトグラフィーの説明図である。試料をＳＤＳ −ＰＡＧＥで分析し、抗ＥＢＰ抗体でプローブした。 第４図は、ホスホリパーゼＣ処理によるＣＨＯ細胞表面からの膜結合ＥＢＰ放 出の分析の説明図である。「−」はホスホリパーゼＣの不在下でのインキュベー ションを示し、「＋」はホスホリパーゼＣの存在下でのインキュベーションを示 す。インキュベーション時間は０、５及び１０分であった。 第５図は、ｅｃｋを発現するＣＨＯ １９．３２細胞への¹²⁵１−ｒＥＢＰの 化学的架橋の説明図である。細胞は実施例５に記載のように処理した。レーン１ 、¹²⁵Ｉ−ｒＥＢＰ＋ＣＨＯ １９．３２。レーン２、¹²⁵Ｉ−ｒＥＢＰ＋ＣＨＯ ｄ−（非トランスフェクション）。レーン３、¹²⁵Ｉ−ｒＥＢＰ＋ＣＨＯ １９ ．３２、架橋剤無添加。レーン４、¹²⁵Ｉ−ｒＥＢＰ＋ＣＨＯ １９．３２＋５ ０Ｘ非標識ｒＥＢＰ。 第６図は、精製ｒＥＢＰで処理したＬＩＭ ２４０５細胞内のｅｃｋ受容体チ ロシンキナーゼの活性化の説明図である。血清飢餓（ｓｅｒｕｍ−ｓｔａｒｖｅ ｄ）ＬＩＭ２４０５細胞を、精製ｒＥＢＰ（ＣＨＯｄ−／ＥＢＰ）濃度を増加し ながら３７℃で１０〜１５分間処理した。処理細胞を溶解し、次いで抗ｅｃｋ Ｃ末端抗体で免疫沈降さ せた。免疫沈降物を二つの同等試料に分け、平行して７．５％ＳＤＳポリアクリ ルアミドゲル中で分離させた。ゲルをメンブラン上にブロットし、次いでモノク ローナル抗ホスホチロシン抗体（上方パネル）又は抗ｅｃｋ Ｃ末端（下方パネ ル）のいずれかでプローブした。ｅｃｋポリペプチドの移動は矢印で示す。 第７図は、ＢＩＡｃｏｒｅで測定した、固定化ｅｃｋ受容体への種々の洗剤配 合物中のＣＨＯ由来ＥＢＰの結合を示す説明図である。精製ＥＢＰを洗剤の存在 下又は不在下でＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌに希釈し、３℃で２時間インキュベー トした。タンパク質試料を図面に記載の濃度に希釈し、ｅｃｋ受容体結合を調べ た。 第８図は、ＥＢＰを単独で存在させた場合、及びＩＬ−３、エリスロポエチン 又はＧＭ−ＣＳＦと組合わせて存在させた場合の、骨髄培養物中のＣＦＵ−Ｃ及 びＣＦＵ−Ｍｋ形成の説明図である。 第９図は、ＥＢＰ、酸性ＦＧＦ又はＫＧＦの存在下での肝細胞培養物中の³Ｈ −チミジンの取込みを示す説明図である。 発明の詳細な説明 本発明は、前出のＬｉｎｄｂｅｒｇらによって同定された１３０ｋＤａタンパ ク質チロシンキナーゼであるｅｃｋ受容体に結合するリガンドに関する。ｅｃｋ 受容体リガンドは、タンパク質−チロシンキナーゼ触媒領域による自己リン酸化 （ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を誘起することによって受容体を 活性化し得る。タンパク質−チロシンキナーゼは、細胞の増殖及び分化を調節す るシグナル形質導入経路の一部分である。従って、ｅｃｋ受容体のタンパク質− チロシンキナーゼ活性を活性化することができるリガンドは、受容体を発現する 細胞の増殖及び分化を調節する上で重要と思われる。ｅｃｋ受容体リガンドは、 ｅｃｋ受容体に結合する、及び／又はｅｃｋ受容体を活性化するポリペプチド、 ペプチド又は非タンパク質分子であり得る。 本発明は、ｅｃｋ受容体に特異的に結合する新規のポリペプチドを提供する。 これらのポリペプチドはｅｃｋ結合タンパク質、又はＥＢＰと称する。ＥＢＰは 、ｅｃｋ受容体細胞外領域（ｅｃｋ−ｘ）をアフィニティ試薬として用いる受容 体アフィニティクロマトグラフィーによって、ＳＫ−ＢＲ−３及びＨＣＴ−８細 胞系のならし培地から単離 された。ｅｃｋ−ｘ遺伝子の構築、並びにｅｃｋ−ｘの発現及び精製は実施例１ で説明する。固定化ｅｃｋ−ｘ上のｅｃｋ結合タンパク質の精製は実施例３Ａで 説明する。 ＨＣＴ−８細胞系由来のＥＢＰは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって明らかにされる ように、２１〜２７ｋＤａ範囲の幾つかの異なる分子量形態で存在する（第１図 Ａ）。２１〜２７ｋＤａ範囲のＥＢＰのＮ末端配列決定で、単一の配列が明らか になった（実施例３Ｂ）。炭水化物鎖を酵素で除去した後、１７〜１９ｋＤａ範 囲の分子種の混合物が観察された。これは、タンパク質の代替（ａｌｔｅｒｉｎ ａｔｉｖｅ）翻訳後プロセシングの結果、種々の形態が発生し得ることを示唆す るものである。 ＳＫ−ＢＲ−３由来ＥＢＰのＮ末端配列は、Ｂ６１遺伝子の発現から予測され たＮ末端アミノ酸配列と同じであった（Ｈｏｌｚｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０、５８３０（１９９０）；ＰＣＴ出願第ＷＯ ９２／０７０９４ 号）。Ｂ６１遺伝子は最初、示差的ハイブリダイゼーション法（ｄｉｆｆｅｒｅ ｎｔｉａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）により即時型初期応答遺伝子として 同定され、その発現は、腫瘍壊死因子−αでの処理により、培 養したヒト血管内皮細胞内で誘発された。コードされたタンパク質は、ＥＢＰ遺 伝子の配列に基づいて、成熟形態で１８７個のアミノ酸を有すると予測された。 ＥＢＰによりコードされたタンパク質の単離及び特徴分析は、これまで報告され ていない。ＥＢＰタンパク質は炎症のサイトカイン誘発マーカーとして機能し、 従って切迫した炎症応答を検出するための診断試薬として有用であることが提示 された（ＰＣＴ出願ＷＯ第９２／０７０９４号）。 実施例３Ｂで決定したＮ末端配列を有するＥＢＰコーディングｃＤＮＡをクロ ーニングし配列決定すると、予想通り、Ｂ６１遺伝子（前出のＨｏｌｚｍａｎら ）と同じであることが判明した。Ｈｏｌｚｍａｎらによって報告されたＢ６１ ＤＮＡ配列は配列番号１１に示す。ＥＢＰ（又はＥＢＰ遺伝子）は、実施例４に 記載のように、ＣＨＯ細胞及び大腸菌中で発現された。ＣＨＯ細胞内では、ＥＢ Ｐ遺伝子によって、異なる分子量を有する二つ以上のポリペプチドが発現された 。ＣＨＯ細胞ＥＢＰのＣ末端配列決定の結果、アミノ酸残基１５０個のポリペプ チドを示す配列−ｌｙｓ−ａｒｇ−ｌｅｕ−ａｌａ−ａｌａ−ＣＯＯＨのみが明 らかにされた。このポリペプチドはＥＢＰ^1-150と称する。 予測されたＥＢＰタンパク質に対応するアミノ酸１８７個のポリペプチドは、存 在したとしても、極めて少量のＣＨＯ細胞発現産物を表す。大腸菌内でのＥＢＰ 遺伝子（リーダー配列を欠く）の発現の結果、完全長タンパク質に関して予測さ れたＣ末端配列を有する単一の産物がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に生じた。アミノ末端 にメチオニン残基を有するこのポリペプチドは［ｍｅｔ^-1］ＥＢＰ^1-187と称し 、Ｎ末端ｍｅｔを除いて、予測されたＥＢＰタンパク質と同じアミノ酸配列を有 する。 下記の実験により、ＣＨＯ細胞由来ｒＥＢＰはｅｃｋ受容体と相互作用するこ とが判明した（実施例５も参照）：１）ｅｃｋ受容体を自然に発現する結腸癌細 胞、又はｅｃｋ遺伝子でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞へのＣＨＯ ｒＥ ＢＰの架橋；２）結腸癌細胞上のｅｃｋ受容体へのＣＨＯ ｒＥＢＰの平衡結合 の検査；並びに３）結腸癌細胞上のｅｃｋ受容体リン酸化の剌激。ＣＨＯ ｒＥ ＢＰによる受容体リン酸化の誘発は、該リガンドが、ｅｃｋ受容体表示細胞内で 生物学的応答（例えば増殖又は分化）に作用する能力を有し得ることを意味する 。 明らかに、ＥＢＰは、一つ以上が生物学的に活性であり 得る多くの異なる分子量形態で発現され得る。第１図Ａ及び第１図Ｂに示すよう に、ヒト細胞系及びＥＢＰ遺伝子トランスフェクション宿主細胞によって種々の 形態のＥＢＰが自然に産生される。第３図に示すように、トランスフェクション ＣＨＯ細胞由来のＥＢＰは、２２ｋＤａ（多量）及び２４ｋＤａ（少量）という 二つの異なる分子量形態で単離された。これらの異なる形態の特徴を調べた結果 、アミノ酸１５０個及び１６５個の二つの異なるＥＢＰが明らかになった。これ らはそれぞれＥＢＰ^1-159及びＥＢＰ^1-159と称する。ＥＢＰトランスフェクショ ンＣＨＯ細胞系をホスホイノシトール−ホスホリパーゼＣで処理すると、可溶性 ＥＢＰが放出される。これは、糖脂質形態のＥＢＰを強く示唆するものである。 単離された２７ｋＤａ形態のＥＢＰはホスホリパーゼＤ消化を受け易い。これは 更に、これらの形態が糖リン脂質結合（ｇｌｙｃｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ− ａｎｃｈｏｒｅｄ）ＥＢＰの可溶化形態であることを示唆するものである。 本発明は、ｅｃｋ受容体に特異的に結合する活性を有し、配列番号１に示すも のと実質的に同じアミノ酸配列を有するＥＢＰを提供する。本明細書中の「実質 的に同じアミノ 酸配列」という用語は、結果として得られるポリペプチドがｅｃｋ受容体に特異 的に結合するような、配列番号１のアミノ酸の欠失又は置換を意味する。前述の ように、ＥＢＰはｅｃｋ受容体のリン酸化も誘起する。しかしながら、本発明は 、ｅｃｋ受容体に結合し、受容体のリン酸化を誘発し得るかもしくは誘発し得な いポリペプチドを包含する。好ましい実施態様では、ＥＢＰは配列番号１に示す アミノ酸配列の一部を有する。例えば、ＥＢＰは位置１５０で終結する配列番号 １に示すようなアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１に示すものと実質的に 同じアミノ酸配列を有する。ＥＢＰは好ましくはＥ^1-150である。即ち、配列番 号１の位置＋１〜１５０のアミノ酸配列を有する。 配列番号１と実質的に同じアミノ酸配列を有し、且つ位置−１にメチオニン残 基を有するＥＢＰも本発明に包含される。具体例としては［Ｍｅｔ^-1］ＥＢＰ^{1- 150} 及び［Ｍｅｔ^-1］ＥＢＰ^1-159が挙げられる。本発明は、これらのＥＢＰをコ ードするＤＮＡ配列も提供する。配列番号１のアミノ酸残基＋１〜１５０をコー ドする切頭ＤＮＡ配列を構築し、大腸菌内で発現させた。得られたタンパク質［ Ｍｅｔ^-1］ＥＢＰ^1-150はｅｃｋ受容体に結合し、受容体の リン酸化を誘起する（実施例６）。 本発明は、配列番号１のアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドのフ ラグメント及び類似体であって、ｅｃｋ受容体に結合するフラグメント及び類似 体と、これらのフラグメント及び類似体をコードするＤＮＡ配列とをも包含する 。例えば、配列番号１に示すようなポリペプチドのＮ末端又はＣ末端からの欠失 及び内部領域からの欠失を有するフラグメントが包含される。ＥＢＰフラグメン トの具体例としては、実施例５に記載のＥＢＰ^1-167、ＥＢＰ^1-171及びＥＢＰ^{1- 180} が挙げられる。類似体としては、前記ポリペプチド中の一つ以上の部位での アミノ酸置換が挙げられる。本発明のフラグメント及び類似体は、当業者に公知 の組換えＤＮＡ技術によって容易に構築される。結果として得られるフラグメン ト及び類似体の生物学的活性は、ｅｃｋ可溶性受容体への結合、又は細胞表面上 のｅｃｋ受容体への結合と、ｅｃｋ受容体のリン酸化の誘起とによって容易に検 査できる。 本発明は、外来ＤＮＡ配列の原核生物又は真核生物発現産物であることを特徴 とするＥＢＰ、即ち組換えＥＢＰであるＥＢＰも包含する。外来ＤＮＡ配列はｃ ＤＮＡ、ゲノ ム又は合成ＤＮＡ配列であり得る。ＥＢＰは、細菌、酵母、植物、昆虫、又は培 養中もしくはトランスジェニック動物の哺乳動物細胞内で発現され得る。種々の 宿主細胞内でのＥＢＰの発現に適したＤＮＡベクターは当業者に公知である。