MXPA03010568A

MXPA03010568A - Metodos para proteger trasplantes alogenicos de celulas de isletas usando moleculas mutantes ctla4 solubles.

Info

Publication number: MXPA03010568A
Application number: MXPA03010568A
Authority: MX
Inventors: B Adams Andrew
Original assignee: Squibb Bristol Myers Co
Priority date: 2001-05-23
Filing date: 2002-05-23
Publication date: 2005-03-07
Also published as: EP1397153A4; HUP0401590A3; CZ305380B6; US20080160022A1; EP1397153A2; PL364578A1; NO20035176L; CA2447921C; WO2002094202A2; DE60225914T2; JP2004535402A; HUP0401590A2; WO2002094202B1; CZ20033188A3; AU2002305716B8; PT1397153E; AU2002305716B2; WO2002094202A3; DE60225914D1; US20030022836A1

Abstract

La presente invencion es un metodo para inhibir el rechazo de transplantes de celulas de isletas, en particular para tratar diabetes, tal como diabetes tipo 1 y tipo 2, al administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una molecula mutante CTLA4 soluble. Un ejemplo de molecula mutante CTW4 soluble es L104EA29YIg.

Description

1 MÉTODOS PARA PROTEGER TRANSPLANTES ALOGENICOS DE CÉLULAS DE ISLETAS USANDO MOLÉCULAS MUTANTES CTLA4 SOLUBLES Campo de la invención La presente invención se refiere generalmente al campo de inhibir el rechazo de transplante de células de isletas. En particular, la invención se refiere a métodos para tratar diabetes, incluyendo diabetes tipo 1 y tipo 2, administrando a un sujeto una cantidad efectiva de moléculas imitantes CTLA4 solubles.

Antecedentes de la invención El transplante de órganos ha surgido como un método de tratamiento preferido para muchas formas de enfermedades que amenazan la vida y que incluyen el daño a órganos. Resultados mejorados en el transplante clínico han sido logrados principalmente a través del desarrollo de fármacos inmunosupresores no específicos cada vez más potentes para inhibir las respuestas de rechazo {Lancet, 345:1321-1325 (1995) ) . Aunque se han mejorado los resultados a corto plazo, las consecuencias a largo plazo permanecen inadecuadas. Actualmente, se requiere de agentes inmunosupresores de por vida para combatir el rechazo crónico del órgano transplantado, y el uso de estos agentes incrementa dramáticamente los riesgos de enfermedades KEF. : 151296 2 cardiovasculares, infecciones y malignidades. El desarrollo de estrategias para promover la aceptación de tejidos alogénicos sin la necesidad de inmunosupresión crónica podría reducir el riesgo de estas complicaciones amenazadoras de vida y expandir ampliamente la aplicación del transplante de órganos, tejidos y células para enfermedades tales como las hemoglobinopatías, inmunodeficiencias genéticas y enfermedades autoinmunes. La diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) es uno de los trastornos metabólicos que más comúnmente ocurren en el mundo. En los Estados Unidos, la IDDM afecta aproximadamente a una de 300 a 400 personas, y estudios epidemiológicos sugieren que la incidencia de la IDDM continúa incrementando. La IDDMA es causada por una respuesta autoinmune que da como resultado la destrucción mediada por linfocitos T de las células de isletas productoras de insulina del páncreas . Una vez que los síntomas clínicos de la IDDM se hacen evidentes, la terapia más comúnmente empleada para controlar los síntomas clínicos de la IDDM es el reemplazo exógeno de insulina. Aunque la terapia de reemplazo de insulina permite que la mayoría de los pacientes de IDDM lleven vidas casi normales, no restablece completamente la homeostasis metabólica, y como resultado, severas complicaciones incluyendo disfunciones del ojo, riñon, 3 corazón y otros órganos son comunes en pacientes diabéticos que se someten a terapia de reemplazo de insulina. Un tratamiento por largo tiempo buscado para pacientes de IDDM es el transplante de células de isletas. Sin embargo, las células de isletas productoras de insulina transplantadas comúnmente son destruidas rápidamente por la misma respuesta autoinmune que destruyó anteriormente las propias células de isletas del paciente. De los 260 aloinjertos transplantados desde 1990, sólo 12.4% han resultado en independencia de insulina durante periodos de más de una semana, y únicamente 8.25% han sido independientes de insulina durante periodos de más de un año (Linsley et al., Diabetes (1997) 46:1120-3). En la mayoría de estos procedimientos, el régimen básico de inmunosupresión consistía en la inducción de anticuerpos con globulina anti-linfocitos combinada con ciclosporina, azatioprina y glucocorticoides . Para cualquier tipo de procedimiento de transplante, un balance entre eficacia y toxicidad es un factor clave para su aceptación clínica. Con respecto al transplante de células de isletas, una preocupación adicional es que muchos de los agentes inmunosupresores actuales con glucocorticoides particulares o un inhibidor de calcineurina, tal como Tarcolimús, dañan células beta o inducen resistencia a insulina periférica (Zeng et al., Surgery (1993) 113:98- 4 102) . Un protocolo inmunosupresor libre de esteroides ("protocolo de Edmonton") que incluye sirolimús, Tarcolimús de baja dosis, y un anticuerpo monoclonal (mftb) contra el receptor IL-2 ha sido usado en una prueba de transplante de células de isletas sólo para pacientes con diabetes tipo 1 (Shapiro, A. M. J. et al., (2000), N, Eng. J. Med., 343:230-238) . El reciente éxito usando el "protocolo de Edmonton" ha renovado el entusiasmo por el uso de transplantes de células de isletas para tratar diabetes. Sin embargo, preocupaciones, que se refieren a la toxicidad del Tarcolimús podrían limitar la aplicación de esta terapia en humanos. Agentes biológicos que bloqueen señales coestimuladoras de células T clave, en particular la vía CD28, son alternativas potenciales para proteger células de isletas alogénicas. Ejemplos de agentes que bloquean la vía CD28 incluyen pero no están limitados a CTLA4 soluble, incluyendo moléculas CTLA4 mutantes .

Breve descripción de la invención La presente invención proporciona métodos para tratar enfermedades del sistema inmunológico, al administrar a un sujeto moléculas mutantes CTLA4 solubles, las cuales se unen a moléculas CD80 y/o CD86 sobre células CD80 y/o CD86 5 positivas, inhibiendo de esta manera moléculas CD80 y/o CD86 endógenas de unirse a CTLA4 y/o CD28 sobre células T, y de esta manera, bloqueando señales coestimuladoras de células T clave, en particular la via CD28. Las moléculas imitantes CTLA4 solubles incluyen, pero no están limitadas a, L104EA29Y, una molécula que tiene mutaciones en el dominio extracelular de CTLA4 en alanina en la posición +29 y/o en leucina en la posición +104, en donde la alanina en la posición 29 es sustituida con tirosina, y la leucina en la posición 104 es sustituida con ácido glutámico. Las moléculas mutantes CTLA4 solubles comprenden además una porción, tal como una molécula de inmunoglobulina, que hace a la proteina mutante soluble. En una modalidad preferida, la L104EA29Y es L104EA29YIg (figura 3) . La presente invención proporciona además métodos para inhibir el rechazo de transplantes de células de isletas en un sujeto al administrar L104EA29Y (por ejemplo, L104EA29YIg) al sujeto que sea sometido a un transplante de células de isletas. La invención proporciona también métodos para tratar diabetes en un sujeto, al administrar un régimen inmunosupresor que comprende L104EA29Y (p.e., L104EA29YIg) al sujeto diagnosticado con diabetes, y transplantar células de isletas . 6 La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas para tratar diabetes, las composiciones comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y mutante CTLA4 soluble, por' ejemplo, L104EA29Y.

Breve descripción de las figuras La figura 1 ilustra la secuencia de nucleótidos completa (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos completa (SEQ ID NO: 2) para el receptor CTLA4 humano fusionado al péptido de señal de oncostatina M. El péptido de señal de oncostatina M es indicado en la posición -25 a -1. La figura 2 ilustra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) y aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de CTLA4Ig que tiene un péptido de señal; una secuencia de aminoácidos tipo silvestre del dominio extracelular de CTLA4 iniciando en metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, o iniciando en alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124; y una región Ig. La figura 3 ilustra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 5) y aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de una molécula mutante CTLA4 (L104EA29YIg) que comprende un péptido de señal; un dominio extracelular imitado de CTLA4 que inicia en metionina en la posición +1 y concluye en ácido aspártico en la posición +124, o que inicia en alanina en la posición -1 y 7 concluye en ácido aspártico en la posición +124; y una región Ig como la descrita en el ejemplo 1, abajo. La figura 4 es una gráfica de linea gue ilustra el nivel de glucosa en plasma en ayunas en un sujeto normal, como se describe en el ejemplo 3, abajo. La figura 5 es una gráfica de linea que ilustra nivel de glucosa en plasma en ayunas en sujetos pancreatectomizados con células de isletas pancreáticas transplantadas como se describe en el ejemplo 3. A los animales se les transplantaron células de isletas el día 0, y se les trató con un régimen inmunosupresor que contenia L104EA29YIg y un régimen inmunosupresor de base (tratado) , o sólo un régimen inmunosupresor de base (control) . El régimen inmunosupresor de base contenia rapamicina e IL2R antihumano. La figura 6 es una gráfica de linea gue ilustra el requerimiento de insulina en sujetos con células de isletas transplantadas como se describe en el ejemplo 3. A los animales se les transplantaron células de isletas el día 0, y fueron tratados con un régimen inmunosupresor que contenia L104EA29YIg y un régimen inmunosupresor de base (tratado) , o sólo un régimen inmunosupresor de base (control) . La figura 7 es una gráfica de linea gue ilustra el nivel de glucosa en sangre en una prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa antes y después del transplante de células de isleta, como se describe en el ejemplo 3. 8 La figura 8 ilustra un diagrama esquemático de un vector, piLN-L104EA29Y, que tiene el inserto L104EA29YIg . Las figuras 9A y 9B ilustran datos de ensayos FACS que muestran la unión de L104EA29YIg, L104Eig y CTLA4Ig a células CHO humanas transfectadas con CD80 o CD86 como se describe en el ejemplo 2, abajo. Las figuras 10A y 10B ilustran la inhibición de la proliferación de células CHO CD80 positivas y CD86 positivas como se describe en el ejemplo 2, abajo. Las figuras 11A y 11B muestran que L104EA29YIg es más efectivo que CTLA4Ig para inhibir la proliferación de células T aloestimuladas primarias y secundarias como se describe en el ejemplo 2 abajo. Las figuras 12A-12C ilustran que L104EA29YIg es más efectivo que CTLA4Ig para inhibir la protección de citocinas IL-2 (fig. 12A) , IL-4 (fig. 12B) y ?-interferón (fig. 12C) de células T humanas aloestimuladas como se describe en el ejemplo 2, abajo. La figura 13 demuestra que L104EA29YIg es más efectivo que CTLA4Ig para inhibir la proliferación de células T de mono estimuladas con fitohemaglutinina (PHA) como se describe en el ejemplo 2 abajo. Las figuras 14A-14C son cromatografías en gel SDS (fig. 14A) para CTLA4Ig (linea 1) , L104Eig (línea 2) y L104EA29YIg (línea 3A) ; y cromatografías de exclusión de 9 tamaño de CTLA4Ig (fig. 14B) y L104EA29YIg (fig. 14C) . Las figuras 15A y 15B ilustran un diagrama de cinta del doblez tipo V de Ig extracelular CTLA4 generado a partir de la estructura en solución determinada mediante espectroscopia de RMN. La figura 15B muestra una vista expandida de la región S25-R33 y la región MYPPPY indicando el lugar y orientación de cadena lateral de las mutaciones de incremento de avidez, L104 y A29. Las figuras 16A-16D ilustra la glucosa en sangre en ayunas para receptores de células de isletas alogénicas (animales representativos) tratados con LEA29YIg (fig.l6A) y de control (fig.l6B) antes y después del transplante. Todos los animales fueron sometidos a pancreatectomía quirúrgica al menos dos semanas antes del transplante (requerimiento de insulina pretransplante promedio de 8.76 + 0.18 unidades/día) (fig.l6C) después de la infusión intraportal de células de isletas alogénicas, . los receptores se hicieron rápidamente euglucemicos y no requirieron de post-transplante de insulina exógeno . (fig.l6D) La inducción de diabetes y función de células de isletas post-transplante se confirmaron mediante una prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa antes del transplante y un mes y tres meses después del transplante, como se describe en el ejemplo 3, abajo. Las figuras 17A y 17B ilustra (fig.l7A) la inmunobistología de células de isletas transplantadas funcionales confirmada 10 mediante tinción positiva para insulina. (fig. 17B) isletas de un animal que recibe un régimen de control rodeado por infiltrado mononuclear, indicando rechazo, como se describe en el ejemplo 3 abajo. Las figuras 18A-18D ilustra la supresión de respuestas a células T y B anti-donador por el régimen de L104EA29Y. (fig.!8A) La respuesta IFN-y-ELISpot antidonador corresponde a la sincronización de rechazo en los controles (aproximadamente una semana después del transplante) . (fig.l8B) El régimen de L104EA29Y suprime efectivamente la generación de una respuesta a células T antidonador. (fig. 18C) Los animales que reciben mAb anti-IL-2R de rapamicina rápidamente producen un anticuerpo antidonador detectable, medido mediante métodos de citometría de flujo en el momento del rechazo. (fig- 18D) Los receptores de células de isletas que reciben el régimen que contiene L104EA29Y no generan una respuesta de anticuerpos antidonador detectable mientras son tratados, como se describe en el ejemplo 3 abajo. La figura 19 ilustra las secuencias de nucleotidos y aminoácidos de L104EIg (SEQ ID NOs : 7-8), como se describen en el ejemplo 2 abajo. La figura 20 muestran la secuencia de nucleotidos y aminoácidos de L104EA29LIg (SEQ ID NOs. 9-10) . La figura 21 muestra las secuencias de nucleotidos y aminoácidos de L104EA29TIg (SEQ ID NOs. 11-12) 11 La figura 22 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de L104EA29WIg (SEQ ID NOs . 13-14). La figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos de un CTLA4lg (SEQ ID NO. : 15) que tiene un péptido de señal; una secuencia de aminoácidos tipo silvestre del dominio extracelular de CTLA4 iniciando en metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, o iniciando en alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124; y una región Ig. La figura 24 muestra la secuencia de aminoácidos de un CTLA4Ig (SEQ ID NO: 16) que tiene un péptido de señal; una secuencia de aminoácidos tipo silvestre del dominio extracelular de CTLA4 iniciando en metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, o iniciando en alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124; y una región Ig.

