CN111643663A - 修饰的t淋巴细胞 - Google Patents

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Abstract

本文提供当细胞死亡多肽被多聚化或二聚化时，引起细胞例如表达细胞死亡多肽的细胞(例如T淋巴细胞)死亡的表达人工细胞死亡多肽的细胞(例如T细胞)。本文还提供所述细胞(例如T淋巴细胞)治疗疾病或癌症的用途。

Description

修饰的T淋巴细胞
本申请是申请日为2014年03月14日、申请号为201480028401.6、名称为“修饰的T淋巴细胞”的发明申请的分案。
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/794,294的优先权，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
1.发明领域
本文的公开内容涉及免疫学领域，更具体地说，涉及T淋巴细胞或其它免疫细胞的修饰。
2.发明背景
T淋巴细胞识别并与包括肿瘤相关或肿瘤特异性抗原在内的特异性抗原相互作用。因为T淋巴细胞能够杀死肿瘤细胞，所以最近25年一直对用T淋巴细胞(抗原特异性T淋巴细胞或经遗传修饰表达一种或多种嵌合抗原受体(CAR；参见例如Eshhar，美国专利号7,741,465；Eshhar，美国专利申请公布号2012/0093842)的T淋巴细胞)靶向肿瘤细胞都十分感兴趣。然而，鉴于T淋巴细胞不仅仅有杀死呈递某种抗原的肿瘤细胞而且还有杀死呈递相同抗原的正常细胞的能力，因此需要将在给予患者后如果脱靶效应证明对患者有害则能够快速杀死所述细胞的安全机制掺入T淋巴细胞中。
虽然描述了杀死T细胞的系统(Straathof等(2005)Blood105(11):4247-4254)，但该系统依赖于特殊且难以进行的蛋白质修饰，使该系统不便于实际应用。因此，本领域存在对相对简单且易于构建的快速杀死治疗性T淋巴细胞的安全系统的需要。本文提供包含这类安全系统的T淋巴细胞。
发明概述
本文提供包含当通过多聚试剂(multimerizing agent)(例如二聚试剂(dimerizing agent))多聚化(例如二聚化)时在表达多肽的细胞(例如T淋巴细胞)中产生凋亡诱导信号，导致细胞死亡(例如通过细胞凋亡)的人工可多聚化的(例如可二聚化的)多肽(本文亦称为“细胞死亡多肽”)的遗传修饰细胞，例如免疫细胞，例如T淋巴细胞，例如人T淋巴细胞。虽然不希望受任何特殊机制或理论的束缚，但是认为当细胞的足够数目的多个细胞死亡多肽多聚化(例如二聚化)时，由此产生的聚集的凋亡诱导信号足以杀死细胞，例如使细胞进行细胞凋亡。
本文提供的细胞死亡多肽可与任何细胞，特别是任何哺乳动物细胞，例如任何人细胞结合使用。例如，所述细胞死亡多肽提供例如用于细胞治疗剂的有用的安全特征。因此，细胞死亡多肽例如对于包含细胞治疗剂(例如表达嵌合抗原受体的CAR T淋巴细胞)的药物产品可能是重要的，因为如果这种快速杀死变成需要的，例如如果给予的细胞在接受它们的患者中引起任何不需要的或有害的作用，或如果不再需要在受试者中存在细胞治疗剂(例如T淋巴细胞)，则细胞死亡多肽能够快速杀死细胞治疗剂(例如T淋巴细胞)。因此，在某些实施方案中，本文提供的细胞死亡多肽可与任何可给予的细胞，例如细胞治疗剂、例如哺乳动物细胞治疗剂、例如人细胞治疗剂联合使用。其中可以使用细胞死亡多肽和多聚试剂或二聚试剂的细胞的非限制性实例包括但不限于自然杀伤(NK)细胞、树突细胞(DC)、胚胎干细胞(例如公开于美国专利号7,468,276、8,057,788和8,202,703的胚胎干细胞，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中)、来自脐带血、胎盘血、外周血、骨髓、牙髓、脂肪组织、骨软组织等的间充质样干细胞；胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、神经嵴干细胞、神经干细胞和分化细胞(例如成纤维细胞等)。细胞死亡多肽和多聚试剂或二聚试剂也可用于肿瘤细胞系，例如用于动物模型实验目的。
通常，细胞死亡多肽是使用可给予的多聚试剂或二聚试剂，例如小分子、多肽(非细胞死亡多肽)例如抗体、寡核苷酸或多糖可多聚化的或可二聚化的。细胞死亡多肽不包含FK506结合蛋白(FKBP)、其功能部分、其修饰部分，且多聚试剂或二聚试剂不是FKBP配体。
第一个方面，本文提供包含含有凋亡诱导结构域的细胞死亡多肽的细胞(例如T淋巴细胞)，其中所述细胞死亡多肽是使用多聚试剂可多聚化的，其中当所述多聚试剂使所述多肽多聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在一个具体的实施方案中，所述多聚试剂是二聚试剂；即，多聚试剂引起细胞死亡多肽二聚化。在另一个具体的实施方案中，当所述二聚试剂使所述多肽二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号。
在某些实施方案中，所述细胞死亡多肽是包含胞外结构域、跨膜结构域和包含所述凋亡诱导结构域的胞内结构域的跨膜多肽。在具体的实施方案中，细胞死亡多肽的凋亡诱导结构域是或包含胱天蛋白酶，例如胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶3，例如人胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶3。
在某些实施方案中，二聚试剂是包含与细胞死亡多肽(例如细胞死亡多肽的胞外结构域)特异性结合的至少两个部位的多肽。在具体的实施方案中，多肽是抗体，例如包含至少两个表位或模拟表位结合部位的抗体。在某些实施方案中，仅抗体的抗原结合结构域用作多聚试剂或二聚试剂。在某些实施方案中，细胞死亡多肽的胞外结构域包含抗体与之特异性结合的至少一个表位或模拟表位。在具体的实施方案中，抗体是包含结合存在于细胞死亡多肽的胞外结构域上的两个不同表位或模拟表位的两个不同表位结合部位或模拟表位结合部位的双特异性抗体。在某些实施方案中，抗体是IgG或IgM抗体。在一个具体的实施方案中，可用作多聚试剂或二聚试剂的抗体是通过美国食品与药物管理局(UnitedStates Food and Drug Administration)批准用于任何用途的抗体。
在一个实施方案中，可用作多聚试剂或二聚试剂的抗体是与CD20表位或模拟表位(例如人CD20表位或模拟表位)特异性结合的抗体，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含抗体与之特异性结余的CD20表位或模拟表位。在某些具体的实施方案中，抗体是利妥昔单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述利妥昔单抗特异性结合的CD20表位或CD20模拟表位。在另一个具体的实施方案中，抗体是托西莫单抗(tositumumab)，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述托西莫单抗特异性结合的CD20表位或CD20模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是替伊莫单抗(ibritumomab)，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述替伊莫单抗特异性结合的CD20表位或CD20模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是奥法本单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述奥法本单抗特异性结合的CD20表位或CD20模拟表位。
在另一个具体的实施方案中，抗体是阿仑珠单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述阿仑珠单抗特异性结合的CD52表位或CD52模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是巴利昔单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述巴利昔单抗特异性结合的CD25表位或CD25模拟表位。在另一个实施方案中，抗体是达克珠单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述达克珠单抗特异性结合的CD25表位或CD25模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是brentuximab，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述brentuximab特异性结合的CD30表位或CD30模拟表位。在另一个实施方案中，抗体是贝利木单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述贝利木单抗特异性结合的B细胞活化因子(BAFF)表位或BAFF模拟表位。在另一个实施方案中，抗体是西妥昔单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述西妥昔单抗特异性结合的表皮生长因子受体(EGFR)表位或EGFR模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是帕尼单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述帕尼单抗特异性结合的表皮生长因子受体(EGFR)表位或EGFR模拟表位。在另一个实施方案中，抗体是依法珠单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述依法珠单抗特异性结合的CD11a的表位或CD11a的模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是伊匹木单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述伊匹木单抗特异性结合的CD152表位或CD152模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是那他珠单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述那他珠单抗特异性结合的α4整联蛋白的表位或α4整联蛋白的模拟表位。在另一个实施方案中，抗体是巴利昔单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述巴利昔单抗特异性结合的CD25表位或CD25模拟表位。
在某些实施方案中，当多聚试剂或二聚试剂与至少两个细胞死亡多肽结合时，发生细胞死亡多肽的二聚化或多聚化，例如发生细胞死亡多肽的二聚化或多聚化。在某些实施方案中，细胞死亡多肽的胞外结构域是或包含受体或其配体结合部分。在一个具体的实施方案中，多聚试剂或二聚试剂是或包含所述受体的至少两个配体或其配体结合部分。在另一个具体的实施方案中，所述多聚试剂或二聚试剂与两个细胞死亡多肽上的所述受体或其所述配体结合部分结合，所述多肽被多聚化或二聚化，例如所述多肽的胞内结构域被多聚化或二聚化。在具体的实施方案中，细胞死亡多肽包含含有胱天蛋白酶结构域的胞内结构域，并发生胱天蛋白酶结构域的多聚化或二聚化。在具体的实施方案中，所述多聚化或二聚化，例如胞内结构域的多聚化或二聚化，例如胱天蛋白酶结构域的多聚化或二聚化，在所述细胞(例如T淋巴细胞)中引发凋亡诱导信号。
在具体的实施方案中，当抗体与至少两个细胞死亡多肽的表位或模拟表位特异性结合时，发生细胞死亡多肽的二聚化，例如发生细胞死亡多肽的胞内结构域的二聚化。在具体的实施方案中，细胞死亡多肽包含含有胱天蛋白酶结构域的胞内结构域，并发生胱天蛋白酶结构域的二聚化。在具体的实施方案中，所述二聚化，例如胞内结构域的二聚化，例如胱天蛋白酶结构域的二聚化，在所述细胞(例如T淋巴细胞)中引发凋亡诱导信号。
在细胞(例如T淋巴细胞)的某些其它实施方案中，细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含受体的配体。在一个具体的实施方案中，所述多聚试剂或二聚试剂包含与所述配体结合的至少两个受体或其配体结合部分。在一个具体的实施方案中，当所述多聚试剂或二聚试剂与至少两个细胞死亡多肽上的所述受体或其所述配体结合部分结合时，所述多肽被多聚化或二聚化。在一个具体的实施方案中，当细胞死亡多肽被多聚化或二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号。
在某些其它的实施方案中，细胞死亡多肽的胞外结构域包含人工寡核苷酸序列。例如，在具体的实施方案中，修饰细胞(例如T淋巴细胞)包含细胞死亡多肽，所述细胞死亡多肽包含含有人工寡核苷酸序列的胞外结构域。在一个具体的实施方案中，多聚试剂或二聚试剂是或包含含有任选通过接头连接的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的至少一个多聚寡核苷酸或二聚寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸与所述人工寡核苷酸序列互补。在某些具体的实施方案中，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸具有相同序列。在具体的实施方案中，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸以头-头或尾-尾构象连接。在具体的实施方案中，当所述多聚试剂或二聚试剂的所述多聚寡核苷酸或二聚寡核苷酸与两个所述细胞死亡多肽的人工寡核苷酸序列杂交时，细胞死亡多肽被多聚化或二聚化。在另一个具体的实施方案中，当细胞死亡多肽被多聚化或二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在具体的实施方案中，细胞死亡多肽包含胞内胱天蛋白酶结构域，且当胞内胱天蛋白酶结构域被多聚化或二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号。
在细胞(例如T淋巴细胞)的某些其它实施方案中，所述多聚试剂或二聚试剂是包含通过一个或多个接头连接的两个或更多个结合结构域的人工多肽。
