CN110392736A - 遗传修饰的反抑细胞及其在免疫治疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分离的细胞毒性T‑淋巴细胞(CTL)，所述CTL是耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性，且其中所述CTL不包括中央记忆T‑淋巴细胞(Tcm)表型，CTL被转导以表达包含T细胞受体信号传导模块的细胞表面受体。本发明还公开了产生和使用其的方法。

Description

遗传修饰的反抑细胞及其在免疫治疗中的用途
发明领域和背景
本发明，在其一些实施方案中，涉及经转导以表达细胞表面受体的遗传修饰的耐受性诱导抗第三方细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，并且更具体但非排除地涉及其在免疫治疗中的用途。
过继细胞疗法(ACT)是一种治疗程序，其中淋巴细胞(如T细胞)被给予患者，以治疗癌症或病毒感染。
这种方法需要离体产生肿瘤或病毒特异性的T细胞，并将其注入患者。为了支持T细胞的接纳，患者通常还用调节方案，例如预调节方案(如照射或化疗)和/或给予淋巴细胞生长因子(如IL-2)处理。已描述了很多生成肿瘤特异性淋巴细胞的方法，两种主要的方法为扩增抗原特异性T细胞或利用基因工程技术重定向T细胞。
依据一种方法，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)从患者自身的肿瘤块(如黑素瘤或肾癌)分离，离体扩增，并再注入回到患者内。TIL是一种很有前途的细胞来源，因为它们是患者自身的一组混合细胞，其具有对存在于肿瘤上的肿瘤相关抗原(TAA)特异性的T-细胞受体(TCR)。然而，它们仅适用于可从肿瘤块分离T细胞的情况。
该方法有望治疗转移性黑素瘤。
根据另一种方法，基因修饰被用来通过使用转基因TCR链或嵌合受体来针对肿瘤重定向淋巴细胞。目前，逆转录病毒或慢病毒，或电穿孔转移嵌合抗原受体(CAR) (其靶标识别依赖于单克隆抗体的单链可变区结构域(scFv))或电穿孔转移T-细胞受体(TCR)通常用于稳定产生治疗性T细胞(分别为CAR-T细胞或TCR-T细胞) [Fujiwara,Pharmaceuticals (2014) 7: 1049-1068]。
TCR转基因细胞(TCR-T)需要特异性HLA分子来识别靶抗原(即，HLA限制)，并具有识别细胞内蛋白的能力，提供了广泛的靶肿瘤-相关抗原或病毒抗原。TCR-T细胞的治疗质量取决于其亲合力。为了创造更高的亲合力，已经实施了若干策略，包括使用从具有相关表位的免疫人HLA转基因小鼠选择的TCR和/或在与HLA/表位复合体相互作用的TCR α/β链的可变区中在CDR区域2或3中插入靶向突变[Fujiwara, Pharmaceuticals (2014)同上]。
或者，CAR-T细胞不受HLA限制。嵌合受体(嵌合抗原受体-CAR)的构建体通常由胞外抗原-结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域组成。初始嵌合受体(即“第一代”)由融合于来自CD3 ζ-链的胞内结构域的scFv片段组成。
还产生了“第二代”嵌合受体，它将来自各种共刺激蛋白受体(如CD28、CD137、4-1BB、ICOS)的胞内信号传导结构域添加到CAR的胞质尾部，以向T细胞提供附加信号。临床前研究已表明，“第二代”CAR提高了T细胞的抗肿瘤活性。最近产生了“第三代”CAR，它将多个信号传导结构域组合，如CD3ζ-CD28-4-1BB或CD3ζ-CD28-OX40，以进一步增强效能。
靶向各种肿瘤抗原的肿瘤特异性CAR在临床上正被测试用于治疗各种不同的癌症。这些癌症及它们正被靶向的抗原的实例包括滤泡性淋巴瘤(CD20或GD2)、神经母细胞瘤(CD171)、非-霍奇金淋巴瘤(CD20)、淋巴瘤(CD19)、成胶质细胞瘤(IL13Rα2)、慢性淋巴细胞白血病或CLL和急性淋巴细胞白血病或ALL (均CD19)。对实体瘤(包括卵巢、前列腺、乳腺、肾脏、结肠、神经母细胞瘤等)显示活性的CAR正在调查中。病毒特异性CAR也已被开发来攻击携带病毒如HIV的细胞。例如，使用对Gp100特异性的CAR启动了一项临床试验，用于治疗HIV (Chicaybam, Ibid)。
一个主要目的是使用完全或部分不匹配的同种异体细胞，而不依赖骨髓移植，应用ACT，包括遗传修饰的T细胞。
已经考虑了各种方法来修饰T细胞用于过继细胞疗法，一些在Gilham et al.,Human Gene Therapy (2015) 26:276-285；Sharpe和Mount, Disease Models andMechanisms (2015) 8:337-350和Gouble et al. Blood (2014) 124(21) 4689中进行了描述。
已经考虑了各种方法以产生无移植物抗宿主(GVH)活性的耐受性诱导细胞及其在移植物移植中的用途，一些总结如下。
Reisner和同事描述了一种经开发以产生无GVH活性的反抑CTL的方法，其中CTL在没有外源IL-2的情况下被针对第三方刺激物刺激。这一方法基于这样的观察，即只有活化的细胞毒性T淋巴细胞前体(CTLp)才能在IL-2剥夺的原代培养中存活(IL-2饥饿导致非诱导的T细胞凋亡)。该方法已在体外和体内显示耗竭来自抗-第三方反抑CTL的GVH反应性[PCT公布号WO 2001/049243, Bachar-Lustig et al. Blood. 2003;102:1943-1950;Aviner et al. Hum Immunol. (2005) 66:644-652]。将这些抗-第三方反抑CTL引入接受者(伴随着移植物)防止移植物排斥，而不诱导移植物抗宿主病(GVHD) (PCT公布号WO2001/049243)。
PCT公布号WO 2010/049935公开了包含具有中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型的非-GVHD诱导的抗-第三方细胞的分离的细胞群，所述细胞是耐受性诱导细胞，并且能够在移植后归巢至淋巴结。
PCT公布号WO 2013/035099公开了产生分离的细胞群的新方法，所述细胞群包括具有中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，所述细胞是耐受性诱导细胞和/或被赋予抗疾病活性，并且能够在移植后归巢至淋巴结。
发明简述
根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种分离的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，CTL是耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性，且其中CTL不包括中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型，CTL被转导以表达包含T细胞受体信号传导模块的细胞表面受体。
根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种分离的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，CTL是耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性，且其中CTL不包括中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型，CTL被转导以表达嵌合抗原受体(CAR)。
根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种分离的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，CTL是耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性，且其中CTL不包括中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型，CTL被转导以表达嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含共刺激结构域。
根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种分离的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，CTL是耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性，且其中CTL不包括中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型，CTL被转导以表达嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含至少两个共刺激结构域。
根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种产生权利要求1-4的任一项的分离的CTL的方法，该方法包括用编码包含T细胞受体信号传导模块的细胞表面受体或嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸转导细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，CTL是耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性，且其中CTL不包括中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型。
根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种包含本发明的一些实施方案的分离的CTL的细胞群。
根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种包含本发明的一些实施方案的细胞群和药用活性载体的药物组合物。
根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的本发明的一些实施方案的细胞群，从而治疗受试者。
根据本发明的一些实施方案中的一个方面，提供了治疗有效量的本发明的一些实施方案的细胞群，用于治疗有需要的受试者的疾病。
根据本发明的一些实施方案，该方法离体进行。
根据本发明的一些实施方案，CTL用包含多核苷酸的载体转导。
根据本发明的一些实施方案，多核苷酸编码转基因T细胞受体(tg-TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
根据本发明的一些实施方案，为耐受性诱导细胞并基本上耗竭了同种异体反应性的CTL是一种抗第三方细胞。
根据本发明的一些实施方案，细胞表面受体包括转基因T细胞受体(tg-TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
根据本发明的一些实施方案，CAR包括为抗体或抗原结合片段的抗原结合结构域。
根据本发明的一些实施方案，抗原-结合片段是Fab或scFv。
根据本发明的一些实施方案，CAR包含CD3ζ。
根据本发明的一些实施方案，CAR包含至少一个选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、Lck、ICOS和DAP10的共刺激结构域。
根据本发明的一些实施方案，CAR包含至少两个选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、Lck、ICOS和DAP10的共刺激结构域。
根据本发明的一些实施方案，细胞表面受体或CAR结合选自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、过敏性抗原和自身免疫性抗原的抗原。
根据本发明的一些实施方案，肿瘤抗原与实体瘤相关。
根据本发明的一些实施方案，肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。
根据本发明的一些实施方案，肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、Her2、GD2、gp100、p53、癌胚抗原(CEA)、MART-1、端粒酶逆转录酶(TERT)、Claudin-6、受体酪氨酸-蛋白激酶胞外结构域(ErbB2-ECD)、受体酪氨酸-蛋白激酶胞内结构域(ErbB2-ICD)、组蛋白H1.2、组蛋白H4、酪氨酸酶、甲胎蛋白(AFP)、MAGE A3、AIM-2a、AFP、ART-4、CLCA2、Cyp-B、EphA2、hTERT、iCE、FGF-5、G250、GnT-V、HST-2 (FGF-6)、Livin (ML-IAP)、MUC1、MUC2、PRAME、PSMA、P15、RAGE、RU1、RU2、SART-1、SART-3、SART-2、SOX10、存活素、存活素-2Bg、TRG、Neo-PAP、CAMEL和NY-ESO-1。
根据本发明的一些实施方案，病毒抗原是选自以下的病毒的抗原：人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感、巨细胞病毒(CMV)、T-细胞白血病病毒1型(TAX)、丙型肝炎病毒(HCV)、流感病毒、狂犬病病毒、疱疹病毒、乳头状瘤病毒、肝炎病毒、水痘病毒、脑炎病毒、巨细胞病毒、埃博拉病毒、人类亲T-淋巴细胞病毒(HTLV)、风疹病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LCM)、轮状病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、腺病毒-3 (HADV-3)、腺病毒-5(HADV-5)、腺相关病毒6 (AAV6)、腺相关病毒8 (AAV8)、BK多瘤病毒(BKV)、假丝酵母、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、人类疱疹病毒(HHV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
根据本发明的一些实施方案，自身免疫性抗原与选自1型糖尿病、多发性硬化、狼疮、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、腹腔疾病和中风的疾病相关。
根据本发明的一些实施方案，CTL被进一步遗传修饰，以抑制至少一个内源性免疫检查点基因在细胞中的表达。
根据本发明的一些实施方案，免疫检查点基因选自PD或CTLA基因。
根据本发明的一些实施方案，为耐受性诱导细胞并基本上耗竭了同种异体反应性的CTL通过将供体的T-淋巴细胞导向一种或多种第三方抗原来产生。
根据本发明的一些实施方案，能够发展成同种异体反应性CTL的T-淋巴细胞的耗竭通过因子的剥夺来实现，所述因子(i) 为CTL成熟所需的；和(ii) 由成熟CTL分泌。
根据本发明的一些实施方案，因子的剥夺进行3-10天。
根据本发明的一些实施方案，因子是细胞因子。
根据本发明的一些实施方案，细胞因子是IL-2。
根据本发明的一些实施方案，为耐受性诱导细胞并基本上耗竭了同种异体反应性的CTL由包括以下步骤的方法生成：(a) 将供体的T-淋巴细胞导向被剥夺IL-2的培养物中的一种或多种第三方抗原，以耗竭同种异体反应性CTL；和(b) 在IL-2的存在下，使步骤(a)的CTL与一种或多种第三方抗原接触，从而使耐受性诱导抗-第三方CTL富集。
根据本发明的一些实施方案，该方法还包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前耗竭CD4+ T细胞和/或CD56+天然杀伤细胞。
根据本发明的一些实施方案，该方法还包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前选择CD8+ T细胞。
根据本发明的一些实施方案，能够发展成同种异体反应性CTL的T-淋巴细胞的耗竭通过亲和标记，接着基于标记的分离来进行。
根据本发明的一些实施方案，能够发展成同种异体反应性CTL的T-淋巴细胞的耗竭通过亲和纯化进行。
根据本发明的一些实施方案，Tcm表型包括CD3+、CD8+、CD62L+、CD45RA-、CD45RO+识别标记。
根据本发明的一些实施方案，Tcm表型包括能够在移植后归巢到淋巴结的细胞。
根据本发明的一些实施方案，为耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性的CTL基本上耗竭了CD4+T细胞。
根据本发明的一些实施方案，为耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性的CTL基本上耗竭了CD56+天然杀伤细胞。
根据本发明的一些实施方案，为耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性的CTL包括CD3+CD8+表型。
根据本发明的一些实施方案，所述疾病选自恶性疾病、病毒疾病、细菌疾病、真菌疾病、原生动物疾病、寄生虫疾病、过敏性疾病和自身免疫性疾病。
根据本发明的一些实施方案，恶性疾病是实体瘤或肿瘤转移。
根据本发明的一些实施方案，恶性疾病是血液恶性肿瘤。
根据本发明的一些实施方案，血液恶性肿瘤包括白血病或淋巴瘤。
根据本发明的一些实施方案，恶性疾病选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、黑素瘤、肉瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、滑膜细胞癌和胰腺癌。
根据本发明的一些实施方案，病毒疾病选自免疫缺陷病毒(HIV)、流感、巨细胞病毒(CMV)、T-细胞白血病病毒1型(TAX)、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
根据本发明的一些实施方案，自身免疫性疾病选自1型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、狼疮、腹腔疾病和中风。
根据本发明的一些实施方案，细胞群与受试者是非-同基因的。
根据本发明的一些实施方案，该方法还包括在亚致死性、致死性或超致死性调节方案下调节受试者，然后给药。
根据本发明的一些实施方案，任一项权利要求使用的治疗有效量还包括亚致死性、致死性或超致死性调节方案。
根据本发明的一些实施方案，亚致死性、致死性或超致死性调节选自全身照射(TBI)、身体局部照射、清髓调节、非清髓调节、共刺激阻滞、化疗剂和抗体免疫治疗。
根据本发明的一些实施方案，给药通过选自以下的途径进行：气管内、支气管内、肺泡内、静脉内、腹膜内、鼻内、皮下、髓内、鞘内、心室内、心内、肌内、浆膜内、粘膜内、经粘膜、经鼻、直肠和肠。
根据本发明的一些实施方案，受试者是人类受试者。
除非另外限定，本文所用的所有的技术和/或科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。尽管类似或等同于本文描述的那些的方法和材料可被用于本发明的实施方案的实践或测试中，示例性方法和/或材料在下文描述。在有抵触的情况下，以本申请，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，并不打算必然是限制性的。
本发明的具体实施方案的描述
本发明，在其一些实施方案中，涉及经转导以表达细胞表面受体的遗传修饰的耐受性诱导抗-第三方细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，并且更具体但非排他地涉及其在免疫治疗中的用途。
在详细地解释本发明的至少一个实施方案之前，要理解本发明不必使其应用受限于以下说明书中叙述或由实施例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施方案，或能够以各种方式实践或执行。此外，应理解的是，此处所使用的用语和术语是为了说明目的，不应被视为是限制性的。
使用淋巴细胞和抗原呈递细胞的基于细胞的治疗是很有前途的免疫治疗方法。来自自体或非自体来源的过继细胞转移(ACT)，包括免疫衍生细胞的转移，提供了将免疫功能和特性转移到宿主的目的。以前用于ACT的一种方法包括遗传修饰的T细胞(如表达T细胞受体或嵌合抗原受体)，其中细胞的特异性被重新定向到靶抗原。然而，移植物排斥反应(通过移植物受体)和/或移植物抗宿主病(通过移植的细胞)的问题是一个持续存在的问题，需要加以克服，以发挥这些细胞的治疗潜力。
