DE69434578T2

DE69434578T2 - Expressionsvektoren die für bispezifische Proteine kodieren, und Verfahren zur Herstellung von biologisch-aktiven bispezifischen Fusionsproteinen in Zellen von Säugetieren

Info

Publication number: DE69434578T2
Application number: DE69434578T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey A. Ledbetter; Lisa K. Gilliland; Martha S. Hayden; Peter S. Linsley; Jurgen Bajorath; Perry H. Fell
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1993-02-01
Filing date: 1994-01-31
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2014-02-01
Also published as: EP1746162A3; EP0610046A2; ATE313633T1; US6623940B1; JPH06319548A; JP2006241165A; EP0610046B1; JP4121161B2; JP4171498B2; CA2114353C; US7915395B2; US5637481A; EP0610046A3; EP1746162A2; DK0610046T3; CA2114353A1; US6132992A; US20030219876A1; ES2255050T3; DE69434578D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Expressionsvektoren, die bispezifische Fusionsproteine exprimieren, und Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteins in einer Säugetierzelle.
Hintergrund der Erfindung
Aufgrund der Probleme bei der traditionellen Antikörpertechnologie, z. B. der Gewinnung von Antikörpern aus Serum oder durch Hybridomtechnologie, wird Gentechnik immer öfter verwendet, um Antikörper oder von Antikörpern abgeleitete Moleküle (z. B. bispezifische Fusionsproteine) mit einem gewünschten Satz von Bindungseigenschaften und Effektorfunktionen zu entwerfen, zu manipulieren und herzustellen.
Schwierigkeiten bei der Herstellung stabiler Hybridome, die menschlichen Antikörper herstellen, haben zu der Entwicklung alternativer Technologien geführt, die entworfen wurden, um die in vivo-Antiköperproduktion und herkömmliche in vitro-Techniken zu umgehen (Mayforth R.D., Quintans, J. (1990) Current Concepts: Designer and catalytic antibodies. New Eng. J. Med. 323 : 173-178; Waldmann, T.A. (1991) Monoclonal antibodies in diagnosis and therapy. Science 252 : 1657-1662; Winter, G., Milstein, C. (1991) Man-made Antibodies. Nature 349 293-299, Morrison, S.L. (1992) In Vitro antibodies: strategies for production and application. Ann. Rev. Immunol. 10 : 239-266).
Die ersten Versuche, die Bindungsspezifitäten zweier ganzer Antikörper gegen verschiedene Zielantigene zu therapeutischen Zwecken zu koppeln, verwendeten chemisch konjugierte "Heterokonjugat"-Moleküle (Staerz, U.D., Kanagawa, O., Bevan, M.J. (1985) Hybrid antibodies can target sites for attack by T cells. Nature 314 : 628-631; Perez, P., Hoffman, R.W., Shaw, S., Bluestone, J.A., Segal, D.M. (1985) Specific targeting of cytotoxic T cells by anti-T3 linked to anti-target antibody. Nature 316 : 354-356; Liu, M.A., Kranz, D.M., Kurnick, J.T., Boyle, L.A., Levy, R., Eisen, H.N. (1985) Heteroantibody duplexes target cells for lysis by cytotoxic T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 8648-8652; Jung, G., Ledbetter, J.A., Muller-Eberhard, H.J. (1987) Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 : 4611-4615; Emmrich, F., Rieber, P., Kurrie, R., Eichmann, K. (1988) Selective stimulation of human T lymphocyte subsets by heteroconjugates of antibodies to the T cell receptor and to subset-specific differentiation antigens. Eur. J. Immunol. 18 : 645-648; Ledbetter, J.A., June, C.H., Rabinovitch, P.S., Grossmann, A., Tsu, T.T., Imboden, J.B. (1988) Signal transduction through CD4 proximity to the CD3/T cell receptor. Eur. J. Immunol., 18 : 525-532).
Diese Versuche zeigten, dass gegen den CD3-Rezeptor auf der Oberfläche von menschlichen oder murinen T-Zellen gerichtete Antikörper, chemisch verknüpft mit Antikörpern gegen Zielzellen, die Lysis der Zielzellen durch cytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) auslösen und somit die Begrenzung der CTLs durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC) überwinden.
Durch Heterohybridomtechniken wurden bispezifische Antikörper aus hybriden Hybridomen hergestellt, und es wurde gezeigt, dass ihre in vitro-Eigenschaften denen von Heterokonjugaten ähnlich sind (Milstein, C., Cuello, A.C. (1983) Hybrid hybridomas and their use in immunohistochemistry. Nature 305 : 537-540; Staerz, U.D., Bevan, M.J. (1986) Hybrid hybridoma producing a bispecific monoclonal antibody that can focus effector cell activity. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 83 : 1453-1457; Clark, M.R., Waldmann, H. (1987) T-cell killing of target cells induced by hybrid antibodies: comparison of two bispecific monoclonal antibodies. J. Natl. Cancer Inst. 79 : 1393-1401; Lanzavecchia, A., Scheidegger, D. (1987) The use of hybrid hybridomas to target cytotoxic T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 17 : 105-111; Gilliland, L.K., Clark, M.R., Waldmann, H. (1988) Universal bispecific antibody for targeting tumor cells for destruction by cytotoxic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 7719-7723). Solche Antikörper wurden jedoch durch Zellfusionen hergestellt.
Trotz der mit ihnen erhaltenen vielversprechenden Resultate machten mehrere Faktoren Heterokonjugate oder bispezifische Antikörper aus Zellfusionen für therapeutische Anwendungen im großen Maßstab untauglich. Zu solchen Faktoren gehören (1) schnelle Clearance großer Heterokonjugate in vivo, (2) die arbeitsintensiven Techniken, die erforderlich sind, um diese Arten von Molekülen herzustellen, (3) die Notwendigkeit für ausgedehnte Reinigungsschritte zur Abtrennung von Homokonjugaten und monospezifischen Antikörpern, und (4) geringe Ausbeuten.
Im Allgemeinen umfassen Verfahren im Zusammenhang mit der Verwendung von Heterokonjugaten oder bispezifischen Antikörpern Co-Expressionsansätze mit zwei verschiedenen Spezifitäten, in denen die Sequenzen, die die schwere (heavy, H) und/oder leichte (L) Immunglobulinkette codieren, nicht verbunden sind, und leiden daher unter dem Problem der zufälligen H-L-Assoziation und/oder zufälliger (HL)-(HL)-Assoziation, was nur einen geringen Anteil korrekten Produkts und komplizierte Reinigungsvorgänge ergibt. Die Reinigung kann aufwendig und die Charakterisierung schwierig werden, wenn es eine übermäßige Anzahl monospezifischer oder unspezifischer Proteinmoleküle gibt.
Im Bemühen, diese Probleme zu überwinden, wurde Gentechnik verwendet, um bispezifische Antikörper oder bifunktionale Einzelketten-Antikörper in vitro zu erzeugen (Haber et al., 1990; Wels, W., Harwerth, I.M., Zwickl, M., Hardman, N., Groner B., Hynes, N.E. (1992) Construction, bacterial expression and characterization of a bifunctional single-chain antibody phosphatase fusion protein targeted to the human ERBB-2 receptor. Biotechnology 10 : 1128-1132; A. Traunecker et al. (1991) EMBO Journal 10(12) : 3655-3659). Jedoch waren solche Versuche nicht vielversprechend.
Bispezifische Antikörper oder bifunktionale Einzelketten-Antikörper wurden in einem bakteriellen System gebildet. Jedoch wurden solche Fusionsproteine in inaktiver Form gebildet (Haber et al., 1990). Überdies zeigen die so hergestellten Fusionsproteine verringerte Bin dungsaffinitäten und/oder -aviditäten oder machen komplizierte Isolations- und Reinigungsverfahren erforderlich, um die gewünschten Produkte zu gewinnen (Haber et al., 1990; Wels et al., 1992a).
Es wurden Expressionsvektoren konstruiert, die einen Einzelketten-Antikörper codieren, der a) über einen Asp-Pro-Linker an das FB-Fragment des Proteins A aus Staphylococcus (WO88/09344) oder b) über ein natürliches Antikörpergelenk mit anderen Bindungsdomänen verbunden ist (Huston et al., 1991, Methods in Enzymol., 203: 46-98). Jedoch werden die von diesen Vektoren codierten bispezifischen Proteine nicht in biologisch aktiver Form gebildet.
Monovalente Einzelketten-Antikörper und bifunktionale Einzelketten-Antikörper wurden exprimiert (Wels, 1992b). Die Antikörpermoleküle wurden genetisch modifiziert, um ihre Größe zu verringern und ihre funktionale Modifikation zu ermöglichen. Außerdem ist der bifunktionale Antikörper nur darin bifunktional, dass das Gen für die bakterielle Alkalische Phosphatase auf der 3'-Seite an das scFv-Gen angefügt wurde. Diese bifunktionalen Antikörper umfassen eine einzelne bindende Domäne (z. B. V_L + V_H), und das Gen für Alkalische Phosphatase wurde lediglich als Marker verwendet, um den an sein Ziel gebundenen Antikörper zu detektieren. Weitere Fusionsproteine, die an ein einzelnes Ziel binden, wurden konstruiert. Zum Beispiel offenbart EP0439095 die Konstruktion eines Expressionsvektors, der die V_H-Region eines Antikörpers, über eine Antikörper-Gelenkregion mit einem biologisch aktiven Liganden wie einem Lymphokin verbunden, enthält. WO92/00092 offenbart einen Expressionsvektor, der eine extrazelluläre B7- oder CD28-Domäne, mit den CH2- und CH3-Gelenkregionen menschlichen IgGs verbunden, codiert.
Janusinmoleküle, die Sequenzen aus FvCD3 und CD4 enthalten, wurden exprimiert (A. Traunecker et al. „Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells, EMBO Journal 10(12) : 3655-3659). Das Janusinkonstrukt enthält einen Teil des CD4-Moleküls im aminoterminalen Bereich des Konstrukts und die Bindungsdomäne (d. h. V_L + V_H) von CD3 im carboxyterminalen Bereich des Konstrukts. Janusinmoleküle umfassen keine helikalen Peptidlinker, die die variablen Regionen von CD3 von den Teilen des CD4-Moleküls trennen. Überdies werden Janusinmoleküle manchmal in multimerer oder aggregierter Form gefunden. Zur Verhinderung der Aggregatbildung ist manchmal ein zusätzlicher Reinigungsschritt erforderlich.
In Anbetracht der oben bezeichneten Probleme betreffend die Herstellung von Antikörpern besteht ein Bedürfnis nach der vorliegenden Erfindung. Gegenwärtig existiert ein ungelöstes Problem im Bereich der Antikörpertechnologie, nämlich die Schwierigkeit, große Mengen spezifischer Antikörper zu erhalten. Historisch wurden Antikörper aus Seren oder Hybridomen murinen Ursprungs gewonnen. Jedoch waren die Seren oft von begrenzter Quantität und schwankender Qualität. Überdies hatten Antikörper murinen Ursprungs begrenzten Nutzen zur Behandlung von Menschen, da sie dazu neigen, eine Immunreaktion auszulösen, die auf nichtmurine Organismen mitunter schädlich wirken kann.
Um die Probleme zu lösen, die allgemein mit der Herstellung substanzieller Mengen funktionaler Proteinmoleküle verbunden sind und insbesondere die Antikörpertechnologie heimsuchen, wird hier ein neuer Expressionsvektor beschrieben, der die Expression biologisch aktiver Fusionsproteine erleichtert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen Expressionsvektor bereit, der ein monospezifisches oder bispezifisches Fusionsprotein codiert.
Der Vektor umfasst eine rekombinante, bispezifische Einzelkettenkassette, umfassend eine DNA-Sequenz, die eine erste Bindungsdomäne codiert, welche ein Ziel zu binden vermag, und eine DNA-Sequenz, die eine zweite Bindungsdomäne codiert, welche ein Ziel zu binden vermag, wobei jede Domäne ein unterschiedliches Ziel zu binden vermag. Ein Linker, der ein hydrophiles helikales Peptid codiert, verbindet die DNA-Sequenz, die die erste Bindungsdomäne codiert, und die DNA-Sequenz der zweiten Bindungsdomäne.
Die erste Domäne bindet Moleküle ausgewählt unter CD1, CD2, CD3, TcR, CD3/TcR, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CDw32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a,b, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49, CDw50, CD51, CDw52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62, CD63, CD64, CDw65, CD66, CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CD76, CDw78, B7, B7(2), CTLA4, BR96, GP39, L6, LFA-3, ICAM-2, und Interleukin (IL) 1-8. Die zweite Bindungsdomäne bindet an Moleküle, ausgewählt unter CD1, CD2, CD3, TcR, CD3/TcR, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CDw32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a,b, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49, CDw50, CD51, CDw52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62, CD63, CD64, CDw65, CD66, CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CD76, CDw78, B7, B7(2), CTLA4, BR96, GP39, LFA-3, L6, ICAM-2, und Interleukin (IL) 1-8. Der Linker umfasst eine DNA-Sequenz, die hydrophile Aminosäuren und mindestens ein Pentamer EEAKK codiert.
Das helikale Linker-Peptid umfasst vorzugsweise SEQ ID NO:12.
Der Expressionsvektor umfasst vorzugsweise weiterhin eine DNA-Sequenz, die einen molekularen Marker codiert.
Die erste Bindungsdomäne bindet vorzugsweise an ein beliebiges der Moleküle CD3, TcR, CD3/TcR, L6, CD28, CD40, B7, B7(2), CTLA4, oder GP39, und die zweite Bindungsdomäne bindet vorzugsweise an eines der Moleküle CD3, TcR, CD3/TcR, L6, CD28, CD40, B7, B7(2), CTLA4, GP39. Vorzugsweise ist die erste Bindungsdomäne mit CD3, TcR, CD3/TcR, CD28 oder CTLA4 reaktiv, und die zweite mit L6.
Die erste und/oder die zweite Bindungsdomäne kann wenigstens ein Teil eines Zelloberflächenantigens sein. Vorzugsweise ist das Zelloberflächenantigen CD3, L6, CD28 oder B7. Vorzugsweise ist die erste Bindungsdomäne wenigstens ein Teil des B7-Moleküls und die zweite mit L6 reaktiv.
Die erste und/oder die zweite Bindungsdomäne können eine oder mehrere variable Regionen eines Antikörpers darstellen.
Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Expressionsvektor ist der als CC9-2 (ATCC Nr. 69235) bezeichnete Expressionsvektor.
Die Erfindung betrifft auch eine in vitro mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transfizierte eukaryontische Zelle. Die Erfindung stellt weiterhin eine eukaryontische Zelle bereit, die durch einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor in vivo transfiziert ist, wobei die eukaryontische Zelle ausgewählt ist unter Schafszellen, Schweinezellen, Mäusezellen oder Rinderzellen. Es wird weiterhin ein Verfahren bereitgestellt, um ein biologisch aktives bispezifisches Fusionsprotein herzustellen, das eine Kultivierung dieser eukaryontischen Zellen zur Proteinbildung und Gewinnung des so gebildeten Proteins umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteins in einer Säurezelle bereit. Dieses Verfahren umfasst: (a) Transfektion der Säugerzelle mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektor; (b) Kultur der in Schritt (a) transfizierten Säugerzelle; und (c) Gewinnung des von der in Kultur gehaltenen Säugerzelle produzierten biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteins. Vorzugsweise umfasst die Gewinnung des biologisch aktiven bispezifischen Proteins: (a) Identifikation des biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteins anhand der Gegenwart des molekularen Markers; und (b) Abtrennung des biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteins, das den molekularen Marker besitzt und solchermaßen identifiziert wird, von Molekülen, denen der molekulare Marker fehlt, so dass das biologisch aktive bispezifische Fusionsprotein, das von der in Kultur gehaltenen Säugerzelle gebildet wird, gewonnen wird.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist ein Diagramm des pCDM8-Expressionsvektors einschließlich der rekombinanten monospezifischen Einzelkettenkassette einschließlich verschiedener molekularer Marker oder eines einfachen Stopcodons.
2A ist ein Diagramm des pCDM8-Expressionsvektors enthaltend die rekombinante bispezifische Einzelkettenkassette.
2B ist eine Photographie eines Western Blot des Einzelketten-Anti-L6-, -Anti-CD3-, und des bispezifischen Anti-CD3-L6-Fusionsproteinmoleküls. Serumfreies verbrauchtes Kulturmedium von transfizierten COS-Zellen wurde geerntet und durch Affinitätschromatographie mit Protein A gereinigt. Das Protein wurde in Probenpuffer aufgenommen und unter nichtreduzierenden (A) oder reduzierenden (B) Elektrophoresebedingungen auf einem SDS-PAGE-Gradientengel (5 %-16 %) unterworfen, dann auf Nitrocellulose übertragen und mit anti menschlichem IgG, mit Alkalischer Phosphatase konjugiert, detektiert. Feld A: Spur 1 = chimärer L6-mAb (0,5 μg); Spur 2 = Anti-L6 WTD (0,5 μg); Spur 3 = CD3-L6FvIg bispezifisch (0,5 μg); Spur 4 = L6FvIg (0,6 μg); und Spur 5 = CD3Fv-Ig (0,4 μg). Feld B: Spur 1 = CD3Fv-Ig (0,4 μg); Spur 2 = L6FvIg (0,6 μg); Spur 3 = CD3-L6FvIg bispezifisch (0,5 μg); Spur 4 = Anti-L6 WTD (0,5 μg); und Spur 5 = L6 chimäre mAb (0,5 μg).
3 zeigt cytometrische Messungen, die die Bindung von L6FvIg, CD3FvIg, CD3-L6FvIg und BR96 an Zielantigen exprimierende Zellen darstellen.
