DE69321555T2

DE69321555T2 - ECK-Rezeptor-Liganden

Info

Publication number: DE69321555T2
Application number: DE69321555T
Authority: DE
Inventors: Timothy D. Thousand Oaks Ca 91362 Bartley; William J. Moorpark Ca 93021 Boyle; Gary M. Newbury Park Ca 91320 Fox; Vann P. Newbury Park Ca 91320 Parker; Andrew A. Newbury Park Ca 91320 Welcher
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1992-11-13
Filing date: 1993-11-15
Publication date: 1999-06-24
Anticipated expiration: 2013-11-16
Also published as: NO951861L; FI952328A; US5716934A; JPH08505765A; CA2149333A1; IL107599A0; US5650504A; AU5599794A; FI952328A0; ES2121915T3; NO951861D0; DK0597503T3; CA2149333C; AU685765B2; ATE172246T1; CN1094446A; WO1994011020A1; EP0597503A3; EP0597503A2; EP0597503B1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein Liganden des eck-Rezeptors, insbesondere als eck-Rezeptor- Bindungsproteine (EBPs) bezeichnete Polypeptid-Liganden. Weiterhin umfaßt die Erfindung die Verwendung von eck-Rezeptor-Liganden und diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen. Ein schnelles und empfindliches Verfahren zum Nachweis von Rezeptor-Bindungsaktivität in nicht aufgereinigten Proben wird beschrieben.

