PL204899B1

PL204899B1 - Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4

Info

Publication number: PL204899B1
Application number: PL364578A
Authority: PL
Inventors: Christian P. Larsen; Thomas C. Pearson; Andrew B. Adams
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2001-05-23
Filing date: 2002-05-23
Publication date: 2010-02-26
Also published as: NO20035176L; DK1397153T3; HUP0401590A2; EP1397153A2; CZ20033188A3; AU2002305716B2; JP2004535402A; US20080160022A1; NO332465B1; MXPA03010568A; US7829534B2; WO2002094202B1; CZ305380B6; ES2302811T3; CA2447921C; ATE390931T1; DE60225914T2; PL364578A1; PT1397153E; WO2002094202A2

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4. Niniejszy wynalazek odnosi się generalnie do dziedziny hamowania odrzucania przeszczepu komórek wysepki trzustki oraz 10 pozwala na wdrożenie metod leczenia cukrzycy, łącznie z cukrzycą typu 1 i cukrzycą typu 2, poprzez podawanie podmiotowi skutecznej ilości rozpuszczalnych, zmutowanych cząsteczek CTLA4.

Tło wynalazku

Przeszczep narządu wyłonił się jako korzystna metoda leczenia wielu postaci chorób zagrażających życiu, związanych ze zniszczeniem narządu. Poprawę wyników transplantacji klinicznych uzyskano przede wszystkim poprzez wykorzystywanie nieswoistych leków immunosupresyjnych o wciąż rosnącej sile, do hamowania odpowiedzi odrzucenia (Lancet, 345:1321-1325 (1995)). Choć nastąpiła poprawa wyników krótkotrwałych, efekty długoterminowe pozostają nieadekwatne. Aktualnie wymaga się aby środki immunosupresyjne stosowane przez całe życie zwalczały przewlekłe odrzucanie przeszczepu narządu, a stosowanie tych środków dramatycznie zwiększa ryzyko choroby naczyń serca, infekcji i nowotworów.

Rozwój strategii pobudzania przyjmowania się tkanek allogenicznych bez potrzeby przewlekłej immunosupresji może zredukować ryzyko tych zagrażających życiu powikłań i w znacznym stopniu rozszerza stosowanie przeszczepów narządowych, tkankowych i komórkowych w chorobach takich jak hemoglobinopatie, genetyczne niedobory odporności i choroby autoimmunologiczne.

Cukrzyca insulinozależna (IDDM) jest jednym z najczęściej występujących schorzeń metabolicznych na świecie. W Stanach Zjednoczonych, IDDM dotyka blisko jednego na 300 do 400 ludzi, a badania epidemiologiczne sugerują , ż e wystę powanie IDDM cią gle wzrasta. IDDM jest spowodowana przez autoimmunologiczną odpowiedź, której wynikiem jest zniszczenie komórek wysepek trzustkowych produkujących insulinę, w rezultacie działania limfocytów T.

Gdy objawy kliniczne IDDM staną się ewidentne, najczęściej wykorzystywaną terapią kontrolującą objawy kliniczne IDDM jest zastępcze podawanie egzogenicznej insuliny. Chociaż zastępcza terapia insulinowa pozwala większości pacjentów z IDDM prowadzić prawie normalne życie, nie przywraca ona pełnej homeostazy metabolicznej, w wyniku czego u cukrzyków poddanych zastępczej terapii insulinowej częste są poważne powikłania obejmujące dysfunkcję oka, serca i innych narządów.

Długo poszukiwaną terapią dla pacjentów z IDDM jest przeszczepienie wysepek. Jednak przeszczepione komórki wysepek produkujących insulinę są często szybko niszczone w wyniku tej samej odpowiedzi autoimmunologicznej, która wcześniej zniszczyła własne komórki wysepek. Z 260 alloprzeszczepów wykonanych od roku 1990 tylko 12,4% dało w efekcie niezależność insulinową przez okres ponad jednego tygodnia, a jedynie 8,25% dało niezależność insulinową przez ponad jeden rok (Linsley i inni, Diabetes (1997) 46: 1120-3). W większości tych procedur, podstawowym reżimem immunosupresji była indukcja przeciwciał za pomocą globuliny antylimfocytowej połączonej z cyklosporyną, azatioprinem i glikokortykoidami.

Dla każdego rodzaju procedury przeszczepu kluczowym czynnikim dla jej akceptacji klinicznej jest równowaga między skutecznością i toksycznością. W przypadku przeszczepu wysepek, dodatkową troskę stanowi wielka liczba aktualnych środków immunosupresyjnych, zwłaszcza glikokortykosteroidów lub inhibitorów kalcyneuryny, takich jak Tarcolimus, które niszczą komórki beta lub indukują obwodową oporność insulinową (Zeng i inni, Surgery (1993) 113:98-102).

Protokół immunosupresyjny bez steroidów („protokół Edmonton), który obejmuje sirolimus, niską dawkę Tarcolimus oraz przeciwciała monoklonalne (mAb) przeciwko receptorowi IL-2, został wykorzystany w pojedynczej próbie przeszczepu wysepek u pacjentów z cukrzycą typu 1 (Shapiro, A.M.J. i inni (2000), N.Eng.J.Med. 343:230-238).

Ostatni sukces „protokołu Edmonton przywrócił entuzjazm związany ze stosowaniem przeszczepu wysepek do leczenia cukrzycy. Jednak obawy dotyczące toksyczności Tarcolismus mogą ograniczać stosowanie tej terapii u ludzi. Środki biologiczne, które blokują kluczowe sygnały kostymulatorowe komórek T, w szczególności szlak CD28, są potencjalną alternatywą zabezpieczania allogenicznych wysepek. Przykłady środków, które blokują szlak CD28 obejmują bez ograniczenia rozpuszczalne CTLA4 łącznie ze zmutowanymi cząsteczkami CTLA4.

PL 204 899 B1

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 do wytwarzania leku do hamowania odrzucenia przeszczepu komórek wysepki, przy czym rozpuszczalna zmutowana cząsteczka CTLA zawiera zmutowaną pozakomórkową domenę CTLA4, posiadającą

a) sekwencję aminokwasową, która rozpoczyna się od metioniny w pozycji +1 i kończy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 3, lub która rozpoczyna się od alaniny w pozycji -1 i koń czy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 3.

b) sekwencję aminokwasową, która rozpoczyna się od metioniny w pozycji +1 i kończy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 19, lub która rozpoczyna się od alaniny w pozycji -1 i kończy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 19.

c) sekwencję aminokwasową, która rozpoczyna się od metioniny w pozycji +1 i kończy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 20, lub która rozpoczyna się od alaniny w pozycji -1 i kończy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 20.

d) sekwencję aminokwasową, która rozpoczyna się od metioniny w pozycji +1 i kończy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 21, lub która rozpoczyna się od alaniny w pozycji -1 i kończy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 21.

e) sekwencję aminokwasową, która rozpoczyna się od metioniny w pozycji +1 i kończy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 22, lub która rozpoczyna się od alaniny w pozycji -1 i koń czy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 22.

W korzystnym rozwiązaniu zastosowania według wynalazku przeszczep komórek wysepki jest do leczenia cukrzycy, a bardziej korzystnie do leczenia cukrzycy typu 1 lub 2.

W nastę pnym alternatywnym rozwiązaniu, przeszczep komórek wysepki zawiera otoczkowane komórki wysepki.

W korzystnej odmianie wynalazku hamowanie odrzucenia przeszczepu komórek wysepki obejmuje podawanie rozpuszczalnej cząsteczki mutanta CTLA4 przed, podczas lub po przeszczepie komórek wysepki.

Także korzystnie, domena pozakomórkowa jest połączona przez fuzję z cząsteczką nie-CTLA4. W bardziej korzystnym rozwiązaniu, cząsteczka nie-CTLA4 zawiera cząsteczkę immunogloguliny, a jeszcze bardziej korzystnie cząsteczka immunoglobuliny jest sta łym regionem immunoglobuliny lub jego częścią.

W zastosowaniu według wynalazku stały region immunoglobuliny lub jego cz ęść korzystnie zawiera jedną lub więcej mutacji dla zredukowania funkcji efektora.

Stały region immunoglobuliny zawiera region zawiasu CH2 lub CH3 cząsteczki immunoglobuliny. W następnym korzystnym rozwiązaniu stały region immunoglobuliny lub jego część jest regionem stałym immunoglobuliny ludzkiej lub małpiej.

Zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się ponadto tym, że rozpuszczalny mutant CTLA4 jest:

a) L104EA29YIg jaką ukazano w fig. 3, rozpoczynająca się Ala w pozycji -1 albo Met w pozycji +1 i kończąca się Lys w pozycji +357 (SEQ ID nr: 6, rozpoczynająca się Ala w pozycji 26 i kończąca się Lys w pozycji 383, albo rozpoczynająca się Met w pozycji 27 i kończąca się Lys w pozycj i 383),

b) L104EIg jaką ukazano w fig. 19, rozpoczynająca się Ala w pozycji -1 albo Met w pozycji +1 i kończąca się Lys w pozycji +357 (SEQ ID nr: 8, rozpoczynająca się Ala w pozycji 26 i ko ńczą ca się Lys w pozycji 383, albo rozpoczynająca się Met w pozycji 27 i kończąca się Lys w pozycj i 383),

c) L104EA29LIg jaką ukazano w fig. 20, rozpoczynająca się Ala w pozycji -1 albo Met w pozycji +1 i koń czą ca się Lys w pozycji +357 (SEQ ID nr: 10, rozpoczynają ca się Ala w pozycji 26 i koń czą ca się Lys w pozycji 383, albo rozpoczynająca się Met w pozycji 27 i kończąca się Lys w pozycj i 383),

d) L104EA29TIg jaką ukazano w fig. 21, rozpoczynająca się Ala w pozycji -1 albo Met w pozycji +1 i kończąca się Lys w pozycji +357 (SEQ ID nr: 12, rozpoczynająca się Ala w pozycji 26 i kończąca się Lys w pozycji 383, albo rozpoczynająca się Met w pozycji 27 i kończąca się Lys w pozycji 383), albo

e) L104EA29WIg jaką ukazano w fig. 22, rozpoczynająca się Ala w pozycji -1 albo Met w pozycji +1 i kończąca się Lys w pozycji +357 (SEQ ID nr:14, rozpoczynająca się Ala w pozycji 26 i kończąca się Lys w pozycji 383, albo rozpoczynająca się Met w pozycji 27 i kończąca się Lys w pozycji 383), przy czym korzystnie cząsteczka rozpuszczalnego mutanta CTLA4 jest stosowana w połączeniu z co

PL 204 899 B1 najmniej jednym dodatkowym związkiem, który jest wybrany z grupy złożonej z związków immunosupresyjnych, związków immunomodulatorowych i związków przeciwzapalnych.

Bardziej korzystnie, związek taki jest wybrany z grupy obejmującej anakinrę, adrenokortykosteroidy, azatioprinę, basiliksmab, inhibitory kalcyneuryny, chlorochinę, kortykosteroidy, cyclosporynę, prednison, cyklofosfamid, cytoksan, 15-deoksyspergalinę i jej analogi, D-penicylaminę, etanercept, octan glatrimeru, FTY720 i jego analogi, glukokortykoidy, sole złota, końską anty-ludzką globulinę tymocytów (ATGAM), humanizowana anty-TAC (HAT), hydroksychlorochina, infiksimab, interferon bata-1a, iterferon beta-1b, leflunomid, i jego analogi, immunoglobulina limfocytów, czynniki, naprowadzające limfocyty, metoksalen, metotreksan, chlorowodorek mitoksantronu, kwas mykofenolowy, mofetil mykofenolanowy, miziribinę, NSAIDE, króliczą anty-ludzką globulinę tymocytów, immunoglobuline Rho(D), sirolimus (rapamycyna) i jej pochodne (np., 40-0-(2-hydroksy)etylo-rapamycyna), sulfasalazopirynę, sulfasalazynę, takrolimus (FK-506) talidomid, blokery TNFa i czynniki biologiczne które nacelowują cytokiny zapalne, inhibitory TOR, związki które współdziałają z CD40 i 0D154, rozpuszczalny gp39, rozpuszczalny 0D29, rozpuszczalny CD40, rozpuszczalny CD80 (np., ATCC 68627), rozpuszczalny CD86, rozpuszczalny CD28, rozpuszczalny CD56, rozpuszczalny Thy-I, rozpuszczalny CD3, rozpuszczalny TCR, rozpuszczalny VLA-4, rozpuszczalny VCAM-1, rozpuszczalny LECAM-1, rozpuszczalny ELAM-1, rozpuszczalny CD44, przeciwciała reaktywne względem gp39, (np., ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 i ATCC HB-12056), przeciwciała reaktywne względem CD40 (np., ATCC HB-9110), przeciwciała reaktywne względem B7 (ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341), przeciwciała reaktywne względem CD28 (np., ATCC HB-11944 lub mAb 9,3) przeciwciała reaktywne względem LFA-1 (np., ATCC HB-9579 i ATCC TIB-213, przeciwciała reaktywne względem LFA-2, przeciwciała reaktywne względem IL-2, przeciwciała reaktywne względem IL-12, przeciwciała reaktywne względem IFN-gamma, przeciwciała reaktywne względem CD2, przeciwciała reaktywne względem CD48, przeciwciała reaktywne względem ICAM (np., ICAM-1 (ATCC CRL-2252, ICAM-2 i ICAM-3) przeciwciała reaktywne względem CTLA4 (np., ATCC HB-304, przeciwciała reaktywne względem Thy-1, przeciwciała reaktywne względem CD56, przeciwciała reaktywne względem CD3, przeciwciała reaktywne względem CD29, przeciwciała reaktywne względem TCR przeciwciała reaktywne względem VLA-4, przeciwciała reaktywne względem VCAM-1, przeciwciała reaktywne względem LECAM-1, przeciwciała reaktywne względem ELAM-1, przeciwciała reaktywne względem CD44, monoklonalne przeciwciała do receptorów leukocytów, np., MHC, CD2, CD3, CD4, CDtla/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD137, ICOS, CD150, (SLAM), OX40, 4-1BB lub ich ligandy, CTLA4/CD28-1g, antagoniści LFA-1, antagoniści selektyny i antagoniści VLA-4 i anty-ludzkie IL-2RmAbs.

Cząsteczka rozpuszczalnego mutanta CTLA4 i dodatkowy związek są podawane jednocześnie, ewentualnie cząsteczka rozpuszczalnego mutanta CTLA4 i dodatkowy związek są podawane razem lub kolejno.

W zastosowaniu według wynalazku hamowanie odrzucania przeszczepu komórki korzystnie obejmuje dodatkowy tryb immunosupresyjny, który bardziej korzystnie jest wolny od glukokortykoidów, lub też może obejmować kortykosteroidy.

Powyżej wspomniany dodatkowy tryb imunosupresyjny według wynalazku jest wolny od inhibitora kalcyneuryny. Może też obejmować jeden lub więcej związków jak zdefiniowano powyżej.

W kolejnym korzystnym rozwiązaniu dodatkowy tryb immunosupresyjny obejmuje inhibitor TOR i/lub czynnik biologiczny, który ukierunkowany jest na IL-2, przy czym bardziej korzystnie, inhibitorem TOR jest rapamycyna (sirolimus) lub jej pochodne.

Wspomniany czynnik biologiczny, ukierunkowany jest na IL-2 może być korzystnie przeciwciałem reaktywnym względem IL-2 lub anty-ludzkim IL-2R mAb, a w bardziej korzystnej odmianie antyludzką IL-2R jest basiliksimab.

Zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się ponadto tym, że dodatkowy tryb immunosupresyjny obejmuje kwas mykofenolowy lub mofetil mykofenolanowy.

Ponadto w kolejnym korzystnym rozwiązaniu dodatkowy tryb immunosupresyjny obejmuje związek, który ingeruje w wiązanie CD40 do CD154, bardziej korzystnie związkiem, który ingeruje w wią zanie CD40 do CD154 jest przeciwciał o anty-CD40, lub ewentualnie jest to przeciwciał o anty-154.

W zastosowaniu wedł ug wynalazku hamowanie odrzucenia przeszczepu komórek wysepki obejmuje podanie komórek szpiku kostnego zubożonych w komórki T, przy czym zgodnie z wynalazkiem to podawanie komórek szpiku kostnego zubożonych w komórki T, odbywa się w przybliżeniu

PL 204 899 B1 w tym samym czasie co umieszczanie przeszczepu komórek wysepki, lub też ewentualnie poprzedza umieszczanie przeszczepu komórek wysepki. Podawanie komórek szpiku kostnego zubożonych w komórki T, korzystnie obejmuje pierwszą dawkę i drugą dawkę.

Niniejszy wynalazek pozwala na wdrożenie metod leczenia chorób układu odpornościowego przez podawanie osobnikowi leczonemu rozpuszczalnych, zmutowanych cząsteczek CTLA4, które wiążą cząsteczki CD80 i/lub CD86 na komórkach pozytywnych pod względem CD80 i/lub CD86, hamując przez to wiązanie endogenicznych cząsteczek CD80 i/lub CD86 z CTLA4 i/lub CD28 na komórkach T, a więc blokując kluczowe sygnały kostymulatorowe komórek T, szczególnie szlaku CD28.

Krótki opis rycin

Fig. 1 opisuje pełne sekwencje nukleotydowe (SEQ ID nr: 1) oraz aminokwasowe (SEQ ID nr:2) dla ludzkiego receptora CTLA4 połączonego przez fuzję z peptydem sygnałowym onkostatyny M. Peptyd sygnałowy onkostatyny M jest zaznaczony w pozycji -25 do -1.

Fig. 2 opisuje sekwencję nukleotydową (SEQ ID nr:3) i aminokwasową (SEQ ID nr:4) CTLA4Ig mającej peptyd sygnałowy; dzikiego typu sekwencję aminokwasową domeny zewnątrzkomórkowe CTLA4 zaczynając od metioniny w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, albo zaczynają od alaniny w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124; oraz region Ig.

Fig. 3 opisuje sekwencję nukleotydową (SEQ ID nr:5) i aminokwasową (SEQ ID nr:6) zmutowanej cząsteczki CTLA4 (L104EA29YIg) obejmującą peptyd sygnałowy; zmutowaną domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 zaczynając od metioniny w pozycji +1 i kończąc na kwasie asparaginowym w pozycji +124, albo zaczynając od alaniny w pozycji -1 i kończąc na kwasie asparaginowym w pozycji +124; oraz region Ig jak opisano w przykładzie 1, poniżej.

Fig. 4 jest wykresem liniowym ilustrującym poziom glukozy w osoczu na czczo, u normalnego podmiotu, jak opisano w przykładzie 3, poniżej.

Fig. 5 jest wykresem liniowym ilustrującym poziom glukozy w osoczu na czczo, u podmiotu z usunię t ą trzustką , któremu przeszczepiono komórki wysepek trzustki, jak opisano w przykł adzie 3. Zwierzęta z komórkami wysepek w dniu 0, oraz albo traktowane reżimem immunosupresyjnym obejmującym L104EA29YIg oraz podstawowym reżimem immunosupresyjnym (traktowane), albo tylko podstawowym reżimem immunosupresyjnym (kontrola). Podstawowy reżim immunosupresyjny obejmował rapamycynę i przeciwciała przeciwko ludzkim IL2R.

Fig. 6 jest wykresem liniowym ilustrującym wymagania insulinowe u podmiotów z przeszczepionymi komórkami wysepek, jak opisano w przykładzie 3. Zwierzętom przeszczepiono komórki wysepek w dniu 0, i był y traktowane reż imem immunosupresyjnym obejmują cym L104EA29YIg oraz podstawowym reżimem immunosupresyjnym (traktowane), albo jedynie podstawowym reżimem immunosupresyjnym (kontrola).

Fig. 7 jest wykresem liniowym ilustrującym poziom glukozy we krwi w dożylnym teście tolerancji glukozowej przed i po przeszczepie wysepek, jak opisano w przykładzie 3.

Fig. 8 opisuje schematyczny diagram wektora piLN-L104EA29Y, mającego insert L104EA29YIg.

Fig. 9A i 9B ilustrują dane z testów FACS ukazujących wiązanie L104EA29YIg, L104EIg oraz CTLA4Ig z komórkami CHO transfekowanymi ludzkimi CD80 lub CD86, jak opisano w przykładzie 2, poniżej.

Fig. 10A i 10B opisują inhibicję proliferacji komórek CHO pozytywnych pod względem CD80 i CD86, jak opisano w przykł adzie 2, poniż ej.

Fig. 11A i 11B ukazują, że L104EA29YIg jest skuteczniejsza niż CTLA4Ig jeśli chodzi o inhibicję proliferacji pierwotnie i wtórnie allostymulowanych komórek T, jak opisano w przykładzie 2, poniżej.

Fig. 12A-C ilustrują, że L104EA29YIg jest skuteczniejsza niż CTLA4Ig jeśli chodzi o inhibicję produkcji cytokin IL-2 (fig. 12A), IL-4 (fig. 12B) oraz γ-interferonu (fig. 12C) allostymulowanych, ludzkich komórek T, jak opisano w przykładzie 2, poniżej.

Fig. 13 pokazuje, że L104EA29YIg jest skuteczniejsza niż CTLA4Ig jeśli chodzi o inhibicję proliferacji małpich komórek T stymulowanych fitohemaglutyniną (PHA), jak opisano w przykładzie 2, poniżej.

Fig. 14A-C obrazują żel SDS (fig. 14A) dla CTLA4Ig (tor 1), L104EIg (tor 2) i L104EA29YIg (tor 3A); oraz chromatogramy żelowe CTLA4Ig (fig. 14B) oraz L104EA29YIg (fig. 14C).

PL 204 899 B1

Fig. 15A i 15B ilustrują diagram prążkowy zewnątrzkomórkowego składania podobnego do V Ig CTLA4, wytworzonego ze struktury roztworu określonej przez spektroskopię NMR. Fig. 15B ukazuje powiększony widok regionu S25-R33 i regionu MYPPPY pokazując położenie i orientację łańcucha bocznego mutacji wzmacniających zachłanność, L104 i A29.

Fig. 16 opisuje poziom glukozy we krwi na czczo dla biorców traktowanych LEA29YIg (A) oraz dla biorców kontrolnych (B) allogenicznych wysepek (zwierzęta reprezentatywne) przed i po przeszczepie. Wszystkie zwierzęta przeszły operacyjne usunięcie trzustki, co najmniej 2 tygodnie przed przeszczepem (średnia zapotrzebowania insulinowego przed przeszczepem wynosząca 8,76±0,18 jednostek/dzień). (C) Po wlewie do żyły wrotnej allogenicznych wysepek, biorcy szybko stali się euglikemiczni, nie wymagając egzogenicznej insuliny po przeszczepie. (D) Indukcję cukrzycy oraz poprzeszczepową funkcję wysepek potwierdzono przez dożylny test tolerancji glukozy przed przeszczepem i 1 miesiąc oraz 3 miesiące po przeszczepie, jak opisano w przykładzie 3, poniżej.

Fig. 17 opisuje (A) immunohistologię funkcjonalnych, przeszczepionych wysepek, potwierdzoną przez pozytywne wybarwienie dla insuliny. (B) wysepka od zwierzęcia otrzymującego reżim kontrolny otoczona przez naciek komórek jednojądrzastych, wskazujący na odrzucenie, jak opisano w przykładzie 3, poniżej.

Fig. 18 opisuje supresję odpowiedzi komórek T i B przeciwko dawcy, za pomocą reżimu L104EA29Y. (A) Odpowiedź przeciwko dawcy IFN-y-ELISpot odpowiada czasowi odrzucenia u kontroli (~1 tydzień po przeszczepie). (B) Reżim L104EA29Y skutecznie hamuje generowanie odpowiedzi komórek T przeciwko dawcy. (C) Zwierzęta otrzymujące rapamycynę i mAb przeciwko IL-2R szybko wytworzyły wykrywalne przeciwciała przeciwko dawcy, jak zmierzono za pomocą metod cytometrii przepływowej, w czasie odrzutu. (D) Biorcy wysepek otrzymujący reżim obejmujący L104EA29Y nie zdołali wygenerować wykrywalnej odpowiedzi przeciwciał przeciwko dawcy podczas traktowania, jak opisano w przykładzie 3, poniżej.

Fig. 19 ukazuje sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe L104EIg (SEQ ID nr:7-8), jak opisano w przykładzie 2, poniżej.

Fig. 20 ukazuje sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe L104EA29LIg (SEQ ID nr:9-10).

Fig. 21 ukazuje sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe L104EA29TIg (SEQ ID nr:11-12).

Fig. 22 ukazuje sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe L104EA29WIg (SEQ ID nr:13-14).

Fig. 23 ukazuje sekwencję nukleotydową CTLA4Ig (SEQ ID nr:15) mającą peptyd sygnałowy; dzikiego typu sekwencję aminokwasową domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4 zaczynając od metioniny w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji + 124, albo zaczynając od alaniny w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124; oraz region Ig.

Fig. 24 ukazuje sekwencję nukleotydową CTLA4Ig (SEQ ID nr:16) mającą peptyd sygnałowy; dzikiego typu sekwencję aminokwasową domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4 zaczynając od metioniny w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, albo zaczynając od alaniny w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124; oraz region Ig.

Szczegółowy opis wynalazku

Definicje

Wszystkie określenia naukowe i techniczne stosowane w tym zgłoszeniu mają znaczenia powszechnie stosowane w technice, chyba, że zaznaczono inaczej. Jak stosuje się w tym zgłoszeniu, następujące słowa lub wyrażenia mają wymienione znaczenia.