4A zeigt Fusionen zwischen L6Fv und verschiedenen von der menschlichen IgG1-Fc-Domäne abgeleiteten Mutanten. Es sind jede Mutante und die in der Gelenkregion und/oder der CH2-Domäne eingeführten Sequenzänderungen bezeichnet. Weiterhin ist für jedes Konstrukt seine Fähigkeit, CDC und ADCC zu vermitteln, angezeigt.
4B ist ein Liniendiagramm der Sättigungsanalyse der L6-Derivate oder chimären L6-Moleküle, die in fortschreitend geringeren Konzentrationen (dreifache Verdünnungsreihen) mit H2981-Tumorzellen inkubiert wurden, wobei die Bindung mit FITC-konjugierten antiidiotypischen Antikörper gegen L6 als Zweitantikörper bestimmt wurde. Aus diesen Daten wurden die Sättigungs-Bindungskurven berechnet, und die Fluoreszenzintensität wurde als Funktion der Antikörperkonzentration aufgetragen. Legende: chimäres L6 (offene Raute), WTD (offenes Quadrat), DM1 (offenes Dreieck), HS1 (Pluszeichen), HS2 (Andreaskreuz), und HS3 (offener Kreis).
4C ist ein Liniendiagramm der Inhibitionsanalyse von H2981-Tumorzellen, die mit Verdünnungsreihen jedes Antikörperderivats 30 Minuten lang inkubiert wurden, gefolgt von 30 Minuten Inkubation mit FITC-konjugiertem L6 (1 μg/ml), bevor eine cytometrische Messung durchgeführt wurde. Die Fluoreszenzintensität wurde als Funktion der Antikörperkonzentration für jedes Molekül aufgetragen. Legende: chimäres L6 (offene Raute), WTD (offenes Quadrat), DM1 (offenes Dreieck), HS1 (Pluszeichen), HS2 (Andreaskreuz) und HS3 (offener Kreis).
4D ist ein Liniendiagramm, das die Resultate zeigt, die erhalten wurden, als H2981-Tumorzellen 2 Stunden lang mit ⁵¹Cr markiert wurden, dann gewaschen und IMDM/10%FBS zugesetzt wurden, das 10fache Verdünnungsreihen der Antikörperderivate und Leukozyten aus peripherem menschlichem Blut als Effektorzellen enthielt, wobei das Verhältnis von Effektor-zu Zielzellen 100 : 1 betrug. Die Ansätze wurden 4,5 Stunden lang inkubiert, dann zentrifugiert, und 100 μl wurden mit einem γ-Zähler auf freigesetzte Radioaktivität untersucht. Der Prozentsatz der Abtötung wurde gemäß der folgenden Formel berechnet: % Abtötung = (Messwert minus Spontanfreisetzung) durch (Maximalfreisetzung minus Spontanfreisetzung) × 100, wobei als Messwerte für Maximalfreisetzung und Spontanfreisetzung jeweils die entsprechenden Durchschnittswerte eingesetzt wurden. Die Werte stellen die Mittelwerte dreifacher Kulturen dar (SEM < 10 %).
Die 5A-D sind Liniendiagramme, die zeigen, dass CD3FvIg in T-Zellen aus peripherem Blut intrazelluläres Calcium mobilisiert, und das eine Vorbehandlung mit CD3FvIg die Reaktion von T-Zellen aus peripherem Blut auf nachfolgende Stimulation durch CD2-Quervernetzung herabsetzt.
6 ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass das bispezifische Molekül CD3-L6Ig Adhäsion zwischen H2981- und Jurkat-Zellen vermittelt und somit im Stande ist, gleichzeitig an CD3- und L6-exprimierende Zellen zu binden.
7 ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass die bispezifischen Fusionsproteine CD3-L6FvIg die Cytotoxizität von T-Zellen auf H2981-Tumorzellen hin dirigieren.
8 ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass das bispezifische CD3-L6FvIg-Protein ein hohes Maß der T-Zell-Proliferation auslöst, wenn es an H2981-Tumorzellen gebunden ist.
9 ist ein Schemadiagramm, das die Modifikation des Expressionsvektors pCDM8 zur Expression der monospezifischen variablen Antikörperregionen in Form von Fusionsprotei nen mit der Fc-Domäne aus menschlichem IgG1 zeigt.
10A ist ein Diagramm der Struktur der L6Fv-Ig-Derivate, wobei die Linkersequenzen durch schwarze Linien und alle funktionalen Domänen durch schattierte Umrahmungen bezeichnet sind.
10B ist ein Vergleich der Fc-Konstrukte von chimärem L6, WTD, DM1, HS1, HS2 und HS3 einschließlich ihrer Sequenzen und ihrer ADCC- oder CDC-Aktivität. L6Fv wurde mit verschiedenen mutierten Derivaten der Fc-Domäne aus menschlichem IgG1 fusioniert. Die in der Gelenkregion und/oder der CH2-Domäne eingeführten Sequenzänderungen sind durch die unterstrichenen Aminosäurereste bezeichnet, wobei der Name des Konstrukts auf der linken Seite aufgeführt ist.
10C ist ein Liniendiagramm der ADCC-Charakteristika von H2981-Tumorzellen, die 2 Stunden lang mit ⁵¹Cr markiert, dann gewaschen und IMDM/10%FBS zugesetzt wurden, das 10fache Verdünnungsreihen der Antikörperderivate und Leukozyten aus peripherem menschlichem Blut als Effektorzellen enthielt, wobei das Verhältnis von Effektor- zu Zielzellen 100 : 1 betrug. Die Ansätze wurden 4,5 Stunden lang inkubiert, dann zentrifugiert, und 100 μl wurden mit einem γ-Zähler auf freigesetzte Radioaktivität untersucht. Der Prozentsatz der Abtötung wurde gemäß der folgenden Formel berechnet: % Abtötung = Messwert minus Spontanfreisetzung durch Maximalfreisetzung minus Spontanfreisetzung × 100, wobei als Messwert Maximalfreisetzung und Spontanfreisetzung jeweils die entsprechenden Durchschnittswerte eingesetzt wurden. Die Werte stellen die Mittelwerte dreifacher Kulturen dar (SEM < 10 %). Legende: chimäres L6 (offene Raute), WTD (offenes Quadrat), DM1 (offenes Dreieck), HS1 (Pluszeichen), HS2 (Andreaskreuz) und HS3 (offener Kreis).
10D ist ein Liniendiagramm eines Assays ähnlich wie in 10C, das durchgeführt wurde, um komplementvermittelte Abtötung zu messen, wobei Komplement anstelle von peripheren Blutlymphozyten verwendet wurde. Legende: chimäres L6 (offene Raute), WTD (offenes Quadrat), DM1 (offenes Dreieck), HS1 (Pluszeichen), HS2 (Andreaskreuz) und HS3 (offener Kreis).
11 zeigt die Aminosäurensequenzen und Nukleotidsequenzen des L6V_L-Leaders, von CD3 F_V(V_L-V_H) sowie des helikalen Linkers Fvlink.
12 (A/B) sind PAGE-Gele, die zeigen, dass CD3FvIg eine starke Tyrosinphosphorylierung und Aktivierung von PLCγ1 in T-Zellen auslöst und die Assoziation von PLCγ1 mit pp35/36 befördert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Im Sprachgebrauch der vorliegenden Erfindung haben die folgenden Worte oder Ausdrücke die nachfolgend spezifizierten Bedeutungen.
Ein „bispezifisches Fusionsprotein" bedeutet hier jedes immunologisch reaktive Molekül, das mindestens zwei verschiedene Ziele zur gleichen Zeit oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten spezifisch erkennt und bindet, und das als einzelne Kette exprimiert wird.
Ein „monospezifisches Fusionsprotein" bezeichnet hier jedes immunologisch reaktive Molekül, das ein Ziel spezifisch erkennt und bindet und ein Komplex ist, der zwei schwere Immunglobulinketten, zwei leichte Immunglobulinketten, eine schwere und/oder leichte Immunglobulinkette und/oder irgend einen Teil davon umfasst, und das als einzelne Kette exprimiert wird.
Ein „Expressionsvektor" bezeichnet hier ein Nukleinsäuremolekül, umfassend (1) einen Promotor und andere Sequenzen (z. B. Leader-Sequenzen), die benötigt werden, um die Expression eines gewünschten Gens oder einer gewünschten DNA-Sequenz zu steuern, und (2) das gewünschte Gen bzw. die gewünschte DNA-Sequenz. Optional kann das Nukleinsäuremolekül eine Polyadenylatsignalsequenz enthalten, um die Stabilität des Gentranskripts zu erhöhen, und/oder eine Enhancer-Sequenz, um die Transkription des Gens zu steigern und dadurch die Expression des Gens zu beeinflussen.
Eine „Bindungsdomäne" bezeichnet hier eine Bindungsstelle, die die gesamte Bindungsfläche eines Ziels oder irgendeinen Teil davon erkennt und bindet. Hierzu gehören beispielsweise, ohne darauf begrenzt zu sein, (1) eine einzelne variable Region eines Antikörpers (V_L oder V_H); (2) zwei oder mehr variable Regionen (z. B. V_L + V_H; V_L + V_L; oder V_H + V_H) oder die komplementätsbestimmende Region (complementary determining region, CDR) davon, oder (3) ein Antigen (wie zum Beispiel ein Leukozytenantigen) oder ein Teil davon.
Ein „molekularer Marker" schließt hier jede DNA-Sequenz ein, die ein Molekül codiert, das die Detektion und Reinigung der hier beschriebenen Fusionsproteine erleichtern kann.
Eine „bispezifische Einzelkettenkassette" umfasst hier eine DNA-Sequenz, codierend eine erste Domäne, die im Stande ist, ein Ziel zu binden, und eine DNA-Sequenz, codierend eine zweite Bindungsdomäne, die im Stande ist, ein Ziel zu binden, wobei jede Domäne fähig ist, zu verschiedenen Zeiten oder zur gleichen Zeit ein anderes Ziel zu binden, und beide Domänen von auf der gleichen Kassette lokalisierten DNA-Sequenzen codiert werden. Die erste und/oder zweite Bindungsdomäne können zwei variable Regionen sein (V_L + V_H, V_H + V_L, V_L + V_L oder V_H + V_H) oder eine einzelne variable Region (V_L oder V_H). Alternativ kann die erste und/oder zweite Bindungsdomäne ein Antigen oder Teil davon sein. Geeignete Beispiele für Antigene umfassen die Leukozytenantigene, ohne darauf begrenzt zu sein. Die erste Bindungsdomäne ist am oder nahe dem Aminoterminus des exprimierten Proteins gelegen, während die zweite Bindungsdomäne am oder nahe dem Carboxyterminus des exprimierten Proteins gelegen ist (entsprechend dem 5'- bzw. 3'-Ende der DNA-Sequenzen der bispezifischen Einzelketten-DNA-Kassette).
Eine „Einzelkettenkassette" bezeichnet hier eine Sequenz, die Proteine codiert, die im Stande sind, wenigstens einen Teil des Ziels zu erkennen und zu binden. Solche Proteine können zum Erkennen und zur Bindung mehrerer Ziele mehrfache Bindungsstellen haben.
Zu einem vollständigeren Verständnis der hier beschriebenen Erfindung wird die nachfolgende Beschreibung gegeben.
A. Vektoren
Der hier beschriebene Expressionsvektor kann modifiziert werden, indem man bestimmte DNA-Sequenzen, die Bindungsproteine codieren (d. h. die dafür codierenden Sequenzen), oder regulatorische Sequenzen, d. h. einen Promotor oder andere für die Expression des gewünschten Gens notwendige Sequenzen (z. B. Leader-Sequenzen) innerhalb des Expressionsplasmids vollständig oder teilweise austauscht.
Die in dem modifizierten Expressionsvektor ersetzte DNA-Sequenz kann eine beliebige variable Region irgendeines Antikörpers oder anderen Rezeptors codieren. Zum Beispiel kann die DNA-Sequenz die variable Region oder Regionen eines Antikörpers codieren, der das BR96-Antigen, CD3, L6, CD28, CTLA4 oder B7 erkennt und bindet. Weiterhin kann die DNA-Sequenz variable Regionen codieren, die fähig sind, andere Zelloberflächenantigene zu binden. Alternativ können die Bindungsdomänen ein gesamtes Antigen oder Teile eines Antigens wie des Leukozytenantigens codieren. Beim Einsetzen einer bestimmten Ersatzsequenz ist hierbei zu berücksichtigen, dass die Ersatzsequenz „im Leseraster" positioniert ist, so dass die gewünschte Bindungsdomäne exprimiert werden kann.
Die so ersetzten Sequenzen können unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) kloniert werden. PCR kann verwendet werden, um eine Vielfalt von DNA-Sequenzen herzustellen, die in den Expressionsvektor eingefügt werden können, der seinerseits in eine eukaryontische Zelle transformiert werden und dadurch die DNA-Sequenz exprimieren kann. Andere Klonierungsmethoden, die eine Vervielfältigung spezifischer Sequenzen erreichen, z. B. die Ligasekettenreaktion (LCR), können ebenfalls verwendet werden.
Der Promotor des Expressionsvektors kann leicht durch andere Promotoren ersetzt werden, abhängig vom Typ der zur Expression verwendeten Zellen oder der einzufügenden DNA-Sequenz. Zu geeigneten Beispielen für Promotoren gehören der Cytomegalievirus (CMV)-Promotor, der Vogelmyeloblastosevirus (AMV)-Promotor und der Moloney-Mäuseleukämie-Virus (MMLV)-Promotor.
In ihrer nativen, monomeren Form sind Antikörper vierkettige Makromoleküle, die zwei identische schwere Ketten und zwei identische leichte Ketten pro Molekül enthalten. Jede Kette besteht aus einer variablen Region (V) und einer konstanten Region (C). Die variable Region der leichten Kette (V_L) wird von den Genen der variablen (V) plus denen der Verbindungs (J)-Region codiert; die variable Region der schweren Kette (V_H) wird von den Genen der variablen (V) und denen der Verbindungs (J)-Region mit einer dazwischengeschalteten Diversitätsregion (D) codiert. Jedes Fragment einer variablen Region (V_L oder V_H), das von V_L + J_L oder von V_H + D_H + J_H-Sequenzen codiert wird, besteht aus ungefähr 100 Aminosäuren. Innerhalb von diesen Sequenzen sind drei hypervariable Regionen enthalten, die als komplementaritätsbestimmende Regionen (complementary determining regions, CDRs) bezeichnet werden und die Aminosäuren zu enthalten scheinen, die die Bindungsstelle des Antikörpers auskleiden. Die CDRs sind zwischen vier Regionen erheblich geringerer Variabilität, die als Rahmenregion (framework regions, FR) bezeichnet werden, eingefügt.
Die antigenbindende Tasche des Antikörpers wird typischerweise durch die Assoziation von Polypeptiden der V_L- und V_H-Region zu ihren β-Faltblatt-Konformationen gebildet, wobei die CDR-Regionen auf den Schleifen zwischen den Strängen oder in ihrer Nähe liegen. Mitunter können die V_L + V_L-Paare oder V_H + V_H-Paare (z. B. G17-2-Leichtkettenmonomere) oder V_L oder V_H alleine das Antigen binden.
Somit umfasst die „Bindungsdomäne" eines oder eine Kombination der folgenden: (a) eine V_L plus V_H-Region eines Immunglobulins (IgG, IgM oder anderen Immunglobulins), (b) eine V_L plus V_L-Region eines Immunglobulins (IgG, IgM oder anderen Immunglobulins), (c) eine V_H plus V_H-Region eines Immunglobulins (IgG, IgM oder anderen Immunglobulins), (d) eine einzelne V_L-Region eines Immunglobulins (IgG, IgM oder anderen Immunglobulins), oder (e) eine einzelne V_H-Region eines Immunglobulins (IgG, IgM oder anderen Immunglobulins).
Erfindungsgemäße Vektoren sind nicht begrenzt auf Vektoren, die Antikörpersequenzen umfassen. Sequenzen, die Bindungsdomänen anderer Proteinarten wie Antigenen und Rezeptoren enthalten, können ebenfalls verwendet werden. Somit codieren die Vektoren bispezifische Fusionsproteine, die zu unterschiedlichen oder im Wesentlichen gleichen Zeiten an verschiedene mehrfache Ziele binden können.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung umfasst die rekombinante Einzelkettenkassette mehrfache DNA-Sequenzen, die mehrfache (1) variable Regionen und/oder (2) Antigene oder Teile davon enthalten, jeweils mit charakteristischen Spezifitäten. In der Kassette ist die Sequenz, die eine variable Region codiert, mit der DNA, die (a) eine andere variable Region oder (b) eine Antigen oder Antigene codiert, vorzugsweise durch Linker verbunden, die durchgängig tandemweise angeordnet sind. Typischerweise sind solche Linker von helikaler Struktur. Helikale Peptidlinker erlauben eine korrekte Faltung des Proteinmoleküls. Weiterhin können helikale Peptidlinker die Löslichkeit des Moleküls erhöhen. Im Kontrast zur Expression einer einzelnen variablen Region (V_L oder V_H) alleine erfordern zwei variable Regionen als Einzelkettenproteine (V_L + V_H; V_L + V_L; V_H + V_H) eine Verbindung der individuellen variablen Regionen durch kurze Linker, z. B. (Gly₄Ser)₃-Linker.
Eine Palette kurzer Linker kann verwendet werden, um die Immunglobulinketten eines V_L + V_H (F_V)-Fragmentes zu verbinden (Huston, J.S., Levinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M.S., Novotny, J., Margolies, M.N., Ridge, R.J., Bruccoleri, R.E., Haber, E., Crea, R., Oppermann, H. (1988) Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an antidigoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5879-5883; Pluckthün, 1991). Während der Faltung des Proteins sind solche Linker passive Entitäten. Im Allgemeinen sind solche Linker hydrophil und flexibel.
