DE69522689T2

DE69522689T2 - Zellzyklus-unabhängige, gliomaoberflach-spezifische, menschliche monoklonale antikörper

Info

Publication number: DE69522689T2
Application number: DE69522689T
Authority: DE
Inventors: Toronto Viventia Biotech Inc.
Original assignee: Viventia Biotech Inc
Current assignee: Viventia Bio Inc
Priority date: 1994-06-21
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 2002-08-08
Anticipated expiration: 2015-06-17
Also published as: CA2192079A1; JPH10501411A; NO965395D0; NZ288157A; CA2192079C; ATE205532T1; DE69522689D1; EP0766736A1; NO965395L; CN1074458C; CN1151184A; EP0766736B1; WO1995035374A1; MX9605895A; US5639863A; AU686394B2; AU2709295A

Description

Die Erfindung betrifft die Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern (MAb) vom IgM-Isotyp und dafür codierende cDNA. Insbesondere betrifft die Erfindung zwei menschliche monoklonale Antikörper gegen bösartige Gliatumor-Zellinien. Diese menschlichen Anti-Gliatumor- Antikörper haben bei der Behandlung dieses aggressiven Gehirntumors eine vielversprechende Bedeutung. Die Erfindung umfaßt die Zelloberflächenmarker, an die diese monoklonalen Antikörper binden.
Bösartige Gliatumoren sind die häufigsten aller primären Gehirntumoren. Sie gehören auch zu den klinisch am schwersten zu behandelnden Tumoren. Je nach ihrer intrakraniellen Position können sie ein erhebliches Wachstum erreichen, bevor sie irgendwelche Symptome hervorrufen. Ihr biologisches Verhalten ist notorisch aggressiv, obwohl sie außerhalb des Zentralnervensystems kaum Metastasen bilden.
Eine Operation und Strahlentherapie allein führen selten zu einer Heilung; auch bei bester Versorgung ist die mittlere Überlebensaussicht kürzer als ein Jahr. Ungeachtet großer Anstrengungen, neue Zusatztherapien einzuführen, ist die Prognose für Patienten mit bösartigen Gliatumoren während der letzten dreißig Jahre im wesentlichen unverändert geblieben.
Viele Zusatztherapien einschließlich der Immuntherapie sind entweder derzeit unwirksam oder weisen ein nicht akzeptables schweres Morbiditätsrisiko auf. Mit der Entwicklung von Mäuse-Hybridomen durch Köhler und Milstein (1975) ist jedoch die Tumor-Immundiagnose und -Immuntherapie mit monoklonalen Antikörpern als ein vielversprechendes Forschungsgebiet hervorgetreten.
Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern von Mäusen haben bereits erheblich zum Verständnis der Biologie und Verschiedenartigkeit von Gliatumoren beigetragen. Diese Reagenzien eignen sich aus verschiedenen Gründen nicht für die klinische Anwendung bei Menschen. Dagegen bieten menschliche monoklonale Antikörper die Möglichkeit einer größeren Spezifität und biologischen Kompatibilität als ihre Mäuse-Gegenstücke.
Bösartige Gliatumoren sind Neuroepitheltumoren, die gewöhnlich in den Großhirnhälften entstehen. Als Gruppe umfassen sie buntes Glioblastom, anaplastisches Oligodendrogliom, anaplastisches Ependymon und multiformes Glioblastom. Alle diese Tumoren besitzen bestimmte gemeinsame mikroskopische Merkmale wie etwa dichten Zellreichtum, erhöhte Mitosezahlen, Mehrgestaltigkeit des Kerns mit Hyperchromatose und Zellmehrgestaltigkeit. Bei multiformem Glioblastom sind sowohl die obigen Merkmale als auch Nekrose mit Pseudopalisaden, kapillare Endothelvermehrung mit Pseudorosettenbildung und Bindegewebsausbreitung vorhanden. Diese Tumoren sind heterogen und zeigen sowohl Inter- als auch Intratumor- Wechselhaftigkeit, was sehr wohl für die therapeutische Resistenz wesentlich ausschlaggebend sein kann. Da es nur wenige Marker gibt, die für schlecht differenzierte Gliomzellen selektiv sind, wäre es besonders vorteilhaft, diese Zellen innerhalb einer im übrigen heterogenen Population selektiv markieren zu können, da ein Wiederauftreten des Tumors unvermeidlich ist, wenn es nicht gelingt, dem Tumor solche schlecht differenzierten Zellen zu entziehen.
Es ist wohletabliert, daß viele Patienten mit bösartigen Gliatumoren eine abgeschwächte Immunreaktion insbesondere in bezug auf zellvermittelte Funktionen zeigen, obwohl nur wenige Patienten kachektisch sind. Die Feststellung einer abgeschwächten Immunreaktion in Abwesenheit von systemischem Kräftezerfall deutet darauf hin, daß erstere auf tumoreigene Mechanismen zurückgeht und nicht eine Widerspiegelung einer übermäßigen Tumorbelastung ist, was gewöhnlich der Fall ist. Humorale Immunmechanismen bei Patienten mit bösartigen Gliatumoren scheinen auch abgeflacht zu sein, obwohl sie intakt bleiben.
Bösartige Gliatumoren haben viele Antigene gemeinsam mit den Normalzellen, von denen sie abstammen. Infolgedessen ist es praktisch unmöglich, herkömmliche Heteroantiseren für Gliomgewebe herzustellen, ohne auf einen gewissen Grad von Kreuzreaktivität mit dem Normalgehirn von Erwachsenen zu treffen. Die gemeinsamen Antigene können intrazellulär, Membranen zugehörig oder extrazellulär sein.
Die Rolle von Glykolipiden und Kohlenhydratstrukturen bei der zellulären Wechselwirkung, Differenzierung und Tumorbildung erfährt seit einiger Zeit viel Aufmerksamkeit. Eine Unterklasse von Glykolipiden, die als Ganglioside bekannt sind, kann eine wichtige Rolle bei der Regulierung der zellulären Adhäsion und Proliferation spielen. Wenn eine Zelle eine bösartige Umwandlung erfährt, können sich subtile qualitative und quantitative Veränderungen der Chemie ihrer Oberflächen-Ganglioside einstellen.
Bösartige Gliatumoren sind gut vaskularisierte Tumoren. Allerdings besteht ein Zusammenbruch oder eine vollkommene Abwesenheit der Blut-Hirn-Schranke, die in einem normalen gesunden Gehirn vorhanden ist, wobei das Gehirn normalerweise gegenüber den Auswirkungen des Immunsystems oder anderer mit dem Blut transportierter Agenzien "privilegiert" oder isoliert ist. Aufgrund dieses Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke bei an diesen Tumoren leidenden Patienten hat das Immunsystem Zugang zu den Tumorzellen.
Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern von Mäusen, die gegen Gliomzellinien gezüchtet wurden, wurden von Schnegg et al. (1981) und von Bourdon et al (1983) berichtet. Beide Gruppen immunisierten Mäuse mit gezüchteten menschlichen Gliomzellinien bzw. verschmolzen Milzzellen mit den Mäusemyelomlinien P3X63-Ag8 oder P3X63-Ag8.653. Die monoklonalen Antikörper BF7, GE2, die von Schnegg et al. (1981) beschrieben werden, scheinen relativ Gliom-beschränkt zu sein, wogegen der Antikörper CG12 (de Tribolet et al., 1984) mit einem Spektrum von Gliomen, Melanomen und Neuroblastomen reagiert. Antikörper 81C6 wurde von Bourdon et al. (1983) produziert und charakterisiert, und es wurde gefunden, daß er mit einem extrazellulären Matrix-Antigen aus Gliombindegewebe (GMEM) reagiert, das an Gliomen, Neuroblastomen, Melanomen, Sarkomen und gezüchteten Fibroblasten exprimiert wird. Zusätzlich zu dem Vorstehenden wurde das GMEM-Antigen auch in normalen Lebersinusoiden, Milzpulpasinusoiden, im Neuralrohr-Interstitium der Niere und im glomerulären Mesangium gefunden. Während die Absorption von CG12 mit normalem erwachsenem und fetalem Gehirn die Bindungsaktivität beseitigte, wurden weder BF7 noch GE2 noch 81C6 durch die gleiche Behandlung beeinflußt.
Berichte von menschlichen monoklonalen Antikörpern von Patienten mit bösartigen Gliatumoren sind in der Literatur erschienen. Keiner dieser Antikörper ist jedoch gut charakterisiert worden.
Sikora et al. (1982) berichtete über die Produktion von menschlichen monoklonalen Antikörpern, die für 0,25% Glutaraldehyd-fixierte Gliomzellen reaktionsfähig waren. Diese Forscher erhielten intratumorale Lymphozyten von 12 Patienten, die sich einer Kraniotomie wegen bösartigen Gliatumors unterzogen, und verschmolzen sie mit der für EBNA*8-Azaguanin-resistenten menschlichen Lymphoblastlinie LICR-LON-Hmy2, von der man weiß, daß sie Gamma- und Lambdaketten sekretiert. Insgesamt 71 Hybridome wurden von fünf Patienten erhalten. Es wurden keine Subklonierungsexperimente berichtet, und man erhält keine Demonstration bzw. keinen Nachweis der Monoklonalität der Hybridome. Diese Studie berichtete auch über Kreuzreaktivität der menschlichen monoklonalen Antikörper mit anderen Tumorzellinien. Die Nachteile des Erfordernisses für intratumorale Zellen aus dem menschlichen Gehirn als Ausgangsmaterial sind deutlich.
In einer späteren Studie von Sikora et al. (1983) schlossen die Autoren, daß in bezug auf das für den für die Untersuchung ausgewählten menschlichen monoklonalen Antikörper dieser menschliche monoklonale Antikörper eine geringe Affinität hatte, und zwar wegen der hohen Konzentrationen, die erforderlich sind, um eine Reaktivität mit Zielgewebe zu demonstrieren.
Der Erfinder und Mitarbeiter der vorliegenden Anmeldung berichteten über die Produktion von fünf Hybridomzellinien, die jeweils einen menschlichen monoklonalen Anti-Gliom- Antikörper des IgM-Isotyps (Dan et al. 1993) erzeugten. Diese fünf Hybridome wurden durch die somatische Verschmelzung von Lymphozyten aus peripherem Blut von vier an Astrozytom leidenden Patienten mit einer menschlichen myelomähnlichen Zellinie TM-H2-SP2 erzeugt.
Die Erzeugung dieser fünf Hybridome basierte auf dem Prinzip, daß menschliche Patienten mit neurologischen Tumoren zirkulierende B-Lymphozyten mit Anti- Gliomspezifitäten besitzen sollten, und basierte auf dem Prinzip, daß Tumor-reaktive Antikörper, die von Gliorn- Patienten stammten, gemeinsame nicht-allelische Determinanten in menschlichen Gliomen erkennen sollten, die hinsichtlich der Spezifitäten und der Verteilung von denjenigen verschieden sein könnten, die von xenogenen Systemen erkannt werden.
Daher wurden diese fünf Hybridome aus der Fusion einer menschlichen myelomähnlichen Linie und B-Zellen, die von an Gliomen leidenden menschlichen Patienten gewonnen waren, abgeleitet. Durch geeignete Züchtung der resultierenden Hybridome wurden für menschliche Gliome wirksame menschliche monoklonale Antikörper in einsetzbaren Mengen erhalten.
Eine signifikante Charakteristik der erhaltenen menschlichen monoklonalen Antikörper ist der hohe Grad an Ähnlichkeit unter ihnen, obwohl sie von Zellen abstammen, die von vier verschiedenen Tumorpatienten erhalten sind, von denen jeder einen anderen Tumortyp, einen anderen Verlauf oder ein anderes Stadium der Tumorentwicklung hat. Außerdem zeigen diese menschlichen monoklonalen Antikörper im Vergleich mit dem Stand der Technik gesteigerte Kompatibilität mit und erhöhte Empfindlichkeit zur Erkennung von menschlichen Zielzellen. Die monoklonalen Antikörper binden nicht an normale menschliche Astrocyten.
Diese monoklonalen Antikörper sind bei der diagnostischen Abbildung zur Radiolokalisierung von neurologischen Tumoren und in der Immuntherapie entweder durch direkte Wirkung oder durch Koppelung dieser monoklonalen Antikörper an Chemotherapeutika, die dann zielgerichtet direkt zu den Tumorzellen gelangen, nützlich. Um klinisch wertvoll zu sein, sollte ein menschlicher monoklonaler Antikörper den folgenden Kriterien genügen: 1) die Oberfläche von lebenden Tumorzellen markieren, d. h. an sie binden, 2) ein vom Zellzyklus unabhängiges tumorspezifisches Antigen erkennen und 3) ebenso gut an Tumorzellen in vitro binden, und zwar ungeachtet ihrer Lebensfähigkeit in Kultur, ihrer Wachstumscharakteristiken oder der Kulturdichte. Von den fünf erhaltenen menschlichen monoklonalen Anti-Gliom- Antikörpern scheinen mindestens zwei diesen Kriterien zu genügen und sind charakterisiert worden. Diese beiden menschlichen monoklonalen Antikörper sind mit BT34/A5 und BT32/A6 bezeichnet.
Durch die Erfindung werden cDNA-Sequenzen angegeben, die für die leichten und schweren Ketten der variablen Bereiche bzw. Regionen der menschlichen monoklonalen Antikörper BT34/A5 und BT32/A6 codieren. Die Erfindung umfaßt die entsprechenden Aminosäuresequenzen und menschlichen monoklonalen Antikörper des IgM-Isotyps mit den charakterisierten variablen Bereichsketten ebenso wie andere Proteine oder Proteinkonjugate, die diese Ketten haben. Insbesondere umfaßt die Erfindung jedes Protein oder Proteinkonjugat (d. h. Immunkonjugat), das variable leichte und schwere Ketten mit hypervariablen Bereichen (die Komplementarität bestimmenden Bereichen oder CDR) hat, die die gleichen wie die hypervariablen Bereiche der leichten und schweren Ketten der Erfindung sind oder zu mindestens 90% homolog damit sind. Wie für den Fachmann ersichtlich ist, umfassen Immunkonjugate Arzneistoffe, Toxine, Cytokine, Radionuklide, Enzyme und andere diagnostische oder therapeutische Moleküle, die mit der Antigen-bindenden Molekülstruktur konjugiert sind.

Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern

Es wurden Zellverschmelzungen durchgeführt, um Hybridome aus der menschlichen Myelom-ähnlichen Zellinie TM-H2-SP2 und peripheren B-Lymphozyten (PBL) herzustellen, die von acht verschiedenen Gehirntumor-Patienten erhalten waren, clie mit BT-24, BT-27, BT-32, BT-34, BT-38, BT-39, BT-54 und BT-55 codiert sind. Diese sowohl männlichen als auch weiblichen Patienten waren zwischen 5 und 55 Jahre alt und hatten die verschiedensten neuroektodermalen Tumoren, umfassend fibrilläres Astrozytom, Oligoastrozytom, primitiven neuroektodermalen Tumor und Glioblastom. Die Verschmelzungen wurden wie früher beschrieben (Dan et al. 1992) durchgeführt. Die Inkubation der Zellen in den 96 Mikrovertiefungen aufweisenden Schalen erfolgte unter Anwendung von frischem Gewebskulturmedium und fetalem Kälberserum (FCS), ergänzt mit L-Glutamin (292 mg/l) und L- Asparagin (44 mg/l). Der Hybridomauswuchs, definiert als die Zahl von Mikrovertiefungen, die makroskopische Kolonien von mehr als 50-100 Zellen (für das bloße Auge sichtbar) enthielten, dividiert durch die Gesamtzahl der geimpften Mikrovertiefungen und ausgedrückt als Prozentsatz, lag zwischen 0 und 19,5%.
Die Anzahl von PBL in allen für die Verschmelzung verfügbaren Proben variierte zwischen 6,0 · 10&sup6; und 5,8 · 10&sup7;. Das Verhältnis der Myelomzellen zu den Lymphozyten blieb zwar mit 1: 4 für jede Verschmelzung konstant, aber die angewandte Dichte lebensfähiger Zellen lag im Bereich von 1,0 · 10&sup5; bis 2,5 · 10&sup5; Myelomzellen pro ml Verschmelzungsgemisch. Die niedrigere Dichte lebensfähiger Zellen wurde für manche Verschmelzungen gewählt, um den Versuch einer besseren anfänglichen Monoklonalität zu fördern, wogegen die höhere Dichte lebensfähiger Zellen ein verbessertes Auswachsen der Hybridome begünstigte. Die Konzentration von Polyethylenglykol war 50% (v/v) bei allen Verschmelzungen.
Typischerweise erschien ein wahrnehmbarer Hybridomauswuchs 4 bis 6 Wochen nach einer Verschmelzung, und das neue Wachstum in Mikrovertiefungen konnte häufig weiterhin noch mehrere Wochen danach beobachtet werden. Im allgemeinen tendierten diejenigen Hybridomkolonien, die zuerst erschienen, dazu, am stabilsten zu sein. Nicht alle am Ende der Kulturperiode in den 96 Mikrovertiefungen (0,28 cm²/Vertiefung) gezüchteten makroskopischen Kolonien konnten erfolgreich auf Mengen fortgepflanzt werden, die für das Wachstum in Schalen mit 24 Vertiefungen (2,01 cm²/Vertiefung) geeignet waren. Beispielsweise bei Verschmelzungen mit BT-43 war von den sieben Kolonien, die ursprünglich in 96 Mikrovertiefungen wuchsen, nur eine imstande, längere Zeit in vitro zu wachsen. Beispiele von Ausfällen von Hybridomwachstum, die später als drei Monate nach dem Verschmelzen auftraten, wurden nicht beobachtet.
Die Hybridome wurden in bezug auf die Anwesenheit von Humanimmunglobulin und die Reaktionsfähigkeit mit 3M KCl- Extrakten von autologen Tumoren oder von mit Glutaraldehyd fixierten Gliomzellinien gescreent.
Eine Gesamtzahl von 1121 Vertiefungen, die Wachstum von putativen Hybridomen aus den beschriebenen Verschmelzungen enthielten, wurden gescreent, und von diesen wurde bei 162 (14,5%) festgestellt, daß sie mit Tumorextrakten oder. Gliomzellinien reagierten. Zwei der Verschmelzungen, und zwar BT-27 und BT-32, wurden in bezug auf Reaktionsvermögen mit verschiedenen Gliomzellinien gescreent, und es wurden Fälle von einzelnen Mikrovertiefungen gefunden, die in Vielfach-ELISA (Enzymimmunoassays) positiv testeten.
Bei den letzten beiden Verschmelzungen BT-54 und BT-55 wurde der ELISA so modifiziert, daß nur diejenigen Mikrovertiefungen nachgewiesen wurden, die reaktionsfähige IgM-Spezies enthielten. Diese Modifikation wurde erreicht durch Substitution von Kulturüberstand von Hybridom BTT27/2D2 für TM-H2 als Kontrolle und durch Zugabe von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegen-Antihuman-IgM als einem zweiten Antikörper. Der Grund hierfür war, daß die Analyse von Immunglobulinketten, die in 34 Hybridomen aus den Verschmelzungen BT-24, BT-27, BT-32 und BT-34 anwesend waren, zeigte, daß alle 34 IgM enhielten, und eine sorgfältige Untersuchung einiger dieser Hybridome zeigte, daß das IgM allein für die Anti-Tumorwirksamkeit verantwortlich war. Hybridom BT27/2D2, das von Zellen von Patient BT-27 stammte und in verschiedenen ELISA für Immunreaktionsvermögen gleichbleibend negativ war, wurde als eine nichtspezifische IgM-Kontrolle gewählt (1-4 ug/l).
Insgesamt neun stark Immunglobulin produzierende Hybridome aus den beschriebenen Verschmelzungsreihen wurden in bezug auf Reaktionsvermögen mit der menschlichen Gliomlinie SK-BG-1 gescreent unter Verwendung des FACS-III Durchflußzytometers. Von fünf Überständen aus den Hybridomen, die als BT27/1A2, BT27/2A3, BT32/A6, BT334/A5 und BT54/B8 bezeichnet wurden, wurde gefunden, daß sie diese spezielle Gliomzellinie markieren. Alle fünf enthielten für Tumor reaktionsfähige IgM-Spezies. Aus acht Verschmelzungen und insgesamt 59 Hybridomen, die nach sechs Wochen makroskopisch sichtbar waren, reagierten somit nur fünf (8,4%) mit der Zelloberfläche einer Gliomzellinie und konnten beständig in Kultur gezüchtet werden. Es wurde beobachtet, daß die Markierung von SK-MG-1 mit BT27/2A3 verstärkt wird, wenn ersteres vor dem Testen auf einer hohen Zelldichte gehalten wird.
Alle fünf Hybridomüberstände enthielten schwere u-Ketten. Nur BT34/A5 enthielt leichte λ-Ketten, und die anderen vier menschlichen monoklonalen Antikörper enthielten leichte Kappa-Ketten. Von jedem menschlichen monoklonalen Antikörper wurde gezeigt, daß er die Zelloberfläche der menschlichen Gliomlinie SK-MG-1 markiert, wobei die durchflußzytometrische (FCM) Analyse und FITC-konjugiertes Ziegen-Antihuman-IgM (IgG-Fraktion, für die u-Kette spezifisch; Cappel Laboratories, Cochranville, PA) angewandt wurden, wobei gezeigt wurde, daß die IgM-Moleküle an die Tumorzelloberflächenmembran banden (Daten nicht gezeigt).
Nach ungefähr sechs Monaten des Haltens in Kultur war die geschätzte IgM-Konzentration von BT27/1A2 5,0 ug/l; für BT27/2A3 war sie 44 ug/l, für BT32/A6 war sie 3,5 ug/l, für BT34/A5 war sie 2,4 ug/l, und für BT54/B8 war sie 22,4 ug/l. Nach weiteren sechs Monaten in ununterbrochener Kultur wurde gefunden, daß die IgM-Erzeugungsspiegel vergleichbar waren.
Drei der fünf menschlichen monoklonalen Antikörper wurden mittels ELISA auf ihre relativen Reaktionsfähigkeiten getestet. Bei der anfänglichen Konzentration von Überstandsfluid, das getestet wurde, war die Reihenfolge der Reaktionsfähigkeit BT27/2A3 > BT27/1A2 > BT32/A6, was der Reihenfolge ihrer jeweiligen IgM-Konzentrationen entspricht. Der mittels ELISA analysierte endgültige Titer, der Werte der optischen Dichte ergab, die signifikant höher als die Kontroll-IgM-Grundlinie waren, war 1: 16 für BT27/2A3, 1: 4 für BT27/1A2 und 1: 2 für BT32/A6. Da dieser Assay die Zugabe eines gleichen Volumens an PBS, d. h. 50 ul, im ersten Schritt bedingt, war die mittels ELISA getestete Anfangsverdünnung 1: 2. Es gab keine Anzeichen einer anfänglichen Plateauphase in irgendeiner der Verdünnungskurven, was zeigt, da unter den angewandten ELISA-Bedingungen die Menge an Tumorextrakt kein einschränkender Faktor war.

Bestimmung der Monoklonalität

Genomische DNA wurde aus TM-H2-SP2-, BT27/1A2-, BT27/2A3-, BT32/A6- und BT27/2D2-Zellen nach Maniatis et al. (1982) isoliert. 10 ug DNA wurden über Nacht bei 37ºC mit BamHi- und HindIII-Restriktionsenzymen (> 3 Einheiten/ug DNA; Böhringer-Mannheim, Deutschland) entsprechend den vom Hersteller angegebenen Bedingungen geschnitten. Nach dem Schneiden wurde die DNA der Elektrophorese auf einem 0,8% (w/v) Agarosegel unterzogen (Maniatis et al., 1982) und nach der üblichen Methode auf eine Genescreen Plus Membran (NEN, Boston, MA) überführt. Nach der Prähybridisierung mit. Heringssamen-DNA (Böhringer-Mannheim, Deutschland) wurde der Southern Blot über Nacht bei 65ºC mit einer mit ³²P- markierten JH-Sonde (Oncor Inc., Gaithersburg, MD), spezifische Wirksamkeit von 5-6 · 10&sup8;/ug, hybridisiert. Die Sonde umfaßt die gesamte menschliche JH-Region und ist insgesamt 5,6 kbp (Ravetch et al., 1981). Nach dem Waschen wurde der Blot mit Kodak-Röntgenfilm mit intensivierenden Screens bei -70ºC belichtet.
Die Southern-Blot-Analyse zeigte, daß die Hybridome BT27/1A2, BT27/2A3 und BT32/A6 jeweils zwei neugeordnete Banden besitzen, die zu der JH-Genregion homolog sind. Das Hybridom BT27/2D2 schien drei solche Banden zu besitzen. Der bei diesen Experimenten eingesetzte B-Zellfusionspartner TM-H2-SP2 hatte nur ein Band und einen scheinbaren Verlust.
Ferner gibt es in keinem der "Hybridome" einen Beweis für eine Neuordnung der JH-Region vom TM-H2-SP2-Typ. Als Kontrolle ergab normale PBL-DNA, die aus 60-70% von T- Zellen stammendem genetischem Material besteht, ein Blotprofil, das mit der plazentalen DNA (Keimbahn-DNA) identisch war. Es gab ferner ein gemeinsames Band mit niedrigem Molekulargewicht, das eine in jeder der Proben vorhandene, nicht verwandte homologe Sequenz enthielt.
Das Ig-Gen der schweren Kette liegt am Chromosom 14 im Menschen und besteht aus vier deutlich ausgeprägten Elementen, die als VH-Bereich (variabler Bereich), DH- Bereich (Diversitäts-Bereich), JH-Bereich (verbindender Bereich) und CH-Bereich (konstanter Bereich) bekannt sind. In der Keimbahn-DNA sind diese Bereiche durch dazwischen liegende Sequenzen getrennt, die ausgespleißt werden, nachdem sich die Zelle für eine B-Zelldifferenzierung entschieden hat.
Ursprünglich wurde angenommen, daß nur ein Chromosom eine Neuanordnung erfuhr, während die übrigen in der Keimbahnkonfiguration verblieben (das Prinzip der allelen Exklusion). Bei dem Mäuse-Gen der schweren Kette ist jedoch das zweite Chromosom im wesentlichen immer neugeordnet (Nottenburg und Weissman, 1981). Es wurde daher vorgeschlagen, daß bei einer gegebenen Zelle die Wahrscheinlichkeit einer funktionellen Neuordnung sehr gering sein mußte (Coleclough et al., 1981). Damit würde man die Situation von zwei nichtfunktionellen oder einer funktionellen und einer nichtfunktionellen, jedoch sehr selten von zwei funktionellen Neuordnungen der schweren Kette pro Zelle antreffen. Diese Beobachtungen gelten für die Maus und scheinen auch für höhere Säugerspezies gültig zu sein (Korsmeyer et al., 1983).
Die bei diesen Experimenten verwendete Sonde der schweren Kette umfaßt den gesamten menschlichen JH-Keimbahnbereich. In Situationen, in denen eine Neuordnung der Keimbahn-DNA erfolgt ist, produziert ein Schneiden mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII DNA-Fragmente, die in bezug auf Länge von der 5,6 kpb JH-Sonde verschieden sind. Das Auffinden von zwei solchen Fragmenten in jeder der Hybridombahnen zeigt, daß zwei Neuordnungen der schweren Kette für jedes Hybridom nachgewiesen werden, was mit einem monoklonalen Ursprung jedes der drei Hybridome, übereinstimmt.