„Dzikiego typu CTLA4 posiada sekwencję aminokwasową naturalnie występującej, pełnej długości CTLA4 (opisy patentowe U.S. nr. 5,434,131, 5,844,095, 5,851,795), lub jakąkolwiek jej domenę zewnątrzkomórkową, która wiąże cząsteczkę B7 (CD80 i/lub CD86), lub zakłóca wiązanie z B7 (np. CD80 i/lub CD86) tak, ż e blokuje wią zanie z ich ligandami albo blokuje wią zanie z domenami zewnątrzkomórkowymi CTLA4 lub jej częściami. W szczególnych postaciach, dzikiego typu CTLA4 rozpoczyna się metionina w pozycji +1 i kończy przy kwasie asparaginowym w pozycji +124 lub dzikiego typu CTLA4 rozpoczyna się alaniną w pozycji -1 i kończy przy kwasie asparaginowym w pozycji +124. W innych postaciach, dzikiego typu CTLA44 obejmuje 187 aminokwasów receptora CTLA4, jak opisano w fig. 3 opisu patentowego nr US 5 434 131, 5 844 095, 5 851 795 oraz ukazanego tutaj jako fig. 1. CTLA4 dzikiego typu jest białkiem powierzchniowokomórkowym, mającym N-terminalną domenę zewnątrzkomórkową, domenę transbłonową i C-terminalną domenę cytoplazmatyczną. Domena zewnątrzkomórkowa wiąże się z docelowymi antygenami, takimi jak CD80 i CD86. W komórce, naturalnie występujące białko CTLA4 dzikiego typu ulega

PL 204 899 B1 translacji jako niedojrzały polipeptyd, który obejmuje peptyd sygnałowy na końcu N. Niedojrzały polipeptyd przechodzi obróbkę potranslacyjną, która obejmuje rozszczepienie i usunięcie peptydu sygnałowego z wytworzeniem produktu rozszczepienia CTLA4 posiadającego nowo utworzony koniec N, który różni się od końca N u postaci niedojrzałej. Fachowiec oceni, że może nastąpić dodatkowa obróbka potranslacyjna, która usuwa jeden lub więcej aminokwasów z nowo utworzonego końca N produktu rozszczepienia CTLA4. Forma dojrzała cząsteczki CTLA4 obejmuje domenę zewnątrzkomórkową CTLA4, lub każdą jej część, która wiąże się z CD80 i/lub CD86.

„Domena zewnątrzkomórkowa CTLA4 oznacza część receptora CTLA4, który wychodzi poza błonę komórkową i obejmuje każdą część CTLA4, która wychodzi poza błonę komórkową, która rozpoznaje i wiąże ligandy CTLA4, takie jak cząsteczka B7 (np. cząsteczki CD80 i/lub CD86). Przykładowo, domena zewnątrzkomórkowa CTLA4 obejmuje metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124 (fig. 2). Alternatywnie, domena zewną trzkomórkowa CTLA4 obejmuje alaninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +125 (fig. 1). Domena zewnątrzkomórkowa obejmuje fragmenty lub pochodne CTLA4, które wiążą cząsteczkę B7 (np. CD80 i/lub CD86).

„Sekwencja białka nie będącego CTLA4 lub „cząsteczka nie będąca CTLA4 jest określana jako każda cząsteczka, która nie wiąże CD80 i/lub CD86 i nie zakłóca wiązania CTLA4 z jej celem. Przykład obejmuje bez ograniczenia, region stały immunoglobuliny (Ig) lub jego część. Korzystnie, regionem stałym Ig jest region stały człowieka lub małpy, np. ludzki C(gamma)1, łącznie z zawiasem, regionami CH2 i CH3. Stały region Ig można mutować redukując jego funkcje efektorowe (opis patentowy nr US 5 637 481; oraz 6 090 914).

„Rozpuszczalny odnosi się do każdej cząsteczki lub jej fragmentów lub pochodnych, nie związanych lub przyczepionych do komórki, czyli krążących. Przykładowo, CTLA4, L104EA29YIg, B7 lub CD28 można uczynić rozpuszczalnymi przez doczepienie cząstki immunoglobuliny (Ig) do domeny zewnątrzkomórkowej odpowiednio CTLA4, B7 lub CD28. Inne cząsteczki mogą obejmować produkt genowy E7 wirusa brodawczaka (E7) antygen p97 związany z czerniakiem (p97) lub białko otoczkowe HIV (env gp120). Alternatywnie, cząsteczkę taką jak CTLA4 można uczynić rozpuszczalną poprzez usunięcie jej domeny transbłonowej. Zwykle, cząsteczki rozpuszczalne stosowane w sposobach według wynalazku, nie zawierają sekwencji sygnałowej (lub liderowej).

„CTLA4Ig jest rozpuszczalnym białkiem fuzyjnym obejmującym domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 lub jej część, która wiąże CD80 i/lub CD86, połączoną z ogonkiem Ig. Szczególna postać realizacji obejmuje domenę zewnątrzkomórkową dzikiego typu CTLA4 zaczynającą się przy metioninie w pozycji +1 i kończącą się przy kwasie asparaginowym w pozycji +124; lub zaczynającą się przy alaninie w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124; węzłową glutaminową resztę aminokwasową w pozycji +125; i część immunoglobuliny obejmującą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357 (fig. 2). DNA kodujący CTLA4Ig złożono 31 maja 1991 w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd, Manassas, VA 20110-2209 na warunkach traktatu budapesztańskiego, i przyznano mu numer dostępu ATCC 68629; Linsley, P. i inni, 1994 Immunity 1:793-80). CTLA4Ig-24, linię komórkową jajnika chomika chińskiego (CHO) o ekspresji CTLA4Ig złożono 31 maja 1991 z numerem identyfikacyjnym ATCC CRL-10762. Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4Ig stosowane w odpowiednich metodach i/lub zestawach mogą zawierać sekwencję peptydu sygnałowego (liderową) lub nie. Zwykle, w tych sposobach i/lub zestawach cząsteczki nie zawierają sekwencji peptydu sygnałowego.

„Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 oznaczają cząsteczki CTLA4 (dzikiego typu lub zmutowane) nie związane z powierzchnią komórkową (to znaczy krążące) albo każdą funkcjonalną część cząsteczki CTLA4, która wiąże B7 łącznie, lecz bez ograniczenia: z białkami fuzyjnymi CTLA4Ig (np. ATCC 68629), przy czym domena zewnątrzkomórkowa CTLA4 jest połączona przez fuzję z cząstką immunoglobuliny (Ig) czyniącą cząsteczkę fuzyjną rozpuszczalną, albo fragmenty i pochodne powyż szych; biał ka z domeną zewnątrzkomórkowa CTLA4 połączoną przez fuzję lub dołączoną do biologicznie aktywnego lub chemicznie aktywnego białka, takiego jak produkt genowy E7 papilomawirusa (CTLA4-E7), antygen p97 związany z czerniakiem (CTLA4-p97) lub białko otoczkowe HIV (CTLA4-env gp120), albo fragmenty i pochodne powyższych; hybrydowe (chimeryczne) białka fuzyjne, takie jak CD28/CTLA4Ig albo fragmenty i pochodne powyższych; cząsteczki CTLA4 z usuniętą domeną transbłonową, czyniąc białko rozpuszczalnym (Oaks, M.K. i inni, 2000 Cellular Immunology 201:144-153) albo fragmenty i pochodne powyż szych. „Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 obejmują także fragmenty, części lub pochodne powyższych oraz rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 mające aktywność wiążącą CTLA4. Rozpuszczalne

PL 204 899 B1 cząsteczki CTLA4 stosowane w sposobach i/lub zestawach mogą zawierać sekwencję peptydu sygnałowego (liderową) lub nie. Zwykle, w sposobach i/lub zestawach według wynalazku, cząsteczki nie zawierają sekwencji peptydu sygnałowego.

„Białko fuzyjne jest określone jako jedna lub więcej sekwencji aminokwasowych połączonych razem przy użyciu metod dobrze znanych w technice i jakie opisano w opisach patentowych nr US 5 434 131 lub 5 637 481. Połączone sekwencje aminokwasowe tworzą przez to jedno białko fuzyjne.

„Zmutowana cząsteczka CTLA4 oznacza cząsteczkę, którą może być pełnej długości CTLA4 lub jej część (pochodne lub fragmenty), posiadającą mutację lub wiele mutacji w CTLA4 (korzystnie w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4) tak, że jest ona podobna lecz nie identyczna jak cząsteczka CTLA4 dzikiego typu. Cząsteczki mutanta CTLA4 wiążą cząsteczkę B7 (np. albo CD80 albo CD86 lub obie). Zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą obejmować biologicznie lub chemicznie aktywne cząsteczki nie będące CTLA4, lub połączone z nią. Cząsteczki mutanta mogą być rozpuszczalne (czyli krążące) lub związane z powierzchnią. Cząsteczki mutanta CTLA4 mogą obejmować całą domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 lub jej część np. fragmenty lub pochodne. Cząsteczki mutanta CTLA4 można wykonać syntetycznie lub rekombinacyjnie.

„Mutacja oznacza zmianę w sekwencji nukleotydowej lub aminokwasowej dzikiego typu polipeptydu. Niniejszy wynalazek opisuje mutację lub zmianę w domenie zewnątrzkomórkowej dzikiego typu CTLA4. Zmiany sekwencji CTLA4 dzikiego typu obejmują zmiany konserwatywne i niekonserwatywne. Zmianą może być zmiana aminokwasowa, która obejmuje substytucje, delecje, addycje lub skrócenia. Zmutowana cząsteczka może posiadać jedną lub więcej mutacji. Mutacje w sekwencji nukleotydowej mogą powodować mutację w sekwencji aminokwasowej lub nie powodować, co jest wiadome w stanie techniki. Pod tym względem, pewne kodony nukleotydowe kodują taki sam aminokwas. Przykłady obejmują kodony nukleotydowe CGT, CGG, CGC i CGA kodujące aminokwas argininę (R); lub kodony GAT i GAC kodujące aminokwas kwas asparaginowy (D). Tak więc, białko może być kodowane przez jedną lub więcej cząsteczek kwasu nukleinowego, które różnią się specyficzną sekwencją nukleotydową lecz wciąż kodują cząsteczki białka mające identyczne sekwencje. Sekwencje kodujące aminokwas są następujące:

Aminokwas	Symbol	Symbol jednoliterowy	Kodony
1	2	3	4
Alanina	Ala	A	GCU, GCC, GCA, GCG
Cysteina	Cys	C	UGU, UGC
Kwas asparaginowy	Asp	D	GAU, GAC
Kwas glutaminowy	Glu	E	GAA, GAG
Fenylo-alanina	Phe	F	UUU, UUC
Glicyna	Gly	G	GGU, GGC, GGA, GGG
Histydyna	His	H	CAU, CAC
Izoleucyna	De	I	AUU, AUC, AUA
Lizyna	Lys	K	AAA, AAG
Leucyna	Leu	L	UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG
Metionina	Met	M	AUG
Asparagina	Asn	N	AAU, AAC
Prolina	Pro	P	CCU, CCC, CCA, CCG
Glutamina	Gln	Q	CAA, CAG
Arginina	Arg	R	CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
Seryna	Ser	S	UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC

PL 204 899 B1 ciąg dalszy

1	2	3	4
Treonina	Thr	T	ACU, ACC, ACA, ACG
Walina	Val	V	GUU, GUC, GUA, GUG
Tryptofan	Trp	W	UGG
Tyrozyna	Tyr	Y	U AU, U AC

„L104EA29YIg oznacza białko fuzyjne, które jest rozpuszczalną, zmutowaną cząsteczką CTLA4 obejmującą domenę zewnątrzkomórkową dzikiego typu CTLA4 mającej zmiany aminokwasów A29Y (reszta aminokwasu tyrozyny zastępuje alaninę w pozycji 29) oraz L104E (reszta aminokwasowa kwasu glutaminowego zastępuje leucynę w pozycji +104) albo ich część, która wiąże cząsteczkę B7 połączoną z ogonkiem Ig (zawarte w fig. 3; DNA kodujący L104EA29YIg złożono w American Type Culture Collection 20 czerwca 2000 i przyznano numer dostępu ATCC PTA-2104). Rozpuszczalne cząsteczki L104EA29YIg stosowane w zastosowaniu według wynalazku mogą zawierać sekwencję peptydu sygnałowego (liderową) lub nie. Zwykle, cząsteczki te nie zawierają sekwencji peptydu sygnałowego.

Zmutowana cząsteczka może posiadać jedną lub więcej mutacji. Jak stosuje się w niniejszym opisie, „sekwencja białkowa nie będąca CTLA4 lub „cząsteczka nie będąca CTLA4 oznacza każdą cząsteczkę, która nie wiąże B7 i nie zakłóca wiązania CTLA4 z jej celem. Przykład obejmuje, lecz bez ograniczania, region stały immunoglobuliny (Ig) lub jego część. Korzystnie, region stały Ig oznacza ludzki lub małpi region stały Ig, np. ludzki C(gamma)1, włączając zawias, regiony CH2 i CH3. Region stały Ig może być zmutowany w celu zredukowania jego funkcji efektorowych (opisy patentowe U.S. nr: 5,637,481; i 6,132,992).

„Fragment lub „część oznacza każdą część albo segment cząsteczki np. CTLA4 bądź CD28, korzystnie domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 albo CD28 lub jej część bądź segment, która rozpoznaje i wiąże jej cel np. cząsteczkę B7.

„B7 odnosi się do rodziny B7 cząsteczek obejmującą, B7-1 (CD80) (Freeman i inni, 1989, J Immunol. 143:2714-2722; B7-2 (CD86) (Freeman i inni, 1993, Science 262:909-911; Azuma i inni, 1993, Nature 366:76-79, która może rozpoznawać i wiązać CTLA4 i/lub CD28.

„CD28 odnosi się do cząsteczki, która rozpoznaje i wiąże B7, jak opisano w opisie nr seryjny US 5 580 756 i 5 521 288 (załączone w niniejszym przez odniesienie w całości).

„Komórki pozytywne pod względem B7 oznaczają wszystkie komórki z ekspresją jednego lub więcej typów cząsteczek B7 na powierzchni komórkowej.

„Pochodna oznacza cząsteczkę, która dzieli podobieństwo i aktywność swej cząsteczki rodzicielskiej. Przykładowo, pochodna CTLA4 obejmuje rozpuszczalną cząsteczkę CTLA4 mającą przynajmniej 70% podobieństwa sekwencji aminokwasowej domeny zewnątrzkomórkowej dzikiego typu CTLA4, i która rozpoznaje i wiąże B7, np. CTLA4Ig albo rozpuszczalną, zmutowaną cząsteczkę CTLA4, L104EA29YIg.

„Blokowanie lub „inhibicja receptora, sygnału albo cząsteczki oznacza zakłócanie aktywacji receptora, sygnału lub cząsteczki, co wykrywa się za pomocą znanych w technice testów. Przykładowo, blokadę odpowiedzi odpornościowej, w której pośredniczą komórki, można wykrywać przez określenie redukcji objawów związanych z chorobą reumatyczną. Blokada lub inhibicja może być częściowa lub całkowita.

„Blokowanie interakcji B7 oznacza zakłócanie wiązania B7 z jej ligandami, takimi jak CD28 i/lub CTLA4 zatrzymując przez to interakcje komórek T i komórek pozytywnych pod względem B7. Przykłady środków, które blokują interakcje B7 obejmują, lecz bez ograniczenia, cząsteczki, takie jak przeciwciała (albo ich część lub pochodna), które rozpoznają i wiążą każdą z cząsteczek CTLA4, CD28 bądź B7 (np. B7-1, B7-2); rozpuszczalna postać (albo ich część lub pochodna) cząsteczek, takich jak rozpuszczalna CTLA4; fragment peptydowy lub inna mała cząsteczka przeznaczona do zakłócania sygnału komórkowego poprzez interakcję CTLA4/CD28/B7. W korzystnej postaci realizacji, środkiem blokującym jest rozpuszczalna cząsteczka CTLA4, taka jak CTLA4Ig (ATCC 68629) albo L104EA29YIg (ATCC PTA-2104), rozpuszczalna cząsteczka CD28, taka jak CD28Ig (ATCC 68628), rozpuszczalna cząsteczka B7, taka jak B7Ig (ATCC 68627), przeciwciało monoklonalne anty-B7 (np. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 i przeciwciała monoklonalne jakie opisano w odniesieniach 82-83) i/lub przeciwciało monoklonalne anty-CC28 (np.

PL 204 899 B1

ATCC HB 11944 i mAb 9.3 jakie opisano u Hansena (Hansen i inni, 1980. Immunogenetics 10:247-260) albo Martina (Martin i inni, 1984, J.Clin.Immun. 4(1):18-22)).

„Choroba układu odpornościowego oznacza każdą chorobę, w której pośredniczą interakcje komórek T z komórkami pozytywnymi pod względem B7 łącznie, z chorobami autoimmunologicznymi, schorzeniami związanymi z przeszczepem oraz chorobami immunoproliferacyjnymi. Przykłady chorób układu odpornościowego obejmują chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD)(np. taka jaka może być wynikiem przeszczepu szpiku, albo indukcji tolerancji), schorzenia odpornościowe związane z odrzuceniem przeszczepu, przewlekłe odrzucenie oraz allo- lub ksenoprzeszczepy tkankowe bądź komórkowe obejmujące narządy stałe, skórę, wysepki, mięśnie, komórki wątroby, neurony. Przykłady chorób immunoproliferacyjnych obejmują, lecz bez ograniczenia, łuszczycę, chłoniaka komórek T, ostrą białaczkę limfoblastyczną komórek T, chłoniaka komórek T jąder z naczyniem centralnym, łagodne limfocytowe zapalenie naczyń, toczeń (np. toczeń rumieniowaty, zapalenie nerek w toczniu), zapalenie tarczycy Hashimoto, obrzęk śluzowaty pierwotny, choroba Graves'a, anemia złośliwa, autoimmunologiczne atroficzne zapalenie żołądka, choroba Addisona, cukrzyca (np. cukrzyca insulinozależna, cukrzyca typu I, cukrzyca typu II), zespół Good Pasture'a, myastenia gravis, pęcherzyca, choroba Crohn'a, współczulne zapalenie naczyniówki oka, autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka, stwardnienie rozsiane, autoimmunologiczna anemia hemolityczna, małopłytkowość idiopatyczna, pierwotna żółciowa marskość wątroby, przewlekłe zapalenie wątroby, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, zespół Sjogrena, choroby reumatyczne (np. reumatoidalne zapalenie stawów), zapalenie wielomięśniowe, twardzina i mieszana choroba tkanki łącznej.

„Podmiot obejmuje bez ograniczenia, człowieka, naczelne nie będące człowiekiem (np. małpę), owcę, królika, świnię, psa, kota, mysz lub szczura.

„Przeszczep tkanki określa się jako tkankę całego lub części narządu, którą przeszczepia się podmiotowemu biorcy. W pewnych postaciach realizacji, tkanka pochodzi od jednego lub więcej narządów litych. Przykłady tkanek lub narządów obejmują, lecz bez ograniczenia, skórę, serce, płuco, trzustkę, wątrobę, szpik kostny, komórki wysepek trzustkowych, wielokierunkowo różnicujące się komórki macierzyste, zawiesiny komórkowe i komórki genetycznie modyfikowane. Tkankę można usunąć odpodmiotowego dawcy lub może być hodowana in vitro. Przeszczep może autoprzeszczepem, izoprzeszczepem, alloprzeszczepem lub ksenoprzeszczepem albo ich kombinacją.

„Odrzucenie przeszczepu określa się jako prawie zupełną lub zupełną utratę żywej tkanki przeszczepu przez podmiotowego biorcy.

„Otoczkowanie określa się jako proces immunoizolacji komórek i/lub ugrupowań komórek, w wyniku której produkowane są i wydzielane substancje, np. insulina, do medycznego stosowania tych preparatów. Proces otoczkowania obejmuje umieszczenie komórek i/lub ugrupowań komórek we wnętrzu półprzepuszczalnej bariery przed przeszczepieniem, w celu uniknięcia odrzucenia przez układ odpornościowy. Ciężar cząsteczkowy odcięcia błony otoczkującej można kontrolować w trakcie procesu otoczkowania tak aby wyłączyć dyfuzję w kierunku do wnętrza oraz czynników litycznych układu dopełniacza, lecz pozwalając na przejście mniejszych cząsteczek, takich jak glukoza i insulina. Otoczkowanie pozwala komórkom wysepek na fizjologiczną odpowiedź na zmiany poziomu glukozy we krwi, lecz zapobiega kontaktowi ze składnikami układu immunologicznego. Metody otoczkowanie komórek wysepek trzustkowych są opisane w opisie patentowym nr US 6 080 412.

„Ligand odnosi się do cząsteczki, która swoiście rozpoznaje i wiąże inną cząsteczkę, np. ligandem dla CTLA4 jest CD80 i/lub CD86.

„Rozpuszczalny ligand, który rozpoznaje i wiąże antygen CD80 i/lub CD86 obejmuje ligandy, takie jak CTLA4Ig, CD28Ig lub inne rozpuszczalne postacie CTLA4 i CD28; rekombinowaną CTLA4 i CD28; zmutowane cząsteczki CTLA4, takie jak L104EA29YIg; oraz każdą cząsteczkę przeciwciała, jego fragment lub rekombinowane białko wiążące, które rozpoznaje i wiąże antygen CD80 i/lub CD86. Te środki są także uważane za „środki immunosupresyjne.

„Szlak kostymulatorowy określa się jako szlak biochemiczny wynikający z interakcji sygnałów kostymulatorowych na komórkach T oraz komórkach prezentujących antygen (APC). Sygnały kostymulatorowe pomagają określić wielkość odpowiedzi immunologicznej wobec antygenu. Jeden sygnał kostymulatorowy jest dostarczony przez interakcję z receptorami komórki T CD28 i CTLA4 z cząsteczkami CD80 i/lub CD86 na APC.

PL 204 899 B1 „CD80 i/lub CD86 obejmuje B7-1 (zwane także CD80), B7-2 (zwane także CD86), B7-3 (zwane także CD74) oraz rodzinę B7, np. kombinację B7-1, B7-2 i/lub B7-3.

„Blokada kostymulatorowa jest określana jako protokół podawania podmiotowi jednego lub więcej środków, które zakłócają lub blokują szlak kostymulatorowy, jak opisano powyżej. Przykłady środków, które zakłócają blokadę kostymulatorowa obejmują, lecz bez ograniczenia, rozpuszczalną CTLA4, zmutowaną CTLA4, rozpuszczalną CD28, przeciwciała monoklonalne anty-B7 (mAb), rozpuszczalną CD40 oraz mAb anty-gp39. W jednej postaci realizacji, L104EA29YIg jest korzystnym środkiem, który zakłóca blokadę kostymulatorowa.

„Szpik kostny pozbawiony komórek T jest określany jako szpik kostny usunięty z kości, który poddano ekspozycji wobec protokołu przeciwko komórkom T. Protokół przeciwko komórkom T jest określany jako procedura usuwania komórek T ze szpiku kostnego. Metody selektywnego usuwania komórek T są dobrze znane w technice. Przykładem protokołu przeciwko komórkom T jest ekspozycja szpiku kostnego wobec przeciwciała swoistych wobec komórek T, przy czym przeciwciała są cytotoksyczne w stosunku do komórek T. Alternatywnie, przeciwciała można sprzęgać z cząstkami magnetycznymi pozwalając na usunięcie komórek T ze szpiku kostnego przy użyciu pola magnetycznego. Innym przykładem protokołu przeciwko komórkom T jest ekspozycja komórek T ze szpiku kostnego wobec surowicy antylimfocytowej lub globuliny antytymocytowej.

„Dawka szpiku kostnego pozbawionego komórek T wywołująca tolerancję jest określana jako kolejna dawka szpiku kostnego pozbawionego komórek T podawana podmiotowi w celu inaktywacji komórek T potencjalnie reaktywnych wobec dawcy.

„Wszczepiająca dawka szpiku kostnego pozbawionego komórek T jest określana jako kolejna dawka szpiku kostnego pozbawionego komórek T, którą podaje się podmiotowi w celu ustalenia mieszanego chimeryzmu krwiotwórczego. Wszczepiająca dawka szpiku kostnego pozbawionego komórek T będzie w związku z tym podawana po dawce szpiku kostnego pozbawionego komórek wywołującej tolerancję.

„Mieszany chimeryzm krwiotwórczy jest określany jako obecność potomnych i dojrzałych komórek krwi dawcy i biorcy (np. komórek pochodzących z krwi) przy braku (lub niewykrywalnej obecności) odpowiedzi odpornościowej.

„Parowania dawca-biorca są określane na podstawie typowania molekularnego przy użyciu panelu wcześniej określonych alleli głównego układu zgodności tkankowej (8 klasy I i 12 klasy II) (Lobashevsky A, i inni, Tissue Antygens 54:254-263 (1999); Knapp LA i inni, Tissue Antygens 50:657-661 (1997); Watkins D.I. Crit Rev Immunol 15:1-29 (1995)). Parowania maksymalizowały różnicę w loci zarówno klasy I jak i II.

„Podawać lub „podawanie podamiotowi obejmuje bez ograniczenia podawanie dożylne (i.v.), podawanie dootrzewnowe (i.p.), podawanie domięśniowe (i.m.), podawanie podskórne, podawanie doustne, podawanie w postaci czopka albo przez kontakt miejscowy, albo wszczepienie urządzenia o powolnym uwalnianiu, takiego jak pompa miniosmotyczna.

„Farmaceutycznie dopuszczalny nośnik obejmuje każdy materiał, który po połączeniu z czynnikiem reaktywnym, zachowuje aktywność biologiczną czynnika reaktywnego, np. swoistość wiązania, i nie reaguje z układem odpornościowym podmiotu. Przykłady obejmują, lecz bez ograniczenia, każdy ze standardowych nośników farmaceutycznych, takich jak roztwór soli buforowany fosforanem, woda, emulsje, takie jak emulsja olej/woda, oraz różne rodzaje środków nawilżających. Inne nośniki mogą także obejmować jałowe roztwory, tabletki, łączenie z tabletkami powlekanymi i kapsułkami. Zwykle, takie nośniki zawierają zaróbki, takie jak skrobia, mleko, cukier, pewne rodzaje glinki, żelatynę, kwas stearynowy lub jego sole, stearynian magnezu lub wapnia, talk, tłuszcze roślinne albo oleje, gumy, glikole lub inne znane zaróbki. Kompozycje obejmujące takie nośniki opracowuje się dobrze znanymi, konwencjonalnymi metodami.