Es gibt mehrere herkömmliche Methoden zur Verbindung der Immunglobulinketten eines F_V-Fragments, d. h., chemische Quervernetzung (Glockshuber et al., 1991); natürliche Quervernetzung durch Disulfidbrücken (Glockshuber, 1990a); natürliche Assoziation ohne die Sulfidbrücken; und Verbindung durch einen genetisch codierten Peptidlinker (Bird, R.E., Hardman, K.D., Jacobson, J.W., Johnson, S., Kaufman, B.M., Lee, S.M., Lee, T., Pope, S.H., Riordan, G.S., Whitlow, M. (1988) Single-chain antigen-binding proteins. Science 242 : 423-427; Huston et al., 1988a).
Die Einzelkettenkassetten können mehrfache Linker umfassen. Die primäre Beschränkung der Anzahl der Linker ist auf diejenige Zahl, die noch die Expression von durch erfindungsgemäße Vektoren codierten Fusionsproteinen erlaubt.
Linker, die erfindungsgemäße helikale Peptide codieren (z. B. SEQ ID NOs: 10, 11, 12), können modifiziert werden, d. h. durch Aminosäurenaustausch innerhalb des Moleküls, um davon abgeleitete Moleküle zu erzeugen. Solche abgeleiteten Moleküle behalten die funktionalen Eigenschaften des helikalen Peptidlinkers, d. h., das Molekül, das solche Substitutionen aufweist, ermöglicht immer noch die Expression des biologisch aktiven Proteinprodukts, das von dem erfindungsgemäßen neuen Expressionsvektor codiert wird.
Diese Aminosäureaustausche umfassen die im Stand der Technik als „konservativ" bekannten, ohne notwendigerweise darauf begrenzt zu sein.
Es ist z. B. ein wohlbekanntes Prinzip der Proteinchemie, dass bestimmte Aminosäurenaustausche, als „konservative Aminosäurenaustausche" bekannt, häufig in einem Protein vorgenommen werden können, ohne entweder die Konformation oder die Funktion des Proteins zu verändern. Solche Austausche umfassen den Austausch von Isoleucin (I), Valin (V) und Leucin (L) durch jede andere dieser hydrophoben Aminosäuren; von Glutamat (E) durch Aspartat (D) und umgekehrt; von Asparagin (N) durch Glutamin (Q) und umgekehrt; und von Threonin (T) durch Serin (S) und umgekehrt.
Andere Austausche können in Abhängigkeit von der Umgebung der einzelnen Aminosäure und ihrer Rolle in der dreidimensionalen Struktur des Proteins ebenfalls als konservativ betrachtet werden. Zum Beispiel können Glycin (G) und Alanin (A) häufig austauschbar sein, auch Alanin und Valin (V).
Methionin (M), das relativ hydrophob ist, kann häufig mit Leucin und Isoleucin und manchmal mit Valin ausgetauscht werden. Lysin (K) und Arginin (R) sind an Orten, an denen das wesentliche Charakteristikum des Aminosäurerests seine Ladung ist und die unterschiedli chen PK-Werte dieser zwei Aminosäurenreste nicht erheblich sind, häufig austauschbar. Noch andere Veränderungen können in bestimmten Umgebungen als „konservativ" betrachtet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst Vektoren, die Fusionsproteine codieren, die variable Regionen von Antikörpern mit Sequenzen leichter und/oder schwerer Ketten und einer oder mehreren nicht aus einem Antikörper stammende Bindungsdomäne umfassen. Die erste und/oder zweite Bindungsregion kann eine variable Region/variable Regionen eines Antikörpers sein. Alternativ kann die erste und/oder zweite Bindungsdomäne ein Antigen oder ein Teil oder mehrere Teile davon sein. Vorzugsweise umfasst der Teil des Antigens denjenigen Teil, der erkannt werden kann, und an den ein Molekül nach der Erkennung binden kann. Zum Beispiel wäre in einem transmembranären Proteinantigen der bevorzugte Teil der extrazelluläre Teil. Jedoch umfasst die Erfindung auch andere Teile.
Beispiele geeigneter Antigene und Rezeptoren umfassen CD- und nicht CD-Moleküle, ohne darauf begrenzt zu sein.
CD-Moleküle umfassen CD1, CD2, CD3/TcR, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CDw32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a,b, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49, CDw50, CD51, CDw52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62, CD63, CD64, CDw65, CD66, CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CD76, CDw78, ohne darauf begrenzt zu sein.
Nicht-CD-Moleküle umfassen B7, B7(2), CTLA4, BR96, GP39, LFA-3, ICAM-2, und Interleukin (IL) 1-8, ohne darauf begrenzt zu sein.
Zum Beispiel ist das CD28-Antigen ein homodimeres Glycoprotein, das zur Immunglobulin-Superfamilie gehört (Aruffo, A., Seed, B. (1987) Molecular cloning of a CD28 cDNA by a high-efficiency COS cell expression system, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 8573-8577), und das auf den meisten reifen menschlichen T-Zellen gefunden wird (Damle et al. (1983) J. Immunol. 131: 2296-2300). Monoklonale Antikörper (mAbs), die mit dem CD28-Antigen reaktiv sind, können durch verschiedene polyklonale Stimuli ausgelöste T-Zell-Antworten verstärken. Ein homologes Molekül, CTLA4, ist durch differenzielles Durchsuchen einer cDNA-Bibliothek muriner cytolytischer T-Zellen identifiziert worden (Brunet et al. (1987) Nature 328 : 267-270).
Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren umfassen Vektoren, die im Stande sind, multispezifische Fusionsproteine zu codieren, d. h. ein Molekül, das im Stande ist, mit mehreren Zielen zu reagieren. Zum Beispiel kann der Expressionsvektor ein trispezifisches Fusionsprotein codieren, das als Einzelkette exprimiert werden kann, d. h. ein Fusionsprotein, das drei Ziele erkennt und bindet. Alternativ kann das Fusionsprotein vier Ziele erkennen und binden.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst der Expressionsvektor (1) eine DNA-Sequenz, die eine erste Bindungsdomäne eines Antikörpers oder eines Zelloberflächenantigens codiert, (2) eine DNA-Sequenz, die eine zweite Bindungsdomäne eines Antikörpers oder eines Zelloberflächenantigens codiert, (3) einen Linker, der ein helikales Peptid codiert, der die DNA-Sequenz, die die erste Bindungsdomäne codiert, und die DNA-Sequenz, die die zweite Bindungsdomäne codiert, verbindet, und (4) eine DNA-Sequenz, die einen molekularen Marker zur Detektion des monospezifischen oder bispezifischen Fusionsproteins codiert.
Der molekulare Marker kann mit einem geeigneten Molekül identifiziert werden, das den molekularen Marker erkennt und bindet, zum Beispiel einem Antikörper, einem komplementären Sinn- oder Gegensinn-Molekül, einem Enzym usw. Zu Beispielen für solche molekularen Marker gehören ein F_C-Fragment, ein HIV-Fragment und die Hämagglutinin-Epitopsequenz HA (Pati et al. (1992) Gene 114 (2) : 285-8).
In Übereinstimmung mit einer bevorzugten Ausführung umfasst der Expressionsvektor eine rekombinante bispezifische Einzelketten-DNA-Kassette, umfassend (1) eine DNA-Sequenz, die eine erste Bindungsdomäne eines Antikörpers oder Zelloberflächenantigens codiert, (2) eine DNA-Sequenz, die eine zweite Bindungsdomäne eines Antikörpers oder Zelloberflächenantigens codiert, und (3) einen Linker, der ein helikales Peptid codiert, der die DNA-Sequenz, die die erste Bindungsdomäne codiert und die DNA-Sequenz, die die zweite Bindungsdomäne codiert, verbindet, wobei jeder der genannten Domänen das gleiche oder ein verschiedenes Ziel oder Antigen binden kann.
Erfindungsgemäß kann die erste und/oder zweite Bindungsdomäne mit einem Zelloberflächenantigen oder Leukozytenantigen reaktiv sein. Zu Zelloberflächenantigenen gehören Moleküle wie CD3, L6, CD28, CTLA4, CD40 oder B7, ohne darauf begrenzt zu sein. Somit kann die erste und/oder zweite Bindungsdomäne mit CD3 reaktiv sein. Ebenso kann die erste und/oder zweite Bindungsdomäne mit L6 reaktiv sein. Weiterhin kann die erste und/oder zweite Bindungsdomäne mit CD28 reaktiv sein. Überdies kann die erste und/oder zweite Bindungsdomäne mit B7 reaktiv sein. Des Weiteren kann die erste und/oder zweite Bindungsdomäne mit CD40 reaktiv sein.
In einer bevorzugten Ausführung ist der Expressionsvektor der als CC9-2 bezeichnete, bei der American Tissue Culture Collection (ATCC) in dem E. coli-Plasmid CC9-2 hinterlegte, wobei er die Abfolge L6 V_L-Leader-Sequenz-CD3 SF_V-Linker-L6 sF_V-Immunglobulin F_C in pCDMB und die ATCC Nr. 69235 hat. Dem Fachmann ist klar, dass jede beliebige DNA-Sequenz verwendet werden kann. Das einzige Erfordernis ist, dass die codierende Sequenz der variablen Region oder Regionen oder des zu verwendenden Moleküls bekannt sein muss, so dass sie in korrekter Orientierung und korrektem Leseraster zur Expression in die Kassette eingefügt werden kann.
Weiterhin wird ein Expressionsvektor, codierend ein bispezifisches Fusionsprotein, bereitgestellt, der eine rekombinante bispezifische Einzelkettenkassette umfasst, die eine DNA-Sequenz umfasst, die eine variable Region oder mehrere variable Regionen eines beliebigen Antikörpers und eine DNA-Sequenz, die einen Liganden codiert, umfasst. Zu Beispielen solcher Liganden gehören B7, CTLA4, CD28, CD40, CD3, ohne darauf begrenzt zu sein. Zu weiteren Beispielen für Liganden gehören alle Leukozytenantigene.
Zum Beispiel stellt die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor bereit, codierend ein bispezifisches Fusionsprotein, das eine rekombinante bispezifische Einzelkettenkassette umfasst, die eine DNA-Sequenz enthält, die eine Domäne codiert, die mit CD3 reaktiv ist, sowie eine DNA-Sequenz, die eine Domäne codiert, die mit L6 reaktiv ist. Die erste oder zweite Bindungsdomäne kann mit CD3 reaktiv sein. Die erste oder zweite Bindungsdomäne kann mit L6 reaktiv sein.
Die Erfindung stellt weiterhin einen Expressionsvektor bereit, der ein bispezifisches Fusionsprotein codiert, das eine rekombinante bispezifische Einzelkettenkassette umfasst, die eine DNA-Sequenz enthält, die eine Domäne codiert, die mindestens ein Teil von B7 ist (z. B. der extrazelluläre Teil), sowie eine DNA-Sequenz, die eine Domäne codiert, die mit L6 reaktiv ist.
Die Erfindung stellt weiterhin einen Expressionsvektor bereit, der ein bispezifisches Fusionsprotein codiert, das eine rekombinante bispezifische Einzelkettenkassette umfasst, die eine DNA-Sequenz enthält, die eine Domäne codiert, die mit CTLA4 reaktiv ist, sowie eine DNA-Sequenz, die eine Domäne codiert, die mit L6 reaktiv ist. Die erste oder zweite Bindungsdomäne kann mit CTLA4 reaktiv sein. Die erste oder zweite Bindungsdomäne kann mit L6 reaktiv sein.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Expressionsvektor bereit, der ein bispezifisches Fusionsprotein codiert, das eine rekombinante bispezifische Einzelkettenkassette umfasst, die eine DNA-Sequenz enthält, die eine Domäne codiert, die mit CD28 reaktiv ist, sowie eine DNA-Sequenz, die eine Domäne codiert, die mit L6 reaktiv ist. Die erste oder zweite Bindungsdomäne kann mit CD28 reaktiv sein. Die erste oder zweite Bindungsdomäne kann mit L6 reaktiv sein.
Beispielsweise stellt die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor bereit, der ein bispezifisches Fusionsprotein codiert, das eine rekombinante bispezifische Einzelkettenkassette enthält, die eine DNA-Sequenz umfasst, die eine Domäne codiert, die mit CD3 reaktiv ist, sowie eine DNA-Sequenz, die den extrazellulären Teil von B7 codiert.
Verfahren zur erfindungsgemäßen Herstellung von Expressionsvektoren und biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteinen werden bereitgestellt. Im Allgemeinen umfassen diese Verfahren (1) Isolation von mRNA aus einem B-Zell-Hybridom oder einer anderen kultivierten Zelle, die einen Antikörper oder anderes bindendes Protein bildet; (2) Synthese von cDNA durch reverse Transkription; (3) Klonierung der bindenden Domänen wie der variablen Region/Regionen unter Verwendung von „anchor-tailed oligonucleotides" oder degenerierten Oligonukleotiden als PCR-Primern; (4) Sequenzierung der so klonierten variablen Region oder Regionen; (5) Konstruktion von Fusionsgenen aus Genen variabler Regionen; (6) Einfügen der so konstruierten variablen Region oder Regionen in ein pUCIg-Vektor (oder andere geeignete Vektoren), mit SalI und BclI geöffnet; (7) Durchmusterung der Klone nach richtiger Konfiguration des Fragments und Sequenzierung solcher Klone; (8) Transfer der Klone in einen geeigneten Expressionsvektor wie pCDMB oder piLNXAn; (9) Transfektion von COS-Zellen mit einer Me thode wie der DEAE-Dextran-Technik; (10) Inkubation der so transfizierten Zellen über einen Zeitraum hinweg, der zur Expression der Fusionsproteine ausreicht, typischerweise etwa 72 Stunden; und (11) Durchmusterung solcher Zellen durch Zytometrie oder Verwendung von FITC-markiertem Ziegen-IgG gegen menschliche Antikörper und/oder ELISA auf die Bildung biologisch aktiver bispezifischer Fusionsproteine hin.
B. Verfahren zur Herstellung des biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteins
Es wird ein Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteins bereitgestellt. Dieses Verfahren beinhaltet, die mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transfizierten Zellen in Kultur zu halten, um das bispezifische Fusionsprotein zu bilden, und das so hergestellte Protein zu gewinnen.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteins in einer Säugerzelle bereit. Dieses Verfahren umfasst (a) Transfektion der Säugerzelle mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor; (b) Kultur der in Schritt (a) transfizierten Säugerzelle; und (c) Gewinnung des biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteins, das von der kultivierten Säugerzelle gebildet wird.
Das Verfahren zur Gewinnung des biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteins umfasst: (a) Identifikation des biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteins anhand der Gegenwart des molekularen Markers; und (b) Abtrennung des biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteins, das den molekularen Marker besitzt und daran identifiziert wird, von den Molekülen ohne den molekularen Marker, so dass das von der in Kultur gehaltenen Säugerzelle gebildete biologisch aktive bispezifische Fusionsprotein gewonnen wird.
Auch wenn in den nachfolgenden Beispielen Zellen mit Säugerursprung verwendet werden, ist grundsätzlich in der Durchführung der vorliegenden Erfindung jede eukaryontische Zelle verwendbar. Zu Beispielen gehören menschliche Zellen, z. B. Fibroblastenzellen, und Zellen von anderen Tieren, z. B. von Schafen, Schweinen, Mäusen und Rindern. Zu speziellen Beispielen von Säugerzellen gehören COS, HeLa, CHO, DUX, B11, Sp2/0, W138, DHK, und HEPG2-Zellen.
Es ist klar, dass die biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteine mit detektierbaren Markern zur diagnostischen, sowohl in vivo als auch in vitro, und therapeutischen Verwendung verbunden werden können. Unter den detektierbaren Markern, mit denen solche biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteine verbunden werden können, sind Enzyme, paramagnetische Ionen oder Verbindungen, Mitglieder des spezifischen Avidin-Biotin-Bindungspaares, Fluorophore, Chromophore, Chemiluminophore, Schwermetalle und Radioisotope. Zu den therapeutischen Agenzien, mit denen die biologisch aktiven bispezifischen Fusionsproteine verbunden werden können, gehören antineoplastische Mittel, Lymphokine und Toxine.
C. Mit erfindungsgemäßen Expressionsvektoren transfizierte Zellen
Die Einführung des Expressionsvektors in eine Säugerzelle kann durch Calciumphosphat-Transfektion (Graham and Van der Eb. (1973) Virol. 52 : 456-467), DEAE-Dextran- Transfektion (Lopata, M.A. et al., (1984) Nucl. Acids Res. 12 : 5707) und Elektroporation (Potter, H. et al. (1984) PNAS 81 : 7161) geschehen. Die Auswahl des Transfektionsverfahrens ist teilweise abhängig davon, was für eine Art von Transfektion durchgeführt werden soll. Sowohl Elektroporation als auch Calciumphosphat-Transfektion können verwendet werden, um wirksam Zelllinien herzustellen, die stabil integrierte DNA enthalten. Elektroporation ist am leichtesten mit freischwimmenden Zellkulturen durchzuführen, während Calciumphosphat-Transfektion am leichtesten mit adhärierenden Zellen durchzuführen ist. Die DEAE-Dextran-Transfektion ist nicht gut geeignet zur Erzeugung stabiler Zelllinien, aber ist in transienten Protokollen reproduzierbarer als die Calciumphosphat-Transfektion. Im Stand der Technik sind auch weitere Transfektionsmethoden beschrieben.
Die hier beschriebenen Expressionsvektoren und mit den hier beschriebenen Verfahren hergestellten neuen Proteine sind nicht auf die hier genannten variablen Regionen beschränkt, sondern generell anwendbar auf die Konstruktion, Expression und Durchmusterung beliebiger einzelkettiger bispezifischer Fusionsproteine.
