JPH07224089A - ｎｅｕレセプターの刺激因子 - Google Patents
ｎｅｕレセプターの刺激因子Info
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- JPH07224089A JPH07224089A JP4091601A JP9160192A JPH07224089A JP H07224089 A JPH07224089 A JP H07224089A JP 4091601 A JP4091601 A JP 4091601A JP 9160192 A JP9160192 A JP 9160192A JP H07224089 A JPH07224089 A JP H07224089A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/4756—Neuregulins, i.e. p185erbB2 ligands, glial growth factor, heregulin, ARIA, neu differentiation factor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 ｒａｓ形質転換繊維芽細胞により馴化した培
地から得られるｐ１８５ｎｅｕタンパク質の哺乳動物タ
ンパク性刺激因子（ｎｅｕレセプター刺激因子）；例え
ばｎｅｕレセプターチロシンリン酸化アッセイによりア
ッセイされ得る因子と実質的に同一の生物学的活性を有
する類似体、変異体及び活性フラグメント；因子を単独
又は他の治療薬と組み合わせて施用することにより例え
ば増殖及び分化のような細胞生物活性を調節する方法；
治療値をそれ自体有する因子に対する抗体；因子及びそ
の結合特性を使用することにより、例えば腫瘍細胞の表
面上に過剰発現されるようなｎｅｕレセプターの体内異
常レベルを診断する方法；並びに抗因子抗体を使用する
ことにより因子それ自体の異常レベルを診断する方法。 【効果】 本因子は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌及び胃癌
を含むｎｅｕレセプター発現に関連する種々の型の腫瘍
の治療に有用である。
地から得られるｐ１８５ｎｅｕタンパク質の哺乳動物タ
ンパク性刺激因子（ｎｅｕレセプター刺激因子）；例え
ばｎｅｕレセプターチロシンリン酸化アッセイによりア
ッセイされ得る因子と実質的に同一の生物学的活性を有
する類似体、変異体及び活性フラグメント；因子を単独
又は他の治療薬と組み合わせて施用することにより例え
ば増殖及び分化のような細胞生物活性を調節する方法；
治療値をそれ自体有する因子に対する抗体；因子及びそ
の結合特性を使用することにより、例えば腫瘍細胞の表
面上に過剰発現されるようなｎｅｕレセプターの体内異
常レベルを診断する方法；並びに抗因子抗体を使用する
ことにより因子それ自体の異常レベルを診断する方法。 【効果】 本因子は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌及び胃癌
を含むｎｅｕレセプター発現に関連する種々の型の腫瘍
の治療に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ｎｅｕレセプターと反
応してこれを刺激し、細胞増殖及び分化を調節する新規
精製哺乳動物タンパク性因子に係る。
応してこれを刺激し、細胞増殖及び分化を調節する新規
精製哺乳動物タンパク性因子に係る。
【０００２】
【従来技術】ポリペプチドのチロシル残基へのリン酸基
の転移の酵素触媒作用はチロシンキナーゼ酵素により得
られ、細胞増殖の調節に関連すると思われる。ポリペプ
チド成長因子の数種のレセプターは、インシュリンチロ
シンキナーゼ活性を有するトランスメンブラン糖タンパ
ク質の類に属する（Ｕｌｌｒｉｃｈ， Ａ． ａｎｄＳ
ｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ， Ｊ．， Ｃｅｌｌ ６１：
２０３−２１２，１９９０）。上皮成長因子（ＥＧ
Ｆ）、インシュリン及び血小板由来成長因子（ＰＤＧ
Ｆ）のレセプターを含むこの類は、広い細胞外リガンド
結合領域を細胞質に面するタンパク質キナーゼ触媒中心
に結合する単一のトランスメンブラン領域の存在により
特徴付けられる。周知の成長及び維持因子のレセプター
以外に、チロシンキナーゼのこの類の数種は未知のリガ
ンドにより調節されると考えられている（Ｈａｎｋｓ，
Ｓ．Ｋ．， Ｃｕｒ． Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ
ｌ．１：３６９−３８３， １９９１）。
の転移の酵素触媒作用はチロシンキナーゼ酵素により得
られ、細胞増殖の調節に関連すると思われる。ポリペプ
チド成長因子の数種のレセプターは、インシュリンチロ
シンキナーゼ活性を有するトランスメンブラン糖タンパ
ク質の類に属する（Ｕｌｌｒｉｃｈ， Ａ． ａｎｄＳ
ｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ， Ｊ．， Ｃｅｌｌ ６１：
２０３−２１２，１９９０）。上皮成長因子（ＥＧ
Ｆ）、インシュリン及び血小板由来成長因子（ＰＤＧ
Ｆ）のレセプターを含むこの類は、広い細胞外リガンド
結合領域を細胞質に面するタンパク質キナーゼ触媒中心
に結合する単一のトランスメンブラン領域の存在により
特徴付けられる。周知の成長及び維持因子のレセプター
以外に、チロシンキナーゼのこの類の数種は未知のリガ
ンドにより調節されると考えられている（Ｈａｎｋｓ，
Ｓ．Ｋ．， Ｃｕｒ． Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ
ｌ．１：３６９−３８３， １９９１）。
【０００３】ｎｅｕ遺伝子（ｃ−ｅｒｂＢ−２又はＨＥ
Ｒ−２遺伝子としても知られる）によりコードされるタ
ンパク質は、このようなレセプター様チロシンキナーゼ
の一例である。最初にヒト乳癌における増幅（Ｋｉｎ
ｇ， Ｃ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．
７：１６４−１６５， １９８８）及びＥＧＦ−レセプ
ターとの関連（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ， Ａ．Ｌ． ｅｔ
ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ３１２：５１３−５１６，
１９８４； Ｓｅｍｂａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８
２：６４９７−６５０１， １９８５）により同定され
た全長遺伝子は、既知の成長因子のレセプター、特に上
皮成長因子（ＥＧＦ）−レセプターとの間に広範な構造
的相同を示すトランスメンブランチロシンキナーゼをコ
ードする（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ， Ｌ．ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１１３２−１１３９， １９
８５； Ｂａｒｇｍａｎｎ， Ｃ．Ｉ． ｅｔ ａ
ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１９：２２６−２３０， １
９８６； Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ ３１９：２３０−２３４， １９８
４）。タンパク質は、細胞外領域と、主としてチロシン
キナーゼ配列を有する細胞質部分と、比較的短いトラン
スメンブラン部分とを有する１８５ｋＤａトランスメン
ブラン糖タンパク質（即ちｐ１８５neuタンパク質）で
ある。ｎｅｕ遺伝子の齧歯目相同体は、アミノ酸のトラ
ンスメンブラン領域における点突然変異により腫瘍遺伝
子として活性化されることが示されている（Ｂａｒｇｍ
ａｎｎ， Ｃ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４５：
６４９−６５７， １９８６）。ヒト遺伝子は数種の組
織からの腺癌で増幅され、タンパク質は初期乳癌の約２
５％で過剰発現される（Ｋｒａｕｓ， Ｍ．Ｈ． ｅｔ
ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：６０５−６１０，１
９８７； Ｓｌａｍｏｎ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１７７−１８２， １９８
７； Ｖａｒｌｅｙ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ １：４２３−４３０， １９８７；
Ｖａｎ ｄｅＶｉｊｖｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏ
ｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １：２０１９−２０２
３， １９８７）。臨床結果による遺伝子増幅と過剰発
現との関連は乳癌及び卵巣癌で報告されている（Ｓｌａ
ｍｏｎ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３５：１７７−１８２， １９８７； Ｖａｒｌｅ
ｙ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
１：４２３−４３０， １９８７； Ｖｅｎｔｅｒ，
Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ，６７
−７２， １９８７； Ｚｈｏｕ， Ｄ．ｅｔ ａ
ｌ．， ＣａｎｃｅｒＲｅｓ． ４７：６１２３−６１
２５，１９８７； Ｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ． ｅｔ
ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ４８： １２３
８−１２４３， １９８８； Ｔｓｕｄａ， Ｈ． ｅ
ｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４９：３１０
４−３１０８， １９８９； Ｓｌａｍｏｎ， Ｄ．
Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０
７−７１２， １９８９）。これらの所見に一致して、
ｎｅｕの異所性過剰発現は齧歯目繊維芽細胞を形質転換
し得る（Ｄｉｆｉｏｒｅ， Ｐ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１７８−１８２， １９８
７； Ｈｕｄｚｉａｋ， Ｒ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８
４：７１５９−７１６３， １９８７）。
Ｒ−２遺伝子としても知られる）によりコードされるタ
ンパク質は、このようなレセプター様チロシンキナーゼ
の一例である。最初にヒト乳癌における増幅（Ｋｉｎ
ｇ， Ｃ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．
７：１６４−１６５， １９８８）及びＥＧＦ−レセプ
ターとの関連（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ， Ａ．Ｌ． ｅｔ
ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ３１２：５１３−５１６，
１９８４； Ｓｅｍｂａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８
２：６４９７−６５０１， １９８５）により同定され
た全長遺伝子は、既知の成長因子のレセプター、特に上
皮成長因子（ＥＧＦ）−レセプターとの間に広範な構造
的相同を示すトランスメンブランチロシンキナーゼをコ
ードする（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ， Ｌ．ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１１３２−１１３９， １９
８５； Ｂａｒｇｍａｎｎ， Ｃ．Ｉ． ｅｔ ａ
ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１９：２２６−２３０， １
９８６； Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ ３１９：２３０−２３４， １９８
４）。タンパク質は、細胞外領域と、主としてチロシン
キナーゼ配列を有する細胞質部分と、比較的短いトラン
スメンブラン部分とを有する１８５ｋＤａトランスメン
ブラン糖タンパク質（即ちｐ１８５neuタンパク質）で
ある。ｎｅｕ遺伝子の齧歯目相同体は、アミノ酸のトラ
ンスメンブラン領域における点突然変異により腫瘍遺伝
子として活性化されることが示されている（Ｂａｒｇｍ
ａｎｎ， Ｃ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４５：
６４９−６５７， １９８６）。ヒト遺伝子は数種の組
織からの腺癌で増幅され、タンパク質は初期乳癌の約２
５％で過剰発現される（Ｋｒａｕｓ， Ｍ．Ｈ． ｅｔ
ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：６０５−６１０，１
９８７； Ｓｌａｍｏｎ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１７７−１８２， １９８
７； Ｖａｒｌｅｙ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ １：４２３−４３０， １９８７；
Ｖａｎ ｄｅＶｉｊｖｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏ
ｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １：２０１９−２０２
３， １９８７）。臨床結果による遺伝子増幅と過剰発
現との関連は乳癌及び卵巣癌で報告されている（Ｓｌａ
ｍｏｎ， Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３５：１７７−１８２， １９８７； Ｖａｒｌｅ
ｙ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
１：４２３−４３０， １９８７； Ｖｅｎｔｅｒ，
Ｄ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ，６７
−７２， １９８７； Ｚｈｏｕ， Ｄ．ｅｔ ａ
ｌ．， ＣａｎｃｅｒＲｅｓ． ４７：６１２３−６１
２５，１９８７； Ｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ． ｅｔ
ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ４８： １２３
８−１２４３， １９８８； Ｔｓｕｄａ， Ｈ． ｅ
ｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４９：３１０
４−３１０８， １９８９； Ｓｌａｍｏｎ， Ｄ．
Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０
７−７１２， １９８９）。これらの所見に一致して、
ｎｅｕの異所性過剰発現は齧歯目繊維芽細胞を形質転換
し得る（Ｄｉｆｉｏｒｅ， Ｐ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１７８−１８２， １９８
７； Ｈｕｄｚｉａｋ， Ｒ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８
４：７１５９−７１６３， １９８７）。
【０００４】モノクローナル抗体（Ｙａｒｄｅｎ Ｙ．
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ
８７：２５６４−２５７３， １９８７； Ｓｃｏｔ
ｔ，Ｇ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ． ２６６：１４３００−１４３０５， １９９１）
及びキメラタンパク質（Ｌｅｅ， Ｊ． ｅｔ ａ
ｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ８：１６７−１７３， １９
８９； Ｌｅｈｖａｓｌａｉｈｏ，Ｈ． ｅｔ ａ
ｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ８：１５９−１６６， １９
８９； Ｐｅｌｅｓ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｂ
ｏ Ｊ． １０：２０７７−２０８６， １９９１；
Ｆａｚｉｏｌｉ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１：２０４０−２０４８，