在一个具体的实施方案中，本文提供包含细胞死亡多肽的细胞(例如T淋巴细胞)，所述细胞死亡多肽含有包含表位的胞外结构域、跨膜结构域和包含胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶9)或其功能部分的胞内结构域。在另一个具体的实施方案中，本文提供包含人工多肽的细胞(例如T淋巴细胞)，所述人工多肽含有包含受体或其配体结合部分的胞外结构域和包含胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶9)或其功能部分的胞内结构域。在另一个具体的实施方案中，本文提供包含人工多肽的细胞(例如T淋巴细胞)，所述人工多肽含有包含配体或其受体结合部分的胞外结构域(其中所述配体结合受体或其配体结合部分)和包含胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶9)或其功能部分的胞内结构域。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
另一方面，本文提供含有包含以下的细胞的细胞(例如T淋巴细胞)安全系统：(a)细胞死亡多肽，其含有包含表位的胞外结构域、跨膜结构域和包含胱天蛋白酶或其功能部分的胞内结构域；和(b)二聚试剂，其包含当与两个所述细胞死亡多肽接触时使所述多肽二聚化的两个表位结合结构域或模拟表位结合结构域，其中所述胱天蛋白酶是胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9，例如人胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9，且其中所述二聚化在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在另一个实施方案中，本文提供细胞(例如T淋巴细胞)安全系统，其包含：(a)包含人工多肽的细胞，所述人工多肽含有包含受体或其配体结合部分的胞外结构域和包含胱天蛋白酶或其功能部分的胞内结构域；和(b)二聚试剂，其包含与所述受体或其配体结合部分结合的两个配体，其中当所述二聚试剂与两个所述多肽接触时，所述二聚试剂使所述多肽二聚化，其中所述胱天蛋白酶是胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9，例如人胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9，且其中所述二聚化在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在另一个实施方案中，本文提供细胞(例如T淋巴细胞)安全系统，其包含：(a)包含人工细胞死亡多肽的细胞，所述人工细胞死亡多肽含有包含配体或其受体结合部分的胞外结构域和包含胱天蛋白酶或其功能部分的胞内结构域；和(b)二聚试剂，其包含与所述配体或其受体结合部分结合的两个受体或其配体结合部分，其中当所述二聚试剂与两个所述多肽接触时，所述二聚试剂使所述多肽二聚化，其中所述胱天蛋白酶是胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9，例如人胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9，且其中所述二聚化在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在本文任何实施方案的具体实施方案中，当在所述细胞(例如T淋巴细胞)中产生多个的所述细胞凋亡诱导信号时，所述信号足以杀死所述细胞。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
另一方面，本文还提供杀死细胞(例如T淋巴细胞)的方法，其中所述细胞包含多个各自包含凋亡诱导结构域的人工细胞死亡多肽，其中细胞死亡多肽是使用不是FK506结合蛋白(FKBP)配体的多聚试剂或二聚试剂可多聚化的或可二聚化的，且其中当所述多聚试剂或二聚试剂使所述多肽多聚化或二聚化时，在所述T淋巴细胞中产生凋亡诱导信号，所述方法包括使所述细胞与足够用于所述多个细胞死亡多肽多聚化或二聚化并产生足以杀死所述细胞的聚集的凋亡诱导信号的一定量的所述多聚试剂或二聚试剂接触。在某些实施方案中，细胞死亡多肽是包含胞外结构域、跨膜结构域和包含所述凋亡诱导结构域的胞内结构域的跨膜多肽。在具体的实施方案中，所述多肽的所述凋亡诱导结构域是或包含胱天蛋白酶，例如胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9，例如人胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶3。在具体的实施方案中，多聚试剂或二聚试剂是蛋白质、寡核苷酸或多糖。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在某些实施方案中，多聚试剂或二聚试剂是蛋白质、寡核苷酸或多糖。在具体的实施方案中，多聚试剂或二聚试剂是包含与细胞死亡多肽(例如细胞死亡多肽的胞外结构域)特异性结合的至少两个部位的多肽。在具体的实施方案中，多肽是抗体，例如包含至少两个表位结合部位或至少两个模拟表位结合部位的抗体。在某些实施方案中，细胞死亡多肽的胞外结构域包含抗体与之特异性结合的至少一个表位或模拟表位。在具体的实施方案中，抗体是包含结合存在于细胞死亡多肽的胞外结构域上的两个不同表位或模拟表位的两个不同表位结合部位或模拟表位结合部位的双特异性抗体。在某些实施方案中，抗体是IgG或IgM抗体。在一个具体的实施方案中，可用作多聚试剂或二聚试剂的抗体是通过美国食品与药物管理局批准用于任何用途的抗体。
在一个具体的实施方案中，当多聚试剂或二聚试剂是抗体时，所述抗体是与CD20表位或模拟表位(例如人CD20表位或模拟表位)特异性结合的抗体，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含所述抗体与之特异性结合的CD20表位或模拟表位。在某些具体的实施方案中，当多聚试剂或二聚试剂是抗体时，所述抗体是利妥昔单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含与所述利妥昔单抗结合的CD20表位或CD20模拟表位；所述抗体是托西莫单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含与所述托西莫单抗结合的CD20表位或CD20模拟表位；所述抗体是替伊莫单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述替伊莫单抗的CD20表位或CD20模拟表位；所述抗体是奥法本单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述奥法本单抗的CD20表位或CD20模拟表位；所述抗体是阿仑珠单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含与所述阿仑珠单抗结合的CD52表位或CD52模拟表位；所述抗体是巴利昔单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述巴利昔单抗的CD25表位或CD25模拟表位；所述抗体是达克珠单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述达克珠单抗的CD25表位或CD25模拟表位；所述抗体是brentuximab，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述brentuximab的CD30表位或CD30模拟表位；所述抗体是贝利木单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述贝利木单抗的B细胞活化因子(BAFF)表位或BAFF模拟表位；所述抗体是西妥昔单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述西妥昔单抗的表皮生长因子受体(EGFR)表位或EGFR模拟表位；所述抗体是帕尼单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述帕尼单抗的表皮生长因子受体(EGFR)表位或EGFR模拟表位；所述抗体是依法珠单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含与所述依法珠单抗结合的CD11a的表位或CD11a的模拟表位；所述抗体是伊匹木单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述伊匹木单抗的CD152表位或CD152模拟表位；所述抗体是那他珠单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述那他珠单抗的α4整联蛋白的表位或α4整联蛋白的模拟表位；或所述抗体是巴利昔单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述巴利昔单抗的CD25表位或CD25模拟表位。在上述实施方案任一个的具体实例方案中，当所述抗体与至少两个所述细胞死亡多肽的所述表位或模拟表位结合时，所述多肽的胞内结构域和/或所述胞内结构域中的相应的胱天蛋白酶多聚化或二聚化。在具体的实施方案中，当所述抗体与至少两个细胞死亡多肽的表位或模拟表位特异性结合时，发生细胞死亡多肽的二聚化，例如发生细胞死亡多肽的胞内结构域的二聚化。在具体的实施方案中，细胞死亡多肽包含含有胱天蛋白酶结构域的胞内结构域，并发生胱天蛋白酶结构域的二聚化。在具体的实施方案中，所述二聚化，例如胞内结构域的二聚化，例如胱天蛋白酶结构域的二聚化，在所述细胞(例如T淋巴细胞)中引发凋亡诱导信号。
在某些具体的实施方案中，细胞死亡多肽的所述胞外结构域是或包含受体或其配体结合部分。在所述实施方案中，所述多聚试剂或二聚试剂包含所述受体的至少两个配体或其配体结合部分。在具体的实施方案中，当所述多聚试剂或二聚试剂与至少两个所述细胞死亡多肽的所述受体或其所述配体结合部分结合时，所述多肽被多聚化或二聚化。在具体的实施方案中，所述多肽的所述多聚化或二聚化在所述细胞(例如T淋巴细胞)中引发凋亡诱导信号。
在某些具体的实施方案中，细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含受体的配体。在所述实施方案中，所述多聚试剂或二聚试剂包含与所述配体结合的至少两个受体或其配体结合部分。在具体的实施方案中，当所述多聚试剂或二聚试剂与两个或更多个所述多肽上的所述受体或其所述配体结合部分结合时，所述多肽的胞内结构域和/或所述多肽的胱天蛋白酶结构域被多聚化或二聚化。在具体的实施方案中，所述胞内结构域和/或胱天蛋白酶结构域的所述多聚化或二聚化在所述细胞(例如T淋巴细胞)中产生凋亡诱导信号。
在某些实施方案中，所述细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含人工寡核苷酸序列。例如，在具体的实施方案中，所述细胞死亡多肽含有包含人工寡核苷酸序列的胞外结构域。在一个具体的实施方案中，多聚试剂或二聚试剂是或包含含有任选通过接头连接的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的至少一个多聚寡核苷酸或二聚寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸与所述人工寡核苷酸序列互补。在某些具体的实施方案中，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸具有相同序列。在具体的实施方案中，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸以头-头或尾-尾构象连接。在具体的实施方案中，当所述多聚试剂或二聚试剂的所述多聚寡核苷酸或二聚寡核苷酸与两个所述细胞死亡多肽的人工寡核苷酸序列杂交时，细胞死亡多肽被多聚化或二聚化。在另一个具体的实施方案中，当细胞死亡多肽被多聚化或二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在具体的实施方案中，细胞死亡多肽包含胞内胱天蛋白酶结构域，且当胞内胱天蛋白酶结构域被多聚化或二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在本文任何实施方案的具体实施方案中，当在所述T淋巴细胞中产生多个所述凋亡诱导信号时，所述信号足以杀死所述细胞(例如T淋巴细胞)。
在其它实施方案中，所述多聚试剂或二聚试剂是包含通过一个或多个接头连接的两个或更多个结合结构域的人工多肽。
在一个具体的实施方案中，本文提供杀死细胞(例如T淋巴细胞)的方法，其中所述细胞包含各包含胱天蛋白酶或其功能部分的多个人工细胞死亡多肽，其中所述胱天蛋白酶是胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9)，且其中所述细胞死亡多肽可使用抗体二聚化，且其中当所述抗体使所述多肽二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号，所述方法包括使所述细胞与足以使足够多的所述多个人工多肽二聚化并产生足以杀死所述细胞的聚集的凋亡诱导信号的一定量的所述抗体接触。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在另一个具体的实施方案中，本文提供杀死细胞(例如T淋巴细胞)的方法，其中所述细胞包含各包含胱天蛋白酶或其功能部分的多个人工细胞死亡多肽，其中所述胱天蛋白酶是胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9)，且其中所述多个人工多肽各自包含含有结合配体的受体或其配体结合部分的胞外结构域，其中所述多肽可使用包含两个所述配体的二聚试剂二聚化，且其中当所述二聚试剂使两个所述多肽二聚化时，在细胞中产生凋亡诱导信号，所述方法包括使所述细胞与足以使足够多的所述多个人工细胞死亡多肽二聚化并产生足以杀死所述细胞的聚集的凋亡诱导信号的一定量的所述二聚试剂接触。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在另一个具体的实施方案中，本文提供杀死细胞(例如T淋巴细胞)的方法，其中所述细胞包含各包含胱天蛋白酶或其功能部分的多个人工细胞死亡多肽，其中所述胱天蛋白酶是胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9)，且其中所述多个人工多肽各自包含胞外结构域，所述胞外结构域包含结合受体或其配体结合部分的配体或其受体结合部分，其中所述多肽可使用包含两个所述受体或其配体结合部分的二聚试剂二聚化，且其中当所述二聚试剂使两个所述多肽二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号，所述方法包括使所述细胞与足以使足够多的所述多个人工多肽二聚化并产生足以杀死所述细胞的聚集的凋亡诱导信号的一定量的所述二聚试剂接触。