D. Verwendung der von den erfindungsgemäßen Vektoren codierten Fusionsproteine
Die anti-L6- und anti-CD3-Einzelkettenderivate ohne molekulare Marker können in Therapie oder Diagnose nützlich sein, zur Behandlung oder Detektion von L6- oder CD3-assoziierten Krankheiten. Zum Beispiel kann L6sFv zur Detektion chemisch mit einem Radionuklid verbunden oder zur Therapie genetisch mit einem Toxin wie PE40 verknüpft werden.
Da kleinere sFv-Fragmente besser im Stande sind, eine Tumormasse zu durchdringen, und im Bereich von Tumoren verbesserte Lokalisierung gezeigt haben, können kleinere Dosen von L6sFv darin wirksam sein, therapeutische Mittel zu Tumorzellen zu dirigieren, die hohe Niveaus des L6-Antigens exprimieren (Colcher, D., Bird, R., Roselli, M., Hardman, K.D., Johnson, S., Pope, S., Dodd, S.W., Pantoliano, M.W., Milenic, D.E., Schlom, J. (1990) In vivo tumor targetin of a recombinant single-chain antigen-binding protein. J. Nat. Cancer Inst. 82 : 1191-1197; Yokota, T., Milenic, D.E., Whitlow, M., Schlom, J. (1992) Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms. Cancer Res. 52 : 3402-3408).
Der CD3sFv kann zur Induktion einer Immunsuppression in vivo gut geeignet sein, da die Übermittlung eines T-Zell-Rezeptor-Signals in Abwesenheit eines zweiten Signals wie CD28-Ligation zu T-Zell-Anergie führen kann. Es wurde gezeigt, dass F(ab')₂-Fragmente von OKT3 immunsuppressiv wirken, während sie die mit durch ganze OKT3-Antikörper ausgelöste Immunsuppression hervorgerufene Cytotoxizität erheblich verringern (Woodle, E.S., Thistlethwaithe, J.R., Ghobrial, I.A., Jolliffe, L.K., Stuart, F.P., Bluestone, J.A. (1991) OKT3 F(ab')₂ fragments: retention of the immunosuppressive properties of whole antibody with marked reduction in T cell activation and lymphokine release. Transplantation 52 : 354-360).
Interessanterweise zeigten CD3-Einzelketten-mAb-Derivate von dem nativen Antikörper verschiedene funktionale Eigenschaften. Das CD3Fv-Ig-Derivat war ein starker Auslöser der Tyrosin-Phosphorylierung von PLCγ1 und erhöhte die Assoziation von PLCγ1 mit pp35/36 verglichen zum nativen Anti-CD3-mAb. Es wurde gezeigt, dass diese Assoziation steigt, wenn T-Zellen maximal stimuliert werden (Kanner, S.B., Deans, J.P., Ledbetter, J.A. (1992a) Regulation of CD3-induced phospholipase C-γ1 (PLCγI) tyrosine phosphorylation by CD4 and CD45 receptors. Immunology 75 : 441-447; Kanner, S.B., Ledbetter, J.A. (1992b) CD45 regulates TCR-induced signalling through tyrosine phosphorylation of phospholipase Cγ1. Biochem. Soc. Trans. 20 : 178-184). Weiterhin führte Stimulation von T-Zellen mit CD3Fv-Ig insgesamt zu größerer Tyrosin-Phosphorylierung zellulärer Proteine nach der Aktivierung. Es ist möglich, dass, da die Moleküle kleiner sind als der native mAb, die Bindungsdomäne auf dem CD3-ε besser zugänglich ist und die Interaktion mit TCR/CD3-assoziierten Tyrosinkinasen verbessert.
In Tierversuchen und klinischen Studien an Menschen zeigten anti-TCR- oder anti-CD3 mAbs eine Verbesserung der T-Zell-Antworten gegen Zielzellen, wenn sie mit Zielzellantigenen quervernetzt wurden. Heterokonjugierte oder bispezifische mAbs dirigieren die Aktivität cytotoxischer T-Lymphozyten oder lymphozytenaktivierter Killerzellen auf die Abtötung maligner Zielzellen (Staez et al., 1986a; Perez et ap., 1985a; Perez, P., Hoffman, R.W., Titus, J.A., Segal, D.M. (1986) Specific targeting of human peripheral blood T cells by heteroaggregates containing anti-T3 crosslinked to anti-target cell antibodies. J. Exp. Med. 163 : 166-178; Liu et al., 1985a; Staerz et al., 1986b) oder virusinfizierter Zielzellen (Paya, C.V., McKean, D.J., Segal, D.M., Schoon, R.A., Schowalter, S.D., Leibson, P.J. (1989) Heteroconjugate antibodies enhance cell-mediated anti-herpes simplex virus immunity. J. Immunol. 142 : 666-671; Zarling, J.M., Moran, P.A., Grosmaire, L.S., McClure, J., Shriver, K., Ledbetter, J.A. (1988) Lysis of cells infected with HIV-1 by human lymphocytes targeted with monoclonal antibody heteroconjugates. J. Immunol. 140 : 2609-2613; Voss, L.M., David, C.S., Showalter, S.D., Paya, C.V., Liebson, P.J. (1992) Heteroconjugate antibodies enhance cell-mediated anti-herpes simplex virus immunity in vivo. Int. Immunol. 4 : 417-420).
Obwohl anti-CD3-mAb starke Cytokintoxizität in vivo auslösen kann (Abramowicz, D., Schandene, L., Goldman, M., Crusiaux, A., Vereerstraeten, P., De Pauw. L., Wybran, J., Kinnaert, P., Dupont, E., Toussaint, C. (1989) Release of tumor necrosis factor, interleukin-2, and gamma interferon in serum after injection of OKT3 monoclonal antibody in kidney transplant recipients. Transplantation 47 : 606-608), entwickelten mit bispezifischem mAb behandelte Patienten keine Cytokintoxizität, da ihre T-Zellen mit dem Mittel in vitro vorbehandelt und dann wieder verabreicht wurden (Mezzanzanica, D., Canevari, S., Colnaghi, M.I. (1991) Retargeting of human lymphocytes against human ovarian carcinoma cells by bispecific antibodies: from laboratory to clinic. Int. J. Clin. Lab. Res. 21 : 159-164; Nitta, T., Sato, K., Yagita, H., Okumura, K., Ishii, S. (1990) Preliminary trial of specific targeting therapy against malignant glioma. Lancet 335 : 368-371). Im Mäusemodell zeigen Moleküle, die kleiner als native mAbs sind, wie zum Beispiel F(ab')₂-Fragmente, sowohl für monospezifische anti-Tumor- als auch für bispezifische anti-CD3- und anti-Tumorspezifitäten verbesserte Tumorlokalisation (van Dijk, J., Zeg veld, S.T., Fleuren, G.J., Warnaar, S.O. (1991) Localization of monoclonal antibody G250 and bispecific monoclonal antibody CD3/G250 in human renal cell carcinoma xenografts: relative effects of size and affinity. Int. J. Cancer 48 : 738-743; Nelson, H., Ramsey, P.S., Kerr, L.A., McKean, D.J., Donohue, J.H. (1990) Regional and systemic distribution of anti-tumor x anti-CD3 heteroconjugate antibodies and cultured human peripheral blood lymphocytes in a human colong cancer xenograft. J. Immunol. 145 : 3507-3515).
Das CD3-L6FvIg-Molekül kann als neues Molekül zur Krebstherapie von Säugern nützlich sein, z. B. zur menschlichen Krebstherapie. Das Molekül enthält Bindungsspezifitäten sowohl für CD3 als auch für das Tumorantigen L6, und es wurde gezeigt, dass es in vitro in Gegenwart von L6-positiven Tumorzellen die T-Zell-Proliferation auslöst und die cytotoxische Aktivität der CTLs auf diese Zellen hin dirigiert. Die beiden verschiedenen Bindungsspezifitäten sind an den Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen des menschlichen IgG1 befestigt, das ursprünglich als Marker zur Charakterisierung und Reinigung der bispezifischen Moleküle dient. Der Marker selbst ist eine relativ kleine Domäne (ungefähr 50 kDa), die die geringere Gesamtgröße des markierten bispezifischen Proteins auf etwa zwei Drittel der Größe nativen IgGs verringert. Da der Marker menschlichen Ursprungs ist, ist zu erwarten, dass die Gesamtimmunogenität des Moleküls erheblich geringer ist als die gesamten murinen IgGs. Zur weiteren Verringerung der Immunogenität der bispezifischen Proteine können zusätzliche Modifikationen durchgeführt werden, zum Beispiel Humanisierung der Rahmenregionen und Angleichung der dem Medium zugänglichen Teile des helikalen Linkers an Helices aus bekannten menschlichen Proteinen. Zwar diente der IgG-Teil als Affinitätsschwanz, er kann jedoch auch in vivo die Halbwertszeit des bispezifischen Proteins erhöhen. In einem Bericht zeigten mit der konstanten Region des menschlichen IgG1 fusionierte variable Regionen chimäre murine Antikörper gegen colorektale Krebszellen (Steplewski, Z., Sun, L.K., Sherman, C.W., Ghrayeb, J., Daddona, P., Koprowski, H. (1988) Biological activity of human-mouse IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 chimäric monoclonal antibodies with antitumor activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 4852-4856) nach Verabreichung an zehn Patienten mit metastatischem Colonkrebs eine 6fache Steigerung der Zirkulationszeit (LoBuglio, A.F., Wheeler, R.H., Trang, J., Haynes, A., Rogers, K., Harvey, E.B., Sun, L., Ghrayeb. J., Khazaeli, M.B. (1989) Mouse/human chimäric monoclonal antibody in man: kinetics and immune response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 4220-4224).
Weiterhin ist der in unserem bispezifischen Fusionsprotein verwendete Ig-Schwanz in der CH2-Domäne mutiert (Prolin zu Serin an Position 238). Diese Mutation hebt die durch die Interaktion des menschlichen IgG1-Schwanzes mit Fc-Rezeptoren vermittelte ADCC-Aktivität auf. Dies sollte „gegenseitiges" Abtöten der CD3-positiven T-Zellen und Fc-Rezeptor-tragenden Zellen in vivo (Clark et al., 1987a) verhindern. Schließlich kann das Protein, obwohl das bispezifische Molekül aus der transienten Transfektion von COS-Zellen exprimiert wird, potenziell in einem stabil transfizierten System exprimiert werden.
Vorteile der Erfindung: Die vorliegende Erfindung überwindet die mit den gegenwärtigen Verfahrensweisen der Antikörperproduktion verbundene Probleme.
Um die Probleme anderer Forscher bei der Herstellung eines bispezifischen Fusionsproteins zu umgehen, passten wir ein existierendes COS-Zell-Expressionssystem an, um die Sekretion funktionaler Einzelketten-Antikörper-Derivate von einer rekombinanten bispezifischen Einzelkettenkassetten-DNA zu erreichen. Die Einzelketten-Antikörper wurden konstruiert, indem die Fc-Domäne des menschlichen IgG1 mit den variablen Regionen muriner Antikörper gegen menschliche Antigene (z. B. CD3 und L6) fusioniert wurden. Die Fc-Region diente als bequeme molekulare Markersequenz zur Identifikation und Reinigung von Fusionsproteinen mit unterschiedlichen Spezifitäten. Weiterhin können die von diesem Segment des Antikörpers vermittelten Effektorfunktionen für bestimmte therapeutische Anwendungen nützlich sein.
Im Gegensatz zu bakteriellen Expressionssystemen, bei denen die Gewinnung biologisch aktiver Moleküle problematisch ist, selbst wenn die Moleküle eine einzelne Bindungsspezifität besitzen, stellt die vorliegende Erfindung eine transiente Expression aus COS-Zellen bereit, die Kulturüberstände liefern, die die exprimierten biologisch aktiven Fusionsproteine enthalten, die dann durch herkömmliche Affinitätschromatographie gereinigt werden können. Interessanterweise zeigen die so hergestellten einzelkettigen bispezifischen Fusionsproteinmoleküle Eigenschaften, die sich von denen der Ausgangsantikörper unterschieden.
Wir wählten eine Expression dieser bispezifischen Fusionsproteinmoleküle in Säugerzellen, da die Gewinnung biologisch aktiver Moleküle aus bakteriellen Expressionssystemen problematisch ist, selbst wenn die Moleküle nur eine einzelne Bindungsspezifität besitzen. Bei der Expression in Säugern kann einfache und schnelle Herstellung von Antiköperderivaten erreicht werden, was wichtig ist, um Charakterisierung, Auswertung und Vergleich zwischen Molekülen innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums durchführen zu können.
Genfusionen, in denen individuelle Proteindomänen auf austauschbaren rekombinanten bispezifischen Einzelkettenkassetten vorliegen, verschaffen die Möglichkeit, neue Kombinationen herzustellen, schnelle Austausche durchzuführen und verschiedene Domänen für ihre Wirksamkeit bei der Durchführung einer bestimmten Funktion zu durchmustern. Die Expression der Konstrukte in einem transient transfizierten System ist für die ersten Rekombinations- und Durchmusterungsschritte gegenüber anderen Herstellungsweisen zu bevorzugen. Nur diejenigen Moleküle, die in dieser Durchmusterung die gewünschte Gruppe von Eigenschaften zeigen, müssen zur Produktion im großen Maßstab in ein zweites Expressionssystem übertragen werden, was für die Mehrzahl der hergestellten Moleküle langwierige oder komplizierte Herstellungs- oder Isolierungsverfahren überflüssig macht.
Wir begannen, ein System zur schnellen Konstruktion, Expression und Analysis von in Form von bispezifischen Einzelketten-DNA-Kassetten mit austauschbaren DNA-Kassetten, d. h., DNA-Kassetten, die einzelkettige variable Regionen oder andere Bindungsdomänen, die gegen einander ausgetauscht werden können, codieren, zu größeren Molekülen zusammengefügten Antikörperbindungsstellen zu entwickeln. Die Sequenzen der ersten und zweiten Bindungsdomäne sind austauschbar oder auswechselbar. Andere Sequenzen können die existierenden ersetzen.
Im Gegensatz zu zuvor beschriebenen Konstrukten sind die bispezifischen Einzelketten-Kassetten vielseitig verwendbar, da in jeder einzelnen oder beiden der ersten oder zweiten Bindungsdomäne beliebige variable Regionen untergebracht werden können.
Durch Konstruktion neuartiger Kombinationen von Strukturdomänen von Antikörpern können zum Beispiel Moleküle, die zwei verschiedenartige Bindungsspezifitäten verbinden, und gewünschte Effektorfunktionen, die ein verbessertes therapeutisches Potenzial zeigen, hergestellt werden. Solche bispezifischen Einzelketten-Antikörper-Derivate dienen als Adaptermoleküle für zwei nicht miteinander interagierende Zelloberflächen-Rezeptoren, um ein künstliches Rezeptor-Liganden-Paar zu erzeugen.
Die hier vorgelegten Daten lassen vermuten, dass auf diese Weise von einer rekombinanten bispezifischen Einzelketten-DNA-Kassette exprimierte bispezifische Fusionsproteinmoleküle fähig sein können, eine cytotoxische Reaktion von T-Zellen sowohl in vivo als auch in vitro gegen L6 exprimierende menschliche Tumoren zu leiten, ohne dass hierbei umfangreiche Gewebekulturvorgänge oder eine Reinigung von potenziell giftigen monospezifischen Antikörpern gegen CD3 notwendig wären.
Einzelketten-Antikörper-Derivate, die die Spezifitäten für Bindung an Tumorzellen und für Bindung an und Aktivierung von T-Zellen kombinieren, ergeben eine erhebliche Verbesserung gegenüber auf einzelnen monoklonalen Antikörpern basierten Therapien für menschliche Erkrankungen. Der hier für Entwurf, Konstruktion, Expression und Prüfung von Fusionsgenen beschriebene Ansatz ist vielseitig verwendbar und bietet erhebliche Vorteile in Schnelligkeit, Einfachheit und Reproduzierbarkeit zur Überprüfung neuer Kombinationen funktionaler Domänen nicht miteinander verwandter Moleküle auf ihre Fähigkeit, auf gewünschte Wiese in einem einzelnen Molekül zusammen zu funktionieren.
Die Erfindung wird von den nachfolgenden Beispielen illustriert. Dieser Abschnitt ist dargestellt, um das Verständnis der Erfindung zu unterstützen, aber nicht mit der Absicht, welche auch nicht unterstellt werden sollte, auf irgend eine Weise die in den nachfolgenden Ansprüchen definierte Erfindung zu beschränken.
Beispiel 1
Material und Methoden:
Modifikation von Expressionsvektoren: Die Plasmide pCDM8 und piLNXAn wurden modifiziert, indem das Platzhalterfragment durch mehrere kleinere Platzhalterfragmente ausgetauscht wurde, von denen jedes dem resultierenden Fusionsprotein eine bestimmte funktionale Eigenschaft vermittelt.
Der Säuger-Expressionsvektor ist mit den gemachten Veränderungen und Hinzufügungen im obersten Teil des Vektors gezeigt dargestellt. Die Expression der Fusionskassetten wird von dem CMV-Promotor angetrieben, und die Replikation in Bakterien und Säugerzellen wird durch die im unteren Teil des Vektors bezeichneten geeigneten Ursprünge erreicht. Der Vektor enthält das supF-Gen zur Suppression von Nonsense-Mutationen in den im p3-Plasmid in den geeigneten Wirtsbakterienstämmen vorhandenen Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenzgenen vorliegen. Die Terminations- und Polyadenylierungssignale werden von den entsprechenden Regionen aus SV40 bereitgestellt.