１９９１）を使用することにより、ｎｅｕ遺伝子により
コードされるタンパク質のチロシンキナーゼ部分を刺激
して成長調節生化学的シグナルを発生できることが立証
された。ｐ１８５neuタンパク質と既知の成長因子レセ
プターとの機能及び構造的類似性に基づき、これらの結
果からｐ１８５neuタンパク質の内因性リガンドが存在
するであろうと予想された。リガンドの潜在的生物源を
スクリーニングするための一連の生化学アッセイを使用
することにより、腫瘍遺伝子形質転換Ｒａｔ１−ＥＪ繊
維芽細胞（Ｌａｎｄ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ
ｕｒｅ ３０４：５９６−６０２， １９８３）は、レ
セプターダウンレギュレーション、チロシン残基上の自
己リン酸化及びマイトジェン活性を含むｎｅｕタンパク
質の機能に特異的に影響する活性の生成物であるとして
同定された（Ｙａｒｄｅｎ Ｙ． ａｎｄ Ｗｅｉｎｂ
ｅｒｇ， Ｒ．Ａ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：３１７９−３１８８，
１９８９）。他の研究室は、ヒト乳癌細胞（Ｌｕｐｕ，
Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１
５５２−１５５５， １９９０）、ウシ腎細胞（Ｈｕａ
ｎｇ， Ｓ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２６５：３３４０−３３４６， １９９
０）、形質転換ヒトＴ細胞（Ｄｏｂａｓｈｉ， Ｋ．ｅ
ｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８８：８５８２−８５８６， １９９
１； Ｄａｖｉｓ， Ｊ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．
１７９：１５３６−１５４２， １９９１； ＷＯ
９１／１５２３０）及び活性化マクロファージ（Ｔａｒ
ａｋｈｏｖｓｋｙ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏ
ｇｅｎｅ ６：２１８７−２１９６，１９９１）から部
分的に精製したｎｅｕ特異的活性因子の存在を報告して
いる。
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ
８７：２５６４−２５７３， １９８７； Ｓｃｏｔ
ｔ，Ｇ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ． ２６６：１４３００−１４３０５， １９９１）
及びキメラタンパク質（Ｌｅｅ， Ｊ． ｅｔ ａ
ｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ８：１６７−１７３， １９
８９； Ｌｅｈｖａｓｌａｉｈｏ，Ｈ． ｅｔ ａ
ｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ８：１５９−１６６， １９
８９； Ｐｅｌｅｓ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｂ
ｏ Ｊ． １０：２０７７−２０８６， １９９１；
Ｆａｚｉｏｌｉ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１：２０４０−２０４８，
１９９１）を使用することにより、ｎｅｕ遺伝子により
コードされるタンパク質のチロシンキナーゼ部分を刺激
して成長調節生化学的シグナルを発生できることが立証
された。ｐ１８５neuタンパク質と既知の成長因子レセ
プターとの機能及び構造的類似性に基づき、これらの結
果からｐ１８５neuタンパク質の内因性リガンドが存在
するであろうと予想された。リガンドの潜在的生物源を
スクリーニングするための一連の生化学アッセイを使用
することにより、腫瘍遺伝子形質転換Ｒａｔ１−ＥＪ繊
維芽細胞（Ｌａｎｄ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ
ｕｒｅ ３０４：５９６−６０２， １９８３）は、レ
セプターダウンレギュレーション、チロシン残基上の自
己リン酸化及びマイトジェン活性を含むｎｅｕタンパク
質の機能に特異的に影響する活性の生成物であるとして
同定された（Ｙａｒｄｅｎ Ｙ． ａｎｄ Ｗｅｉｎｂ
ｅｒｇ， Ｒ．Ａ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：３１７９−３１８８，
１９８９）。他の研究室は、ヒト乳癌細胞（Ｌｕｐｕ，
Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１
５５２−１５５５， １９９０）、ウシ腎細胞（Ｈｕａ
ｎｇ， Ｓ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２６５：３３４０−３３４６， １９９
０）、形質転換ヒトＴ細胞（Ｄｏｂａｓｈｉ， Ｋ．ｅ
ｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８８：８５８２−８５８６， １９９
１； Ｄａｖｉｓ， Ｊ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．
１７９：１５３６−１５４２， １９９１； ＷＯ
９１／１５２３０）及び活性化マクロファージ（Ｔａｒ
ａｋｈｏｖｓｋｙ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏ
ｇｅｎｅ ６：２１８７−２１９６，１９９１）から部
分的に精製したｎｅｕ特異的活性因子の存在を報告して
いる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、ｒａｓ形質転
換繊維芽細胞により馴化した培地から得られるｐ１８５
neuタンパク質の哺乳動物タンパク性刺激因子に係る。
換繊維芽細胞により馴化した培地から得られるｐ１８５
neuタンパク質の哺乳動物タンパク性刺激因子に係る。
【０００６】本発明によると、ｐ１８５neuタンパク質
（以下、「ｎｅｕレセプター」と呼称する）の特異的刺
激因子（以下、「ｎｅｕレセプター刺激因子」と呼称す
る）がｒａｓ形質転換ラット繊維芽細胞により馴化した
組織培養培地から均質に精製され、リガンドの種々の生
化学的及び生物学的特性が決定された。したがって、本
発明は、ｒａｓ形質転換繊維芽細胞により馴化した培地
からほぼ均質形で得られるｎｅｕレセプターの特異的精
製哺乳動物刺激因子を提供するものである。ｎｅｕ刺激
因子は本発明によると、ヘパリンアフィニティークロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、カ
チオン交換クロマトグラフィー及び金属キレートアフィ
ニティークロマトグラフィーの４段階のうちの少なくと
も３段階を組み合わせて使用し、好ましくは全４段階を
この順序で使用することにより、このような馴化培地か
ら得られる。
（以下、「ｎｅｕレセプター」と呼称する）の特異的刺
激因子（以下、「ｎｅｕレセプター刺激因子」と呼称す
る）がｒａｓ形質転換ラット繊維芽細胞により馴化した
組織培養培地から均質に精製され、リガンドの種々の生
化学的及び生物学的特性が決定された。したがって、本
発明は、ｒａｓ形質転換繊維芽細胞により馴化した培地
からほぼ均質形で得られるｎｅｕレセプターの特異的精
製哺乳動物刺激因子を提供するものである。ｎｅｕ刺激
因子は本発明によると、ヘパリンアフィニティークロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、カ
チオン交換クロマトグラフィー及び金属キレートアフィ
ニティークロマトグラフィーの４段階のうちの少なくと
も３段階を組み合わせて使用し、好ましくは全４段階を
この順序で使用することにより、このような馴化培地か
ら得られる。
【０００７】本発明のｎｅｕレセプター刺激因子は、約
４４０００ダルトン（即ち４４０００±５０００）の分
子量を有する糖タンパク質であることが知見された。刺
激因子はリガンドとしてｎｅｕレセプターに直接結合し
てもしなくてもよい。
４４０００ダルトン（即ち４４０００±５０００）の分
子量を有する糖タンパク質であることが知見された。刺
激因子はリガンドとしてｎｅｕレセプターに直接結合し
てもしなくてもよい。
【０００８】刺激因子は、ｎｅｕレセプターチロシンリ
ン酸化を刺激するのにピコモル範囲の濃度で活性であ
り、既知のタンパク質との間に相同を示さないアミノ酸
配列をもたらす。培養ヒト乳癌細胞で試験した処、添付
のデータに示すように刺激因子は、細胞形態の顕著な変
化及び乳成分（即ちカゼイン及び脂質）の合成を含む表
現型細胞分化を誘導した。これらの変化は、核面積の増
加、細胞増殖の抑制及びＤＮＡ倍数体の誘導をもたらし
た。
ン酸化を刺激するのにピコモル範囲の濃度で活性であ
り、既知のタンパク質との間に相同を示さないアミノ酸
配列をもたらす。培養ヒト乳癌細胞で試験した処、添付
のデータに示すように刺激因子は、細胞形態の顕著な変
化及び乳成分（即ちカゼイン及び脂質）の合成を含む表
現型細胞分化を誘導した。これらの変化は、核面積の増
加、細胞増殖の抑制及びＤＮＡ倍数体の誘導をもたらし
た。
【０００９】成長及び分化因子との類似を含む以上及び
他の生物学的証拠に基づき、本発明のｎｅｕレセプター
刺激因子は種々の潜在的用途を有することが予想され
る。例えば刺激因子は恐らくｎｅｕレセプターを発現す
る細胞の増殖及び分化を調節すると考えられるので、損
傷後の組織再生の刺激に使用され得る。更に、本発明の
刺激因子は（分化因子としてのその活性により）単独で
又は（モノクローナル抗体との結合による毒素の疾患タ
ーゲッティングに類似する、ｎｅｕレセプターに対する
選択的親和性により）複合毒素、放射性核種もしくはサ
イトカインを場合により腫瘍細胞（例えばｎｅｕレセプ
ターを過剰発現する乳房、卵巣、胃もしくは前立腺の腺
癌）に向けるために抗癌剤として使用され得る。
他の生物学的証拠に基づき、本発明のｎｅｕレセプター
刺激因子は種々の潜在的用途を有することが予想され
る。例えば刺激因子は恐らくｎｅｕレセプターを発現す
る細胞の増殖及び分化を調節すると考えられるので、損
傷後の組織再生の刺激に使用され得る。更に、本発明の
刺激因子は（分化因子としてのその活性により）単独で
又は（モノクローナル抗体との結合による毒素の疾患タ
ーゲッティングに類似する、ｎｅｕレセプターに対する
選択的親和性により）複合毒素、放射性核種もしくはサ
イトカインを場合により腫瘍細胞（例えばｎｅｕレセプ
ターを過剰発現する乳房、卵巣、胃もしくは前立腺の腺
癌）に向けるために抗癌剤として使用され得る。
【００１０】ｎｅｕレセプター刺激因子に対する抗体を
産生させ、所定の診断用途（例えば癌のようなヒト疾患
における刺激因子のレベルの変化の測定）に使用するこ
とができ、更に刺激因子が細胞におよぼす効果、例えば
細胞増殖の抑制を阻止することができる。
産生させ、所定の診断用途（例えば癌のようなヒト疾患
における刺激因子のレベルの変化の測定）に使用するこ
とができ、更に刺激因子が細胞におよぼす効果、例えば
細胞増殖の抑制を阻止することができる。
【００１１】要約すると本発明は、本明細書中に記載す
るような特性を有しており且つ記載の精製方法により得
られる精製哺乳動物レセプター刺激因子；本明細書中に
記載する方法（例えばｎｅｕレセプターチロシンリン酸
化アッセイ）によりアッセイされ得る因子と実質的に同
一の生物学的活性を有する類似体、変異体及び活性フラ
グメント；因子を単独又は他の治療薬と組み合わせて施
用することにより例えば増殖及び分化のような細胞生物
活性を調節する方法；治療値をそれ自体有する因子に対
する抗体；因子及びその結合特性を使用することによ
り、例えば腫瘍細胞の表面上に過剰発現されるようなｎ
ｅｕレセプターの体内異常レベルを診断する方法；並び
に抗因子抗体を使用することにより因子それ自体の異常
レベルを診断する方法に係る。
るような特性を有しており且つ記載の精製方法により得
られる精製哺乳動物レセプター刺激因子；本明細書中に
記載する方法（例えばｎｅｕレセプターチロシンリン酸
化アッセイ）によりアッセイされ得る因子と実質的に同
一の生物学的活性を有する類似体、変異体及び活性フラ
グメント；因子を単独又は他の治療薬と組み合わせて施
用することにより例えば増殖及び分化のような細胞生物
活性を調節する方法；治療値をそれ自体有する因子に対
する抗体；因子及びその結合特性を使用することによ
り、例えば腫瘍細胞の表面上に過剰発現されるようなｎ
ｅｕレセプターの体内異常レベルを診断する方法；並び
に抗因子抗体を使用することにより因子それ自体の異常
レベルを診断する方法に係る。
【００１２】本発明は、形質転換ラット繊維芽細胞から
精製した哺乳動物ｎｅｕレセプター刺激因子に関して実
施例中に説明される。この因子は明示したように、ヒト
ｎｅｕレセプターを刺激し、ヒト乳癌細胞の成長停止及
び表現型変化を誘導する点で極めて活性である。これら
の効果及び異なる哺乳動物種の類似因子間の実質的な相
同により、ヒト又は他の哺乳動物源から精製した相同ｎ
ｅｕレセプター刺激因子は、ｎｅｕレセプターを発現す
るヒト細胞に実質的に同一の生物学的効果を誘導し、同
一の実際的用途を有することが予想される。更に本発明
の方法は、ｎｅｕレセプター刺激活性を生じる他の哺乳
動物種の細胞系、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌
細胞（Ｌｕｐｕ， Ｒ， ｅｔ ａｌ．， 前出）、形
質転換ヒトＴ細胞（Ｄｏｂａｓｈｉ， Ｋ． ｅｔ ａ
ｌ．，前出）等の馴化培地から哺乳動物ｎｅｕレセプタ
ー刺激因子を精製することができ、ヒト因子を含むこれ
らの全哺乳動物因子は本発明に包含される。
精製した哺乳動物ｎｅｕレセプター刺激因子に関して実
施例中に説明される。この因子は明示したように、ヒト
ｎｅｕレセプターを刺激し、ヒト乳癌細胞の成長停止及
び表現型変化を誘導する点で極めて活性である。これら
の効果及び異なる哺乳動物種の類似因子間の実質的な相
同により、ヒト又は他の哺乳動物源から精製した相同ｎ
ｅｕレセプター刺激因子は、ｎｅｕレセプターを発現す
るヒト細胞に実質的に同一の生物学的効果を誘導し、同
一の実際的用途を有することが予想される。更に本発明
の方法は、ｎｅｕレセプター刺激活性を生じる他の哺乳
動物種の細胞系、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌
細胞（Ｌｕｐｕ， Ｒ， ｅｔ ａｌ．， 前出）、形
質転換ヒトＴ細胞（Ｄｏｂａｓｈｉ， Ｋ． ｅｔ ａ
ｌ．，前出）等の馴化培地から哺乳動物ｎｅｕレセプタ
ー刺激因子を精製することができ、ヒト因子を含むこれ
らの全哺乳動物因子は本発明に包含される。
【００１３】以下、サンプル中のｎｅｕレセプターの刺
激因子の存在を試験し、刺激因子を単離及び特徴付けす
るための具体的な方法及び材料に関して本発明を説明す
る。
激因子の存在を試験し、刺激因子を単離及び特徴付けす
るための具体的な方法及び材料に関して本発明を説明す
る。
【００１４】抗体 ｎｅｕレセプターのキナーゼ領域に対するモノクローナ
ル抗体（Ａｂ３）は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ（Ｕｎｉｏｎｄａｌｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から入
手した。Ｐｅｌｅｓ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢ
Ｏ Ｊ． １０：２０７７−２０８６ （１９９１）の
記載に従ってｎｅｕレセプターカルボキシ末端に対する
ポリクローナルウサギ抗体を産生させた。ＭＯＰＣ−１
４１形質細胞腫抗体はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ）から入手した。Ｋａｍｐｓ， Ｍ．Ｄ． ａｎ
ｄ Ｓｅｆｔｏｎ， Ｂ．Ｍ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
２：３０５−３１６（１９８８）に記載されているよう
に、抗ホスホチロシンウサギ抗体を製造し、アフィニテ
ィー精製した。ヒトβ及びχカゼインを認識するマウス
モノクローナル抗体は、Ｒ．Ｃ． Ｃｏｏｍｂｓ， Ｃ
ｈａｒｉｎｇ Ｃｒｏｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏ
ｏｌ， 英国、Ｌｏｎｄｏｎから入手した。
ル抗体（Ａｂ３）は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ（Ｕｎｉｏｎｄａｌｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から入
手した。Ｐｅｌｅｓ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢ
Ｏ Ｊ． １０：２０７７−２０８６ （１９９１）の
記載に従ってｎｅｕレセプターカルボキシ末端に対する
ポリクローナルウサギ抗体を産生させた。ＭＯＰＣ−１