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在另一个具体的实施方案中，本文提供杀死细胞(例如T淋巴细胞)的方法，其中所述细胞包含各包含胱天蛋白酶或其功能部分的多个人工细胞死亡多肽，其中所述胱天蛋白酶是胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9)，且其中所述多个人工多肽各自含有包含人工寡核苷酸的胞外结构域，其中所述多个多肽可使用包含含有第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的寡核苷酸的二聚试剂二聚化，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸具有相同的核苷酸序列，且其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸任选通过接头连接，且其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸与所述多肽的所述胞外结构域中的所述人工寡核苷酸互补，且其中当所述二聚试剂使两个所述细胞死亡多肽二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号，所述方法包括使所述细胞与足以使足够多的所述多个人工多肽二聚化并产生足以杀死所述细胞的聚集的凋亡诱导信号的一定量的所述二聚试剂接触。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在某些实施方案中，按照本文所述方法杀死的细胞(例如T淋巴细胞)包含起使细胞靶向特定抗原(例如肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原)的作用的多肽，其中所述多肽当与所述抗原结合时，引起细胞杀死呈递所述抗原的细胞，例如嵌合抗原受体(CAR)。包含CAR的T淋巴细胞在本文称为CAR-T淋巴细胞。嵌合抗原受体通常包含(i)淋巴细胞表面上表达的并引发所述淋巴细胞的活化和/或增殖的内源蛋白质的胞内结构域(例如胞质结构域)，(ii)跨膜结构域，和(iii)与目标抗原(例如肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原)结合的胞外结构域。CAR-T淋巴细胞通常还包含一个或多个协同刺激结构域(co-stimulatorydomain)。在某些实施方案中，CAR-T淋巴细胞包含至少两个CAR多肽，其至少一种向CAR-T淋巴细胞提供一级刺激信号，且至少一种向CAR-T淋巴细胞提供协同刺激信号。下面提供包含细胞死亡多肽和包含CAR的具体实施方案的CAR-T淋巴细胞。
另一方面，本文提供治疗患有疾病或病症的个体的方法，其中疾病或病症的特征在于或可表征为表达抗原的细胞，所述方法包括将本文所述表达多肽的细胞(例如T淋巴细胞)给予个体。在某些实施方案中，当将本文所述修饰细胞(例如修饰的T淋巴细胞)给予有需要的受试者时，选择所选的多聚试剂和细胞死亡多肽的组合，使得它们与其中给予细胞(例如T淋巴细胞)的患者群(或亚群)相容。仅举例来说，如果所选多聚试剂是抗体利妥昔单抗，则在某些实施方案中，患者群是患有B细胞癌(例如B细胞淋巴瘤)的个体。
3.发明详述
3.1.包含细胞死亡多肽的细胞
本文提供包含当通过多聚试剂(例如二聚试剂)多聚化(例如二聚化)时，在表达多肽的细胞(例如T淋巴细胞)中产生凋亡诱导信号，导致细胞死亡(例如通过细胞凋亡)的人工可多聚化(例如可二聚化)的多肽(本文亦称为“细胞死亡多肽”)的遗传修饰细胞，例如免疫细胞，例如T淋巴细胞，例如人T淋巴细胞。虽然不希望受任何特殊机制或理论的束缚，但是认为当细胞的足够数目的多个细胞死亡多肽多聚化(例如二聚化)时，由此产生的聚集的凋亡诱导信号足以杀死细胞，例如使细胞进行细胞凋亡。在一个具体的实施方案中，本文提供的遗传修饰细胞是T淋巴细胞。
在某些实施方案中，通过可给予的多聚试剂或二聚试剂，例如蛋白质(例如抗体、受体或其配体结合部分、配体或其受体结合部分)、寡核苷酸等，可使细胞死亡多肽多聚化或二聚化。在某些实施方案中，多聚试剂不是小分子。多聚试剂或二聚试剂可在体外或体内用来杀死包含细胞死亡多肽的T淋巴细胞。
因此，第一个方面，本文提供包含含有凋亡诱导结构域的人工多肽(细胞死亡多肽)的T淋巴细胞，其中所述细胞死亡多肽是使用多聚试剂可多聚化的，其中所述多聚试剂不是FK506结合蛋白(FKBP)配体，且其中当所述多聚试剂使所述多肽多聚化时，在所述T淋巴细胞中产生凋亡诱导信号。在一个具体的实施方案中，所述多聚试剂是二聚试剂；即多聚试剂引起细胞死亡多肽二聚化。在另一个具体的实施方案中，当所述二聚试剂使所述细胞死亡多肽二聚化时，在所述T淋巴细胞中产生凋亡诱导信号。细胞死亡多肽不包含FK506结合蛋白、其功能部分或其修饰形式。
在某些实施方案中，所述细胞死亡多肽是包含胞外结构域、跨膜结构域和包含所述凋亡诱导结构域的胞内结构域的跨膜多肽。在某些实施方案中，细胞死亡多肽的凋亡诱导结构域可以是例如当二聚化时在细胞中引发凋亡诱导信号的任何蛋白质或其部分。在某些实施方案中，凋亡诱导结构域是同二聚化的任何胱天蛋白酶，优选是或包含胱天蛋白酶，例如胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶3(例如人胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶3)。人胱天蛋白酶，包括人胱天蛋白酶9、人胱天蛋白酶8和人胱天蛋白酶3的氨基酸序列是本领域众所周知的。例如人胱天蛋白酶3被指定为NCBI Gene ID:836；人胱天蛋白酶8被指定为NCBI Gene ID:841；人胱天蛋白酶9被指定为NCBI Gene ID:842。在某些实施方案中，是或包含胱天蛋白酶结构域的胞内结构域和包含表位或模拟表位的胞外结构域被可作为跨膜结构域起作用的至少一部分的CD8α柄或CD8β柄连接。
在某些实施方案中，二聚试剂是包含与细胞死亡多肽(例如细胞死亡多肽的胞外结构域)特异性结合的至少两个部位的多肽。在具体的实施方案中，多肽是抗体，例如包含至少两个表位结合部位或模拟表位结合部位的抗体。在某些实施方案中，仅抗体的抗原结合结构域用作多聚试剂或二聚试剂。在某些实施方案中，细胞死亡多肽的胞外结构域包含抗体与之特异性结合的至少一个表位或模拟表位。在具体的实施方案中，抗体是包含结合存在于细胞死亡多肽的胞外结构域上的两个不同表位或模拟表位的两个不同表位结合部位或模拟表位结合部位的双特异性抗体。在某些实施方案中，抗体是IgG或IgM抗体。还可使用包含任选通过一个或多个接头连接的来自抗体的表位结合结构域或模拟表位结合结构域的人工抗体构建体。
在一个具体的实施方案中，可用作多聚试剂或二聚试剂的所述抗体已获政府管理机构例如美国食品和药物管理局(United States Food and Drug Administration)批准用于任何用途。这确保了例如抗体当用作二聚试剂或多聚试剂时，具有已知的毒性和患者安全性特征。抗体和相关靶标的任何组合可用于本文提供的T淋巴细胞。在一个实施方案中，可用作多聚试剂或二聚试剂的抗体是与CD20表位或模拟表位(例如人CD20表位或模拟表位)特异性结合的抗体，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含抗体与之特异性结余的CD20表位或模拟表位。在某些具体的实施方案中，抗体是利妥昔单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述利妥昔单抗特异性结合的CD20表位或CD20模拟表位。在另一个具体的实施方案中，抗体是托西莫单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述托西莫单抗特异性结合的CD20表位或CD20模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是替伊莫单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述替伊莫单抗特异性结合的CD20表位或CD20模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是奥法本单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述奥法本单抗特异性结合的CD20表位或CD20模拟表位。
在另一个具体的实施方案中，抗体是阿仑珠单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述阿仑珠单抗特异性结合的CD52表位或CD52模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是巴利昔单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述巴利昔单抗特异性结合的CD25表位或CD25模拟表位。在另一个实施方案中，抗体是达克珠单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述达克珠单抗特异性结合的CD25表位或CD25模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是brentuximab，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述brentuximab特异性结合的CD30表位或CD30模拟表位。在另一个实施方案中，抗体是贝利木单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述贝利木单抗特异性结合的B细胞活化因子(BAFF)表位或BAFF模拟表位。在另一个实施方案中，抗体是西妥昔单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述西妥昔单抗特异性结合的表皮生长因子受体(EGFR)表位或EGFR模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是帕尼单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述帕尼单抗特异性结合的表皮生长因子受体(EGFR)表位或EGFR模拟表位。在另一个实施方案中，抗体是依法珠单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述依法珠单抗特异性结合的CD11a的表位或CD11a的模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是伊匹木单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述伊匹木单抗特异性结合的CD152表位或CD152模拟表位。在又一个实施方案中，抗体是那他珠单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述那他珠单抗特异性结合的α4整联蛋白的表位或α4整联蛋白的模拟表位。在另一个实施方案中，抗体是巴利昔单抗，且细胞死亡多肽的胞外结构域包含与所述巴利昔单抗特异性结合的CD25表位或CD25模拟表位。
配体和受体可用于构建本文提供的细胞死亡多肽，且包含受体的相应配体的多聚试剂或二聚试剂可用于使多肽多聚化或二聚化。在某些实施方案中，当多聚试剂或二聚试剂与至少两个细胞死亡多肽结合时，发生细胞死亡多肽的二聚化或多聚化，例如，发生细胞死亡多肽的二聚化或多聚化。在某些实施方案中，细胞死亡多肽的胞外结构域是或包含受体或其配体结合部分。在一个具体的实施方案中，多聚试剂或二聚试剂是或包含所述受体的至少两个配体或其配体结合部分。在另一个具体的实施方案中，所述多聚试剂或二聚试剂与两个细胞死亡多肽上的所述受体或其所述配体结合部分结合，所述多肽被多聚化或二聚化，例如所述多肽的胞内结构域被多聚化或二聚化。在具体的实施方案中，细胞死亡多肽包含含有胱天蛋白酶结构域的胞内结构域，并发生胱天蛋白酶结构域的多聚化或二聚化。在具体的实施方案中，所述多聚化或二聚化，例如胞内结构域的多聚化或二聚化，例如胱天蛋白酶结构域的多聚化或二聚化，在所述细胞(例如T淋巴细胞)中引发凋亡诱导信号。
在具体的实施方案中，当抗体与至少两个细胞死亡多肽的表位或模拟表位特异性结合时，发生细胞死亡多肽的二聚化，例如发生细胞死亡多肽的胞内结构域的二聚化。在具体的实施方案中，细胞死亡多肽包含含有胱天蛋白酶结构域的胞内结构域，并发生胱天蛋白酶结构域的二聚化。在具体的实施方案中，所述二聚化，例如胞内结构域的二聚化，例如胱天蛋白酶结构域的二聚化，在所述细胞(例如T淋巴细胞)中引发凋亡诱导信号。
在细胞(例如T淋巴细胞)的某些其它实施方案中，细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含受体的配体。在一个具体的实施方案中，所述多聚试剂或二聚试剂包含与所述配体结合的至少两个受体或其配体结合部分。在一个具体的实施方案中，当所述多聚试剂或二聚试剂与至少两个细胞死亡多肽上的所述受体或其所述配体结合部分结合时，所述多肽被多聚化或二聚化。在一个具体的实施方案中，当细胞死亡多肽被多聚化或二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在某些其它的实施方案中，细胞死亡多肽的胞外结构域包含人工寡核苷酸序列。例如，在具体的实施方案中，修饰细胞(例如T淋巴细胞)包含细胞死亡多肽，所述细胞死亡多肽包含含有人工寡核苷酸序列的胞外结构域。在一个具体的实施方案中，多聚试剂或二聚试剂是或包含含有任选通过接头连接的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的至少一个多聚寡核苷酸或二聚寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸与所述人工寡核苷酸序列互补。在某些具体的实施方案中，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸具有相同序列。在具体的实施方案中，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸以头-头或尾-尾构象连接。在具体的实施方案中，当所述多聚试剂或二聚试剂的所述多聚寡核苷酸或二聚寡核苷酸与两个所述细胞死亡多肽的人工寡核苷酸序列杂交时，细胞死亡多肽被多聚化或二聚化。在另一个具体的实施方案中，当细胞死亡多肽被多聚化或二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在具体的实施方案中，细胞死亡多肽包含胞内胱天蛋白酶结构域，且当胞内胱天蛋白酶结构域被多聚化或二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在T淋巴细胞的某些其它实施方案中，多聚试剂或二聚试剂是包含通过一个或多个接头连接的两个或更多个结合结构域的人工多肽。
