NO332465B1

NO332465B1 - Anvendelse av loselige, muterte CTLA4-molekyler for fremstilling av et medikament for a inhibere avstotning av oycelletransplantat.

Info

Publication number: NO332465B1
Application number: NO20035176A
Authority: NO
Inventors: Christian P Larsen; Thomas C Pearson; Andrew B Adams
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2001-05-23
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2012-09-24
Also published as: US7304033B2; EP1397153A4; MXPA03010568A; DK1397153T3; EP1397153B1; HUP0401590A2; DE60225914D1; NO20035176D0; EP1397153A2; JP2004535402A; US20030022836A1; US7829534B2; HU229680B1; HUP0401590A3; WO2002094202A3; PL364578A1; ATE390931T1; DE60225914T2; NO20035176L; JP4837880B2

Abstract

Foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for å hemme øycelletransplantatavstøtning spesielt for behandling av diabetes, slik som type 1 og type 2 diabetes, ved administrering til et individ en effektiv mengde av et løselig, mutert CTLA4-molekyl. Ett eksempel på løselig, mutert CTLA4-molekyl er L104EA29Ylg.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår generelt hemming av

øycelletransplantatavstøtning. Spesielt angår oppfinnelsen anvendelse av et løselig mutert CTLA4 molekyl for fremstilling av et medikament for å inhibere avstøtning av øycelletransplantat. Diabetes, inkludert type 1 og type 2 diabetes kan behandles ved administrering av en effektiv mengde av løselige, muterte CTI_A4-molekyler til et individ.

Organtransplantasjon har vist seg som en foretrukket behandlingsmåte for mange former av livstruende sykdommer som involverer organskade. Forbedrede resultater i klinisk transplantasjon er oppnådd primært gjennom utviklingen av mer potente uspesifikke immunsuppresive medikamenter for å hemme avstøtningsresponser (Lancet, 345:1321-1325 (1995)). Mens korttidsresultater er forbedret, forblir langtidsutfall inadekvate. Fortiden er livslange immunsuppresive midler nødvendig for å bekjempe kronisk avstøtning av det transplanterte organet, og anvendelse av disse midlene øker dramatisk risikoene for kardiovaskulær sykdom, infeksjoner og maligniteter.

Utvikling av strategier for å fremme aksept av allogene vev uten behov for kronisk immunsuppresjon kan redusere risikoen for disse livstruende komplikasjonene og i øker høy grad anvendelsen av organ-, vevs- og celletransplantasjon for sykdommer slik som hemoglobinopatier, genetiske immundefekter og autoimmune sykdommer.

Insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM) er én av de mest vanlig forekommende metabolske lidelsene i verden. I USA berører IDDM omtrent hvert 300. til 400. menneske, og epidemiologiske studier antyder at forekomsten av IDDM vil fortsette å øke. IDDM er forårsaket ved en autoimmun respons som resulterer i den T-lymfocyttmedierte nedbrytningen av de insulinproduserende øycellene i pankreas.

Når de kliniske symptomene for IDDM blir synlig, er den mest vanlig anvendte terapien for å kontrollere de kliniske symptomene for IDDM eksogen insulinerstatning. Selv om insulinerstatningsterapi tillater de fleste IDDM-pasienter til å føre normale liv, gjenoppretter den ikke metabolsk homeostase fullstendig, og som et resultat av dette er alvorlige komplikasjoner omfattende dysfunksjoner av øye, nyre, hjerte og andre organer vanlig i diabetiske pasienter som gjennomgår insulinerstatningsterapi.

En lenge ønsket behandling for IDDM-pasienter er øytransplantasjon. Transplanterte insulinproduserende øyceller blir imidlertid ofte raskt ødelagt ved den samme autoimmune responsen som tidligere ødela pasientens egne øyceller. Av de 260 allotransplantatene transplantert siden 1990, har bare 12,4 % resultert i insulinuavhengighet for perioder på mer enn én uke, og bare 8,25 % er insulinuavhengige for perioder på mer enn ett år (Linsley et al., Diabetes (1997) 46:1120-3). I majoriteten av disse fremgangsmåtene bestod grunnkuren for immunsuppresjon av antistoffinduksjon med et antilymfocyttglobulin kombinert med cyklosporin, azatiprin og glukokortikoider.

For hvilken som helst transplantasjonsprosedyretype er en balanse mellom effektivitet og toksisitet en nøkkelfaktor for dens kliniske aksept. Med hensyn til øytransplantasjon er en ytterligere bekymring at mange av de nåværende immunsuppresive midlene med spesielle glukokortikoider eller en kalsineurinhemmer, slik som Tacrolimus, skader betaceller eller induserer perifer insulinresistens (Zeng et al., Surgery (1993) 113: 98-102).

En steroidfri immunsuppresiv protokoll ("Edmonton-protokollen") som omfatter sirolimus, lav dose Tacrolimus og et monoklonalt antistoff (mAb) mot IL-2 reseptor er anvendt i en studie av øytransplantasjon alene for pasienter med type 1 diabetes (Shapiro, A. M. J. et al., (2000), N. Eng. J. Med., 343: 230-238).

Den nylige suksessen ved anvendelse av "Edmonton-protokollen" har fornyet entusiasmen for å anvende øytransplantasjon for behandling av diabetes. Imidlertid kan bekymring vedrørende toksisitet av Tacrolimus begrense anvendelsen av denne terapien i mennesker. Biologiske midler som blokkerer viktige T-cellesamstimulatoriske signaler, spesielt CD28-signalveien, er potensielle alternativer for å beskytte allogene øyer. Eksempler på midler som blokkerer CD28-signalveien omfatter, men er ikke begrenset til, løselig CTLA4 inkludert muterte CTLA4-molekyler. C.J. WEBER et al., CTI_A4-lg Prolongs Survival of Microencapsulated Rabbit Islet Xenografts in Spontaneously Diabetic Nod Mice, Transplantation Proceedings, 1996, Vol. 28(2), side 821-823, omhandler overlevelse av diabetiske NOD mus ved øycelletransplantasjon, ved anvendelse av innkapslet ikke-mutert CDLA4-lg, og WO 0192337 omhandler mutert CTLA4-lg fusjonsprotein.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelse av et løselig mutert CTLA4 molekyl for fremstilling av et medikament for å inhibere avstøtning av øycelletransplantat, hvor det løselige muterte CTLA4 molekylet omfatter et mutert ekstracellulært domene av CTLA4, og hvor det løselige muterte CTLA4 molekylet er: a) L104EA29Ylg som vist i figur 3 som begynner med Ala i posisjon -1 eller Met i posisjon +1 og slutter med Lys i posisjon +357 (SEK ID NR:6, som begynner med Ala i posisjon 26 og slutter med Lys i posisjon 383, eller begynner med Met i posisjon 27 og slutter med Lys i posisjon 383);

b) L104Elg som vist i figur 19 som begynner med Ala i posisjon -1 eller Met i posisjon +1 og slutter med Lys i posisjon +357 (SEK ID NR:8, som begynner med

Ala i posisjon 26 og slutter med Lys i posisjon 383, eller begynner med Met i posisjon 27 og slutter med Lys i posisjon 383);

c) L104EA29Llg som vist i figur 20 som begynner med Ala i posisjon -1 eller Met i posisjon +1 og slutter med Lys i posisjon +357 (SEK ID NR: 10, som begynner

med Ala i posisjon 26 og slutter med Lys i posisjon 383, eller begynner med Met i posisjon 27 og slutter med Lys i posisjon 383);

d) L104EA29Tlg som vist i figur 21 som begynner med Ala i posisjon -1 eller Met i posisjon +1 og slutter med Lys i posisjon +357 (SEK ID NR: 12, som begynner

med Ala i posisjon 26 og slutter med Lys i posisjon 383, eller begynner med Met i posisjon 27 og slutter med Lys i posisjon 383); eller

e) L104EA29Wlg som vist i figur 22 som begynner med Ala i posisjon -1 eller Met i posisjon +1 og slutter med Lys i posisjon +357 (SEK ID NR:14, som begynner

med Ala i posisjon 26 og slutter med Lys i posisjon 383, eller begynner med Met i posisjon 27 og slutter med Lys i posisjon 383).

Disse og ytterligere trekk ved oppfinnelsen fremgår av de vedlagte kravene 1-32.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser den fullstendige nukleotid- (SEKV ID NR:1) og aminosyresekvensen (SEKV ID NR:2) for human CTLA4-reseptor fusjonert til onkostatin M-signalpeptidet. Onkostatin M-signalpeptidet er angitt i posisjon -25 til -1. Figur 2 viser en nukleotid- (SEKV ID NR:3) og aminosyresekvens (SEKV ID NR:4) av et CTI_A4lg med et signalpeptid; en villtypeaminosyresekvens av det ekstracellulære domenet til CTLA4 som begynner med metionin i posisjon +1 til asparaginsyre i posisjon +124 eller som begynner med alanin i posisjon -1 til asparaginsyre i posisjon +124; og en lg-region. Figur 3 viser en nukleotid- (SEKV ID NR:5) og aminosyresekvens (SEKV ID NR:6) av et mutert CTI_A4-molekyl (L104EA29Ylg) omfattende et signalpeptid; et mutert ekstracellulært domene av CTLA4 som begynner med metionin i posisjon +1 og slutter med asparaginsyre i posisjon +124 eller som begynner med alanin i posisjon -1 og slutter med asparaginsyre i posisjon +124; og en lg-region som beskrevet i Eksempel 1, infra. Figur 4 er en linjegraf som illustrerer fastende plasmaglukosenivå i et normalt individ, som beskrevet i Eksempel 3, infra. Figur 5 er en linjegraf som illustrerer fastende plasmaglukosenivå i pankreatektomiserte individer med transplanterte pankreatiske øyceller som beskrevet i Eksempel 3. Dyrene ble transplantert med øyceller på dag 0 og enten behandlet med en immunsuppresiv kur inneholdende L104EA29Ylg og en immunsuppresiv grunnkur (behandlet) eller bare en immunsuppresiv grunnkur (kontroll). Den immunsuppresive grunnkuren inneholdt rapamycin og anti-human IL2R. Figur 6 er en linjegraf som illustrerer insulinbehov i individer med transplanterte øyceller som beskrevet i Eksempel 3. Dyrene ble transplantert med øyceller på dag 0 og ble behandlet med en immunsuppresiv kur inneholdende L104EA29Ylg og en immunsuppresiv grunnkur (behandlet) eller bare en immunsuppresiv

grunnkur (kontroll).

Figur 7 er en linjegraf som illustrerer blodglukosenivå i en intravenøs glukosetoleransetest før og etter øytransplantasjon som beskrevet i Eksempel 3. Figur 8 viser et skjematisk diagram av en vektor, pil_N-L104EA29Y, som har L104EA29Ylg-innsettet. Figur 9A & 9B illustrerer resultater fra FACS-tester som viser binding av L104EA29Ylg, L104Elg og CTLA4lg til humane CD80- eller CD86-transfekterte CHO-celler som beskrevet i Eksempel 2, infra. Figur 10A & 10B viser hemming av proliferasjon av CD80-positive og CD86-positive CHO-celler som beskrevet i Eksempel 2, infra. Figur 11A & 11B viser at L104EA29Ylg er mer effektiv enn CTLA4lg til å hemme proliferasjon av primære og sekundære allostimulerte T-celler som beskrevet i Eksempel 2, infra. Figur 12A-C illustrerer at L104EA29Ylg er mer effektiv enn CTLA4lg til å hemme IL-2 (Figur 12A), IL-4 (Figur 12B) og y-interferon (Figur 12C) cytokinproduksjon fra allostimulerte humane T-celler som beskrevet i Eksempel 2, infra. Figur 13 viser at L104EA29Ylg er mer effektiv enn CTLA4lg til å hemme proliferasjon av fytohemaglutinin- (PHA) stimulerte T-celler fra ape som beskrevet i Eksempel 2, infra. Figur 14A-C er en SDS-gel (Figur 14A) for CTLA4lg (spor 1), L104Elg (spor 2) og L104EA29Ylg (spor 3A); og størrelseseksklusjonskromatografier av CTLA4lg (Figur 14B) og L104EA29Ylg (Figur 14C). Figur 15A og 15B illustrerer et diagram av den CTLA4-ekstracellulære IgV-lignende folden generert fra løsningsstrukturen bestemt ved NMR-spektroskopi. Figur 15B viser et utsnitt av S25-R33 regionen og MYPPPY-regionen som antyder lokasjon og sidekjedeorientering av de aviditetsøkende mutasjonene L104 og A29. Figur 16 viser fastende blodglukose for LEA29Ylg-behandlede- (A) og kontroll- (B) mottakere av allogene øyer (representative dyr) før og etter transplantasjon. Alle dyrene gjennomgikk kirurgisk pankreatektomi minst 2 uker før transplantasjon (gjennomsnittlig pretransplantasjonsinsulinbehov på 8,76 ± 0,18 enheter/dag) (C) Etter intraportal infusjon av allogene øyer ble mottakere raskt euglykemiske og trengte ikke eksogent insulin etter transplantasjon. (D) Diabetesinduksjon og posttransplantasjons øyfunksjon ble bekreftet ved intravenøs glukosetoleransetest før transplantasjon og 1 måned og 3 måneder etter transplantasjon, som beskrevet i Eksempel 3, infra. Figur 17 viser (A) immunhistologi av funksjonelt transplantert øy bekreftet ved positiv farging for insulin. (B) Øy fra et dyr som mottar kontrollkur omgitt av mononukleært infiltrat, hvilket indikerer avstøtning, som beskrevet i Eksempel 3, infra. Figur 18 viser suppresjon av anti-donor T- og B-celleresponser ved L104EA29Y-kur. (A) Anti-donor IFN-y-ELISpot-respons tilsvarer timing av avstøtning i kontrollene (-1 uke etter transplantasjon). (B) L104EA29Y-kur undertrykker effektivt dannelsen av anti-donor T-cellerespons. (C) Dyr som mottar rapamycin anti-IL-2R mAb produserer raskt detekterbart anti-donor antistoff, som målt ved væskestrømcytometriske metoder på avstøtningstidspunktet. (D) Øymottakere som mottar den L104EA29Y-inneholdende kuren genererer ikke en detekterbar anti-donor antistoffrespons mens de blir behandlet, som beskrevet i Eksempel 3, infra. Figur 19 viser nukleotid- og aminosyresekvensene til L104Elg (SEKV ID NR:7-8), som beskrevet i Eksempel 2, infra. Figur 20 viser nukleotid- og aminosyresekvensen til L104EA29Llg (SEKV ID NR:9-10). Figur 21 viser nukleotid- og aminosyresekvensene til L104EA29Tlg (SEKV ID

NR:11-12). Figur 22 viser nukleotid- og aminosyresekvensene til L104EA29Wlg (SEKV ID NR:13-14). Figur 23 viser nukleotidsekvensen til et CTLA4lg (SEKV ID NR: 15) med et signalpeptid; en villtypeaminosyresekvens av det ekstracellulære domenet til CTLA4 som begynner med metionin i posisjon +1 til asparaginsyre i posisjon +124 eller som begynner med alanin i posisjon -1 til asparaginsyre i posisjon +124; og en lg-region. Figur 24 viser aminosyresekvensen til et CTI_A4lg (SEKV ID NR: 16) med et signalpeptid; en villtypeaminosyresekvens av det ekstracellulære domenet til CTLA4 som begynner med metionin i posisjon +1 til asparaginsyre i posisjon +124 eller som begynner med alanin i posisjon -1 til asparaginsyre i posisjon +124; og en lg-region.

DEFINISJONER

Alle vitenskapelige og tekniske betegnelser anvendt i denne søknaden har betydninger vanligvis anvendt på området, med mindre noe annet er spesifisert. Som anvendt i denne søknaden har de følgende ord eller uttrykk betydningene som er spesifisert.

Slik det er anvendt heri, har "villtype CTLA4" aminosyresekvensen til naturlig forekommende, fullengde CTLA4 (US patent nr. 5.434.131, 5.844.095, 5.851.795) eller hvilken som helst del derav som binder et B7-molekyl (CD80 og/eller CD86) eller interfererer med et B7-molekyl (f.eks. CD80 og/eller CD86) slik at det blokkerer deres binding til deres ligand eller blokkerer deres binding til det ekstracellulære domenet til CTLA4 eller deler derav. I spesielle utførelsesformer starter villtype CTLA4 med metionin i posisjon +1 og slutter med asparaginsyre i posisjon +124, eller villtype CTLA4 starter med alanin i posisjon -1 og slutter med asparaginsyre i posisjon +124.1 andre utførelsesformer består villtype CTLA4 av de 187 aminosyrene til CTLA4-reseptoren som beskrevet i Figur 3 ifølge US pat. nr. 5.434.131, 5.844.095 og 5.851.795 og vist heri som Figur 1. Villtype CTLA4 er et celleoverflateprotein som har et N-terminalt ekstracellulært domene, et transmembrant domene og et C-terminalt cytoplasmatisk domene. Det ekstracellulære domenet binder til målantigener slik som CD80 og CD86.1 en celle blir det naturlig forekommende CTLA4-villtypeproteinet translatert som et umodent polypeptid som omfatter et signalpeptid på den N-terminale enden. Det umodne polypeptidet gjennomgår posttranslatorisk prosessering, som omfatter kutting og fjerning av signalpeptidet, for å generere et CTLA4-kutteprodukt med en nygenerert N-terminal ende som er forskjellig fra den N-terminale enden i den umodne formen. En fagperson vil forstå at videre posttranslatorisk prosessering kan forekomme, som fjerner én eller flere av aminosyrene fra den nygenererte N-terminale enden av CTLA4-kutteproduktet. Den modne formen av CTLA4-molekylet omfatter det ekstracellulære domenet til CTLA4 eller hvilken som helst del derav som binder til CD80 og/eller CD86.

Slik det er anvendt heri, er "det ekstracellulære domenet til CTLA4" delen av CTI_A4-reseptoren som stikker utenfor cellemembranen og omfatter hvilken som helst del av CTLA4 som stikker utenfor cellemembranen som gjenkjenner og binder CTLA4-ligander, slik som et B7-molekyl (f.eks. CD80- og/eller CD86-molekyler). For eksempel omfatter et ekstracellulært domene av CTLA4 metionin i posisjon +1 til asparaginsyre i posisjon +124 (Figur 2). Alternativt omfatter et ekstracellulært domene av CTLA4 alanin i posisjon +1 til asparaginsyre i posisjon +125 (Figur 1). Det ekstracellulære domenet omfatter fragmenter eller derivater av CTLA4 som binder et B7-molekyl (f.eks. CD80 og/eller CD86).

Slik det er anvendt heri, er en "ikke-CTI_A4 proteinsekvens" eller "ikke-CTLA4 molekyl" definert som hvilket som helst molekyl som ikke binder CD80 og/eller CD86 og som ikke interfererer med bindingen av CTLA4 til dets mål. Et eksempel omfatter, men er ikke begrenset til, en immunglobulin (lg) konstant region eller en del derav. Fortrinnsvis er den lg-konstante regionen en human eller ape lg-konstant region, f.eks. human C(gamma)1, omfattende hengsels-, CH2- og CH3-regionene. Den lg-konstante regionen kan muteres for å redusere dens effektorfunksjoner (US patent nr. 5.637.481 og 6.090.914).

Slik det er anvendt heri, henviser "løselig" til hvilket som helst molekyl eller fragmenter og derivater derav som ikke er bundet eller festet til en celle, dvs. som er i sirkulasjonen. For eksempel kan CTLA4, L104EA29Ylg, B7 eller CD28 gjøres løselig ved å feste en immunglobulin (Ig)-gruppe til det ekstracellulære domenet av henholdsvis CTLA4, B7 eller CD28. Andre molekyler kan være papillomavirus E7-genprodukt (E7), melanomassosiert antigen p97 (p97) eller HIV env-protein (env gp120). Alternativt kan et molekyl slik som CTLA4 gjøres løselig ved fjerning av dets transmembrane domene. Typisk omfatter ikke de løselige molekylene anvendt i fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse en signal (eller leder) sekvens.