Hintergrund der Erfindung

Peptid-Wachstums- und Differenzierungsfaktoren rufen durch spezifische Interaktionen mit Rezeptoren an der Zelloberfläche Antworten in den Zielzellen hervor. Wachstumsfaktor- Rezeptoren sind typischerweise Membran-Glycoproteine mit getrennten Extrazellulär-, Transmembran- und Intrazellulär-Domänen. Die strukturelle Trennung der Domänen entspricht der Funktion (Ullrich et al., Cell 61, 203 (1990)); die Extrazellulär-Domäne scheint fiu die Liganden-Bindung und Liganden-vermittelte Rezeptor-Dimerisierung (Cunningham et al., Science 254, 821 (1991); Lev et al., J. Biol. Chem. 267, 10866 (1992)) verantwortlich zu sein, während die Intrazellulär-Domäne des Rezeptors oder die Intrazellulär-Domäne eines akzessorischen Elements (Takeshita et al., Science 257, 379 (1992)) verantwortlich ist für die Signal-Transduktion. Ein Großteil der Spezifität der Wachstumsfaktor-Aktivität wird bestimmt durch die Interaktion mit der Bindungsstelle auf der Extrazellulär-Domäne des Erkennungsrezeptors. Chimäre Rezeptoren, so verändert, daß sie die Extrazellulär-Domäne eines Rezeptors und die Intrazellulär-Domäne eines zweiten Rezeptors enthalten, behalten die Liganden-Spezifität der Extrazellulär-Komponente (Lehvaslaiho et al., EMBO J. 8, 159 (1989)). Die abwärts gerichteten Signal-Wege, die von solchen chimären Rezeptoren aktiviert werden, entsprechen jenen, die von der Intrazellulär-Komponente aktiviert werden. In vielen Fällen behalten die löslichen nur aus Extrazellulär-Domänen bestehenden Rezeptor-Formen die Liganden-Bindungsaktivität bei (Lev et al., supra; Duan et al., J. Biol. Chem. 266, 413 (1991)). Verkürzte Rezeptoren sind im Serum (Fernandez-Botran, FASEB J. 5, 2567 (1991)), Zellkultur-Überständen (Zabrecky et al., J. Biol. Chem. 266, 1716 (1991)) nachgewiesen worden und durch Rekombinationsverfahren hergestellt worden (Lev et al., supra; Duan et al., supra).
Fortschritt in der Nucleinsäure-Sequenzierung und -Amplifikationsverfahren in neuerer Zeit hat zur Identifizierung einer steigenden Anzahl an Genen geführt, die für vorher nicht identifizierte Wachstumsfaktor-Rezeptoren kodieren (Wilks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 36, 1603 (1989); Lai et al., Neuron 6, 691 (1991)). Folglich besteht ein Bedarf daran, Verfahren zu entwickeln, die die biologischen Rollen der Waisen-Rezeptoren definiert, einschließlich Verfahren, die Liganden für diese Rezeptoren identifizieren können (McConnell et al., Science 257, 1906 (1992)). Das Rezeptor-Affinitätsverfahren ist ein Ansatz für dieses Problem. Dieses Verfahren kann existierende Strategien zur Isolierung neuer Wachstumsfaktoren verstärken, da es den Nachweis von Liganden erlaubt, wenn die biologischen Antworten gering oder unbestimmt sind.
Neuere Berichte haben nahegelegt, daß die Extrazellulär-Dömänen von Rezeptoren als Wachstumsfaktor-spezifische Affinitätsreagenzien genutzt werden können. Bailon et al. (Biotechnology 5, 1195 (1987)) haben gezeigt, daß die Extrazellulär-Domäne der IL2-Rezeptor α-Untereinheit an chromatographischen Medien immobilisiert und zur Aufreinigung von rekombinantem IL2 verwendet werden kann. Eine genetische Fusion der kit-Extrazellulär- Domäne mit einem alkalische Phosphatase-enzymatischen Tag erlaubte die Identifizierung eines Zell-assoziierten Liganden für den Rezeptor (Flanagan et al., Cell 63, 185 (1990)). Lupu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2287 (1992)) haben die Affinitätsreinigung einer Aktivität beschrieben, die an die immobilisierte Extrazellär-Domäne des erbB-2-Genprodukts bindet.
Das ursprünglich durch cDNA-Klonierung aus einer humanen Epithelzell-Bibliothek identifizierte eck-Gen kodiert eine 130 kDa Rezeptor-artige Protein-Tyrosin-Kinase (p130eck) (im nachfolgenden als der eck-Rezeptor bezeichnet) (Lindberg et al., Mol. Cell. Biol. 10, 6316 (1990)). Immunhistochemisches und mRNA-Screening von Geweben und Zellinien legt nahe, daß die eck-Expression am höchsten in Zellen epithelialer Herkunft ist. In Analogie zu Genen, die andere Rezeptor-artige Protein-Tyrosin-Kinasen kodieren, kann das eck ein Proto-Onko gen sein und deshalb eine Rolle in der Karzinogenese haben. Diese mögliche Rolle für eck ist wahrscheinlicher aufgrund der häufigen Beteiligung epithelialer Zellen bei humanen Krebsarten. Rezeptor-Protein-Kinasen werden typischerweise aktiviert durch Interaktion mit einem oder mehreren Liganden. Jedoch wurde bisher kein Ligand beschrieben, der p130eck aktivieren kann. Die Identifizierung eines solchen Liganden kann wichtig sein, um die Rolle von p130eck-Aktivierung bei der Entwicklung einiger humaner Krebsarten zu bestimmen.
Es ist deshalb eine Aufgabe dieser Erfindung, einen oder mehrere Liganden für p130eck zu identifizieren. Die mögliche Rolle von p130eck bei der Transformation von Epithelzellen in einen Krebszustand legt nahe, daß die Identifizierung des für die Rezeptor-Aktivierung verantwortlichen Liganden therapeutische Auswirkungen für einige Epithelzell-abgeleitete Malignitäten haben kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eck-Rezeptor-Liganden. Insbesondere werden spezifisch an den eck-Rezeptor bindende Polypeptide offenbart, hier als eck-Rezeptor-Bindungsproteine (EBPs) bezeichnet. EBPs werden identifiziert und isoliert durch Affinitätschromatographie mit dem immobilisierten Extrazellulär-eck-Rezeptor. EBPs der vorliegenden Erfindung können auch die Phosphorylierung nach Rezeptor-Bindung induzieren, was Änderungen in der Zielzell-Physiologie, z. B. Zellwachstum und/oder Differenzierung auslösen kann. EPB hat im wesentlichen die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform hat EBP einen Teil der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Beispielsweise hat EBP eine bei Position 150 endende Aminosäuresequenz.
Ein spezifisch an den eck-Rezeptor bindendes Polypeptid, wobei das Polypeptid im wesentlichen die gleiche in SEQ ID NO: 1 gezeigt Aminosäuresequenz und einen Methionin-Rest an Position -1 hat, ist weiterhin umfaßt. Spezielle Beispiele sind das Polypeptid [Met&supmin;¹] EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0; oder [Met&supmin;¹] EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup9;. Weiterhin werden dafür kodierende DNA-Sequenzen bereitgestellt. EBPs können auch Analoga sein, die einen Teil der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz haben. Beispiele solcher Analoga sind EBPs, die an den Positonen 167, 171 oder 180 enden.
Die Erfindung stellt auch EBP bereit als Produkt prokaryotischer oder eukaryotischer Expression einer exogenen DNA-Sequenz, d. h. das eck-Rezeptor-Bindungsprotein wird abgeleitet aus rekombinaten DNA-Verfahren.
Ein Verfahren zum Nachweis der Rezeptor-Bindungsaktivität in nicht aufgereinigten Proben durch Überwachung der Bindung an eine immobilisierte Liganden-Bindungsdomäne eines Rezeptors wird auch von der Erfindung umfaßt.
Pharmazeutische Zubereitungen, die eine therapeutisch wirksame Menge eines eck-Rezeptor- Liganden umfassen, werden beschrieben. Weiterhin umfaßt ist die Verwendung eines eck- Rezeptor-Liganden bei der Behandlung bestimmter Krebs-Typen, besonders der durch Epithelzell-Proliferation gekennzeichneten Typen. eck-Rezeptor-Liganden können auch zur Behandlung von Wunden zur Beschleunigung der Heilung, zur Erhöhung der Hämatopoiese und zur Stimulierung der Proliferation von Hepatozyten und Kolon-Krypten-Zellen verwendet werden:
Die Verwendung therapeutisch wirksamer Mengen von Liganden-Antagonisten zur Modulierung der biologischen Wirkungen der eck-Rezeptor-Liganden wird auch von der Erfindung umfaßt. Solche Behandlungen sind nützlich bei der Therapie von Krebs und bei Entzündungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A. SDS-PAGE-Analyse immobilisierter eck-x-Affinitätschromatographie. Konditioniertes Medium aus HCT-8-Zellen wurde konzentriert, diafiltriert und auf eine 1 ml Säule von immobilisiertem eck-x (1 mg eck-x pro ml Gel) geladen. Die Proben wurden, soweit notwendig, in Gegenwart von 0,02% SDS konzentriert; die entsprechenden ursprünglichen Volumina sind in Klammer angegeben. Spur 1, Säulenbeladung (20 ml). Spur 2, nicht-gebundene Fraktion (20 ml). Spur 3, PBS-Waschung (50 ml). Spur 4, pH 4,0 Elution, Fraktion 1 (200 ml). Spur 5, pH 4,0 Elution, Fraktion 2 (200 ml). Spur 6, pH 4,0 Elution, Fraktion 3 (200 ml).
Fig. 1B. SDS-PAGE-Analyse immobilisierter eck-x-Affinitätschromatographie. Zell- Überstände aus CHO-Zellen, transfiziert mit dem EBP-Gen, wurden behandelt und, wie in der Legende zu Fig. 1A beschrieben, untersucht.
Fig. 2. Gelitrations-Analyse von aufgereinigtem EBP aus der HCT-8-Zellinie. Durch immobilisierte eck-x-Rezeptor-Affinitätschromatographie aufgereinigtes EBP wurde versetzt mit 50 ug/ml BSA und auf eine Superdex 75-Säule injiziert. Die Fraktionen wurden auf eck- x-Bindungsaktivität durch BIAcore untersucht.
Fig. 3. Q-Sepharose-Chromatographie von EBP aus CHO-Zellen transfiziert mit EBP cDNA. Proben wurden analysiert durch SDS-PAGE und mit dem anti-EBP-Antikörper als Sonde in Kontakt gebracht:
Fig. 4. Untersuchung der Freisetzung von Membran-gebundenem EBP von CHO- Zelloberflächen durch Phospholipase C-Behandlung. "-" bedeutet die Inkubation in Abwesenheit von Phospholipase C; "+" bedeutet die Inkubation in Gegenwart von Phospholipase C. Die Inkubationszeit war 0,5 und 10 Minuten.
Fig. 5. Chemische Vernetzung von ¹²&sup5;I-rEBP an CHO 19.32-Zellen, die eck exprimieren. Die Zellen wurden wie in Beispiel 5 beschrieben behandelt. Spur 1, ¹²&sup5;I-rEBP + CHO 19.32. Spur 2, ¹²&sup5;I-rEBP + CHOd- (nicht transfiziert). Spur 3, ¹²&sup5;I-rEBP + CHO 19.32, kein Vernetzungsmittel hinzugefügt. Spur 4, ¹²&sup5;I-rEBP + CHO 19.32 + 50 · nicht-markiertes rEBP.
Fig. 6. Aktivierung der eck-Rezeptor-Tyrosin-Kinase in mit aufgereinigtem rEBP behandelten LIM 2405-Zellen. Serum-verarmte LIM 2405-Zellen wurden über 10-15 min bei 37ºC mit ansteigender Konzentration an aufgereinigtem rEBP (CHOd-/EBP) behandelt. Die behandelten Zellen wurden lysiert und sodann mit anti-eck C-terminalem Antikörper immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden in zwei gleiche Gruppen unterteilt und parallel in einem 7,5% SDS-Polyacrylamidgel getrennt. Das Gel wurde auf Membran geblottet und sodann entweder mit monoklonalem anti-Phosphotyrosin-Antikörper (obere Tafel) oder antieck C-Terminus (untere Tafel) als Sonde in Kontakt gebracht. Die Wanderung des eck-Polypeptids ist durch eine Pfeilspitze markiert.
Fig. 7. Bindung von CHO-abgeleitetem EBP in verschiedenen Detergenz-Formulierungen an immobilisierten eck-Rezeptor gemessen durch BIAcore. Aufgereinigtes EBP wurde auf 100 ug/ml in PBS in Gegenwart oder Abwesenheit von Detergens verdünnt und über 2 Stunden bei 3ºC inkubiert. Die Proteinproben wurden auf die in der Figur angegebenen Konzentrationen verdünnt und auf eck-Rezeptor-Bindung untersucht.
Fig. 8. CFU-C- und CFU-Mk-Bildung in Knochenmarks-Kulturen in Gegenwart von EBP allein und in Kombination mit IL-3, Erythropoietin oder GM-CSF.
Fig. 9. Einbau von ³H-Thymidin in Hepatozyten-Kulturen in Gegenwart von EBP, saurem FGF oder KGF.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Liganden, die an den eck-Rezeptor, eine von Lindberg et al., supra, identifizierte 130 kDa Protein-Tyrosin-Kinase binden. Ein eck-Rezeptor-Ligand kann den Rezeptor durch Induzieren der Autophosphorylierung durch die katalytische Domäne der Protein-Tyrosin-Kinase aktivieren. Protein-Tyrosin-Kinasen sind Teil des Signaltransduktionsweges, der die Zell-Proliferation und die -Differenzierung moduliert. Deshalb wird ein zur Aktivierung der Protein-Tyrosin-Kinase-Aktivität des eck-Rezeptors fähiger Ligand wahrscheinlich wichtig sein bei der Modulierung des Wachstums und der Differenzierung von diesen Rezeptor exprimierenden Zellen. Ein eck-Rezeptor-Ligand kann ein Polypeptid, Peptid oder Nicht-Protein-Molekül sein, das an den eck-Rezeptor bindet und/oder diesen aktiviert.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Polypeptide bereit, die spezifisch an den eck-Rezeptor binden. Diese Polypeptide werden als eck-Bindungsproteine oder EBPs (eck-Rezeptor-Bindungsproteine) bezeichnet. EBPs sind aus konditioniertem Medium von SK-BR-3 und HCT-8 Zellinien durch Rezeptor-Affinitätschromatographie mit der eck-Rezeptor-Extrazellulär- Domäne (eck-x) als Affinitätsreagenz isoliert worden. Die Konstruktion des eck-x-Gens und Expression und Aufreinigung des eck-x sind in Beispiel 1 beschrieben. Die Aufreinigung von eck-Bindungsproteinen an immobilisiertem eck-x ist in Beispiel 3A beschrieben.
Aus der HCT-8 Zellinie abgeleitetes EBP liegt in mehreren unterschiedlichen Molekulargewichts-Formen im Bereich von 21-27 kDa vor, wie durch SDS-PAGE (Fig. 1A) gezeigt wurde. N-terminale Sequenzierung von EBPs im 21-27 kDa-Bereich zeigte eine einzige Sequenz (Beispiel 3B). Nach der enzymatischen Entfernung der Kohlenhydratketten wurde ein Gemisch von Formen im Bereich von 17-19 kDa beobachtet, das nahelegt, daß die unterschiedlichen Formen aus der alternativen post-translationalen Prozessierung des Proteins stammen.
Die N-terminale Sequenz von SK-BR-3 abgeleitetem EBP war identisch mit der für die Expression des B61-Gens vorhergesagten N-terminalen Aminosäuresequenz (Holzman et al., Mol. Cell. Biol. 10, 5830 (1990); PCT-Anmeldung Nr. WO 92/07094). Das B61-Gen wurde ursprünglich durch differenzielle Hybridisierung als direktes-frühes (immediate-early) Antwort-Gen identifiziert, und seine Expression wurde in kultivierten humanen Gefäß-Endothelzellen durch Behandlung mit Tumor-Nekrosefaktor-α induziert. Aufgrund der Sequenz des EBP-Gens wurde vorhergesagt, daß das kodierte Protein in seiner reifen Form 187 Aminosäuren hat. Die Isolierung und Charakterisierung des EBP-kodierten Proteins ist zuvor nicht beschrieben worden. Es wurde vorgeschlagen, daß das EBP-Protein als Zytokin-induzierter Marker für die Entzündung wirkt, und deshalb nützlich ist als diagnostisches Reagenz zum Nachweis einer bevorstehenden Entzündungs-Antwort (PCT-Anmeldung Nr. WO 92107094).
EBP-kodierende cDNA mit der in Beispiel 3B bestimmten N-terminalen Sequenz wurde kloniert und sequenziert, und es wurde erwartungsgemäß gefunden, daß sie identisch ist mit der des B61-Gens (Holzman et al., supra). Die von Holzman et al. beschriebene B61-DNA- Sequenz ist in SEQ ID NO: 11 gezeigt. Das EBP (oder EBP-Gen) wurde wie in Beispiel 4 beschrieben in CHO-Zellen und in E. coli exprimiert. Wenigstens zwei Polypeptide mit unterschiedlichen Molekulargewichten wurden von dem EBP-Gen in CHO-Zellen exprimiert. C- terminale Sequenzierung von CHO-Zell-EBP zeigte nur die Sequenz-Lys-Arg-Leu-Ala-Ala- COOH, was ein Polypeptid von 150 Aminosäureresten anzeigt. Dieses Polypeptid wird als EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0; bezeichnet. Ein dem vorhergesagten EBP-Protein entsprechendes Polypeptid von 187 Aminosäuren stellt, sofern überhaupt vorhanden, ein sehr gering vorkommendes Produkt der CHO-Zell-Expression dar. Die Expression des EBP-Gens (ohne die Signalsequenz) in E. coli führte zu einem einzigen Produkt in der SDS-PAGE mit einer für das Vollängen-Protein vorhergesagten C-terminalen Sequenz. Dieses Polypeptid, das einen Methionin-Rest am Aminoterminus hat, wird als [Met&supmin;¹] EPB¹&supmin;¹&sup8;&sup7; bezeichnet, und ist mit Ausnahme des N-terminalen Met identisch in der Aminosäuresequenz mit dem vorhergesagten EBP-Protein.
Es ist durch die folgenden Experimente (vgl. auch Beispiel 5) gezeigt worden, daß das CHO- Zell-abgeleitete rEBP mit dem eck-Rezeptor wechselwirkt: 1) Vernetzung von CHO-rEBP mit natürlicherweise den eck-Rezeptor exprimierenden Colon-Karzinom-Zellen oder mit CHO- Zellen, transfiziert mit dem eck-Gen; 2) Gleichgewichts-Bindungsstudien von CHO-rEBP mit den eck-Rezeptoren auf Colon-Karzinom-Zellen; und 3) Stimulierung der eck-Rezeptor-Phosphorylierung in Colon-Karzinom-Zellen. Induktion der Rezeptor-Phosphorylierung durch CHO-rEBP zeigt an, daß der Ligand vielleicht in der Lage ist, eine biologische Antwort (z. B. Wachstum oder Differenzierung) in den eck-Rezeptor zeigenden Zellen zu bewirken.
Es ist ersichtlich, daß EBP in einer Anzahl unterschiedlicher Molekulargewichtsformen exprimiert werden kann, wobei mehr als eine biologisch aktiv sein kann. Verschiedene Formen von EBP werden natürlicherweise von humanen Zellinien und von EBP-Gen-transfizierten Wirtszellen, wie in den Fig. 1A und 1B gezeigt, hergestellt. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde EBP aus transfizierten CHO-Zellen als zwei unterschiedliche Molekulargewichtsformen von 22 kDa (hauptsächlich) und 24 kDa (gering) isoliert. Charakterisierung dieser unterschiedlichen Formen zeigte zwei getrennte EBPs von 150 und 159 Aminosäuren, bezeichnet als EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0; und EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup9;. Phosphoinositol-Phospholipase C-Behandlung von EBP-transfizierten CHO-Zellinien setzt lösliches EBP frei, was eine Glycolipidform von EBP sehr nahelegt: Isolierte 27 kDa Formen von EBP sind einem Verdau mit Phospholipase D zugänglich, was nahelegt, daß diese Formen gelöste Formen des Glykophospholipid-verankerten EBP sind.
Die Erfindung stellt weiterhin EBP mit der Aktivität der spezifischen Bindung an den eck- Rezeptor und mit im wesentlichen der gleichen in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz bereit. Der hier verwendete Begriff "im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz" betrifft Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in SEQ ID NO: 1, so daß die entstehenden Polypeptide spezifisch an den eck-Rezeptor binden. Wie vorstehend beschrieben, induziert EBP auch die Phosphorylierung des eck-Rezeptors. Jedoch umfaßt die vorliegende Erfindung Polypeptide, die den eck-Rezeptor binden und die Rezeptor-Phosphorylierung induzieren können oder nicht können. In einer bevorzugten Ausführungsform hat EBP einen Teil der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Beispielsweise hat EBP die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz, die an der Positionen 150 endet, oder hat im wesentlichen die gleiche wie in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz. Vorzugsweise ist EBP EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0;, d. h. es hat die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz von den Positionen +1 bis 150.
Ein EBP mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 hat einen Methionin-Rest an Position -1 hat, und ist auch umfaßt. [Met&supmin;¹] EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0; und [Met&supmin;¹] EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup9; sind Beispiele. Weiterhin werden auch diese kodierende DNA-Sequenzen bereitgestellt. Eine verkürzte DNA-Sequenz, die die in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäurereste kodiert, wurde konstruiert und in E. coli exprimiert. Das resultierende Protein, [Met&supmin;¹] EBP¹&supmin; ¹&sup5;&sup0;, bindet an den eck-Rezeptor und induziert die Rezeptor-Phosphorylierung (Beispiel 6).
Weiterhin umfaßt die Erfindung Fragmente und Analoga des Polypeptids mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz, wobei die Fragmente und Analoga an den eck-Rezeptor binden und diese Fragmente und Analoga kodierende DNA-Sequenzen. Es werden Fragmente mit Deletionen am N-terminalen oder C-terminalen Ende des in SEQ ID NO: 1 gezeigten Polypeptids und Deletionen auf internen Regionen umfaßt. Beispiele von EBP-Fragmenten umfassen EBP¹&supmin;¹&sup6;&sup7;, EBP¹&supmin;¹&sup7;¹ und EBP¹&supmin;¹&sup8;&sup0;, die in Beispiel 5 beschrieben sind. Analoga umfassen Aminosäure-Substitutionen an einer oder mehreren Stellen im Polypeptid. Fragmente und Analoga der Erfindung werden leicht hergestellt mit rekombinanten DNA-Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Die biologische Aktivität der entstehenden Fragmente und Analoga ist leicht zu untersuchen durch die Bindung an löslichen eck-Rezeptor oder an eck-Rezeptoren auf Zelloberflächen oder durch Induzieren der Phosphorylierung des eck-Rezeptors.
Die Erfindung umfaßt auch EBP, dadurch gekennzeichnet, daß es das Produkt prokaryotischer oder eukaryotischer Expression einer exogenen DNA-Sequenz ist, d. h. EBP ist rekombinantes EBP. Exogene DNA-Sequenzen können cDNA, genomische oder synthetische DNA-Sequenzen sein. EBP kann in bakteriellen, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder Säugerzellen in Kultur oder in transgenen Tieren exprimiert werden. Zur Expression von EBP geeignete DNA-Vektoren in einer Vielzahl von Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt. Beispiele solcher Vekto ren sind pDSRα2 für die Expression von EBP-Gen in CHO D-Zellen und pCFM1 156 für die Expression des EBP-Gens in E coli.
EBP-Expression in E. coli führt zur Bildung von unlöslichen Einschlußkörpern (inclusion bodies). Die Wiedergewinnung von biologisch aktivem EBP erfordert die Solubilisierung von EBP-Aggregaten mit nachfolgender Rückfaltung des gelösten Proteins. Beispiel 4C beschreibt ein Rückfaltungsverfahren für E. coli abgeleitetes EBP, das EBP ergibt, das aktiv ist in der eck-x-Bindung und eck-Phosphorylierung. EPB-Rückfaltungsverfahren können modifiziert werden, um die Aktivität des renaturierten Proteins und die Ausbeute an aktivem EPB zu erhöhen. Solche Modifikationen umfassen den Wechsel des zur Solubilisierung des Einschlußkörpers verwendeten Denaturierungsmittels (z. B. Verwendung von Guanidiniumchlorid anstelle von Harnstoff), des Oxidationsmittels (was Oxidations-/Reduktionspaare wie oxidiertes und reduziertes Glutathion umfassen kann), oder des Verdünnungsverfahrens des Denaturierungsmittels (z. B. EBP kann bei einer unterschiedlichen Proteinkonzentration in einem Detergens-enthaltenden Puffer bei einem modifizierten pH verdünnt werden).
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines in nicht aufgereinigten Proben, wie z. B. konditioniertem Medium, vorhandenen Liganden, der fähig ist, einen Rezeptor zu binden. Das Verfahren umfaßt die Schritte:
a) Immobilisieren einer aufgereinigten Liganden-Bindungsdomäne des Rezeptors;
b) In-Kontakt-Bringen des immobilisierten Rezeptors mit den Liganden enthaltendem konditioniertem Medium; und
c) Überwachen der Bindung des Liganden an den immobilisierten Rezeptor durch ein Oberflächen-Plasmon-Resonzanz-Nachweissystem (surface plasmon resonance detection system).
Wie in Beispiel 2 beschrieben, stellt dieses Verfahren ein schnelles und empfindliches Screening auf eck-Rezeptor-Bindungsaktivität in Zellüberständen bereit. Die Ergebnisse dieses Screenings sind in Tabelle 1 gezeigt. Obwohl das Verfahren zum Nachweis der eck-Bindungsaktivität verwendet wird, kann es allgemein auf jede Rezeptor-Ligand-Interaktion angewendet werden. Jede Liganden-Bindungsdomäne eines Rezeptors kann zur Isolierung von Rezeptor-Bindungsproteinen immobilisiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Liganden-Bindungsdomäne die Extrazellulär-Domäne oder ein Fragment oder Analogon davon, das zur Bindung fähig ist. Zusätzlich zum Screening von Zellüberständen kann das Verfahren auch zum Screening von Gemischen von Peptiden mit zufälliger Sequenz auf Rezeptor-Bindung verwendet werden.
Die Erfindung stellt erstmals ein Verfahren zum Modulieren der endogenen enzymatischen Aktivität eines eck-Rezeptors bereit. Das Verfahren umfaßt das Verabreichen einer effektiven Menge eines Liganden des eck-Rezeptors an einen Säuger, um die enzymatische Aktivität des Rezeptors zu modulieren. Die eck-Rezeptor-enzymatische Aktivität reguliert zelluläre Funktionen, die die Differenzierung, Proliferation und den Metabolismus umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist EPB oder ein Fragment oder Analogon davon, der Ligand. Jedoch können auch andere Liganden zur Modulierung der eck-Rezeptor-Aktivität verwendet werden, beispielsweise, nicht zu EPB in Beziehung stehende Polypeptide, oder Peptide und Nicht-Protein-organische Moleküle.
Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Aktivität eines eck-Rezeptors modulieren. Das Verfahren umfaßt die Schritte:
a) In-Kontakt-Bringen der den Rezeptor tragenden Zellen für bekannte Liganden über eine ausreichende Zeit, um die Bildung von Rezeptor-Ligand-Komplexen zu erlauben und die Signal-Transduktion zu induzieren;
b) Bestimmen des Ausmaßes der Aktivität in den Zellen; und
c) Vergleichen der gemessenen Aktivität mit der Aktivität in Zellen, die nicht mit dem Liganden in Kontakt gebracht worden sind.
Die eck-Rezeptor-Aktivität kann durch Änderungen in der Zielzell-Proliferation, -Differenzierung oder -Metabolismus nachgewiesen werden. Eine Beschreibung von Verfahren, die die Modulierung der eck-Rezeptor-Aktivität auf hämatopoietischen Vorläufer-Zellen, Colon-Krypten-Zellen und Hepatozyten betreffen, ist in Beispiel 9 wiedergegeben.
Die Erfindung umfaßt auch einen isolierten eck-Rezeptor-Ligand-Komplex, der aus der Interaktion des eck-Rezeptors mit einem Liganden wie EBP entsteht. Die Interaktion kann zur Aktivierung des Rezeptors und zur Transduktion eines Signals führen, das den physiologischen Zustand der Rezeptor tragenden Zellen moduliert. Vorzugsweise wirkt der Ligand als Wachstumsfaktor, um die Proliferation der Zielzellen zu stimulieren. Alternativ kann die Liganden-Bindung den eck-Rezeptor nicht aktivieren. In diesem Fall kann der Ligand als ein Antagonist für andere Moleküle dienen, die den Rezeptor aktivieren und die Signal-Transduktion induzieren.
Der eck-Rezeptor wird primär in Geweben mit bedeutenden Anteilen an Epithelzellen (z. B. Lunge und Darm) und in von Epithelzellen abgeleiteten Zellinien exprimiert (Lindberg et al., supra). Ein Ligand des eck-Rezeptors kann entweder das Wachstum oder die Differenzierung von den Rezeptor exprimierenden Zellen stimulieren. Ein Ligand, der die Differenzierung von den eck-Rezeptor tragenden Zellen induziert, kann nützlich sein bei der Behandlung von bestimmten Krebstypen, insbesondere jenen, die aus der Proliferation von Epithelzellen entstehen. Ein eck-Rezeptor-Ligand kann allein oder in Kombination mit Standard-Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie zur Krebsbehandlung verwendet werden.
EBP-Interaktion mit dem eck-Rezeptor kann beteiligt sein bei der Entwicklung eines Krebszustandes durch Stimulierung des Zellwachstums oder kann die Metastasierung durch Stimulierung der Zellbeweglichkeit und -adhäsion fördern. Mehrere Strategien sind verfügbar zur Modulierung der biologischen Wirkungen von EBP. Fragmente oder Analoga von EBP, die an den eck-Rezeptor binden, diesen jedoch nicht aktivieren, sind nützlich als EBP-Antagonisten. Die Verabreichung eines EBP-Antagonisten mit Affmität für den eck-Rezeptor wird die Rezeptor-Bindung und Aktivierung durch zirkulierendes EBP blockieren.
Weiterhin können monoklonale Antikörper, die entweder gegen EBP oder gegen den eck- Rezeptor gerichtet sind, nützlich sein zur Blockierung der Interaktionen von EBP mit eck- Rezeptoren auf Zelloberflächen.
Es ist gezeigt worden, daß die Expression des EBP-Gens in Endothelzellen durch TNF-α und IL-1β, zwei proinflammatorische Cytokine, die verschiedene Funktionen in Endothelzellen aktivieren, als Teil der Entzündungsantwort (Holzman et al., supra) stimuliert werden.
Ein Verfahren zur Wundbehandlung in einem Säuger, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines eck-Rezeptor-Liganden, wird bereitgestellt. Wie in Beispiel 9A gezeigt, förderte EBP einen Anstieg im Gewebe-Naßgewicht, Gesamtprotein, Gesamt-DNA und Gesamt-Glycosaminoglycan im Ratten-Wund-Kammer-Assay. Da EBP früh in der Entzündungsantwort exprimiert wird, könnte es eine Rolle spielen bei der Rekrutierung von Epithelzellen an den Ort der Verletzung.
Ein Verfahren zur Erhöhung der Hämatopoiese in einem Säugetier, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines eck-Rezeptor-Liganden, wird auch bereitgestellt. Wie in Beispiel 9B gezeigt, zeigt EPB in Kombination mit Interleukin-3 (IL-3) eine deutliche Erhöhung an CFU-Cs in Maus-Knochenmarks-Kulturen. EBP wäre verwendbar bei der Wiederherstellung der Hämatopoiese nach Unterdrückung des Knochenmarks, entweder als Ergebnis einer Krankheit oder nach Aussetzen gegenüber Knochenmarks-unterdrückenden Mitteln, wie chemotherapeutischen Medikamenten oder Mitteln. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine therapeutisch wirksame Menge von EBP in Kombination mit einer therapeutisch wirksamen Menge von IL-3 zur Erhöhung der Hämatopoise verwendet.
Weiterhin umfaßt ist ein Verfahren zur Stimulation der Proliferation von Colon-Zellen in einem Säuger, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines eck- Rezeptor-Liganden. Wie in Beispiel 9C gezeigt, stimuliert EBP die Zell-Proliferation in einem Colon-Krypten-Assay. Ein eck-Rezeptor-Ligand wie EBP wäre nützlich bei der Milderung der auf Chemotherapie folgenden Darm-Toxizität:
Ein Verfahren zur Stimulation der Proliferation von Hepatozyten, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines eck-Rezeptor-Liganden wird bereitgestellt. Beispiel 9D zeigt die Stimulation von Hepatozyten durch EBP. Diese Stimulation ist vergleichbar mit der im gleichen Assay mit saurem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (a-FGF) gezeigten, einem bekannten Hepatozyten-Wachstumsfaktor. Die Behandlung mit einem eck- Rezeptor-Liganden ist nützlich zur Behebung von durch Krankheit oder Verletzung entstandenen Leberschäden.
Die Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend therapeutisch wirksame Mengen eines eck-Rezeptor-Liganden zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln, Trägern, Konservierungsstoffen, Emulgatoren und/oder Lösungsvermittlern bereit. Eine "therapeutisch wirksame Menge", wie hierin verwendet, bedeutet diejenige Menge, die eine therapeutische Wirkung für einen gegebenen Zustand und ein Verabreichungsschema. Es wird erwartet, daß der Fachmann in der Lage ist, eine therapeutisch wirksame Menge eines eck-Rezeptor-Liganden für irgendeinen gegebenen Zustand zu bestimmen, der behandelt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen Verdünnungsmittel von verschiedenen Puffern (z. B. Tris, Acetat; Phosphat), Lösungsvermittler (z. B. Tween, Polysorbat), Träger, wie humanes Serumalbumin, Konservierungsmittel (Thimerosal, Benzylalkohol) und Antioxidationsmittel, wie Ascorbinsäure. Wie in Beispiel 7 gezeigt, ist die Fähigkeit, von aufgereinigtem und verdünntem EBP an löslichen eck-Rezeptor zu binden, verlängert, wenn EBP in Gegenwart eines Stabilisators formuliert wird. Der Stabilisator kann ein Detergenz sein, wie Tween- 20, Tween-80, NP-40 oder Triton X-100. EBP kann auch in partikuläre Zubereitungen von polymeren Verbindungen zur gesteuerten Abgabe an einen Patienten über einen ausgedehnten Zeitraum einverleibt werden. Eine ausführlichere Übersicht von Bestandteilen in pharmazeutischen Zusammensetzungen findet sich in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, A.R. Gennaro, Herausgeber Mack, Easton, PA (1990).
EBP kann durch Injektion, entweder subkutan, intravenös oder intramuskulär, oder durch orale oder nasale Verabreichung gegeben werden. Der Verabreichungsweg wird von dem besonderen Zustand abhängen, der behandelt wird.
Die nachstehenden Beispiele sind zur Erläuterung der Erfindung gegeben, aber sind nicht in einschränkender Weise aufzufassen.