こ の種のベクターの具体例としては、ＣＨＯ Ｄ−細胞内でのＥＢＰ遺伝子発現用 のｐＤＳＲα２、及び大腸菌内でのＥＢＰ遺伝子発現用のｐＣＦＭ１１５６が挙 げられる。 大腸菌内でのＥＢＰ発現の結果、不溶性封入体が形成される。生物学的に活性 なＥＢＰの回収には、ＥＢＰ凝集体の可溶化と、それに次ぐ可溶化タンパク質の 再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）とが必要とされる。実施例４Ｃは、ｅｃｋ −ｘ結合及びｅｃｋリン酸化において活性なＥＢＰを与える大腸菌由来ＥＢＰの 再折りたたみ手順を記述している。ＥＢＰ再折りたたみ手順は、再生したタンパ ク質の活性を増加させ且つ活性ＥＢＰの収率を増加させるように改変し得る。こ のような改変には、封入体の可溶化に使用する変性剤の変更（例えば尿素に代え て塩化グアニジニウムを使用する）、酸化剤の変更（酸化剤は酸化型及び還元型 グルタチオンのような酸化還元対を含み得る）、又は変 性剤からの希釈プロトコルの変更（例えば、ＥＢＰを異なるタンパク質濃度で、 変更したｐＨの緩衝液を含む洗剤中に希釈し得る）が含まれる。 本発明は、例えばならし培地のような未精製試料中に存在する、受容体に結合 することができるリガンドの検出方法も提供する。この方法は、ａ）受容体の精 製リガンド結合領域を固定化し、ｂ）固定化受容体をリガンド含有ならし培地と 接触させ、ｃ）表面プラスモン共鳴検出システムにより固定化受容体へのリガン ドの結合をモニターするステップを含む。 実施例２に記載のように、この方法は細胞上清中のｅｃｋ受容体結合活性に関 する迅速且つ高感度のスクリーニングを提供する。このスクリーニングの結果は 表１に示す。この方法はｅｃｋ結合活性の検出に使用されるが、一般的には任意 の受容体−リガンド相互作用に適用し得る。受容体結合タンパク質の単離のため には、受容体の任意のリガンド結合領域を固定化し得る。好ましい実施態様では 、リガンド結合領域が、結合に適した細胞外領域又はそのフラグメントもしくは 類似体である。本発明の方法は、細胞上清のスクリーニング以外に、受容体に結 合するランダム配 列ペプチドの混合物のスクリーニングにも使用し得る。 本発明は、ｅｃｋ受容体の内在性酵素活性を変化させる方法を初めて提供する 。この方法は、ｅｃｋ受容体に対するリガンドを、前記受容体の酵素活性を調節 するのに効果的な量で哺乳動物に投与することからなる。ｅｃｋ受容体酵素活性 は、分化、増殖及び代謝を含む細胞機能を調節する。好ましい実施態様では、Ｅ ＢＰ又はそのフラグメントもしくは類似体が前記リガンドである。しかしながら 、別のリガンド、例えば、ＥＢＰに関係のないポリペプチド、又はペプチド及び 非タンパク質有機分子もｅｃｋ受容体の活性を調節するために使用し得る。 本発明は、ｅｃｋ受容体の活性を調節する化合物の同定方法も包含する。この 方法は、ａ）受容体を表示する細胞を、受容体−リガンド複合体を形成し且つシ グナル形質導入を誘起するのに十分な時間にわたって既知のリガンドに暴露し、 ｂ）細胞内の活性の程度を測定し、ｃ）測定した活性を、リガンドに暴露してい ない細胞内の活性と比較するステップを含む。ｅｃｋ受容体の活性は、標的細胞 の増殖、分化又は代謝の変化によって検出し得る。造血前駆細胞、結腸腺細胞及 び肝細胞上のｅｃｋ受容体活性を調節す る方法は実施例９で説明する。 本発明は、ｅｃｋ受容体とＥＢＰのようなリガンドとの相互作用の結果得られ る単離ｅｃｋ受容体−リガンド複合体も包含する。前記相互作用は、受容体の活 性化と、受容体担持細胞の生理学的状態を変化させるシグナルの形質導入とを生 起させ得る。好ましくは、リガンドが標的細胞の増殖を刺激する増殖因子として 作用する。あるいは、リガンド結合がｅｃｋ受容体を活性化し得ない。その場合 は、リガンドが、受容体を活性化し且つシグナル形質導入を誘起する別の分子の アンタゴニストとして作用し得る。 ｅｃｋ受容体は、有意な量の上皮細胞を含む組織（例えば肺及び腸）並びに上 皮細胞由来の細胞系内（Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、前出文献）で主に発現される。ｅ ｃｋ受容体のリガンドは、該受容体を発現する細胞の増殖又は分化を剌激し得る 。ｅｃｋ受容体担持細胞の分化を誘起するリガンドは、ある種の癌、特に上皮細 胞の増殖の結果生じた癌の治療に有用であり得る。ｅｃｋ受容体リガンドは癌の 治療のために、単独で、又は標準的化学療法もしくは放射線療法と組合わせて使 用し得る。 ＥＢＰとｅｃｋ受容体との相互作用は、細胞増殖の刺激 を介する癌状態の発生に関与し得、又は細胞の移動性及び接着性を剌激すること により癌転移を促進し得る。ＥＢＰの生物学的作用を変化させるために使用し得 る手法は幾つか存在する。ｅｃｋ受容体に結合するがこれを活性化することはな いＥＢＰのフラグメント又は類似体は、ＥＢＰアンタゴニストとして有用である 。ｅｃｋ受容体に対する親和性を有するＥＢＰアンタゴニストの投与は、循環Ｅ ＢＰによる受容体の結合及び活性化を抑止する。可溶性ｅｃｋ受容体の投与も、 ＥＢＰの生物学的効果を相殺するために使用し得る。可溶性ｅｃｋ受容体は、Ｅ ＢＰとの結合に関して細胞表面受容体と競合し、それによってＥＢＰによるｅｃ ｋ受容体の活性化の程度を低下させる。治療用途に適した可溶性ｅｃｋ受容体と しては、実施例１に記載の受容体タンパク質、並びにＥＢＰに結合する該受容体 タンパク質のフラグメント及び類似体が挙げられる。また、ＥＢＰ又はｅｃｋ受 容体に対するモノクローナル抗体は、ＥＢＰと細胞表面上のｅｃｋ受容体との相 互作用を阻止する上で有用であり得る。 内皮細胞内でのＥＢＰ遺伝子の発現は、炎症応答の一部として内皮細胞内の種 々の機能を活性化する二つの炎症促 進（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインであるＴＮＦ−α及びＩＬ −１βによって刺激されることが判明している（Ｈｏｌｚｍａｂら、前出の文献 ）。炎症応答中に増加したＥＢＰの濃度を低下させるために可溶性ｅｃｋ受容体 を投与することからなる処置は、炎症を抑制する上で有用であり得る。 治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドを投与することからなる、哺乳動物の創 傷の治療方法も提供する。実施例９Ａで説明するように、ＥＢＰはラット創傷チ ャンバ（ｗｏｕｎｄ ｃｈａｍｂｅｒ）アッセイで、組織の湿潤重量、タンパク 質総量、ＤＮＡ総量及びグリコサミノグリカン総量の増加を促進した。ＥＢＰは 炎症応答の初期に発現されるため、損傷部位までの上皮細胞のレクリートメント （ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）で何らかの役割を果たす可能性がある。 治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドを投与することからなる、哺乳動物の造 血機能増進方法も提供する。実施例９Ｂで説明するように、ＥＢＰをインターロ イキン−３（ＩＬ−３）と組合わせて使用すると、マウス骨髄培養物中のＣＦＵ −Ｃが著しく増加する。ＥＢＰは、骨髄抑圧 （ｍｙｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）が、病気の結果として、又は化学療法薬の ような骨髄抑制剤への暴露後に生起した場合に、造血機能を回復させる上で有用 であり得る。好ましい実施態様では、造血機能を増進するために、治療上有効量 のＥＢＰを治療上有効量のＩＬ−３と組み合わせて使用する。 治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドを投与することからなる、哺乳動物の結 腸細胞増殖刺激方法も提供する。実施例９Ｃで説明するように、ＥＢＰは結腸腺 （ｃｏｌｏｎ ｃｒｙｐｔ）アッセイで細胞増殖を剌激する。ＥＢＰのようなｅ ｃｋ受容体リガンドは、化学療法後の消化管毒性の軽減に有用であろう。 治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドを投与することからなる、肝細胞増殖剌 激方法も提供する。実施例９Ｄは、ＥＢＰによる肝細胞の剌激を示している。こ の剌激は、公知の肝細胞増殖因子である酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）を 用いた同じアッセイで見られるものと類似している。ｅｃｋ受容体リガンドでの 治療は、病気又は怪我に起因する肝臓の損傷を治す上で有用である。 本発明は、治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドを医薬 的に許容し得る希釈剤、担体、防腐剤、乳化剤及び／又は可溶化剤と共に含む医 薬組成物を提供する。本明細書で使用する「治療上有効量」という用語は、所与 の状態について所与の投与方法で治療効果をもたらす量を意味する。当業者は、 治療すべき所与の状態について、治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドを決定す ることができるであろう。 医薬組成物は種々の緩衝剤からなる希釈剤（例えばトリス、アセテート、ホス フェート）、可溶化剤（例えばトゥイーン、ポリソルベート）、ヒト血清アルブ ミンのような担体、防腐剤（チメロソール、ベンジルアルコール）及びアスコル ビン酸のような酸化防止剤を含む。実施例７で説明するように、精製し希釈した ＥＢＰが可溶性ｅｃｋ受容体に結合する能力は、安定剤の存在下でＥＢＰを配合 すると長く持続する。安定剤はトゥイーン−２０、トゥイーン−８０、ＮＰ−４ ０又はトリトン Ｘ−１００のような洗剤であってよい。ＥＢＰはまた、長時間 にわたって患者に徐放的に送達するために、高分子化合物の粒状調製物中に含ま せ得る。医薬組成物の成分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ， Ｅａｓｔ ｏｎ，ＰＡ（１９９０）に詳述されている。 ＥＢＰは、皮下、静脈もしくは筋内のいずれかの注射、又は経口もしくは鼻孔 投与によって投与し得る。投与経路は治療すべき特定状態に応じて決定する。 以下の実施例は本発明をより詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲 を限定するものではない。 実施例 １ ｅｃｋ受容体細胞外領域の産生 Ａ． ｅｃｋ−ｘ発現プラスミドの構築 ｅｃｋの細胞外領域の哺乳動物発現のためのプラスミドを、ｅｃｋ ｃＤＮＡ の３．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ ＩサブクローンであるｐＧＥＭ３Ｚ−ｅｃ ｋを用いて開始する幾つかのステップで形成した（Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、前出文 献）。オリゴヌクレオチド３１７−１１（５’−ＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＣＣ− ３’；配列番号７）及び３１７−１２（５’−ＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＣＴＡ−３ ’；配列番号８）をキナーゼ処理し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し たｐＧＥＭ４Ｚ及びｐＧＥＭ３Ｚ−ｅｃｋの１．７ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメン トに連結した。オリゴヌクレオチドがｅｃｋの５’末端のみに付加されたクロ ーンを選択した。