４１形質細胞腫抗体はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ）から入手した。Ｋａｍｐｓ， Ｍ．Ｄ． ａｎ
ｄ Ｓｅｆｔｏｎ， Ｂ．Ｍ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
２：３０５−３１６（１９８８）に記載されているよう
に、抗ホスホチロシンウサギ抗体を製造し、アフィニテ
ィー精製した。ヒトβ及びχカゼインを認識するマウス
モノクローナル抗体は、Ｒ．Ｃ． Ｃｏｏｍｂｓ， Ｃ
ｈａｒｉｎｇ Ｃｒｏｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏ
ｏｌ， 英国、Ｌｏｎｄｏｎから入手した。
【００１５】細胞系の維持及び特徴付け 文献（Ｌａｎｄ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒ
ｅ ３０４：５９６−６０２， １９８３）に記載され
ているようにヒトＥＪ遺伝子（活性化Ｈａｒｖｅｙ ｒ
ａｓ遺伝子）をＲａｔ１繊維芽細胞にトランスフェクト
することにより、Ｒａｔ１−ＥＪ １−１細胞系（ＡＴ
ＣＣ）を形成した。以下に記載するｎｅｕレセプターチ
ロシンリン酸化アッセイを使用して、クローニングした
６個の独立したＲａｔ１−ＥＪ細胞系からｎｅｕレセプ
ター刺激因子を産生する細胞系をスクリーニング後、Ｒ
ａｔ１−ＥＪ １−１細胞系を大規模馴化培地製造用と
して選択した。ＡＵ−５６５細胞は、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎａｖａｌ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （Ｎａｖ
ａｌ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｏａｋｌａｎ
ｄ， ＣＡ）から入手した。ＭＣＦ７、ＳＫ−ＢＲ−
３、Ａ−４３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞は、Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌ， ＭＤ）から入手し
た。３７℃空気中で５％ＣＯ2を含む加湿インキュベー
ターで１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇ
ａｎ， Ｕｔａｈ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０又は
ＤＭＥ培地（ＧＩＢＣＯ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎ
ｄ， ＮＹ）で細胞系を培養した。
ｅ ３０４：５９６−６０２， １９８３）に記載され
ているようにヒトＥＪ遺伝子（活性化Ｈａｒｖｅｙ ｒ
ａｓ遺伝子）をＲａｔ１繊維芽細胞にトランスフェクト
することにより、Ｒａｔ１−ＥＪ １−１細胞系（ＡＴ
ＣＣ）を形成した。以下に記載するｎｅｕレセプターチ
ロシンリン酸化アッセイを使用して、クローニングした
６個の独立したＲａｔ１−ＥＪ細胞系からｎｅｕレセプ
ター刺激因子を産生する細胞系をスクリーニング後、Ｒ
ａｔ１−ＥＪ １−１細胞系を大規模馴化培地製造用と
して選択した。ＡＵ−５６５細胞は、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎａｖａｌ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （Ｎａｖ
ａｌ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｏａｋｌａｎ
ｄ， ＣＡ）から入手した。ＭＣＦ７、ＳＫ−ＢＲ−
３、Ａ−４３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞は、Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌ， ＭＤ）から入手し
た。３７℃空気中で５％ＣＯ2を含む加湿インキュベー
ターで１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇ
ａｎ， Ｕｔａｈ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０又は
ＤＭＥ培地（ＧＩＢＣＯ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎ
ｄ， ＮＹ）で細胞系を培養した。
【００１６】馴化培地 馴化培地の大規模製造のために、まずＲａｔ１−ＥＪ
１−１細胞をＴ形フラスコで培養し、２リットル細胞増
殖器（Ｎｕｎｃ）で増殖し、その後、ローラーびんに移
した。８０％の集密に達したら、単層を無血清培地と共
に３７℃で８時間インキュベートし、細胞結合タンパク
質を放出させた。次に、培地を新しい無血清培地に交換
し、細胞と共に３７℃で４８時間インキュベートした。
更に４８時間インキュベーション後、馴化培地を回収
し、最初の回収物と共にプールした。
１−１細胞をＴ形フラスコで培養し、２リットル細胞増
殖器（Ｎｕｎｃ）で増殖し、その後、ローラーびんに移
した。８０％の集密に達したら、単層を無血清培地と共
に３７℃で８時間インキュベートし、細胞結合タンパク
質を放出させた。次に、培地を新しい無血清培地に交換
し、細胞と共に３７℃で４８時間インキュベートした。
更に４８時間インキュベーション後、馴化培地を回収
し、最初の回収物と共にプールした。
【００１７】ｎｅｕレセプターチロシンリン酸化アッセ
イ 生存ＭＤＡ−ＭＢ−４５３ヒト乳癌細胞におけるｎｅｕ
レセプターチロシンリン酸化の誘導をアッセイすること
により、サンプルのｎｅｕレセプター刺激因子を試験し
た。これらの細胞はｎｅｕレセプターを過剰発現する
が、ＥＧＦレセプターは発現しない（Ｋｒａｕｓ，
Ｍ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．６：６０５
−６１０， １９８７）。カラムフラクションのサンプ
ルをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ， １ｍｇ／ｍｌ）を
含有するＰＢＳで通常通り希釈した。アッセイ前１２時
間０．５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥ培地でインキ
ュベートしておいたＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞３×１０
5個を含む４８穴皿（Ｎｕｎｃ， デンマーク）の個々
のウェルにこれらの希釈液を加えた。各ウェルにＰＢＳ
０．１５ｍｌを加えた。３７℃でサンプルと共に５分間
インキュベーション後、培地を吸引し、細胞をβメルカ
プトエタノールを含む０．０７ｍｌ熱ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
サンプル緩衝液に直接溶解させた。その後、溶解物を可
溶化させ、５分間９５℃に加熱し、各サンプルの３分の
１を６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で電気泳動に
かけた。ゲル分離したタンパク質を電気泳動によりニト
ロセルロース膜に移した。膜をまず１時間２２℃で１％
低脂肪粉ミルクで飽和させた。次にアフィニティー精製
した抗ホスホチロシンウサギ抗体を加え、インキュベー
ションを１時間続けた。検出のために、フィルタをＴＴ
ＢＳ溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６及
び１７ｍＭ ＮａＣｌ中０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２
０）で洗い、５５分間２２℃で西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ結合プロテインＡと反応させた。ＴＴＢＳで４回洗
浄することにより酵素を除去し、フィルタを１分間化学
ルミネセンス試薬（ＥＣＬ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）と反
応させた。次にフィルタを高性能ルミネセンス検出フィ
ルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）に３０秒〜３０分間暴露させた。シグナルの定量の
ために、細胞を刺激せずに又は高張性刺激剤を用いて細
胞を１Ｍ ＮａＣｌに２０分間２２℃で暴露することに
より平行アッセイを実施した。暴露したフィルムを自動
走査デンシトメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａ
ｍｉｃｓ）で走査し、シグナルを相対リン酸化単位（Ｒ
ＰＵ）で表した。尚、１単位は高張性刺激により誘導さ
れるリン酸化の程度とした。
イ 生存ＭＤＡ−ＭＢ−４５３ヒト乳癌細胞におけるｎｅｕ
レセプターチロシンリン酸化の誘導をアッセイすること
により、サンプルのｎｅｕレセプター刺激因子を試験し
た。これらの細胞はｎｅｕレセプターを過剰発現する
が、ＥＧＦレセプターは発現しない（Ｋｒａｕｓ，
Ｍ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．６：６０５
−６１０， １９８７）。カラムフラクションのサンプ
ルをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ， １ｍｇ／ｍｌ）を
含有するＰＢＳで通常通り希釈した。アッセイ前１２時
間０．５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥ培地でインキ
ュベートしておいたＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞３×１０
5個を含む４８穴皿（Ｎｕｎｃ， デンマーク）の個々
のウェルにこれらの希釈液を加えた。各ウェルにＰＢＳ
０．１５ｍｌを加えた。３７℃でサンプルと共に５分間
インキュベーション後、培地を吸引し、細胞をβメルカ
プトエタノールを含む０．０７ｍｌ熱ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
サンプル緩衝液に直接溶解させた。その後、溶解物を可
溶化させ、５分間９５℃に加熱し、各サンプルの３分の
１を６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で電気泳動に
かけた。ゲル分離したタンパク質を電気泳動によりニト
ロセルロース膜に移した。膜をまず１時間２２℃で１％
低脂肪粉ミルクで飽和させた。次にアフィニティー精製
した抗ホスホチロシンウサギ抗体を加え、インキュベー
ションを１時間続けた。検出のために、フィルタをＴＴ
ＢＳ溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６及
び１７ｍＭ ＮａＣｌ中０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２
０）で洗い、５５分間２２℃で西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ結合プロテインＡと反応させた。ＴＴＢＳで４回洗
浄することにより酵素を除去し、フィルタを１分間化学
ルミネセンス試薬（ＥＣＬ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）と反
応させた。次にフィルタを高性能ルミネセンス検出フィ
ルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）に３０秒〜３０分間暴露させた。シグナルの定量の
ために、細胞を刺激せずに又は高張性刺激剤を用いて細
胞を１Ｍ ＮａＣｌに２０分間２２℃で暴露することに
より平行アッセイを実施した。暴露したフィルムを自動
走査デンシトメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａ
ｍｉｃｓ）で走査し、シグナルを相対リン酸化単位（Ｒ
ＰＵ）で表した。尚、１単位は高張性刺激により誘導さ
れるリン酸化の程度とした。
【００１８】刺激因子の１２５Ｉ標識 本発明の単離したｎｅｕレセプター刺激因子（１μｇ）
を報告されている手順（Ｂｏｌｔｏｎ， Ａ．Ｅ． ａ
ｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ， Ｗ．Ｍ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ． １３３：５２４−５３８， １９７３）に従っ
てアミノ基特異的Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ， ＡｒｌｉｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，
ＩＬ）で放射性標識した。次に刺激因子をゲル濾過ク
ロマトグラフィーにより遊離試薬から分離した。得られ
た比活性は８×１０3ｃｐｍ／ｎｇであった。
を報告されている手順（Ｂｏｌｔｏｎ， Ａ．Ｅ． ａ
ｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ， Ｗ．Ｍ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ． １３３：５２４−５３８， １９７３）に従っ
てアミノ基特異的Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ， ＡｒｌｉｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，
ＩＬ）で放射性標識した。次に刺激因子をゲル濾過ク
ロマトグラフィーにより遊離試薬から分離した。得られ
た比活性は８×１０3ｃｐｍ／ｎｇであった。
【００１９】脂質可視化 Ｂａｃｕｓ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ３：３５０−３
６２（１９９０）の記載に従って、”ＯｉｌＲｅｄ Ｏ
ｉｎ Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ”法の変形
を使用して中性脂質を可視化した。
ａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ３：３５０−３
６２（１９９０）の記載に従って、”ＯｉｌＲｅｄ Ｏ
ｉｎ Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ”法の変形
を使用して中性脂質を可視化した。
【００２０】免疫細胞化学的染色 ヒトβ及びχカゼインに対するマウスモノクローナル抗
体を用いて免疫細胞化学的染色によりカゼインの存在を
検出した。培地を除去し、成形成分を分離後、Ｌａｂ−
ＴｅｋスライドをＰＢＳで濯ぎ、細胞を室温で１０分間
エタノール−ホルムアミド溶液（１：１，ｖ：ｖ）に固
定した。室温で２０％ヤギ血清に結合する非特異的抗体
をブロッキング後、細胞を室温で抗カゼイン（β及び
χ）抗体（希釈比１：２５０）と共にインキュベートし
た。その後、スライドを０．５ＭＴｒｉｓ緩衝食塩溶液
（ＴＢＳ），ｐＨ７．６で濯ぎ、結合抗体ビオチニル化
ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，
Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を希釈比１：２００で細
胞に加えた。細胞を再びＴＢＳで濯ぎ、希釈比１：２０
０でストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ
（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，
Ｐａ）を細胞に加えた。細胞を再びＴＢＳで濯ぎ、１
５分間ＣＡＳ Ｒｅｄと共にインキュベートし、ＣＡＳ
ＤＮＡ染色（Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｅｌｍｈｕｒｓｔ， ＩＬ）で
逆染色した。
体を用いて免疫細胞化学的染色によりカゼインの存在を
検出した。培地を除去し、成形成分を分離後、Ｌａｂ−
ＴｅｋスライドをＰＢＳで濯ぎ、細胞を室温で１０分間
エタノール−ホルムアミド溶液（１：１，ｖ：ｖ）に固
定した。室温で２０％ヤギ血清に結合する非特異的抗体
をブロッキング後、細胞を室温で抗カゼイン（β及び
χ）抗体（希釈比１：２５０）と共にインキュベートし
た。その後、スライドを０．５ＭＴｒｉｓ緩衝食塩溶液
（ＴＢＳ），ｐＨ７．６で濯ぎ、結合抗体ビオチニル化
ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，
Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を希釈比１：２００で細
胞に加えた。細胞を再びＴＢＳで濯ぎ、希釈比１：２０
０でストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ
（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，
Ｐａ）を細胞に加えた。細胞を再びＴＢＳで濯ぎ、１
５分間ＣＡＳ Ｒｅｄと共にインキュベートし、ＣＡＳ
ＤＮＡ染色（Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｅｌｍｈｕｒｓｔ， ＩＬ）で
逆染色した。
【００２１】細胞を過ヨウ素酸塩／リシン／パラホルム
アルデヒド（１：１：１容量比）に３０分間及び１０％
中和ホルマリンに６０分間固定後、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ
腫瘍遺伝子染色キット（Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｅｌｍｈｕｒｓｔ， ＩＬ）でｎｅ
ｕレセプターを免疫細胞化学的に染色した。
アルデヒド（１：１：１容量比）に３０分間及び１０％
中和ホルマリンに６０分間固定後、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ
腫瘍遺伝子染色キット（Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｅｌｍｈｕｒｓｔ， ＩＬ）でｎｅ
ｕレセプターを免疫細胞化学的に染色した。
【００２２】
【実施例】実施例１ ： Ｒａｔ１−ＥＪ １−１馴化培地からのｎ
ｅｕレセプター刺激因子の精製 ｎｅｕレセプター刺激因子の精製のために、タンパク質
９．４ｇを含有するＲａｔ１−ＥＪ １−１馴化培地１
２０リットルを記載の方法に従って５００個のローラー
びんから調製した。０．２μｍフィルタで濾過すること
により培地を清澄化させ、排除限界分子量２００００ダ
ルトンの膜を使用してＰｅｌｉｃｏｎ限外濾過システム
で３１倍に濃縮した。その後の全タンパク質精製段階は
Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステムを使用して実施
した。
ｅｕレセプター刺激因子の精製 ｎｅｕレセプター刺激因子の精製のために、タンパク質
９．４ｇを含有するＲａｔ１−ＥＪ １−１馴化培地１
２０リットルを記載の方法に従って５００個のローラー
びんから調製した。０．２μｍフィルタで濾過すること
により培地を清澄化させ、排除限界分子量２００００ダ
ルトンの膜を使用してＰｅｌｉｃｏｎ限外濾過システム
で３１倍に濃縮した。その後の全タンパク質精製段階は
Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステムを使用して実施
した。
【００２３】濃縮馴化培地の初期分画は、ヘパリンに対
する刺激因子の並の親和性（図１）に基づいて実施し
た。ＰＢＳで予め平衡化しておいたＨｅｐａｒｉｎ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１５０ｍｌを
収容するカラムに濃縮材料を直接流した。２８０ｎｍの
吸光度の低下が記録できなくなるまで、０．２Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含有するＰＢＳでカラムを洗った。結合タンパク
質を２５０ｍｌの０．２Ｍ〜１．０Ｍ ＮａＣｌ勾配で
溶離させた（図１に破線で示す）。５ｍｌフラクション
を収集した。このクロマトグラフィー段階の溶離相を図
１に示す。サンプル（０．１ｍｌ）における刺激因子活
性の存在を試験した。特に、ｎｅｕレセプターを過剰発
現する生存ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞をカラムフラクシ
ョンの透析サンプルと共にインキュベートし、記載のチ
ロシンリン酸化アッセイを使用することによりレセプタ
ーのチロシンリン酸化レベルを測定した。指示フラクシ
ョン数のアッセイの結果をオートラジオグラム（挿入
図）として示す。オートラジオグラムの自動デンシトメ
ーター走査から得られた定量アッセイ結果（走査単位）
をプロットした。走査データのグラフ上の閉じた円は、
ホスホチロシンウェスタンブロットでアッセイしたフラ
クションに対応する。
する刺激因子の並の親和性（図１）に基づいて実施し
た。ＰＢＳで予め平衡化しておいたＨｅｐａｒｉｎ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１５０ｍｌを
収容するカラムに濃縮材料を直接流した。２８０ｎｍの
吸光度の低下が記録できなくなるまで、０．２Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含有するＰＢＳでカラムを洗った。結合タンパク
質を２５０ｍｌの０．２Ｍ〜１．０Ｍ ＮａＣｌ勾配で
溶離させた（図１に破線で示す）。５ｍｌフラクション
を収集した。このクロマトグラフィー段階の溶離相を図
１に示す。サンプル（０．１ｍｌ）における刺激因子活
性の存在を試験した。特に、ｎｅｕレセプターを過剰発
現する生存ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞をカラムフラクシ
ョンの透析サンプルと共にインキュベートし、記載のチ
ロシンリン酸化アッセイを使用することによりレセプタ
ーのチロシンリン酸化レベルを測定した。指示フラクシ
ョン数のアッセイの結果をオートラジオグラム（挿入
図）として示す。オートラジオグラムの自動デンシトメ
ーター走査から得られた定量アッセイ結果（走査単位）
をプロットした。走査データのグラフ上の閉じた円は、
ホスホチロシンウェスタンブロットでアッセイしたフラ
クションに対応する。
【００２４】疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー
を使用してｎｅｕレセプター刺激因子の付加精製（図
２）を得た。Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラ
ムからの活性フラクション（合計容量３６０ｍｌ）をプ
ールし、ＹＭ１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｄａｎｖ
ｅｒｓ， ＭＡ）を使用することにより２５ｍｌに濃縮
し、濃度１．７Ｍに達するまで硫酸アンモニウムを加え
た。遠心分離（１００００×ｇ、１５分間）により清澄
化後、プールした材料をＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓ
ｅカラム（ＨＲ １０／１０， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
に充填した。０．１Ｍ Ｎａ2ＰＯ4，ｐＨ７．４中の減
少硫酸アンモニウム濃度（１．７Ｍ〜０ｍＭ）勾配４５
ｍｌによりカラム結合材料を溶離させた（図２中破
線）。２ｍｌフラクションを収集し、記載のｎｅｕレセ
プターチロシンリン酸化アッセイ（挿入図）でアッセイ
した（サンプル当たり０．００２ｍｌ）。
を使用してｎｅｕレセプター刺激因子の付加精製（図
２）を得た。Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラ
ムからの活性フラクション（合計容量３６０ｍｌ）をプ
ールし、ＹＭ１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｄａｎｖ
ｅｒｓ， ＭＡ）を使用することにより２５ｍｌに濃縮
し、濃度１．７Ｍに達するまで硫酸アンモニウムを加え
た。遠心分離（１００００×ｇ、１５分間）により清澄
化後、プールした材料をＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓ
ｅカラム（ＨＲ １０／１０， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
に充填した。０．１Ｍ Ｎａ2ＰＯ4，ｐＨ７．４中の減
少硫酸アンモニウム濃度（１．７Ｍ〜０ｍＭ）勾配４５
ｍｌによりカラム結合材料を溶離させた（図２中破
線）。２ｍｌフラクションを収集し、記載のｎｅｕレセ
プターチロシンリン酸化アッセイ（挿入図）でアッセイ
した（サンプル当たり０．００２ｍｌ）。
【００２５】イオン交換カラムクロマトグラフィーを使
用して刺激因子精製を続けた（図３）。Ｐｈｅｎｙｌ−
Ｓｕｐｅｒｏｓｅフラクション４４〜６６からのタンパ
ク質（タンパク質０．８８ｍｇ、３５ｍｌ）をプール
し、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．３）で透析し
て塩を除去し、５０ｍＭリン酸ナトリウムで予め平衡化
しておいたＨＲ５／５ Ｍｏｎｏ Ｓカチオン交換カラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。カラムを出発緩
衝液で洗浄し、その後、１ｍｌ／分の速度でＮａＣｌ勾
配で展開させた（破線）。カラムフラクションを記載の
ｎｅｕレセプターチロシンリン酸化アッセイにより希釈
比１：５０でアッセイした（挿入図）。刺激因子活性を
０．４５〜０．５５Ｍ塩濃度でフラクション２２〜２５
（各２ｍｌ）から溶離させた。
用して刺激因子精製を続けた（図３）。Ｐｈｅｎｙｌ−
Ｓｕｐｅｒｏｓｅフラクション４４〜６６からのタンパ
ク質（タンパク質０．８８ｍｇ、３５ｍｌ）をプール
し、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．３）で透析し
て塩を除去し、５０ｍＭリン酸ナトリウムで予め平衡化
しておいたＨＲ５／５ Ｍｏｎｏ Ｓカチオン交換カラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。カラムを出発緩
衝液で洗浄し、その後、１ｍｌ／分の速度でＮａＣｌ勾
配で展開させた（破線）。カラムフラクションを記載の
ｎｅｕレセプターチロシンリン酸化アッセイにより希釈
比１：５０でアッセイした（挿入図）。刺激因子活性を
０．４５〜０．５５Ｍ塩濃度でフラクション２２〜２５
（各２ｍｌ）から溶離させた。
【００２６】精製刺激因子を得るために使用した最終カ
ラム段階は、金属キレートアフィニティーカラムクロマ
トグラフィー（図４）である。Ｍｏｎｏ Ｓフラクショ
ン２２〜２５中のタンパク質をプールし、１ｍｌ Ｈｉ
−Ｔｒａｐ Ｃｕ2+キレート化セファロースカラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）に直接充填した。結合タンパク質を
増加塩化アンモニウム濃度線形勾配（０〜１Ｍ、破線）
３０ｍｌで溶離させ、記載のアッセイでｎｅｕレセプタ
ーチロシンリン酸化の誘導を試験した（挿入図）。刺激
因子はタンパク質の単一ピークを含むことが知見された
フラクション１０〜１５（０．０５〜０．２Ｍ ＮＨ4
Ｃｌ）で溶離した。
ラム段階は、金属キレートアフィニティーカラムクロマ
トグラフィー（図４）である。Ｍｏｎｏ Ｓフラクショ
ン２２〜２５中のタンパク質をプールし、１ｍｌ Ｈｉ
−Ｔｒａｐ Ｃｕ2+キレート化セファロースカラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）に直接充填した。結合タンパク質を
増加塩化アンモニウム濃度線形勾配（０〜１Ｍ、破線）
３０ｍｌで溶離させ、記載のアッセイでｎｅｕレセプタ
ーチロシンリン酸化の誘導を試験した（挿入図）。刺激
因子はタンパク質の単一ピークを含むことが知見された
フラクション１０〜１５（０．０５〜０．２Ｍ ＮＨ4
Ｃｌ）で溶離した。
【００２７】この４段階カラムクロマトグラフィー手順
により、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で約４４０００ダ
ルトンの分子量を有する精製タンパク質を得た（図
５）。指示フラクションの０．０１ｍｌアリコートを４
〜２５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動にかけ、
その後、ＩＣＮ（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ， ＣＡ）製銀
染色キットで染色した。Ｃｕ2+キレート化カラムフラク
ション１０〜１５中におけるこのタンパク質の存在は、
これらのフラクション中のｎｅｕレセプター刺激因子の
分布に相関する。表１は精製手順を要約したものであ
る。タンパク質濃度をＢｉｏＲａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎ
ｄ， ＣＡ）製タンパク質アッセイキットで決定した。
全体精製３５１１５倍及び回収率７．５％で精製タンパ
ク質２０μｇを回収した。
により、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で約４４０００ダ
ルトンの分子量を有する精製タンパク質を得た（図
５）。指示フラクションの０．０１ｍｌアリコートを４
〜２５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動にかけ、
その後、ＩＣＮ（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ， ＣＡ）製銀
染色キットで染色した。Ｃｕ2+キレート化カラムフラク
ション１０〜１５中におけるこのタンパク質の存在は、
これらのフラクション中のｎｅｕレセプター刺激因子の
分布に相関する。表１は精製手順を要約したものであ
る。タンパク質濃度をＢｉｏＲａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎ
ｄ， ＣＡ）製タンパク質アッセイキットで決定した。
全体精製３５１１５倍及び回収率７．５％で精製タンパ
ク質２０μｇを回収した。
【００２８】
【表１】 尚、表１中ＲＰＵは相対リン酸化単位を表す。１単位
は、細胞の高張衝撃を使用することにより得られるリン
酸化の程度である（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９
０）。
は、細胞の高張衝撃を使用することにより得られるリン
酸化の程度である（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９
０）。
【００２９】実施例２： ゲル電気泳動後のｎｅｕレセ
プター刺激因子の回収 ｎｅｕレセプター刺激活性が図５のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルで同定される精製タンパク質に関連することを確認す
るために、実施例１の方法により精製した２個の１００
ｎｇサンプルを非還元４〜２５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルの２つのレーンで電気泳動させた（図６）。一方のレ
ーンは銀染色した（左側パネル）。他方のレーンは８個
の水平ストリップ（Ａ〜Ｈ）に分割し、９６ｍＭグリシ
ン及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．３で
３時間ゲルの各ストリップからタンパク質を電気溶離さ
せた。電気溶離のためにＹＭ１０ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ
ｓ（Ａｍｉｃｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ Ａ
ｐｐａｒａｔｕｓ）を使用した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎコ
ンセントレーターを使用して溶離用緩衝液をＰＢＳに交
換した。次に各溶離フラクションを記載のｎｅｕレセプ
ターチロシンリン酸化アッセイでアッセイした（右側パ
ネル）。定量アッセイ結果を中央パネルに示す。活性は
約４４０００ダルトンのタンパク質を含むゲルスライス
から回収され、従ってｎｅｕレセプター刺激因子活性は
このタンパク質によるもの以外ではないことが判明し
た。
プター刺激因子の回収 ｎｅｕレセプター刺激活性が図５のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルで同定される精製タンパク質に関連することを確認す
るために、実施例１の方法により精製した２個の１００
ｎｇサンプルを非還元４〜２５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルの２つのレーンで電気泳動させた（図６）。一方のレ
ーンは銀染色した（左側パネル）。他方のレーンは８個
の水平ストリップ（Ａ〜Ｈ）に分割し、９６ｍＭグリシ
ン及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．３で
３時間ゲルの各ストリップからタンパク質を電気溶離さ
せた。電気溶離のためにＹＭ１０ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ
ｓ（Ａｍｉｃｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ Ａ
ｐｐａｒａｔｕｓ）を使用した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎコ
ンセントレーターを使用して溶離用緩衝液をＰＢＳに交
換した。次に各溶離フラクションを記載のｎｅｕレセプ
ターチロシンリン酸化アッセイでアッセイした（右側パ
ネル）。定量アッセイ結果を中央パネルに示す。活性は
約４４０００ダルトンのタンパク質を含むゲルスライス
から回収され、従ってｎｅｕレセプター刺激因子活性は
このタンパク質によるもの以外ではないことが判明し
た。
【００３０】実施例３： ｎｅｕレセプター刺激因子の
アミノ末端配列 ｎｅｕレセプター刺激活性は主要な４４キロダルトンタ
ンパク質に関連していたが、タンパク質バンドの拡散性
から、活性フラクションがこの分子量を有する２個以上
の分子種を含むという可能性が生じた。この可能性を試
験するために、最後の精製段階から得られる活性フラク
ション（図４）をＮ末端アミノ酸配列分析した。限外濾
過セル（Ａｍｉｃｏｎ）及び０．０５％ＳＤＳで予備洗
浄したＹＭ１０膜を使用することにより、精製材料の５
μｇサンプル（約１００ピコモル）を０．２ｍｌに濃縮
した。オンラインフェニルチオヒダントイニル（ＰＴＨ
−）アミノ酸分析計及びＭｏｄｅｌ ９００データ分析
システム（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ， Ｍ．Ｗ． ｅｔ
ａｌ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，”
Ｓｈｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｒ． ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ， Ｃｌｉｆｔｏｎ， ＮＪ，１９８６，
ｐａｇｅｓ ２２３−２４７）を備えるＭｏｄｅｌ ４
７７タンパク質シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｗｙｗｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔ
ｙ， ＣＡ）でタンパク質のＮ末端配列分析を行った。
ポリプレン及びＮａＣｌでプレサイクルを行ったトリフ
ルオロ酢酸処理グラスファイバーディスクにタンパク質
を充填した。デュアルシュリンジポンプ及び逆相（Ｃ−
１８）小孔カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ， ２．１ｍｍ×２５０ｍｍ）を使用して微量液体
クロマトグラフィーシステム（Ｍｏｄｅｌ１２０）でＰ
ＴＨ−アミノ酸分析を実施した。継続配列決定による
と、２３サイクルで主要配列が明確に同定された（図７
Ａ）。２つの位置はシグナルの欠如により割り当てられ
なかった。一次配列の第３番目のアミノ酸（リシン）か
ら出発する２０個のアミノ酸に対応する二次配列（一次
シグナルの約１０分の１）も検出可能であった（図７
Ｂ）。タンパク質配列決定の最初の３サイクル中のアミ
ノ酸の回収は主要配列で８５ピコモルであった。この高
収率と本質的に単一のＮ末端アミノ酸配列の存在とから
判断すると、恐らくグリコシル化変異及びＮ末端差異を
含むただ１つのタンパク質分子が、単離された活性材料
を含むと予想される。
アミノ末端配列 ｎｅｕレセプター刺激活性は主要な４４キロダルトンタ
ンパク質に関連していたが、タンパク質バンドの拡散性
から、活性フラクションがこの分子量を有する２個以上
の分子種を含むという可能性が生じた。この可能性を試
験するために、最後の精製段階から得られる活性フラク
ション（図４）をＮ末端アミノ酸配列分析した。限外濾
過セル（Ａｍｉｃｏｎ）及び０．０５％ＳＤＳで予備洗
浄したＹＭ１０膜を使用することにより、精製材料の５
μｇサンプル（約１００ピコモル）を０．２ｍｌに濃縮
した。オンラインフェニルチオヒダントイニル（ＰＴＨ
−）アミノ酸分析計及びＭｏｄｅｌ ９００データ分析
システム（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ， Ｍ．Ｗ． ｅｔ
ａｌ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，”
Ｓｈｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｒ． ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ， Ｃｌｉｆｔｏｎ， ＮＪ，１９８６，
ｐａｇｅｓ ２２３−２４７）を備えるＭｏｄｅｌ ４
７７タンパク質シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｗｙｗｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔ
ｙ， ＣＡ）でタンパク質のＮ末端配列分析を行った。
ポリプレン及びＮａＣｌでプレサイクルを行ったトリフ
ルオロ酢酸処理グラスファイバーディスクにタンパク質
を充填した。デュアルシュリンジポンプ及び逆相（Ｃ−
１８）小孔カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ， ２．１ｍｍ×２５０ｍｍ）を使用して微量液体
クロマトグラフィーシステム（Ｍｏｄｅｌ１２０）でＰ
ＴＨ−アミノ酸分析を実施した。継続配列決定による
と、２３サイクルで主要配列が明確に同定された（図７
Ａ）。２つの位置はシグナルの欠如により割り当てられ
なかった。一次配列の第３番目のアミノ酸（リシン）か
ら出発する２０個のアミノ酸に対応する二次配列（一次
シグナルの約１０分の１）も検出可能であった（図７
Ｂ）。タンパク質配列決定の最初の３サイクル中のアミ
ノ酸の回収は主要配列で８５ピコモルであった。この高
収率と本質的に単一のＮ末端アミノ酸配列の存在とから
判断すると、恐らくグリコシル化変異及びＮ末端差異を
含むただ１つのタンパク質分子が、単離された活性材料
を含むと予想される。
【００３１】実施例４： ジスルフィド結合及び炭水化
物を含む刺激因子 本発明の精製ｎｅｕレセプター刺激因子は還元後にその
分子量を維持した（図８）。刺激因子の構造に対する糖
の貢献を直接分析するために、このタンパク質を125Ｉ
で放射性標識し、酵素的に脱グリコシル化した。放射性
標識した刺激因子（８×１０4ｃｐｍ）の１０ｎｇサン
プルを、０．１％ＳＤＳを含有するＰＢＳ中で５分間煮
沸した。化合物３−（３−コルアミドプロピル−ジメチ
ルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰ
Ｓ）を終濃度２％まで加えた。次にＮ−グリカナーゼ、
Ｏ−グリカナーゼ及び／又はノイラミニダーゼ（Ｇｅｎ
ｚｙｍｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）０．５単位
を加え、因子と共に１８時間３７℃でインキュベートし
た。消化したタンパク質を１２％ＳＤＳゲル中で分離し
た。この分析（図９）の結果、Ｎ−グリカナーゼは、β
アスパルチルグリコシルアミン結合でアスパラギン結合
したオリゴ糖を放出し。タンパク質の分子量を１〜２キ
ロダルトンだけ減少させることが判明した。（Ｏ−グリ
カナーゼによる）Ｇａｌ−β（１，３）−Ｇａｌ ＮＡ
ｃコア二糖の除去の効果はより大きく、全体で８キロダ
ルトンの減少を生じた。従って、Ｏ結合糖は刺激因子の
分子量の約１５％に寄与し、Ｎ結合糖は見かけ質量の５
％未満に寄与する。
物を含む刺激因子 本発明の精製ｎｅｕレセプター刺激因子は還元後にその
分子量を維持した（図８）。刺激因子の構造に対する糖
の貢献を直接分析するために、このタンパク質を125Ｉ
で放射性標識し、酵素的に脱グリコシル化した。放射性
標識した刺激因子（８×１０4ｃｐｍ）の１０ｎｇサン
プルを、０．１％ＳＤＳを含有するＰＢＳ中で５分間煮
沸した。化合物３−（３−コルアミドプロピル−ジメチ
ルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰ
Ｓ）を終濃度２％まで加えた。次にＮ−グリカナーゼ、
Ｏ−グリカナーゼ及び／又はノイラミニダーゼ（Ｇｅｎ
ｚｙｍｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）０．５単位
を加え、因子と共に１８時間３７℃でインキュベートし
た。消化したタンパク質を１２％ＳＤＳゲル中で分離し
た。この分析（図９）の結果、Ｎ−グリカナーゼは、β
アスパルチルグリコシルアミン結合でアスパラギン結合
したオリゴ糖を放出し。タンパク質の分子量を１〜２キ
ロダルトンだけ減少させることが判明した。（Ｏ−グリ
カナーゼによる）Ｇａｌ−β（１，３）−Ｇａｌ ＮＡ
ｃコア二糖の除去の効果はより大きく、全体で８キロダ
ルトンの減少を生じた。従って、Ｏ結合糖は刺激因子の
分子量の約１５％に寄与し、Ｎ結合糖は見かけ質量の５
％未満に寄与する。
【００３２】実施例５：刺激因子によるヒトｎｅｕレセ
プターの活性化 ｎｅｕレセプターチロシンリン酸化刺激の濃度依存性の
試験の結果、本発明のｎｅｕレセプター刺激因子は１ｎ
ｇ／ｍｌの濃度（２２ｐＭ、図１０）で生物学的に活性
であることが判明した。この濃度は夫々のチロシンキナ
ーゼを刺激する他の成長因子の有効濃度と同等であるか
あるいはそれ以下である（ＹａｒｄｅｎＹ． ａｎｄ
Ｕｌｌｒｉｃｈ， Ａ．， Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ． ５７：４４３−４４８， １９８８）。ア
ミノ末端タンパク質配列分析と相俟ってこの濃度依存性
は、単離した本発明の刺激因子が確かにｎｅｕレセプタ
ー活性化に関与する分子であることを強く示唆する。従
来、ｎｅｕ特異的刺激機能からＥＧＦレセプター刺激活
性を分離することはできなかった。このため、推定ｎｅ
ｕレセプター刺激因子はＥＧＦ−レセプターのリガンド
又は刺激因子でもあることが示唆された（Ｌｕｐｕ
Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５
５２−１５５５， １９９０）。均質に精製されたタン
パク質が入手できるようになったため、この問題の直接
生化学的分析が可能になった。ｎｅｕレセプター刺激因
子がｎｅｕレセプター即ちＥＧＦレセプターに最も密接
に関係するチロシンリン酸化を刺激する能力を試験する
ことにより、レセプター特異性を試験した。
プターの活性化 ｎｅｕレセプターチロシンリン酸化刺激の濃度依存性の
試験の結果、本発明のｎｅｕレセプター刺激因子は１ｎ
ｇ／ｍｌの濃度（２２ｐＭ、図１０）で生物学的に活性
であることが判明した。この濃度は夫々のチロシンキナ
ーゼを刺激する他の成長因子の有効濃度と同等であるか
あるいはそれ以下である（ＹａｒｄｅｎＹ． ａｎｄ
Ｕｌｌｒｉｃｈ， Ａ．， Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ． ５７：４４３−４４８， １９８８）。ア
ミノ末端タンパク質配列分析と相俟ってこの濃度依存性
は、単離した本発明の刺激因子が確かにｎｅｕレセプタ
ー活性化に関与する分子であることを強く示唆する。従
来、ｎｅｕ特異的刺激機能からＥＧＦレセプター刺激活
性を分離することはできなかった。このため、推定ｎｅ
ｕレセプター刺激因子はＥＧＦ−レセプターのリガンド
又は刺激因子でもあることが示唆された（Ｌｕｐｕ
Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５
５２−１５５５， １９９０）。均質に精製されたタン
パク質が入手できるようになったため、この問題の直接
生化学的分析が可能になった。ｎｅｕレセプター刺激因
子がｎｅｕレセプター即ちＥＧＦレセプターに最も密接
に関係するチロシンリン酸化を刺激する能力を試験する
ことにより、レセプター特異性を試験した。
【００３３】この分析の結果を図１１に示す。本発明の
ｎｅｕレセプター刺激因子は、ＭＤＡ−ＭＢ０４５３ヒ
ト乳癌細胞でｎｅｕレセプターのチロシンリン酸化を刺
激することが可能であったが、ヒトＡ−４３１表皮癌細
胞でＥＧＦ−レセプター−チロシンを活性化することは
できなかった。後者はＥＧＦの添加により誘導され、従
って、本発明のｎｅｕレセプター刺激因子の特異性はｎ
ｅｕレセプターに制限されると考えられる。一方、刺激
因子で処理すると、フィルムを長時間ウェスタンブロッ
ティング後にＥＧＦレセプターチロシンリン酸化の非常
に僅かな増加を観察することができた。しかしながら、
これは十分に特徴付けられている相互反応との類似にお
いてｎｅｕレセプター刺激因子がＥＧＦレセプターに及
ぼす間接相互調節効果によるものであると予想された
（Ｓｔｅｒｎ， Ｄ．Ｊ． ａｎｄＫａｍｐｓ， Ｍ．
Ｐ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ７：９９５−１００１， １
９８８； Ｋｉｎｇ Ｃ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭ
ＢＯ Ｊ． １：１６４７−１６５１， １９８８；
Ｋｏｋａｉ， Ｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５３８９−５
３９３， １９８８）。
ｎｅｕレセプター刺激因子は、ＭＤＡ−ＭＢ０４５３ヒ
ト乳癌細胞でｎｅｕレセプターのチロシンリン酸化を刺
激することが可能であったが、ヒトＡ−４３１表皮癌細
胞でＥＧＦ−レセプター−チロシンを活性化することは
できなかった。後者はＥＧＦの添加により誘導され、従
って、本発明のｎｅｕレセプター刺激因子の特異性はｎ
ｅｕレセプターに制限されると考えられる。一方、刺激
因子で処理すると、フィルムを長時間ウェスタンブロッ
ティング後にＥＧＦレセプターチロシンリン酸化の非常
に僅かな増加を観察することができた。しかしながら、
これは十分に特徴付けられている相互反応との類似にお
いてｎｅｕレセプター刺激因子がＥＧＦレセプターに及
ぼす間接相互調節効果によるものであると予想された
（Ｓｔｅｒｎ， Ｄ．Ｊ． ａｎｄＫａｍｐｓ， Ｍ．
Ｐ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ７：９９５−１００１， １
９８８； Ｋｉｎｇ Ｃ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭ
ＢＯ Ｊ． １：１６４７−１６５１， １９８８；
Ｋｏｋａｉ， Ｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５３８９−５
３９３， １９８８）。
【００３４】ｎｅｕレセプター刺激因子とＥＧＦレセプ
ターとの直接相互作用の可能性を更に排除するために、
単離された因子がＡ−４３１細胞への放射性標識ＥＧＦ
（１０ｎｇ／ｍｌ）の結合を阻止する能力を試験した。
非標識ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）は125Ｉ−ＥＧＦ結
合の９０％を抑制したが、２００ｎｇ／ｍｌで本発明の
ｎｅｕレセプター刺激因子は放射性標識ＥＧＦとの競合
を示さず、ｎｅｕレセプターに対する特異性を立証し
た。
ターとの直接相互作用の可能性を更に排除するために、
単離された因子がＡ−４３１細胞への放射性標識ＥＧＦ
（１０ｎｇ／ｍｌ）の結合を阻止する能力を試験した。
非標識ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）は125Ｉ−ＥＧＦ結
合の９０％を抑制したが、２００ｎｇ／ｍｌで本発明の
ｎｅｕレセプター刺激因子は放射性標識ＥＧＦとの競合
を示さず、ｎｅｕレセプターに対する特異性を立証し
た。
【００３５】実施例６： ｎｅｕレセプターに対する刺
激因子の架橋 以上の実施例では、細胞中のｎｅｕレセプターチロシン
リン酸化レベルを増加する能力に基づいて本発明の刺激
因子を精製した。刺激因子がｎｅｕレセプターに特異的
に作用することを更に立証するために、共役結合架橋方
法を使用して分析用の推定刺激因子レセプター複合体を
安定化させた（図１２）。
激因子の架橋 以上の実施例では、細胞中のｎｅｕレセプターチロシン
リン酸化レベルを増加する能力に基づいて本発明の刺激
因子を精製した。刺激因子がｎｅｕレセプターに特異的
に作用することを更に立証するために、共役結合架橋方
法を使用して分析用の推定刺激因子レセプター複合体を
安定化させた（図１２）。
【００３６】細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４５３又はＳＫ−ＢＲ
−３（細胞３×１０5個）の単層を５０倍過剰の非標識
刺激因子の不在又は存在下で125Ｉ標識ｎｅｕレセプタ
ー刺激因子（２５ｎｇ／ｍｌ）と共に氷上で１時間イン
キュベートした。次に化学的架橋剤エチレングリコール
ビス（コハク酸スクシンイミジル）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒ
ｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を終濃度５ｍＭまで加え、細
胞と共に２２℃で４５分間インキュベートした。ＰＢＳ
で洗浄後、単層を１０分間２２℃でクエンチング緩衝液
（ＰＢＳ，ｐＨ７．４中１００ｍＭグリシン）と共にイ
ンキュベートした。ＰＢＳで更に２回洗浄後、細胞溶解
