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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Hinweis auf
Geldmittel seitens der Regierung
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Diese
Erfindung entstand teilweise unter Verwendung von Geldmitteln der
Regierung unter der NIH-Zulassung Nr. R01 NS 36692. Dementsprechend
hat die Regierung gewisse Rechte an dieser Erfindung.
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen die Gebiete der Zellphysiologie,
Neurologie, Entwicklungsbiologie und Onkologie. Insbesondere betrifft
die vorliegende Erfindung neue Verwendungen eines chlorotoxinsensitiven
zytoplasmischen Proteins für
die Herstellung eines Medikaments für die Diagnose und Behandlung
von neuroektodermalen Tumoren, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht
aus Medulloblastomen, Neuroblastomen, Gangliomen, Phäochromozytomen,
Melanomen, kleinzelligem Lungenkarzinom und dem Ewing-Sarkom.
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Beschreibung
des Standes der Technik
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Während der
Embryonalentwicklung bildet sich das künftige Nervensystem aus einer
spezialisierten Schicht aus ektodermalen Zellen, die als Neuroektoderm
bezeichnet wird. Diese Schicht erstreckt sich entlang der Körperachse
entlang der zukünftigen
Wirbelsäule.
Die Einstülpung
des Neuroektoderms führt
zu dem Neuralrohr, von dem sich im Wesentlichen alle Bestandteile
des Zentralnervensystems (ZNS) einschließlich des Rückenmarks entwickeln. Spezialisierte
Zellcluster am Rand des Invaginationsneuralrohrs bleiben von dem Rohr
abgetrennt und bilden die Neuralleiste. Diese im hohen Ausmaß zur Migration
neigenden neuroektodermalen Zellen bilden spezialisierte Zellen
im Körper
einschließlich
der Schwann'schen-Zellen,
neuronale Zellen des peripheren Nervensystems (PNS) (enterale, parasympathische,
sympathoadrenale und sensorische Neuronen), Pigmentzellen (Melanozyten),
endokrine Zellen und Zellen, die das Bindegewebe des Gesichts und des
Nackens bilden. Da diese Zellen einen gemeinsamen embryonalen Ursprung
mit den Zellen des Zentralnervensystems aufweisen, ist es nicht überraschend,
dass diese Zellen oder die Tumore, die sich aus diesen Zellen entwickeln,
einige genetische und antigenische Phänotypen mit den Zellen des
Zentralnervensystems teilen.
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Beispielsweise
teilen Melanome und Glioblastome eine gemeinsame Mutation auf dem
Gen, das für den
epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR)(1) codiert. Maligne Astrozytome
und Neurofibrome exprimieren nicht nur hohe Anteile des epidermalen
Wachstumsfaktorrezeptors, sondern auch des vaskulären Endothelwachstumsfaktorrezeptors
(VEGF-R) und des thrombocytären
Wachstumsfaktorrezeptors (PDGF-R) (2).
Eine hohe Expression der mutanten Variante EGFRvIII wurde in Gliatumoren
wie auch in extrazellulären Matrixproteinen,
GP 240 und Tenascin nachgewiesen (3). Tenascin und das Gangliosid-3',6'-isoLDl wurden sowohl
in Gliomen als auch in primitivem neuroektodermalen Gewebeproben
nachgewiesen (3). In einer anderen Studie wurde gezeigt, dass Antikörper bezüglich Tenascin
extensiv an ZNS-Gliome und auch an Melanome, Brust-, Lungen- und
Plattenepithelkarzinome binden (4). Es wurde gezeigt, dass sich
ein anderes Gangliosid, GD2, ein gemeinsamer Antigenmarker, sowohl
in Gliomen als auch in primitivem neuroektodermalen Tumorgeweben
findet (5). Andere gemeinsame Antigene zwischen Melanomen und Gliomen
wurden nachgewiesen, indem gezeigt wurde, dass Tyr-, TRP-1-, TRP-2-
und gp100-Genprodukte gewöhnlich
sowohl in Melanomen als auch in Gliomatumoren gefunden wurden (6).
Gewöhnliche
Zytokine oder deren rezeptorverbundene Tumore von Astrozytomen,
Ependymomen und primitiven neuroektodermalen Tumoren wurden identifiziert
als: Interleukin (IL) IL-1 alpha, IL-1, IL-1R1, IL-1R-Antagonist
und transformierender Wachstumsfaktor (TGF) TGF-beta 1 (11).
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Eine
andere Klasse von Proteinen, die als Marker für Gliome und primitive neuroektodermale
Tumore verwendet werden, sind die Zytoskelettproteine, Neurofilament
(NF), saures Gliafibrillärprotein
(GFAP), Zwischenfilamente (IF), verbundenes Zwi schenproteinfilament
(IFAP), Vimentin, Nestin und Keratine. Diese Marker wurden verwendet,
um Stufen der Differenzierung entlang der zahlreichen Zellabstammungen
zu bestimmen (12). Ein neuer Beweis für die Verbindung von Astrozytomen
mit bestimmten primitiven neuroektodermalen Tumoren ist der Zytoskelettmarker
IFAP-300 kDa, ein Marker von immaturem Glia (13).
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Weitere
Argumente für
eine feste Verbindung von neuroektodermal abgeleiteten Zellen im
Zentralnervensystem und der Peripherie können aufgrund der ähnlichen
Abhängigkeit
auf epigenetische Einflüsse
getroffen werden. Beispielsweise erfordern sympathoadrenale Precursorneurone
einen grundlegenden Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) zur Proliferation
und Differenzierung, aber das Überleben
dieser Zellen hängt von
der Empfänglichkeit
des Nervenwachstumsfaktors (NGF) und von der Verfügbarkeit
des Nervenwachstumsfaktors ab (14). Ein ähnliches Szenario ist für jeden
der anderen Zellarten erforderlich. Es sind nicht nur Wachstumsfaktoren
und trophische Faktoren erforderlich, sondern es werden auch Zytokine
und Hormone benötigt,
deren Verbindungen zwischen primitiven neuroektodermalen Tumoren
und Gliomen aufgeklärt
werden sollten.
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Dennoch
sind diese Zellen trotz der Reihe an Ähnlichkeiten, die zwischen
neuroektodermal abgeleiteten Zellen besteht, getrennte Einheiten
mit einzigartigen zytologischen biochemischen und funktionellen
Eigenschaften. In der Tat übersteigt
die Reihe an einzigartigen Eigenschaften, die nicht mit anderen
neuroektodermal abgeleiteten Zellen geteilt werden, die oben genannten
gemeinsamen Phänotypen.
Somit kann nicht a priori angenommen werden, dass die Exprimierung
eines bestimmten Antigens oder Phänotyps in einer gegebenen Zellart
in Abhängigkeit
von der Exprimierung eines anderen Mitglieds der neuroektodermal
abgeleiteten Zelltypen erwartet werden kann.
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Neuroblastome
zeigen im allgemeinen einen selektiven Anstieg in der Genkopieanzahl
des MYCN-Gens, welches in den fetalen Stufen der Gehirnentwicklung
gefunden wurde, was eine Verbindung zwischen dem Ursprung der Zellen
und der Fähigkeit
der neoplastischen Zellen zur Dedifferenzierung vorschlägt (7).
Allerdings muss dieses Gen in den Gliomazellen nachgewiesen werden.
Andere Proteine, die nicht so wohl bei Glioma als auch bei primitiven
neuroektodermalen Tumoren auftreten, wurden nachgewiesen. Die CD99-Immunoreaktivität wird als
ein Tool verwendet, um primitive neuroektodermale Tumore zu identifizieren (8)
und wurde in Ewing-Sarkomtumoren nachgewiesen, allerdings nicht
in Gliomen (9). Ein anderer Faktor, der Stammzellenfaktor und sein
Rezeptor, c-Kit, wurden sowohl in primitiven neuroektodermalen Tumoren
als auch in Ewing-Sarkomtumoren nachgewiesen (10).