このクローンの特徴としては、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＢｇｌ ＩＩ部位の付加、並びにｅｃｋ配列に隣接する５’ＥｃｏＲＩ部位の欠失が挙げ られる。このクローンからの挿入物を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＥｃｏＲＩでの消 化後に分離し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＳａｌ Iで消化されたｐＧＥＭ４Ｚとと もにキナーゼ処理オリゴヌクレオチド： に連結した。その結果、Ｂａｍ Ｈ１部位、Ａｓｎ⁵³⁴に続くＴＧＡストップコ ドン、及びＳａｌ Ｉ制限酵素部位が付加された。次いで、ｅｃｋの外部領域を コードする配列を含むＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｓａｌ ＩフラグメントをｐＤＳＲα ２にトランスファーした（ｄｅＣｌｅｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６ ，３８９３（１９９１））。 Ｂ． ｅｃｋ ｘの哺乳動物細胞発現 発現プラスミドｐＤＳＲα−ｅｃｋ−ｘをカルシウム仲介トランスフェクショ ンによりＣＨＯ細胞内に導入した （Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１，２３３（１９７７））。プラスミド内のジ ヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子の発現に基づいて個々のコロニーを 選択し、２１．０２１と名付けた一つのクローンを増幅用に選択した。ｅｃｋ遺 伝子の発現をＲＮＡハイブリダイゼーションによりモニターした（Ｈｕｎｔら、 Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９、７７９（１９９１））。 ｅｃｋ発現の増幅を１０ｎＭメトトレキセート中で行った。細胞系２１．０２ をｅｃｋ−ｘの産生のために増殖した。非必須アミノ酸と１０ｎＭ メトトレキ セートと５％ＦＢＳとを加えた２００ｍｌのＤＭＥＭ：Ｈａｍ’s Ｆ１２（１ ：１）中２×１０⁷個の細胞でローラーボトルに接種した。細胞は３日間で集密 状態に到達した。この時点で、５％ＦＢＳを含まない新しい培地を加えた。７日 後にならし培地を回収して交換し、１４日後に２回目の回収を行った。 Ｃ． ｅｃｋ−ｘの精製 ２１．０２細胞からのならし培地を濃縮し、１０，０００ ＭＷＣＯ螺旋フィ ルター（Ｓ１Ｙ１０，Ａｍｉｃｏｎ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いて１０ｍＭ トリス−ＨＣ １、ｐＨ７．４に対して透析濾過した。５０ｍｌの濃縮物を陰イオン交換カラム （Ｈｅｍａ−Ｑ、粒径１０μｍ、１．６×１２ｃｍ、Ｓｅｐａｒｏｎ，Ｓｕｎｎ ｙｖａｌｅ，ＣＡ）に充填し、１０ｍＭのｐＨ７．４のトリス−ＨＣｌ中０〜０ ．５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶離した。画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ｅｃｋ −ｘの合成Ｎ末端ペプチドに対するウサギ抗血清を用いるウェスタンブロットと によって分析した。ｅｃｋ−ｘ含有画分をプールし、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、 ｐＨ７．４に対して透析し、Ｈｅｍａ−Ｑカラムに再充填し、前述のように溶離 し分析した。得られたプールを３ｍｌに濃縮し（ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０， Ａｍｉｃｏｎ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ＰＢＳ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅ ｘ ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）ゲル濾過カラ ム（２．２×９０ｃｍ、流速１．０ｍｌ／分）に載置した。精製ｅｃｋ−ｘを含 むプールを作り、後続の実験の基礎として使用した。 実施例 ２ ｅｃｋ細胞外領域への結合に関するならし培地のスクリーニング ｅｃｋ−ｘとの相互作用を、表面プラスモン共鳴検出システム（ＢＩＡｃｏｒ ｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔｗａｙ，ＮＪ）で 、製造業者により推奨されている手順を用いて測定した。センサーチップのデキ ストラン表面を、３５μｌの０．２Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノ プロピル）カルボジイミド−ＨＣｌ、０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ドを流速５μｌ／分で注入することにより活性化した。精製ｅｃｋ−ｘ（１０ｍ Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中０．２ｍｇ／ｍｌ）を、５０μｌ注入を５ μｌ／分で２回連続して行うことにより固定化した。非反応結合部位を１Ｍエタ ノールアミン、ｐＨ８．５の注入によってブロックした。安定な基線が得られる まで、緩衝液（ＨＢＳ）１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％トゥイーン２０、ｐＨ７．４）を流しながら表面 を一晩洗浄した。典型的固定化の結果、元の値を超える基線６０００〜８０００ 応答単位が確立された。無血清条件下で培養し５〜４０倍濃縮した（ｃｅｎｔｒ ｉｃｏｎ−１０，Ａｍｉｃｏｎ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）種々のならし培地の５ ０μｌ試料を流速１０μｌ／分で注入 した。各注入の終了２０秒後に対応するセンサーグラム上のリポートポイントで 試料応答を測定した。固定化ｅｃｋ−ｘの表面を、２５ｍＭ ３−（シクロヘキ シルアミノ）−１−プロパンスルホン酸、ｐＨ１０．４の５０μｌ注入により試 料間で再生した。 ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ上に固定化した精製ｅｃｋ−ｘを用いて、濃縮 ならし培地を受容体結合活性についてスクリーニングした。結合活性は、ＨＣＴ −８、ＳＫ−ＢＲ−３及びＨＴ−２９細胞系由来のものを含む幾つかのならし培 地中で観察された（表１参照）。 実施例 ３ ならし培地からのｅｃｋ受容体結合タンパク質（ＥＢＰ）の精製及び特徴分析 Ａ． 固定化ｅｃｋ−ｘ受容体アフィニティクロマトグラフィー 精製ｅｃｋ−ｘを０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．３に 対して透析し、最終濃度を２ｍｇ／ｍｌにした。該タンパク質を、ゲル１ｍｌ当 たり１ｍｇのｅｃｋ−ｘのリガンド密度でＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上に固定化した（Ｋ ｅｎｎｙら、Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊ．Ｍ．Ｗａｌ ｋｅｒ編，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ．（１９８ ８））。 ＳＫ−ＢＲ−３又はＨＣＴ−８細胞系由来のならし培地を２０倍濃縮し、ＰＢ Ｓに対して透析濾過した（Ｓ１Ｙ１０螺旋カートリッジ，Ａｍｉｃｏｎ）。濃縮 物を固定化ｅｃｋ−ｘのカラム（１×１ｃｍ、樹脂１ｍｌ当たり１ｍｇのｅｃｋ −ｘ）に流速０．１ｍｌ／分で直接ロードした。 カラムを１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで０．０５Ｍ 酢酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０で溶離した。溶離プールに０ ．０１％となるようにＳＤＳを加え、濃縮し、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０限外濾 過装置（Ａｍｉｃｏｎ）で１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して緩衝 液交換した。試料を、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０から回収したＳＤＳ−ＰＡＧＥ 試料緩衝液と混合し、ポリアクリルアミドゲル上に直接ロードした。ゲルを銀染 色するか（Ｍｅｒｒｉｌｌ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２，４７７（１９ ９１））又はＰＶＤＦメンブラン（Ｐｒｏｂｌｏｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上にブロットしてＮ末端配列を 分析した（Ｆａｕｓｓｅｔら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｒｅｓｉｓ １２，２２（１ ９９１））。 典型的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を第１図に示す。レーン５に示されているカラム のｐＨ４．０溶離は、見かけ分子量２１〜２７ｋＤａの幾つかのタンパク質の量 がかなり多いことを示している。これらのタンパク質は、類似の量の非ならし培 地を同じカラムに通した時には検出されなかった。これは、２１〜２７ｋＤａタ ンパク質が前記細胞系によって産生されることを意味する。これと対照的に、Ｈ ＣＴ− ８又はＳＫＢＲ−３ならし培地のｐＨ４．０溶離画分中に存在する分子量のより 大きいタンパク質は、非ならし培地中でも観察された。これらのタンパク質はカ ラムとの非特異的相互作用を表し、細胞培養に使用した血清に由来する。 Ｂ． ＥＢＰのＮ末端配列の分析 Ｎ末端配列の分析を、液体パルス自動配列分析器（モデル４７７、Ａｐｐｌｉ ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で実施した。得 られたフェニルチオヒダントイニルアミノ酸を、オンラインマイクロボア（ｍｉ ｃｒｏｂｏｒｅ）高性能液体クロマトグラフィー（モデル１２３，Ａｐｐｌｉｅ ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ｃ−１８逆相カラム（０． ２１×２５ｃｍ）を用いて分析した。ＰＶＤＦブロットの配列分析のための配列 決定サイクル及び最適化は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの推奨に基 づいて決定した。 ゲルの２１〜２７ｋＤａ範囲のエレクトロブロットしたタンパク質のＮ末端配 列分析では、単一の配列が明らかにされた（配列番号１３）： ＮＢＲＦタンパク質データベースのコンピューターベースホモロジーサーチ（ Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，３８７（１ ９８４））の結果、この配列がＥＢＰに帰するものであることは明白であった（ Ｈｏｌｚｍａｎら、前出文献）。 Ｃ． ＥＢＰの構造的特徴の分析 Ｎ末端配列決定では単一の配列が検出されたため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察さ れたいくつかの形態のＥＢＰは、分子の別の領域での翻訳後修正の結果生じたも のと思われる。サイクル８（Ｎ）の配列決定収率は大幅に減少した。