Descripción detallada de la invención Definiciones Todos los términos científicos y técnicos usados en esta solicitud tienen los significados usados comúnmente en la técnica a menos que se especifique lo contrario. Según se usa en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados. 12 Según se usa en la presente ¾CTLA4 tipo silvestre" tiene la secuencia de aminoácidos de CTLA4 de longitud completa que ocurre naturalmente (patentes de E.U.A. Nos. 5,434,131, 5,844,095, 5,851,795), o cualquier posición de la misma que se una a una molécula B7 (CD80 y/o CD86) , o interfiera con una molécula B7 (por ejemplo, CD80 y/o CD86) para bloquear su unión a su ligando, o bloquear su unión al dominio extracelular de CTLA4 o porciones del mismo. En modalidades particulares, CTLA4 tipo silvestre comienza con metionina en la posición +1 y concluye en ácido aspártico en la posición +124, o CTLA4 tipo silvestre comienza con alanina en la posición -1 y concluye en ácido aspártico en la posición +124. En otras modalidades, CTLA4 tipo silvestre consiste en los 187 aminoácidos del receptor de CTLA4 como el descrito en la figura 3 de las patentes de E.U.A. Nos. 5,434,131, 5,844,095, 5,851,796 y mostrado aquí como figura 1. CTLA4 tipo silvestre es una proteína de superficie celular, que tiene un dominio extracelular N-terminal, un dominio de transmembrana y un dominio citoplásmico C-terminal. El dominio extracelular se une a antígenos objetivo, tales como CD80 y CD86. En una célula, la proteína CTLA4 tipo silvestre que ocurre naturalmente es traducida como un polipéptido inmaduro, el cual incluye un péptido de señal en el extremo N-terminal. El polipéptido inmaduro sufre procesamiento post-traduccional, que incluye el corte y 13 remoción del péptido de señal para generar un producto de corte CTLA4 que tiene un extremo N-terminal recién generado que es diferente del extremo N-terminal en la forma inmadura. Un experto en la técnica apreciará que puede ocurrir procesamiento post-traduccional adicional, el cual remueve uno o más de los aminoácidos del extremo N-terminal recién generado del producto de corte CTLA4. La forma madura de la molécula CTLA4 incluye el dominio extracelular de CTLA4, o cualquier porción del mismo, que se une a CD80 y/o CD86. Según se usa en la presente "el dominio extracelular de CTLA4" es la porción del receptor CTLA4 que se extiende fuera de la membrana celular, e incluye cualquier porción de CTLA4 que se extiende fuera de la membrana celular que reconoce y se une a ligandos CTLA4, tales como una molécula B7 (por ejemplo, moléculas CD80 y/o CD86) . Por ejemplo, un dominio extracelular de CTLA4 comprende metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124 (figura 2) . Como alternativa, un dominio extracelular de CTLA4 comprende alanina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +125 (figura 1) . El dominio extracelular incluye fragmentos o derivados de CTLA4 que se unen a una molécula B7 (por ejemplo, CD80 y/o CD86) . Según se usa en la presente una "secuencia de proteínas no CTLA4" o "molécula no CTLA4" se define como cualquier molécula que no se une a CD80 y/o CD86 y que no 14 interfiere con la unión de CTLA4 a su objetivo. Un ejemplo incluye, pero no está limitado a, una región constante de inmunoglobulina (Ig) o porción de la misma. De preferencia, la región constante de Ig es una región constante de Ig humana o de mono, por ejemplo, C(gama)l humana, incluyendo las regiones de pivoteo, CH2 y CH3. La región constante de Ig puede ser mutada para reducir sus funciones efectoras (patentes de E.Ü.A. Nos. 5,637,481 y 6,090,914). Según se usa en la presente, "soluble" se refiere a cualquier molécula, o fragmentos y derivados de la misma, no unida o fijada a una célula, es decir, circulante. Por ejemplo, CTLA4, L104EA29YIg, B7 o CD28 se puede hacer soluble al fijar una porción de inmunoglobulina (Ig) al dominio extracelular de CTLA4, B7 o CD28, respectivamente. Otras moléculas pueden ser el producto de gen E7 de papilomavirus (E7), antígeno p97 asociado a melanoma (p97) o proteina env de VIH (env gpl20) . Como alternativa, una molécula tal como CTLA4 puede hacerse soluble al remover su dominio de transmembrana. Típicamente, las moléculas solubles usadas en los métodos de la invención no incluyen una secuencia de señal (o líder) . CTLA4Ig" es una proteína de fusión soluble que comprende un dominio extracelular de CTL7A4, o una porción de la misma que se une a CD80 y/o CD86, unida a una cola de Ig. Una modalidad particular comprende el dominio extracelular de 15 CTLA4 tipo silvestre iniciando en metionina en la posición +1 y concluyendo en ácido aspártico en la posición +124; o iniciando en alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124; un residuo de aminoácido de unión glutamina en la posición +125 y una porción de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 a lisina en la posición +357 (figura 2) . El ADN que codifica para CTLA4Ig fue depositado el 31 de mayo de 1991 en la Colección Americana de Tipos de Cultivos (ATCC) 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 bajo las provisiones del Tratado de Budapest, y se le ha dado el número ATCC de acceso ATCC 68629; Linsley, P., et al., 1994 I munity 1:793-80) . CTLA4Ig-24, una linea de células de Ovario de Hámster Chino (CHO) que expresa CTLA4Ig fue depositada el 31 de mayo de 1991 con el número ATCC de identificación CRL-10762) . Las moléculas CTLA4Ig solubles usadas en los métodos y/o equipos de la invención pueden o no incluir una secuencia de péptidos de señal (líder) . Típicamente, en los métodos y/o equipos de la invención, las moléculas no incluyen una "secuencia de péptidos de señal. Según se usa en la presente, "moléculas CTLA4 solubles" significa moléculas CTLA4 (tipo silvestre o mutantes) no unidas a superficie celular (es decir, circulantes) o cualquier porción funcional de una molécula CTLA4 que se una a B7 incluyendo, pero no limitada a: 16 proteína de fusión CTLA4Ig (por ejemplo, ATCC 68629), en donde el dominio extracelular de CTLA4 es fusionado a una porción de inmunoglobulina (Ig) haciendo a la molécula de fusión soluble, o fragmentos y derivados de la misma; proteínas con el dominio extracelular de CTLA4 fusionado o unido con una porción de proteína biológicamente activa o químicamente activa tal como el producto del gen E7 de virus de papiloma (CTLA4-E7) , p97 antígeno asociado a melanoma (CTLA4-p97) o proteína env de VIH (CTLA4-env gpl20) , o fragmentos y derivados de las mismas; proteínas de fusión híbridas (quiméricas) tales como CD28/CTLA4Ig, o fragmentos y derivados de las mismas; moléculas CTLA4 con el dominio de transmembrana removido para hacer a la proteína soluble (Oaks, M. K. , et al., 2000 Cellular Iwmunology 201:144-153), o fragmentos y derivados de las mismas. Las "moléculas CTLA4 solubles" incluyen también fragmentos, porciones o derivados de las mismas, y moléculas mutantes CTLA4 solubles que tienen actividad de unión a CTLA4. Las moléculas CTLA4 solubles usadas en los métodos de la invención pueden o no incluir una secuencia de péptidos de señal (líder) . Típicamente, en los métodos de la invención, las moléculas no incluyen una secuencia de péptidos de señal. Según se usa en la presente, una "proteína de fusión" se define como una o más secuencias de aminoácidos unidas entre sí usando métodos bien conocidos en la técnica y 17 como los descritos en la patente de E.U.A. No. '5, 434, 131 ó 5,637,481. Las secuencias de aminoácidos unidas forman entonces una proteina de fusión. Según se usa en la presente, una "molécula mutante CTLA4" es una molécula que puede ser CTLA4 de longitud completa o porciones de la misma (derivados o fragmentos) que tengan una mutación o varias mutaciones en CTLA4 (de preferencia en el dominio extracelular de CTLA4) por lo que es similar pero no idéntica a la molécula CTLA4 tipo silvestre. Las moléculas mutantes CTLA4 se unen a una molécula B7 (por ejemplo, ya sea CD80 o CD86, o ambas) . Las moléculas CTLA4 mutantes pueden incluir una molécula no CTLA4 biológica o químicamente activa en las mismas o unida a las mismas. Las moléculas mutantes pueden ser solubles (es decir, circulantes) o unidas a una superficie. Las moléculas mutantes CTLA4 pueden incluir el dominio extracelular completo de CTLA4 o porciones del mismo, por ejemplo, fragmentos o derivados. Las moléculas mutantes CTLA4 pueden hacerse sintéticamente o en forma recombinante . Según se usa en la presente, el término "mutación" es un cambio en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de un polipéptido tipo silvestre. La presente invención proporciona una mutación o un cambio en el dominio extracelular CTLA4 tipo silvestre. Los cambios en la secuencia de CTLA4 tipo silvestre incluyen cambios 18 conservadores y no conservadores. El cambio puede ser un cambio de aminoácido que incluya sustituciones, supresiones, adiciones o truncados. Una molécula mutante puede tener una o más mutaciones. Las mutaciones en una secuencia de nucleótidos pueden o no dar como resultado una mutación en la secuencia de aminoácidos como se sabe bien en la técnica. A ese respecto, ciertos codones de nucleótidos codifican para el mismo aminoácido. Ejemplos incluyen codones de nucleótidos CGT, CGG, CGC y CGA que codifican para el aminoácido, arginina (R) ; o los codones GAT y GAC que codifican para el aminoácido, ácido aspártico (D) . De esta manera, una proteina puede ser codificada por una o más moléculas de ácido nucleico que sean diferentes en su secuencia de nucleótidos especifica, pero aún codificar para moléculas proteinicas que tengan secuencias idénticas. La secuencia de codificación de aminoácidos es la siguiente: 19 "L104EA29YIg" es una proteína de fusión que es una 20 molécula mutante CTLA4 soluble que comprende un dominio extracelular de CTLA4 tipo silvestre que tiene cambios de aminoácido A29Y (un residuo de aminoácido de tirosina que sustituye una alanina en la posición 29) y L104E (un residuo de aminoácido de ácido glutámico que sustituye una leucina en la posición +104) , o una porción de los mismos que se una a una molécula B7, unida a una cola de Ig (incluida en la figura 3; ADN que codifica para L104EA29YIg fue depositado en la Colección Americana de Tipos de Cultivos el 20 de junio de 2000 y se le asignó el número ATCC PTA-2104) . Las moléculas L104EA29YIg solubles usadas en los métodos y/o equipos de la invención pueden o no incluir una secuencia de péptidos de señal (líder) . Típicamente, en los métodos y/o equipos de la invención, las moléculas no incluyen una secuencia de péptidos de señal. La molécula mutante puede tener una o más mutaciones. Según se usa en la presente, una "secuencia de proteínas no CTLA4" o "molécula no CTLA4" significan cualquier molécula de proteína que no se une a B7 y que no interfiere con la unión de CTLA4 a su objetivo. Un ejemplo incluye, pero no está limitado a, una región constante de inmunoglobulina. (Ig) o porción de la misma. De preferencia, la región constante de Ig es una región constante de Ig humana o de mono, por ejemplo, C(gama)l humana, incluyendo las regiones de pivoteo, CH2 y CH3. La región constante de 21 Ig puede ser imitada para reducir sus funciones efectoras (patentes de E.U.A. 5,637,481, 5,844,095 y 5,434,131). Según se usa en la presente, un "fragmento" o "porción" es cualquier parte o segmento de una molécula, por ejemplo, CTLA4 o CD28, de preferencia el dominio extracelular de CTLA4 o CD28 o una parte o segmento de la misma, que reconoce y se une a su objetivo, por ejemplo, una molécula B7. Según se usa en la presente, "B7" se refiere a la familia B7 de moléculas que incluyen, pero no están limitadas a, B7-1 (CD80) (Freeman et al., 1989, J. Immunol . 143:2714- 2722, incorporada en la presente a manera de referencia en su totalidad), B7-2 (CD86) (Freeman et al., 1993, Science 262:909-911 incorporada a manera de referencia en su totalidad; Azuma et al., 1993, Nature 366:76-79 incorporada en la presente a manera de referencia en su totalidad) que puede reconocer y unirse a CTLA4 y/o CD28. Según se usa en la presente, "CD28" se refiere a la molécula que reconoce y se une a B7 como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 5,580, 756 y 5,521,288 (incorporadas en la presente a manera de referencia en su totalidad) . Según se usa en la presente, "células B7-positivas" son cualquier célula con uno o más tipos de moléculas B7 expresadas sobre la superficie celular. . Según se usa en la presente, un "derivado" es un 22 una molécula que comparte similitud de secuencia y actividad de su molécula progenitora. Por ejemplo, un derivado de CTLA4 incluye una molécula CTLA4 soluble que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 70% similar al dominio extracelular de CTLA4 tipo silvestre, y la cual reconoce y se une a B7, por ejemplo, CTLA4Ig o molécula mutante CTLA4 soluble L104EA29YIg. Según se usa en la presente, "bloquear" o "inhibir" un receptor, señal o molécula, significa interferir con la activación del receptor, señal o molécula, como se detecta por pruebas reconocidas en la técnica. Por ejemplo, el bloqueo de una respuesta inmune mediada por células puede ser detectado determinando la reducción síntomas asociados con enfermedades reumáticas. El bloqueo o inhibición puede ser parcial o total. Según se usa en la presente, "bloquear la interacción de B7" significa interferir con la unión de B7 a sus ligandos, tales como CD28 y/o CTLA4, obstruyendo de esta manera las interacciones entre células B7 positivas y células T. Ejemplos de agentes que bloquean las interacciones de B7 incluyen, pero no están limitados a, moléculas tales como un anticuerpo (o porción o derivado del mismo) que reconocen y se unen a cualquiera de moléculas CTLA4, CD28 o B7 (por ejemplo, B7-1, B7-2); una forma soluble (o porción o derivado de la misma) de las moléculas tales como CTLA4 soluble; un 23 fragmento peptidico u otra molécula pequeña diseñada para interferir con la señal de la célula a través de la interacción mediada por CTLA4/CD28/B7. En una modalidad preferida, el agente de bloqueo es una molécula CTLA4 soluble, tal como CTLA4Ig (ATCC 68629) o L104EA29YIg (ATCC PTA-2104), una molécula CD28 soluble tal como CD28Ig (ATCC 68628), una molécula B7 soluble tal como B7Ig (ATCC 68627), un anticuerpo monoclonal anti-B7 (por ejemplo, ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 y anticuerpos monoclonales como los descritos en Anderson et al., patente de E.U.A. 6,113,898 o Yokochi et al.r 1982, J. Immun., 128 (2 ) : 823-827 ) , un anticuerpo monoclonal anti-CTLA4 (por ejemplo, ATCC HB-304, y anticuerpos monoclonales como los descritos en las referencias 82-83) y/o un anticuerpo monoclonal anti-CD28 (por ejemplo, ATCC HB 11944 y mAb 9.3 como el descrito por Hansen (Hansen et al., 1980. Immunogenetics 10:247-260) o Martin (Martin et al., 1984, J. Clin. Immun. 4 (1) : 18-22) ) . Según se usa en la presente, "enfermedad del sistema inmunológico" significa cualquier enfermedad mediada por interacciones de células T con células B7-positivas incluyendo, pero no limitadas a, enfermedades autoinmunes, trastornos relacionados con injertos y enfermedades inmunoproliferativas . Ejemplos de enfermedades del sistema inmunológico incluyen enfermedad de injerto contra huésped 24 (GVHD) (por ejemplo, tal como puede resultar a partir el transplante de médula ósea, o en la inducción de tolerancia) , trastornos inmunes asociados con rechazo de transplantes de injertos, rechazo crónico y alo- o xenoinjertos de tejidos o células, incluyendo órganos sólidos, piel, células de isletas, músculos, hepatocitos y neuronas. Ejemplos de enfermedades inmunoporliferativas incluyen, pero no están limitadas a, psoriasis, linfoma de células T, leucemia linfoblástica aguda de células T, linfoma de células T angiocéntrico testicular, angiitis linfocítica benigna, lupus (por ejemplo, lupus eritematoso, nefritis por lupus), tiroiditis de Hashimoto, mixedema primario, enfermedad de Graves, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmune, enfermedad de Addison, diabetes (por ejemplo, diabetes mellitus dependiente de insulina, diabetes mellitus tipo I y diabetes mellitus tipo II) , síndrome del buen pastor, miastenia grave, pénfigo, enfermedad de Cro n, oftalmía simpática, uveitis autoinmune, esclerosis múltiple, anemia hemolítica autoinmune, trombocitopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis de acción crónica, colitis ulcerante, síndrome de Sjogren, enfermedades reumáticas (por ejemplo, artritis reumatoide) , polimiositis, escleroderma y enfermedad de tejidos colectivos mixta. Según se usa en la presente, "sujeto" incluye pero no está limitado a humaos, primates no humanos (por e emplo, 25 mono, simio), borregos, conejos, cerdos, perros, gatos, ratones o ratas. Según se usa en la presente, "transplante de tejidos" se define como un tejido de todo, o parte de, un órgano que sea transplantado a un sujeto receptor. En ciertas modalidades, el tejido es de uno o más órganos sólidos. Ejemplos de tejidos u órganos incluyen, pero no están limitados a, piel, corazón, pulmón, páncreas, riñon, hígado, médula ósea, células de isletas pancreáticas, células madre pluripotentes, suspensiones de células y células genéticamente modificadas. El tejido puede ser removido de un sujeto donador, o puede ser cultivado in vitro. El transplante puede ser un autoinjerto, isoinjerto, aloinjerto o xenoinjerto, o una combinación de los mismos. Según se usa en la presente, "rechazo de transplante", es definido como la pérdida casi completa o completa de tejido de injerto viable del sujeto receptor. Según se usa en la presente, "encapsulación" se define como un proceso que inmunoaísla células y/o racimos de células, que producen y secretan sustancias terapéuticas, por ejemplo, insulina, y al uso médico de estas formulaciones. El proceso de encapsulación incluye la colocación de las células y/o racimos de células dentro de una barrera de membrana semipermeable antes de su transplante para poder evitar así el rechazo por el sistema inmunologico. El corte 26 de peso molecular de la membrana de encapsulación puede ser controlado mediante el procedimiento de encapsulación para excluir asi la difusión hacia adentro de inmunoglobulina y factores Uticos del sistema complemento, pero permitir el paso de moléculas más pequeñas tales como glucosa e insulina. La encapsulación permite que las células de isletas respondan fisiológicamente a cambios en la glucosa en sangre pero evita el contacto con componentes del sistema inmunológico . Los métodos de encapsulación de células de isletas pancreáticas se describen en la patente de E.U.A. 6,080,412. Según se usa en la presente, "ligando" se refiere a una molécula que reconoce específicamente y se une a otra molécula, por ejemplo, un ligando para CTLA4 es una molécula CD80 y/o CD86. Según se usa en la presente, "un ligando soluble que reconoce y se une a un antígeno CD80 y/o CD86" incluye ligandos tales como CTLA4Ig, CD28Ig u otras formas solubles de CTLA4 y CD28; CTLA4 y CD28 recombinantes; moléculas CTLA4 mutantes tales como L104EA29YIg y cualquier molécula de anticuerpo, fragmento de la misma o proteína de unión recombinante que reconozca y se una a un antígeno CD80 y/o CD86. Estos antigenos también son considerados "agentes inmunosupresores" . Según se usa en la presente, "vía coestimuladora" se define como una vía bioquímica que es el resultado de la 27 interacción de señales coestimuladoras en células T y células presentadoras de antigenos (APCs) . Las señales coestimuladoras ayudan a determinar la magnitud de una respuesta inmunológica a un antigeno. Se proporciona una señal coestimuladora mediante la interacción con receptores de células T CD28 y CTLA4 con moléculas CD80 y/o CD86 sobre APCs. Según se usa en la presente, "CD80 y/o CD86" incluye B7-1 (también llamado CD80) , B7-2 (también llamado CD86), B7-3 (también llamado CD74) y la familia B7, por ejemplo, una combinación de B7-1, B7-2 y/o B7-3. Según se usa en la presente, "bloqueo coestimulador" es definido como un protocolo de administrar a un sujeto uno o más agentes que interfieran o bloqueen una vía coestimuladora, como se describió arriba. Ejemplos de agentes que interfieren con el bloqueo coestimulador incluyen, pero no están limitados a, CTLA4 soluble, CTLA4 mutante, CD28 soluble, anticuerpos monoclonales anti-B7 (mAbs), CD40 soluble y mAbs anti-gp39. En una modalidad, L104EA29YIg es un agente preferido que interfiere con el bloqueo coestimulador. Según se usa en la presente, "médula ósea sin células T" se define como médula ósea removida de hueso que ha sido expuesta a un protocolo anti- células T. Un protocolo anti-células T es definido como un procedimiento 28 para remover células T de médula ósea. Los métodos para remover selectivamente células T se conocen bien en la técnica. Un ejemplo de un protocolo anti-células T es exponer médula ósea a anticuerpos específicos de células T, tales como anticuerpos monoclonales anti-CD3, anti-CD4, anti-CD5, anti-CD8 y anti-CD90, en donde los anticuerpos son citotóxicos para las células T. Como alternativa, los anticuerpos pueden ser copulados a partículas magnéticas para permitir la remoción de células T de la médula ósea usando campos magnéticos. Otro ejemplo de protocolo anti-células T es exponer células T de médula ósea a suero anti-linfocitos o globulina anti-timocitos . Según se usa en la presente, "dosis de tolerancia de médula ósea sin células T" se define como una dosis inicial de médula ósea sin células T que se administra a un sujeto con el propósito de inactivar células T reactivas donantes potenciales. Como se usa en la presente, "dosis de injerto de médula ósea sin células T" se define como una dosis posterior de médula ósea sin células T que se administra a un sujeto con el propósito de establecer quimerismo hematopoyético mixto. La dosis de injerto de médula ósea sin células T será administrada en consecuencia después de la dosis de tolerancia de médula ósea sin células T. Según se usa en la presente, "quimerismo 29 hematopoyético mixto" se define como la presencia de células progenitores y maduras de sangre donante y receptora (por ejemplo, células que se derivan de sangre) en ausencia (o presencia indetectable) de una respuesta inmune. Como se usa en la presente, los "apáreos donador-receptor" se definen con base en la tipificación molecular usando un panel de alelos de histocompatibilidad mayor definidos anteriormente (8 clase I y 12 clase II) (Lobashevsky A et al., Tissue Antigens 54:254-263, (1999);Knapp LA et al., Tissue Antigens 50:657-661, (1997); Watkins D.I., Crit Rev Immunol 15:1-29, (1995)). Los apáreos maximizaron la disparidad tanto en los locus de clase I como II. Según se usa en la presente, "administrar" o ""administración" a un sujeto incluye pero no está limitado a administración intravenosa (i.v.), administración intraperitoneal (i.p.), administración intramuscular (i.m.), administración subcutánea, administración oral, administración mediante inyección, como un supositorio, o la implantación de un dispositivo de liberación lenta tal como una bomba miniosmótica, al sujeto. Según se usa en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando es combinado con el agente reactivo, conserva la actividad biológica del agente reactivo, por ejemplo, 30 especificidad de unión, y que no es reactivo con el sistema inmunológico del sujeto. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándares tales como solución salina de pH regulado con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua y varios tipos de agentes humectantes. Otros vehículos también pueden incluir soluciones estériles, tabletas, incluyendo tabletas recubiertas y cápsulas. Típicamente, estos vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales de los mismos, estearato de magnesio o calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles y otros excipientes conocidos. Estos vehículos también pueden incluir aditivos de sabor y color u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden estos vehículos se formulan mediante métodos convencionales bien conocidos. Según se usa en la presente, los "agentes inmunosupresores" se definen como una composición que tiene uno o más tipos de moléculas que previenen la ocurrencia de una respuesta inmune, o que debilitan el sistema inmunológico de un sujeto. De preferencia, los agentes reducen o evitan la proliferación de células T. Algunos agentes pueden inhibir la proliferación de células T al inhibir la interacción de las células T con otras células presentadoras de antígenos (APCs) . Un ejemplo de APCs es células B. 31 Ejemplos de agentes que interfieren con las interacciones de células T con APCs, y que de esta manera inhiben la proliferación de células T, incluyen, pero no están limitados a, ligandos para antigenos CD80 y/o CD86, ligandos para antigeno CTLA4 y ligandos para antigeno CD28. Ejemplos de ligandos para antigenos CD80 y/o CD86 incluyen, pero no están limitados a, CTLA4 soluble, imitante de CTLA4 soluble, CD28 soluble o anticuerpos monoclonales que reconocen y se unen a antigenos CD80 y/o CD86 o fragmentos de los mismos. Un agente que se prefiere es L104EA29YIg. Los ligandos para antigenos CTLA4 o CD28 incluyen anticuerpos monoclonales que reconocen y se unen a CTLA4 y/o CD28, o fragmentos de los mismos. Otros ligandos para CTLA4 o CD28 incluyen moléculas CD80 y/o CD86 solubles, tales como CD80 y/o CD86Ig. Las personas capacitadas en la técnica entenderán fácilmente que pueden usarse otros antigenos o ligandos para inhibir la interacción de CD28 con CD80 y/o CD86. Los agentes inmunosupresores incluyen, pero no están limitados a, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina) , sales de oro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anaquinra, infliximab (REMICADE®) , etanercept, bloqueadores de TNFa, un agente biológico que se dirige a una citocina inflamatoria y fármacos antiinflamatorios no esteroidales (NSAIDs) . Los NSAIDs 32 incluyen, pero no están limitados a, ácido acetilsalicilico, salicilato de colina-magnesio, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolaco, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetina, acetaminofén, ibuprofeno, inhibidores de ciclooxigenasa-2 y tramado1.