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Der
gemeinsame Ursprung und die Fähigkeit,
während
normaler Entwicklungsprozesse auf interne und externe Signale zu
reagieren, schlägt
vor, dass Zellen des Zentralnervensystems und peripheral neuroektodermal
abgeleitete Zellen auch gemeinsame Mechanismen während pathologischer Entwicklungen
wie beispielsweise während
der Neoplasie teilen können.
Solches neoplastisches Gewebe umfasst ZNS-Gliome, die glia-abgeleitete
Tumorzellen sind, die gegenüber
dem ZNS spezifisch sind. Sie bilden nur innerhalb des ZNS einschließlich des
Rückenmarks
Metastasen. Es wird angenommen, dass sie von wenigstens drei getrennten Abstammungslinien
entweder von undifferenzierten Precursorzellen oder durch Dedifferenzierung
von Astrozyten, Oligodendrozyten oder Ependymalzellen abstammen.
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Primitive
neuroektodermale Tumore (PNET) werden sowohl in dem ZNS als auch
in dem PNS gefunden. Primitive neuroektodermale Tumore, die nur
in dem PNS gefunden wurden, werden als periphere primitive neuroektodermale
Tumore (PPNET) bezeichnet. Primitive neuroektodermale Tumore manifestieren
sich vorzugsweise bei Kindern und weisen die Fähigkeit auf, sich in eine Vielzahl
an neuronalen, astrozytischen, ependymalen, muskulären und
melanotischen Linien zu entwickeln. Die konzeptionelle Basis der
Gruppierung dieser Tumore bezieht sich auf das Teilen gemeinsamer
Progenitorzellen wie auch auf das Teilen von ähnlichen neoplastischen Transformationen,
was zu Tumoren von ähnlichen
morphologischen Eigenschaften und biologischen Verhalten führt. Allerdings
verbleiben Kontroversen darüber,
alle primitiven neuroektodermalen Tumore in die gleiche Kategorie
einzuteilen. Die folgenden Abschnitte zeigen Beispiele der Überschneidung von
gemeinsamen Antigenen zwischen den verschiedenen Arten an ZNS- und
PNS-Tumoren.
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Supratentoriale
primitive neuroektodermale Tumore umfassen Großhirnmedulloblastome, Großhirnneuroblastome, „blaue" Tumore, Ependymoblastome
und andere primitive neuroektodermale Tumore wie Pineoblastome (WHO
Grad IV). Die geeignetesten Marker für diese Tumore umfassen GFAP,
NFP, Desmin und Melanin. Andere Antigene, die in diesen Tumoren
gefunden werden, sind Vimentin, Nestin, Keratin, die aber nicht
für diagnostische
Zwecke geeignet sind.
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Peripherale
neuroblastische Tumore der Nebenniere (Medulla) und des sympathischen
Nervensystems sind die gängigsten
Arten an Tumoren bei Kindern außerhalb
des ZNS. Primäre
Seiten für
diese primitiven neuroektodermalen Tumore befinden sich in der Nebenniere,
abdominal, Thorax, Zervix und in dem sympathischen Beckenganglion,
umfassen aber andere primäre
Seiten wie Augenhöhle,
Niere, Lunge, Haut, Eierstöcke,
Samenstrang und Urinblase. Spezifische Namen dieser verwandten Tumore
sind Phäochromozytome, Paragangliome,
Neuroblastome, Ganglioneurome, Ganglioneuroblastome, Neurofibrome,
Schwannome und periphere maligne Nervenscheidentumore. All diese
weisen einen gemeinsamen Ursprung in der Neuralleiste auf. Neuroblastome
teilen alle hohe TRK-A (NGFR) und CD44-Exprimierungen. Neuronale
spezifische Enolase (NSE), Synaptophysin, neurales Filamentprotein
(NF), GD2, Tyrosinhydroxylase (TH) und Chromogranin werden als diagnostische
Marker verwendet, auch bei Medulloblastomen. Neuroblastome exprimieren
im allgemeinen einen selektiven Anstieg bei der Genkopieanzahl der
MYCN-Gene, was bei fetalen Stufen bei der Genhirnentwicklung festgestellt
wurde (7).
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Medulloblastome
sind Mitglieder der primitiven neuroektodermalen Tumore, die als
hochmaligne Embryonaltumore des ZNS, gefunden im Zerebellum (WHO
Typ IV), beschrieben worden sind. Ein gemeinsames Antigen dieser
Medulloblastome und anderer neuronaler Abstammungstumore ist Synaptophysin
(nicht gefunden in Glia- oder Mesenchymalgehirntumoren). Nestin
(IF-Protein) wird bei der Entwicklung von ZNS-Precursorzellen und in Medulloblastomen
und in einigen peripheralen neuroektodermalen Urspungszellen gefunden. Nestin
(und Vimentin) werden gefunden in Medulloblastomen, Astrozytomen,
Glioblastomen, Ependymomen, Gangliogliomen und Meningiomen (nur
GFAP wurde in den astrozytisch-abgeleiteten Zellen gefunden, welche gelegentlich
in Medulloblastomen „gefangen" werden). Erhöhte Anteile
an neuralzellulären
Adhäsionsmolekülen (N-CAM),
die in diesen Tumoren gefunden wurden, können die Anteile der Differenzierung
bei der Entwicklung von Tumoren (15) widerspiegeln. Während variierende
Anteile des Nervenwachstumsfaktors (NGF) in nahezu allen Tumoren
gefunden wurden, zeigen Medulloblastome eine beträchtliche
Reaktivität
bezüglich
dem NGF-Rezeptor und verwandten Proteinen, Neurotrophin (NT) NT-3,
TRK-C und gehirnabgeleiteter neurotrophischer Faktor (BDNF)(16).
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Melanome,
die von Melanozyten abstammen, folgen einer abgestuften Entwicklung
von diffuser Melanozytose zu Melanocytoma zu malignen Melanomen.
S100 Protein ist ein Marker für
diese Tumore, da die Vimentin- und NSE-Reaktivität variabel ist.
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Kleine
neuroendokrine Zellkarzinome der Lunge sind hochinvasiv und werden
typischerweise bei erwachsenen Rauchern gefunden. Es wurde gezeigt,
dass sie bezüglich
vieler neuraler und neuroendokriner Marker (einige von ihnen sind
N-CAMs ähnlich)
für die
Tumordifferenzierung als peripherale primitive neuroektodermale
Tumore, Gliome und Ependymome Reaktivität zeigen. Diese Marker umfassen
spezifische Neuralenolase und eine extrem hohe c-src-Expression
(17).
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Eine
auffallende Eigenschaft, die in der Entwicklung von ZNS-Zellen und
von der Neuralleiste abgeleiteten Zellen geteilt wird, ist deren
Neigung, entweder zu einem Ziel oder zu einer Zielfläche zu migrieren.
Es wird angenommen, dass diese Fähigkeit
nach der Zelldifferenzierung und Maturation verloren wird. Allerdings zeigen
Tumore des ZNS eine signifikante Zellmigration und Invasion in das
gesunde Gehirn, was darauf hinweist, dass die Zelle diese verstärkte Migrationsfähigkeit
behalten oder wiedererlangt hat. Dementsprechend ist es nicht überraschend,
dass die neoplastische Transformation von neuroektodermal abgeleiteten
Zellen außerhalb
des ZNS ähnliche
Migrationseigenschaften aufweisen würde. Bei der beabsichtigten
Bestimmung differenzieren diese Zellen in ihren endgültigen Phänotyp, ähnlich wie
bei der normalen Entwicklung, beeinflusst von etlichen trophischen
Faktoren, die für
die Proliferation und Differentiation von verschiedenen Zellarten
kritisch sind.
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WO
97/24619 offenbart die Verwendung von Chlorotoxin, verbunden mit
einem cytotoxischen Anteil für
die Diagnose und Behandlung von Gliomen und Meningiomen.