"CTLA4lg" er et løselig fusjonsprotein omfattende et ekstracellulært domene av CTLA4 eller en del derav som binder CD80 og/eller CD86 koblet til en lg-hale. En spesiell utførelsesform omfatter det ekstracellulære domenet av villtype CTLA4 som begynner med metionin i posisjon +1 og slutter med asparaginsyre i posisjon +124; eller som begynner med alanin i posisjon -1 til asparaginsyre i posisjon +124; en glutaminovergangsaminosyrerest i posisjon +125; og en immunglobulindel som omfatter glutaminsyre i posisjon +126 til og med lysin i posisjon +357 (Figur 2). DNA som koder for CTLA4lg ble deponert 31. mai, 1991, hos American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, i henhold til Budapestkonvensjonen og er tildelt ATCC-aksesjonsnummer ATCC 68629; Linsley, P. et al., 1994 Immunity 1:793-80. CTLA4lg-24, en kinesisk hamster eggstokk (CHO) cellelinje som uttrykker CTLA4lg ble deponert 31. mai, 1991, med ATCC-identifikasjonsnummer CRL-10762). De løselige CTLA4lg-molekylene anvendt i fremgangsmåtene og/eller testsettene ifølge foreliggende oppfinnelse kan eller kan ikke omfatte en signal (leder) peptidsekvens. Typisk, i fremgangsmåtene og/eller testsettene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter ikke molekylene en signalpeptidsekvens.

Slik det er anvendt heri, betyr "løselige CTLA4-molekyler" ikke-celleoverflatebundne (dvs. sirkulerende) CTLA4-molekyler (villtype eller mutant) eller hvilken som helst funksjonell del av et CTLA4-molekyl som binder B7 inkludert, men ikke begrenset til: CTI_A4lg-fusjonsproteiner (f.eks. ATCC 68629), der det ekstracellulære domenet til CTLA4 er fusjonert til en immunglobulin (lg)- gruppe som gjør fusjonsmolekylet løselig, eller fragmenter og derivater derav; proteiner med det ekstracellulære domenet til CTLA4 fusjonert eller koblet med en del av et biologisk aktivt eller kjemisk aktivt protein, slik som papillomavirus E7-genproduktet (CTLA4-E7), melanomassosiert antigen p97 (CTLA4-p97) eller HIV env-protein (CTLA4-env gp120) eller fragmenter og derivater derav; hybrid (kimæriske) fusjonsproteiner slik som CD28/CTLA4lg eller fragmenter og derivater derav; CTLA4-molekyler med det transmembrane domenet fjernet for å gjøre proteinet løselig (Oaks, M. K., et al., 2000 Cellular Immunology 201:144-153) eller fragmenter og derivater derav. "Løselige CTLA4-molekyler" omfatter også fragmenter, deler eller derivater derav og løselige, muterte CTLA4-molekyler som har CTLA4-bindingsaktivitet. De løselige CTLA4-molekylene anvendt i fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse kan eller kan ikke omfatte en signal (leder) peptidsekvens. Typisk, i fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter ikke molekylene en signalpeptidsekvens.

Slik det er anvendt heri, er et "fusjonsprotein" definert som én eller flere aminosyresekvenser koblet sammen ved anvendelse av fremgangsmåter velkjent på området og som beskrevet i US pat. nr. 5.434.131 eller 5.637.481. De koblede aminosyresekvensene danner dermed ett fusjonsprotein.

Slik det er anvendt heri, er et "mutert CTLA4-molekyl" et molekyl som kan være fullengde CTLA4 eller deler derav (derivater eller fragmenter) som har én eller flere mutasjoner i CTLA4 (fortrinnsvis i det ekstracellulære domenet til CTLA4) slik at det er lik, men ikke identisk med, CTLA4-villtypemolekylet. Muterte CTLA4-molekyler binder et B7-molekyl (f.eks. enten CD80 eller CD86 eller begge). Muterte CTLA4-molekyler kan omfatte et biologisk eller kjemisk aktivt ikke-CTLA4-molekyl deri eller festet dertil. De muterte molekylene kan være løselige (dvs. sirkulerende) eller bundet til en overflate. Muterte CTLA4-molekyler kan omfatte hele det ekstracellulære domenet til CTLA4 eller deler derav, f.eks. fragmenter eller derivater. Muterte CTLA4-molekyler kan fremstilles syntetisk eller rekombinant.

Slik det er anvendt heri, er betegnelsen "mutasjon" en forandring i nukleotid- eller aminosyresekvensen til et villtypepolypeptid. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en mutasjon eller en forandring i det villtype CTLA4-ekstracellulære domenet. Forandringene i CTLA4-villtypesekvensen omfatter konservative og ikke-konservative forandringer. Forandringen kan være en aminosyreforandring som omfatter substitusjoner, delesjoner, addisjoner eller trunkeringer. Et mutert molekyl kan ha én eller flere mutasjoner. Mutasjoner i en nukleotidsekvens kan eller kan ikke resultere i en mutasjon i aminosyresekvensen noe som er velkjent blant fagfolk på området. Med hensyn til dette koder visse nukleotidkodoner for den samme aminosyren. Eksempler omfatter nukleotidkodonene CGT, CGG, CGC og CGA som koder for aminosyren arginin (R); eller kodonene GAT og GAC som koder for aminosyren asparaginsyre (D). Derfor kan et protein kodes for av ett eller flere nukleinsyremolekyler som er forskjellige i deres spesifikke nukleotidsekvens, men som fortsatt koder for proteinmolekyler med identiske sekvenser. Den aminosyrekodende sekvensen er som følger:

"L104EA29Ylg" er et fusjonsprotein som er et løselig, mutert CTI_A4-molekyl omfattende et ekstracellulært domene av villtype CTLA4 med aminosyreforandringene A29Y (en tyrosinaminosyrerest som substituerer for alanin i posisjon 29) og L104E (en glutaminsyreaminosyrerest som substituerer for leucin i posisjon +104) eller en del derav som binder et B7-molekyl, koblet til en lg-hale (inkludert i Figur 3; DNA som koder for L104EA29Ylg ble deponert hos American Type Culture Collection 20. juni, 2000, og tildelt ATCC-nummer PTA-2104). De løselige L104EA29Ylg-molekylene anvendt i fremgangsmåtene og/eller testsettene ifølge foreliggende oppfinnelse kan eller kan ikke omfatte en signal (leder) peptidsekvens. Typisk, i fremgangsmåtene og/eller testsettene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter ikke molekylene en signalpeptidsekvens.

Det mutante molekylet kan ha én eller flere mutasjoner. Slik det er anvendt heri, betyr en "ikke-CTLA4-proteinsekvens" eller "ikke-CTLA4-molekyl" hvilket som helst proteinmolekyl som ikke binder B7 og som ikke interfererer med bindingen av CTLA4 til dets mål. Et eksempel omfatter, men er ikke begrenset til, en immunglobulin (lg) konstant region eller del derav. Fortrinnsvis er den lg-konstante regionen en human eller ape lg konstant region, f.eks. human C(gamma)1, omfattende hengsels-, CH2- og CH3-regionene. Den lg-konstante regionen kan muteres for å redusere dens effektorfunksjoner (US patenter 5.637.481, 5.844.095 og 5.434.131).

Slik det er anvendt heri, er et "fragment" eller "del" hvilken som helst del eller segment av et molekyl, f.eks. CTLA4 eller CD28, fortrinnsvis det ekstracellulære domenet til CTLA4 eller CD28 eller en del eller segment derav, som gjenkjenner og binder dets mål, f.eks. et B7-molekyl.

Slik det er anvendt heri, henviser "B7" til B7-molekylfamilien omfattende, men ikke begrenset til, B7-1 (CD80) (Freeman et al., 1989, J Immunol. 143: 2714-2722, inntatt heri ved referanse i sin helhet), B7-2 (CD86) (Freeman et al., 1993, Science 262:909-911, inntatt heri ved referanse i sin helhet; Azuma et al., 1993, Nature 366:76-79, inntatt heri ved referanse i sin helhet) som kan gjenkjenne og binde CTLA4 og/eller CD28.

Slik det er anvendt heri, henviser "CD28" til molekylet som gjenkjenner og binder B7 som beskrevet i US serie nr. 5.580.756 og 5.521.288 (inntatt heri ved referanse i deres helhet).

Slik det er anvendt heri, er "B7-positive celler" hvilke som helst celler med én eller flere typer B7-molekyler uttrykt på celleoverflaten.

Slik det er anvendt heri, er et "derivat" et molekyl som har sekvenslikhet og aktivitet til dets foreldermolekyl. For eksempel omfatter et derivat av CTLA4 et løselig CTLA4-molekyl med en aminosyresekvens som er minst 70 % lik det ekstracellulære domenet til villtype CTLA4 og som gjenkjenner og binder B7, f.eks. CTLA4lg eller løselig, mutert CTLA4-molekyl L104EA29Ylg.

Slik det er anvendt heri, betyr å "blokkere" eller "hemme" en reseptor, signal eller molekyl å interferere med aktivering av reseptoren, signalet eller molekylet, som detekteres med en godkjent test i faget. For eksempel kan blokkering av en cellemediert immunrespons detekteres ved å bestemme reduksjon av symptomer assosiert med revmatisk sykdom. Blokkering eller hemming kan være delvis eller fullstendig.

Slik det er anvendt heri, betyr "blokkering av B7-interaksjon" å interferere med bindingen av B7 til dets ligander, slik som CD28 og/eller CTLA4, og dermed hindre T-celle og B7-positive celleinteraksjoner. Eksempler på midler som blokkerer B7-interaksjoner omfatter, men er ikke begrenset til, molekyler slik som et antistoff (eller del eller derivat derav) som gjenkjenner og binder til hvilke som helst av CTLA4-, CD28- eller B7-molekyler (f.eks. B7-1, B7-2); en løselig form (eller del eller derivat derav) av molekylene slik som løselig CTLA4; et peptidfragment eller annet lite molekyl utformet til å interferere med cellesignalet via den CTI_A4/CD28/B7-medierte interaksjonen. I en foretrukket utførelsesform er det blokkerende midlet et løselig CTLA4-molekyl, slik som CTLA4lg (ATCC 68629) eller L104EA29Ylg (ATCC PTA-2104), et løselig CD28-molekyl slik som CD28lg (ATCC 68628), et løselig B7-molekyl slik som B7lg (ATCC 68627), et anti-B7 monoklonalt antistoff (f.eks. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 og monoklonale antistoffer som beskrevet av Anderson et al. i US patent 6.113.898 eller Yokochi et al., 1982, J. Immun., 128(2):823-827), et anti-CTLA4 monoklonalt antistoff (f.eks. ATCC HB-304 og monoklonale antistoffer som beskrevet i referansene 82-83) og/eller et anti-CD28 monoklonalt antistoff (f.eks. ATCC HB 11944 og mAb 9.3 som beskrevet av Hansen (Hansen et al., 1980, Immunogenetics 10:247-260) eller Martin (Martin et al., 1984, J. Clin. Immun., 4(1): 18-22)).

Slik det er anvendt heri, betyr "immunsystemsykdom" hvilken som helst sykdom mediert av T-celleinteraksjoner med B7-positive celler omfattende, men ikke begrenset til, autoimmune sykdommer, transplantatrelaterte lidelser og immunproliferative sykdommer. Eksempler på immunsystemsykdommer omfatter transplantat-mot-vert-reaksjon (GVHD) (f.eks. slik som kan følge av beinmargstransplantasjon eller i induksjon av toleranse), immunlidelser assosiert med transplantatavstøtning, kronisk avstøtning og vev eller celle allo- eller xenotransplantater, omfattende organer, hud, øyer, muskler, hepatocytter og nevroner. Eksempler på immunproliferative sykdommer omfatter, men er ikke begrenset til, psoriasis, T-cellelymfom, akutt lymfoblastisk T-celleleukemi, testikulært angiocentrisk T-cellelymfom, godartet lymfocyttisk angitt, lupus (f.eks. lupus erythematosus, lupus nefritt), Hashimotos tyreoiditt, primært myksødem, Graves sykdom, pernisiøs anemi, autoimmun atrofisk gastritt, Addisons sykdom, diabetes (f.eks. insulinavhengig diabetes mellitis, type I diabetes mellitis, type II diabetes mellitis), Goodpastures syndrom, myasthenia gravis, pemfigus, Crohns sykdom, sympatisk oftalmi, autoimmun uveitt, multippel sklerose, autoimmun hemolytisk anemi, idiopatisk trombocytopeni, primær biliær cirrhose, kronisk aktiv hepatitt, ulcerøs kolitt, Sjogrens syndrom, revmatiske sykdommer (f.eks. revmatoid artritt), polymyositt, skleroderm og blandet bindevevssykdom.

Slik det er anvendt heri, omfatter "individ", men er ikke begrenset til, menneske, ikke-humane primater (f.eks. ape, menneskeape), sau, kanin, gris, hund, katt, mus eller rotte.

Slik det er anvendt heri, er "vevstransplantat" definert som et vev fra hele eller en del av et organ som blir transplantert til et mottakerindivid. I visse utførelsesformer er vevet fra ett eller flere organer. Eksempler på vev eller organer omfatter, men er ikke begrenset til, hud, hjerte, lunge, pankreas, nyre, lever, beinmarg, pankreatiske øyceller, pluripotente stamceller, cellesuspensjoner og genetisk modifiserte celler. Vevet kan fjernes fra et donorindivid eller kan dyrkes in vitro. Transplantatet kan være et auto-, iso-, allo- eller xenotransplantat eller en kombinasjon derav.

Slik det er anvendt heri, er "transplantatavstøtning" definert som det nesten fullstendige eller fullstendige tapet av levende transplantatvev fra mottakerindividet.

Slik det er anvendt heri, er "innkapsling" definert som en prosess som immunisolerer celler og/eller celleclustere, som produserer og sekrerer terapeutiske substanser, f.eks. insulin, og den medisinske anvendelsen av disse formuleringene. Innkapslingsprosessen involverer plassering av cellene og/eller celleclusterne i en semipermeabel membranbarriere før transplantasjon for å unngå avstøtning av immunsystemet. Molekylvekt cut-off av innkapslingsmembranen kan kontrolleres av innkapslingsfremgangsmåten for å utelukke innadgående diffusjon av immunglobulin og lytiske faktorer i komplementsystemet, men tillater passering av mindre molekyler slik som glukose og insulin. Innkapsling tillater øycellene å respondere fysiologisk til forandringer i blodglukose, men hindrer kontakt med komponenter i immunsystemet. Fremgangsmåter for innkapsling av pankreatiske øyceller er beskrevet i US patent 6.080.412.

Slik det er anvendt heri, henviser "ligand" til et molekyl som spesifikt gjenkjenner og binder et annet molekyl, for eksempel er en ligand for CTLA4 et CD80- og/eller CD86-molekyl.

Slik det er anvendt heri, omfatter "en løselig ligand som gjenkjenner og binder CD80- og/eller CD86-antigen" ligander slik som CTLA4lg, CD28lg eller andre løselige former av CTLA4 og CD28; rekombinant CTLA4 og CD28; muterte CTLA4-molekyler slik som L104EA29Ylg; og hvilket som helst antistoffmolekyl, fragment derav eller rekombinant bindende protein som gjenkjenner og binder et CD80- og/eller CD86-antigen. Disse midlene er også betraktet som "immunsuppresive midler".

Slik det er anvendt heri, er "samstimulatorisk signalvei" definert som en biokjemisk signalvei som følger av interaksjon av samstimulatoriske signaler på T-celler og antigenpresenterende celler (APCer). Samstimulatoriske signaler bidrar til å bestemme størrelsen av en immunologisk respons til et antigen. Ett samstimulatorisk signal blir fremskaffet ved interaksjon med T-cellereseptorene CD28 og CTLA4 med CD80- og/eller CD86-molekyler på APCer.

Slik det er anvendt heri, omfatter "CD80 og/eller CD86" B7-1 (også kalt CD80). B7-2 (også kalt CD86), B7-3 (også kalt CD74) og B7-familien, f.eks. en kombinasjon av B7-1, B7-2 og/eller B7-3.

Slik det er anvendt heri, er "samstimulatorisk blokkering" definert som en protokoll ved å administrere til et individ ett eller flere midler som interfererer eller blokkerer en samstimulatorisk signalvei, som beskrevet ovenfor. Eksempler på midler som interfererer med den samstimulatoriske blokkeringen omfatter, men er ikke begrenset til, løselig CTLA4, mutert CTLA4, løselig CD28, anti-B7 monoklonale antistoffer (mAb'er), løselig CD40 og anti-gp39 mAb'er. I én utførelsesform er L104EA29Ylg et foretrukket middel som interfererer med den samstimulatoriske blokkeringen.

Slik det er anvendt heri, er "T-celledepletert beinmarg" definert som beinmarg fjernet fra bein som er eksponert for en anti-T-celleprotokoll. En anti-T-celleprotokoll er definert som en fremgangsmåte for å fjerne T-celler fra beinmarg. Fremgangsmåter for selektiv fjerning av T-celler er velkjent på området. Et eksempel på en anti-T-celleprotokoll er å eksponere beinmarg for T-cellespesifikke antistoffer, slik som anti-CD3, anti-CD4, anti-CD5, anti-CD8 og anti-CD90 monoklonale antistoffer, der antistoffene er cytotoksiske til T-cellene. Alternativt kan antistoffene kobles til magnetiske partikler for å muliggjøre fjerning av T-celler fra beinmarg ved anvendelse av magnetisk felt. Et annet eksempel på en anti-T-celleprotokoll er å eksponere beinmarg T-celler for anti-lymfocytt serum eller anti-tymocytt globulin.

Slik det er anvendt heri, er "toleranseinduserende dose av T-celledepletert beinmarg" definert som en innledende dose av T-celledepletert beinmarg som blir administrert til et individ med formål om å inaktivere potensielle donorreaktive T-celler.

Slik det er anvendt heri, er "transplantert dose av T-celledepletert beinmarg" definert som en senere dose av T-celledepletert beinmarg som blir administrert til et individ med formål om å etablere en blandet hematopoetisk kimær. Den transplanterte dosen av T-celledepletert beinmarg vil følgelig bli administrert etter den toleranseinduserende dosen av T-celledepletert beinmarg.

Slik det er anvendt heri, er "blandet hematopoetisk kimær" definert som nærvær av donor- og mottaker blodprogenitor- og modne celler (f.eks. blodavledede celler) i fravær (eller ikke-detekterbart nærvær) av en immunrespons.

Slik det er anvendt heri, er "donor-mottaker paringer" definert basert på molekylær typing ved anvendelse av et panel av tidligere definerte viktige vevsforlikelighetsalleler (8 klasse I og 12 klasse II) (Lobashevsky A. et al., Tissue Antigens 54:254-263, (1999); Knapp LA, et al., Tissue Antigens 50:657-661,

(1997); Watkins D. I., Crit Rev Immunol 15:1-29, (1995)). Paringer maksimerte ulikhet i både klasse I- og ll-loki.

Slik det er anvendt heri, omfatter "administrere" eller "administrering" til et individ, men er ikke begrenset til, intravenøs (i.v.) administrering, intraperitoneal (i.p.) administrering, intramuskulær (i.m.) administrering, subkutan administrering, oral administrering, administrering ved injeksjon, som en stikkpille eller implantering av en sakte frigjøringsanordning, slik som en miniosmotisk pumpe, til individet.

Slik det er anvendt heri, omfatter "farmasøytisk akseptabel bærer" hvilket som helst materiale som, når kombinert med det reaktive midlet, beholder det reaktive midlets biologiske aktivitet, f.eks. bindingsspesifisitet, og er ikke-reaktivt med individets immunsystem. Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til, hvilken som helst av de standard farmasøytiske bærerne slik som en fosfatbufret saltvannsløsning, vann, emulsjoner slik som olje/vann-emulsjon og ulike typer fuktemidler. Andre bærere kan også omfatte sterile løsninger, tabletter, inkludert belagte tabletter, og kapsler. Typisk inneholder slike bærere hjelpestoffer, slik som stivelse, melk, sukker, visse typer leire, gelatin, stearinsyre eller salter derav, magnesium eller kalsiumstearat, talkum, vegetabilsk fett eller oljer, gummi, glykoler eller andre kjente hjelpestoffer. Slike bærere kan også omfatte smaks- og fargetilsetningsstoffer eller andre bestanddeler. Sammensetninger omfattende slike bærere blir formulert ved velkjente konvensjonelle fremgangsmåter.