Composiciones de la invención La presente invención proporciona composiciones para tratar enfermedades inmunes, tales como diabetes, que comprenden moléculas CTLA4 solubles. La invención proporciona además composiciones para inhibir rechazos de transplantes, por ejemplo, rechazo de transplante de células T para tratar diabetes. Además, la presente invención proporciona composiciones que comprenden un agente biológico que inhibe la función de células T pero que no inhibe el agotamiento de células T en un humano al poner en contacto células B7-positivas en el humano con una CTLA4 soluble. Ejemplos de CTLA4 solubles incluyen CTLA4lg y moléculas mutantes CTLA4 solubles tales como L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg y L104EA29WIg. Las moléculas CTLA4, con secuencias mutantes o tipo silvestre, pueden hacerse solubles al suprimir el segmento de 33 transmembrana de CTLA4 (Oaks, M. K., et al., 2000 Cellular Immunology 201:144-153) . Como alternativa, las moléculas CTLA4 solubles, con secuencias mutantes o tipo silvestre, pueden ser proteínas de fusión, en donde las moléculas CTLA4 sean fusionadas a porciones que no sean CTLA4 tales como moléculas de inmunoglobulina (Ig) que hagan a las moléculas CTLA4 solubles. Por ejemplo, una proteína de fusión CTLA4 puede incluir el dominio extracelular de CTLA4 fusionado a un dominio constante de inmunoglobulina, dando como resultado la molécula CTLA4Ig (figura 2) (Linsley, P. S., et al., 1994 Immunity 1:793-80) . Para protocolos clínicos, se prefiere que la porción de inmunoglobulina no desarrolle una respuesta inmune dañina en un sujeto. La porción que se prefiere es la región constante de inmunoglobulina, incluyendo las regiones constantes de inmunoglobulina humana o de mono. Un ejemplo de una región de inmunoglobulina adecuada es Cyl humana, incluyendo las regiones de pivoteo, CH2 y CH3 que pueden mediar funciones efectoras tales como la unión a receptores Fe, mediar la citotoxicidad dependiente de complementos (CDC) o la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) . La porción de inmunoglobulina puede tener una o más mutaciones en la misma (por ejemplo, en el dominio CH2, para reducir funciones efectoras tales como CDC 34 o ADCC) , en donde la mutación module la capacidad de unión de la inmunoglobulina a su ligando, al incrementar o disminuir la capacidad de unión de la inmunoglobulina a receptores Fe. Por ejemplo, las mutaciones en la porción de inmunoglobulina pueden incluir cambios en cualquiera o todos de sus residuos de cisteina dentro del dominio de pivoteo, por ejemplo, las cisteinas en las posiciones +130, +136 y +139 son sustituidas con serina (figura 24) . La porción de inmunoglobulina también puede incluir la prolina en la posición +148 sustituida con una serina, como se muestra en la figura 24. Además, las mutaciones en la porción de inmunoglobulina pueden incluir aquellas que tengan la leucina en la posición +144 sustituida con fenilalanina, leucina en la posición +145 sustituida con ácido glutámico o glicina en la posición +147 sustituida con alanina. Las porciones no CTLA4 adicionales para usarse en las moléculas CTLA4 solubles o moléculas mutantes CTLA4 solubles incluyen, pero no están limitadas a, molécula p97, molécula gpl20 de env, molécula E7 y molécula ova (Dash, B. et al., 1994 J, Gen. Virol . 75 (Pt 6):1389-97; Ideda, T., et al., 1994 Gene 138 (1-2) : 193-6; Falk, , et al., 1993 Cell . Immunol. 150 (2 ): 447-52 ; Fujisaka, K. et al., 1994 Virology 204 (2) : 789-93) . También son posibles otras moléculas (Gerard, C. et al., 1994 Neurosclence 62(3) :721; Bym, R. et al., 1989 63(10) :4370; Smith, D. et al., 1987 Science 35 238:1704; Lasky, L. 1996 Science 233:209). La presente invención proporciona moléculas CTLA4 solubles que incluyen una secuencia de péptidos de señal ligada al extremo N-terminal del dominio extracelular de la porción de CTLA4 de la molécula. El péptido de señal puede ser . cualquier secuencia que permita la secreción de la molécula mutante, incluyendo el péptido de señal de oncostatina M (Malik, et al., 1989 Molec. Cell. Biol. 9:2847-2853) o CD5 (Jones, N, H. et al., 1986 Nature 323:346-349), o el péptido de señal de cualquier proteína extracelular. La molécula CTLA4 soluble de la invención puede incluir el péptido de señal de oncostatina M ligado en el extremo N-terminal del dominio extracelular de CTLA4, y la molécula de inmunoglobulina humana (por ejemplo, pivoteo, CH2 y CH3) ligada al extremo C-terminal del dominio extracelular (tipo silvestre o mutado) de CTLA4. Esta molécula incluye el péptido de señal de oncostatina M que abarca una secuencia de aminoácidos que tiene metionina en la posición -26 a alanina en la posición -1, la porción CTLA4 abarcando una secuencia de aminoácidos que tiene metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, un residuo de aminoácido de unión, glutamina en la posición +125 y la porción de inmunoglobulina que abarca una secuencia de aminoácidos que tiene ácido glutámico en la posición +126 a lisina en la posición +357. 36 En una modalidad, las moléculas mutantes CTLA4 solubles de la invención, que comprenden las secuencias CTLA4 nortadas describas abajo, son moléculas de fusión que comprenden porciones de IgC(gama)l humana (es decir, IgCyl) fusionadas a los fragmentos CTLA4 imitados . Las moléculas mutantes CTLA4 solubles pueden comprender una o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos) en el dominio extracelular de CTLA4. Por ejemplo, las moléculas mutantes CTLA4 solubles pueden incluir una mutación o mutaciones dentro o en cercana proximidad a la región abarcada por serina en la posición +25 a arginina en la posición +33 (por ejemplo, S25-R33, usando símbolos de aminoácido de una sola letra estándares) . Las moléculas CTLA4 mutantes pueden incluir una sustitución de aminoácido en cualquiera o en más de las siguientes posiciones: S25, P26, G27, K28, A29, T30, E31 o 33. En otra modalidad, las moléculas mutantes CTLA4 solubles pueden incluir una mutación o mutaciones dentro o en cercana proximidad a la región abarcada por ácido glutámico en la posición +95 a glicina en la posición +107 (por ejemplo, E95-G107) . Las moléculas CTLA4 mutantes pueden incluir una sustitución de aminoácido en cualquiera o más de las siguientes posiciones: K93, L96, M97, ?98, P99, P100, P101, Y102, Y103, L104, G105, 1106 y G107. 37 Además, la invención proporciona moléculas mutantes CTLA4 solubles que tienen una mutación o mutaciones dentro o en cercana proximidad a la región abarcada por asparagina +108 a leucina en la posición +115 (por ejemplo, N108-I115) . La molécula CTLA4 mutante puede incluir una sustitución de aminoácido en cualquiera o más de las siguientes posiciones: L104, G105, 1106, G107, Qlll, Y113 o 1115. En una modalidad, las moléculas mutantes CTLA4 solubles comprenden IgCyl fusionada a un fragmento CTLA4 que comprende una mutación de un solo sitio en el dominio extracelular . El dominio extracelular de CTLA4 comprende metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124 (por ejemplo, figura 1) . La porción extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124 (por ejemplo, figura 1) . Ejemplos de mutaciones de un solo sitio incluyen las siguientes, en donde la leucina en la posición +104 es cambiada por cualquier otro aminoácido : 38 Además, la invención proporciona moléculas imitantes que tienen el dominio extracelular de CTLA4 con dos mutaciones, fusionado a una porción de Ig Cyl . Ejemplos incluyen los siguientes, en donde la leucina en la posición +104 es cambiada a otro aminoácido (por ejemplo, ácido glutámico) y la glicina en la posición +105, la serina en la posición +25, la treonina en la posición +30 o la alanina en la posición +29 es cambiada a cualquier otro aminoácido: 39 Más aún, la invención proporciona moléculas mutantes que tienen el dominio extracelular de CTLA4 que comprende tres mutaciones, fusionado a una porción de IgCyl . Ejemplos incluyen los siguientes, en donde la leucina en la posición +104 es cambiada a otro aminoácido (por ejemplo ácido glutámico) , la alanina en la posición +29 es cambiada a otro aminoácido (por ejemplo tirosina) y la serina en la posición +25 es cambiada a otro aminoácido: 40 Las moléculas mutantes CTLA4 solubles pueden tener un residuo de aminoácido de unión que se localice entre la porción CTLA4 y la porción Ig de la molécula. El aminoácido de unión puede ser cualquier aminoácido, incluyendo glutamina. El aminoácido de unión puede introducirse mediante métodos de síntesis molecular o química conocidos en la técnica. La invención proporciona moléculas mutantes CTLA4 solubles que comprenden una mutación de un solo sitio en el dominio extracelular de CTLA4 tales como L104EIg (como se incluye en la figura 19) o Ll04SIg, en donde L104EIg y L104SIg son mutadas en sus secuencias CTLA4 de tal manera que la leucina en la posición +104 sea sustituida con ácido glutámico o serina, respectivamente. Las moléculas mutantes de un solo sitio incluyen además porciones de CTLA4 que abarcan metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, un residuo de aminoácido de unión, glutamina en la posición +125 y una porción de inmunoglobulina que 41 abarca ácido glutámico en la posición +126 a lisina en la posición +357. La porción de inmunoglobulina de la molécula mutante también puede ser mutada de tal manera que las cisteinas en las posiciones +130, +136 y +139 sean sustituidas con serina, y la prolina en la posición +148 sea sustituida con serina. Como alternativa, la molécula mutante CTLA4 soluble de un solo sitio puede tener una porción CTLA4 que abarque alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la " posición +124. La invención proporciona moléculas imitantes CTLA4 solubles que comprenden una mutación de doble sitio en el dominio extracelular de CTLA4, tales como L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29Tlg o L104EA29WIg, en donde la leucina en la posición +104 es sustituida con un ácido glutámico y la alanina en la posición +29 es cambiada a tirosina, leucina, treonina y triptófano, respectivamente. Las secuencias para L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg y L104EA29WIg, iniciando con metionina en la posición +1 y concluyendo con lisina en la posición +357, más una secuencia de péptidos de señal (líder) están incluidas en las secuencias mostradas en las figuras 3 y 20-22 respectivamente. Las moléculas mutantes de doble sitio comprenden además porciones CTLA4 que abarcan metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, un residuo de aminoácido de unión, glutamina en la posición +125, y una porción de inmunoglobulina que 42 abarca ácido glutámico en la posición +126 a lisina en la posición +357. La porción de inmunoglobulina de la molécula mutante también puede ser mutada, para que las cisteinas en las posiciones +130, +136 y +139 sean sustituidas con serina, y la prolina en la posición +148 sea sustituida con serina. Como alternativa, estas moléculas mutantes pueden tener una porción CTLA4 que abarque alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124. La invención proporciona moléculas mutantes CTLA4 solubles que comprenden una mutación de doble sitio en el dominio extracelular de CTLA4, tales como L104EG105FIg, L104EG105WIg y L104EG105LIg, en donde la leucina en la posición +104 es sustituida con un ácido glutámico y la glicina en la posición +105 es sustituida con fenilalanina, triptófano y leucina, respectivamente. Las moléculas mutantes de doble sitio comprenden además porciones CTLA4 que abarcan metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, un residuo de aminoácido de unión, glutamina en la posición +125, y una porción de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 a lisina en la posición +357. La porción de inmunoglobulina también puede ser mutada, para que las cisteinas en las posiciones +130, +136 y +139 sean sustituidas con serina, y la prolina en la posición +148 sea sustituida con serina. Como alternativa, estas moléculas mutantes pueden tener una porción CTLA4 que abarque 43 alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124. La invención proporciona L104ES25RIg que es una molécula mutante de doble sitio que incluye una porción CTLA4 que abarca metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, un residuo de aminoácido de unión, glutamina en la posición +125, y la porción de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 a lisina en la posición +357. La porción que tiene el dominio extracelular de CTLA4 es mutada para que la serina en la posición +25 sea sustituida con arginina, y la leucina en la posición +104 sea sustituida con ácido glutámico. Como alternativa, L104ES25RIg puede tener una porción CTLA4 que abarque alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124. La invención proporciona moléculas mutantes CTLA4 solubles que comprenden una mutación de doble sitio en el dominio extracelular de CTLA4, tales como L104ET30GIg y L104ET30NIg, en donde la leucina en la posición +104 es sustituida con un ácido glutámico y la treonina en la posición +30 es sustituida con glicina y asparagina, respectivamente. Las moléculas mutantes de doble sitio comprenden además porciones CTLA4 que abarcan metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, un residuo de aminoácido de unión, glutamina en la posición +125, y una 44 porción de inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 a lisina en la posición +357. La porción de inmunoglobulina de la molécula murante también puede ser mutada, para que las cisteinas en las posiciones +130, +136 y +139 sean sustituidas con serina, y la prolina en la posición +148 sea sustituida con serina. Como alternativa, estas moléculas mutantes pueden tener una porción CTLA4 que abarque alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124. La invención proporciona moléculas mutantes CTLA4 solubles que comprenden una mutación de triple sitio en el dominio extracelular de CTLA4, tales como Ll04EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg, L104EA29YS25RIg, en donde la leucina en la posición +104 es sustituida con un ácido glutámico, la alanina en la posición +29 es cambiada a tirosina y la serina en la posición +25 es cambiada a lisina, asparagina y arginina, respectivamente. Las moléculas mutantes de triple sitio comprenden además porciones CTLA4 que abarcan metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124, un residuo de aminoácido de unión, glutamina en la posición +125, y una porción de- inmunoglobulina que abarca ácido glutámico en la posición +126 a lisina en la posición +357. La porción de inmunoglobulina de la molécula mutante también puede ser mutada, para que las cisteinas en las posiciones +130, +136 y +139 sean sustituidas con serina, y la prolina 45 en la posición +148 sea sustituida con serina. Como alternativa, estas moléculas mutantes pueden tener una porción CTLA4 que abarque alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124. Las modalidades adicionales de moléculas mutantes CTLA4 solubles incluyen moléculas mutantes homologas CTLA4/CD28 quiméricas que se unen a B7 (Peach, R. J., et al . , 1994 J Exp Med 180:2049-2058). Ejemplos de estas moléculas mutantes CTLA4/CD28 quiméricas incluyen HSl, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS12, HS13 y HS14 (patente de E.U.A. número 5,773,253). Las modalidades preferidas de la invención son moléculas CTLA4 solubles tales como CTLA4Ig (como se muestra en la figura 2, iniciando en metionina en la posición +1 y concluyendo en Usina en la posición +357) y mutante CTLA4 soluble L104EA29YIg (como se muestra en la figura 3, iniciando en metionina en la posición +1 y concluyendo en lisina en la posición +357) . La invención proporciona además moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para las secuencias de aminoácidos que corresponden a las moléculas CTLA4 solubles de la invención. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico es un ADN (por ejemplo, ADNc) o un híbrido del mismo. ADN que codifica para CTLA4Ig (figura 2) fue depositado el 31 de mayo de 1991 en la 46 Colección Americana de Tipos de Cultivos (ATCC) , 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 y se le ha acordado el número ATCC de acceso ATCC 68629. ADN que codifica para L104EA29YIg (secuencia incluida en la figura 3) fue depositado el 19 de junio de 2000 en la ATCC y se le ha asignado al número de ' acceso ATCC PTA-2104. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico son ARN o un híbrido del mismo.

Híbridos CTLA4 La presente invención proporciona moléculas mutantes CTLA4 solubles que comprenden al menos el dominio extracelular de CTLA4 o porciones del mismo que se unen a CD80 y/o CD86. La porción extracelular de CTLA4 comprende metionina en la posición +1 a ácido aspártico en la posición +124 (por ejemplo, figura 1) . La porción extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición -1 a ácido aspártico en la posición +124 (por ejemplo, figura 1) . La porción extracelular del CTLA4 puede comprender ácido glutámico en la posición +95 a cisteina en la posición +120. La porción extracelular de la CTLA4 puede comprender metionina en la posición +1 a cisteina en la posición +21 y ácido glutámico en la posición +95 a ácido aspártico en la posición +122. La porción extracelular de CTLA4 puede comprender metionina en la posición +1 a tirosina en la 47 posición +23 y valina en la posición +32 a ácido aspártico en la posición +122. La porción extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 a ácido glutámico en la posición +31 y ácido glutámico en la posición +95 a ácido aspártico en la posición +122. La porción extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 a ácido glutámico en la posición +31 y ácido glutámico en la posición +95 a isoleucina en la posición +112. La porción extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 a ácido glutámico en la posición +31 y tirosina en la posición +113 a ácido aspártico en la posición +122. La porción extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +50 a ácido glutámico en la posición +57 y ácido glutámico en la posición +95 a ácido aspártico en la posición +122. La porción extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 a ácido glutámico en la posición +31; alanina en la posición +50 a ácido glutámico en la posición +57 y ácido glutámico en la posición +95 a ácido aspáritco en la posición +122. La porción extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +50 a ácido glutámico en la posición +57 y ácido glutámico en la posición +95 a isoleucina en la posición +112. La porción extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 a ácido glutámico en la posición +31/ alanina en la posición +50 a ácido glutámico en la posición +57 y ácido 48 glutámico en la posición +95 a ácido aspártico en la posición +122. La porción extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 a valina en la posición +94. La porción extracelular de la CTLA4 puede comprender alanina en la posición -1 a cisteina en la posición +21. La porción extracelular de CTLA4 puede comprender metionina en la posición +1 a cisteina en la posición +21. La porción extracelular de CTLA4 puede comprender ácido glutámico en la posición +95 a ácido aspártico en la posición +122. La porción extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la posición -1 a valina en la posición +94. La porción extracelular de CTLA4 puede comprender metionina en la posición +1 a valina en la posición +94. La porción extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la posición +24 a ácido glutámico en la posición +31. La porción extracelular de CTLA4 puede comprender alanina en la posición -1 a tirosina en la posición +23. La porción extracelular de CTLA4 puede comprender metionina en la posición +1 a tirosina en la posición +23. La porción extracelular de CTLA4 puede comprender valina en la posición +32 a ácido aspártico en la posición +122. La porción extracelular de CTLA4 puede comprender tirosina en la posición +113 a ácido aspártico en la posición +122. La porción extracelular de CTLA4 puede comprender ácido glutámico en la posición +95 a isoleucina en la posición +112. La porción extracelular de CTLA4 puede 49 comprender alanina en la posición +50 a ácido glutámico en la posición +57.