„Środki immunosupresyjne określa się jako kompozycję mającą jeden lub więcej rodzajów cząsteczek, które zapobiegają występowaniu odpowiedzi odpornościowej, albo osłabiają układ odpornościowy podmiotu. Korzystnie, środki redukują lub zapobiegają proliferacji komórek T. Niektóre środki mogą hamować proliferację komórek T przez hamowanie interakcji komórek T z innymi komórkami prezentującymi antygen (APC). Przykładem APC jest komórka B. Przykładami środków, które zakłócają interakcje komórek T z APC, a przez to hamują proliferację komórek T, są bez ograniczenia, rozpuszczalne CTLA4, rozpuszczalne, zmutowane CTLA4, rozpuszczalne CD28 lub przeciwciała monoklonalne, które rozpoznają i wiążą antygeny CD80 i/lub CD86, albo ich fragmenty. Korzystnym środkiem jest L104EA29YIg. Ligandy dla antygenów CTLA4 lub CD28 obejmują przeciwciała monoklonal12

PL 204 899 B1 ne, które rozpoznają i wiążą antygeny CD80 i/lub CD86, albo ich fragmenty. Inne ligandy dla CTLA4 lub CD28 obejmują rozpuszczalne cząsteczki CD80 i/lub CD86, takie jak CD80 i/lub CD86lg. Fachowcy łatwo zrozumieją, że można stosować inne środki lub ligandy do hamowania interakcji CD28 z CD80 i/lub CD86.

Środki immunosupresyjne obejmują metotreksat, cyklofosfamid, cyklosporynę, cyklosporynę A, chlorochin, hydroksychlorochin, sulfasalazynę (sulfosalazopirynę), sole złota, D-penicylaminę, leflunomid, azatioprin, anakinra, infliksimab (REMICADE^r), etanercept, blokery TNFa, środek biologiczny, który integruje się z cytokiną zapalną, oraz niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSAID). NSAID obejmują bez ograniczenia, kwas acetylosalicylowy, diklofenak, etodolak, fenoprofen, flurbiprofen, indometacynę, ketoprofen, ketorolak, meklfenamat, naproksen, nabumeton, fenylobutazon, prioksikam, sulindak, tolmetin, acetaminofen, ibuprofen, inhibitory C-x-2 i tramadol.

Cząsteczki CTLA4, z sekwencjami zmutowanymi albo dzikiego typu, można uczynić rozpuszczalnymi poprzez delecję segmentu transbłonowego CTLA4 (Oaks, M.K. i inni, 2000 Cellular Immunology 201:144-153).

Alternatywnie, rozpuszczalne cząsteczki CTLA4, z sekwencjami zmutowanymi albo dzikiego typu, mogą być białkami fuzyjnymi, w których cząsteczki CTLA4 są w fuzji z cząstkami nie będącymi CTLA4, takimi jak cząsteczki immunoglobuliny (Ig), które czynią cząsteczki CTLA4 rozpuszczalnymi. Przykładowo, białko fuzyjne CTLA4 może obejmować domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 w fuzji z domeną stałą immunoglobuliny, w wyniku czego powstaje cząsteczka CTLA4Ig (fig. 2)(Linsley, P.S. i inni, 1994, Immunity 1:793-80).

Dla protokołów klinicznych korzystne jest aby region immunoglobulinowy nie wzbudzał szkodliwej odpowiedzi odpornościowej u podmiotu. Korzystną cząstką jest region stały immunoglobuliny, obejmujący ludzkie lub małpie regiony stałe immunoglobuliny. Przykładem odpowiedniego regionu immunoglobulinowego jest ludzki Cy1, łącznie z zawiasem, regiony CH2 i CH3, które mogą pośredniczyć w funkcjach efektorowych, takich jak wiązanie z receptorami Fc, pośredniczenie w cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) albo pośredniczyć w cytotoksyczności za pośrednictwem komórek, zależnej od przeciwciała (ADCC). Cząstka immunoglobulinowa może obejmować jedną lub więcej mutacji (np. w domenie CH2, do redukowania funkcji takich efektorowych jak CDC albo ADCC), gdzie mutacja moduluje zdolność wiązania immunoglobuliny z jej ligandem, przez zwiększanie lub zmniejszanie zdolności do wiązania immunoglobuliny z receptorami Fc. Przykładowo, mutacje w immunoglobulinie mogą obejmować zmiany w którejkolwiek albo wszystkich resztach cysteinowych w domenie zawiasowej, np. cysteiny w pozycjach +130, +136 i +139 są podstawione seryną (fig. 24). Cząsteczka immunoglobulinowa może także zawierać prolinę w pozycji +148 odstawioną seryną, jak ukazano w fig. 24. Dalej, mutacje cząstki immunoglobuliny mogą obejmować substytucję leucyny w pozycji +144 fenyloalaniną, substytucję leucyny w pozycji +145 kwasem glutaminowym albo substytucję glicyny w pozycji +147 alaniną.

Dodatkowe cząstki nie będące CTLA4, do wykorzystania w rozpuszczalnych cząsteczkach CTLA4 albo rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczkach CTLA4 obejmują, lecz bez ograniczenia, cząsteczkę p97, cząsteczkę env gp120, cząsteczkę E7 i cząsteczkę ova (Dash, B. i inni, 1994 J.Gen.Virol. 75 (Pt6) :1389-97; Ikeda, T. i inni, 1994 Gene 138 (1-2):193-6; Falk, K. i inni, 1993 Cell. Immunol. 150(2):447-52; Fujisaka, K. i inni, 1994 Virology 204(2):789-93). Inne cząsteczki są także możliwe (Gerard, C. i inni, 1994 Neuroscience 62(3):721; Byrn, R. i inni 1989 63(10):4370; Smith, D. i inni 1987 Science 238:1704; Lasky, L. 1996 Science 233:209).

Niniejszy wynalazek opisuje rozpuszczalną cząsteczkę CTLA4 obejmującą sekwencję peptydu sygnałowego połączoną z końcem N-terminalnym domeny zewnątrzkomórkowej części CTLA4 cząsteczki. Peptyd sygnałowy może być każdą sekwencją, która pozwoli na sekrecję cząsteczki, łącznie z peptydem sygnałowym z onkostatyny M (Malik, i inni, (1989) Molec.Cell.Biol.9:2847-2853) albo CD5 (Jones, N.H. i inni, (1986) Nature 323:346-349) albo peptyd sygnałowy z każdego białka zewnątrzkomórkowego. Rozpuszczalna cząsteczka CTLA4 stosowana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może obejmować peptyd sygnałowy onkostatyny M połączony na końcu N-terminalnym domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4 oraz cząsteczkę ludzkiej immunoglobuliny (np. zawias, CH2 i CH3) połączoną z końcem C-terminalnym domeny zewnątrzkomórkowej (dzikiego typu lub zmutowanej) CTLA4. Ta cząsteczka zawiera peptyd sygnałowy onkostatyny M obejmujący sekwencję aminokwasową posiadającą metioninę w pozycji -26 do alaniny w pozycji -1, część CTLA4 obejmującą sekwencję aminokwasową posiadającą metioniPL 204 899 B1 nę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, węzłową resztę aminokwasową, metioninę w pozycji +125, oraz część immunoglobulinową obejmującą sekwencję aminokwasową mającą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357.

W jednej postaci realizacji, rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 według wynalazku, obejmujące zmutowane sekwencje CTLA4 opisane poniżej, są cząsteczkami fuzyjnymi zawierającymi cząstki ludzkiej IgC(gamma)1 (czyli IgCY1) w fuzji ze zmutowanymi fragmentami CTLA4. Rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą zawierać jedną lub więcej mutacji (np. substytucji aminokwasu, delecji lub insercji) w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4.

Przykładowo, rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą zawierać mutację albo mutacje wewnątrz albo w bezpośredniej bliskości z regionem objętym przez serynę w pozycji +25 do argininy w pozycji +33 (np. S25-R33, stosując standardowe, jednoliterowe symbole aminokwasów). Zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą obejmować substytucję aminokwasu w każdej jednej lub więcej następujących pozycji: S25, P26, G27, K28, A29, T30, E31 lub R33.

W innej postaci realizacji, rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą obejmować mutację lub mutacje wewnątrz albo w bezpośredniej bliskości z regionem objętym przez kwas glutaminowy w pozycji +95 do glicyny w pozycji +107 (np. E95-G107). Zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą obejmować substytucję aminokwasu w każdej jednej lub więcej następujących pozycji: K93, L96, M97, Y98, P99, P100, P101, Y102, Y103, L104, G105, I106 i G107.

Dodatkowo wynalazek opisuje rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 mające mutację lub mutacje wewnątrz albo w bezpośredniej bliskości z regionem objętym przez asparaginę +108 do izoleucyny w pozycji +115 (np. N108-I115). Zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą obejmować substytucję aminokwasu w każdej jednej lub więcej następujących pozycji: L104, G105, I106, G107, Q11, Y113 lub I115.

W jednej postaci realizacji, rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 zawierają IgCY1 w fuzji z fragmentem CTLA4 obejmującym mutację pojedynczego miejsca w domenie zewnątrzkomórkowej. Domena zewnątrzkomórkowa CTLA4 obejmuje metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124 (np. fig. 1). Zewnątrzkomórkowa część CTLA4 może zawierać alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124 (np. fig. 1).

Przykłady mutacji pojedynczego miejsca obejmują następujące, przy czym leucyna w pozycji +104 jest zamieniona na jakikolwiek inny aminokwas:

Mutant pojedynczego miejsca:	Zmiana kodonu:
L104EIg	Kwas glutaminowy GAG
L104SIg	Seryna AGT
L104TIg	Treonina ACG
L104AIg	Alanina GCG
L104WIg	Tryptofan TGG
L104QIg	Glutamina CAG
L104KIg	Lizyna AAG
L104RIg	Arginina CGG
L104GIg	Glicyna GGG

Dodatkowo, wynalazek podaje zmutowane cząsteczki mające domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 z dwoma mutacjami, w fuzji z cząstką IgCY1. Przykłady obejmują następujące, przy czym leucyna w pozycji +104 jest zamieniona innym aminokwasem (np. kwasem glutaminowym), a glicyna w pozycji +105, seryna w pozycji +25, treonina w pozycji +30 lub alanina w pozycji +29 jest zamieniona jakimkolwiek innym aminokwasem:

PL 204 899 B1

Mutanty podwójnego miejsca:	Zmiana kodonu:
L104EG105FIg	Fenyloalanina TTC
L104EG105WIg	Tryptofan TGG
L104EG105LIg	Leucyna CTT
L104ES25RIg	Arginina CGG
L104ET30GIg	Glicyna GGG
L104ET30NIg	Asparagina AAT
L104EA29YIg	Tyrozyna TAT
L104EA29LIg	Leucyna TTG
L104EA29TIg	Treonina ACT
L104EA29WIg	Tryptofan TGG

Jeszcze dodatkowo, wynalazek podaje zmutowane cząsteczki mające domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 obejmującą trzy mutacje, w fuzji z cząstką Ig Cy1. Przykłady obejmują następujące, przy czym leucyna w pozycji +104 jest zamieniona na inny aminokwas (np. kwas glutaminowy), alanina w pozycji +29 jest zamieniona na inny aminokwas (np. tyrozynę), a seryna w pozycji +25 jest zmieniona na inny aminokwas:

Mutanty trójmiejscowe:	Zmiany kodonu:
L104EA29YS25KIg	Lizyna AAA
L104EA29YS25KIg	Lizyna AAG
L104EA29YS25NIg	Asparagina AAC
L104EA29YS25RIg	Arginina CGG

Rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą posiadać resztę aminokwasową łączenia, która jest umiejscowiona między częścią CTLA4 i częścią Ig cząsteczki. Aminokwasem łączenia może być każdy aminokwas, łącznie z glutaminą. Aminokwas łączenia można wprowadzić przez syntezę molekularną lub chemiczną, metodami znanymi w technice.

Wynalazek opisuje rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 obejmujące mutację w pojedynczym miejscu w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, taką jak L104EIg (jak podano w fig. 19) albo L104SIg, gdzie L104EIg i L104SIg są zmutowane w sekwencjach CTLA4 tak, że leucyna w pozycji +104 jest podstawiona, odpowiednio kwasem glutaminowym albo seryną. Cząsteczki z mutacjami w pojedynczym miejscu dodatkowo zawierają części CTLA4 obejmujące metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, resztę aminokwasu łączącego, glutaminę, w pozycji +125 oraz część immunoglobulinową obejmującą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357. Część immunoglobulinowa zmutowanej cząsteczki może być także zmutowana tak, że cysteiny w pozycjach +130, +136 i +139 są podstawione seryną, a prolina w pozycji +148 jest podstawiona seryną. Alternatywnie, rozpuszczalna, zmutowana w pojedynczym miejscu cząsteczka CTLA4 może posiadać część CTLA4 obejmującą alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124.

Wynalazek omawia rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 obejmujące mutacje w podwójnym miejscu w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, takie jak L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg lub L104EA29WIg, przy czym leucyna w pozycji +104 jest podstawiona kwasem glutaminowym, a alanina w pozycji +29 jest podstawiona, odpowiednio, tyrozyną, leucyną, treoniną i tryptofanem. Sekwencje dla L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg lub L104EA29WIg, zaczynając od metioniny w pozycji +1 i kończąc na lizynie w pozycji +357, plus sekwencja peptydu sygnałowego (liderowa) są podane w sekwencjach ukazanych, odpowiednio, w fig. 3 oraz 20-22. Cząsteczki zmutowane w podwójnym miejscu obejmują części CTLA4 zawierające metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, resztę aminokwasu łąPL 204 899 B1 czącego, glutaminę, w pozycji +125, oraz część immunoglobulinową obejmującą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357. Część immunoglobulinowa zmutowanej cząsteczki może być zmutowana tak, że cysteiny w pozycjach +130, +136 i +139 są podstawione seryną, a prolina w pozycji +148 jest podstawiona seryną. Alternatywnie, te zmutowane cząsteczki mogą mieć część CTLA4 obejmującą alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124.

Wynalazek opisuje rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 zawierające mutację podwójnego miejsca w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, takie jak L104EG105FIg, L104EG105WIg i L104EG105LIg, przy czym leucyna w pozycji +104 jest podstawiona kwasem glutaminowym, a glicyna w pozycji +105 jest podstawiona, odpowiednio, fenyloalaniną, tryptofanem i leucyną. Cząsteczki zmutowane w podwójnym miejscu obejmują części CTLA4 zawierające metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, resztę aminokwasu łączącego, glutaminę, w pozycji +125, oraz część immunoglobulinową obejmującą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357. Część immunoglobulinowa zmutowanej cząsteczki może być zmutowana tak, że cysteiny w pozycjach +130, +136 i +139 są podstawione seryną , a prolina w pozycji +148 jest podstawiona seryną. Alternatywnie, te zmutowane cząsteczki mogą mieć część CTLA4 obejmującą alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124.

Wynalazek opisuje L104ES29RIg, która jest cząsteczką zmutowaną w podwójnym miejscu, obejmującą część CTLA4 zawierającą metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, resztę aminokwasu łączącego, glutaminę w pozycji +125, oraz część immunoglobulinową zawierającą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357. Część zawierająca domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 jest tak zmutowana, że seryna w pozycji +25 jest podstawiona argininą, a leucyna w pozycji +104 jest podstawiona kwasem glutaminowym. Alternatywnie, L104ES29RIg może posiadać część CTLA4 obejmującą alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124.

Wynalazek opisuje rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 zawierające mutację podwójnego miejsca w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, takie jak L104ET30GIg i L104ET30NIg, przy czym leucyna w pozycji +104 jest podstawiona kwasem glutaminowym, a treonina w pozycji +30 jest podstawiona, odpowiednio, glicyną albo asparaginą. Cząsteczki zmutowane w podwójnym miejscu dodatkowo obejmują części CTLA4 zawierające metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, resztę aminokwasu łączą cego, glutaminę , w pozycji +125, oraz część immunoglobulinową zawierającą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357. Część immunoglobulinowa zmutowanej cząsteczki może być także zmutowana tak, że cysteiny w pozycjach +130, +136 i +139 są podstawione seryną, a prolina w pozycji +148 jest podstawiona seryną. Alternatywnie, te zmutowane cząsteczki mogą posiadać część CTLA4 obejmującą alaninę -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124.

Wynalazek podaje rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 obejmujące mutację potrójnego miejsca w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, taką jak L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg, L104EA29YS25RIg, przy czym leucyna w pozycji +104 jest podstawiona kwasem glutaminowym, alanina w pozycji +29 jest podstawiona tyrozyną, a seryna w pozycji +25 jest zmieniona odpowiednio na lizynę, asparaginę albo argininę. Cząsteczki zmutowane w potrójnym miejscu dodatkowo obejmują części CTLA4 zawierające metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, resztę aminokwasu łączącego, glutaminę , w pozycji +125, oraz część immunoglobulinową zawierającą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357. Część immunoglobulinowa zmutowanej cząsteczki może być także zmutowana tak, że cysteiny w pozycjach +130, +136 i +139 są podstawione seryną, a prolina w pozycji +148 jest podstawiona seryną. Alternatywnie, te zmutowane cząsteczki mogą posiadać część CTLA4 obejmującą alaninę -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124.

Inne postacie realizacji rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczek CTLA4 obejmują chimeryczne cząsteczki zmutowanego homologa CTLA4/CD28, które wiążą B7 (Peach, R.J. i inni, 1994 J. Exp. Med. 180:204 9-2058). Przykłady tych chimerycznych, zmutowanych cząsteczek CTLA4/CD28 obejmują HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS12, HS13 i HS14 (opis patentowy nr US 5 773 253).

Korzystne postacie realizacji wynalazku to rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 takie jak CTLA4Ig (jak ukazano w fig. 2, zaczynając od metioniny w pozycji +1 i kończąc na lizynie w pozycji +357) oraz rozpuszczalna, zmutowana CTLA4, L104EA29YIg (jaką ukazano w fig. 3, zaczynając od metioniny w pozycji +1 i kończą c na lizynie w pozycji +357).

PL 204 899 B1

Wynalazek opisuje dodatkowo cząsteczki kwasu nukleinowego obejmujące sekwencje nukleotydowe kodujące sekwencje aminokwasowe odpowiadające rozpuszczalnym cząsteczkom CTLA4 według wynalazku. W jednej postaci realizacji, cząsteczką kwasu nukleinowego jest DNA (np. cDNA) albo jego hybryda. DNA kodujący CTLA4Ig (fig. 2) złożono 31 maja 1991 w American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 i przyznano mu numer dostępu ATCC 68629. DNA kodujący L104EA29YIg (sekwencja podana w fig. 3) złożono 19 czerwca 2000 w ATCC i przyznano numer dostępu ATCC PTA-2104. Alternatywnie, cząsteczkami kwasu nukleinowego jest RNA lub jego hybryda.

Hybrydy CTLA4

Niniejszy wynalazek opisuje rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 obejmujące co najmniej domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 lub jej część, która wiąże CD80 i/lub CD86. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 obejmuje metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124 (np. fig. 1). Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124 (np. fig. 1). Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować kwas glutaminowy w pozycji +95 do cysteiny w pozycji +120. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować metioninę w pozycji +1 i kwas glutaminowy w pozycji +95 do kwasu asparaginowego w pozycji +122. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować metioninę w pozycji +1 do tyrozyny w pozycji +23 i walinę w pozycji +32 do kwasu asparaginowego w pozycji +122. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować alaninę w pozycji +24 do kwasu glutaminowego w pozycji +31 oraz kwas glutaminowy w pozycji +95 do izoleucyny w pozycji +112. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować alaninę w pozycji +24 do kwasu glutaminowego w pozycji +31 i tyrozynę w pozycji +113 do kwasu asparaginowego w pozycji +122. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować alaninę w pozycji +50 do kwasu glutaminowego w pozycji +57 oraz kwas glutaminowy w pozycji +95 do kwasu asparaginowego w pozycji +122. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować alaninę w pozycji +24 do kwasu glutaminowego w pozycji +31; alaninę w pozycji +50 do kwasu glutaminowego w pozycji +57; oraz kwas glutaminowy w pozycji +95 do kwasu asparaginowego w pozycji +122. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować alaninę w pozycji +50 do kwasu glutaminowego w pozycji +57 oraz kwas glutaminowy w pozycji +95 do izoleucyny w pozycji +112. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować alaninę w pozycji +24 do kwasu glutaminowego w pozycji +31; alaninę w pozycji +50 do kwasu glutaminowego w pozycji +57; oraz kwas glutaminowy w pozycji +95 do kwasu asparaginowego w pozycji +122. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować alaninę w pozycji +24 do waliny w pozycji +94. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować alaninę w pozycji -1 do cysteiny w pozycji +21. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować metioninę w pozycji +1 do cysteiny w pozycji +21. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować kwas glutaminowy w pozycji +95 do kwasu asparaginowego w pozycji +122. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować alaninę w pozycji -1 do waliny w pozycji +94. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować metioninę w pozycji +1 do waliny w pozycji +94. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować alaninę w pozycji +24 do kwasu glutaminowego w pozycji +31. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować alaninę w pozycji -1 do tyrozyny w pozycji +23. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować metioninę w pozycji +1 do tyrozyny w pozycji +23. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować walinę w pozycji +32 do kwasu asparaginowego w pozycji +122. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować kwas glutaminowy w pozycji +95 do izoleucyny w pozycji +112. Część zewnątrzkomórkowa CTLA4 może obejmować alaninę w pozycji +50 do kwasu glutaminowego w pozycji +57.

Sposoby wytwarzania cząsteczek mutanta CTLA4

Ekspresja cząsteczek mutanta CTLA4 może następować w komórkach prokariotycznych. Organizmy prokariotyczne są najczęściej reprezentowane przez różne szczepy bakterii. Bakterie mogą być gram dodatnie lub gram ujemne. Można także stosować inne szczepy drobnoustrojów.

Sekwencje kodujące cząsteczki mutanta CTLA4 można wprowadzić do wektora zaplanowanego do ekspresji obcych sekwencji w komórkach prokariotycznych, takich jak E. coli. Te wektory mogą obejmować zwykle wykorzystywane prokariotyczne sekwencje kontrolne, które są określone w niniejszym, jako obejmujące promotory początku transkrypcji, ewentualnie z operatorem, razem z sekwencjami miejsca wiązania rybosomu, obejmujące takie powszechnie stosowane promotory jak układy promotorowe beta laktamazy (penicylinazy) i laktozy (lac) (Chang, i inni, (1977) Nature 198:1056),

PL 204 899 B1 tryptofanowy (trp) układ promotorowy (Goeddel, i inni, (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) oraz pochodzący od lambda promotor PL i N-genowe miejsce wiązania rybosomu (Shimatake, i inni, (1981) Nature 292:128).

Takie wektory ekspresji będą także obejmować początki replikacji i markery selekcji, takie jak gen betalaktamazy lub fosfotransferazy neomycynowej, nadający odporność na antybiotyki tak, że wektory, które mogą replikować w bakteriach i komórkach niosących plazmidy, można selekcjonować w czasie hodowli w obecności antybiotyków, takich jak ampicylina lub kanamycyna.

Plazmid ekspresji można wprowadzić do komórek prokariotycznych różnymi standardowymi metodami, włączając lecz bez ograniczenia szok CaCl2 (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110. i Sambrook i inni (wydawcy) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-gie wydanie, Cold Spring Harbor Press, (1989)) i elektroporację.

Zgodnie z praktyką wynalazku, komórki eukariotyczne są także odpowiednimi komórkami gospodarza. Przykłady komórek eukariotycznych obejmują każdą komórkę zwierzęcą, czy to pierwotną czy unieśmiertelnioną, drożdżową (np. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe i Pichia pastoris) oraz komórki roślinne. Komórki szpiczaka, COS i CHO są przykładami komórek zwierzęcych, które mogą być wykorzystane jako gospodarze. Poszczególne komórki CHO obejmują, lecz bez ograniczenia, DG44 (Chasin, i inni 1986 Som. Celi. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909), CHO-K1 (ATCC Nr. CCL-61), linia komórkowa CHO-K1 Tet-On (Clontech), CHO oznaczone ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), klon CHO 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO klon B (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF oznaczone ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) i RR-CHOK1 oznaczone ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Przykładowe komórki roślinne obejmują tytoń (całe rośliny, hodowle komórkowe lub kalus), komórki kukurydzy, soi i ryżu. Dopuszczalne są także nasiona kukurydzy, soi i ryżu.

Sekwencje nukleotydowe kodujące cząsteczki mutanta CTLA4 można także wprowadzić do wektora zaplanowanego do ekspresji obcych sekwencji w gospodarzu eukariotycznym. Elementy regulatorowe wektora mogą się zmieniać zgodnie z poszczególnym gospodarzem eukariotycznym. Cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje L104EA29YIg jest zawarta w pD16 L104EA29YIg i złożono ją 19 czerwca 2000 w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 (ATCC nr PTA-2104). Wektor pD16 L104EA29YIg jest pochodną wektora pcDNA3 (INVITROGEN).

Powszechnie stosowane eukariotyczne sekwencje kontrolne do stosowania w wektorach ekspresji obejmują promotory i sekwencje kontrolne zgodne z komórkami ssaków, takie jak np. promotor CMV (wektor CDM8) i wirus mięsaka ptaków (ASV) (wektor nLN). Inne powszechnie wykorzystywane promotory obejmują wczesny i późny promotor z Simian Virus 40 (SV40) (Fiers, i inni, (1973) Nature 273:113), lub inne promotory wirusowe, takie jak te pochodzące od poliomy, adenowirusa 2 i bydlęcego papillomawirusa. Można także stosować promotor możliwy do indukcji, taki jak hMTII (Karin, i inni, (1982) Nature 299:797-802).

Wektory do ekspresji cząsteczek mutanta CTLA4 u eukariontów mogą także nieść sekwencje zwane regionami wzmacniaczowymi. Są one istotne przy optymalizacji ekspresji genu i znajdują się albo w górę lub w dół od regionu promotora.

Przykłady wektorów ekspresji dla eukariotycznych komórek gospodarzy obejmują, lecz bez ograniczenia, wektory dla ssaczych komórek gospodarzy (np. BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); wektory pVPakc, wektory pCMV, wektory pSG5 (Stratagene), wektory retrowirusowe (np. pFB wektory (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) lub jego postacie modyfikowane, wektory adenowirusowe; wektory wirusowe związane z adenowirusem, wektory bakulowirusowe, wektory drożdżowe (np. wektory pESC (Stratagene)).