Slik det er anvendt heri, er "immunsuppresive midler" definert som en sammensetning som har én eller flere typer molekyler som hindrer forekomsten av en immunrespons eller svekker et individs immunsystem. Fortrinnsvis reduserer eller forebygger midlene T-celleproliferasjon. Noen midler kan hemme T-celleproliferasjon ved å hemme interaksjon av T-celler med andre antigenpresenterende celler (APCer). Ett eksempel på APCer er B-celler. Eksempler på midler som interfererer med T-celleinteraksjoner med APCer og dermed hemmer T-celleproliferasjon omfatter, men er ikke begrenset til, ligander for CD80- og/eller CD86-antigener, ligander for CTI_A4-antigen og ligander for CD28-antigen. Eksempler på ligander for CD80- og/eller CD86-antigener omfatter, men er ikke begrenset til, løselig CTLA4, løselig CTLA4-mutant, løselig CD28 eller monoklonale antistoffer som gjenkjenner og binder CD80- og/eller CD86-antigener eller fragmenter derav. Ett foretrukket middel er L104EA29Ylg. Ligander for CTLA4- eller CD28-antigener omfatter monoklonale antistoffer som gjenkjenner og binder CTLA4 og/eller CD28 eller fragmenter derav. Andre ligander for CTLA4 eller CD28 omfatter løselige CD80- og/eller CD86-molekyler, slik som CD80 og/eller CD86lg. Fagfolk vil lett forstå at andre midler eller ligander kan anvendes for å hemme interaksjonen av CD28 med CD80 og/eller CD86.

Immunsuppresive midler omfatter, men er ikke begrenset til, metotreksat, cyklofosfamid, cyklosporin, cyklosporin A, klorokin, hydroksyklorokin, sulfasalazin (sulfasalazopyrin), gullsalter, D-penicillamin, leflunomid, azatioprin, anakinra, infliksimab (REMICADE<R>), etanercept, TNFa-blokkere, et biologisk middel som er rettet mot et inflammatorisk cytokin og ikke-steroid antiinflammatorisk legemiddel (NSAID'er). NSAID'er omfatter, men er ikke begrenset til, acetylsalisylsyre, kolinmagnesiumsalicylat, diflunisal, magnesiumsalicylat, salsalat, natriumsalicylat, diklofenak, etodolac, fenoprofen, flurbiprofen, indometacin, ketoprofen, ketorolac, meclofenamat, naproxen, nabumeton, fenylbutazon, piroxicam, sulindac, tolmetin, acetaminofen, ibuprofen, Cox-2 hemmere og tramadol.

CTI_A4-molekyler, med muterte- eller villtypesekvenser, kan gjøres løselig ved å fjerne det CTI_A4-transmembrane segmentet (Oaks, M. K., et al., 2000 Cellular Immunology 201:144-153).

Alternativt kan løselige CTI_A4-molekyler, med muterte- eller villtypesekvenser, være fusjonsproteiner, der CTLA4-molekylene er fusjonert til ikke-CTI_A4-grupper slik som immunglobulin (lg) molekyler som gjør CTLA4-molekylene løselig. For eksempel kan et CTI_A4-fusjonsprotein omfatte det ekstracellulære domenet til CTLA4 fusjonert til et immunglobulin konstant domene som resulterer i CTLA4lg-molekylet (Figur 2) (Linsley, P. S., et al., 1994 Immunity 1:793-80).

For kliniske protokoller er det foretrukket at immunglobulingruppen ikke fremkaller en skadelig immunrespons i et individ. Den foretrukne gruppen er den immunglobulinkonstante regionen, omfattende human eller ape immunglobulinkonstante regioner. Ett eksempel på en egnet immunglobulinregion er human Cy1, inkludert hengsels-, CH2- og CH3-regionene, som kan mediere effektorfunksjoner slik som binding til Fc-reseptorer som medierer komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) eller antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC). Immunglobulingruppen kan ha én eller flere mutasjoner deri (f.eks. i CH2-domenet, for å redusere effektorfunksjoner slik som CDC eller ADCC), der mutasjonen modulerer bindingsevnen av immunglobulinet til dets ligand, ved å øke eller redusere bindingsevnen av immunglobulinet til Fc-reseptorer. For eksempel kan mutasjoner i immunglobulingruppen omfatte forandringer i hvilken som helst eller alle dens cysteinrester i hengselsdomenet, for eksempel er cysteinene i posisjonene +130, +136 og +139 substituert med serin (Figur 24). Immunglobulingruppen kan også omfatte prolin i posisjon +148 substituert med et serin, som vist i Figur 24. Videre kan mutasjonene i immunglobulingruppen omfatte å ha leucin i posisjon +144 substituert med fenylalanin, leucin i posisjon +145 substituert med glutaminsyre eller glysin i posisjon +147 substituert med alanin.

Ytterligere ikke-CTLA4-grupper for anvendelse i de løselige CTLA4-molekylene eller løselige, muterte CTLA4-molekylene omfatter, men er ikke begrenset til, p97-molekyl, env gp120-molekyl, E7-molekyl og ova-molekyl (Dash, B. et al., 1994 J. Gen. Virol. 75 (Pt 6): 1389-97; Ikeda, T. et al., 1994 Gene 138(1-2): 193-6; Falk, K., et al., 1993 Cell. Immunol. 150(2):447-52; Fujisaka, K. et al., 1994 Virology 204(2):789-93). Andre molekyler er også mulig (Gerard, C. et al., 1994 Neuroscience 62(3):721; Byrn, R. et al., 1989 63(10):4370; Smith, D. et al., 1987 Science 238:1704; Lasky, L. 1996 Science 233:209).

Det tilveiebringes løselige CTLA4-molekyler omfattende en signalpeptidsekvens koblet til den N-terminale enden av det ekstracellulære domenet til CTLA4-delen av molekylet. Signalpeptidet kan være hvilken som helst sekvens som vil muliggjøre sekresjon av det muterte molekylet, inkludert signalpeptidet fra onkostatin M (Malik, et al., 1989 Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853), eller CD5 (Jones, N. H. et al., 1986 Nature 323:346-349) eller signalpeptidet fra hvilket som helst ekstracellulært protein. Det løselige CTLA4-molekylet ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte onkostatin M-signalpeptidet bundet på den N-terminale enden av det ekstracellulære domenet til CTLA4 og det humane immunglobulinmolekylet (f.eks. hengsel, CH2 og CH3) bundet til den C-terminale enden av det ekstracellulære domenet (villtype eller mutert) av CTLA4. Dette molekylet omfatter onkostatin M-signalpeptidet omfattende en aminosyresekvens som har metionin i posisjon -26 til og med alanin i posisjon -1, CTLA4-delen omfattende en aminosyresekvens som har metionin i posisjon +1 til og med asparaginsyre i posisjon +124, en glutaminovergangsaminosyrerest i posisjon +125 og immunglobulindelen omfattende en aminosyresekvens som har glutaminsyre i posisjon +126 til og med lysin i posisjon +357.

I én utførelsesform er de løselige, muterte CTLA4-molekylene omfattende de muterte CTLA4-sekvensene beskrevet infra, fusjonsmolekyler omfattende humane lgC(gamma)1 (dvs. IgCyl) grupper fusjonert til de muterte CTLA4-fragmentene. De løselige, muterte CTLA4-molekylene kan omfatte én eller flere mutasjoner (f.eks. aminosyresubstitusjoner, -delesjoner eller -insersjoner) i det ekstracellulære domenet til CTLA4.

For eksempel kan de løselige, muterte CTLA4-molekylene omfatte en mutasjon eller mutasjoner i eller nær regionen omfattet av serin i posisjon +25 til og med arginin i posisjon +33 (f.eks. S25-R33, ved anvendelse av standard én-bokstavs aminosyresymboler). De muterte CTI_A4-molekylene kan omfatte en aminosyresubstitusjon i hvilken som helst av én eller flere av de følgende posisjonene: S25, P26, G27, K28, A29, T30, E31 eller R33.

I en annen utførelsesform kan de løselige, muterte CTI_A4-molekylene omfatte en mutasjon eller mutasjoner i eller nær regionen omfattet av glutaminsyre i posisjon +95 til glysin i posisjon +107 (f.eks. E95-G107). De muterte CTI_A4-molekylene kan omfatte en aminosyresubstitusjon i hvilken som helst av én eller flere av de følgende posisjonene: K93, L96, M97, Y98, P99, P100, P101, Y102, Y103, L104, G105, 1106 ogG107.

I tillegg tilveiebringes løselige, muterte CTLA4-molekyler som har en mutasjon eller mutasjoner i eller nær regionen omfattet av asparagin +108 til isoleucin i posisjon +115 (f.eks. N108-1115). Det muterte CTLA4-molekylet kan omfatte en aminosyresubstitusjon i hvilken som helst av én eller flere av de følgende posisjonene: L104, G105,1106, G107, Q111, Y113 eller 1115.

I én utførelsesform omfatter de løselige, muterte CTLA4-molekylene IgCyl fusjonert til et CTI_A4-f rag ment omfattende en enkeltsetemutasjon i det ekstracellulære domenet. Det ekstracellulære domenet av CTLA4 omfatter metionin i posisjon +1 til og med asparaginsyre i posisjon +124 (f.eks. Figur 1). Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon -1 til og med asparaginsyre i posisjon +124 (f.eks. Figur 1).

Eksempler på enkeltsetemutasjoner omfatter følgende der leucin i posisjon +104 er forandret til hvilken som helst annen aminosyre:

Videre tilveiebringes muterte molekyler som har det ekstracellulære domenet til CTLA4 med to mutasjoner fusjonert til en lg Cy1-gruppe. Eksempler omfatter følgende der leucin i posisjon +104 er forandret til en annen aminosyre (f.eks. glutaminsyre) og glysin i posisjon +105, serin i posisjon +25, treonin i posisjon +30 eller alanin i posisjon +29 er forandret til hvilken som helst annen aminosyre:

Fortsatt videre tilveiebringes muterte molekyler som har det ekstracellulære domenet til CTLA4 omfattende tre mutasjoner fusjonert til en lg Cy1-gruppe. Eksempler omfatter følgende der leucin i posisjon +104 er forandret til en annen aminosyre (f.eks. glutaminsyre), alanin i posisjon +29 er forandret til en annen aminosyre (f.eks. tyrosin) og serin i posisjon +25 er forandret til en annen aminosyre:

Løselige, muterte CTLA4-molekyler kan ha en overgangsaminosyrerest som er lokalisert mellom CTLA4- og lg-delen av molekylet. Overgangsaminosyren kan være hvilken som helst aminosyre, inkludert glutamin. Overgangsaminosyren kan innføres ved molekylære eller kjemiske syntesefremgangsmåter kjent på området.

Det tilveiebringes løselige, muterte CTLA4-molekyler omfattende en enkeltsetemutasjon i det ekstracellulære domenet til CTLA4 slik som L104Elg (som inkludert i Figur 19) eller L104Slg, der L104Elg og L104Slg er mutert i deres CTI_A4-sekvenser slik at leucin i posisjon +104 er substituert med henholdsvis glutaminsyre eller serin. De enkeltsetemuterte molekylene omfatter videre CTLA4-deler som omfatter metionin i posisjon +1 til og med asparaginsyre i posisjon +124, en glutaminovergangsaminosyrerest i posisjon +125 og en immunglobulindel som omfatter glutaminsyre i posisjon +126 til og med lysin i posisjon +357. Immunglobulindelen av det muterte molekylet kan også muteres slik at cysteinene i posisjonene +130, +136 og +139 er substituert med serin og prolin i posisjon +148 er substituert med serin. Alternativt kan det enkeltsetemuterte, løselige CTI_A4-molekylet ha en CTLA4-del som omfatter alanin i posisjon -1 til og med asparaginsyre i posisjon +124.

Det tilveiebringes løselige, muterte CTLA4-molekyler omfattende en dobbeltsetemutasjon i det ekstracellulære domenet til CTLA4, slik som L104EA29Ylg, L104EA29Llg, L104EA29Tlg eller L104EA29Wlg, der leucin i posisjon +104 er substituert med en glutaminsyre og alanin i posisjon +29 er forandret til henholdsvis tyrosin, leucin, treonin og tryptofan. Sekvensene for L104EA29Ylg, L104EA29Llg, L104EA29Tlg og L104EA29Wlg, som begynner med metionin i posisjon +1 og slutter med lysin i posisjon +357, pluss en signal (leder) peptidsekvens er inkludert i sekvensene som vist i henholdsvis Figur 3 og 20-22. De dobbeltsetemuterte molekylene omfatter videre CTLA4-deler som omfatter metionin i posisjon +1 til og med asparaginsyre i posisjon +124, en glutaminovergangsaminosyrerest i posisjon +125 og en immunglobulindel som omfatter glutaminsyre i posisjon +126 til og med lysin i posisjon +357. Immunglobulindelen av det muterte molekylet kan også muteres, slik at cysteinene i posisjonene +130, +136 og +139 er substituert med serin og prolin i posisjon +148 er substituert med serin. Alternativt kan disse muterte molekylene ha en CTLA4-del som omfatter alanin i posisjon -1 til og med asparaginsyre i posisjon +124.

Det tilveiebringes løselige, muterte CTI_A4-molekyler omfattende en dobbeltsetemutasjon i det ekstracellulære domenet til CTLA4, slik som L104EG105Flg, L104EG105Wlg og L104EG105Llg, der leucin i posisjon +104 er substituert med en glutaminsyre og glysin i posisjon +105 er substituert henholdsvis med fenylalanin, tryptofan og leucin. De dobbeltsetemuterte molekylene omfatter videre CTLA4-deler som omfatter metionin i posisjon +1 til og med asparaginsyre i posisjon +124, en glutaminovergangsaminosyrerest i posisjon +125 og en immunglobulindel som omfatter glutaminsyre i posisjon +126 til og med lysin i posisjon +357. Immunglobulindelen av det muterte molekylet kan også muteres, slik at cysteinene i posisjonene +130, +136 og +139 er substituert med serin og prolin i posisjon +148 er substituert med serin. Alternativt kan disse muterte molekylene ha en CTLA4-del som omfatter alanin i posisjon -1 til og med asparaginsyre i posisjon +124.

Det tilveiebringes L104ES25Rlg som er et dobbeltsetemutert molekyl omfattende en CTLA4-del som omfatter metionin i posisjon +1 til og med asparaginsyre i posisjon +124, en glutaminovergangsaminosyrerest i posisjon +125 og immunglobulindelen som omfatter glutaminsyre i posisjon +126 til og med lysin i posisjon +357. Delen som har det ekstracellulære domenet til CTLA4 er mutert slik at serin i posisjon +25 er substituert med arginin og leucin i posisjon +104 er substituert med glutaminsyre. Alternativt kan L104ES25Rlg ha en CTLA4-del som

omfatter alanin i posisjon -1 til og med asparaginsyre i posisjon +124.

Det tilveiebringes løselige, muterte CTI_A4-molekyler omfattende en dobbeltsetemutasjon i det ekstracellulære domenet til CTLA4, slik som L104ET30Glg og L104ET30Nlg, der leucin i posisjon +104 er substituert med en glutaminsyre og treonin i posisjon +30 er substituert med henholdsvis glysin og asparagin. De dobbeltsetemuterte molekylene omfatter videre CTI_A4-deler som omfatter metionin i posisjon +1 til og med asparaginsyre i posisjon +124, en glutaminovergangsaminosyrerest i posisjon +125 og en immunglobulindel som omfatter glutaminsyre i posisjon +126 til og med lysin i posisjon +357. Immunglobulindelen av det muterte molekylet kan også muteres, slik at cysteinene i posisjonene +130, +136 og +139 er substituert med serin og prolin i posisjon +148 er substituert med serin. Alternativt kan disse muterte molekylene ha en CTI_A4-del som omfatter alanin i posisjon -1 til og med asparaginsyre i posisjon +124.

Det tilveiebringes løselige, muterte CTLA4-molekyler omfattende en trippelsetemutasjon i det ekstracellulære domenet til CTLA4, slik som L104EA29YS25Klg, L104EA29YS25Nlg, L104EA29YS25Rlg, der leucin i posisjon +104 er substituert med en glutaminsyre, alanin i posisjon +29 er forandret til tyrosin og serin i posisjon +25 er forandret til henholdsvis lysin, asparagin og arginin. De trippelsetemuterte molekylene omfatter videre CTI_A4-deler som omfatter metionin i posisjon +1 til og med asparaginsyre i posisjon +124, en glutaminovergangsaminosyrerest i posisjon +125 og en immunglobulindel som omfatter glutaminsyre i posisjon +126 til og med lysin i posisjon +357. Immunglobulindelen av det muterte molekylet kan også muteres, slik at cysteinene i posisjonene +130, +136 og +139 er substituert med serin og prolin i posisjon +148 er substituert med serin. Alternativt kan disse muterte molekylene ha en CTI_A4-del som omfatter alanin i posisjon -1 til og med asparaginsyre i posisjon +124.

Ytterligere utførelsesformer av løselige, muterte CTLA4-molekyler omfatter kimæriske CTI_A4/CD28-homologmuterte molekyler som binder et B7 (Peach, R. J., et al., 1994 J Exp Med 180:2049-2058). Eksempler på disse kimæriske CTLA4/CD28-muterte molekylene omfatter HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS12, HS13 og HS14 (US patent nr. 5.773.253).

Løselige CTLA4-molekyler slik som CTI_A4lg (som vist i Figur 2, som begynner med metionin i posisjon +1 og slutter med lysin i posisjon +357) og løselig CTLA4-mutant L104EA29Ylg (som vist i Figur 3, som begynner med metionin i posisjon +1 og slutter med lysin i posisjon +357) er foretrukket.

Det tilveiebringes videre nukleinsyremolekyler omfattende nukleotidsekvenser som koder for aminosyresekvensene som svarer til de løselige CTLA4-molekylene. I én utførelsesform er nukleinsyremolekylet et DNA (f.eks. cDNA) eller en hybrid derav. DNA som koder for CTLA4lg (Figur 2) ble deponert 31. mai, 1991, hos American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, og er tildelt ATCC-aksesjonsnummer ATCC 68629. DNA som koder for L104EA29Ylg (sekvens inkludert i Figur 3) ble deponert 19. juni, 2000, hos ATCC og er tildelt ATCC-aksesjonsnummer PTA-2104. Alternativt er nukleinsyremolekylene RNA eller en hybrid derav.

CTLA4-hybrider

Det tilveiebringes løselige, muterte CTI_A4-molekyler omfattende minst det ekstracellulære domenet til CTLA4 eller deler derav som binder CD80 og/eller CD86. Den ekstracellulære delen av CTLA4 omfatter metionin i posisjon +1 til og med asparaginsyre i posisjon +124 (f.eks. Figur 1). Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon -1 til og med asparaginsyre i posisjon +124 (f.eks. Figur 1). Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte glutaminsyre i posisjon +95 til og med cystein i posisjon +120. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte metionin i posisjon +1 til og med cystein i posisjon +21 og glutaminsyre i posisjon +95 til og med asparaginsyre i posisjon +122. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte metionin i posisjon +1 til og med tyrosin i posisjon +23 og valin i posisjon +32 til og med asparaginsyre i posisjon +122. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon +24 til og med glutaminsyre i posisjon +31 og glutaminsyre i posisjon +95 til og med asparaginsyre i posisjon +122. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon +24 til og med glutaminsyre i posisjon +31 og glutaminsyre i posisjon +95 til og med isoleucin i posisjon +112. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon +24 til og med glutaminsyre i posisjon +31 og tyrosin i posisjon +113 til og med asparaginsyre i posisjon +122. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon +50 til og med glutaminsyre i posisjon +57 og glutaminsyre i posisjon +95 til og med asparaginsyre i posisjon +122. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon +24 til og med glutaminsyre i posisjon +31; alanin i posisjon +50 til og med glutaminsyre i posisjon +57; og glutaminsyre i posisjon +95 til og med asparaginsyre i posisjon +122. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon +50 til og med glutaminsyre i posisjon +57 og glutaminsyre i posisjon +95 til og med isoleucin i posisjon +112. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon +24 til og med glutaminsyre i posisjon +31; alanin i posisjon +50 til og med glutaminsyre i posisjon +57; og glutaminsyre i posisjon +95 til og med asparaginsyre i posisjon +122. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon +24 til og med valin i posisjon +94. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon -1 til og med cystein i posisjon +21. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte metionin i posisjon +1 til og med cystein i posisjon +21. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte glutaminsyre i posisjon +95 til og med asparaginsyre i posisjon +122. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon -1 til og med valin i posisjon +94. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte metionin i posisjon +1 til og med valin i posisjon +94. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon +24 til og med glutaminsyre i posisjon +31. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon -1 til og med tyrosin i posisjon +23. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte metionin i posisjon +1 til og med tyrosin i posisjon +23. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte valin i posisjon +32 til og med asparaginsyre i posisjon +122. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte tyrosin i posisjon +113 til og med asparaginsyre i posisjon +122. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte glutaminsyre i posisjon +95 til og med isoleucin i posisjon +112. Den ekstracellulære delen av CTLA4 kan omfatte alanin i posisjon +50 til og med glutaminsyre i posisjon +57.