物を調製し、ｎｅｕレセプター（ｎｅｕ−Ｒ）をモノク
ローナル抗体（Ａｂ３）で免疫沈降させた。無関係マウ
ス（形質細胞腫）抗体（ＭＯＰＣ−１４１，「対照」）
を対照として使用した。継続して使用した免疫複合体を
６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離し、ゲルを乾燥させ
て−７０℃で増感剤を塗布したＸ線フィルムに暴露し
た。免疫沈降及びゲル電気泳動の手順はＧｏｌｄｍａ
ｎ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ２９：１１０２４−１１０２８（１９９０）に記載
されている。
−３（細胞３×１０5個）の単層を５０倍過剰の非標識
刺激因子の不在又は存在下で125Ｉ標識ｎｅｕレセプタ
ー刺激因子（２５ｎｇ／ｍｌ）と共に氷上で１時間イン
キュベートした。次に化学的架橋剤エチレングリコール
ビス（コハク酸スクシンイミジル）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒ
ｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を終濃度５ｍＭまで加え、細
胞と共に２２℃で４５分間インキュベートした。ＰＢＳ
で洗浄後、単層を１０分間２２℃でクエンチング緩衝液
（ＰＢＳ，ｐＨ７．４中１００ｍＭグリシン）と共にイ
ンキュベートした。ＰＢＳで更に２回洗浄後、細胞溶解
物を調製し、ｎｅｕレセプター（ｎｅｕ−Ｒ）をモノク
ローナル抗体（Ａｂ３）で免疫沈降させた。無関係マウ
ス（形質細胞腫）抗体（ＭＯＰＣ−１４１，「対照」）
を対照として使用した。継続して使用した免疫複合体を
６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離し、ゲルを乾燥させ
て−７０℃で増感剤を塗布したＸ線フィルムに暴露し
た。免疫沈降及びゲル電気泳動の手順はＧｏｌｄｍａ
ｎ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ２９：１１０２４−１１０２８（１９９０）に記載
されている。
【００３７】分析の結果、夫々分子量２３０ｋＤａ（二
次種）及び５００ｋＤａ（主要種）の２つのタンパク質
バンドが生成されたことが判明した。両方のタンパク質
複合体は抗ｎｅｕレセプターモノクローナル抗体で免疫
沈降可能であったが、非特異的抗体では免疫沈降しなか
った。この結果、２３０ｋＤａタンパク質はｎｅｕレセ
プター及びｎｅｕ刺激因子の１：１複合体であると同定
された。他の分子量バンド（約５００ｋＤａ）は、ＥＧ
Ｆレセプターの共有結合的に安定化された二量体に類似
するｎｅｕレセプター刺激因子の１又は２分子に架橋し
たｎｅｕレセプターの二量体を表すと考えられる（Ｃｏ
ｃｈｅｔ，Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ． ２６３：３２９０−３２９５， １９８８）。
架橋剤の不在下（−）で標識タンパク質は検出できず、
したがって、ｎｅｕレセプター刺激因子とｎｅｕレセプ
ターとの間の相互作用は非共有結合性であると判断され
る。更に、大幅に過剰（５０倍）の非標識刺激因子は、
放射性シグナルを完全に廃止することが知見された。非
標識刺激因子による競合、刺激因子含有複合体の分子量
及びｎｅｕレセプター特異的抗体による複合体の認識に
基づき、本発明のｎｅｕレセプター刺激因子はｎｅｕレ
セプターの特異的結合リガンドであるか又は、ｎｅｕレ
セプターに密接に関連する分子と相互作用すると結論す
ることができる。
次種）及び５００ｋＤａ（主要種）の２つのタンパク質
バンドが生成されたことが判明した。両方のタンパク質
複合体は抗ｎｅｕレセプターモノクローナル抗体で免疫
沈降可能であったが、非特異的抗体では免疫沈降しなか
った。この結果、２３０ｋＤａタンパク質はｎｅｕレセ
プター及びｎｅｕ刺激因子の１：１複合体であると同定
された。他の分子量バンド（約５００ｋＤａ）は、ＥＧ
Ｆレセプターの共有結合的に安定化された二量体に類似
するｎｅｕレセプター刺激因子の１又は２分子に架橋し
たｎｅｕレセプターの二量体を表すと考えられる（Ｃｏ
ｃｈｅｔ，Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ． ２６３：３２９０−３２９５， １９８８）。
架橋剤の不在下（−）で標識タンパク質は検出できず、
したがって、ｎｅｕレセプター刺激因子とｎｅｕレセプ
ターとの間の相互作用は非共有結合性であると判断され
る。更に、大幅に過剰（５０倍）の非標識刺激因子は、
放射性シグナルを完全に廃止することが知見された。非
標識刺激因子による競合、刺激因子含有複合体の分子量
及びｎｅｕレセプター特異的抗体による複合体の認識に
基づき、本発明のｎｅｕレセプター刺激因子はｎｅｕレ
セプターの特異的結合リガンドであるか又は、ｎｅｕレ
セプターに密接に関連する分子と相互作用すると結論す
ることができる。
【００３８】実施例７： 刺激因子によるヒト腫瘍細胞
における細胞分化の誘導 ヒトｎｅｕレセプタータンパク質に対する所定のモノク
ローナル抗体は、ヒト乳癌に由来する細胞から乳産生及
び成長停止細胞への分化を誘導することが従来知見され
ている（Ｂａｃｕｓ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， 前出）。
従って、本発明の均質に精製されたｎｅｕレセプター刺
激因子が培養ヒト乳癌細胞に表現型の変化を誘導する能
力を試験した（表２）。
における細胞分化の誘導 ヒトｎｅｕレセプタータンパク質に対する所定のモノク
ローナル抗体は、ヒト乳癌に由来する細胞から乳産生及
び成長停止細胞への分化を誘導することが従来知見され
ている（Ｂａｃｕｓ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， 前出）。
従って、本発明の均質に精製されたｎｅｕレセプター刺
激因子が培養ヒト乳癌細胞に表現型の変化を誘導する能
力を試験した（表２）。
【００３９】
【表２】 尚、表２の検出にあたり、指示濃度の精製刺激因子を培
養ＡＵ−５６５細胞に４日間加えた。細胞数決定と脂質
及びカゼインの染色は本明細書中に記載したように実施
した。カゼイン、脂質及び細胞密度に与えた数値は、１
０個の異なる顕微鏡フィールド（倍率４０倍）から得た
平均である。フィールド間の変化は１５％以内であっ
た。
養ＡＵ−５６５細胞に４日間加えた。細胞数決定と脂質
及びカゼインの染色は本明細書中に記載したように実施
した。カゼイン、脂質及び細胞密度に与えた数値は、１
０個の異なる顕微鏡フィールド（倍率４０倍）から得た
平均である。フィールド間の変化は１５％以内であっ
た。
【００４０】表に記載した実験にあたり、チャンバ当た
り１０％血清を補充した１ｍｌ培地に、細胞０．４×１
０4個の割合でＡＵ−５６５細胞０．４×１０4個をＬａ
ｂ−Ｔｅｋチャンバスライド（Ｎｕｎｃ）に接種した。
２４時間後、刺激因子を指示濃度で加え、更に４日後に
細胞を分析した。血球計チャンバ計数又はコンピュータ
ー画像分析により細胞数を決定した。Ｆｕｅｌｇｅｎで
ＤＮＡ染色後に核面積をＣＡＳ−２００ Ｉｍａｇｅ
Ａｎａｌｙｚｅｒで測定した。ｎｅｕレセプターを過剰
発現するＡＵ−５６５細胞を刺激因子６ｎｇ／ｍｌで４
日間処理した処、成熟形態を示す細胞のフラクションは
著しく増加した（因子の不在下では１０〜２０％であっ
たが、存在下では９０％）。この表現型は大きい核及び
平坦な形態を含んでおり、免疫細胞化学的染色による
と、ｎｅｕレセプタータンパク質は血漿膜から核周囲位
置に転位していた。
り１０％血清を補充した１ｍｌ培地に、細胞０．４×１
０4個の割合でＡＵ−５６５細胞０．４×１０4個をＬａ
ｂ−Ｔｅｋチャンバスライド（Ｎｕｎｃ）に接種した。
２４時間後、刺激因子を指示濃度で加え、更に４日後に
細胞を分析した。血球計チャンバ計数又はコンピュータ
ー画像分析により細胞数を決定した。Ｆｕｅｌｇｅｎで
ＤＮＡ染色後に核面積をＣＡＳ−２００ Ｉｍａｇｅ
Ａｎａｌｙｚｅｒで測定した。ｎｅｕレセプターを過剰
発現するＡＵ−５６５細胞を刺激因子６ｎｇ／ｍｌで４
日間処理した処、成熟形態を示す細胞のフラクションは
著しく増加した（因子の不在下では１０〜２０％であっ
たが、存在下では９０％）。この表現型は大きい核及び
平坦な形態を含んでおり、免疫細胞化学的染色による
と、ｎｅｕレセプタータンパク質は血漿膜から核周囲位
置に転位していた。
【００４１】乳房上皮の成熟は最終的に乳タンパク質及
び脂質の合成及び分泌をもたらす（Ｔｏｐｐｅｒ，
Ｙ．Ｊ． ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｃ．Ｓ．， Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ． ６０：１０４９−１１０６，
１９８０）ので、刺激因子で処理した細胞をこのよう
な変化について試験した。確かに、刺激因子で処理した
ＡＵ−５６５細胞は大きい脂質滴の出現を示し、これは
対照（非処理）細胞培養物では不在又は著しく小さかっ
た。同様に、刺激因子で処理した細胞の大部分でカゼイ
ン（タイプβ及びχ）の出現が観察された（表２）。細
胞間カゼイン以外に、カゼインの細胞間染色も検出する
ことができ、この主要乳タンパク質の分泌を示した。半
最大カゼイン及び脂質効果は、ｎｅｕレセプターチロシ
ンリン酸化の活性化に必要な濃度に従い、４０ピコモル
の刺激因子濃度で達せられた（図１０）。
び脂質の合成及び分泌をもたらす（Ｔｏｐｐｅｒ，
Ｙ．Ｊ． ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｃ．Ｓ．， Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ． ６０：１０４９−１１０６，
１９８０）ので、刺激因子で処理した細胞をこのよう
な変化について試験した。確かに、刺激因子で処理した
ＡＵ−５６５細胞は大きい脂質滴の出現を示し、これは
対照（非処理）細胞培養物では不在又は著しく小さかっ
た。同様に、刺激因子で処理した細胞の大部分でカゼイ
ン（タイプβ及びχ）の出現が観察された（表２）。細
胞間カゼイン以外に、カゼインの細胞間染色も検出する
ことができ、この主要乳タンパク質の分泌を示した。半
最大カゼイン及び脂質効果は、ｎｅｕレセプターチロシ
ンリン酸化の活性化に必要な濃度に従い、４０ピコモル
の刺激因子濃度で達せられた（図１０）。
【００４２】乳腺による分化特異的遺伝子の発現は必ず
しも細胞増殖の抑制を意味しない（Ｓｃｈｏｅｎｅｎｂ
ｅｒｇｅｒ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ
Ｊ．７：１６９−１７５， １９８８； Ｔａｖｅｒｎ
ａ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆ
ｆ．２：１４５−１５４， １９９１）。しかしなが
ら、ヒト腺癌細胞培養物を本発明の精製刺激因子で処理
後に細胞増殖の再現可能な抑制が観察された（表２）。
刺激因子のこの効果は濃度依存性であり、処理後２４時
間直後に現れた。因子処理細胞のＤＮＡ倍数性の分析の
結果、増殖抑制はＤＮＡ倍数性の顕著な増加を伴うこと
が判明した（図１４）。刺激因子６ｎｇ／ｍｌと共に５
日間インキュベートした処、細胞ＤＮＡの平均含有量は
全体で５０％増加した。ほぼ二頂のＤＮＡ分布は、Ｇ1
／Ｇ0細胞を犠牲にしてＧ2／Ｍ相で細胞フラクションが
大幅に増加したことを示すものである。八倍性以外に、
本発明の刺激因子は更に高いＤＮＡ多重倍数性を誘導し
た。これらの効果は増殖抑制と相俟って、細胞周期のＳ
又はＧ2／Ｍ相におけるブロック、及び細胞分割からの
ＤＮＡ合成の分離を示すものとして判断され得る。
しも細胞増殖の抑制を意味しない（Ｓｃｈｏｅｎｅｎｂ
ｅｒｇｅｒ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ
Ｊ．７：１６９−１７５， １９８８； Ｔａｖｅｒｎ
ａ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆ
ｆ．２：１４５−１５４， １９９１）。しかしなが
ら、ヒト腺癌細胞培養物を本発明の精製刺激因子で処理
後に細胞増殖の再現可能な抑制が観察された（表２）。
刺激因子のこの効果は濃度依存性であり、処理後２４時
間直後に現れた。因子処理細胞のＤＮＡ倍数性の分析の
結果、増殖抑制はＤＮＡ倍数性の顕著な増加を伴うこと
が判明した（図１４）。刺激因子６ｎｇ／ｍｌと共に５
日間インキュベートした処、細胞ＤＮＡの平均含有量は
全体で５０％増加した。ほぼ二頂のＤＮＡ分布は、Ｇ1
／Ｇ0細胞を犠牲にしてＧ2／Ｍ相で細胞フラクションが
大幅に増加したことを示すものである。八倍性以外に、
本発明の刺激因子は更に高いＤＮＡ多重倍数性を誘導し
た。これらの効果は増殖抑制と相俟って、細胞周期のＳ
又はＧ2／Ｍ相におけるブロック、及び細胞分割からの
ＤＮＡ合成の分離を示すものとして判断され得る。
【００４３】実地適用 本発明のｎｅｕレセプター刺激因子は、表面上にｎｅｕ
レセプターを発現する細胞の哺乳動物疾患及び状態を処
理するのに有用であると予想される。本発明の因子は、
細胞表面でｎｅｕレセプターを刺激し、恐らくこれに結
合することにより細胞の機能を調節し、こうして細胞間
シグナル形質導入を変更させ、細胞機能を変更させると
予想される。
レセプターを発現する細胞の哺乳動物疾患及び状態を処
理するのに有用であると予想される。本発明の因子は、
細胞表面でｎｅｕレセプターを刺激し、恐らくこれに結
合することにより細胞の機能を調節し、こうして細胞間
シグナル形質導入を変更させ、細胞機能を変更させると
予想される。
【００４４】腫瘍細胞の表面でｎｅｕレセプターを過剰
発現する腫瘍を治療するためには、本発明の因子、類似
体、変異体又はその活性フラグメントもしくは部分を、
患者又はこれらの因子等が腫瘍に効果を有すると予想さ
れる腫瘍の部位に投与する。因子は成長阻害剤及び所定
の癌細胞の分化因子として有用であることが立証された
ので、因子はｎｅｕレセプターを過剰発現する悪性腫瘍
の特性（例えば非調節細胞増殖及び非分化表現型）を変
更させると予想される。したがって、本発明の因子は、
乳癌、卵巣癌、前立腺癌及び胃癌を含むｎｅｕレセプタ
ー発現に関連する種々の型の腫瘍の治療に有用であると
予想される。
発現する腫瘍を治療するためには、本発明の因子、類似
体、変異体又はその活性フラグメントもしくは部分を、
患者又はこれらの因子等が腫瘍に効果を有すると予想さ
れる腫瘍の部位に投与する。因子は成長阻害剤及び所定
の癌細胞の分化因子として有用であることが立証された
ので、因子はｎｅｕレセプターを過剰発現する悪性腫瘍
の特性（例えば非調節細胞増殖及び非分化表現型）を変
更させると予想される。したがって、本発明の因子は、
乳癌、卵巣癌、前立腺癌及び胃癌を含むｎｅｕレセプタ
ー発現に関連する種々の型の腫瘍の治療に有用であると
予想される。
【００４５】既に説明した理由で高レベルのｎｅｕレセ
プターを発現する腫瘍で放射性標識分子、毒素、サイト
カイン及び腫瘍治療に使用される他の化合物の局在を増
加するために、因子をこれらの化合物と組み合わせても
よい。
プターを発現する腫瘍で放射性標識分子、毒素、サイト
カイン及び腫瘍治療に使用される他の化合物の局在を増
加するために、因子をこれらの化合物と組み合わせても
よい。
【００４６】他の生物学的又は治療用適用も可能であ
る。例えば、胃腸管、気道、尿路、生殖管及び皮膚の正
常ヒト上皮細胞はその表面にｎｅｕレセプターを発現す
る（Ｐｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
５：９５３−９６２， １９９０）。このレセプターに
結合又は反応して細胞増殖又は代謝を変更させる物質
は、物理的損傷による細胞破壊後に細胞再生が必要な状
況、又は細胞の代謝活性もしくは細胞増殖及び分化（例
えば皮膚の毛包からの毛髪成長）に起因する特性を増加
もしくは刺激することが所望される状況で有用である。
る。例えば、胃腸管、気道、尿路、生殖管及び皮膚の正
常ヒト上皮細胞はその表面にｎｅｕレセプターを発現す
る（Ｐｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
５：９５３−９６２， １９９０）。このレセプターに
結合又は反応して細胞増殖又は代謝を変更させる物質
は、物理的損傷による細胞破壊後に細胞再生が必要な状
況、又は細胞の代謝活性もしくは細胞増殖及び分化（例
えば皮膚の毛包からの毛髪成長）に起因する特性を増加
もしくは刺激することが所望される状況で有用である。
【００４７】他の医薬用途では、ヒト疾患状態で発生す
る因子の異常レベルを検出及び測定するために当業者に
周知の従来方法を使用して本発明の因子に対する抗体を
診断用アッセイで使用することができる。例えば、この
ようなアッセイは、抗体と因子との反応に適切な条件下
で因子に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗
体と生物組織又は流体サンプルとを接触させ、その後、
例えばサンプル中の因子の量を指示する免疫化学的方法
により抗体−抗原反応（即ち抗体結合）のレベルを決定
する。抗体は更に、上述のように細胞増殖に作用するた