BEISPIEL 1

Herstellung der eck-Rezeptor-Extrazellulär-Domäne

A. Herstellung eines eck-x-Expressions-Plasmids

Ein Plasmid zur Expression der Extrazellulär-Domäne von eck in Säugern wurde in mehreren Schritten hergestellt, beginnend mit pGEM3Z-eck, einem 3,4 kb EcoRI-KpnI-Subklon der eck-cDNA (Lindberg et al., supra). Oligonucleotide 317-11(5'-AGCTTAGATCTCC-3'; SEQ ID NO: 7) und 317-12 (S'-AATTGGAGATCTA-3; SEQ ID NO: 8) wurden phosphoryliert und mit dem 1,7 kb EcoRI-Fragment von pGEM3Z-eck und pGEM4Z, das mit Hind III und EcoRI verdaut worden war, ligiert. Ein Klon wurde ausgewählt, der die Oligonucleotide nur an dem 5'-Ende von eck enthielt. Eigenschaften dieses Klons umfassen das Hinzufügen von Hind III- und Bgl II-Schnittstellen und die Deletion der an die eck-Sequenz angrenzenden 5'-EcoRI- Schnittstelle. Das Insert dieses Klons wurde nach Verdau mit Hind III und EcoRI isoliert und mit den phosphorylierten Oligonucleotiden ligiert:
317-9 5'-AATTCCAGACGCTGTCCCCGGAGGGATCCGGCAACTGAG-3' (SEQ ID NO: 9) und
317-10 5'-TCGACTCAGTTGCCGGATCCCTCCGGGGACAGCGTCTGG-3 (SEQ ID NO: 10),
wobei pGEM4Z mit Hind III und Sal I verdaut wurde. Dies fügte eine BamHI-Schnittstelle, ein TGA-Stopkodon nach Asn&sup5;³&sup4; und eine Sal I-Restriktionsenzym-Schnittstelle hinzu. Das die kodierende Sequenz der externen Domäne von eck enthaltende Hind III-Sal I-Fragment wurde dann in pDSRα2 (deClerk et al., J. Biol. Chem. 266, 3893 (1991)) übertragen.

B. Expression von eck-x in Säugerzellen

Das Expressionsplasmid pDSRα-eck-x wurde in CHO-Zellen durch Calcium-vermittelte Transfektion eingeführt (Wigler et al., Cell 11, 233 (1977)). Einzelne Klone wurden ausgewählt aufgrund der Expression des Dihydrofolat-Reduktase-Gens (DHFR) im Plasmid, und ein Klon, bezeichnet als 21.021, wurde zur Amplifikation ausgewählt. Die Expression des eck-Gens wurde überwacht durch RNA-Hybridisierung (Hunt et al., Exp. Hematol. 19, 779 (1991)).
Die Amplifikation des eck-Expressionsplasmids wurde in 10 nM Methotrexat durchgeführt. Die Zellinie 21.02 wurde zur Produktion von eck-x expandiert. In Rollerflaschen wurden 2 · 10&sup7; Zellen in 200 ml DMEM : Ham's F12 (1 : 1) supplementiert mit nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 nm Methotrexat und 5% FBS eingebracht. Die Zellen waren nach 3 Tagen konfluent, zu diesem Zeitpunkt wurde frisches Medium ohne 5% FBS hinzugeffigt. Konditionierte Medien wurden nach 7 Tagen geerntet und ersetzt und eine zweite Ernte wurde nach 14 Tagen durchgeführt.