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Nachteilig
am Stand der Technik ist die Tatsache, dass es keine diagnostischen
und therapeutischen Mittel gibt, die spezifisch an spezifische neuroektodermale
Tumore binden. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses langbestehende Bedürfnis und
den Wunsch vom Stand der Technik.
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KURZDARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung
für die
Herstellung eines Medikaments für
die Behandlung von Tumoren von neuroektodermalem Ursprung beschrieben,
wobei ein spezifischer Ligand für
diese Tumorklasse, der mit einem zytotoxischen Rest verbunden ist,
verabreicht wird, wobei der neuroektodermale Tumor ausgewählt ist
aus der Gruppe, die besteht aus Medulloblastomen, Neuroblastomen,
Gangliomen, Phäochromozytomen,
Melanomen, kleinzelligem Lungenkarzinom und dem Ewing-Sarkom. Der
neuroektodermale tumorspezifische Ligand ist Chlorotoxin in der
Form eines Fusionsproteins aus Chlorotoxin mit einem zytotoxischen
Rest. Das Chlorotoxin kann natürlich,
synthetisch oder rekombinant sein. Mögliche Cytotoxinreste umfassen
Gelonin, Ricin, Saponin, Pseudomonas Exotoxin, Pokeweed antiviral
Protein, Diphtherietoxin und Komplementproteine. Der neuroektodermale
tumorspezifische Ligand umfasst auch einen Antikörper gegen den Chlorotoxinrezeptor,
vermutlich einen 72 kDa Chloridkanal. Der Antikörper kann verbunden sein mit
Gelonin, Ricin, Saponin, Pseudomonas Exotoxin, Pokeweed antiviral
Protein, Diphtherietoxin und Komplementproteinen.
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In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von markiertem Chlorotoxin
für die
Herstellung eines Medikaments für
die Unterscheidung von neuroektodermalem tumor-abgeleiteten neoplastischen
Gewebe von nicht-neoplastischem Gewebe, wobei der neuroektodermale
Tumor ausgewählt
ist aus der Gruppe, die besteht aus Medulloblastomen, Neuroblastomen,
Gangliomen, Phäochromozytomen,
Melanomen, kleinzelligem Lungenkarzinom und dem Ewing- Sarkom, vorgestellt.
Dies wird durchgeführt,
indem das Gewebe mit markiertem Chlorotoxin ausgesetzt wird und
die Bindung des markierten Chlorotoxins gemessen wird. Ein erhöhter Bindungsgrad
im Verhältnis
zu normalem Gewebe ist ein Anzeichen dafür, dass das Gewebe neoplastisch
ist. In einer Ausführungsform
ist die Markierung ein Fluoreszenzrest, der durch Fluoreszenzmikroskopie,
aktivierten Fluoreszenzzellsortieren oder einem Fluoreszenzplattenzähler gemessen
wird. Als Alternative wird das Chlorotoxin radioaktiv markiert (z.B. 131I-Chlorotoxin oder 125I-Chlorotoxin;
ein Fachmann würde
leicht andere geeignete radioaktive Markierungen erkennen) und mittels
Positronemissionstomographiescanning nachgewiesen. Als Alternative
kann das Chlorotoxin an einen nicht-fluoreszierenden Nachweisrest
wie Biotin angehängt
werden und es wird die Immunohistochemie gemessen oder über Verwendung
einer kolorimetrischen Vorrichtung.
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Noch
eine andere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis einer neuroektodermal
tumor-abgeleiteten Zelle in einer Gewebeprobe, wobei der neuroektodermale
Tumor ausgewählt
ist aus der Gruppe, die besteht aus Medulloblastomen, Neuroblastomen,
Gangliomen, Phäochromozytomen,
Melanomen, kleinzelligem Lungenkarzinom und dem Ewing-Sarkom, umfassend
Kontaktieren der Gewebeprobe mit Chlorotoxin und Nachweis des Auftretens
der Bindung des markierten Chlorotoxins an die Gewebeprobe.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Der
Gegenstand, bei dem die oben zitierten Eigenschaften, Vorteile und
Aufgaben der Erfindung und auch andere, die deutlich werden, erreicht
werden, kann im Detail insbesondere in der Beschreibung der Erfindung,
die oben kurz zusammengefasst wurde, unter Bezugnahme auf bestimmte
Ausführungsformen
davon, die in den beigefügten
Zeichnungen veranschaulicht sind, verstanden werden. Diese Zeichnungen
sind ein Teil der Beschreibung. Jedoch ist darauf hinzuweisen, dass
die beigefügten
Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung zeigen und nicht dazu dienen, den Gegenstand der Erfindung
einzuschränken.
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1 zeigt
die positive immunohistochemische Färbung eines Glioblastommultiformtumors
(GBM) mit Chlorotoxin. Das braune Reaktionsprodukt von DAB 3'3'-Diaminobenzidin mit biotinyliertem
Chlorotoxin ist in dem TM-601
gefärbten
Abschnitt deutlich sichtbar. TM-601: gefärbtes biotinyliertes Chlorotoxin,
gegengefärbt mit
Methylgrün;
Kontrolle: nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin
und Eosin.
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2 zeigt,
dass das normale Gehirn durch biotinyliertes Chlorotoxin nicht immunohistochemisch
gefärbt
wird.TM-601: biotinyliertes Chlorotoxin, gegengefärbt mit
Methylgrün,
Kontrolle: nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin
und Eosin. Normales Gehirn wurde auch mit biotinylierten Antikörpern gegen GFAP
(saures fibrilläres
Gliaprotein) gefärbt,
was die Astrozyten im normalen Gehirngewebe positiv einfärbt.
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3 zeigt
die Chlorotoxinfärbung
eines Nebennierenneuroblastomatumors. TM-601: biotinyliertes Chlorotoxin, gegengefärbt mit
Methylgrün;
Kontrolle: nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin
und Eosin.
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4 zeigt,
dass biotinyliertes Chlorotoxin immunohistochemisch Phäochromozytome
färbt.
TM-601: biotinyliertes Chlorotoxin, gegengefärbt mit Methylgrün, Kontrolle:
nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin
und Eosin.
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5 zeigt,
dass normales Nebennierengewebe durch biotinyliertes Chlorotoxin
immunohistochemisch nicht gefärbt
wird. TM-601: biotinyliertes Chlorotoxin, gegengefärbt mit
Methylgrün,
Kontrolle: nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin und Eosin.
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6 zeigt
die immunohistochemische Färbung
mit biotinyliertem Chlorotoxin von Melanomtumorzellen, die im Gehirn
metastasisiert sind. TM-601: biotinyliertes Chlorotoxin, gegengefärbt mit
Methylgrün,
Kontrolle: nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin
und Eosin.
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7 zeigt
die immunohistochemische Färbung
mit biotinyliertem Chlorotoxin von Melanomtumorzellen, die in der
Lunge metastasisiert sind. TM-601: biotinyliertes Chlorotoxin, gegengefärbt mit
Methylgrün,
Kontrolle: nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin
und Eosin.
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8 zeigt
die immunohistochemische Färbung
von normaler Haut mit biotinyliertem Chlorotoxin. TM-601: biotinyliertes
Chlorotoxin, gegengefärbt
mit Methylgrün,
Kontrolle: nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin
und Eosin.
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9 zeigt
die immunohistochemische Färbung
von kleinzelligen Lungenkarzinomen mit biotinyliertem Chlorotoxin.
TM-601: biotinyliertes Chlorotoxin, gegengefärbt mit Methylgrün, Kontrolle:
nur Methylgrün; und,
H&E-Färbung: Hämatoxylin und Eosin.
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10 zeigt,
dass biotinyliertes Chlorotoxin normales Lungengewebe immunohistochemisch
nicht einfärbt.