Die HindIII-Schnittstelle am 5'-Ende der Platzhalterregion wurde verwendet, um eine HindIII-SalI-Kassette einzufügen, die eine Leader-Sequenz zur Sekretion von Fusionsproteinen enthält, die aus der variablen Region der leichten Kette des anti-L6-Antikörpers stammt (hier auch als anti-L6 bezeichnet) (1). Diese Sequenz wurde auf komplementären 72-mer-Oligonukleotiden mit überhängenden klebrigen Enden für HindIII und SalI codiert. Das verwendete Sinnstrang-Oligonukleotid war L6VL-LP5/AGC TTA TGG ATT TTC AAG TGC AGA TTT TCA GCT TCC TGC TAA TCA GTG CTT CAG TCA TAA TGT CCA GAG GAG (SEQ ID NO:1), während das komplementäre Oligonukleotid L6VL-LP3/TCG ACT CCT CTG GAC ATT ATG ACT GAA GCA CTG ATT AGC AGG AAG CTG AAA ATC TGC ACT TGA AAA TCC ATA (SEQ ID NO:2). Das Sinnstrang-Oligonukleotid wurde mit Polynukleotidkinase (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, ID) phosphoryliert und vor der Ligation gemäß einem zuvor veröffentlichten Verfahren (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning – a laboratory manual, second edition. ISBN 0-87969-309-6) mit dem Komplementstrang zusammengefügt. Zur Verhinderung von tandemförmigen Mehrfachinsertionen wurde nur eines der Oligonukleotide phosphoryliert.
Weiterhin wurde die XbaI-Schnittstelle am 3'-Ende des Platzhalterfragments verwendet, um einen molekularen Marker oder ein einfaches Stopcodon einzufügen, flankiert von BclI- und XbaI-Restriktionsschnittstellen am Carboxyterminus (1). Die getesteten molekularen Marker umfassten ein Fc-Fragment aus menschlichem IgG1, ein Peptid aus der V3-Schleife des gp110-Glycoproteins des menschlichen Immundefizienzvirus (HIV), ein FLAG-Peptid, und die konstante Region des menschlichen C-κ. Die menschlichen IgG1-Sequenzen wurden durch gekoppelte reverse Transkription (Vogelmyeloblastosevirus; Life Sciences, St. Petersburg, FL) aus der RNA des chimären L6-Transfektoms und/oder PCR-Reaktionen aus der RNA eines menschlich-murin chimäres L6 exprimierenden Myeloms isoliert. Mehrere verschiedene mutierte Derivate der Fc-Domäne wurden durch PCR-Reaktionen unter Verwendung von Vorwärtsprimern, die entweder in der Gelenk- oder der CH2-Region die jeweiligen Mutationen enthielten, hergestellt.
Die modifizierten Expressionsvektoren wurden durch Einfügung und Expression der variablen Regionen für zwei verschiedene Antikörper bindende Spezifitäten, das menschliche L6-Tumorantigen und das menschliche CD3-ε, getestet. Die Einzelketten-Antikörper-Derivate banden in Abhängigkeit von dem molekularen Marker, mit dem sie verbunden waren, die Antigene mit unterschiedlichen Aviditäten und Affinitäten. Die Fc-Domäne des menschlichen IgG1 war trotz des Fehlens von CH1- und C-κ-Domänen bei der Nachbildung der Charakteristika des nativen Antikörpers der erfolgreichste Marker. Verschiedene andere Marker wurden konstruiert und erprobt, aber sowohl das C-κ-Peptid (Traunecker, A., Lanzavecchia, A.M., Karjalainen, K. (1991) Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells. EMBO J. 10 : 3655-3659) als auch das FLAG-Peptid funktionierten nicht zuverlässig. Das Peptid RKSIRIQRGPGRAFVTIGKI (SEQ ID NO:3) aus der V3-Schleife des vom menschlichen Immundefizienzvirus codierten gp110, von dem peptidspezifischen monoklonalen Antikörper 110.3 erkannt, wurde ebenfalls als Affinitätsschwanz verwendet. Dieser Marker gab in Abhängigkeit von dem Fv, mit dem er fusioniert war, unterschiedliche Ergebnisse, wobei er, wenn er mit L6 fusioniert war, nicht richtig funktionierte, aber erfolgreich, wenn er mit CD3 fusioniert war.
Das Peptid 29 (RKSIRIQRGPGRAFVTIGKI) (SEQ ID NO:3) entspricht einem Segment der V3-Schleife des gp 110 aus HIV (HIV-Peptid). Ein molekularer Marker wurde hergestellt, indem zwei komplementäre 76gliedrige Oligonukleotide mit klebrigen Enden zusammengefügt wurden. Das Sinnstrang-Oligonukleotid umfasste ein BclI-Überhang, die Sequenzen der V3-Schleife und ein Stopcodon: HIVSTOP5 GA TCA AGA TCC GCG GAA ATC GAT TAG AAT CCA GAG AGG CCC TGG GCG CGC CTT CGT TAC GAT CGG CAA GAT CTA GT (SEQ ID NO:4), während das komplementäre Oligonukleotid den XbaI-Überhang enthielt: HIVSTOP3/CTA GAC TAG ATC TTG CCG ATC GTA ACG AAG GCG CGC CCA GGG CCT CTC TGG ATT CTA ATC GAT TTC CGC GGA TCT T (SEQ ID NO:5). Das Sinnstrang-Oligonukleotid wurde vor der Ligation in den BclI-XbaI-verdauten Vektor phosphoryliert und mit dem unphosphorylierten Gegensinn-Oligonukleotid zusammengefügt, wie oben beschrieben.
Wir überprüften, ob das von IBI zur Verwendung als aminoterminaler Marker vermarktete FLAG-Peptid noch funktionierte, wenn es am Carboxyterminus des markierten Proteins platziert war. Es wurden komplementäre Oligonukleotide entworfen, die die folgenden 51gliedrigen Sequenzen enthielten: FLAG5/GAT CAA GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG TGA GCG GCC GCG AAT TCG TCT (SEQ ID NO:6) und FLAG3/CTA GAG ACT AAT TCG CGG CCG CTC ACT TGT CAT CGT CGT CCT TGT AGT CTT (SEQ ID NO:6). Diese Sequenzen wurden mit Kinase behandelt, verbunden und distal von der Antikörperbindenden Domäne in den Vektor ligiert. Die menschlichen C-κ-Sequenzen wurden durch reverse Transkription und PCR aus der chimären L6-RNA erhalten, wie zuvor beschrieben. Der Vorwärtsprimer für die Isolation von C-κ war L6CK5BCL/GGT GCT CTG ATC ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC (SEQ ID NO: 8) und der Rückwärtsprimer war L6CK3XBA/CCT CCT CAT TCT AGA CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT (SEQ ID NO:9).
Der helikale Peptidlinker, der verwendet wurde, um eine rekombinante bispezifische Einzelkettenkassetten-DNA zwischen den CD3- und L6-Bindungsdomänen zu schaffen, wurde von komplementären 78gliedrigen Oligonukleotiden mit klebrigen GATC-Überhängen codiert. Das Sinnstrang-Oligonukleotid ist Fvlink1/GAT CAA TCC AAC TCT GAA GAA GCA AAG AAA GAG GAG GCC AAA AAG GAG GAA GCC AAG AAT CTA ACA GCC TCG AGA GC (SEQ ID NO:10), und das Gegensinnstrang-Oligonukleotid ist Fvlink2/GAT CGC TCT CGA GGC TGT TAG ATT TCT TGG CTT CCT CCT TTT TGG CCT CCT CTT TCT TTG CTT CTT CAG AGT TGG ATT (SEQ ID NO:11). Das codierte Peptid ist hydrophil und an geladenen Aminosäuren reich (DQSNSEEAKKEEAKKEEAKKSNSLESL) (SEQ ID NO:12), um die Löslichkeit des Moleküls zu erhöhen. Das Sequenzmotiv (EEAKK)_n ist infolge seines Reichtums an geladenen Aminosäuren besonders hydrophil.
Die PCR-Reaktionen (in einem gesamten Reaktionsvolumen von 100 μl) wurden in Taq-Polymerasepuffer (Stratagene, Torrey Pines, CA oder Boehringer-Mannheim) durchgeführt, mit jeweils 20 μmol von jedem dNTP, 50-100 pmol an Primern, 1-10 ng an Template und Taq-Polymerase (Stratagene oder Boehringer-Mannheim). Die Reaktionen wurden in einem Perkin-Elmer Cetus-Thermocycler mit einem 30-Runden-Programm durchgeführt, wobei die Runde typischerweise aus 1 Minute bei 94 °C, 1 Minute bei 55 °C und 1 Minute bei 72 °C bestand. Die Ligationsprodukte wurden in MC1061/p3 transformiert, und Kolonien wurden auf Plasmide mit den richtigen Insertionen durchsucht. Positive Klone wurden durch DNA-Sequenzierung und Transfektion im kleinen Maßstab überprüft.
Isolierung der V-Regionen: RNA wurde unter der NP-40-Rapid-Lysis-Technik aus dem chimären L6-Transfektom isoliert, und DNA mit voller Länge sowohl für die schweren als auch für die leichten Ketten wurden unter Verwendung von Primern, die mit den publizierten Sequenzen für L6 und die konstanten Regionen des Menschen identisch waren, amplifiziert (Hieter, P.S., Maz, E.E., Seidman, J.G., Maizel, J.V. Jr., Leder, P. (1980) Cloned human and mouse kappa immunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments. Cell 22 : 197-207; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 3438-3442), jedoch unter Anfügung von Restriktionsschnittstellen für die Klonierung. Diese cDNAs mit voller Länge wurden als Template für sekundäre PCR-Reaktionen verwendet, um die variablen Regionen umzuklonieren. In einem Beispiel wurden Subfragmente der variablen Regionen durch PCR von cDNA-Templaten kloniert, die mit Zufallshexameren anstelle von spezifischen Primern erzeugt worden waren.
Aus G19-4-Zellen wurde RNA unter Verwendung der NP-40-Rapid-Lysis-Technik extrahiert. Die V_L- und V_H-Sequenzen des anti-CD3-Hybridoms G19-4 wurden unter Verwendung etablierter PCR-Verfahren amplifiziert (Orlandi, R., Gussow, D.H., Jones, P.T., Winter, G. (1989) Cloning immunoglobulin variable regions for expression by the Polymerase Chain Reaction. Proc. Nat. Acad. Sci. 86 : 3833-3837). Die Synthese des ersten cDNA-Stranges wurde unter Verwendung von AMV-Reverser Transkriptase (Life Sciences) und zu den konstanten Regionen der schweren oder der leichten Ketten komplementären Primern durchgeführt. An die einzelsträngigen cDNA-Produkte wurden unter Verwendung terminaler Transferase (Stratagene, Torrey Pines, California) Polyguanylatschwänze angehängt. Es wurde dann unter Verwendung von 100 pmol jedes Primers und 1-2 μl nach dem Gene-Clean-Verfahren gereinigter cDNA mit Polyguanylatschwanz aus der Erststrangsynthese eine PCR durchgeführt. Der ANC-TAIL-Vorwärtsprimer enthielt sinnlose DNA und Polycytosylatsequenzen, die zu der Anchor-Sequenz komplementär waren, der ANC-ER-Vorwärtsprimer enthielt eine EcoRI-Schnittstelle und sinnlose Sequenzen stromaufwärts der Anchorstelle, und die Rückwärtsprimer MHγC und MCK-3 enthielten Sequenzen innerhalb des Primers für den ersten Strang, komplementär zu den konstanten Regionen der schweren bzw. der leichten Kette. Die Primersequenzen waren wie folgt:
ANCTAIL: 5'-GCATGTGCAAGTCCGATGAGTCCCCCCCCCCCCCC-3' SEQ ID NO:13,
ANC-ER: 5'-ACGTCGAGAATTCGCATGTGCAAGTCCGATGAGTCC-3' SEQ ID NO:14,
MHγC: 5'-A(TC)CTCCACACACAGG(AG)(AG)CCAGTGGATAGAC-3' SEQ ID NO:15,
MCK-1: 5'-CTTCCACTTGACATTGATGTCTTTG-3' SEQ ID NO:16,
MCK-3: 5'-CAAGAAGCACACGACTGAGGCA-3' SEQ ID NO:17.
Immunfärbung und fluoreszenzaltivierte Zytometrie (FACS): Jurkat-Zellen, Lymphozyten aus peripherem Blut und/oder L6-positive Tumorzellen (H2981 oder H3639) wurden durch indirekte Immunfärbung analysiert. Vor der Färbung wurden die H2981-Zellen von den Flaschen durch Inkubation in Trypsin-EDTA (GIBCO-BRL) abgelöst. Die Zellen wurden mit Einzelketten-Antikörper oder nativem Ausgangsantikörper in verschiedenen Konzentrationen in Bindungspuffer (GIBCO-BRL) 40 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Die Zellen wurden nach dem ersten Schritt gewaschen und mit einem FITC-konjugierten Zweitreagens über weiter 30-40 Minuten bei 4 °C inkubiert. Der Zweitantikörper war einer der folgenden: Ziege-anti-Maus-Ig für murine monoklonale Antikörper, Ziege-anti-Mensch-IgG für einfache Ig-Fusionen (Tago, Inc., Burlingame, CA), FITC-110.3, gerichtet gegen die V3-Schleife des gp110, für HIV-Peptid-Fusionsproteine, und FITC-anti-idiotyp (1B) gegen den L6-Antikörper für alle Arten von L6-enthaltenden Konstrukten. Die Fluoreszenz wurde auf einem FACS IV-Zellsorfer (Becton Dickinson und Co., Mountain View, CA), ausgerüstet mit einem 4-decadigen logarithmischen Verstärker, analysiert.
Kompetitionsmessungen wurden durchgeführt, indem die zwei Antikörper in verschiedenen Verhältnissen auf eine Gesamtkonzentration von 10 μg/ml Antikörper vor der Zugabe von Zellen gemischt wurden. Einer der beiden Antikörper, üblicherweise chimäres oder murines L6 oder natives G19-4, waren mit FITC markiert. Für Inhibitionsmessungen wurde der erste Antikörper 30 Minuten vor dem Zusatz des zweiten FITC-konjugierten Antikörpers zugesetzt.
Zellkultur, Transfektionen und Reinigung der Fusionsproteine: COS-Zellen wurden wie zuvor beschrieben (Linsley, P.S., Brady, W., Grosmaire, L., Aruffo, A., Damle, N.K., Ledbetter, J.A. (1991) Bindung of proliferation and interleukin 2 mRNA accumulation. J. Exp Med. 173 721-730; Aruffo and Seed, 1987a) mit Expressionsplasmiden transfiziert. Die Plasmid-DNA wurde auf eine Konzentration von 1 μg/ml in einem Gesamtvolumen von 12 ml/150 mm-Platte dem Transfektionsmedium zugesetzt. Verbrauchtes serumfreies Kulturmedium von drei Chargen transfizierter COS-Zellen wurde vereint und zur Reinigung der Fusionsproteine, die Ig, HIV- oder Stopp-Molekularmarker trugen, verwendet. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei niedriger Umdrehungszahl entfernt, und die Überstände wurden gegebenenfalls vor der Aufrei nigung durch 0,2 μm-Filter filtriert. Das Medium von Ig-Fusions-Transfektionen wurde auf eine mit 0,05 M Natriumcitrat, pH 8,0 (Linsley et al, 1991a) äquilibrierte Säule immobilisierten Proteins A (Repligen Corp., Cambridge, MA) aufgetragen. Für jeweils 500 ml Überstand wurde 1 ml gepackter Protein A-Beads verwendet. Nach zweimaligem Auftragen des Mediums wurde die Säule mit 100 mM Kaliumphosphat, pH 8,0, gewaschen, und das gebundene Protein wurde mit 0,05 M Natriumcitrat, pH 3, eluiert. Die Fraktionen wurden in Röhrchen aufgefangen, die jeweils 1/5 Volumen 1 M Tris pH 8,0 enthielten. Diejenigen Fraktionen, die den Peak des bei 230 nm absorbierenden Materials enthielten, wurden vereint und vor der Verwendung gegen PBS dialysiert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des BioRad-Proteinassay-Kits, auf der Lowry-Technik basierend, bestimmt.
Für andere molekulare Marker enthaltende Fusionsproteine wurden Affinitätssäulen hergestellt, in dem passende Antikörper (entweder anti-L6 idiotyp-mab 13B oder anti-HIV-mAb 110.3 gegen die V3-Schleife des gp110) unter Verwendung von Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose 4B gemäß den Anweisungen von Pharmacia immobilisiert wurden. Die Affinitätsmatrices enthielten ungefähr 5 mg monoklonalen Antikörpers pro ml Gelbettvolumens, und die typische Säulengröße war 1 × 5 cm (4 ml). Die Proben wurden auf pH 7 eingestellt und auf die zuvor mit 0,1 M Zitronensäure, pH 2,2, gewaschene und mit PBS, pH 7,2 äquilibrierte Immunoaffinitätssäule geeigneten Typs aufgetragen. Die Säule wurde gründlich mit PBS gewaschen, und das gebundene Material wurde mit 0,1 M Citrat, pH 3,0, eluiert, gefolgt von sofortiger Neutralisierung mit Tris. Das gereinigte Antikörperderivat wurde schließlich in PBS dialysiert und sterilfiltiert.