Durchflußzytometrie

Die Durchflußzytometrie-Analyse von kultivierten menschlichen Zellinien und -Stämmen wurde durchgeführt, nachdem die Zellen bis zum Zusammenfließen gewachsen waren und in diesem Zustand gehalten wurden, wobei ein Austausch von frischem Medium mindestens 24 h vor der Markierung erfolgte. Suspensionskultur-Zellinien wurden von Kulturen mit hoher Zelldichte, d. h. nahe der Sättigung, gehalten und eingesetzt. Ein Screening wurde nach der oben angegebenen Methode parallel bei zwei oder mehr gesonderten Gelegenheiten mit etablierten positiven Zellinien durchgeführt, um die Aufrechterhaltung des Immunreaktionsvermögens der menschlichen monoklonalen Antikörper zu bestätigen.
Die Ergebnisse des FCM-Screenings mit menschlichen Zellinien sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengefaßt. Mehrere verschiedene Klassen von neuroektodermalen und nichtneuroektodermalen Tumoren und Geweben wurden getestet. Alle fünf menschlichen monoklonalen Antikörper zeigten einen gleichartigen Verlauf des Reaktionsvermögens für die 30 untersuchten Zellinien, wobei es nur wenige erwähnenswerte Ausnahmen gab. Die menschliche epitheliale Zervixkarzinom- Zellinie ME180 reagierte beispielsweise mit BT27/1A2 und BT27/2A3, aber nicht mit BT32/A6. Die Antikörper BT34/A5 und BT54/B8 reagierten beide nicht mit der Gliomzellinie SKI-1, markierten jedoch die Melanomlinie M-4.
Nur der menschliche monoklonale Antikörper BT32/A6 hatte ein spezielles Muster des Reaktionsvermögens. Die Antikörper BT27/1A2 und BT27/2A3 zeigten ein Muster des Reaktionsvermögens, und die Antikörper BT34/A5 und BT54/B8 hatten ein anderes Muster des Reaktionsvermögens, die geringfügig voneinander verschieden waren. Keiner der menschlichen monoklonalen Antikörper reagierte mit irgendeiner der hämatologischen Zellinien, die untersucht wurden. Tabelle 1: Reaktionsvermögen von drei menschlichen monoklonalen Antikörpern
Fußnoten: aHybridome, bes wurde nachgewiesen, daß menschlicher monoklonaler Antikörper über den Hintergrundspiegel der Markierung mit Kontroll-Antikörper hinaus gebunden war, cT-Zellenleukämie, dchronische myelozytische Leukämie, eakute promyelozytische Leukämie, fepitheliales Zervixkarzinom, gKolonadenokarzinom, hBlasenzellkarzinom im Übergangsstadium, N.D.: nicht durchgeführt. Tabelle 2: Reaktionsvermögen der menschlichen monoklonalen Antikörper BT34/A5 und BT54/B8
Fußnoten: aHybridome, bsiehe Tabelle 1, cTZellenleukämie, dchronische myelocytische Leukämie, eakute promyelocytische Leukämie, fhistiocytisches Lymphom, monozyten-artig, gB-Zellenlymphom, hepitheliales Zervixkarzinom, iKolonadenokarzinom, jBlasenzellkarzinom im Übergangsstadium, N.D.: nicht durchgeführt.
Ungeachtet kleinerer Unterschiede im Muster des Reaktionsvermögens gegenüber einem Panel von menschlichen Tumorzellinien scheinen alle fünf menschlichen monoklonalen Antikörper gleichartige molekulare Substanzen zu erkennen, und zwar sowohl in bezug auf die biochemische Zusammensetzung als auch die biologische Verteilung, obwohl sie von vier verschiedenen Patienten mit unterschiedlichen Tumoren abstammen.

Anfärben mit Immunperoxidase

Der Antikörper BT32/A6 wurde für einen Immunperoxidase- Anfärbeassay unter Verwendung eines Panels von Tumorzellen ausgewählt. Tumorzellen wurden auf Deckgläsern für 2 bis 3 Tage in Vollmedium gezüchtet, mit PBS gewaschen und mit 2% Formaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur fixiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit 1% Ziegen-Normalserum für 60 min inkubiert. Nach einer weiteren Wäsche mit PBS wurden die Zellen entweder mit 10-20 ug/ml monoklonalem Antikörper oder mit menschlichem Myelom-IgM als Kontrolle für 120 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer weiteren Wäsche mit PBS wurden die Zellen für 60 min bei Raumtemperatur mit biotinyliertem Ziegen-Antihuman-IgM für 60 min bei Raumtemperatur angefärbt, dann für weitere 60 min mit mittels HRP markiertem Streptavidin inkubiert, gefolgt von einer Wäsche mit PBS. Die Peroxidasereaktion wurde unter Einsatz von 0,06% Diaminobenzidin mit 0,01% Hydrogenperoxid in 50 mM Tris-CHl-Puffer, pH 7,0, für 10 min eingeleitet. Die Zellen wurden kurz mit Hematoxylin gegengefärbt. Wie die Tabelle 3 zeigt, bestätigen die Anfärbeergebnisse weitgehend die Ergebnisse der Durchflußzytometrie, wobei die Ausnahmen eine positive Bindung von menschlichem monoklonalem Antikörper an Melanom- und Neuroblastom-Zellinien unter Anwendung dieses Assays sind. Tabelle 3: Reaktionsvermögen von mit Peroxidase angefärbtem menschlichem monoklonalem Antikörper BT32/A6

Reaktionsfähigkeit mit normalen menschlichen Astrocyten

Gezüchtete menschliche Astrozyten wurden für die Markierung mit menschlichen monoklonalen Antikörpern bewertet. Alle Reagenzien wurden auf Immunreaktionsfähigkeit gegen eine etablierte positive menschliche Gliomzellinie (U-373) geprüft. Keiner der menschlichen monoklonalen Antikörper BR27/1A2, BR27/2A3 und BT32/A6 schien gezüchtete Astrozyten von zwei verschiedenen Personen zu markieren. Auch die Antikörper BT34/A5 und BT54/B8 konnten normale menschliche Astrozyten, die von einer Person stammten, nicht markieren.

Relative Affinität

Zur Bestimmung der relativen Antikörper-Affinitäten der fünf menschlichen monoklonalen Antikörper wurde eine Modifikation der Methode von De Bernado und Davies (1987) angewandt. Die Resultate von ELISA der fünf menschlichen monoklonalen Antikörper mit Tumorextrakt von Patient BT-37 (multiformes Glioblastom) nach entweder einer langen (18 h) oder einer kurzen (4 h) Inkubationszeit bei 4ºC wurden in Form von Messungen der optischen Dichte (OD) ausgedrückt. Der Vergleich der OD-Meßwerte für jeden menschlichen monoklonalen Antikörper zu den beiden Zeitpunkten zeigt, daß für BT32/A6 und BT54/B8 mit der längeren Inkubationsdauer eine statistisch signifikante Zunahme (p< 0,05) der optischen Dichte erhalten wird. Keiner der anderen drei menschlichen monoklonalen Antikörper (BT27/1A2, BT27/2A3 und BT34/A5) zeigte eine signifikante Steigerung des Reaktionsvermögens nach einer längeren Inkubation bei 4ºC. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, daß BT32/A6 und BT54/B8 sich als Antikörper mit geringer Affinität bei niedrigen Temperaturen verhalten.
Nach einer langen Inkubationsdauer (18 h bei 4ºC) wurden mittels ELISA alle fünf menschlichen monoklonalen Antikörper als positiv (p< 0,05) bei Vergleich mit der Kontrolle bestätigt. Nach der kurzen Inkubationsdauer jedoch (9: h bei 4ºC) waren nur BT27/1A2, BT27/2A3 und BT34/A5 deutlich positiv; BT32/A6 und BT54/B8 reagierten nicht signifikant, möglicherweise wegen ihrer geringen Affinität.