在一个具体的实施方案中，本文提供包含细胞死亡多肽的细胞(例如T淋巴细胞)，所述细胞死亡多肽含有包含表位的胞外结构域、跨膜结构域和包含胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶9)或其功能部分的胞内结构域。在另一个具体的实施方案中，本文提供包含人工多肽的细胞(例如T淋巴细胞)，所述人工多肽含有包含受体或其配体结合部分的胞外结构域和包含胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶9)或其功能部分的胞内结构域。在另一个具体的实施方案中，本文提供包含人工多肽的细胞(例如T淋巴细胞)，所述人工多肽含有包含配体或其受体结合部分的胞外结构域(其中所述配体结合受体或其配体结合部分)和包含胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶9)或其功能部分的胞内结构域。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在本文实施方案的任一个中，其中修饰细胞是T淋巴细胞，T淋巴细胞可以是CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞。T淋巴细胞可以是没有遗传修饰的对特定抗原(例如肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原、病毒抗原等)有特异性的。T淋巴细胞可经遗传修饰以表达使T淋巴细胞靶向特异性抗原的一种或多个多肽，例如嵌合抗原受体。
3.2.杀死包含细胞死亡多肽的细胞的方法
本文提供的细胞死亡多肽可用于杀死包含细胞死亡多肽的细胞(例如T淋巴细胞)的方法。本文提供的细胞死亡多肽可与任何细胞、特别是任何哺乳动物细胞、例如任何人细胞联用。所述细胞死亡多肽提供例如用于细胞治疗剂的有用的安全特征。因此，细胞死亡多肽例如对于包含细胞治疗剂(例如表达嵌合抗原受体的CAR T淋巴细胞)的药物产品可能是重要的，因为如果这种快速杀死成为需要的，例如如果给予细胞在接受它们的患者中引起任何不需要的或有害的作用，或如果不再需要在受试者中存在细胞治疗剂(例如T淋巴细胞)，则细胞死亡多肽能够快速杀死细胞治疗剂(例如T淋巴细胞)。因此，在某些实施方案中，本文提供的细胞死亡多肽可与任何可给予的细胞，例如细胞治疗剂、例如哺乳动物细胞治疗剂、例如人细胞治疗剂联用。其中可以使用细胞死亡多肽和多聚试剂或二聚试剂的细胞的非限制性实例包括但不限于自然杀伤(NK)细胞、树突细胞(DC)、胚胎干细胞(例如美国专利号7,468,276、8,057,788和8,202,703中公开的胚胎干细胞，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中)、来自脐带血、胎盘血、外周血、骨髓、牙髓、脂肪组织、骨软组织等的间充质样干细胞；胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、神经嵴干细胞、神经干细胞和分化细胞(例如成纤维细胞等)。细胞死亡多肽和多聚试剂或二聚试剂也可用于肿瘤细胞系，例如用于动物模型实验目的。
通过本文所述细胞死亡多肽杀死细胞可发生在体内，例如在已给予细胞(例如T淋巴细胞)的个体中，或体外，例如在实验室中，例如作为质量控制实验的一部分。在一个实施方案中，本文提供杀死细胞(例如T淋巴细胞)的方法，其中所述细胞包含多个各自包含凋亡诱导结构域的人工细胞死亡多肽，其中所述多肽是使用不是FK506结合蛋白(FKBP)配体的多聚试剂或二聚试剂可多聚化的或可二聚化的，且其中当所述多聚试剂或二聚试剂使所述多肽多聚化或二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号，所述方法包括使所述细胞与足以使所述多个人工多肽二聚化并产生足以杀死所述细胞的聚集的凋亡诱导信号的一定量的所述多聚试剂或二聚试剂接触。在某些实施方案中，细胞死亡多肽是包含胞外结构域、跨膜结构域和包含所述凋亡诱导结构域的胞内结构域的跨膜多肽。在某些实施方案中，是或包含胱天蛋白酶结构域的胞内结构域和包含表位或模拟表位的胞外结构域被可作为跨膜结构域起作用的至少一部分的CD8α柄或CD8β柄连接。在所述方法的某些具体的实施方案中，所述多肽的凋亡诱导结构域是或包含胱天蛋白酶，例如胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶3)。
用于所述方法的多聚试剂或二聚试剂可以是可使细胞死亡多肽(例如蛋白质)、寡核苷酸或多糖二聚化或多聚化的非小分子的任何化合物。在某些实施方案中，多聚试剂或二聚试剂是抗体，例如包含至少两个表位结合部位或至少两个模拟表位结合部位的抗体。在某些实施方案中，仅抗体的抗原结合结构域用作多聚试剂或二聚试剂。在所述实施方案中，细胞死亡多肽的胞外结构域包含抗体与之结合的表位或模拟表位。抗体可以是任何价的抗体，但优选为IgG或IgM抗体。
在一个具体的实施方案中，可用作多聚试剂或二聚试剂的所述抗体已获政府管理机构例如美国食品和药物管理局批准用于任何用途。抗体和相关靶标的任何组合可用于杀死本文提供的T淋巴细胞的方法。
在一个具体的实施方案中，当多聚试剂或二聚试剂是抗体时，所述抗体是与CD20表位或模拟表位(例如人CD20表位或模拟表位)特异性结合的抗体，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含所述抗体与之特异性结合的CD20表位或模拟表位。在某些具体的实施方案中，当多聚试剂或二聚试剂是抗体时，所述抗体是利妥昔单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含与所述利妥昔单抗结合的CD20表位或CD20模拟表位；所述抗体是托西莫单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含与所述托西莫单抗结合的CD20表位或CD20模拟表位；所述抗体是替伊莫单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述替伊莫单抗的CD20表位或CD20模拟表位；所述抗体是奥法本单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述奥法本单抗的CD20表位或CD20模拟表位；或所述抗体是阿仑珠单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含与所述阿仑珠单抗结合的CD52表位或CD52模拟表位。
在某些具体的实施方案中，当多聚试剂或二聚试剂是抗体时，所述抗体是巴利昔单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述巴利昔单抗的CD25表位或CD25模拟表位；所述抗体是达克珠单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述达克珠单抗的CD25表位或CD25模拟表位；所述抗体是brentuximab，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述brentuximab的CD30表位或CD30模拟表位；所述抗体是贝利木单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述贝利木单抗的B细胞活化因子(BAFF)表位或BAFF模拟表位；所述抗体是西妥昔单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述西妥昔单抗的表皮生长因子受体(EGFR)表位或EGFR模拟表位；所述抗体是帕尼单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述帕尼单抗的表皮生长因子受体(EGFR)表位或EGFR模拟表位；所述抗体是依法珠单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含与所述依法珠单抗结合的CD11a的表位或CD11a的模拟表位；所述抗体是伊匹木单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述伊匹木单抗的CD152表位或CD152模拟表位；所述抗体是那他珠单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述那他珠单抗的α4整联蛋白的表位或α4整联蛋白的模拟表位；或所述抗体是巴利昔单抗，且细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含结合所述巴利昔单抗的CD25表位或CD25模拟表位。
在上述实施方案任一个的具体实例方案中，当所述抗体与至少两个所述细胞死亡多肽的所述表位或模拟表位结合时，所述多肽的胞内结构域和/或所述胞内结构域中的相应的胱天蛋白酶多聚化或二聚化。在具体的实施方案中，当所述抗体与至少两个细胞死亡多肽的表位或模拟表位特异性结合时，发生细胞死亡多肽的二聚化，例如发生细胞死亡多肽的胞内结构域的二聚化。在具体的实施方案中，细胞死亡多肽包含含有胱天蛋白酶结构域的胞内结构域，并发生胱天蛋白酶结构域的二聚化。在具体的实施方案中，所述二聚化，例如胞内结构域的二聚化，例如胱天蛋白酶结构域的二聚化，在所述细胞(例如T淋巴细胞)中引发凋亡诱导信号。
虽无意受理论束缚，但是当抗体与至少两个所述多肽上的各自的表位或模拟表位结合时，所述多肽的胞内结构域多聚化，例如二聚化，届时所述胞内结构域中相应的胱天蛋白酶二聚化。所述多肽的二聚化在所述T淋巴细胞中引发凋亡诱导信号。
同上，受体及其相应的配体可用来使细胞死亡多肽多聚化或二聚化，从而实现杀死包含所述多肽的细胞(例如T淋巴细胞)。例如，细胞死亡多肽的所述胞外结构域是或包含受体或其配体结合部分。在所述实施方案中，多聚试剂或二聚试剂包含所述受体的至少两个配体或其配体结合部分，使得当多聚试剂或二聚试剂与至少两个所述多肽的所述受体或其所述配体结合部分结合时能够使细胞死亡多肽多聚化或二聚化，所述多肽被二聚化。在优选的实施方案中，所述多肽的二聚化在所述细胞中引发凋亡诱导信号。
在杀死细胞(例如T淋巴细胞)的方法的其它实施方案中，细胞死亡多肽的胞外结构域包含受体的配体。在该方法的所述实施方案中，多聚试剂或二聚试剂包含与所述配体结合的至少两个受体或其配体结合部分。当二聚试剂与两个所述细胞死亡多肽的所述受体或其所述配体结合部分结合时，所述多肽中的胞内结构域，且因此优选胱天蛋白酶结构域被二聚化。所述胞内结构域和胱天蛋白酶结构域的二聚化，优选引发在所述细胞中产生的凋亡诱导信号。
在杀死细胞(例如T淋巴细胞)的方法的某些其它实施方案中，所述细胞死亡多肽的所述胞外结构域包含人工寡核苷酸序列。例如，在具体的实施方案中，所述细胞死亡多肽含有包含人工寡核苷酸序列的胞外结构域。在一个具体的实施方案中，多聚试剂或二聚试剂是或包含含有任选通过接头连接的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的至少一个多聚寡核苷酸或二聚寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸与所述人工寡核苷酸序列互补。在某些具体的实施方案中，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸具有相同序列。在具体的实施方案中，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸以头-头或尾-尾构象连接。在具体的实施方案中，当所述多聚试剂或二聚试剂的所述多聚寡核苷酸或二聚寡核苷酸与两个所述细胞死亡多肽的人工寡核苷酸序列杂交时，细胞死亡多肽被多聚化或二聚化。在另一个具体的实施方案中，当细胞死亡多肽被多聚化或二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在具体的实施方案中，细胞死亡多肽包含胞内胱天蛋白酶结构域，且当胞内胱天蛋白酶结构域被多聚化或二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在杀死T淋巴细胞的方法的某些其它实施方案中，多聚试剂或二聚试剂是包含通过一个或多个接头连接的两个或更多个结合结构域的人工多肽。
在一个具体的实施方案中，本文提供杀死细胞(例如T淋巴细胞)的方法，其中所述细胞包含各包含胱天蛋白酶或其功能部分的多个人工细胞死亡多肽，其中所述胱天蛋白酶是胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9)，且其中所述细胞死亡多肽可使用抗体二聚化，且其中当所述抗体使所述多肽二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号，所述方法包括使所述细胞与足以使足够多的所述多个人工多肽二聚化并产生足以杀死所述细胞的聚集的凋亡诱导信号的一定量的所述抗体接触。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在另一个具体的实施方案中，本文提供杀死细胞(例如T淋巴细胞)的方法，其中所述细胞包含各包含胱天蛋白酶或其功能部分的多个人工细胞死亡多肽，其中所述胱天蛋白酶是胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9)，且其中所述多个人工多肽各自包含含有结合配体的受体或其配体结合部分的胞外结构域，其中所述多肽可使用包含两个所述配体的二聚试剂二聚化，且其中当所述二聚试剂使两个所述多肽二聚化时，在细胞中产生凋亡诱导信号，所述方法包括使所述细胞与足以使足够多的所述多个人工细胞死亡多肽二聚化并产生足以杀死所述细胞的聚集的凋亡诱导信号的一定量的所述二聚试剂接触。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在另一个具体的实施方案中，本文提供杀死细胞(例如T淋巴细胞)的方法，其中所述细胞包含各包含胱天蛋白酶或其功能部分的多个人工细胞死亡多肽，其中所述胱天蛋白酶是胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9)，且其中所述多个人工多肽各自包含胞外结构域，所述胞外结构域包含结合受体或其配体结合部分的配体或其受体结合部分，其中所述多肽可使用包含两个所述受体或其配体结合部分的二聚试剂二聚化，且其中当所述二聚试剂使两个所述多肽二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号，所述方法包括使所述细胞与足以使足够多的所述多个人工多肽二聚化并产生足以杀死所述细胞的聚集的凋亡诱导信号的一定量的所述二聚试剂接触。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在另一个具体的实施方案中，本文提供杀死细胞(例如T淋巴细胞)的方法，其中所述细胞包含各包含胱天蛋白酶或其功能部分的多个人工细胞死亡多肽，其中所述胱天蛋白酶是胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9(例如人胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9)，且其中所述多个人工多肽各自含有包含人工寡核苷酸的胞外结构域，其中所述多个多肽可使用包含含有第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的寡核苷酸的二聚试剂二聚化，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸具有相同的核苷酸序列，且其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸任选通过接头连接，且其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸与所述多肽的所述胞外结构域中的所述人工寡核苷酸互补，且其中当所述二聚试剂使两个所述细胞死亡多肽二聚化时，在所述细胞中产生凋亡诱导信号，所述方法包括使所述细胞与足以使足够多的所述多个人工多肽二聚化并产生足以杀死所述细胞的聚集的凋亡诱导信号的一定量的所述二聚试剂接触。在一个具体的实施方案中，所述细胞是T淋巴细胞。