Zelladhäsionsversuche: Adhäsionsversuche wurden im Wesentlichen wie beschrieben (Linsley, P.S., Clark, E.A., Ledbetter, J.A. (1990) T-cell antigen CD28 mediates adhesion with B cells by interacting with activation antigen B7/BB1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 5031-5035) in Gegenwart von 10 mM EDTA durchgeführt. Jurkat-Zellen wurden zuerst mit ⁵¹Cr markiert, dann mit Antikörperstimuli inkubiert, gewaschen, mit H2981-Tumorzellen inkubiert und mikroskopisch untersucht. Um nicht spezifische Bindung an H2981-Zellen zu verhindern, wurden die Jurkats und H2981-Einzelschichten zur Absättigung der Fc-Rezeptoren vor der Zugabe der CD3Ig (hier auch als CD3FvIg bezeichnet), L6Ig (hier auch als L6FvIg bezeichnet) oder CD3-L6Ig (hier auch als CD3-L6FvIg bezeichnet)-Antikörperderivate mit einem irrelevanten Antikörper inkubiert. Nach Abschluss der Adhäsionsreaktionen wurden die Zellschichten fünfmal mit eiskaltem RPMI-Medium gewaschen, durch Zusatz von 0,5 M Natriumhydroxid aufgelöst, und die Radioaktivität wurde in einem γ-Zähler gemessen. Die Anzahlen der gebundenen Zellen wurden berechnet, indem man die gesamte gebundene Radioaktivität (cpm) durch die spezifische Aktivität (cpm pro Zelle) der markierten Zellen dividierte (6).
In 6 wurden Einzelschichten von H2981-Tumorzellen mit einer Dichte von 10⁵ Zellen pro Napf in 48-Napf-Platten ausplattiert, 20 Minuten lang bei 23 °C in 0,1 % Paraformaldehyd fixiert, gewaschen, mit vollständigem RPMI + 10 % fötalen Kälberserum blockiert und 1 Stunde lang bei 37 °C alleine oder mit dem bezeichneten Antikörper präinkubiert. Ein Hetero konjugat aus den monoklonalen Antikörpern anti-CD3 (G19-4) und anti-L6 wurde als Positivkontrolle verwendet. Alle Antikörper wurden sofern nicht anders angegeben, mit einer Konzentration von 20 μg/ml verwendet. Jurkat-Zellen wurden mit ⁵¹Cr markiert, in 10 mM EDTA präinkubiert und den Tumorzellen und Antikörpern zugesetzt. Die Adhäsion wurde initiiert, indem die Platten 2 Minuten lang bei 1000 Umdrehungen pro Minute rotiert wurden. Die Reaktionen wurden 45 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, fünfmal in eiskaltem RPMI gewaschen und in 0,5 N Natriumhydroxid lysiert. Die freigesetzte Radioaktivität wurde durch γ-Zählung bestimmt. Die Daten stellen die Anzahl der gebundenen Zellen dar (× 10³). Mittelwert und Standardabweichung (Fehlerbalken) drei wiederholter Messungen sind gezeigt.
SDS-PAGE und Western-Plot: Acrylamidgele, die einen linearen 6-15 %-Gradienten mit einem 4 %igen Sammelgel bildeten, liefen 3 Stunden bei 225 Volt oder über Nacht bei 8 mA. Die Gele wurden unter Verwendung eines Western Semi-dry-Transferapparats (Ellard Instruments, Seattle, WA) bei 130 mAmp während 1 Stunde auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Die Blots wurden mit 1 % fettfreier Milch, 0,05 % NP-40 in PBS (BLOTTO, d. h. Blockpuffer) 1-2 Stunden lang geblockt. Die Inkubation mit dem Erstantikörper wurde mit Ziege-anti-Mensch-IgG (Boehringer-Mannheim), konjugiert mit Alkalischer Phosphatase, 1 : 1500 in BLOTTO verdünnt, oder mit der geeigneten Verdünnung unkonjugierten murinen oder chimären Antikörpers oder zur Detektion von nicht-Ig-Fusionen, d. h. Sf_V ohne Ig-Marker, durchgeführt. In jeden Fall wurden die Blots dreimal in BLOTTO gewaschen und mit mit Alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-anti-Maus-Antikörper oder anti-Mensch-IgG, wenn ein zweiter Schritt erforderlich war, inkubiert. Die Blots wurden 5-15 Minuten lang in Western Blue (Promega, Madison, WI) entwickelt, und die Reaktion wurde mit destilliertem Wasser beendet.
Immunopräzipitation und Western Blotting mit anti-Phosphotyrosinantikörpern: Jurkat-T-Zellen wurden unstimuliert (0), mit nativem G19-4 Mab (Ledbetter, J.A., Norris, N.A., Grossman, A., Grosmaire, L.S., June, C.H., Ucklin, F.M., Cosand, W.L., Rabinovitch P.S. (1989) Enhanced transmembrane signalling activity of monoclonal antibody heteroconjugates suggest molecular interactions between receptors on the T cell surface. Mol. Immunol. 26 : 137-145) oder mit CD3Fv-Ig in den bezeichneten Konzentrationen stimuliert und in modifiziertem RIPA-Puffer (Kanner, S.B., Reynolds, A.B., Parsons, J.T. (1989) Immunoaffinity purification of tyrosinephosphorylated cellular proteins. J. Immunol. Methods 120 : 115-124), der Phosphatase- und Proteaseinhibitoren enthielt (1 mM Natriumorthovanadat, 1 mM PMSF, 2 mM EGTA, 0,5 % Aprotinin und 10 μg/ml Leupeptin), lysiert. Die Zelllysate wurden von Partikeln befreit (10 Minuten bei 14000 rpm) und entweder mit anti-Phosphotyrosin-Kaninchenantikörpern oder anti-PLCγ1-Antiserum immunpräzipitiert. Die Immunkomplexe wurden mit Protein A-Sepharose-Beads (Pharmacia, Piscataway, NJ) gewonnen und gewaschen. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE (8 %) aufgetrennt und 2 Stunden lang bei 4 °C auf PVDF Immobilon (Millipore, Redford, MA) übertragen. Die Immunoblots wurden vor der Zugabe von 0,5 μg/ml affinitätsgereinigten anti-Phosphotyrosin-Kaninchenantikörpers in Blockpuffer geblockt. Die Proteine wurden mit 1 μCi/ml an hochspezifisch mit Iod 125-aktivitätsmarkiertem Protein A (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA) und durch Autoradiographie detektiert.
Proliferationsmessungen: Lymphozyten aus peripherem Blut wurden durch Verdünnung und Zentrifugation in Lymphozytentrennungsmedium isoliert (Organon Teknika, Durham, NC). Die Lymphozyten wurden mehrmals in serumfreiem RPMI 1640 gewaschen, und die Zelldichte wurde auf 10⁶ Zellen pro ml in 10 % fötales Kälberserum enthaltendem RPMI eingestellt. Die Zellen wurden in 96-Napf-Flachbodenplatten kultiviert (5 × 10⁴ Zellen/Napf in einem Volumen von 0,2 ml). Die Proliferation wurde anhand der Aufnahme von Tritium-Thymidin in der Konzentration von 1 μCi/ml während der letzten 6-8 Stunden einer dreitägigen Kultur in Triplikatproben gemessen. Durch Phorbolester aktivierte T-Zellen wurden hergestellt, indem man Lymphozyten aus peripherem Blut mit 1 μg/ml PHA (Wellcome, Charlotte, NC) 5 Tage lang kultivierte und einen Tag lang in Medium ohne PHA ruhen ließ.
H2981-Tumorzellen wurden vor der Verwendung in Proliferationsmessungen mit 10.000 rad bestrahlt. Die Zellen wurden entweder vor der Inkubation mit peripheren Blutlymphozyten an Fusionsproteine gebunden und gewaschen („gebundene" Proben), oder sie wurden während der dreitägigen Kultur mit den Fusionsproteinen in Lösung zugesetzt („Lösungsproben"). Das Waschen der gebundenen Proben entfernt ungebundenes Protein, so dass nur an die Tumorzellen gebundenes Protein zur Stimulation der peripheren Blutlymphozyten während der Messung beiträgt. Die peripheren Blutlymphozyten wurden relativ zu den bestrahlten Zellen folgendermaßen titriert: (2 : 1), 5 : 1, 125 : 1, (625 : 1), wobei die erste Zahl sich auf die relative Anzahl der anwesenden peripheren Blutlymphozyten bezieht (5 × 10⁴ Zellen/ml) im Vergleich zur sinkenden Anzahl der Tumorzellen.
Cytotoxizitätstests: Vor der Inkubation mit dem Fusionsprotein (0,1 μg/ml bis 10 μg/ml) und den peripheren Blutlymphozyten (bei verschiedenen Effektor : Ziel-Verhältnissen von 10 : 1 bis 100 : 1) wurden die H2981-Tumorzellen zwei Stunden lang mit ⁵¹Cr inkubiert. Vor der Zählung wurden die Zellen fünf Stunden lang in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml in RPMI, enthaltend 10 % fötales Kälberserum, kultiviert. Die Chromfreisetzung wurde in einem γ-Zähler gemessen, um gegen die Tumorzellen gerichtete Cytotoxizität zu messen.
COS-Zellen können Antikörper von rekombinanter bispezifischer Einzelkettenkassetten-DNA exprimieren: Wir begannen, ein System zur transienten Expression von Antikörpern in Säugerzellen zu entwickeln, um ihre schnelle Detektion, Reinigung und Charakterisierung zu erleichtern. Es war wichtig, dass das System flexibel genug war, um Moleküle verschiedener Spezifitäten aufzunehmen und Domänenaustausche zu erlauben, um Erzeugung, Prüfung und Vergleich zwischen verschiedenen bispezifischen Einzelkettenantikörpern zu vereinfachen. Ein transientes Expressionssystem auf Basis von COS-Zellen wurde von früheren Forschern erfolgreich verwendet, um lösliche Zelloberflächenrezeptoren zu exprimieren, in dem Fusionsproteine zwischen der extrazellulären Domäne des Oberflächenrezeptors und der schweren Kette des menschlichen Immunglobulins IgG1 hergestellt wurden (Aruffo and Seed, 1987b; Linsley et al., 1991b).
Dieses System wurde als attraktive Alternative zu bakteriellen Expressionssystemen ausgewählt, da die Moleküle sezerniert werden und leicht in aktiver Form aus den Kulturüberständen gewonnen werden konnten. In anfänglichen Experimenten wurde untersucht, ob ein transientes Expressionssystem auf Basis von COS-Zellen im Stande ist, unter Verwendung von cDNA anstelle von genomischen Sequenzen funktionale intakte IgG-Moleküle zu exprimieren und zu sezernieren. κ- und γ-cDNA-Kassetten mit voller Länge, die Spezifität gegen das Tumorantigen L6 codierten, wurden in pCDM8 ligiert und die Vektoren mit den Inserts wurden durch das DEAE-Dextrat-Verfahren in COS-Zellen cotransfiziert. Es wurde gefunden, dass die Kulturüberstände Proteinspiegel im Bereich von 100-500 ng/ml an L6-positive Tumorzellen bindende Aktivität enthielten, was zeigte, das COS-Zellen native Antikörper aus rekombinanten bispezifischen Einzelkettenkassetten-DNA herstellen und sezernieren konnten.
Anpassung von Vektoren zur Expression in Säugerzellen: Nachdem wir erst die Fähigkeit der COS-Zellen, solche Moleküle zu exprimieren, sichergestellt hatten, modifizierten wir die Expressionsvektoren pCDM8 und piLNXAn, um unter Verwendung austauschbarer Kassetten, die individuelle Proteindomänen codierten, Einzelkettenantikörpermoleküle zu exprimieren. Die Vektoren pCDM8 und piLNX verwenden entweder den Cytomegalievirus- oder den AMV-Promotor und -Enhancer, um die Expression von in die Polylinker-/Platzhalter-Region stromabwärts der Kontrollregionen inserierten Genen zu erreichen. Diese Region wurde dahingehend abgeändert, dass sie zwei kurze cDNA-Kassetten enthielt, die die Insertionsstelle für die variable Region in dem Polylinker flankierten. 1 stellt die Modifikationen am Vektor dar und ist eine schematische Ansicht der Vektormodifikationen und der Konfiguration der variablen Regionen für exprimierte Einzelkettenmoleküle. Ein HindIII-SalI-Fragment, das das Leader-Peptid aus der variablen Region der L6-κ-Leichtkette enthielt, wurde am 5'-Ende des Polylinkers eingefügt, um die Sekretion der damit fusionierten Moleküle zu erreichen. Ein BclI-XbaI-Fragment, das die Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen des menschlichen IgG1 codierte, d. h. ein molekularer Marker, wurde im richtigen Leseraster am 3'-Ende des Polylinkers angefügt, um Detektion und Reinigung von Molekülen mit verschiedenen Spezifitäten zu erleichtern. Einzelkettenantikörper-DNA-Kassetten, die die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten codierten, wurden über einen kurzen Peptidlinker miteinander verbunden und als SalI-BclI-Fragmente (manchmal wurden andere kompatible Enden verwendet) zwischen diesen beiden kurzen flankierenden Kassetten eingefügt, so dass ein einzelner offener Leserahmen gebildet wurde. Wir haben somit existierende Expressionsvektoren für Säugerzellen angepasst, um wirksame Expression von cDNA-Kassetten, die Einzelkettenantikörpermoleküle (SCAs) beliebiger Spezifität codieren, zu erreichen. Das System erlaubt die schnelle Expression, Reinigung, Durchmusterung und Veränderung von Fusionsproteinen, so dass Kassetten, die verschiedene molekulare Marker, Linker und Bindungsspezifitäten codieren, im Hinblick auf ihre relative Effektivität in der Expression funktionaler löslicher Moleküle verglichen werden können.
Konstruktion und Expression einzelkettiger monospezifischer L6F_V-Ig-, CD3 F_V-Ig- und bispezifischer CD3-L6Ig-Antikörperderivate: zwei unterschiedliche Bindungsspezifitäten wurden als Modelle verwendet, um das angepasste Expressionssystem für Einzelkettenantikörper zu testen. Die variablen Regionen für die schwere und leichte Kette von Antikörpern gegen das L6-Tumorantigen und den CD3-T-Zell-Oberflächenrezeptor wurden wie in Material und Methoden beschrieben isoliert.
Die variablen Regionen von anti-L6 oder G19-4 wurden durch Overlap-Extension-PCR zu einer einzelnen codierenden Region zusammengefügt, um einen (Gly₄Ser)₃-Linker zwischen dem Carboxyterminus von V_L und dem Aminoterminus von V_H zu schaffen.
2A zeigt den einzelnen offenen Leserahmen, der durch Fusion der Sequenzen der variablen Regionen der leichten und schweren Kette des G19-4-Antikörpers mit dem (Gly₄Ser)₃-Linker geschaffen worden war.
cDNA-Konstrukte, codierend das Leader-Peptid aus der variablen Region der leichten Kette von L6 (gepunktete Region), die das CD3- bzw. L6-Antigen bindende Domäne (unschattierte Region) und die menschliche IgG1-Fc-Domäne, wurden wie in Material und Methoden beschrieben konstruiert (2a).
In 2A wurde der Säugerexpressionsvektor pCDM8 modifiziert, indem das Platzhalter-Fragment entfernt und durch Adaptersequenzen für die Expression von Einzelkettenantikörpermolekülen ersetzt wurde. Ein HindIII-SalI-Fragment, das das Leader-Peptid aus der variablen Region der leichten Kette von anti-L6 codierte, wurde eingefügt, um Sekretion der exprimierten Moleküle zu erreichen. Die Fc-Domäne des menschlichen IgG1 wurde stromabwärts als BclI-XbaI-Segment eingefügt, um die Detektion, Reinigung und Charakterisierung der Fusionskonstrukte zu erleichtern. Für die CD3-Konstrukte wurde auch eine kleinere molekulare Markersequenz, die einen Teil der V3-Schleife des gp110 aus HIV codierte, verwendet. Zwischen der Leader-Sequenz und dem Marker wurde eine Fusionskassette zwischen V_L und V_H eingefügt, wobei die beiden Domänen durch einen (Gly₄Ser)₃-Aminosäurenlinker getrennt wurden.
Eispezifische Moleküle konnten hergestellt werden, indem man eine zweite V_L-V_H-Kassette an der BclI-Schnittstelle zwischen der ersten Kassette und der Fc-Domäne einfügte. Die zwei Bindungsspezifitäten wurden voneinander durch ein Oligonukleotid getrennt, das einen 27 Aminosäuren langen helikalen Peptidlinker codierte, um sterische Behinderungen zu verhindern und die Löslichkeit zu verbessern.
Die dargestellten Sequenzen zeigen die Übergangsstellen zwischen den Domänen, wobei die während der Konstruktion eingeführten Aminosäuren in Fettschrift hervorgehoben sind.
Die Fusionskassetten mit der variablen Region wurden in den modifizierten Expressionsvektor eingefügt, um die Fusionsgene herzustellen, die in 2A schematisch dargestellt sind, und dann in COS-Zellen transfiziert. Verbrauchtes serumfreies Medium wurde geerntet, und die Proteine wurden durch Affinitätschromatographie mit Protein A gereinigt. Western Blots von reduzierendem oder nicht reduzierendem SDS-PAGE unterzogenen Proteinen wurden mit Ziege-anti-Mensch-IgG, mit Alkalischer Phosphatase konjugiert, sondiert, wie in 2B dargestellt. Die Felder A und B illustrieren, dass die L6Fv-Ig- und CD3Fv-Ig-Fusionsproteine sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht reduzierenden Bedingungen als eine einzige Spezies mit einem Molekulargewicht von 55000 Dalton wanderten, ungefähr der für diese Einzelketten-antikörperderivate erwarteten Größe. In ähnlicher Weise wanderte das bispezifische CD3-L6FvIg-Molekül als einzelne Spezies mit einem Molekulargewicht von etwa 94000 Dalton unter jeder dieser Bedingungen. Im Vergleich hierzu zeigten chimäre L6-mAb oder Dimere des Wild-Typ L6 (WTD), die aus mit Wildtyp-Sequenzen für den menschlichen Antikörperteilgelenk-CH2-CH3 fusionierten murinen variablen Regionen bestanden, in Abhängigkeit von Reduktion und Denaturierungsgrad erhebliche Unterschiede in elektrophoretischer Beweglichkeit, was zeigte, dass die konstanten Regionen der schweren Ketten dieser Moleküle sich durch Disulfidbrückenbildung zusammenschlossen und dimerisierten. Gelegentlich zeigten Western Blots von nicht reduzierenden SDS-PAGE für die monospezifischen Moleküle eine sehr schwache Bande, die bei einem Molekulargewicht von mehr als 100 kDa wanderte, und die mit einem Molekulargewicht von mehr als 200 kDa wanderte.