Ekspresjon av muterte CTLA4-molekyler kan være i prokaryote celler. Prokaryoter er oftest representert ved ulike stammer av bakterier. Bakteriene kan være grampositive eller gramnegative. Andre mikrobielle stammer kan også anvendes.

Nukleotidsekvenser som koder for muterte CTLA4-molekyler kan bli satt inn i en vektor utformet for å uttrykke fremmede sekvenser i prokaryote celler slik som E. coli. Disse vektorene kan omfatte mye anvendte prokaryote kontrollsekvenser som er definert heri til å omfatte promotere for transkripsjonsstart, eventuelt med en operator, sammen med ribosombindingssetesekvenser, omfatte slike vanlig anvendte promotere som beta-laktamase (penicillinase) og laktose (lac) promotersystemene (Chang et al. (1977) Nature 198:1056), tryptofan (trp) promotersystemet (Goeddel et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) og lambda-avledet Pi_-promoter og N-genribosombindingssete (Shimatake et al. (1981) Nature 292:128).

Slike ekspresjonsvektorer vil også omfatte replikasjonsorigoer og selekterbare markører, slik som et beta-laktamase- eller neomycinfosfotransferasegen som gir resistens til antibiotika, slik at vektorene kan replikere i bakterier og celler som har plasmidene kan selekteres for når de blir dyrket i nærvær av antibiotika, slik som ampicillin eller kanamycin.

Ekspresjonsplasmidet kan innføres i prokaryote celler via mange standard fremgangsmåter omfattende, men ikke begrenset til, CaCb-sjokk (Cohen, (1972) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69:2110 og Sambrook et al. (red.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. utgave, Cold Spring Harbor Press, (1989)) og elektroporering.

Også eukaryots celler er egnede vertsceller. Eksempler på eukaryote celler omfatter hvilken som helst dyrecelle, enten primær eller udødeliggjort, gjær (f.eks. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe og Pichia pastoris) og planteceller. Myelom, COS og CHO-celler er eksempler på dyreceller som kan anvendes som verter. Spesielt omfatter CHO-celler, men er ikke begrenset til, DG44 (Chasin et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909), CHO-K1 (ATCC nr. CCL-61), CHO-K1 Tet-On cellelinje (Clontech), CHO kalt ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, England), CHO klon 13 (GEIMG, Genova, Italia), CHO klon B (GEIMG, Genova, Italia), CHO-K1/SF kalt ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, England) og RR-CHOK1 kalt ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, England). Eksempler på planteceller omfatter tobakk- (hele planter, cellekultur eller kallus), mais-, soyabønne- og risceller. Mais-, soyabønne- og risfrø er også akseptabelt.

Nukleotidsekvenser som koder for de muterte CTLA4-molekylene kan også settes inn i en vektor utformet for ekspresjon av fremmede sekvenser i en eukaryot vert. De regulatoriske elementene til vektoren kan variere i henhold til den spesielle eukaryots verten. Nukleinsyremolekylet som koder for L104EA29Ylg er del av pD16 L104EA29Ylg og ble deponert 19. juni, 2000, hos American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manasas, VA 20110-2209 (ATCC nr. PTA-2104). pD16 L104EA29Ylg-vektoren er et derivat av pcDNA3-vektoren

(INVITROGEN).

Mye anvendte eukaryote kontrollsekvenser for anvendelse i ekspresjonsvektorer omfatter promotere og kontrollsekvenser kompatible med pattedyrceller, slik som for eksempel CMV-promoter (CDM8-vektor) og fuglesarkomvirus (ASV) (nLN-vektor). Andre mye anvendte promotere omfatter de tidlig og sene promoterne fra Simian-virus 40 (SV40) (Fiers et al. (1973) Nature 273:113) eller andre virale promotere slik som de avledet fra polyoma, Adenovirus 2 og bovint papillomavirus. En induserbar promoter, slik som hMTII (Karin, et al., (1982) Nature 299:797-802) kan også anvendes.

Vektorer for ekspresjon av muterte CTI_A4-molekyler i eukaryoter kan også bære sekvenser kalt enhancerregioner. Disse er viktig i optimalisering av genekspresjon og er funnet enten oppstrøms eller nedstrøms for promoterregionen.

Eksempler på ekspresjonsvektorer for eukaryote vertsceller omfatter, men er ikke begrenset til, vektorer for pattedyrvertsceller (f.eks. BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc-vektorer, pCMV-vektorer, pSG5-vektorer (Stratagene)), retrovirale vektorer (f.eks. pFB-vektorer (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) eller modifiserte former derav, adenovirale vektorer; adenoassosierte virusvektorer, baculovirusvektorer, gjærvektorer (f.eks. pESC-vektorer (Stratagene)).

Nukleotidsekvenser som koder for muterte CTLA4-molekyler kan integrere i genomet til den eukaryote vertscellen og replikere når vertsgenomet replikerer. Alternativt kan vektoren som bærer muterte CTLA4-molekyler inneholde replikasjonsorigoer som tillater ekstrakromosomal replikasjon.

For ekspresjon av nukleotidsekvensene i Saccharomyces cerevisiae kan replikasjonsorigoen fra det endogene gjærplasmidet, 2n-sirkelen, anvendes (Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307). Alternativt kan sekvenser fra gjærgenomet som kan fremme autonom replikasjon anvendes (se for eksempel Stinchcomb et al., (1979) Nature 282:39); Tschemper et al., (1980) Gene 10:157; og Clarke et al.,

(1983) Meth. Enz. 101:300).

Transkripsjonskontrollsekvenser for gjærvektorer omfatter promotere for syntese av glykolytiske enzymer (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland et al., (1978) Biochemistry 17:4900). Ytterligere promotere kjent på området omfatter CMV-promoteren gitt i CDM8-vektoren (Toyama og Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); promoteren for 3-fosfoglyseratkinase (Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073) og de for andre glykolytiske enzymer.

Andre promotere er induserbare fordi de kan reguleres ved miljøstimuli eller vekstmediet til cellene. Disse induserbare promoterne omfatter de fra genene for varmesjokkproteiner, alkoholdehydrogenase 2, isocytokrom C, syrefosfatase, enzymer assosiert med nitrogennedbrytning og enzymer ansvarlig for maltose- og galaktoseutnyttelse.

Regulatoriske sekvenser kan også plasseres på 3' enden av de kodende sekvensene. Disse sekvensene kan fungere ved å stabilisere budbringer-RNA. Slike terminatorer er funnet i den 3' ikke-translaterte regionen etter de kodende sekvensene i flere gjæravledede gener og pattedyrgener.

Eksempler på vektorer for planter og planteceller omfatter, men er ikke begrenset til, Agrobacterium Trplasmider, blomkålmosaikkvirus (CaMV) og "tomato golden" mosaikkvirus (TGMV).

Generelle aspekter ved pattedyrcellevertssystemtransformasjoner er beskrevet av Axel (US patent nr. 4.399.216 utstedt 16. august, 1983). Pattedyrceller kan transformeres ved fremgangsmåter omfattende, men ikke begrenset til, transfeksjon i nærvær av kalsiumfosfat, mikroinjeksjon, elektroporering eller via transduksjon med virale vektorer. Fremgangsmåter for å innføre fremmede DNA-sekvenser i plante- og gjærgenomer omfatter (1) mekaniske fremgangsmåter, slik som mikroinjeksjon av DNA i enkeltceller eller protoplaster, blande celler med glasskuler i nærvær av DNA med en vortekser, eller skyte DNA-belagte wolfram-eller gullkuler inn i celler eller protoplaster; (2) innføre DNA ved å gjøre cellemembraner permeable for makromolekyler ved hjelp av polyetylenglykolbehandling eller eksponering for elektriske pulser med høy spenning (elektroporering); eller (3) anvendelse av liposomer (inneholdende cDNA) som smelter sammen med cellemembraner.

Ekspresjon av muterte CTI_A4-molekyler kan detekteres ved fremgangsmåter kjent på området. For eksempel kan de muterte molekylene detekteres ved Coomassie-farging av SDS-PAGE geler og immunblotting ved anvendelse av antistoffer som binder CTLA4. Proteinisolering kan utføres ved anvendelse av standard proteinrensingsmetoder, f.eks. affinitetskromatografi eller ionebyttekromatografi, hvilket gir hovedsakelig rent produkt (R. Scopes i: "Protein Purification, Principles and Practice", tredje utgave, Springer-Verlag (1994)).

CTLA4IG-KODONBASERT MUTAGENESE

I én utførelsesform ble målstyrt mutagenese og en ny screeningsprosedyre anvendt til å identifisere flere mutasjoner i det ekstracellulære domenet til CTLA4 som forbedrer bindingsaviditet for CD86.1 denne utførelsesformen ble mutasjoner utført i rester i regionene av det ekstracellulære domenet til CTLA4 fra serin 25 til arginin 33, C'-kjeden (alanin 49 og treonin 51), F-kjeden (lysin 93, glutaminsyre 95 og leucin 96) og i regionen fra metionin 97 til og med tyrosin 102, tyrosin 103 til og med glysin 107 og i G-kjeden i posisjonene glutamin 111, tyrosin 113 og isoleucin 115. Disse setene ble valgt basert på studier av kimæriske CD28/CTLA4-fusjonsproteiner (Peach et al., J. Exp. Med. 1994,180:2049-2058) og på en modell som forutser hvilke aminosyrerestsidekjeder som vil bli eksponert for løsningsmiddel og en mangel på aminosyrerestlikhet eller -homologi i visse posisjoner mellom CD28 og CTLA4. Enhver rest som er spatialt i nærheten (5 til 20 angstrømsenheter) av de identifiserte restene betraktes også som del av den foreliggende oppfinnelsen.

For å syntetisere og screene løselige, muterte CTLA4-molekyler med endrede affiniteter for CD80 og/eller CD86, ble en to-trinns strategi tilpasset. Eksperimentene medførte først å generere et bibliotek av mutasjoner på et spesifikt kodon av en ekstracellulær del av CTLA4 og deretter screene disse ved BIAcore-analyse, for å identifisere mutanter med endret reaktivitet til CD80 eller CD86. Biacore-testsystemet (Pharmacia, Piscataway, NJ) anvender et overflateplasmonresonansdetektorsystem som i alt vesentlig involverer kovalent binding av enten CD80lg eller CD86lg til en dekstranbelagt sensorbrikke som er lokalisert i en detektor. Testmolekylet kan deretter injiseres i kammeret inneholdende sensorbrikken, og mengden av komplementært protein som binder kan bli vurdert basert på forandringen i molekylmasse som er fysisk assosiert med den dekstranbelagte siden av sensorbrikken; forandringen i molekylmasse kan måles av detektorsystemet.

Farmasøytiske sammensetninger for anvendelse i behandling av immunsystemsykdommer omfattende farmasøytisk effektive mengder av løselige, muterte CTLA4-molekyler er beskrevet. I visse utførelsesformer blir immunsystemsykdommene mediert av CD28- og/eller CTLA4-positive celleinteraksjoner med CD80- og/eller CD86-positive celler. De løselige CTLA4-molekylene er fortrinnsvis løselige CTLA4-molekyler med villtypesekvens og/eller løselige CTLA4-molekyler som har én eller flere mutasjoner i det ekstracellulære domenet til CTLA4. Den farmasøytiske sammensetningen kan omfatte løselig CTLA4 eller muterte CTLA4-proteinmolekyler og/eller nukleinsyremolekyler og/eller vektorer som koder for molekylene. Foretrukket har det løselige, muterte CTI_A4-molekylet aminosyresekvensen til det ekstracellulære domenet til CTLA4 som vist i Figur 3 (L104EA29Y). Enda mer foretrukket er det løselige, muterte CTLA4-molekylet L104EA29Ylg som beskrevet heri vist i Figur 3. Sammensetningene kan i tillegg omfatte andre terapeutiske midler omfattende, men ikke begrenset til, immunsuppresive midler, NSAID'er, kortikosteroider, glukokortikoider, medikamenter, toksiner, enzymer, antistoffer eller konjugater.

En utførelsesform av den farmasøytiske sammensetningen omfatter en effektiv mengde av et løselig CTLA4-molekyl alene eller i kombinasjon med en effektiv mengde av minst ett annet terapeutisk middel, inkludert et immunsuppresivt middel eller NSAID.

Effektive mengder av løselig CTLA4 i den farmasøytiske sammensetningen kan variere ca. 0,1 til 100 mg/kg vekt av individet. I en annen utførelsesform kan den effektive mengden være en mengde ca. 0,5 til 5 mg/kg vekt av et individ, ca. 5 til 10 mg/kg vekt av et individ, ca. 10 til 15 mg/kg vekt av et individ, ca. 15 til 20 mg/kg vekt av et individ, ca. 20 til 25 mg/kg vekt av et individ, ca. 25 til 30 mg/kg vekt av et individ, ca. 30 til 35 mg/kg vekt av et individ, ca. 35 til 40 mg/kg vekt av et individ, ca. 40 til 45 mg/kg vekt av et individ, ca. 45 til 50 mg/kg vekt av et individ, ca. 50 til 55 mg/kg vekt av et individ, ca. 55 til 60 mg/kg vekt av et individ, ca. 60 til 65 mg/kg vekt av et individ, ca. 65 til 70 mg/kg vekt av et individ, ca. 70 til 75 mg/kg vekt av et individ, ca. 75 til 80 mg/kg vekt av et individ, ca. 80 til 85 mg/kg vekt av et individ, ca. 85 til 90 mg/kg vekt av et individ, ca. 90 til 95 mg/kg vekt av et individ eller ca. 95 til 100 mg/kg vekt av et individ. I en utførelsesform er den effektive mengden 2 mg/kg vekt av et individ. I en annen utførelsesform er den effektive mengden 10 mg/kg vekt av et individ. I en utførelsesform er den effektive mengden av et løselig CTLA4-molekyl 2 mg/kg vekt av et individ. I en utførelsesform er den effektive mengden av et løselig CTLA4-molekyl 10 mg/kg vekt av et individ.

Mengden av et immunsuppresivt middel administrert til et individ varierer avhengig av flere faktorer inkludert effektiviteten til medikamentet på et spesifikt individ og toksisiteten (dvs. toleransen) av et medikament til et spesifikt individ.

Metotreksat blir vanligvis administrert i en mengde på ca. 0,1 til 40 mg per uke med en vanlig dosering som varierer fra ca. 5 til 30 mg per uke. Metotreksat kan administreres til et individ i ulike inkrementer: ca. 0,1 til 5 mg/uke, ca. 5 til 10 mg/uke, ca. 10 til 15 mg/uke, ca. 15 til 20 mg/uke, ca. 20 til 25 mg/uke, ca. 25 til 30 mg/uke, ca. 30 til 35 mg/uke eller ca. 35 til 40 mg/uke. I én utførelsesform er en effektiv mengde av et immunsuppresivt middel, inkludert metotreksat, en mengde på ca. 10 til 30 mg/uke.

Effektive mengder av metotreksat varierer fra ca. 0,1 til 40 mg/uke. I én utførelsesform varierer den effektive mengden fra ca. 0,1 til 5 mg/uke, ca. 5 til 10 mg/uke, ca. 10 til 15 mg/uke, ca. 15 til 20 mg/uke, ca. 20 til 25 mg/uke, ca. 25 til 30 mg/uke, ca. 30 til 35 mg/uke eller ca. 35 til 40 mg/uke. I én utførelsesform blir metotreksat administrert i en mengde som varierer fra ca. 10 til 30 mg/uke.

Cyklofosfamid, et alkylerende middel, kan administreres i doseringer som varierer fra ca. 1 til 10 mg/kg kroppsvekt per dag.

Cyklosporin (f.eks. NEORAL<R>), også kjent som Cyklosporin A, blir vanligvis administrert i doseringer som varierer fra ca. 1 til 10 mg/kg kroppsvekt per dag. Doseringer som varierer fra ca. 2,5 til 4 mg per kroppsvekt per dag er mye anvendt.

Klorokin eller hydroksyklorokin (f.eks. PLAQUENIL<R>) blir vanligvis administrert i doseringer som varierer fra ca. 100 til 1000 mg daglig. Foretrukne doseringer varierer fra ca. 200-600 mg administrert daglig.

Sulfasalazin (f.eks. AZULFIDINE EN-tabs<R>) blir vanligvis administrert i mengder som varierer fra ca. 50 til 5000 mg per dag, med en vanlig dosering på ca. 2000 til 3000 mg per dag for voksne. Doseringer for barn er vanligvis ca. 5 til 100 mg/kg kroppsvekt, opp til 2 gram per dag.

Gullsalter blir formulert for to typer administrering: injeksjon eller oralt. Injiserbare gullsalter blir vanligvis foreskrevet i doseringer på ca. 5 til 100 mg doser hver 2. til 4. uke. Oralt administrerte gullsalter blir vanligvis foreskrevet i doser som varierer fra ca. 1 til 10 mg per dag. D-penicillamin eller penicillamin (CUPRIMINE<R>) blir vanligvis administrert i doseringer på ca. 50 til 2000 mg per dag, med foretrukne doseringer på ca. 125 mg per dag opp til 1500 mg per dag.

Azatioprin blir vanligvis administrert i doseringer på ca. 10 til 250 mg per dag. Foretrukne doseringer varierer fra ca. 25 til 200 mg per dag.

Anakinra (f.eks. KINERET<R>) er en interleukin-1 reseptorantagonist. Et vanlig doseringsområde for anakinra er ca. 10 til 250 mg per dag, med en anbefalt dosering på ca. 100 mg per dag.

Infliksimab (REMICADE<R>) er et kimærisk monoklonalt antistoff som binder til tumornekrosefaktor alfa (TNFa). Infliksimab blir vanligvis administrert i doseringer på ca. 1 til 20 mg/kg kroppsvekt hver 4. til 8. uke. Doseringer på ca. 3 til 10 mg/kg kroppsvekt kan administreres hver 4. til 8. uke avhengig av individet.

Etanercept (f.eks. ENBREL<R>) er et dimerisk fusjonsprotein som binder tumornekrosefaktor (TNF) og blokkerer dets interaksjoner med TNF-reseptorer. Vanlig administrerte doseringer av etanercept er ca. 10 til 100 mg per uke for voksne, med en foretrukket dosering på ca. 50 mg per uke. Doseringer for ungdommer varierer fra ca. 0,1 til 50 mg/kg kroppsvekt per uke med et maksimum på ca. 50 mg per uke.

Leflunomid (ARAVA<R>) blir vanligvis administrert ved doseringer på ca. 1 og 100 mg per dag. En vanlig daglig dosering er ca. 10 til 20 mg per dag.

De farmasøytiske sammensetningene omfatter også fortrinnsvis egnede bærere og adjuvantia som omfatter hvilket som helst materiale som, når kombinert med molekylet ifølge foreliggende oppfinnelse (f.eks. et løselig, mutert CTLA4-molekyl, f.eks. L104EA29Ylg), beholder molekylets aktivitet og er ikke-reaktivt med individets immunsystem. Eksempler på egnede bærere og adjuvantia omfatter, men er ikke begrenset til, humant serumalbumin; ionebyttere; alumina; lecitin; buffersubstanser, slik som fosfater; glysin; sorbinsyre; kaliumsorbat; og salter eller elektrolytter, slik som protaminsulfat. Andre eksempler omfatter hvilken som helst av de standard farmasøytiske bærerne, slik som en fosfatbufret saltvannsløsning; vann; emulsjoner, slik som olje/vann-emulsjon; og ulike typer av fuktemidler. Andre bærere kan også omfatte sterile løsninger; tabletter, inkludert belagte tabletter og kapsler. Typisk inneholder slike bærere hjelpestoffer slik som stivelse, melk, sukker, visse typer leire, gelatin, stearinsyre eller salter derav, magnesium eller kalsiumstearat, talkum, vegetabilsk fett eller oljer, gummi, glykoler eller andre kjente hjelpestoffer. Slike bærere kan også omfatte smaks- og fargetilsetningsstoffer eller andre bestanddeler. Sammensetninger omfattende slike bærere blir formulert ved velkjente konvensjonelle fremgangsmåter. Slike sammensetninger kan også formuleres i ulike lipidsammensetninger, slik som for eksempel liposomer, så vel som i ulike polymersammensetninger, slik som polymermikrosfærer.