C. Aufreinigung von eck-x

Konditioniertes Medium aus 21.02 Zellen wurde konzentriert und diafiltriert gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, mit einem 10.000 MWCO Molekulargewichtsausschluß-Spiralfilter (S1Y10, Amicon, Danvers, MA). Das 50 ml Konzentrat wurde auf eine Anionenaustauschersäule (Hema-Q, 10 um Partikelgröße, 1,6 · 12 cm, Separon, Sunnyvale, CA) geladen und mit einem linearen Gradienten von 0-0,5 M NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, eluiert. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE und Western-Blot mit einem gegen ein synthetisches N- terminales Peptid von eck-x erzeugtes Kaninchen-Antiserum untersucht. Die eck-x enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt, gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, dialysiert, auf die Hema-Q- Säule wieder aufgeladen und eluiert und analysiert wie vorstehend beschrieben. Der resultierende Pool wurde auf 3 ml (Centriprep-10, Amicon, Danvers, MA) konzentriert und auf eine Superdex 200 (Pharmacia, Piscataway, NJ)-Gelfiltrationssäule (2,2 · 90 cm, Flußrate 1,0 ml/min), die mit PBS equilibriert wurde, aufgebracht. Ein aufgereinigter eck-x enthaltender Pool wurde hergestellt und diente als Grundlage für die weiteren Experimente.

BEISPIEL 2

Screening von konditionierten Medien auf Bindung an die eck-Extrazellulär-Domäne

Wechselwirkungen mit eck-x wurden auf einem Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Nachweissystem (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) gemäß vom Hersteller empfohlenen Verfahren gemessen. Die Dextran-Oberfläche des Sensorchips wurde aktiviert durch Injektion von 35 ul von 0,2 M 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-HCl, 0,05 M N- Hydroxysuccinimid bei einer Flußrate von 5 ul/min. Das aufgereinigte eck-x (0,2 mg/ml in 10 mM Natriumacetat, pH 4,0) wurde immobilisiert durch zwei aufeinanderfolgende Injektionen von 50 ul bei 5 ul/min. Nicht umgesetzte Bindungsstellen wurden blockiert durch Injektion von 1 M Ethanolamin, pH 8,5. Die Oberfläche wurde über Nacht in Laufpuffer (HBS, 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,005% Tween 20, pH 7,4) gewaschen; bis eine stabile Grundlinie erreicht wurde. Typische Immobilisierungen führten zum Erhalt von Grundlinien 6000-8000 Antworteinheiten oberhalb der ursprünglichen Werte. 50 ul Proben verschiedener konditionierter Medien, die unter Serum-freien Bedingungen kultiviert und 5- bis 40fach (Centricon-10, Amicon, Danvers, MA) konzentriert waren, wurden bei einer Flußrate von 10 ul/min injiziert. Die Probenantwort wurde gemessen an Reporterstellen (report points) auf dem Sensorgram, die 20 Sekunden nach Abschluß jeder Injektion entsprechen. Die immobilisierte eck-x-Oberfläche wurde zwischen den Proben durch 50 ul-Injektionen von 25 mM 3- (Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure, pH 10,4, regeneriert.
Aufgereinigtes, auf einem BIAcore-Sensorchip immobilisiertes eck-x wurde verwendet, um konditionierte Medien auf Rezeptor-Bindungsaktivität zu screenen. Bindungsaktivität wurde beobachtet in mehreren konditionierten Medien, einschließlich derjenigen von HCT-8, SK- BR-3 und HT-29 Zellinien (vgl. Tabelle 1). Tabelle 1 Untersuchung von Zellkulturüberständen durch BIAcore und anti-EBP-Westem-Blot
Die Proben (50 ul-Injektionen) wurden untersucht auf Bindung an immobilisiertes eck-x mit BIAcore, wie in Beispiel 2 beschrieben. Aliquots (10 ul) gleicher Proben wurden im Nachhinein mit Kaninchen-anti-EBP (E. coli)-Antiserum untersucht.

BEISPIEL 3

Aufreinigung und Charakterisierung eines eck-Rezeptor-Bindungsproteins (EBP) aus konditioniertem Medium

A. Immobilisierte eck-x-Rezeptor Affinitätschromatographie

Aufgereinigtes eck-x wurde dialysiert gegen 0,1 M NaHCO&sub3;, 0,5 M NaCl, pH 8,3 und auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml gebracht. Das Protein wurde an CNBr-aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia, Piscataway, NJ) bei einer Liganden-Dichte von 1 mg eck-x pro ml Gel immobilisiert (Kenny et al. in New Protein Techniques, J.M. Walker, Herausgeber, The Human Press, Clifton, NJ (1988)).
Konditioniertes Medium aus SK-BR-3 oder HCT-8 Zellinien wurde 20fach aufkonzentriert und gegen PBS diafiltriert (SIY10-Spiralkartusche, Amicon). Das Konzentrat wurde direkt auf Säulen mit immobilisiertem eck-x (1 · 1 cm, 1 mg eck-x pro ml Harz) aufgeladen bei einer Flußrate von 0,1 ml/min. Die Säule wurde gewaschen mit 10 ml PBS, gefolgt von der Elution mit 0,05 M Natriumacetat, 0,5 M NaCl, pH 4,0. Der Elutionspool wurde auf 0,01% SDS gebracht, konzentriert und der Puffer wurde gegen 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, in einer Centricon-10-Ultrafiltrationsvorrichtung (Amicon) ausgetauscht. Die Proben wurden mit SDS-PAGE-Probenpuffer gemischt, aus der Centricon-10-Vorrichtung geerntet und direkt auf Polyacrylamidgele geladen. Die Gele wurden silber gefärbt (Merrill Meth. Enzymol. 182, 477 (1991)) oder auf PVDF-Membranen geblottet (Problot, Applied Biosystems, Foster City, CA) zur N-terminalen Sequenzanalyse (Fausset et al., Electrophoresis 12, 22 (1991)).
Eine SDS-PAGE-Analyse eines typischen Laufs ist in Fig. 1 gezeigt. Die in Spur 5 gezeigte pH 4,0-Elution der Säule zeigt eine deutliche Anreicherung mehrerer Proteine mit scheinbaren Molekulargewichten von 21-27 kDa. Diese Proteine wurden nicht nachgewiesen, wenn ein ähnliches Volumen nicht-konditioniertes Medium über die gleiche Säule gegeben wurde. Dies zeigt, daß die 21-27 kDa-Proteine durch die Zellinien hergestellt wurden. Hingegen wurden die Proteine mit hohem Molekulargewicht, die in den pH 4,0-Elutionsftaktionen von HCT-8 oder SK-BR-3 konditioniertem Medium vorhanden waren, auch in nicht-konditioniertem Medium beobachtet. Diese Proteine stellen nicht-spezifische Interaktionen mit der Säule dar, und stammen aus dem zur Zellkultur verwendeten Serum.

B. N-terminale Sequenzanalyse von EBP

N-terminale Sequenzanalyse wurde durchgeführt auf einem Flüssigkeits-Puls automatischen Sequenzierer (Modell 477, Applied Biosystems, Foster City, CA). Die entstehenden Phenylthiohydantoinyl-Aminosäuren wurden untersucht durch In-Serie-Mikrobohrung (microbore) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Modell 123, Applied Biosystems) mit einer Brownlee C-18-Umkehrphasensäule (0,21 · 25 cm). Die Sequenzierungszyklen und die Optimierung für die Sequenzanalyse von PVDF-Blots wurden durchgeführt aufgrund der von Applied Biosystems zur Verfügung gestellten Empfehlungen.
N-terminale Sequenzanalyse der elektro-geblotteten Proteine in der 21-27 kDa-Region des Gels zeigte eine einzige Sequenz (SEQ ID NO: 13):
NH&sub2;-Asp-Arg-His-Thr-Val-Phe-Trp-[Asn]-Ser-Ser-Asn-Pro-Lys-Phe-Arg-Asn-Glu-Asp-Tyr- Thr-Ile-His-Val-Gln
Eine Computergestützte Homologiesuche der NBRF-Protein-Datenbank (Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12, 387 (1984)) führte zur eindeutigen Zuordnung dieser Sequenz zu EBP (Holzman et al., supra).

C. Strukturelle Charakterisierung von EBP

Da die N-terminale Sequenzierung eine einzige Sequenz zeigte, entstehen wahrscheinlich die in der SDS-PAGE beobachteten mehreren Formen von EBP aus post-trarislationalen Modifikationen an anderen Stellendes Moleküls. Die Sequenzierungsausbeute von Zyklus 8 (N) war stark vermindert, was effiziente Glykosylierung an dieser Stelle anzeigt. Jedoch kann die Heterogenität des Proteins nicht vollständig Glykosylierungsunterschieden zugeordnet werden, da der Verdau von rEBP mit Kombinationen von N-Glycanase, Neuraminidase und O- Glycanase bei der Untersuchung durch SDS-PAGE zu einem Gemisch von Formen mit Mr 17-19 kDa führte. Da das EBP-Gen für ein Protein von 22 kDa kodiert (Holzman et al., supra), legte diese Beobachtung nahe, daß EBP einer protolytischen Prozessierung unterliegt.

D. Interaktionen von EBP mit löslichem eck-Rezeptor

Die Gelfiltrationsuntersuchung des pH 4,0-eluierten Pools zeigte, daß die gesamte eck-Bindungsaktivität, wie durch BIAcore-Antwort gemessen, Material zugeordnet werden konnte, das mit scheinbarem Molekulargewicht von 22 kDa eluierte (Fig. 2). Die SDS-PAGE-Untersuchung der Fraktionen von dieser Säule bestätigte, daß EBP mit der Rezeptor-Bindungsaktivität ko-eluierte. In getrennten Experimenten band aufgereinigtes EBP nicht an die mit der Extrazellulär-Domäne des kit-Rezeptors aktivierten BIAcore-Oberflächen, obwohl diese Oberflächen rSCF, den kit-Liganden, binden konnten.

E. Screening weiterer Zellinien auf eck-Bindungsproteine

Nach der Isolierung und Identifizierung von EBP wurde Antiserum gegen das Protein hergestellt, und eine nachträgliche Untersuchung des ursprünglichen Screenings durchgeführt (Tabelle 1). Die Western-Blot-Untersuchung bestätigte, daß EBP in hohen Mengen in drei konditionierten Medien (SK-BR-3, HCT-8 und HT-29) vorhanden war, die positiv im Screening gewertet wurden. Mehrere andere Zellinien (AG-3022, AG-2804 und HT-1080) wurden positiv gewertet, aber nur Spuren von prozessiertem EBP konnten durch Western-Analyse nachgewiesen werden. Diese Zellinien stellten ein 28 kDa-Protein her, das durch das anti- EBP-Antiserum nachgewiesen wurde.

BEISPIEL 4

Klonierung, Expression und Charakterisierung von EBP

Durch Hitze aufgeschlossene Phagen aus einer Human-Nabelvenen-Endothelzell (HUVEC)- Biblitothek (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) wurden als Template zur Amplifikation des humanen EBP-Gens durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Saiki et al., Science 230, 1350 (1985); Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263) verwendet. Die Primer wurden hergestellt aufgrund der veröffentlichten Nucleinsäuresequenz von EBP (Holzman et al., supra), um PCR-Fragmente zu ergeben, die entweder in E. coli oder CHO- Zell-Expressionsvektoren inseriert werden können.

A. Klonierung von EBP zur E. coli-Expression

Ein Gen zur E. coli-Expression der Vollängen-Form von EBP wurde erzeugt durch PCR mit den Oligonucleotid-Primern 386-4 und 386-5, wie nachstehend gezeigt:
386-4) 5' AAG CAT ATG GAT CGC CAC ACC GTC TTC TGG 3' (SEQ ID NO: 2)
386-5) S' GAA GGA TCC TTA TCA CGG GGT TTG CAG CAG CAG AA 3' (SEQ ID NO: 3)
Dieser Form fehlte das Signalpeptid und sie umfaßte ein Start-Methionin ebenso wie zur Klonierung in das Expressionsplasmid pCFM1 156 benötigte Restriktionsstellen (Fox et al., J. Biol. Chem. 263, 18452 (1988)). Ein 10 ul-Aliquot der λ gt11/HUVEC-Bibliothek (Clontech) wurde hitze-behandelt bei 70ºC über 5 Minuten und sodann auf nassem Eis abgekühlt. Die aufgeschlossenen Phagen wurden verwendet als Template für eine PCR-Reaktion, die 300 picomol jedes Primers 386-4 und 386-5, 1 · TaqI-Polymerase-Puffer (Promega, Madison, WI), 0,77 mM von jedem dNTP und 2,5 Einheiten TaqI-Polymerase (Promega) in einem Volumen von 100 ul enthielt. Das Reaktionsprodukt wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert, in 20 ul destilliertem Wasser resuspendiert und sodann mit den Restriktionsendonucleasen NdeI und BamHI (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) verdaut. Dieses Fragment wurde in den mit den gleichen beiden Enzymen verdauten Plasmidvektor pCFM1156 ligiert und in den E. coli-Wirtsstamm FM5 (ATCC-Nr. 53911) transformiert. Bei Temperaturverschiebung der transformierten Zellen von 30ºC auf 42ºC wurde EBP in großen Mengen exprimiert.
Ein Gen zur Expression der 150 Aminosäure-Form von EBP in E. coli wurde konstruiert wie für das Vollängen-Gen, jedoch wurde das Oligonucleotid 469-11 in der PCR-Reaktion verwendet anstelle von 386-5. Oligonucleotid 469-11 hat die Sequenz:
5' GAAGGATCCCTATTATGCTGCAAGTCTCTTCTCCTG 3' (SEQ ID NO: 4)