Die V_L-V_H-Fusionskassette wurde so in den angepassten Vektor eingefügt, dass ein einzelner offener Leserahmen entstand, der das Signalpeptid der leichten Kette von anti-L6, die fusionierte variable Region, die die Bindungsspezifität des Antikörpers codierte, und die Fc-Domäne des menschlichen IgG1 umfasste. Die bispezifische CD3-L6-Fusionskassette entstand durch Fusionierung der CD3- und L6-Fusionskassetten über einen kurzen helikalen Peptidlinker, und sie wurde wie bei den monospezifischen Konstrukten eingefügt. Der bei den ersten Tests des Expressionssystems verwendete molekulare Marker war ein mutiertes Derivat des menschlichen Fc, in dem die Disulfide des Gelenkbereichs durch Serinreste ersetzt worden waren, um die Bildung von Disulfidbrücken zwischen den Ketten zu verringern oder zu verhindern. Diese Einzelkettenkonstrukte wurden individuell in COS-Zellen transfiziert, und die Fusionsproteine wurden aus den Kulturüberständen durch Affinitätschromatographie auf immobilisiertem Protein A aufgereinigt.
Die Ausbeuten an gereinigten Proteinen betrug typischerweise ungefähr 2 mg/Liter für das L6Ig-Fusionsprotein, ungefähr 10 mg/Liter für CD3Ig und ungefähr 0,5 mg/Liter für das bispezifische CD3-L6Ig-Molekül. Western Blots von Proteinen, die nichtreduzierenden SDS-PAGE unterzogen wurden und mit Ziege-anti-Mensch-IgG, mit Alkalischer Phosphatase konjugiert, sondiert worden waren, sind in 2B dargestellt. In den CD3Ig- und L6Ig-Spuren ist eine einzige Spezies sichtbar, die bei einem Molekulargewicht von 55000 Dalton wandert, der für diese Einzelkettenantikörperderivate erwarteten ungefähren Größe, jedoch in der Negativkontrollspur keine solche (2B). Das bispezifische CD3-L6Ig-Molekül wandert mit einem Molekulargewicht von ungefähr 95000 bis 98000 Dalton, wobei eine Bande mit höherem Molekulargewicht bei einem Molekulargewicht von mehr als 200000 Dalton sichtbar ist (2B).
Bindungsaktivitäten der Fusionsproteine L6Ig, CD3Ig und CD3-L6Ig: Um die funktionalen Aktivitäten unserer Einzelkettenantikörperderivate zu untersuchen und sicherzustellen, dass die Moleküle spezifisch Antigene binden konnten, testeten wir zuerst die Bindung der Fc-Fusionsproteine an Zellen, die das Zielantigen exprimierten. Die menschliche Tumorzelllinie H2981 exprimiert ein hohes Maß an L6-Zielantigen, aber nicht CD3 oder BR96, während die menschliche H3396-Tumorzelllinie ein hohes Maß an BR96 exprimiert, aber kein L6 oder CD3, und die menschliche Jurkat-Zelllinie exprimiert CD3, aber kein L6 oder BR96. Die Bindung wurde durch fluoreszenzaktivierte Zytometrie unter Verwendung von FITC-konjugiertem Ziege-anti-Mensch-Ig als Zweitantikörper gemessen. Wie in 3 dargestellt, binden die Fusionsproteine ähnlich wie die nativen Ausgangsantikörper (d. h. die nativen anti-L6- und G19-4-Antikörper) an Zellen, die die Zielantigene exprimieren, aber binden nicht an Zellen, denen nachweisbare Mengen des Antigens fehlen. Das bispezifische CD3-L6Ig-Fusionsprotein band sowohl an Jurkat- als auch an H2981-Zellen, ein indirekter Hinweis, dass die Moleküle mehr als eine Spezifität besitzen. Ähnliche Ergebnisse wurden unabhängig davon beobachtet, ob die Detektion mit Ziege-anti-Mensch-IgG oder einem gegen die L6-Bindungsspezifität gerichteten FITC-konjugierten anti-idiotypischen Antikörper durchgeführt wurde.
Die Antikörperderivate wurden bei einer Konzentration von 10 μg/ml mit H2981-Tumorzellen (L6-positiv), Jurkat-Zellen (CD3-positiv) oder H3396-Tumorzellen (BR96-positiv) inkubiert (3). Die Zellen wurden gewaschen und mit FITC-konjugiertem Ziege-anti-Mensch-IgG als Zweitantikörper inkubiert. Eine Gesamtzahl von 10000 gefärbten Zellen wurde dann zytometrisch analysiert (3). 3 zeigt, dass L6Ig, CD3Ig und CD3-L6-Ig an die Zellen binden, die das Zielantigen exprimieren.
Zur Erkundung der biologischen Eigenschaften der Fusionsproteine wählten wir verschiedene funktionale Assays auf der Basis der erwarteten oder erwünschten Eigenschaften jedes einzelnen Moleküls. Die Ergebnisse werden daher für jedes Einzelkettenmolekül getrennt dargestellt werden, angefangen mit den L6Ig-Einzelkettenantikörperderivaten.
Wirkungen von Variationen in der Molekularmarkersequenz auf die Bindungsaktivitäten von L6-Fusionsproteinen: Mehrere verschiedene Molekularmarkersequenzen wurden wie unter Material und Methoden beschrieben hergestellt und mit der L6-Bindungsdomäne fusioniert, um zu bestimmen, ob exprimierte Fusionskonstrukte unter Verwendung dieser Regionen als Bindungsziele für Protein A oder gegen sie gerichtete spezifische Antikörper detektiert und gereinigt werden können. C-κ, das HIV-Peptid und das FLAG-Peptid funktionierten nicht als zuverlässige molekulare Marker, wenn sie direkt mit der L6-Bindungsdomäne fusioniert waren. Alle drei dieser Peptide führten dazu, dass die transfizierten Zellen kein erkennbares L6 exprimierten. Selbst wenn die Detektion nicht von dem molekularen Marker abhing, sondern man die L6-anti-idiotyp-Antikörper verwendete, war in Bindungsassays an H2981-Tumorzellen kein funktionierendes Fusionsprotein nachweisbar.
Wirkungen von Variationen in der Fc-Domäne auf die Effektorfunktionen von L6-Derivaten: Es wurden andere L6-Derivate einschließlich eines einfachen sFv der L6-Bindungsdomänen ohne molekularen Marker (sFv) und mehrere an verschiedene mutierte Fc-Domänen angefügte -Ig-Fusionen hergestellt. Jedes Fc-Konstrukt erhielt eine Bezeichnung auf der Basis der in der Gelenk- und/oder CH2-Domäne eingeführten Mutationen, wie in 4A und 4B dargestellt. Der Wildtyp-Dimer (WTD) ist für alle Fc-Sequenzen Wildtyp, in Bezug auf die Aminosäurenreste in dieser Region mit dem nativen Antikörper identisch. Die Monomerkon strukte enthalten Sequenzveränderungen, d. h. Austausch von Cysteinresten, die die Disulfide im Gelenkbereich in Serine umwandeln (HS1). Die monomere Mutante 1 (auch als mut 1 bekannt) (HS2) enthält einen Prolin zu Serin Austausch an Position 238 in der CH2-Domäne, einer zur Ausübung der IgG1-Effektorfunktion wichtigen Region. Das Monomer mut 1 (HS3) ist in dieser Region von CH2 an mehreren Resten mutiert (234-238). Das dimere mut 1 (DM1) enthält in der Gelenkregion der Fc-Domäne Wildtyp-Sequenzen, aber ist im Hinblick auf die CH2-Sequenzen, die die Reste 234-238 codieren, ebenfalls mutiert.
Der Sfv für L6 enthält nach der L6-V_L-V_H-Fusionskassette einen Stopcodon anstelle irgendeiner anderen Molekularmarker-Peptidsequenz. Jedes dieser Moleküle wurde konstruiert und in COS-Zellen transfiziert, und die exprimierten Proteine wurden entweder über Protein A-Sepharose oder über eine Säule mit immobilisiertem L6-anti-idiotyp-Antikörper gereinigt. Die Fusionsproteine wurden mit nativem chimären L6-Antikörper und mit Fab'-Derivaten in Sättigungs- und Bindungsinhibitions-AnaLysisn verglichen (4C-D). Die L6-Fc-Mutanten brachten Sättigungskurven hervor, die denen des nativen Antikörpers sehr ähnlich waren (4C), während das Sfv-Fusionsprotein schlecht band (4B). Die Inhibitionsuntersuchungen wurden durch Inkubation zunehmender Mengen des Testantikörpers mit den Tumorzellen vor Zugabe des FITC-konjugierten chimären L6 durchgeführt. Abermals beobachteten wir ähnliche Kurven für alle -Ig-Fusionen und chimären Antikörper (4D), wobei Sfv und Fab'- eine verringerte Fähigkeit zeigten, die Bindung des nativen Antikörpers zu inhibieren (4C). Obwohl es außerstande war, mit der Bindung des nativen Antikörpers zu kompetieren oder sie zu inhibieren, ergaben sich mit dem Sfv-Fusionsprotein in diesem Versuch geringfügig bessere Ergebnisse als mit dem chemisch hergestellten L6-Fab'-Molekül.
Die relativen Befähigungen dieser Moleküle, die mit menschlichem IgG1 verbundenen Effektorfunktionen zu vermitteln, wurden durch Assays für antikörpervermittelte zelluläre Cytotoxizität (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) oder komplementabhängige Cytotoxizität (complement dependent cytotoxicity, CDC) gemessen, und die spezifische Lysis wurde als Funktion der Antikörperkonzentration aufgetragen. Während keine der in der Gelenkregion defekten Mutanten im Hinblick auf ihre Fähigkeit, ADCC zu vermitteln, betroffen war, waren alle der Mutanten im Bereich der CH2-Domäne unfähig, diesen Prozess zu vermitteln. Überraschenderweise entdeckten wir, dass, obwohl chimäres L6 sehr gut CDC vermittelte, keines der L6-Derivate im Stande war, komplementvermittelte Lysis der Tumorziele zu stimulieren.
Eine oder mehrere variable Regionen aus dem gegen das menschliche Tumorantigen L6 gerichteten murinen Antikörper wurden mit mehreren Derivaten der Fc-Domäne aus menschlichem IgG1 fusioniert, in COS-Zellen exprimiert, und die Fusionsproteine wurden durch Affinitätschromatographie aufgereinigt (10A-D).
Jede konstruierte Fc-Domäne ist dargestellt, wobei die Sequenzveränderungen durch unterstrichene Aminosäuren bezeichnet sind (10A-D). Das gereinigte Protein jedes Konstrukts wurde mit chimärem L6 in Sättigungs- und Inhibitionsmessungen verglichen. Weiterhin wurde die Fähigkeit dieser Moleküle gemessen, normale IgG1-Effektorfunktionen wie ADCC und CDC zu vermitteln, indem H2981-Tumorzellen 2 Stunden lang mit ⁵¹Cr markiert wurden, gewaschen und IMDM + 10 % FCS zugesetzt wurden, das eine 10fache serielle Verdünnung des Antikörpers enthielt sowie entweder menschliche periphere Blutlymphozyten (ADCC) oder Kaninchenkomplement (CDC). Die Ansätze wurden 4,5 Stunden lang inkubiert, zentrifugiert, und die freigesetzte Radioaktivität wurde mit einem γ-Zähler gemessen. Die Werte stellen die Mittelwerte dreifacher Ansätze dar (Standardabweichung < 10 %).
CD3-Einzelkettenantikörper zeigen biologische Aktivitäten, die denen des nativen Antikörpers qualitativ ähnlich, aber quantitativ anders sind: mehrere verschiedene CD3-Fusionsproteine wurden konstruiert, darunter ein -Ig-Fusionsprotein, ein HIV-Peptid-Fusionsprotein, ein V_L-V_H-sFv (kein Marker) und das bispezifische CD3-L6-Fv-Ig-Molekül.
Das HIV-Peptid diente als zuverlässiger molekularer Marker, wenn es mit CD3 fusioniert war. Es erlaubte die Detektion und Reinigung von CD3-Einzelketten-Fusionsproteinen. Die markierten Moleküle wurden durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von immobilisiertem Protein A (-Ig-Fusionen) oder 110.3-Antikörper (HIV-Fusionen) gereinigt. Das einfache Sfv wurde als filtrierter Überstand verwendet, und die ungefähren Konzentrationen der Lösung wurden abgeschätzt, indem die Fähigkeit des Überstands titriert wurde, die Bindung des G19-4-Antikörpers an Jurkat-Zellen zu inhibieren. Wir wollten die durch die Bindung dieser veränderten Moleküle an den CD3-7-Zell-Rezeptor-Komplex ausgelösten zellulären Wirkungen untersuchen. Jedes Molekül wurde an Indo-1-beladene periphere Blutlymphozyten oder T-Zellen gebunden, und die Mobilisierung des intrazellulären Calciums wurde durch Durchflusscytometrie gemessen. Wie in den 5A-D gezeigt, wurde im Vergleich zur äquivalenten Konzentration des nativen G19-4-Antikörpers die Transmembransignalübertragungsaktivität sowohl für die Ig- als auch für die HIV-Fusionsproteine erhöht. Das einfache Sfv erzeugte zwar ein Calciumsignal, doch war dies weder so intensiv noch so lang wie das mit dem nativen Antikörper beobachtete.
Die Sequenzen der variablen Regionen von anti-CD3 sind in 11 dargestellt, einschließlich der Verbindungssequenzen für die mono- und bispezifischen Derivate. Die Ig-Fusionsproteine wurden durch Affinitätschromatographie unter Verwendung immobilisierten Proteins A gereinigt, und das Sfv wurde als filtrierter Überstand verwendet. Die Konzentration des Sfv wurde durch Titration der Fähigkeit des Transfektionsüberstandes abgeschätzt, die Bindung bekannter Konzentrationen des monoklonalen G19-4-Antikörpers an Jurkat-Zellen zu inhibieren. Um die Signalaktivität des CD3Fv-Ig-Moleküls zu untersuchen, wurde es auf seine Fähigkeit geprüft, Tyrosinphosphorylierung von PLCγ1 auszulösen. Jurkat-T-Zellen wurden mit dem CD3Fv-Ig oder mit nativem G19-4-Mab stimuliert, und die Proteine aus den Zell-Lysaten wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine PDVF-Membran transferiert und mit Antikörpern gegen entweder Phosphotyrosin oder PLCγ1 sondiert. Überraschenderweise fanden wir, dass das CD3Fv-Ig starke Tyrosinphosphorylierung zellulärer Proteine in den gesamten Zell-Lysaten, einschließlich von PLCγ1, auslöst, und das eine größere Menge des pp35/36-Phosphoproteins sich mit PLCγ1 assoziierte (12A-B). Weiterhin lösten sowohl das CD3Fv-Ig- als auch das CD3-Sfv-Protein Calciumströme in peripheren Blutleukozyten aus, die von größeren Dimensionen als die für äquivalene Konzentrationen des nativen G19-4-Mab beobachteten waren.
In 11 wurden die variablen Regionen der schweren und der leichten Kette des anti-CD3-Antikörpers G19-4 durch PCR kloniert. Die Nukleotid- und Proteinsequenz des aus diesen cDNA-Kassetten konstruierten Fusionsgens ist dargestellt, wobei der (Gly₄Ser)₃-Linker in Fettschrift angezeigt ist. Der Aminoterminus der V_L-V_H-Fusionskassette wurde an der SalI-Schnittstelle mit dem Leader-Peptid der variablen Region der leichten Ketten von anti-L6 fusioniert, und der Carboxyterminus wurde an der PclI-Schnittstelle direkt mit der Gelenkregion der Fc-Domäne oder mit einem kurzen „helikalen" Peptidlinker fusioniert, um das bispezifische CD3-L6FvIg-Antikörperderivat zu konstruieren. Die variablen Regionen für L6 wurden im Leseraster mit den entgegengesetzten Enden des „helikalen" Linkers fusioniert, wie in 1 und 2 dargestellt.
In den 12A-B wurden Jurkat-Zellen (10⁷ pro Probe) 1 oder 3 Minuten lang mit dem nativen anti-CD3-Mab G19-4 in Konzentrationen von 5, 20 oder 80 μg/ml oder mit CD3FvIg in Konzentrationen von 1, 5 oder 20 μg/ml, wie bezeichnet, stimuliert. Die Proteine aus den Zell-Lysaten wurden mit anti-Phosphotyrosin-Kaninchenantikörpern (Feld A) oder Antiserum gegen PLCγ1 (Feld B) immunopräzipitiert und mit Protein A-Sepharose gewonnen, durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit gereinigtem anti-Phosphotyrosin-Kaninchenantikörper und Iod-125-markiertem Protein A detektiert.
Die 5A-D sind Liniendiagramme, die zeigen, dass die CD3FvIg-Fusionsderivate verschiedene Maße transmembranärer Signalübertragungsaktivität zeigen. Die 5A-B zeigen, dass CD3FvIg intrazelluläres Calcium in T-Zellen aus peripherem Blut mobilisiert. Durchflusscytometrie und der calciumbindende Farbstoff Indo-1 wurden verwendet, um die Konzentrationen intrazellulären freien Calciums ([Ca²⁺]) nach Stimulation mit CD3FvIg (_;_;_), nativem monoklonalen Antikörper gegen CD3 (----) oder einem nicht an T-Zellen bindenden Kontroll-L6FvIg (....). Jeder Stimulus (2 μg) wurde Indo-1-beladenen T-Zellen zum Zeitpunkt 1 Minute zugesetzt, wobei 130 nm = ruhende Zellen und Prozentangabe = reagierende Zellen.