TM-601: biotinyliertes Chlorotoxin, gegengefärbt mit Methylgrün, Kontrolle:
nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin
und Eosin.
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11 zeigt
die immunohistochemische Färbung
eines Medullablastoms mit biotinyliertem Chlorotoxin. TM-601: biotinyliertes
Chlorotoxin, gegengefärbt
mit Methylgrün,
Kontrolle: nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin und Eosin.
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12 zeigt,
dass der seltene neuroektodermal abgeleitete Knochenkrebs, das Ewing-Sarkom,
auch eine positive immunohistochemische Färbung mit biotinyliertem Chlorotoxin
ergibt. TM-601: biotinyliertes Chlorotoxin, gegengefärbt mit
Methylgrün,
Kontrolle: nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin
und Eosin.
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13 zeigt
die negativen Ergebnisse, die mit dem immunohistochemischen Färben von
normalem Magengewebe mit biotinyliertem Chlorotoxin erhalten werden.
TM-601: biotinyliertes Chlorotoxin, gegengefärbt mit Methylgrün, Kontrolle:
nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin
und Eosin.
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14 zeigt
das Fehlen der immunohistochemischen Färbung von normalem Lungengewebe
mit biotinyliertem Chlorotoxin. TM-601: biotinyliertes Chlorotoxin,
gegengefärbt
mit Methylgrün,
Kontrolle: nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin und Eosin.
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15 zeigt,
dass normales Milzgewebe immunohistochemisch nicht mit biotinyliertem
Chlorotoxin eingefärbt
wird. TM-601: biotinyliertes Chlorotoxin, gegengefärbt mit
Methylgrün,
Kontrolle: nur Methylgrün; und, gegengefärbt mit
Methylgrün,
Kontrolle: nur Methylgrün;
und, H&E-Färbung: Hämatoxylin und Eosin.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Es
können
erfindungsgemäß herkömmliche
molekularbiologische, mikrobiologische und rekombinante DNA-Techniken
verwendet werden, die vom Stand der Technik her bekannt sind. Solche
Techniken sind ausführlich
in der Literatur beschrieben. Siehe z.B. Maniatis, Fritsch & Sambrook, „Molecular
Cloning: A Laboratory Manual" (1982); „DNA Cloning:
A Practical Approach," Volume
I und II (D. N. Glover ed. 1985); „Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed.
1984); „Nucleic
Acid Hybridization" [B.
D. Hames & S.
J. Higgins eds. (1985)]; „Transcription
and Translation" [B.
D. Hames & S.
J. Higgins eds. (1984)]; „Animal
Cell Culture" [R.
I. Freshney, ed. (1986)]; „Immobilized
Cells And Enzyrnes" [IRL
Press, (1986)]; B. Perbal, „A
Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
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Dementsprechend
sollen die folgenden Begriffe, wenn sie in dem Text vorkommen, die
Definitionen aufweisen, die unten angegeben sind.
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Wie
hier verwendet, soll sich der Ausdruck „cDNA" auf die DNA-Kopie des mRNA-Transkripts
eines Gens beziehen.
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Wie
hier verwendet, soll der Begriff „abgeleitete Aminosäuresequenz" die Aminosäuresequenz
bedeuten, die durch Lesen der Triplettsequenz der Nukleotidbasen
in der cDNA bestimmt wird.
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Wie
hier verwendet, soll sich der Begriff „Screening einer DNA-Bibliothek" auf ein Verfahren
zur Verwendung einer markierten Probe beziehen, um unter geeigneten
Bedingungen zu überprüfen, ob
eine Komplementärsequenz
zu der Probe in einer bestimmten DNA-Datenbank vorhanden ist. Zusätzlich könnte das „Screening
einer DNA-Datenbank" mit PCR ausgeführt werden.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff „PCR" auf die Polymerasekettenreaktion, die
Gegenstand der US-Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202 von Mullis
ist, wie auch andere Verbesserungen, die nun im Stand der Technik
bekannt sind.
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Die
hier beschriebene Aminosäure
liegt bevorzugt in der „L"-isomeren Form vor.
Allerdings können Reste
in der „D"-isomeren Form für irgendeinen
L-Aminosäurerest
substituiert werden, so lange die gewünschte funktionelle Eigenschaft
der Immunoglobulinbindung durch das Polypeptid erhalten bleibt.
NH2 bezieht sich auf die freie Aminogruppe,
die am Aminoende eines Polypeptids vorhanden ist. COOH bezieht sich
auf die freie Carboxylgruppe, die am Carboxylende eines Polypeptids
vorhanden ist. Unter Beibehaltung der Standardpeptidnomenklatur,
J. Biol. Chem., 243: 3552–59
(1969), sind dem Fachmann Abkürzungen
für Aminosäurereste
bekannt.
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Es
sollte erwähnt
werden, dass alle Aminosäurerestsequenzen,
die hier mit einer Formel abgebildet sind, deren linke und rechte
Orientierung in der konventionellen Richtung vom Aminoende zum Carboxylende abgebildet
ist. Darüber
hinaus sollte erwähnt
werden, dass ein Strich am Anfang oder am Ende einer Aminosäurerestsequenz
eine Peptidbindung zu einer weiteren Sequenz von ein oder mehreren
Aminosäurereste
anzeigt.
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Ein „Replikon" ist irgendein genetisches
Element (z.B. Plasmid, Chromosom, Virus), das als eine autonome
Einheit der DNA-Replikation in vivo fungiert; d.h. die Fähigkeit
zur Replikation unter eigener Kontrolle.
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Ein „Vektor" ist ein Replikon
wie Plasmid, Phage oder Cosmid, an den ein anderers DNA-Segment
angehängt
werden kann, um die Replikation des angehängten Segments herbeizuführen.
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Ein „DNA-Molekül" bezieht sich auf
die polymere Form von Desoxyribonukleotiden (Adenin, Guanin, Thymin
oder Cytosin) in entweder einzelsträngiger Form oder in Form einer
doppelsträngigen
Helix. Dieser Begriff bezieht sich nur auf die Primär- oder Sekundärstruktur
des Moleküls
und beschränkt
sich nicht auf irgendwelche beson deren tertiären Formen. Somit umfasst dieser
Begriff doppelsträngige
DNA, die inter alia in linearen DNA-Molekülen (d.h. Restriktionsfragmente),
Viren, Plasmiden und Chromosomen vorkommt. Bei der Diskussion der
hier beschriebenen Struktur gemäß der normalen
Konvention wird nur die Sequenz in die 5'nach 3'-Richtung entlang des nichttranskribierten
Strangs an DNA (d.h. der Strang mit einem Sequenzhomologen zu der
mRNA) angegeben.
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Ein „Startpunkt
der Replikation" bezieht
sich auf solche DNA-Sequenzen, die bei der DNA-Synthese teilnehmen.
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Eine „DNA-Kodiersequenz" ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz,
die in ein Polypeptid in vivo transkribiert und translatiert wird,
wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten Regulationssequenzen
gegeben wird. Die Enden der Kodiersequenz werden mit einem Startcodon
am 5'-(Amino)Ende
und mit einem Translationsstopkodon am 3'-(Carboxyl)Ende
bestimmt. Eine Kodiersequenz kann umfassen, ist aber nicht beschränkt auf
prokaryontische Sequenzen, cDNA von eukaryontischer mRNA, genomische
DNA-Sequenzen von eukaryontischer (z.B. Säugetier-)DNA, und sogar von
synthetischen DNA-Sequenzen. Ein Polyadenylierungssignal und die
Transkriptionsabschlusssequenz befinden sich gewöhnlich am 3'-Ende der Kodiersequenz.
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Transkriptionelle
und translatierende Kontrollsequenzen sind DNA-regulierende Sequenzen
wie Promotor, Verstärker,
Polyadenylierungssignale, Terminierer und dergleichen, die die Expression
einer Kodiersequenz in einer Wirtszelle bereitstellen.