在将本发明付诸实践的同时，本发明人发现，在没有造血祖细胞的情况下，没有移植物抗宿主反应性的抗-第三方细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)被赋予内在的反抑耐受性诱导活性，并能自行诱导耐受性。本发明人还发现，抗-第三方CTL可经遗传修饰以表达T细胞受体(如转基因T细胞受体或嵌合抗原受体)并可被用来对抗疾病，同时诱导反抑活性且缺乏移植物抗宿主潜力。
具有从供体抗-第三方CTL培养物成为同种异体反应性(抗宿主) CTL的潜力的细胞的耗竭涉及初始的IL-2饥饿，这导致培养物中存在的未诱导的T-细胞的凋亡。使用这样的小鼠和人类CTL制剂的研究表明，这样的非同种异体反应性CTL制剂耗竭了有成熟为抗-宿主CTL的潜力的细胞。
总体看来，这些CTL提供了在单个细胞中同时缺乏移植物抗宿主潜力、移植物排斥反应和靶向特定抗原的解决方案。这些细胞消除了使用自体细胞治疗的需要或随其移植造血细胞的需要。此外，这些细胞克服了在"每个患者的基础上"制造基于细胞的疗法的需要，并能够制造一种“现成的”的治疗产品。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种分离的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，CTL是一种耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性，且其中CTL不包括中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型，CTL被转导以表达包含T细胞受体信号传导模块的细胞表面受体。
如本文所用的，术语“分离的细胞”指从其自然环境(如从组织，如从人体)分离的细胞。
如本文所用的短语"细胞毒性T-淋巴细胞"或“CTL”指包括细胞毒性(如杀伤细胞)表型的T细胞的子集。在人类中，具有CTL表型的细胞通常包括CD3+ CD8+识别标记。
根据一些实施方案，本发明的CTL不包括中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型。
如本文所用的短语"中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型"指归巢于淋巴结的T细胞毒性细胞的子集。在人类中，具有Tcm表型的细胞通常包括CD3+/CD8+/CD62L+/CD45RO+/CD45RA-识别标记。应该意识到，Tcm细胞可以在单个细胞上表达所有识别标记，或者可以在单个细胞上仅表达部分识别标记。
Tcm细胞通常在移植后归巢于淋巴结。因此，Tcm细胞可归巢于任何淋巴结，例如，外周淋巴结和肠系膜淋巴结。
根据一个实施方案，本发明的CTL不归巢于淋巴结。根据一个实施方案，移植后CTL集中在受试者的肝脏、肺和骨髓。
如本文所用的短语"耐受性诱导细胞"指与在给予的耐受性诱导细胞不存在下受体的细胞的反应性比较，当它们与受体的细胞接触时，引起受体的细胞(如受体的T细胞)的反应性下降的细胞。耐受性诱导细胞包括如之前在PCT公布号WO 2001/049243和WO 2002/102971中所描述的反抑细胞(即，与宿主T细胞接触时导致宿主T细胞凋亡的T细胞)。
根据一个实施方案，本发明的CTL (如从同种异体细胞供体中获得)基本上耗竭了同种异体反应性。
如本文所用的术语“同种异体反应性”涉及CTL在遭遇受体的一种或多种抗原(如细胞)时的活性(如杀伤能力)。
如本文所用的术语“基本上耗竭同种异体反应性”涉及相对于不是抗-第三方CTL的T细胞的移植，CTL对抗受体的一种或多种抗原(例如细胞)的活性(例如杀伤能力)降低。
根据一个实施方案，本发明的CTL也是非-GVHD诱导细胞。
如本文所用的术语"非-GVHD"指具有显著减少或没有移植物抗宿主诱导反应性。因此，产生本发明的细胞以不显著导致移植物抗宿主病(GVHD)，如移植的受试者在移植后30-100天的存活、体重和整体外观所证明的。
根据一个实施方案，本发明的细胞相对于不是抗-第三方CTL的T细胞移植，具有至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75%、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或甚至100 %减少的针对宿主的反应性(如同种异体反应性或GVHD)。
根据一个实施方案，本发明的CTL是遗传修饰的。
根据一个实施方案，本发明的CTL被转导以表达包括T细胞受体信号传导模块的细胞表面受体。
如本文所用的，术语"转导"可与术语“转染"或"转化"互换使用，指的是外源核酸(异源)被转移或导入细胞的过程。"转染"或"转化"或"转导"的细胞是用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代细胞及其子代或其细胞系。
如本文所用的术语“细胞表面受体”指细胞膜上存在的一种重组或合成的分子，它与配体(例如抗原)结合并介导细胞的活化。
如本文所用的术语"抗原"或"Ag"被定义为激发免疫反应的分子。技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，以及碳水化合物、脂质和DNA可用作抗原。
根据本发明的一些实施方案，抗原与恶性疾病相关，即肿瘤抗原(如，肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原)、病毒蛋白抗原、细菌蛋白抗原、真菌蛋白抗原、与过敏反应相关的抗原(即，过敏性抗原)或自身免疫相关抗原(如“自体”抗原)，如以下进一步详细描述的。
本发明的细胞表面受体包含T细胞受体信号传导模块。
术语“T细胞受体信号传导模块”指负责激活其中放置受体的T细胞的至少一种正常效应器功能的受体的胞内部分。例如，T细胞的正常效应器功能可包括分泌免疫刺激细胞因子(如IFN-γ、IL-2、TNF-α)、抗原特异性细胞毒性和细胞增殖。因此，本发明的T细胞受体信号传导模块指蛋白质中传导效应器功能信号并引导细胞执行特定功能的部分。
根据一个实施方案，细胞表面受体包括转基因T细胞受体(tg-TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
如本文所用的，术语“转基因T细胞受体”或“tg-TCR”指重组或合成分子，其包含T细胞受体(TCR)的特异性，即主要组织相容性复合体(MHC)蛋白所呈现的抗原肽(即抗原)的识别。
本发明的tg-TCR通常包含两条链(即，多肽链)，例如，T细胞受体(TCR)的α链、TCR的β链、TCR的γ链、TCR的δ链，或其组合(如αβ链或γδ链)。tg-TCR的多肽可包含任何氨基酸序列，只要Tg-TCR具有如上所述的抗原特异性和T细胞效应器功能。应该意识到，抗原特异性由TCR异二聚体(即由αβ或γδ链)决定。
应该意识到，两条链的每一条通常由两个细胞外结构域组成，即可变(V)区和恒定(C)区。
根据一个实施方案，tg-TCR包含TCR的可变区。根据一个特定的实施方案，tg-TCR包含TCR的α-和β-链的可变区。根据另一个特定的实施方案，tg-TCR包含TCR的γ-和δ-链的可变区。
根据本发明的一些实施方案，tg-TCR的可变区包括互补决定区(CDR)，其能够特异性地结合抗原。CDR可选自CDR1、CDR2、CDR3和/或CDR4的任何一种。根据一个特定的实施方案，CDR存在于单链上，优选地，CDR存在于tg-TCR的双链上。
根据一个实施方案，tg-TCR包含TCR的恒定区。根据一个特定的实施方案，tg-TCR包含TCR的α-和β-链的恒定区。根据另一个特定的实施方案，tg-TCR包含TCR的γ-和δ-链的恒定区。
为了避免内源性TCR (即源自转导细胞内的TCR)和tg-TCR链之间形成混合二聚体，本发明的tg-TCR可包含鼠科动物(如小鼠) TCR的恒定区。可用于增加tg-TCR链的特异性配对的另一种方法是在tg-TCR链(如α和β链)的恒定区内引入额外的半胱氨酸残基，这导致附加二硫键的形成。或者，可以引入tg-TCR链(如α和β链)恒定区中关键相互作用氨基酸的突变反转，这有利于tg-TCR链的配对，并且还提高tg-TCR的反应性。作为选择或另外地，可以使用例如小干扰RNA (siRNA)来实现内源TCR的下调，所述小干扰RNA用于特异性下调内源TCR。有关进一步的详情，参见例如Zhang和Morgan, Adv Drug Deliv Rev. (2012) 64(8): 756-762，通过引用并入本文。
如已提及的，tg-TCR以MHC依赖性方式识别抗原。
如本文所用的，短语“主要组织相容性复合体”或“MHC”指由一组连锁基因座编码的抗原复合体，其在小鼠中被统称为H-2，在人中被统称为人类白细胞抗原(HLA)。MHC抗原的两大类，即Ⅰ类和Ⅱ类，各自包括一组细胞表面糖蛋白，这些糖蛋白在决定组织类型和移植相容性方面起作用。
主要的MHC I类分子被涵盖在本文中。
主要组织相容性复合体(MHC) I类分子在几乎所有细胞的表面上表达。这些分子通过与αβ T-细胞受体的相互作用，发挥向CD8+ T细胞呈递主要来自内源性合成的蛋白质的肽的功能。在人类中，有几种MHC单倍型，例如，HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A28、HLA-A31、HLA-A33、HLA-A34、HLA-B7、HLA-B45和HLA-Cw8，它们的序列可以在kabbat数据库，即在www(dot)immuno(dot)bme(dot)nwu(dot)edu中发现。有关MHC单倍型的更多信息可见于Paul, B. Fundamental Immunology Lippincott-Raven Press。
tg-TCR的选择取决于定义靶细胞表面的抗原的类型和数量。例如，可以选择tg-TCR以识别一种抗原，该抗原用作与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记。因此，例如，可用作由tg-TCR识别的抗原的细胞表面标记可能包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病和癌细胞有关的那些标记。例子在下文提供。
为生成一种成功的tg-TCR，首先需要鉴定合适的靶序列。因此，TCR可从抗原反应性T细胞(如肿瘤反应性T细胞)分离，或在这是不可能的情况下，可采用替代技术。根据一个示例性实施方案，转基因动物(如兔或小鼠，优选人-HLA转基因小鼠)用人类抗原肽(如肿瘤或病毒抗原)免疫，产生表达针对人类抗原的TCR的T细胞[如在Stanislawski et al., NatImmunol. (2001) 2(10):962-70中所述]。根据另一个示例性实施方案，抗原-特异性T细胞(如肿瘤特异性T细胞)从正在经历疾病(如肿瘤)缓解的患者中分离出来，并从其中分离出反应性TCR序列[如在de Witte et al., Blood (2006) 108(3):870中所述]。
根据另一个示例性实施方案，体外技术被用于改变现有的TCR序列，以增强弱反应抗原-特异性TCR与靶抗原的亲合力(这样的方法在下文中描述)。
根据一个实施方案，选择本发明的tg-TCR以用高亲合力(即，TCR和肽-MHC-复合体之间的单体相互作用的物理强度)识别抗原肽-HLA复合体。
可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法来实现具有高功能性亲合力的细胞(即，有效地对抗原反应的细胞)的生产。因此，根据一个实例，通过增加tg-TCR的亲和力(即TCR与其配体结合的强度)或增加tg-TCR在细胞表面上的表达，达到增加tg-TCR的亲合力。根据一个示例性实施方案，增加TCR亲和力通过修饰tg-TCR基因来进行。例如，tg-TCR基因的一个可能的修饰包括对tg-TCR的互补决定区(CDR)，如第三CDR (CDR3)的修饰。因此，可以利用CDR链(如α或β链)中的单氨基酸或双氨基酸替换来增加tg-TCR的亲和力，并提高转导细胞的抗原-特异性反应。根据另一个示例性实施方案，增加tg-TCR功能亲合力通过去除tg-TCR链的恒定结构域中定义的N-糖基化基序来进行。根据另一个示例性实施方案，增加亲和力通过密码子优化来执行。
因此，tg-TCR的稀有密码子被高表达的人类基因中最常见分布的密码子所取代。在优化过程中，顺式作用的AT或GC丰富的序列段、隐蔽剪接和RNA不稳定基序也可能被去除。对于更多的信息，参见如Zhang和Morgan, Adv Drug Deliv Rev. (2012)，同上，通过引用并入本文。
根据一个实施方案，tg-TCR的信号传导模块可以包括单个子单元或多个信号传导单元。因此，本发明的tg-TCR可使用与TCR一致作用的共受体，以启动抗原受体连接后的信号转导，以及其具有相同功能能力的任何衍生物或变体。
根据一个实施方案，TCR信号传导模块包含CD3复合体(如CD3链，如CD3δ/ε、CD3γ/ε和/或ζ链，如ζ/ζ或ζ/η)。
另外地或者作为选择，TCR信号传导模块可包含共刺激蛋白受体，以向T细胞提供额外的信号。这些在本文下面将详细地加以讨论。
根据一个实施方案，tg-TCR可包括如在本文下面将详细地讨论的跨膜结构域。
用TCR转导细胞的方法在本文下面将详细地加以讨论。
如本文所用的，短语“嵌合抗原受体(CAR)”指一种重组或合成的分子，它将对所需抗原的特异性与T细胞受体-激活的胞内结构域(即T细胞受体信号传导模块)结合起来，以产生一种嵌合蛋白，该嵌合蛋白对特定抗原显示出细胞免疫活性。
因此，本发明的CAR一般包括包含抗原结合部分的细胞外结构域、跨膜结构域和T细胞对抗原的有效反应所必需的胞内结构域(即细胞质结构域)。
抗原结合部分
在一个实施方案中，本发明的CAR包括另外称为抗原结合部分的靶-特异性结合元件。该部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体(即抗原)的类型和数量。例如，可选择抗原结合结构域以识别配体(即抗原)，其用作与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记。因此，可在本发明的CAR中用作抗原部分结构域的配体的细胞表面标记的例子包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病和癌症细胞相关的那些。
根据本发明的一些实施方案，抗体结合部分包括能够特异性地结合抗原的互补决定区(CDR)。这样的CDR可从抗体获得。
如本发明所用的术语"抗体"包括完整的分子及其功能片段，如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、线性抗体、scFv抗体和从能够与抗原结合的抗体片段形成的多特异性抗体。这些功能抗体片段被定义如下：(1) Fab，该片段含有抗体分子的单价抗原-结合片段，可用酶木瓜蛋白酶消化整个抗体来产生，以得到完整的轻链和一条重链的部分；(2) Fab'，抗体分子的片段，其可用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原来获得，得到完整的轻链和部分重链；每个抗体分子得到两个Fab'片段；(3) (Fab')2，该抗体片段可用酶胃蛋白酶处理整个抗体而得到，无需随后的还原；F(ab')2是由两个二硫键结合在一起的两个Fab'片段的二聚体；(4)Fv，定义为含有表达为两条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；(5) 单链抗体("SCA")，一种包含轻链可变区和重链可变区的基因工程分子，通过合适的多肽接头作为基因融合的单链分子连接；(6) CDR肽是编码单个互补-决定区(CDR)的肽；和(7) 单域抗体(也称为纳米体)，一种基因工程的单一单体可变抗体结构域，其选择性地与特定抗原结合。纳米体的分子量仅为12-15 kDa，这远小于普通抗体(150-160 kDa)。
如本文所用的"抗体重链"指在天然存在的构象的所有抗体分子中存在的两类多肽链中较大者。
如本文所用的"抗体轻链"指在天然存在的构象的所有抗体分子中存在的两类多肽链中较小者。κ-和λ-轻链指两个主要抗体轻链同种型。
如本文所用的术语"合成抗体"意指用重组DNA技术产生的抗体，例如，如本文所述的由噬菌体表达的抗体。该术语还应该被解释为指通过合成编码抗体的DNA分子并且所述DNA分子表达抗体蛋白，或合成指定抗体的氨基酸序列而产生的抗体，其中DNA或氨基酸序列利用本领域可获得和熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
产生多克隆和单克隆抗体及其片段的方法是本领域熟知的(见例如，Harlow和Lane，抗体：实验室手册(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring HarborLaboratory, New York, 1988，通过引用并入本文)。
根据本发明的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白表达系统)中表达编码该片段的DNA来制备。抗体片段可通过常规方法，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完全抗体获得。例如，抗体片段可用胃蛋白酶酶促裂解抗体而产生，提供一个称为F(ab')2的5S片段。该片段可以使用硫醇还原剂和任选地由二硫键裂解而产生的巯基的阻断基团进一步裂解，以产生3.5S Fab'单价片段。或者，用胃蛋白酶进行酶切，直接产生两个单价Fab'片段和Fc片段。这些方法例如由Goldenberg, 美国专利号4,036,945和4,331,647及其中包含的参考文献描述，这些专利以其整体通过引用并入本文。也参见Porter, R. R. [Biochem. J. 73: 119-126 (1959)]。裂解抗体的其它方法，如分离重链以形成单价轻链-重链片段，进一步裂解片段，或其它酶、化学或基因技术也可以使用，只要片段与完整的抗体识别的抗原结合即可。
Fv片段包括VH和VL链的缔合。这种缔合可以是非共价的，如在Inbar et al.[Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720]中所述。或者，可变链可以通过分子间二硫键连接，也可以通过化学物质如戊二醛交联。优选地，Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)通过构建包含由寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因来制备。将该结构基因插入到表达载体中，然后将其导入宿主细胞，如大肠杆菌中。重组宿主细胞用桥接这两个V结构域的接头肽合成单一的多肽链。产生sFvs的方法描述于例如[Whitlow和Filpula, Methods 2: 97-105 (1991); Bird et al.,Science 242:423-426 (1988); Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993)；和美国专利号4,946,778中，所述文献以其整体通过引用并入本文。
CDR肽("最小识别单元")可以通过构建编码感兴趣抗体的CDR的基因来获得。这样的基因例如通过使用聚合酶链反应以从产生抗体的细胞的RNA合成可变区来制备。参见例如，Larrick和Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)]。
一旦鉴定了抗体的CDR，利用传统的基因工程技术，编码本文描述的抗体的任何形式或片段的可表达的多核苷酸就可以多种方法之一合成和修饰，以产生一系列相关产品。
根据本发明的一些实施方案，CDR来源于特异性地结合抗原的αβ T细胞受体(TCR)。
根据本发明的一些实施方案，CDR来源于特异性地结合抗原的γδ T细胞受体(TCR)。
根据本发明的一些实施方案，CDR来源于一种特异性地结合抗原的工程化亲和力增强的αβ T细胞受体或γδ T细胞受体(TCR) (如上文所详细讨论的)。
根据本发明的一些实施方案，CDR来源于具有改进的稳定性或任何其它生物物理性质的工程化αβ T细胞受体或γδ T细胞受体(TCR)。
根据本发明的一些实施方案，CDR来源于特异性地结合抗原的T细胞受体-样(TCRL)抗体。TCRL及其产生方法的实例描述于WO03/068201、WO2008/120203、WO2012/007950、WO2009125395、WO2009/125394，其各自以其整体全部并入本文。