めに治療薬として使用することもできる。
る因子の異常レベルを検出及び測定するために当業者に
周知の従来方法を使用して本発明の因子に対する抗体を
診断用アッセイで使用することができる。例えば、この
ようなアッセイは、抗体と因子との反応に適切な条件下
で因子に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗
体と生物組織又は流体サンプルとを接触させ、その後、
例えばサンプル中の因子の量を指示する免疫化学的方法
により抗体−抗原反応（即ち抗体結合）のレベルを決定
する。抗体は更に、上述のように細胞増殖に作用するた
めに治療薬として使用することもできる。
【００４８】別の型の診断アッセイによると、ｎｅｕレ
セプターを発現する哺乳動物腫瘍を検出するために本発
明の刺激因子を使用することができる。例えば、ｎｅｕ
レセプターを発現する腫瘍を有する疑いのある患者に放
射性標識したｎｅｕ刺激因子を投与することができる。
腫瘍部位における放射性標識因子の局在は、ｎｅｕレセ
プターを発現する腫瘍細胞の存在を示す。
セプターを発現する哺乳動物腫瘍を検出するために本発
明の刺激因子を使用することができる。例えば、ｎｅｕ
レセプターを発現する腫瘍を有する疑いのある患者に放
射性標識したｎｅｕ刺激因子を投与することができる。
腫瘍部位における放射性標識因子の局在は、ｎｅｕレセ
プターを発現する腫瘍細胞の存在を示す。
【００４９】本発明の因子は、処置すべき具体的疾患、
個々の患者の状態、因子の放出部位、投与方法及び診療
医に既知の他の状況に応じて調合及び検量される。従っ
て、本発明の目的では因子の有効量は細胞増殖及び分化
を変更させ、又は因子の投与を必要とする状態を予防
し、その悪化を抑制し、緩和し、もしくは治癒させるた
めに有効な量である。
個々の患者の状態、因子の放出部位、投与方法及び診療
医に既知の他の状況に応じて調合及び検量される。従っ
て、本発明の目的では因子の有効量は細胞増殖及び分化
を変更させ、又は因子の投与を必要とする状態を予防
し、その悪化を抑制し、緩和し、もしくは治癒させるた
めに有効な量である。
【００５０】本発明の因子は滅菌水、生理的食塩溶液又
は他の緩衝液のような医薬上許容可能なキャリヤーと組
み合わせるか又はエマルジョンとして哺乳動物に投与さ
れ得る。本発明の因子は、経口、静脈内、皮下、局所及
び他の投与方法のような任意の適切な経路により、表面
にｎｅｕレセプターを発現する哺乳動物の細胞に投与さ
れ得る。本発明の因子は、細胞の増殖及び分化を調節す
るために十分な濃度及び期間、処置すべき哺乳動物に投
与される。所与の特定の濃度は、因子が必要な状態、レ
シピエントの年齢及び体重並びに投与方法等に依存す
る。
は他の緩衝液のような医薬上許容可能なキャリヤーと組
み合わせるか又はエマルジョンとして哺乳動物に投与さ
れ得る。本発明の因子は、経口、静脈内、皮下、局所及
び他の投与方法のような任意の適切な経路により、表面
にｎｅｕレセプターを発現する哺乳動物の細胞に投与さ
れ得る。本発明の因子は、細胞の増殖及び分化を調節す
るために十分な濃度及び期間、処置すべき哺乳動物に投
与される。所与の特定の濃度は、因子が必要な状態、レ
シピエントの年齢及び体重並びに投与方法等に依存す
る。
【図１】Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムク
ロマトグラフィーによるＲａｔ１−ＥＪ １−１細胞馴
化培地の初期分画を示し、カラムフラクションが腫瘍細
胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４５３でｎｅｕレセプターのチロシ
ンリン酸化に及ぼす効果を示す。Ｒａｔ１−ＥＪ １−
１繊維芽細胞を含むローラーびんから無血清培地を回収
し、濃縮し、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラ
ムに充填した。ＰＢＳ／０．２Ｍ ＮａＣｌで洗浄後、
結合タンパク質を塩勾配で溶離させた（破線により示
す）。このクロマトグラフィー段階の溶離相を吸収プロ
フィルで示す。フラクションのサンプルにおけるｎｅｕ
レセプター刺激因子の存在を試験した。各タンパク質サ
ンプルをＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の単層と共にインキ
ュベートした。細胞を溶解させ、全細胞溶解物をホスホ
チロシン抗体によりウェスタンブロッティングした。結
果をオートラジオグラムとして示し、フラクション数を
示す（挿入図）。刺激因子の定量のために、オートラジ
オグラムを自動走査デンシトメーターにより走査した。
オートラジオグラム中のフラクション数に対応する走査
のグラフ上の点を閉じた円により示す。
ロマトグラフィーによるＲａｔ１−ＥＪ １−１細胞馴
化培地の初期分画を示し、カラムフラクションが腫瘍細
胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４５３でｎｅｕレセプターのチロシ
ンリン酸化に及ぼす効果を示す。Ｒａｔ１−ＥＪ １−
１繊維芽細胞を含むローラーびんから無血清培地を回収
し、濃縮し、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラ
ムに充填した。ＰＢＳ／０．２Ｍ ＮａＣｌで洗浄後、
結合タンパク質を塩勾配で溶離させた（破線により示
す）。このクロマトグラフィー段階の溶離相を吸収プロ
フィルで示す。フラクションのサンプルにおけるｎｅｕ
レセプター刺激因子の存在を試験した。各タンパク質サ
ンプルをＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の単層と共にインキ
ュベートした。細胞を溶解させ、全細胞溶解物をホスホ
チロシン抗体によりウェスタンブロッティングした。結
果をオートラジオグラムとして示し、フラクション数を
示す（挿入図）。刺激因子の定量のために、オートラジ
オグラムを自動走査デンシトメーターにより走査した。
オートラジオグラム中のフラクション数に対応する走査
のグラフ上の点を閉じた円により示す。
【図２】Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅカラムクロマ
トグラフィーによるｎｅｕリガンドの付加的精製を示
す。ｎｅｕレセプター刺激活性を有するＨｅｐａｒｉｎ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅフラクション（図１）からのタン
パク質をプールし、濃縮し、終濃度１．７Ｍまで（ＮＨ
4）2ＳＯ4を加えた。この材料をＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐ
ｅｒｏｓｅカラムに充填し、硫酸アンモニウム濃度を減
少させることによりカラムから溶離させた。図１につい
て記載したと同様に、フラクションにおける刺激因子の
存在を試験した（挿入図）。
トグラフィーによるｎｅｕリガンドの付加的精製を示
す。ｎｅｕレセプター刺激活性を有するＨｅｐａｒｉｎ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅフラクション（図１）からのタン
パク質をプールし、濃縮し、終濃度１．７Ｍまで（ＮＨ
4）2ＳＯ4を加えた。この材料をＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐ
ｅｒｏｓｅカラムに充填し、硫酸アンモニウム濃度を減
少させることによりカラムから溶離させた。図１につい
て記載したと同様に、フラクションにおける刺激因子の
存在を試験した（挿入図）。
【図３】Ｍｏｎｏ Ｓカラムクロマトグラフィーによる
ｎｅｕレセプター刺激因子の更に付加的な精製を示す。
図２の活性Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅフラクショ
ンからのタンパク質をＭｏｎｏ Ｓカチオン交換カラム
に充填し、増加塩濃度勾配で溶離させた。個々のカラム
フラクションからのサンプルを、図１及び図２と同様に
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞でｎｅｕレセプターのチロシ
ンリン酸化の誘導について試験した（挿入図）。
ｎｅｕレセプター刺激因子の更に付加的な精製を示す。
図２の活性Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅフラクショ
ンからのタンパク質をＭｏｎｏ Ｓカチオン交換カラム
に充填し、増加塩濃度勾配で溶離させた。個々のカラム
フラクションからのサンプルを、図１及び図２と同様に
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞でｎｅｕレセプターのチロシ
ンリン酸化の誘導について試験した（挿入図）。
【図４】金属キレートアフィニティークロマトグラフィ
ーによるｎｅｕリガンドの継続精製を示す。図３の活性
カチオン交換フラクションからのタンパク質をＣｕ2+キ
レート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムでクロマトグラフィ
ーにより分画した。結合タンパク質を塩化アンモニウム
増加勾配で溶離させ、上記と同様にフラクションをｎｅ
ｕレセプターのチロシンリン酸化の誘導について試験し
た。
ーによるｎｅｕリガンドの継続精製を示す。図３の活性
カチオン交換フラクションからのタンパク質をＣｕ2+キ
レート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムでクロマトグラフィ
ーにより分画した。結合タンパク質を塩化アンモニウム
増加勾配で溶離させ、上記と同様にフラクションをｎｅ
ｕレセプターのチロシンリン酸化の誘導について試験し
た。
【図５】図４のキレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムか
らの活性フラクションにおけるタンパク質のドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）分析を示す。活性フラクションのアリコー
ト（０．０１ｍｌ）を還元条件下で４〜２０％勾配ポリ
アクリルアミドゲル中に電気泳動にかけた。銀染色キッ
トを使用してゲルを染色した。分子量マーカータンパク
質（ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）の位置をキロ
ダルトンで示す。
らの活性フラクションにおけるタンパク質のドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）分析を示す。活性フラクションのアリコー
ト（０．０１ｍｌ）を還元条件下で４〜２０％勾配ポリ
アクリルアミドゲル中に電気泳動にかけた。銀染色キッ
トを使用してゲルを染色した。分子量マーカータンパク
質（ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）の位置をキロ
ダルトンで示す。
【図６】ゲル電気泳動後のｎｅｕレセプター刺激因子活
性の回収を示す。図１〜４に示した４段階プロトコルに
より精製した刺激因子の２つの１００ｎｇサンプルを、
４〜２０％ポリアクリルアミドゲル中で非還元条件下で
電気泳動により分離させた。一方のレーンは銀染色キッ
トを使用して染色した（左側パネル）。他方のレーンは
８個のストリップ（Ａ〜Ｈ）に分割し、タンパク質を電
気溶離させ、生存ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞でウェスタ
ンブロットによりｎｅｕレセプターチロシンリン酸化の
誘導について試験した。ウェスタンブロットのオートラ
ジオグラムを示し（右側パネル）、チロシンリン酸化ｎ
ｅｕレセプターの位置を矢印で示す（「ゼロ」はタンパ
ク質無添加、「充填」は電気泳動なしの精製刺激因子１
００ｎｇを表す）。ウェスタンブロットのデンシトメー
ター走査を中央パネルに与え、８本のバー（Ａ〜Ｈ）は
８個のゲルストリップの各々から溶離した刺激因子活性
に対応する。
性の回収を示す。図１〜４に示した４段階プロトコルに
より精製した刺激因子の２つの１００ｎｇサンプルを、
４〜２０％ポリアクリルアミドゲル中で非還元条件下で
電気泳動により分離させた。一方のレーンは銀染色キッ
トを使用して染色した（左側パネル）。他方のレーンは
８個のストリップ（Ａ〜Ｈ）に分割し、タンパク質を電
気溶離させ、生存ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞でウェスタ
ンブロットによりｎｅｕレセプターチロシンリン酸化の
誘導について試験した。ウェスタンブロットのオートラ
ジオグラムを示し（右側パネル）、チロシンリン酸化ｎ
ｅｕレセプターの位置を矢印で示す（「ゼロ」はタンパ
ク質無添加、「充填」は電気泳動なしの精製刺激因子１
００ｎｇを表す）。ウェスタンブロットのデンシトメー
ター走査を中央パネルに与え、８本のバー（Ａ〜Ｈ）は
８個のゲルストリップの各々から溶離した刺激因子活性
に対応する。
【図７】図１〜４の精製プロトコルを使用して単離した
本発明のｎｅｕレセプター刺激因子のアミノ末端配列を
示す。こうして得られた一次配列を上段（７Ａ）に示
す。下段（７Ｂ）に示す二次的なＮ末端変異体も検出さ
れた。割り当てられなかった位置は「？」により示す。
本発明のｎｅｕレセプター刺激因子のアミノ末端配列を
示す。こうして得られた一次配列を上段（７Ａ）に示
す。下段（７Ｂ）に示す二次的なＮ末端変異体も検出さ
れた。割り当てられなかった位置は「？」により示す。
【図８】勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動後にお
ける還元及び非還元条件下の本発明のｎｅｕレセプター
刺激因子を示す。電気泳動前に５０ｎｇサンプルを１０
０℃でβメルカプトエタノール還元剤（２％ｖ／ｖ）で
処理するか又は前処理なしに分離し、夫々「＋」及び
「−」により示す。銀染色ゲルを分子量マーカータンパ
ク質（ＢＲＬ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）の位置と
共に示す。
ける還元及び非還元条件下の本発明のｎｅｕレセプター
刺激因子を示す。電気泳動前に５０ｎｇサンプルを１０
０℃でβメルカプトエタノール還元剤（２％ｖ／ｖ）で
処理するか又は前処理なしに分離し、夫々「＋」及び
「−」により示す。銀染色ゲルを分子量マーカータンパ
ク質（ＢＲＬ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）の位置と
共に示す。
【図９】脱グリコシル化が本発明のｎｅｕレセプター刺
激因子に及ぼす効果を示すオートラジオグラムである。
放射性標識した刺激因子を、Ｎ−グリカナーゼ、Ｏ−グ
リカナーゼ及び／又はノイラミニダーゼと共にインキュ
ベートした。１８時間後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルサンプ
ル緩衝液中で９５℃に加熱することにより反応を停止し
た。次にサンプルをＳＤＳゲル電気泳動（１２％アクリ
ルアミド）にかけ、その後、乾燥ゲルをフィルムに５時
間暴露した。分子量マーカータンパク質の位置をバー及
びキロダルトンにより示す。
激因子に及ぼす効果を示すオートラジオグラムである。
放射性標識した刺激因子を、Ｎ−グリカナーゼ、Ｏ−グ
リカナーゼ及び／又はノイラミニダーゼと共にインキュ
ベートした。１８時間後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルサンプ
ル緩衝液中で９５℃に加熱することにより反応を停止し
た。次にサンプルをＳＤＳゲル電気泳動（１２％アクリ
ルアミド）にかけ、その後、乾燥ゲルをフィルムに５時
間暴露した。分子量マーカータンパク質の位置をバー及
びキロダルトンにより示す。
【図１０】チロシンリン酸化がピコモル濃度の精製ｎｅ
ｕレセプター刺激因子により刺激されることを示す。Ｍ
ＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を上記４段階プロトコルにより
精製した指示濃度の刺激因子（ＳＦ）で３７℃で処理し
た。細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロット分析し
た。上段パネルはホスホチロシン（ｐ−ＴＹＲとして示
す）に対する抗体で検出したｎｅｕレセプターリン酸化
を示す。下段パネルではウェスタンブロットからホスホ
チロシンに結合した抗体を除去し、ｎｅｕレセプター
（ｎｅｕ−Ｒ）に対する抗体でリプローブした。チロシ
ンリン酸化の増加は刺激因子の量を増加することにより
誘導され、細胞溶解物中の可変量のｎｅｕレセプターに
よるものでないことが明らかである。
ｕレセプター刺激因子により刺激されることを示す。Ｍ
ＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を上記４段階プロトコルにより
精製した指示濃度の刺激因子（ＳＦ）で３７℃で処理し
た。細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロット分析し