これは、こ の部位での効率的グリコシル化を意味する。しかしながら、該タンパク質の明ら かな不均一性は、グリコシル化の相違だけに起因し得るものではない。なぜなら 、Ｎ−グリカナーゼとノイラミニダーゼとＯ−グリカナーゼとを組み合わせてｒ ＥＢＰを消化すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した時に、Ｍ_r１７〜１９ｋＤａ の形態の混合物が得られるからである。ＥＢＰ遺伝子は２２ｋＤａタンパク質を コードするのであるから（Ｈｏｌｚｍａｎら，前出文献）、この観察事項は、Ｅ ＢＰがタンパク質分解プロセッシングにかけられ得ることを示唆している。 Ｄ． ＥＢＰと可溶性ｅｃｋ受容体との相互作用 ｐＨ４．０溶離プールのゲル濾過分析は、ＢＩＡｃｏｒｅ応答で測定される総 てのｅｃｋ結合活性が、見かけ分子量２２ｋＤａで溶離する物質に起因し得るこ とを明らかにした（第２図）。このカラムからの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で は、ＥＢＰが受容体結合活性と共に同時溶離されることが確認された。別個の実 験では、精製ＥＢＰは、ｋｉｔ受容体の細胞外領域で活性化したＢＩＡｃｏｒｅ 表面に結合しなかったが、これらの表面は、ｋｉｔリガンドであるｒＳＣＦには 結合できた。 Ｅ． ｅｃｋ結合タンパク質に関する別の細胞系のスクリーニング ＥＢＰの分離及び同定に次いで、該タンパク質に対する抗血清を製造し、元の スクリーニングの遡及的分析を行った（表１）。ウェスタンブロット分析では、 スクリーニングで陽性と判定された３種類のならし培地（ＳＫ−ＢＲ−３、ＨＣ Ｔ−８及びＨＴ−２９）中にＥＢＰが高濃度で存在することが確認された。幾つ かの別の細胞系（ＡＧ−３０２２、ＡＧ−２８０４及びＨＴ−１０８０）も陽性 と判定されたが、ウェスタン分析ではプロセシングされたＥＢ Ｐが微量しか検出されなかった。これらの細胞系は、抗ＥＢＰ抗血清によって検 出される２８ｋＤａタンパク質を確かに産生した。 実施例 ４ ＥＢＰのクローニング、発現及び特徴分析 ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）に由来する熱分裂ファージを 、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＲＣ）によるヒトＥＢＰ遺伝子の増幅のための鋳型 として使用した（Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０（１９８５ ）；Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕ ａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１，２６３）。プライマーは、大腸菌又はＣＨＯ細胞発現 ベクターのいずれかに挿入できるＰＲＣフラグメントを得るために、ＥＢＰの公 表済み核酸配列（Ｈｏｌｚｍａｎら、前出文献）に基づいて設計した。 Ａ． 大腸菌発現のためのＥＢＰのクローニング 完全長形態のＥＢＰの大腸菌発現のための遺伝子を、下記のようなオリゴヌク レオチドプライマー３８６−４及び３８６−５を用いて、ＰＲＣにより形成した ： この形態はシグナルペプチドを欠き、イニシエーターメチオニンと、発現プラス ミドｐＣＦＭ１１５６へのクローニングに必要な制限部位とを含んでいた（Ｆｏ ｘら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１８４５２（１９８８））。λｇｔ１ １／ＨＵＶＥＣライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の１０μｌアリコートを７０ ℃で５分間熱処理し、次いでウエットアイス上で急冷した。分裂ファージを、３ ００ピコモルのプライマー３８６−４及び３８６−５の各々と、１Ｘ ＴａｑＩ ポリメラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と、０．７７ｍ Ｍの各ｄＮＴＰと、２．５単位のＴａｑＩポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とを １００ｐｌ中に含むＰＲＣ反応の鋳型として使用した。この反応の生成物をフェ ノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、２０μｌの蒸留水に再 懸濁し、次いで制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ） で消化した。このフラグメントを、同じ二つの酵素で消化したプラスミドベクタ ーｐＣＦＭ１１５６に連結し、大腸菌宿主株ＦＭ５（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．５ ３９１１）中に形質転換させた。形質転換細胞を３０℃から４２℃に温度シフト させると、ＥＢＰが高レベルで発現された。 １５０アミノ酸形態のＥＢＰを大腸菌内で発現させるために設計した遺伝子は 、３８６−５の代わりにオリゴヌクレオチド４６９−１１をＰＣＲで使用すると いう点を除いて、完全長遺伝子の場合と同様に構築した。オリゴヌクレオチド４ ６９−１１は下記の配列を有する： Ｂ． ＣＨＯ細胞発現のためのＥＢＰのクローニング 細胞系ＳＫ−ＢＲ−３から全ＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡの製造に使用した。全 ＲＮＡ３μｇを３μｇのランダムプライマー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈ ｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と混合し、６５℃で５分間インキュベートし、 次いで氷上で短時間冷却した。このＲＮＡ−プライマー混合物を、５０ｍＭ ト リス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）と、７５ｍＭ ＫＣｌと、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂と、 １０ｍＭ ＤＴＴと、１２５μＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ）ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ 、ｄＴＴＰ）と、２００単位の逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ，ＢＲＬ） とを最終反応体量２０μｌで含むｃＤＮＡ反応体中で使用した。該反応体を３７ ℃で１時間インキュベートした。 ２種類のオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲによるＥＢＰコーディング領域 の増幅のためにＳＫ−ＢＲ−３ ｃＤＮＡと共に使用した。 ＰＣＲは、１μｌのｃＤＮＡ反応体と、５００ｎｇの前記２種類のオリゴヌク レオチドと、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）と、５０ｍＭのＫＣｌと 、２００μＭの各ｄＮＴＰと、１．２５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉ ｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，ＣＡ）とを含んで いた。ＤＮＡを３５サイクルにわたって増幅し（９４℃で３０秒、５０℃で１分 、７２℃で１分）、フェノールで１回、フェノール−クロロホルムで１回抽出し 、沈殿させ、ミクロ遠心分離によってペレット化し、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 及びＸｂａ Ｉ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化した。ＤＮ Ａをゲル精製し（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩ，Ｂｉｏ １０１，Ｌａ Ｊｏｌｌ ａ，ＣＡ）、予め同じ制限酵素で消化したプラスミドｐＤＳＲα２（ｄｅＣｌｅ ｒｃｋら，前出文献）に連結した。連結ＤＮＡをコンピテントＨＢ１０１細菌（ ＢＲＬ）中にトランスフェクションし、プラスミドＤＮＡを分離した（Ｑｉａｇ ｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）。ＥＢＰ ＤＮＡ配列に対応する合成プラ イマーを用いて、二本鎖プラスミドＤＮＡ上でのジデオキシ鎖終結反応（Ｓａｎ ｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５４６３（ １９７７））によりＤＮＡ配列を確認した。 ＥＢＰ遺伝子でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞の培養上清はＢＩＡｃｏ ｒｅでｅｃｋ−ｘ結合活性を示し、該上清から固定化ｅｃｋ−ｘ受容体アフィニ ティクロマトグラフィーによってＥＢＰを回収することができた。非ト ランスフェクションＣＨＯ細胞、又は内部欠失を含むＥＢＰ遺伝子でトランスフ ェクションしたＣＨＯ細胞は、受容体結合活性を示さなかった。 Ｃ． 大腸菌及びＣＨＯ細胞からの組換えＥＢＰの精製 組換えＥＢＰを、実施例３Ａに記載のように、固定化ｅｃｋ−ｘ受容体アフィ ニティクロマトグラフィーによってＣＨＯ細胞培養上清から精製した。精製ＥＢ Ｐを５ｍＭ ＣＨＡＰＳ（構造分析及び架橋検査の場合）又は０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（リン酸化検査の場合）を用いてＰＢＳに対して透析した。受容体アフ ィニティクロマトグラフィーによって精製したＣＨＯ細胞由来ＥＢＰは、二つの 大バンドと数個の小バンドとを含んでいた（第１Ｂ図）。 ＣＨＯ細胞由来の組換えＥＢＰを一般的なクロマトグラフィーによっても精製 した。ＣＨＯ細胞培養上清を濃縮し、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．５に対して透析 濾過し、陰イオン交換カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ− ＬＫＢ）に載置した。カラムを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中ＮａＣｌ 直線勾配で溶離した。ウェスタンブロットによる画分の分析の結果、二つの大Ｅ ＢＰバンドは互いに分離していることが判明した。大ＥＢＰバン ドを含む画分で別個のプールを形成し、これらのプールを更にゲル濾過クロマト グラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）で精製し た。 大腸菌由来の組換えＥＢＰは下記の方法で精製した。ＥＢＰ^1-150又はＥＢＰ^{1 -187} 遺伝子を発現する細胞を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４に懸濁し、フ レンチプレスを用いて溶解させた。溶解物をＪ６−Ｂ（ＪＳ−４．２ローター） で４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。不溶性ペレット（変性したＥＢＰ^{1- 150} 又はＥＢＰ^1-187を含む）を更にプロセシングすべく回収した。ペレットを２ ％デオキシコール酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、 ｐＨ８．