Vorläufige Antigen-Charakterisierung

Es wurden Tüpfel-Blots von Gesamtlipidextrakten aus gezüchteten neuroektodermalen Zellinien untersucht. LN-340 und M-4 sind Gliom- und Melanom-Zellinien, die vorher als nichtreaktionsfähig mit jedem der fünf menschlichen monoklonalen Antikörper gezeigt wurden. Im Vergleich mit dem als Kontrolle dienenden menschlichen monoklonalen Antikörper BT27/2D2 gab es ein gewisses Anzeichen für eine potentielle Reaktionsfähigkeit bei allen fünf menschlichen monoklonalen Antikörpern beim Test gegen Glykolipide aus der Gliom- Zellinie U-373. In bezug auf die Gliomlinie SK-MG-1 schienen mit Ausnahme von BT54/B8 alle menschlichen monoklonalen Antikörper ein gewisses Maß an Reaktionsfähigkeit für den Lipidextrakt zu zeigen, obwohl die Qualität dieser Tüpfel- Blots nicht vollständig zufriedenstellend war.
Eine Immunchromatographie des Gesamtlipidextrakts, der aus SK-MG-1-Gliomzellen präpariert war, wurde durchgeführt, wobei BT34/A5 und die Elternlinie TM-H2 als Kontrolle dienten. Es wurde ein einziges spezifisches Band mit Rf = 0,60 beobachtet. Ebenso war ein nichtspezifisches Band mit RF = 0,80 in der BT34/A5-Bahn sowie der TM-H2-Bahn ersichtlich. Bei separaten Experimenten wurden ähnliche Ergebnisse für BT27/1A2 und BT27/2A3 im Vergleich mit BT27/2D2 erzielt, d. h. ein spezifisches Band mit Rf = 0,60. Die Immunchromatographie mit dem menschlichen monoklonalen Antikörper BT54/B8 zeigte keine Anwesenheit irgendeines spezifischen Bandmusters, aber dieses Ergebnis ist in Übereinstimmung mit dem Tüpfelblot-Experiment.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß die menschlichen monoklonalen Antikörper eine Determinante eines Glykolipids oder Gangliosids erkennen, die in Verbindung mit Glykoproteinen nicht nachgewiesen wurde.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1A-1D sind durchflußzytometrische Analysen von geschabten SK-MG-1-Zellen.
Die Fig. 2A und 2B sind durchflußzytometrische Analysen von Gliomzellen, die für mit BT32/A6 markiertes PI permeabel sind (Fig. 2B), gegenüber einer Kontrolle (Fig. 2A).
Fig. 3 zeigt Verhältnisse von lebensfähigen zu nichtlebensfähigen Zellen durch Überführen von zusammenfließenden Kulturen von SK-MG-1-Zellen mit verschiedenen Teilungsverhältnissen.
Fig. 4 zeigt Zellwachstumsraten der verschiedenen Teilungsverhältnisse.
Fig. 5 zeigt die relative Anzahl Zellen in jeder Phase des Zellzyklus für die verschiedenen Teilungsverhältnisse. Die gezeigten Trends stimmen mit der in Fig. 4 gezeigten Zunahme der Wachstumsrate überein.
Fig. 6 zeigt die Markierung von SK-MG-1-Zellen mit monoklonalem Antikörper BT32/A6 gegenüber dem Teilungsverhältnis der Kultur.

Menschlicher monoklonaler Antikörper BT32/A6

Der menschliche monoklonale Antikörper BT32/A6 wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt.
Zellkulturüberstände von BT32/A6 wurden präpariert durch Züchten der Zellen in RPMI-1640 Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin und 1% HAT (Gibco, Grand Island, NY) entweder in T175-cm²-Kolben, (Costar, Cambridge, MA) oder 3-1-Rührkolben (Kontes, Vineland, NJ). Nach vier oder fünf Wachstumstagen und bei einer Zelldichte von 1-2 · 1&sup6; pro ml wurden die Überstände mittels Zentrifugierung für 10 min bei 500 g geerntet. Dieser Überstand wurde entweder direkt eingesetzt oder vor dem Gebrauch eingeengt und ausgereinigt. Zur Einengung von Zellkulturüberständen wurden Tangentialdurchflußmembranen mit einem Molekulargewichts-Ausschluß von 100.000 in einem Minitan-Konzentrationsgerät (Millipore, Bradford, MA) verwendet. Die Ausreinigung von IgM-Antikörper erfolgte in Säulenchromatographie mit Mischmodus-Ionenaustausch (J.T. Baker Inc., Phillipsburg, NJ), Q-Sepharose Fast Flow und Superose-6 (Pharmacia, Uppsala, Schweden). Die Endkonzentration des menschlichen monoklonalen Antikörpers wurde bei dem Antigeneinfang-ELISA unter Anwendung einer Standardkurve bestimmt, die mit polyklonalem menschlichem IgM erzeugt war (Cappel Labs., Malvern, PA).
Wie berichtet (Dan et al., 1992), zeigte die FCM-Analyse von SK-MG-1-Gliomzellen (ursprünglich mit AJ bezeichnet; Pfreundschuh et al., 1978) die Anwesenheit von zwei deutlich ausgeprägten Zellpopulationen, die als "kleine" und "große" Zellen bezeichnet werden (auf der Basis von Hinstreuprofilen). Diese Beobachtung basierte auf Arbeiten mit SK-MG-1-Gliomzellen, die aus Gewebskulturkolben durch mechanisches Ausschaben der Zellen aus dem Kolben entfernt worden waren. Wenn SK-MG-1-Zellen mit Trypsin oder EDTA entnommen werden, die keine so starke Einwirkung auf die Zellen haben, zeigt die FCM-Analyse nur eine Zellpopulation (Ergebnisse nicht gezeigt). Durch Fluoreszenz aktiviertes Sortieren von geschabten SK-MG-1-Zellen zeigte, daß die "kleinen" Zellen eine 2,0% Koloniebildungseffizienz (CFE) hatten, wogegen die "großen" Zellen eine CFE von 38,0%, nahezu 20mal größer, hatten. Wenn geschabte SK-MG-1- Gliomzellen mit PI (Propidiumiodid) alleine markiert wurden, wurde eine Zunahme der PI-Fluoreszenz nur unter den "kleinen" Zellen, jedoch nicht unter den "großen" Zellen beobachtet. Daß tote Zellen mit PI anfärbbar sind, wurde daraus geschlossen, daß die "großen" Zellen von geschabtem SK-MG-1 lebensfähig und die "kleinen" Zellen nichtlebensfähig sind.

Oberflächenmarkierung von lebenden Zellen

Wenn die nichtlebensfähigen "kleinen" Zellen erneut mit dem Hinstreuprofil gegenüber dem 90º-Streuprofil ausgewählt werden, erscheinen sie als separate Population unter den lebensfähigen "großen" Zellen (Bereich 'A' in Fig. 1A), und PI wurde allen FCM-Proben zugefügt, um die Aufgabe, nur lebende und lebensfähige SK-MG-1-Gliomzellen durchzulassen, zu unterstützen. In Fig. 1B bezeichnet ein mit 'B' markierter Bereich die SK-MG-1-Zellen, die nicht mit PI markiert waren. Die Doppelspitze rechts von 'B' repräsentiert SK-MG-1-Gliomzellen, die PI aufgenommen haben (Bereich 'C) und somit nichtlebensfähig sind. Die Doppelspitze entspricht den G&sub0;/G&sub1;- bzw. G&sub2;/M-Spitzen des Zellzyklus. Fig. 1C stellt SK-MG-1-Zellen dar, die aus dem Bereich 'A' und dem Bereich 'B' zweifach ausgewählt wurden und daher leben und imstande sind, Kolonien in vitro zu bilden. Diese Zellen sind mit menschlichem monoklonalem Kontroll-Antikörper markiert. Es wurde gefunden, daß die mittlere FITC-Fluoreszenz dieser Zellen nach Zugabe von menschlichem monoklonalem Antikörper BT32/A6 um einen Faktor > 360% zunahm. Daher markiert der menschliche monoklonale IgM-Antikörper BT32/A6 die Oberfläche von lebenden SK-MG-1- Gliomzellen, die lebensfähig und imstande sind, in vitro Kolonien zu bilden.