Métodos para producir las moléculas de la invención La expresión de las moléculas mutantes CTLA4 puede ser en células procarióticas . Los procariontes muy frecuentemente son representados por varias cepas de bacterias- Las bacterias pueden ser gram positivas o gram negativas. Pueden usarse también otras cepas microbianas. Las secuencias de nucleótidos que codifican para las moléculas mutantes CTLA4 pueden ser insertadas en un vector diseñado para expresar secuencias extrañas en células procarióticas tales como E. coli. Estos vectores pueden incluir secuencias de control procarióticas comúnmente usadas las cuales son definidas en la presente como incluyendo promotores para inicio de transcripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias de sitios de unión a ribosomas, incluyendo promotores comúnmente usados tales como los sistemas promotores de beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang, et al., (1977) Nature 198:1056), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res . 8:4057) y el promotor PL derivado lambda y sitio de unión a ribosoma del gen N (Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128) . Estos vectores de expresión incluirán también 50 orígenes de replicación y. marcadores seleccionadles, tales como un gen de beta-lactamasa o neomicina fosfotransferasa que confiera resistencia a antibióticos, de tal manera que los vectores que puedan replicarse en bacterias y células que porten los plásmidos puedan seleccionarse para cuando crezcan en presencia de antibióticos, tales como ampicilina o kanamicina . El plásmido de expresión puede ser introducido en células procarióticas mediante una variedad de métodos estándares, incluyendo pero no limitados a choque de CaCl2 (Cohén, (1972) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 69:2110 y Sambrook et al., (eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2da. edición, Cold Spring Harbor Press, (1989) ) y electroporación. De acuerdo con la práctica de la invención, las células eucarióticas también son células huésped adecuadas. Ejemplos de células eucarióticas incluyen cualquier célula animal, ya sea primaria o inmortalizada, levadura (por ejemplo, Saccharomvces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris) y células vegetales. Células de mieloma, COS y CHO son ejemplos de células animales que pueden usarse como huéspedes. Las células CHO particulares incluyen, pero no están limitadas a, DG44 (Chasin, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61) , línea de células 51 Tet-On CHO-K1 (Clontech) , CHO designada ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido) , clon 13 de CHO (GEIMG, Génova, Italia) , clon B de CHO (GEIMB, Genova, Italia) , CHO-KI/SF designado ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido) y RR-CHOKI designado ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido) . Las células vegetales ejemplares incluyen células de tabaco (plantas enteras, cultivo de células o callos), maíz, soya y arroz. Son también aceptables semillas de maiz, soya y arroz. Las secuencias de nucleótidos que codifican para las moléculas mutantes CTLA4 también pueden ser insertadas en un vector diseñado para expresar secuencias extrañas en un huésped eucariótico. Los elementos reguladores del vector pueden variar de acuerdo con el huésped ecuariótico particular. La molécula de ácido nucleico que codifica para L104EA29YIg está contenida en pD16 L104EA29YIg y fue depositada el 19 de junio de 2000 en la Colección Americana de Tipos de Cultivos (ATCC) , 10801 University Blvd., Manasas, VA 20110-2209 (ATCC No. PTA-2104) . El vector pD16 L104EA29YIg es un derivado del vector pcADN3 (INVITROGEN) . Las secuencias de control ecuarióticas .comúnmente usadas para utilizarse en métodos de expresión incluyen secuencias promotoras y de control compatibles con células de mamífero tales como, por ejemplo, promotor de CMV (vector CDM8) y de virus de sarcoma aviario (ASV) (vector TCLN) . 52 Otros promotores comúnmente usados incluyen los promotores temprano y tardío de virus 40 de simio (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nature273 : 113) , u otros promotores virales tales como aquellos derivados de polioma, adenovirus 2 y virus de papiloma bovino. También puede usarse un promotor inducible, tal como hMTII (Karin, et al., (1982) Nature 299:797-802). Los vectores para expresar moléculas mutantes CTLA4 en eucariontes también pueden portar secuencias llamadas regiones potenciadoras . Éstas son importantes para optimizar la expresión génica y se encuentran ya sea hacia el extremo cinco prima o hacia el extremo tres prima de la región promotora . Ejemplos de vectores de expresión para células huésped eucarióticas incluyen, pero no están limitados a, vectores para células huésped de mamífero (por ejemplo, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis) ; pIRES (Clontech) ; pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); vectores pVPakc, vectores pC V, vectores pSG5 (Stratagene) ) , vectores retrovirales (por ejemplo, vectores pFB (Stratagene) ) , pCDNA-3 (Invitrogen) o formas modificadas de los mismos, vectores adenovirales; vectores de virus adeno-asociados, vectores de baculovirus, vectores de levadura (por ejemplo, vectores pESC (Stratagene) ) . Las secuencias de nucelótidos que codifican para moléculas mutantes CTLA4 pueden integrarse en el genoma de la 53 célula huésped eucariótica y replicarse al replicarse el genoma del huésped. Como alternativa, el vector que porta moléculas mutantes CTLA4 puede contener orígenes de replicación que permitan la replicación extracromosómica . Para expresar las secuencias de nucleótidos en Saccharomyces cerevisiae, se puede usar el origen de replicación del plásmido de levadura endógeno, el círculo de 2µ. (Broach, (1983) Meth. Enz . 101:307). Como alternativa, se pueden usar secuencias del genoma de levadura capaces de promover la replicación autónoma (véase, por ejemplo, Stinchcomb et al., (1979) Nature 282:39); Tschemper et al., (1980) Gene 10:157 y Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101:300) . Las secuencias de control de transcripción para vectores de levadura incluyen promotores para la síntesis de enzimas glucolíticas (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland et al., (1978) Biochemistry 17:4900). Los promotores adicionales conocidos en la técnica incluyen el promotor de CMV provisto en el vector CDM8 (Toyama y Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); el promotor para 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073) y aquellos para otras enzimas glucolíticas. Otros promotores son inducibles porque pueden ser regulados mediante estímulos ambientales o el medio de crecimiento de las células. Estos promotores inducibles 54 incluyen aquellos de los genes de proteínas de choque térmico, alcohol deshidrogenasa 2, isocitocroma C, fosfatasa ácida, enzimas asociadas con el catabolismo de nitrógeno, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Las secuencias reguladoras también pueden ser colocadas en el extremo 3' de las secuencias de codificación. Estas secuencias pueden actuar para estabilizar ARN mensajero. Estos terminadores se encuentran en la- región no traducida 3' después de las secuencias de codificación en varios genes derivados de levadura y de mamífero . Los vectores ejemplares para plantas y células vegetales incluyen, pero no están limitados a, plásmidos Ti de Agrobacterium, virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y virus del mosaico dorado del tomate (TGMV) . Los aspectos generales de transformaciones para sistemas de huéspedes de células de mamífero han sido descritos por Axel (patente de E.U.A. No. 4,399,216 expedida el 16 de agosto de 1983) . Las células de mamífero pueden ser transformadas mediante métodos que incluyen pero no están limitados a, transfección en presencia de fosfato de calcio, microinyección, electroporación o mediante transducción con vectores virales. Los métodos para introducir secuencias de ADN extrañas en genomas vegetales y de levadura incluyen 1) métodos mecánicos, tales como microinyección de ADN en 55 células o protoplastos individuales, vortexeo de células con esferas de vidrio en presencia de ADN o el disparo de esferas de tungsteno u oro recubiertas con ADN en células o protoplastos; 2) introducir ADN al hacer membranas celulares permeables a macromoléculas a través de tratamiento con polietilenglicol o sujeción a impulsos eléctricos de alto voltaje (electroporación) o 3) el uso de liposomas (que contengan ADNc) que se fusionan a las membranas celulares. La expresión de las moléculas mutantes CTLA4 se puede detectar mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las moléculas mutantes pueden ser detectadas mediante geles SDS-PAGE para tinción de Coomassie e inmunoabsorción usando anticuerpos que se unan a CTLA . La recuperación de proteínas se puede llevar a cabo usando medios de purificación de proteínas estándares, por ejemplo, cromatografía de afinidad o cromatografía de intercambio iónico, para crear un producto sustancialmente puro (R. Scopes en: "Protein Purificaction. Principies and Practice", tercera edición, Springer-Verlag (1994) ) . La invención proporciona además moléculas de proteína mutante CTLA4 producidas mediante los métodos de la presente .

Mutagénesis a base de codones CTLA4Ig En una modalidad, la mutagénesis dirigida a sitio y 56 un procedimiento de tamizado novedoso fueron usados para identificar varias mutaciones en el dominio extracelular de CTLA4 que mejoran la avidez de unión para CD86. En esta modalidad, se llevaron a cabo mutaciones en residuos en las regiones del dominio extracelular de CTLA4 de serina 25 a arginina 33, la hebra C (alanina 49 y treonina 51) , la hebra F (lisina 93, ácido glutámico 95 y leucina 96), y en la región de metionina 97 a tirosina 102, tirosina 103 a glicina 107 y la hebra G en las posiciones glutamina 111, tirosina 113 e isoleucina 115. Estos sitios fueron seleccionados con base en estudios de proteínas de fusión CD28/CTLA4 quiméricas (Peach et al.r J. Exp. Med., 1994, 180:2049-2058), y en un modelo que predecía qué cadenas laterales del residuo de aminoácidos podrían ser expuestas a solventes, y una falta de identidad u homología del residuo de aminoácido en ciertas posiciones entre CD28 y CTLA4. Asimismo, cualquier residuo que esté espacialmente en cercana proximidad (5 a 20 unidades Angstrom) a los residuos identificados se considera parte de la presente invención. Para sintetizar y tamizar moléculas mutantes CTLA4 solubles con afinidades alteradas para CD80 y/o CD86, se adoptó una estrategia de dos etapas. Los experimentos implicaron generar primero una biblioteca de mutaciones en un codón específico de una porción extracelular de CTLA4 y luego analizarlos mediante análisis BIAcore para identificar los 57 mutantes con reactividad alterada a CD80 o CD86. El sistema de ensayo Biacore (Pharmacia, Piscataway, N.J.) usa un sistema detector de resonancia plasmó-nica de superficie que incluye esencialmente la unión covalente ya sea de CD80Ig o CD86Ig a un microcircuito sensor recubierto con dextrano que se localiza en un detector. La molécula de pruebas puede ser inyectada después en la cámara que contenga el microcircuito sensor, y la cantidad de proteína complementaria que se una puede ser determinada con base en el cambio de la masa molecular que esté asociada físicamente con el lado recubierto con dextrano del microcircuito sensor; el cambio en la masa molecular puede ser medido por el sistema detector .

Composiciones farmacéuticas de la invención La invención incluye composiciones farmacéuticas para usarse en el tratamiento de enfermedades del sistema inmunológico, que comprenden cantidades farmacéuticamente efectivas de moléculas mutantes CTLA4 solubles- En ciertas modalidades, las enfermedades del sistema inmunológico son mediadas por interacciones de células CD28- y/o CTLA4-positivas con células CD80 y/o CD86 positivas. Las moléculas CTLA4 solubles son de preferencia moléculas CTLA4 solubles con moléculas CTLA4 solubles y/o de secuencia tipo silvestre, y/o moléculas CTLA4 solubles que tienen una o más mutaciones 58 en el dominio extracelular de CTLA . La composición farmacéutica puede incluir CTLA4 soluble o moléculas de proteina mutante CTLA4 soluble y/o moléculas de ácido nucleico, y/o vectores que codifiquen para las moléculas. En una modalidad preferida, la molécula mutante CTLA4 soluble tiene la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de CTLA4 como la mostrada en la figura 3 (L104EA29Y) . Aún más preferiblemente, la molécula mutante CTLA4 soluble es L104EA29YIg como la descrita en la presente y mostrada en la figura 3. Las composiciones pueden incluir además otros agentes terapéuticos, incluyendo, pero no limitados ar agentes inmunosupresores, NSAIDs, corticosteroides, glucocorticoides, fármacos, toxinas, enzimas, anticuerpos o conjugados. Una modalidad de la composición farmacéutica comprende una cantidad efectiva de una molécula CTLA4 soluble sola o en combinación con una cantidad efectiva de por lo menos algún otro agente terapéutico, incluyendo un agente inmunosupresor, o NSAID. Las cantidades efectivas de CTLA4 soluble en la composición farmacéutica pueden variar de aproximadamente 0.1 a 100 mg/kg de peso del sujeto. En otra modalidad, la cantidad efectiva puede ser una cantidad de aproximadamente 0.5 a 5 mg/kg de peso de un sujeto, aproximadamente 5 a 10 mg/kg de peso de un sujeto, aproximadamente 10 a 15 mg/kg de 59 peso de un sujeto, aproximadamente 15 a 20 mg/kg de peso de un sujeto, aproximadamente 20 a 25 mg/kg de peso de un suj eto, aproximadamente 25 a 30 mig/kg de peso de un sujeto, aproximadamente 30 a 35 mg/kg de peso de un sujeto, aproximadamente 35 a 40 mg/kg de peso de un suj eto, aproximadamente 40 a 45 mg/kg de peso de un sujeto, aproximadamente 45 a 50 mg/kg de peso de un sujeto, aproximadamente 50 a 55 mg/kg de peso de un sujeto, aproximadamente 55 a 60 mg/kg de peso de un suj eto, aproximadamente 60 a 65 mg/kg de peso de un suj eto, aproximadamente 65 a 70 mg/kg de peso de un sujeto, aproximadamente 70 a 75 mg/kg de peso de un sujeto, aproximadamente 75 a 80 mg/kg de peso de un sujeto, aproximadamente 80 a 85 mg/kg de peso de un sujeto, aproximadamente 85 a 90 mg/kg de peso de un sujeto, aproximadamente 90 a 95 mg/kg de peso de un sujeto, o aproximadamente 95 a 100 mg/kg de peso de un sujeto . En una modalidad, la cantidad efectiva es de 2 mg/kg de peso de un sujeto. En otra modalidad, la cantidad efectiva es de 10 mg/kg de peso de un sujeto. En una modalidad, la cantidad efectiva de una molécula CTLA4 soluble es de 2 mg/kg de peso de un sujeto. En una modalidad, la cantidad efectiva de una molécula CTLA4 soluble es de 10 mg/kg de peso de un sujeto. La cantidad de un agente inmunosupresor administrada a un sujeto varia dependiendo de varios factores 60 incluyendo la eficacia del fármaco en un sujeto específico y la toxicidad (es decir, la tolerabilidad) de un fármaco en un sujeto específico. El metotrexato se administra comúnmente en una cantidad de alrededor de 0.1 a 40 mg por semana con una dosis común variando de aproximadamente 5 a 30 mg por semana. El metotrexato se puede administrar a un sujeto en varios incrementos: aproximadamente 0.1 a 5 mg/semana, alrededor de 5 a 10/semana, alrededor de 10 a 15 mg/semana, aproximadamente 15 a 20 mg/semana, aproximadamente 20 a 25 mg/semana, aproximadamente 25 a 30 mg/semana, alrededor de 30 a 35 mg/semana, o aproximadamente 35 a 40 mg/semana. En una modalidad, una cantidad efectiva dé un agente inmunosupresor, incluyendo metotrexato, es una cantidad de alrededor de 10 a 30 mg/semana. Cantidades efectivas de metotrexato varían de alrededor de 0.1 a 40 mg/semana. En una modalidad, la cantidad efectiva varía de alrededor de 0.1 a 5 mg/semana, alrededor de 5 a 10 mg/semana, aproximadamente 10 a 15 mg/semana, aproximadamente 15 a 20 mg/semana, alrededor de 20 a 25 mg/semana, aproximadamente 25 a 30 mg/semana, aproximadamente 30 a 35 mg/semana, o aproximadamente 5 a 40 mg/semana. En una modalidad, el metotrexato se administra en una cantidad que varía de aproximadamente 10 a 30 mg/semana. Ciclofosfamida, un agente alquilante, puede 61 administrarse en dosis que varíen de aproximadamente 1 a 10 mg/kg de peso corporal al día. Ciclosporina (por ejemplo NEORAL®) también conocida como Ciclosporina A, se administra comúnmente en dosis que varían de alrededor de 1 a 10 mg/kg de peso del cuerpo al día. Se usan comúnmente dosis que varían de aproximadamente 2.5 a 4 mg por peso del cuerpo al día. Cloroquina e hidroxicloroquina (por ejemplo PLAQUENIL®) , se administra comúnmente en dosis que varían de alrededor de 100 a 1000 mg diariamente. Las dosis preferidas varían de aproximadamente 200-600 mg administrados diariamente . Sulfasalazina (por ejemplo, AZULFIDINE EN-tabs®) se administra comúnmente en cantidades que varían de aproximadamente 50 a 5000 mg al día, como una dosis común de alrededor de 2000 a 3000 mg al día para adultos. Las dosis para niños son comúnmente de alrededor de 5 a 100 mg/kg de peso del cuerpo, hasta 2 gramos al día. Las sales de oro se formulan y para dos tipos de administración: inyección u oral. Las sales de oro inyectables se prescriben comúnmente en dosis de aproximadamente 5 a 100 mg cada dos a cuatro semanas. Las sales de oro oralmente administradas son prescritas comúnmente en dosis que varían de alrededor de 1 a 10 mg al día. 62 D-penicilamina o penicilamina (CUPRIMINE ) se administra comúnmente en dosis de aproximadamente 50 a 2000 mg al día, con dosis preferidas de alrededor de 125 mg al día hasta 1500 mg al día. La azatioprina se administra comúnmente en dosis de aproximadamente 10 a 250 mg al día. Las dosis que se prefieren varían de alrededor de 25 a 200 mg al día. La anaquinra (por ejemplo, INERET®) es un antagonista del receptor de interleucina-1. Una escala de dosificación común para anaquinra es de aproximadamente 10 a 250 mg al día, con una dosis recomendada de alrededor de 100 mg al día. Infliximab (REMICADE®) es un anticuerpo monoclonal quimérico que se une a factor de necrosis tumoral alfa (FNTct) El infliximab se administra comúnmente en dosis de alrededor de 1 a 20 mg/kg de peso corporal cada cuatro a ocho semanas. Dosis de aproximadamente 3 a 10 mg/kg de peso corporal pueden administrarse cada cuatro a ocho semanas dependiendo del sujeto. Etanercept (por ejemplo, ENBREL®) es una proteína de fusión dimérica que se une al factor de necrosis tumoral (FNT) y bloquea sus interacciones con los receptores de FNT. Las dosis comúnmente administradas de etanercept son de aproximadamente 10 a 100 mg a la semana para adultos, con una dosis preferida de aproximadamente 50 mg a la semana. Las 63 dosis para sujetos jóvenes varían de aproximadamente 0.1 a 50 mg/kg de peso corporal a la semana con un máximo de aproximadamente 50 mg semanales. La leflunomida (ARAVA®) se administra comúnmente a dosis de aproximadamente 1 y 100 mg al día. Una dosis diaria común es de aproximadamente 10 a 20 mg al día. Las composiciones farmacéuticas también incluyen de preferencia vehículos y adyuvantes adecuados que incluyen cualquier material que cuando sea combinado con la molécula de la invención (por ejemplo, una molécula mutante CTLA4 soluble, por ejemplo, Ll04EA29YIg) conserve la actividad de la molécula y no sea reactivo con el sistema inmunológico del sujeto. Ejemplos de vehículos y adyuvantes adecuados incluyen, pero no están limitados a, albúmina de suero humano; intercambiadores iónicos; alúmina; lecitina; sustancias reguladoras de pH tales como fosfatos; glicina; ácido sórbico; sorbato de potasio; y sales o electrolitos tales como sulfato de protamina. Otros ejemplos incluyen cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándares tales como una solución salina de pH regulado con fosfato; agua; emulsiones tales como emulsión de aceite/agua y varios tipos de agentes humectantes. Otros vehículos también pueden incluir soluciones estériles; tabletas; incluyendo tabletas recubiertas y cápsulas. Típicamente estos vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, 64 ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales de los mismos, estearato de magnesio o calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Estos vehículos pueden incluir aditivos de sabor y color u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden estos vehículos se formulan mediante métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones se pueden formular también dentro de varias composiciones lípidas, tales como, por ejemplo, liposomas, así como en varias composiciones poliméricas, tales como raicroesferas poliméricas . Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar usando modos de administración convencionales incluyendo, pero no limitados a, administración intravenosa (i.v.), administración intraperitoneal (i.p.), administración intramuscular (i.m. ), administración subcutánea, administración oral, administración como un supositorio, o como un contacto tópico, o la implantación de un dispositivo de liberación lenta' tal como una bomba miniosmótica, al sujeto. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden estar en una variedad de formas de dosis, las cuales incluyen, pero no están limitadas a, soluciones o suspensiones líquidas, tabletas, pildoras, polvos, supositorios, microcápsulas o microvesículas poliméricas, 65 liposomas y soluciones inyectables o infundibles. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica. El modo más efectivo de administración y régimen de dosificación para las composiciones de esta invención depende de la severidad y curso de la enfermedad, de la salud del paciente y la respuesta al tratamiento y del juicio del médico tratante. En consecuencia, las dosis de las composiciones deben ser adaptadas al paciente individual. Las moléculas imitantes CTLA4 solubles pueden administrarse a un sujeto en una cantidad y durante un tiempo (por ejemplo, longitud de tiempo y/o varias veces) suficientes como para bloquear la unión de moléculas B7 endógenas (por ejemplo, CD80 y/o CD86) a sus ligandos respectivos, en el sujeto. El bloqueo de la unión B7/ligando endógeno inhibe de esta manera las interacciones entre células B7-positivas (por ejemplo, células CD80- y/o CD86-positivas) con células CD28- y/o CTLA4-positivas . La dosis de un agente terapéutico depende de muchos factores que incluyen, pero no están limitados a, el tipo de tejido afectado, el tipo de enfermedad autoinmune que esté siendo tratada, la severidad de la enfermedad, la salud de un sujeto y la respuesta de un sujeto al tratamiento con los agentes. En consecuencia, las dosis de los agentes pueden variar dependiendo del sujeto y el modo de administración. Las 66 moléculas mutantes CTLA4 solubles pueden administrarse en una cantidad de entre 0.1 a 20.0 mg/kg de peso del paciente/día, de preferencia entre 0.5 a 10.0 mg/kg/dia. La administración de las composiciones farmacéuticas de la invención puede llevarse a cabo durante varios meses. En una modalidad, la composición farmacéutica de la invención se puede administrar durante una o más horas. Además, la administración se puede repetir dependiendo de la severidad de la enfermedad, asi como otros factores que se entiendan en la técnica.