在一个具体的实施方案中，按照本文所述方法杀死的T淋巴细胞是CAR-T淋巴细胞。
3.3.嵌合抗原受体
在某些实施方案中，当本文提供的细胞是包含本文所述细胞死亡多肽的T淋巴细胞时，所述T淋巴细胞可包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体是将T淋巴细胞引向抗原，并刺激T淋巴细胞杀死呈递抗原的细胞的人工膜结合蛋白。参见例如Eshhar，美国专利号7,741,465。至少，CAR包含与抗原(例如细胞上的抗原)结合的胞外结构域、跨膜结构域和将一级活化信号传送至免疫细胞的胞内(胞质)信号转导结构域。所有其它条件被满足时，当CAR在例如T淋巴细胞的表面表达，且CAR的胞外结构域与抗原结合时，胞内信号转导结构域将信号传送至T淋巴细胞以激活和/或增殖，且如果抗原存在于细胞表面，则杀死表达抗原的细胞。因为为了激活，T淋巴细胞需要两种信号，一级活化信号和协同刺激信号，所以通常CAR还包含协同刺激结构域，使得抗原与胞外结构域的结合导致一级活化信号和协同刺激信号两者的传递。
3.3.1.通用CAR结构胞内结构域
在某些实施方案中，CAR的胞内结构域是或包含在T淋巴细胞表面上表达并引发所述T淋巴细胞活化和/或增殖的蛋白质的胞内结构域或基序。所述结构域或基序能够传送响应抗原与CAR的胞外部分结合时T淋巴细胞活化所需要的一级抗原结合信号。通常，该结构域或基序包含或是ITAM(基于免疫受体酪氨酸的活化基序)。适于CAR的含ITAM的多肽包括例如ζCD3链(CD3ζ)或其含ITAM的部分。在一个具体的实施方案中，胞内结构域是CD3ζ胞内信号转导结构域。在其它具体的实施方案中，胞内结构域来自淋巴细胞受体链、TCR/CD3复合蛋白质、Fc受体亚基或IL-2受体亚基。
在某些实施方案中，CAR另外包含一个或多个协同刺激结构域或基序，例如作为多肽的胞内结构域的一部分。一个或多个协同刺激结构域或基序可以是或包含以下的一个或多个：协同刺激CD27多肽序列、协同刺激CD28多肽序列、协同刺激OX40(CD134)多肽序列、协同刺激4-1BB(CD137)多肽序列或协同刺激诱导型T细胞协同刺激(ICOS)多肽序列或其它协同刺激结构域或基序。
跨膜区域可以是可掺入功能CAR的任何跨膜区域，通常来自CD4或CD8分子的跨膜区域。
3.3.2.来自CTLA4或PD-1的CAR跨膜结构域
在某些实施方案中，CAR的跨膜结构域来自通常将抑制信号传送至所述免疫系统细胞的免疫系统蛋白质，例如来自CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞抗原4或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)或PD-1(程序性死亡-1)的跨膜结构域。
在某些实施方案中，本文提供的包含多个细胞死亡多肽的任何T淋巴细胞包含来自CTLA4或PD-1(程序性细胞死亡1)的跨膜结构域，在一个具体的实施方案中，表达所述多肽或本文所述的任何这类多肽的T淋巴细胞当所述多肽与所述抗原结合时被激活或刺激以增殖。在一个具体的实施方案中，多肽当在T淋巴细胞表面表达时，引导T淋巴细胞杀死表达所述抗原的细胞。
在本文的任何多肽的具体实施方案中，其中多肽的跨膜结构域来自CTLA4，CTLA4跨膜结构域来自哺乳动物CTLA4，例如人、灵长类或啮齿动物例如鼠CTLA4。优选跨膜结构域不包含来自CTLA4或PD-1的胞内结构域、胞外结构域或胞内或胞外结构域任一个的氨基酸。下面提供CTLA4或PD-1跨膜结构域序列的具体的非限制性实例。
在一个具体的实施方案中，CTLA4跨膜结构域是人CTLA4基因的外显子3编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，CTLA4跨膜结构域是或包含氨基酸序列PEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(三字母代码，Pro-Glu-Pro-Cys-Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-S er-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(SEQ ID NO:1)。在另一个具体的实施方案中，CTLA4跨膜结构域是或包含由GenBank登记号NM_005214.4的核苷酸610-722编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，CTLA4跨膜结构域是或包含氨基酸序列PDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSL(三字母代码，Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Ph e-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu)(SEQ ID NO:2)。在另一个具体的实施方案中，CTLA4跨膜结构域是或包含GenBank登记号NM_005214.4的核苷酸636-699编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，CTLA4跨膜结构域是或包含氨基酸序列FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAV(三字母代码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Ph e-Leu-Leu-Thr-Ala-Val)(SEQ ID NO:3)。参见例如Ensembl蛋白质查阅号ENSP00000303939.3。在另一个具体的实施方案中，CTLA4跨膜结构域是或包含多肽序列FLLWILAAVSSGLFFYSFLLT(三字母代码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Ph e-Leu-Leu-Thr)(SEQ ID NO:4)，参见例如UNIPROT登记号P16410。在另一个具体的实施方案中，CTLA4跨膜结构域是或包含多肽序列FLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLS(三字母代码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Val-Ala-Val-Ser-Leu-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-P he-Leu-Val-Ser-Ala-Val-Ser-Leu-Ser)(SEQ ID NO:5)。参见例如Shin等，Blood 119:5678-5687(2012)。在另一个具体的实施方案中，PD-1跨膜结构域是或包含氨基酸序列TLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(三字母代码，Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile-Cys-Ser-Arg-Ala-Ala)(SEQ ID NO:6)。参见Finger等，Gene 197(1-2):177-187(1997)。在另一个具体的实施方案中，PD-1跨膜结构域是或包含氨基酸序列VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(三字母代码，Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(SEQ ID NO:7)。参见例如UNIPROT登记号Q15116。在另一个具体的实施方案中，PD-1跨膜结构域是或包含氨基酸序列FQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(三字母代码，Phe-Glu-Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(SEQ ID NO:8)。参见例如GenBank登记号NM_005018.2。在某些实施方案中，编码本文公开的跨膜多肽之一的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中公开的任何氨基酸序列的核苷酸序列。在另一个具体的实施方案中，PD-1跨膜结构域是或包含SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8中公开的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续氨基酸。在某些实施方案中，编码本文公开的多肽之一的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:8公开的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续氨基酸的核苷酸序列。在某些实施方案中，在构建多肽(例如CAR)时，人序列可与非人序列组合。例如包含人胞外和胞内结构域氨基酸序列的多肽(例如CAR)可包含来自非人特种的跨膜结构域；例如，可包含鼠CTLA4跨膜结构域或鼠PD-1跨膜结构域。在一个更具体的实施方案中，多肽例如CAR包含胞外和胞内结构域的人氨基酸序列，并包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由SEQ IDNO:5的氨基酸序列组成的跨膜结构域。
3.3.3.CAR胞内结构域
多肽的胞外结构域与目标抗原结合。在本文所述任何多肽的某些实施方案中，胞外结构域包含与所述抗原结合的受体或受体的部分。胞外结构域可以是例如与所述抗原结合的受体或受体的部分。在某些实施方案中，胞外结构域包含或是抗体或其抗原结合部分。在具体的实施方案中，胞外结构域包含或是单链Fv结构域。单链Fv结构域可包含例如通过柔性接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH来自结合所述抗原的抗体。
多肽的胞外结构域与之结合的抗原可以是任何目标抗原，例如可以是肿瘤细胞上的抗原。肿瘤细胞可以是例如实体瘤中的细胞或血癌的细胞。抗原可以是在任何肿瘤或癌症类型的细胞例如以下细胞中表达的任何抗原：淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑素瘤例如恶性黑素瘤、皮肤癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、尤因肉瘤、外周性原始神经外胚层肿瘤、实体生殖细胞肿瘤、肝胚细胞瘤、成神经细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤、骨肉瘤、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、维尔姆斯瘤、成胶质细胞瘤、粘液瘤、纤维瘤、脂肪瘤等。在更具体的实施方案中，所述淋巴瘤可以是慢性淋巴细胞白血病(小淋巴细胞淋巴瘤)、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T淋巴细胞幼淋巴细胞白血病、T淋巴细胞大颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T淋巴细胞白血病/淋巴瘤、结外NK/T淋巴细胞淋巴瘤、鼻型、肠病型T淋巴细胞淋巴瘤、肝脾T淋巴细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿病、塞扎里综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T淋巴细胞淋巴瘤、外周T淋巴细胞淋巴瘤(未分类的)、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
在一个具体的实施方案中，其中癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)，CLL的B细胞具有正常核型。在其它具体的实施方案中，其中癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)，CLL的B细胞携带17p缺失、11q缺失、12q三体性、13q缺失或p53缺失。
在某些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在多个具体的实施方案中，肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原无限制地为Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、CD19、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液体蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白质melan-A(被T淋巴细胞识别的黑素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触泡蛋白(synaptophysis)、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、二聚形式的丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、异常ras蛋白或异常p53蛋白。