Die 5C-D zeigen, dass vor Behandlung mit CD3FvIg die Antwort von T-Zellen aus peripherem Blut auf nachfolgende Stimulationen durch CD2-Quervernetzung verringert. Die Indo-1-beladenen Zellen wurden 15 Minuten lang bei 37 °C mit 1 μg CD3FvIg, 2 μg nativen monoklonalen Antikörpers gegen CD3 oder L6FvIg (nicht an T-Zellen bindende Kontrolle) inkubiert. Biotinylierter Antikörper gegen CD2 (5 μg) wurde zum Zeitpunkt 1 Minute zugesetzt und zum Zeitpunkt 5 Minuten durch Avidin (20 μg) quervernetzt. Die Reaktionen auf die CD2-Quervernetzung wurden dann 5 Minuten lang gemessen. Die Daten sind dargestellt als ([Ca²⁺]), wobei 130 nM = ruhende Zellen (Feld A) und Prozentangabe = reagierende Zellen (Feld B).
Bei Proliferationsmessungen peripherer Blutlymphozyten und gereinigter T-Zellen in Reaktion auf Stimulation durch verschiedene Konzentrationen der CD3-Antikörperderivate fanden wir, dass alle CD3-Derivate die T-Zellen aktivierten. In Tabelle 1 sind die bei Behandlung mit Antikörperkonzentrationen von 1 μg/ml gemessenen proliferativen Reaktionen dargestellt. Ein ähnliches Muster der proliferativen Reaktionen wurde sowohl bei 0,2 als auch bei 5 μg/ml beobachtet. Die Daten zeigen, dass die Bindung der CD3-Derivate in T-Zellen proliferative Reaktionen ähnlich den entweder mit nativem G19-4 (im Vergleich zu CD3Fv-Ig) oder dem Farbfragment (im Vergleich zu sFv) des murinen Antikörpers beobachteten hervorruft. Die gentechnisch veränderten Moleküle stimulierten gereinigte T-Zellen zu geringfügig höherem Maß an Proliferation und periphere Blutlymphozyten zu geringfügig geringerem Maß, mit der Ausnahme, dass CD3Fv-Ig) mit PMA synergistisch wirkt und bei peripheren Blutlymphozyten stärkere proliferative Antworten hervorruft, als sie mit nativem G19-4 beobachtet werden.
Da die beiden markierten CD3-Fusionsproteine stärkere Transmembransignalübertragungsaktivitäten zeigten als der native Antikörper, wollten wir bestimmen, wie diese Moleküle die Proliferation von T-Zellen beeinflussten. Periphere Blutlymphozyten und gereinigte T-Zellen wurden 72 Stunden lang mit Antikörperderivaten in verschiedenen Konzentrationen inkubiert und vor Ernte und Messung 6 Stunden lang mit tritiummarkiertem Thymidin gepulst. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Antikörperbehandlungen bei einer Konzentration von 1 μg/ml. Ein ähnliches Muster proliferativer Antworten wurde auch bei Konzentrationen sowohl von 0,2 als auch 5 μg/ml beobachtet.
Tabelle 1: CD3-Einzelkettenmoleküle stimulieren die Proliferation von T-Zellen in Gegenwart von Monocyten und wirken in Gegenwart von PMA oder 9.3 synergistisch auf die Aktivierung von T-Zellen.
Die Proliferation wurde nach 72 Stunden in Kultur gemessen, indem die Zellen 6 Stunden lang mit 1 μCi/Napf an tritiummarkiertem Thymidin gepulst wurden. Die T-Zellen wurden von Monozyten und B-Zellen durch zwei Runden der Adhäsion an Kunststoff, gefolgt von Passage über Nylonwollsäulen, abgetrennt.
Die Daten zeigen, dass unter den Untersuchungsbedingungen die Bindung der CD3-Derivate bei T-Zellen proliferative Antworten ähnlich den mit entweder G19-4 (Ig-Fusion) oder dem Fab-Fragment (HIV- und Stopp-Fusionen) des murinen Antikörpers beobachteten auslöst. Die gentechnisch veränderten Moleküle neigten dazu, gereinigte T-Zellen in etwas stärkerem und periphere Blutlymphozyten in etwas geringerem Maß zur Proliferation zu reizen, obwohl die Unterschiede in den meisten Fällen nicht signifikant sind. Die einzige Ausnahme von diesem Muster ist die im Vergleich zum nativen G19-4 stärkere proliferative Antwort, die von den CD3sFvIg- und CD3HIV-Konstrukten in Synergie mit PMA ausgelöst wird.
Das bispezifische CD3-L6 Fusionsprotein vermittelt Adhäsion zwischen Jurkat- und H2981-Tumorzellen. Ein zuvor entwickeltes Zelladhäsionsassay (Linsley et al., 1990a) wurde verwendet, um zu ermitteln, ob ein einzelnes bispezifisches CD3-L6-Molekül gleichzeitig an CD3- und L6-exprimierende Zellen binden kann. Zuerst wurden Jurkat-Zellen mit anti-CD3 oder mit CD3-L6FvIg inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit oder ohne L6FvIg präinkubierten adhärenten H2981-Zellen zugesetzt. Die mikroskopische Untersuchung der H2981-Einzelschichten (6) zeigte, dass das CD3-L6FvIg-Protein in Gegenwart von EDTA Adhäsion zwischen Jurkat- und H2981-Zellen vermittelte, aber nur, wenn die CD3- und L6-Rezeptoren nicht durch einen Liganden blockiert waren. Um quantitativ zu zeigen, dass die Moleküle echte Bifunktionalität besaßen, wurden Jurkat-Zellen mit ⁵¹Cr vormarkiert und dann mit dem Fusionsprotein und den H2981-Tumorzellen inkubiert. Die Anzahl der in Gegenwart des bispezifischen CD3-L8-Fusionsproteins an die unmarkierte Zellschicht gebundenen radioaktiven Zerfälle war erheblich höher als bei Zellen, die mit den unverbundenen CD3- und L6-Antikörpern vorbehandelt waren.
Das bispezifische CD3-L6Ig-Fusionsprotein dirigiert die Cytotoxizität von T-Zellen auf H2981-Tumorzellen (7). H2981-Tumorzellen wurden 2 Stunden lang mit ⁵¹Cr markiert und mit Antikörper-Stimuli und peripheren Blutlymphozyten bei Effektor-zu-Ziel-Verhältnissen von 10 1 und 100 : 1 inkubiert (7). Die Chromfreisetzung wurde wie unter Material und Methoden beschrieben gemessen, und die spezifische Lysis ist für jedes Antikörperderivat anhand von Dreifach-Messungen (Standardabweichung < 12 %) aufgelistet (7). Für Inhibitionsmessungen wurden die monospezifischen CD3- oder L6Ig-Derivate vor dem Zusatz des bispezifischen CD3-L6Ig-Moleküls mit dem entsprechenden Zelltyp inkubiert (7). Die Präinkubation mit keinem von beiden monospezifischen Molekülen konnte die Stimulation der Cytotoxizität durch das bispezifische Konstrukt inhibieren (7).
Das bispezifische CD3-L6-Fusionsprotein dirigiert die Cytotoxizität von T-Zellen auf H2981-Tumorzellen. Als nächstes wollten wir die biologischen Konsequenzen der Kopplung dieser zwei antigenbindenden Domänen zu einem einzigen Molekül bestimmen. Wir argumentierten, dass gentechnisch hergestellte bifunktionale Moleküle, die die Adhäsion zwischen Tumorzellen und T-Zellen fördern, die Natur oder Größenordnung der Antworten auf die Rezeptorbindung verändern können.
Um störende Beiträge IgG-vermittelter Effektorfunktionen auszuschalten, wurde der antigenbindende Teil des Moleküls mit dem monomeren Fc-Mutanten verbunden, die als Ergebnis eines Prolin zu Serin-Austauschs in CH2 und mehrerer Cystein zu Serin-Austausche im Gelenkteil diese Funktionen nicht vermitteln kann. Ein standardmäßiger Cytotoxizitätstest unter Verwendung von H2981-Tumorzellen als Ziele für die Lysis wurde durchgeführt. Ruhende periphere Blutlymphozyten wurden als Effektorzellen verwendet, um herauszufinden, ob ruhende oder native Zellen aktiviert werden konnten, um ihre Cytotoxizität auf den Tumor zu richten (7).
Bei einem Effektor-zu-Ziel-Verhältnis von 10 : 1 vermittelte das CD3-L6fvIg-Molekül eine spezifische Lysis von 30 %, während bei einem Verhältnis von 100 : 1 die spezifische Lysis auf 71 % anstieg. Das Ausmaß der spezifischen Lysis betrug für ein Gemisch von DE3FvIG und L6FvIg oder jedes dieser Moleküle allein 3 % bis 5 % bei E : Z von 10 : 1 und 9 % bis 20 % bei E : Z von 100 : 1. Obwohl die Cytotoxizität geringfügig verringert wurde, konnten die CD3FvIg- und L6FvIg-Antikörperderivate die durch das CD3-L6-Fusionsprotein dirigierte Cytotoxizität nicht vollständig blockieren. PHA-aktivierte T-Zell-Blasten wurden ebenfalls als Effektoren in diesem Assay verwendet, aber sie zeigten ein hohes Maß unspezifischer Abtötung.
Das bispezifische CD3-L6Ig-Fusionsprotein stimuliert hohe Niveaus der T-Zell-Proliferation, wenn es an H2981-Tumorzellen gebunden ist (8). Leukozyten aus peripherem Blut wurden isoliert und in Gegenwart der gekennzeichneten Stimulatoren der T-Zell-Proliferation und bestrahlter H2981-Tumorzellen in Kultur gehalten. Die Stimulatoren wurden in Lösung in Konzentrationen von entweder 1 oder 10 μg/ml zugesetzt. Für Vorbehandlungsversuche wurde H2981-Tumorzellen bestrahlt und eine Stunde lang auf Eis mit 10 μg/ml des Antikörperderivats inkubiert, dann mehrmals gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen, und in verschiedenen Verhältnissen peripheren Blutlymphozyten in Mengen von 5 × 10⁴ Zellen/Napf zu besetzen. Nach drei Tagen in Kultur wurde die Proliferation anhand der Aufnahme von Tritiumthymidin 6 Stunden lang gemessen. Die Werte wurden durch Vierfach-Messung für jede Behandlung bestimmt (Standardabweichung < 15 %).
Das bispezifische CD3-L6-Fusionsprotein stimuliert in vitro ein hohes Maß an T-Zell-Proliferation. Wir untersuchten, ob eine Auslösung des CD3-T-Zell-Oberflächenrezeptor (CD3/TCR)-Komplexes durch das CD3-L6FvIg-Fusionsprotein die Proliferation von T-Zellen stimulierte. Die Proliferationsassays wurden unter Verwendung von mit bestrahlten H2981-Tumorzellen inkubierten ruhenden peripheren Blutleukozyten und den Stimuli (Fusionsprotein) in Lösung durchgeführt.
Alternativ wurden stimulierende Proteine vor dem Versuch an die bestrahlten Tumorzel len gebunden, und ungebundenes Protein wurde durch mehrere Waschungen vor der Aufnahme in den Versuch entfernt, was Moleküle, die nicht an das L6-Antigen binden können, davon abhielt, zu der Stimulation der T-Zellen durch CD3 beizutragen. Die H2981-Tumorzellen neigten dazu, unspezifisch auch an die in der Fc-Domäne mutierten Antikörperderivate zu binden, weswegen zur Entfernung dieser Quelle unspezifischen Hintergrunds aus dem Assay ein irrelevan ter Antikörper vor der Zugabe der Stimuli von Interesse mit den Zellen inkubiert wurde. 8 zeigt die Ergebnisse der Proliferationsexperimente sowohl in Lösung als auch mit Vorinkubation.
Das Ausmaß der Proliferation stieg in Gegenwart des bispezifischen CD3-L6FvIg-Fusionsproteins bei einer Konzentration von 10 μg/ml erheblich, und selbst bei 1 μg/ml wurde ein deutliches Maß an Proliferation beobachtet. Die Vorinkubation von L6FvIg mit den Tumorzellen vor Zugabe der bispezifischen Moleküle eliminierte diese durch die beschichteten Tumorzellen ausgelöste Stimulation der T-Zell-Proliferation. Das CD3Ig-Fusionsprotein konnte ein erhebliches Maß an Proliferation auslösen, wenn es in Lösung vorlag, unabhängig von Gegenwart oder Abwesenheit der Tumorzellen. Diese Moleküle wurden nachweislich in den Waschschritten des Tumorzell-Präinkubations-Assays entfernt, da unter diesen Bedingungen nur Hintergrundniveaus an Proliferation erreicht wurden. Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des bispezifischen CD3-L6-Fusionsproteins, an H2981-Tumorzellen gebunden, die Cytotoxizität von T-Zellen zu dirigieren und Proliferation zu stimulieren.

Claims

Expressionsvektor, kodierend ein biologisch aktives, bispezifisches Fusionsprotein, umfassend eine rekombinante, bispezifische Einzelketten-Kassette, umfassend (1) eine DNA-Sequenz, die eine erste Bindungsdomäne kodiert, welche ein Ziel zu binden vermag, (2) eine DNA-Sequenz, die eine zweite Bindungsdomäne kodiert, welche ein Ziel zu binden vermag, wobei jede Domäne ein unterschiedliches Ziel zu binden vermag, und (3) einen Linker, der ein hydrophiles, helikales Peptid kodiert, welches die DNA-Sequenz, welche die erste Bindungsdomäne kodiert, und die DNA-Sequenz der zweiten Bindungsdomäne verbindet, worin die erste Bindungsdomäne Moleküle bindet, die ausgewählt sind unter CD1, CD2, CD3, TcR, CD3/TcR, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CDw32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a,b, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49, CDw50, CD51, CDw52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62, CD63, CD64, CDw65, CD66, CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CD76, CDw78, B7, B7(2), CTLA4, BR96, GP39, LFA-3, L6, ICAM-2 und Interleukin (IL) 1-8, und worin die zweite Bindungsdomäne an Moleküle bindet, die ausgewählt sind unter CD1, CD2, CD3, TcR, CD3/TcR, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CDw32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a,b, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49, CDw50, CD51, CDw52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62, CD63, CD64, CDw65, CD66, CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CD76, CDw78, B7, B7(2), CTLA4, BR96, LFA-3, L6, ICAM-2 und Interleukin (IL) 1-8, und worin der Linker eine DNA-Sequenz umfasst, die hydrophile Aminosäuren und wenigstens ein Pentamer EEAKK kodiert.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, worin das helikale Linker-Peptid SEQ ID NO:12 umfasst.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, der weiterhin eine DNA-Sequenz umfasst, die einen molekularen Marker kodiert.
Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die erste Bindungsdomäne an ein beliebiges der Moleküle CD3, TcR, CD3/TcR, L6, CD28, CD40, B7, B7(2), CTLA4 oder GP39 bindet und worin die zweite Bindungsdomäne an ein beliebiges der Moleküle CD3, TcR, CD3/TcR, L6, CD28, CD40, B7, B7(2), CTLA4 oder GP39 bindet.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 4, worin die erste Bindungsdomäne mit CD3, TcR, CD3/TcR, CD28 oder CTLA4 und die zweite Bindungsdomäne mit L6 reaktiv sind.
Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die erste Bindungsdomäne wenigstens ein Teil eines Zelloberflächenantigens ist.
Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die zweite Bindungsdomäne wenigstens ein Teil eines Zelloberflächenantigens ist.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 6 oder Anspruch 7, worin das Zelloberflächenantigen CD3, L6, CD28 oder B7 ist.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 8, worin die erste Bindungsdomäne wenigstens ein Teil des B7-Moleküls ist und die zweite Bindungsdomäne mit L6 reaktiv ist.
Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die erste Bindungsdomäne eine variable Region oder Regionen eines Antikörpers ist.
Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder gemäß Anspruch 10, worin die zweite Bindungsdomäne eine variable Region oder Regionen eines Antikörpers ist.
Als CC9-2 (ATCC-Nr. 69235) bezeichneter Expressionsvektor gemäß Anspruch 11.
In vitro mit dem Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 transfizierte eukaryontische Zelle.
In vivo mit dem Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 transfizierte eukaryontische Zelle, wobei die eukaryontische Zelle ausgewählt ist unter: Schafszellen, Schweinezellen, Mäusezellen oder Rinderzellen.
Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven, bispezifischen Fusionsproteins, wobei man die Zeilen gemäß Anspruch 13 oder 14 kultiviert, um das Protein herzustellen, und das auf diese Weise hergestellte Protein gewinnt.
Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven, bispezifischen Fusionsproteins in einer Säugetierzelle, wobei man: (a) die Säugetierzelle mit dem rekombinanten Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 3 bis 12 transfiziert; (b) die auf diese Weise in Schritt (a) transfizierte Säugetierzelle kultiviert; und (c) das auf diese Weise durch die kultivierte Säugetierzelle hergestellte biologisch aktive, bispezifische Fusionsprotein gewinnt.
Verfahren gemäß Anspruch 16, worin man bei der Gewinnung des biologisch aktiven, bispezifischen Proteins: (a) das biologisch aktive, bispezifische Fusionsprotein durch das Vorliegen des molekularen Markers identifiziert; und (b) das auf diese Weise identifizierte biologisch aktive, bispezifische Fusionsprotein, das den molekularen Marker aufweist, von Molekülen ohne den molekularen Marker abtrennt, wodurch das auf diese Weise von den kultivierten Säugetierzellen hergestellte biologisch aktive, bispezifische Fusionsprotein gewonnen wird.