Métodos de la invención La presente invención proporciona métodos para tratar enfermedades del sistema inmunológico y enfermedades autoinmunes en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una molécula CTLA4 soluble o una molécula mutante CTLA4 que se une a moléculas CD80 y/o CD86 sobre células CD80 y/o CD86-positivas para inhibir de esta forma la unión de CD80 y/o CD86 a CTLA4 y/o CD28. Los métodos comprenden administrar una composición terapéutica, que comprende moléculas CTLA4 soluble o mutantes CTLA4 de la invención, a un sujeto en una cantidad efectiva para aliviar por lo menos uno de los síntomas asociados con enfermedades del sistema inmunológico. Además, la invención puede proporcionar terapia a largo plazo para enfermedades del sistema inmunológico al bloquear las interacciones entre 67 células T/células B7-positivas, bloqueando de esta manera la activación/estimulación de células T por señales coestimuladoras tales como la unión de B7 a CD28, llevando a la inducción de alergia o tolerancia a células T. Las moléculas CTLA4 solubles o moléculas mutantes CTLA4 de la invención exhiben propiedades inhibitorias in vivo. Bajo condiciones en las que las interacciones células T/células B7-positivas, por ejemplo, las interacciones células T/células B, ocurren como resultado del contacto entre células T y células B7-positivas, la unión de las moléculas CTLA4 introducidas para reaccionar a células B7-positi as, por ejemplo células B, podría interferir, es decir, inhibir, las interacciones entre células T/células B7-positivas, dando como resultado la regulación de las respuestas inmunes-. La inhibición de las respuestas a células T al administrar una molécula CTLA4 soluble también podría ser útil para tratar trastornos autoinmunes. Muchos trastornos autoinmunes son el resultado de una activación inadecuada de células T que son reactivas contra autoantígenos, y las cuales promueven la producción de citocinas y autoanticuerpos que están implicados en la patología de la enfermedad. La administración de la molécula L104EA29YIg a un sujeto que sufra de o sea susceptible a un trastorno autoinmune podría evitar la activación de las células T autorreactivas y podría reducir o eliminar los 68 síntomas de la enfermedad. Este método puede comprender también administrar al sujeto la molécula L104EA29YIg de la invención, sola o junta, con ligandos adicionales, tales como aquellos reactivos con IL-2, IL-4 o ?-interferón. La invención proporciona métodos para regular respuestas inmunes. Las ¦ repuestas inmunes pueden ser subreguladas (reducidas) por las moléculas mutantes CTLA4 o CTLA4 solubles de la invención por medio de inhibir o bloquear una respuesta inmune ya en progreso, o pueden incluir evitar la inducción de una respuesta inmune. Las moléculas CTLA4 solubles o moléculas mutantes CTLA4 de la invención pueden inhibir las funciones de células T activadas, tales como la proliferación de linfocitos T y la secreción de citocinas, al suprimir las respuestas a células T o al inducir tolerancia específica en células T, o ambas. Además, las moléculas CTLA4 solubles o moléculas mutantes CTLA4 de esta invención, que interfieren con la vía CTLA4/CD28/B7 podrían inhibir la proliferación de células T y/o secreción la citocinas, y de esta manera dar como resultado una destrucción de tejidos reducida y la inducción de no respuesta a células T o anergia. La invención proporciona además métodos para inhibir el rechazo de transplantes de órganos o tejidos en sujetos, que comprenden administrar una cantidad efectiva de por lo menos una molécula CTLA4 soluble o molécula CTLA4, por 69 ejemplo, L104EA29YIg, al sujeto antes, durante y/o después del transplante. En otra modalidad, el método de la invención incluye administrar a un sujeto por lo menos una molécula CTLA4 soluble o una molécula mutante CTLA4 en combinación con por lo menos algún otro agente terapéutico, incluyendo, pero no limitado a un fármaco, una toxina, una -enzima, un anticuerpo o un conjugado. El transplante de órganos o tejidos puede ser de cualquier tipo de órgano o tejido que pueda transplantarse . En una modalidad, el tejido transplantado puede ser un tejido pancreático. En una modalidad preferida, el tejido de transplante es células de isletas pancreáticas. La invención proporciona también métodos para tratar diabetes tipo 1 y/o tipo 2 en sujetos al inhibir el rechazo de transplante de células de isletas. La presente invención proporciona además un método para inhibir el rechazo de transplante de células de isletas pancreáticas en un sujeto, el sujeto siendo un receptor de tejido de transplante. Típicamente, en transplantes de tejido, el rechazo del injerto es iniciado a través de su reconocimiento como extraño por células T, seguido por una respuesta inmune que destruye el injerto. La administración de una molécula CTLA4 soluble en el método de esta invención, inhibe la proliferación de linfocitos T y/o la secreción de citocinas, dando como resultado una destrucción tisular 70 reducida y una inducción de no respuesta a células T especificas de antígenos que podría dar como resultado la aceptación del injerto a largo plazo, sin la necesidad de inmunosupresión generalizada. Una modalidad preferida de la invención comprende el uso de la molécula mutante CTLA4 soluble L104EA29YIg para regular las interacciones entre células CTLA4- y CD28-positivas funcionales con células B7-positivas, para tratar enfermedades del sistema inmunológico tales como diabetes y/o para subregular respuestas inmunes. La L104EA29YIg de la invención es una molécula mutante CTLA4 soluble que comprende al menos los dos cambios de aminoácido, la leucina (L) a ácido glutámico (E) en la posición +104 y la alanina (A) a tirosina (Y) en la posición +29. La molécula L104EA29YIg puede abarcar además mutaciones más allá de las dos especificadas en la presente. El método puede comprender además administrar con las moléculas mutantes CTLA4 solubles, un régimen inmunosupresor de base al sujeto. El régimen inmunosupresor de base puede incluir (pero no está limitado a) : ciclosporina, azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, globulina inmune linfocítica, anticuerpos anti-CD3, globulina inmune Rho (D) , adrenocorticosteroides, sulfasalazina, FK-506 metoxsalén, mofetil micofenolato (CELLCEPT) , globulina de tomocito antihumano de caballo (ATGAM) , anti-TAC 71 humanizado (HAT), basiliximab (SIMULECT) , globulina de timocito antihumano de conejo (THYMOGLOBULIN) , sirolimús, talidomida, metotrexato, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina, sulfasalazopirina, leflunomida, sales de oro, D-penicilamina, azatioprina, anaquinra, infliximab, etanercept, bloqueadores de FNTa o un agente biológico que se dirija a una citocina inflamatoria. En una modalidad preferida, el régimen inmunosupresor de base está libre de esteroides. De manera más preferible, el régimen inmunosupresor de base comprende rapamicina y anticuerpo • monoclonal IL-2 R antihumano. Una modalidad de la invención comprende el uso de una molécula para bloquear la interacción entre B7 y CTLA4 en conjunto con un agente inmunosupresor para regular una respuesta inmune para tratar asi una enfermedad del sistema inmunológico tal como diabetes. La molécula usada para bloquear la interacción B7/CTLA4 puede ser una CTLA4 soluble tal como CTLA4lg, CTLA4Ig/CD28Ig o L104EA29YIg, una CD28 soluble tal como CD28Ig, una B7 soluble (B7-1 o B7-2) tal como B7Ig, anticuerpos monoclonales anti-CTLA4, anticuerpos monoclonales anti-CD28 o anticuerpos monoclonales anti-B7. Los sujetos tratados por la presente invención incluyen sujetos mamíferos, incluyendo, humano, mono, simio, perro, gato, vaca, caballo, cabra, cerdo, conejo, ratón y rata. 72 La presente invención proporciona varios métodos, locales o sistémicos, para administrar las composiciones terapéuticas de la invención tales como la molécula CTLA4 soluble sola o en conjunto con un agente inmunosupresor y/u otro fármaco terapéutico. Los métodos incluyen administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, oral, por inhalación y subcutánea, asi como una bomba implantable, infusión continua, terapia génica, liposomas, supositorios, contacto tópico, vesículas, cápsulas y métodos de inyección. El agente terapéutico, mezclado con un vehículo, se liofiliza comúnmente para su almacenamiento y es reconstituido con agua o una solución de pH regulado con un pH neutro (pH de aproximadamente 7-8, por ejemplo, un pH de 7.5) antes de su administración. Como es la práctica común en la técnica, las composiciones de la invención pueden administrarse al sujeto en cualquier forma farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con la práctica de la invención, los métodos comprenden administrar a un sujeto las moléculas CTLA4 solubles de la invención para regular las interacciones entre células CD28- y/o CTLA4-positivas con células B7-positivas. Las células B7-positivas son puestas en contacto con una cantidad efectiva de las moléculas CTLA4 solubles de la invención, o fragmentos o derivados de las mismas, para formar así complejos CTLA4/B7 solubles. Los complejos 73 interfieren con la interacción entre moléculas CTLA4 y CD28 endógenas con las moléculas de la familia B7. Las moléculas CTLA4 solubles pueden administrarse a un sujeto en una cantidad y durante un tiempo (por ejemplo, longitud de tiempo y/o varias veces) suficiente como para bloquear las moléculas B7 endógenas de unirse a sus ligandos respectivos, en el sujeto. El bloqueo de la unión B7/ligando endógena, inhibiendo de esta manera las interacciones entre células B7-positivas con células CD28- y/o CTLA4-positivas . La dosis de un agente terapéutico depende de muchos factores que incluyen, pero no están limitados a, el tipo de tejido afectado, el tipo de enfermedad autoinmune que esté siendo tratada, la severidad de la enfermedad, la salud de un sujeto y la respuesta al - tratamiento con los agentes. En consecuencia, las dosis de los agentes pueden -variar dependiendo de cada sujeto y del modo de administración. Las moléculas CTLA4 solubles pueden administrarse en una cantidad de aproximadamente 0.1 a 100 mg/kg de peso del paciente/dia. La invención abarca también el uso de las composiciones de la invención junto con otros agentes farmacéuticos para tratar enfermedades del sistema inmunológico . Por ejemplo, la diabetes puede ser tratada con las moléculas de la invención en conjunto con, pero no limitados a, agentes inmunosupresores tales como corticosteroides, ciclosporina (Mathiesen 1989 Cáncer Lett. 74 44 (2) : 151-156) , prednisona, azatioprina, (R. Handschumacher, en: "Drugs üsed for Immunosuppression" páginas 1264-1276) , bloqueadores o antagonistas de ???a (New England Journal of Medicine, vol . 340:253-259, 1999; The Lancet vol. 354: 1932-39, 1999, Annals of Internal Medicine, vol. 130:478-486) o cualquier otro agente biológico que se dirija a cualquier citocina inflamatoria, fármacos antiinflamatorios no esteroidales/in ibidores de Cox-2, hidroxicloroquina, sulfasalazopirina, sales de oro, etanercept, infliximab, rapamicina, micofenolato mofetilo, azatioprina, tacrolimús, basiliximab, citoxan, interferón beta-la, interferón beta-lb, acetato de glatiramero, clorhidrato de mitoxantrona, anaquinra y/o otros agentes biológicos. Las moléculas CTLA4 solubles (de preferencia, L104EA29YIg) también pueden usarse en combinación con uno o más de los siguientes agentes para regular una respuesta inmune: gp39 soluble (también conocido como ligando CD40 (CD40L) , CD154, T-BAM, TRAP) , CD29 soluble, CD40 soluble, CD80 soluble (por ejemplo, ATCC 68627), CD86 soluble, CD28 soluble (por ejemplo 68628), CD56 soluble, Thy-1 soluble, CD3 soluble, TCR soluble, VLA-4 soluble, VCAM-1 soluble, LECAM-1 soluble, ELAM-1 soluble, CD44 soluble, anticuerpos reactivos con gp39 (por ejemplo ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 y ATCC HB-12056), anticuerpos reactivos con CD40 (por ejemplo, ATCC HB-9110), anticuerpos reactivos con B7 (por ejemplo ATCC HB-253, 75 ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, etc.), anticuerpos reactivos con CD28 (por ejemplo, ATCC HB-11944 o itiAb 9.3 como los descritos por Martin et ai., (J. Clin. Immun. 4(1): 18-22, 1980), anticuerpos reactivos con LFA-1 (por ejemplo, ATCC HB-9579 y ATCC TIB-213), anticuerpos reactivos con LFA-2, anticuerpos reactivos con IL-2, anticuerpos reactivos con IL-12, anticuerpos reactivos con IFN-gama, anticuerpos reactivos con CD2, anticuerpos reactivos con CD48, anticuerpos reactivos con cualquier ICAM (por ejemplo, ICAM-1 (ATCC CRL-2252) , ICAM-2 y ICAM-3) , anticuerpos reactivos con CTLA4 (por ejemplo, ATCC HB-304) , anticuerpos reactivos con Thy-1, anticuerpos reactivos . con CD56, anticuerpos reactivos con CD3, anticuerpos reactivos con CD29, anticuerpos reactivos con TCR, anticuerpos reactivos con VLA-4, anticuerpos reactivos con VCAM-1, anticuerpos reactivos con LECAM-1, anticuerpos reactivos con ELAM-1, anticuerpos reactivos con CD44. En ciertas modalidades se prefieren los anticuerpos monoclonales . En otras modalidades, se prefieren fragmentos de anticuerpos. Como lo entenderán fácilmente las personas con capacidad en la técnica, la combinación puede incluir las moléculas CTLA4 de la invención y algún otro agente inmunosupresor, las moléculas CTLA4 solubles con otros dos agentes inmunosupresores, las moléculas CTLA4 solubles con otros tres agentes inmunosupresores, etc. La determinación de la 76 combinación y dosis óptimas puede determinarse y optimizarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Algunas combinaciones especificas incluyen las siguientes: L104EA29YIg y anticuerpos monoclonales (mAbs) CD80; L104EA29YIg y mAbs CD86; L104EA29YIg, mAbs CD80 y mAbs CD86; L104EA29YIg y mAbs gp39; L104EA29YIg y mAbs CD40; L104EA29YIg y mAbs CD28; Ll04EA29YIg, mAbs CD80 y CD86 y mAbs gp39; L104EA29YIg, mAbs CD80 y CD86 y mAbs CD40 y L104EA29YIg, mAb anti-LFAl y mAb anti-gp39. Un ejemplo especifico de un mAb gp39 es MR1. Otras combinaciones serán fácilmente apreciadas y entendidas por las personas capacitadas en la técnica. Las moléculas CTLA4 solubles de la invención, por ejemplo L104EA29YIg, pueden administrarse como el único ingrediente activo o junto con otros fármacos en regímenes inmunomoduladores u otros agentes antiinflamatorios, por ejemplo, para el tratamiento o prevención de un rechazo agudo o crónico de alo- o xenoinj ertos, o trastornos inflamatorios o autoinmunes, o para inducir tolerancia. Por ejemplo, se puede usar en combinación con un inhibidor de calcineurina, por ejemplo, ciclosporina A o F 506; un macrólido inmunosupresor, por ejemplo, rapamicina o un derivado de la misma (por ejemplo, 4.0-0- (2-hidroxi) etil-rapamicina) ; un agente de alojamiento de linfocitos, por ejemplo, FTY720 o un análogo del mismo; corticosteroides; ciclofosfamida; 77 azatiopreno; metotrexato; leflunoiaida o un análogo de la misma; mizoribina; ácido micofenólico; micofenolato mofetilo; 15-desoxiespergualina o un análogo de la misma; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos monoclonales para receptores de leucocitos, por ejemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD lla/CD18, CD7, CD25, CD 27, B7, CD40, CD45, CD58, CD 137, ICOS, CD150 (SLAM) 0X40, 4-1BB o sus ligandos; u otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo, CTLA4/CD28-Ig, u otros inhibidores de moléculas de adhesión, por ejemplo, mAbs o innhibidores de bajo peso molecular incluyendo antagonistas de LFA-1, antagonistas de Selectina y antagonistas de VLA-4.. El compuesto es particularmente útil en combinación con un compuesto que interfiera con CD40 y su ligando, por ejemplo, anticuerpos para CD40 y anticuerpos para CD40-L. Cuando las moléculas mutantes CTLA4 solubles de la invención se administran en conjunto con otras terapias inmunosupresoras/inmunomoduladoras o antiinflamatorias, por ejemplo, como las descritas anteriormente en la presente, las dosis del compuesto inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio o coadministradas serán por supuesto variables dependiendo del tipo de cofármaco empleado, por ejemplo ya sea que éste sea un esteroide o una ciclosporina, dependiendo del fármaco especifico empleado, o de la condición que se esté tratando y demás . 78 De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona en un aspecto más métodos como los definidos arriba que comprenden la coadministración, por ejemplo, en forma concomitante o en secuencia, de una cantidad terapéuticamente efectiva de moléculas CTLA4 solubles en la invención, por ejemplo, CTLA4Ig y/o L104EA29YIg, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, y una segunda sustancia de fármaco, la segunda sustancia de fármaco siendo un fármaco inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio, por ejemplo como el indicado arriba. Se proporcionan además combinaciones terapéuticas, por ejemplo un equipo, que comprende una molécula CTLA4 soluble, .en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, para usarse en forma concomitantemente o en secuencia con por lo menos una composición farmacéutica que comprende un fármaco inmunosupresor, inmunomodulador o antiinflamatorio, por ejemplo, NSAID, glucocorticoide o corticosteroide. El equipo puede comprender instrucciones para su administración. Los equipos de la invención se pueden usar en cualquier método de la presente invención. En otra modalidad de la invención, el rechazo de transplantes de tejidos u órganos es inhibido al administrar a un sujeto CTLA4 soluble y células de médula ósea sin células T al sujeto. La administración de médula ósea sin células T puede ocurrir aproximadamente al mismo tiempo que 79 el sujeto reciba el transplante de tejido u órgano o en un momento diferente. La administración de médula ósea aproximadamente al mismo tiempo indica que la médula ósea es administrada al sujeto como parte de la preparación para los procedimientos para administrar el transplante de tejido u órgano. No se requiere que la médula ósea sea transplantada exactamente al mismo tiempo (es decir, dentro de minutos de) que el transplante de órgano. En modalidades preferidas, la médula ósea sin células T es administrada antes del transplante de órgano. Las modalidades particulares incluyen administrar la médula ósea sin células T un día antes, doce horas antes o a seis horas antes del transplante de órganos sólidos. Sin embargo, la médula ósea sin células T puede administrarse más temprano, siempre y cuando los efectos resultantes de la médula ósea sin células T se logren aún, en relación con el transplante de órgano o tejido. En modalidades alternativas, se puede desear administrar médula ósea sin células T después del transplante de órganos. En una modalidad, el método comprende administrar una dosis de células de médula ósea sin células T (dosis de tolerancia) a un sujeto, y posteriormente administrar una dosis adicional de células de médula ósea sin células T (dosis de .injerto) al sujeto. En ciertas modalidades, el agente inmunosupresor comprende al menos uno o dos tipos de 80 ligandos que interfieren con la unión del antigeno CD28 al antigeno CD80 y/o CD86. Como se describió arriba, el ligando es de preferencia una molécula CTLA4 mutante, tal como L104EA29YIg. Además, la cantidad de médula ósea sin células T puede determinarse mediante experimentación de rutina y optimizarse empíricamente. Por ejemplo, la cantidad de médula ósea sin células T puede calcularse durante experimentación de rutina para determinar la cantidad suficiente para lograr los efectos deseados. Los métodos de la invención también pueden practicarse al administrar, además de la molécula mutante CTLA4 soluble, dos o más dosis de médula ósea sin células T al sujeto, sola o en combinación con, uno o más de agentes inmunosupresores . Según se describe en la presente, en los métodos de la invención, la administración de una molécula CTLA4 soluble o una molécula CTLA4 mutante se puede lograr de muchas maneras diferentes incluyendo rutas de administración local o sistémica. Por ejemplo, las moléculas mutantes CTLA4 solubles se pueden administrar intravenosamente, intramuscularmente o intraperitonealmente . Como alternativa, CTLA4 mutante puede administrarse oralmente o subcutáneamente. Otros métodos de administración serán reconocidos por los expertos en la técnica. De manera 81 similar, la médula ósea sin células T puede administrarse en muchas formas diferentes conocidas por las personas capacitadas en la técnica. Un ejemplo es por medio de infusión intravenosa. Los agentes inmunosupresores pueden administrarse antes o después de la administración de la molécula mutante CTLA4 soluble y/o antes o después del transplante de órgano/te ido. De preferencia, la médula ósea y el agente inmunosupresor se administran antes de la administración de la molécula mutante CTLA4 soluble. En una modalidad, una primera dosis de médula ósea sin células T (dosis de tolerancia) y el agente inmunosupresor se administra aproximadamente al mismo tiempo que el transplante de órgano. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención. La metodología y resultados pueden variar dependiendo de la meta del tratamiento deseada y de los procedimientos empleados. Los ejemplos no están diseñados de ninguna manera para limitar de otra forma el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Este ejemplo proporciona una descripción de los métodos usados para generar las secuencias de nucleótidos que codifican para las moléculas imitantes CTLA4 solubles de la invención. Una L104EIg mutante de un solo sitio fue generada 82 y probada para cinética de unión a CD80 y/o CD86. La secuencia de nucieótidos de L104EIg se usó como una plantilla para generar la secuencia de CTLA4 mutante de doble sitio, Ll04EA29YIg, la cual se probó para cinética de unión a CD80 y/o CD86.