De farmasøytiske sammensetningene kan administreres ved anvendelse av konvensjonelle administreringsmåter omfattende, men ikke begrenset til, intravenøs (i.v.) administrering, intraperitoneal (i.p.) administrering, intramuskulær (i.m.) administrering, subkutan administrering, oral administrering, administrering som en stikkpille eller som en topisk kontakt eller implantering av en sakte frigjøringsanordning, slik som en miniosmotisk pumpe, til individet.

De farmasøytiske sammensetningene kan være i en rekke doseringsformer som omfatter, men ikke er begrenset til, væskeløsninger eller suspensjoner, tabletter, piller, pulvere, stikkpiller, polymere mikrokapsler eller mikrovesikler, liposomer og injiserbare eller infusible løsninger. Den foretrukne formen er avhengig av administreringsmåten og den terapeutiske anvendelsen.

Den mest effektive administreringsmåten og doseringskuren for sammensetningene er avhengig av alvorlighetsgraden og forløpet av sykdommen, pasientens helse og respons til behandling og vurderingen til den behandlende legen. Følgelig skal doseringene av sammensetningene titreres til den individuelle pasienten.

De løselige, muterte CTLA4-molekylene kan administreres til et individ i en mengde og for en varighet (f.eks. tidslengde og/eller flere ganger) som er tilstrekkelig for å blokkere endogene B7 (f.eks. CD80 og/eller CD86) molekyler fra å binde deres respektive ligander i individet. Blokkering av endogen B7/ligandbinding hemmer dermed interaksjoner mellom B7-positive celler (f.eks. CD80-og/eller CD86-positive celler) med CD28- og/eller CTI_A4-positive celler. Dosering av et terapeutisk middel er avhengig av mange faktorer omfattende, men ikke begrenset til, typen vev som er affisert, formen for autoimmun sykdom som skal behandles, alvorlighetsgraden av sykdommen, et individs helse og et individs respons til behandling med midlene. Følgelig kan doseringer av midlene variere avhengig av individet og administreringsmåten. De løselige, muterte CTLA4-molekylene kan administreres i en mengde mellom 0,1 til 20,0 mg/kg vekt av pasienten/dag, fortrinnsvis mellom 0,5 til 10,0 mg/kg/dag. Administrering av de farmasøytiske sammensetningene kan utføres over ulike tidsperioder. I én utførelsesform kan den farmasøytiske sammensetningen administreres i én eller flere timer. I tillegg kan administreringen repeteres avhengig av alvorlighetsgraden av sykdommen så vel som andre faktorer som forstått av fagfolk på området.

Fremgangsmåter for behandling av immunsystemsykdommer og autoimmune sykdommer i et individ er beskrevet, som omfatter administrering til individet av en effektiv mengde av et løselig CTLA4 eller et mutert CTI_A4-molekyl som binder CD80- og/eller CD86-molekyler på CD80- og/eller CD86-positive celler, for å hemme binding av CD80 og/eller CD86 til CTLA4 og/eller CD28. Fremgangsmåtene omfatter å administrere en terapeutisk sammensetning, omfattende løselig CTLA4 eller muterte CTLA4-molekyler til et individ i en mengde som er effektiv til å lindre minst ett av symptomene assosiert med immunsystemsykdommer. Langtidsterapi for immunsystemsykdommer ved blokkering av de T-celle/B7-positive celleinteraksjonene kan oppnås, hvilket derved blokkerer T-celleaktivering/stimulering ved samstimulatoriske signaler slik som B7-binding til CD28, som fører til induksjon av T-celleanergi eller toleranse.

Løselig CTLA4 eller muterte CTLA4-molekyler oppviser hemmende egenskaper in vivo. Under betingelser der T-celle/B7-positive celleinteraksjoner, for eksempel T-celle/B-celle interaksjoner, forekommer som et resultat av kontakt mellom T-celler og B7-positive celler, kan binding av innførte CTLA4-molekyler for å reagere med B7-positive celler, for eksempel B-celler, interferere, dvs. hemme, de T-celle/B7-positive celleinteraksjonene som resulterer i regulering av immunresponser. Hemming av T-celleresponser ved administrering av et løselig CTLA4-molekyl kan også være anvendelig for behandling av autoimmune lidelser. Mange autoimmune lidelser følger av upassende aktivering av T-celler som er reaktive mot autoantigener og som stimulerer produksjon av cytokiner og autoantistoffer som er involvert i sykdomspatologien. Administrering av L104EA29Ylg-molekyl i et individ som lider av eller er mottakelig for en autoimmun lidelse kan hindre aktivering av autoreaktive T-celler og kan redusere eller eliminere sykdomssymptomer. Denne fremgangsmåten kan også omfatte administrering til individet av L104EA29Ylg-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse alene eller sammen med ekstra ligander, slik som de som er reaktive med IL-2, IL-4 eller y-interferon.

Det tilveiebringes fremgangsmåter for regulering av immunresponser. Immunresponser kan nedreguleres (reduseres) ved løselig CTLA4 eller muterte CTLA4-molekyler eller hemme eller blokkere en immunrespons allerede i utvikling eller kan involvere å forebygge induksjon av en immunrespons. Løselig CTLA4 eller muterte CTLA4-molekyler kan hemme funksjonene til aktiverte T-celler, slik som T-lymfocyttproliferasjon og cytokinsekresjon, ved suppresjon av T-celleresponser eller ved induksjon av spesifikk toleranse i T-celler eller begge deler. Videre kan løselige CTLA4 eller muterte CTLA4-molekyler som interfererer med CTI_A4/CD28/B7-signalveien, hemme T-celleproliferasjon og/eller cytokinsekresjon og således resultere i redusert vevsnedbrytning og induksjon av T-celle ikke-responderende evne eller anergi.

Det tilveiebringes videre fremgangsmåter for å hemme avstøtning av organ- eller vevstransplantater i individer, som omfatter administrering av en effektiv mengde av minst ett løselig CTLA4 eller CTLA4-molekyl, f.eks. L104EA29Ylg, til individet før, under og/eller etter transplantasjon. I en annen utførelsesform omfatter fremgangsmåten administrering til et individ av minst ett løselig CTLA4 eller et mutert CTLA4-molekyl i kombinasjon med minst ett annet terapeutisk middel omfattende, men ikke begrenset til, et medikament, et toksin, et enzym, et antistoff eller et konjugat.

Organ- eller vevstransplantatet kan være fra hvilket som helst organ eller vev egnet for transplantasjon. I én utførelsesform kan det transplanterte vevet være et pankreatisk vev. I en foretrukket utførelsesform er transplantatvevet pankreatiske øyceller. Fremgangsmåter for behandling av type 1 og/eller type 2 diabetes i individer ved hemming av øycelletransplantatavstøtning er beskrevet.

Det tilveiebringes videre en fremgangsmåte for å hemme pankreatisk øytransplantatavstøtning i et individ, der individet er en mottaker av transplantatvev. I vevstransplantater blir avstøtning av transplantatet typisk initiert gjennom dets gjenkjennelse som fremmed av T-celler, etterfulgt av en immunrespons som ødelegger transplantatet. Administrering av et løselig CTLA4-molekyl hemmer T-lymfocyttproliferasjon og/eller cytokinsekresjon, som resulterer i redusert vevsnedbrytning og induksjon av antigenspesifikk T-celle ikke-responderende evne som kan resultere i langvarig transplantataksept, uten behov for generalisert immunsuppresjon.

En foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av det løselige, muterte CTLA4-molekylet L104EA29Ylg for å regulere funksjonelle CTLA4- og CD28-positive celleinteraksjoner med B7-positive celler, for å behandle immunsystemsykdommer slik som diabetes og/eller å nedregulere immunresponser. L104EA29Ylg er et løselig, mutert CTLA4-molekyl omfattende minst de to aminosyreforandringene leucin (L) til glutaminsyre (E) i posisjon +104 og alanin (A) til tyrosin (Y) endring i posisjon +29. L104EA29Ylg-molekylet kan omfatte videre mutasjoner utover de to spesifisert heri.

Fremgangsmåten kan videre omfatte administrering med de løselige, muterte CTI_A4-molekylene, en immunsuppresiv grunnkur til individet. Den immunsuppresive grunnkuren kan omfatte (men er ikke begrenset til): cyklosporin, azatioprin, metotreksat, cyklofosfamid, lymfocyttimmunglobulin, anti-CD3 antistoffer, Rho (D) immunglobulin, adrenokortikosteroider, sulfasalzin, FK-506, metoxsalen, mykofenolatmofetil (CELLCEPT), hest anti-human tymocyttglobulin (ATGAM), humanisert anti-TAC (HAT), basiliximab (SIMULECT), kanin anti-human tymocyttglobulin (THYMOGLOBULIN), sirolimus, talidomid, metotreksat, klorokin, hydroksyklorokin, sulfasalazin, sulfasalazopyrin, leflunomid, gullsalter, D- penicillamin, azatioprin, anakinra, infliksimab, etanercept, TNFa-blokkere eller et biologisk middel som er rettet mot et inflammatorisk cytokin. I en foretrukket utførelsesform er immunsuppresiv grunnkur steroidfri. Mer foretrukket omfatter den immunsuppresive grunnkuren rapamycin og anti-humant IL-2 R mAb.

I en utførelsesform anvendes et molekyl for å blokkere interaksjonen mellom B7 og CTLA4 sammen med et immunsuppresivt middel, for å regulere en immunrespons for behandling av en immunsystemsykdom slik som diabetes. Molekylet anvendt for å blokkere B7/CTI_A4-interaksjonen kan være et løselig CTLA4 slik som CTLA4lg, CTLA4lg/CD28lg eller L104EA29Ylg, et løselig CD28 slik som CD28lg, et løselig B7 (B7-1 eller B7-2) slik som B7lg, monoklonale anti-CTI_A4-antistoffer, monoklonale anti-CD28-antistoffer eller monoklonale anti-B7-antistoffer.

Individene som behandles omfatter pattedyrindivider, inkludert menneske, ape, menneskeape, hund, katt, ku, hest, geit, gris, kanin, mus og rotte.

Det tilveiebringes ulike fremgangsmåter, lokalt eller systemisk, for administrering av de terapeutiske sammensetningene, slik som løselig CTLA4-molekyl alene eller sammen med et immunsuppresivt middel og/eller annet terapeutisk medikament. Fremgangsmåtene omfatter intravenøse, intramuskulære, intraperitoneale, orale, inhalasjon og subkutane fremgangsmåter, så vel som implanterbar pumpe, kontinuerlig infusjon, genterapi, liposomer, stikkpiller, topisk kontakt, vesikler, kapsler og injeksjonsfremgangsmåter. Det terapeutiske midlet, formulert med en bærer, er vanligvis frysetørket for lagring og blir rekonstituert med vann eller en bufret løsning med en nøytral pH (ca. pH 7-8, f.eks. pH 7,5) før administrering.

Som standard utførelse på området kan sammensetningene administreres til individet i hvilken som helst farmasøytisk akseptabel form.

Fremgangsmåtene omfatter administrering til et individ av de løselige CTLA4-molekylene for å regulere CD28- og/eller CTLA4-positive celleinteraksjoner med B7-positive celler. De B7-positive cellene kommer i kontakt med en effektiv mengde av de løselige CTI_A4-molekylene eller fragmenter eller derivater derav, for å danne løselige CTLA4/B7-komplekser. Kompleksene interfererer med interaksjon mellom endogene CTLA4- og CD28-molekyler med B7-familiemolekyler.

De løselige CTLA4-molekylene kan administreres til et individ i en mengde og for en tid (f.eks. tidslengde og/eller flere ganger) som er tilstrekkelig for å blokkere endogene B7-molekyler fra å binde deres respektive ligander i individet. Blokkering av endogen B7/ligand-binding hemmer dermed interaksjoner mellom B7-positive celler med CD28- og/eller CTLA4-positive celler.

Dosering av et terapeutisk middel er avhengig av mange faktorer omfattende, men ikke begrenset til, type vev som er affisert, formen for autoimmun sykdom som behandles, alvorlighetsgraden av sykdommen, et individs helse og respons til behandling med midlene. Følgelig kan doseringer av midlene variere avhengig av hvert individ og administreringsmåten. De løselige CTLA4-molekylene kan administreres i en mengde fra ca. 0,1 til 100 mg/kg vekt av pasienten/dag.

Sammensetningene kan anvendes sammen med andre farmasøytiske midler for å behandle immunsystemsykdommer. For eksempel kan diabetes behandles med molekyler sammen med, men ikke begrenset til, immunsuppresive midler slik som kortikosteroider, cyklosporin (Mathiesen 1989 Cancer Lett. 44(2): 151-156), prednison, azatioprin, (R. Handschumacher, i: "Drugs Used for Immunosuppression", side 1264-1276), TNFa-blokkere eller antagonister (New England Journal of Medicine, vol. 340: 253-259, 1999; The Lancet vol. 354: 1932-39,1999, Annals of Internal Medicine, vol. 130: 478-486) eller hvilket som helst annet biologisk middel rettet mot hvilket som helst inflammatorisk cytokin, ikke-steroide antiinflammatoriske medikamenter/Cox-2 hemmere, hydroksyklorokin, sulfasalazopryin, gullsalter, etanercept, infliksimab, rapamycin, mykofenolatmofetil, azatioprin, tacrolimus, basiliximab, cytoxan, interferon beta-1a, interferon beta-1b, glatirameracetat, mitoksantronhydroklorid, anakinra og/eller andre biologiske forbindelser.

De løselige CTLA4-molekylene (fortrinnsvis L104EA29Ylg) kan også anvendes i kombinasjon med ett eller flere av de følgende midlene for å regulere en immunrespons: løselig gp39 (også kjent som CD40-ligand (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), løselig CD29, løselig CD40, løselig CD80 (f.eks. ATCC 68627), løselig CD86, løselig CD28 (f.eks. 68628), løselig CD56, løselig Thy-1, løselig CD3, løselig TC R, løselig VLA-4, løselig VCAM-1, løselig LECAM-1, løselig ELAM-1, løselig CD44, antistoffer reaktive med gp39 (f.eks. ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 og ATCC HB-12056), antistoffer reaktive med CD40 (f.eks. ATCC HB-9110), antistoffer reaktive med B7 (f.eks. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, osv.), antistoffer reaktive med CD28 (f.eks. ATCC HB-11944 eller mAb 9.3 som beskrevet av Martin et al. (J. Clin. Immun. 4(1 ):18-22, 1980)), antistoffer reaktive med LFA-1 (f.eks. ATCC HB-9579 og ATCC TIB-213), antistoffer reaktive med LFA-2, antistoffer reaktive med IL-2, antistoffer reaktive med IL-12, antistoffer reaktive med IFN-gamma, antistoffer reaktive med CD2, antistoffer reaktive med CD48, antistoffer reaktive med hvilket som helst ICAM (f.eks. ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 og ICAM-3), antistoffer reaktive med CTLA4 (f.eks. ATCC HB-304), antistoffer reaktive med Thy-1, antistoffer reaktive med CD56, antistoffer reaktive med CD3, antistoffer reaktive med CD29, antistoffer reaktive med TCR, antistoffer reaktive med VLA-4, antistoffer reaktive med VCAM-1, antistoffer reaktive med LECAM-1, antistoffer reaktive med ELAM-1, antistoffer reaktive med CD44.1 visse utførelsesformer er monoklonale antistoffer foretrukket. I andre utførelsesformer er antistoffragmenter foretrukket. Fagfolk vil lett forstå at kombinasjonen kan omfatte de løselige CTI_A4-molekylene og et annet immunsuppresivt middel, de løselige CTLA4-molekylene med to andre immunsuppresive midler, de løselige CTLA4-molekylene med tre andre immunsuppresive midler, osv. Bestemmelse av den optimale kombinasjonen og doseringer kan bestemmes og optimaliseres ved anvendelse av fremgangsmåter velkjent på området.

Noen spesifikke kombinasjoner omfatter følgende: L104EA29Ylg og CD80 monoklonale antistoffer (mAb'er); L104EA29Ylg og CD86 mAb'er; L104EA29Ylg, CD80 mAb'erog CD86 mAb'er; L104EA29Ylg og gp39 mAb'er; L104EA29Ylg og CD40 mAb'er; L104EA29Ylg og CD28 mAb'er; L104EA29Ylg, CD80 og CD86 mAb'er og gp39 mAb'er; L104EA29Ylg, CD80 og CD86 mAb'er og CD40 mAb'er; og L104EA29Ylg, anti-LFA1 mAb og anti-gp39 mAb. Et spesifikt eksempel på et gp39 mAb er MR1. Andre kombinasjoner vil lett bli verdsatt og forstått av fagfolk. De løselige CTLA4-molekylene, foreksempel L104EA29Ylg, kan administreres som den eneste aktive bestanddelen eller sammen med andre medikamenter i immunmodulerende kurer eller andre antiinflammatoriske midler, f.eks. for behandling eller forebyggelse av allo- eller xenotransplantat akutt eller kronisk avstøtning eller inflammatoriske eller autoimmune lidelser eller for å indusere toleranse. For eksempel kan det anvendes i kombinasjon med en kalsineurinhemmer, f.eks. cyklosporin A eller FK506; et immunsuppresivt makrolid, f.eks. rapamycin eller et derivat derav (f.eks. 40-O-(2-hydroksy)etyl-rapamycin); et lymfocyttsøkende middel, f.eks. FTY720 eller en analog derav; kortikosteroider; cyklofosfamid; azatiopren; metotreksat; leflunomid eller en analog derav; mizoribin; mykofenolsyre; mykofenolatmofetil; 15-deoksyspergualin eller en analog derav; immunsuppresive monoklonale antistoffer, f.eks. monoklonale antistoffer til leukocyttreseptorer, f.eks. MHC, CD2, CD3, CD4, CD11a/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB eller deres ligander; eller andre immunmodulerende forbindelser, f.eks. CTLA4/CD28-lg, eller andre adhesjonsmolekylhemmere, f.eks. mAb'er eller lavmolekylære hemmere omfattende LFA-1 antagonister, selektinantagonister og VLA-4 antagonister. Forbindelsen er spesielt anvendelig i kombinasjon med en forbindelse som interfererer med CD40 og dens ligand, f.eks. antistoffer til CD40 og antistoffer til CD40-L.

Der de løselige, muterte CTLA4-molekylene blir administrert sammen med annen immunsuppressiv/immunmodulerende eller antiinflammatorisk terapi, f.eks. som spesifisert ovenfor heri, vil doseringer av den samadministrerte immunsuppresive, immunmodulerende eller antiinflammatoriske forbindelsen selvfølgelig variere avhengig av type medikament anvendt samtidig, f.eks. hvorvidt det er et steroid eller et cyklosporin, det spesifikke medikamentet anvendt, tilstanden som behandles og så videre.

I henhold til det foregående tilveiebringes det også fremgangsmåter som definert ovenfor omfattende samadministrering, f.eks. samtidig eller sekvensielt, av en terapeutisk effektiv mengde av løselige CTLA4-molekyler, f.eks. CTI_A4lg og/eller L104EA29Ylg, i fri form eller i farmasøytisk akseptabel saltform, og en andre medikamentsubstans, der nevnte andre medikamentsubstans er et immunsuppresivt, immunmodulerende eller antiinflammatorisk medikament, f.eks. som angitt ovenfor.

Videre er det fremskaffet terapeutiske kombinasjoner, f.eks. et testsett, omfattende et løselig CTLA4-molekyl, i fri form eller i farmasøytisk akseptabel saltform, som skal anvendes samtidig eller sekvensielt, med minst én farmasøytisk sammensetning omfattende et immunsuppresivt, immunmodulerende eller antiinflammatorisk medikament, f.eks. NSAID, glukokortikoid eller kortikosteroid. Testsettet kan omfatte instruksjoner for dets administrering. Testsettene kan anvendes i hvilken som helst fremgangsmåte.