根据本发明的一些实施方案，抗原结合结构域包含单链Fv (scFv)分子。
细胞质结构域
本发明的CAR分子的细胞质结构域(也称为“细胞内信号传导结构域”或“T细胞受体信号传导模块”)负责激活CAR所在的细胞的至少一个正常的效应器功能。
虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不需要使用整个链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的方面，只要该部分传递效应器功能信号，就可以使用这样的截短部分代替完整的链。因此，术语细胞内信号传导结构域意指包括足以传递效应器功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明CAR分子的细胞内信号传导结构域的优选的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列，它们协同作用以启动抗原受体连接后的信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。
众所周知，仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，并且还需要一个次级或共刺激信号。因此，T细胞的激活可以通过两类不同的细胞质信号传导序列来介导：一种是通过TCR (初级细胞质信号传导序列)启动抗原-依赖的初级激活，另一种是以不依赖抗原的方式提供次级或共刺激信号(次级细胞质信号传导序列)。
初级细胞质信号传导序列以刺激的方式或以抑制的方式调节TCR复合体的初级激活。以刺激方式作用的初级细胞质信号传导序列可能含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
包含本发明中特别有用的初级细胞质信号传导序列的ITAM的例子包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选的是，本发明的CAR中的细胞质信号传导分子包含源自CD3ζ的细胞质信号传导序列。
在一个优选的实施方案中，CAR的细胞质结构域可以被设计为包含CD3-ζ信号传导结构域自身，或者可以与在本发明的CAR中有用的任何其它所需的细胞质结构域相结合。例如，CAR的细胞质结构域可包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是一种并非淋巴细胞对抗原的有效反应所必需的抗原受体或它们的配体的细胞表面分子。这样的分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能-相关抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性地与CD83结合的配体等。因此，虽然本发明主要以4-1BB作为共刺激信号传导元件为例，但其它共刺激元件在本发明的范围内。
根据本发明的一些实施方案，胞内结构域包含共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR分子的一部分。共刺激分子是并非淋巴细胞对抗原的有效反应所必需的抗原受体或它们的配体的细胞表面分子。
"共刺激配体"，当该术语在本文使用时，包括抗原呈递细胞[如，aAPC (人工抗原呈递细胞)、树突状细胞、B细胞等]上的分子，其特异性地结合T细胞上的同源共刺激分子，因此，除了通过例如TCR/CD3复合体与随肽携带的MHC分子结合提供的初级信号外，还提供了一种介导T细胞反应的信号，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可包括，但不限于CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、与Toll配体受体结合的激动剂或抗体，以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还特别包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性地结合的抗体，例如，但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能-相关抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性地结合CD83的配体。
"共刺激分子"指T细胞上的同源结合配体，它与共刺激配体特异性地结合，从而介导T细胞的共刺激反应，例如，但不限于增殖。共刺激分子包括，但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
如本文所用的"共刺激信号"，指一种信号，其与初级信号，如TCR/CD3连接组合，导致T细胞增殖和/或上调或下调关键分子。
所谓术语"刺激"是指通过刺激分子(如TCR/CD3复合体)与其同源配体的结合，从而介导信号传导事件，例如，但不限于通过TCR/CD3复合体进行信号转导而诱导的初级反应。刺激可介导某些分子的表达改变，如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组等。
"刺激分子"，当该术语在本文使用时，意指T细胞上的分子，它与抗原呈递细胞上存在的同源刺激配体特异性结合。
如本文所用的"刺激配体"意指一种配体，当其存在于抗原呈递细胞(如，aAPC、树突状细胞、B-细胞等)上时，可与T细胞上的同源刺激配体(在此称为"刺激分子")特异性地结合，从而介导T细胞的初级反应，包括但不限于激活、启动免疫反应、增殖等。刺激配体是本领域熟知的并且尤其涵盖携带有肽的MHC I类分子、抗-CD3抗体、超激动剂抗-CD28抗体和超激动剂抗-CD2抗体。
至于细胞质结构域，本发明的一些实施方案的CAR分子可被设计为包含CD28和/或4-1BB信号传导结构域自身或与任何其它所需的细胞质结构域结合，后者可用于本发明的一些实施方案的CAR分子的情况下。在一个实施方案中，CAR的细胞质结构域可被设计以进一步包含CD3-ζ的信号传导结构域。例如，CAR的细胞质结构域可包括但不限于CD3-ζ、4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。
根据本发明的一些实施方案，胞内结构域包含至少1种，例如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种，例如至少6种选自以下的多肽：CD3ζ (CD247、CD3z)、CD27、CD28、4-1BB/CD137、ICOS、OX40/CD134、DAP10、肿瘤坏死因子受体(TNFr)和Lsk。
根据本发明的一些实施方案，胞内结构域包含CD3ζ-链[CD247分子，也称为“CD3-ζ”和“CD3z”；GenBank Accession NOs. NP_000725.1和NP_932170.1]，它是来自内源性TCR的信号的主要发送器。
根据本发明的一些实施方案，胞内结构域包含对CAR的细胞质尾部的各种共刺激蛋白受体，以提供额外的信号到T细胞(“第二代”CAR)。实例包括，但不限于CD28 [如，GenBank Accession Nos. NP_001230006.1, NP_001230007.1, NP_006130.1]、4-1BB [肿瘤坏死因子受体超家族，成员9 (TNFRSF9)，也称为“CD137”，如GenBank Accession No.NP_001552.2]、ICOS [可诱导的T-细胞共刺激剂，如GenBank Accession No. NP_036224.1]、DAP10 [造血细胞信号传感器，如GenBank Accession Nos. NP_001007470,NP_055081.1]和Lsk [LCK原癌基因、Src家族酪氨酸激酶，如GenBank Accession Nos. NP_001036236.1, NP_005347.3]。临床前的研究表明，“第二代CAR设计提高了T细胞的抗肿瘤活性。
根据本发明的一些实施方案，胞内结构域包含多信号传导结构域，如CD3z-CD28-4-1BB或CD3z-CD28-OX40，以进一步增强效力。术语“OX40”指肿瘤坏死因子受体超家族，成员4 (TNFRSF4)，如GenBank Accession No. NP_003318.1 ("第三代" CAR)。
根据本发明的一些实施方案，胞内结构域包含CD28-CD3z、CD3z、CD28-CD137-CD3z。术语“CD137”指肿瘤坏死因子受体超家族，成员9 (TNFRSF9)，如GenBank AccessionNo. NP_001552.2。
根据本发明的一些实施方案，胞内结构域包含CD3z、CD28和肿瘤坏死因子受体(TNFr)。
根据本发明的一些实施方案，CAR包含CD3ζ链。
根据本发明的一些实施方案，CAR包括至少一个选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、Lck、ICOS和DAP10的共刺激结构域。
根据本发明的一些实施方案，CAR包含至少两个选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、Lck、ICOS和DAP10的共刺激结构域。
跨膜结构域
CAR的跨膜结构域可从天然来源或从合成来源衍生而来。当所述来源为天然来源时，跨膜结构域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。本发明中特别使用的跨膜区域可源自(即至少包括它们的跨膜区域) T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包括疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成跨膜结构域的每一端存在苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，短的寡肽或多肽接头, 优选长度在2到10个氨基酸之间，可以在CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸成对物提供了特别合适的接头。
根据本发明的一些实施方案，本发明的一些实施方案的CAR分子包含的跨膜结构域是与CAR中的结构域之一天然缔合的跨膜结构域。根据本发明的一些实施方案，跨膜结构域可以通过氨基酸替代来选择或修饰，以避免这些结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以尽量减少与受体复合体其它成员的相互作用。
根据本发明的一些实施方案，跨膜结构域是CD8铰链结构域。
根据一些实施方案，在CAR分子的胞外结构域和跨膜结构域之间，或者在CAR分子的细胞质结构域和跨膜结构域之间，可能存在间隔结构域。如本文所用的，术语"间隔结构域"通常是指用于将跨膜结构域连接到多肽链中的胞外结构域或细胞质结构域的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包含至多300个氨基酸，优选10-100个氨基酸和最优选25-50个氨基酸。
如所提及的，本发明的细胞的细胞表面受体(如tg-TCR和/或CAR)结合于抗原(如在靶细胞上)。
根据一个实施方案，抗原可包括肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、过敏性相关抗原和/或自身免疫性抗原。
如本文所用的短语“肿瘤抗原”指特定高增殖性疾病(如癌症)常见的抗原。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，其引起免疫反应，特别是T-细胞介导的免疫反应。本发明的抗原结合部分的选择将取决于要治疗的特定类型的癌症。
根据一个实施方案，肿瘤抗原与实体瘤相关。
根据一个实施方案，肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。
本发明中所提及的肿瘤抗原的类型包括肿瘤-特异性抗原(TSA)或肿瘤-相关抗原(TAA)。“TSA”指肿瘤细胞特有的蛋白或多肽抗原，它不存在于体内其它细胞上。“TAA”指由肿瘤细胞表达的蛋白或多肽抗原。例如，TAA可以是肿瘤细胞的一种或多种表面蛋白或多肽、核蛋白或糖蛋白，或其片段。
本文讨论的抗原只是通过举例说明而包括在内。这份清单不意图是排他性的，更多的例子对于本领域技术人员将是显而易见的。
肿瘤抗原是本领域熟知的并包括例如，胶质瘤-相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素-反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2 (AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、prostase、前列腺-特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1 (PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性白细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
这些分子包括但不限于组织-特异性抗原如MART-1、酪氨酸酶和黑素瘤中的GP100和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺-特异性抗原(PSA)。其它靶分子属于转化相关分子组，如癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌胚(onco-fetal)抗原如癌胚抗原(CEA)。在B-细胞淋巴瘤中，肿瘤-特异性独特型免疫球蛋白构成真正的肿瘤-特异性免疫球蛋白抗原，该抗原对于单个肿瘤是唯一的。B-细胞分化抗原如CD19、CD20和CD37是B-细胞淋巴瘤中的靶抗原的其它候选抗原。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20、独特型)已被用作单克隆抗体被动免疫治疗的靶标，但成功率有限。
TSA或TAA抗原的非-限制性实例包括以下：分化抗原如MART-1/MelanA (MART-1)、gp100 (Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤-特异性多谱系抗原如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过度表达的胚胎抗原如CEA；过度表达的癌基因和突变的抑癌基因如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位得到的独特肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，如爱泼斯坦-巴尔病毒抗原EBVA和人类乳头状瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.291\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
肿瘤抗原的更多的实例包括，但不限于，A33、BAGE、Bcl-2、β-联蛋白、CAl25、CA19-9、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD37、CD45、CD123、CEA、c-Met、CS-1、细胞周期蛋白B1、DAGE、EBNA、EGFR、ephrinB2、雌激素受体、FAP、铁蛋白、叶酸-结合蛋白、GAGE、G250、GD-2、GM2、gp75、gp100 (Pmel 17)、HER-2/neu、HPV E6、HPV E7、Ki-67、LRP、间皮素、p53和PRAME。更多的肿瘤抗原在van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B，肽数据库：T细胞-定义的肿瘤抗原. Cancer Immun (2013), www(dot)cancerimmunity(dot)org/peptide/中提供，通过引用并入本文。
根据一个特定的实施方案，肿瘤抗原包括，但不限于CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、Her2、GD-2、gp100、p53、癌胚抗原(CEA)、MY-ESO-1、MART-1、MAGE A3等。
根据一个实施方案，靶抗原是CD19。
根据本发明的一些实施方案，抗原是病毒抗原。病毒抗原可源自任何病毒，例如但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感、巨细胞病毒(CMV)、T-细胞白血病病毒1型(TAX)、丙型肝炎病毒(HCV)、(HBV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、腺病毒(Adv)、感冒病毒、流感病毒、甲型、乙型和丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒、天花病毒、水痘带状疱疹病毒、轮状病毒、西尼罗河病毒、多瘤病毒(如BK病毒)和/或寨卡病毒。
根据本发明的一些实施方案，病毒抗原包括，但不限于选自以下的多肽的病毒表位：人类亲T淋巴细胞病毒Ⅰ型(HTLV-1)转录因子(TAX)、流感基质蛋白表位、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)-衍生的表位、HIV-1 RT、HIV Gag、HIV Pol、流感膜蛋白M1、流感血凝素、流感神经氨酸酶、流感核蛋白、流感核蛋白、流感基质蛋白(M1)、流感离子通道(M2)、流感非-结构蛋白NS-1、流感非-结构蛋白NS-2、流感PA、流感PB1、流感PB2、流感BM2蛋白、流感NB蛋白、流感核衣壳蛋白、巨细胞病毒(CMV)磷酸化基质蛋白(pp65)、TAX、丙型肝炎病毒(HCV)、HBVpre-S蛋白85-66、HTLV-1 tax 11-19、HBV表面抗原185-194。
根据本发明的一些实施方案，抗原是细菌抗原。细菌抗原可源自任何细菌，例如但不限于炭疽；革兰氏阴性杆菌、衣原体、白喉、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、疟疾、结核分枝杆菌、百日咳毒素、肺炎球菌、立克次体、葡萄球菌、链球菌和破伤风。
根据本发明的一些实施方案，细菌抗原包括，但不限于，炭疽抗原包括，但不限于，炭疽保护性抗原；革兰氏阴性杆菌抗原包括，但不限于，脂多糖；流感嗜血杆菌抗原包括，但不限于荚膜多糖；白喉抗原包括，但不限于, 白喉毒素；结核分枝杆菌抗原包括，但不限于霉酚酸、热休克蛋白65 (HSP65)、30 kDa主分泌蛋白和抗原85A；百日咳毒素抗原包括，但不限于血凝素、百日咳杆菌粘附素、FIM2、FIM3和腺苷酸环化酶；肺炎球菌抗原包括，但不限于肺炎球菌溶血素和肺炎球菌荚膜多糖；立克次体抗原包括，但不限于rompA；链球菌抗原包括，但不限于M蛋白；和破伤风抗原包括，但不限于破伤风毒素。
根据本发明的一些实施方案，抗原是一种超级细菌(superbug)抗原(如多重耐药细菌)。超级细菌的例子包括，但不限于屎肠球菌、艰难梭菌、鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌科(包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属)。
根据本发明的一些实施方案，抗原是真菌抗原。真菌的例子包括，但不限于假丝酵母、球孢子菌、隐球菌、组织胞浆菌、利什曼原虫、疟原虫、原生动物、寄生虫、血吸虫、癣、弓形体和克氏锥虫。
根据本发明的一些实施方案，真菌抗原包括，但不限于球孢子菌抗原，包括，但不限于球粒抗原；隐球菌抗原包括，但不限于荚膜多糖；组织胞浆菌抗原包括，但不限于热休克蛋白60 (HSP60)；利什曼虫抗原包括，但不限于gp63和脂磷酸聚糖；恶性疟原虫抗原包括，但不限于裂殖子表面抗原、孢子体表面抗原、环子孢子抗原、配子母细胞/配偶子表面抗原；原生动物和其它寄生虫抗原，包括血期抗原pf 155/RESA；血吸虫抗原包括，但不限于，谷胱甘肽-S-转移酶和副肌球蛋白；癣真菌抗原包括，但不限于发癣菌素；弓形体抗原包括，但不限于SAG-1和p30；和克氏锥虫抗原包括，但不限于75-77 kDa抗原和56 kDa抗原。
根据本发明的一些实施方案，抗原是与过敏症相关的细胞所表达的抗原。过敏性抗原的实例包括，但不限于，花粉抗原如日本雪松花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麦草花粉抗原、动物源性抗原(如尘螨抗原和猫抗原)、组织相容性抗原和青霉素和其它治疗药物。