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Eine „Promotersequenz" ist eine DNA-Regulierungsregion,
die in der Lage ist, RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und
die Transkription einer Kodierseqeunz stromab (3'-Richtung) zu initiieren. Zum Zwecke der
Definition der vorliegenden Erfindung ist die Promotersequenz an
dessen 3'-Ende durch
die Transkriptionsinitiierungsseite gebunden und erstreckt sich
nach oben (5'-Ende),
um eine minimale Anzahl an Basen oder Elementen, die notwendig sind,
um die Transkription an den Leveln, die oberhalb des Hintergrunds
erkennbar sind, zu initiieren. Innerhalb der Promotersequenz befindet
sich eine Transkriptionsinitierungsseite wie auch Proteinbindungsbereiche (Konsensussequenzen),
die für
die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryontische
Promoter enthalten oft, aber nicht immer „TATA"-Boxen und „CAT"-Boxen.
Prokaryontische Promoter enthalten Shine-Dalgarnosequenzen zusätzlich zu
den –10
und –35
Konsensussequenzen.
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Eine „Expressionskontrollsequenz" ist eine DNA-Sequenz,
die die Transkription und Translation einer anderen DNA-Sequenz
kontrolliert und reguliert. Eine Kodiersequenz ist „unter
Kontrolle" von transkriptionellen
und translatierenden Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn RNA-Polymerase
die Kodiersequenz in mRNA transkribiert, welche anschließend in
das Protein translatiert wird, die durch die Kodiersequenz codiert wird.
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Eine „Signalsequenz" kann neben der Kodiersequenz
eingearbeitet werden. Diese Sequenz kodiert ein Signalpeptid, N-Ende
des Polypeptids, das mit der Wirtszelle kommuniziert, um das Polypeptid
zu der Zelloberfläche
zu führen
oder das Polypeptid in der Mitte abzusondern und dieses Signalpeptid
wird durch die Wirtszelle abgeklemmt, bevor das Protein die Zelle
verlässt.
Es können
Signalsequenzen im Zusammenhang mit einer Vielzahl an Proteinen
nativ mit Prokaryonten und Eukaryonten gefunden werden.
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Der
Begriff „Oligonukleotid", wie er hier unter
Bezug auf die Untersuchung der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, ist definiert als ein Molekül, das zwei oder mehr Ribonukleotide,
vorzugsweise mehr als drei umfasst. Die exakte Größe wird
von vielen Faktoren abhängen,
welche ihrerseits von der letztendlichen Funktion und Verwendung
des Oligonukleotids abhängen.
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Der
Begriff „Primer", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf ein Oligonukleotid, welches natürlich in
einer gereinigten Restriktionsverdauung auftritt oder wird synthetisch
hergestellt, wobei der Primer in der Lage ist, als ein Initiierungspunkt
bei der Synthese zu agieren, wenn er unter Bedingungen gebracht
wird, bei denen die Synthese eines Primerextensionsprodukt, das
komplementär
zu dem Nukleinsäurestrang
ist, induziert wird, d.h. in Anwesenheit von Nukleotiden und einem
induzierenden Mit tel wie eine DNA-Polymerase und bei einer geeigneten
Temperatur und einem geeigneten pH-Wert. Der Primer kann entweder
einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein umd muss ausreichend lang sein, um die Synthese des gewünschten
Extensionsprodukts in Anwesenheit des Induziermittels zu initiieren.
Die exakte Länge
des Primers wird von vielen Faktoren einschließlich der Temperatur, der Art
des Primers und der Verwendung des Verfahrens abhängen. Beispielsweise
enthält
der Oligonukleotidprimer für
diagnostische Anwendungen in Abhängigkeit
von der Komplexität der
Zielsequenz typischerweise 15–25
oder mehr Nukleotide, obwohl er weniger Nukleotide enthalten kann.
-
Die
hier verwendeten Primer sind ausgewählt, damit sie „zu einem
großen
Ausmaß" zu verschiedenen Strängen einer
bestimmten Ziel-DNA-Sequenz komplementär sind. Dies bedeutet, dass
die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren jeweiligen
Strängen
zu hybridisieren. Dementsprechend muss die Primersequenz nicht die
exakte Sequenz des Templats reflektieren. Beispielsweise kann ein
nicht-komplementäres Nukleotidfragment
an das 5'-Ende des
Primers angehängt
werden, wobei der Rest der Primersequenz komplementär zu dem
Strang ist. Als Alternative können
nicht-komplementäre
Basen oder längere
Sequenzen in den Primer eingestreut werden, unter der Voraussetzung,
dass die Primersequenz mit der Sequenz ausreichend komplementär ist oder
damit hybridisiert und somit das Templat für die Synthese des Extensionsprodukts
bildet.
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Wie
hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Restriktionsendonukleasen" und „Restriktionsenzyme" auf Enzyme, wobei
jedes Enzym doppelsträngige
DNA bei oder in der Nähe
einer spezifischen Nukleotidsequenz schneidet.
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Eine
Zelle wurde durch exogene oder heterologe DNA „transformiert", wenn solche DNA
innerhalb der Zelle eingeführt
worden ist. Die transformierende DNA kann oder kann nicht in das
Genom der Zelle integriert werden (kovalent verbunden). Bei Prokaryonten,
Hefe und Säugetierzellen
beispielsweise kann die transformierende DNA auf einem episomalen
Element wie auf einem Plasmid gehalten werden. In Bezug auf eukaryontische
Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine Zelle, in die die
transfor mierende DNA in ein Chromosom integriert worden ist, so
dass sie durch Tochterzellen über
Chromosomenreplikation übernommen
worden ist. Diese Stabilität
wird anhand der Fähigkeit
der eukaryontischen Zelle demonstriert, indem sie Zelllinien oder Klone
entwickelt, die aus einer Population an Tochterzellen besteht, die
die transformierende DNA enthalten. Ein „Klon" ist eine Population an Zellen, die
von einer einzelnen Zelle abstammn oder von dem Vorfahren durch Zellteilung.
Eine „Zelllinie" ist ein Klon einer
primären
Zelle, der zu stabilem Wachstum in vitro für viele Generationen in der
Lage ist.
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Eine „heterologe" Region auf dem DNA-Konstrukt
ist ein identifizierbares Segment aus DNA innerhalb eines größeren DNA-Moleküls, welches
in Verbindung mit dem größeren Molekül nicht
in der Natur gefunden wird. Somit wird das Gen, wenn die heterologe
Region ein Säugetiergen
kodiert, gewöhnlich
von der DNA flankiert, die nicht die genomische Säugetier-DNA
in dem Genom des Ursprungsorganismus flankiert. In einem anderen
Beispiel ist die Kodiersequenz ein Konstrukt, wenn die Kodiersequenz
selbst nicht in der Natur gefunden wird (z.B. eine cDNA, wobei die
genomische Kodiersequenz Introns enthält oder synthetische Sequenzen mit
Kodons, die sich von dem nativen Gen unterscheiden). Allelische
Variationen oder natürlich
auftretende Mutationsereignisse geben keinen Anlass zu einer heterologen
Region der DNA, wie hier definiert wird.
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Die
Markierungen, die für
diese Studien am häufigsten
eingesetzt werden, sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien,
die fluoreszieren, wenn sie UV-Licht ausgesetzt werden und andere.
Eine Anzahl an Fluoreszenzmaterialien sind bekannt und können als
Markierungen eingesetzt werden. Diese umfassen beispielsweise Fluorescein,
Rhodamin, Auramin, Texas Red, AMCA Blue und Lucifer Yellow. Ein
besonderes Nachweismaterial ist anti-Kaninchen-Antikörper, das
in Ziegen hergestellt wird und mit Fluorescein über eine Isothiocyanatverbindung
konjugiert.