５に懸濁し、４℃で３０分間混合した。該懸濁液を前述のように遠心分 離し、上清を捨てた。不溶性ペレットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４に 懸濁し、混合し、前述のように遠心分離した。ＥＢＰ^1-150又はＥＢＰ^1-187を可 溶化すべく、不溶性ペレットを２％サルコシル、１０ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ１０ に溶解した。ＣｕＳＯ₄を最終濃度５０μＭで加え、得られた混合物を４℃で一 晩撹拌し、次いで洗剤を除去すべくＤｏｗｅｘ１×４樹脂で処理した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、ＥＢＰ^1-150又はＥＢＰ^1-187の大部分が酸化さ れており、モノマーであることが判明した。しかしながら、ＥＢＰ^1-187のゲル 濾過分析では、該タンパク質が高分子量非共有結合凝集体として挙動することが 判明した。これに対し、折りたたまれたＥＢＰ^1-150は、ゲル濾過分析の結果、 モノマー又はダイマーとして挙動することが判明した。 大腸菌内で産生したＥＢＰ^1-187及びＥＢＰ^1-150を、実施例２に記載のように 、ＢＩＡｃｏｒｅにより固定化ｅｃｋ−ｘへの結合について検査した。ＥＢＰ^{1- 187} 凝集体はｅｃｋ−ｘ表面に結合したとしても僅かであった。折りたたまれた ＥＢＰ^1-150は、ＢＩＡｃｏｒｅで、ｅｃｋ−ｘ表面に対して大きな親和性を示 した。 別の方法として、大腸菌内で発現したＥＢＰ^1-150を下記の手順で再折りたた みを行った。細胞ペーストを９倍容（ｖ／ｗ）のＳｕｐｅｒ−Ｑ冷水に懸濁した 。Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーを圧力９，０００ｐｓｉで使用して懸濁細胞ペー ストを溶解させた。溶解物を即座に３，５００×Ｇで４℃で３０分間遠心分離し た。上清を捨て、ＥＢＰ封入体を含むペレットを回収した。ペレットを１０倍容 （ｖ ／ｗ）の８Ｍ尿素、０．１Ｍトリス，ｐＨ８．５に懸濁し、１時間撹拌した。次 いで遠心分離にかけて不溶性画分を除去した。可溶性封入体を２段階で希釈する ことにより再折りたたみを実施した。まず封入体を、酸化剤として０．０００５ ％のＣｕＳＯ₄を含む１０倍容（ｖ／ｗ）の３Ｍ尿素、０．１Ｍトリス、ｐＨ８ ．５に４℃で希釈し、一晩撹拌した。この物質を３倍容（ｖ／ｖ）の２０ｍＭト リス、ｐＨ９．２で希釈し、静かに撹拌しながら２４時間インキュベートした。 遠心分離を１５，０００×Ｇで４℃で３０分間行い、沈殿物を除去した。 次いで上清をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムにかけ、５ カラム倍容の２０ｍＭトリス、ｐＨ９．２で洗浄した。カラムを、２０ｍＭトリ ス、ｐＨ９．２中０〜０．５ＭのＮａＣｌ直線勾配で溶離した。ＥＢＰ含有画分 をプールし、濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５クロマトグラフィーにかけた。Ｅ ＢＰを１×ＰＢＳで溶離した。 得られた精製ＥＢＰは、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイで固定化ｅｃｋ−ｘへの結合 能力によって測定して、精製ＣＨＯ由来ＥＢＰの３０〜４０％の比活性を有して いた。この手 順で再生し精製した大腸菌産生ＥＢＰは、細胞表面に局在しているｅｃｋのリン 酸化を誘起した。 Ｄ． 大腸菌及びＣＨＯ細胞発現に由来する組換えＥＢＰの特徴分析 受容体クロマトグラフィーによってＣＨＯ細胞培養上清から精製した、又はＲ Ｐ−ＨＰＬＣによって大腸菌から精製した組換えＥＢＰをトリプシンで消化し、 ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。Ｃ末端ペプチド（ａａ １５５−１８７）は大腸菌 内で発現されたＥＢＰ^1-187遺伝子から回収可能であったが、哺乳動物由来組換 えタンパク質中では検出できなかった。精製ＣＨＯ ＥＢＰのカルボキシペプチ ダーゼ消化は、唯一の検出可能なＣ末端配列が−ｌｙｓ−ａｒｇ−ｌｅｕ−ａｌ ａ−ａｌａ−ＣＯＯＨ（配列番号１２）であることを明らかにした。これは、ア ミノ酸１５０での終結を意味する。 Ｅ． 別の形態のＥＢＰ 実施例３に記載のようにＳＫ−ＢＲ−３細胞系から分離したＥＢＰは、ＳＤＳ −ＰＡＧＥ上で２１〜２７ｋＤａの範囲で移動した（第１図Ａ参照）。ＣＨＯ細 胞上清中の組換えＥＢＰは、ｅｃｋ−ｘクロマトグラフィー後に二つの の主要分子種及び数個の小バンドとして存在していた（実施例４及び第１図Ｂ） 。種々の分子量形態のＣＨＯ由来ＥＢＰの特徴を更に調べた。ＣＨＯ細胞上清に 由来する組換えＥＢＰの精製によって、２２及び２４ｋＤａの二つのバンドと第 三の２７ｋＤａの小バンドとが明らかにされた（第３図参照）。精製ＥＢＰのグ リコシダーゼ処理ではこれらのバンドの相対移動は変化しなかった。これは、こ れらのバンドが単にＮ−又はＯ−結合炭水化物の変化によって生起したのではな いことを示唆する。２２ｋＤａバンドは予めＣ末端配列決定で、アミノ酸１５０ 個のポリペプチドであることが明らかにされ、ＥＢＰ^1-150と名付けられた。２ ４ｋＤａバンドは、Ｃ末端配列決定により、アミノ酸１５９個の長さを有するこ とが判明した。この形態はＥＢＰ^1-159と名付けた。 ＥＢＰ発現ＣＨＯ細胞を、膜結合形態のＥＢＰの存在について調べた。ＣＨＯ ｄ−細胞をプラスミドｐＤＳＲα−ＥＢＰでトランスフェクションすることによ り、組換えＣＨＯ細胞系３６．４４を樹立した。１×非必須アミノ酸と１×ペニ シリンとストレプトマイシンとグルタミンと１０％熱不活性化透析ウシ胎児血清 とを加えたＤＭＥＭ：Ｆ１ ２培地を用いて、懸濁培地中で細胞を増殖させた。細胞１０⁶個のアリコート卜 を、１ｍｌのリン酸塩緩衝食塩水中４μｇ／ｍｌのホスホリパーゼＣ（Ｃａｌｂ ｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で種々の時間にわたり３７℃で処理し た。細胞を１４，０００ｒｐｍで１分間ペレット化した。上清を分析のために除 去した。細胞ペレットをＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１％ＮＰ−４ ０；０．５％デオキシコレート；５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；０．１ ％ＳＤＳ；１．７４μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ；各々１ｎｇ／ｍｌのアプロチニン、 ペプスタチン及びロイペプチン；１８．４μｇ／ｍｌオルトバナデート）中で溶 解させた。試料を１４％トリス−グリシンゲルに載置し、ＰＶＤＦメンブランに ブロットし、ウサギ抗ＥＢＰポリクローナル抗体でプローブした。第４図は、Ｅ ＢＰがホスホリパーゼＣの存在下で上清中に放出されたことを示している。これ らの実験は、２７ｋＤａ形態のＥＢＰが糖リン脂質アンカーを有することを示唆 した。 実施例 ５ ＥＢＰ類似体 完全長ＥＢＰ遺伝子から形成した種々の形態の組換えＥ ＢＰの他に、種々のポリペプチド長さのＥＢＰ類似体を構築した。特に、アミノ 酸１６７個、１７１個及び１８０個のＥＢＰを下記のように構築した。オリゴヌ クレオチド４２１−１２、４２１−１３及び４２１−１４を、それぞれアミノ酸 １８０、１７１及び１６７に続く終結コドンを導入するためのＰＣＲプライマー として使用するために合成した。ＰＣＲ反応は、これらの各プライマーとｐＤＳ Ｒα−ＥＢＰプラスミドとオリゴヌクレオチド３８６−２とを用いて実施例４Ｂ に記載のように実施した。 得られた類似体は、ＥＢＰの発現に関して説明した手順を用いて、改変ＤＮＡ 配列でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞内で発現された。血清の存在下で細 胞を集密状態まで増殖させ、その時点で培地を無血清培地に換え、増殖させた。 ４８時間の時点でならし培地を回収し、付着細胞 を溶解させた。ならし培地及び溶解物のアリコートをポリアクリルアミドゲル電 気泳動で分別し、ウェスタンブロッティングにかけた。ＥＢＰ^1-187及びＥＢＰ^{1 -180} は、溶解物中及び上清中の抗体と反応するタンパク質の分布が互いに類似し ていた。ＥＢＰ^1-171及びＥＢＰ^1-167を発現する細胞は、上清中ではＥＢＰが増 殖していたが溶解物中では増殖していなかった。ＥＢＰ類似体を、実施例２に記 載のようにＢＩＡｃｏｒｅでｅｃｋ−ｘへの結合について分析し、且つ実施例６ に記載のようにｅｃｋ受容体のリン酸化活性について分析した。 実施例 ６ 組換えＥＢＰとｅｃｋ受容体との相互作用 Ａ． 架橋検査 ＣＨＯ細胞由来ＥＢＰを下記のように¹²⁵Ｉで放射性標識し、架橋及び結合の 検査に使用した。０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ₄、ｐＨ８．０）中５ 又は１０μｇのＥＢＰを５ｍＣｉの乾燥¹²⁵Ｉ−Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試 薬（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に最終量５０μｌ又は１００μｌで加え、管 を４℃で１時間インキュベートした。０．１Ｍ ＮａＰＯ₄中０．２Ｍのグリシ ンを ０．３ｍｌ加えることによって反応を停止させ、次いで４℃で５分間インキュベ ートした。標識タンパク質を、０．１Ｍ ＮａＰＯ₄− ０．２５％ゼラチンで 平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む１０ ｍｌ ＰＤ１０カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーにより、非封入試薬から 分離した。¹²⁵Ｉ−ＥＢＰの比活性は４〜１９ｃｐｍ／ｐｇであった。 ＬＩＭ ２４０５（ｅｃｋ受容体を自然に発現する細胞系）又はＣＨＯ １９ ．３２（完全長ｅｃｋ受容体のクローンでトランスフェクションしたチャイニー ズハムスター卵巣細胞）へのＥＢＰの架橋を下記のように実施した。ＣＨＯ細胞 を、培地中約５×１０⁵細胞／ｍｌの密度まで懸濁液中で増殖させた。ＬＩＭ２ ４０５細胞は、５％ ＦＣＳ、１μｇ／ｍｌインスリン、１μｇ／ｍｌヒドロコ ルチゾン、１０μＭチオグリセロール及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭ Ｉ １６４０培地中で、Ｔ−１７５フラスコ内約９０％の集密状態まで増殖させ 、掻き取りにより取り出して架橋の検査に使用した。細胞を遠心分離し、ＰＢＳ 中に再懸濁させて単一細胞懸濁液を得た。各架橋反応毎に、２×１０⁶個の細胞 を約２０ｎｇの¹²⁵Ｉ−ＥＢＰと 総量１ｍｌで混合した。この混合物を４℃で１時間インキュベートしてＥＢＰを 細胞表面受容体に結合させ、その後２０μｌの１０ｍＭスベリン酸ジスクシンイ ミジル（ＤＳＳ）を架橋剤として加えた。次いで、細胞を結合緩衝液中で３回洗 浄し、遠心分離によって回収し、細胞ペレット中に取り込まれた放射能の量を測 定して架橋度を評価した。次いで、１００μｌ ＰＢＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０ ．５％ＮＰ−４０、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ，Ｓｉｇ ｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１０分間４℃で処理することにより、細胞を 溶解させた。