根据本发明的一些实施方案，抗原是与自身免疫性疾病有关的自身抗原。
如本文所用的术语"自身免疫性疾病"被定义为由自身免疫性反应引起的紊乱。自身免疫性疾病是对自身抗原的不当过度反应的结果。
自身免疫性疾病的实例包括，但不限于阿狄森氏病、斑秃(alopecia greata)、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩氏病、炎性肠病(IBD)、腹腔疾病、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、I型糖尿病、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯氏病(Graves' disease)、格-巴二氏综合征、桥本氏病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)、重症肌无力、寻常天疱疮、银屑病、风湿热、关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣关节炎)、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、史-约综合征(Stevens-Johnson syndrome)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液水肿、贫血、哮喘、恶性贫血、溃疡性结肠炎和中风等。
如本文所用的短语“自身抗原肽”指源自内源性(即，自身-蛋白)或消耗的蛋白质(例如，食物)的抗原，针对其产生炎性反应作为自身免疫性炎性反应的一部分。
应该指出的是，短语“内源性”、“自身”是指涉及引起自身免疫性反应的个体的相对表达。
自身抗原包含，但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
根据本发明的一些实施方案，自身抗原肽与选自糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、腹腔疾病和中风的疾病相关。
多发性硬化自身抗原包括，但不限于髓磷脂蛋白如髓磷脂碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)和髓磷鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。
类风湿性关节炎-相关自身抗原包括，但不限于源自胶原蛋白II (COL2A1)、基质金属蛋白酶-1 (MMP1)、Aggrecan核心蛋白前体(ACAN)、基质金属蛋白酶-16 (MMP16)、生腱蛋白(TNXB)和异质核核糖核蛋白A2 (HNRNPA2B1)的自身抗原肽。
1型糖尿病(T1D)自身抗原包括，但不限于在胰岛中表达的抗原，包括谷氨酸脱羧酶(GAD65)和β-细胞自身抗原肽。
腹腔(Coeliac)自身抗原包括，但不限于麦醇溶蛋白(如α麦醇溶蛋白、γ麦醇溶蛋白)和热休克蛋白20。
克罗恩氏病、溃疡性结肠炎或炎性肠病(IBD)自身抗原包括，但不限于FAM84A、颗粒膜糖蛋白2 (GP2)、CUB和Zona Pellucida-样结构域1 (CUZD1)、补体C3、过氧化氢酶和α-烯醇酶。
根据本发明的一些实施方案，中风-相关自身抗原包括，但不限于源自脑抗原的自身抗原肽如髓磷脂碱性蛋白、神经丝和N-甲基-D-天冬氨酸受体(MOG-35-55)的NR2A/2B亚型。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种产生本发明的一些实施方案的分离细胞的方法，该方法包括用编码包含T细胞受体信号传导模块的细胞表面受体或嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸转导细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，CTL是一种耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性，且其中CTL不包括中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型。
根据一个实施方案，为耐受性诱导细胞并基本上耗竭同种异体反应性的CTL是一种抗第三方细胞。
如本文所用的短语"抗-第三方细胞"是指指向(即通过T细胞识别)一种或多种第三方抗原的淋巴细胞(即T淋巴细胞)。
如本文所用的短语"一种或多种第三方抗原"指供体或受体中不存在的一种或多种可溶性或非-可溶性抗原(如膜相关抗原)，如下文所详细描述的。
例如，第三方抗原可以是第三方细胞、细胞抗原(如细胞表面抗原)、病毒的抗原(即病毒抗原)，例如爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)或巨细胞瘤病毒(CMV)，或细菌的抗原(即细菌抗原)，如鞭毛蛋白。病毒或细菌抗原可由受其感染或以其它方式使其表达病毒/细菌蛋白的细胞(如细胞系)提供。
自体或非-自体抗原呈递细胞，或人工载体或人工抗原呈递细胞，可用于呈递与其融合或负载的短合成肽，或提供蛋白质提取物或纯化蛋白。这样的短肽、蛋白提取物或纯化蛋白可以是病毒或细菌衍生的肽或代表任何其它抗原的肽。
专用软件可用于分析病毒或其它序列，以识别免疫原性短肽，即可在Ⅰ类MHC或Ⅱ类MHC的情况下呈递的肽。
相对于接受者，第三方细胞可以是同种异体的，也可以是异种的(在本文下面进一步详细说明)。就同种异体第三方细胞而言，这些细胞的HLA抗原不同于供体的HLA抗原，但与接受者HLA抗原没有交叉反应，使得针对这些细胞产生的抗-第三方细胞对移植物或接受者抗原没有反应。
根据本发明的一个实施方案，同种异体或异种第三方细胞是选自以下的刺激细胞：从外周血淋巴细胞(PBL)、脾脏或淋巴结、细胞因子-动员的PBL、体外扩增的抗原呈递细胞(APC)、体外扩增的树突状细胞(DC)和人工抗原呈递细胞纯化的细胞。
本发明的人工APC可以经工程改造以在不受外源肽冲击的情况下，展示含第三方肽或第三方MHC的自体MHC。因此，根据一个实施方案，人工APC包含用第三方MHC决定簇和共刺激分子转染的K562肿瘤细胞[如之前在例如Suhoski MM et al., Mol Ther. (2007) 15(5): 981-8中所述]，或用它们转染的成纤维细胞。
第三方抗原可存在于细胞、病毒或细菌表面上或从其中衍生和/或纯化。或者，病毒或细菌抗原可以在受感染的细胞上呈现，细胞抗原可以在人工载体上呈现，如脂质体或人工抗原呈递细胞(例如，用一种或多种第三方抗原转染的白血病或成纤维细胞系)。
第三方抗原还可包括由自体呈递细胞、非-自体呈递细胞呈递或在人工载体或人工抗原呈递细胞上呈递的合成肽。
此外，第三方抗原可以是例如从各种来源提取或纯化的蛋白。可用作根据本发明的第三方抗原的纯化蛋白的例子是卵清蛋白。也设想了其它例子。
利用细胞、病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、病毒肽呈递细胞或细菌肽呈递细胞作为第三方抗原是特别有利的，因为这样的第三方抗原包括一系列不同的抗原决定簇，因此指导形成了不同群体的抗-第三方细胞，这在需要重建的情况下，例如在致死性或亚致死性照射或化疗程序后，可能进一步有助于更快地重建T-细胞。
此外，当抗-第三方细胞指向第三方抗原时，这些细胞被赋予抗-疾病活性。术语“抗-疾病活性”指CTL对抗患病细胞的活性(如杀伤能力) (如癌细胞，如移植物抗白血病(GVL)活性)。这种活性通常是由LFA1-I/CAM1结合介导的TCR非依赖性杀伤所致[Ardittiet al., Blood (2005) 105(8):3365-71. Epub 2004 Jul 6]。
根据一个实施方案，第三方细胞包括树突状细胞。
根据一个实施方案，第三方细胞包含成熟树突状细胞。
产生第三方树突状细胞的方法是众所周知的，这些树突状细胞可以用作诱导CTL的刺激细胞。因此，作为一个非-限制性实例，外周血单核细胞(PBMC)可以从第三方非同基因细胞供体中获得[例如在CTL是同基因，例如自体的情况下，树突状细胞(DC)对于受试者可能是非同基因的，例如同种异体的；而如果CTL是非同基因的，例如同种异体的，那么DC是从非同基因(例如同种异体)的供体中选择的，而HLA与受试者和CTL都不匹配]。然后用塑料粘附法分离单核细胞，并用补充有人血清(如1%人血清)、青霉素/链霉素和GM-CSF (如800IU/ml)和IL-4 (如20 ng/ml) (从例如Peprotech, Hamburg, Germany获得)的DC细胞培养基(例如Cellgro DC培养基)培养(例如在细胞培养板中)。培养约24-72 h (如48 h)后，可加入包含GM-CSF (如1600 IU/ml)和IL-4 (如20 ng/ml)的DC培养基。约12-36 h (如24 h)后，可收获非-贴壁细胞，大细胞(主要是未成熟的DC)可重新悬浮在含有GM-CSF (例如800IU/ml)、IL-4 (例如20 ng/ml)、LPS (例如来自大肠杆菌O55:B5，例如10 ng/ml)和IFNγ(如100 IU/ml) (从例如Peprotech, Hamburg, Germany获得)的新鲜培养基中，平铺和培养过夜。次日，可弃去非-贴壁细胞，而贴壁DC可在冰上培养约15-30分钟(如20分钟)后，使用如冷PBS/1% HS温和地除下，从而获得由成熟DC组成的大细胞。
根据一个实施方案，第三方细胞包含照射的树突状细胞。
因此，根据一个实施方案，DC用约5-10 Gy、约10-20 Gy、约20-30 Gy、约20-40 Gy、约20-50 Gy、约10-50 Gy照射。根据一个特定的实施方案，DC用约10-50 Gy (如30 Gy)照射。
产生抗-第三方CTL的任何方法可根据本发明采用，如之前在PCT公布号WO 2010/049935、WO 2012/032526和WO 2013/035099中描述的，通过引用并入本文。
根据一个实施方案，为基本上耗竭同种异体反应性的耐受性诱导CTL如上文所述，通过将供体来源的T-淋巴细胞导向一种或多种第三方抗原而产生。
根据本发明的一个实施方案，同种异体反应性的耗竭(如通过耗竭能够发展为同种异体反应性CTL的T-淋巴细胞)通过剥夺在因子的第三方抗原存在下培养的T淋巴细胞来进行，所述因子(i) 为CTL成熟或防止细胞凋亡所需的；和(ii) 由成熟CTL分泌。在这样的培养条件，能够发展为同种异体反应性CTL的T-淋巴细胞发生凋亡，其中培养物中存在的成熟CTL (如针对一种或多种第三方抗原激活的CTL)在经历因子剥夺之后还存在，因为这些细胞自身分泌(自分泌)该因子。
根据本发明的教导，因子可以是例如细胞因子，例如，但不限于，IL-2。
根据一个实施方案，因子的剥夺进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天或更长时间。根据一个特定的实施方案，某种因子的剥夺进行3-10天(如6天)。
因此，本发明的抗-第三方CTL通常是由第一次接触同基因(如自体)或非-同基因(如非-自体的如同种异体或异种的)外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原(如上所述)在缺乏IL-2的培养中产生的。这个步骤通常执行约12-24小时、约12-36小时、约12-72小时、24-48小时、24-36小时、约24-72小时、约48-72小时、1-2天、2-3天、1-3天、2-4天、1-5天、2-5天、2-6天、2-8天、1-7天、3-7天、5-7天、5-9天、2-8天、6-12天、8-10天、8-12天或1-10天并允许耗竭同种异体反应性CTL。根据一个特定的实施方案，这个步骤进行6天。
一种或多种第三方抗原(如树突状细胞)与PBMC的比例通常为约1:2-约1:10，例如约1:4、约1:6、约1:8或约1:10。根据一个特定的实施方案，一种或多种第三方抗原(如树突状细胞)与PBMC的比例为约1:2-约1:8 (如1:5)。
根据一个实施方案，PBMC包含非-贴壁细胞。
根据一个实施方案，PBMC包含CD3+ T细胞。
根据一个实施方案，PBMC包含CD8+ T细胞。
根据一个实施方案，PBMC包含幼稚细胞(如幼稚CD8+ T细胞)。幼稚CD8+ T细胞的选择可通过选择表达CD45RA+的细胞和/或表达CD45RO-的细胞进行。
根据一个实施方案，T细胞首先与PBMC分离，然后在缺少因子(如IL-2)的培养物中培养。T淋巴细胞的选择可使用本领域已知的任何方法，例如通过基于亲和力的纯化(例如通过使用MACS珠、FACS分选器和/或捕获ELISA 标记)来进行(如在下文进一步讨论的)。
依据本发明的一个实施方案，能够发展为同种异体反应性CTL的T-淋巴细胞的耗竭通过亲和标记，接着通过基于标记的分离来进行。因此，当受宿主抗原刺激时，特异性地结合T-淋巴细胞的独特活化抗原的荧光标记抗-CD69或抗-CD25抗体和/或特异性结合分泌这些细胞因子的细胞的荧光标记抗-IL-2或抗-IFNγ，可用于将抗-宿主T-淋巴细胞从抗-第三方CTL中分离出来，从而使能够发展成同种异体反应性CTL的T-淋巴细胞耗竭。这样的特异性标记可被用来在IL-2饥饿之前选择抗-第三方CTL前体或作为IL-2饥饿的替代。
根据本发明的一个实施方案，能够发展为同种异体反应性CTL的T-淋巴细胞的耗竭通过亲和纯化进行。例如，底物，包括能够特异地结合只有T-淋巴细胞而不是由CTL (或者反之亦然)展示的细胞表面分子的抗体或配体，可用于从CTL制备物中有效地耗竭能够发展成同种异体反应性CTL的T-淋巴细胞。根据本发明的亲和底物可以是柱状基质，例如琼脂糖、纤维素等，也可以是珠粒，例如磁珠，如上面所述的抗-T-淋巴细胞或抗-CTL抗体被固定在其上。
因此，根据本发明的这个方面，能够发展为同种异体反应性CTL的T-淋巴细胞的耗竭可通过柱层析或磁珠分离(例如MACS)进行。
在获得基本上耗竭同种异体反应性T细胞克隆的CTL后，CTL细胞(即非-同种异体反应性CTL)可被进一步培养。根据一个实施方案，培养基补充有缺失因子(如IL-2)。这种培养期允许非-同种异体反应性抗-第三方CTL的富集(如增殖/扩增)，并可能进一步耗竭剩余的抗-宿主克隆。
因此，根据一个实施方案，在因子被剥夺后(例如3-10天)，CTL在被剥夺因子(如IL-2)的存在下培养。这样的培养条件可进行3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天或更长时间。根据一个特定的实施方案，在因子(如IL-2)的存在下的培养进行10-18天(如12天)。
这个步骤通常在约0.001-3000 IU/ml、0.01-3000 IU/ml、0.1-3000 IU/ml、1-3000 IU/ml、10-3000 IU/ml、100-3000 IU/ml、1000-3000 IU/ml、0.001-1000 IU/ml、0.01-1000 IU/ml、0.1-1000 IU/ml、1-1000 IU/ml、10-1000 IU/ml、100-1000 IU/ml、250-1000 IU/ml、500-1000 IU/ml、750-1000 IU/ml、10-500 IU/ml、50-500 IU/ml、100-500IU/ml、250-500 IU/ml、100-250 IU/ml、0.1-100 IU/ml、1-100 IU/ml、10-100 IU/ml、30-100 IU/ml、50-100 IU/ml、1-50 IU/ml、10-50 IU/ml、20-50 IU/ml、30-50 IU/ml、1-30IU/ml、10-30 IU/ml、20-30 IU/ml、10-20 IU/ml、0.1-10 IU/ml，或1-10 IU/ml IL-2的存在下进行。
根据一个特定的实施方案，IL-2的浓度是20-1000 IU/ml (如50 IU /ml)。
根据一个实施方案，将因子(如IL-2)每12小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时加入到培养物。根据一个特定的实施方案，将因子(如IL-2)每48小时加入到细胞中。
根据一个实施方案，CTL细胞在整个培养期(例如在缺乏因子的培养物中培养的第一步，以及在补充有该因子，如IL-2培养CTL的第二步中)被导向一种或多种第三方抗原。
产生为基本上耗竭T-淋巴细胞(所述细胞能够发展为同种异体反应性CTL)的耐受性诱导抗-第三方CTL的示例性方法包括：(a) 将供体的T-淋巴细胞导向被剥夺IL-2的培养物中的一种或多种第三方抗原，以耗竭同种异体反应性CTL (例如培养期3-10天，如6天)；和(b) 使步骤(a)的CTL与一种或多种第三方抗原在IL-2的存在下接触，从而允许耐受性诱导抗第三方CTL的富集(例如培养期6-18天，如12天)。
本发明人通过艰苦的实验和筛选，收集了一些标准，这些标准可用于促进无移植物抗宿主(GVH)反应细胞和/或增强抗疾病(如GVL)反应细胞的抗第三方CTL的增殖/扩增。
根据一个实施方案，该方法是通过在步骤(a)之后和步骤(b)之前，例如在补充IL-2的培养物中培养CTL之前耗竭CD4+ T细胞和/或CD56+自然杀伤细胞来进行的。
根据一个实施方案，该方法还包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前，例如在补充IL-2的培养物中培养CTL之前选择CD8+ T细胞。
耗竭CD4+和/或CD56+细胞，或选择CD8+细胞，可使用本领域已知的任何方法，如通过基于亲和力的纯化(例如使用MACS珠、FACS分选器和/或捕获ELISA标记)进行。这样的步骤对提高培养物中CD8+细胞的纯度(即在细胞培养物中排除其它淋巴细胞如CD4+ T细胞或NK细胞)或增加CD8++ T细胞的数量可能是有益的。
应该意识到，至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少55%、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85%、至少90 %、至少95 %或甚至100 %的抗-第三方细胞是CD3+CD8+细胞。根据一个特定的实施方案，抗-第三方细胞包含约40-50 % CD3+CD8+细胞。
根据一个实施方案，本发明的CTL包含少于1 %、2 %、3 %、4 %、5 %、10 %、20 %、30%、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95%的具有Tcm识别标记的细胞(如上所讨论的)。
因此，本发明的CTL不是天然存在的，因而不是大自然的产物。这些细胞通常通过离体操作(即在特定细胞因子的存在或不存在下，暴露于一种或多种第三方抗原)产生。
如所提及的，本发明的CTL用编码包含T细胞受体信号传导模块的细胞表面受体的多核苷酸转导。
如本文所用的术语“多核苷酸”指单链或双链核酸序列，其被分离并以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，上述的组合)的形式提供。
术语“分离的”指至少部分地从自然环境，例如从细胞，或从组织，如从人体分离。
所分离的多核苷酸可以使用本领域已知的重组方法获得，例如，从表达该基因的细胞中筛选文库，从已知包含该基因的载体中提取该基因，或使用标准技术直接从含有该基因的细胞和组织中分离出该基因。或者，可以合成地产生感兴趣的基因，而不是克隆。
根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸可包括单个多核苷酸，其包含编码细胞表面受体(如tg-TCR和/或CAR)的细胞外结构域、跨膜结构域和/或信号传导模块的核酸序列。或者，可以使用两个或更多个多核苷酸，其中一个多核苷酸可以包含编码例如细胞外结构域和跨膜结构域的核酸序列，而另一个多核苷酸可以包括编码信号传导模块的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种包含分离的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸包括编码本发明的一些实施方案的分子的核酸序列和用于指导分离的多核苷酸在宿主细胞中转录的顺式作用调节元件。
因此，编码本发明的细胞表面受体(如tg-TCR或CAR分子)的天然或合成核酸的表达通常通过可操作地将编码细胞表面受体(例如tg-TCR或CAR)多肽或其部分的核酸连接到顺式作用调节元件(例如启动子序列)，并将该构建体引入表达载体中来实现。