在某些实施方案中，TAA或TSA是癌症/睾丸(CT)抗原，例如BAGE、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-ESO-1、NY-SAR-35、OY-TES-1、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1或TPTE。
在某些其它的实施方案中，TAA或TSA是糖或神经节苷脂，例如fuc-GM1、GM2(肿瘤胚胎抗原-免疫原性-1；OFA-I-1)；GD2(OFA-I-2)、GM3、GD3等。
在某些其它的实施方案中，TAA或TSA是α-辅肌动蛋白-4、Bage-1、BCR-ABL、Bcr-Abl融合蛋白、β-联蛋白、CA 125、CA 15-3(CA27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、Casp-8、cdc27、cdk4、cdkn2a、CEA、coa-1、dek-can融合蛋白、EBNA、EF2、EB病毒抗原、ETV6-AML1融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1、2和3、neo-PAP、肌球蛋白I类、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸丙糖异构酶、Gage 3、4、5、6、7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、NA-88、NY-Eso-1/Lage-2、SP17、SSX-2、TRP2-Int2、gp100(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、RAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、RAGE、、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、13-联蛋白、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、精液蛋白质17(Sp17)、mesothelin、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、prostein、TARP(T细胞受体γ另起读框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六跨膜上皮抗原1)、异常ras蛋白或异常p53蛋白。在另一个具体的实施方案中，所述肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是整联蛋白αvβ3(CD61)、催乳激素、K-Ras(V-Ki-ras2 Kirsten大鼠脂肪瘤病毒癌基因)或Ral-B。其它肿瘤相关和肿瘤特异性抗原是本领域已知的。
与TSA和TAA结合的抗体和scFv是本领域已知的，其编码核苷酸序列同样。
在某些具体的实施方案中，抗原是不被视为TSA或TAA但仍与肿瘤细胞或由肿瘤引起的损害有关的抗原。在某些实施方案中，例如，抗原为例如生长因子、细胞因子或白介素，例如与血管生成或血管发生有关的生长因子、细胞因子或白介素。所述生长因子、细胞因子或白介素可包括例如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)或白介素-8(IL-8)。肿瘤还会在肿瘤局部产生低氧环境。因此，在其它具体的实施方案中，抗原是低氧相关因子，例如HIF-1α、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α或HIF-3β。肿瘤还会对正常组织造成局部损害，引起称为损伤相关分子模式分子(DAMP；亦称为alarmins)的分子释放。因此，在某些其它具体的实施方案中，抗原是DAMP，例如热激蛋白、染色质相关蛋白高迁移率组框1(HMGB1)、S100A8(MRP8、钙粒蛋白A)、S100A9(MRP14、钙粒蛋白B)、血清淀粉状蛋白A(SAA)，或可以是脱氧核糖核酸、腺苷三磷酸、尿酸或硫酸肝素。
在本文所述多肽的某些实施方案中，胞外结构域通过接头、间隔基或铰链多肽序列(例如来自CD28的序列或来自CTLA4的序列)与所述跨膜结构域连接。
3.3.4.双特异性CAR
在本文所述的T淋巴细胞或方法的某些实施方案中，T淋巴细胞，除包含细胞死亡多肽以外，还包含两个或更多个CAR，其中一级信号转导机制和协同刺激机制被分成两个或更多个多肽。
在某些实施方案中，例如T淋巴细胞包含细胞死亡多肽的和至少两个不同的其它多肽例如嵌合受体，其中来源于一级信号转导多肽(例如嵌合受体)与第一抗原结合的免疫信号与由协同刺激多肽(例如嵌合受体)产生的协同刺激信号分隔开，其中协同刺激信号取决于第二抗原被第二嵌合受体的抗原结合。
在一个实施方案中，T淋巴细胞包含含有结合第一抗原的第一胞外抗原结合结构域的一级信号转导多肽和第一胞内信号转导结构域(其中所述一级信号转导多肽不包含协同刺激结构域)；和包含结合第二抗原的第二胞外抗原结合结构域或结合所述第二抗原的受体的协同刺激结构域；和第二胞内信号转导结构域；其中只有当所述第一信号转导结构域和所述第二信号转导结构域两者分别被所述第一抗原和所述第二抗原激活时，所述T淋巴细胞才变得有最大的细胞毒性。在一个具体的实施方案中，在所述第二抗原不与所述第二结合结构域结合的情况下所述第一抗原与所述第一抗原结合结构域的结合，或在第一抗原不与所述第一结合结构域结合的情况下所述第二抗原与所述第二抗原结合结构域的结合诱导所述T淋巴细胞的无反应性，或所述T淋巴细胞对所述第一抗原或所述第二抗原不起反应。
在另一个具体的实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域独立地为受体的抗原结合部分、抗体的抗原结合部分或其它基于肽的大分子抗原结合剂。在某些具体的实施方案中，所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域的任一个或两个是scFv抗体片段。在具体的实施方案中，所述一级信号转导多肽或所述协同刺激多肽的任一个或两个另外包含跨膜结构域。在其它具体的实施方案中，所述一级信号转导多肽或所述协同刺激多肽包含T淋巴细胞存活基序。在一个具体的实施方案中，T淋巴细胞存活基序是CD28 T淋巴细胞存活基序。在其它具体的实施方案中，所述T淋巴细胞存活基序是IL-7受体(IL-7R)的胞内信号转导结构域、IL-12受体的胞内信号转导结构域、IL-15受体的胞内信号转导结构域、IL-21受体的胞内信号转导结构域或转化生长因子β(TGFβ)受体的胞内信号转导结构域。在另一个具体的实施方案中，所述一级信号转导多肽或所述协同刺激多肽包含含有T淋巴细胞存活基序的CD28分子的部分。在一个更具体的实施方案中，所述一级信号转导多肽或所述协同刺激多肽包含含有T淋巴细胞存活基序的CD28分子。在某些具体的实施方案中，所述第一胞内信号转导结构域包含含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的多肽序列。在一个更具体的实施方案中，所述多肽序列是CD3ζ信号转导结构域。
在某些具体的实施方案中，所述第一抗原是肿瘤细胞上的抗原。在一个更具体的实施方案中，所述肿瘤细胞是实体瘤中的细胞。在另一个具体的实施方案中，所述肿瘤细胞是血癌细胞。在另一个具体的实施方案中，所述抗原是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在更具体的实施方案中，所述肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液体蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白质melan-A(被T淋巴细胞识别的黑素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、二聚形式的丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、异常ras蛋白或异常p53蛋白。
在另一个具体的实施方案中，所述第二抗原是生长因子、细胞因子或白介素。第二抗原是与血管生成或血管发生有关的生长因子、细胞因子或白介素。在更具体的实施方案中，所述第二抗原是血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)或白介素-8(IL-8)。
在另一个具体的实施方案中，由所述第二抗原提供的信号转导活化是非抗原的，但与缺氧有关。在更具体的实施方案中，所述刺激通过缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α或HIF-3β的活化诱导。
在另一个具体的实施方案中，所述第二抗原是白介素。
在另一个具体的实施方案中，所述第二抗原是损伤相关分子模式分子(DAMP；亦称为alarmin)。在更具体的实施方案中，所述DAMP是热激蛋白、染色质相关蛋白高迁移率组框1(HMGB1)、S100A8(亦称为MRP8或钙粒蛋白A)、S100A9(亦称为MRP14或钙粒蛋白B)、血清淀粉状蛋白A(SAA)、脱氧核糖核酸、腺苷三磷酸、尿酸或硫酸肝素。
在某些具体的实施方案中，所述第二抗原是结合由肿瘤细胞呈递的抗原的抗体上的抗原。
在本文任何实施方案的具体实施方案中，所述协同刺激多肽包含一个或多个协同刺激结构域。在具体的实施方案中，所述一个或多个协同刺激结构域包含协同刺激CD27多肽序列、协同刺激CD28多肽序列、协同刺激OX40(CD134)多肽序列、协同刺激4-1BB(CD137)多肽序列或协同刺激诱导型T细胞协同刺激(ICOS)多肽序列的一个或多个。
在一个具体的实施方案中，所述一级信号转导多肽包含胞外肿瘤抗原结合结构域和CD3ζ信号转导结构域，且其中所述协同刺激多肽包含其中所述抗原是血管生成因子或血管源性因子的抗原结合结构域和一个或多个协同刺激分子信号转导结构域。所述血管生成因子可以是例如VEGF。所述一个或多个协同刺激分子信号转导基序可包含例如来自CD28、OX40和4-1BB每一个的协同刺激信号转导结构域。在一个更具体的实施方案中，所述一级信号转导多肽包含胞外肿瘤抗原结合结构域和CD3ζ信号转导结构域，且其中所述协同刺激多肽包含其中所述抗原是VEGF的抗原结合结构域和来自CD28、OX40和4-1BB每一个的协同刺激信号转导结构域。
在一个更具体的实施方案中，所述一级信号转导多肽或所述协同刺激多肽包含T淋巴细胞存活基序。在更具体的实施方案中，所述T淋巴细胞存活基序是或来源于IL-7受体(IL-7R)的胞内信号转导结构域、IL-12受体的胞内信号转导结构域、IL-15受体的胞内信号转导结构域、IL-21受体的胞内信号转导结构域或转化生长因子β(TGFβ)受体的胞内信号转导结构域。因此，在所述T淋巴细胞的一个更具体的实施方案中，所述一级信号转导多肽包含胞外肿瘤抗原结合结构域和CD3ζ信号转导结构域，且其中所述协同刺激多肽包含其中所述抗原是VEGF的抗原结合结构域、IL-7受体胞内T淋巴细胞存活基序和来自CD28、OX40和4-1BB每一个的协同刺激信号转导结构域。
在T淋巴细胞的另一个具体的实施方案中，所述第一抗原是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原，所述第一胞内信号转导结构域包含CD3ζ信号转导结构域；且其中所述协同刺激多肽包含结合所述第二抗原的抗原结合结构域和来自CD28、OX40和4-1BB每一个的协同刺激信号转导结构域。在一个更具体的实施方案中，所述协同刺激多肽还包含胞内T淋巴细胞存活基序，例如是或来源于以下的T淋巴细胞存活基序：IL-7受体(IL-7R)的胞内信号转导结构域、IL-12受体的胞内信号转导结构域、IL-15受体的胞内信号转导结构域、IL-21受体的胞内信号转导结构域或转化生长因子β(TGFβ)受体的胞内信号转导结构域。
在本文提供的任何T淋巴细胞的一个具体的实施方案中，所述第二抗原是VEGF或IL-4。
另一方面，本文提供T淋巴细胞，其包含细胞死亡多肽、包含结合第一抗原的第一胞外抗原结合结构域的协同刺激多肽和第一胞内信号转导结构域；以及包含结合第二抗原的第二胞外抗原结合结构域或结合所述第二抗原的受体的一级信号转导多肽和第二胞内信号转导结构域，其中所述一级信号转导多肽不包含协同刺激结构域；其中只有当所述第一信号转导结构域和所述第二信号转导结构域两者分别被所述第一抗原和所述第二抗原激活时，所述修饰的淋巴细胞才变得有最大的细胞毒性。在一个具体的实施方案中，在所述第二抗原不结合所述第二结合结构域的情况下所述第一抗原与所述第一抗原结合结构域的结合，或在第一抗原不结合所述第一结合结构域的情况下所述第二抗原与所述第二抗原结合结构域的结合诱导所述T淋巴细胞的无反应性，或所述T淋巴细胞对所述第一抗原不起反应。在一个具体的实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述抗原结合结构域独立地为受体的抗原结合部分或抗体的抗原结合部分。在另一个具体的实施方案中，所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域的任一个或两个是scFv抗体片段。在具体的实施方案中，所述协同刺激多肽和/或所述一级信号转导多肽另外包含跨膜结构域。在一个更具体的实施方案中，所述协同刺激多肽或所述一级信号转导多肽包含T淋巴细胞存活基序，例如本文所述T淋巴细胞存活基序的任一种。在另一个具体的实施方案中，所述第一抗原是肿瘤细胞上的抗原，例如实体瘤中的细胞或血癌细胞。在一个具体的实施方案中，所述第一抗原是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原，例如Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液体蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白质melan-A(被T淋巴细胞识别的黑素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、二聚形式的丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、精液蛋白质17(Sp17)、mesothelin、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、prostein、TARP(T细胞受体γ另起读框蛋白)、Trp-p8、或STEAP1(前列腺六跨膜上皮抗原1)。在另一个具体的实施方案中，所述肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是整联蛋白αvβ3(CD61)、催乳激素、K-Ras(V-Ki-ras2 Kirsten大鼠脂肪瘤病毒癌基因)或Ral-B。