I en annen utførelsesform blir avstøtning av vevs- eller organtransplantat hemmet ved å administrere løselig CTLA4 og T-celledepleterte beinmargsceller til et individ. Administrering av T-celledepletert beinmarg kan forekomme på omtrent samme tidspunkt som individet mottar vevs- eller organtransplantatet eller på et annet tidspunkt. Administrering av beinmarg på omtrent samme tidspunkt indikerer at beinmargen blir administrert til individet som del av fremstillingen for prosedyrene for administrering av vevs- eller organtransplantatet. Det er ikke nødvendig at beinmargen blir transplantert på eksakt det samme tidspunktet (dvs.

i løpet av minutter) som organtransplantatet.

Foretrukket blir den T-celledepleterte beinmargen administrert før organtransplantatet. Bestemte utførelsesformer omfatter å administrere den T-celledepleterte beinmargen i løpet av en dag, i løpet av tolv timer eller i løpet av seks timer etter det faste organtransplantatet. Imidlertid kan den T-celledepleterte beinmargen administreres tidligere, så lenge som de resulterende effektene av den T-celledepleterte beinmargen fortsatt blir oppnådd i sammenheng med organ-eller vevstransplantatet. Alternativt kan det være ønskelig å administrere T-celledepletert beinmarg etter organtransplantatet.

I én utførelsesform omfatter fremgangsmåten administrering av en dose av T-celledepleterte beinmargsceller (toleranseinduserende dose) til et individ og deretter administrering av en ytterligere dose av T-celledepleterte beinmargsceller

(transplantert dose) til individet. I visse utførelsesformer omfatter det immunsuppresive midlet minst én eller flere typer ligander som interfererer med binding av CD28-antigen til CD80- og/eller CD86-antigen. Som beskrevet supra er liganden fortrinnsvis et mutert CTLA4-molekyl slik som L104EA29Ylg.

Videre kan mengden av T-celledepletert beinmarg bestemmes ved rutineeksperimentering og optimaliseres empirisk. For eksempel kan mengden av T-celledepletert beinmarg titreres i løpet av rutineeksperimentering for bestemmelse av mengden som er tilstrekkelig for å oppnå de ønskede effektene.

Fremgangsmåtene kan også utføres ved å administrere, i tillegg til det løselige, muterte CTLA4-molekylet, to eller flere doser av T-celledepletert beinmarg til individet, alene eller i kombinasjon med ett eller flere immunsuppresive midler.

Som beskrevet heri kan administrering av et løselig CTLA4 eller mutert CTLA4-molekyl utføres på mange ulike måter, inkludert lokale eller systemiske administreringsveier. For eksempel kan løselige, muterte CTLA4-molekyler administreres intravenøst, intramuskulært eller intraperitonealt. Alternativt kan mutert CTLA4 administreres oralt eller subkutant. Andre administreringsmetoder vil bli gjenkjent av fagfolk. Likeledes kan T-celledepletert beinmarg administreres på mange ulike måter kjent av fagfolk. Ett eksempel er ved intravenøs infusjon.

Det immunsuppresive midlet/midlene kan administreres før eller etter administrering av løselig CTLA4-mutant og/eller før eller etter organ/vevstransplantatet. Fortrinnsvis blir beinmargen og det immunsuppresive midlet administrert før administrering av løselig, mutert CTLA4-molekyl. I én utførelsesform blir en første dose av T-celledepletert beinmarg (toleranseinduserende dose) og det immunsuppresive midlet administrert på omtrent samme tidspunkt som organtransplantatet.

De følgende eksemplene er presentert for å illustrere foreliggende oppfinnelse. Metodologien og resultatene kan variere avhengig av det tilsiktede målet med behandling og fremgangsmåtene anvendt.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1

Dette eksemplet tilveiebringer en beskrivelse av fremgangsmåtene anvendt for å generere nukleotidsekvensene som koder for de løselige, muterte CTLA4-molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse. Et enkeltsetemutert L104Elg ble generert og testet for bindingskinetikker til CD80 og/eller CD86. L104Elg-nukleotidsekvensen ble anvendt som et templat for å generere den dobbeltsetemuterte CTLA4-sekvensen, L104EA29Ylg, som ble testet for bindingskinetikker til CD80 og/eller CD86.

CTLA4lg-kodonbasert mutagenese:

En mutagenese- og screeningsstrategi ble utviklet for å identifisere muterte CTI_A4lg-molekyler som hadde lavere dissosieringshastigheter (av-hastigheter) fra binding av CD86-molekyler. Enkeltsetemuterte nukleotidsekvenser ble generert ved anvendelse av CTLA4lg (US patent nr: 5.844.095; 5.851.795 og 5.885.796; ATCC aksesjonsnr. 68629) som et templat. Mutagene PCR-oligonukleotidprimere ble utformet for random mutagenese av et spesifikt cDNA-kodon ved å tillate hvilken som helst base i posisjonene 1 og 2 i kodonet, men bare guanin eller tymin i posisjon 3 (XXG/T; også kjent som NNG/T). På denne måten kan et spesifikt kodon som koder for en aminosyre muteres tilfeldig for å kode for hver av de 20 aminosyrene. Med hensyn til dette gir XXG/T-mutagenese 32 potensielle kodoner som koder for hver av de 20 aminosyrene. PCR-produkter som koder for mutasjoner nær -M97-G107 i CTLA4lg (se Figur 1 eller 2) ble kuttet med Sacl/Xbal og subklonet inn i lignende kuttet CTLA4lgTtLN-ekspresjonsvektor. Denne fremgangsmåten ble anvendt for å generere det enkeltsetemuterte CTLA4-molekylet L104Elg.

For mutagenese i nærheten av S25-R33 i CTLA4lg ble et Nhel-restriksjonssete først innført 5' i forhold til denne løkken ved PCR-primerstyrt mutagenese. Dette Nhel-restriksjonssetet førte ikke til endret aminosyresekvens. PCR-produkter ble kuttet med Nhel/Xbal og subklonet inn i lignende kuttet CTLA4lg- eller L104Elg-ekspresjonsvektorer. Denne fremgangsmåten ble anvendt for å generere det dobbeltsetemuterte CTLA4-molekylet L104EA29Ylg (Figur 3). Spesielt ble nukleinsyremolekylet som koder for det enkeltsetemuterte CTLA4-molekylet, L104Elg, anvendt som et templat for å generere det dobbeltsetemuterte CTLA4-molekylet, L104EA29Ylg.

EKSEMPEL 2

Følgende tilveiebringer en beskrivelse av screeningsfremgangsmåtene anvendt for å identifisere de enkelt- og dobbeltsetemuterte CTLA4-polypeptidene, uttrykt fra konstruksjonene beskrevet i Eksempel 1, som hadde en høyere bindingsaviditet for CD80- og CD86-antigener, sammenlignet med ikke-muterte CTLA4lg-molekyler.

Nåværende in vitro- og in v/Vo-studier indikerer at CTI_A4lg alene ikke kan blokkere primingen fullstendig av antigenspesifikt aktiverte T-celler. In wfro-studier med CTLA4lg og enten monoklonalt antistoff spesifikt for CD80 eller CD86 som måler hemming av T-celleproliferasjon indikerer at anti-CD80 monoklonalt antistoff ikke økte CTLA4lg-hemming. Imidlertid økte anti-CD86 monoklonalt antistoff hemmingen, hvilket indikerer at CTI_A4lg ikke var like effektiv til å blokkere CD86-interaksjoner. Disse resultatene støtter tidligere funn av Linsley et al. (Immunity,

(1994), 1:793-801) som viser at hemming av CD80-medierte cellulære responser trengte ca. 100 ganger lavere CTLA4lg-konsentrasjoner enn for CD86-medierte responser. Basert på disse funnene ble det antatt at løselige, muterte CTLA4-molekyler som har en høyere aviditet for CD86 enn villtype CTLA4 bør være bedre i stand til å blokkere primingen av antigenspesifikt aktiverte celler enn CTLA4lg.

Med dette formålet ble de løselige, muterte CTLA4-molekylene beskrevet i Eksempel 1 ovenfor screenet ved anvendelse av en ny screeningsprosedyre, for å identifisere flere mutasjoner i det ekstracellulære domenet til CTLA4 som forbedrer bindingsaviditet for CD80 og CD86. Denne screeningsstrategien fremskaffet en effektiv metode for å direkte identifisere mutanter med tydelig lavere av-hastigheter uten behov for proteinrensing eller kvantifisering, siden av- hastighetsbestemmelse er konsentrasjonsuavhengig (0'Shannessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212:457-468).

COS-celler ble transfektert med individuelt miniprep-renset plasmid-DNA og ekspandert i flere dager. Tre dager gammelt kondisjonert dyrkningsmedium ble overført til BIAcore-biosensorbrikker (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sverige) belagt med løselig CD80lg eller CD86lg. Den spesifikke bindingen og dissosieringen av muterte proteiner ble målt ved overflateplasmonresonans (0'Shannessy, D. J., et al., (1993) Anal. Biochem. 212:457-468). Alle eksperimenter ble kjørt på BIAcore™ eller BIAcore™ 2000-biosensorer ved 25 °C. Ligander ble immobilisert på NCM5-sensorbrikker (Pharmacia) av forskningskvalitet ved anvendelse av standard N-etyl-N'-(dimetylaminopropyl) karbodiimidN-hydroksysuksinimid-kobling (Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277; Khilko, S. N., et al., (1993) J. Biol. Chem 268:5425-15434).

Screeningsfremgangsmåte

COS-celler dyrket i 24-brønners vevskulturplater ble transfektert transient med DNA som koder for mutert CTLA4lg. Dyrkningsmedium inneholdende utskilt, løselig, mutert CTLA4lg ble høstet tre dager senere.

Kondisjonert COS-celledyrkningsmedium fikk strømme over BIAcore-biosensorbrikker derivatisert med CD86lg eller CD80lg (som beskrevet i Greene et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771), og muterte molekyler ble identifisert med lavere av-hastigheter enn det som ble observert for villtype CTI_A4lg. cDNA'ene som svarer til selekterte mediumprøver ble sekvensert, og DNA ble fremstilt for å utføre større skala av transient COS-celletransfeksjon, som mutert CTI_A4lg-protein ble fremstilt fra etter protein A-rensing av dyrkningsmedier.

BIAcore-analysebetingelser og likevektsbindingsdataanalyse ble utført som beskrevet i J. Greene et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771 og som beskrevet heri.

BIAcore-dataanalyse

Senosorgramutgangsnivåer ble normalisert til null responsenheter (RU) før analyse. Prøver ble kjørt over kontrollavledede gjennomstrømningsceller for å bestemme RU-bakgrunnsverdier som skyldes forskjeller i bulk-brytningsindeks mellom løsninger. Likevektsdissosieringskonstanter (Kd) ble beregnet fra grafer av Rekvversus C, der RekV er likevektsresponsen minus responsen på en kontrollavledet brikke og C er den molare analyttkonsentrasjonen. Bindingskurver ble analysert ved å anvende kommersielt ulineært kurvetilpasningsprogram (Prism, GraphPAD Software).

Eksperimentelle data ble først tilpasset en modell for binding av en enkel ligand til en enkel reseptor (ett-sete modell, dvs. et enkelt langmuir-system, A+B AB), og likevektsassosieringskonstanter (Kd= [A]«[B]\[AB]) ble beregnet fra likningen R = Rmaks«C/(Kd+C). Deretter ble data tilpasset den enkleste to-sete modellen av ligandbinding (dvs. til en reseptor som har to ikke-interagerende uavhengige bindingsseter som er beskrevet av likningen R = Rmaksi#C\(Kd1+C)+Rmaks2« C\(Kd2+C).

Tilpasningsgraden til disse to modellene ble analysert visuelt ved sammenligning med eksperimentelle data og statistisk ved en F-test av "sums-of-squares". Den enklere ett-sete modellen ble valgt som den beste tilpasningen, med mindre to-sete modellen passer signifikant bedre (p<0,1).

Assosierings- og disassosieringsanalyser ble utført ved anvendelse av BIA 2.1 evalueringsprogram (Pharmacia). Assosieringshastighetskonstanter kPåble beregnet på to måter, ved å anta både homogene enkeltseteinteraksjoner og parallelle to-sete interaksjoner. For enkeltseteinteraksjoner ble kPå-verdier beregnet i henhold til likningen Rt = RekV(1-exp"ks(t to), der Rt er en respons på et gitt tidspunkt, t; Rekver likevektsresponsen; to er tidspunktet for injeksjonsstart; og ks = dR/dt = kPå«Ckav, der C er en analyttkonsentrasjon, beregnet i form av monomere bindingsseter. For to-sete interaksjoner ble kpå-verdier beregnet i henhold til likningen Rt<=>Rekvi(1-exp"<ks1>(<t>"<t>o)+RekV2(1-exp<ks>2(t"to). For hver modell ble verdiene av kpåbestemt fra den beregnede stigningen (til ca. 70 % maksimal assosiering) av grafer av ks versus C.

Dissosieringsresultater ble analysert i henhold til modeller med ett sete (AB=A+B) eller to seter (AiBj=Ai+Bj), og hastighetskonstanter (kav) ble beregnet fra beste tilpasningskurver. Bindingssetemodellen ble anvendt unntatt når residualene var større enn maskinbakgrunn (2-10 RU, i henhold til maskin), i det tilfellet ble to-bindingssetemodellen anvendt. Halv-tid av reseptorokkupasjon ble beregnet ved anvendelse av forholdet ti/2=0,693/kav-

Væskestrømcytometri:

Murint mAb L307.4 (anti-CD80) ble kjøpt fra Becton Dickinson (San Jose, California) og IT2.2 (anti-B7-0 [også kjent som CD86]) fra PharMingen (San Diego, California). For immunfarging ble CD80-positive og/eller CD86-positive CHO-celler fjernet fra deres kulturbeholdere ved inkubering i fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 10 mM EDTA. CHO-celler (1-10 x 10<5>) ble først inkubert med mAb'er eller immunglobulinfusjonsproteiner i DM EM inneholdende 10 % føtalt bovint serum (FBS), deretter vasket og inkubert med fluoresceinisotiocyanat-konjugert geit anti-mus eller anti-humant immunglobulin andre-trinns reagenser (Tago, Burlingame, California). Celler ble gitt en endelig vask og analysert på en FACScan (Becton Dickinson).

SDS-PAGE og størrelseseksklusjonskromatografi

SDS-PAGE ble utført på Tris/glysin 4-20 % akrylamidgeler (Novex, San Diego, CA). Analytiske geler ble farget med Coomassie blå, og bilder av våte geler ble fremskaffet ved digital skanning. CTLA4lg (25 ug) og L104EA29Ylg (25 ug) ble analysert ved størrelseseksklusjonskromatografi ved å anvende en TSK-GEL G300 SWxL-kolonne (7,8 x 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA) ekvilibrert i fosfatbufret saltvann inneholdende 0,02 % NAN3ved en strømningshastighet på 1,0 ml/min.

CTLA4Xci2os og L104EA29YXci2os

Enkeltkjedet CTLA4XCi2osble fremstilt som tidligere beskrevet (Linsley et al.,

(1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424). Kort fortalt ble et onkostatin M CTLA4 (OMCTLA4) ekspresjonsplasmid anvendt som et templat, fremoverprimeren,

GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG (SEKV ID

NR: 17), ble valgt for å matche sekvenser i vektoren; og den reverse primeren,

GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC (SEKV ID

NR: 18), tilsvarte de siste sju aminosyrene (dvs. aminosyrene 118-124) i det ekstracellulære domenet til CTLA4 og inneholdt et restriksjonsenzymsete og et stoppkodon (TGA). Den reverse primeren spesifiserte en C120S (cystein til serin i posisjon 120) mutasjon. Spesielt er nukleotidsekvensen GCA (nukleotidene 34-36) i den reverse primeren vist ovenfor byttet ut med én av de følgende nukleotidsekvensene: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT eller GCT. Som fagfolk vil forstå, er nukleotidsekvensen GCA en reversert komplementær sekvens av kodonet TGC for cystein. Likeledes er nukleotidsekvensene AGA, GGA, TGA, CGA, ACT eller GCT de reverserte komplementære sekvensene til kodonene for serin. Polymerasekjedereaksjonsprodukter ble kuttet med Hind\\\/ Xba\ og subklonet retningsbestemt inn i ekspresjonsvektoren ttLN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). L104EA29YXCi2osble fremstilt på en identisk måte. Hver konstruksjon ble verifisert med DNA-sekvensering.

Identifisering og biokjemisk karakterisering av mutanter med høy aviditet

Tjuefire aminosyrer ble valgt for mutagenese, og de resulterende -2300 muterte proteinene ble undersøkt for CD86lg-binding ved overflateplasmonresonans (SPR; som beskrevet supra). De dominerende effektene av mutagenese på hvert sete er oppsummert i Tabell II. Tilfeldig mutagenese av noen aminosyrer i S25-R33 forandret tilsynelatende ikke ligandbinding. Mutagenese av E31 og R33 og restene M97-Y102 resulterte i redusert ligandbinding. Mutagenese av restene S25, A29 og T30, K93, L96, Y103, L104 og G105 resulterte i proteiner med lave på- og/eller lave av-hastigheter. Disse resultatene bekrefter tidligere funn om at rester i S25-R33 regionen og rester i eller nær M97-Y102 påvirker ligandbinding (Peach et al.,

(1994) J. Exp. Med. 180:2049-2058).

Mutagenese av setene S25, T30, K93, L96, Y103 og G105 resulterte i identifiseringen av noen muterte proteiner som hadde lavere av-hastigheter fra CD86lg. I disse tilfellene ble imidlertid den lave av-hastigheten fulgt av en lav på-hastighet som resulterte i muterte proteiner med en total aviditet for CD86lg som var tilsynelatende lik den observert med villtype CTLA4lg. I tillegg resulterte mutagenese av K93 i signifikant aggregering som kan ha vært ansvarlig for kinetikkforandringene som ble observert.

Tilfeldig mutagenese av L104 etterfulgt av COS-celletransfeksjon og screening ved SPR av dyrkningsmediumprøver over immobilisert CD86lg fremskaffet seks mediumprøver inneholdende muterte proteiner med ca. 2-fold lavere av-hastigheter enn villtype CTLA4lg. Når det tilsvarende cDNA'et til disse mutantene ble sekvensert, ble hver funnet å kode for en leucin- til glutaminsyremutasjon (L104E). Tilsynelatende affiserte ikke substitusjon av leucin 104 til asparaginsyre (L104D)CD86lg-binding.

Mutagenese ble deretter repetert på hvert sete nevnt i Tabell II, denne gang ved anvendelse av L104E som PCR-templat i stedet for villtype CTLA4lg, som beskrevet ovenfor. SPR-analyse, igjen ved å anvende immobilisert CD86lg, identifiserte seks dyrkningsmediumprøver fra mutagenese av alanin 29 med proteiner som har ca. 4-fold lavere av-hastigheter enn villtype CTLA4lg. De to laveste var tyrosinsubstitusjoner (L104EA29Y), to var leucin (L104EA29L), én var tryptofan (L104EA29W) og én var treonin (L104EA29T). Tilsynelatende ingen lave av-hastighetsmutanter ble identifisert når alanin 29 ble tilfeldig mutert alene i villtype CTLA4lg.

Den relative molekylmassen og aggregeringstilstanden til renset L104E og L104EA29Ylg ble vurdert ved SDS-PAGE og størrelseseksklusjonskromatografi. L104EA29Ylg (-1^g; spor 3) og L104Elg (-1^g; spor 2) hadde tilsynelatende den samme elektroforetiske mobiliteten som CTI_A4lg (-1^g; spor 1) under reduserende (-50 kDa; +(5ME; pluss 2-merkaptoetanol) og ikke-reduserende (-100 kDa; -(5ME) betingelser (Figur 14A). Størrelseseksklusjonskromatografi demonstrerte at L104EA29Ylg (Figur 14C) tilsynelatende hadde den samme mobiliteten som dimerisk CTLA4lg (Figur 14B). De store toppene representerer proteindimer, mens den raskere eluerende mindre toppen i Figur 14B representerer aggregater med høyere molekylvekt. Bortimot 5,0 % av CTLA4lg forelå som aggregater med høyere molekylvekt, men det var ingen holdepunkter for aggregering av L104EA29Ylg eller L104Elg. Derfor kan ikke den sterkere bindingen til CD86lg observert med L104Elg og L104EA29Ylg bli tillagt aggregering indusert av mutagenese.