本发明的核酸构建体还可包括增强子、转录和翻译起始序列、转录和翻译终止子和多腺苷化信号、5' LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起始和3' LTR或其一部分；额外的多核苷酸序列，其例如允许从单个mRNA翻译几种蛋白，例如内部核糖体入口位点(IRES)和启动子-嵌合多肽的基因组整合序列；经设计以提高表达肽的稳定性、生产、纯化、产量或毒性的序列。
增强子调节转录起始的频率。典型地，启动子元件位于起始位点的上游30-110 bp的区域中，尽管最近已经显示一些启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是灵活的，使得当元件相对于其它元件反转或移动时，启动子功能将被保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以增加到相隔50 bp。根据启动子，似乎单个元件可以协同地或独立地发挥作用以激活转录。
合适的启动子的一个例子是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这种启动子序列是一个强的组成型启动子序列，能够驱动任何可操作地与其连接的多核苷酸序列的高水平表达。另一个合适的启动子的例子是延伸生长因子-1.α. (EF-1.α.)。然而，其它组成型启动子序列也可使用，包括但不限于猿病毒40 (SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒即时早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子例如，但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。而且，本发明不应受限于组成型启动子的应用。可诱导的启动子也被认为是本发明的一部分。可诱导的启动子的应用提供了一种能够当需要这种表达时启动可操作地连接的多核苷酸序列的表达或者在不需要表达时关闭该表达的分子开关。可诱导的启动子的例子包括，但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
本发明的分离的多核苷酸可被克隆到许多类型的载体中。例如，分离的多核苷酸可被克隆到载体中，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
哺乳动物表达载体的例子包括，但不限于pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81 (它们可从Invitrogen获得)、pCI (可从Promega获得)、pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV (可从Strategene获得)、pTRES (可从Clontech获得)，及其衍生物。
还可以使用含有来自真核病毒如逆转录病毒的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。源自牛乳头状瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，和源自爱泼斯坦-巴尔病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其它示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，和允许在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠科动物乳腺瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或显示在真核细胞中有效表达的其它启动子的指导下表达蛋白的任何其它载体。
目前优选的体内或体外核酸转移技术包括用病毒或非病毒构建体，如腺病毒、慢病毒、单纯疱疹I型病毒或腺-相关病毒(AAV)转染。重组病毒载体具有诸如侧向感染和靶向特异性的优点。通过病毒感染引入核酸可提供多种优于其它方法如脂质转染和电穿孔的优点，因为可由于病毒的感染性而获得更高的转染效率。
病毒载体技术是本领域熟知的并描述于例如Sambrook et al. (2001, 分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring HarborLaboratory, New York)和其它病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括，但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺-相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来说，合适的载体含有在至少一种生物中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一个或多个可选择标记(如，WO 01/96584; WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
根据本发明的一些实施方案，本发明的核酸构建体是病毒载体。
源自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定的整合及其在子细胞中的传播。慢病毒载体具有与源自癌-逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体相比的附加优势，因为它们可以转导非增殖细胞，例如肝细胞。
此外，慢病毒载体提供较大的基因插入能力，同时也具有免疫原性低的附加优势。或者，可以使用γ-逆转录病毒载体。γ-逆转录病毒载体具有良好的转导效率，并且没有载体-相关的毒性[参见如Zhang和Morgan, Adv Drug Deliv Rev. (2012)同上]。
例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了一个方便的平台。所选择的基因可以插入到载体中，然后使用本领域已知的技术将其包装在逆转录病毒粒子中。然后重组病毒可以在体内或离体被分离并传递给受试者的细胞。
为了评价细胞表面受体(如tg-TCR或CAR)多肽或其部分的表达，待引入细胞的核酸构建体也可以含有可选择的标记基因或报告基因，也可以同时包含两种基因，以便于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群体中识别和选择表达细胞。在其它方面，可选择的标记可以携带在单独的DNA段上，并用于共转染过程。可选择的标记和报告基因都可能有侧接的适当的调控序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括，例如，抗生素耐药基因，如neo等。
报告基因用于识别潜在转染细胞并评估调控序列的功能。一般来说，报告基因是指在受体生物或组织中不存在或不表达的基因，它编码一种多肽，其表达表现为某种易于检测的特性，例如酶活性。在DNA导入受体细胞后，在适当时间检测报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(如，Ui-Tel et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。合适的表达系统是众所周知的，且可以用已知的技术制备或经商业获得。一般来说，显示报告基因最高表达水平的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区域可连接于报告基因并被用来评估药剂调控启动子-驱动的转录的能力。
各种方法可被用来将本发明的核酸构建体引入宿主细胞，如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。这样的方法一般描述于Sambrook et al., 分子克隆：实验室手册(MolecularCloning: A Laboratory Manual), Cold Springs Harbor Laboratory, New York(1989, 1992)，Ausubel et al., 分子生物学现代方法(Current Protocols inMolecular Biology), John Wiley和Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., 体细胞基因治疗(Somatic Gene Therapy), CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vegaet al., 基因靶向(Gene Targeting), CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), 载体：分子克隆载体及其应用的综述(Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors andTheir Uses), Butterworths, Boston Mass. (1988)和Gilboa et at. [Biotechniques4 (6): 504-512, 1986]中并包括物理、化学或生物方法(如，重组病毒载体的稳定或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和感染)。此外，对于正负选择方法，参见美国专利号5,464,764和5,487,992。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。见例如，Sambrook et al. (2001, 分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning: A LaboratoryManual), Cold Spring Harbor Laboratory, New York)。用于将多核酸引入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染法。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递药媒介的示例性胶系统统是脂质体(如，人工膜囊泡)。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物方法包括应用DNA和RNA载体(如上所述)。病毒载体，且特别是逆转录病毒载体，已经成为在哺乳动物，例如人类细胞中插入基因的最广泛使用的方法。其它病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒1型、腺病毒和腺相关病毒等。见例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性的传递载体是脂质体。
"脂质体"是一种通用术语，涵盖由生成封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质载体。脂质体可表征为具有含磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分离的多个脂质层。当磷脂被悬浮在过量的水溶液中时，它们自发地形成。
脂质成分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间俘获水和溶解的溶质(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。然而，在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物也包括在内。例如，脂质可以采取胶束结构或仅仅作为脂质分子的非均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合体。
考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，核酸可与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可包封在脂质体的水内部，分散在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸缔合的连接分子与脂质体相连，俘获在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，含有胶束或与胶束复合，或以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可作为胶束存在于双层结构中，或以"折叠"结构存在。它们也可能只是分散在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可能是自然产生的，也可能是合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪液滴，以及含有长链脂肪烃及其衍生物的化合物类，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱("DMPC")可从Sigma, St. Louis, Mo.获得；二鲸蜡磷酸酯("DCP")可从K & K Laboratories(Plainview, N.Y.)获得；胆固醇("Choi")可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油("DMPG")；和其它脂质可从Avanti Polar Lipids, Inc, (Birmingham, Ala.)获得。另外地或者作为选择，可以使用DOTMA、DOPE和DC-Chol [Tonkinson et al., CancerInvestigation, 14(1): 54-65 (1996)]脂质。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备液可在约-20℃储存。氯仿被用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。
另一个根据本发明可以使用的示例性非-病毒递送系统是一种基于转座子的非病毒基因递送系统，例如睡美人(Sleeping Beauty)或PiggyBac。
无论采用何种方法将外源核酸引入宿主细胞，为了证实重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员熟知的"分子生物学"测定，如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；"生物化学"测定，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹法)或通过本发明所述的鉴定落入本发明范围内的试剂的测定来检测特定肽的存在或不存在。
应该意识到，用细胞表面受体(如tg-TCR和/或CAR)转导的细胞可以进一步经遗传修饰以抑制细胞中至少一个内源性免疫检查点基因的表达。
免疫检查点基因可包括PD或CTLA基因。
如本文所用的术语"免疫检查点基因"指参与调节免疫反应的幅度的抑制过程(例如反馈回路)，例如减轻有害免疫反应的不受控制的传播的免疫抑制反馈回路的任何基因。
免疫检查点基因的非-选择性实例包括扩展的CD28受体家族的成员及其配体，以及参与共抑制通路的基因(如，CTLA-4和PD-1)。
因此，根据一个实施方案，可以使用PD1和/或CTLA-4-靶向核酸酶或转录抑制物，如在美国专利申请号20140120622中所讨论的，通过引用并入本文。
另外地或或者，免疫检查点蛋白，其调控T细胞的激活或功能，包括例如PD1、PDL-1、B7H2、B7H4、CTLA-4、CD80、CD86、LAG-3、TIM-3、KIR、IDO、CD19、OX40、4-1BB (CD137)、CD27、CD70、CD40、GITR、CD28和/或ICOS (CD278)，可以通过使用免疫检查点调节剂在转导的细胞中进行调节(例如根据需要上调或下调)。
依据特定实施方案，免疫-检查点调节剂选自抗-CTLA4、抗-PD-1、抗-PDL-1、CD40激动剂、4-1BB激动剂、GITR激动剂和OX40激动剂。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种包含本发明的一些实施方案的分离细胞的细胞群。
本发明的一些实施方案的分离的细胞或细胞群可本身给予生物体，或在与适当的载体或赋形剂混合的药物组合物中给予。
如本文所用的"药物组合物"指本文描述的一种或多种活性成分与其它化学组分如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是有利于给予化合物至生物体。
在此术语"活性成分"指对生物效应负责的本发明的一些实施方案的细胞。
下文中，可互换使用的短语"生理上可接受的载体"和"药学上可接受的载体"指的是不对生物体造成重大刺激，也不废除所给予的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。在这些短语中包括辅助剂。
本文的术语"赋形剂"指在药物组合物中加入的惰性物质，以进一步促进活性成分的给予。赋形剂的不受限制的例子包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉种类、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
配制和给药的技术可在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”, MackPublishing Co., Easton, PA的最新版本中找到，其通过引用并入本文。
给药的合适途径可，例如，包括口服、直肠、经粘膜特别是经鼻、肠内或胃肠外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内，心内，例如进入右或左心室腔，进入总冠状动脉，静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
向中枢神经系统(CNS)递送药物的常规方法包括：神经外科策略(例如脑内注射或脑室内注射)；药物的分子操纵(例如，产生嵌合融合蛋白，该融合蛋白包括与对内皮细胞表面分子具有亲和力的运输肽，以及自身无法穿越BBB的药物的组合)，试图利用BBB的内源性转运途径之一；经设计以提高药物的脂质溶解度的药理学策略(例如水溶性药物与脂质或胆固醇载体的缀合)；以及高渗透干扰(将甘露醇溶液注入颈动脉或使用生物活性药物如血管紧张素肽导致)造成的BBB完整性的短暂性破坏。然而，这些策略中的每一个具有局限性，例如与侵入性外科手术相关的固有风险、由内源性运输系统固有的限制所施加的尺寸限制、与由在CNS外部可以是活性的载体基序组成的嵌合分子的全身施用相关的潜在不良生物学副作用，和在BBB被破坏的脑区域内可能存在脑损伤的风险，这使其成为一种次优的递送方法。或者，例如，通过将药物组合物直接注射到患者的组织区域中，可以以局部而非全身方式施用药物组合物。
根据一个实施方案，过药途径包括例如注射、摄入、输注、植入或移植。本文描述的组合物可以皮下、皮内、瘤内、节点内、髓内、肌内、静脉内(i.v.)注射或腹膜内给予患者。在一个实施方案中，本发明的药物组合物通过皮肤内或皮下注射给予患者。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物优选地通过i.v.注射给药。药物组合物可直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
本发明的一些实施方案的药物组合物可通过本领域熟知的方法，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、封装、包埋或冻干方法制备。
因此，根据本发明的一些实施方案使用的药物组合物可以常规的方式，使用一或多种生理学上可接受的载体(包括赋形剂和辅助剂)配制，所述载体有利于将活性成分加工成可在药学上使用的制剂。合适的制剂取决于所选择的给药途径。
对于注射，药用组合物的活性成分可配制在水性溶液中，优选地在生理学上相容的缓冲液例如Hank’s溶液、Ringer’s溶液，或生理盐缓冲液中。对于经粘膜给药，适宜于透过屏障的渗透剂被用于制剂中。这样的渗透剂一般是本领域已知的。