不溶性物質を遠心分離で除去し、受容体／リガンド複合体を含む可 溶性画分を回収した。これらの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに直接かけるか、又は最 初にｅｃｋ受容体のＣ末端部分に対する抗体で免疫沈降させた（Ｌｉｎｄｂｅｒ ｇら、前出文献）。非標識ＥＢＰ又は無関係なタンパク質（ＦＧＦ）との競合を 、細胞への添加の前に競合相手を標識ＥＢＰと混合することによって生起させた 。 第５図に示すように、¹²⁵Ｉ−ｒＥＢＰはＣＨＯ１９．３２細胞には架橋でき るが（レーン１）、非トランスフェクション細胞には架橋できなかった（レーン ２）。架橋の 結果、１４５ｋＤａタンパク質と、受容体ダイマー又はより多量体の複合体を示 し得るより高い分子量の形態が検出された。５０倍モル過剰の非標識ｒＥＢＰは 結合及び架橋に関して競合することができた（レーン３）。別個の実験では、１ μｇ／ｍｌの濃度の組換え線維芽細胞増殖因子はｒＥＢＰ架橋に効果を示さなか った。ＬＩＭ２４０５細胞系についても類似の架橋結果が得られた。 Ｂ． 結合検査 結合反応速度を測定するために、ＣＨＯ１９．３２細胞（２×１０⁶細胞／ｍ ｌ）をＰＢＳ−ＢＳＡ（１ｍ／ｍ１）中３．８ｎＭ ¹²⁵Ｉ−ＥＢＰと共に０℃ でインキュベートした。アリコートを除去し、細胞結合¹²⁵Ｉ−ＥＢＰをスクロ ース勾配を介する遠心分離によって調べた。非特異的結合を、３８０ｎＭ非標識 ＥＢＰ含有並行反応物から測定した。 ＣＨＯ１９．３２又はＬＩＭ２４０５細胞（０．５×１０⁶細胞／ｍｌ）を種 々の量の¹²⁵Ｉ−ＥＢＰと共に０℃で１時間インキュベートすることにより平衡 結合定数を決定し、結合ＥＢＰを前述のように調べ、データをＳｃａｔｃｈａｒ ｄの方法で分析した（Ａｎｎａｌ．Ｎ．Ｙ，Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．５１，６６０（１９４９））。非特異的結合を、５０倍過剰の非標 識ＥＢＰを含む並行反応物から測定した。 ＬＩＭ２４０５細胞に対する¹²⁵Ｉ−ｒＥＢＰの定常的結合のＳｃａｔｃｈａ ｒｄ分析の結果、単一種類の受容体が２．８×１０^-8Ｍ±０．３×１０^-8のｋd で細胞表面に存在することが判明した。ＬＩＭ２４０５細胞は平均して１．３× １０⁶ＥＢＰ受容体を細胞表面に含んでいた。固定化ｅｃｋ−ｘ表面へのＥＢＰ 結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析の結果、ｋ_dは２．４×１０^-8Ｍ±０．４×１０^-8と 推算された。 Ｃ． ｐ１３０^eck自己リン酸化の検査 ＬＩＭ２４０５結腸直腸癌細胞系（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら，Ｉｍｍｕｎｏｌ． ａｎｄ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７０，２２７（１９９２））を、５％ＦＢＳ、１ μｇ／ｍｌインスリン、１０μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン及び１０μＭα−チオ グリセロールを含むＰＲＭＩ １６４０中に維持し、トリプシン処理と新しい培 地中への希釈（１：５）とによってサブ継代した。アッセイに先立って２．５× １０⁵ＬＩＭ２４０５細胞を６ウェル皿（Ｆａｌｃｏｎ＃３０ ４６）に接種し、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を捨て、０．０３ ％ＢＳＡ、１μｇ／ｍｌインスリン、１０μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン及び１０ μＭ α−チオグリセロールを含む無血清ＲＰＭＩ １６４０と交換し、１２〜 １８時間インキュベートした。ある実験では、処理の前に細胞培養物を無リン酸 ＲＰＭＩ １６４０（Ｆｌｏｗ）中³²Ｐ−オルトホスフェート（２ｍＣｉ／ｍｌ ）で２〜３時間標識した。増殖因子ストック溶液を２．０ｍｌの無血清培地中に 種々の濃度で予備希釈し、次いで３７℃に温めた。インキュベーターから細胞培 養物を取り出し、上清培地を廃棄した。処理物を迅速に加え、細胞培養物を３７ ℃で１０〜１５分間インキュベートした。次いで培養物をインキュベーターから 取り出し、氷上に配置し、培養上清を吸引した。 処理した細胞培養物を０℃に冷却し、次いで氷冷ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）で１回 洗浄した。残留ＰＢＳを吸引し、１．０ｍｌの氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭリ ン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ドデシル硫 酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０、１％デオキシコレート、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ 、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ フッ化ナトリウム及び１００ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム）の添加によっ て細胞を溶解させた。１０分間インキュベートした後、溶解物を１．５ｍｌ管に 移し、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離することにより清澄化した。清澄化 溶解物の上清を新しい管に移し、１．０μｇ／ｍｌのアフィニティ精製ウサギ抗 Ｅｃｋ Ｃ末端領域抗体で２時間０℃で免疫沈降させた。免疫複合体をＰｒｏｔ ｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に４℃で３０分 間吸着させ、氷冷ＲＩＰＡ緩衝液で２回洗浄し、０．５Ｍ ＬｉＣｌを含む０． １Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で１回、ＲＩＰＡで１回洗浄した。得られた免 疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で可溶化し、更に分析すべく貯蔵した。 処理した及び未処理のＬＩＭ２４０５細胞溶解物に由来する抗ｅｃｋ免疫沈降 物を、前述のように、７．５％ポリアクリルアミドゲル上で分離させ（Ｂｏｙｌ ｅら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１，１１０（１９９１））。電気泳動後 、ゲルをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にエレクトロブロッ トし（Ｋａｍｐｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１，１１０（１９９１）） 、ブ ロットを、０．１％トゥイーン−２０（ＴＢＳＴ）及び５％ＢＳＡを含むトゥイ ーン緩衝食塩水中で１時間インキュベートして、膜上の非特異的結合部位をブロ ックした。抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０，ＵＢＩ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ ，ＮＹ）又は抗ｅｃｋ Ｃ末端のいずれかである一次抗体を、３％ＢＳＡ、１％ オブアルブミンを含むＴＢＳＴ中で１．０μｇ／ｍｌに希釈し、ブロットと共に 室温で１時間インキュベートした。その後、ブロットをＴＢＳＴで濯ぎ、ＴＢＳ Ｔで１０〜１５分間にわたり１回、５分間にわたり２回洗浄した。次いでブロッ トを、ＴＢＳＴのみの中の西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体の１ ：５０００希釈液（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）と共に２０〜３０分間インキュベートし、次いでＴＢＳＴを用いて前述の ように洗浄した。室温で０．５〜５分間、Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ Ｘ線フィ ルムに化学発光暴露することにより（ＥＣＬ）Ａｍｅｒｓｈａｍ）免疫複合体を 検出した。 ³²Ｐ標識ＬＩＭ２４０５細胞由来のｅｃｋ受容体免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅによって分離し、固定せずに直接ゲル乾燥した。Ｘ線フィルムへの暴露後、標 識ｅｃｋ受容 体バンドを分離し、ホスホアミノ酸含量を記述のように測定した（Ｂｏｙｌｅら 、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１，１１０（１９９１））。 ＣＨＯ細胞由来ｒＥＢＰは、無傷のＬＩＭ２４０５細胞内でｅｃｋ受容体のリ ン酸化を用量依存的に剌激した。最適濃度は１００ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌで あった（第６図、上方パネル）。また、細胞ｅｃｋタンパク質の総量にわずかな 用量依存減少が見られた（第６図、下方パネル）。これは、可溶性ＥＢＰへの暴 露後の受容体のダウンレギュレーションを示唆する。ＥＢＰでのＬＩＭ２４０５ 細胞の処理は、ＥＧＦ受容体の疑似リン酸化を生起させず、ＥＧＦ処理もｅｃｋ リン酸化を生起させない。また、ｒＥＢＰで処理したＬＩＭ２４０５細胞に由来 する全細胞タンパク質を分析した時には、唯一の誘導リン酸化タンパク質が、成 熟ｅｃｋ受容体に対応するＭｒ １３０ｋｄポリペプチドであった。 大腸菌由来ｒＥＢＰ^1-150も、ＣＨＯ細胞由来ｒＥＢＰに使用した手順で、Ｌ ＩＭ２４０５細胞上のｅｃｋ受容体の自己リン酸化についてアッセイした。同量 のＣＨＯ由来ｒＥＢＰ及び大腸菌由来ＥＢＰ^1-150で細胞を処理すると、 両方の形態の組換えＥＢＰがリン酸化誘発で活性を示すことが観察された。 実施例 ７ 組換えＥＢＰの配合 ＥＢＰがｅｃｋの固定化可溶性細胞外領域に結合する能力をＢＩＡｃｏｒｅを 用いて測定した結果、精製ＥＢＰの希釈溶液は、洗剤のような保護剤を用いて配 合しないと、ｅｃｋ受容体への結合能力を急速に失うことが判明した。ＰＢＳ中 に１００μｇ／ｍｌまで希釈し、３℃で２時間インキュベートした組換えＣＨＯ ＥＢＰは、ｅｃｋ結合能力を約５０％喪失した。この活性喪失は、ＥＢＰを洗 剤、例えば１ｍＭ ＣＨＡＰＳ、０．１％ＮＰ−４０、０．１％トゥイーン ２ ０、０．１％トリトン−Ｘ １００又は０．１％トゥイーン ８０中に配合する ことにより回避できる（第７図参照）。希釈ＥＢＰのｅｃｋ結合活性の喪失は、 該タンパク質を別のタンパク質担体、例えばウシ胎児血清と共にインキュベート することによっても回避できる。 洗剤溶液中に２〜５ｍｇ／ｍｌで維持したＥＢＰのｅｃｋ結合活性は３℃で１ 週間以上安定であるが、１０〜５０ ０μｇ／ｍｌの範囲のタンパク質溶液は、−２０℃で貯蔵するか又は複数の凍結 解凍サイクルにかけると活性を喪失する。 実施例 ８ 組織及び細胞系内でのＥＢＰ及びｅｃｋ受容体の発現 Ｌｉｎｄｂｅｒｇらの前出の文献に記載の手順を用いて、種々のラット組織及 び器官におけるｍＲＮＡレベルでのＥＢＰの発現を調べた。ＥＢＰは、肺、腸、 肝臓、卵巣及び腎臓で最も高度に発現される。発現は、筋肉、胃及び脳でもより 低いレベルで検出された。 発現の検査は、細胞系内でＥＢＰ及びｅｃｋ受容体の両方について行った。