Likevekt og kinetikkbindingsanalyse

Likevekt og kinetikkbindingsanalyse ble utført på protein A-renset CTLA4lg, L104Elg og L104EA29Ylg ved anvendelse av overflateplasmonresonans (SPR). Resultatene er vist i Tabell I. Observerte likevektsdissosieringskonstanter (Kd; Tabell I) ble beregnet fra bindingskurver generert over et konsentrasjonsområde (5,0-200 nM). L104EA29Ylg binder sterkere til CD86lg enn det L104Elg eller CTLA4lg gjør. Den lavere Kd-verdien til L104EA29Ylg (3,21 nM) enn L104Elg (6,06 nM) eller CTLA4lg (13,9 nM) indikerer høyere bindingsaviditet av L104EA29Ylg til CD86lg. Den lavere Kd-verdien til L104EA29Ylg (3,66 nM) enn L104Elg (4,47 nM) eller CTLA4lg (6,51 nM) indikerer høyere bindingsaviditet av L104EA29Ylg til CD80lg.

Kinetikkbindingsanalyse avslørte at de komparative på-hastighetene for CTLA4lg-, L104Elg- og L104EA29Ylg-binding til CD80 var like, slik det var for på-hastigheter for CD86lg (Tabell I). Av-hastigheter for disse molekylene var imidlertid ikke ekvivalente (Tabell I). Sammenlignet med CTLA4lg hadde L104EA29Ylg ca. 2-fold lavere av-hastighet fra CD80lg og ca. 4-fold lavere av-hastighet fra CD86lg. L104E hadde av-hastigheter som lå mellom L104EA29Ylg og CTLA4lg. Siden innføringen av disse mutasjonene ikke affiserte på-hastigheter signifikant, skyldes økningen i aviditet for CD80lg og CD86lg observert med L104EA29Ylg sannsynligvis primært en reduksjon i av-hastigheter.

For å bestemme om økningen i aviditet av L104EA29Ylg for CD86lg og CD80lg skyldes mutasjonene som affiserer måten hver monomer assosierte som en dimer, eller om der var aviditetsøkende strukturelle forandringer innført i hver monomer, ble enkeltkjedekonstruksjoner av CTLA4- og L104EA29Y-ekstracellulære domener fremstilt etter mutagenese av cystein 120 til serin som beskrevet supra og av Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424 (84). De rensede proteinene CTLA4XCi2osog L104EA29YXCi2osble vist å være monomere ved gelpermeasjonskromatografi (Linsley et al., (1995), supra), før deres ligandbindingsegenskaper ble analysert ved SPR. Resultater viste at bindingsaffinitet av begge monomere proteiner for CD86lg var ca. 35-80-fold lavere enn det som var observert for deres respektive dimerer (Tabell I). Dette støtter tidligere publiserte resultater som fastslår at dimerisering av CTLA4 var nødvendig for ligandbinding med høy aviditet (Greene et al., (1996) J. Biol. Chem., 271:26762-26771).

L104EA29YXCi2osbandt med ca. 2-fold høyere affinitet enn CTLA4XCi2ostil både CD80lg og CD86lg. Den økte affiniteten skyldtes ca. 3-fold lavere dissosieringshastighet fra begge ligander. Derfor skyldes sterkere ligandbinding med L104EA29Y mest sannsynlig aviditetsøkende strukturelle forandringer som hadde blitt innført i hver monomere kjede i stedet for endringer der molekylet dimeriserte.

Lokasjon og strukturell analyse av aviditetsøkende mutasjoner

Strukturen til det ekstracellulære IgV-lignende domenet til CTLA4 har nylig blitt bestemt ved NMR-spektroskopi (Metzler et al., (1997) Nature Struct. Biol., 4:527-531). Dette tillott nøyaktig lokasjon av leucin 104 og alanin 29 i den tredimensjonale folden (Figur 15A-B). Leucin 104 er lokalisert nær den sterkt konserverte MYPPPY-aminosyresekvensen. Alanin 29 er lokalisert nær den C-terminale enden til S25-R33 regionen som er spatialt ved siden av MYPPPY-regionen. Mens det er signifikant interaksjon mellom rester på basen av disse to regionene, er det tilsynelatende ingen direkte interaksjon mellom L104 og A29, selv om de begge utgjør del av en sammenhengende hydrofob kjerne i proteinet. De strukturelle konsekvensene av de to aviditetsøkende mutantene ble vurdert ved modellering. A29Y-mutasjonen kan lett bli tilpasset i kløften mellom S25-R33 regionen og MYPPPY-regionen og kan stabilisere konformasjonen av MYPPPY-regionen. I villtype CTLA4 danner L104 omfattende hydrofobe interaksjoner med L96 og V94 nær MYPPPY-regionen. Det er svært usannsynlig at glutaminsyremutasjonen adopterer en lignende konformasjon som den L104 har av to grunner. For det første er det utilstrekkelig med rom til å plassere den lengre glutaminsyresidekjeden i strukturen uten signifikant forstyrrelse av S25-R33 regionen. For det andre vil energikostnadene bli høye ved å begrave den negative ladningen til glutaminsyresidekjeden i den hydrofobe regionen. I stedet antyder modelleringsstudier at glutaminsyresidekjeden vipper ut over på overflaten, der dens ladning kan bli stabilisert med løsningsmidlet. En slik konformasjonsendring kan lett bli tilpasset med G105, med minimal distorsjon til andre rester i regionene.

Binding av mutanter med høy aviditet til CHO-celler som uttrykker CD80 eller CD86

FACS-analyse (Figur 9) av CTI_A4lg og muterte molekyler som binder til stabilt transfekterte CD80+ og CD86+ CHO-celler ble utført som beskrevet heri. CD80-positive og CD86-positive CHO-celler ble inkubert med økende konsentrasjoner av CTLA4lg, L104EA29Ylg eller L104Elg og deretter vasket. Bundet immunglobulinfusjonsprotein ble detektert ved å anvende fluoresceinisotiocyanat-konjugert geit anti-humant immunglobulin.

Som vist i Figur 9 ble CD80-positive eller CD86-positive CHO-celler (1,5 x 10<5>) inkubert med de indikerte konsentrasjonene av CTLA4lg (lukkede firkanter), L104EA29Ylg (sirkler) eller L104Elg (trekanter) i 2 timer ved 23 °C, vasket og inkubert med fluoresceinisotiocyanat-konjugert geit anti-humant immunglobulinantistoff. Binding på totalt 5.000 levende celler ble analysert (én parameter) på en FACScan, og gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) ble bestemt fra datahistogrammer ved anvendelse av PC-LYSYS. Data ble korrigert for bakgrunnsfluorescens målt på celler kun inkubert med andre trinns-reagens (MFI = 7). Kontroll L6 mAb (80 ug/ml) ga MFK 30. Disse resultatene er representative for fire uavhengige eksperimenter.

Binding av L104EA29Ylg, L104Elg og CTLA4lg til humane CD80-transfekterte CHO-celler er bortimot ekvivalent (Figur 9A). L104EA29Ylg og L104Elg binder sterkere til CHO-celler stabilt transfektert med humant CD86 enn det CTLA4lg gjør

(Figur 9B).

Funksjonelle tester:

Humane CD4-positive T-celler ble isolert ved immunmagnetisk negativ seleksjon (Linsley et al., (1992) J. Exp. Med. 176:1595-1604). Isolerte CD4-positive T-celler ble stimulert med forbalmyristatacetat (PMA) pluss CD80-positive eller CD86-positive CHO-celler i nærvær av titrerende konsentrasjoner av hemmer. CD4-positive T-celler (8-10 x 104/brønn) ble dyrket i nærvær av 1 nM PMA med eller uten bestrålte CHO-cellestimulatorer. Proliferative responser ble målt ved tilsetning av 1^Ci/brønn av [<3>H]tymidin i løpet av de siste 7 timene av en 72 timers kultur. Hemming av PMA pluss CD80-positive CHO, eller CD86-positive CHO, stimulerte T-celler med L104EA29Ylg og CTI_A4lg ble utført. Resultatene er vist i Figur 10. L104EA29Ylg hemmer proliferasjon av CD80-positive PMA-behandlede CHO-celler mer enn CTLA4lg (Figur 10A). L104EA29Ylg er også mer effektiv enn CTI_A4lg til å hemme proliferasjon av CD86-positive PMA-behandlede CHO-celler (Figur 10B). Derfor er L104EA29Ylg en mer potent hemmer av både CD80- og CD86-mediert samstimulering av T-celler. Figur 11 viser hemming med L104EA29Ylg og CTI_A4lg av allostimulerte humane T-celler preparert ovenfor og videre allostimulert med en human B-lymfoblastoid cellelinje (LCL) kalt PM som uttrykte CD80 og CD86 (T-celler ved 3,0 x 104/brønn og PM ved 8,0 x 10<3>/brønn). Primær allostimulering foregikk i 6 dager, deretter fikk cellene tilsatt<3>H-tymidin i 7 timer, før innføring av radioaktiv markør ble bestemt.

Sekundær allostimulering ble utført som følger: Sju dagers primært allostimulerte T-celler ble høstet over lymfocyttsepareringsmedium (LSM) (ICN, Aurora, OH) og fikk stå urørt i 24 timer. T-celler ble deretter restimulert (sekundært), i nærvær av titrerende mengder av CTLA4lg eller L104EA29Ylg, ved tilsetning av PM i det samme forholdet som ovenfor. Stimulering varte i 3 dager, deretter fikk cellene tilsatt radioaktiv markør og ble høstet som ovenfor. Effekten av L104EA29Ylg på primært allostimulerte T-celler er vist i Figur 11 A. Effekten av L104EA29Ylg på sekundært allostimulerte T-celler er vist i Figur 11B. L104EA29Ylg hemmer både primære og sekundære T-celleproliferative responser bedre enn CTI_A4lg.

For å måle cytokinproduksjon (Figur 12), ble duplikate sekundære allostimuleringsplater satt opp. Etter 3 dager ble dyrkningsmedium undersøkt ved anvendelse av ELISA-testsett (Biosource, Camarillo, CA) ved å anvende betingelser anbefalt av produsenten. L104EA29Ylg ble funnet å være mer potent enn CTI_A4lg til å blokkere T-celle IL-2, IL-4 og y-IFN cytokinproduksjon etter en sekundær allogen stimulus (Figur 12A-C).

Effektene av L104EA29Ylg og CTLA4lg på blandet lymfocyttrespons (MLR) fra ape er vist i Figur 13. Mononukleære celler fra perifert blod (PBMCer; 3,5 x 104 celler/brønn fra hver ape) fra 2 aper ble renset over lymfocyttsepareringsmedium (LSM) og blandet med 2 ug/ml fytohemagglutinin (PHA). Cellene ble stimulert 3 dager og deretter tilsatt radioaktiv markør 16 timer før høsting. L104EA29Ylg hemmet ape T-celleproliferasjon bedre enn CTLA4lg.

EKSEMPEL 3

Dette eksemplet tilveiebringer en beskrivelse av donorpankreatektomi og øyisolering og øytransplantatprosedyrer i en dyremodell.

Materialer og metode:

Dyr. Halvvoksne rhesushannaper avlet i fangenskap (Macaca mulatta) (-4-20 kg) ble anvendt som mottakere og donorer. Fravær av forhåndsdannede donorspesifikke antistoffer i mottakeren ble bekreftet før transplantasjon. Alle potensielle donorer og mottakere ble testet for anti-CMV antistoffer, og bare dyr som var sero-positive for CMV ble anvendt som mottakere.

Donorpankreatektomi og øyisolering. Donorpankreatektomi ble utført én dag før transplantasjon. Prosedyren ble utført under total bedøvelse (en kombinasjon av parenteral ketamin og isolfluran ved inhalasjon) gjennom et midtlinjeabdominalt innsnitt. De splenorenale og splenokoliske ligamentene ble delt slik at milten, sammen med halen av pankreas ble mobilisert. Pankreashodet og andre del av tolvfingertarmen ble mobilisert etter Kochers manøver. Etter administrering av heparin (200 U/kg) ble aortaen kanylert rett ovenfor dens bifurkasjon og blod ble tappet. Vandig is ble plassert umiddelbart i den mindre sekken og bak pankreaskroppen. Pankreaskroppen og -nakken ble forsiktig fjernet ved skarp disseksjon for ikke å skade den pankreatiske kapselen. Den felles gallegangen, hoved- og bipankreaskanaler ble identifisert og ligert, og pankreashodet dissekert fra den andre delen av tolvfingertarmen.

Rhesusapeøyisolering ble fullført via mindre modifikasjoner av den automatiserte metoden for human øyisolering (Ricordi, (1988) Diabetes, 37:413; Ranuncoli,

(2000) Cell Transplant 9: 409) ved anvendelse av Liberase (Roche/Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) i en konsentrasjon på 0,47-0,71 mg/ml. En tre-sjikts, diskontinuerlig Euroficoll-gradient (tetthetene 1,108, 1,097, 1,037; Meditech, Herndon, VA) og en Cobe 2991-blodcelleprosessor (Gambro, Lakewood, CO) ble anvendt til rensing av øyer fra enzymbehandlet pankreas. Prøver av den endelige øyprepareringen ble farget med dithizon (Sigma, St. Louis, MO), og prepareringen ble vurdert ved å telle antall øyer i hvert av de følgende størrelsesområdene: 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350 og 350-400 nm. Resultatene ble matematisk omregnet til å bestemme antall øyer med en gjennomsnittsdiameter på 150 (xm og ble uttrykt som øyekvivalenter (IEQ) (Ricordi C. et al., Acta Diabetol Lat 27:185-195, 1990).

Mottakerpankreatektomi og intrahepatisk øycelletransplantasjon. Total pankreatektomi, uten duodenektomi eller splenektomi, ble utført minst én uke før transplantasjon. Halen og kroppen til pankreas ble dissekert langs miltarterien og - venen, som ble forsiktig bevart ved bare å ligere og dele pankreatiske grener. De inferior mesenteriske og midtre koliske venene ble identifisert og bevart i løpet av disseksjon av pankreaskroppen. De portale og superior mesenteriske venene ble gjenkjent og pankreatiske vener ble ligert og delt.

Tolvfingertarmen ble mobilisert og grener av de pankreatikoduodenale karene som ender i pankreas ble ligert og delt ved å la de duodenale grenene være intakte. Den felles gallegangen ble identifisert og bevart i løpet av "blunt" disseksjon mellom pankreashodet og c-løkken til tolvfingertarmen. Hoved- og bipankreaskanaler ble ligert, delt og pankreas ble fjernet fra det abdominale hulrommet. Alle dyrene gjennomgikk intravenøs glukosetoleransetest for å vurdere effektiviteten til pankreatektomiprosedyren. Alle ble dokumentert å være c-peptid negative før øytransplantasjon.

Øyer dyrket natten over ble vasket i transplantasjonsmedium, bestående av RPMI-medium 1640 (Mediatech) supplert med 2,5 % humant serumalbumin, og telt for å bestemme antall IEQ. Øyer ble deretter pelletert og resuspendert i 20 ml transplantasjonsmedium supplert med 200 enheter heparin. Intra-hepatisk øytransplantasjon ble utført via gravitasjonsdrenering av øyer inn i en sigmoid eller gren av den venstre koliske venen som drenerer inn i den portale venen gjennom et 22-gauge intravenøst kateter.

Blodglukosemonitorering, insulinadministrering og definisjon av avstøtning. Fastende og postprandiale blodglukosenivåer ble monitorert to ganger daglig (før frokost og etter lunsj) via ørestikk, etterfulgt av blodtesting med et glukometer elite (Bayer, Elkhart, IN). Insulin (NPH, Ultralente; Eli Lilly, Indianapolis, IN) ble administrert tre ganger daglig i forsøk på å opprettholde fastende blodglukose < 300 mg/dl i pretransplanterte pankreatektomiserte dyr eller i de som hadde avstøtt deres allotransplantater.

Eksperimentelle grupper og immunsuppresive protokoller. To behandlingsprotokoller ble testet: (1) Edmonton-protokoll - ved anvendelse av Tacrolimus, Sirolimus og anti-IL-2R mAb (Shapiro, A. M. J. et al., (2000), N. Eng. J. Med., 343: 230-238) og (2) L104EA29Y-Edmonton-protokoll - ved anvendelse av L104EA29Ylg, Sirolimus og anti-IL-2R mAb. Kontrollgruppen omfattet mottakere behandlet med "immunsuppresiv grunnkur" som har rapamycin og anti-IL-2R alene. Tacrolimus ble gitt 0,05 mg/kg bid POD 0-14 (målnivåer 5-8) og 0,06 mg/kg daglig (målnivåer 3-5) POD 15-120. L104EA29Ylg ble administrert intravenøst intra-operativt (10 mg/kg) og på postoperativ dag 4 (15 mg/kg), 14, 28, 42, 56, 70, 84, 98, 112, 126 (20 mg/kg) for å opprettholde serum ved høyere nivåer enn 30 ug/ml. Kimærisk anti-humant IL-2R mAb (0,3 mg/kg iv) ble administrert intra-operativt og på POD 4. Sirolimus (Rapamune®) ble administrert oralt 1,25 mg/kg bid (målnivåer 10-15) POD 0-50, 1 mg/kg bid (målnivåer 7-10) POD 50-100 og deretter gradvis redusert til å stanse dosering ved POD130. Sirolimus (Rapamune®) og Tacrolimus (Prograf®) ble kjøpt fra apoteket ved Emory universitetssykehus. Kimærisk anti-humant IL-2R mAb (Simulect®) ble tilveiebrakt av Novartis Pharma AG (Basel, Sveits).

Nekropsi. Alle mottakere hadde en fullstendig nekropsi utført av Yerkes veterinæransatte på dødstidspunktet.

Deteksjon av anti-donor antistoffer. Tilstedeværelse av detekterbart donorspesifikt alloantistoff ble bestemt ved anvendelse av væskestrømcytometri. Leukocytter fra perifert blod fungerte som målceller for

pretransplantasjonsanalysen. Leukocytter isolert fra mesenteriske lymfeknuter

fremskaffet på transplantasjonstidspunktet var målcellene for posttransplantasjonstestene.

Statistikk. Overlevelse av øytransplantatene blant eksperimentelle grupper ble sammenlignet ved anvendelse av Mann-Whitney-Wilcoxon-testen (Armitage et al.,

(1987) Statistical methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publication, Oxford).

Anti-donor enzymbundet immunospot-test. Responser ble målt ved interferon-y (IFN-y) enzymbundet immunospot (ELISpot) test ved anvendelse av leukocytter i perifert blod fremskaffet fra mottaker- og donordyrene. Et likt antall bestrålte stimulatorer (donorleukocytter) og respondere (mottakerleukocytter) ble satt til estercellulosebunnplater (Millipore, Bedford, MA) belagt med fange-antistoffet, mus anti-humant IFN-y (klon GZ-4; Mabtech, Sverige). Etter 14-16 timers inkubasjon ble biotinylert mus anti-humant IFN-y (klon 7-B6-1; Mabtech, Sverige) tilsatt, ubundet antistoff ble fjernet og pepperrotperoksidase-Avidin D (Vector, Burlingame, CA) ble tilsatt. Flekker ble utviklet med substratet 3-amino-9-etyl-karbazol (Sigma). Hver flekk representerer en IFN-y-sekrerende celle; frekvensen av disse cellene kan bestemmes ved å dividere antall flekker generert med det totale antallet responderceller tilsatt platen.

Resultater:

CD28-signalveiblokkeringbasert terapi forlenger overlevelsen av øyallotransplantatene i Rhesus makaki-aper. Diabetes ble indusert ved kirurgisk pankreatektomi av mottakerdyr og bekreftet ved intravenøs glukosetoleransetest før transplantasjon. Donor-mottaker paringer ble definert basert på molekylær typing ved anvendelse av et panel av tidligere definerte viktige vevsforlikelighetsalleler (8 klasse I og 12 klasse II (Lobashevsky A. et al., Tissue Antigens 54:254-263, (1999); Knapp LA. et al., Tissue Antigens 50:657-661, (1997); Watkins D. I., Crit Rev Immunol 15:1-29, (1995)). Paringer maksimerte ulikhet i både klasse I- og ll-loki. Avstøtning ble definert som to påfølgende fastende blodglukoseverdier > 125 mg/dl på påfølgende dager. Intra portal infusjon av allogene øyer (> 10.000 IEQ/kg) resulterte i begynnende gjenoppretting av euglykemi og insulinuavhengighet i diabetiske aper i begge grupper.