对于口服给药，药用组合物可通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体混合而容易地配制。这样的载体能够将药物组合物配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液剂、混悬剂等，用于由患者口服摄入。口服使用的药物制剂可使用固体赋形剂，任选地研磨生成的混合物，在加入合适的辅助剂(如果需要)后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣片芯制得。合适的赋形剂尤其是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或藻酸或其盐例如藻酸钠。
给糖衣片芯提供合适的包衣。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可任选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可被加入到片剂或糖衣丸包衣中，用于区别或鉴定活性化合物剂量的不同的组合。
可口服使用的药用组合物，包括由明胶制得的推入配合(push-fit)胶囊以及由明胶和增塑剂，例如甘油或山梨醇制得的软的、密封胶囊。推入配合胶囊可含有与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉，润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可溶于或悬浮于合适的液体，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可加入稳定剂。用于口服给予的所有制剂应以适合于所选择的给药途径的剂量给予。
对于含服给药，组合物可采取以常规方式配制的片剂或糖锭剂的形式。
对于经鼻吸入给药，根据本发明的一些实施方案使用的活性成分以使用合适的抛射剂(如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯-四氟乙烷或二氧化碳)，从加压包或喷雾器喷出的气溶胶喷雾剂的形式常规地传递。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过传递计量的量的阀确定。例如，用于分药器的明胶胶囊和药筒可被配制为含有化合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
在此描述的药用组合物可被配制用于胃肠外给予，例如通过推注或连续的输注。
用于注射的制剂可以单位剂型，例如在安瓿中或在任选地加入防腐剂的多剂量容器中存在。组合物可以是在油性或水性媒介中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并可含有配方剂例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠外给予的药用组合物包括水溶性形式的活性制剂的水性溶液。另外地，活性成分的混悬剂可制备为适宜的油基或水基注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。
水性注射混悬剂可含有增加悬浮液的粘性的物质，例如羧基甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。任选地，混悬剂也可含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解性的试剂，以使得制剂为高度浓缩的溶液。
备选地，活性成分可呈现为在使用前用合适的媒介，如无菌、无热原的水基溶液构成的粉末形式。
本发明的一些实施方案的药用组合物也可使用例如常规的栓剂基质例如可可酯或其它甘油酯配制成直肠组合物例如栓剂或保留灌肠剂。
适合用于本发明的药用组合物包括活性成分以有效实现预定目的量包含于其中的组合物。更特别地，治疗有效量指活性成分有效预防、缓解或改善病变症状或延长受治疗的受试者的存活的量。
治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据在此提供的详细的公开内容。
当指示"治疗量"时，可由医生在考虑患者(受试者)的年龄、体重、疾病状态(如肿瘤大小、感染程度或转移程度)和病情的情况下确定要给药的本发明组合物的精确量。通常可以说，包含本文描述的细胞的药物组合物可以104-109个细胞/kg体重的剂量(包括这些范围内的所有整数值)给予。
例如，输注给接受者的细胞数量应大于1 x 104 /Kg体重。输注给接受者的细胞数量通常应在1 x 103 /Kg体重-1 x 104 /Kg体重范围内，1 x 104 /Kg体重-1 x 105 /Kg体重范围内，1 x 104 /Kg体重-1 x 106 /Kg体重范围内，1 x 104 /Kg体重-10 x 107 /Kg体重范围内，1 x 104 /Kg体重-1 x 108 /Kg体重范围内，1 x 103 /Kg体重-1 x 105 /Kg体重范围内，1 x 104 /Kg体重-1 x 106 /Kg体重范围内，1 x 106 /Kg体重-10 x 107 /Kg体重范围内，1 x 105 /Kg体重-10 x 107 /Kg体重范围内，1 x 106 /Kg体重-1 x 108 /Kg体重范围内，或1 x 106 /Kg体重-1 x 109 /Kg体重范围内。根据一个特定的实施方案，输注给接受者的细胞数量应该在1 x 106 /Kg体重-10 x 108 /Kg体重范围内。
本发明的一些实施方案的细胞组合物还可以这些剂量多次给予。这些细胞可以通过免疫治疗中通常已知的输注技术给予(见例如Rosenberg et al., New Eng. J. ofMed. 319:1676, 1988)。对于特定患者的最佳剂量和治疗方案可通过医学领域的技术人员监测患者的疾病体征和相应地调整治疗而容易地确定。
例如，活性成分(例如，本发明的一些实施方案中的细胞)对病理的影响可以通过使用众所周知的方法(例如ELISA、FACS等)在经治疗的受试者的生物样品中监测标记(例如激素、葡萄糖、肽、碳水化合物等)的水平来评估，或者用众所周知的方法(如超声波、CT、MRI等)监测肿瘤的大小来评估。
对于在本发明方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量最初可从体外和细胞培养试验中估计。例如，可以在动物模型中配制剂量，以达到预期的浓度或效价。这样的信息可用于更准确地确定人体中的有用剂量。
本文所描述的活性成分的毒性和治疗效果可通过标准药物程序，在体外、在细胞培养或实验动物中确定。从这些体外及细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于制定供人类使用的剂量范围。
剂量可根据所用的剂型和所用的给药途径而变化。精确的制剂、给药途径和剂量可由个体医生根据患者的病情选择(见例如，Fingl, et al., 1975，The PharmacologicalBasis of Therapeutics, Ch. 1 p.1)。
给药的量和间隔可单独调整以提供例如足以诱导或抑制生物学作用的活性成分的水平(最小有效浓度，MEC)。对于每一制剂，MEC将是变化的，但可从体外数据估算。获得MEC所必需的剂量将取决于个体特征和给药途径。检测分析可被用来测定血浆浓度。
取决于要治疗的病症的严重性和响应，剂量可以单次或多次给予，疗程持续从几天至几周或直到实现治愈或病情减轻。
要给予的组合物的量当然将取决于受治疗的受试者，病痛的严重性，给药方式，开具处方的临床医师的判断等。
根据本发明的一些实施方案，本发明的治疗剂可与经设计用于治疗病变的其他药物一起提供给受试者[组合疗法(如，之前、同时或之后)]。
在本发明的某些实施方案中，本发明的一些实施方案的细胞与任何数量的相关治疗方式联合给予患者，包括但不限于使用药物如抗病毒药物(如更昔洛韦、伐昔洛韦、阿昔洛韦、缬更昔洛韦、膦甲酸、西多福韦、马立巴韦(Maribavir)、来氟米特)；化学治疗剂(如抗肿瘤药物，例如但不限于烷化剂，包括例如环磷酰胺、白消安、双氯乙基甲胺或氮芥(HN2)、乌拉莫司汀或尿嘧啶氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、苯达莫司汀、亚硝基脲卡莫司丁、罗莫司汀、链佐星、噻替派、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、沙铂、四硝酸三铂、丙卡巴肼、六甲蜜胺、三嗪类(达卡巴嗪、米托唑胺、替莫唑胺)、达卡巴嗪、替莫唑胺、马利兰、白消安(Busulfex)、氟达拉滨、二甲基mileran或阿糖胞苷)；治疗MS的药物(如那他珠单抗)；或治疗牛皮癣的药物(如依法利珠单抗)治疗。
在进一步的实施方案中，本发明的一些实施方案的细胞可与化学疗法、照射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506)、抗体或其它免疫消融剂联合使用(下文将进一步详细讨论)。
在进一步实施方案中，本发明的一些实施方案的细胞组合物与骨髓移植(如，之前、同时或之后)联合给予患者。
在进一步实施方案中，本发明的一些实施方案的细胞组合物在使用例如化疗剂例如氟达拉滨、外束照射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH的T细胞消融疗法之后被给予患者。
在另一个实施方案中，本发明的细胞组合物在B-细胞消融疗法例如与CD20反应的药物，如Rituxan之后给予。
联合疗法可增加本发明的药物在治疗的受试者中的治疗效果。
本发明的一些实施方案的组合物，如有需要，可在包装或分药器装置中提供，如FDA批准的药剂盒，其可包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装可例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分药器装置可附有给药说明书。包装或分药器也可容纳由管理药物的制造、使用或销售的政府当局规定的形式的与容器相关的注意事项，该注意事项是当局批准组合物的形式或人或兽医给药的反映。这样的注意事项，例如，可以具有由美国食品和药品管理局对处方药批准的标签或批准的产品插页。也可制备在相容的药用载体中配制的包含本发明制剂的组合物，置于适宜的容器中，并被标记用于治疗指定的病症，如在上文进一步详述的。
药剂盒可以例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分药器装置可附有给药说明书。包装或分药器也可容纳由管理药物的制造、使用或销售的政府当局规定的形式的与容器相关的注意事项，该注意事项是当局批准组合物的形式或人或兽医给药的反映。这样的注意事项，例如，可以具有由美国食品和药品管理局对处方药批准的标签或批准的产品插页。也可制备在相容的药用载体中配制的包含本发明制剂的组合物，置于适宜的容器中，并被标记用于治疗指定的病症，如在上文进一步详述的。
根据一个实施方案，所述药剂盒还包含化疗剂(例如，如上文详细讨论的抗肿瘤剂)。
根据一个实施方案，所述药剂盒还包含抗病毒剂(如上文详细讨论的)。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的本发明的一些实施方案的细胞群，从而治疗受试者。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供治疗有效量的本发明的一些实施方案的细胞群，用于治疗有需要的受试者的疾病。
术语“治疗”指抑制、预防或阻止病变(疾病、障碍或病症)的发展和/或导致病变的减轻、减退或消退。本领域技术人员应该理解，各种方法和测定可用来评价病变的发展，并且类似地，各种方法和测定可用来评价病变的减轻、减退或消退。
如本文所用的，术语“受试者”包括哺乳动物，优选罹患病变的任何年龄或性别的人。
病变可以是，但不限于恶性疾病(癌症)、感染性疾病(如病毒感染、细菌感染、真菌感染、原生动物感染或寄生虫感染)、过敏性和/或自身免疫性疾病。
癌症疾病
恶性疾病(也称为癌症)，其可以通过本发明的一些实施方案的方法治疗，可以是任何实体或非实体瘤和/或肿瘤转移。
癌症的例子包括，但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、软-组织肉瘤、卡波济氏肉瘤、黑素瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非-小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric或stomach cancer)(包括胃肠道癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、子宫内膜或子宫癌、类癌、涎腺癌、肾癌(kidney或renal cancer)、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，及各种类型的头和颈癌(如脑瘤)。可适合于本发明的治疗的癌性病症包括转移癌。
根据一个实施方案，恶性疾病是血液恶性肿瘤。示例性血液恶性肿瘤包括，但不限于白血病[如，如急性淋巴细胞、急性成淋巴细胞、急性成淋巴细胞前-B细胞、急性成淋巴细胞T细胞白血病、急性巨核母细胞、单核细胞、急性骨髓性、急性骨髓样、急性骨髓样伴嗜酸性粒细胞增多、B细胞、嗜碱性细胞、慢性骨髓样、慢性B细胞、嗜酸性细胞、Friend、粒细胞或髓细胞、毛细胞、淋巴细胞、巨核母细胞、单核细胞、单核-巨噬细胞、髓母细胞、骨髓样、骨髓单核细胞、浆细胞、前-B细胞、前髓细胞、亚急性、T细胞、淋巴样肿瘤、髓系恶性肿瘤易感性、急性非淋巴细胞性白血病、T-细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)和B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)]和淋巴瘤[如，霍奇金氏病、非-霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏病、皮肤T细胞、组织细胞、成淋巴细胞、T细胞，胸腺、B细胞，包括低级/滤泡；小淋巴细胞(SL) NHL；中级/滤泡NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级成淋巴细胞NHL；高级小非-分裂细胞NHL；庞大病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS-相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症]。
根据一个特定的实施方案，恶性疾病是白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、黑素瘤、肉瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、滑膜细胞癌或胰腺癌。
根据本发明的一些实施方案，病变是实体瘤。
根据本发明的一些实施方案，病变是瘤转移。
根据本发明的一些实施方案，病变是血液恶性肿瘤。
根据本发明的一些实施方案，病变是白血病或淋巴瘤。
可用本发明的一些实施方案的方法治疗的示例性恶性疾病列于下表1和2中。
表1：利用具有任选的预调节方案的tg-TCR转导细胞的临床应用。
表2：利用具有任选的预调节方案的CAR转导细胞的临床应用。
根据一个特定的实施方案，恶性疾病是白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、黑素瘤、肉瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、滑膜细胞癌和胰腺癌。
感染性疾病
感染性疾病的例子包括，但不限于慢性感染性疾病、亚急性感染性疾病、急性感染性疾病、病毒疾病、细菌疾病、原生动物疾病、寄生虫疾病、真菌疾病、支原体疾病和朊病毒疾病。
引起根据本发明的教义可治疗的感染性疾病的特定类型的病毒病原体包括，但不限于逆转录病毒、环病毒、细小病毒、乳多泡病毒、腺病毒、疱疹病毒、虹彩病毒、痘病毒、肝DNA病毒、微小核糖核酸病毒、杯状病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠病毒、正黏液病毒、副粘液病毒、杆状病毒、布亚病毒、冠状病毒、沙粒病毒和纤丝病毒。
根据本发明的教义可治疗的病毒感染的具体例子包括，但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)-诱导的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、流感、鼻病毒感染、病毒性脑膜炎、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染、甲型、乙型或丙型肝炎病毒感染、麻疹、乳头状瘤病毒感染/疣、巨细胞病毒(CMV)感染、单纯疱疹病毒感染、黄热病、埃博拉病毒感染和狂犬病。
根据一个特定的实施方案，病毒疾病选自免疫缺陷病毒(HIV)、流感、巨细胞病毒(CMV)、T-细胞白血病病毒1型(TAX)、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
过敏性疾病
过敏性疾病的例子包括，但不限于哮喘、荨麻疹(hives)、荨麻疹(urticaria)、花粉过敏、尘螨过敏、毒液过敏、化妆品过敏、胶乳过敏、化学过敏、药物过敏、昆虫咬伤过敏、动物皮屑过敏、刺植物过敏、毒藤过敏和食物过敏。
自身免疫性疾病
自身免疫性疾病包括，但不限于心血管疾病、类风湿性疾病、腺体疾病、胃肠道疾病、皮肤疾病、肝脏疾病、神经疾病、肌肉疾病、肾疾病、生殖相关疾病、结缔组织疾病和全身疾病。
自身免疫性心血管疾病的例子包括，但不限于动脉粥样硬化(Matsuura E. et al., Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135)、心肌梗死(Vaarala O. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132)、血栓症(Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9)、韦格纳氏肉芽肿、大动脉炎(Takayasu’s arteritis)、川崎综合征(Praprotnik S. et al., Wien KlinWochenschr 2000 Aug 25;112 (15-16):660)、抗-因子VIII自身免疫性疾病(Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000;26 (2):157)、坏死性小血管炎、显微镜下多血管炎、Churg和Strauss综合征、微量免疫局灶性坏死和新月体肾小球肾炎(NoelLH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May;151 (3):178)、抗磷脂综合征(Flamholz R.et al., J Clin Apheresis 1999;14 (4):171)、抗体-诱发性心力衰竭(Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 1999 Jun 17;83 (12A):75H)、血小板减少性紫癜(Moccia F. AnnItal Med Int. 1999 Apr-Jun;14 (2):114; Semple JW. et al., Blood 1996 May 15;87 (10):4245)、自身免疫性溶血性贫血(Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998Jan;28 (3-4):285; Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 Mar;74 (3):139)、查加斯病的心脏自身免疫(Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 1996 Oct 15;98 (8):1709)和抗-辅助T淋巴细胞自身免疫(Caporossi AP. et al.,Viral Immunol 1998;11 (1):9)。
自身免疫性类风湿性疾病的例子包括，但不限于类风湿性关节炎[Krenn V. et al., Histol Histopathol (2000) 15 (3):791; Tisch R和McDevitt HO. Proc NatlAcad Sci USA (1994) 18; 91(2): 437–438]和强直性脊柱炎[Jan Voswinkel et al.,Arthritis Res (2001) 3 (3): 189]。