Ｅ ＢＰ発現は、アフィニティ精製抗ヒトＥＢＰモノクローナル抗体を用いて、ウェ スタン分析で細胞上清をイムノブロットすることにより検査した。表２に示すよ うに、ＥＢＰは多くの癌細胞内で検出される。ｅｃｋ発現は、完全細胞溶解物の イムノブロット及び細胞溶解物由来抗ｅｃｋ抗体での免疫沈降を含む幾つかの方 法で検査した（Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、前出文献）。表２に示す結果から明らかな ように、ｅｃｋは上皮由来の多くの細胞系内で発現され、更に、線維芽細胞及び 黒色腫細胞系でも 検出される。 実施例 ９ ＥＢＰの生物学的活性 Ａ． ラット創傷チャンバアッセイにおけるＥＢＰの活性 組換えＣＨＯ由来ＥＢＰ及び大腸菌由来ＥＢＰが、ラットの皮下に移植した創 傷チャンバ（ｗｏｕｎｄ ｃｈａｍｂｅｒ）内での肉芽組織の形成に及ぼす効果 を調べた。 この検査には、オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ＳＰＦラット（３００〜 ３５０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用した。ラットにペントバルビタールナトリウム（５ ０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射して麻酔をかけた。無菌外科法を用いて、ラッ トの背面を３ｃｍにわたり正中切開した。該動物の片側の鈍的剥離により、筋肉 層の下に単一のポケットを形成した。次いで、長さ３ｃｍ×直径１ｃｍの無菌ス テンレス鋼ワイヤメッシュシリンダーを皮下に挿入した。使用した創傷チャンバ は、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇらによって記述されており（Ｓｕｒｇｅｒｙ ４６，７ ０２〜７１０（１９５９））且つＨｕｎｔらにより創傷治癒モデルとして使用さ れたもの（Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１１４，３０２−３０７（１９６７））と類似 していた。 切開部を創傷クリップで閉じた。ラットは術後の問題を伴わずによく回復した。 創傷チャンバ移植の３日後から始めて、ラットをアットランダムに５グループに 分けた。この時点で、１）１０μｇのＣＨＯ由来ＥＢＰ、２）１μｇのＣＨＯ由 来ＥＢＰ、３）８μｇの大腸菌由来ＥＢＰ、４）５μｇの組換え血小板由来増殖 因子（ＰＤＧＦ）、又は５）０．１ｍｌの無菌ＰＢＳ及び１ｍＭ ＣＨＡＰＳを 毎日注射する操作を開始し、合計９日間続けた。注射は、創傷チャンバの外縁で シリコーン中隔を介してチャンバ内に直接行った。チャンバ移植の１２日後、ラ ットをＣＯ₂で窒息死させた。その直後に、チャンバを外科的に除去し、注意深 く開放した。次いで、中の肉芽組織を計量し、後の処理のために−７０℃で貯蔵 した。 肉芽組織試料を解凍し、２ｍｌの氷冷蒸留水中でＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイ ザーにより約１分間均質化した。このホモジネートに２ｍｌの氷冷１０％トリク ロロ酢酸を加え、４℃で１時間インキュベートした。ＴＣＡ沈降試料を４℃で遠 心分離し（５００ｇ、１０分間）、２ｍｌの氷冷５％ＴＣＡで１回洗浄し、最後 に５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む２ｍｌの氷冷９５％エタノールで洗浄した。試 料を ２ｍｌのエタノール：エーテル（３：１、ｖ／ｖ）で２０℃で２回脱脂した。各 脱脂処理後に、試料を遠心分離し（５００×ｇ、１０分間）、上清を捨てた。次 いでペレットを１Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し、量を１０ｍｌにした。 可溶化肉芽組織のアリコートを採取し、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５１（１９７６））で試料をアッセイするこ とにより、総タンパク質を測定した。タンパク質標準線にはウシ血清アルブミン （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用し た。 ＤＮＡ総含量をＢｕｒｔｏｎの比色法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．６２，３１５（ １９５６））によりデオキシリボースとして測定した。要約すれば、可溶化試料 （Ｎ ＮａＯＨ）の１ｍｌアリコートを０．５ｍｌの２Ｎ ＨＣｌの添加により 中和し、該中和溶液の１ｍｌアリコートを１０％過塩素酸中で９０℃で１５分間 抽出し、最終抽出物のうちの１ｍｌを２ｍｌの活性化ジフェニルアミン（Ｓｉｇ ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）試薬に加え、室温で一晩イ ンキュベートした後６００ｎｍの吸光度を測定した。加水分解した子ウシ胸腺Ｄ ＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を 用いて標準曲線を作成した。ＤＮＡ含量を創傷チャンバ内の細胞数の大凡の指数 として測定し、細胞の種類及び細胞周期状態もＤＮＡ含量に影響することを確認 した。 硫酸コンドロイチンを標準として使用してグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）総 量を測定した。染料１，９−ジメチルメチレンブルーの吸収スペクトルの変化を 利用して、ＧＡＧの分光光度アッセイを実施した（Ｆａｒｎｄａｌｅら、Ｃｏｎ ｎ．Ｔｉｓｓ．Ｒｅｓ．９，２４７−２４８（１９８２））。 可溶化肉芽組織を６Ｎ ＨＣｌ中で１１０℃で２４時間加水分解した後、コラ ーゲン総含量をヒドロキシプロリンとして測定した（コラーゲン含量の指数）。 ２００μｌの試料加水分解物のアリコートを乾燥し、２００μｌの緩衝液中で再 構成し、Ｂｅｃｋｍａｎ６３００アミノ酸分析機を用いてアミノ酸を分析するこ とによりヒドロキシ−Ｌ−プロリンについて分析した。ヒドロキシ−Ｌ−プロリ ンの外部標準（Ｓｉｇｍａ）を用いて定量を行った。 データを単方向分散分析により分析した。次いで、ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｕ ｎｐａｉｒｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定を用いて個々のグループの平均値 を比較するこ とにより、有意差を分析した。統計的有意はｐ＜０．０５と決定された。総ての 値は平均値±ＳＥＭで表す。 ＣＨＯ由来ｒＥＢＰを１０μｇ／チャンバ／日の用量で連続９日間投与し、ｒ ＰＤＧＦを５μｇ／日（×９日間）の用量で投与すると、どちらの場合も、チャ ンバの肉芽組織の湿潤重量、タンパク質総量、ＤＮＡ総量及びＧＡＧ総量が、ビ ヒクル処理（ＰＢＳ及び１ｍＭ ＣＨＡＰＳ）した対照ラットと比べて有意に増 加した（表３参照）。移植の１２日後に総てのチャンバを回収した。これは、肉 芽組織形成のピーク及びコラーゲン形成の初期段階に相当する時点である。ＣＨ Ｏ由来ｒＥＢＰを１μｇ／チャンバ／日で投与すると、肉芽組織の湿潤重量及び ＧＡＧ含量が、ビヒクル処理した対照ラットのチャンバと比べて有意に増加した 。しかしながら、１μｇのｒＥＢＰ量では、対照と比べて、タンパク質総量、Ｄ ＮＡ及びヒドロキシプロリン含量に有意な差は見られなかった。 コラーゲンの増加はおそらく創傷強さに寄与する唯一の最も重要な因子であろ う。ＰＤＧＦ処理したチャンバは、対照チャンバと比べて、ヒドロキシプロリン 含量（従ってコラーゲン合成）が８２％増加した。ＣＨＯ由来ｒＥＢＰ は、１μｇ／チャンバ／日で２１％のヒドロキシプロリン増加を示し、１０μｇ ／チャンバ／日で３５％のヒドロキシプロリン増加を示したが、これらの増加は 統計的に有意なものではなかった。 Ｂ． マウス造血機能におけるＥＢＰの活性 ＢＤＦマウス由来の非分別骨髄懸濁液を０．３％アガロース中の無血清培養培 地（Ｉｓｃｏｖｅの改質ダルベッコ培地）にプレーティングし、９６ウェルプレ ートで１×１０⁵／ｍｌの細胞濃度で、３７℃、５％ＣＯ₂で１０日間インキュベ ートした。細胞当たり総量は５０μｌであった。ＥＢＰ及び他の増殖因子を指定 の量で加え、インキュベーション１０日目にコロニーを数えた。結果は表８に示 す。 ＥＢＰは１μｇ／ｍｌで、ネズミＩＬ−３依存性マウスＣＦＵ−Ｃ形成を、Ｉ Ｌ−３のみの場合と比べて約２倍に高めることができた。ＣＦＵ−Ｃは、ＣＦＵ −Ｇ、ＣＦＵ−ＧＭ及びＣＦＵ−Ｍを表す。ＥＢＰのみでは、ＣＦＵ−Ｍ又はＢ ＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−Ｅの刺激は見られなかった。 Ｃ． 結腸腺アッセイにおけるＥＢＰの活性 ５匹の（ＢＤＦ）マウスから結腸を除去し、非酵素的（ＥＤＴＡ）抽出方法に よって腺（ｃｒｙｐｔｓ）を分離した。要約すれば、結腸を洗浄し、０．４％次 亜塩素酸ナトリウム含有ＰＢＳ溶液中で２０分間静置させ、組織を３ｍＭ ＥＤ ＴＡ及び０．５ｍＭ ＤＴＴを含むＰＢＳ溶液中で３７℃で１時間インキュベー トすることにより腺を分 離する。次いで、単一細胞懸濁液を得るために、腺を３７℃で９０分間パンクレ アチン消化（ＰＢＳ中０．２％）にかける。細胞をＰＢＳで洗浄し、計数し、ト リパンブルー排除法（この実験では８５％）により生存率を測定する。次いで細 胞を、０．５％寒天の下方層上の０．３７％Ｓｉｇｍａ低融点寒天の上方層にプ レーティングする。寒天中で使用したＲＰＭＩ培地は１×ＩＴＳ（インスリン、 トランスフェリン及びセレン、Ｇｉｂｃｏ）の存在を含む。インキュベーション は、１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び下記の濃度の下記増殖因子の存在下で実施 した：ＴＧＦα、５０ｎｇ／ｍｌ；ｂＦＧＦ、６０ｎｇ／ｍｌ；ＥＢＰ、５００ ｎｇ／ｍｌ。対照インキュベーションでは増殖因子及び／又はＦＣＳを使用しな かった。種々の培養条件はいずれも三つ組みで実施し、数日間隔で計数した。 腺細胞を１％ＦＣＳ及びＥＢＰ又は１％ＦＣＳ及びｂＦＧＦと共にインキュベ ートした後で陽性結果が得られた。どちらの条件でも、細胞クラスターは大きく 、クラスター内の個々の細胞は健康な様子であった。クラスターが腺のような形 状をしている場合もあった。ＥＢＰ及びｂＦＧＦの両方をＦＣＳと一緒に加えた 時は、いずれかの増殖因子 のみを１％のＦＣＳの存在下で加えた場合より少なく且つ小さいクラスターが見 られた。最初は、ＥＢＰとｂＦＧＦとの組合わせが細胞の増殖を誘起するように 見えたが、この増殖刺激は長続きしなかった。ＥＢＰのみのプレート（無血清） では、時折大きなクラスターが観察されたが密度が低く、細胞がより大きく、ほ ぼ半数の細胞がクラスター内で生存不能であった。 これらの結果は、ＥＢＰが結腸腺細胞の増殖、分化又は再形成に関与している ことを示唆する。 Ｄ． 肝細胞の一次培養物に対するＥＢＰの活性 Ｓｅｇｌｅｎによって記述されているその場での２ステップコラゲナーゼ潅流 技術により、肝細胞を分離した（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌ，Ｖｏ ｌ．１Ａ，２３１−２４３（１９９３））。要約すれば、潅流した肝臓を氷冷Ｈ ａｎｋ緩衝液中に分散させ、ナイロンメッシュで濾過し、５０×ｇでの反復遠心 分離により非実質細胞から肝細胞を分離した。肝細胞は、トリパンブルー排除法 により８５％生存率を上回ると決定された。肝細胞を、ラット尾コラーゲンでコ ーティングしたプレート上で培養し、５％ＦＣＳ、１０^-7Ｍインスリン、１０^-8 Ｍデキサメタゾン、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＷｉ ｌｌｉａｍｓ Ｅ中にプレーティングした。 