Vom Zellzyklus unabhängige Antigen-Exprimierung

Die Exprimierung des BT32/A6-Antigens während des gesamten Zellzyklus wurde untersucht, indem eine Untergruppe von SK- MG-1-Gliomzellen, die für PI permeabel waren (Fig. 1B, Bereich 'C'), gewählt und mit menschlichem monoklonalem Antikörper BT32/A6 markiert wurde. Die in Fig. 2B gezeigten Ergebnisse zeigen eine Markierung von Tumorzellen sowohl in der G&sub0;/G&sub1;-Phase als auch der G&sub2;/M-Phase des Zellzyklus. Es gab eine minimale Markierung von SK-MG-1-Zellen in der S- Phase des Zellzyklus, was in der Figur nicht wiedergegeben ist.
Die Beobachtung einer Markierung während jeder Phase des Zellzyklus wird durch die Feststellung einer erhöhten Fluoreszenz in nahezu 100% der lebensfähigen SK-MG-1-Zellen gestützt. Zu jedem Zeitpunkt ist ein bestimmter Anteil der SK-MG-1-Zellen in jeder Phase des Zellzyklus. Die Tatsache, daß nahezu 100% der Zellen markiert waren, muß bedeuten, daß sämtliche SK-MG-1-Zellen in jeder Phase des Zellzyklus mit menschlichem monoklonalem Antikörper BT32/A6 markiert waren. Daher wird die Exprimierung von BT32/A6-Antigen an der Oberfläche lebender Zellen durch den Zellzykluszustand mit dem untersuchten Zelldurchlaufverhältnis und der untersuchten Kulturdichte von SK-MG-1-Zellen nicht beeinflußt.

Antigen-Exprimierung und Kulturteilungsverhältnis

Durch die Passage von zusammenfließenden Kulturen von SK-MG-1-Gliomzellen mit Teilungsverhältnissen von 0, 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1: 16, 1: 32 und 1: 64 und anschließendes Züchten der Zellen für 3 Tage unter Standardbedingungen wurden signifikante Trends in bezug auf die folgenden Parameter erzeugt: 1) das Verhältnis von lebensfähigen zu nichtlebensfähigen Zellen (Fig. 3), 2) die Zellwachstumsrate (Fig. 4), und 3) die relative Anzahl Zellen in den G&sub0;/G&sub1;-, S- und G&sub2;/M-Phasen des Zellzyklus (Fig. 5). Es gab eine ausgezeichnete Korrelation zwischen der Kulturlebensfähigkeit (bestimmt durch das Verhältnis von lebensfähigen zu nichtlebensfähigen Zellen) und der Zellwachstumsrate (bestimmt durch die Zellzahl am Tag 3 in Form eines Prozentsatzes der Zellzahl am Tag 0) mit r = 0,991 und p < 0,01.
Gegenüber diesen Trends der Kulturlebensfähigkeit, der Wachstumsrate und der Zellzyklusphase wurde kein signifikanter Trend bei der Markierung von SK-MG-1- Gliomellen mit BT32/A6 als Funktion des Kulturteilungsverhältnisses beobachtet (r = -0,303, p > 0,05, Fig. 6). Die Daten konnten die Nullhypothese, daß die Steigung der Regressionslinie Null war, bei Anwendung des t- Tests nach Student nicht zurückweisen. Somit ist die Markierung von SK-MG-1 mit menschlichem monoklonalem Antikörper BT32/A6 unabhängig von: 1) der Kulturlebensfähigkeit, 2) der Wachstumsrate und 3) der Zellzyklusphase über den Bereich von Passage- Teilungsverhältnissen, die untersucht wurden.

Komplement-vermittelte Zytotoxizität

Menschliche Gliomzellen (SK-MG-1-Zellen) wurden mit RPMI- 1640 Medium gewaschen, das 5% FBS und 5 mM HEPES, pH 7,2, enthielt. 50 ul SK-MG-1-Zellsuspension mit 5 · 10&sup5; Zellen/ml wurden in Mikrotiter-Rundbodenvertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) mit 50 ul entweder von Medium (Kontrolle) oder verschiedenen Verdünnungen von monoklonalem Antikörper (Testprobe) für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Alle Proben wurden als Doppelserie verwendet. Die Mikrotiterplatte wurde dann für 5 min mit 400 g zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, und 50 ul Kulturmedium oder eine 1 : 10-Verdünnung von Kaninchenkomplement (Cedarlane Laboratories, Hornby, ON, Canada) wurde jeder Vertiefung zugegeben. Die Inkubation wurde für 90 min bei 37ºC fortgesetzt. Nach der Inkubationszeit wurde die Platte für 5 min mit 400 g zentrifugiert, 25 ul Überstand wurde entnommen und auf Eis verbracht. Am Ende der Analyse wurde eine Zellsuspensionsprobe mit einem gleichen Volumen von 0,2% Trypanblau angefärbt, und der Prozentsatz lebensfähiger Zellen wurde in einem Hämozytometer gezählt. Die mittleren Lebensfähigkeiten von Duplikatproben wurden errechnet. Der Prozentsatz der spezifischen Zytotoxizität aufgrund von monoklonalem Antikörper wurde entsprechend der nachstehenden Formel bestimmt:
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 4: Komplement-abhängige Zytotoxizität von menschlichem monoklonalem Antikörper BT32/A6
Fußnoten: aKaninchenkomplement, bnicht durchgeführt

Charakterisierung der menschlichen monoklonalen Antikörper BT32/A6 und BT34/A5

DNA-Sequenzen wurden für die variablen Bereiche bzw. Regionen der leichten und schweren Ketten der menschlichen monoklonalen Antikörper BT32/A6 und BT34/A5 unter Anwendung von Standardverfahren (Le Boeuf et al. (1989), Schroeder et al. (1990)) erhalten. Somit wurde mRNA aus Hybridomzellinien BT32/A6 und BT34/A5 extrahiert, und die V-Bereichs-cDNA wurde verstärkt unter Einsatz von PCR mit für V-Bereichs- Sequenzen spezifischen Primern. Geeignete Vektoren für die Klonierungsexprimierung wurden präpariert, und Bakterienkulturen wurden in LB-Medium, das Ampicillin enthielt, gezüchtet. Minipräparate von dsDNA wurden nach der ALKALI-Methode (Molecular Cloning, Maniatis) hergestellt, und die DNA wurde unter sequenziert unter Anwendung des United States Biochemical Sets und Protokolls.
Da die DNA-Sequenzen der konstanten Bereiche von menschlichem IgM der leichten und schweren Kette bekannt sind, resultiert die Sequenzierung der variablen Bereiche eines IgM in einer vollständigen Charakterisierung.
Die verschiedenen Sequenzen sind in der Liste der Sequenzen dargestellt. Der menschliche monoklonale Antikörper BT34/A5 hat eine cDNA-Codiersequenz für die VH(u)-Kette von 363 Nucleotiden (SEQ ID NR: 1). Eine partielle Signalsequenz für VH(u) BT34/A5 von 30 Nucleotiden (SEQ ID NR: 2) wurde ebenfalls ermittelt. Diese cDNA-Codierungssequenzen zeigen, daß BT34/A5 VH(u) aus 121 Aminosäureresten (SEQ ID NR: 3) besteht und die partielle Signalsequenz aus 10 Aminosäureresten (SEQ ID NR: 4) besteht.
Die VL(λ)-Kette des menschlichen monoklonalen Antikörpers BT34/A5 hat eine cDNA-Codierungssequenz von 333 Nucleotiden (SEQ ID NR: 5), die für eine Proteinkette von 111 Aminosäureresten (SEQ ID NR: 6) codiert. Eine partielle Signalsequenz von 30 Nucleotiden (SEQ ID NR: 7), die für 10 Aminosäurereste (SEQ ID NR: 8) codiert, wurde ebenfalls ermittelt.
Die VL(K) -Kette des menschlichen monoklonalen Antikörpers BT32/A6 hat eine cDNA-Codierungssequenz von 339 Nucleotiden (SEQ ID NR: 9), die für eine Proteinkette von 113 Aminosäureresten (SEQ ID NR: 10) codiert. Eine Signalsequenz von 60 Nucleotiden (SEQ ID NR: 11), die für 20 Aminosäurereste (SEQ ID NR: 12) codiert, wurde ermittelt.
Die Sequenzen für die VH(u)-Kette des menschlichen monoklonalen Antikörpers BT32/A6 wurden nicht vollständig ermittelt, wobei nur eine partielle Sequenzierung in den FR1- und FR4-Bereichen erfolgte. Somit ist die partielle cDNA-Codierungssequenz für diese VH(u)-Kette 360 Nucleotide (SEQ ID NR: 13), die für eine Proteinkette von 120 Aminosäureresten (SEQ ID NR: 14) codiert.
Die anfängliche Analyse dieser Sequenzergebnisse zeigt mindestens für VH(u) von BT32/A6, daß die Antigen- Bindungsstelle wahrscheinlich in der CDR3-Region ist, das sind die Aminosäuren 92-114 von SEQ ID NR: 14.
Die hypervariablen oder die Komplementarität bestimmenden Bereiche bzw. Regionen (CDR) der hier charakterisierten V- Ketten sind von speziellem Interesse, da mindestens einige davon bei der Antigen-Bindung eine Rolle spielen. So umfaßt die Erfindung diejenigen Moleküle, die leichte und schwere variable Immunglobulinketten mit CDR aufweisen, die zu mindestens 90% homolog mit den hier charakterisierten CDR sind.
Somit hat die VH(u)-Kette des menschlichen monoklonalen Antikörpers BT34/A5 die folgenden die Komplementarität bestimmenden Bereiche oder Regionen (CDR):
CDR 1 SEQ ID NR: 15
CDR 2 SEQ ID NR: 16
CDR 3 SEQ ID NR: 17
Die VL(λ)-Kette des menschlichen monoklonalen Antikörpers BT34/A5 hat die folgenden CDR:
CDR 1 SEQ ID NR: 18
CDR 2 SEQ ID NR: 19
CDR 3 SEQ ID NR: 20
Die VH(λ)-Kette des menschlichen monoklonalen Antikörpers BT32/A6 hat die folgenden CDR:
CDR 1 SEQ ID NR: 21
CDR 2 SEQ ID NR: 22
CDR 3 SEQ ID NR: 23
Die VL(K)-Kette des menschlichen monoklonalen Antikörpers BT32/A6 hat die folgenden CDR:
CDR 1 SEQ ID NR: 24
CDR 2 SEQ ID NR: 25
CDR 3 SEQ ID NR: 26