自身免疫性腺体疾病的例子包括，但不限于胰腺疾病、I型糖尿病、甲状腺疾病、格雷夫斯氏病、甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎、桥本甲状腺炎、特发性粘液水肿、卵巢自身免疫、自身免疫性抗-精子不孕、自身免疫性前列腺炎和I型自身免疫性多腺性综合征。疾病包括，但不限于胰腺的自身免疫性疾病、1型糖尿病(Castano L.和Eisenbarth GS.Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct;34Suppl:S125)、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯氏病(Orgiazzi J. Endocrinol MetabClin North Am 2000 Jun;29 (2):339; Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993Mar;92 (1):77)、自发性自身免疫性甲状腺炎(Braley-Mullen H.和Yu S, J Immunol2000 Dec 15;165 (12):7262)、桥本甲状腺炎(Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999Aug;57 (8):1810)、特发性粘液水肿(Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 Aug;57 (8):1759)、卵巢自身免疫(Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb;37 (2):87)、自身免疫性抗-精子不孕(Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. 2000 Mar;43 (3):134)、自身免疫性前列腺炎(Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec;50 (6):893)和I型自身免疫性多腺性综合征(Hara T. et al., Blood. 1991 Mar 1;77 (5):1127)。
自身免疫性胃肠道疾病的例子包括，但不限于慢性炎性肠道疾病(Garcia HerolaA. et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23 (1):16)、腹腔疾病(Landau YE.和Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16;138 (2):122)、结肠炎、回肠炎和克罗恩氏病。
自身免疫性皮肤疾病的例子包括，但不限于自身免疫性大疱性皮肤病，例如，但不限于寻常天疱疮、大疱性类天疱疮和落叶型天疱疮。
自身免疫性肝脏疾病的例子包括，但不限于肝炎、自身免疫性慢性活动性肝炎(Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar; 54 (3):382)、原发性胆汁性肝硬化(Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Nov; 91 (5):551; Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun; 11 (6):595)和自身免疫性肝炎(MannsMP. J Hepatol 2000 Aug; 33 (2):326)。
自身免疫性神经疾病的例子包括，但不限于多发性硬化(Cross AH. et al.,JNeuroimmunol 2001 Jan 1;112 (1-2):1)、阿尔茨海默氏病(Oron L. et al., J NeuralTransm Suppl. 1997;49:77)、重症肌无力(Infante AJ.和Kraig E, Int Rev Immunol1999;18 (1-2):83; Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 Dec;20 (12):2563)、神经病、运动神经病(Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May;7 (3):191)；格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)和自身免疫性神经病(Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000Apr;319 (4):234)、肌无力、兰伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenicsyndrome) (Takamori M. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):204)；副肿瘤性神经系统疾病、小脑萎缩、副肿瘤性小脑萎缩和僵人综合征(Hiemstra HS. et al., Proc Natl AcadSci units S A 2001 Mar 27;98 (7):3988)；非-副肿瘤性僵人综合征、进行性小脑萎缩、脑炎、拉斯穆森脑炎(Rasmussen’s encephalitis)、肌萎缩侧索硬化症、风湿性舞蹈病(Sydenham chorea)、抽动秽语综合征(Gilles de la Tourette syndrome)和自身免疫性多内分泌病(Antoine JC.和Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan;156 (1):23)；免疫失调神经病(Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin NeurophysiolSuppl 1999;50:419)；获得性神经性肌强直、先天性多关节挛缩(Vincent A. et al., AnnN Y Acad Sci. 1998 May 13;841:482)、神经炎、视神经炎(Soderstrom M. et al., JNeurol Neurosurg Psychiatry 1994 May;57 (5):544)和神经退行性疾病。
自身免疫性肌肉疾病的例子包括，但不限于肌炎、自身免疫性肌炎和原发性斯耶格伦综合征(Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep;123 (1):92)和平滑肌自身免疫性疾病(Zauli D.et al.,Biomed Pharmacother 1999 Jun;53 (5-6):234)。
自身免疫性肾疾病的例子包括，但不限于肾炎和自身免疫性间质性肾炎(KellyCJ. J Am Soc Nephrol 1990 Aug; 1 (2):140)。
生殖相关的自身免疫性疾病的实例包括，但不限于反复胎儿丢失(Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl 2:S107-9)。
自身免疫性结缔组织疾病的例子包括，但不限于耳病、自身免疫性耳病(Yoo TJ.et al., Cell Immunol 1994 Aug; 157 (1):249)和内耳的自身免疫性疾病(Gloddek B.et al., Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29; 830:266)。
自身免疫性全身疾病的例子包括，但不限于系统性红斑狼疮(Erikson J. et al., Immunol Res 1998; 17 (1-2): 49)和系统性硬化(Renaudineau Y. et al., ClinDiagn Lab Immunol. 1999 Mar; 6 (2): 156); Chan OT. et al., Immunol Rev 1999Jun;169:107)。
根据一个特定的实施方案，自身免疫性疾病选自1型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、腹腔疾病和中风。
如所提及的，本发明的细胞可以从任何细胞供体获得。因此，待治疗的受试者可以是人类受试者，而细胞可从同基因(如自体)或非-同基因供体(如相对于接受者为同种异体或异种)获得。
如本文所用的，术语“同基因”细胞指与受试者在基因上基本相同的细胞，或基本上与受试者的所有淋巴细胞相同的细胞。同基因细胞的例子包括源自受试者(本领域也称为“自体”)、源自受试者的克隆，或源自受试者的相同双胞胎的细胞。
如本文所用的，术语“非-同基因的”细胞指与受试者在基因上基本上不相同的细胞，或本质上与受试者的所有淋巴细胞不相同的细胞(如同种异体细胞或异种细胞)。
如本文所用的，术语“同种异体”指来源于与受试者相同物种但与受试者基本上为非-克隆的供体的细胞。通常，相同物种的远亲后代、非-合子孪生哺乳动物彼此是同种异体的。应该意识到，同种异体细胞相对于受试者可以是HLA相同的，部分HLA相同的或HLA非-相同的(即显示一个或多个完全不同的HLA决定簇)。
如本文所用的，术语“异种的”指相对于受试者的相当大比例的淋巴细胞的物种，基本上表达不同物种的抗原的细胞。典型地，不同物种的远亲后代哺乳动物是彼此异种的。
本发明构思了异种细胞源自各种物种。因此，根据一个实施方案，细胞可源自任何哺乳动物。细胞的合适物种来源包括大多数驯化或家畜动物和灵长类动物。这样的动物包括，但不限于猪(如猪(pig))、牛(如，奶牛)、马(如，马(horse))、羊(如，山羊、绵羊)、猫(如，家猫(Felis domestica))、犬(如，家犬(Canis domestica))、啮齿动物(如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠)和灵长类动物(如，黑猩猩、恒河猴、食蟹猴、狨猴)。
异种来源(如猪来源)的细胞优选地从已知没有动物感染性疾病(例如猪内源性逆转录病毒)的来源获得。类似地，人-来源的细胞或组织优选从基本上无病原体的来源获得。
根据一个实施方案，细胞与受试者为非-同基因的。
根据一个实施方案，细胞与受试者为同种异体的。
根据一个实施方案，细胞与受试者为同基因的(如自体)。
依据本发明的一个实施方案，受试者是人类且细胞得自人类来源(如非-自体的)。
根据一个实施方案，受试者是人类且细胞得自异种用来(如猪来源)。
可采用本领域已知的任何方法获得用于移植的细胞。因此，例如，免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞、DC)可以通过从供体采集外周血获得。采集外周血的方法是本领域熟知的并包括，但不限于从供体中抽取多达500-1000 mL全血，并在含有抗凝剂(如肝素或柠檬酸盐)的容器中收集，或通过血浆分离置换法收集，血浆分离置换法为一种程序，其中个体的外周血通过装置，产生主要成分(如单核细胞，如淋巴细胞、单核细胞或树突状细胞)，并将其他成分返回到受试者的循环中。或者，细胞可通过体外或离体培养细胞获得。应该意识到，本发明的细胞可以是新鲜的或冷冻的(例如冷冻保存的)制剂的细胞。
根据移植背景，为了便于细胞的植入，该方法还可以有利地包括在移植前在亚致死性、致死性或超致死性的条件下调节受试者。
如本文所用的，术语“亚致死性”、“致死性”和“超致死性”，当与本发明的受试者的调节有关时，指骨髓毒性和/或淋巴细胞毒性治疗，当其应用于受试者的代表性群体时，这些治疗通常分别是：基本上对该群体的所有成员都是非-致死性的；对该群体一些成员，但不是所有成员是致死性的；或在正常无菌条件下，对该群体的所有成员基本上都是致死性的。
根据本发明的一些实施方案，亚致死性、致死性或超致死性调节包括全身照射(TBI)、全淋巴照射(TLI，即暴露所有淋巴结、胸腺和脾脏)、身体局部照射(如结肠、乳房等的特定暴露)、清髓调节和/或非-清髓调节，如用不同的组合，包括但不限于共刺激阻滞、化疗剂和/或抗体免疫治疗。根据本发明的一些实施方案，调节包含任何上述调节方案的组合(如化疗剂和TBI、共刺激阻滞和化疗剂、抗体免疫治疗和化疗剂等)。
根据一个实施方案，TBI包括在以下范围内的单次或分次的照射剂量：0.5-1 Gy、0.5-1.5 Gy、0.5-2.5 Gy、0.5-5 Gy、0.5-7.5 Gy、0.5-10 Gy、0.5-15 Gy、1-1.5 Gy、1-2Gy、1-2.5 Gy、1-3 Gy、1-3.5 Gy、1-4 Gy、1-4.5 Gy、1-1.5 Gy、1-7.5 Gy、1-10 Gy、2-3 Gy、2-4 Gy、2-5 Gy、2-6 Gy、2-7 Gy、2-8 Gy、2-9 Gy、2-10 Gy、3-4 Gy、3-5 Gy、3-6 Gy、3-7Gy、3-8 Gy、3-9 Gy、3-10 Gy、4-5 Gy、4-6 Gy、4-7 Gy、4-8 Gy、4-9 Gy、4-10 Gy、5-6 Gy、5-7 Gy、5-8 Gy、5-9 Gy、5-10 Gy、6-7 Gy、6-8 Gy、6-9 Gy、6-10 Gy、7-8 Gy、7-9 Gy、7-10Gy、8-9 Gy、8-10 Gy、10-12 Gy或10-15 Gy。
根据一个特定的实施方案，TBI包括在1-7.5 Gy范围内的单次或分次的照射剂量。
根据一个实施方案，调节步骤是通过在超致死性条件下，如在清髓条件下对受试者调节来实现的。
或者，调节步骤可以通过在致死性或亚致死性条件下对受试者进行调节，例如通过在清髓条件下或非-清髓条件下对受试者进行调节来实现。
根据一个实施方案，调节步骤通过用清髓药物(如白消安或美法仑)或非-清髓药物(如环磷酰胺和或氟达拉滨)调节受试者进行。
可被用来调节受试者的调节剂的例子包括，但不限于照射、药物和耐受性诱导细胞(如本文描述的)。
药物的例子包括骨髓毒性药物、淋巴细胞毒性药物和免疫抑制药物(在下文详细讨论)。
骨髓毒性药物的例子包括，但不限于白消安、二甲基mileran、美法仑和噻替派。
另外地或者作为选择，该方法还可包括在细胞移植之前、同时或之后用免疫抑制方案调节受试者。
合适类型的免疫抑制方案的例子包括给予免疫抑制药物和/或免疫抑制照射。
本领域的文献为选择和实施合适的免疫抑制方案用于移植提供了充分的指导(例如，参考：Kirkpatrick CH.和Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM.et al., 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M.和Strom TB., 1996. New Engl.J. Med. 331, 365; Midthun DE. et al., 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; MorrisonVA. et al., 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW., 1995. Annu Rev Med. 46, 381;Senderowicz AM. et al., 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F. et al.,1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J. et al. 1998. Lancet 351, 623)。
免疫抑制剂的例子包括，但不限于他克莫司(也称为FK-506或藤霉素，商品名：Prograf, Advagraf, Protopic)、麦考酚酸吗乙酯、麦考酚酸钠、泼尼松、甲氨蝶呤、环磷酰胺、环孢菌素、环孢菌素A、氯喹、羟基氯喹、柳氮磺胺吡啶(sulphasalazopyrine)、金盐，D-青霉胺、来氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滞素、英利昔单抗(REMICADE)、依那西普、TNFα阻滞剂、靶向炎性细胞因子的生物制剂和非-甾体抗炎药(NSAID)。NSAID的例子包括，但不限于乙酰水杨酸、胆碱水杨酸镁、二氟尼柳、水杨酸镁、双水杨酯、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、萘普生、萘丁美酮、苯丁酮、吡罗昔康、舒林酸、托美汀、对乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制剂、曲马多、雷帕霉素(西罗莫司)和雷帕霉素类似物(如CCI-779、RAD001、AP23573)。这些药物可单独或组合给予。
如本文所用的术语“约”指±10 %。
术语"包含(comprises)"、"包含(comprising)"、"包括(includes)"、"包括(including)"、“具有”及其变化形式意指"包括，但不限于"。
术语“由…组成”意指“包括且限于”。
术语"基本上由…组成"意指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部件，但只是在另外的成分、步骤和/或部件不实质性地改变所要求的组合物、方法或结构的基本和新颖的特性的时候。
如本文所用的，单数形式"a"、"an"和"the"包括复数指代，除非文中另外清楚地指明。例如，术语"化合物"或"至少一种化合物"可包括多种化合物，包括其混合物。
贯穿本申请，本发明的各个实施方案可以范围格式提出。应该理解，在范围格式中的描述仅仅是为了方便和简明，而不应被解释为对本发明范围的硬性限制。因此，一定范围的描述应被认为已具体公开所有的可能的子范围以及在该范围内的各个数值。例如，范围例如从1至6的描述应被认为已具体公开例如从1至3，从1至4，从1至5，从2至4，从2至6，从3至6等的子范围，以及在该范围内的各个数值，例如，1、2、3、4、5和6。这适用于无论多宽的范围。
每当本文指明一个数值范围时，则意味着包括在该指明的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“在第一个指明的数字和第二个指明的数字之间的范围”和“从第一个指明的数字至第二个指明的数字的范围”在此可互换使用并意欲包括第一个和第二个指明的数字以及在其之间的所有分数和整数数值。
如本文所用的，术语"方法"指为完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于，化学、药学、生物学、生物化学和医学领域的专业人员已知的那些方式、手段、技术和程序，或者化学、药学、生物学、生物化学和医学领域的专业人员从已知的方式、手段、技术和程序容易地开发的那些方式、手段、技术和程序。
要意识到本发明的某些特征，为了清楚起见，其在独立的实施方案的情况下被描述，也可在单一实施方案中组合提供。反过来，本发明的各个特征，为了简明起见，其在单一实施方案的情况下被描述，也可分开地或以任何合适的亚组合或合适时在本发明的任何其它描述的实施方案中提供。在各个实施方案的情况下描述的某些特征并不认为是那些实施方案的必要特征，除非没有那些要素时，所述实施方案无法实施。
如上文描述的和如在下文权利要求书部分所要求的本发明的各个实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现在参照以下实施例，所述实施例与以上描述一起以非限制性方式说明本发明。