細胞を血清含有培地中で３〜４時間付着させ、次いで無血清培地にトランスフ ァーした。適当な濃度のＥＢＰ又は他の増殖因子を加え、細胞を³Ｈ−チミジン の存在下で２４〜４８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞内 への³Ｈ−チミジンの取込み度を測定した。検査した増殖因子は、１０ｎｇ／ｍ ｌのケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、２０ｎｇ／ｍｌの酸性ＦＧＦ（ａＦＧ Ｆ）及 び２０ｎｇ／ｍｌのＥＢＰである。結果は第９図に示す。ＥＢＰによって剌激さ れた３Ｈ−チミジン取込み量は、ａＦＧＦによって誘起されたものとほぼ同じで ある。ＫＧＦとＥＢＰとの組合わせは、ＫＧＦのみの場合に観察されたレベルと 比べて、肝細胞の増殖を刺激することはなかった。この特定の実験では、無血清 値は通常大きかった（約３倍）。 以上、好ましい実施態様を挙げて本発明を説明してきたが、種々の変形が当業 者によって想到され、これらの変形は総て本発明の範囲に含まれると理解された い。 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２０５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列 配列番号：２ 配列の長さ：３０ヌクレオチド 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：３ 配列の長さ：３５ヌクレオチド 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：４ 配列の長さ：３６ヌクレオチド 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：５ 配列の長さ：３１ヌクレオチド 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：６ 配列の長さ：３５ヌクレオチド 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：７ 配列の長さ：１３ヌクレオチド 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：８ 配列の長さ：１３ヌクレオチド 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：９ 配列の長さ：３９ヌクレオチド 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：１０ 配列の長さ：３９ヌクレオチド 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：１１ 配列の長さ：１４８０ヌクレオチド 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：１２ 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列 配列番号：１３ 配列の長さ：２３アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列 配列番号：１４ 配列の長さ：４０ヌクレオチド 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：１５ 配列の長さ：３９ヌクレオチド 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：１６ 配列の長さ：４１ヌクレオチド 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＣＳ ＡＤＳ ＡＤＵ ＡＥＤ Ｃ０７Ｋ 14/47 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/02 6807−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/566 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ ＡＤＵ ＡＢＥ ＡＣＣ ＡＣＳ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，Ｊ Ｐ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者 ボイル，ウイリアム・ジエイ アメリカ合衆国、カリフオルニア・93021、 ムーアパーク、ウイリアムズ・ランチ・ロ ード・13024 (72)発明者 フオツクス，ゲイリー・エム アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、 ニユーバリー・パーク、ウエスト・ケリ ー・ロード・35 (72)発明者 ウエルチヤー，アンドリユー・エイ アメリカ合衆国、カリフオルニア・91202、 グレンデイル、メリマン・ドライブ・1431 (72)発明者 パーカー，バン・ピー アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、 ニユーバリー・パーク、アンテイロウプ・ プレイス・1086

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ｅｃｋ受容体に特異的に結合し且つ配列番号１に示すものと実質的に同じ アミノ酸配列を有する精製単離ポリペプチド。 ２． ｅｃｋ受容体のリン酸化を誘起する請求項１に記載のポリペプチド。 ３． 位置１５０で終結する配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するか、又 は位置１５０で終結する配列番号１と実質的に同じアミノ酸配列を有する請求項 １に記載のポリペプチド。 ４． アミノ酸配列が配列番号１に示す位置＋１から１５０に及ぶ請求項３に記 載のポリペプチド。 ５． 位置−１にメチオニン残基を有する請求項１に記載のポリペプチド。 ６． ［Ｍｅｔ^-1］ＥＢＰ^1-150及び［Ｍｅｔ^-1］ＥＢＰ^1-159の中から選択した 請求項５に記載のポリペプチド。 ７． ＥＢＰ^1-167、ＥＢＰ^1-171及びＥＢＰ^1-180の中から選択される請求項１ に記載のポリペプチド。 ８． 外来ＤＮＡ配列の原核生物又は真核生物発現産物で あることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。 ９． ＣＨＯ細胞発現産物である請求項８に記載のポリペプチド。 １０． 外来配列がｃＤＮＡ配列である請求項８に記載のポリペプチド。 １１． 外来配列がゲノムＤＮＡ配列である請求項８に記載のポリペプチド。 １２． 外来配列が合成ＤＮＡ配列である請求項８に記載のポリペプチド。 １３． 外来ＤＮＡ配列が自律複製型ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターに 担持されている請求項８に記載のポリペプチド。 １４． 大腸菌発現産物である請求項８に記載のポリペプチド。 １５． Ｎ末端メチオニン残基を有する請求項８に記載のポリペプチド。 １６． ｅｃｋ受容体に特異的に結合するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列 であって、前記ポリペプチドが位置−１にメチオニン残基を有し且つ配列番号１ に示すものと実質的に同じアミノ酸配列を有する前記ＤＮＡ配列。 １７． ［Ｍｅｔ^-1］ＥＢＰ^1-150及び［Ｍｅｔ^-1］ＥＢＰ^1-159をコードする請 求項１６に記載のＤＮＡ配列。 １８． ＥＢＰ^1-167、ＥＢＰ^1-171及びＥＢＰ^1-180をコードするＤＮＡ配列。 １９． 単離ｅｃｋ受容体−リガンド複合体。 ２０． リガンドが請求項１に記載のポリペプチドである請求項１３に記載の受 容体−リガンド複合体。 ２１． 受容体に結合することができるリガンドを未精製試料中で検出するため の方法であって、 ａ）受容体の精製リガンド結合領域を固定化し、 ｂ）固定化受容体をリガンド含有ならし培地と接触させ、 ｃ）表面プラスモン共鳴検出システムにより固定化受容体へのリガンドの結合を モニターする ステップを含む前記方法。 ２２． 受容体がｅｃｋ受容体である請求項２１に記載の方法。 ２３． 哺乳動物におけるｅｃｋ受容体の内在活性を調節する方法であって、ｅ ｃｋ受容体に対するリガンドを前記受容体の活性を変化させるのに有効な量で哺 乳動物に投与することからなる前記方法。 ２４． リガンドが請求項１に記載のポリペプチドである請求項２３に記載の方 法。 ２５． 前記ｅｃｋ受容体活性の変化が、分化、増殖及び代謝を含む細胞機能を 調節する請求項２３に記載の方法。 ２６． ｅｃｋ受容体の活性を調節する化合物を同定するための方法であって、 ａ）受容体を提示する細胞を、受容体−リガンド複合体の形成とシグナル形質導 入の誘起とを可能にするのに十分な時間にわたって既知のリガンドに暴露し、 ｂ）細胞内の活性度を測定し、 ｃ）測定した活性を、リガンドに暴露していない細胞内の活性と比較する ステップを含む前記方法。 ２７． 治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドを患者に投与することからなる癌 の治療方法。 ２８． 請求項２７に記載のリガンドを患者に治療上有効量投与することからな る癌の治療方法であって、前記リガンドがｅｃｋ受容体に結合するが該受容体を リン酸化することはない、前記方法。 ２９． 治療上有効量のｅｃｋ可溶性受容体を患者に投与 することからなる癌の治療方法。 ３０． 治療上有効量の化学療法又は放射線療法も含む請求項２７から２９のい ずれか一項に記載の方法。 ３１． 治療上有効量のｅｃｋ可溶性受容体を患者に投与することからなる炎症 の治療方法。 ３２． 治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドを患者に投与することからなり、 前記リガンドがｅｃｋ受容体に結合するが該受容体をリン酸化することはない、 炎症の治療方法。 ３３． 治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドを投与することからなる哺乳動物 の創傷の治療方法。 ３４． 治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドを投与することからなる哺乳動物 の造血機能増進方法。 ３５． リガンドが請求項１に記載のポリペプチドである請求項３４に記載の方 法。 ３６． 治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドを投与することからなる結腸細胞 増殖剌激方法。 ３７． 癌の治療と関連して使用される請求項３６に記載の方法。 ３８． リガンドが請求項１に記載のポリペプチドである 請求項３６に記載の方法。 ３９． 治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドを投与することからなる肝細胞増 殖刺激方法。 ４０． リガンドが請求項１に記載のポリペプチドである請求項３９に記載の方 法。 ４１． 治療上有効量のｅｃｋ受容体リガンドと、医薬的に許容し得る希釈剤、 アジュバント又は担体とを含む医薬組成物。 ４２． 治療上有効量のｅｃｋ可溶性受容体と、医薬的に許容し得る希釈剤、ア ジュバント又は担体とを含む医薬組成物。 ４３． 請求項１に記載のポリペプチドと洗剤とを含む組成物。