た。上段パネルはホスホチロシン（ｐ−ＴＹＲとして示
す）に対する抗体で検出したｎｅｕレセプターリン酸化
を示す。下段パネルではウェスタンブロットからホスホ
チロシンに結合した抗体を除去し、ｎｅｕレセプター
（ｎｅｕ−Ｒ）に対する抗体でリプローブした。チロシ
ンリン酸化の増加は刺激因子の量を増加することにより
誘導され、細胞溶解物中の可変量のｎｅｕレセプターに
よるものでないことが明らかである。
【図１１】２種の異なる癌細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−４５
３及びＡ−４３１）を使用して、ｎｅｕ刺激因子（Ｓ
Ｆ）がＥＧＦ−レセプターでなくｎｅｕレセプターのチ
ロシンリン酸化を刺激することを示す。指示細胞を１０
ｎｇ／ｍｌの刺激因子又は５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで処
理した。ゲル電気泳動及び抗ホスホチロシン抗体による
ウェスタンブロッティング以前に、ｎｅｕレセプター
（ｎｅｕ−Ｒ）又はＥＧＦレセプター（ＥＧＦ−Ｒ）に
対する抗体との間に免疫沈降が生じた。
３及びＡ−４３１）を使用して、ｎｅｕ刺激因子（Ｓ
Ｆ）がＥＧＦ−レセプターでなくｎｅｕレセプターのチ
ロシンリン酸化を刺激することを示す。指示細胞を１０
ｎｇ／ｍｌの刺激因子又は５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで処
理した。ゲル電気泳動及び抗ホスホチロシン抗体による
ウェスタンブロッティング以前に、ｎｅｕレセプター
（ｎｅｕ−Ｒ）又はＥＧＦレセプター（ＥＧＦ−Ｒ）に
対する抗体との間に免疫沈降が生じた。
【図１２】２種の異なるヒト乳癌細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ
−４５３及びＳＫ−ＢＲ−３）からのｎｅｕレセプター
及び放射性標識ｎｅｕレセプター刺激因子の複合体の電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のオートラジオグラムを示
す。複合体を架橋剤（ＥＧＳ）で化学的に安定化させ
た。複合体を抗ｎｅｕレセプター（ｎｅｕ−Ｒ）モノク
ローナル抗体又は対照抗体で免疫沈降させた。矢印は単
量体（Ｍ）及び二量体（Ｄ）を示す。複合体の形成を、
過剰の非標識刺激因子（Ｅｘｃｅｓｓ Ｃｏｌｄ）の添
加により競合させた。分子量マーカーの位置を示す。
−４５３及びＳＫ−ＢＲ−３）からのｎｅｕレセプター
及び放射性標識ｎｅｕレセプター刺激因子の複合体の電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のオートラジオグラムを示
す。複合体を架橋剤（ＥＧＳ）で化学的に安定化させ
た。複合体を抗ｎｅｕレセプター（ｎｅｕ−Ｒ）モノク
ローナル抗体又は対照抗体で免疫沈降させた。矢印は単
量体（Ｍ）及び二量体（Ｄ）を示す。複合体の形成を、
過剰の非標識刺激因子（Ｅｘｃｅｓｓ Ｃｏｌｄ）の添
加により競合させた。分子量マーカーの位置を示す。
【図１３】刺激因子がＭＤＡ−ＭＢ−４５３ヒト乳癌細
胞系に及ぼす成長阻害効果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４５
３細胞を多重ウェル培養皿に接種し、２４時間後に培養
培地を無血清培地で交換した。これにＥＧＦ５ｎｇ／ｍ
ｌ（正方形）又は刺激因子５ｎｇ／ｍｌ（円）を補充し
た。対照培地（三角形）にはＥＧＦもｎｅｕレセプター
刺激因子も添加しなかった。その後、皿を３７℃でイン
キュベートし、指示日に細胞数を２つの培地で決定し
た。平均及びその範囲（バー）を示す。
胞系に及ぼす成長阻害効果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４５
３細胞を多重ウェル培養皿に接種し、２４時間後に培養
培地を無血清培地で交換した。これにＥＧＦ５ｎｇ／ｍ
ｌ（正方形）又は刺激因子５ｎｇ／ｍｌ（円）を補充し
た。対照培地（三角形）にはＥＧＦもｎｅｕレセプター
刺激因子も添加しなかった。その後、皿を３７℃でイン
キュベートし、指示日に細胞数を２つの培地で決定し
た。平均及びその範囲（バー）を示す。
【図１４】本発明のｎｅｕレセプター刺激因子で処理し
たＡＵ−５６５癌細胞におけるＤＮＡ濃度の分布を示
す。細胞培養物を刺激因子６ｎｇ／ｍｌで５日間処理し
た。対照培養物は未処理のままにした。その後、Ｆｅｕ
ｌｇｅｎ反応を使用することにより個々の細胞中のＤＮ
Ａ濃度を決定した。ＣＡＳ−２００ Ｉｍａｇｅ Ａｎ
ａｌｙｚｅｒ（Ｂａｃｕｓ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．，
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ
３：３５０−３６２， １９９０）を用いてコンピュー
ター画像分析により細胞当たりのＤＮＡの定量を実施し
た。上段の数は、細胞周期のＧ0／Ｇ1段における各細胞
のＤＮＡ濃度を参照ヒト二倍体細胞の濃度で除すること
により計算したＤＮＡ指数を表す。パターンは任意に選
択した少なくとも１２個の顕微鏡フィールド（４０倍）
を示す。上段パネル（Ａ）は対照（非処理）細胞を表
し、下段パネル（Ｂ）はｎｅｕレセプター刺激因子で処
理した細胞を表す。
たＡＵ−５６５癌細胞におけるＤＮＡ濃度の分布を示
す。細胞培養物を刺激因子６ｎｇ／ｍｌで５日間処理し
た。対照培養物は未処理のままにした。その後、Ｆｅｕ
ｌｇｅｎ反応を使用することにより個々の細胞中のＤＮ
Ａ濃度を決定した。ＣＡＳ−２００ Ｉｍａｇｅ Ａｎ
ａｌｙｚｅｒ（Ｂａｃｕｓ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．，
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ
３：３５０−３６２， １９９０）を用いてコンピュー
ター画像分析により細胞当たりのＤＮＡの定量を実施し
た。上段の数は、細胞周期のＧ0／Ｇ1段における各細胞
のＤＮＡ濃度を参照ヒト二倍体細胞の濃度で除すること
により計算したＤＮＡ指数を表す。パターンは任意に選
択した少なくとも１２個の顕微鏡フィールド（４０倍）
を示す。上段パネル（Ａ）は対照（非処理）細胞を表
し、下段パネル（Ｂ）はｎｅｕレセプター刺激因子で処
理した細胞を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (27)
- 【請求項１】 精製哺乳動物ｎｅｕレセプター刺激因
子。 - 【請求項２】 還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより決定した場合に約４４０００ダルトンの分子量
を有することを特徴とする請求項１に記載の因子。 - 【請求項３】 糖タンパク質であることを特徴とする請
求項１に記載の因子。 - 【請求項４】 ２２ピコモル以下の濃度でｎｅｕレセプ
ターのチロシンリン酸化を誘導することを特徴とする請
求項１に記載の因子。 - 【請求項５】 細胞増殖及び分化を調節する能力を有す
ることを特徴とする請求項１に記載の因子。 - 【請求項６】 癌細胞の増殖を抑制する能力を有するこ
とを特徴とする請求項１に記載の因子。 - 【請求項７】 癌細胞が細胞表面上にｎｅｕレセプター
を発現することを特徴とする請求項６に記載の因子。 - 【請求項８】 ラットから単離されることを特徴とする
請求項１に記載の因子。 - 【請求項９】 図７Ａのアミノ末端アミノ酸配列を有す
ることを特徴とする請求項１に記載の因子。 - 【請求項１０】 図７Ｂのアミノ末端アミノ酸配列を有
することを特徴とする請求項１に記載の因子。 - 【請求項１１】 有効量の請求項１に記載の因子に細胞
を接触させることを特徴とする細胞増殖及び分化の調節
方法。 - 【請求項１２】 哺乳動物で実施することを特徴とする
請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 ヒトで実施することを特徴とする請求
項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 腫瘍細胞の表面にｎｅｕレセプターを
発現する哺乳動物腫瘍の治療方法であって、このような
腫瘍を有する哺乳動物に腫瘍成長を弱めるために有効な
量の請求項１に記載の因子を投与することを特徴とする
方法。 - 【請求項１５】 哺乳動物がヒトであることを特徴とす
る請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 腫瘍が乳癌、卵巣癌、前立腺癌又は胃
癌であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 請求項１に記載の因子を細胞毒性分子
から選択した１種以上の物質と組み合わせて使用するこ
とを特徴とする請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 細胞毒性分子が放射性標識分子、毒素
及びサイトカインであることを特徴とする請求項１７に
記載の方法。 - 【請求項１９】 腫瘍細胞の表面にｎｅｕレセプターを
発現する哺乳動物腫瘍の診断方法であって、被疑腫瘍細
胞を請求項１に記載の因子に接触させ、ｎｅｕ因子の結
合活性を測定し、このような活性の存在によりｎｅｕレ
セプターを発現する腫瘍細胞の存在を検出することを特
徴とする方法。 - 【請求項２０】 請求項１に記載の因子の特異的抗体。
- 【請求項２１】 請求項１に記載の因子のレベルを検出
するためのアッセイであって、抗体を因子と反応させる
のに適切な条件下で因子の特異的抗体を生物組織又は流
体サンプルに接触させ、サンプル中の因子の量の指標と
して抗体−抗原反応のレベルを決定することを特徴とす
る方法。 - 【請求項２２】 抗体がポリクローナル抗体であること
を特徴とする請求項２１に記載のアッセイ。 - 【請求項２３】 抗体がモノクローナル抗体であること
を特徴とする請求項２１に記載のアッセイ。 - 【請求項２４】 精製哺乳動物ｎｅｕレセプター刺激因
子の製造方法であって、ｒａｓ形質転換繊維芽細胞によ
り馴化した培地に、ヘパリンアフィニティークロマトグ
ラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、カチオ
ン交換クロマトグラフィー及び金属キレートアフィニテ
ィークロマトグラフィーの４段階のうちの少なくとも３
段階を実施することを特徴とする方法。 - 【請求項２５】 ヘパリンアフィニティークロマトグラ
フィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、カチオン
交換クロマトグラフィー及び金属キレートアフィニティ
ークロマトグラフィーの４段階を順次実施することを特
徴とする請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２６】 請求項２４又は２５に記載の方法によ
り製造された生成物。 - 【請求項２７】 因子と実質的に同一の生物学的活性を
有することを特徴とする請求項１に記載の因子の類似
体、変異体又は活性フラグメント。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL97575A IL97575A0 (en) | 1991-03-17 | 1991-03-17 | Ligand of neu receptor |
| US84558192A | 1992-03-10 | 1992-03-10 | |
| US845581 | 1992-03-10 | ||
| US97575 | 1992-03-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07224089A true JPH07224089A (ja) | 1995-08-22 |
Family
ID=26322239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4091601A Pending JPH07224089A (ja) | 1991-03-17 | 1992-03-17 | ｎｅｕレセプターの刺激因子 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0505148A1 (ja) |
| JP (1) | JPH07224089A (ja) |
| KR (1) | KR920018078A (ja) |
| AU (1) | AU1298392A (ja) |
| CA (1) | CA2063239A1 (ja) |
| FI (1) | FI921133A (ja) |
| NO (1) | NO921040L (ja) |
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| US5834229A (en) | 1991-05-24 | 1998-11-10 | Genentech, Inc. | Nucleic acids vectors and host cells encoding and expressing heregulin 2-α |
| IL101943A0 (en) * | 1991-05-24 | 1992-12-30 | Genentech Inc | Structure,production and use of heregulin |
| WO1993022424A1 (en) * | 1992-04-29 | 1993-11-11 | Amgen Inc. | RECOMBINANT STIMULATING FACTOR OF THE neu RECEPTOR |
| WO1994028133A1 (en) * | 1993-05-21 | 1994-12-08 | Amgen Inc. | Recombinant neu differentiation factors |
| US5518885A (en) * | 1994-04-19 | 1996-05-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | ERBB2 promoter binding protein in neoplastic disease |
| DE19509792A1 (de) * | 1995-03-17 | 1996-09-19 | Max Delbrueck Centrum | Mittel zur Beeinflussung der Zelldifferenzierung und seine Verwendung |
| ATE290595T1 (de) | 1996-07-12 | 2005-03-15 | Genentech Inc | Gamma-heregulin |
| US7371376B1 (en) | 1996-10-18 | 2008-05-13 | Genentech, Inc. | Anti-ErbB2 antibodies |
| IL129354A0 (en) * | 1996-10-18 | 2000-02-17 | Genentech Inc | Anti-ErbB2 antibodies |
| ES2324320T3 (es) | 1997-02-10 | 2009-08-04 | Genentech, Inc. | Variantes de herregulina. |
| US6136558A (en) * | 1997-02-10 | 2000-10-24 | Genentech, Inc. | Heregulin variants |
| US20010023241A1 (en) | 1998-02-04 | 2001-09-20 | Sliwkowski Mark X. | Use of heregulin as a growth factor |
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| EP3550012A1 (en) | 2008-11-04 | 2019-10-09 | ViaCyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof |
| AU2013248265B2 (en) | 2012-11-08 | 2018-11-01 | Viacyte, Inc. | Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof |
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1992
- 1992-03-17 CA CA002063239A patent/CA2063239A1/en not_active Abandoned
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- 1992-03-17 JP JP4091601A patent/JPH07224089A/ja active Pending
Also Published As
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