一般来说，本文所用的命名和本发明所用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中有充分的解释。见例如，"分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning: A laboratory Manual)" Sambrook et al., (1989); "分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)" Volumes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel et al., "分子生物学现代方法(Current Protocols inMolecular Biology)", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal,"分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)", John Wiley &Sons, New York (1988); Watson et al., "重组DNA (Recombinant DNA)", ScientificAmerican Books, New York; Birren et al. (eds) "基因组分析：实验室手册丛书(Genome Analysis: A Laboratory Manual Series)", Vols. 1-4, Cold Spring HarborLaboratory Press, New York (1998)；如在美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中提出的方法；"细胞生物学：实验室手册(Cell Biology: ALaboratory Handbook)", I-III卷, Cellis, J. E., ed. (1994)；"免疫学现代方法(Current Protocols in Immunology)" I-III卷, Coligan J. E., ed. (1994); Stiteset al. (eds), "基础和临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)" (第8版),Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell和Shiigi (eds), "细胞免疫学的选择方法(Selected Methods in Cellular Immunology)", W. H. Freeman and Co., NewYork (1980)；可获得的免疫分析在专利和科学文献中有广泛的描述，见例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)" Gait, M. J., ed. (1984)；“核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)" Hames, B. D.和Higgins S. J., eds.(1985)；"转录和翻译(Transcription and Translation)" Hames, B. D.和Higgins S.J., eds. (1984)；"动物细胞培养(Animal Cell Culture)" Freshney, R. I., ed.(1986)；"固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)" IRL Press, (1986)；"分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)" Perbal, B., (1984)和"酶学方法(Methods in Enzymology)" Vol. 1-317, Academic Press；"PCR方案：方法和应用指导(PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications)", Academic Press,San Diego, CA (1990)；Marshak et al., "蛋白纯化和表征的策略-实验室课程手册(Strategies for Protein Purification and Characterization - A LaboratoryCourse Manual)" CSHL Press (1996)；所有文献通过引用结合到本文中，如同在本文中全面阐明一样。本文通篇提供其它一般参考。认为其中的程序是本领域熟知的并为读者方便而提供。其中含有的所有信息通过引用结合到本文中。
通用材料和实验程序
宿主非-反应性供体抗-癌、抗第三方CTL的制备
供体小鼠-F1-OT-1转基因小鼠(其是宿主X OT-1 (H2db Balb/c*OT1CD45.1+RAG2-)的后代)的脾细胞，在细胞因子剥夺条件下，针对来自卵清蛋白表达小鼠的照射脾细胞培养6天。随后，利用磁活化细胞分选纯化(MACS, Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)，阳性选择CD8细胞(即CD8表达和/或缺乏CD4和/或CD56表达)。通过FACS测试所得细胞群的纯度，并在无Ag环境中再次针对来自卵清蛋白表达小鼠的照射脾细胞进行培养。每隔一天加入IL-2直到培养结束(第14天)。然后细胞在Ficoll-Paque Plus上分级，洗涤，计数，并准备移植。
F1-OT-1新鲜细胞的准备
淋巴结和脾脏取自F1-OT-1转基因小鼠。F1-OT-1小鼠是宿主X OT-1 (H2db Balb/c*OT1CD45.1+RAG2-)的后代，可用于消除同种异体现象。制备单细胞悬液，然后使用磁活化细胞分选纯化，阳性选择CD8细胞。通过FACS检测得到的F1-OT-1 T-细胞群的纯度。然后细胞作为“新鲜”细胞被注入。
实施例1
为了评价嵌合小鼠中移植的F1-OT1 T-细胞的功能，使用了鼠模型(由本发明人开发)。特别地，使用表达OVA肽和tdTomato标记的B16(H2b)黑素瘤细胞系(B16-OVA-tdTomato)开发该模型。该方法利用OT1 TCR的抗-OVA特异性，以模拟抗原-特异性修饰的TCR，例如用于细胞治疗的那些TCR。为了模拟最小的残留疾病，向同基因C57BL/6小鼠注射少量B16-OVAtdTomato黑素瘤细胞(0.25 x 106)。1天后，对小鼠进行亚致死性照射(6 Gy TBI)，使细胞能够稳态扩增，所述细胞在第二天过继转移：新鲜的F1-OT1 CD8+细胞(H2db Balb/c*OT1CD45.1+RAG2-)或者F1-OT1 CD8+ CTL (H2db Balb/c*OT1CD45.1+RAG2-)。
然后监测肿瘤发展。预期与注射F1-OT1 CD8+新鲜细胞相比，接受F1-OT1 CD8+CTL注射的小鼠中肿瘤生长受到明显抑制。当注射非-OVA表达肿瘤细胞(B16-tdTomato黑素瘤细胞(0.25x 106))时，预期肿瘤生长不会减弱，从而证明抗-肿瘤反应性的特异性。
综上所述，这些结果表明，在非-同基因细胞被用于抗肿瘤治疗的情况下，抗-第三方细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)可用于治疗。
虽然本发明已结合其特定实施方案进行了描述，显然许多选择、修饰和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，打算涵盖所有这样的选择、修饰和变化，其落入所附权利要求书的精神和宽泛范围内。
本说明书中提及的所有的出版物、专利和专利申请通过引用以其全文在此结合到本说明书中，如同各个独立的出版物、专利或专利申请特别地和单独地指明通过引用结合到本文中的程度一样。此外，本申请中的任何参考文献的引用和鉴定不应视为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术获得。在使用章节标题的方面来说，不应将它们视为必然是限制性的。

Claims (55)

1.一种分离的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，所述CTL是耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性，且其中所述CTL不包括中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型，所述CTL被转导以表达包含T细胞受体信号传导模块的细胞表面受体。
2.一种分离的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，所述CTL是耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性，且其中所述CTL不包括中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型，所述CTL被转导以表达嵌合抗原受体(CAR)。
3.一种分离的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，所述CTL是耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性，且其中所述CTL不包括中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型，所述CTL被转导以表达嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含共刺激结构域。
4.一种分离的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，所述CTL是耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性，且其中所述CTL不包括中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型，所述CTL被转导以表达嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含至少两个共刺激结构域。
5.一种产生权利要求1-4的任一项的分离的CTL的方法，该方法包括用编码所述包含T细胞受体信号传导模块的细胞表面受体或所述嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸转导细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，所述CTL是耐受性诱导细胞，并基本上耗竭了同种异体反应性，且其中所述CTL不包括中央记忆T-淋巴细胞(Tcm)表型。
6.权利要求5的方法，其中所述方法离体进行。
7.权利要求5的方法，其中CTL用包含所述多核苷酸的载体转导。
8.权利要求5或7的方法，其中所述多核苷酸编码转基因T细胞受体(tg-TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
9.权利要求1-4的任一项的分离的CTL，或权利要求5-8的任一项的方法，其中作为耐受性诱导细胞并基本上耗竭了同种异体反应性的CTL是一种抗第三方细胞。
10.权利要求1的分离的CTL，或权利要求5的方法，其中所述细胞表面受体包括转基因T细胞受体(tg-TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
11.权利要求2-4或10的任一项的分离的CTL，或权利要求5或10的方法，其中所述CAR包括抗原结合结构域，其为抗体或抗原-结合片段。
12.权利要求11的分离的CTL或方法，其中抗原-结合片段是Fab或scFv。
13.权利要求2-4或10的任一项的分离的CTL，或权利要求5或10的方法，其中所述CAR包含CD3ζ。
14.权利要求2-4或10的任一项的分离的CTL，或权利要求5或10的方法，其中所述CAR包括至少一个选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、Lck、ICOS和DAP10的共刺激结构域。
15.权利要求2-4或10的任一项的分离的CTL，或权利要求5或10的方法，其中所述CAR包含至少两个选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、Lck、ICOS和DAP10的共刺激结构域。
16.权利要求1-4或9-15的任一项的分离的CTL，或权利要求5-15的任一项的方法，其中所述细胞表面受体或所述CAR结合选自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、过敏性抗原和自身免疫性抗原的抗原。
17.权利要求16的分离的CTL或方法，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关。
18.权利要求16的分离的CTL或方法，其中所述肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。
19.权利要求16-18的任一项的分离的CTL或方法，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、Her2、GD2、gp100、p53、癌胚抗原(CEA)、MART-1、端粒酶逆转录酶(TERT)、Claudin-6、受体酪氨酸-蛋白激酶胞外结构域(ErbB2-ECD)、受体酪氨酸-蛋白激酶胞内结构域(ErbB2-ICD)、组蛋白H1.2、组蛋白H4、酪氨酸酶、甲胎蛋白(AFP)、MAGE A3、AIM-2a、AFP、ART-4、CLCA2、Cyp-B、EphA2、hTERT、iCE、FGF-5、G250、GnT-V、HST-2 (FGF-6)、Livin (ML-IAP)、MUC1、MUC2、PRAME、PSMA、P15、RAGE、RU1、RU2、SART-1、SART-3、SART-2、SOX10、存活素、存活素-2Bg、TRG、Neo-PAP、CAMEL和NY-ESO-1。
20.权利要求16的分离的CTL或方法，其中所述病毒抗原是选自以下的病毒的抗原：人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感、巨细胞病毒(CMV)、T-细胞白血病病毒1型(TAX)、丙型肝炎病毒(HCV)、流感病毒、狂犬病病毒、疱疹病毒、乳头状瘤病毒、肝炎病毒、水痘病毒、脑炎病毒、巨细胞病毒、埃博拉病毒、人类亲T-淋巴细胞病毒(HTLV)、风疹病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LCM)、轮状病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、腺病毒-3 (HADV-3)、腺病毒-5 (HADV-5)、腺相关病毒6 (AAV6)、腺相关病毒8 (AAV8)、BK多瘤病毒(BKV)、念珠菌、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、人类疱疹病毒(HHV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
21.权利要求16的分离的CTL或方法，其中所述自身免疫性抗原与选自1型糖尿病、多发性硬化、狼疮、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、腹腔疾病和中风的疾病相关。
22.权利要求1-4或9-15的任一项的分离的CTL，或权利要求5-15的任一项的方法，其中所述CTL被进一步遗传修饰以抑制所述细胞中至少一种内源性免疫检查点基因的表达。
23.权利要求22的分离的CTL或方法，其中所述免疫检查点基因选自PD或CTLA基因。
24.权利要求1-4或9-23的任一项的分离的CTL，或权利要求5-23的任一项的方法，其中所述作为耐受性诱导细胞并基本上耗竭了同种异体反应性的CTL通过将供体的T-淋巴细胞导向一种或多种第三方抗原来产生。
25.权利要求1-4或9-24的任一项的分离的CTL，或权利要求5-24的任一项的方法，其中能够发展成同种异体反应性CTL的T-淋巴细胞的耗竭通过因子的剥夺来实现，所述因子(i)为CTL成熟所需的；和(ii) 由成熟CTL分泌。
26.权利要求25的分离的CTL或方法，其中所述因子的剥夺进行3-10天。
27.权利要求25或26的分离的CTL或方法，其中所述因子是细胞因子。
28.权利要求27的分离的CTL或方法，其中所述细胞因子是IL-2。
29.权利要求1-4或9-24的任一项的分离的CTL，或权利要求5-24的任一项的方法，其中所述作为耐受性诱导细胞并基本上耗竭了同种异体反应性的CTL由包括以下步骤的方法生成：
(a) 将供体的T-淋巴细胞导向被剥夺IL-2的培养物中的一种或多种第三方抗原，以耗竭同种异体反应性CTL；和
(b) 在IL-2的存在下，使步骤(a)的所述CTL与一种或多种第三方抗原接触，以允许所述耐受性诱导抗第三方CTL的富集。
30.权利要求29的分离的CTL或方法，其还包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前耗竭CD4+T细胞和/或CD56+天然杀伤细胞。
31.权利要求29或30的分离的CTL或方法，其还包括在步骤(a)之后和步骤(b)之前选择CD8+T细胞。
32.权利要求1-4或9-24的任一项的分离的CTL，或权利要求5-24的任一项的方法，其中能够发展成同种异体反应性CTL的T-淋巴细胞的耗竭通过亲和标记，接着基于标记的分离来实现。
33.权利要求1-4或9-24的任一项的分离的CTL，或权利要求5-24的任一项的方法，其中能够发展成同种异体反应性CTL的T-淋巴细胞的耗竭通过亲和纯化实现。
34.权利要求1-4或9-33的任一项的分离细胞，或权利要求5-33的任一项的方法，其中所述Tcm表型包括CD3+、CD8+、CD62L+、CD45RA-、CD45RO+识别标记。
35.权利要求1-4或9-34的任一项的分离细胞，或权利要求5-34的任一项的方法，其中所述Tcm表型包括能够在移植后归巢到淋巴结的细胞。
36.权利要求1-4或9-35的任一项的分离的CTL，或权利要求5-35的任一项的方法，其中作为耐受性诱导细胞并基本上耗竭了同种异体反应性的CTL基本上耗竭了CD4+ T细胞。
37.权利要求1-4或9-36的任一项的分离的CTL，或权利要求5-36的任一项的方法，其中作为耐受性诱导细胞并基本上耗竭了同种异体反应性的CTL基本上耗竭了CD56+天然杀伤细胞。
38.权利要求1-4或9-37的任一项的分离的CTL，或权利要求5-37的任一项的方法，其中作为耐受性诱导细胞并基本上耗竭了同种异体反应性的CTL包括CD3+ CD8+表型。
39.一种细胞群，其包含权利要求1-4或9-38的任一项的分离的CTL。
40.一种药物组合物，其包含权利要求39的细胞群和药用活性载体。
41.一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的权利要求39的细胞群，从而治疗所述受试者。
42.治疗有效量的权利要求39的细胞群，其用于治疗有需要的受试者的疾病。
43.权利要求41的方法，或依据权利要求42使用的治疗有效量，其中疾病选自恶性疾病、病毒疾病、细菌疾病、真菌疾病、原生动物疾病、寄生虫疾病、过敏性疾病和自身免疫性疾病。
44.权利要求43的方法或使用的治疗有效量，其中所述恶性疾病是实体瘤或肿瘤转移。
45.权利要求43的方法或使用的治疗有效量，其中所述恶性疾病是血液恶性肿瘤。
46.权利要求45的方法或使用的治疗有效量，其中所述血液恶性肿瘤包括白血病或淋巴瘤。
47.权利要求43-45的任一项的方法或使用的治疗有效量，其中所述恶性疾病选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、黑素瘤、肉瘤、神经母细胞瘤、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、滑膜细胞癌和胰腺癌。
48.权利要求43的方法或使用的治疗有效量，其中所述病毒疾病选自免疫缺陷病毒(HIV)、流感、巨细胞病毒(CMV)、T-细胞白血病病毒1型(TAX)、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
49.权利要求43的方法或使用的治疗有效量，其中所述自身免疫性疾病选自1型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、狼疮、腹腔疾病和中风。
50.权利要求41或43-49的任一项的方法，或权利要求42-49的任一项使用的治疗有效量，其中所述细胞群与受试者为非-同基因的。
51.权利要求41或43-50的任一项的方法，其还包括在亚致死性、致死性或超致死性调节方案下对受试者进行调节，然后进行所述给予。
52.权利要求42-50的任一项使用的治疗有效量，其还包括亚致死性、致死性或超致死性调节方案。
53.权利要求51的方法，或权利要求52使用的治疗有效量，其中所述亚致死性、致死性或超致死性调节选自全身照射(TBI)、身体局部照射、清髓调节、非清髓调节、共刺激阻滞、化疗剂和抗体免疫治疗。
54.权利要求41的方法，其中所述给予通过选自以下的途径进行：气管内、支气管内、肺泡内、静脉内、腹膜内、鼻内、皮下、髓内、鞘内、心室内、心内、肌内、浆膜内、粘膜内、经粘膜、经鼻、直肠和肠。
55.权利要求41或43-54的任一项的方法，或权利要求42-54的任一项使用的治疗有效量，其中所述受试者是人类受试者。
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