Diskussion

Die hier angegebenen Daten zeigen, daß die Exprimierung des von dem menschlichen monoklonalen Antikörper BT32/A6 erkannten Antigens insofern ungewöhnlich ist, als anscheinend praktisch 100% von SK-MG-1-Zellen (gemäß der Bestimmung mit FCM) dieses Antigen exprimieren, und zwar ungeachtet ihrer Kulturdichte, ihrer Kulturlebensfähigkeit oder ihres Zellzykluszustands. Aufgrund der Ähnlichkeit des menschlichen monoklonalen Antikörpers BT34/A5 mit BT32/AE ist für die BT34/A5-Bindung ein gleichartiges Resultat zu erwarten. Der Grund dafür, daß diese Antigen-Erkennung so bedeutsam ist, ist der, daß bösartige Gliome gewöhnlich als heterogene Tumoren angesehen werden und es ungewöhnlich ist, einen gemeinsamen biologischen Faden zwischen sämtlichen Zellen in einem gegebenen Tumor zu finden. Tatsächlich ist Heterogenität ein gemeinsames Merkmal der meisten, wenn nicht aller Tumorgewebe; sie kann durch "normale" Mechanismen entstehen oder aus einer erhöhten genetischen Instabilität resultieren, die der Krebszelle eigen ist. Es ist vorgeschlagen worden, daß in der striktesten Bedeutung der Ausdruck "Tumor-Heterogenität" für Situationen reserviert sein sollte, bei denen Unterschiede im Zellklon vorhanden sind. Zellzykluseffekte und andere epigenetische Erscheinungen fügen dem Bild der Tumorzellen-Variabilität eine weitere Komplexitätsstufe hinzu.
Es existieren wenige tumorspezifische menschliche monoklonale Antikörper, die selbst in einer hochpassagierten Linie wie SK-MG-1 100% aller Tumorzellen erkennen. In einer exzellenten Studie unter Anwendung von computergestützter Zytofluorometrie berichten Stavrou et al., 1989, über zwei solche menschlichen monoklonalen Antikörper MUC 8-22 und MUC 2-63, die bis zu 100% von bestimmten gezüchteten Astrozytom- und Glioblastomlinien (z. B. 86HG-63, 86HG-39) erkennen, obwohl diese Beobachtungen selten sind. Die gleiche Gruppe von Autoren stellte fest, daß der Prozentsatz an Zellen, der Antikörper- Bindung zeigte, von einer Zellinie zur nächsten und selbst innerhalb einzelner Zellinien auf verschiedenen Passagestufen variierte.
Ein menschlicher monoklonaler Antikörper (CLN-IgG), der ein einem Gliom zugehöriges Antigen erkennt, dessen Oberflächen- Exprimierung durch den Zellzykluszustand beeinflußt wird, wurde von Kokunai et al., 1990, berichtet. Es wurde gezeigt, daß die Exprimierung des von CLN-IgG erkannten Antigens an der Oberfläche von Gliomzellen in der G&sub2;/M-Phase des Zellzyklus deutlich erhöht war, jedoch an Zellen in der G&sub0;/G&sub1;-Phase signifikant verringert war. Diese Feststellungen haben wichtige therapeutische Implikationen, da die meisten herkömmlichen Zusatztherapien (z. B. Strahlentherapie, Chemotherapie) gegen umlaufende Tumorzellen gerichtet sind, wogegen man glaubt, daß die Tumorstammzellen sich unter den mehr mitotisch bewegungslosen, nichtumlaufenden Zellpopulationen befinden. Wenn eine Tumor-Immuntherapie auf der Basis von monoklonalen Antikörpern erfolgreich sein soll, muß sie sowohl Tumorzellen, die mitotisch bewegungslos sind, als auch diejenigen, die sich aktiv teilen, als Ziel haben. Dieses Erfordernis bedeutet, daß der monoklonale Antikörper eher auf von der Abstammugslinie abhängige als auch vom Zellzyklus abhängige zum Tumor gehörige Antigene gerichtet werden muß.
Bisher gibt es nur einen weiteren Bericht über einen monoklonalen Antikörper, der auf ein zu einem Astrozytom gehöriges Antigen gerichtet ist und in einer vom Zellzyklus unabhängigen Weise exprimiert wird (Sarawar et al., 1991), wie durch die FCM-Analyse gezeigt ist. Dieser mit M2 bezeichnete spezielle monoklonale Antikörper ist ein Mäuse- MAb, der Antigen-Determinanten erkennt, die an einer großen Vielzahl von Tumoren des Zentralnervensystems exprimiert werden, umfassend: juvenile Astrozytome, Ependymoblasten, Medulloblastome, Meningiome und Oligodendrogliome. Es wurde ferner festgestellt, daß M2 mit Astrozyten in allen Bereichen des normalen Gehirns des menschlichen Erwachsenen sowie mit einer kleinen Zahl von Neuronen und mit fetalem Gehirn reagiert.
Daher erkennt der menschliche monoklonale Antikörper BT32/A6 ein vom Zellzyklus unabhängiges, zu einem Gliom gehörendes Antigen, das an 100% von lebensfähigen SK-MG-1-Zellen exprimiert wird, jedoch nicht an gezüchteten normalen menschlichen Astrozyten. Die Exprimierung des BT32/A6- Antigens wird von Zelldichte, Wachstumsrate oder Kulturlebensfähigkeit nicht beeinflußt. Diese Charakteristik macht den menschlichen monoklonalen Antikörper BT32/A6 und analog dazu andere menschliche monoklonale Antikörper, die auf die gleiche Weise erhalten sind, für die zusätzliche Immuntherapie bei der Behandlung von bösartigen Gliomen beim Menschen gut geeignet. Durch die Konstruktion von Immuntoxinen auf der Basis der Sequenzen des monoklonalen Antikörpers BT32/A6 im variablen Bereich sollte es möglich sein, sowohl proliferierende (S, G&sub2;/M) als auch nichtproliferierende (G&sub0;/G&sub1;) Gliomzellen in vivo zu treffen.