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Proteine
können
auch mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym markiert
werden. Die radioaktive Markierung kann über irgendeines der derzeit
erhältli chen
Zählverfahren
detektiert werden. Das bevorzugte Isotop kann ausgewählt werden
aus 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I und 186Re.
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Enzymmarkierungen
sind auch hilfreich und können
durch irgendwelche der derzeit verwendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen,
fluorospektrophotometrischen, amperometrischen oder gasometrischen
Techniken nachgewiesen werden. Das Enzym ist mit dem ausgewählten Teilchen über Reaktion
mit Brückenmolekülen wie
Carbodiimide, Diisocyanate, Glutaraldehyd und dergleichen konjugiert.
Viele Enzyme, die in diesen Verfahren verwendet werden, sind bekannt
und können
angewendet werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase; β-D-Galaktosidase, Urease,
Glucoseoxidase plus Peroxidase und Alkaliphosphatase. Es wird beispielsweise
auf die US-Patente Nr. 3,654,090, 3,850,752 und 4,016,043 bezüglich deren
Offenbarung der alternativen Markierungsmaterialien und Verfahren
verwiesen.
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Ein
besonderes Assaysystem, welches im Stand der Technik entwickelt
und verwendet wurde, ist als ein Rezeptorassay bekannt. In einem
Rezeptorassay wird das zu untersuchende Material geeignet markiert und
anschließend
werden bestimmte Zelltestkolonien mit einer Menge der Markierung
geimpft, wobei anschließend
Bindungsstudien durchgeführt
werden, um das Ausmaß zu
bestimmen, mit dem das markierte Material an die Zellrezeptoren
bindet. Auf diese Weise können
Unterschiede bei der Affinität
zwischen den Materialien nachgewiesen werden.
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Ein
Assay, der im Stand der Technik geeignet ist, ist als ein „cis/trans"-Assay bekannt. Kurz
gesagt verwendet dieser Assay zwei genetische Konstrukte, wobei
einer davon typischerweise ein Plasmid ist, das kontinuierlich einen
bestimmten Rezeptor von Interesse exprimiert, wenn dieser in eine
geeignete Zelllinie transferiert wird und wobei der zweite ein Plasmid
ist, das einen Reporter wie Luziferase unter Kontrolle eines Rezeptor/Ligand-Komplex
exprimiert. Somit würden
beispielsweise, wenn es gewünscht
ist, eine Verbindung als einen Liganden für einen besonderen Rezeptor
zu entwickeln, einer der Plasmide ein Konstrukt sein, was zu der
Expression des Rezeptors in der gewählten Zelllinie führt, während das
zweite Plasmid einen Promotor aufweisen würde, der mit dem Luziferasegen
verbunden ist, in das das Reaktionselement zu dem besonde ren Rezeptor
eingeführt
ist. Wenn die Verbindung, die getestet wird, ein Agonist für den Rezeptor
ist, wird der Ligand mit dem Rezeptor komplexieren und der entstandene
Komplex wird zu dem Reaktionselement binden und die Transkription
des Luziferasegens initiieren. Die resultierende Chemilumineszenz
wird dann photometrisch gemessen und es werden Dosisreaktionskurven
erhalten und mit denen von bekannten Liganden verglichen. Der zuvor
beschriebene Ablauf ist im Detail in dem US-Patent Nr. 4,981,784
beschrieben.
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Die
vorliegende Erfindung ist gerichtet auf die Verwendung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung, umfassend einen neuroektodermalen tumorspezifischen
Liganden, der mit einem zytotoxischen Rest verbunden ist, für die Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung eines neuroektodermalen Tumors,
wobei der neuroektodermale Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe, die
besteht aus Medulloblastomen, Neuroblastomen, Gangliomen, Phäochromozytomen,
Melanomen, kleinzelligem Lungenkarzinom und dem Ewing-Sarkom. Der
neuroektodermale tumorspezifische Ligand ist Chlorotoxin, verbunden
mit einem zytotoxischen Rest. Beispiele an möglichen zytotoxischen Resten
umfassen Gelonin, Ricin, Saponin, Pseudomonas Exotoxin, Pokeweed
antiviral Protein, Diphtherietoxin und Komplementprotein. Der neuroektodermale
tumorspezifische Ligand umfasst auch einen Antikörper gegen den Chlorotoxinrezeptor,
wobei angenommen wird, dass es ein 72 kDa Chloridkanal ist. Der
Antikörper
kann mit Gelonin, Ricin, Saponin, Pseudomonas Exotoxin, Pokeweed
antiviral Protein, Diphtherietoxin und Komplementprotein verbunden
werden.
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich auch auf die Verwendung des markierten
Chlorotoxins für
die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für die Unterscheidung
von neuroektodermalem tumor-abgeleiteten neoplastischen Gewebe von
normalem Gewebe, wobei der neuroektodermale Tumor ausgewählt ist
aus der Gruppe, die besteht aus Medulloblastomen, Neuroblastomen,
Gangliomen, Phäochromozytomen,
Melanomen, kleinzelligem Lungenkarzinom und dem Ewing-Sarkom, wobei
das betreffende Gewebe mit markierten Chlorotoxin inkubiert wird
und die Bindung des markierten Chlorotoxins unter Bezug auf normales
Gewebe, sofern erhältlich,
gemessen wird. Das Chlorotoxin kann entweder mit einem fluoreszierenden Rest
markiert werden oder kann mit radioaktiven Markierungen wie 131I oder 125I radioaktiv
markiert werden. Es können
Fluoreszenzreste für
den Nachweis mittels Fluoreszenzmikroskopie oder fluoreszenzaktiviertes
Zellensortieren verwendet werden. Radioaktiv markiertes Chlorotoxin
kann mittels Positronenmissionstomographiescanning nachgewiesen
werden.
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich auch auf ein Verfahren zum Nachweis
des Auftretens einer neuroektodermalen tumor-abgeleiteten Zelle
in einer Gewebeprobe, wobei der neuroektodermale Tumor ausgewählt ist
aus der Gruppe, die besteht aus Medulloblastomen, Neuroblastomen,
Gangliomen, Phäochromozytomen,
Melanomen, kleinzelligem Lungenkarzinom und dem Ewing-Sarkom, umfassend
Kontaktieren der Gewebeprobe mit Chlorotoxin und Nachweis des Auftretens
der Bindung des markierten Chlorotoxins an die Gewebeprobe.
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Die
folgenden Beispiele sind zum Zwecke der Veranschaulichung verschiedener
Ausführungsformen der
Erfindung wiedergegeben und sind nicht dazu bestimmt, die Erfindung
auf irgendeine Weise einzuschränken.
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BEISPIEL 1
-
Zusammenfassung
der Chlorotoxinergebnisse aus Gliomaexperimenten
-
Kürzlich durchgeführte Studien
haben gezeigt, dass durch die überwiegende
Mehrzahl an Gliomazellen ein gemeinsames Antigen exprimiert wird.
Dieses Antigen wird von Chlorotoxin (Ctx oder TM-601), einem 36
Aminosäurepeptid,
welches ursprünglich
von Leirus quinquestriatus Scorpiongift isoliert wurde, anvisiert. Chlorotoxin
bindet selektiv an die Membran von Gliomazellen, wobei ein selektives
Anvisieren dieser Zellen innerhalb des ZNS ermöglicht wird (18). Das Antigen,
welches von diesem Peptid anvisiert wird, scheint ein Chloridionenkanal
zu sein, obwohl das Antigen bisher noch nicht eindeutig auf molekularer
Ebene identifiziert wurde. Bisher zeigen die Daten an, dass Chlorotoxin
an ein Membranprotein mit einem Molekulargewicht von 72 kDa bindet,
welches vorzugsweise in der zytoplasmischen Membran von Gliomazellen
exprimiert wird. Die Bindung zu dem Peptid erhöht die Gliomazellproliferation
(19) und unterdrückt
die Fähigkeit
von Gliomazellen, in Transwell-Assays, ein in vitro Assay zur Bestimmung
der Tumoreindringungsfähigkeit,
zu migrieren (20). Chlorotoxin scheint diese Effekte auszuüben, indem
die Membranpermeabilität
bezüglich
Cl– Ionen
vermindert wird, wodurch Änderungen
bei dem Zellvolumen verhindert werden, die erforderlich sind, um
zu ermöglichen, in
gesundes Gewebe einzudringen (20). Somit liegt die wahrscheinlichste
Wirkung des Chlorotoxins in einem Gliomachloridkanal, was zuvor
ausführlich
beschrieben wurde (19).