Sekwencje nukleotydowe kodujące cząsteczki mutanta CTLA4 mogą integrować z genomem eukariotycznej komórki gospodarza i replikować wraz z replikacją genomu gospodarza. Alternatywnie, wektor niosący cząsteczki mutanta CTLA4 może zawierać początki replikacji pozwalające na replikację pozachromosomową.

Dla ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego w Saccharomyces cerevisiae, początku replikacji endogenicznego plazmidu drożdżowego, można użyć koło 2μ (Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307). Alternatywnie, można wykorzystać sekwencje z genomu drożdżowego zdolne do pobudzania replikacji autonomicznej (patrz np. Stinchcomb i inni, (1979) Nature 282:39); Tschemper i inni, (1980) Gene 10:157; i Clarke i inni, (1983) Meth.Enz. 101:300).

PL 204 899 B1

Transkrypcyjne sekwencje kontrolne dla wektorów drożdżowych obejmują promotory syntezy enzymów glikolitycznych (Hess i inni, (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland i inni, (1978) Biochemistry 17:4900). Inne promotory znane w technice obejmują promotor CMV zawarty w wektorze CDM8 (Toyama i Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); promotor kinazy 3-fosfoglicerynianowej (Hitzeman i inni, (1980) J. Biol. Chem. 255:2073) oraz te dla innych enzymów glikolitycznych.

Inne promotory można indukować, ponieważ mogą one być regulowane przez bodźce środowiskowe lub pożywkę wzrostową dla komórek. Te promotory możliwe do indukowania obejmują te z genów białek szoku termicznego, dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, kwaśnej fosfatazy, enzymów związanych z katabolizmem azotu i enzymów odpowiedzialnych za utylizację maltozy i galaktozy.

Sekwencje regulatorowe mogą być także umieszczone na końcu 3' sekwencji kodującej. Te sekwencje mogą działać w celu ustabilizowania informacyjnego RNA. Takie terminatory znajdują się w regionie nie podlegającym translacji 3', za sekwencjami kodującymi, w kilku genach otrzymanych od drożdży i ssaków.

Przykładowe wektory dla roślin i komórek roślinnych obejmują, lecz bez ograniczenia, plazmidy Ti Agrobacterium, wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) i wirusa złotej mozaiki pomidora (TGMV).

Ogólne aspekty transformacji układu komórek gospodarza ssaka został opisany przez Axel (opis patentowy U.S. Nr. 4,399,216 opublikowany 16 sierpnia 1983). Komórki ssaków można transformować metodami obejmującymi, lecz bez ograniczenia, transfekcje w obecności fosforanu wapnia, mikroiniekcję, elektroporację lub przez transdukcję z wektorami wirusowymi. Metody wprowadzania obcych sekwencji DNA do genomów roślinnych i drożdżowych obejmują (1) metody mechaniczne, takie jak mikroiniekcja DNA do pojedynczych komórek lub protoplastów, wirowanie komórek ze szklanymi paciorkami w obecności DNA, lub wstrzeliwanie kulek wolframowych lub złotych powleczonych DNA, do komórek lub protoplastów; (2) wprowadzanie DNA przez błonę komórkową, która stała się przenikalną dla makrocząsteczek, na skutek traktowania glikolem polietylenowym lub poddania impulsom elektrycznym o wysokim napięciu (elektroporacji); lub (3) stosowanie liposomów (zawierających cDNA), które łączą się w fuzje z błonami komórkowymi.

Ekspresję cząsteczek mutanta CTLA4 można wykrywać metodami znanymi w technice. Przykładowo, cząsteczki mutanta można wykrywać przez żele SDS-PAGE z barwieniem Coomassie i odcisk immunologiczny z użyciem przeciwciał, które wiążą CTLA4. Odzyskiwanie białka można przeprowadzić wykorzystując standardowe środki oczyszczania białka np. chromatografię powinowactwa lub chromatografię jono wymienną, z uzyskaniem zasadniczo czystego produktu (R. Scopes w: „Protein Purification. Principles and Practice trzecie wydanie, Springer-Verlag (1994)).

Wynalazek dodatkowo opisuje rozpuszczalne cząsteczki mutanta CTLA4 wytworzone powyżej opisanym sposobem.

Mutageneza CTLA4Ig na podstawie kodonu

W jednej postaci realizacji, wykorzystano mutagenezę skierowaną miejscowo i nową procedurę przesiewową, w celu identyfikacji kilku mutacji w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, która poprawia zachłanność wiązania CD86. W tej postaci realizacji, mutacji dokonano w resztach w regionach domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4 od seryny do argininy 33, nici C' (alanina 49 i treonina 51), nici F (lizyna 93, kwas glutaminowy 95 i leucyna 96) i w regionie od metioniny 97 do tyrozyny 102, tyrozyny 103 do glicyny 107 i w nici G w pozycjach glutaminy 111, tyrozyny 113 oraz izoleucyny 115. Te miejsca wybrano na podstawie badań chimerycznych białek fuzyjnych CD28/CTLA4 (Peach i inni, J. Eksp. Med., 1994, 180:2049-2058) i na modelu przewidującym, które łańcuchy boczne reszt aminokwasowych byłyby wystawione na działanie rozpuszczalnika oraz brak identyczności lub homologii reszt aminokwasowych w pewnych pozycjach między CD28 i CTLA4. Również, każda reszta, która znajduje się w ścisłej bliskości przestrzennej (5 do 20 jednostek angstromowych) w stosunku do identyfikowanych reszt, jest uważana za część niniejszego wynalazku.

Aby syntetyzować i przesiać rozpuszczalne cząsteczki mutanta CTLA4 o zmienionym powinowactwie do CD80 i/lub CD86, dostosowano strategię dwuetapową. Doświadczenia obejmowały najpierw utworzenie biblioteki mutacji przy konkretnym kodonie zewnątrzkomórkowej części CTLA4, a potem ich przesiew przez analizę BIAcore w celu identyfikacji mutantów o zmienionej reaktywności wobec CD80 lub CD86. Układ testowy Biacore (Pharmacia, Piscataway, N.J.) wykorzystuje układ detektorów powierzchniowego rezonansu plazmonowego, który zasadniczo obejmuje wiązanie kowalencyjne albo CD80Ig albo CD86Ig z płytką czujnika powlekanego dekstranem, umieszczonego w detektorze. Testową cząsteczkę można potem wstrzyknąć do komory

PL 204 899 B1 zawierającej płytkę czujnika i oszacować ilość związanego białka komplementarnego, na podstawie zmian masy cząsteczkowej, która jest fizycznie związana ze stroną płytki czujnika powleczoną dekstranem; zmianę masy cząsteczkowej można mierzyć za pomocą układu detektorowego.

Wynalazek pozwala na sporządzenie kompozycji farmaceutycznej do stosowania przy leczeniu chorób układu odpornościowego, obejmującej farmaceutycznie skuteczne ilości rozpuszczalnych, zmutowanych cząsteczek CTLA4. W pewnych postaciach, choroby układu odpornościowego są sterowane przez CD28 i/lub CTLA4-pozytywne interakcje komórkowe z komórkami pozytywnymi pod względem CD80 i/lub CD86. Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 to korzystnie rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 z sekwencją dzikiego typu i/lub rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 mające jedną lub więcej mutacji w domenie zewnątrzkomórkowe CTLA4. Kompozycja farmaceutyczna może zawierać rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 lub zmutowane cząsteczki CTLA4 i/lub cząsteczki kwasu nukleinowego, i/lub wektory kodujące te cząsteczki. Rozpuszczalna, zmutowana cząsteczka CTLA4 posiada sekwencję aminokwasową domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4 jaką ukazano w każdej fig. 3 (L104EA29Y). Rozpuszczalną, zmutowaną cząsteczka CTLA4 może być korzystnie - L104EA29YIg jak tutaj opisano i ukazano na fig. 3. Kompozycje mogą dodatkowo zawierać inne środki terapeutyczne łącznie z ś rodkami immunosupresyjnymi, NSAID, korytkosteroidami, glikokortykoidami, lekami, toksynami, enzymami, przeciwciałami lub koniugatami.

Postać realizacji kompozycji farmaceutycznej obejmuje skuteczną ilość rozpuszczalnej cząsteczki CTLA4 pojedynczo lub w kombinacji ze skuteczną ilością co najmniej jednego środka terapeutycznego, łącznie ze środkiem immunosupresyjnym lub NSAID.

Skuteczne ilości rozpuszczalnej CTLA4 w kompozycji farmaceutycznej mogą mieć zakres wynoszący około 0,1 o 100 mg/kg masy ciała podmiotu. W innej postaci, skuteczną ilością może być ilość wynosząca około 0,5 do 5 mg/kg masy ciała podmiotu, około 5 do 10 mg/kg ciężaru podmiotu, około 10 do 15 mg/kg ciężaru podmiotu, około 15 do 20 mg/kg ciężaru podmiotu, około 20 do 25 mg/kg ciężaru podmiotu, około 25 do 30 mg/kg ciężaru podmiotu, około 30 do 35 mg/kg ciężaru podmiotu, około 35 do 40 mg/kg ciężaru podmiotu, około 40 do 45 mg/kg ciężaru podmiotu około 45 do 50 mg/kg ciężaru podmiotu, około 50 do 55 mg/kg ciężaru podmiotu, około 55 do 60 mg/kg ciężaru podmiotu, około 60 do 65 mg/kg ciężaru podmiotu, około 65 do 70 mg/kg ciężaru podmiotu, około 70 do 75 mg/kg ciężaru podmiotu, około 75 do 80 mg/kg ciężaru podmiotu, około 80 do 85 mg/kg ciężaru podmiotu, około 85 do 90 mg/kg ciężaru podmiotu, około 90 do 95 mg/kg ciężaru podmiotu, około 95 do 100 mg/kg ciężaru podmiotu. W postaci realizacji, skuteczną ilością jest 2 mg/kg ciężaru podmiotu. W postaci realizacji, skuteczną ilością rozpuszczalnej cząsteczki CTLA4 jest 2 mg/kg ciężaru podmiotu. W postaci realizacji, skuteczną ilością rozpuszczalnej cząsteczki CTLA4 jest 10 mg/kg ciężaru podmiotu.

Ilość środka immunosupresyjnego podawanego podmiotowi zmienia się w zależności od kilku czynników obejmujących skuteczność leku na konkretny podmiot oraz toksyczność (czyli możliwość tolerancji) leku przez konkretny podmiot.

Metotreksat jest powszechnie podawany w ilościach około 0,1 do 40 mg tygodniowo, przy powszechnym dawkowaniu w zakresie około 5 do 30 mg tygodniowo. Metotreksat można podawać podmiotowi w różnych przyrostach: około 0,1 do 5 mg/tydzień, około 5 do 10 mg/tydzień, około 10 do 15 mg/tydzień, około 15 do 20 mg/tydzień, około 20 do 25 mg/tydzień, około 25 do 30 mg/tydzień, około 30 do 35 mg/tydzień albo około 35 do 40 mg/tydzień. W jednej postaci realizacji, skuteczną ilością środka immunosupresyjnego obejmującego metotreksat, jest ilość wynosząca około 10 do 30 mg/tydzień.

Skuteczne ilości metotreksatu wynoszą około 0,1 do 40 mg/tydzień. W jednej postaci realizacji skuteczna ilość wynosi około 0,1 do 5 mg/tydzień, około 5 do 10 mg/tydzień, około 10 do 15 mg/tydzień, około 15 do 20 mg/tydzień, około 20 do 25 mg/tydzień, około 25 do 30 mg/tydzień, około 30 do 35 mg/tydzień albo około 35 do 40 mg/tydzień. W jednej postaci realizacji metotreksat podaje się w ilości wynoszącej około 10 do 30 mg/tydzień.

Cyklofosfamid, środek alkilujący, można podawać w dawkach w zakresie około 1 do 10 mg/kg ciężaru ciała na dzień.

Cyklosporyna (np. NEORAL^R), znana także jako cyklosporyna A, podaje się powszechnie w dawkach wynoszących od około 1 do 10 mg/kg ciężaru ciała na dzień. Powszechnie stosuje się dawki w zakresie około 2,5 do 4 mg na ciężar ciała.

PL 204 899 B1

Chlorochin lub hydroksychlorochin (np. PLAQUENIL^R), podaje się powszechnie w dawkach w zakresie około 100 do 1000 mg dziennie. Korzystne dawki wynoszą około 20-600 mg w dziennym podaniu.

Sulfasalazynę (np. AZULFIDINE EN-tabsR) podaje się powszechnie w ilościach w zakresie około 50 do 5000 mg dziennie, przy typowym dawkowaniu wynoszącym około 2000 do 3000 mg dziennie dla dorosłych. Dawki dla dzieci wynoszą zazwyczaj około 5 do 100 mg/kg ciężaru ciała, do 2 gramów dziennie.

Sole złota są opracowane dla dwóch rodzajów podawania: wstrzyknięcia lub doustnego. Wstrzykiwane sole złota przepisuje się powszechnie w dawkach około 5 do 100 mg dawkowanych co dwa do czterech tygodni. Doustnie podawane sole złota przepisuje się zazwyczaj w dawkach w zakresie około 1 do 10 mg dziennie.

D-penicylaminę lub penicylaminę (CUPRIMINE^R) podaje się zwykle w dawkach około 50 do 2000 mg dziennie, przy czym korzystne dawki wynoszą około 125 mg dziennie, do 15000 mg dziennie.

Azatioprin podaje się zwykle w dawkach około 10 do 250 mg dziennie. Korzystne dawki wynoszą około 25 do 200 dziennie.

Anakinra (np. KINERET^R) jest antagonistą receptora interleukiny-1. Zwykły zakres dawkowania dla anakinry wynosi około 10 do 250 mg dziennie, przy zalecanej dawce wynoszącej około 100 mg dziennie.

Infliksimab (REMICADE^R) jest chimerycznym przeciwciałem monoklonalnym, które wiąże się z czynnikiem nekrozy nowotworu alfa (TNFa). Infliksimab podaje się zwykle w dawkach wynoszących około 1 do 20 mg/kg ciężaru ciała, co cztery do ośmiu tygodni. Dawki około 3 do 10 mg/kg ciężaru ciała można podawać co cztery do ośmiu tygodniu w zależności od podmiotu.

Etanercept (np. ENBREL^R) jest dimerycznym białkiem fuzyjnym, które wiąże czynnik nekrozy nowotworu (TNF) i blokuje interakcje z receptorami TNF. Powszechnie podawane dawki etanerceptu wynoszą około 10 do 100 mg na tydzień dla dorosłych, przy czym korzystna dawka wynosi 50 mg na tydzień. Dawki dla młodzieży wynoszą około 0,1 do 50 mg/kg ciężaru ciała na tydzień, przy maksimum wynoszącym około 50 mg na tydzień.

Leflunomid (ARAVA^R) jest powszechnie podawany w dawkach wynoszących około 1 i 100 mg na dzień. Zwykłą dzienną dawką jest około 10 do 20 mg dziennie.

Kompozycje farmaceutyczne korzystnie zawierają także odpowiednie nośniki i adiuwanty, obejmujące każdy materiał, który po połączeniu z cząsteczką według wynalazku (np. rozpuszczalną zmutowaną cząsteczką CTLA4, np. L104EA29YIg) zachowuje aktywność cząsteczki i nie jest reaktywny z układem odpornościowym podmiotu. Przykłady odpowiednich nośników i adiuwantów obejmują, lecz bez ograniczenia, ludzką albuminę surowicy; wymienniki jonowe; tlenek glinu; lecytynę; substancje buforujące, takie jak fosforany; glicynę; kwas sorbowy; sorbinian potasu; oraz sole lub elektrolity, takie jak siarczan protaminy. Inne przykłady obejmują jakiekolwiek ze standardowych nośników farmaceutycznych, takie jak roztwór soli buforowany fosforanem; woda; emulsje, takie jak emulsja olej/woda; i różne rodzaje środków nawilżających. Inne nośniki mogą także obejmować jałowe roztwory; tabletki, łącznie z tabletkami powlekanymi i kapsułkami. Zwykle, takie nośniki zawierają zaróbki, takie jak skrobia, mleko, cukier, pewne rodzaje glinki, żelatyna, kwas stearynowy lub jego sole, stearynian wapnia lub magnezu, talk, tłuszcze roślinne lub oleje, gumy, glikole lub inne znane zarobki. Takie nośniki mogą także obejmować dodatki zapachowe lub barwniki albo inne składniki. Kompozycje obejmujące takie nośniki opracowuje się dobrze znanymi, konwencjonalnymi metodami. Takie kompozycje można także opracowywać w różnych kompozycjach tłuszczowych, takich jak, np. liposomach, jak również w różnych kompozycjach polimerowych, takich jak mikrokulki polimerowe.

Kompozycje farmaceutyczne można podawać z zastosowaniem konwencjonalnych sposobów podawania włączając, lecz bez ograniczenia, podawanie dożylne (i.v.), podawanie dootrzewnowe (i.p.), podawanie domięśniowe (i.m.), podawanie podskórne, podawanie doustne, podawanie w postaci czopków lub w postaci kontaktu miejscowego, lub wszczepienia podmiotowi urządzenia do powolnego uwalniania, takiego jak pompa miniosmotyczna.

Kompozycje farmaceutyczne mogą występować w rozmaitych postaciach dawkowania, które obejmują, lecz bez ograniczenia, płynne roztwory lub zawiesiny, tabletki, pigułki, proszki, czopki, mikrokapsułki polimerowe lub mikropęcherzyki, liposomy i roztwory do wstrzyknięć lub wlewów. Korzystna postać zależy do sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.

PL 204 899 B1

Najskuteczniejszy sposób podawania i reżim dawkowania dla powyższych kompozycji zależy od ciężkości i przebiegu choroby, zdrowia pacjenta i odpowiedzi na leczenie oraz oceny lekarza leczącego. W związku z tym, dawkowanie kompozycji powinno być dopasowane do poszczególnego pacjenta.

Rozpuszczalne cząsteczki mutanta CTLA4 mogą być podawane podmiotowi w ilości i przez okres czasu (np. długość czasu i/lub wielokrotność czasu) wystarczający do zablokowania u podmiotu wiązania endogenicznych cząsteczek B7 (np. CD80 i/lub CD86) z ich odpowiednimi ligandami. Zablokowanie endogenicznego wiązania B7/ligand hamuje przez to interakcje między komórkami dodatnimi pod względem B7 (np. CD80- i/lub komórkami dodatnimi pod względem CD86), a komórkami dodatnimi pod względem CD28 i/lub CTLA4. Dawkowanie środka terapeutycznego zależy od wielu czynników obejmujących, lecz bez ograniczenia, rodzaj chorej tkanki, rodzaj leczonej choroby autoimmunologicznej, ciężkość choroby, zdrowie podmiotu i odpowiedź podmiotu na leczenie środkami. W związku z tym, dawki środków mogą się zmieniać w zależności od podmiotu i sposobu podawania. Rozpuszczalne cząsteczki mutanta CTLA4 mogą być podawane w ilości wynoszącej między 0,1 do 20,0 mg/kg ciężaru pacjenta/dzień, korzystnie między 0,5 do 10,0 mg/kg/dzień. Podawanie kompozycji farmaceutycznych sporządzanych w oparciu o wynalazek można przeprowadzać w różnym czasie. W jednej postaci realizacji, kompozycję farmaceutyczną można podawać przez jeden lub więcej godzin. Poza tym, podawanie można powtarzać w zależności od ciężkości choroby, jak również innych czynników, o jakich wiadomo w technice.

Sposoby według wynalazku

Niniejszy wynalazek pozwala na wdrożenie leczenia chorób układu odpornościowego i chorób autoimmunologicznych u podmiotu, obejmujące podawanie podmiotowi skutecznej ilości rozpuszczalnej cząsteczki CTLA4 lub zmutowanej cząsteczki CTLA4, która wiąże cząsteczki CD80 i/lub CD86 na komórkach pozytywnych pod względem Cd80 i/lub CD86 tak aby zahamować wiązanie CD80 5 i/lub CD86 z CTLA4 i/lub CD28. Metoda leczenia obejmuje podawanie kompozycji terapeutycznej, obejmującej rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 albo zmutowane cząsteczki CTLA4 według wynalazku, podmiotowi w skutecznej ilości aby ulżyć pod względem co najmniej jednego z objawów związanych z chorobami układu odpornościowego. Poza tym, wynalazek może zapewnić długoterminową terapię chorób układu odpornościowego przez blokowanie interakcji komórka T/komórka pozytywna pod względem B7, blokując przez to aktywację/stymulację komórek T poprzez sygnały kostymulatorowe, takie jak wiązanie B7 z CD28, prowadząc do indukcji anergii lub tolerancji komórek T.

Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 lub zmutowane cząsteczki CTLA4 wykazują właściwości hamujące in vivo. W warunkach występowania interakcji komórka T/komórka pozytywna pod względem B7, np. interakcji komórka T/komórka B, w wyniku kontaktu między komórkami T i komórkami pozytywnymi pod względem B7, wiązanie wprowadzonych cząsteczek CTLA4 reagujących z komórkami pozytywnymi pod względem B7, np. komórkami B, może zakłócać, czyli hamować, interakcje komórka T/komórka pozytywna pod względem B7, w wyniku czego następuje regulacja odpowiedzi odpornościowych. Inhibicja odpowiedzi komórek T przez podawanie rozpuszczalnej cząsteczki CTLA4 może być także użyteczne przy leczeniu schorzeń autoimmunologicznych. Wiele schorzeń autoimmunologicznych wynika z nieprawidłowej aktywacji komórek T, które reagują przeciwko autoantygenom, i które pobudzają produkcję cytokin i autoprzeciwciał związanych z patologią choroby. Podawanie cząsteczki L104EA29YIg podmiotowi cierpiącemu lub podejrzanemu o schorzenie autoimmunologiczne, może zapobiec aktywacji autoreaktywnych komórek T i może zredukować lub wyeliminować objawy choroby. Sposób ten może także obejmować podawanie podmiotowi cząsteczki L104EA29Yg według wynalazku, pojedynczo lub razem z dodatkowymi ligandami, takimi jak te reaktywne z IL-2, IL-4 lub γ-interferonem.

Wynalazek opisuje sposoby regulowania odpowiedzi odpornościowych. Odpowiedzi odpornościowe mogą być hamowane (redukowane) przez rozpuszczalne cząstki CTLA4 lub zmutowane cząsteczki za pomocą hamowania lub blokowania odpowiedzi odpornościowej już postępującej albo mogą obejmować zapobieganie indukcji odpowiedzi odpornościowej. Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 lub zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą hamować funkcje aktywowanych komórek T, takie jak proliferacja limfocytów T oraz wydzielanie cytokin, przez hamowanie odpowiedzi komórek T albo przez indukcję swoistej tolerancji w komórkach T, albo obie. Dalej, rozpuszczalne CTLA4 lub zmutowane cząsteczki CTLA4, zakłócając szlak CTLA4/CD28/B7 mogą hamować proliferację komórek T i/lub wydzie22

PL 204 899 B1 lanie cytokin, a więc powodując mniejsze zniszczenie tkanki i indukcję braku odpowiedzi lub anergiękomórek T.

Wynalazek dodatkowo opisuje sposoby hamowania odrzucenia przeszczepu narządu lub tkanki u podmiotu, obejmujące podawanie skutecznej ilości co najmniej jednej rozpuszczalnej cząsteczki CTLA4 lub cząsteczki CTLA4, np. L104EA29YIg, podmiotowi przed, w czasie i/lub po przeszczepie. Możliwe też jest podawanie podmiotowi co najmniej jednej rozpuszczalnej cząsteczki CTLA4 lub zmutowanej cząsteczki CTLA4 w połączeniu z co najmniej jednym innym środkiem terapeutycznym łącznie, lecz bez ograniczania, z lekiem, toksyną, enzymem, przeciwciałem lub koniugatem.

Przeszczep narządu lub tkanki może pochodzić z każdego rodzaju narządu lub tkanki zdatnej do przeszczepiania. W jednej postaci realizacji, przeszczepianą tkanką może być tkanka trzustki. Tkanką przeszczepu są także komórki wysepek trzustkowych. Wynalazek opisuje także sposoby leczenia cukrzycy typu 1 i/lub typu 2 u podmiotów, przez hamowanie odrzucenia przeszczepu komórek wysepek.

Niniejszy wynalazek dodatkowo opisuje sposób hamowania odrzucenia przeszczepu wysepek trzustkowych u podmiotu, przy czym podmiot jest biorcą tkanki przeszczepu. Zwykle przy przeszczepach tkankowych, odrzucenie przeszczepu jest zapoczątkowane przez rozpoznanie go przez komórki T jako obcego, po czym następuje odpowiedź odpornościowa, która niszczy przeszczep. Podawanie rozpuszczalnej cząsteczki CTLA4 hamuje proliferację limfocytów T i/lub wydzielanie cytokin, czego efektem jest mniejsze zniszczenie tkanki i indukcja braku odpowiedzi komórek T swoistych wobec antygenu, co może spowodować długotrwałe przyjęcie przeszczepu, bez potrzeby uogólnionej immunosupresji.

Korzystna postać realizacji wynalazku obejmuje zastosowanie rozpuszczalnej, zmutowanej cząsteczki CTLA4, L104EA29YIg do regulacji funkcjonalnych interakcji komórek pozytywnych pod względem CTLA4 i CD28 z komórkami pozytywnymi pod względem B7, do leczenia chorób układu odpornościowego, takich jak cukrzyca i/lub do osłabiania odpowiedzi odpornościowych. L104EA29YIg według wynalazku jest rozpuszczalną, zmutowaną cząsteczką CTLA4 zawierającą co najmniej dwie zmiany aminokwasowe, leucynę (L) w kwas glutaminowy (E) w pozycji +104 i alaninę (A) w tyrozynę (Y) w pozycji +29. Cząsteczka L104EA29YIg może obejmować dodatkowe mutacje poza dwiema wymienionymi w niniejszym.