B. Klonierung von EBP zur CHO-Zell-Expression

Gesamt-RNA wurde isoliert aus der Zellinie SK-BR-3 und zur Herstellung von cDNA verwendet. 3 ug Gesamt-RNA wurde mit 3 ug Random-Primer (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) gemischt, bei 65ºC über 5 Minuten inkubiert und sodann rasch auf Eis abgekühlt. Das RNA- Primer-Gemisch wurde dann in einem cDNA-Reaktionsgemisch verwendet, das aus 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 125 uM von jedem dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 200 Einheiten Reverse-Transkriptase (Superscript, BRL) in einem Gesamt-Reaktionsvolumen von 20 ul bestand. Das Reaktionsgemisch wurde inkubiert bei 37ºC über 1 Stunde.
Zwei Oligonucleotide wurden synthetisiert und mit der SK-BR-3 cDNA verwendet zur Amplifikation der EBP-kodierenden Region durch PCR.
386-2) 5' GAA TTC AAG CTT CAG GCC CCG CGC TAT GGA G 3' (SEQ ID NO: 5)
386-3) 5' GAA TTC TCT AGA TCA TCA CGG GGT TTG CAG CAG CA 3' (SEQ ID NO: 6)
Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt 1 ul des cDNA-Reaktionsgemisches, 500 ng jedes der beiden vorstehenden Oligonucleotide, 10 mM Tris-HCl (pI-L 8,3), 50 mM KCl, 200 uM von jedem dNTP und 1,25 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin Eimer Cetus, CA). Die DNA wurde über 35 Zyklen (94ºC, 30 Sekunden, 50ºC, 1 Minute, 72ºC, 1 Minute) amplifiziert, 1 mal mit Phenol, 1 mal mit Phenol-Chloroform extrahiert, präzipitiert und durch Mikrozentrifugation pelletiert und mit den Restriktionsenzymen Hind III und Xba I (Boehringer Mannheim) verdaut. Die DNA wurde gel-aufgereinigt (Geneclean II, Bio 101, La Jolla, CA) und mit dem Plasmid pDSRα2 ligiert (deClerk et al., supra), das vorher mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut worden war. Die ligierte DNA wurde in kompetente HB101-Bakterien (BRL) transfiziert, und die Plasmid-DNA wurde isoliert (Qiagen, Chatsworth, CA). Die DNA- Sequenz wurde bestätigt durch Didesoxy-Sequenzierung (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)) auf doppelsträngiger Plasmid-DNA unter Verwendung von synthetischen Primern, die der EBP-DNA-Sequenz entsprachen.
Kulturüberstände von mit dem EBP-Gen transfizierten CHO-Zellen zeigten eck-x-Bindungsaktivität am BIAcore, und EBP konnte aus den Überständen durch immobilisierte eck-x- Rezeptor-Affinitätschromatographie wiedergewonnen werden. Nicht-transfizierte CHO-Zellen oder CHO-Zellen, die mit einem EBP-Gen transfiziert waren, das eine interne Deletion enthielt, zeigten keine Rezeptor-Bindungsaktivität.

C. Aufreinigung von rekombinantem EBP aus E. coli und CHO-Zellen

Rekombinantes EBP wurde aufgereinigt aus CHO-Zell-Kulturüberständen durch immobilisierte eck-x-Rezeptor-Affinitätschromatographie, wie in Beispiel 3A beschrieben. Das aufgereinigte EBP wurde dialysiert gegen PBS entweder mit 5 mM CHAPS (zur strukturellen Analyse und Vernetzungsstudien) oder mit 0,5 mg/ml BSA (für Phosphorylierungsstudien). Das durch Rezeptor-Affinitätschromatographie aufgereinigte CHO-Zell-abgeleitete EBP enthielt zwei Hauptbanden ebenso wie einige wenige Nebenbanden (Fig. 1B).
Rekombinantes EBP aus CHO-Zellen wurde auch aufgereinigt durch konventionelle Chromatographie. Der CHO-Zell-Kulturüberstand wurde konzentriert und diafiltriert gegen 10 mM Tris, pH 8,5, und auf eine Anionenaustauschersäule (Q-Sepharose, Pharmacia-LKB) aufgebracht. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, eluiert. Die Untersuchung der Fraktionen durch Western-Blotting zeigte, daß die zwei Haupt- EBP-Banden voneinander getrennt worden waren. Getrennte Pools wurden hergestellt aus Fraktionen, die die Haupt-EBP-Banden enthielten, und die Pools wurden weiter durch Gelfiltrationschromatographie (Superdex-75, Pharmacia-LKB) aufgereinigt.
Rekombinantes EBP aus E. coli wurde aufgereinigt durch das nachstehende Verfahren. Zellen, die EBP¹&supmin;&sup5;&sup0;- oder EBP¹&supmin;¹&sup8;&sup7;-Gene exprimierten, wurden in 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, suspendiert und mit einer French Press lysiert. Das Lysat wurde in einem J6-B (J5-4.2 Rotor) bei 4000 U/min 30 Minuten zentrifugiert. Die unlöslichen Pellets (mit entweder nicht-gefaltetem EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0; oder EBP¹&supmin;¹&sup8;&sup7;) wurden für die weitere Verarbeitung aufbewahrt. Die Pellets wurden suspendiert in 2% Natriumdesoxycholat, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, und über 30 Minuten bei 4ºC gemischt. Die Suspensionen wurden wie vorstehend zentrifugiert, und die Überstände wurden verworfen. Die unlöslichen Pellets wurden in 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, suspendiert, gemischt und wie vorstehend zentrifugiert. Die unlöslichen Pellets wurden in 2% Sarkosyl, 10 mM CAPS, pH 10, gelöst, um EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0; oder EBP zu lösen. CuSO&sub4; wurde bis zu einer Endkonzentration von 50 uM hinzugefügt, und die Gemische wurden über Nacht bei 4ºC gerührt und sodann mit Dowex 1X4-Harz behandelt, um das Detergenz zu entfernen.
SDS-PAGE-Analyse zeigte, daß ein großer Anteil von EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0; oder EBP¹&supmin;¹&sup8;&sup7; oxidiert war und als Monomer vorlag. Jedoch zeigte die Gelfiltrations-Analyse von EBP¹&supmin;¹&sup8;&sup7;, daß das Protein sich wie ein nicht-kovalentes Aggregat mit hohem Molekulargewicht verhält. Im Gegensatz hierzu zeigte die Gelfiltrations-Analyse, daß sich das rückgefaltete EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0; wie ein Monomer oder Dimer verhält.
EBP¹&supmin;¹&sup8;&sup7; und EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0;, hergestellt in E. coli, wurden auf die Bindung an immobilisiertem eck- x durch BIAcore, wie in Beispiel 2 beschrieben, untersucht. Das EBP¹&supmin;¹&sup8;&sup7;-Aggregat band chwach, wenn überhaupt, an die eck-x-Oberfläche. Rückgefaltetes EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0; zeigte eine hohe Affinität für eck-x-Oberflächen auf dem BIAcore.
Alternativ wurde das nachstehende Verfahren zur Rückfaltung von in E. coli exprimiertem EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0; verwendet. Zell-Paste wurde suspendiert in 9 Volumen (Volumen/Gewicht) von kaltem Super-Q-Wasser. Die suspendierte Zell-Paste wurde mit einem Gaulin-Homogenisator bei einem Druck von 9.000 psi lysiert. Das Lysat wurde sofort bei 3.500 · g, 4ºC über 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das den EBP-Einschlußkörper (inclusion body) enthaltende Pellet wurde aufbewahrt. Das Pellet wurde in 10 Volumen (Volumen/Gewicht) Harnstoff, 0,1 M Tris, pH 8,5, suspendiert und 1 Stunde gerührt. Die Zentrifugation wurde sodann durchgeführt, um den unlöslichen Anteil abzutrennen. Die Rückfaltung wurde durch zwei schrittweise Verdünnungen der löslichen Einschlußkörper bewirkt. Zunächst wurden die Einschlußkörper in 10 Volumen (Volumen/Gewicht) 3 M Harnstoff, 0,1 M Tris, pH 8,5, mit 0,0005% CuSO&sub4; als Oxidationsmittel verdünnt und bei 4ºC über Nacht gerührt. Dieses Material wurde mit 3 Volumen (Volumen/Volumen) von 20 mM Tris, pH 9,2, verdünnt und über 24 Stunden bei sanftem Rühren inkubiert.
Die Zentrifugation wurde bei 15.000 · g, 4ºC über 30 Minuten durchgeführt, um das Präzipitat zu entfernen.
Der Überstand wurde sodann auf eine Q-Sepharose Fast Flow-Säule aufgetragen und mit 5 Säulen-Volumen von 20 mM Tris, pH 9,2, gewaschen. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0-0,5 M in 20 mM Tris, pH 9,2, eluiert. Fraktionen mit EBP wurden vereinigt, konzentriert und der Superdex-75-Chromatographie unterzogen. Das EBP wurde mit 1 · PBS eluiert.
Das resultierende aufgereinigte EBP hatte eine spezifische Aktivität, die 30-40% derjenigen von aufgereinigtem CHO-abgeleitetem EBP entsprach, wie bestimmt durch seine Fähigkeit, an immobilisiertes eck-x in einem BIAcore-Assay zu binden. Das nach diesem Verfahren rückgefaltete und aufgereinigte, von E. coli hergestellte EBP induzierte die Phosphorylierung von auf den Zelloberflächen gelegenem eck.

D. Charakterisierung von rekombinantem EBP aus E. coli und CHO-Zell-Expression

Rekombinantes EBP, das durch Rezeptor-Chromatographie aus CHO-Zell-Kulturüberständen oder durch RP-HPLC-Verfahren aus E. coli aufgereinigt wurde, wurde mit Trypsin verdaut und mit RP-HPLC untersucht. Obwohl das C-terminale Peptid (AS 155-187) aus dem in E. coli exprimierten EBP¹&supmin;¹&sup8;&sup7;-Gen wiedergewonnen werden konnte, konnte es nicht in dem von dem Säuger stammenden rekombinanten Protein nachgewiesen werden. Carboxidpeptidase- Verdau des aufgereinigten CHO EBP zeigte an, daß die einzige nachweisbare C-terminale Sequenz-Lys-Arg-Leu-Ala-Ala-COOH (SEQ ID NO: 12) war, was anzeigt, daß sich das Ende an der Aminosäure 150 befand.

E. Alternative Formen von EBP

Das aus der SK-BR-3 Zellinie, wie in Beispiel 3 beschrieben, isolierte EBP wanderte in der SDS-PAGE im Bereich von 21-27 kDa (vgl. Fig. 1A). Das rekombinante EBP in CHO-Zellüberständen lag in zwei Hauptformen und einigen Nebenbanden nach der eck-x-Chromatographie vor (Beispiel 4 und Fig. 1B). Die weitere Charakterisierung der unterschiedlichen Molekulargewichtsformen von CHO-abgeleitetem EBP wurde unternommen. Die Aufreinigung von rekombinantem EBP aus CHO-Zellüberständen zeigte zwei Banden von 22 und 24 kDa und eine dritte Nebenbande von 27 kDa (vgl. Fig. 3). Die Behandlung von aufgereinigtem EBP mit Glycosidasen zeigte keine Änderung der relativen Wanderung dieser Banden, was nahelegte, daß sie nicht einfach durch Variation der N- oder O-verknüpften Kohlenhydrate entstanden. Die C-terminale Sequenzierung zeigte zuvor, daß die 22 kDa-Bande als mit EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0; bezeichnetes Polypeptid von 150 Aminosäuren vorliegt. Es wurde gefunden, daß das Protein der 24 kDa-Bande 159 Aminosäuren lang war, wie durch C-terminale Sequenzierung gezeigt. Diese Form wurde als EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup9; bezeichnet.
Die EPB-exprimierenden CHO-Zellen wurden auf das Vorhandensein von Membran-gebundenen Formen von EBP untersucht. Die rekombinante CHO-Zellinie 36.44 wurde erzeugt durch Transfektion von CHOd-Zellen mit dem Plasmid pDSRα-EBP. Die Zellen wurden in Suspensionsmedien mit DMEM: F12-Medien unter Zusatz von 1 · nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 · Penicillin, Streptomycin, Glutamin mit 10% hitzeinaktiviertem dialysierten fötalem Rinderserum gezüchtet. Aliquots von 10&sup6; Zellen wurden mit 4 ug/ml Phospholipase C (Calbiochem, La Jolla, CA) in 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung bei 37ºC über unterschiedliche Zeiten behandelt. Die Zellen wurden bei 14.000 U/min 1 Minute pelletiert. Die Überstände wurden zur Untersuchung entfernt. Die Zellpellets wurden in RIPA-Puffer (150 mM NaCl; 1% NP-40; 0,5% Desoxycholat; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,1% SDS; 1,74 ug/ml PMSF; 1 ng/ml jeweils von Aprotinin, Pepstatin und Leupeptin; 18,4 ug/ml Orthovanadat) lysiert. Die Zellen wurden auf ein 14% Tris-Glycin-Gel aufgetragen, auf eine PVDF-Membran geblottet und mit einem Kaninchen-anti-EBP-polyklonalen Antikörper in Kontakt gebracht. Fig. 4 zeigt, daß EBP in den Überstand in Gegenwart von Phospholipase C freigesetzt wurde. Diese Experimente legen nahe, daß die 27 kDa-Form von EBP einen Glycophospholipid-Anker aufwies.