Mutagénesis a base de codones CTLA4Ig Se desarrolló una estrategia de mutagénesis y análisis para identificar moléculas CTLA4Ig imitantes que tuvieran velocidades de disociación más lentas (velocidades "apagadas") de unión a molécula CD86. Las secuencias de nucieótidos imitantes de un solo sitio se generaron usando CTLA Ig (patentes de- E.U.A. Nos: 5,844,095; '5,851,795; y 5,885,796; ATCC No. de acceso 6829) como una plantilla. Cebadores PCR de oligonucleótidos mutagénicos fueron diseñados para la mutagénesis . aleatoria de un codón de ADNc especifico al permitir cualquier base en las posiciones 1 y 2 del codón, pero sólo guanina o trimina en la posición 3 (XXG/T, también conocida como NNG/T) . De esta manera, un codón especifico que codificaba para un aminoácido pudo ser mutado aleatoriamente para codificar para cada uno de los 20 aminoácidos. A ese respecto, la mutagénesis de XXG/T produce 32 codones potenciales que codifican cada uno de los 20 aminoácidos. Los productos de PCR que codifican para mutaciones en proximidad cercana a -M97-G107 de CTLA4Ig 83 (véase figura 1 ó 2), fueron digeridos con Sacl/Xbal y subclonados en vector de expresión CTLA4Ig 7cLN cortado de manera similar. Este método se usó para generar la molécula mutante CTLA4 de un solo sitio L104EIg. Para la mutagénesis en proximidad a S25-R33 de CTLA4Ig, un sitio de restricción Nhel silente fue introducido primero 5' hacia esta asa, mediante mutagénesis dirigida por cebadores de PCR. Los productos de PCR fueron digeridos con Nhel/Xbal y subclonados- en vectores de expresión CTLA4lg o L104EIg cortados similármente . Se usó este método para generar la molécula mutante CTLA4 de doble sitio L104EA29YIg (figura 3) . En particular, la molécula de ácido nucleico que codifica para la molécula mutante CTLA4 de un solo sitio L104EIg se usó como una plantilla para generar la molécula mutante CTLA4 de doble sitio L104EA29YIg.

Ejemplo 2 Lo siguiente proporciona una descripción de los métodos de tamizado utilizados para identificar los polipéptidos CTLA4 mutantes de un solo sitio y de doble sitio, expresados a partir de las construcciones descritas en el ejemplo 1, que exhibieron una avidez de unión más alta para antigenos CD80 y CD86, en comparación con las moléculas CTLA4Ig no mutadas. Estudios actuales in vitro e in vivo indican que 84 CTLA4Ig por sí misma es incapaz de bloquear completamente el cebado de células T activadas específicas de antígeno. Estudios in vitro con CTLA4Ig y ya sea anticuerpo monoclonales específicos para CD80 o CD86 midiendo la inhibición de la proliferación de células T indican que el anticuerpo monoclonal anti-CD80 no incrementó la inhibición de CTLA4Ig. Sin embargo, el anticuerpo monoclonal anti-CD86 sí aumentó la inhibición, indicando que CTLA4Ig no era tan efectiva para bloquear las interacciones de CD86. Estos datos soportan descubrimientos anteriores por Linsley et al., (Immunity, (1994), 1:793-801) que muestran la que inhibición de respuestas celulares mediadas por CD80 requerían de concentraciones de CTLA4Ig aproximadamente 100 veces más bajas que para las respuestas mediadas por CD86. Con base en estos hallazgos, se creó la hipótesis de que las moléculas mutantes CTLA4 solubles que tienen una avidez más alta para CD86 que CTLA4 tipo silvestre deben ser más capaces de bloquear el cebado de células activadas específicas de antígenos que CTLA4lg. Para este fin, las moléculas mutantes CTLA4 solubles descritas en el ejemplo 1 anterior fueron tamizadas usando un procedimiento de tamizado novedoso para identificar varias mutaciones en el dominio extracelular de CTLA4 que • mejoran la avidez de unión para CD80 y CD86. Esta estrategia de tamizado proporcionó un método efectivo para identificar 85 directamente imitantes con velocidades "apagadas" aparentemente más lentas, sin la necesidad de la purificación o cuantificación de proteínas toda vez que una determinación de la velocidad "apagada" depende de la concentración (O'Shannessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212:457-468). Células COS fueron -transfectadas con ADN plasmidico purificado por miniprep individual y se propagaron durante varios días. Medio de cultivo acondicionado tres días fue aplicado a microcircuitos biosensores BIAcore (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) recubiertos con CD80Ig o CD86Ig solubles. La unión específica y la disociación de las proteínas mutantes se midió mediante resonancia plasmónica de superficie (O'Shannessy, D. J., et al. r (1993) Anal. Biochem. 212:457-468). Todos los experimentos se llevaron a cabo en biosensores BIAcore™ o BIAcore™ 2000 a 25°C. Los ligandos fueron inmovilizados sobre microcircuitos sensores NCM5 grado investigación (Pharmacia) usando copulación estándar de N-etil-N' - (dimetilaminopropil) carbodiimid-N-hidroxisuccinimida (Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277; Khilko, S.N., et al. (1993) J. Biol. Chem 268:5425-15434).

Método de análisis Células COS cultivadas en placas de cultivo de tejidos de 24 pocilios fueron transfectadas transitoriamente con ADN que codifica para CTLA4Ig imitante. Medio de cultivo 86 que contenía CTLA4Ig imitante soluble secretada se recogió tres días más tarde. El medio de cultivo de células COS acondicionado se dejó fluir sobre los microcircuitos biosensores BIAcore derivados con CD86Ig o CD80Ig (como se describe en Greene et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771), y las moléculas imitantes fueron identificadas con velocidades "apagadas" más lentas que las observadas para CTLA Ig tipo silvestre. Las moléculas de ADNc que corresponden a las muestran de medio seleccionadas fueron secuenciadas y el ADN se preparó para llevar a cabo una transfección transitoria de células COS de más grande escala, de la cual la proteína CTLA4Ig se preparó siguiendo la purificación de proteína A en medio de cultivo. Las condiciones de análisis BIAcore y los datos de unión de equilibrio se llevaron a cabo como se describió en J. Greene et ai., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771 y como se describe en la presente.

Análisis de datos BIAcore Líneas de base de sensogramas fueron normalizadas a cero unidades de respuesta (RU) antes del análisis. Las muestras fueron corridas sobre células de flujo derivadas en falso para determinar los valores de unidad de respuesta (RU) anteriores debido a las diferencias en el índice de refracción general entre soluciones. Las constantes de 87 disociación de equilibrio (¾) se calcularon a partir de gráficas de Req contra C, en donde Req es la respuesta en estado latente menos la respuesta en un microcircuito derivado en falso, y C es la concentración molar de analito. Las curvas de unión se analizaron usando software de ajuste de curvas no lineales comercial (Prism, Software GraphPAD) . Los datos experimentales se ajustaron primero a un modelo para una sola unión de ligando a un solo receptor (modelo de 1 sitio, es decir, un sistema de langmuir simple, A+B AB) , y las constantes de asociación de equilibrio ( Kd= [A] · [B] \ [AB] ) se calcularon a partir de la ecuación (Kd+C) . Posteriormente, los datos se ajustaron al modelo de unión a ligando de dos sitios más simple (es decir, a un receptor que tenía dos sitios de unión independientes no interactivos como el descrito por la ecuación Las bondades de ajuste de estos dos modelos se analizaron visualmente mediante la comparación con datos experimentales y estadísticamente por medio de una prueba F de las sumas de cuadrados. El modelo de un sitio más simple se seleccionó como el mejor ajuste, a menos que el ajuste del modelo de dos sitios fuera significativamente mejor (p<0.1). Los análisis de asociación y disociación se llevaron a cabo usando software 2.1 de evaluación BIA (Pharmacia) . Las constantes de velocidad de asociación kon 88 fueron calculadas en dos formas, asumiendo tanto interacciones de un solo sitio homogéneas como interacciones de dos sitios paralelas. Para las interacciones de un solo sitio, los valores kon fueron calculados de acuerdo con la ecuación Rt=Req (l-exp~ks<t_to) , en donde Rt es una respuesta en un momento dado, t; Req es la respuesta en estado latente; t0 es el tiempo en el inicio de la inyección y y en donde C es una concentración de analito, calculada en términos de sitios de unión monoméricos. Para la interacción de dos sitios se calcularon los valores kon de acuerdo con la ecuación Rt=Reqi (l-exp'^^'V+I (l-expks2<t~V . Para cada modelo, los valores de kon fueron determinados a partir de la pendiente calculada (a aproximadamente 70% de asociación máxima) de las gráficas de ks contra C . Los datos de disociación se analizaron de acuerdo con modelos de un sitio (AB=A+B) o dos sitios (AiBj=Ai+Bj ) , y las constantes de velocidad ( k0ff) se calcularon a partir de las curvas de mejor ajuste. Se usó el modelo de sitio de unión excepto cuando los residuos fueron mayores que el fondo de la máquina (2-10 RU, de acuerdo con la máquina) , en cuyo caso se empleó el modelo de dos sitios de unión. Los tiempos medios de ocupación del receptor se calcularon usando la relación ti/2=0 . 693/kDff . 89 Citometría de flujo Anticuerpo monoclonal L307.4 de murino (anti-CD80) se compró de Becton Dickinson (San José, California) e IT2.2 (anti-B7-0 [también conocido como CD86] ) , de P armingen (San Diego, California) . Para la inmunotinción, células CHO CD80-positivas y/o CD86-positivas fueron removidas de sus recipientes de cultivo mediante incubación en solución salina de pH regulado con fosfato (PBS) que contenia 10 mM de EDTA. Las células CHO (1-10 x 105) se incubaron con iriAbs o proteínas de fusión de inmunoglobulina en DMEM gue contenía 10% de suero bovino fetal (FBS), luego se lavaron y se incubaron con reactivos de segunda etapa de inmunoglobulina humana o anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado a isotianato de fluoresceína (Tago, Burlingame, California) . A las células se les dio un lavado final y se analizaron en un aparato FACScan (Becton Dickinson) .

SDS-PAGE y cromatografía de exclusión de tamaño Se llevó a cabo SDS-PAGE en geles de acrilamida Tris/glicina 4-20% (Novex, San Diego, California) . Los geles analíticos fueron teñidos con azul de Coomassie, e imágenes de geles húmedos fueron obtenidas mediante escaneo digital. CTLA4Ig (25 ]iq) y L104EA29YIg (25 ig) fueron analizadas mediante cromatografía de exclusión de tamaño usando la columna TSK-GEL G300 SWJO. (7.8 x 300 mm, Tosohass, 90 Montgomeryville, PA) equilibrada en solución salina de pH regulado con fosfato que contenia 0.02% de NAN3 a una velocidad de flujo de 1.0 ml/min.

CTLA4XC120S y L104EA29YXCi2os . CTLA4XCi2os de una cadena se preparó como se describió anteriormente (Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem. 270:15417-15424). Brevemente, un plásmido de expresión CTLA4 de oncostatina M (OMCTLA4) se usó como una plantilla, el cebador delantero, GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG (SEQ ID NO: 17) se seleccionó para hacer coincidir las secuencias en el vector, y el cebador inverso, GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC (SEQ ID NO: 18) correspondía a los últimos siete aminoácidos (es decir, los aminoácidos 118-124) en el dominio extracelular de CTLA4, y contenia un sitio de enzima de restricción, y un codón de detención (TGA) . El cebador inverso especificó una mutación C120S (cisteina a serina en la posición 120) . En particular, la secuencia de nucleótidos GCA (nucleótidos 34-36) del cebador inverso mostrada arriba es reemplazada con una de las siguientes secuencias de nucleótidos: AGAr GGA, TGA, CGA, ACT o GCT. Como las personas capacitadas en la técnica lo entenderán, la secuencia de nucleótidos GCA es una secuencia complementaria invertida del codón TGC para cisteina. De 91 manera similar, las secuencias de nucleótidos AGA, GGA, TGA, CGA, ACT o GCT son las secuencias complementarias invertidas de los codones para serina. Los productos de reacción en cadena de polimerasa fueron digeridos con HindIII/Xbal y subclonados direccionalmente en el vector de expresión 7.LN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ) . L104EA2 YXcl20s se preparó de una manera idéntica. Cada construcción se verificó mediante secuenciación de ADN.

Identificación y caracterización bioquímica de mutantes de alta avidez Veinticuatro aminoácidos fueron seleccionados para mutagénesis y las proteínas mutantes de ~2300 resultantes fueron ensayadas para la unión a CD86Ig mediante resonancia plasmónica de superficie (SPR; como se describió arriba) . Los efectos predominantes de la mutagénesis en cada sitio se resumen en la taba II. La mutagénesis aleatoria de algunos aminoácidos en la S25-R33 aparentemente no alteró la unión a ligando. La mutagénesis de E31 y R33 y los residuos M97-Y102 dieron como resultado aparentemente una unión a ligando reducida. La mutagénesis de los residuos S25, A29 y T30, K93, L96, Y103, L104 y G105, dio como resultado proteínas con velocidades "encendidas" lentas y/o "apagadas" lentas. Estos resultados confirman los descubrimientos anteriores de que los residuos en la región S25-R33 y los residuos en o cerca- 92 de M97-Y102 tienen influencia en la unión a ligando (Peac et al., (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058. La mutagénesis de los sitios S25, T30, K93, L96, Y103 y G105 dio como resultado la identificación de algunas proteínas mutantes que tenían velocidades "apagadas" más lentas de CD86Ig. Sin embargo, en estos casos, la velocidad "apagada" lenta fue comprometida por una velocidad "encendida" lenta que dio como resultado proteínas mutantes con una avidez general para CD86Ig que era aparentemente similar a la observada con CTLA4Ig tipo silvestre. Además, la mutagénesis de K93 dio como resultado una agregación significativa que pudiera haber sido responsable de los cambios cinéticos observados. La mutagénesis aleatoria de L104 seguida por la transfección de células COS y el tamizado mediante SPR de muestras de medio de cultivo sobre CD86Ig inmovilizada produjeron seis muestras de medio que contenían proteínas mutantes con velocidades "apagadas" aproximadamente dos veces más lentas que las de CTLA4Ig tipo silvestre. Cuando el ADNc correspondiente de estos mutantes fue secuenciado, se encontró que cada uno codificaba para una mutación de leucina a ácido glutámico (L104E) . Aparentemente, la sustitución de leucina 104 para ácido aspártico (L104D) no afectó la unión a CD86íg. La mutagénesis se repitió después en cada sitio 93 listado en la tabla II, esta vez usando L104E como la plantilla de PCR en lugar de CTLA4Ig tipo silvestre, como se describió arriba. El análisis de SPR, de nuevo usando CD86Ig inmovilizada, identificó seis muestras de medios de cultivo de la mutagénesis de alanina 29 con proteínas que tenían velocidades de "apagado" aproximadamente cuatro veces más lentas que la de CTLA4Ig tipo silvestre. Las dos más lentas fueron las sustituciones de tirosina (L104EA29Y) , dos fueron leucina (L104EA29L) , una fue triptófano (L104EA29W) y una fue treonina (L104EA29T) . Aparentemente, ningún imitante de velocidad "apagada" lenta se identificó cuando alanina 29 fue mutada aleatoriamente, sola, en CTLA4Ig tipo silvestre. La masa molecular relativa y el estado de agregación de L104E y L104EA29YIg purificadas se determinó mediante SDS-PAGE y cromatografía de exclusión de tamaño. L104EA29YIg (~1 ]ig; línea 3) y L104Eig (~1 µg; línea 2) tuvieron aparentemente la misma movilidad electroforética que CTLA4Ig (~1 pg; línea 1) bajo condiciones reductoras (~50kDa; +ß??; más 2-mercaptoetanol) y no reductoras (~100kDa; -ß??) (figura 14A) . La cromatografía de exclusión de tamaño demostró que L104EA29YIg (figura 14C) aparentemente tuvo la misma movilidad que CTLA4Ig dimérica (figura 14B) . Los picos principales representan dímero de proteína mientras que el pico menor de elución más rápida en la figura 14B representa agregados con peso molecular más alto. Aproximadamente 5.0% 94 de CTLA4Ig estuvo presente como agregados de peso molecular más alto pero no hubo evidencia de agregación de L104EA29Ylg o L104Eig. Por lo tanto, la unión más fuerte a CD86Ig observada con L104Eig y Ll04EA29YIg no pudo ser atribuida a la agregación inducida por mutagénesis.