Sposób może dodatkowo obejmować podawanie podmiotowi wraz z rozpuszczalnymi, zmutowanymi cząsteczkami CTLA4, podstawowego reżimu immunosupresyjnego. Podstawowy reżim immunosupresyjny może obejmować (lecz bez ograniczenia): cyklosporynę, azatioprin, metotreksat, cyklofosfamid, limfocytową globulinę odpornościową, przeciwciała anty-CD3, globulinę odpornościową Rho (D), adrenokortykosteroidy, sulfasalazynę, FK-506, metoksalen, mykofenolan mofetilu (CELLCEPT), końską globulinę przeciwko ludzkim tymocytom (THYMOGLOBULIN), sirolimus, talidomid, metotreksat, chlorochin, hydroksychlorochin, sulfasalazynę, sulfasalazopirynę, leflunomid, sole złota, D-penicylaminę, azatioprin, anakinra, infliksimab, etanercept, blokery TNFa lub środki biologiczne, które integrują z cytokiną zapalną. W korzystnej postaci realizacji, podstawowy reżim immunosupresyjny jest pozbawiony steroidów. Korzystniej, podstawowy reżim immunosupresyjny obejmuje rapamycynę i mAb przeciwko ludzkim IL-2R.

Postać realizacji wynalazku obejmuje zastosowanie cząsteczki do blokowania interakcji między B7 i CTLA4 w połączeniu ze środkiem immunosupresyjnym do regulowania odpowiedzi odpornościowej, w celu leczenia choroby układu odpornościowego, takiej jak cukrzyca. Cząsteczką stosowaną do blokowania interakcji B7/CTLA4 może być rozpuszczalna CTLA4, taka jak CTLA4Ig, CTLA4Ig/CD28 lub L104EA29YIg, rozpuszczalna CD28, taka jak CD28Ig, rozpuszczalna B7 (B7-1 lub B7-2), taka jak B7Ig, przeciwciała monoklinalne anty-CTLA4, przeciwciała monoklonalne anty-CD28 albo przeciwciała monoklonalne anty-B7.

Podmioty leczone przez zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTL4 w leku obejmują podmioty będące ssakami, włączając człowieka, małpę, małpę bezogonową, psa, kota, krowę, konia, kozę, świnię, królika, mysz i szczura.

Niniejszy wynalazek opisuje różne sposoby, miejscowe lub układowe, podawania kompozycji terapeutycznych, takich jak rozpuszczalna cząsteczka CTLA4 pojedynczo lub w połączeniu ze środkiem immunosupresyjnym i/lub innym środkiem terapeutycznym. Sposoby obejmują sposoby dożylne, domięśniowe, dootrzewnowe, doustne, przez inhalację oraz podskórne, jak również wszczepialną pompę, ciągły wlew, terapię genową, liposomy, czopki, kontakt miejscowy, pęcherzyki, kapsułki

PL 204 899 B1 i wstrzyknięcia. Środek terapeutyczny skomponowany z nośnikiem, jest zwykle liofilizowany do przechowywania i jest przywracany do postaci użytkowej za pomocą wody lub buforowanego roztworu o oboję tnym pH (pH okoł o 7-8, np. pH 7,5) przed podaniem.

Zgodnie ze standardową praktyką w technice, opisane powyżej w wynalazku kompozycje można podawać podmiotowi w każdej, farmaceutycznie dopuszczalnej postaci.

Podawanie podmiotowi rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4 odbywa się w celu regulacji interakcji komórek pozytywnych pod względem CD28 i/lub CTLA4 z komórkami pozytywnymi pod względem B7. Komórki pozytywne pod względem B7 styka się ze skuteczną ilością rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4 według wynalazku albo ich fragmentami lub pochodnymi, tak aby utworzyć rozpuszczalne kompleksy CTLA4/B7. Kompleksy zakłócają interakcję między endogenicznymi cząsteczkami CTLA4 i CD28 z cząsteczkami rodziny B7.

Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 można podawać podmiotowi w ilości i przez okres czasu (np. długość czasu i/lub wielokrotność) wystarczający do zablokowania u podmiotu wiązania endogenicznych cząsteczek B7 z ich odpowiednimi ligandami. Blokada wiązania endogeniczne B7/ligand hamuje przez to interakcje między komórkami pozytywnymi pod względem B7 i komórkami pozytywnymi pod względem CD28 i/lub CTLA4.

Dawkowanie środka terapeutycznego jest zależne od wielu czynników obejmujących rodzaj chorej tkanki, rodzaj leczonej choroby autoimmunologicznej, ciężkość choroby, zdrowie podmiotu i odpowiedź na leczenie środkami. W związku z tym, dawkowanie środków może się zmieniać w zależności od każdego podmiotu i sposobu podawania. Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 można podawać w ilości od około 0,1 do 100 mg/kg ciężaru ciała pacjenta/dzień.

Powyżej opisaną kompozycję można stosować także razem z innymi środkami farmaceutycznymi do leczenia chorób układu odpornościowego. Przykładowo, cukrzycę można leczyć cząsteczkami opisanymi w wynalazku w połączeniu ze środkami immunosupresyjnymi takimi jak kortykosteroidy, cyklosporyna (Mathiasen 1989 Cancer Lett. 44 (2):151-156), prednizon, azatioprin, metotreksat (R.Handschumacher, w: „Drugs Used for Immunosupression, strony 1264-1276), blokery albo antagoniści TNFa (New England Journal of Medicine, tom 340:253-259, 1999; The Lancet, tom 354:193239, 1999, Annals of Internal Medicine, tom 130:478-486) albo jakikolwiek inny środek biologiczny, integrujący z cytokiną zapalną, niesteroidalny lek przeciwzapalny/inhibitor Cox-2, hydroksychlorochin, sulfasalazopiryna, sole złota, etanercept, infliksimab, rapamycyna, mykofenolan mofetilu, azatioprin, tacrolimus, basiliksimab, cytoksan, interferon beta-1a, interferon beta-1b, octan glatirameru, chlorowodorek mitoksantronu, anakinra i/lub inne środki biologiczne.

Rozpuszczalne cząsteczki mutanta CTLA4 (korzystnie, L104EA29YIg) można także stosować w połączeniu z jednym lub więcej n astępujących środków, w celu regulacji odpowiedzi odpornościowej: rozpuszczalny gp39 (znany także jako ligand CD40 (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), rozpuszczalny CD29, rozpuszczalny CD40, rozpuszczalny CD80 (np. ATCC 68627), rozpuszczalny CD86, rozpuszczalny CD28 (np. ATCC 68628), rozpuszczalny CD56, rozpuszczalny Thy-1, rozpuszczalny CD3, rozpuszczalny TCR, rozpuszczalny VLA-4, rozpuszczalny VCAM-1, rozpuszczalny LECAM-1, rozpuszczalny ELAM-1, rozpuszczalny CD44, przeciwciała reaktywne z gp39 (np. ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 i ATCC HB-12056), przeciwciała reaktywne z CD40 (np. ATCC HB-9110), przeciwciała reaktywne z B7 (np. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, itd.), przeciwciała reaktywne z CD28 (np. ATCC HB11944 lub mAb 9.3 jakie opisał Martin i inni (J.Clin. Immun. 4(1):18-22, 1980), przeciwciała reaktywne z LFA-1 (np. ATCC HB-9579 i ATCC TIB-213), przeciwciała reaktywne z LFA-2, przeciwciała reaktywne z IL-2, przeciwciała reaktywne z IL-12, przeciwciała reaktywne z IFN-gamma, przeciwciała reaktywne z CD2, przeciwciała reaktywne z CD48, przeciwciała reaktywne z każdym ICAM (np. ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 i ICAM-3), przeciwciała reaktywne z CTLA4 (np. ATCC HB-304, przeciwciała reaktywne z Thy-1, przeciwciała reaktywne z CD56, przeciwciała reaktywne z CD3, przeciwciała reaktywne z CD29, przeciwciała reaktywne z TCR, przeciwciała reaktywne z VLA-4, przeciwciała reaktywne z VCAM-1, przeciwciała reaktywne z LECAM-1, przeciwciała reaktywne z ELAM-1, przeciwciała reaktywne z CD44. W pewnych postaciach realizacji korzystne są przeciwciała monoklonalne. W innych postaciach realizacji, korzystne są fragmenty przeciwciał. Jak fachowcy łatwo pojmą, kombinacje mogą obejmować rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 opisane w wynalazku i jeden inny środek immunosupresyjny, rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 z dwoma innymi środkami immunosupresyjnymi, rozpuszczalne cząsteczki CTLA4

PL 204 899 B1 z trzema innymi środkami immunosupresyjnymi, itd. Można określić optymalną kombinację i dawkowanie i optymalizować stosując metody dobrze znane w stanie techniki.

Niektóre specyficzne kombinacje obejmują następujące: L104EA29YIg i przeciwciała monoklonalne (mAb) CD80; L104EA29YIg i mAb CD86; L104EA29YIg, mAb CD80 i mAb CD86; L104EA29YIg i mAb gp39; L104EA29YIg i mAb CD40; L104EA29YIg i mAb CD28; L104EA29YIg, mAb CD80 i CD86 i mAb gp39; L104EA29YIg, mAb CD80 i CD86 i mAb CD40; i L104EA29YIg, mAb anty-LFA1, i mAb anty-gp39. Konkretnym przykładem mAb gp39 jest MR1.

Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 według wynalazku, np. L104EA29YIg, mogą być podawane jako jedyny składnik aktywny lub razem z innymi lekami w reżimie immunomodulacyjnym lub innymi środkami przeciwzapalnymi, np. przy leczeniu lub zapobieganiu ostremu lub przewlekłemu odrzucaniu alloprzeszczepu lub ksenoprzeszczepu albo schorzeń zapalnych lub autoimmunologicznych, lub aby indukować tolerancję. Przykładowo, można je stosować w kombinacji z inhibitorem kalcyneuryny, np. cyklosporyną A lub FK506; makrolitem immunosupresyjnym, np. rapamycyną lub jej pochodną; np. 40-O-(2-hydroksy)etylorapamycyną, środkiem zawracającym limfocyty, np. FTY720 lub jego analogiem; kortykosteroidami; cyklofosfamidem; azatioprenem; metotreksatem; leflunomidem lub jego analogiem; mizoribiną; kwasem mykofenolowym; mykofenolanem mofetilu; 15-deoksyspergualiną lub jej analogiem; immunosupresyjnymi przeciwciałami monoklonalnymi, np. przeciwciałami monoklonalnymi wobec receptorów leukocytów np. MHC, CD2, CDS, CD4, CD11a/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40,4-1BB lub ich ligandami; albo innymi związkami immunomodulatorowymi np. CTLA4/CD28-Ig, lub innymi inhibitorami cząsteczek adhezyjnych np. mAb lub inhibitorami o niskim ciężarze cząsteczkowym obejmującymi antagonistów LFA-1, antagonistów selektyny i antagonistów VLA-4. Związek jest szczególnie użyteczny w kombinacji ze związkiem, który zakłóca CD40 i jego ligand, np. przeciwciałami wobec CD40 i przeciwciałami wobec CD40-L.

Jeśli rozpuszczalne cząsteczki mutanta CTLA4 podaje się w połączeniu z inną terapią immunosupresyjną/immunomodulatorową lub przeciwzapalną, np. jak wymieniono powyżej, dawkowanie równocześnie podawanego związku immunosupresyjnego, immunomodulatorowego lub przeciwzapalnego będzie się oczywiście zmieniać w zależności od rodzaju leku równocześnie wykorzystywanego np. czy jest to steroid czy cyklosporyna, od konkretnego wykorzystywanego leku, od leczonego stanu i tak dalej.

Zgodnie z powyższym, niniejszy wynalazek opisuje w sposoby jakie wymieniono powyżej, obejmujące wspólne podawanie, np. równocześnie lub w kolejności, terapeutycznie skutecznej ilości rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4, np. L104EA29YIg, w postaci wolnej lub w postaci soli farmaceutycznie dopuszczalnej, oraz drugiej substancji lekowej, przy czym wymieniona druga substancja lekowa jest lekiem immunosupresyjnym, immunomodulatorowym lub przeciwzapalnym, np. jak zaznaczono powyżej.

Dodatkowo opisuje się kombinacje terapeutyczne, np. zestaw obejmujący rozpuszczalną cząsteczkę CTLA4, w postaci wolnej lub w postaci soli farmaceutycznie dopuszczalnej, do stosowania równocześnie lub kolejno, z co najmniej jedną kompozycją farmaceutyczną obejmującą lek immunosupresyjny, immunomodulatorowy lub przeciwzapalny. Zestaw może zawierać instrukcję podawania leku.

W innej postaci realizacji wynalazku, odrzucenie przeszczepu tkanki lub narządu jest hamowane przez podawanie podmiotowi rozpuszczalnej CTLA4 oraz komórek szpiku kostnego pozbawionego komórek T. Podawanie komórek szpiku kostnego pozbawionego komórek T może nastąpić w przybliżeniu w tym samym czasie kiedy podmiot otrzymuje przeszczep tkanki lub narządu, albo w innym czasie. Podanie szpiku kostnego w przybliżeniu w tym samym czasie wskazuje, że szpik kostny jest podany podmiotowi jako część przygotowań do procedur podawania przeszczepu tkankowego lub narządowego. Nie jest konieczne aby szpik kostny był przeszczepiany dokładnie w tym samym czasie (czyli w ciągu minut) co przeszczep narządu.

W korzystnym postaciach realizacji, szpik kostny pozbawiony komórek T podaje się przed przeszczepem narządu. Konkretne postacie obejmują podawanie szpiku kostnego pozbawionego komórek T w ciągu dnia, w ciągu dwunastu godzin lub w ciągu sześciu godzin przeszczepu narządu litego. Jednak szpik kostny pozbawiony komórek T można podawać wcześniej, tak długo jak ciągle osiągany jest efekt szpiku kostnego pozbawionego komórek T w związku z przeszczepem narządu lub tkanki. W alternatywnych postaciach, może być pożądane aby podać szpik kostny pozbawiony komórek T, po przeszczepieniu narządu.

PL 204 899 B1

W jednej postaci realizacji, sposób obejmuje podawanie podmiotowi dawki komórek szpiku kostnego pozbawionego komórek T (dawkę wywołującą tolerancję), a następnie podawanie podmiotowi dodatkowej dawki komórek szpiku kostnego pozbawionego komórek T (dawki wywołującej wszczepienie). W pewnych postaciach realizacji, środek immunosupresyjny obejmuje co najmniej jeden lub więcej rodzajów ligandów, które zakłócają wiązanie antygenu CD28 z antygenem CD80 i/lub CD86. Jak opisano powyżej, ligandem jest korzystnie zmutowana cząsteczka CTLA4, taka jak L104EA29YIg.

Ponadto, ilość szpiku kostnego pozbawionego komórek T można określić drogą rutynowych doświadczeń i optymalizować empirycznie. Przykładowo ilość szpiku kostnego pozbawionego komórek T można dostroić podczas rutynowych doświadczeń mających na celu określenie ilości wystarczającej do uzyskania żądanych efektów.

Sposoby według wynalazku można także praktykować przez podawanie podmiotowi, oprócz rozpuszczalnej, zmutowanej cząsteczki CTLA4, dwóch lub więcej dawek szpiku kostnego pozbawionego komórek T pojedynczo lub w kombinacji z jednym lub więcej środków immunosupresyjnych.

Jak omówiono w niniejszym w sposobach podawanie rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 lub zmutowanej cząsteczki CTLA4 można wykonać wieloma różnymi drogami, obejmującymi drogi podawania miejscowego lub układowego. Przykładowo, rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 można podawać dożylnie, domięśniowo lub dootrzewnowo. Alternatywnie, zmutowaną CTLA4 można podawać doustnie lub podskórnie. Inne metody podawania będą rozpoznane przez fachowców. Podobnie, szpik kostny pozbawiony komórek T można podawać wieloma różnymi drogami, jakie są znane fachowcom. Przykładem jest droga wlewu dożylnego.

Środek (środki) immunosupresyjny można podawać przed albo po podaniu rozpuszczalnej, zmutowanej CTLA4 i/lub przed albo po przeszczepie narządu/tkanki. Korzystnie, szpik kostny i środek immunosupresyjny podaje się przed podaniem rozpuszczalnej, zmutowanej cząsteczki CTLA4. W jednej z postaci realizacji, pierwszą dawkę szpiku kostnego pozbawionego komórek T (dawkę wywołującą tolerancję) oraz środek immunosupresyjny podaje się w przybliżeniu w tym samym czasie co przeszczep narządu.

Przedstawia się następujące przykłady w celu zilustrowania niniejszego wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Przykład ten podaje opis metod stosowanych w celu wytworzenia sekwencji nukleotydowych kodujących rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 według wynalazku. Utworzono mutanta pojedynczego miejsca L104EIg i testowano pod względem kinetyki wiązania dla CD80 i/lub CD86. Sekwencję nukleotydową L104EIg wykorzystano jako matrycę do wytworzenia zmutowanej sekwencji CTLA4 podwójnego miejsca, L104EA29YIg, którą testowano pod względem kinetyki wiązania z CD80 i/lub CD86.

Mutageneza CTLA4Ig na podstawie kodonu:

Strategię mutagenezy i przesiewu wykorzystano do zidentyfikowania zmutowanych cząsteczek CTLA4Ig, które odznaczały się niższym tempem dysocjacji (szybkości „off) od wiązana cząsteczek CD86. Utworzono sekwencje nukleotydowe zmutowane w jednym miejscu, stosując CTLA4Ig jako matrycę (opisy patentowe nr US: 5 844 095; 5 851 795; i 5 885 796; numer dostępu ATCC 68629). Zaplanowano mutagenne primery oligonukleotydowe PCR do losowej mutagenezy specyficznego kodonu cDNA pozostawiając zasady w pozycjach 1 i 2 kodonu, lecz tylko guaninę lub tyminę w pozycji 3 (XXG/T; znany także jako NNG/T). W ten sposób, specyficzny kodon kodujący aminokwas mógł być losowo zmutowany tak aby kodował każdy z 20 aminokwasów. Pod tym względem, mutageneza XXG/T dała 32 potencjalne kodony kodujące każdy z 20 aminokwasów. Produkty PCR kodujące mutacje w ścisłej bliskości w stosunku do -M97-G107 CTLA4Ig (patrz fig. 1 lub 2), poddano trawieniu Sacl/Xbal i subklonowano do podobnie pociętego wektora ekspresji nLN CTLA4Ig. Metodę tę wykorzystano do wytworzenia cząsteczki CTLA4, L104EIg, zmutowanej w pojedynczym miejscu.

Dla mutagenezy w pobliżu S25-R33 CTLA4Ig, wprowadzono najpierw ciche miejsce restrykcji Nhel, 5' w stosunku do tej pętli, przez mutagenezę kierowaną przez primer PCR. Produkty PCR poddano trawieniu Nhel/Xbal i subklonowano do podobnie pociętych wektorów ekspresji CTLA4Ig lub L104EIg. Metodę tę wykorzystano do wytworzenia cząsteczki CTLA4 L104EA29YIg zmutowanej w podwójnym miejscu (fig. 3). W szczególności, wykorzystano cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego cząsteczkę CTLA4 zmutowaną w pojedynczym miejscu, L104EIg, jako matrycę do wytworzenia cząsteczki CTLA4 zmutowanej w dwóch miejscach, L104EA29YIg.

PL 204 899 B1

P r z y k ł a d 2

W przykładzie tym podaje się opis metod przesiewowych stosowanych do identyfikacji polipeptydów CTLA4 zmutowanych w pojedynczym i podwójnym miejscu, które uległy ekspresji z konstrukcji opisanych w przykładzie 1, które wykazywały wyższą zachłanność wiązania antygenów CD80 i CD86, w porównaniu z niezmutowanymi cząsteczkami CTLA4Ig.

Aktualne badania in vitro i in vivo pokazują, że sama CTLA4Ig jest niezdolna do pełnego zablokowania pobudzenia swoistych wobec antygenu, aktywowanych komórek T. Badania in vitro z CTLA4Ig i albo przeciwciałem monoklonalnym specyficznym dla CD80 albo dla CD86 mierzące inhibicję proliferacji komórek T pokazują, że przeciwciało monoklonalne anty-CD80 nie wzmacnia inhibicji CTLA4Ig. Jednak przeciwciało monoklonalne anty-CD86 wzmocniło inhibicję pokazując, że CTLA4Ig nie blokowało tak skutecznie interakcji CD86. Dane te podtrzymują wcześniejsze odkrycia Lindley i innych (Immunity, (1994), 1:793-801) ukazujące, że inhibicja odpowiedzi komórkowych za pośrednictwem CD80 wymagała w przybliżeniu 100-krotnie niższego stężenia CTLA4Ig niż dla odpowiedzi za pośrednictwem CD86. Na podstawie tych odkryć przypuszczano, że rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 o wyższej zachłanności dla CD86 niż dzikiego typu CTLA4 powinny lepiej blokować pobudzenie komórek aktywowanych, specyficznych wobec antygenu, niż CTLA4Ig.

W tym celu, rozpuszczalne, zmutowane cząsteczki CTLA4 opisane w przykładzie 1 powyżej, przesiano przy użyciu nowej procedury przesiewowej, w celu identyfikacji kilku mutacji w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, która poprawia zachłanność wiązania dla CD80 i CD86. Ta strategia przesiewowa zapewniała skuteczną metodę bezpośredniej identyfikacji mutantów przy wyraźniej niższych wskaźnikach „off, bez potrzeby oczyszczania białka lub oceny ilościowej, ponieważ określenie współczynnika „off jest niezależne od stężenia (O'Shannessy i inni, (1993) Anal. Biochem., 212:457-468).

Komórki COS transfekowano poszczególnym plazmidowym DNA oczyszczonym metodą miniprep i namnażano przez kilka dni. Kondycjonowane przez trzy dni pożywki hodowlane nałożono na płytki bioczujnika BIAcore (Pharmacia Biotach AB, Uppsala, Szwecja) opłaszczone rozpuszczalnym CD80lg lub CD86Ig. Swoiste wiązanie i dysocjację zmutowanych białek mierzono metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (O'Shannessy, D.J., i inni, (1993) Anal. Biochem. 212:4 57-4 68). Wszystkie doświadczenia przeprowadzono na bioczujnikach BIAcore™ lub BIAcore™ 2000, w temperaturze 25°C. Ligandy unieruchomiono na płytkach czujników badawczych NCM5 (Pharmacia), przy użyciu standardowego sprzęgania N-etylo-N'-(dimetyloaminopropylo)karbodiimido-N-hydroksysukcynoimidowego (Johnsson, B., i inni (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277; Khilko, S.N. i inni (1993) J. Biol. Chem 268:5425-15434.

Metoda przesiewowa

Komórki COS, hodowane w 24 studzienkowych płytkach do hodowli tkankowej, transfekowano krótkotrwale DNA kodującym zmutowane CTLA4Ig. Pożywki hodowlane zawierające wydzielone, rozpuszczalne, zmutowane CTLA4Ig zebrano 3 dni później.

Kondycjonowane pożywki hodowlane komórek COS pozostawiono do przepływu przez płytki bioczujników BIAcore derywatyzowane CD86Ig lub CD80lg (jak opisano u Greene i inni, 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771) i zmutowane cząsteczki zidentyfikowano za pomocą pomiaru szybkości „off, które były wolniejsze niż obserwowane dla dzikiego typu CTLA4Ig. cDNA odpowiadające wybranym próbkom pożywek poddano sekwencjonowaniu i wytworzono DNA aby przeprowadzić krótkotrwałą transfekcję komórek COS na większą skalę, z której sporządzono zmutowane CTLA4Ig białko, w następstwie oczyszczania pożywek hodowlanych z użyciem białka A.

Warunki analizy BIAcore i analizę danych równowagi wiązania przeprowadzono jak opisano u J. Greene i inni 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771, i jaką opisano w niniejszym.

Analiza danych BIAcore

Linie podstawowe zapisu odczytu czujników znormalizowano do zerowych jednostek odpowiedzi (RU), przed analizą. Próbki przepuszczono przez pozornie derywatyzowane płynące komórki, w celu ustalenia wartości jednostki odpowiedzi tła (RU), z powodu różnic zbiorczego wskaźnika refrakcji między roztworami. Stałe równowagi dysocjacji (Kd) obliczono z wykresów Req przeciwko C, gdzie Req oznacza odpowiedź stanu stabilności minus odpowiedź na pozornie derywatyzowanej płytce, a C oznacza stężenie molowe analitu. Krzywe wiązania analizowano przy użyciu rynkowego programu komputerowego nieliniowego dopasowania krzywej (Prism, GraphPAD Software).

PL 204 899 B1

Dane doświadczalne dopasowano najpierw do modelu wiązania pojedynczego liganda z pojedynczym receptorem (model 1-miejscowy, czyli prosty układ Langmuir, A+B> >AB), a stałe równowagi asocjacji (K_d=[AHB]\[AB]) obliczono z równania R=R_max^C\(Kd+C). Następnie, dane dopasowano do najprostszego dwumiejscowego modelu wiązania liganda (czyli z receptorem mającym dwa nieoddziałujące, niezależne miejsca wiązania, jakie opisano przez równanie ^R=Rmax1 •C\(K_d1+C)+Rmax2<\(K_d2+C)).

Jakość dopasowania tych dwóch modeli analizowano wizualne przez porównanie z danymi doświadczalnymi i statystycznie, testem F sumy kwadratów. Prostszy, jednomiejscowy model wybrano jako najlepsze dopasowanie, o ile model dwumiejscowy nie pasował istotnie lepiej (p<0,1).

Analizy asocjacji i dysocjacji przeprowadzono z użyciem oceny BIA 2.1 Software (Pharmacia). Stałe szybkości asocjacji kon obliczono dwoma sposobami, zakładając zarówno jednorodne interakcje jednomiejscowe jak i równoległe interakcje dwumiejscowe. Dla interakcji jednomiejscowych, wartości kon obliczono zgodnie z równaniem Rt=Req(1-exp^-ks(t-t0), gdzie Rt oznacza odpowiedź w danym czasie t; R_eq oznacza odpowiedź w stanie stabilnym; t₀ oznacza czas początku wstrzyku; i k_s=dR/dt=k_on<k_off, i gdzie C oznacza stężenie analitu, obliczone pod względem miejsc wiązania monomerowego. Dla interakcji dwumiejscowych wartości kon obliczono zgodnie z równaniem Rt=Req(1-exp-^ks1(t-t0)+Req2(1-exp^-ks1(t-t0). Dla każdego modelu, wartości kon określono z obliczonego spadku (do około 70% maksymalnej asocjacji) wykresów ks przeciwko C.