在某些具体的实施方案中，所述第二胞内信号转导结构域包含含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的多肽序列，例如CD3ζ信号转导结构域。在一个具体的实施方案中，所述第二抗原是生长因子、细胞因子或白介素。在另一个具体的实施方案中，所述第二抗原是与血管生成或血管发生有关的生长因子、细胞因子或白介素，例如VEGF、bFGF、PDGF、HGF、IGF或IL-8。在其它更具体的实施方案中，因所述第二嵌合受体引起的信号转导通过以下低氧相关因子的活化来诱导：例如HIF-1α、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α或HIF-3β。在其它具体的实施方案中，所述第二抗原是白介素。在其它具体的实施方案中，所述第二抗原是DAMP，例如热激蛋白、HMGB1、S100A8、S100A9、SAA、DNA、ATP、尿酸或硫酸肝素。在其它具体的实施方案中，所述第二抗原是所给予的肽，例如抗体或合成多肽。在其它具体的实施方案中，所述第二抗原是结合由肿瘤细胞呈递的抗原的抗体上的抗原。在某些具体的实施方案中，所述协同刺激多肽包含一个或多个协同刺激结构域，例如协同刺激CD27多肽序列、协同刺激CD28多肽序列、协同刺激OX40(CD134)多肽序列、协同刺激4-1BB(CD137)多肽序列或协同刺激诱导型T细胞协同刺激(ICOS)多肽序列的一个或多个。在上述实施方案的任一个中，在一个具体的实施方案中，所述协同刺激多肽或所述一级信号转导多肽包含T淋巴细胞存活基序，例如所述T淋巴细胞存活基序是或来源于IL-7受体(IL-7R)的胞内信号转导结构域、IL-12受体的胞内信号转导结构域、IL-15受体的胞内信号转导结构域、IL-21受体的胞内信号转导结构域或转化生长因子β(TGFβ)受体的胞内信号转导结构域。
3.4.分离的多肽
通过例如酰化、酰胺化、糖基化、甲基化、磷酸化、硫酸盐化、苏素化、泛素化等，修饰本文提供的包含CTLA4或PD-1跨膜结构域的多肽的任一种。可用能够提供可检测信号的标记(例如用放射性同位素和荧光化合物)对多肽进行标记。第一或第二多肽的一个或多个侧链可被衍生化，例如赖氨酰基和氨基端残基用琥珀酸或其它羧酸酐的衍生化，或用例如亚氨基酯例如甲基吡啶亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2,4-戊二酮衍生化；和与乙醛酸盐的转氨酶催化反应。可通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R')例如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基苯基)碳二亚胺反应，选择性地修饰羧基侧基、天冬氨酰基或谷氨酰基。
3.5.分离的核酸
本文提供的多肽(例如嵌合受体)可按照本领域众所周知的方法由多核苷酸序列编码。多核苷酸可包含在适于免疫细胞(例如T淋巴细胞)转化的任何多核苷酸载体内。例如，T淋巴细胞可使用含有编码第一和第二多肽(例如嵌合受体)的多核苷酸的合成载体、慢病毒或反转录病毒载体、自主复制质粒、病毒(例如反转录病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)等转化。适于T淋巴细胞转化的慢病毒载体包括但不限于例如描述于美国专利号5,994,136、6,165,782、6,428,953、7,083,981和7,250,299的慢病毒载体，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。适于T淋巴细胞转化的HIV载体包括但不限于例如描述于美国专利号5,665,577的载体，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
可用于在例如T淋巴细胞内产生第一和第二多肽的核酸包括DNA、RNA或核酸类似物。可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架上修饰核酸类似物，并可包括脱氧尿苷替代脱氧胸苷、5-甲基-2'-脱氧胞苷或5-溴-2'-脱氧胞苷替代脱氧胞苷。糖部分的修饰可包括核糖的2'羟基修饰形成2'-O-甲基或2'-O-烯丙基糖。可修饰脱氧核糖磷酸酯骨架以产生吗啉代核酸，其中每个碱基部分与6元吗啉代环或肽核酸连接，其中脱氧磷酸骨架被假肽骨架置换，并保留4种碱基。参见例如Summerton和Weller(1997)Antisense Nucleic Acid DrugDev.7:187-195；以及Hyrup等(1996)Bioorgan.Med.Chain.4:5-23。此外，脱氧磷酸骨架可被例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架、氨基磷酸酯或烷基磷酸三酯骨架置换。
3.6.细胞
其中可以使用细胞死亡多肽和多聚试剂或二聚试剂的细胞的非限制性实例包括但不限于自然杀伤(NK)细胞、树突细胞(DC)、胚胎干细胞(例如公开于美国专利号7,468,276、8,057,788和8,202,703的胚胎干细胞，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中)、来自脐带血、胎盘血、外周血、骨髓、牙髓、脂肪组织、骨软组织等的间充质样干细胞；胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、神经嵴干细胞、神经干细胞和分化细胞(例如成纤维细胞等)。细胞死亡多肽和多聚试剂或二聚试剂也可用于肿瘤细胞系，例如用于动物模型实验目的。
在一个具体的实施方案中，包含本文提供的多肽的细胞是T淋巴细胞。包含本文提供的多肽的T淋巴细胞可以是幼稚T淋巴细胞或MHC限制性T淋巴细胞。在某些实施方案中，T淋巴细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。在某些实施方案中，T淋巴细胞从肿瘤活检样品中分离，或从自肿瘤活检样品分离的T淋巴细胞扩增。在某些其它的实施方案中，T淋巴细胞从外周血、脐带血或淋巴分离，或从自外周血、脐带血或淋巴扩增的T淋巴细胞扩增。
用于本发明方法的免疫细胞(例如T淋巴细胞)优选对向其给予T淋巴细胞的个体是自体的。在某些其它的实施方案中，T淋巴细胞对向其给予T淋巴细胞的个体是同种异体的。在使用同种异体的T淋巴细胞制备T淋巴细胞时，优选选择可降低个体的移植物抗宿主病(GVHD)的可能性的T淋巴细胞。例如，在某些实施方案中，选择病毒特异生T淋巴细胞用于制备T淋巴细胞；预期这类淋巴细胞结合任何受体抗原(recipient antigen)的天然能力大大降低，并因此变得被任何受体抗原激活。在某些实施方案中，共同给予宿主一种或多种免疫抑制剂，例如环孢菌素、他克莫司、西罗莫司、环磷酰胺等，来降低受体介导的同种异体T淋巴细胞的排斥。
在一个实施方案中，T淋巴细胞获自个体，任选随后扩增，然后用编码细胞死亡多肽的多核苷酸和任选编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸转化，任选随后扩增。在另一个实施方案中，T淋巴细胞获自个体，任选随后扩增，然后用编码细胞死亡多肽的多核苷酸和任选编码一种或多种CAR的一种或多种多核苷酸转化，任选随后扩增。可使用一种或多种选择含有所述任何多核苷酸的细胞。
在某些实施方案中，除含有CTLA4或PD-1跨膜结构域的多肽以外，本文提供的任何T淋巴细胞表达或包含天然TCR蛋白，例如能够形成天然TCR复合体的TCR-α和TCR-β。在某些其它的实施方案中，T淋巴细胞中编码TCR-α和TCR-β的天然基因的任一种或两种被修饰成无功能的，例如部分或全部缺乏、插入突变等。
在某些实施方案中，本文提供的任何T淋巴细胞从肿瘤病变中分离，例如是肿瘤浸润性淋巴细胞；预期所述T淋巴细胞对TSA或TAA有特异性。
T淋巴细胞和含有包含CD3ζ信号转导结构域和CD28协同刺激结构域的多肽的T淋巴细胞可使用抗CD3和CD28的抗体(例如连接至珠粒或细胞培养板表面的抗体)扩增；参见例如美国专利号5,948,893、6,534,055、6,352,694、6,692,964、6,887,466和6,905,681。
在上述实施方案的任一个中，抗原和/或抗体可游离存在于其中T淋巴细胞是培养物的培养基中，或任一个或两个可与固相载体(例如组织培养塑料表面、珠粒等)连接。
除细胞死亡多肽以外，本文提供的T淋巴细胞可任选包含第二种类型的“自杀基因”或“安全开关”。在某些实施方案中，例如，T淋巴细胞可包含HSV胸苷激酶基因(HSV-TK)，其在与更昔洛韦接触时引起T淋巴细胞死亡。在另一个实施方案中，T淋巴细胞包含诱导型胱天蛋白酶，例如诱导型胱天蛋白酶9(icaspase9)，例如允许使用特定的小分子药物二聚化的胱天蛋白酶9和人FK506结合蛋白之间的融合蛋白。参见Straathof等，Blood 105(11):4247-4254(2005)。
3.7.使用包含细胞死亡多肽的细胞的方法
本文提供的包含细胞死亡多肽和任选本文其它部分描述的一种或多种CAR的细胞(例如T淋巴细胞)可用来治疗具有需要被本文所述细胞靶向的一种或多种类型的细胞，例如待被杀死的一种或多种类型的细胞的个体。在某些实施方案中，待被杀死的细胞是癌细胞，例如肿瘤细胞。在具体的实施方案中，癌细胞是实体瘤的细胞。在具体的实施方案中，细胞以下的细胞：淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑素瘤例如恶性黑素瘤、皮肤癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、尤因肉瘤、外周性原始神经外胚层肿瘤、实体生殖细胞肿瘤、肝胚细胞瘤、成神经细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤、骨肉瘤、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、维尔姆斯瘤、成胶质细胞瘤、粘液瘤、纤维瘤、脂肪瘤等。在更具体的实施方案中，所述淋巴瘤可以是慢性淋巴细胞白血病(小淋巴细胞淋巴瘤)、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T淋巴细胞幼淋巴细胞白血病、T淋巴细胞大颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T淋巴细胞白血病/淋巴瘤、结外NK/T淋巴细胞淋巴瘤、鼻型、肠病型T淋巴细胞淋巴瘤、肝脾T淋巴细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿病、塞扎里综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T淋巴细胞淋巴瘤、外周T淋巴细胞淋巴瘤(未分类的)、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
在某些实施方案中，当将本文所述修饰细胞(例如修饰的T淋巴细胞)给予有需要的受试者时，选择所选的多聚试剂和细胞死亡多肽的组合，使得它们与其中给予细胞(例如T淋巴细胞)的患者群(或亚群)相容。仅举例来说，如果所选多聚试剂是抗体利妥昔单抗，则在某些实施方案中，患者群是患有B细胞癌(例如B细胞淋巴瘤)的个体。
在给予患有通过所述细胞(例如T淋巴细胞)可治疗的疾病或病症的个体(例如患有癌症的个体)之后，可通过本领域普通技术人员已知的对特定疾病或病症是特有的、表明疾病或病症进展的一个或多个标准，评价细胞(例如T淋巴细胞)的功效。一般来讲，当一个或多个所述标准从疾病状态值或范围向着或接近正常值或范围可检测(例如显著)地移动时，将细胞给予所述个体是有效的。
可在任何药学上可接受的溶液、优选适于递送活细胞的溶液，例如盐水溶液(例如林格氏液)、明胶、糖(例如乳糖、直链淀粉、淀粉等)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等中，配制细胞，例如T淋巴细胞。优选将这类制剂在加入细胞之前灭菌，并且可与例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂和着色剂等助剂混合。适用于配制细胞的药用载体是本领域已知的，并描述于例如WO96/05309。
在某些实施方案中，将细胞(例如T淋巴细胞)配制成单独的剂量，其中所述单独的剂量包含至少、至多或约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010或1×1011个T淋巴细胞。在某些实施方案中，配制细胞用于静脉内、动脉内、胃肠外、肌内、皮下、鞘内或眼内给予，或在特定的器官或组织内给予。
4.实施例
4.1.实施例1：B细胞淋巴瘤的治疗
个体表现为患有B细胞慢性淋巴细胞白血病，一种B细胞淋巴瘤。个体B细胞的测试确定B细胞携带17p缺失。从个体获取T淋巴细胞，用包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的慢病毒载体转染，并用包含编码可二聚化的细胞死亡多肽的核苷酸序列的第二慢病毒载体转染，所述细胞死亡多肽含有包含被抗体利妥昔单抗结合的模拟表位的胞外结构域和包含胱天蛋白酶9结构域的胞内结构域。T淋巴细胞使用包被CD3+CD28的珠粒扩增到用于给予的足够数目。嵌合受体包含与CD19结合的胞外抗原结合区；来自CTLA4的跨膜结构域；来自CD28的胞内协同刺激结构域；和胞内CD3ζ结构域。通过30分钟内的静脉内输注，将200mL盐水溶液中的109和1010个T淋巴细胞给予个体。监测个体之后的2周以证实个体血液中降低至少90％的CD19+B细胞。当在给予T淋巴细胞后患者显示因T淋巴细胞引起的不适体征(例如呼吸困难、发热、血清细胞因子水平异常、皮疹等)时，以200-500mg/m2的剂量给予利妥昔单抗或直到症状减轻。
4.2.实施例2：B细胞淋巴瘤的治疗
个体表现为患有B细胞慢性淋巴细胞白血病，一种B细胞淋巴瘤。个体B细胞的测试确定B细胞携带17p缺失。从个体获取约106个T淋巴细胞，用包含编码细胞死亡多肽的核苷酸序列的慢病毒载体转染，所述细胞死亡多肽含有包含可被抗体利妥昔单抗结合的模拟表位的胞外结构域和包含胱天蛋白酶8结构域的胞内结构域，并用包含编码CAR的核苷酸序列的慢病毒载体转染。CAR包含与CD19结合的胞外抗原结合区；来自PD-1的跨膜结构域；来自CD28的胞内协同刺激结构域；和胞内CD3ζ结构域。在没有T淋巴细胞之前扩增的情况下将表达CAR的T淋巴细胞给予个体。通过30分钟内的静脉内输注，将200mL盐水溶液中的105和106个T淋巴细胞给予个体。监测个体之后的2周以证实个体血液中降低至少90％的CD19+B细胞。当在给予T淋巴细胞后患者显示因T淋巴细胞引起的不适体征(例如呼吸困难、发热、血清细胞因子水平异常、皮疹等)时，以200-500mg/m2的剂量给予利妥昔单抗或直到症状减轻。