REFERENZEN

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Stavrou D., Bise K., Groeneveld J. et al. (1989): Antigenic heterogeneity of human brain tumors defined by monoclonal antibodies. Anticancer Res 9: 1489-1496.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: Michael D. Dan
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: MENSCHLICHE MONOKLONALE ANTIKÖRPER, DIE FÜR EIN VOM ZELLZYKLUS UNABHÄNGIGES GLIATUMOR-OBERFLÄCHENANTIGEN SPEZIFISCH SIND
(iii) ANZAHL SEQUENZEN: 26
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) EMPFÄNGER: Ridout & Maybee
(B) STRASSE: 2300 Richmond-Adelaide Centre 101 Richmond Street West
(C) Stadt: Toronto
(D) Staat: Ontario
(E) Land: Kanada
(F) Postleitzahl: M5H 2J7
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGERTYP: Diskette - 3,5 Inch, Speicherkapazität 1,4 Mb
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: MS-DOS 6,00
(D) SOFTWARE: ASCII Editor
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN: nicht anwendbar
(viii) ANWALT-/VERTRETER-INFORMATION:
(A) NAME: Lake, James R.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 31081
(C) REFERENZ-/REGISTERNUMMER: NOVOW/1C
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: (416) 868-1482
(B) TELEFAX: (416) 362-0823

(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR.: 1:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 363 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGE: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR.: 1:

(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR.: 2:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LANGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGE: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NO.: 2:

TTG GTG GCA GCA GCA ACA GGT GCC CAC TCC 30

(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR.: 3:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 121 AMINOSÄUREN
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr.: 3:

(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NO.: 4:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 4:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 5:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 333 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGE: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 5:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 6:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 111 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 6:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 7:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGE: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 7:

CTC CTC ACT CAC TGT GCA GGG TCC TGG GCC

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 8:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 8:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 9:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 339 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGE: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 9:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 10:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 113 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR.: 10:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 11:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 60 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGE: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 11:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 12:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) Stränge: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 12:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 13:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 360 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGE: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 13:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 14:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 120 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 14:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 15:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 15:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 16:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 16:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 17:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 17:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 18:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 18:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 19:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 19:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 20:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 20:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 21:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 21

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 22:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 22:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 23:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 23 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 23:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 24:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 24:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 25:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 25:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 26:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGE: nicht anwendbar
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 26:

Claims

1. Isolierte DNA, die für die variable Region der schweren Kette, Untergruppe u, (VH(u)) des menschlichen monoklonalen Antikörpers BT34/35 codiert und die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr.1 hat.

2. Isolierte DNA nach Anspruch 1, die ferner eine Nucleotidsignalsequenz aufweist, die von dem 5'-Ende der DNA ausgeht, wobei die Signalsequenz an ihrem 3'-Ende die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr.2 aufweist.

3. Isolierte DNA, die für die variable Region der leichten Kette, Untergruppe λ, (VL(λ)) des menschlichen monoklonalen Antikörpers BR34/35 codiert und die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr.5 hat.

4. Isolierte DNA nach Anspruch 3, die ferner eine Nucleotidsignalsequenz aufweist, die von dem 5'-Ende der DNA ausgeht, wobei die Signalsequenz an ihrem 3'-Ende die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr.7 hat.

5. Isolierte DNA-Sequenz, die für eine Aminosäuresequenz codiert, die eine Immunglobulin-VH(u)-Kette aufweist, wobei die Immunglobulin-VH(u)-Kette charakterisiert ist durch eine CDR3-Region, die eine Aminosäuresequenz hat, die die Aminosäuren 92-114 von SEQ ID Nr.14 aufweist; oder eine Sequenz, die wenigstens zu 90% homolog damit ist.

6. Isolierte DNA, die für eine variable Region einer leichten Antikörperkette, Untergruppe K(VL(K)) codiert, wobei die DNA die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr.9 aufweist.

7. Isolierte DNA nach Anspruch 6, die ferner eine Nucleotidsignalsequenz aufweist, die von dem 5'-Ende der DNA ausgeht, wobei die Signalsequenz die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr.11 hat.

8. Immunglobulin-VH(u)-Kette, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.3 hat.

9. V(H(u)-Kette nach Anspruch 8, die ferner eine Signalsequenz aufweist, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.4 an ihrem Carboxyl-Ende hat.

10. Immunglobulin-VH(u)-Kette, die die Komplementarität bestimmende Regionen (CDRs) mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr.15 (CDR1), SEQ ID Nr.16 (CDR2) und SEQ ID Nr.17 (CDR3) oder Sequenzen, die wenigstens zu 90% homolog damit sind, hat.

11. Immunglobulin-VL(λ))-Kette, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.6 hat.

12. VL(λ)-Kette nach Anspruch 11, die ferner eine Signalsequenz aufweist, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.8 an ihrem Carboxyl-Ende hat.

13. Immunglobulin-VL(λ)-Kette, die CDRs mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr.18 (CDR 1), SEQ ID Nr.19 (CDR 2) und SEQ ID Nr.20 (CDR 3) oder Sequenzen, die wenigstens zu 90% homolog damit sind, hat.

14. Immunglobulin, das VH(u)- und VL(λ)-Ketten hat, die die Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr.3 bzw. SEQ ID Nr.4 haben.

15. Immunglobulin nach Anspruch 14, das ein monoklonaler Antikörper ist.

16. Immunglobulin nach Anspruch 15 vom Isotyp M.

17. Immunkonjugat, das VH(u)-Ketten mit CDRs hat, die die Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr.15 (CDR1), SEQ ID Nr.16 (CDR2) und SEQ ID Nr.17 (CDR3) oder Sequenzen haben, die wenigstens zu 90% homolog damit sind, wobei das Immunkonjugat VL(λ)- Ketten mit CDRs hat, die die Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr.18 (CDR1), SEQ ID Nr.19 (CDR2) und SEQ ID Nr.20 (CDR3) oder Sequenzen, die wenigstens zu 90% homolog damit sind, haben.

18. Immunglobulinkonjugat nach Anspruch 17, das ein. Immunotoxin ist.

19. Immunglobulin-VH(u)-Kette, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.14 hat.

20. Immunglobulin-VH(u)-Kette, die CDRs mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr.21 (CDR1), SEQ ID Nr.22 (CDR2) und SEQ ID Nr.23 (CDR3) oder Sequenzen, die wenigstens zu 90% homolog damit sind, hat.

21. Immunglobulin-VL(K)-Kette, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.10 hat.

22. VL(K)-Kette nach Anspruch 21, die ferner eine Signalsequenz aufweist, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.12 hat.

23. Immunglobulin-VL(K)-Kette, die CDRs mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr.24 (CDR1), SEQ ID Nr.25 (CDR2) und SEQ ID Nr.26 (CDR3) oder Sequenzen, die wenigstens zu 90% homolog damit sind, hat.

24. Immunglobulin, das VH(u)-Ketten hat, die die Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr.14 bzw. SEQ ID Nr.10 haben.

25. Immunglobulin nach Anspruch 24, das ein monoklonaler Antikörper ist.

26. Immunglobulin nach Anspruch 25 vom Isotyp M.

27. Immunglobulin, das eine VH(u)-Kette hat, die eine CDR3- Region aufweist, die eine Aminosäuresequenz hat, die die Aminosäuren 92-114 von SEQ ID Nr.14 (CDR3) aufweist, und eine VL(K)-Kette hat, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.26 (CDR3) aufweist; oder Sequenzen, die wenigstens zu 90% homolog damit sind.

28. Immunglobulin, das eine VH(u)-Kette hat, die charakterisiert ist durch eine CDR3-Region, die eine Aminosäuresequenz hat, die die Aminosäuren 92-114 von SEQ ID Nr.14 (CDR3) aufweist, und eine VL(K)-Kette mit CDRs hat, die die Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr.24 (CDR1), SEQ ID Nr.25 (CDR2) und SEQ ID Nr.26 (CDR3)haben; oder Sequenzen, die wenigstens zu 90% homolog damit sind.

29. Immunkonjugat, das eine VH(u)-Kette mit CDRs hat, die Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr.21 (CDR1), SEQ ID Nr.22 (CDR2) und SEQ ID Nr.23 (CDR3) oder Sequenzen, die wenigstens zu 90% homolog damit sind, haben, wobei das Immunkonjugat VL(K)- Ketten mit CDRs hat, die die Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr.24 (CDR1), SEQ ID Nr.25 (CDR2) und SEQ ID Nr.26 (CDR3) oder Sequenzen, die wenigstens zu 90% homolog damit sind, haben.

30. Immunkonjugat nach Anspruch 29, das ein Immunotoxin ist.

31. Isolierte DNA-Sequenz, die für eine Aminosäuresequenz codiert, die eine Immunglobulin-VH(u)-Kette gemäß den Ansprüchen 19 oder 20 aufweist.

32. Isolierte DNA nach Anspruch 31, die die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr.13 aufweist.

33. Isolierte DNA, die für eine Immunglobulin-VL(K)-Kette gemäß Anspruch 21 codiert.

34. Immunglobulin-VH(u)-Kette, die charakterisiert isst durch eine CDR3-Region, die eine Aminosäuresequenz hat, die die Aminosäuren 92-114 von SEQ ID Nr. 14 aufweist; oder Sequenzen, die wenigstens 90% homolog damit sind.

35. Immunkonjugat, das eine VH(u)-Kette hat, die eine CDR3- Region mit einer Aminosäuresequenz hat, die die Aminosäuren 92-114 von SEQ ID Nr.14 (CDR3) aufweist, und eine VL(K)-Kette hat, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.26 (CDR3) aufweist; oder Sequenzen, die wenigstens zu 90% homolog damit sind.

36. Immunkonjugat nach Anspruch 35, das ein Immunotoxin ist.