Dane dysocjacji analizowano zgodnie z modelem jednomiejscowym (AB=A+B) lub dumiejscowym (AiBj=Ai+Bj) i stałe szybkości (koff) obliczono z najlepszych dopasowań do krzywych. Stosowano model miejsca wiązania z wyjątkiem, gdy resztki były większe niż tło urządzenia (2-10 RU, według maszyny), w którym to przypadku wykorzystano model wiązania dwumiejscowego. Połowiczny czas zajęcia receptora obliczono przy użyciu związku t1/2=0,693/koff.

Cytometria przepływowa:

Mysie mAb L307.4 (anty-CD80) nabyto od Becton Dickinson (San Jose, California) i IT2.2 (anty-B7-0 [znane także jako CD86]), od Pharmingen (San Diego, California). Do barwienia immunologicznego, komórki CHO dodatnie pod względem CD80 i/lub dodatnie pod względem CD86 usunięto z ich naczyń hodowlanych przez inkubację w roztworze buforowanym fosforanem (PBS) zawierającym 10mM EDTA. Komórki CHO (1-10 x 10⁵) inkubowano najpierw z mAb lub białkami fuzyjnymi immunogobulin w DMEM zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), następnie przemyto i inkubowano z odczynnikami drugiego etapu, kozią anty-mysią lub anty-ludzką immunoglobuliną, sprzężoną z izocyjanianem fluoresceiny (Tago, Burlingame, California). Komórki poddano końcowemu myciu i analizowano na FACScan (Becton Dickinson).

SDS-PAGE i chromatografia żelowa

SDS-PAGE przeprowadzono na żelach akrylamidowych Tris/glicyna 4-20% (Novex, San Diego, CA). Żele analityczne wybarwiono Coomassie Blue, a obrazy wilgotnych żeli otrzymano przez skanowanie cyfrowe. CTLA4Ig (25 μg) i L104EA29YIg (25 μg) analizowano poprzez chromatografię żelową stosując kolumnę TSK-GEL G300 SWXL (7,8 x 300mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA) zrównoważoną w roztworze soli buforowanej fosforanem, zawierającym 0,02% NAN3, przy prędkości przepływu wynoszącej 1,0 ml/minutę.

CTLA4XC120S i L104EA29YXC120S.

Wytworzono pojedynczy łańcuch CTLA4KSC120S jak opisano poprzednio (Linsley i inni, (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424). W skrócie, plazmid ekspresji onkostatyny M CTLA4 (OMCTLA4) wykorzystano jako matrycę, wybrano primer zgodny, GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG (SEQ ID nr:17) aby dopasować sekwencje w wektorze; i primer odwrotny, GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC (SEQ ID nr:18) który odpowiadał ostatnim siedmiu aminokwasom (czyli aminokwasom 118-124) w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4 i zawierał miejsce dla enzymu restrykcyjnego oraz kodon przestankowy (TGA). Primer odwrotny wykazywał mutację C120S (cysteiny na serynę w pozycji 120). W szczególności, sekwencja nukleotydowa GCA (nukleotydy 34-36) primera odwrotnego ukazanego powyżej, jest zastąpiona jedną z następujących sekwencji nukleotydowych: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, lub GCT. Jak specjaliści łatwo będą rozumieć, sekwencja nukleotydowa GCA jest odwrotną sekwencją komplementarną dla kodonu TGC dla cysteiny. Podobnie, sekwencje nukleotydowe AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, lub GCT są odwrotnymi sekwencjami komplementarnymi kodonów dla seryny. Produkty reakcji łańcuchowej polimerazy poddano trawieniu HindIII/XbaI i kierunkowo subklonowano do wektora ekspresji nLN (Bristol-Myers Squ28

PL 204 899 B1 ibb Company, Princeton, NJ). L104EA29YXC120S wytworzono w identyczny sposób. Każdą konstrukcję weryfikowano przez sekwencjonowanie DNA.

Identyfikacja i charakteryzacja biochemiczna mutantów o wysokiej zachłanności

Wybrano dwadzieścia cztery aminokwasy do mutagenezy i uzyskane -2300 zmutowanych białek testowano pod względem wiązania CD86Ig przez powierzchniowy rezonans plazmonowi (SPR; jak opisano wyżej). Przeważające efekty w każdym miejscu są omówione w tablicy II. Losowa mutageneza niektórych aminokwasów w S25-R33 najwyraźniej nie zmieniła wiązania liganda. Mutageneza E31 i R33 i reszt M97-Y102 najwyraź niej spowodował a osł abienie wią zania liganda.

Mutageneza reszt S25, A29 i T30, K93, L96, Y103, L104 i G105, spowodowała otrzymanie białek o powolnym wskaźniku „on i/lub powolnym „off. Te wyniki potwierdzają wcześniejsze odkrycia, że reszty w regionie S25-R33 i reszty w M97-Y102 lub obok, mają wpływ na wiązanie liganda (Peach i inni, (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058).

Mutageneza miejsc S25, T30, K93, L96, Y103 i G105 umożliwiła identyfikację niektórych zmutowanych białek, które miały wolniejsze szybkości „off od CD86lg. Jednakże, w tych przypadkach, powolny wskaźnik „off był zakłócany przez powolny wskaźnik „on, w wyniku czego uzyskano zmutowane białka o całkowitej zachłanności dla CD86Ig, która była najwyraźniej podobna do obserwowanej przy dzikiego typu CTLA4Ig. Poza tym, mutageneza K93 powodowała znaczącą agregację, która mogła być odpowiedzialna za obserwowane zmiany kinetyki.

Losowa mutageneza L104, po czym transfekcja komórek COS i przesiew przez SPR próbek pożywek hodowlanych przez unieruchomioną CD86lg, dały sześć próbek pożywek zawierających zmutowane białka o około 2-krotnie wolniejszym wskaźniku „off, niż dzikiego typu CTLA4Ig. Po sekwencjonowaniu odpowiadającego cDNA tych mutantów, okazało się, że każdy koduje mutacje leucyny do kwasu glutaminowego (L104E). Najwyraźniej, substytucja leucyny 104 do kwasu asparaginowego (L104D) nie wpływała na wiązanie CD86Ig.

Mutagenezę powtórzono następnie w każdym miejscu wymienionym w tablicy II, tym razem stosując L104E jako matrycę PCR, zamiast dzikiego typu CTLA4Ig, jak opisano powyżej. Analiza SPR, ponownie z użyciem unieruchomionej CD86Ig, zidentyfikowała sześć próbek pożywki hodowlanej z mutagenezą alaniny 29, z białkami mającymi w przybliżeniu 4-krotnie wolniejsze szybkości „off niż dzikiego typu CTLA4Ig. Najwolniejsze były substytucje tyrozyny (L104EA29Y), dwie były leucyny (L104EA29L), jedną był tryptofan (L104EA29W) i jedną była treonina (L104EA29T). Najwyraźniej, nie zidentyfikowano mutantów o powolnych wskaźnikach „off dla losowej mutacji samej alaniny 29, w dzikiego typu CTLA4Ig.

Względne ciężary cząsteczkowe i stan agregacji oczyszczonych L104E i L104EA29YIg szacowano przez SDS-PAGE i chromatografię żelową. L104EA29YIg (~1 μg; tor 3) i L104EIg (~1 μg; tor 2) najwyraźniej miały taką samą ruchliwość elektroforetyczną jak CTLA4Ig (~1 μg; tor 1) w warunkach redukujących (~50kDa; +eME; plus 2-merkaptoetanol) i nieredukujących (~100kDa; -eME) (fig. 14A). Chromatografia żelowa pokazała, że L104EA29YIg (fig. 14C) najwyraźniej miał taką samą ruchliwość jak dimeryczny CTLA4Ig (fig. 14B). Główne piki przedstawiają białka dimeryczne, podczas gdy szybciej wymywający się pomniejszy pik w fig. 14B przedstawia agregaty o wyższym ciężarze cząsteczkowym. W przybliżeniu 5,0% CTLA4Ig występowało w postaci agregatów o wyższym ciężarze cząsteczkowym, lecz nie było dowodów agregacji L104EA29YIg lub L104EIg. Zatem, silniejsze wiązanie z CD86lg widoczne dla L104EIg i L104EA29YIg nie mogło być przypisane agregacji indukowanej przez mutagenezę.

Analiza równowagi i kinetyki wiązania

Przeprowadzono analizę równowagi i kinetyki wiązania na CTLA4Ig, L104EIg i L104EA29YIg oczyszczonych za pomocą białka A, z użyciem powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR). Wyniki są ukazane w tablicy I. Obserwowane stałe równowagi dysocjacji (Kd; tablica I) obliczono z krzywych wiązania wygenerowanych w zakresie stężeń (5,0-200 nM). L104EA29YIg wiąże silniej CD86lg niż L104EIg lub CTLA4Ig. Niższa Kd L104EA29YIg (3,21 nM) niż L104EIg (6,06 nM) lub CTLA4Ig (13,9 nM) wskazuje na wyższą zachłanność wiązania L104EA29YIg z CD86lg. Niższa Kd L104EA29YIg (3,66 nM) niż L104EIg (4,47 nM) lub CTLA4Ig (6,51 nM) wskazuje na wyższą zachłanność wiązania L104EA29YIg z CD80Ig.

Analiza kinetyki wiązania ujawniła, że porównywalne szybkości „on dla wiązania CTLA4Ig, L104EIg i L104EA29YIg z CD80 były podobne, jak szybkości „on dla CD86Ig (tablica I). Jednakże, szybkości „off dla tych cząsteczek nie były równe (tablica I). W porównaniu z CTLA4Ig, L104EA29YIg miała szybkość „off w przybliżeniu 2-krotnie wolniejszą od CD80lg i w przybliżeniu

PL 204 899 B1

4-krotnie wolniejszą szybkość „off od CD86Ig. L104E miał szybkości „off pośrednie między L104EA29YIg i CTLA4Ig. Ponieważ wprowadzenie tych mutacji nie wpływało znacząco na szybkości „on, zwiększenie zachłanności wobec CD80Ig i CD86lg obserwowanej dla L104EA29YIg, było prawdopodobnie spowodowane przede wszystkim zmniejszeniem szybkości „off.

Aby określić, czy zwiększenie zachłanności L104EA29YIg wobec CD86Ig i CD80Ig było spowodowane mutacjami mającymi wpływ na sposób asocjacji każdego monomeru do dimeru, lub czy istniały zmiany strukturalne zwiększające zachłanność, wprowadzone do każdego monomeru, wytworzono konstrukcje o pojedynczym łańcuchu domen zewnątrzkomórkowych CTLA4 i L104EA29Y, po czym przeprowadzono mutagenezę cysteiny 120 do seryny, jak opisano wyżej i przez Linsley i inni, (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424. W wyniku chromatografii żelowopermeacyjnej okazało się, że oczyszczone białka CTLA4XC120S i L104EA29YXC120S są monomerami (Linsley i inni,. (1995), jak wyżej), przed analizą ich właściwości wiązania liganda przez SPR. Wyniki pokazały, że powinowactwo wiązania obu białek monomerycznych wobec CD86Ig było w przybliżeniu 35-80-krotnie mniejsze niż obserwowane dla ich odpowiadających dimerów (tablica I). Potwierdza to wcześniej opublikowane dane stanowiące, że dimeryzacja CTLA4 jest konieczna dla wysokiej zachłanności wiązania liganda (Greene i inni, (1996) J. Biol. Chem., 271:26762-26771).

L104EA2 9YXC120S wiązał się z około 2-krotnie wyższym powinowactwem niż CTLA4XC120S zarówno z CD80lg jak i CD86lg. Większe powinowactwo było spowodowane około 3-krotnie wolniejszą szybkością dysocjacji od obu ligandów. Zatem, silniejsze wiązanie liganda przez L104EA29Y było najprawdopodobniej raczej spowodowane zmianami strukturalnymi wzmacniającymi zachłanność, które zostały wprowadzone dla każdego łańcucha monomerowego, niż zmianami, w których dimeryzowała cząsteczka.

Położenie i analiza strukturalna mutacji wzmacniających zachłanność

Strukturę roztworu zewnątrzkomórkowej domeny podobnej do IgV CTLA4 określono ostatnio przez spektroskopię NMR (Metzler i inni, (1997) Nature Struct. Biol., 4:527-531. Pozwoliło to na dokładne umiejscowienie leucyny 104 i alaniny 29 w złożeniu trójwymiarowym (fig. 15A-B). Leucyna 104 jest umiejscowiona obok wysoko zakonserwowanej sekwencji aminokwasowej MYPPPY. Alanina 29 jest umiejscowiona obok końca C regionu S25-R33, który przestrzennie sąsiaduje z regionem MYPPPY. Mimo, że istnieje znacząca interakcja między resztami u podstawy tych dwóch regionów, najwyraźniej nie ma bezpośredniej interakcji między L104 i A29 choć obie obejmują część przyległą rdzenia hydrofobowego w białku. Konsekwencje strukturalne dwóch mutantów wzmacniających zachłanność oszacowano przez modelowanie. Mutację A29Y można łatwo dostosować do szczeliny między regionem S25-R33 i regionem MYPPPY, i może to służyć stablilizacji konformacji regionu MYPPPY. W dzikiego typu CTLA4, L104 tworzy rozległe interakcje hydrofobowe z L96 i V94 obok regionu MYPPPY. Jest wysoce nieprawdopodobne, że mutacja kwasu glutaminowego dostosowuje konformację podobnie jak L104, z dwóch powodów. Po pierwsze, nie ma wystarczającej przestrzeni aby dostosować dłuższy łańcuch boczny kwasu glutaminowego do struktury, bez znacznego zakłócania regionu S25-R33. Po drugie, koszty energetyczne ukrywania ujemnego ładunku łańcucha bocznego kwasu glutaminowego w regionie hydrofobowym, byłby wielki. Zamiast tego, badania modelowania przewidują, że łańcuch boczny kwasu glutaminowego zostanie wyrzucony na powierzchnię, gdzie jego ładunek może być stabilizowany przez solwatację. Taka zmiana konformacyjna może być dostosowana do G105, przy minimalnym zaburzeniu w stosunku do innych reszt w regionach.

Wiązanie mutantów o wysokiej zachłanności z komórkami CHO wykazującymi ekspresję CD80 lub CD865 Przeprowadzono analizę FACS (Fig. 9) wiązania CTLA4Ig i cząsteczek mutanta ze stabilnie transfekowanymi komórkami CHO CD80+ i CD86+, jak opisano w niniejszym. Komórki CHO pozytywne pod względem CD80 i pozytywne pod względem CD86 inkubowano ze wzrastającymi stężeniami CTLA4Ig, L104EA29YIg lub L104EIg, a następnie przemyto. Związane immunoglobulinowe białko fuzyjne wykrywano przy użyciu sprzężonej z izocyjanianem fluoresceiny, koziej immunoglobuliny anty-ludzkiej.

Jak ukazano w fig. 9, komórki CHO dodatnie pod względem CD80 lub dodatne pod względem CD86 (1,5x10⁵) inkubowano z określonymi stężeniami CTLA4Ig (pełne kwadraty), L104EA29YIg (kółka) lub L104EIg (trójkąty) przez 2 godziny w temperaturze 23°C, przemyto i inkubowano ze sprzężonym z izocyjanianem fluoresceiny, kozim, anty-ludzkim przeciwciałam immunoglobulinowym. Wiązanie analizowano na całkowitej ilości 5,000 żywych komórek (pojedyncze określenie) na FACScan, a średnią intensywność fluorescencji (MFI) określono z histogramów danych przy użyciu PC-LYSYS. Dane

PL 204 899 B1 korygowane pod względem fluorescencji tła mierzono na komórkach inkubowanych jedynie z odczynnikami drugiego etapu (MFI = 7). Kontrolne mAb L6 (80 μg/ml) dało MFI < 30. Te wyniki są reprezentatywne dla czterech niezależnych doświadczeń.

Wiązanie L104EA29YIg, L104EIg i CTLA4Ig z ludzkimi komórkami CHO transfekowanymi CD80 jest w przybliżeniu równe (fig. 2A). L104EA29YIg i L104EIg wiążą się silniej z komórkami CHO stabilnie transfekowanymi ludzkim CD86, niż CTLA4Ig (fig. 2B).

Testy funkcjonalne:

Ludzkie komórki T, pozytywne pod względem CD4 wyizolowano przez immunomagnetyczną selekcję ujemną (Linsley i inni, (1992) J. Exp. Med. 176:1595-1604). Wyizolowane komórki T pozytywne pod względem CD4 stymulowano mirystynianooctanem forbolu (PMA) plus komórki CHO pozytywne pod względem CD80 lub pozytywne pod względem CD86, w obecności mianowanych stężeń inhibitora. Komórki pozytywne pod względem CD4 (8-10 x 10⁴/studzienkę) hodowano w obecności 1 nM PMA z napromieniowanymi stymulatorami komórek CHO lub bez. Odpowiedzi proliferacyjne mierzono przez dodanie 1 μCi/studzienkę [3H] tymidyny, podczas końcowych 7 godzin 72 godzinnej hodowli. Przeprowadzono inhibicję komórek T stymulowanych PMA plus CHO pozytywnych pod względem CD80 lub CHO pozytywnych pod względem CD86, przez L104EA29YIg i CTLA4Ig. Wyniki są ukazane w fig. 10. L104EA29YIg hamuje proliferację pozytywnych pod względem CD80 komórek CHO traktowanych PMA bardziej niż CTLA4Ig (fig. 10A). L104EA29YIg jest także skuteczniejszy niż CTLA4Ig jeśli chodzi o inhibicję proliferacji pozytywnych pod względem CD86 komórek CHO traktowanych PMA (fig. 10B). Zatem, L104EA29YIg jest silniejszym inhibitorem kostymulacji komórek T za pośrednictwem zarówno CD80 jak i CD86.

Fig. 11 ukazuje inhibicję przez L104EA29YIg i CTLA4Ig allostymulowanych ludzkich komórek T przygotowanych powyżej i dodatkowo allostymulowanych ludzką linią komórkową limfoblastoidu B (LCL) zwaną PM, która wykazywała ekspresję CD80 i CD86 (komórki T w ilości 3,0 x 10⁴/studzienkę i PM w ilości 8,0 x 10³/studzienkę). Pierwotna alostymulacja następowała przez 6 dni, następnie komórki poddano impulsom [3H]tymidyny przez 7 godzin, przed określeniem wprowadzonego radioznacznika.

Wtórną allostymulację przeprowadzono w następujący sposób. Siedmiodniowe, pierwotnie allostymulowane komórki T zebrano na pożywkę rozdzielającą limfocyty (LSM) (ICN, Aurora, OH) i pozostawiono na 24 godziny. Następnie komórki T ponownie stymulowano (wtórnie), w obecności mianowanych ilości CTLA4Ig lub L104EA29YIg, przez dodanie PM w takim samym stosunku jak powyżej. Stymulacja następowała przez 3 dni, potem komórki poddano impulsom radioznacznika i zbierano jak powyżej. Wpływ L104EA29YIg na pierwotnie allostymulowane komórki T jest ukazany w fig. 11A. Wpływ L104EA29YIg na wtórnie allostymulowane komórki T jest ukazany w fig. 11B. L104EA29YIg hamuje zarówno pierwotne jak i wtórne odpowiedzi proliferacyjne komórek T lepiej niż CTLA4Ig.

Aby zmierzyć wytwarzanie cytokin (fig. 12), przygotowano podwójne płytki, wtórnie allostymulowane. Po 3 dniach, pożywki hodowlane testowano przy użyciu zestawów ELISA (Biosource, Camarillo, CA) stosując warunki zalecane przez producenta. Okazało się, że L104EA29YIg jest silniejsza niż CTLA4Ig pod względem blokowania wytwarzania cytokin IL-2, IL-4, i γ-IFN przez komórki T w następstwie wtórnego bodźca alogenicznego (fig. 12A-C).

Wpływ L104EA29YIg i CTLA4Ig na odpowiedź małpich mieszanych limfocytów (MLR) jest ukazany w fig. 6. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC; 3,5x10⁴ komórek/studzienkę dla każdej małpy) od 2 małp, oczyszczono na pożywce do rozdzielania limfocytów (LSM) i wymieszano z 2 μg/ml fitohemaglutyniny (PHA). Komórki stymulowano 3 dni, następnie poddano impulsom radioznacznika 16 godzin przed zbiorem. L104EA29YIg hamował proliferację małpich komórek T lepiej niż CTLA4Ig.

T a b l i c a I:

Stałe równowagi i widocznej kinetyki podano w następującej tablicy (wartości oznaczają średnie ± odchylenie standardowe z trzech różnych doświadczeń):

Unieruchomione białko	Analit	kon (x10⁵) M¹ S¹	koff (x10^-3) s^-1	Kd nM
1	2	3	4	5
CD80Ig	CTLA4Ig	3,44 ± 0,29	2,21 ± 0,18	6,51 ± 1,08
CD80Ig	L104EIg	3,02 ± 0,05	1,35 ± 0,08	4,47 ± 0,36

PL 204 899 B1 cd. tablicy I

i	2	3	4	5
CD8OIg	L1O4EA29YIg	2,96 ± O,2O	1,08 ± O,O5	3,66 ± 0,41
CD8OIg	CTLA4Xci20s	12,0 ± 1,0	23O ± 1O	195 ± 25
CD8OIg	L104EA29YXci20s	8,3 ± O,26	71 ± 5	85,O ± 2,5
CD86Ig	CTLA4Ig	5,95 ± O,57	8,16 ± 0,52	13,9 ± 2,27
CD86Ig	L1O4EIg	7,O3 ± O,22	4,26 ± 0,11	6,06 ± O,O5
CD86Ig	L1O4EA29YIg	6,42 ± O,4O	2,06 ± 0,03	3,21 ± 0,23
CD86lg	CTLA4Xci2os	16,5 ± O,5	84O ± 55	511 ± 17
CD86Ig	L1O4EA29YXci2os	11,4 ± 1,6	3OO ± 10	267 ± 29

T a b l i c a II

Wpływ na wiązanie CD86lg przez mutagenezę CTLA4Ig w wymienionych miejscach był określony przez SPR, opisany jak wyżej. Przeważający wpływ jest zaznaczony znakiem „+.

Miejsce mutagenezy	Wpływ na mutagenezę
	Brak widocznego wpływu	Powolna szybkość on/ powolna szybkość „off	Zmniejszone wiązanie liganda
S25		+
P26	+
G27	+
K28	+
A29		+
T3O		+
E31			+
R33			+
K93		+
L96		+
M97			+
Y98			+
P99			+
Pioo			+
P1O1			+
Y1O2			+
Y1O3		+
L1O4		+
G1O5		+
1106
G1O7	+
Q111	+
Y113	+
1115	+

PL 204 899 B1

P r z y k ł a d 3

Przykład ten podaje opis wycięcia trzustki dawcy i izolację wysepki oraz procedury przeszczepu wysepki w modelu zwierzęcym.

Materiały i metody

Zwierzęta. Hodowane w niewoli, dorastające samce małpy rezus (Macaca mulatta) (~4-20 kg) wykorzystano jako biorców i dawców. Brak u biorców wstępnie wytworzonych przeciwciał swoistych wobec dawcy, potwierdzono przed przeszczepem. Wszystkich potencjalnych dawców i biorców testowano pod względem przeciwciała anty-CMV i tylko zwierzęta seropozytywne pod względem CMV wykorzystano jako biorców.

Wycięcie trzustki dawcy i izolacja wysepek. Wycięcie trzustki dawcy przeprowadzono jeden dzień przed przeszczepem. Procedurę przeprowadzono w ogólnym znieczuleniu (kombinacja pozajelitowej ketaminy i izofluranu wziewnie) poprzez środkowe nacięcie brzucha. Więzadło śledziony i nerek oraz śledziony i okrężnicy podzielono tak, że śledziona, wraz z ogonem trzustki były ruchome. Głowę trzustki oraz drugą część dwunastnicy uruchomiono w następstwie manewru Kochera. Po podaniu heparyny (200 U/kg) cewnikowano aortę tuż powyżej rozgałęzienia i zwierzę wykrwawiono. Zimny, na poły roztopiony lód umieszczono natychmiast w mniejszej torbie i za korpusem trzustki. Korpus i szyję trzustki ostrożnie odcięto ostrym cięciem, uważając aby nie naruszyć torebki trzustkowej. Wspólny przewód żółciowy, główny i pomocniczy przewód trzustkowy zidentyfikowano i podwiązano, a głowę trzustki odcięto od drugiej części dwunastnicy.

Izolację wysepek od małp rezus zakończono poprzez mniejsze modyfikacje automatycznej metody izolacji ludzkich wysepek (Ricordi (1988) Diabetes, 37:413; Ranuncoli (2000) Cell Trasplant 9:409) stosując Liberase (Roche/Boehringer Mannheim, Indpls, IN) o stężeniu wynoszącym 0,47-0,71 mg/ml. Trzywarstwowy, nieciągły gradient Euroficoll (gęstości 1,108, 1,097, 1,037; Meditech, Herndon, VA oraz procesor dla komórek krwi Cobe 2991 (Gambro, Lakewood, CO) wykorzystano do oczyszczenia wysepek z produktów trawienia trzustkowego. Próbki końcowego preparatu wysepek wybarwiono z użyciem barwnika dithizone (Sigma, St. Louis, MO) i preparat oceniono przez obliczenie liczby wysepek w każdym z następujących zakresów wielkości: 50-100, 100-150, 150-200,

200-250, 250-300, 300-350 i 350-400 μm. Dane przekształcono matematycznie w celu określenia liczby wysepek o przeciętnej średnicy wynoszącej 150 nm i wyrażono jako równoważniki wysepek (IEQ) (Ricordi C. i inni, Acta Diabetol Lat 27:185-195).