4.3.实施例3：B细胞淋巴瘤的治疗
个体表现为患有B细胞慢性淋巴细胞白血病，一种B细胞淋巴瘤。个体B细胞的测试确定B细胞携带p53缺失。从个体中获取T淋巴细胞，用包含编码细胞死亡多肽的核苷酸序列的慢病毒载体转染，所述细胞死亡多肽含有包含可被抗体利妥昔单抗结合的表位的胞外结构域和包含胱天蛋白酶3结构域的胞内结构域，并用包含编码CAR的核苷酸序列的慢病毒载体转染。T淋巴细胞使用包被CD3+CD28的珠粒扩增至用于给予的足够数目。CAR包含与CD19结合的胞外抗原结合区；来自CTLA4的跨膜结构域；CD28、4-1BB和OX40每一个的胞内协同刺激结构域；和胞内CD3ζ结构域。通过30分钟内的静脉内输注，将200mL盐水溶液中的109和1010个T淋巴细胞给予个体。监测个体之后的2周以证实个体血液中降低至少90％的CD19+B细胞。当在给予T淋巴细胞后患者显示因T淋巴细胞引起的不适体征(例如呼吸困难、发热、血清细胞因子水平异常、皮疹等)时，以200-500mg/m2的剂量给予利妥昔单抗或直到症状减轻。
4.4.实施例4：B细胞淋巴瘤的治疗
个体表现为患有B细胞慢性淋巴细胞白血病，一种B细胞淋巴瘤。个体B细胞的测试确定B细胞携带p53缺失。从个体获取约106个T淋巴细胞，用包含编码细胞死亡多肽的核苷酸序列的慢病毒载体转染，所述细胞死亡多肽含有包含可被抗体利妥昔单抗结合的表位的胞外结构域和包含胱天蛋白酶9结构域的胞内结构域，并用包含编码CAR的核苷酸序列的慢病毒载体转染。CAR包含与CD19结合的胞外抗原结合区；来自PD-1的跨膜结构域；CD28、4-1BB和OX40每一个的胞内协同刺激结构域；和胞内CD3ζ结构域。在没有T淋巴细胞之前扩增的情况下将表达CAR的T淋巴细胞给予个体。通过30分钟内的静脉内输注，将200mL盐水溶液中的105和106个T淋巴细胞给予个体。监测个体之后的2周以证实个体血液中降低至少90％的CD19+B细胞。当在给予T淋巴细胞后患者显示因T淋巴细胞引起的不适体征(例如呼吸困难、发热、血清细胞因子水平异常、皮疹等)时，以200-500mg/m2的剂量给予利妥昔单抗或直到症状减轻。
4.5.实施例5：前列腺癌的治疗
个体表现为患有T2期前列腺癌、未扩散到局部淋巴结或其它淋巴结(N0，M0)。确定组织学分级为G2。总的来说，个体被确诊为患有I1期前列腺癌。通过30分钟内的静脉内输注，将200mL盐水溶液中的介于109和1010个间的包含CAR的T淋巴细胞给予个体。CAR包含与PSCA结合的胞外抗原结合区，来自CTLA4的跨膜结构域，来自CD28的胞内协同刺激结构域，和胞内CD3ζ结构域。T淋巴细胞还包含细胞死亡多肽，所述细胞死亡多肽含有包含可被抗体利妥昔单抗结合的表位的胞外结构域和包含胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9结构域的胞内结构域。在给药后30、60和90天，针对前列腺癌病期和扩散至淋巴结对个体进行重新评价，并进行了活检前列腺组织的组织学研究。当在给予T淋巴细胞后患者显示因T淋巴细胞引起的不适体征(例如呼吸困难、发热、血清细胞因子水平异常、皮疹等)时，以200-500mg/m2的剂量给予利妥昔单抗或直到症状减轻。
4.6.实施例6：前列腺癌的治疗
个体表现为患有T2期前列腺癌、未扩散到局部淋巴结或其它淋巴结(N0，M0)。确定组织学分级为G2。总的来说，个体被确诊为患有I1期前列腺癌。通过30分钟内的静脉内输注，将200mL盐水溶液中的介于109和1010个间的包含CAR的T淋巴细胞给予个体。CAR包含与PSCA结合的胞外抗原结合区，来自PD-1的跨膜结构域，来自CD28的胞内协同刺激结构域，和胞内CD3ζ结构域。T淋巴细胞还包含细胞死亡多肽，所述细胞死亡多肽含有包含可被抗体利妥昔单抗结合的表位的胞外结构域和包含胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9结构域的胞内结构域。在给药后30、60和90天，针对前列腺癌病期和扩散至淋巴结对个体进行重新评价，并进行了活检前列腺组织的组织学研究。当在给予T淋巴细胞后患者显示因T淋巴细胞引起的不适体征(例如呼吸困难、发热、血清细胞因子水平异常、皮疹等)时，以200-500mg/m2的剂量给予利妥昔单抗或直到症状减轻。
4.7.实施例7：前列腺癌的治疗
个体表现为患有T2期前列腺癌、未扩散到局部淋巴结或其它淋巴结(N0，M0)。确定组织学分级为G2。总的来说，个体被确诊为患有I1期前列腺癌。通过30分钟内的静脉内输注，将200mL盐水溶液中的介于109和1010个间的包含CAR的T淋巴细胞给予个体。CAR包含与PSCA结合的胞外抗原结合区，来自CTLA-4的跨膜结构域，CD28、4-1BB和OX40每一个的胞内协同刺激结构域，和胞内CD3ζ结构域。T淋巴细胞还包含细胞死亡多肽，所述细胞死亡多肽含有包含可被抗体利妥昔单抗结合的表位的胞外结构域和包含胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9结构域的胞内结构域。在给药后30、60和90天，针对前列腺癌病期和扩散至淋巴结对个体进行重新评价，并进行了活检前列腺组织的组织学研究。当在给予T淋巴细胞后患者显示因T淋巴细胞引起的不适体征(例如呼吸困难、发热、血清细胞因子水平异常、皮疹等)时，以200-500mg/m2的剂量给予利妥昔单抗或直到症状减轻。
4.8.实施例8：前列腺癌的治疗
个体表现为患有T2期前列腺癌、未扩散到局部淋巴结或其它淋巴结(N0，M0)。确定组织学分级为G2。总的来说，个体被确诊为患有I1期前列腺癌。通过30分钟内的静脉内输注，将200mL盐水溶液中的介于109和1010个间的包含CAR的T淋巴细胞给予个体。CAR包含与PSCA结合的胞外抗原结合区，来自PD-1的跨膜结构域，CD28、4-1BB和OX40每一个的胞内协同刺激结构域，和胞内CD3ζ结构域。T淋巴细胞还包含细胞死亡多肽，所述细胞死亡多肽含有包含可被抗体利妥昔单抗结合的表位的胞外结构域和包含胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9结构域的胞内结构域。在给药后30、60和90天，针对前列腺癌病期和扩散至淋巴结对个体进行重新评价，并进行了活检前列腺组织的组织学研究。当在给予T淋巴细胞后患者显示因T淋巴细胞引起的不适体征(例如呼吸困难、发热、血清细胞因子水平异常、皮疹等)时，以200-500mg/m2的剂量给予利妥昔单抗或直到症状减轻。
等同内容
本公开内容不限于本文所述具体的实施方案的范围。实际上，根据前面的描述，除所描述的以外，本文提供的主题的各种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。预期这类修改落入随附权利要求书的范围内。
本文引用了各种出版物、专利和专利申请，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
序列表
<110> 人类起源公司
<120> 修饰的T淋巴细胞
<130> 12827-395-228
<140> to be assigned
<141> 2014-03-14
<150> 61/794,294
<151> 2013-03-15
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CTLA4跨膜结构域的序列
<400> 1
Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala
1 5 10 15
Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser
20 25 30
Leu Ser Lys Met
35
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CTLA4跨膜结构域的序列
<400> 2
Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly
1 5 10 15
Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu
20 25
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CTLA4跨膜结构域的序列
<400> 3
Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr
1 5 10 15
Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val
20
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CTLA4跨膜结构域的序列
<400> 4
Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr
1 5 10 15
Ser Phe Leu Leu Thr
20
<210> 5
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTLA4跨膜结构域的序列
<400> 5
Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe Tyr
1 5 10 15
Ser Phe Leu Val Ser Ala Val Ser Leu Ser
20 25
<210> 6
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-1跨膜结构域的序列
<400> 6
Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala
20 25
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> PD-1跨膜结构域的序列
<400> 7
Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp
1 5 10 15
Val Leu Ala Val Ile
20
<210> 8
<211> 26
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> PD-1跨膜结构域的序列
<400> 8
Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile
20 25

Claims (7)

1.一种T淋巴细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述T淋巴细胞含有包含凋亡诱导结构域的人工细胞死亡多肽，所述人工细胞死亡多肽是包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的跨膜蛋白，该胞外结构域包含表位或模拟表位，该胞内结构域包含所述凋亡诱导结构域，所述凋亡诱导结构域是胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9或者包含胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9，其中所述人工细胞死亡多肽是使用抗体可二聚化的，且其中当所述抗体使所述人工细胞死亡多肽二聚化时，在所述T淋巴细胞中产生凋亡诱导信号，
其中
所述抗体是利妥昔单抗，且所述表位或模拟表位是与所述利妥昔单抗结合的CD20表位或CD20模拟表位；
所述抗体是托西莫单抗，且所述表位或模拟表位是与所述托西莫单抗结合的CD20表位或CD20模拟表位；
所述抗体是替伊莫单抗，且所述表位或模拟表位是与所述替伊莫单抗结合的CD20表位或CD20模拟表位；
所述抗体是奥法本单抗，且所述表位或模拟表位是与所述奥法本单抗结合的CD20表位或CD20模拟表位；
所述抗体是阿仑珠单抗，且所述表位或模拟表位是与所述阿仑珠单抗结合的CD52表位或CD52模拟表位；
所述抗体是巴利昔单抗，且所述表位或模拟表位是与所述巴利昔单抗结合的CD25表位或CD25模拟表位；
所述抗体是达克珠单抗，且所述表位或模拟表位是与所述达克珠单抗结合的CD25表位或CD25模拟表位；
所述抗体是brentuximab，且所述表位或模拟表位是与所述brentuximab结合的CD30表位或CD30模拟表位；
所述抗体是贝利木单抗，且所述表位或模拟表位是与所述贝利木单抗结合的B细胞活化因子(BAFF)表位或BAFF模拟表位；
所述抗体是西妥昔单抗，且所述表位或模拟表位是与所述西妥昔单抗结合的表皮生长因子受体(EGFR)表位或EGFR模拟表位；
所述抗体是帕尼单抗，且所述表位或模拟表位是与所述帕尼单抗结合的表皮生长因子受体(EGFR)表位或EGFR模拟表位；
所述抗体是依法珠单抗，且所述表位或模拟表位是与所述依法珠单抗结合的CD11a表位或CD11a模拟表位；
所述抗体是伊匹木单抗，且所述表位或模拟表位是与所述伊匹木单抗结合的CD152表位或CD152模拟表位；或
所述抗体是那他珠单抗，且所述表位或模拟表位是与所述那他珠单抗结合的α4整联蛋白的表位或α4整联蛋白的模拟表位。
2.权利要求1的用途，其中所述抗体是利妥昔单抗，且所述表位或模拟表位是与所述利妥昔单抗结合的CD20表位或CD20模拟表位。
3.权利要求1或2的用途，其中所述T淋巴细胞包含至少两种人工细胞死亡多肽，其中所述抗体与所述至少两种人工细胞死亡多肽上的表位或模拟表位结合，所述细胞死亡多肽的胞内结构域二聚化并生成足以杀死所述T淋巴细胞的聚集的凋亡诱导信号。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其还包含嵌合抗原受体(CAR)，其识别所述癌症细胞上的抗原。
5.权利要求4的用途，其中所述癌症是实体瘤或血癌。
6.权利要求4的用途，其中所述癌症是血癌。
7.权利要求4-6中任一项的用途，其中所述抗原是Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液体蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白质melan-A(被T淋巴细胞识别的黑素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、二聚形式的丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、异常ras蛋白或异常p53蛋白。
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