BEISPIEL 5

EBP-Analoga

Zusätzlich zu den unterschiedlichen Formen von rekombinantem EBP, die aus dem Vollängen EBP-Gen hergestellt wurden, wurden EBP-Analoga hergestellt mit unterschiedlichen Polypeptid-Längen. Insbesondere wurden EBPs mit 167, 171 und 180 Aminosäuren, wie nachstehend beschrieben, hergestellt. Die Oligonucleotide 421-12, 421-13 und 421-14 wurden zur Verwendung als PCR-Primer hergestellt, um Terminationskodons nach den Aminosäuren 180, 171 bzw. 167 einzuführen. Die PCR-Reaktionen wurden, wie in Beispiel 4B beschrie ben, durchgeführt mit jedem der Primer und dem pDSRα-EBP-Plasmid und dem Oligonucleotid 386-2.
421-12 5'-GAATTCTCTAGATTATCATGGAAGGAGCAGCACAGTCCAG-3' (SEQ ID NO: 14)
421-13 5'-GAATTCTCTAGATTATCATGGGAAGAGGCGTGGGGCAGC-3' (SEQ ID NO: 15)
421-14 5'-GAATTCTCTAGATTATCATGGGGCAGCACTGTGACCGATGC-3' (SEQ ID NO: 16)
Die resultierenden Analoga wurden in CHO-Zellen exprimiert, die mit den veränderten DNA- Sequenzen transfiziert worden waren, gemäß den für die Expression von EBP beschriebenen Verfahren. Man ließ die Zellen bis zur Konfluenz in Gegenwart von Serum wachsen, woraufhin das Medium auf Serum-freies Medium gewechselt wurde, und man ließ sie sich vermehren. Nach 48 Stunden wurde das konditionierte Medium gesammelt und die adhärenten Zellen lysiert. Aliquots der konditionierten Medien und Lysate wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese fraktioniert und dem Western-Blotting unterzogen. EBP¹&supmin;¹&sup8;&sup7; und EBP¹&supmin;¹&sup8;&sup0; zeigten eine ähnliche Verteilung von Protein, das mit dem Antikörper in Lysaten und Überständen reagierte. Die EBP¹&supmin;¹&sup7;¹ und EBP¹&supmin;¹&sup6;&sup7; exprimierenden Zellen zeigten eine Anhäufung von EBP in den Überständen, jedoch nicht in den Lysaten. EBP-Analoga wurden auf Bindung an eck-x durch BIAcore, wie in Beispiel 2 beschrieben, und auf Phosphorylierungsaktivität von eck-Rezeptor, wie in Beispiel 6 beschrieben, untersucht.

BEISPIEL 6

Wechselwirkungen von rekombinantem EBP mit dem eck-Rezeptor

A. Vernetzungsstudien

CHO-Zell-abgeleitetes EBP wurde mit 1, wie nachstehend beschrieben, zur Verwendung in Vernetzungs- und Bindungsstudien markiert. 5 oder 10 ug von EBP in 0,1 M Natriumphosphat (NaPO&sub4;, pH 8,0) wurden zu 5 mCi von getrocknetem ¹²&sup5;I-Bolton-Hunter-Reagenz (NEN, Boston, MA) in einem Endvolumen von 50 ul oder 100 ul versetzt. Das Röhrchen wurde bei 4ºC 1 Stunde inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 0,3 ul von 0,2 M Glycin in 0,1 M NaPO&sub4; beendet, gefolgt von Inkubation bei 4ºC über 5 Minuten. Das markierte Protein wurde von nicht-eingebautem Reagenz durch Gelfiltrationschromatographie auf einer 10 ml PD10-Säule mit Sephadex G-25 M (Pharmacia), die mit 0,1 M NaPO&sub4;- 0,25% Gelatine equilibriert worden war, abgetrennt. Die spezifische Aktivität des ¹²&sup5;I-EBP lag im Bereich von 4 bis 19 cpm/pg.
Die Vernetzung von EBP an entweder LIM 2405 (eine natürlicherweise den eck-Rezeptor exprimierende Zellinie) oder CHO 19.32 (Ovarialzellen von Chinesischem Hamster, die mit einem Klon des Vollängen-eck-Rezeptors transfiziert wurden) wurde folgendermaßen durchgeführt. Die CHO-Zellen wurden in einer Suspension bis zu einer Dichte von etwa 5 · 10&sup5; Zellen/ml in Medium gezüchtet. LIM 2405-Zellen wurden in RPMI 1640-Medien mit 5% FCS, 1 ug/ml Insulin, 1 ug/ml Hydrocortison, 10 uM Thioglycerin und 2 mM L-Glutamin gezüchtet, bis etwa 90%-Konfluenz in T-175-Behältern gezüchtet und durch Abschaben zur Verwendung in Vernetzungsstudien entfernt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und in PBS resuspendiert, um eine Einzelzellsuspension zu ergeben. Für jede Vernetzungsreaktion wurden 2 · 10&sup6; Zellen mit etwa 20 ng ¹²&sup5;I-EBP in einem Gesamtvolumen von 1 ml gemischt. Dieses Gemisch wurde bei 4ºC 1 Stunde inkubiert, um die Bindung von EBP an die Zelloberflächen-Rezeptoren zu ermöglichen, bevor 20 ul 10 mM Disuccinimidylsuberat (DSS) als Vernetzungsmittel hinzugefügt wurden. Die Zellen wurden sodann dreimal in Bindungspuffer gewaschen, durch Zentrifugation gesammelt und die Menge der in die Zellpellets eingebauten Radioaktivität wurde bestimmt, um das Ausmaß der Vernetzung zu bestimmen. Die Zellen wurden sodann durch Behandlung mit 100 ul PBS, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma, St. Louis, MO) für 10 Minuten bei 4ºC lysiert. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation entfernt, und die lösliche Fraktion mit dem Rezeptor-Ligand-Komplex wurde gesammelt. Diese Proben wurden entweder direkt auf SDS-PAGE aufgetragen oder zunächst mit einem gegen den C-terminalen Anteil des eck- Rezeptors gerichteten Antikörper (Lindberg et al., supra) immunpräzipitiert. Die Kompetition mit entweder nicht-markiertem EBP oder einem irrelevanten Protein (FGF) wurde durchgeführt durch Mischen des Kompetitors mit dem markierten EBP vor dem Hinzufügen zu den Zellen.
Wie in Fig. 5 gezeigt, konnte ¹²&sup5;I-rEBP an CHO 19.32-Zellen (Spur 1) vernetzt werden, jedoch nicht an nicht-transfizierte Zellen (Spur 2). Die Vernetzung führte zum Nachweis eines 145 kDa-Proteins, ebenso wie Formen mit höherem Molekulargewicht, die Rezeptor-Dimere oder Komplexe höherer Ordnung darstellen können. Nicht-markiertes rEBP in 50fachem molaren Überschuß war in der Lage, um die Bindung und die Vernetzung in Konkurrenzreaktion zu treten (Spur 3). In separaten Experimenten hatte der rekombinante Fibroblasten- Wachstumsfaktor bei Konzentrationen von 1 ug/ml keine Auswirkung auf die rEBP-Vernetzung. Ähnliche Vernetzungsergebnisse wurden für die LIM 2405-Zellinie erhalten.

B. Bindungsstudien

Um die Assoziationskinetik zu messen, wurden CHO 19.32-Zellen (2 · 10&sup6; Zellen/ml) mit 3,8 nM ¹²&sup5;I-EBP in PBS-BSA (1 mg/ml) bei 0ºC inkubiert. Die Aliquots wurden entfernt und das Zell-gebundene ¹²&sup5;I-EBP wurde durch Zentrifugation über Sucrose-Gradienten bestimmt. Die nicht-spezifische Bindung wurde in Parallelreaktion mit 380 nM nicht-markiertem EBP gemessen.
Die Gleichgewichtsbindungskonstanten wurden durch Inkubation von CHO 19.32- oder LIM 2405-Zellen (0,5 · 10&sup6; Zellen/ml) mit unterschiedlichen Mengen an ¹²&sup5;I-EBP bei 0ºC über eine Stunde bestimmt, das gebundene EBP wurde wie vorstehend bestimmt, und die Daten wurden nach dem Verfahren von Scatchard (Annal. N.Y. Acad. Sci. 51, 660 (1949)) analysiert. Die nicht-spezifische Bindung wurde in Parallelreaktionen mit einem 50fachen Überschuß an nicht-markiertem EBP bestimmt.
Eine Scatchard-Analyse der "Steady-State"-Bindung von ¹²&sup5;I-rEBP an LIM 2405-Zellen zeigte, daß anscheinend eine einzige Rezeptor-Klasse auf der Zelloberfläche mit einem Kd- Wert von 2,8 · 10&supmin;&sup8; M ± 0,3 · 10&supmin;&sup8; vorliegt. Im Durchschnitt hatten die LIM 2405-Zellen 1,3 · 10&sup6; EBP-Rezeptoren an der Zelloberfläche. Die BIAcore-Analyse der EBP-Bindung an immobilisierte eck-x-Oberflächen führte zu einem abgeschätzten Kd-Wert von 2,4 · 10&supmin;&sup8; M ± 0,4 · 10&supmin;&sup8;.

C. p130eck Autophosphorylierungsuntersuchungen

Die LIM 2405 Kolorektal-Carcinom-Zellinie (Whitehead et al., Immunol. and Cell Biol. 70, 227 (1992)) wurde in RPMI 1640 mit S% FBS, 1 ug/ml Insulin, 10 ug/ml Hydrocortison und 10 uM α-Thioglycerin gehalten und durch Trypsinierung und Verdünnung (1 : 5) in frisches Medium subpassagiert. Vor dem Test wurden 2,5 · 10&sup5; LIM 2405-Zellen in 6-Napf-Platten (Falcon # 3046) ausgesät und über 24 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Medien wurden verworfen und ersetzt durch Serum-freies RPMI 1640 mit 0,03% BSA, 1 ug/ml Insulin, 10 ug/ml Hydrocortison und 10 uM α-Thioglycerin, und sodann 12-18 Stunden inkubiert. In einigen Experimenten wurden die Zellkulturen vor der Behandlung mit ³²P-Orthophosphat (2 mCi/ml) in Phosphatfreiem RPMI 1640 (Flow) für 2-3 Stunden markiert. Die Wachstumsfaktor- Stammlösungen wurden in unterschiedlichen Konzentrationen in 2,0 ml Serum-freien Medien vorverdünnt und sodann auf 37ºC aufgewärmt. Die Zellkulturen wurden aus dem Inkubator entfernt, und der Mediumsüberstand wurde verworfen. Die Behandlungslösungen wurden sofort hinzugefügt und die Zellkulturen bei 37ºC 10-15 Minuten inkubiert. Die Kulturen wurden sodann aus dem Inkubator entfernt, auf Eis gestellt, und der Kulturüberstand abgesaugt.
Die behandelten Zellkulturen wurden auf 0ºC abgekühlt und sodann einmal mit eiskaltem PBS (GIBCO) gewaschen. Das restliche PBS wurde abgesaugt und die Zellen wurden durch Hinzufügen von 1,0 ml eiskaltem RIPA-Puffer (10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid, 0,1% Natriumdodecylsulfat, 1% NP-40, 1% Desoxycholat, 1% Trasylol, 2 mM EDTA, 50 mM Natriumfluorid und 100 mM Natriumorthovanadat) lysiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation wurden die Lysate in 1,5 ml-Röhrchen transferiert und durch Zentrifugation für 30 Minuten bei 10.000 · g geklärt. Die geklärten Lysat-Überstände wurden in neue Röhrchen übertragen und mit 1,0 ul/ml affinitätsgereinigtem Kaninchen-anti-Eck C- terminale Domäne-Antikörper über 2 Stunden bei 0ºC immunpräzipitiert. Die Immunkomplexe wurden an Protein-Gel-Sepharose-Kügelchen (Pharmacia) bei 4ºC über 30 Minuten adsorbiert, zweimal mit eiskaltem RIPA-Puffer, einmal mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 mit 0,5 M LiCI und einmal mit RIPA-Puffer gewaschen. Die resultierenden Immunpräzipitate wurden mit SDS-PAGE-Probenpuffer solubilisiert und für die weitere Untersuchung gelagert.
Die anti-eck-Immunpräzipitate aus behandelten und nicht-behandelten LIM 2405-Zell-Lysaten wurden in einem 7,5% Polyacrylamidgel, wie kürzlich beschrieben (Boyle et al., Meth. Enzymol. 201, 110 (1991)), aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele elektrogeblottet (Kamps, Meth. Enzymol. 201, 110 (1991)) auf Immobilon P (Millipore), und die Blots wurden 1 Stunde in Tris-gepufferter Saline mit 0,1% Tween-20 (TBST) und 5% BSA inkubiert, um die unspezifischen Bindungsstellen auf der Membran zu blockieren. Die Erst- Antikörper, entweder anti-Phosphotyrosin-Antikörper (4G10, UBI, Lake Placid, NY) oder anti-eck C-terminal, wurden auf 1,0 ug/ml in TBST mit 3% BSA, 1% Ovalbumin, verdünnt und mit den Blots 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Blots mit TBST abgewaschen, sodann einmal 10-15 Minuten, nachfolgend zweimal 5 Minuten, jeweils mit TBST gewaschen. Die Blots wurden sodann mit einer 1 : 5000-Verdünnung des an Meerrettichperoxidase gekoppelten Zweit-Antikörpers (Amersham, Arlington Heights, IL) in TBST allein 20-30 Minuten inkubiert und sodann wie vorstehend mit TBST gewaschen. Die Immunkomplexe wurden durch Chemilumineszenz-Aufnahme (ECL, Amersham) auf Kodak X-OMAT Röntgenfilm bei Raumtemperatur über 0,5 bis 5 Minuten nachgewiesen.
Die E eck-Rezeptor-Immunpräzipitate aus ³²P-markierten LIM 2405-Zellen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, und das Gel wurde direkt ohne Fixierung getrocknet. Nach dem Belichten des Röntgenfilms wurde die markierte eck-Rezeptor-Bande isoliert und der Gehalt an Phosphoaminosäure nach Boyle et al., Meth. Enzymol. 201, 110 (1991)) bestimmt.
Das CHO-Zell-abgeleitete rEBP stimulierte die eck-Rezeptor-Phosphorylierung in intakten LIM 2405-Zellen in einer Dosis-abhängigen Weise, mit einer optimalen Konzentration zwischen 100 ng/ml und 1 mg/ml (Fig. 6, obere Tafel). Es schien auch eine moderate Dosisabhängige Erniedrigung der Mengen des gesamten zellulären eck-Proteins zu geben (Fig. 6, untere Tafel), was eine Hinunterregulation des Rezeptors nach Exposition mit löslichem EBP vermuten läßt. Behandlung von LIM 2405-Zellen mit EBP führt nicht zur scheinbaren Phosphorylierung des EGF-Rezeptors, und Behandlung mit EGF induziert keine eck-Phosphorylierung. Weiterhin ist das einzige induzierte Phosphoprotein ein Polypeptid mit Mr 130 kd, das dem reifen eck-Rezeptor entspricht, falls Gesamtzellprotein von mit rEBP behandelten LIM 2405-Zellen untersucht wurde.
rEBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0; aus E. coli wurde auch auf Autophosphorylierung des eck-Rezeptors auf LIM 2405- Zellen getestet, gemäß dem Verfahren für rEBP aus CHO-Zellen. Bei der Behandlung von Zellen mit den gleichen Mengen an CHO-rEBP und EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0; aus E. coli wurde beobachtet, daß beide rekombinante EBP-Formen aktiv eine Phosphorylierung induzierten.