Wycięcie trzustki biorcy i dowątrobowy przeszczep komórek wysepki. Pełne wycięcie trzustki, bez wycięcia dwunastnicy czy wycięcia śledziony, przeprowadzono co najmniej jeden tydzień przed przeszczepem. Ogon i korpus trzustki odcięto wzdłuż tętnicy i żyły śledziony, które ostrożnie zabezpieczono przez podwiązanie i oddzielenie tylko gałęzi trzustki. Żyły mniejszą krezkową i środkową okrężnicy zidentyfikowano i zabezpieczono podczas odcinania korpusu trzustki. Żyły wrotną i większą krezkową rozpoznano i żyły trzustkowe podwiązano i oddzielono.

Uruchomiono dwunastnicę i gałęzie naczyń trzustkowo-dwunastniczych, które wchodziły do trzustki, podwiązano i oddzielono, pozostawiając gałęzie dwunastnicze nietknięte. Wspólny przewód żółciowy zidentyfikowano i zabezpieczono podczas tępego cięcia między głową trzustki i pętlą c dwunastnicy. Główne i pomocnicze przewody trzustkowe podwiązano, oddzielono i trzustkę usunięto z jamy brzusznej. Wszystkie zwierzęta przeszły dożylny test tolerancji glukozy aby ocenić skuteczność procedury wycięcia trzustki. Wszystkie udokumentowano jako negatywne w stosunku do peptydu c przed przeszczepem wysepek.

Wysepki hodowane całą noc przemyto w pożywce do przeszczepów, składającej się z pożywki RPMI 1640 (Mediatech) uzupełnionej 2,5% ludzką albuminą surowicy i zliczono aby określić liczbę IEQ. Wysepki zbito w grudkę i ponownie zawieszono w 20 ml pożywki do przeszczepów uzupełnionej 200 jednostkami heparyny. Dowątrobowy przeszczep wysepek przeprowadzono za pomocą drenażu grawitacyjnego do esicy lub gałęzi lewej żyły okrężniczej drenującej żyłę wrotną przez cewnik dożylny nr 22.

Monitoring glukozy we krwi, podawanie isuliny i określenie odrzucenia. Poziom glukozy we krwi na czczo i po posiłku monitorowano dwa razy dziennie (przed śniadaniem i po lunchu) za pomocą nakłucia usznego, po czym testowano krew glukometrem elite (Bayer, Elkhart, IN). Insulinę (NPH, Ultralente; Eli Lilly, Indianapolis, IN) podawano trzy razy dziennie próbując utrzymać poziom glukozy na czczo <300 mg/dl u zwierząt z wyciętą trzustką, przed przeszczepem albo u tych, które odrzuciły swe alloprzeszczepy.

PL 204 899 B1

Grupy doświadczalne i protokoły immunosupresyjne. Testowano dwa protokoły traktowania: (1) protokół Edmonton, wykorzystujący Tacrolimus, Sirolimus oraz mAb anty-IL-2R (Shapiro, A.M.J. i inni, (2000), N.Engl. J. Med., 343: 230-238) i (2) L104EA29Y-protokół Edmonton, wykorzystujący L104EA29YIg, Sirolimus i mAb anty-IL-2R. Grupa kontrolna obejmowała biorców traktowanych „podstawowym reżimem immunosupresyjnym stosującym rapamycynę i same anty-IL-2R. Tacrolimus był podawany 0,05 mg/kg dwa razy dziennie, dni po operacji 0-14 (poziom docelowy 5-8) i 0,06 mg/kg dziennie (poziom docelowy 3-5), dni po operacji 15-120. L104EA29YIg podawano dożylnie do miejsca operacyjnego (10 mg/kg) i w dniu 4 po operacji (15 mg/kg), 14, 28, 42, 56, 70, 84, 98, 112, 126 (20 mg/kg) aby utrzymać surowicę na poziomie wyższym niż 30 μg/ml. Chimeryczne mAb przeciwko ludzkiemu IL-2R (0,3 mg/kg iv) podawano do miejsca operacyjnego w dzień po operacji 4. Sirolimus (Rapamune®) podawano doustnie 1,25 mg/kg dwa razy dziennie (poziom docelowy 10-15), dzień po operacji 0-50, 1 mg/kg dwa razy dziennie (poziom docelowy 7-10), dni po operacji 50-100, a następnie zmniejszano dawkowanie do zakończenia do dnia 130. Sirolimus (Rapamune®) i Tacrolimus (Prograf®) nabyto od Emory University Hospital Pharmacy. Chimeryczne mAb przeciwko ludzkiemu IL-2R (Simulect®) dostarczono od Novartis Pharma AG (Basel, Switzerland).

Sekcja zwłok. Wszyscy biorcy mieli pełną sekcję zwłok przeprowadzoną przez Yerkes Veterinary Staff zaraz po śmierci.

Wykrywanie przeciwciał przeciwko dawcy. Obecność wykrywalnych alloprzeciwciał swoistych wobec dawcy określono przy użyciu cytometrii przepływowej. Leukocyty z krwi obwodowej służyły jako komórki docelowe dla analizy przed przeszczepem. Leukocyty izolowane z krezkowych węzłów chłonnych w czasie przeszczepu, stanowiły komórki docelowe dla testów po przeszczepie.

Statystyka. Przeżycie przeszczepów wysepek w grupie doświadczalnej porównywano stosując test Mann-Whitney-Wilcoxon (Armitage i inni (1987) Statistical methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publication, Oxford).

Test immunoenzymatyczny przeciwko dawcy. Odpowiedzi mierzono za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISpot) dla interferonu-γ (IFN-γ), przy użyciu leukocytów krwi obwodowej otrzymanych od zwierząt będących biorcami i dawcami. Równe liczby napromieniowanych stymulatorów (leukocyty dawcy) i respondentów (leukocyty biorcy) dodano do płytek o spodach z estrem celulozy (Millipore, Bedford, MA) powleczono przeciwciałem wychwytu, mysim, przeciw ludzkiemu IFN-γ (klon GZ-4; Mebtech, Szwecja). Po 14-16 godzinach inkubacji, dodano biotynylowane, mysie przeciw ludzkiemu IFN-γ (klon 7-B6-1; Mebtech, Szwecja), niezwiązane przeciwciało usunięto i dodano peroksydazę chrzanowo-Avidin D (Vector, Burlingame, CA). Każda plamka reprezentowała komórkę wydzielającą IFN-γ; częstość tych komórek można określić przez podzielenie liczby wytworzonych plam przez całkowitą liczbę powleczonych komórek odpowiadających.

Wyniki:

Terapia na bazie blokady szlaku CD28 przedłuża przeżycie alloprzeszczepów wysepek u makaków rezus. Cukrzycę indukowano poprzez chirurgiczne wycięcie trzustki zwierząt biorców i potwierdzono za pomocą dożylnego testu tolerancji glukozy, przed przeszczepem. Parowanie dawca-biorca określono na podstawie typingu molekularnego przy użyciu panelu wcześniej określonych alleli głównej zgodności tkankowej (8 klasy I i 12 klasy II) (Lobashevsky A. i inni, Tissue Antigens 54:254-263 (1999); Knapp LA i inni Tissue Antigens 50:657-661 (1997); Watkins D.I. Crit Rev Immunol 15:1-29 (1995)). Parowanie maksymalizowalizowało niezgodność w loci obu klas I i II. Odrzucenie określono jako dwie kolejne wartości poziomu glukozy we krwi na czczo >125 mg/dl w kolejnych dniach. Wlew do żyły wrotnej allogenicznych wysepek (>10 000 IEQ/kg) dał początkowe przywrócenie euglikemii i niezależności insulinowej u małp z cukrzycą, w obu grupach.

Traktowanie makaków z usuniętymi trzustkami reżimem L104EA2 9YIg/Rapamycyna/mAb anty-IL-2R, istotnie wydłużyło przeżycie alloprzeszczepu wysepek (odpowiednio 204, 190, 216, >200 i 56 dniach). Zwierzęta otrzymujące reżim L104EA29YIg/Rapamycyna/mAb anty-IL-2R dało adekwatną kontrolę glukozy, pokazaną poprzez poziom glukozy we krwi, na czczo (fig. 5 i 16B). Poza tym, zwierzęta te nie wymagały insulinowej terapii zastępczej, przez znacznie dłuższy okres czasu (fig. 6). Przeciwnie, te zwierzęta, które otrzymywały sam reżim podstawowy (Rapamycyna/mAb anty-IL-2R) odrzuciły przeszczepione wysepki w ciągu jednego tygodnia (fig. 16C). Zwierzęta kontrolne wykazywały znacznie podniesiony poziom glukozy w osoczu (fig. 5). Dalej, zwierzęta kontrolne wymagały insulinowej terapii zastępczej w ciągu tygodnia od przeszczepu wysepek (fig. 6). Cztery z pięciu zwierząt otrzymujących reżim L104EA29YIg cieszyły się przeżyciem

PL 204 899 B1 bez odrzucenia, przez okres trwania okresu leczenia (tablica III). Dożylny test tolerancji glukozy z pomiarem poziomu insuliny i glukozy, potwierdziły funkcję wysepek po przeszczepie (reprezentatywne zwierzę, fig. 7 i 16D).

T a b l i c a III

Przeżycie alloprzeszczepu wysepek i traktowanie

Niedopasowanie MHC (n)
	IEQ/kg	Przeżycie *	Traktowanie	Klasa I	Klasa II
RKf-7	22,250	204	LEA29Y/Rapa/aIL-2R	2	ND
RUf-7	17,087	190	LEA29Y/Rapa/aIL-2R	ND	3
RRe-7	20,266	216	LEA29Y/Rapa/aIL-2R	2	6
RWt-6	16,033	56	LEA29Y/Rapa/aIL-2R	2	3
RMv-6	8,201	>220	LEA29Y/Rapa/aIL-2R	1	3
RQz-6	12,980	7	Rapa/aIL-2R	2	5
RIb-7	10,903	7	Rapa/aIL-2R	1	4

Niezależność insulinowa. ND, nie wykryto w allelach, które typowano.

W 100 dni po przeszczepie, dawkowanie rapamycyny zmniejszono i zminimalizowano do zera w dniu 121. Zwierzęta wciąż utrzymywały niezależność insulinową w trakcie otrzymywania terapii z użyciem jedynie L104EA29YIg. W ~150 dni po przeszczepie, pozostali biorcy wysepek otrzymali ostatnią dawkę L104EA29YIg, kończąc jakąkolwiek terapię immunosupresyjną.

Jak się spodziewano, ~1-2 miesiące po przerwaniu terapii, u biorców pojawiła się hiperglikemia i konieczność terapii egzogeniczną insuliną. Analiza histologiczna ujawniła naciek komórek jednojądrzastych, silnie sugerujący odrzucenie jako etiologię utraty kontroli nad glukozą (fig. 17). W dożylnym teście tolerancji glukozy, testowane zwierzęta otrzymujące reżim L104EA29YIg/Rapamycyna/mAb anty-IL-2R, przedstawiały normalny poziom glukozy, po przeszczepie wysepek (fig. 7 i 16D).

Częstość komórek produkujących IFN-γ przeciwko dawcy, wykrywano testem ELISpot i analizowano przy użyciu układu obrazowania Immunospot. Zwierzęta otrzymujące sam podstawowy reżim immunosupresyjny demonstrowały większe liczby komórek T produkujących IFNy, reaktywnych wobec dawcy (84 ± 4,6 komórek), podczas gdy zwierzęta otrzymujące reżim L104EA29YIg nie wykazywały wykrywalnej odpowiedzi (2 ± 0,56 komórek).

Terapia L104EA29YIg hamuje odpowiedź komórek T i B przeciwko dawcy. Częstotliwość pobudzonych alloreaktywnych komórek T można skutecznie wykrywać z użyciem testu ELISpot, który może wyróżnić produkcję IFN-γ na poziomie pojedynczej komórki. Próbki krwi obwodowej od biorców wysepek analizowano w różnych punktach czasowych, zarówno przed jak i po przeszczepie, pod względem ich zdolności do wytwarzania IFN-γ w odpowiedzi na antygen dawcy. Zwierzęta traktowane samym reżimem podstawowym szybko rozwinęły możliwą do zmierzenia odpowiedź przeciwko dawcy, która pokrywała się z odrzuceniem, 1 tydzień po przeszczepie. Przeciwnie, częstotliwość komórek produkujących IFN-γ przeciwko dawcy, u zwierząt otrzymujących reżim zawierający L104EA29YIg, była niewykrywalna aż do wycofania terapii (reprezentatywne zwierzęta, fig. 18A i B). Tak więc, reżim L104EA29YIg skutecznie blokował generowanie odpowiedzi komórek T przeciwko dawcy, mierzonej poprzez zdolność do produkcji IFN-γ.

Do zbadania rozwoju odpowiedzi przeciwciała przeciwko dawcy wykorzystano cytometrię przepływową. Jedno zwierzę w grupie kontrolnej wygenerowało silną odpowiedź Ab przeciwko dawcy, podczas gdy inne nie zdołało rozwinąć możliwej do wykrycia odpowiedzi, prawdopodobnie ponieważ było uśpione zanim zaistniała możliwość zmierzenia wygenerowania odpowiedzi przeciwciała (fig. 18C). Przeciwnie, cztery z pięciu zwierząt nie zdołało wygenerować odpowiedzi przeciwciała w czasie otrzymywania terapii L104EA29YIg. Zgadza się to z wcześniej opisywanych

PL 204 899 B1 wyników z użyciem CTLA4-Ig w modelu przeszczepu wysepek (Levisetti, M.G. i inni, J Immunol 159:5187-5191, 1997) jak również naszych doświadczeń w modelu alloprzeszczepu nerkowego, gdzie biorca nie zdołał wygenerować przeciwciała przeciwko dawcy (Pearson T i inni, (skrót). W programach i skrótach 17-th American Society of Transplant Physicians Annual Meeting, Chicago, 10-14 maja 1997, Chicago, American Society of Transplant Physicians). Jedno zwierzę na pięciu biorców przeszło epizod odrzucenia w czasie otrzymywania terapii L104EA29YIg i następnie rozwinęło odpowiedź przeciwciała przeciwko dawcy. Jak oczekiwano, pozostałe czworo zwierząt otrzymujących reżim L104EA29YIg zgodnie rozwijało odpowiedź przeciwciał przeciwko dawcy, około czasu odrzucenia (~200 dni po przeszczepie, 50 dni po ostatniej dawce L104EA29YIg).

Przeszczep wysepki szybko staje się możliwą do zaistnienia opcją dla pacjentów z łamliwą cukrzycą typu 1. Ostatnie doniesienia opisujące reżim immunosupresyjny bez steroidów, w wyniku które uzyskuje się zadowalającą niezależność insulinową po przeszczepie wysepek, dały początek nowemu optymizmowi jeśli chodzi o praktyczne stosowanie przeszczepu wysepek. Podczas gdy eliminacja glikokortykoidów z reżimów immunosupresyjnych stanowi główny krok w kierunku usilnych prób leczenia cukrzycy typu 1, poleganie na terapii inhibitorami kalcyneuryny do pierwotnej immunosupresji, może ograniczyć stosowanie tego podejścia. Inhibitory kalcyneuryny charakteryzują się licznymi, niepożądanymi skutkami ubocznymi, łącznie z nefrotoksycznością, cukrzycą, nadciśnieniem, zakłóceniem metabolizmu tłuszczów i nadmiernym owłosieniem (Kahan B.D. i inni, N Engl J Med 321:1725-1738, 1989; Group TUSMFLS: A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosupression in liver transplantation: the U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N Engl J Med 331:1110-1115, 1994; de Mattos AM i inni, Am J Kidney Disease 35:333-346, 2000). Nawet gdy poziom leku jest utrzymywany na niskim poziomie, mogą się rozwinąć znaczące skutki uboczne. Ma to miejsce w szczególności w populacji pacjentów cukrzycowych, gdzie funkcja nerek może już być zaburzona. W istocie, w większości ostatnich doniesieniem z Edmonton, dwóch pacjentów z łagodnie podwyższonym poziomem kreatyniny przed przeszczepem, miała znacznie zmniejszoną funkcję nerek podczas terapii inhibitorem kalcyneuryny i zdecydowanie wymagali wycofania tego leku (Ryan E.A. i inni, Diabetes 50:710-719, 2001). W tym samym doniesieniu, dwie trzecie biorców rozwinęło pewien stopień nietolerancji glukozy, przy czym jedna czwarta rozwinęła prawdziwą cukrzycę poprzeszczepową uznaną za związaną ze stosowaniem tacrolimusu. Podkreśla to przemawiający i zasadniczy charakter reżimu immunosupresyjnego bez inhbitorów kalcyneuryny, szczególnie przy przeszczepie wysepek.

Blokada szlaków kostymulatorowych komórek T jest obiecującą strategią opracowywania reżimów nietoksycznych, immunosupresyjnych i potencjalnie dających tolerancję. Podejście to bierze pod uwagę te komórki T, które otrzymują „sygnał 1 w okresie podawania leku. Przykładowo, leczenie w okresie okołoprzeszczepowym jest uważane za wywołujące bezsilność allospecyficznych komórek T napotykających nowy narząd lub tkankę, podczas gdy inne komórki T pozostają niezaburzone (Li Y i inni, Nat Med 5:1298-1302, 1999). Blokada szlaku CD28/B7 okazała się znacząco obietnica w modelach doświadczalnych autoodporności i przeszczepu, czyniąc tą blokadę szczególnie przemawiającym celem immunosupresyjnym przy przeszczepach wysepek, gdzie prawdopodobnie istnieją przeszkody zarówno auto- jak alloimmunologiczne. Potencjał blokady CD28 w modelu przeszczepu na dużych zwierzętach opisano u Levisetti MG i innych (J Immunol 159:5187-5191, 1997). Traktowanie CTLA4-Ig jak okazało się dawało znaczące, choć umiarkowane, przedłużenie przeżycia alloprzeszczepu wysepek u naczelnych nie będących ludźmi (Levisetti MG i inni, J Immunol 159:5187-5191, 1997). Monoterapia CTLA4-Ig w niewielkim stopniu przedłuża przeżycie alloprzeszczepu nerkowego (Pearson T i inni, (Skrót). W Programs and Abstracts of the 17th American Society of Transplant Physicians Annual Meeting, Chicago, 10-14 maja 1997, Chicago, American Society of Transplant Physicians). Ostatnio, pojawiło się kilka doniesień o długookresowym przeżyciu alloprzeszczepów wysepek w modelach naczelnych nie będących ludźmi. Terapia mAb anty-CD40L dała wyniki największe, jednak podobnie jak w doświadczeniach z użyciem modelu przeszczepu nerki, nie uzyskano tolerancji, wraz z wycofaniem terapii miało miejsce odrzucenie przeszczepu (Kenyon N.S. i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8132-8137 (1999); Kirk A.D. i inni, Nat. Med. 5, 686-693 (1999). W innym zachęcającym doniesieniu, Thomas i inni (Diabetes 50:1227-1236, (2001)) opisywał ostatnio stosowanie immunotoksyny anty-CD3 oraz środka immunomodulującego DSG (15-deoksyspergualina) jako znacząco wydłużające przeżycie wysepek u cukrzycowych naczelnych indukowanych streptozotocyną. Choć obiecujące, doniesienia te stosowały środki terapeutyczne, których potencjał kliniczny w obecnym czasie jest wciąż niepewny.

PL 204 899 B1

Dane in vivo z użyciem L104EA29YIg, zmutowanej postaci CTLA4-Ig w modelu alloprzeszczepu wysepek u rezusów, jest zgodny z dowodami in vitro wskazującymi, że ta cząsteczka drugiej generacji jest silniejszym inhibitorem odpowiedzi komórek T niż cząsteczka rodzicielska. Biorąc pod uwagę, że CTLA4-Ig już wykazała skuteczność w próbie klinicznej u pacjentów z łuszczycą (Abrams J.R i inni, J.Clin. Invest. 103:1243-1252 (1999)), istnieje znaczny entuzjazm w stosunku do tych prób wykorzystujących L104EA29YIg jako podstawowego środka immunosupresyjnego. Jest ona wyraźnie zgodna, jeśli nie synergistyczna, z klinicznie dopuszczonymi środkami immunosupresyjnymi (mAb anty-IL2R i rapamycyną) ułatwiającymi planowanie prób klinicznych. Początkowe próby na ludziach z użyciem L104EA29YIg mają już miejsce u pacjentów dotkniętych reumatoidalnym zapaleniem stawów oraz tych, którzy przeszli przeszczep nerki. Chociaż nie podjęto prób bezpośredniego porównania protokołu na bazie tacrolimusu i reżimu L104EA29YIg, z powodu opisywanej niedopuszczalnej toksyczności u naczelnych nie będących ludźmi (Montgomery S.P i inni, Am J. Transplant 1 (dodatek 1):438, 2001), nasze wyniki sugerują, że L104EA29YIg ma potencjał bycia co najmniej tak skuteczną jak tacrolimus środkiem immunosupresyjnym.

Wnioski:

Opisany jest nowy reżim immunosupresyjny, pozbawiony inhibitora kalcyneuryny/steroidów, który zapewnia istotne zabezpieczenie przed odrzuceniem i wydłuża przeżycie 15 alloprzeszczepów wysepek u naczelnych nie będących ludźmi. Środek biologiczny L104EA29YIg jest silnym środkiem immunosupresyjnym. L104EA29YIg może zastąpić Tacrolimus w protokole Edmonton, eliminując przez to niepożądane skutki uboczne inhibitora kalcyneuryny.

PL 204 899 B1

Lista sekwencji <110> Emory University

Larsen, Christian P.Pearson, Thomas C. Adams, Andrew B. <120> Sposoby zabezpieczania allogenicznego przeszczepu wysepki przy zastosowaniu rozpuszczalnych cząsteczek mutanta CTLA4 <130> D0173PCT / 30436.62WOU1 <140> PCT/US02/16708 <141> 2002-05-23 <150> 60/293 402 <151> 2001-05-23 <160> 18 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 636 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1

atgggtgtac	tgctcacaca	gaggacgctg	ctcagtctgg	tccttgcact	cctgtttcca	60
agcatggcga	gcatggcaat	gcacgtggcc	cagcctgctg	tggtactggc	cagcagccga	120
ggcatcgcca	gctttgtgtg	tgagtatgca	tctccaggca	aagccactga	ggtccgggtg	180
acagtgcttc	ggcaggctga	cagccaggtg	actgaagtct	gtgcggcaac	ctacatgatg	240
gggaatgagt	tgaccttcct	agatgattcc	atctgcacgg	gcacctccag	tggaaatcaa	300
gtgaacctca	ctatccaagg	actgagggcc	atggacacgg	gactctacat	ctgcaaggtg	360
gagctcatgt	acccaccgcc	atactacctg	ggcataggca	acggaaccca	gatttatgta	420
attgatccag	aaccgtgccc	agattctgac	ttcctcctct	ggatccttgc	agcagttagt	480
tcggggttgt	ttttttatag	ctttctcctc	acagctgttt	ctttgagcaa	aatgctaaag	540
aaaagaagcc	ctcttacaac	aggggtctat	gtgaaaatgc	ccccaacaga	gccagaatgt	600

PL 204 899 B1

gaaaagcaat	ttcagcctta ttttattccc atcaat	636
<210>	2
<211>	212
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	2
Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro

25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu

40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg

55 60

Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met

70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser

90 95

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr Ile Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp

100 105 110

Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

115 120 125

Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gin Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu

130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser

145 150 155 160

Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser

165 170 175

Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys

PL 204 899 B1

180 185 190

Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe

195 200 205

Ile Pro Ile Asn

210 <210> 3 <211> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja CTLA4Ig <400> 3

atgggtgtac	tgctcacaca	gaggacgctg	ctcagtctgg	tccttgcact	cctgtttcca	60
agcatggcga	gcatggcaat	gcacgtggcc	cagcctgctg	tggtactggc	cagcagccga	120
ggcatcgcta	gctttgtgtg	tgagtatgca	tctccaggca	aagccactga	ggtccgggtg	180
acagtgcttc	gg caggctga	cagccaggtg	actgaagtct	gtgcggcaac	ctacatgatg	240
gggaatgagt	tgaccttcct	agatgattcc	atctgcacgg	gcacctccag	tggaaatcaa	300
gtgaacctca	ctatccaagg	actgagggcc	atggacacgg	gactctacat	ctgcaaggtg	360
gagctcatgt	acccaccgcc	atactacctg	ggcataggca	acggaaccca	gatttatgta	420
attgatccag	aaccgtgccc	agattctgat	caggagccca	aatcttctga	caaaactcac	480
acatccccac	cgtccccagc	acctgaactc	ctgggtggat	cgtcagtctt	cctcttcccc	540
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacatg	cgtggtggtg	600
gacgtgagcc	acgaagaccc	tgaggtcaag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	660
cataatgcca	agacaaagcc	gcgggaggag	cagtacaaca	gcacgtaccg	ggtggtcagc	720
gtcctcaccg	tcctgcacca	ggactggctg	aatggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	780
aacaaagccc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aagccaaagg	gcagccccga	840
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggatgagc	tgaccaagaa	ccaggtcagc	900
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctatccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	960
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccacg	cctcccgtgc	tggactccga	cggctccttc	1020

PL 204 899 B1

ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1080
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1140
ccgggtaaat	ga					1152

<210> 4 <211> 383 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja CTLA4Ig <400> 4

Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro

25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu

40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg

55 60

Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met

70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser

90 95

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr Ile Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp

100 105 110

Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

115 120 125

Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gin Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu

130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

PL 204 899 B1

145 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val

165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

180 185 190

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

195 200 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

210 215 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

225 230 235 240

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro

275 280 285

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu

290 295 300

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

305 310 315 320

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 340 345 350

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 355 360 365

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

PL 204 899 B1 <210> 5 <211> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja L104EA29YIg <400> 5

atgggtgtac	tgctcacaca	gaggacgctg	ctcagtctgg	tccttgcact	cctgtttcca	60
agcatggcga	gcatggcaat	gcacgtggcc	cagcctgctg	tggtactggc	cagcagccga	120
ggcatcgcta	gctttgtgtg	tgagtatgca	tctccaggca	aatatactga	ggtccgggtg	180
acagtgcttc	ggcaggctga	cagccaggcg	accgaagccc	gcgcggcaac	ccacatgacg	240
gggaatgagt	tgaccttcct	agatgattcc	atctgcacgg	gcacctccag	tggaaatcaa	300
gtgaacctca	ctatccaagg	actgagggcc	atggacacgg	gactctacat	ctgcaaggtg	360
gagctcatgt	acccaccgcc	atactacgag	ggcataggca	acggaaccca	gatttatgta	420
attgatccag	aaccgtgccc	agattctgat	caggagccca	aatcttctga	caaaactcac	480
acatccccac	cgtccccagc	acctgaactc	ctggggggat	cgtcagtctt	cctcttcccc	540
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacatg	cgtggtggtg	600
gacgtgagcc	acgaagaccc	tgaggtcaag	ttcaactggt	acgtggacąg	cgtggaggtg	660
cataatgcca	agacaaagcc	gcgggaggag	cagtacaaca	gcacgtaccg	tgtggtcagc	720
gtcctcaccg	tcctgcacca	ggactggctg	aatggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	780
aacaaagccc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aagccaaagg	gcagccccga	840
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggatgagc	tgaccaagaa	ccaggtcagc	900
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctatccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	960
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccacg	cctcccgtgc	tggactccga	cggctccttc	1020
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1080
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1140
ccgggtaaat	ga					1152

<210> 6 <211> 383

PL 204 899 B1 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja L104EA29YIg <400> 6

Met Gly Val Leu

Leu Leu Phe Pro

Ala Val Val Leu

Tyr Ala Ser Pro

Gin Ala Asp Ser .