-
BEISPIEL 2
-
Immunohistochemisches
Färben
von Glioma mit Chlorotoxin
-
Es
wurden über
250 gefrorene Abschnitte oder Paraffinabschnitte von menschlichem
Biopsiegewebe histochemisch mit einer chemisch synthetisierten Form
von Chlorotoxin gefärbt,
das eine nachweisbare Biotingruppe aufweist, die chemisch an den
N-Terminus (TM-601)
gebunden ist. Die Bindung des TM-601-Moleküls wurde an ausgewählten Zellen
beobachtet, die mit im wesentlichen allen Gliomatumoren mit bis
zu 95% positiven Zellen pro Tumor verbunden waren. Unter Bezugnahme
auf diese Studien wurde vorgeschlagen, Chlorotoxin als einen Glioma-spezifischen
Marker und als ein potentielles therapeutisches Tool zum Identifizieren
von Gliomatumoren zu verwenden. Für solche Zwecke könnte eine
Chlorotoxinverbindung mit radioaktiven Molekülen oder zytotoxischen Resten
wie Saporin verwendet werden.
-
BEISPIEL 3
-
Rekombinante
DNA-Manipulation von Chlorotoxin
-
Unter
Verwendung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, können rekombinante
Proteine hergestellt werden, die spezifisch maßgeschneidert sind, um die
Bindung und die Wirkung des nativen Toxins nachzuahmen. Die biologische
Aktivität
des synthetischen Chlorotoxins ist so wirksam für die Chloridionenkanalblockade
wie das native Gifttoxin. Es werden rekombinante Techniken verwendet,
um Chlorotoxin in E. coli unter Verwendung eines modifizierten PGEX-Vektorsystem
zu synthetisieren und das Toxin kann an verschiedene Fusionsproteine
unter Verwendung gemeinsamer Restriktionsseiten gebunden werden.
Nach der Synthese von rekombinantem Chlorotoxin kann es an verschiedene
zytotoxische Fusionsproteine einschließlich Glutathion-S-transferase (GST),
Gelonin, Ricin, Diphtherietoxin, Komplementproteine und Radioliganden
und andere solche Proteine, die im Stand der Technik bezüglich der
Immunotoxine gut bekannt sind, gebunden werden.
-
BEISPIEL 4
-
Antikörper gegen den Chlorotoxin-bindenden
Chloridionenkanal
-
Antikörper für die Chloridionenkanäle in glia-abgeleiteten
Tumoren können
folgendermaßen
hergestellt werden. Polyklonale Antiseren werden hergestellt, indem
Fusionsproteine injiziert werden, die zwischen der Glutathion-S-Transferase
und dem Chlorotoxin, das in Mäuse
oder Kaninchen eingeführt
wird, gebildet wurden. Mäuse
werden mit 0,5 mL einer 1:1-Emulsion von 1 mg/mL gereinigtem Fusionsprotein
in Freund'sches
komplettes Adjuvans immunisiert und nachfolgend mit zwei zusätzlichen
Injektionen nach 14 und 28 Tagen in Freund'sches inkomplettes Adjuvans. Die Maus- und Kaninchenantikörper werden
aus dem Antiserum unter Verwendung des GST-Fusionsproteins gereinigt, welches auf
Nitrozellulosefilter immobilisiert wurde. Die Antikörper werden
anschließend
bezüglich
der Bindungsspezifität
in verschiedenen Geweben untersucht.
-
BEISPIEL 5
-
Gründe für die Untersuchung von neuroektodermal
abgeleiteten Tumoren für
die Chlorotoxinbindung
-
Mit
den Gemeinsamkeiten, die zwischen Gliomazellen und anderen neuroektodermal-abgeleiteten Zellen
geteilt werden können
und mit den entwickelten Argumenten, die ähnliche Migrationsneigungen
von neuroektodermalen Zellen vorschlagen, wurde eine gründliche
Untersuchung durchgeführt,
um neuroektodermal abgeleitete Tumore für die Exprimierung von Chlorotoxinbindungsseiten
zu untersuchen.
-
BEISPIEL 6
-
Herstellung
von Abschnitten aus gefrorenenen oder paraffin-eingebetteten menschlichen
Biopsien
-
Die
meisten Proben vom menschlichen Gewebe beiderlei Geschlechts, aller
Altersstufen und Rassen wurden über
das Cooperative Human Tissue Network, Tissue Procurement von UAB,
UAB Krankenhäuser
und der Human Brain Tissue Bank in London, Kanada erhalten. Es wurde
gefrorenes und frisches Gewebe, eingebettet in ein gefrierendes
Gel auf 8 μm
geschnitten und auf positiv beladene Glasseiten aufgebracht. Diese Abschnitte
wurden anschließend
in 4% Paraformaldehyd oder Milloniqs gemäß dem Färbungsprotokoll fixiert. Es
wurden Paraffinblöcke
abgeteilt und gemäß Standardverfahren
vorbereitet.
-
BEISPIEL 7
-
Untersuchung
der Biopsieproben für
die Chlorotoxinbindung
-
Biopsieabschnitte
wurden für
1 Stunde in 10% normalem Ziegenserum in PBS blockiert und mit einer Verdünnung aus
biotinyliertem Chlorotoxin über
Nacht bei 4°C
behandelt. Nach gründlichem
Spülen
wurden die Färbungen über Avidin-Biotinkomplex (ABC)-Technik
(Vectastain Elite ABC Kit von Vector Laboratories, Burlington, CA)
und durch die kolorimetrische Reaktion von DAB (3'3'-Diaminobenzidin;
Vector Laboratories) mit dem ABC-Komplex visualisiert.
-
Die
Biopsieabschnitte wurden mit Methylgrün, einem Kernfarbstoff kontrastgefärbt, um
die nichtgefärbten
Zellen leichter zu visualisieren, Es kann eine nichtspezifische
Hintergrundmarkierung von Versuch zu Versuch aufgrund von Änderungen
in den effektiven Konzentrationen der Markierung, des Zustands des
Gewebes oder der Dauer der Reaktion variieren. Aus diesem Grund
wurde ein Kontrollabschnitt identisch mit Methylgrün, aber
ohne biotinyliertes Chlorotoxin gefärbt. Es wurde positives Zellfärben über die
Chlorotoxinmarkierung oberhalb des Hintergrundes identifiziert,
wenn es mit der individuellen Kontrolle einer sukzessiven Probe
verglichen wurde. Zellen, die große Mengen endogener Peroxidase
enthalten, zeigen eine dunkle Hintergrundfärbung in den Kontrollen aufgrund
der Reaktion von DAB mit den Peroxidasen.
-
Schließlich wurde
ein dritter benachbarter Abschnitt mit sowohl Hämatoxylin, einem zellkernspezifischen
Farbstoff als auch mit Eosin, einem zytoplasmischen Farbstoff gefärbt. Somit
wurden für
jedes analysierte Gewebe drei benachbarte Abschnitte gefärbt. Diese
sind in Photomikrographien gezeigt und bieten den Nachweis der Spezifität der TM-601
Chlorotoxinbindung an Tumore von neuroektodermaler Abstammung in Vergleich
mit Kontrollen. In den Photomikrographien werden benachbarte Abschnitte
folgendermaßen
identifiziert: TM-601: biotinyliertes Chlorotoxin, nachgewiesen
durch ein braunes Reaktionsprodukt aus DAB mit dem Biotin und weiter
kontrastgefärbt
mit Methylgrün;
Kontrolle: der Kontrollabschnitt wurde nur mit Methylgrün gefärbt; und,
H&E: der Hämatoxylin
und Eosin gefärbte
Abschnitt.