Análisis de equilibrio y unión cinética El análisis de equilibrio y unión cinética se llevó a cabo en CTLA4Ig, L104EIg y L104EA29YIg purificadas con proteina A usando resonancia plasmónica de superficie (SPR) . Los resultados se muestran en la tabla I. Las constantes de disociación de equilibrio observadas (kd; tabla I) se calcularon a partir de curvas de unión generadas sobre un intervalo de concentraciones (5.0-200 nM) . Ll04EA29YIg se une más fuertemente a CD86Ig que L104EIg o CTLA4Ig. La ¾ más baja de L104EA29YIg (3.21 nM) que L104EIg (6.06 nM) o CTLA4Ig (13.9 nM) indica una avidez de unión más alta de L104EA29YIg a CD86Ig. -La ¾ más baja de L104EA29YIg (3.66 nM) que L104Eig (4.47 nM) o CTLA4Ig (6.51 nM) indica una mayor avidez de unión de Ll04EA29YIg a CD80Ig. El análisis de unión cinética reveló que las velocidades "encendidas" comparativas para unión de CTLA4Ig, L104EIg, y L104EA29YIg a CD80 eran similares, al igual que las velocidades "encendidas para CD86Ig (tabla I) . Sin embargo, las velocidades "apagadas" para estas moléculas no 95 fueron equivalentes (tabla I) . En comparación con CTLA4Ig, L104EA29YIg tuvo una velocidad "apagada" aproximadamente dos veces más lenta de CD80Ig, y una velocidad "apagada" aproximadamente cuatro veces más lenta de CD86lg. L104E tuvo velocidades "apagadas" intermedias entre L104EA29YIg y CTLA4Ig. Ya que la introducción de estas mutaciones no afectó significativamente las velocidades "encendidas", el incremento en avidez para CD80Ig y CD86Ig observado con L104EA29YIg fue tal vez principalmente debido a una disminución en las velocidades "apagadas". Para determinar si el incremento en avidez de L104EA29YIg para CD86Ig y CD80Ig se debió a las mutáciones que afectan la forma en la que cada monómero se asoció como un dímero, o si habían cambios estructurales que incrementaran la avidez introducidos en cada monómero, construcciones de una cadena de dominios extracelulares de CTLA4 y L104EA29Y fueron preparadas siguiendo la mutagénesis de cisterna 120 a serina como se describió arriba, y por Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem. , 270:15417-15424. Las proteínas purificadas CTLA4XCi2s y L104EA29YXCi2os mostraron ser monoméricas mediante cromatografía de permeación en gel (Linsley et al., (1995), arriba); antes de que sus propiedades de unión a ligando fueran analizadas por SPR. Los resultados mostraron que la afinidad de unión de ambas proteínas monoméricas para CD86lg era aproximadamente 35-80 96 veces menor que la observada para sus dimeros respectivos (tabla I) . Esto soporta datos previamente publicados que establecen que se requería la dimerización de CTLA4 para unión a ligando de alta avidez (Grene et al., (1996) J. Biol. Chem. , 271:26762-26771). L104EA29YXCi2os se unió con una afinidad aproximadamente dos veces más alta que CTLA4XCi2os tanto a CD80Ig como a CD86Ig. La afinidad incrementada se debió a una velocidad de disociación aproximadamente tres veces más lenta de ambos ligandos. Por lo tanto, la unión a ligando más fuerte por L104EA29Y fue muy probablemente debida a los cambios estructurales de incremento de avidez que habían sido introducidos en cada cadena monomérica en lugar de alteraciones en las cuales la molécula se dimerizó.

Localización y Análisis estructural de mutaciones de incremento de avidez La estructura en solución del dominio tipo IgV extracelular de CTLA4 ha sido recientemente determinada mediante espectroscopia de M (Metzler et al., (1997) Nature Struct. Biol. 4:527-531. Esto permitió la localización precisa de leucina 104 y alanina 29 en el doblez tridimensional (figura 15A-B) . La leucina 104 se sitúa cerca de la secuencia de aminoácidos MYPPPY altamente conservada. Alanina 29 se sitúa cerca del extremo C-terminal de la región 97 S25-R33, la cual es espacialmente adyacente a la región MYPPPY. Aunque existe una interacción significativa entre los residuos en la base de estas dos regiones, aparentemente no existe interacción alguna entre L104 y ?29 aunque ambas comprenden parte de un núcleo hidrofóbico contiguo en la proteina. Las secuencias estructurales de los dos mutantes de incremento de avidez fueron determinadas mediante modelado. La mutación A29Y se puede alojar fácilmente en la hendidura entre la región S25-R33 y la región MYPPPY, y podría servir para estabilizar la conformación de la región MYPPY. En- CTLA4 tipo silvestre, L104 forma extensas interacciones hidrofóbicas con L96 y V94 cerca de la región MYPPPY. Es muy poco probable que la mutación de ácido glutámico adopte una conformación similar a la de LIO4 por dos razones. Primero, existe un espacio insuficiente para recibir la cadena lateral de ácido glutámico más larga en la estructura sin una perturbación significativa de la región S25-R33. Segundo, los costos energéticos de enterrar la carga negativa de la cadena lateral de ácido glutámico en la región hidrofóbica serían altos. En lugar de ello, estudios de modelado predicen que la cadena lateral de ácido glutámico sale hacia la superficie cuando su carga puede ser estabilizada mediante solvatación. Este cambio en conformación se puede recibir fácilmente por G105, con una distorsión mínima a otros residuos en las regiones. 98 Unión de mutantes de alta avidez a células CHO que expresan CD80 o CD86 El análisis FACS (figura 9) de la unión de CTLA4Ig y moléculas mutantes a células CHO CD80+ y CD86+ establemente transfectadas se llevó a cabo como se describe en la presente. Células CHO CD80-positi as y CD86-positivas fueron incubadas con concentraciones cada vez más altas de CTLA4Ig, L104EA29YIg o Ll04EIg, y luego lavadas. La proteina de fusión de inmunoglobulina unida se detectó usando inmunoglobulina anti-humana de cabra conjugada por isotiocianato de fluorescein . Como se muestra en la figura 9, células CHO CD80-positivas o CD86-positivas (1.5 x 105) fueron incubadas con las concentraciones indicadas de CTLA4Ig (cuadros cerrados) , L104EA29YIg (circuios) o L104EIg (triángulos) durante dos horas a 23°C, lavadas e incubadas con anticuerpo de inmunoglobulina anti-humano de cabra conjugado por isotiocianato de fluoresceina. La unión sobre un total de 5,000 células viables fue analizada (determinación individual) en un aparato FACScan, y la intensidad de fluorescencia promedio (MFI) se determinó a partir de histogramas de datos usando PC-LYSYS . Los datos se corrigieron para fluorescencia de fondo medida sobre células incubadas con reactivo de segunda etapa únicamente (MFI=7) . El mAb L6 de control (80 µg/ml) dio" MFK30. Estos resultados 99 son representativos de cuatro experimentos independientes. La unión de L104EA29YIg, L104EIg y CTLA4Ig a células CHO transfectadas con CD80 humana es aproximadamente equivalente (figura 9A) . Ll04EA29YIg y L104EIg se unen más fuertemente a células CHO transfectadas establemente con CD86 humano que CTLA4Ig (figura 9B) .

Ensayos funcionales Células T humanas CD4-positivas fueron aisladas mediante selección negativa inmunomagnética (Linsley et al., (1992) J. Exp. Med. 176:1595-1604) . Las células T CD4-positivas aisladas fueron estimuladas con acetato de miristato fórbico (PMA) más células CHO CD80-positivas o CD86-positivas en presencia de concentraciones graduadas de inhibidor. Las células T CD4-positivas (3-10 x 10 /pocillo) fueron cultivadas en presencia de PMA 1 nM con o sin estimuladores de células CHO irradiados. Las respuestas proliferativas se midieron mediante la adición de ?µ??/??????? de [3H]timidina durante las siete horas finales de un cultivo de 72 horas. Se llevó a cabo la inhibición de PMA más células T estimuladas con CHO CD80-positivas, o CHO CD86-positivas, por Ll04EA29YIg y CTLA4Ig. Los resultados se muestran en la figura 1?. L104EA29YIg inhibe la proliferación de células CHO tratadas con PMA CD80-positivas más que CTLA4Ig (figura 10A) . L104EA29YIg también es más 100 efectivo que CTLA4lg para inhibir la proliferación de células CHO tratadas con PMA CD86-positivas (figura 10B) . Por lo tanto, Ll04EA29YIg es un inhibidor más potente de la coestimulación de células T mediada tanto por CD80 como por CD86. La figura 11 muestra la inhibición por L104EA29YIg y CTLA4Ig de células T humanas aloestimuladas preparadas arriba, y aloestimuladas más con una línea de células linfoblastoides B humanas (LCL) llamada PM que expresaba CD80 y CD86 (células T a 3. OxlOVpocillo y PM a 8.0 x lOVpocillo) . La aloestimulación primaria ocurrió durante seis días, y luego las células fueron pulsadas con 3H-timidina durante siete horas, antes de que se determinara la incorporación de marcador radioactivo. La aloestimulación secundaria se llevó a cabo como sigue. Células T aloestimuladas primarias de siete días fueron cosechadas sobre medio de separación de linfocitos (LSM) (ICN, Aurora, OH) y reposadas durante 24 horas. Las células T se reestimularon después (secundaria), en presencia de cantidades graduadas de CTLA4Ig o L104EA29YIg, añadiendo PM en la misma relación que arriba. La estimulación ocurrió durante tres días, y luego las células fueron pulsadas con marcadores radioactivos y cosechadas como se mencionó arriba. El efecto de L104EA29YIg en células T aloestimuladas primarias se muestra en la figura 11A. El efecto de 101 L104EA29YIg en células T aloestimuladas secundarias se muestra en la figura 11B. L104EA29YIg inhibe las respuestas proliferativas de células T tanto primarias como secundarias mejor que CTLA4Ig. Para medir la producción de citocina (figura 12), se establecieron placas de aloestimulación secundarias por duplicado. Después de tres días, medio de cultivo fue ensayado usando equipos ELISA (Biosource, Camarillo, CA) usando las condiciones recomendadas por el fabricante. Se encontró que L104EA29YIg era más potente que CTLA4Ig para bloquear la producción de citocinas IL-2, IL-4 y ?-IFN por células T después un estimulo alogénico secundario (figuras 12A-C) . Los efectos de L104EA29YIg y CTLA4Ig en la respuesta linfocitica mixta de mono (MLR) se muestran en la figura 13. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC'S; 3.5xl04 células/pocilio de cada mono) de dos monos fueron purificadas sobre medio de separación de linfocitos (LSM) y mezcladas con 2pg/ml de fitoheitiaglutinina (PHA) . Las células se estimularon tres días y luego se pulsaron con marcador radioactivo 16 horas antes de la cosecha. L104EA29YIg inhibió la proliferación de células T de mono mejor que CTLA4Ig. 102 Las constantes de equilibrio y cinética aparente se muestran en la siguiente tabla (los valores son desviación media + estándar de tres experimentos diferentes) : Tabla 1 Proteína Analito on (X 10*) oíf (x 10 inmovilizada M1 S1 3) nM S"1 CD80Ig CTLA4Ig 3.44±0.29 2.21±0.18 6.51±1.08 CD80Ig L104EIg 3.02±0.05 1.35+0.08 4.47+0.36 CD80Ig L104EA29YIg 2.96+0.20 1.08+0.05 3.66±0.41 CD80Ig CTLA4XCi20s 12.0±1.0 230+10 195±25 CD80Ig L104EA29YXci 8.3+26 71+5 85.0+2.5 20S CD86Ig CTLA4Ig 5.95±0.57 8.16±0.52 13.9+2.27 CD86Ig L104EIg 7.03+0.22 4.26±0.11 6.06+0.05 CD86Ig L104EA29YIg 6.42±0.40 2.06±0.03 3.21+0.23 CD86Ig CTLA4Xci2os 16.5+0.5 840+55 511+17 CD86Ig L104EA29YXci 11.4+1.6 300+10 267+29 20S 103 Tabla II El efecto de la unión de CD86Ig mediante mutagénesis de CTLA4Ig en los sitios listados se determinó mediante SPR, descrito arriba. El efecto predominante se indica con "+". 104 Ejemplo 3 Este ejemplo, proporciona la descripción de la pancreatectomía y aislamiento de células de isletas de donador, y procedimientos de transplante de células de isletas en un modelo animal.

Materiales y método: Animales. Monos rhesus macho adolescentes y criados en cautiverio (Macaca mulatta) (~4-20 kg) se usaron como receptores y donadores. La ausencia de anticuerpos específicos de donador preformados en el receptor se confirmó antes del transplante. Todos los donadores y receptores potenciales fueron probados para anticuerpos anti-CMV y sólo los animales que eran cero-positivos para CM fueron usados como receptores. 105 Pancreatectomia de donador ? aislamiento de células de isletas. La pancreatectomia del donador se llevó a cabo un día antes del transplante. El procedimiento se llevó a cabo bajo anestesia general (una combinación de cetamina parenteral e isolflurano mediante inhalación) a través de una incisión abdominal de linea media. Los ligamentos esplenorrenales y esplenocólicos fueron divididos para que el bazo, junto con la cola del páncreas fuera movilizado. La cabeza del páncreas y la segunda porción del duodeno fueron movilizadas siguiendo la maniobra de Kocher. Luego de la administración de heparina (200U/kg) , la aorta fue canulada justo arriba de su bifurcación y el animal fue desangrado. Se colocó inmediatamente una gasa fría en el saco menor y detrás del cuerpo del páncreas. El cuerpo y cuello del páncreas fueron cuidadosamente extirpados mediante disección filosa teniendo cuidado de no violar la cápsula pancreática. El ducto biliar común, los ductos pancreáticos principal y accesorio fueron identificados y ligados, y la cabeza del páncreas fue diseccionada de la segunda porción del duodeno. El aislamiento de células de isletas de mono rhesus se completó mediante modificaciones menores del método matizado para el aislamiento de células de isletas humanas (Ricordi, (1988) Diabetes, 37: 413; Ranuncoli, (2000) Cell Transplant 9:409) mediante el uso de Libérasa (Roche/Boehringer annheim, Indpls, IN) a una concentración 106 de 0.47-0.71 itig/ml . Una gradiente Euroficoll discontinua de tres capas (densidades 1.108, 1.097, 1.037; Meditec , Herndon, VA) y un procesador de células hemáticas Cobe 2991 (Grambro, Lakewood, CO) fueron usadas para la purificación de células de isletas de la digestión pancreática. Muestras de la preparación de células de isletas finales fueron teñidas con ditizona (Sigma, St. Louis, MO) , y la preparación fue evaluada al contar el número de células de isletas en cada una de las siguientes escalas de tamaño: 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350 y 350-400 um. Los datos se convirtieron matemáticamente para determinar el número de células de isletas con un diámetro promedio de 150um y se expresaron como equivalentes de isletas (IEQ) (Ricordi C. et al., Acta Diabetol at 27:185-195, 1990).

Pancreatectomia de receptor y transplante intrahepático de células de isletas. La pancreatectomia total, sin duodenectomía o esplenectomia, se llevó a cabo por lo menos una semana antes del transplante. La cola y cuerpo del páncreas fueron diseccionados a lo largo de la arteria y vena esplénicas, las cuales fueron cuidadosamente conservadas al ligar y dividir solamente las ramas pancreáticas. Las venas cólicas mesentérica y media inferiores fueron identificadas y conservadas durante la disección del cuerpo del páncreas. Las venas mesentéricas portal y superior 107 fueron reconocidas y las venas pancreáticas fueron ligadas y divididas . El duodeno fue movilizado y las ramas de los vasos pancreaticoduodenales que entran en el páncreas fueron ligadas y divididas, dejando las ramas duodenales intactas. El ducto biliar común fue identificado y conservado durante la disección roma entre la cabeza del páncreas y el asa en forma de c del duodeno. Los ductos pancreáticos principal y accesorio fueron ligados, divididos y el páncreas fue removido de la cavidad abdominal. Todos los animales fueron sometidos a pruebas de tolerancia a la glucosa intravenosa para evaluar la eficacia del procedimiento de pancreatectomia. Todos fueron documentados como péptido c negativos antes del transplante de células de isletas. Isletas cultivadas durante la noche fueron lavadas en medio de transplante, que consistía en medio RPMI 1640 (Mediatech) complementado con 2.5% de albúmina de suero humano, y contadas para determinar el número de IEQ. Las células de isletas fueron después peletizadas y resuspendxdas en 20 mi de medio de transplante complementado con 200 unidades de heparina. El transplante intrahepático de células de isletas se llevó a cabo mediante drenaje por gravedad de las isletas en un sigmoide o rama de la vena cólica izquierda que drena dentro de la vena portal a través de un catéter intravenoso calibre 22. 108 Monitoreo de glucosa en sangre, administración de insulina y definición del rechazo. Los niveles de glucosa en sangre en ayunas y post-prandiales fueron monitoreados dos veces al día (antes del desayuno y después del almuerzo) mediante punción de la oreja, seguidos por pruebas de sangre con un glucómetro (Bayer, Elkhart, IN) . Se administró insulina (NPH, Ultralente; Eli Lilly, Indianápolis, IN) tres veces al dia en un intento por mantener la glucosa en sangre en ayunas <300 mg/dl en animales pancreatectomizados pretransplante o en aquellos que habían rechazado sus aloinj ertos .

Grupos experimentales y protocolos inmunosupresores . Dos protocolos de tratamiento fueron probados: 1) protocolo de Edmonton - usando Tacrolimús, Sirolimús y anticuerpo monoclonal anti-IL-2R (Shapiro, A. M. J. et al., (2000), N. Eng. J. Med., 343: 230-238) y 2) L104EA29Y-protocolo de Edmonton -usando L104EA29YIg, Sirolimús y anticuerpo monoclonal anti-IL-2R. El grupo de control incluía receptores tratados con "régimen inmunosupresor de base" que tenían rapamicina y anti-IL-2R solo. Se dio tacrolimús 0.05 mg/kg bid POD 0-14 (niveles objetivo 5-8) y 0.06 mg/kg diariamente (niveles objetivo 3-5) POD 15-120. L104EA29YIg se administró intravenosamente intra-operativamente (10 mg/kg) y en los días postoperatorios 109 4 (15mg/kg), 14, 28, 42, 56, 70, 84, 98, 112, 126 (20 mg/kg) para mantener los niveles en suero en más de 30 pg/ml . El anticuerpo monoclonal IL-2R antihumano quimérico (0.3 mg/kg iv) se administró intraoperativamente y en POD 4. Se administró sirolimús (Rapamune®) oralmente 1.25 mg/kg bid (niveles objetivo 10-15) POD 0-50, lmg/kg (niveles objetivo 7-10) POD 50-100, y luego se fue reduciendo gradualmente para terminar la dosis por POD130. Sirolimú (Rapamune®) y Tacrolimús (Prograf®) se compraron de la Emory University Hospital Pharmacy. El anticuerpo monoclonal IL-2R antihumano quimérico (Simulect®) fue proporcionado por Novartis P arma AG (Basel, Suiza) .

Necropsia. Todos los receptores fueron sometidos a una necropsia completa llevada a cabo por el equipo veterinario de Yerkes en el momento de su muerte.

Detección de anticuerpos anti-donador . La presencia de aloanticuerpos específicos de donador detectables se determinó usando citometría de flujo. Los leucocitos de sangre periférica sirvieron como las células objetivo para el análisis pre-transplante . Leucocitos aislados de nodulos linfáticos mesentéricos obtenidos en el. momento del transplante fueron las células objetivo para los ensayos post-transplante. 110 Estadísticas. La supervivencia de los injertos de isletas entre grupos experimentales se comparó usando la prueba de Mann-Whitney-Wilcoxon (Armitage et al., (1987) Statistical methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publication, Oxford) .