BEISPIEL 7

Formulierung von rekombinantem EBP

Bei Messung der Bindung von EBP an die immobilisierte lösliche extrazelluläre Domäne aus eck mittels BIAcore wurde herausgefunden, daß verdünnte Lösungen an gereinigtem EBP schnell die Fähigkeit verloren, an den eck-Rezeptor zu binden, sofern sie nicht mit einem schützenden Agens formuliert wurden, wie einem Detergens. Rekombinantes CHO-EBP, in PBS zu 100 ug/ml verdünnt, und 2 Stunden bei 3ºC inkubiert, verlor etwa 50% seiner eck- Bindeaktivität. Dieser Verlust an Aktivität kann durch Formulierung des EBPs in einem Detergens, wie 1 mM CHAPS, 0,1% NP-40, 0,1% Tween 20, 0,1% Triton-X 100 oder 0,1% Tween 80 vermieden werden (vgl. Fig. 7). Der Verlust an eck-Bindeaktivität in verdünntem EBP kann ebenfalls durch Inkubation des Proteins mit anderen Protein-Carriern, wie fetalem Kälberserum, vermieden werden.
Die eck-Bindeaktivität von EBP bei 2-5 mg/ml in Detergenslösungen ist für wenigstens eine Woche bei 3ºC stabil. Proteinlösungen ün Bereich von 10-500 ug/ml verlieren Aktivität, falls sie bei -20ºC aufbewahrt werden oder falls sie mehrmals eingefroren und aufgetaut werden.

BEISPIEL 8

Expression von EBP und eck-Rezeptor in Geweben und Zellinien

Expression von EBP wurde auf mRNA-Ebene in verschiedenen Rattengeweben und Organen untersucht, unter Verwendung der durch Lindberg et al., supra, beschriebenen Verfahren. EBP wird am stärksten in der Lunge, im Darm, in der Leber, im Ovar und in der Niere exprimiert. Eine niedrigere Expression wurde ebenfalls im Muskel, Magen und Gehirn entdeckt.
Expressionsstudien wurden sowohl für EBP als auch den eck-Rezeptor in Zellinien durchgeführt. EBP-Expression wurde durch Immunoblotting von Zellüberständen in einer Western- Analyse mit affinitätsgereinigtem monoklonalen Antikörpern gegen menschliches EBP untersucht. Wie in Tabelle 2 gezeigt, wird EBP in vielen Karzinomzellen gefunden. eck-Expression wurde durch mehrere Verfahren untersucht, einschließlich Immunoblotting von vollständigen Zellysaten und Immunopräzipitation mit anti-eck Antikörpern aus Zellysaten (Lindberg et al., supra). Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß eck in vielen Zellinien epithelialen Ursprungs exprimiert wird und zusätzlich, daß es in Fibroblasten und Melanomzellinien vorhanden ist.

TABELLE 2

Zellinien, die EBP exprimieren:

Zelline Zelltyp

CaCo2 Kolon-Adenokarzinom
FADU squamöses Karzinom
T47D Brustkarzinom
MDAMD361 Brust-Adenokarzinom
THP-1 monozytäre Leukämie
SKBR3 Brust-Adenokarzinom
CaOV4 Adenokarzinom
MDAMB453 Brust-Adenokarzinom
Caki1 Nierenkarzinom
HBL100 Brust
HT29 Kolon-Adenokarzinom
JEG1 Choriokarzinom
293 embryonische Niere
A704 Nieren-Adenokarzinom
Caki2 Nieren-Adenokarzinom
CaOV3 Ovar-Adenokarzinom
SKOV3 Ovar-Adenokarzinom
A172 Glioblastom
A431 epidermales Karzinom
BSC1 Niere
BT20 Brustkarzinom
PC3 Prostata-Adenokarzinom
JAR Choriokarzinom
A498 Nierenkarzinom
LNCaP Prostata-Adenokarzinom
BT474 Brustkarzinom
SW480 Kolon-Adenokarzinom
SW620 Kolon-Adenokarzinom
MCF7 Brust-Adenokarzinom
T24 Blasenkarzinom
5637 Blasenkarzinom
Du145 Prostatakarzinom
SKNSH Neuroblastom
L929 Bindegewebe
G401 Nierentumor
THP-1 monozytäre Leukämie
CCD11Lu Lunge
HT29 Kolon-Adenokarzinom
SKOV3 Ovar-Adenokarzinom
A172 Glioblastom
A431 Epidermiskarzinom

TABELLE 2 (Fortsetzung)

Zellinien, die EBP exprimieren:

Zelline Zelltyp

JAR Choriokarzinom
GM4312A Fibroblast
Wi38 Lunge
UT7 Promegakaryozyt
CHOK1 Ovar
HS249T Melanom
M14 Melanom
NIH3T3 Fibroblast

BEISPIEL 9

Biologische Aktivität von EBP

A. Aktivität von EBP in einem Ratten-Wundkammer-Assay

Die Wirkungen von rekombinantem EBP aus CHO-Zellen und E. coli auf die Bildung von Granulationsgewebe in subkutan eingesetzten Wundkammern in Ratten wurden untersucht.
Männliche Sprague-Dawley-spezifische pathogenfreie Ratten (300-350 g; Charles River Breeding Laboratories, Inc.) wurden für diese Studie verwendet. Ratten wurden mit Natriumpentobarbital (50 mg/kg Körpergewicht) mittels intraperitonealer Injektion anästhesiert. Mittels aseptischer chirurgischer Techniken wurde ein Schnitt einer Mittellinie von 3 cm auf der dorsalen Oberfläche der Ratte durchgeführt. Eine einzige Tasche bildete sich unter dem Panniculus carnosis durch stumpfe Dissektion auf einer Seite des Tieres. Ein steriler Draht-Meßzylinder aus rostfreiem Stahl einer Länge von 3 cm und einem Durchmesser von 1 cm wurde dann subkutan eingesetzt. Die verwendeten Wundkammern waren ähnlich zu den durch Schilling et al. (Surgery 46, 702-710 (1959)) beschriebenen und den durch Hunt et al. (Am. J. Surg. 114, 302-307 (1967)) als Wundheilmodelle verwendeten. Der Einschnitt wurde mit Wundklammern geschlossen. Die Ratten überlebten die Operation ohne Anzeichen einer postoperativen Schädigung. Ab dem 3. Tag nach Einsetzen der Wundkammer wurden die Ratten zufällig in 5 Gruppen aufgeteilt. Zu dieser Zeit begannen tägliche Injektionen von 1) 10 ug EBP aus CHO-Zellen, 2) 1 ug EBP aus CHO-Zellen, 3) 8 ug EBP aus E. coli, 4) 5 ug rekombinanter Wachstumsfaktor aus Blutplättchen (PDGF) oder 5) 0,1 ml steriles PBS und 1 mM CHAPS und wurden über eine Gesamtzeit von 9 Tagen weitergeführt. Die Injektionen erfolgten direkt in die Wundkammer durch ein Silikonseptum am äußeren Eck der Kammer. 12 Tage nach Einsetzen der Kammer wurden die Ratten durch Ersticken mit CO&sub2; getötet. Unmittelbar nach dem Töten wurden die Kammern operativ entfernt und vorsichtig geöffnet. Das eingeschlossene Granulationsgewebe wurde dann gewogen und zur Weiterbehandlung bei -70ºC aufbewahrt.
Proben von Granulationsgewebe wurden aufgetaut und mit einem Polytron Homogenisator in 2 ml eiskaltem destillierten Wasser 1 Minute homogenisiert. Sodann wurden 2 ml eiskalte 10%ige Trichloressigsäure zum Homogenisat hinzugefügt und 1 Stunde bei 4ºC inkubiert. Die TCA-präzipitierten Proben wurden bei 4ºC zentrifugiert (500 g, 10 Minuten), einmal mit 2 ml eiskalter 5%iger TCA gewaschen und schließlich mit 2 ml eiskaltem 95%igen Ethanol mit 50 mM Natriumacetat gewaschen. Die Proben wurden zweimal mit 2 ml Ethanol : Ether (3 : 1, v/v) bei 20ºC entfettet. Nach dem Entfetten wurden die Proben zentrifugiert (500 · g, 10 Minuten) und der Überstand verworfen. Das Präzipitat wurde dann in 1 N Natriumhydroxid gelöst und auf ein Volumen von 10 ml gebracht.
Die Menge an Gesamtprotein wurde durch Entnahme eines Aliquots des gelösten Granulationsgewebes und dem Testen der Probe nach Bradford (Anal. Biochem. 72, 248-251 (1976)) bestimmt. Rinderserumalbumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde für eine Protein- Standardkurve verwendet.
Der Gesamtgehalt an DNA wurde als Desoxyribose durch das kolorometrische Verfahren nach Burton (Biochem. J. 62, 315 (1956)) wie folgt bestimmt. 1 ml Aliquot der gelösten Probe (in N NaOH) wurde durch Zugabe von 0,5 ml 2 N HCl neutralisiert. Ein 1 ml Aliquot der neutralisierten Lösung wurde mit 10% Perchlorsäure 15 Minuten bei 90ºC extrahiert. Eine Menge von 1 ml des endgültigen Extrakts wurde zu 2 ml aktiviertem Diphenylamin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) Reagenz gegeben und die Absorption bei 600 nm nach über Nacht-Inkubation bei Raumtemperatur gemessen. Hydrolysierte Kalbsthymus-DNA (Sigma) wurde zur Erstellung der Standardkurve verwendet. Der DNA-Gehalt wurde als ungefährer Anhaltspunkt für die Zellen in der Wundkammer gemessen, wobei man sich bewußt war, daß der Zelltyp und der Status des Zellzyklus auch den DNA-Gehalt beeinflussen.
Die Menge an Gesamt-Glycosaminglykanen (GAGs) wurde mittels Chondroitinsulfat als Standard bestimmt. Ein spektrophotometrischer Test für GAGs wurde durchgeführt und eine Veränderung im Absorptionsspektrum des 1,9-Dimetyhlmethylenblau-Farbstoffs gemessen (Farndale et al., Conn. Tiss. Res. 9,247-248 (1982)).
Der Gesamtgehalt an Kollagen wurde als Hydroxyprolin (ein Marker für den Kollagengehalt) nach Hydrolyse des gelösten Granulationsgewebes in 6 N HCl für 24 Stunden bei 110ºC bestimmt. Proben von 200 ul des Hydrolysats wurden eingetrocknet, in 200 ul-Puffer gelöst und auf Hydroxy-L-Prolin durch Aminosäure-Analyse mittels eines Beckman 6300 Aminosäure-Analyzer untersucht. Eine Quantifizierung wurde mittels eines externen Standards an Hydroxy-L-Prolin (Sigma) durchgeführt.
Die Daten wurden durch eine Einweg-Analyse der Abweichung analysiert. Signifikante Unterschiede wurden durch Vergleich von einzelnen Gruppen mit einem zweifachen ungepaarten Student T-Test ausgewertet. Statistische Signifikanz wurde als p < 0,05 festgelegt. Alle Werte werden als Mittelwert ±SEM angegeben.
CHO-rEBP bei einer Dosis von 10 ug pro Kammer pro Tag für 9 aufeinanderfolgende Tage und rPDGF bei einer Dosis von 5 ug pro Tag (· 9 Tage) erhöhten beide signifikant das Naßgewicht, Gesamtprotein, die Gesamt-DNA und den Gesamt-GAG-Gehalt des Granulationsgewebes der Kammer im Vergleich zu den mit dem Träger behandelten (PBS und 1 mM CHAPS) Kontrollratten (vgl. Tabelle 3). Alle Kammern wurden 12 Tage nach dem Einsetzen entnommen. Dieser Zeitpunkt befindet sich am Maximum einer Bildung von Granulationsgewebe und am frühen Stadium einer Kollagenbildung. CHO-rEBP bei einer Dosis von 1 ug pro Kammer pro Tag zeigte eine signifikante Erhöhung des Naßgewichts und GAG- Gehalts des Granulationsgewebes gegenüber Kammern aus Träger behandelten Kontrollratten. Jedoch gab es keine signifikanten Unterschiede gegenüber der Kontrolle im Gehalt an Gesamtprotein, DNA und Hydroxyprolin bei der 1 ug rEBP-Dosis.
Die Anhäufung von Kollagen ist wahrscheinlich der einzige wichtigste Faktor, der eine Wundstärke bedingt. PDGF-behandelte Kammern zeigten eine 82%ige Erhöhung des Hydroxyprolingehalts (und daher der Kollagensynthese) gegenüber Kontrollkammern. CHO- rEBP zeigte eine 21%ige Erhöhung des Hydroxyprolins bei 1 ug/Kammer/Tag und eine 35%ige Erhöhung des Hydroxyprolins bei 10 ug/Kammer/Tag, obwohl diese Erhöhungen statistisch nicht signifikant waren. TABELLE 3 Wirkungen von CHO-EBP auf die Bildung von Granulationsgewebe in Wundkammern in Ratten
Alle Werte sind Mittelwerte ±SEM
*p < 0,05 durch zweifachen unpaarigen Student-T-Test gegen Kontrollgruppe
**p < 0,01 durch zweifachen unpaarigen Student-T-Test gegen Kontrollgruppe

B. Aktivität von EBP in der Hämatopoese von Mäusen

Nicht fraktionierte Knochenmarkssuspensionen aus BDF-Mäusen wurden auf serumfreies Kulturmedium (Iscove's modifiziertes Dulbeccos Medium) mit 0,3% Agarose plattiert und bei 37ºC, 5% CO&sub2; 10 Tage bei einer Zellkonzentration von 1 · 10&sup5;/ml in Platten mit 96 Näpfchen inkubiert. Das Gesamtvolumen pro Zelle betrug 50 ul. EBP und weitere Wachstumsfaktoren wurden in den angegebenen Mengen hinzugegeben und Kolonien wurden am 10. Tag der Inkubation verzeichnet. Die Resultate sind in Fig. 8 gezeigt.
EBP bei 1 ug/ml konnte die Mäuse-IL-3-abhängige Bildung von Mäuse-CFU-C etwa 2fach gegenüber IL-3 allein erhöhen. CFU-C steht für CFU-G, CFU-GM und CFU-M. EBP allein zeigte keine Stimulierung von CFU-M oder BFU-E/CFU-E.