Behandling av pankreatektomiserte makaki-aper med

L104EA29Ylg/Rapamycin/anti-IL-2R mAb-kuren forlenget

øyallotransplantatoverlevelse signifikant (henholdsvis 204, 190, 216, > 220 og 56 dager). Dyrene som mottok L104EA29Ylg/Rapamycin/anti-IL-2R kur resulterte i adekvat glukosekontroll som angitt ved fastende plasmaglukosenivåer (Figur 5 og 16B). I tillegg trengte ikke disse dyrene insulinerstatningsterapi for en signifikant forlenget tidsperiode (Figur 6). Derimot avstøtte dyrene som mottok grunnkuren alene (Rapamycin/anti-IL-2R mAb) de transplanterte øyene i løpet av én uke (Figur 16C). Kontrolldyrene viste markert økte nivåer av fastende plasmaglukose (Figur 5). Videre trengte kontrolldyrene insulinerstatningsterapi i løpet av én uke

etter øytransplantasjon (Figur 6). Fire av fem dyr som mottok L104EA29Ylg-kuren hadde avstøtningsfri overlevelse i hele behandlingsperioden (Tabell III). Intravenøs glukosetoleransetest med måling av insulin- og glukosenivåer bekreftet øyfunksjon etter transplantasjon (representativt dyr, Figur 7 og 16D).

Insulinuavhengighet. ND, ingen detektert i alleler som ble klassifisert.

100 dager etter transplantasjon var doseringen av rapamycin senket og gradvis redusert til null ved dag 121. Dyr fortsatte å være insulinuavhengige mens de mottok L104EA29Ylg-monoterapi. -150 dager etter transplantasjon mottok de gjenværende øymottakerne deres siste dose av L104EA29Ylg og stanset enhver ekstra immunsuppresiv terapi.

Som forventet, -1-2 måneder etter opphør av terapi, ble mottakere hyperglykemiske og trengte eksogen insulinterapi. Histologisk analyse avslørte et mononukleært infiltrat, hvilket sterkt indikerte avstøtning som etiologi av tap av glukosekontroll (Figur 17). I en intravenøs glukosetoleransetest viste testdyrene som mottok L104EA29Ylg/Rapamycin/anti-IL-2R mAb-kur normale glukosenivåer etter øytransplantasjon (Figur 7 og 16D).

Frekvensen av anti-donor IFN-y produserende celler ble detektert ved ELISpot-test og analysert ved anvendelse av et immunspot-avbildingssystem. Dyr som mottok den immunsuppresive grunnkuren alene demonstrerte signifikant økt antall av donor-reaktive IFNy-produserende T-celler (84 ± 4,6 celler), mens dyr som mottok L104EA29Ylg-kuren hadde ingen detekterbar respons (2 ± 0,56 celler).

L104EA29Ylg-terapi hemmer priming av anti-donor T- og B-celleresponser. Frekvensen av primede alloreaktive T-celler kan detekteres effektivt ved anvendelse av ELISpot-testen, som kan skjelne produksjon av IFN-y på enkeltcellenivå. Prøver fra perifert blod av øymottakere ble analysert på ulike tidspunkter både før og etter transplantasjon for deres evne til å generere IFN-y i respons til donorantigen. Dyr behandlet med grunnkuren alene utviklet raskt en målbar anti-donor respons som inntraff samtidig med avstøtning 1 uke etter transplantasjon. Derimot var frekvensen av anti-donor IFN-y produserende celler i dyr som mottok den L104EA29Ylg-inneholdende kuren ikke-detekterbar før terapien ble stanset (representative dyr, Figur 18A og B). Derfor blokkerte L104EA29Ylg-kuren effektivt dannelsen av anti-donor T-celleresponser, som ble målt ved evnen til å produsere IFN-y.

Væskestrømcytometri ble anvendt for å undersøke utviklingen av anti-donor antistoffresponser. Ett dyr i kontrollgruppen genererte en sterk anti-donor Ab-respons, mens det andre ikke klarte å utvikle en detekterbar respons, trolig fordi det ble gitt en lett og rolig død før antistoffresponsen kunne måles (Figur 18C). I motsetning til dette klarte ikke fire av fem dyr å generere en antistoffrespons mens de mottok L104EA29Ylg-terapi. Dette er i samsvar med tidligere rapporterte resultater ved anvendelse av CTLA4-lg i en øytransplantatmodell (Levisetti, M. G. et al., J Immunol 159:5187-5191, 1997), så vel som vår erfaring i en renal allotransplantatmodell der mottakere ikke klarte å generere anti-donor antistoffer (Pearson T, et al., (sammendrag). I: Programs and Abstracts of the 17th American Society of Transplant Physicians Annual Meeting, Chicago, 10.-14. mai, 1997. Chicago, American Society of Transplant Physicians). Ett dyr av fem mottakere gjennomgikk en avstøtningsepisode mens det mottok L104EA29Ylg-terapien og utviklet deretter en anti-donor antistoffrespons. Som forventet utviklet de gjenværende fire dyrene som mottok L104EA29Ylg-kuren konsekvent anti-donor antistoffresponser rundt avstøtningstidspunktet (-200 dager etter transplantasjon, 50 dager etter den siste dosen av L104EA29Ylg).

Øytransplantasjon har raskt blitt et alternativt behandlingsvalg for pasienter med ustabil type 1 diabetes. Nylige rapporter som beskriver steroidfrie immunsuppresive kurer, som resulterer i vellykket insulinuavhengighet etter øytransplantasjon, har spådd fornyet optimisme for den praktiske applikasjonen av øytransplantasjon. Mens eliminering av glukokortikoider fra immunsuppresive kurer representerer et viktig trinn fremover i anstrengelsen for å behandle type 1 diabetes, kan tiltro til kalsineurinhemmerterapi for primær immunsuppresjon begrense applikasjonen av denne tilnærmingen. Kalsineurinhemmere har mange uønskede bivirkninger, omfattende nefrotoksisitet, diabetes, hypertensjon, svekket lipidmetabolisme og hirsutisme (Kahan B. D. et al., N Engl J Med 321:1725-1738, 1989; Group TUSMFLS: A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation: USA Multicenter FK506 Liver Study Group. N Engl J Med 331:1110-1115, 1994; de Mattos AM et al., Am J Kidney Disease 35:333-346, 2000). Selv når medikamentnivåer holdes lave, kan betydelige bivirkninger utvikles. Dette gjelder spesielt for den diabetiske pasientpopulasjonen der renal funksjon allerede kan være svekket. Faktisk, i de nyeste rapportene fra Edmonton, hadde to pasienter med svakt økte

pretransplantasjonskreatininnivåer signifikant reduksjon i renal funksjon mens de gikk på kalsineurinhemmerterapi og måtte til slutt stanse denne terapien (Ryan E. A. et al., Diabetes 50:710-719, 2001). I den samme rapporten utviklet to-tredjedeler av mottakerne en viss grad av glukoseintoleranse, med en-fjerdedel utviklende utvetydig posttransplantasjonsdiabetes antatt å være relatert til anvendelse av tacrolimus. Dette understreker den tiltrekkende og essensielle egenskapen til en kalsineurinhemmerfri immunsuppresiv kur, spesielt for øytransplantasjon.

Blokkering av T-cellesamstimulatoriske signalveier er en lovende strategi for utvikling av ikke-toksiske immunsuppresive og potensielt toleranseinduserende kurer. Denne tilnærmingen er rettet mot de T-cellene som mottar "signal 1" i løpet av perioden med medikamentadministrering. For eksempel er behandling i løpet av peritransplantasjonsperioden antatt å svekke allospesifikke T-celler ved møte med det nye organet eller vevet, mens andre T-celler forblir usvekket (Li Y, et al., Nat Med 5:1298-1302, 1999). Blokkering av CD28/B7-signalveien har demonstrert bemerkelsesverdig forventning i eksperimentelle modeller av autoimmunitet og transplantasjon, hvilket gjør den til et spesielt tiltrekkende immunsuppresivt mål i øytransplantasjon, der trolig både auto- og alloimmunhindringer forekommer. Potensialet av CD28-blokkering i en stor dyretransplantatmodell ble beskrevet av Levisetti MG, et al. (J Immunol 159:5187-5191, 1997). Behandling med CTLA4-lg ble funnet å forlenge øyallotransplantatoverlevelse i ikke-humane primater signifikant, selv om det var beskjedent (Levisetti MG, et al., J Immunol 159:5187-5191, 1997). CTLA4-lg monoterapi bidrar lite til for å forlenge renal allotransplantatoverlevelse (Pearson T. et al., (sammendrag). I: Programs and Abstracts of the 17th American Society of Transplant Physicians Annual Meeting, Chicago, 10.-14. mai 1997. Chicago, American Society of Transplant Physicians). Nylig har det vært flere rapporter om langtidsoverlevelse av øyallotransplantater i ikke-humane primatmodeller. Anti-CD40L mAb-terapi har vist de mest imponerende resultatene så langt; imidlertid ble ikke toleranse oppnådd i lignende eksperimenter ved anvendelse av en renal transplantatmodell, ettersom tilbaketrekning av terapi til slutt resulterte i avstøtning (Kenyon, N. S., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 96:8132-8137 (1999); Kirk, A. D., et al., Nat. Med. 5, 686-693

(1999). I en annen oppmuntrende rapport beskrev Thomas et al. (Diabetes 50:1227-1236, (2001)) nylig anvendelse av et anti-CD3 immuntoksin og det immunmodulerende midlet DSG (15 deoksyspergualin) til å dramatisk forlenge øyoverlevelse i streptozotocin-induserte diabetiske primater. Selv om de er lovende, anvendte disse rapportene terapeutika hvis kliniske potensial på nåværende tidspunkt fortsatt er usikker.

In v/Vo-resultatene ved anvendelse av L104EA29Ylg, en mutert form av CTLA4-lg, i Rhesus-øyallotransplantatmodellen er i samsvar med in wfro-bevis som indikerer at dette andregenerasjonsmolekylet er en sterkere hemmer av T-celleresponser enn foreldermolekylet. Gitt at CTLA4-lg allerede har vist effektivitet i en klinisk studie av psoriasispasienter (Abrams, J. R. et al., J. Clin. Invest. 103:1243-1252

(1999)), er det betydelig entusiasme for studiene som anvender L104EA29Ylg som det primære immunsuppresive midlet. Det er tydelig kompatibelt, om ikke synergistisk, med klinisk godkjente immunsuppresive midler (anti-IL-2R mAb og rapamycin) som letter utformingen av kliniske studier. Innledende humane studier med L104EA29Ylg er allerede underveis i pasienter plaget med revmatoid artritt og de som gjennomgår renal transplantasjon. Selv om en direkte sammenligning av en tacrolimus-basert protokoll og L104EA29Ylg-kuren ikke ble gjort pga. rapporterte intolerable toksisiteter i ikke-humane primater (Montgomery, S. P., et al., Am J Transplant 1 (Supplement 1):438, 2001), antyder våre resultater at L104EA29Ylg har potensial til å være minst like effektiv som tacrolimus som et primært immunsuppresivt middel.

Konklusjoner:

En ny kalsineurinhemmer/steroidfri immunsuppresiv kur som tilveiebringer betydelig beskyttelse fra avstøtning og forlenger overlevelse av øyallotransplantater i ikke-humane primater er beskrevet. Det biologiske midlet L104EA29Ylg er et potent immunsuppresivt middel. L104EA29Ylg kan erstatte Tacrolimus i Edmonton-protokollen og dermed eliminere de uønskede bivirkningene av kalsineurinhemmeren.

Claims

1. Anvendelse av et løselig mutert CTLA4 molekyl for fremstilling av et medikament for å inhibere avstøtning av øycelletransplantat, hvor det løselige muterte CTLA4 molekylet omfatter et mutert ekstracellulært domene av CTLA4, og hvor det løselige muterte CTLA4 molekylet er: a) L104EA29Ylg som vist i figur 3 som begynner med Ala i posisjon -1 eller Met i posisjon +1 og slutter med Lys i posisjon +357 (SEK ID NR:6, som begynner med Ala i posisjon 26 og slutter med Lys i posisjon 383, eller begynner med Met i posisjon 27 og slutter med Lys i posisjon 383); b) L104Elg som vist i figur 19 som begynner med Ala i posisjon -1 eller Met i posisjon +1 og slutter med Lys i posisjon +357 (SEK ID NR:8, som begynner med Ala i posisjon 26 og slutter med Lys i posisjon 383, eller begynner med Met i posisjon 27 og slutter med Lys i posisjon 383); c) L104EA29Llg som vist i figur 20 som begynner med Ala i posisjon -1 eller Met i posisjon +1 og slutter med Lys i posisjon +357 (SEK ID NR: 10, som begynner med Ala i posisjon 26 og slutter med Lys i posisjon 383, eller begynner med Met i posisjon 27 og slutter med Lys i posisjon 383); d) L104EA29Tlg som vist i figur 21 som begynner med Ala i posisjon -1 eller Met i posisjon +1 og slutter med Lys i posisjon +357 (SEK ID NR: 12, som begynner med Ala i posisjon 26 og slutter med Lys i posisjon 383, eller begynner med Met i posisjon 27 og slutter med Lys i posisjon 383); eller e) L104EA29Wlg som vist i figur 22 som begynner med Ala i posisjon -1 eller Met i posisjon +1 og slutter med Lys i posisjon +357 (SEK ID NR:14, som begynner med Ala i posisjon 26 og slutter med Lys i posisjon 383, eller begynner med Met i posisjon 27 og slutter med Lys i posisjon 383).

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor øycelletransplantasjon er for å behandle diabetes.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvor diabetes er type 1 diabetes eller type 2 diabetes.

4. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor øycelletrans plantatet omfatter innkapslede øyceller.

5. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor inhibering av avstøtning av øycelletransplantat omfatter administrering av det muterte CTLA4 molekylet før, under eller etter øycelletransplantasjon.

6. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 5, hvor det ekstracellulære domenet er fusjonert til en ikke-CTI_A4 enhet.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor ikke-CTLA4 enheten omfatter en immunoglobulin enhet.

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvor immunoglobulinenheten er en immunoglobulin konstant region eller del derav.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvor immunoglobulin konstant regionen eller delen derav omfatter en eller flere mutasjoner for å redusere effektorfunksjon.

10. Anvendelse ifølge krav 8 eller 9, hvor immunoglobulin konstant regionen omfatter hengsel-, CH2- og CH3-regionene av et immunoglubulinmolekyl.

11. Anvendelse hvilket som helst av kravene 8 til 10, hvor immunoglobulin konstant regionen eller delen derav er en immunoglobulin konstantregion fra mennesker eller aper.

12. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 11, hvor det løselige muterte CTLA4 molekylet anvendes i kombinasjon med minst en ytterligere forbindelse som er valgt fra gruppen som består av immunsupresjonsforbindelser, immunmodulerende forbindelser og anti-inflammatoriske forbindelser.

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvor forbindelsen er valgt fra gruppen som består av anakinra, adrenokortikosteroider, azatioprin, basiliksimab, kalcineurin inhibitorer, klorokin, kortikosteroider, cyklosporin, prednison, cyklofosfamid, cytoksan, 15-deoksyspergualin og analoger derav, D-penicillamin, etanercept, glatirameracetat, FTY720 og analoger derav, glukokorikoider, gullsalter, hest anti-humant tymocyttglobulin (ATGAM), humanisert anti-TAC (HAT), hydroksyklorokin, infliksimab, interferon beta-1a, interfon beta-1b, leflunomid og analoger derav, lymfocyttimmunglobulin, lymfocytt-homing midler, metoksalen, metotreksat, mitoksantronhydroklorid, mykofenolsyre, mykofenolat mofetil, mizoribin, NSAID'er kanin anti-humant tymocyttglobulin, Rho (D) immunglobulin, sirolismus (rapamycin) og derivater derav (f.eks. 40-0-(2-hydroksy)etyl-rapamycin), sulfasalazopyrin, sulfasalzin, takrolismus (FK-506), thalidomid, TNFALPHA blokkere og biologiske midler som målsøker et inflammatorisk cytokin, TOR inhibitorer, forbindelser som interferer med CD40 og CD154, løselig gp39, løselig CD29, løselig CD40, løselig CD80 (f.eks. ATCC 68627), løselig CD86, løselig CD28, løselig CD56, løselig Thy-I, løselig CD3, løselig TC R, løselig VLA-4, løselig VCAM-1, løselig LECAM-1, løselig ELAM-1, løselig CD44, antistoffer reaktive med gp39 (f.eks. ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 og ATCC HB-12056), antistoffer reaktive med CD40 (f.eks. ATCC HB-9110), antistoffer reaktive med B7 (f.eks. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341), antistoffer reaktive med CD28 (f.eks. ATCC HB-11944 eller mAb 9.3), antistoffer reaktive med LFA-1 (f.eks. ATCC HB-9579 og ATCC TIB-213), antistoffer reaktive med LFA-2, antistoffer reaktive med IL-2, antistoffer reaktive med IL-12, antistoffer reaktive med IFN-gamma, antistoffer reaktive med CD2, antistoffer reaktive med CD48, antistoffer reaktive med hvilket som helst ICAM (f.eks. med ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 og ICAM-3), antistoffer reaktive med CTLA4 (f.eks. ATCC HB-304), antistoffer reaktive med Thy-1, antistoffer reaktive med CD56, antistoffer reaktive med CD3, antistoffer reaktive med CD29, antistoffer reaktive med TCR, antistoffer reaktive med VLA-4, antistoffer reaktive med VCAM-1, antistoffer reaktive med LECAM-1, antistoffer reaktive med ELAM-1, antistoffer reaktive med CD44, monoklonale antistoffer mot leukocyttreseptorer, f.eks. MHC, CD2, CD3, CD4, CDIIa/CD18, CD7, CD25, CD27, B7. CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1 BB eller deres ligander, CTLA4/CD28-1g; LFA-1 antagonister, selektinantagonister og VLA-4 antagonister og anti-humane IL-2R mAb'er.

14. Anvendelse ifølge krav 12 eller 13, hvor det løselige muterte CTLA4 molekylet og den ytterligere forbindelsen skal ko-administreres.

15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor det løselige muterte CTLA4 molekylet og den ytterligere forbindelsen skal administreres samtidig eller påfølgende.

16. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 11, hvor inhibering av øycelletransplantatavstøtning omfatter en ytterligere immunosuppresiv kur.

17. Anvendelse ifølge krav 16, hvor den ytterligere immunosuppresive kur er glukokortikoidfri.

18. Anvendelse ifølge krav 16, hvor den ytterligere immunosuppressive kur omfatter et kortikosteroid.

19. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 16 til 18, hvor den ytterligere immunosuppressive kur er kalcineurin inhibitorfri.

20. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 16 til 19, hvor den ytterligere immunosuppresive kur omfatter en eller flere forbindelser ifølge krav 14.

21. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 16 til 20, hvor den ytterligere immunosuppressive kur omfatter en TOR inhibitor og/eller et biologisk middel som målsøker IL-2.

22. Anvendelse ifølge krav 21, hvor TOR inhibitoren er rapamycin (sirolismus) eller et derivat derav.

23. Anvendelse ifølge krav 21, hvor det biologiske middel som målsøker et IL-2 er et antistoff reaktivt med IL-2 eller et anti-humant IL-2R mAb.

24. Anvendelse ifølge krav 23, hvor det anti-humane IL-2R mAb er basiliksimab.

25. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 16 til 24, hvor den ytterligere immunosuppressive kur omfatter mykofenolsyre eller mykofenolat-mofetil.

26. Anvendelse ifølge krav 15, hvor den ytterligere immunosuppressive kur omfatter en forbindelse som interferer med binding av CD40 til CD154.

27. Anvendelse ifølge krav 26, hvor forbindelsen som interferer med binding av CD40 til CD154 er et anti-CD40 antistoff.

28. Anvendelse ifølge krav 26, hvor forbindelsen som interferer med binding av CD40 til CD154 er et anti-CD154 antistoff.

29. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor inhibering av øycelletransplantatavstøtning omfatter administrering av T-celle depleterte benmargsceller.

30. Anvendelse ifølge krav 29, hvor administreringen av T-celle depleterte benmargsceller er i omtrent det samme tidspunkt som plasseringen av øycelletransplantatet.

31. Anvendelse ifølge krav 29, hvor administreringen av T-celle depleterte benmargsceller er før plasseringen av øycelletransplantatet.

32. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 29 til 31, hvor administreringen av T-celle depleterte benmargsceller omfatter en første dose og en andre dose.