Gly Asn Glu Leu

Ser Gly Asn Gin

100

Thr Gly Leu Tyr

115

Tyr Glu Gly Ile

130

Pro Cys Pro Asp

145

Thr Ser Pro Pro

Phe Leu Phe Pro

180

Leu Thr Gin Arg

Ser Met Ala Ser

Ala Ser Ser Arg

Gly Lys Tyr Thr

Gin Val Thr Glu

Thr Phe Leu Asp

Val Asn Leu Thr

Ile Cys Lys Val

120

Gly Asn Gly Thr

135

Ser Asp Gin Glu

150

Ser Pro Ala Pro

165

Pro Lys Pro Lys

Thr Leu Leu Ser

Met Ala Met His

Gly Ile Ala Ser

Glu Val Arg Val

Val Cys Ala Ala

Asp Ser Ile Cys

Ile Gin Gly Leu

105

Glu Leu Met Tyr

Gin Ile Tyr Val

140

Pro Lys Ser Ser

155

Glu Leu Leu Gly

170

Asp Thr Leu Met

185

Leu Val Leu Ala

Val Ala Gin Pro

Phe Val Cys Glu

Thr Val Leu Arg

Thr Tyr Met Met

Thr Gly Thr Ser

Arg Ala Met Asp

110

Pro Pro Pro Tyr

125

Ile Asp Pro Glu

Asp Lys Thr His

160

Gly Ser Ser Val

175

Ile Ser Arg Thr

190

PL 204 899 B1

Pro

Glu

Val 195

Thr

Cys

Val

Val 200

Asp

Val

Ser

His

Glu 205

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

210

215

220

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

225

230

235

240

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

245

250

255

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

260

265

270

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

275

280

285

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

290

295

300

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

305

310

315

320

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

325

330

335

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

340

345

350

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

355

360

365

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

370 375 380

<210>	7
<211>	1152
<212>	DNA
<213>	Sekwencja
<220>

PL 204 899 B1 <223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja L104EIg <400> 7

atgggtgtac	tgctcacaca	gaggacgctg	ctcagtctgg	tccttgcact	cctgtttcca	60
agcatggcga	gcatggcaat	gcacgtggcc	cagcctgctg	tggtactggc	cagcagccga	120
ggcatcgcta	gctttgtgtg	tgagtatgca	tctccaggca	aagccactga	ggtccgggtg	180
acagtgcttc	ggcaggctga	cagccaggtg	actgaagtct	gtgcggcaac	ctacatgatg	240
gggaatgagt	tgaccttcct	agatgattcc	atctgcacgg	gcacctccag	tggaaatcaa	300
gtgaacctca	ctatccaagg	actgagggcc	atggacacgg	gactctacat	ctgcaaggtg	360
gagctcatgt	acccaccgcc	atactacgag	ggcataggca	acggaaccca	gatttatgta	420
attgatccag	aaccgtgccc	agattctgat	caggagccca	aatcttctga	caaaactcac	480
acatccccac	cgtccccagc	acctgaactc	ctggggggat	cgtcagtctt	cctcttcccc	540
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacatg	cgtggtggtg	600
gacgtgagcc	acgaagaccc	tgaggtcaag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	660
cataatgcca	agacaaagcc	gcgggaggag	cagtacaaca	gcacgtaccg	tgtggtcagc	720
gtcctcaccg	tcctgcacca	ggactggctg	aatggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	780
aacaaagccc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aagccaaagg	gcagccccga	840
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggatgagc	tgaccaagaa	ccaggtcagc	900
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctatccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	960
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccacg	cctcccgtgc	tggactccga	cggctccttc	1020
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1080
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1140

ccgggtaaat ga <210> 8 <211> 383 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja L104EIg <400> 8

PL 204 899 B1

225 230 235 240

Val

Leu

Thr

Val

Leu 245

His

Gin

Asp

Trp

Leu 250

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr 255

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

260

265

270

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

275

280

285

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

290

295

300

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

305

310

315

320

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

325

330

335

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

340

345

350

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

355

360

365

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

370

375

380

<210>

9

<211>

1152

<212>

DNA

<213>

Sekwencj a

sztuczna

<220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja L104EA29LIg <400> 9

atgggtgtac	tgctcacaca	gaggacgctg	ctcagtctgg	tccttgcact	cctgtttcca	60
agcatggcga	gcatggcaat	gcacgtggcc	cagcctgctg	tggtactggc	cagcagccga	120
ggcatcgcta	gctttgtgtg	tgagtatgca	tctccaggca	aattgactga	ggtccgggtg	180

PL 204 899 B1

acagtgcttc	ggcaggctga	cagccaggtg	actgaagtct	gtgcggcaac	ctacatgatg	240
gggaatgagt	tgaccttcct	agatgattcc	atctgcacgg	gcacctccag	tggaaatcaa	300
gtgaacctca	ctatccaagg	actgagggcc	atggacacgg	gactctacat	ctgcaaggtg	360
gagctcatgt	acccaccgcc	atactacgag	ggcataggca	acggaaccca	gatttatgta	420
attgatccag	aaccgtgccc	agattctgat	caggagccca	aatcttctga	caaaactcac	480
acatccccac	cgtccccagc	acctgaactc	ctggggggat	cgtcagtctt	cctcttcccc	540
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacatg	cgtggtggtg	600
gacgtgagcc	acgaagaccc	tgaggtcaag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	660
cataatgcca	agacaaagcc	gcgggaggag	cagtacaaca	gcacgtaccg	tgtggtcagc	720
gtcctcaccg	tcctgcacca	ggactggctg	aatggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	780
aacaaagccc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aagccaaagg	gcagccccga	840
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggatgagc	tgaccaagaa	ccaggtcagc	900
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctatccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	960
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccacg	cctcccgtgc	tggactccga	cggctccttc	1020
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1080
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	caccacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1140

ccgggtaaat ga 1152 <210> 10 <211> 383 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja L104EA29LIg <400> 10

Met

Gly

Val

Leu

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu

Ser

Leu

Val

Leu

Ala

1

5

10

15

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

Val

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

PL 204 899 B1

40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Leu Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg

55 60 ~

Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met

70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser

90 95

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr Ile Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp

100 105 110

Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

115 120 125

Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gin Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu

130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

145 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val

165 170 175

Phe ,Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

180 185 190

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

195 200 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

210 215 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

225 230 235 240

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

260 265 270

PL 204 899 B1

Ser

Lys

Ala 275

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 280

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr 285

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

290

295

300

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

305

310

315

320

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

325

330

335

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

340

345

350

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

355

360

365

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

370 375 380 <210> 11 <211> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja L104EA29TIg <400> 11

atgggtgtac	tgctcacaca	gaggacgctg	ctcagtctgg	tccttgcact	cctgtttcca	60
agcatggcga	gcatggcaat	gcacgtggcc	cagcctgctg	tggtactggc	cagcagccga	120
ggcatcgcta	gctttgtgtg	tgagtatgca	tctccaggca	aaactactga	ggtccgggtg	180
acagtgcttc	ggcaggctga	cagccaggtg	actgaagtct	gtgcggcaac	ctacatgatg	240
gggaatgagt	tgaccttcct	agatgattcc	atctgcacgg	gcacctccag	tggaaatcaa	300
gtgaacctca	ctatccaagg	actgagggcc	atggacacgg	gactctacat	ctgcaaggtg	360
gagctcatgt	acccaccgcc	atactacgag	ggcataggca	acggaaccca	gatttatgta	420
attgatccag	aaccgtgccc	agattctgat	caggagccca	aatcttctga	caaaactcac	480

PL 204 899 B1

acatccccac	cgtccccagc	acctgaactc	ctggggggat	cgtcagtctt	cctcttcccc	540
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacatg	cgtggtggtg	600
gacgtgagcc	acgaagaccc	tgaggtcaag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	660
cataatgcca	agacaaagcc	gcgggaggag	cagtacaaca	gcacgtaccg	tgtggtcagc	720
gtcctcaccg	tcctgcacca	ggactggctg	aatggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	780
aacaaagccc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aagccaaagg	gcagccccga	840
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggatgagc	tgaccaagaa	ccaggtcagc	900
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctatccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	960
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccacg	cctcccgtgc	tggactccga	cggctccttc	1020
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1080
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1140

ccgggtaaat ga 1152 <210> 12 <211> 383 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja L104EA29TIg <400> 12

Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro

25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu

40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Thr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg

55 60

Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met

70 75 80

PL 204 899 B1

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr

100

Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val

115 120

Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr

130 135

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu

145 150

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro

165

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

130

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

195 200

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

210 215

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr

225 230

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp

245

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

260

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg

275 280

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

290 295

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser

95

Ile Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp

105 110

Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

125

Gin Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu

140

Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

155 160

Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val

170 175

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

185 190

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

205

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

220

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

235

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

250 255 '

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

265 270

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro

285

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu

300

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

PL 204 899 B1

305

310

315

320

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

325

330

335

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

340

345

350

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

355

360

365

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

370 375 380 <210> 13 <211> 1152 <212> DNA

<213> Sekwencja	sztuczna
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja L104EA29WIg
<400> 13
atgggtgtac	tgctcacaca	gaggacgctg	ctcagtctgg	tccttgcact	cctgtttcca	60
agcatggcga	gcatggcaat	gcacgtggcc	cagcctgctg	tggtactggc	cagcagccga	120
ggcatcgcta	gctttgtgtg	tgagtatgca	tctccaggca	aatggactga	ggtccgggtg	180
acagtgcttc	ggcaggctga	cagccaggtg	actgaagtct	gtgcggcaac	ctacatgatg	240
gggaatgagt	tgaccttcct	agatgattcc	atctgcacgg	gcacctccag	tggaaatcaa	300
gtgaacctca	ctatccaagg	actgagggcc	atggacacgg	gactctacat	ctgcaaggtg	360
gagctcatgt	acccaccgcc	atactacgag	ggcataggca	acggaaccca	gatttatgta	420
attgatccag	aaccgtgccc	agattctgat	caggagccca	aatcttctga	caaaactcac	480
acatccccac	cgtccccagc	acctgaactc	ctggggggat	cgtcagtctt	cctcttcccc	540
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacatg	cgtggtggtg	600
gacgtgagcc	acgaagaccc	tgaggtcaag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	660
cataatgcca	agacaaagcc	gcgggaggag	cagtacaaca	gcacgtaccg	tgtggtcagc	720
gtcctcaccg	tcctgcacca	ggactggctg	aatggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	780

PL 204 899 B1

aacaaagccc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aagccaaagg	gcagccccga	840
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggatgagc	tgaccaagaa	ccaggtcagc	900
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctatccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	960
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccacg	cctcccgtgc	tggactccga	cggctccttc	1020
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1080
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1140

ccgggtaaat ga 1152 <210> 14 <211> 383 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja L104EA29WIg <400> 14

Met

Gly

Val

Leu

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu

Ser

Leu

Val

Leu

Ala

1

5

10

15

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

Val

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Trp

Thr

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gin

Ala

Asp

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

Val

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

65

70

75

80

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Gly

Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gin

Gly

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

Tyr

PL 204 899 B1

115

120

125

Tyr

Glu

Gly

Ile Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

Tyr

Val

Ile

Asp

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp Ser

Asp

Gin

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

145

150

155

160

Thr

Ser

Pro

Pro Ser

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Ser

Val

165

170

175

Phe

Leu

Phe

Pro Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

180

185

190

Pro

Glu

Val

Thr Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

195

200

205

Val

Lys

Phe

Asn Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

215 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser ²²⁵ 230 235 240

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro

275 280 285

Pro Ser Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu

290 295 300

Val Lys Gly'Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn ³⁰⁵ 310 315 320

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

340 345 350

PL 204 899 B1

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala Leu

355

360

365

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

370

375

380

<210> 15 <211> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja CTLA4Ig <400> 15

atgggtgtac	tgctcacaca	gaggacgctg	ctcagtctgg	tccttgcact	cctgtttcca	60
agcatggcga	gcatggcaat	gcacgtggcc	cagcctgctg	tggtactggc	cagcagccga	120
ggcatcgcca	gctttgtgtg	tgagtatgca	tctccaggca	aagccactga	ggtccgggtg	180
acagtgcttc	ggcaggctga	cagccaggtg	actgaagtct	gtgcggcaac	ctacatgatg	240
gggaatgagt	tgaccttcct	agatgattcc	atctgcacgg	gcacctccag	tggaaatcaa	300
gtgaacctca	ctatccaagg	actgagggcc	atggacacgg	gactctacat	ctgcaaggtg	360
gagctcatgt	acccaccgcc	atactacctg	ggcataggca	acggaaccca	gatttatgta	420
attgatccag	aaccgtgccc	agattctgat	caggagccca	aatcttctga	caaaactcac	480
acatccccac	cgtccccagc	acctgaactc	ctggggggat	cgtcagtctt	cctcttcccc	540
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacatg	cgtggtggtg	600
gacgtgagcc	acgaagaccc	tgaggtcaag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	660
cataatgcca	agacaaagcc	gcgggaggag	cagtacaaca	gcacgtaccg	tgtggtcagc	720
gtcctcaccg	tcctgcacca	ggactggctg	aatggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	780
aacaaagccc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aagccaaagg	gcagccccga	840
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggatgagc	tgaccaagaa	ccaggtcagc	900
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctatccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	960
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccacg	cctcccgtgc	tggactccga	cggctccttc	1020
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1080

PL 204 899 B1 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 16 <211> 383 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja CTLA4Ig

<400>

16

Met

Gly

Val

Leu

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu

Ser

Leu

Val

Leu

Ala

1

5

10

15

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

Val

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Ala

Thr

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gin

Ala

Asp

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

Val

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

65

70

75

80

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Gly

Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gin

Gly

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Leu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

Tyr

Val

Ile

Asp

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Gin

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

145 150 155 160

PL 204 899 B1

Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val

170 175

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

185 190

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

205

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

220

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

235 240

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

250 255

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

265 270

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro

285

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu

300

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

315 320

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

330 335

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

345 350

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

365

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

380

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro

165

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

180

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

195 200

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

210 215

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr

225 230

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp

245

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

260

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg

275 280

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

290 295

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

305 310

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

325

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

340

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser

355 360

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser

370 375 <210> 17

PL 204 899 B1 <211> 41 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: starter zgodny CTLA4 onkostatyna M (0MCTLA4) <400> 17 gaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g 41 <210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: starter odwrotny CTLA4 onkostatyna M (OMCTLA4) <400> 18 gtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc 42

Claims

1. Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 do wytwarzania leku do hamowania odrzucenia przeszczepu komórek wysepki, przy czym rozpuszczalna zmutowana cząsteczka CTLA zawiera zmutowaną pozakomórkową domenę CTLA4, posiadającą

a) sekwencję aminokwasową, która rozpoczyna się od metioniny w pozycji +1 i kończy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 3, lub która rozpoczyna się od alaniny w pozycji -1 i kończy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 3.

e) sekwencję aminokwasową, która rozpoczyna się od metioniny w pozycji +1 i kończy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 22, lub która rozpoczyna się od alaniny w pozycji -1 i kończy się kwasem asparaginowym w pozycji +124 jak pokazano na fig. 22.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeszczep komórek wysepki jest do leczenia cukrzycy.

PL 204 899 B1

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że cukrzyca jest cukrzycą typu 1 lub 2.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeszczep komórek wysepki zawiera otoczkowane komórki wysepki.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że hamowanie odrzucenia przeszczepu komórek wysepki obejmuje podawanie rozpuszczalnej cząsteczki mutanta CTLA4 przed, podczas lub po przeszczepie komórek wysepki.

6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że domena pozakomórkowa jest połączona przez fuzję z cząsteczką nie-CTLA4.

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że cząsteczka nie-CTLA4 zawiera cząsteczkę immunogloguliny.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że cząsteczka immunoglobuliny jest stałym regionem immunoglobuliny lub jego częścią.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że stały region immunoglobuliny lub jego część zawiera jedną lub więcej mutacji dla zredukowania funkcji efektora.

10. Zastosowanie według zastrz. 8, albo 9, znamienne tym, że stały region immunoglobuliny zawiera region zawiasu CH2 lub CH3 cząsteczki immunoglobuliny.

11. Zastosowanie według zastrz. 8 albo 9, albo 10, znamienne tym, że stały region immunoglobuliny lub jego część jest regionem stałym immunoglobuliny ludzkiej lub małpiej.

12. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że rozpuszczalny mutant CTLA4 jest:

a) L104EA29YIg jaką ukazano w fig. 3, rozpoczynająca się Ala w pozycji -1 albo Met w pozycji +1 i kończąca się Lys w pozycji +357 (SEQ ID nr:6, rozpoczynająca się Ala w pozycji 26 i kończąca się Lys w pozycji 383, albo rozpoczynająca się Met w pozycji 27 i kończąca się Lys w pozycji 383),

b) L104EIg jaką ukazano w fig. 19, rozpoczynająca się Ala w pozycji -1 albo Met w pozycji +1 i kończąca się Lys w pozycji +357 (SEQ ID nr:8, rozpoczynająca się Ala w pozycji 26 i kończącć się Lys w pozycji 383, albo rozpoczynająca się Met w pozycji 27 i kończąca się Lys w pozycji 383),

c) L104EA29LIg jaką ukazano w fig. 20, rozpoczynająca się Ala w pozycji -1 albo Met w pozycji +1 i kończąca się Lys w pozycji +357 (SEQ ID nr:10, rozpoczynająca się Ala w pozycji 26 i kończąca się Lys w pozycji 383, albo rozpoczynająca się Met w pozycji 27 i kończąca się Lys w pozycj i 383),

d) L104EA29TIg jaką ukazano w fig. 21, rozpoczynająca się Ala w pozycji -1 albo Met w pozycji +1 i kończąca się Lys w pozycji +357 (SEQ ID nr:12, rozpoczynająca się Ala w pozycji 26 i kończąca się Lys w pozycji 383, albo rozpoczynająca się Met w pozycji 27 i kończąca się Lys w pozycji 383), albo

e) L104EA29WIg jaką ukazano w fig. 22, rozpoczynająca się Ala w pozycji -1 albo Met w pozycji +1 i kończąca się Lys w pozycji +357 (SEQ ID nr:14, rozpoczynająca się Ala w pozycji 26 i kończąca się Lys w pozycji 383, albo rozpoczynająca się Met w pozycji 27 i kończąca się Lys w pozycj i 383).

13. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że cząsteczka rozpuszczalnego mutanta CTLA4 jest stosowana w połączeniu z co najmniej jednym dodatkowym związkiem, który jest wybrany z grupy złożonej z związków immunosupresyjnych, związków immunomodulatorowych i związków przeciwzapalnych.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że związek jest wybrany z grupy obejmującej anakinrę, adrenokortykosteroidy, azatioprinę, basiliksmab, inhibitory kalcyneuryny, chlorochinę, kortykosteroidy, cyclosporynę, prednison, cyklofosfamid, cytoksan, 15-deoksyspergalinę i jej analogi, D-penicylaminę, etanercept, octan glatrimeru, FTY720 i jego analogi, glukokortykoidy, sole złota, końską anty-ludzką globulinę tymocytów (ATGAM), humanizowana anty-TAC (HAT), hydroksychlorochina, infiksimab, interferon bata-1a, iterferon beta-1b, leflunomid, i jego analogi, immunoglobulina limfocytów, czynniki naprowadzające limfocyty, metoksalen, metotreksan, chlorowodorek mitoksantronu kwas mykofenolowy, mofetil mykofenolanowy, miziribinę, NSAIDE, króliczą anty-ludzką globulinę tymocytów, immunoglobulinę Rho(D), sirolimus (rapamycyna) i jej pochodne (np., 40-0-(2-hydroksy)etylo-rapamycyna), sulfasalazopirynę, sulfasalazynę, takrolimus (FK-5O6) talidomid, blokery TNFa i czynniki biologiczne które nacelowują cytokiny zapalne, inhibitory TOR związki które współdziałają z CD40 i 0D154, rozpuszczalny gp39, rozpuszczalny 0D29, rozpuszczalny CD40, rozpuszczalny CD80 (np., ATCC 68627), rozpuszczalny CD86, rozpuszczalny CD28, rozpuszczalny CD56, rozpuszczalny Thy-I, rozpuszczalny CD3, rozpuszczalny TCR, rozpuszczalny VLA-4, rozpuszczalny VCAM-1, rozpuszczalny LECAM-1, rozpuszczalny ELAM-1, rozpuszczalny CD44, przeciwciała reaktywne względem gp39, (np., ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 i ATCC HB-12056), przeciwciała reaktywne względem CD40 (np., ATCC HB-9110), przeciwciała reaktywne względem B7 (ATCC HB-253, ATCC

PL 204 899 B1

CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341), przeciwciała reaktywne względem CD28 (np., ATCC HB-11944 lub mAb 9,3) przeciwciała reaktywne względem LFA-1 (np., ATCC HB9579 i ATCC TIB-213, przeciwciała reaktywne względem LFA-2, przeciwciała reaktywne względem IL-2, przeciwciała reaktywne względem IL-12, przeciwciała reaktywne względem IFN-gamma, przeciwciała reaktywne względem CD2, przeciwciała reaktywne względem CD48, przeciwciała reaktywne względem ICAM (np., ICAM-1 (ATCC CRL-2252, ICAM-2 i ICAM-3) przeciwciała reaktywne względem CTLA4 (np., ATCC HB-304, przeciwciała reaktywne względem Thy-1, przeciwciała reaktywne względem CD56, przeciwciała reaktywne względem CD3, przeciwciała reaktywne względem CD29, przeciwciała reaktywne względem TCR przeciwciała reaktywne względem VLA-4, przeciwciała reaktywne względem VCAM-1, przeciwciała reaktywne względem LECAM-1, przeciwciała reaktywne względem ELAM-1, przeciwciała reaktywne względem CD44, monoklonalne przeciwciała do receptorów leukocytów, np., MHC, CD2, CD3, CD4, CDtla/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD137, ICOS, CD150, (SLAM), OX40, 4-1BB lub ich ligandy, CTLA4/CD28-lg, antagoniści LFA-1, antagoniści selektyny i antagoniści VLA-4 i anty-ludzkie IL-2RmAbs.

15. Zastosowanie według zastrz. 13 lub 14, znamienne tym, że cząsteczka rozpuszczalnego mutanta CTLA4 i dodatkowy związek są podawane jednocześnie.

16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że cząsteczka rozpuszczalnego mutanta CTLA4 i dodatkowy związek są podawane razem lub kolejno.

17. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że hamowanie odrzucania przeszczepu komórki obejmuje dodatkowy tryb immunosupresyjny.

18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że dodatkowy tryb immunosupresyjny jest wolny od glukokortykoidow.

19. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że dodatkowy tryb immunosupresyjny obejmuje kortykosteroidy.

20. Zastosowanie według zastrz. 17, albo 18, albo 19, znamienne tym, że dodatkowy tryb immunosupresyjny jest wolny od inhibitora kalcyneuryny.

21. Zastosowanie według zastrz. 17, albo 18 albo 19, albo 20 znamienne tym, że dodatkowy tryb immunosupresyjny obejmuje jeden lub więcej związków jak zdefiniowano w zastrz. 14.

22. Zastosowanie według zastrz. 17, albo 18 albo 19, albo 20, albo 21, znamienne tym, że dodatkowy tryb immunosupresyjny obejmuje inhibitor TOR i/lub czynnik biologiczny, który ukierunkowany jest na IL-2.

23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że inhibitorem TOR jest rapamycyna (sirolimus) lub jej pochodne.

24. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że czynnik biologiczny który ukierunkowany jest na IL-2 jest przeciwciałem reaktywnym względem IL-2 lub anty-ludzkim IL-2R mAb.

25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że anty-ludzką IL-2R jest basiliksimab.

26. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że dodatkowy tryb immunosupresyjny obejmuje kwas mykofenolowy lub mofetil mykofenolanowy.

27. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że dodatkowy tryb immunosupresyjny obejmuje związek, który ingeruje w wiązanie CD40 do CD154.

28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że związkiem, który ingeruje w wiązanie CD40 do CD154 jest przeciwciało anty-CD40.

29. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że związkiem, który ingeruje w wiązanie CD40 do CD154 jest przeciwciało anty-154.

30. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że hamowanie odrzucenia przeszczepu komórek wysepki obejmuje podanie komórek szpiku kostnego zubożonych w komórki T.

31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że podawanie komórek szpiku kostnego zubożonych w komórki T jest w przybliżeniu w tym samym czasie co umieszczanie przeszczepu komórek wysepki.

32. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że podawanie komórek szpiku kostnego zubożonych w komórki T poprzedza umieszczanie przeszczepu komórek wysepki.

33. Zastosowanie według zastrz. 30, albo 31, albo 32, znamienne tym, że podawanie komórek szpiku kostnego zubożonych w komórki T obejmuje pierwszą dawkę i drugą dawkę.