Ensayo de inmunopuntos ligado a enzimas de anticuerpos anti-donador. Las respuestas se midieron mediante inmunopuntos ligados a enzimas de interferón-? (IFN-?) (ELlSpot) usando leucocitos de sangre periférica obtenidos de los animales receptores y donadores. Un número igual de estimuladores irradiados (leucocitos donadores) y respondedores (leucocitos receptores) fueron añadidos a placas con fondo de éster de celulosa (Millipore, Bed'ford, MA) recubiertas con el anticuerpo de captura, IFN-? antihumana de ratón (clon GZ-4; Mabtech,. Suecia) . Luego de 14-16 horas de incubación, IFN-? anti-humana de ratón biotinilada (clon 7-B6-1; Mabtech, Suecia) fue añadida, el anticuerpo no ligado fue removido y se añadió peroxidasa de rábano-Avidina D (Vector, Burlingame, CA) . Los puntos fueron desarrollados con el substrato 3-amino-9-etil-carbazol (Sigma) . Cada punto representa una célula secretora de IFN— ?; la . frecuencia de estas células se puede determinar al dividir el número de puntos generados entre el número total de células respondedoras colocadas en la placa. 111 Resultados : La terapia a base del bloqueo de la vía CD28 prolonga la supervivencia de los aloinjertos de células de isletas en macacos Rhesus. Se indujo diabetes mediante la pancreatectomia quirúrgica de animales receptores y se confirmó mediante prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa pretransplante . Pares donador-receptor fueron definidos con base en tipificación molecular usando un panel de alelos de histocompatibilidad mayor definidos anteriormente (8 clase I y 12 clase II) (Lobashevsky A, et al., Tissue Antigens 54:254-263, (1999); Knapp LA, et al., Tissue Antigens 50:657-661, (1997); Watkins D . I., Crit Rev Immunol 15:1-29, (1995)). Los pares maximizaron la disparidad tanto en locus clase I como clase II. El rechazo se definió como dos valores de glucosa en sangre en ayunas consecutivos >125 mg/dl los dias subsecuentes. La infusión intraportal de isletas alogénicas (>10,000 IEQ/Kg) dio como resultado la restauración inicial de euglucemia y la independencia a insulina en monos diabéticos en ambos grupos. El tratamiento de macacos pancreatectomizados con el régimen de L104EA29YIg/Rapamicina/mAb anti-IL-2R prolongó significativamente la supervivencia de aloinjertos de isletas (204, 190, 216>220 y 56 dias, respectivamente) . Los animales que recibían el régimen de L104EA29YIg/Rapamicina/anti-IL-2R dieron como resultado un control de glucosa adecuado como lo 112 indican los niveles de glucosa en plasma' en ayunas (figura 5 y 16B) . Además, estos animales no requirieron de terapia de reemplazo de insulina durante un periodo de tiempo significativamente prolongado (figura 6) . En contraste, aquellos animales que recibían el régimen de base solo (Rapamicina/mftb anti-IL-2R) rechazaron las isletas transplantadas a la semana (figura 16-C) . Los animales de control mostraron niveles marcadamente elevados de glucosa en plasma en ayunas (figura 5) . Además, los animales de control requirieron de terapia de reemplazo de insulina a la semana del transplante de células de isletas (figura 6) . Cuatro de cinco animales que recibían el régimen de L104EA29YIg disfrutaron de una supervivencia libre de rechazo durante la duración del periodo del tratamiento (tabla III) . La prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa con la medición de los niveles de insulina y glucosa confirmó el post-transplante de función de isletas (animal representativo, figuras 7 y 16D) . 113 Tabla III Supervivencia y tratamiento de aloinjerto de células de isletas Dependencia a insulina. ND, ninguno detectado en alelos que fueron tipificados. Cien días después del transplante, la dosis de rapamicina fue disminuida y graduada a cero en el día 121. Los animales continuaron siendo independientes de insulina mientras recibían la monoterapia de L104EA29YIg. Casi ciento cincuenta días después del transplante, los receptores de isletas restantes recibieron su dosis final de L104EA29YIg, cesando cualquier terapia inmunosupresora adicional. Como se esperaba, ~l-2 meses después de discontinuar la terapia, los receptores se hicieron 114 hiperglucémicos y requirieron de terapia con insulina exógena. El análisis histológico reveló un infiltrado mononuclear, sugiriendo fuertemente un rechazo como la etiología de la pérdida del control de glucosa (figura 17) . En la prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa, los animales de prueba que recibían L104EA29YIg/Rapamicina/mAb anti-IL-2R demostraron niveles de glucosa normales después del transplante de células de isletas (figuras 7 y 16D) . La frecuencia de células productoras de IFN-? anti-donador se detectó mediante el ensayo ELISpot y se analizó usando un sistema de imágenes Inmunospot. Los animales que recibían el régimen inmunosupresor de base solo demostraron números significativamente incrementados de células T productoras de ???? reactivas en donador (84+4.6 células), mientras que los animales que recibían el régimen de L104EA29YIg no tuvieron respuesta detectable (2±0.56).

La terapia con L104EA29YIg inhibe el cebado de respuestas de células T y B anti-donador . La frecuencia de células T alorreactivas cebadas se puede detectar efectivamente mediante el uso del ensayo ELISpot, el cual puede discriminar la producción de IFN-? al nivel de una sola célula. Muestras de sangre periférica de receptores de células de isletas fueron analizadas en varios puntos de tiempo tanto antes como después del transplante para 115 verificar su capacidad para generar IFN-? en respuesta al antigeno donador. Los animales tratados con el régimen de base solo desarrollaron rápidamente una respuesta antidonador medible que coincidió con la semana 1 de rechazo después del transplante. En contraste, la frecuencia de células productoras de IF -? anti-donador en animales que • recibían el régimen que contenía Ll04EA29YIg no fue detectable hasta que la terapia fue retirada (animales representativos, figura 18? y B) . De esta manera, el régimen de Ll04EA29YIg bloqueó efectivamente la generación de respuestas de células T anti-donador medido por la capacidad para producir IFN-?. Se usó citómetría de flujo para examinar el desarrollo de respuestas de anticuerpos anti-donador. Un animal dentro del grupo de control generó una fuerte respuesta de Ab anti-donador, mientras que el otro falló en desarrollar una respuesta detectable, posiblemente debido a que fue eutanizado antes de que la respuesta a anticuerpos pudiera ser medida (figura 18C) . En contraste, cuatro a cinco animales fallaron en generar una respuesta de anticuerpos mientras recibían la terapia con L104EA29YIg. Esto es consistente con los resultados previamente reportados usando CTLA4-Ig en un modelo de transplante de isletas (Levisetti, M. G. et al., J, Immunol 159 : 5187-5191, 1997) así como en la experiencia de los inventores en un modelo de 116 aloinjerto renal en el que los receptores fallaron en generar anticuerpos anti-donador (Pearson T, et al,, (Abstract) . En Programs and Abstracts of the 17th American Society de Transplant Physicians Annual Meeting, Chicago, 10-14 de mayo de 1997. Chicago, American Society of Transplant Physicians). Un animal de cinco receptores sufrió un episodio de rechazo mientras recibía la terapia con L104EA29YIg y posteriormente desarrolló una respuesta de anticuerpos anti-donador. Como se esperaba, los cuatro animales restantes que recibían el régimen de L104EA29YIg desarrollaron en forma consistente respuestas de anticuerpos anti-donador alrededor del momento de la inyección (~200 días después del transplante, 50 días después de la dosis final de Ll04EA2.9YIg) . El transplante de células de isletas se está volviendo rápidamente una opción de tratamiento viable para pacientes con diabetes tipo I leve. Recientes reportes que describen' regímenes inmunosupresores libres de esferoides, los cuales dan como resultado una independencia de insulina exitosa después del transplante de células de isletas, han ocasionado un optimismo renovado para la aplicación práctica del transplante de células de isletas. Mientras que la eliminación de glucocorticoides de regímenes inmunosupresores representa un gran avance en el esfuerzo por tratar diabetes tipo 1, la confianza en la terapia con inhibidores de calcineurina para una inmunosupresión primaria podría limitar 117 la aplicación de este enfoque. Los inhibidores de calcineurina tienen numerosos efectos secundarios desagradables, incluyendo nefrotoxicidad, diabetes, hipertensión, metabolismo de lipidos deteriorado e hirsutismo (Kahan B. D. et al., N Engl J Med 321:1725-1738, 1989; Group TUSMFLS: A comparison of tacrolimus (FK 506) and ciclosporine for immunosuppression in liver transplantation: the Ü. S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N Engl J Med 331:1110-1115, 1994; de Mattos AM et al., Mi J Kidney Disease 35:333-346, 2000) . Incluso cuando los niveles de fármaco se mantienen bajos, efectos secundarios significativos podrían desarrollarse. Esto es particularmente cierto en la población de pacientes diabéticos en donde la función renal podría estar ya deteriorada. De hecho, en- los reportes más recientes de Edmonton, dos pacientes con niveles de creatinina pretransplante levemente elevados tuvieron disminuciones significativas en la función renal mientras estaban bajo terapia con inhibidores de calcineurina y finalmente requirieron del retiro de este fármaco (Ryan E. A., et al., Diabetes 50:710-719, 2001). En el mismo reporte, dos tercios de los receptores desarrollaron cierto grado de intolerancia a la glucosa, con un cuarto desarrollando diabetes post-transplante franca que se pensó estaba relacionada con el uso de tacrolimus . Esto acentúa la naturaleza atractiva y esencial de un régimen inmunosupresor 118 libre de inhibidores de calcineurina, particularmente para el transplante de células de isletas. El bloqueo de las vías coestimuladoras de células T es una estrategia promisoria, para el desarrollo de regímenes potencialmente tolerogénicos e inmunosupresores no tóxicos. Este enfoque dirige las células T que reciben la "señal 1" durante el período de administración de fármaco. Por e emplo, se cree que el tratamiento durante el periodo peritransplante hace a las células T aloespecíficas impotentes después de encontrarse con el nuevo órgano o tejido, mientras que otras células T se dejan sin afectar (Li, Y, et al., Nat Med 5:1298-1302, 1999). El bloqueo de la vía CD28/B7 ha demostrado una promesa notable en donde los experimentales de autoinmunidad y transplante, haciéndolo un objetivo inmunosupresor particularmente atractivo en el transplante de células de isletas, en donde presumiblemente existen obstáculos tanto auto- como alo-inmunes. El potencial del bloqueo de CD28 en un modelo de transplante de animal grande se describió por Levisetti MG, et al., (J. Immunol 159:5187-5191, 1997). Se encontró que el tratamiento con CTLA4-Ig prolongaba de manera significativa, aunque modesta, la supervivencia de aloinjertos de isletas en primates no humanos (Levissetti MG, et al.r J Immunol 159:5187-5191, 1997). La monoterapia con CTLA4-Ig hace muy poco por prolongar la. supervivencia de aloinjertos renales 119 (Pearson T. et al., (Abstract) . En Programs and Abstracts of the 17th American Society of Transplant Physians Annual Meeting, Chicago, 10-14 May 1991. Chicago, American Society of Transplant Physicians) . Recientemente han habido varios reportes de superviviencia a largo plazo de aloinjertos de isletas en modelos de primates no humanos. La terapia con anticuerpo monoclonal anti-CD40L ha mostrado los resultados más impresionantes hasta el momento;- sin embargo, de manera similar a experimentos usando un modelo de transplante renal, no se logró tolerancia, ya que el retiro de la terapia eventualmente dio como resultado el rechazo (Kenyon, N. S. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:8132-8137 (1999); Kirk, A. D., et al., Nat. Med. 5, 686-693 (1999). En otro alentador reporte, Thomas et al. [Diabetes 50:1227-1236, (2001)) describieron recientemente que el uso de una inmunotoxina anti-CD3 y el . agente inmunomodulador DSG (15-desoxiespergualina) prolongaba dramáticamente la supervivencia de células de isletas en primates diabéticos inducidos por estreptozotocina . Aunque promisorios, estos reportes usaron agentes terapéuticos cuyo potencial clínico aún es incierto actualmente. Los datos in vivo usando L104EA29YIg, una forma mutante de CTLA4-Ig, en el modelo de aloinjerto de células de isletas de Rhesus son consistentes con evidencia in vitro que indica que esta molécula de segunda generación es un 120 inhibidor más potente de las respuestas de células T que la molécula de origen. Dado que CTLA4-Ig ya ha mostrado eficacia en una prueba clínica de pacientes con psoriasis (Abrams, J. R. et al., J. Clin. Invest. 103:1243-1252 (1999) ) , existe un entusiasmo significativo para las pruebas usando L104EA29YIg como el inmunosupresor primario. Es claramente compatible, si no sinergístico, con agentes inmunosupresores clínicamente aprobados (anticuerpo monoclonal anti-IL-2R y rapamicina) facilitando el diseño de pruebas clínicas. Pruebas humanas iniciales con L104EA29YIg ya se están llevando a cabo en pacientes afligidos con artritis reumatoide y aquellos que son sometidos a transplante renal . Aunque una comparación directa de un protocolo a base de tacrolimús y el régimen de L104EA29YIg no se ha intentado debido a toxicidades intolerables reportadas en primates no humanos (Montgomery, S.P., et al., Am J. Transplant 1 (Suppl. 1):438, 2001), los resultados de los presentes inventores sugieren que L104EA29YIg tiene el potencial de ser por lo menos tan efectivo como el tacrolimús como un inmunosupresor primario .

Conclusiones : Se describe un nuevo régimen inmunosupresor libre de esteroides/inhibidores de calcineurina que proporciona protección significativa del rechazo y prolonga la 121 supervivencia de aloinjertos de células de isletas en primates no humanos. El agente biológico L104EA29YIg es un potente inmunosupresor . L104EA29YIg puede reemplazar Tacrolimús en el protocolo de Edmonton, eliminando de esta manera los efectos secundarios desagradables del inhibidor de calcineurina. Como será evidente para aquellos expertos en la técnica a la cual la invención pertenece, la presente invención puede ser incorporada en formas que no sean aquellas específicamente descritas arriba sin alejarse del espíritu o características esenciales de la invención. Las modalidades particulares de la invención descritas arriba son, por lo tanto, consideradas como ilustrativas y no restrictivas. El alcance de la presente invención es como el descrito en las reivindicaciones anexas en lugar de ser limitado a los ejemplos contenidos en la descripción anterior . Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

122 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para inhibir el rechazo de transplantes de células de isletas en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una molécula mutante CTLA4 soluble, en donde el sujeto es transplantado con células de isletas antes o después de la administración de la molécula mutante CTLA4 soluble .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula mutante CTLA4 soluble es: a) L104EA29YIg como la mostrada en la figura 3 iniciando con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y concluyendo con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 6, iniciando con Ala en la posición 26 y concluyendo con Lys en la posición 383, o iniciando con Met en la posición 27 y concluyendo con Lys en la posición 383) ; b) L104EIg como la mostrada en la figura 19 iniciando con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y concluyendo con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 8, iniciando con Ala en la posición 26 y concluyendo con Lys en 123 la posición 383, o iniciando con Met en la posición 27 y concluyendo con Lys en la posición 383) ; c) L104EA29LIg como la mostrada en la figura 20 iniciando con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y concluyendo con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 10, iniciando con Ala en la posición 26 y concluyendo con Lys en la posición 383, o iniciando con Met en la posición 27 y concluyendo con Lys en la posición 383) ; d) L104EA29TIg como la mostrada en la figura 21 iniciando con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y concluyendo con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 12, iniciando con Ala en la posición 26 y concluyendo con Lys en la posición 383, o iniciando con Met en la posición 27 y concluyendo con Lys en la posición 383) o e) L104EA29WIg como la mostrada en la figura 22 iniciando con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y concluyendo con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 14, iniciando con Ala en la posición 26 y concluyendo con Lys en la posición 383, o iniciando con Met en la posición 27 y concluyendo con Lys en la posición 383) .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula mutante CTLA4 soluble se une a una molécula CD80 y/o CD86 sobre células CD80 y/o CD86-positivas .

4. Un método para tratar diabetes al inhibir el 124 rechazo de transplantes de células de isletas en un sujeto mediante el método de conformidad con la reivindicación 1.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de isletas son 5 encapsuladas antes de su administración al sujeto.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además administrar al sujeto una cantidad efectiva de por lo menos un agente inmunosupresor antes de, durante o después del transplante. 10

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el agente inmunosupresor está libre de esteroides.

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el agente inmunosupresor comprende' ¦15 Rapamicina y anticuerpo monoclonal IL-2R antihumano.

9. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el agente inmunosupresor es un corticosteroide, ciclosporina, tarcolimús, prednisona, azatioprina, inhibidor de TOR, metotrexato, bloqueador de 20 FNTa, antagonista de FNT, infliximab, un agente biológico que se dirige a una citocina inflamatoria, hidroxicloroquina, sulfasalazopirina, sales de oro, etanercept o anaquinra.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula imitante CTLA4 soluble es 25 L104EA29YIg como la mostrada en la figura 3 iniciando con Ala 125 en la posición -1 o Met en la posición +1 y concluyendo con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 6, iniciando con Ala en la posición 26 y concluyendo con Lys en la posición 383, o iniciando con Met en la posición 27 y concluyendo con Lys en la posición 383), la cual interfiere con las interacciones entre células T/células CD80 y/o CD86 positivas.

11. El método de conformidad con la reivindicación I, caracterizado porque la administración de la molécula mutante CTLA4 soluble se lleva a cabo localmente o sistémicamente.

12. El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque la administración es mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección subcutánea, bomba implantable, infusión continua, terapia génica, liposomas o administración oral.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el su eto es un humano, primate no humano, conejo, borrego, rata, perro, gato, cerdo o ratón.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el primate no humano es un mono.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además administrar células de médula ósea sin células T al sujeto.

16. Un método para inhibir el rechazo de transplantes de células de isletas en un sujeto, 126 caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una molécula mutante CTLA4 soluble y un anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo, en donde el sujeto es transplantado con células de isletas antes, durante o después de la administración de la molécula mutante CTLA4 soluble y el anticuerpo anti-CD40.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la molécula mutante CTLA4 soluble es : a) L104EA29YIg como la mostrada en la figura ¦ 3 iniciando con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y concluyendo con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 6, iniciando con Ala en la posición 26 y concluyendo con Lys en la posición 383, o iniciando con Met en la posición 27 y concluyendo con Lys en la posición 383); b) L104EIg como la mostrada en la figura 19 iniciando con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y concluyendo con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 8, iniciando con Ala en la posición 26 y concluyendo con Lys en la posición 383, o iniciando con Met en la posición 27 y concluyendo con Lys en la posición 383) ; c) L104EA29LIg como la mostrada en la figura 20 iniciando con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y concluyendo con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 10, iniciando con Ala en la posición 26 y concluyendo con Lys en 127 la posición 383, o iniciando con Met en la posición 27 y concluyendo con Lys en la posición 383) ; d) L104EA29TIg como la mostrada en la figura 21 iniciando con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y concluyendo con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 12, iniciando con Ala en la posición 26 y concluyendo con Lys en la posición 383, o iniciando con Met en la posición 27 y concluyendo con Lys en la posición 383) o e) L104EA29WIg como la mostrada en la figura 22 iniciando con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y concluyendo con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 14, iniciando con Ala en la posición 26 y concluyendo con Lys en la posición 383, o iniciando con Met en la posición 27 y concluyendo con Lys en la posición 383) .

18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la molécula mutante CTLA4 soluble es L104EA29YIg como la mostrada en la figura 3 iniciando con Ala en la posición -1 o Met en la posición +1 y concluyendo con Lys en la posición +357 (SEQ ID NO: 6, iniciando con Ala en la posición 26 y concluyendo con Lys en la posición 383, o iniciando con Met en la posición 27 y concluyendo con Lys en la posición 383), la cual interfiere con las interacciones entre células T/células CD80 y/o CD86 positivas.

19. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD40 o fragmento