-
BEISPIEL 8
-
Glioblastomamultiformtumore
(GBM)
-
Glioblastomamultiform
(GBM) wurde mit dem biotinylierten Chlorotoxin (TM-601) gefärbt. Diese
Tumore sind extrem reaktiv gegenüber
biotinyliertem Chlorotoxin, da 25 von 25 Patientenproben positiv
getestet wurden, wie es aus 1 ersichtlich
ist. Diese Glioblastomamultiform kann mit der Färbung des normalen menschlichen
Gehirngewebes mit biotinyliertem Chlorotoxin (18/23 negativ) verglichen
werden. 2 zeigt eine dementsprechende
Färbung.
Normales Gehirngewebe zeigt ein Fehlen der TM-601 Färbung. Dies
ist in Übereinstimmung
mit dem vorherigen Nachweis der Chlorotoxinbindung an Gliome.
-
BEISPIEL 9
-
GFAP-Färbung im
normalen Gehirngewebe
-
Der
Biopsieabschnitt wurde für
1 Stunde in 10% normalem Ziegenserum in PBS blockiert und anschließend mit
Antikörpern
gegen saures fibrilläres
Gliaprotein über
Nacht gefärbt
(GFAP; DAKO Corporation, Carpinteria CA). Der zweite Antikörper, der
mit Peroxidase konjugierte, wurde auf das gespülte Gewebe für 2 Stunden
aufgetragen und wieder gespült,
bevor die Färbung
mit DAB visualisiert wurde. Eine typische Färbung des sauren fibrillären Gliaproteins
des normalen Gehirns ist in 2 gezeigt.
Normales Gehirn war positiv für die
Färbung
des sauren fibrillären
Gliaproteins, wobei die Astrozyten, die typischerweise in dem normalen
Gewebe vorhanden sind, gefärbt
wurden.
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BEISPIEL 10
-
Neuroblastome
-
Neuroblastome
sind Tumore, die hauptsächlich
bei Kindern auftreten, mit einem hohen Vorkommen in den Nebennieren.
Neuroblastome zeigen eine TM-601-Reaktivität oberhalb
der Kontrollfärbung,
wie es in 3 gezeigt ist. Sechs von sieben
Neuroblastomen sind für
die Chlorotoxinbindung positiv.
-
BEISPIEL 11
-
Phäochromozytome
-
Phäochromozytome
sind neoplastische Chromaffinzellen der Nebenniere. Dieser Tumor
zeigt auch einen hohen Färbungsgrad,
wie es in 4 gesehen werden kann. Fünf von sechs
Phäochromozytomen
sind für
das Färben
mit biotinyliertem Chlorotoxin positiv, insbesondere im Vergleich
mit dem TM-601 Färben
der normalen Nebenniere (3/3 negativ), wie es in 5 ersichtlich
ist.
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BEISPIEL 12
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Melanome
-
6 zeigt
die biotinylierte Chlorotoxinfärbung
eines Melanoms, das im Gehirn metastasisiert ist. Sieben von sieben
Melanomgehirnmetastasen sind für
TM-601 positiv. Zusätzlich
wurde Melanom, welches in der Lunge metastasisiert wurde, analysiert,
wie es aus 7 ersichtlich ist. Normale Haut
ist allerdings unreaktiv gegenüber
TM-601 (6/6 negativ) (8), obwohl etwas Hintergrundfärbung in
den Melanozyten sogar in den Kontrollen vorhanden ist.
-
BEISPIEL 13
-
Kleinzellige
Lungenkarzinome
-
Kleinzellige
Lungenkarzinome sind bezüglich
TM-601 reaktiv. Es gibt einen guten Kontrast zwischen den Zellen,
die färben
und denen, die nicht färben
(9). Die Zellen, die für TM-601 in der Kontrolle positiv sind
(mittlerer Abschnitt) sind rote Blutzellen, die einen hohen Anteil
von Hintergrundperoxidasefärbung
aufweisen. Diese TM-601-Spezifität
kann weiter über
den Vergleich der TM-601-Färbung
des kleinzelligen Karzinoms (2/3 positiv) und der normalen Lunge
(3/3 negativ) nachgewiesen werden (10).
-
BEISPIEL 14
-
Medulloblastome
-
Eine
andere neuroektodermal abgeleitete Tumorart sind die Medulloblastome.
Sie zeigen eine spezifische Reaktivität bezüglich TM-601, wie es aus 11 ersichtlich
ist (4/4 positiv).
-
BEISPIEL 15
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Ewing-Sarkom
-
Ewing-Sarkom,
ein seltener Knochenkrebs, der manchmal in Weichgewebe auftritt,
ist TM-601 positiv (2/2)(12).
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BEISPIEL 16
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Testen der
möglichen
Seiten der Chlorotoxinverabreichung auf Nebenwirkungen
-
Um
in dem Design der Medizintherapie mit diesem Produkt unterstützend mitzuwirken,
wurde normales Gewebe mit TM-601 gefärbt, um mögliche Seiten zu bestimmen,
bei denen Nebeneffekte auftreten können. Voruntersuchungen zeigen,
dass einige der meist gemeinsamen Ziele für Nebenwirkungen wie Magen
und Leber TM-601
negativ sind (2/2 negative Proben für beide Gewebe, bis jetzt)
(13 bzw. 14). Das
Färben von
Milzgewebe ist auch in 15 gezeigt (3/3 negativ). Das
TM-601-Färben von
anderem normalen menschlichen Gewebe ist in Tabelle 1 zusammengefasst.
-
-
-
-
BEISPIEL 17
-
Zusammenfassung der getesteten
Tumore und Gewebe
-
Wie
in Tabelle 1 zusammengefasst, bindet die überwiegende Mehrzahl der neuroektodermal
abgeleiteten Tumore Chlorotoxin, was darauf hindeutet, dass Chlorotoxin
eine weitverbreitete Verwendbarkeit bei der Identifizierung von
Tumoren vom neuroektodermalen Ursprung hat. Es wurden insbesondere
primitive neuroektodermale Tumore von 34 Patienten getestet, wobei
31 davon eine Chlorotoxinspezifität in dem Tumormaterial zeigen,
wie es in Tabelle 1 gesehen werden kann. Dieses Färben wurde
mit dem Chlorotoxinfärben
von anderen Arten von ZNS- und PNS-Tumoren verglichen und auch mit
verschiedenem normalen menschlichen Gewebe verglichen.
-
TM-601
bindet spezifisch an neuroektodermal abgeleitete Tumore einschließlich Medulloblastome, Neuroblastome,
Ganglioneurome, Melanome, Phäochromozytome,
kleinzelligem Lungenkarzinom und dem Ewing-Sarkom. Somit können Chlorotoxin
abgeleitete Moleküle
verwendet werden, um spezifisch für therapeutische oder diagnostische
Zwecke die oben angegebenen neuroektodermal-abgeleiteten Tumore
zu identifizieren. Auch können
diese Tumore durch andere Moleküle
wie Antikörper
identifiziert werden, die zu dem Chlorotoxinrezeptor binden, wobei
angenommen wird, dass dies der 72 kDa Cl–-Ionenkanal
ist.
-
Die
folgenden Literaturstellen wurden hier zitiert:
-
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of the EGF receptor gene in glioblastomas. Hegi ME, Hausen AZ, Ruedi
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Irgendwelche
Patente oder Publikationen, die in dieser Beschreibung erwähnt sind,
sind ein Hinweis auf den Kenntnisgrad des Fachmanns, auf den sich
die Erfindung bezieht.