C. Aktivität von EBP im Kolon-Krypte-Assay

Kolone wurden von 5 (BDF) Mäusen entfernt und Krypte mittels eines nicht enzymatischen (EDTA)-Extraktionsverfahrens wie folgt isoliert. Die Kolone werden gewaschen und 20 Minuten in einer PBS-Lösung mit 0,04% Natriumhypochlorid stehengelassen. Krypte werden durch Inkubation des Gewebes für 1 Stunde bei 37ºC in einer PBS-Lösung mit 3 mM EDTA und 0,5 mM DTT isoliert. Krypte werden dann einem 90minütigen Pankreatinverdau (0,2% in PBS) bei 37ºC unterzogen, um eine einzelzellige Suspension zu erhalten. Zellen werden in PBS gewaschen, gezählt und die Überlebensrate durch Trypanblau-Ausschluß (85% in diesem Experiment) bestimmt. Zellen werden dann in einer obersten Schicht an 0,37% Sigma-Weich- Agar auf eine untere Schicht von 0,5% Agar ausplattiert. Die RPMI-Medien für den Agar beinhalten 1 · ITS (Insulin, Transferrin und Selen, Gibco). Inkubationen fanden in Gegenwart von 1% fetalem Kälberserum (FCS) statt und mit den angegebenen Wachstumsfaktoren bei folgenden Konzentrationen: TGFα, 50 ng/ml; bFGF, 60 ng/ml; EBP, 500 ng/ml. Kontrollinkubationen fehlten Wachstumsfaktoren und/oder FCS. Jede der verschiedenen Kulturbedingungen wurde dreifach durchgeführt und alle paar Tage verzeichnet.
Positive Resultate wurden nach der Inkubation der Krypte-Zellen mit 1% FCS und EBP oder 1% FCS und bFGF erhalten. Unter beiden Bedingungen waren die Zellcluster groß und die einzelnen Zellen innerhalb der Cluster scheinen gesund zu sein. In manchen Fällen hatten die Cluster die Form einer Krypte. Falls sowohl EBP als auch bFGF mit FCS hinzugefügt wurden, erschienen weniger und kleinere Cluster im Vergleich zu einer Zugabe einem der Wachstumsfaktoren allein in Gegenwart von 1% FCS. Anfänglich schien die Kombination von EBP und bFGF Zellwachstum zu induzieren, jedoch war diese Stimulation des Wachstums kurzlebig. In den Platten mit EBP allein (kein Serum) waren gelegentlich große Cluster, jedoch waren diese lockerer, die Zellen waren größer und etwa die Hälfte der Zellen im Cluster waren nicht lebensfähig.
Diese Resultate zeigen, daß EBP in der Vermehrung, Differenzierung oder Bildung von Kolon-Krypte-Zellen beteiligt ist. TABELLE 4 Aktivität von EBP im Kolon-Krypte-Assay
NT - nicht behandelt

D. Aktivität von EBP auf Primärkulturen von Hepatozyten

Hepatozyten wurden durch die in situ-Zweischritt-Kollagenase-Perfusionstechnik isoliert, beschrieben durch Seglen (Methods in Toxicol., Band 1A, 231-243 (1993)). Die perfundierten Lebern wurden in eiskaltem Hanks Puffer dispergiert, durch ein Nylonnetz filtriert und Hepatozyten von nicht-parenchymatischen Zellen durch wiederholte Zentrifugation bei 50 · g abgetrennt. Gemäß der Bestimmung durch Tryptanblau-Ausschluß waren die Hepatozyten zu mehr als 85% lebensfähig. Die Hepatozyten wurden auf mit Rattenschwanz-Kollagen beschichteten Platten kultiviert und auf Williams E mit 5% FCS, 10&supmin;&sup7; M Insulin, 10&supmin;&sup8; M Dexamethason, Glutamin, Penicillin und Streptomycin ausplattiert.
Man ließ die Zellen für 3-4 Stunden in Serum-enthaltendem Medium anheften und sie wurden dann in Serum-freies Medium transferiert. EBP und andere Wachstumsfaktoren wurden in geeigneten Konzentrationen hinzugefügt und die Zellen wurden 24 bis 48 Stunden in Gegenwart von ³H-Thymidin inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Grad des 3H-Thymidin-Einbaus in die Zellen bestimmt. Die getesteten Wachstumsfaktoren waren Keratinocyten-Wachstumsfaktor (KGF) bei 10 ng/ml, saures FGF (aFGF) bei 20 ng/ml und EBP bei 20 ng/ml. Die Resultate sind in Fig. 9 gezeigt. Die Stärke des EBP-stimulierten Einbaus von ³H-Thymidin ist etwa gleich zur aFGF-induzierten. Die Kombination von KGF und EBP simulierte Hepatozytenwachstum nicht über das Maß, wie es für KGF allein beobachtet wird. In diesem bestimmten Experiment war der Serum-freie Wert ungewöhnlich hoch (etwa 3fach).
Obwohl die vorliegende Erfindung durch bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurde, sollen verständlicherweise Abänderungen und Modifikationen dem Fachmann klar sein. Daher sollen die angefügten Ansprüche alle äquivalenten Variationen abdecken, die im Bereich der Erfindung liegen, wie sie beansprucht wird.

Sequenzprotokoll

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:

(A) NAME: Amgen Inc.
(B) STRASSE: One Amgen Center Drive
(0) STADT: Thousand Oaks
(D) STAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 91320-1789

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Eck-Rezeptor-Liganden

(i) ANZAHL DER SEQUENZEN: 16
(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette, 3,5 inch, DS
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 205 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 30 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2

AAGCATATGG ATCGCCACAC CGTCTTCTGG 30

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 35 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

GAAGGATCCT TATCACGGGG TTTGCAGCAG CAGAA 35

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 36 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

GAAGGATCCC TATTATGCTG CAAGTCTCTT CTCCTG 36

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 31 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

GAATTCAAGC TTCAGGCCCC GCGCTATGGA G 31

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

GAATTCTCTA GATCATCACG GGGTTTGCAG CAGCA 35

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 13 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

AGCTTAGATC TCC 13

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

AATTGGAGAT CTA 13

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 39 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

AATTCCAGAC GCTGTCCCCG GAGGGATCCG GCAACTGAG 39

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

TCGACTCAGT TGCCGGATCC CTCCGGGGAC AGCGTCTGG 39

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 1480 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure.
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 40 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

GAATTCTCTA GATTTCATGG AAGGAGCAGC ACAGTCCAG 40

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LANGE: 39 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

GAATTCTCTA GATTATCATG GGAAGAGGCG TGGGGCAGC 39

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 41 Nukleotide
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

GAATTCTCTA GATTATCATG GGGCAGCACT GTGACCGATG C 41

Claims

1. Ein gereinigtes und isoliertes Polypeptid, spezifisch bindend die 130 kDa eck-Rezeptorprotein-Tyrosinkinase (EBP = eck-Rezeptorbindungsprotein) und mit Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1.

2. Polypeptid gemäß Anspruch 1, das die Phosphorylierung der 130 kDa eck-Rezeptorprotein-Tyrosinkinase induziert.

3. Polypeptid gemäß Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, endend an Position 150 oder mit Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, endend an Position 150.

4. Polypeptid gemäß Anspruch 3, wobei die Aminosäuresequenz von Position +1 bis 150 von SEQ ID NO: 1 ist.

5. Polypeptid gemäß Anspruch 1 mit einem Methioninrest an Position -1.

6. Polypeptid gemäß Anspruch 1 mit einer der Aminosäuresequenzen von Positionen 1 bis 150 (EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0;), 1 bis 159 (EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup9;), 1 bis 167 (EBP¹&supmin;¹&sup6;&sup7;), 1 bis 171 (EBP¹&supmin;¹&sup7;¹) oder 1 bis 180 (EBP¹&supmin;¹&sup8;&sup0;) von SEQ ID NO: 1.

307. Polypeptid gemäß Anspruch 6, ferner umfassend einen Methioninrest an Position -1.

8. Polypeptid gemäß Anspruch 1, das charakterisiert ist, das Produkt einer prokaryotischen oder eukaryotischen Expression einer exogenen DNA-Sequenz zu sein.

9. Polypeptid gemäß Anspruch 8, das ein Produkt der CHO-Zellexpression ist.

10. Polypeptid gemäß Anspruch 8, wobei die exogene Sequenz eine cDNA-Sequenz ist.

11. Polypeptid gemäß Anspruch 8, wobei die exogene Sequenz eine genomische DNA- Sequenz ist.

12. Polypeptid gemäß Anspruch 8, wobei die exogene Sequenz eine synthetische DNA- Sequenz ist.

13. Polypeptid gemäß Anspruch 8, wobei die exogene DNA-Sequenz auf einem autonom replizierenden DNA-Plasmid oder einem viralen Vektor ist.

14. Polypeptid gemäß Anspruch 8, das das Produkt der E. coli-Expression ist.

15. Polypeptid gemäß Anspruch 8 mit einem N-terminalen Methioninrest.

16. Eine DNA-Sequenz, kodierend ein Polypeptid, spezifisch bindend die 130 kDA eck- Rezeptorprotein-Tyrosinkinase, wobei das Polypeptid Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 hat.

17. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 16, kodierend ein Polypeptid mit einer der Aminosäuresequenzen von Position 1 bis 150 (EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup0;), 1 bis 159 (EBP¹&supmin;¹&sup5;&sup9;), 1 bis 167 (EBP¹&supmin;¹&sup6;&sup7;), 1 bis 171 (EBP¹&supmin;¹&sup7;¹) oder 1 bis 180 (EBP¹&supmin;¹&sup8;&sup0;) von SEQ ID NO: 1.

18. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 17, kodierend ein Polypeptid ferner umfassend einen Methioninrest an Position -1.

19. Ein isolierter 130 kDa eck-Rezeptorprotein-Tyrosinkinase-Ligand-Komplex, wobei der Ligand das Polypeptid gemäß Anspruch 1 ist.

20. Ein Verfahren zum Nachweis in einer rohen Probe eines Liganden, fähig zur Bindung der 130 kDa eck-Rezeptorprotein-Tyrosinkinase, umfassend die Schritte:

a) Immobilisieren einer gereinigten Liganden-Bindungsdomäne des Rezeptors;

b) Kontaktieren des immobilisierten Rezeptors mit konditioniertem Medium, enthaltend den Liganden, und

c) Beobachten der Bindung des Liganden an den immobilisierten Rezeptor durch ein Oberflächen-Plasmonresonanz-Nachweissystem.

21. Der 130 kDa eck-Rezeptorprotein-Tyrosinkinase-Ligand gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Verwendung als eine aktive therapeutische Substanz.

22. Die Verwendung eines 130 kDa eck-Rezeptorprotein-Tyrosinkinase-Liganden gemäß Anspruch 21 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs; Entzündung und Wunden zur Steigerung der Hämatopoese zur Stimulierung der Colon-Krypta-Zellen und zur Stimulierung der Vermehrung der Hepatozyten.

23. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines 130 kDa eck-Rezeptorprotein-Tyrosinkinase-Liganden gemäß Anspruch 21 und eines pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittels, Hilfsstoffs oder Trägers.

24. Eine Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 und ein Detergens.

25. Die Verwendung eines Liganden der 130 kDa eck-Rezeptorprotein-Tyrosinkinase zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, um die Aktivität der 130 kDa eck- Rezeptorprotein-Tyrosinkinase zu modulieren, wobei der Ligand ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 15 ist.

26. Ein in vitro-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Aktivität der 130 kDa eck-Rezeptorprotein-Tyrosinkinase modulieren, umfassend die Schritte:

a) Aussetzen der Zellen, die den Rezeptor ausstellen, gegenüber bekannten Liganden für 5 eine Zeit, die ausreichend ist, um die Bildung von Rezeptor-Liganden-Komplexen zu erlauben und die Signaltransduktion zu induzieren;

b) Bestimmung des Ausmaßes der Aktivität innerhalb der Zellen, und

c) Vergleichen der gemessenen Aktivität gegenüber der Aktivität in Zellen, die nicht dem Liganden ausgesetzt sind.